TWI324070B - Nucleic acids, polypeptides, and methods for modulating apoptosis - Google Patents

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1324070 玖、發明說明： 【相關申請案】 本申請案是2002年7月23日之美國申請案系列號 10/200,148之部份續篇，其為2〇〇2年5月7日之美國申請案系 列號10/141，647之部份續篇，其為2001年7月23日之美國申 請案系列號9/909,796之部份續篇。 【發明所屬之技術領域】

本發明是有關細胞凋亡-特異性真核細胞啟動因子_5A (eIF-5 A)及去氧海蒲酸合成酶（deoXyhypUSine Synthase , DHS) 核fe及多肽’及利用細胞凋亡_特異性eIF_5 a及dhs調控細 胞中細胞凋亡之方法。 【先前技術】 細胞调亡（apoptosis)是遺傳上有計劃之細胞事件，其特徵 為明確的外形特色，如細胞收縮，染色質凝縮，核斷裂及 膜起泡。Kerr et al. (1972) Br. J. Cancer, 26, 239-257 ; Wyllie et al‘（1980) Int· Rev. Cytol.，68, 251-306。其在正常組織發 展及止血中扮演重要角色，且細胞凋亡過程中之缺失被視 為造成各種人類疾病，由神經退化及自體免疫力失調症至 ^ 瘤。Thompson (1995) Science, 267，1456-1462 ; Mullauer et al_ (2001) Mutat. Res, 488, 21 1-23 1。雖然細胞凋亡細胞之外 形特色已明定’然調控此過程之分子路徑仍僅開始被闡明 而已。 在細胞凋亡中被視為扮演關鍵角色的一群蛋白質是半胱 胺酸蛋白酶一族’稱為卡斯蛋白酶（caSpases)，此對大多數 88794 -6 · 1324070 細胞’周亡路徑是必要的。Creagh & Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29, 696-701 ; Dales et al. (2001) Leuk. Lymphoma, 41，247-253。卡斯蛋白酶反應細胞凋亡刺激而啟動細胞凋 亡’係解離各種細胞蛋白質，造成典型細胞凋亡表徵，包 括細胞收縮，膜起泡及DNA斷裂。Chang & Yang (2000)

Microbiol· Mol. Biol. Rev·，64, 821-846。 細胞凋亡前蛋白質，如Bax或Bak，經由釋出卡斯蛋白酶 活化分子在纟田胞凋亡路徑中扮演關键角色，如粒線體細胞 色素c，由是經由細胞调亡促進細胞死亡。Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 63-67 ； Zou et al. (1997) Cell，90, 405-413。抗·細胞凋亡蛋白質，如Bcl-2，經由拮抗 細胞调亡前蛋白質之活性而促進細胞存活，Bax及Bak。 Tsujimoto (1998) Genes Cells, 3, 697-707 ； Kroemer (1997) Nature Med.，3, 614-620。Bax : Bcl-2之比例是決定細胞命運 的一個方式.；過量的Bax可促進細胞凋亡，而過量的Bcl-2 促進細胞存活。Salomons et al. (1997) Int. J. Cancer, 71， 959-965 ； Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci., 55, 64-75 〇 涉及細胞凋亡的另一關鍵性蛋白質是由腫瘤遏止子基因 p53所編碼者。此蛋白質是一種轉錄因子，可能是經由Bax 之正向調控，調控受損及遺傳上不穩定細胞之生長及绣導 細胞调亡。Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6，133-142 ; Ronen et al., 1996 ； Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans., 29, 684-688 ； Ryan et al. (2001) Curr. Opin. Cell Biol., 88794 1324070 1 3, 332-337 ； Zornig et al. (2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551， F1-F37 。 鑑定細胞正進行凋亡之顯明的外形學特色，因此可構成 許多評估細胞调亡被啟動及過程之方法。可供偵測用的凋 亡細胞特色是翻轉酵素（flippase)之活化，其造成磷脂醯基 絲胺酸之分泌，此磷脂常位於漿膜之内小葉^ Fad〇k et al (1992) J. Immunol·，149, 4029-4035。攜有經分泌之磷脂醯基 絲胺酸之凋亡細胞可以磷脂醯基-結合蛋白質，Annexin v 共輛至螢光染料而染色偵測。在細胞凋亡過程中發生之典 型DNA斷裂情形，可經由標記以螢光素之去氧核苷酸之 DNA片段曝出之3·-ΟΗ端之標記而測及。與核酸結合之勞光 染料，如Hoescht 33258 ’可用來偵測染色質凝縮，及細胞 凋亡細胞中之核斷裂。在細胞族群之細胞凋亡程度也可由 細胞萃取物中卡斯蛋白酶蛋白水解活性之程度中推論而 知。 至於遺傳上明確之過程，細胞凋亡，就如同其他發展過 程，可因突變而瓦解。細胞凋亡路徑.之變化咸信在許多疾 病過程中扮演關鍵角色，包括癌症。Wyllie et al. (1980) Int. Rev. Cytol., 68, 251-306 ； Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462 ； Sen & D'Incalci (1992) FEBS Letters, 307, 122-127 ； McDonnell et al. (1995) Seminars in Cancer and Biology, 6，53-60。癌症發展及進行之檢視，傳統上集中在 細胞增殖。然而，細胞凋亡在腫瘤生成中扮演的重要角色 近來已漸明顯。事實上，目前關於細胞凋亡有許多係利用 88794 1324070 腫瘤模式學習而來，因為細胞凋亡之控制在腫瘤細胞係以 某些方式必然地改變。Bold et al. (1997) Surgical Oncology， 6, 133-142 。 在腫瘤發展中，細胞凋亡可因各種訊號而啟動。細胞外 訊號包括生長或存活因子之耗盡，缺氧及離子化輻射。可 啟動細胞调亡的内部訊號包括DNA損傷、終端縮短及可產 生不適當增殖訊號之致癌突變e Lowe & Lin (2000)

Caixinogenesin，21，485-495。離子化輻射及用來治療惡疾之 幾乎所有的胞毒化療劑，被認為經由啟動内源細胞凋亡機 制έ秀導細胞死亡而作用。Rowan & Fisher (1997) Leukemia, 11, 457-465 ； Kerr et al. (1994) Cancer, 73, 2013-2026 ； Martin & Schwartz (1997) 〇nc〇l〇gy Research，9,卜5。 澄據顯示’在癌症進行早期，腫瘤細胞對可誘導細胞凋 亡之作用物（如離子化輻射或化療藥物）敏感β然而，當腫瘤 進行’細胞對凋亡刺激發展出抗性》Naik et al (丨996) Genes and Development, 1〇, 2105-2110。此點可用以解釋為何早期 之癌症對治療之反應較已成熟傷害還好。晚期癌症對化療 及輕射治療發展出抗性之能力，似乎與細胞凋亡路徑之改 變有關’其使腫瘤細胞對細胞凋亡刺激反應之能力受限。

Reed et al. (1996) Journal of Cellular Biology, 60，23-32 ; Meyn et al. (1996) Cancer Metastasis Reviews, 15，119-131 ;

Hannun (1997) Blood, 89, 1 845-1 853 ； Reed (1995) Toxicology Letters, 82-83, 155-158 . Hickman (1996) European Journal of C ancer，3 2 A，921 -926。對化療之抗性已知在慢性淋巴性白 88794 -9- 1324070 血病及結腸癌中分別與抗-細胞凋亡基因bcl_2之過度表 現，及前-細胞凋亡bax基因之刪除或突變互有關聯。 腫瘤細胞成功地發展瀰漫性轉變之能力，似乎也涉及細 胞凋亡路徑上之改變。Bold et al (1997) Surgical 〇nc〇1〇gy， 6, 133-142。例如’腫瘤遏止子基因p53之突變被視為7〇%腫 瘤會發生。Evan et al. (1995) Curr. Opin. Cell Biol.，7, 825-834。失活p53之突變’會使細胞反應〇να損傷而誘生 細胞凋亡之能力受限，使細胞易受進一步突變之攻擊。K〇 & Pnves (1996) Genes and Development, 10, 1054-1072 〇 因此’細胞凋亡係緊密地涉及於贅瘤轉形及轉移之發展 及進行’且對於細胞凋亡路徑所涉及的有更多的了解，對 於經由基因治療途徑調控細胞凋亡路徑，可提供治療癌症 新的潛在標的。Bold et al· (1997) Surgical Oncology, 6, 133-142 。 已知去氧海蒲酸合成酶（DHS)及含有海蒲酸之真核細胞 轉譯啟動因子-5 A(eIF-5A)，在涉及於細胞生長及分化的許 少細胞過程中扮演重要角色。海蒲酸（hypUsjne)是一種見於 所有受檢之真核生物及原始細菌之獨特胺基酸，但未見於 真核細菌’且eIF-5A是僅知之含海蒲酸蛋白質。park (1988) J. Biol. Chem., 263, 7447-7449 ； Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol., 1 1, 103-107 ； Bartig et al. (1990) System. Appl. Microbiol., 13, 112-116 ； Gordon et al. (1987a) J· Biol. Chem.，262, 1658 5-165 89。具活性之eIF-5A以二個轉 譯後步驟形成：第一步驟是將亞精胺之4·胺基丁基部份、 88794 •10- 1324070 經由去氧海蒲酸合成酶之催化，轉移至前驅體eIF_5A特異 賴胺酸之α-胺基上而形成去氧海蒲酸殘基；第二步驟涉及 經由去氧海蒲酸羥化酶羥化此4-胺基丁基部份以形成海蒲 酸。 eIF-5 Α之胺基酸在各種屬間相當具保留性，且在eIF_5A 海蒲酸殘基四週之胺基酸序列，且有嚴苛之保留性，可推 知此處理修飾對生存而言是十分重要的。park et al. (1993) Biofactors，4, 95-104。此推論可由以下觀察進一步支持，即 將在酵母中迄今所見之eIF-5A二個同型失活，或DHS基因之 失活，其係催化其活化作用中之第一步驟，可阻斷細胞分 裂。Schnier et al. (1991) Mol. Cell, Biol.，11，3105-3114 ;

Sasaki et al. (1996) FEBS Lett., 384, 151-154 ； Park et al. (1998) J. Biol. Chem” 273, 1677-1683。然而，耗盡酵母中之 eIF-5A蛋白質，對於總蛋白質之合成僅有些微減少，可推 知eIF-5 A對於mRNA特異子集之轉譯是必要的，而非蛋白質 總體之合成。Kang et al· (1993), "Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis," in Tuite, M. (ed.), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H。可與eIF-5 A結合之配體共有高度保留性基 序的近來發現也支持eIF-5A之重要性。Xu & Chen (2001) J.

Biol. Chem., 276, 2555-2561。此外，頃發現經修飾之ejF-5A 之海蒲酸殘基係與RNA序列-特異性結合所必要的，且此結 合並未提供免於核糖核酸酶之保護作用。 eIF-5A的第一個cDNA由 Smit-McBride et al.，在 1989年選 88794 -11 - 1324070 殖自人類，且之後已自各種真核生物中，包括酵母、大鼠、 雞胚、苜辕及蕃莊選殖出eIF-5A之cDNAs或基因。 Smit-McBride et al. (1989a) J. Biol. Chem., 264, 1578-1583 ； Schnier et al. (1991)(酵母）；Sano, A· (1995) in Imah〇ri，M et

al. (eds), Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU

Science Press，The Netherlands，81-88(大鼠）；Rinaucio & Park (1992) FASEB J.，6, A453(雞胚）；pay et ai. (1991) Plant m〇1. Biol.，17, 927-929(苜蓿）；Wang et al· (2001) J. Biol. Chem.， 276, 17541-17549(蕃茄）。 此外’ eIF-5A之細胞内耗盡可使核内特異mRNA顯著累 積’顯示eIF-5A可能負責mRNA特異種類由核至胞質之往 復。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a ° Abstract No. 2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。eIF-5A 累積在與核孔-有關 之核内纖維，及其與一般核輸出受體之交互作用，可進一 步推知eIF-5A是一種核質往復蛋白質，而非多核糖體之一 組份。Rosoruis et al· (1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380。 eIF-5A mRNA之表現已應用於各種人類组織及哺乳動物 細胞株。例如’ eIF-5 A表現之改變可見於加入血清繼之血 清損失後之人類纖維母細胞中。Pang & Chen (1994) J. Cell Physiol.，160，53 1-538。在老化的纖維母細胞中也可觀察到 去氧海蒲酸合成酶活性與年齡有關之減少及前驅體eiF-5A 之充裕。雖然此反應出同型中分化變化之均分之可能性並 未定。Chen & Chen (1997b) J. Cell Physiol.，170, 248-254。 88794 •12- 1324070 研究顯示，eIF-5A可能是病毒蛋白質之細胞標的，如人 類免疫缺失病毒1型Rev蛋白質及人類τ細胞白血病病毒i型 Rex蛋白質。Ruhl et al· (1993) j Cell Bi〇1，123, 13〇9132〇 ;

Katahira et al. (1995) J. Vir〇i.，69, 3125-3 133。初步的研究 顯示，eIF-5A經由與其他RNA-結合蛋白質（如Rev)之交互作 用而對準RNA，推知，這些病毒蛋白質可補充eIF_5A以行 病毒 RNA 之處理修飾。Liu et al. (1997) Biol. Signals, 6, 166- 174 ° 已知去氧海蒲酸合成酶及eIF-5 a在關鍵性細胞過程中扮 4重要角色，包括細胞生長及老化。例如，植物中去氧海 >看酸合成酶表現之反義減少，造成葉及果實延緩老化，顯 不在植物中存在有可誘使老化之eIF_5A同型。見W〇 01/02592 ; PCT/US 01/44505 ; U.S. Appl. No. 09/909,796。 酵母中去氧海蒲酸合成酶或eIF_5 A基因之失活可造成細胞 分裂之抑制作用。Schnier et al. (1991) Mol. Cell. Biol.，11， 3105-3114； Sasaki et al. (1996) FEBS Lett. 384, 151-154； Park et al. (1998) J. Biol. Chem·，273, 1677-1683。 亞精胺同系物已成功地用於活體内抑制去氧海蒲酸合成 酶’以及可抑制活體内海蒲酸之形成，其伴有蛋白質合成 及細胞生長之抑制。Jakus et al. (1993) J_ Biol. Chem., 268, 13151-13159 ; park et al. (1994) J. Biol. Chem.，269，27827- 27832。多胺類本身，特別是腐胺及亞精胺，在細胞增殖及 分化中似乎也扮演重要角色。Tabor & Tabor (1984) Annu. Rev. Biochem., 53, 749-790 ； Pegg (1988) Cancer Res., 48, 88794 • 13 - 1324070 759-774。例如，其中多胺生合成路徑已被阻斷之酵母突變 株，無法生長除非提供外源之多胺。Cohn et al. (1980) J, Bacteriol·, 134, 208-213。 已示出多胺可保護細胞使免於細胞凋亡之誘導。例如， 胸腺細胞之細胞凋亡可曝於亞精胺及精胺而阻斷之，其機 制似乎是避免内切核酸酶活化。Desiderio et al. (1995) Cell Growth Differ., 6, 505-5 13； Brune et al. (1991) Exp. Cell Res., 195，323-3 29。此外，已示出外源的多胺可遏止B細胞由受 體-調介之細胞凋亡，以及單細胞寄生蟲，克氏錐蟲

Trypanosoma cruzi，之細胞凋亡。Nitta et al. (2001) Exptl.

Cell Res., 265, 174-183 ； Piacenza et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，98, 7301-7306。低濃度之精胺及亞精胺也 觀察到可減少新生大鼠正常發展中神經細胞喪失之數目， 以及在腦絕血中可保護腦免於神經元之損傷。Gilad et al. (1985) Brain Res., 348, 363-366 ； Gilad & Gilad (1991) Exp. Neurol.，111，349-3 55。多胺也可抑制植物組織之老化，一 種有序之細胞死亡型式《已示出亞精胺及腐胺可延緩康乃 馨花木及分開之蘿萄葉於收成後之老化e Wang & Baker (1980) HortScience，15, 805-806(康乃馨花朵）；Altman (1982) Physiol. Plant.，54, 189-193(分開之蘿蔔葉）。 然而’在其他的研究中可觀察到因反應外源多胺而誘導 細胞凋亡。例如’人類乳房癌細胞株經由誘生細胞凋亡而 反應多胺同系物，且已示出過量的腐胺可誘生DH23 A細胞 中之細胞凋亡。McCloskey et al. (1995) Cancer Res.，55, 88794 -14- 1324070 3233-3236 ; Tome et al. (1997) Biochem. J·，328，847-854。 由多胺實驗中所得之結果可總結地推知，eIF-5A特異同 型之存在，在細胞凋亡之誘導上扮演其角色。特言之，數 據符合以下觀點，即此中有eIF-5A細胞凋亡-特異性同型之 存在，其係由DHS所活化。此DHS反應需亞精胺之事實符 合以下發現，即已示出多胺可誘使卡斯蛋白酶活化，此為 與細胞凋亡之相關之蛋白水解反應之關鍵性執行者。 Stefanelli et al. (2000) Biochem. J.5 347,875-880； Stefanelli et al.(1999)FEBSLett.，451，95-98。在一個相似之條理下，多 胺合成之抑制劑可延緩細胞凋亡。Das et al. (1997) Oneoli Res., 9, 565-572 ； Monti et al. (1998) Life Sci., 72, 799-806 ； Ray et al. (2000) Am. J. Physiol., 278, C480-C489 ； Packham & Cleveland (1994) Mol. Cell Biol·，14, 5741-5747。 外源多胺可抑制且同時促進細胞凋亡之發現可由以下事 實加以解釋，即依據所應用之層次，其或可抑制DHS反應 造成eIF-5 A之活化，且因此阻礙細胞调亡，或經由具毒性 之理由而誘生細胞凋亡。低濃度外源多胺可阻斷植物及動 物系統之細胞凋亡之發現，與低濃度多胺及其同系物可充 作DHS反應之競爭性抑制劑之事實是一致的。確實，即使 是DHS反應受質之外源亞精胺，可會因受質抑制作用而阻 礙反應。Jakus et al. (1993) J. Biol· Chem.，268, 13 153-13 159。 然而’所有的多胺及其同系物在高濃度下均是有毒的， 且可誘生細胞凋亡。此基於二個理由而發生，姑不論其抑 制推想之eIF-5 A細胞凋亡-特異性同型之活化能力。首先， 88794 -15- 1324070 經/舌化之eIF-5A有長的半茨期。T〇rreii〇 et ai. (I%?) Biochem. Biophys. Res. Commun., 145, 1335-1341 ； Dou &

Chen (1990) Biochem. Biophys. Acta·，1036, 128-137。因此， 因去氧海蒲酸合成酶活性之抑制所致之活化的細胞凋亡· 特異性eIF-5A之耗盡，並無法即時發生，以阻斷因亞精胺 尤毒性作用所引起之細胞调亡。其次，多胺是去氧海蒲酸 反應之競爭性抑制劑，因此即使在具毒性之濃度下似乎仍 無法完全阻斷反應。 ' 本發明是有關eIF-5 A cDNA之選殖，其係在細胞凋亡誘生 前立即被正向調控。此與細胞凋亡_特異的eIF_5A似乎是介 入細胞凋亡-造成疾病狀況之適合的標的，因其作用在細胞 调亡路徑所涉及之下游效應物及轉錄因子之轉錄後調控層 次上。特言之，細胞凋亡-特異的eIF_5 A似乎可選擇性促進 編碼下游效應物及轉錄因子之mRNA由核至胞質之轉位，在 此其被接绩地轉譯。啟動細胞凋亡之最終決定，似乎源自 内及外前-及抗-細胞凋亡訊號之間之複雜交互作用。L〇we & Lin (2000) Carcinogenesis，21，485-495。經由其促進下游 細胞凋亡效應物及轉錄因子之轉譯之能力，與細胞凋亡-有 關之eIF-5 A似乎可將這些訊號間之平衡傾向於細胞凋亡。 如先前所述的，已熟知抗癌劑可誘生細胞凋亡，且在細 胞调亡路徑上之變化可減緩由藥物-誘生之細胞死亡。

Schmitt & Lowe (1999) J· path〇l.，187, 127-137。例如，許多 k癌藥可正向調控p53，而喪失p53之腫瘤細胞可發展出對 這些藥物之抗性。然而，幾乎所有的化療劑，只要其劑量 88794.doc ，16- 1324070 足夠，均可在與p 5 3無關下誘生細胞凋亡’顯示即使在抗藥 之腫瘤中，至細胞凋亡之路徑並未冗全被阻斷。 Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci., 55, 64-75。此推測，細胞凋亡之誘導’ eIF-5A即使未必可校正 已突變基因，也可克服p53-相關之路徑，並經由促進不同 路徑而誘生細胞调亡。 與細胞凋亡-有關之eIF-5 A，其誘導作用具有選擇性對準 癌細胞之潛力，同時對於正常的鄰近細胞少有或無影響。 此點始因於在腫瘤細胞中所表現之致突變致癌基因，可以 mRNA特異種類型式提供細胞凋亡訊號，而此係不存在於正 常細胞中。Lowe et al. (1993) Cell，74, 954-967 ; Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21, 485-495。例如，在p53-突變腫瘤 細胞中恢復野生型p53，可直接地誘生細胞凋亡，以及增加 腫瘤細胞株及異物照像中之藥物敏感性。（Spitz et al.， 1996 ; Badi.e et al·，1998)。 細胞凋亡-eIF-5 A之選擇性始自以下事實，即經由調控其 由核至胞質之轉位，其可選擇性促進下游細胞凋亡效應物 及轉錄因子mRNA之轉譯。因此，為使細胞凋亡eIF_5a有作 用’這些效應物及轉錄因子之mRNA必須被轉錄。癌細胞中 這些mRNA被轉錄地愈多（但鄰近正常細胞中則否），可預期 到細胞凋亡eIF-5A可促進癌細胞之細胞凋亡，但對正常細 胞即使有的話也是極少影響。因此，以細胞凋亡_相關之 eIF-5 A恢復腫瘤細胞中細胞凋亡潛力，可減少癌症病人由 於腫瘤細胞選擇性對準標的所經驗到之毒性及副作用。細 88794 -17- 1324070 胞凋亡eIF-5 A之誘導，也有加強腫瘤細胞對抗-癌藥物反應 之潛力，由於改善這些作用物插抗抗藥性腫瘤之效力。此 接著使抗癌藥在效力下可採較低劑量，且因此對病人毒性 較低。 【發明内容】 本發明提供經分離的及/或純化的大鼠細胞调亡-特異性 eIF-5A及DHS核酸，及多肽及反義寡核苷酸，及細胞凋亡-特異的eIF-5A及DHS之表現載體。本發明也提供經分離及/ 或純化的細胞凋亡-特異性eIF-5A(在此也稱為人類eIF-5Al 或eIF5a)。本發明也提出經分離及/或純化的人類eiF-5A2(在 此也稱為增殖性eIF-5 A或eIF5b)。本發明也提出利用細胞凋 亡-特異性eIF-5A及DHS調控細胞凋亡之效應。 本發明也提供鑑定哺乳動物组織中，特別是哺乳動物心 臟組織中絕血發病率之方法。再者，也提供減少哺乳動物 组織中細胞.凋亡，較好是心臟組織，之方法。這些方法包 括偵測及比較細胞凋亡-特異性eIF-5 A及增殖性elF-5A之基 因表現水平’且當細胞凋亡-特異性A之表現水平高過 增殖性eIF-5 A時’將之與絕血發病率互成相聯性。在減低 哺乳動物組織中之細胞调亡方法中，提出一種可抑制細胞 凋亡-特異性eIF-5A表現之作用物。 【實施方式】 本發明之基礎部份根基於由大鼠黃體中所分離之編碼 eIF-5A之全長cDNA之發現及鑑定，其涉及於細胞调亡（細胞 凋亡-特異性）β因此，在一個具體實例中，本發明提出一種 88794 •18, 1324070 經仝離之核酸，其中含有編碼大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5 A 多月太之核：y：酸序列《本發明也提出一種經純化之多肽，其 中含有大鼠細胞凋亡-特異性eIF_5 a多肽之胺基酸序列。大 氣細胞凋亡-特異性eIF_5A多肽表示與大鼠特異之任何多 肽’其在細胞凋亡細胞中差別地表現，且始自去氧海蒲酸 殘基之形成，係在去氧海蒲酸合成酶催化下將亞精胺之4_ 胺基丁基部份轉移至前驅體eIF_5 A特異保留性賴胺酸之α_ 胺基上，此4-胺基丁基部份再經由去氧海蒲酸羥化酶行羥 化作用以形成海蒲酸，由是活化eIF_5 a。 此外’本發明之核酸及多肽大鼠細胞凋亡_特異性ειρ_5 a 序列’可在此中提供之準則及精藝者熟知之技術下，自其 他細胞、組織、器官或動物中，分離與細胞凋亡_特異性核 酸及多肽。本發明也提出適合充作引子或雜交探針之核酸 分子，可偵測編碼本發明大鼠細胞凋亡_特異性eIF 5A多肽 之核酸。 本發明之核酸可為DNA ’ RNA，DNA/RNA雙聯體，蛋白 質-核酸（PNA)或其衍生物。如此中所用的，核酸或多肽被 稱為”經分離的"或"純化的"係指其實質上無細胞物質或無 化學前驅體或其他化學藥劑。應明白，所謂經分離或純化 的並不指含有許多其他序列片段之基因庫型製劑。本發明 之核酸或多肽可純化至均質或其他純度。純化層次依欲求 用途而疋。關鍵特色在於，即使在其他組份相當大量存在 下，製劑仍可有核酸或多肽欲求之功能。 所分離之多肽可純化自可自然表現彼等之細胞，純化自 88794 •19- 1324070 已被改變以表現彼等之細胞（重組體），或利用已知之蛋白質 合成方法合成。例如’蛋白質之重組產製涉及將編碼細胞 调亡誘生eIF-5A或DHS之核酸分子選殖至表現載體内。表現 載體引入宿主細胞内，且蛋白質在宿主細胞中表現。蛋白 質可經任何適合的純化流程，利用標準蛋白質純化技術分 離自細胞。 較好’本發明編碼大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5 A多肽之經 分離的核酸’具有SEQ ID NO: 1之核：y：酸序列，且本發明經 純化之多肽具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列。本發明的大鼠 細胞凋亡-特異性eIF-5A核酸及多肽，也包括分別與seqid ΝΟ:1及SEQ ID NO:2有實質序列同一性或同質性之序列，以 及其功能性衍生物及變型。 如此中所用的，"實質上序列同一性”或”實質上同質"用以 表示序列與另一序列呈現實質上結構或功能之同等性。具 實質序列同一性或實質同質性序列間之任何結構或功能差 異將是最微小的；即其將不致影響序列如欲求應用上所示 之功能般作用之能力。差異例如可因不同種屬間密碼子用 法之固有變異所致。結構差異被視為最微小，係指若二種 以上不同序列間存在有大量序列重疊或相似性，或是若不 同的序列呈現類似的物理特性，即使若序列是有長度或結 構上之差異β此特性包括如在明確條件下可雜交之能力， 或若在蛋白質例子中之免疫交叉反應性，類似的酵素活性 等。精藝者可由技藝中已知之方法，容易地決定這些各個 特性。 88794 -20- 1324070 另外，二段核Ϋ酸序列是"實質上互補的"係指若序列之 間有至少約70%以上，又較好8〇%以上，甚至約9〇%以上， 且最好約95%以上之序列相似性。若二段胺基酸序列有至 少50%,較好至少70%，又較好至少8〇%，甚至至少9〇%， 又最好至少95%之相似性，#多肽之活性，或功能上相關 部份間，則指為實質上的同質。 為了決定二序列之同一性百分率’序列基於最佳比較目 的而比對（如為了有最佳之比對，可在第一及第二胺基酸或 核酸序列之一或二者中引入空隙，而非同質之序列可基於 比較目的而不理之）。在一個較佳具體實例中，為比較目 的’則參考序列比對長度要至少3〇%，4〇%，5〇%，6〇0/。， 70%，80°/。或90%以上。之後再比較在相當胺基酸位置或核 甞酸位置上之胺基酸殘基或核苷酸。當在第一序列中之位 置為和第二序列相當位置之相同胺基酸殘基或核苷酸所占 據時’則指分子在該位置上是同一的（如此中所用之胺基酸 或核酸"同一性’係相當於胺基酸或核酸"同質性"）。二序列 間之同一性百分率是序列所共有之相同位置數目之函數， 考慮空隙之數目’各空隙之長度，其必須引入以使二序列 有最佳之比對。 序列之比較及二序列間同一性及相似性百分率之決定， 可利用數學算則完成（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988 ； Biocomputing： Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993 ； Computer Analysis of 88794 -21 - 1324070

Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 ； and

Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds.，M Stockton Press, New York，1991)。 本發明的核酸及蛋白質序列可進一步充作"質間序列 (query sequence)"以對序列庫進行搜查以鑑定如其他的家 族成員或相關序列。此搜查可利用NBLAST及XBLAST程式 來進行’係 Altschul，et al.(2.0版本）（1990) J. Mol, Biol. 215: 403-10。BLAST核苷酸搜查可利用NBLAST程式進行。 BLAST蛋白質搜查可利用xBLAST程式進行，以取得與本發 明蛋白質同質之胺基酸序列。針對比較目的為了獲得有間 隙之比對，可利用Gapped BLAST進行，如Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res· 25(17):3389-3402所述。當利用 BLAST及有間隙之BLAST程式時，可使用個別程式之預設 參數（如 XBLAST及 NBLAST)。 所謂核酸之”功能性衍生物”在此表示基因或核苷酸序列 之同系物或類似物。功能性衍生物可保有至少部份的特定 基因功能’使其可依據本發明利用之。如此中所謂之細胞 凋亡-特異性eIF_5A多肽之"功能性衍生物，，指細胞凋亡-特 異性eIF-5A之片段，變型，類似物或化學衍生物，其保有 至少部份的細胞凋亡-特異性eIF_5A活性，或與細胞凋亡-特異性eIF-5A之特異抗體具有免疫交又反應性。細胞闲I 特異性eIF-5A多肽之片段係表示任何副群之分子。 ° 88794.doc -22- 1324070 功能性變型也含有類似胺基酸之置換，其不造成功能上 之變化或僅微小足量之變化。功能所必要之胺基酸可以技 蟄中已知之方法鏜定，如位置-指令之突變或丙胺酸_掃描突 變（CUnningham et al. (1989) Sdence 244 1〇811〇85)。後一 步驟在分子之每一殘1中引入單_丙胺酸突變。戶斤生成之突 又刀子再進行生物活性之測試，如激酶活性’或試管内增 殖活性之刀析。之後再經由結構分析決定結合配對/受質結 。關鍵性位i ’如結晶& ’核磁共振或光親和力標記如仙 et al. (1992) J. Mol. Biol. 224:899-904 ； de Vos et al. (1992) Science 255:306-312) 〇 變型"指的是與完整基因或其片段實質上類似之分子， 如具有或多個經置換之核苷酸之核甞酸置換變型，但其 絲有與特殊基因雜交之能力，或可編碼可與天然DNA雜 父之mRNA轉錄子。”同系物，，指由不同動物屬或種來之片段 或又土序列類似物"指非天然分子，實質上類似於或作 用上和整個分子有關，其變型或片段。 變型肽包括自然生成之變型，以及由精藝者已知方法所 製造者。此變型可利用分子技術及此中揭示之序列資訊容 易地鑑定/製作。再者，此變型可依據序列及/或與本發明 eIF_5A或DHS蛋白質之結構同質性為基礎’與其他蛋白質容 易地區別。同質性，同-性程度，主要以蛋白質是否是功 能性變型或非功能性變型’存在於同物種同源基因族内之 分歧量及在異物種同源基因間演化之距離為基礎。 本發明eIF-5A或DHS蛋白質之非自，然生成之變型可利用 88794 -23· 1324070 重組體技術容易地產生。此變型包括刪除、加入及置換在 蛋白質之胺基酸序列内，但不限於此。例如，有一類之置 換為保留性胺基酸置換。此置換係在蛋白質之特定胺基酸 上以具類似特性之另一胺基酸置換。通常被視為保留性置 換者為脂族胺基酸中（Ala，Val，Leu及lie) —者為另一者之 取代；羥基殘基Ser及Thr之互換；酸性殘基Asp及Glu之交 換；醯胺殘基Asn及Gin間之置換；鹼性殘基Lys及Arg之交 換；及芳族殘基Phe及Tyr間之取代。關於何種胺基酸之變 化似乎是表型上沉默的之準則可見於Bowie et al.，Science 247:1306-1310 (1990)。 另外，但也是較好’編碼本發明大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5A多肽之核酸，可在高度迫切條件下與和seqIDn〇:1 互補之核苷酸序列雜交。所謂"雜交"如此中所用的通常表 示在適當之迫切條件下核酸之雜交，此係精藝者依探針序 列及標的序列之本質而顯而易知的。雜交及洗滌條件是技 藝中熟知的，且依據欲求迫切度，經由變化培育時間、溫 度及/或溶液之離子強度，可容易地完成條件之判斷。如見

Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York，1989。 條件之選擇受令於欲雜交序列之長度，特別是探針序列 (長度，核酸之相關G-C含量及所許可之誤配量。當需較低 互補性足二股行部份雜交時，則以低迫切度條件為較佳。 當欲求完美或幾近完美之互補性時，以高迫切度條件為較 88794 -24· 1324070 佳。於典型高迫切條件下，雜交條件含有6X S.S.C.，〇.〇1 M EDTA ’ IX登哈瓦溶液及〇 5% SDS。雜交在約68。〇下進行约 3至4小時，用於所選殖DNA之片段，及約1 2至1 6小時，用 於總真核DNA。於較低迫切度下，雜交溫度可下降至約^ °c，低於雙聯體之熔化溫度（Tm)。已知、是G_c含量及雙聯 體長度以及溶液離子強度之函數關係。 如此中所用的，"雜交至DNA或RNA分子之相當部份”表 示所雜交之分子，如寡核苷酸，多核苷酸，或任何核茹酸 序列（王有義或反義方向）可確認及雜交至另一核酸中之序 列，其大約相同尺寸且與之有足夠的序列類似性，以在適 合條件下達成雜又。例如，丨〇〇個核苷酸長之有義分子可與 核甘序列中約1 〇〇個核:y：酸部份雜交，只要二序列間有約 7 0 /〇以上之序列相似性即可。也應了解，"相當部份"之尺寸 將容許雜交中有某些誤配，如此"相當部份"可較與之雜交 之分予小些或大些，如20-30%較大或較小，較好不超過約 12-15%大或小。 此外’多肽之功能性變型也可含有類似胺基酸之置換， 中功flb典改.史或改變微不足道。功能上必要之胺基酸可 以技藝中已知之方法鑑定，如位置-指令之突變或丙胺酸_ 知私哭變（Cunningham et al·，Science 244:1081-1085 (1989)卜後一步驟可在分子之每一殘基上引入單一個丙胺 8¾•突變。所生成之突變分子再進行生物活性之測試或分析。 例如，細胞凋亡-特異性eIF-5 A之類似物係指與整個蛋白 貝或其片段實質上類似之非天然蛋白質或肽擬物。細胞凋 88794 -25- 1324070 亡-特異性eIF-5 A之化學衍生物含有肽或肽片段非天然部份 之額外的化學部份。修飾可引入肽或其片段中，係將肽之 標的胺基酸殘基與可與所選定之側鏈或末端殘基反應之有 機衍生化作用物反應。 編碼細胞凋亡-特異性eIF-5 A之全長cDNA，其分離自大鼠 黃體，此最初的發現及特性化造成編碼DHS之部份長度 cDNA純系之發現及特性化，其也分離自大鼠黃體並涉及於 細胞凋亡。因此，在另一具體實例中，本發明提出經分離 之核酸，其中含有編碼大鼠細胞凋亡-特異性DHS多肽之核 苷酸序列。也提出含有大鼠細胞凋亡-特異性DHS多肽之胺 基酸序列之經純化多肽。大鼠細胞凋亡-特異性DHS多肽指 與大鼠特異的任何適合的多肽，其在細胞凋亡之細胞中差 別地表現，且可催化去氧海蒲酸殘基之形成，即將亞精胺 之4-胺基丁基部份轉移至失活eIF-5A特異的保留性賴胺酸 之ot-胺基上.，可形成去氧海蒲酸，由是活化了 eIF-5A。 較好，編碼本發明大鼠細胞凋亡-特異性DHS多肽之經分 離核酸，具有SEQIDNO:6之核苷酸序列，且本發明之經純 化多肽具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列。本發明大鼠細胞凋 亡-特異性DHS核酸及多肽，也包括分別與SEQ ID NO:6及 SEQ ID NO:7有實質序列同一性或同質性之序列。以及其功 能性衍生物及變型，其先前已述。另外，也是較好的，本 發明經分離之核酸所具有之核苷酸序列係在高迫切條件下 可與SEQ ID NO:6之互補物雜交者，其先前也已述。 在此中所述之大鼠細胞凋亡-特異性elF-5 A序列之核酸及 88794 -26- 1324070 夕肽例中，本發明大鼠細胞凋亡特異性DHS序列之核酸及 多肽，可用於自其他動物中（包括人類）分離細胞凋亡_特異 性DHS核酸及多肽。利用技藝中已知方法及此中所提供之 準則，依序種屬間至少80%之序列類似性，可達成自動物 及人類中分離此DHS序列。本發明也提出適合充作引子或 雜交探針之核酸分子’以偵測編碼本發明大鼠細胞凋亡特 異性DHS多肤之核酸。 細胞凋亡-特異性eIF-5A及DHS為適合的標的，可用於調 .控細胞凋亡，包括細胞凋亡基礎疾病過程，因為其似乎作 用在涉及細胞;周亡路徑中，下游效應物及轉錄因子之轉錄 後凋控上。因此’本發明也提出調控細胞中細胞凋亡之方 法’係對細胞投予可調控細胞凋亡_特異性eIF_5A及/或DHS 功能之作用物。精藝者應明白，作用物可為僅調控細胞凋 亡-特異性eIF-5A功能者，僅是單獨的細胞凋亡·特異性dhs 功能，或有.細胞凋亡-特異性eIF-5A及DHS功能二者。 細胞凋亡可調控可經由細胞中細胞凋亡-特異性eIF_5 A及 /或DHS功能正常層次下之任何適當改變而成，如此中所欲 求的’處理修飾或改變可以是完全的或部份的，且可包括 轉錄或轉譯控制上之變化，或改變細胞中細胞凋亡-特異性 eIF-5A及/或DHS功能之其他變化《細胞凋亡-特異性eiF-5A 或DHS功能表示與去氧海蒲酸殘基形成有關之任何活性， 係將亞精胺之4-胺基丁基部份轉移至前驅體elF-5A特異保 留性賴胺酸之α-胺基上，其由DHS所催化，此4-胺基丁基部 份再經去氧海蒲酸羥化酶之羥化作用形成海蒲酸，由是活 88794 -27- 1324070 化了 eIF-5A。 在本發明一個具體實例中，可抑制細胞凋亡-特異性 eIF-5A及/或DHS功能之作用物，由是可抑制細胞凋亡。抑 制性細胞凋亡表示細胞凋亡任一或所有明確的外形特色， 在強度及/或數目上之任何減少，及/或在開端上之延遲，如 細胞收縮，染色質凝縮，核斷裂及膜起泡。 可抑制細胞凋亡-特異性eIF-5A及/或DHS功能的一種作 用物是反義寡核嘗酸。較好，反義寡核芬酸具有編碼部份 細胞凋亡-特異性eIF-5A多肽及/或細胞凋亡-特異性DHS多 肽之核茹酸序列。許多編碼細胞凋亡-特異性eIF-5 A多肽及/ 或DHS多肽之適合的核酸序列係技藝中已知的。如，SEQ ID NOS:l，3，4，5，11，15，19，20及21(細胞凋亡-特異性 eIF-5A核酸序列），SEQ ID NOS:6及8(細胞凋亡-特異性DHS 核酸序列），3£(^101^0:12及166抒-5八（細胞凋亡-特異性多 肽序列）及SEQ ID NO:7(細胞凋亡-特異性DHS多肽序列）或 其部份，可提供適合的序列。其他適合的序列，利用已知 序列為探針，依據此中所述方法可尋獲。 因此，本發明也提出反義寡核苷酸，其編碼部份細胞凋 亡-特異性eIF-5A多肽及/或細胞凋亡-特異性DHS多肽，或 其互補物。本發明之反義寡核甞酸可呈RNA或DNA型式， 如，cDNA，基因體DNA或合成的RNA或DNA。DNA可為雙 股或單股，且若是單股可為編碼股或非編碼股。寡聚化合 物與其標的核酸之特異雜交，造成核酸正常功能之干擾， 通常稱為"反義"。可干擾之DNA功能包括複製及轉錄。可 88794 -28 - 1324070

干擾之RNA功能包括所有功能，如：RNA至蛋白質轉譯處 之轉位，蛋白質自RNA之轉譯，RNA剪接以生成一或多種 mRNA種類，及RNA可參與或促進之催化活性。此反義寡核 苷酸整體之作用是抑制細胞凋亡-特異性eIF-5A及/或DHS 之表現，及/或抑制經活化之細胞凋亡-特異性eIF-5A之產 〇 另外，由細胞凋亡-特異性DHS對細胞凋亡-特異性eIF-5A 之活化作用，可由投予可抑制DHS酵素反應之化學劑而抑 制之。例如，反應細胞凋亡之DNA梯狀反應之開端可因動 物以亞精胺處理而在大鼠黃體中延緩，其為注入PGF-2a誘 生細胞凋亡後，DHS反應之抑制劑（圖18-19)。Jakus et al., (1993) J. Biol· Chem· 268:1315 1-13 159。 加入可降解細胞凋亡-特異性eIF-5A DNA，RNA或蛋白質 之作用物，或已降解之細胞凋亡-特異性DHS DNA、RNA或 蛋白質可抑制或實質地減低細胞凋亡，由是避免細胞凋亡-特異性eIF-5A為細胞凋亡-特異性DHS之活化。在本發明另 一具體實例中，内源哺乳動物細胞凋亡-特異性DHS，細胞 调亡-特異性eIF-5 A，或二者在表現上之抑制作用，可經由 核糖酶之使用而受影響。適合藥物之實例包括可抑制細胞 凋亡-特異性eIF-5 A為細胞凋亡-特異性DHS所活化者，抑制 細胞凋亡-特異性eIF-5 A為去氧海蒲酸羥化酶所活化者，可 抑制細胞调亡-特異性D H S之轉錄及/或轉譯者，可抑制細胞 凋亡-特異性去氧海蒲酸羥化酶之轉錄及/或轉譯者，及可抑 制細胞凋亡-特異性eIF-5A轉錄或轉譯者。可抑制eIF-5A為 88794 -29- 1324070 細胞凋亡-特異性DHS活化之藥物實例有亞精胺，1，夂二胺 基-丙烷，1，4-二胺基-丁烷（腐胺），1，7-二胺基-庚烷或ι，8_ —胺基-辛燒。 也可經由失活指導合成細胞凋亡-特異性eIF-5 A之基因抑 制細胞凋亡-特異性eIF-5A。此失活可由刪除細胞中之基 因’或將刪除或突變引入基因内而發生，由是失活該基因。 基因之失活也可將另一 DNA片段引入基因而成，如此内源 細胞凋亡-特異性eIF-5 A蛋白質之表現不會發生。另外，經 由失活可指導合成細胞凋亡-特異性DHS之基因，也可抑制 細胞凋亡-特異性eIF-5A之活化。將突變引入真核細胞基因 内之方法，如删除及嵌入，係技藝中已知的，如u s. patent No. 5,464,764。用於突變細胞中基因之寡核苷酸及表現載 體，可依技藝中已知之方法及此中提供之準則進行，例如， 用於製作及表現反義寡核苷酸之方法，可用來製作可用於 突變細胞中基因之寡核苷酸及表現載體。 I由遏止可指導合成細胞中細胞凋亡_特異性A之基 因表現，也可抑制細胞洞亡_特異性eIF_5A之表現。此失活 17二由/、遏止作用元成，如將可指導合成細胞凋亡_特異性 A之核：y：酸序列引入細胞内，如此可發生共遏止作 用。另外’經由遏止細胞中可指導合成細胞;周亡-特異性麵 ^基因表現，經由共-遏止作用，也有可能抑制細胞调亡- 主. ‘作用。用於共遏止作用之寡核苷酸及 表現載體，可依據技蓺中 釗见 又=τ已知爻万法及此中所提供之準則 良備’例如，用於製作 作及表現反義寡核甞酸之方法，可製 88794 -30· 1324070 備用於共遏止作用中之寡核苷酸及表現載體。共遏止作用 之方法是技藝中已知的，如U.S. Pat. No. 。

抑制作用的一個結果（經由如反義，突變或共遏止作用） 疋内源可轉譯之細胞凋亡-特異性eIF_5A*DHS_編碼mRNA 量之減少。因此’細胞凋亡-特異性dHS蛋白質產量減少， 由是活化的eIF-5 A之量也減少，其接著減少細胞凋亡特異 性蛋白質之轉譯作用。細胞凋亡由此受抑制或延緩，因為 啟動細胞凋亡需重新合成蛋白質。 在本發明另一具體實例中，可誘生細胞凋亡-特異性 eIF-5A或DHS功能之作用物可誘生細胞凋亡。誘生細胞凋亡 表示細胞凋亡明確之外形學特色任一者或全部，在強度或 數目上之任何增加’或啟動之加速，如細胞收縮，染色質 凝縮，核斷裂及膜起泡。 任何可誘導細胞凋亡-特異性eIF-5A及/或DHS功能之適 合作用物均可使用。精藝者明白，可投予失活的及活性型 式之細胞凋亡-特異性eIF-5 A。投予不活化型式，或海蒲酸 -未修飾型式，則天然的細胞凋亡-特異性DHS可活化 eIF_5A。編碼細胞凋亡-特異性elF-5A多肽及/或DHS多肽之 許多適合的核酸序列係技藝中已知的。如SEQ ID NO:卜3， 4，5 ’ 11，15，19，20及21(細胞凋亡-特異性eIF-5A核酸序 列），SEQ ID NO:6及8(細胞凋亡-特異性DHS核酸序列）’ SEQ ID NO: 12及16 eIF-5 A(細胞凋亡-特異性多肽序列）及SEQ ID NO:7(細胞凋亡-特異性DHS多爿太序列）或其部份均可提供適 合的序列。其他適合的序列，依據此中所述之方法利用已 88794 -31 - 1324070 知序列為探針仍可尋。 例如，裸露的核酸（裸露的DNA載體，如寡核苷酸或質 體），或多肽，包括重組體產製之多肽，均可投予至細胞内。 重組產製之多肽表示，編碼eIF-5A或DHS蛋白質之DNA序 列係置於適合表現載體之内，其詳述於下。宿主為表現載 體所轉感，之後產生欲求之多肽。多肽再自宿主細胞中分 離。可製備重組體細胞凋亡-誘生性eIF-5 A蛋白質，如在中 國倉鼠卵（CHO)細胞内，並利用重組體DHS為精藝者所活 化。Wang et al. (2001) J. Biol. Chem·，276，17541-17549 ； Eriksson et al·，（2001) Semin. Hem at ol.，38，24-31。多肽也可 合成，其利用已知之蛋白質合成法合成。 多肽之攝入可利用配體促進，如由炭疽衍生之配體，其 可調介攝各樣細胞内。Liu et al. (2001)，J. Biol. Chem·，276, 46326-46332。重組體蛋白質也可投予至標的細胞，組織及 哺乳動物器官内，利用脂質體。包容有蛋白質之脂質體採 靜脈内方式投予。將配體納入特殊細胞受體至脂質體内可 達成對準標的。見，如Kaneda，Adv Drug Delivery Rev 43: 197-205 (2000)。 可誘導細胞凋亡-特異性eIF-5 A或DHS功能之較佳作用物 是表現載體。因此，本發明提出表現載體，其含有啟動子 並操作連結至編碼細胞凋亡-特異性eIF-5A多肽及/或DHS 多肽之核酸上。本發明之表現載體可呈RNA或DNA，如 cDNA，i因體DNA或合成的RNA或DNA型式。DNA可為雙 股或單股，且若是單股可為非編碼股或編碼股。任何適合 88794 -32- 1324070 的表現載體均可使用（如，Pouwels et al.，Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevior，Ν.Υ·:1985))。較好，表現載體 具有一個啟動子序列’操作連結至編碼細胞凋亡-特異性（相 關的）eIF-5A多肽及/或細胞凋亡-特異性（相關的）Dhs多肽 之核苷酸序列。 在表現載體内’欲求之核酸及啟動子係操作連接，如此 啟動子可驅動核酸之表現。任何適合的啟動子均可使用， 只要核酸可表現即可。此適合的啟動子實例包括各種病毒 啟動子，真核啟動子及原構活性之啟動子。只要此操作連 結仍維持，表現載體可包含有—種以上的核酸（如，編碼細 胞凋亡-特異性eIF_5A及/或DHS之核酸）。表現載體可視所 需含有其他元件，如聚腺:y：化序列，核糖體進入位置，轉 錄凋控元件（如加強子，沉默子等）’其他序列以加強載體或 轉錄子之穩定性，或欲求轉錄子在細胞内之轉譯或處理修 飾（如分泌訊號，領導子等），或其他任何適合的元件。 表現載體可衍生自病毒，如腺病毒，與腺體相關之病毒’ 疱疹病毒，反轉錄病毒或慢病毒。本發明之表現載體可轉 感至宿王細胞内，其包括細菌，哺乳動物或昆蟲宿主細胞 系統，但不限於此，包括桿狀病毒系統（如，Luck〇w et ai， Bi〇/TeChn〇l〇gy，6,47 (1988))，及已確立之細胞株，如 293 COS-7，C127 ’ 3T3，CHO ’ HeLa，BHK等。 以腺病毒載體為較佳，因為和質體及其他病毒載體不同 (如單純疱疹病毒），腺病毒載體可達成基因轉移至分裂及未 分裂細胞内，在心血管相關部位有高水平之蛋白質表現， 88794 -33- 1324070 如心肌、血管内皮及骨骼肌。再者，由腺病毒載體轉移之 基因作用在表染色體位置，且因此不適當將轉移基因插入 宿主基因體關鍵位置之危險性極小。腺病毒載體也希望有 至少一個病毒複製必要之基因功能有缺失。較好，腺病毒 載體在腺病毒基因體E卜E2及/或E4區有至少一個基本基因 功能之缺失。又較好，載體在腺病毒基因體E3區有至少一 部份之缺失（如E3區之Xbal刪除）。 將病毒單純地加至培養基内可將重組體腺病毒遞送至培 養細胞内。將病毒粒子直接注入血流或至欲求組織，也可 達到宿主動物/人類之感染。血清中病毒之半衰期可由病毒 與脂質體（如Lipofectin，Life Technologies)或聚乙二醇之複 合而延長。腺病毒載體進入細胞通常是經由病毒纖維蛋白 質之圓形功能部位與柯薩奇病毒及腺病毒受體，CAR間之 交互作用。病毒載體可指令至特殊細胞，或至不會表現CAR 之細胞，經遺傳操作病毒可表現與特定細胞受體特異之配 體。 在另一具體實例中，細胞凋亡可以化學藥劑化學上正向 調控内源細胞凋亡-特異性eIF-5 A或細胞凋亡-特異性 DHS，或二者之轉錄作用，或化學上加強細胞凋亡-特異性 eIF-5A之活化作用而予以啟動。在此一具體實例中，將 PGF-2a投予至癌細胞或動物/人類之腫瘤，以正向調控DHS 及eIF-5A之轉錄作用。 細胞凋亡-特異性eIF-5 A是調控細胞凋亡適合之標的，包 括細胞凋亡基礎疾病過程，因其似乎可作用在涉及於細胞 88794 -34 - 1324070 凋亡路徑中，下游效應物及轉錄因子之轉錄作用後調控 上。本發明調控細胞凋亡-特異性eIF-5A及細胞凋亡-特異性 DHS之方法，或單獨或組合地，可在動物中完成以誘生或 加強細胞凋亡，並生成新穎的方法及組合物以治療及預防 因細胞無法進行細胞凋亡所致的，引起的，或具相關病因 學之疾病。 5午夕重要的人類疾病均因細胞凋亡控制失常所致。這此 失常可造成細胞數病理上增加（如癌症）或細胞受損之喪失 (如退化性疾病）。在非限制實例下，本發明方法及組合物可 用於預防或治療的以下細胞凋亡_相關疾病及失調症有：神 經學/神經退化性失調症（如阿滋海默氏，巴金森氏，亨丁頓 氏，肌萎縮性側索硬化（Lou自體免疫失調症 (如類風濕性關節炎，全身性紅斑狼瘡（SLE)、多發性硬化卜 裘馨氏肌肉萎縮症(DMD)’運動神經之失調症，絕血，心 臟絕血，慢性心臟衰竭’中風，幼兒脊髄肌肉萎縮症，心 跳知止％又衰竭’異位性皮膚炎敗血病及敗血性休克， AIDS ’肝火，青光眼，糖尿病（1型及2型），氣喘，色素性 視網膜炎’骨質疏鬆症，異種移植物排斥及灼傷。 本發明方法可用於治瘩，地老仰> 、療佳處理有癌細胞或受腫瘤之苦之 動物，其用量分別足以坪；、产， <匕癌，··田胞或可抑制腫瘤之進行。 適於完成之劑量定義為户豳 …口療上有效劑量。此用途有效之劑 量依疾病之嚴重度及動物本， 柳尽身免疫系統之一般狀況而定。 腫瘤生長之機制表示腫瘤 進订之預防或減少，如腫瘤.之 生長，侵入，轉移及/或再 丹見。本發明方法可用治療任何適 88794.doc ' 35 - 1324070 合的腫瘤，包括如乳房，心臟，肺，小腸，結腸，脾，腎， 膀胱，頭及頸部，卵巢，前列腺，腦，胰臟，皮膚，骨骼， 骨髓’血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸或肝之腫瘤。動 物’較好疋哺乳動物，最好是人，可利用本發明之組合物 及方法治療之。本發明方法因此可於試管内、活體外或活 體内進行。 給藥程序也可依疾病狀況及動物狀況而變化，且通常由 單一快速濃注劑量或連續輸液至每天多次投藥（如每4_6小 時）’或依治療及動物狀況所示。然而應注意，本發明並不 限於任何特殊劑量。 在本發明中，任何適合的方法或路徑均可用於投藥，如 口服’靜脈内，腹膜内，皮下或肌内投藥。所投予之拮抗 劑劑量依許多因素而定，包括如投予之分子型式，接受治 療之腫瘤型式及嚴重度及投藥路徑。然而應強調，本發明 並不限於任何特定方法或投藥路徑。 在一個不同的具體實例中.，·本發明方法可配合以一種以 上之傳統治療。例如，可使用適合之抗贅瘤劑，如化療劑 或餐射。在另一個不同的具體實例中，本發明方法可組合 以一或多種的適合佐物’如細胞動素（例如IL_丨〇及IL- i 3 )， 或其他免疫刺激劑》 在另一具體實例中，診斷細胞凋亡-相關或有關失調症（如 心臟組織之絕血）可測度細胞凋亡-特異性eIF_5 A及增殖性 eIF-5A(eIF-5b)之表現水平。増殖性eiF_5 A(eIF-5b)及細胞凋 亡-特異性eIF-5A之差異處在於其係自不同所在為不同啟動 88794.doc -36- 1324070 子所轉錄；雖然二者結構上類似，但有不同的羧基末端。 本發明之診斷方法涉及將在特定細胞中增殖性eIF-5 A含量 與在相同細胞中之細胞凋亡·特異性eIF-5 A比較。針對增殖 性eIF-5A及細胞凋亡-特異性elF-5A，均比較其基因表現水 平’再互相比較。於正常之功能下，細胞内增殖性eIF_5 A(在 此也稱為eIF-5A2)之量應相同或較多於細胞凋亡-特異性 eIF-5A(在此也稱為eiF-5Al)。然而，細胞在死亡或壓力下， 如絕血，細胞凋亡-特異性eIF_5 A之表現水平應大於增殖性 eIF-5A ^因此，偵測細胞凋亡-特異性eIF_5A增加之表現水 平，對鑑定或診斷細胞凋亡-相關或有關失調症（如絕血）提 出其方法。 圖46示出實驗結果，其中細胞凋亡-特異性ejF-5a(eIF5a) 及增殖性eIF-5A(eIF5b)之水平，於心臟組織絕血誘生前及 後測度。也見貫例6。在絕血前，細胞凋亡-特異性eip_5a (eIF5a)及增殖性eIF_5A(eIF5b)之表現水平大約相似，且係 在低水平《 —旦誘生絕血後，細胞凋亡_特異性eIF_5a (eIF5a) 水平之增加更甚於增殖性eIF_5A(eIF5b)水平。 已知細胞调亡-特異性eIF_5a(eIF5a)及增殖性eIF—5A (eIF5b)之表現水平相當低，且在正常組織中互相平衡，追 蹤細胞凋*c -特異性eiF_5a(eIF5a)基因表現水平之增加對於 診斷細胞或組織處理壓力下之各種疾病或狀況（如絕血）可提 供方法。 再者，.經由偵漁J基因表現水平以偵、測這些狀況，在此提出 治療此狀況之方法。例如，若以技藝中已知之方法或由偵測 88794 -37- 1324070 細胞凋亡-特異性eIF_5a(eIF5a)表現水平增加之程度來偵測 心臟中之絕血，則可提供可抑制或降低基因表現水平之作 用物’且因此減少細胞死亡之發生率β 上文纣刑可抑制或降低細胞凋亡-特異性eIF-5a(eIF5a)基 因表現之作用物’包括使用細胞凋亡-特異性eiF_5a(eip5a) 之反義寡核％•酸。較佳的反義寡核：y：酸包括與編碼細胞凋 亡-特異性eIF-5a之核：y：酸序列編碼股互補之寡核苷酸，如列 於SEQ ID NO:3或4之核：y：酸序列，但不限於此。 在某些癌細胞中，正常的調控機制出錯，且細胞凋亡_特 異性eIF-5A之量，相較於增殖性eIF_5A之量改變（細胞凋亡_ 特異性eIF-5A水平增加，如此其水平大於增殖性eIF 5A)。如 此可在細胞任何表型變化前即診斷出癌症細胞。 此外，在絕血的心臟組織中，細胞凋亡_特異性eIF_5A之 $相較於增殖性eIF-5 A之量改變，如此細胞；周亡_特異性 eIF-5A水平相較於增殖性eIF_5A有所增加。 又在另一具體實例中，增殖性eIF-5A與細胞凋亡-特異性 eIF-5A之比例，可用於藥物篩選.此方法也涉及比較特定 細胞中增殖性eIF-5 A之量，相較於相同細胞中細胞凋亡_特 異性eIF-5A之量。增殖性eIF-5A與細胞凋亡-特異性eIF_5A 之正常比例，可與細胞和藥物候選者接觸後之增殖性 eIF-5A與細胞凋亡-特異性eIF-5A之比例比較。接觸後增殖 性eIF-5 A與細胞凋亡-特異性eIF-5 A比例之改變，可用於鑑 定具有細胞-調控活性之候選者。具細胞凋亡_調控活性之候 選者可用於治療與細胞凋亡相關之疾病，可能是經由細胞 88794 -38- 1324070 调亡之抑制或誘導。此外，增殖性eIF_5A對細胞调亡-特異 性eIF-5A比例之改變可用來調控細胞调亡，其也可用於治 療和不正常細胞凋亡有關之任何上述狀況。 利用此方法，可有效地ϋ選大量的有潛力候選者，以鑑 定可調控細胞凋亡之庫中成員.利用此方法任何候選者或 候選者庫均可筛選。例纟，利用本方法針對明確的細胞调 亡-調控活性，可篩選具細胞凋亡調控劑潛力之生物反應調 控劑，包括可改變訊號轉導路徑之單株抗體，細胞動素如 TRAIL(AP〇2配體），充作類視色素/類固醇族核受體之配 體’及可結合及抑制蛋白質激酶之小分子化合物。 一個適合的候選者是蛋白質激酶c_a反義寡核苷酸，isis 3521 (ISIS Pharmaceuticals, Inc.，Carlsbad，CA)，其具有抗腫 瘤活性。其他特異性候選者包括⑶—阳㈦仙

Pharmaceuticals, San Diego，CA)，已知其在各種細胞型式 中，於啟動及執行細胞凋亡中扮演關鍵角色，以導致癌症 及神經退化性疾病；GENASENSETM (Genta，Inc.，Berkeley

Heights，NJ)，其係可阻斷Bci_2產製之反義藥物；ingn 24ι (Introgen Therapeutics, Inc” Houston, TX)，其係基因治療標 的 ρ53 ’ 美維華（rituximab (IDEC Corporation, Osaka Japan) ’其係抗-CD2〇單株抗體；及用於心血管疾病及癌症 之一般細胞调亡驅動之治療（AEgera Therapeutics Inc.， Quebec, Canada) 〇 應了解’本發明之核酸及多肽，當用於動物中以針對預 防或治療目的時，應以另外含有醫藥上可接受載劑之组合 -39· 88794 1324070 物型式投藥。適合的藥學上可接受載劑包括如：一種以上 的水，食鹽水，磷酸鹽緩衝之食鹽水，右旋糖，甘醇，乙 醇等’以及其組合。醫藥上可接受之載劑可進—步含有少 量的佐劑，如沾濕劑或乳化劑，保藏劑或緩衝物質，其可 加強結合蛋白質之貯架期或效力。可調和（如技藝中已知的） 注射組合物，使活性組份投予至哺乳動物後可提供快速， 持續或延長之釋出。 本發明之組合物可呈各種型式。包括如：固體、半-固體 及液體劑型，如錠劑、丸劑、散劑、液體溶液劑、分散劑 或懸液劑。脂質體，栓劑，可注射及灌注之溶液劑。較佳 型式依欲求之投藥模式及治療應用而定。 此组合物可以醫藥技藝中熟知之方式製備。在製備組合 物中，活性組份通常混合以載劑，或為載劑所稀釋，及/或 密封在載劑内，其可呈膠囊，發、泡，顆粒，紙或其他容器 内。當载劑充作稀釋劑時，纟可為固體，半固體，或液體 物質，其可充作活性組份之溶媒，賦形劑或介質。因此， 組合物可呈鍵劑，糖錠，發泡性顆粒，扁囊劑，她劑，懸 液劑，氣霧劑(呈固體或在液體介質中），含有高達1〇%按重 計活性化合物之油膏，軟及硬明膠膠囊劑，检劑，注射溶 液劑，懸液劑，無菌包裝之散劑及呈局部貼劑。 本發明目前已述’經由參考以下實例可更容易地了解， 其係經由說明万式提出。示出之實例有助於了解本發明， 但不欲受限，且應不受其任何方式下限制範園。實例不包 括傳統方法之詳述。此方法係—般精藝者所了解的，且述 88794 -40- 1324070 於許多刊物中。傳統方法之詳述說明，如用於構築載體及 質體者，將編碼多肽之核酸嵌入此載體内及質體内，質體 引入宿主細胞，及由各種刊物中可得基因及基因產物之表 現及決定，包括 Sambrook，J. et al.，（1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press。此中所述之所有參考文獻均以全文方式 列入。 實例 實例1 本實例明示出編碼大鼠elF-5 A核酸，且呈現細胞凋亡-特 異性表現之全長cDNA之分離及鑑定。 大鼠黃體内之超速排卵及細胞凋亡之誘導 未成熟（21-30天大）之雌性大鼠，皮下注入50 IU PMSG (Pregant Mare Serum Gonadotropin)使超速排卵，且在 60至 65 小時後注入.50 IU的HCG(人類絨毛膜促性腺激素）。以HCG 處理7天後，皮下注入500毫克的PGF-2a誘生黃體之細胞凋 亡。經PGF-2a處理後，大鼠在各時間下犧牲（如1，8及24 小時），取出黃體，並置液態氮下。在PGF-2a處理前應即犧 牲大鼠取出之黃體组織充作對照組。 大鼠即桌黃體細胞之分散 於超速排卵後6至9天，大鼠以500毫克PGF-2a多部位皮下 注射處理之。15至30分鐘後，取出超速排卵大鼠之卵巢， 置冰上之EBSS(Gibco)中，吸潰使乾燥再稱重。剪除結缔組 織，卵巢切碎（利用剃刀）再以EBSS洗2X。製備膠原酶溶液， 88794 -41 - 1324070 係在5毫升EBSS中渦旋6·5毫克的膠原酶（Sigma，Cat〇丨 #C 5138)。來自8個卵巢的切碎組織加至5毫升膠原酶於 EBSS中，於50<t^Erlenmeyer燒瓶内，並在Diamed吸量管 中抽吸數次以緩和攪動。有切碎組織之燒瓶再置3 71之水 /谷中20为叙，伴以緩和震盛（p〇siti〇n 45在gfl培育箱中）， 於95%空氣，5°/。C02下。 在培育後，燒瓶置冰上，且細胞懸液以塑質轉移吸量管 轉移至裝配有 Swiss Nitex Nylon M〇n〇filament (75 m)之

Nitex濾器上。濾液收集至15毫升以卜⑽試管内。加入第二 份（2.5¾升）的膠原酶溶液（6 5毫克膠原酶/5毫升EBSS)至含 有切碎組織之50毫升三角燒瓶内，利用吸量管緩和攪動， 培sj 10分鐘再如上述般過濾。混合二份濾液，在臨床離心 機中（〜200 g)離心，於室溫下歷5分鐘。以吸量管移去所有 但〜2毫升之上清液，並丟棄，所沉降之細胞再懸浮於其餘2 毫升上清液中β 細胞中加入5耄升MEM洗二次，再如上述般離心及再懸 浮洗過之細胞再懸浮於3 0毫升含有1 〇 mM穀胺酸之MEM 中’於50毫升三角錐瓶内，再置3rc，95〇/〇空氣及5% c〇2 下乂不震堡方式培育1小時。細胞再以如上述般離心而沉 降並再懸浮於含有1 0 mM穀胺酸之MEM中。 利用血球計決定分散細胞之濃度，存活率則利用錐藍染 料坪估。每份2-5XI05細胞置12x75 mm試管，再於未震盧下 培育2-5小時，於3rc，95%空氣及5%(：〇2下。在此期間細 胞;周亡之過程可由評估DNA階梯狀（DNA laddering)程度而 88794 -42- 1324070 追蹤。 由DNA階梯狀具象化大鼠黃體中之細胞凋亡 細胞凋亡的程度由DN A階梯狀決定。基因體DN A分離自 分散之黃體細胞，或利用QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen) 依據廠商指示分離自切除下之黃體組織。黃體組織切下 前，先以PGF-2a處理以誘生細胞调亡，謗生後24小時再進 行。經分離的DNA末端標記，係將500毫微克DNA加上0.2 微居里[a-32P]dCTP，1 mM Tris，0.5 mM EDTA，3 單位的 Klenow酵素及各0.2 pM的dATP，dGTP及dTTP，在室溫下培 育30分鐘。未納入之核嘗酸係將樣品通過1毫升Sepadex G-50管柱而移除，依Sambrooketal.。樣品再經Tris-醋酸鹽 -EDTA(1.8%)凝膠電泳解析。凝膠在室溫真空下乾燥30分 鐘，並曝於-80 °C下之X底片歷24小時。 在一個實驗中，在超速排卵大鼠黃體中細胞凋亡程度於 注入PGF-2a後0，1或24小時時檢查。於0小時之對照組中， 卵巢在未注入PGF-2a下移出。反映出與細胞凋亡有關之核 酸酶活性之低分子量DNA片段之階梯狀現象，在PGF-2a處 理前切出之對照組黃體中並不明顯，但在誘生細胞凋亡後1 個小時内是可辨別的，且誘生細胞凋亡後24小時是顯著 的。此示出圖1 6中。在此圖片中，上圖是以大鼠黃體細胞 凋亡-特異性DHS cDNA之3 ^未轉譯區經32P-dCTP標記而探 測之北方墨點放射自顯圖。下圖是總RN A之溴化乙錠染色 凝膠圖。各列含有10微克RN A。數據顯示，在抽回血清後， eIF-5A轉錄子有向下調控情形。 88794 -43- 1324070 在另一實驗中，相當的對照組動物以食鹽水而非PGF_2a 處理》以食鹽水或PGF-2ct處理後15分鐘，黃體自動物體移 去。移去動物之組織後3及6小時，自黃體中分離基因體 DNA。組織移去後6小時’自PGF-2a處理動物中可明顯看出 DNA階梯狀現象及基因體DNA增加之末端階梯狀現象，但 在組織移出後3小時則否。見圖1 7，反映出細胞凋亡之dna 階梯狀現象。在以PGF-2a處理後15分鐘切出之黃體中也十 分明顯’且在EBSS(Gibco)之試管内條件下可維持6小時。 與細胞调亡有關之核酸酶活性在基因體DNA更充份末端標 記中也更明顯。 在另一實驗中，皮下注入500微克的PGF-2a以誘生超速排 卵。對照組大鼠以等量的食鹽水溶液處理* 1 5至3 0分鐘後， 取出卵巢，以膠原蛋白酶切碎。以PGF-2a處理之大鼠分散 細胞，在10 mM穀胺酸+ 10 mM亞精胺中培育1小時，於1〇 mM穀胺酸但無亞精胺下（第2列）再5小時，或在10 mM穀胺 酸+ 10 mM亞精胺下1小時，而在10 mM穀胺酸+ 1 mM亞精胺 下再5小時（3列）。以食鹽水處理之大鼠對照組細胞以膠原蛋 白酶處理，並再培育1小時，及在僅穀胺酸下再5小時（1列）。 來自各樣品之500毫微克DNA，利用Klenow酵素標以[a-32P] -dCTP，在1.8%瓊脂糖凝膠上分離，在底片上曝光24小時， 結果示於圖1 8。 又在另一實驗中，經超速排卵的大鼠皮下注入1毫克/100 克體重之亞精胺，係分三等份即0.333毫克/1〇〇克體重，在 皮下注入500微克PGF-2a前24、12及2小時時送入。對照组 88794 •44· 1324070 分成二組.未注射，二注亞精胺但無pGF-2α及三次等體積 之食鹽水於PGF-2a處理前。卵巢在前列腺素處理後1小時3 5 分鐘或3小時45分鐘移出，並用於分離DNA。各樣品取500 愛微克DNA^以[a- P]-dCTP，利用Klenow酵素，在1.8% 瓊脂糖凝膠上分離，並底片曝光24小時：第1列，未注射（動 物在如列3-5之相同時間下犧牲）；第2列，以亞精胺注射三 次（動物在如列3-5之相同時間下犧牲）；第3列，以食鹽水注 射三次’繼之以PGF-2a注射（動物在以PGF-2ct處理後1小時 35分時犧牲）；第4列’以亞精胺注射三次，繼以pGF_2a注 射（動物以PGF-2a處理後1小時35分時犧牲）；第5列，以亞 精胺注射三次，繼以PGF-2a注射（動物以pGF-2a處理後1小 時3 5分時犧牲）；第6列’注以亞精胺繼之注射PGF_2a(動物 以PGF-2a處理後3小時45分時犧牲）；第7列，以亞精胺注射 三次，繼以PGF-2a注射（動物在以PGF-2a處理後3小時45分 時犧牲）。結果示於圖19。 RNA分離 在以P G F - 2 ct έ秀生細胞调亡後各時間點時，自取出之黃㈣ 組織中分離總RNA。簡言之，組織（5克）在液態氮中磨碎。 磨碎之粉末混合以3 0毫升狐緩衝溶液（4 Μ異硫氰酸狐，2 5 mM NaOAc，pH 8.5，0_8% β-巯基乙醇）。混合物經四層 Miracloth過遽，再於10,000 g下離心30分鐘，4°C。上清液

再接受11,200 g之氯化铯密度梯度離心歷2〇小時。成團塊之 RNA以75%乙醇潤洗，再懸浮於600毫升DEPC-處理過的水 中，且RNA在-70°C下以1.5毫升95%乙醇及6〇毫升3 M 88794.doc -45 - 1324070

NaOAc使沉澱。 基因體DNA之分離及階梯狀現象 基因體DNA分離自萃取的黃體組織，或分散的黃體細 胞’利用QIAamp DNA Blood套組（Qiagen)，依庭商之指示。 DNA予以末端-標記，係將500毫微克DNA與0.2微居里 [a-32P]-dCTP，1 mM Tris , 0·5 mM EDTA ’ 3 單位 Klenow酵 素及各0.2 pM的dATP，dGTP及dTTP在室溫下共培育30分 鐘。未納入之核苷酸經過1毫升Sephadex G-50管柱而移去， 依Maniatis et al.所述之方法。樣品再經"Tris-醋酸鹽-EDTA (2%)凝膠電泳解析。凝膠在室溫及真空下乾燥30分鐘，再 曝於-80°C之光底片下24小時。 質體DNA分離，DNA定序 使用Sambrook etal. ’上文所述之驗水解方法來分離質體 DNA。全長的陽性cDNA純系依據二去氧定序法定序之。 Sanger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467。開 放讀譯架構收集並利用BLAST搜尋方式分析（GenBank, Bethesda, MD)再利用 BCM Search Launcher: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method (見 F. Corpet，Nuc. Acids Res.，16:10881-10890，（1987) 達到序列比對。序列及序列比對示於圖5 -11。 大鼠黃體RNA之北方吸潰雜交 自大鼠黃體在各細胞凋亡不同階段分離之20毫克總 RNA，於1 %變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離，並固化在耐綸 膜上。全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A cDNA(SEQ ID ΝΟ:1) 88794.doc -46- 1324070 標以32P-dCTP，利用任意引子套組（Boehringer)標記，以此 來探測膜（7χ 107)。另外，全長大鼠細胞凋亡-特異性DHS cDNA(SEQ ID ΝΟ:6)利用任意引子套組（Boehringer)標以 32P-dCTP，以此來探測膜（7xl07 cpm)。膜以 lx SSC，0.1% SDS在室溫下洗一次，以0.2 X SSC，0.1% SDS在65°C下洗 三次。膜乾燥再曝於X-底片，置-70°C下一夜。 如所見的，eIF-5A及DHS在細胞凋亡之黃體組織中均正向 調控。細胞凋亡-特異性eIF-5A之表現在以PGF-2a處理誘生 細胞凋亡後可顯著地增加。在零時間時很低，在處理1小時 内實質地增加，在處理8小時内仍有較多的增加，在處理24 小時内略增加（圖14)。DHS之表現在零時間時很低，在處理 1小時内實質地增加，在處理8小時内仍有較多的增加，而 處理24小時内再次略增加。（圖1 5) 利用以酵母、真菌及人類eIF-5A序列為基礎之引子，產 生細胞凋亡.的大鼠黃體RT-PCR產物 相當於基因3’端之部份長度細胞凋亡-特異性eIF-5A序列 (SEQ ID N0:11)，利用RT-PCR產自細胞凋亡大鼠黃體RNA 模板，其中的寡核茹酸引子對設計自酵母，真菌及人類 eIF-5A序列。用來分離大鼠eIF-5A基因3'端之上游引子是20 個核钻酸之簡併引子：5' TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3' (SEQ ID NO:9)，其中S選自C及G ; R選自A及G ; Η選自A， T及C; Y選自C及T;且N是任何核酸。下游引子用來分離 大鼠eIF-5A基因3·端，含有42個核站酸：5' GCGAAGCTTCCA TGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' (SEQ ID NO: 88794 ·47· 1324070 10) 。進行反轉錄酶聚合酶連鎖反應（RT-PCR)。簡言之，利 用5毫克下游引子，可合成CDNA的第一股。第一股再充作 RT-PCR中之模板，利用上游及下游引子。 RT-PCR產物在瓊月旨糖凝膠上之分離顯示有一段900 bp之 存在’其繼代選殖至 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)利用鈍端連結並定序（SEQ ID NO: 11) 。3'端之cDNA序列是SEQ ID NO:ll，且3·端之胺基酸序 列是 SEQIDNO:12。見圖 1-2。 相當於基因5'端並與3'端重疊的部份長度細胞凋亡-特異 性eIF-5A序列（SEQ ID NO:15)以RT-PCR產自細胞凋亡大鼠 黃體RNA模板。5·引子是24-成員，具有序列，5' CAGGTCTA GAGTTGGAATCGAAGC 3，（SEQ ID NO:13)，其設計自人類 eIF-5A序列。Y引子是30成員，具有序列，5^TATCTCGAGC CTTGATTGCAACAGCTGCC 3，(SEQ ID NO:14)，其依 3'端 RT-PCR片段所設計。進行反轉錄酶-聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)。簡言之，利用5毫克下游引子，可合成CDNA ό勺 第一股。第一股再充作RT-PCR中之模板，利用上游及下游 引子。 利用瓊脂糖凝膠分離RT-PCR產物，顯示有500 bp片段之 存在，其在繼代選殖至 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla，CA)利用存在於上游及下游引子中之xbai 及Xhol選殖位置，再予以定序（SEQ ID NO:15)。5,端之cDNA 序列是SEQ ID NO: 15及5'端之胺基酸序列是SEQ ID NO:16。見圖 2。 -48 - 88794 1324070 大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A 3'及5'端之序列（分別是SEQ IDN0:11及SEQIDN0:15)重疊，並可生成全長之CDNA序列 (SEQIDNO:l)。此全長序列比對，並與在GeneBank資料庫 中之序列比較。見圖1 -3。cDNA純系編碼1 54個胺基酸多肽 (SEQ ID N〇:2)，具有16.8 KDa之經估計分子量。核苷酸序 列，SEQ ID NO: 1，係大鼠細胞凋亡-特異性黃體eIF-5 A基因 之全長cDNA，由RT-PCR所得，示於圖3，且相當的衍生胺 基酸序列是SEQIDNO:2。eIF-5A所衍生之全長胺基酸序列 與人類及老鼠eIF-5a序列比對。見圖8-10。

利用以人類DHS序列為基礎之引子，產生細胞凋亡-特異 性大鼠黃體RT-PCR 相當於基因3'端之部份長度細胞凋亡·特異性DHS序列 (SEQ ID N〇:6)，以RT-PCR自細胞凋亡大鼠黃體RNA模板中 產生，其中所利用之寡核苷酸引子對設計自人類DHS序 列。5'引子是具有以下序列之20-成員：51 GTCTGTGTATTAT TGGGCCC 3，（SEQ ID N0.17)，3'引子是 42-成員，具有以下 序列：5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTT 3’（SEQ ID NO:18)。進行反轉錄酶聚合酶連鎖反 應（RT-PCR)。簡言之，利用5毫克的下游引子，可合成第一 股cDNA。再以第一股為模板，於RT-PCR中使用上游及下游 引子。 在瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產物，顯示存在有606 bp之 片段，其再繼代選殖至 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla，CA)利用純端連接及定序（SEQ ID NO:6)。 88794 -49- 1324070 以RT-PCR所得之大鼠細胞凋亡-特異性黃體DHS基因之部 份長度cDNA之核甞酸序列（SEQ ID NO:6)示於圖4，且相當 的衍生胺基酸序列是S E Q ID Ν 0:7。 基因體DNA之分離及南方吸潰法 用於南方吸潰之基因體DN A，分離自切碎的大鼠卵巢。 約1 〇〇毫克的卵巢組織分成小片並置於1 5毫升試管内。組織 以1毫升PBS洗二次，係緩和地震盪組織懸液，再利用吸量 管移去PBS。組織再懸浮於2.06毫升DNA-缓衝溶液（0.2 Μ Tris-HCl pH 8.0 及 0.1 mM EDTA)，再加入 240 微升 10% SDS 及100微升蛋白酶K(Boehringer Manheim ; 10毫克/毫升）。組 織置45°C水浴中一夜。次日加入另100微升蛋白酶K(10毫克 /毫升），且組織懸液在45°C水浴中再培育4小時。培育後， 組織懸液以等量的酚：氣仿-異戊醇（25 : 24 : 1)萃取一次， 以等體積的氣仿：異戊醇（24 : 1)萃取一次。在萃取後加入 1/10體積的3 Μ醋酸鈉（pH 5.2)及2倍體積之乙醇。將玻璃吸 量管熔封，利用本生燈形成吊鈎用來將DNA細絲拉出溶 液，並將DNA轉移至清潔的微量離心管。DNA以70%乙醇 洗滌，再風乾10分鐘。DNA團塊溶於500微升10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，加入10微升RNase A(10毫克/毫升），且DNA在3 7 °C下培育1小時。DNA以酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1)萃取 一次，且DNA加1/10體積的3M醋酸鈉（ρΗ5·2)及2倍體積之 乙醇以沉澱之。DNA在13,000 X g下以4°C離心10分鐘以使 成團塊。DNA團塊以70%乙醇洗一次，再溶於200微升10 mM Tris-HCl (pH 8·0)係在 4°C 下渦旋 DNA—夜。 88794 -50- 1324070 於南方吸潰分析中，分離自卵巢之基因體DNA以各種限 制酶水解，其或無法在内源基因中切割或僅可切一次。為 達到此，10微克基因體DNA，20微升10X反應缓衝溶液及100 單位限制酶、在共200微升之總反應體積中反應5至6小時。 經水解之DNA填料至0.7%瓊脂糖凝膠中，再接受電泳，於 40伏特下6小時或15伏特下一夜。電泳後，凝膠在0.2 N HC1 中去嘌呤化1 0分鐘，繼之在變性溶液中二次1 5分鐘之洗滌 (0.5 M NaOH，1.5 M NaCl)，及在中和緩衝溶液中二次15分 鐘之洗滌（1.5 M NaCl，0.5 M Tris-HCL pH 7.4)。DNA轉移 至尼龍膜，且膜預雜交在雜交溶液中（40%甲醯胺，6 X SSC，5 X登哈氏溶液（1 X登哈氏溶液是0.02% FicoU，0.02% PVP及0.02°/。BSA)，0.5% SDS及1_5毫克變性之鮭魚精子 DNA)。大鼠 eIF-5A cDNA 3, UTR之 700 bp PCR片段（650 bp 之3’ UTR及50 bp之編碼），標以[a-32P]-dCTP，利用任意之 引子並以lxl06cpm/毫升加至膜中。 類似地，606 bp大鼠DHS cDNA之PCR片段（450 bp編碼及 156 bp 3，UTR)以[ct-32P]-dCTP任意引子標記，並在 ΙχΙΟ6 cpm/毫升下加至第二相同膜上。吸潰物在42 °C下雜交一 夜，再以2 X SSC及0.1% SDS在42°C下洗二次，及以1 X SSC 及0.1% SDS在42 °C下洗二次。吸潰物曝於X光底片下3-10 天。 大鼠黃體基因體DNA以限制酶切割，如圖2 0所示，並以 32P-dCTP-標記之全長eIF-5A cDNA探測。在高度迫切條件 下之雜交顯示針對各限制酶水解之DNA樣品，全長cDNA探 88794 •51 - 1324070 針可與各限制片段雜交，顯示存在有eIF-5A之許多同型。 一旦特別注意到，當大鼠基因體DNA以EcoRV水解，其在細 胞凋亡-特異性eIF-5 A之開放讀譯架構上有一個限制位置， 於南方吸潰中可測及eIF-5 A細胞凋亡-特異性同型之二個限 制片段。二片段在圖20中以雙箭號表示。相當於細胞凋亡-特異性eIF-5A同型之限制片段，在標以EcoRI及BamHI之列 中以單箭號表示，此二限制酶在開放讀譯架構内無切割位 置。這些結果推知，細胞凋亡-特異性eIF-5 A是大鼠中單套 數基因。如圖5至13所示，eIF-5A基因在種屬間具高度保留 性，且如此可預期在任何種屬内之同型間存在有相當大量 之保留性。 圖21示出以32P-dCTP-標記之部份長度大鼠黃體細胞凋亡 -特異性DHS cDNA所探測之大鼠基因體DNA之南方吸潰 圖。基因體DNA以EcoRV切割，此限制酶不會切割充作探針 之部份長度cDNA。可明顯地看出有二個限制片段，顯示此 中有二套數基因或基因含有一個有EcoRV位置之插入子。 實例2 本實例證明以細胞凋亡-特異性eIF-5 A及DHS調控細胞凋 亡。 C Ο S - 7細胞之培養及RN A之分離 COS-7，一種非洲綠猴腎臟類纖維母細胞，轉形以可指導 合成野生型T抗原之SV40突變子，可用於所有以轉感為基 礎之實驗。COS-7細胞培養在Dulbecco’s經修钟之Eagle’s培 養基（DMEM)，其中每升含有0.584克L-穀胺酸，4.5克葡萄 88794 -52- 1324070 糖及0 · 3 7 %碳酸氫納。培養基添加有1 0 %胚牛血清（F B S)及 100單位青黴素/鏈霉素。細胞培養在37°C之5% C02及95% 空氣之潮濕環境中。細胞每3至4天繼代培養，係以0.25%胰 蛋白酶及1 mM EDTA之溶液將黏附之細胞分離。所分離的 細胞以1 : 1 0之分裂比例分散在有新鮮培養基之新培養皿 中〇 用於分離RNA之C0S-7細胞，生長在150毫米組織培養物 處理過之中（Corning)。細胞之收獲係將之以胰蛋白酶 -EDTA溶液處理而分離。分離之細胞收集在離心管中，且 細胞以3 000 rpm離心5分鐘使成團塊。上清液移去，且細胞 團塊在液態氮中快速冷凍。RNA分離自冷凍細胞，利用 GenElute Mammalian Total RNA Miniprep kit (Sigma)，依廢 商指示。 重組體質體之構築及COS-7細胞之轉感 構築重組體質體，其中攜有大鼠細胞凋亡eIF-5 A之全長 編碼序列，於有義股方向，及大鼠細胞凋亡eIF-5A之3'未轉 譯區（UTR)，於反義股方向，其中利用哺乳動物表位標幟表 現載體，pHM6 (Roche Molecular Biochemicals)，其於圖 21 中說明。載體含有下列：CMV啟動子-人類巨細胞病毒即早· 啟動子/加強子；Η A -九肽表位標幟，來自流感血球凝集素； BGH pA-牛生長激素聚腺苷化訊號；fl ori-fl源；SV40 ori-SV40早期啟動子及源頭；新黴素-新黴素抗性（G4 18)基因； SV40 pA-SV40聚腺甞化作用訊號；Col El-ColEl源頭；氨 芊青霉素-氨芊青黴素抗性基因。大鼠細胞凋亡elF-5 A之全 88794 -53- 1324070 長編碼序列及大鼠細胞凋亡eIF-5 A之3’ UTR，以PCR自原先 大鼠 eIF-5A RT-PCR片段於 pBluescript(SEQ ID ΝΟ:1)中擴 大。為擴大全長eIF-5 A，使用如下之引子：向前5' GCCAAGC TTAATGGCAGATGATTT GG 3，（SEQ ID NO:22)及反向 5, CT GAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3'(EcoRl)(SEQ ID NO: 23)。為擴大3’ UTR大鼠eIF-5A，使用如下之引子：向前51 AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3 (EcoRl)(SEQ ID NO:24)及反向 5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTm1 (Hind3)(SEQ ID NO:10)。 自瓊脂糖凝膠電泳後分離所分離之全長大鼠eIF-5 A PCR 產物長度為430 bp，而3' UTR大鼠eIF-5A PCR產物長697 bp。二段PCR產物均可繼代選殖至pHM6之Hindlll及EcoRI 内，生成pHM6-全長eIF-5A及pHM6-全長eIF-5A及pHM6-反 義3, UTR eIF-5A。全長的大鼠eIF-5A PCR產物繼代選殖， 與來自流感.血球凝集素（HA)之九肽表位標幟在架構上，其 在多重選殖位置之上游，以可利用抗-[HA]-過氧化酶抗體 偵測重組體蛋白質。表現可由人類巨細胞病毒即早啟動子/ 加強子所驅動，以確保在哺乳動物細胞株中有高的表現水 平。質體中也有新黴素-抗性（G418)基因，其可用以選出穩 定的轉感子，及SV40早期啟動子及源頭，如此可在表現 SV40大T抗原之細胞中，如COS-7行基因副體複製。 欲用於轉感作用實驗之COS-7細胞，培養在24孔洞之細胞 培養盤（Corning)以用於蛋白質萃取，或4室之培養m (Falcon) 使細胞可用於染色。細胞培養在DMEM培養中，其中添加 88794 -54- 1324070 有10°/。FBS，但缺乏青黴素/鏈黴素，至50-70%融合程度。 製備足供24孔洞盤或培養m-孔洞之轉感培養基，係將0.32 微克質體DNA稀釋在42.5微升無血清之DMEM中，並在室溫 下培育混合物達15分鐘。1.6微升的轉感試劑， LipofectAMINE (Gibco，BRL)稀釋於 42.5 微升無血清之 DMEM中，並在室溫下培育5分鐘。5分鐘後，LipofectAMINE 混合物加至DNA混合物中，並在室溫下一起培育3 0-60分 鐘。欲轉感之細胞以無血清之DMEM洗一次，再平舖在轉 感培養基中，細胞再置回生長室内歷4小時。 培育後，在細胞中加入0.17毫升DMEM+20% FBS。細胞 再培養4 0小時，之後或謗導使進行細胞凋亡再染色，或回 收以行西方墨點分析。至於對照組，空白之轉感也進行， 其中在轉感培養基中略去質體DNA。 蛋白質萃取及西方吸潰 自轉感細胞中分離蛋白質以行西方吸潰，係以PBS(8克/ 升 NaCl，0.2 克 / 升 KC1，1.44 克 / 升 Na2HP04 及 0.24 克 / 升 KH2P04)洗滌細胞二次，再加150微升熱的SDS凝膠-填料緩 衝溶液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，100 mM二硫異未絲蕩醇， 2% SDS，0· 1 %溴酚藍及1 0%甘油）。溶胞產物收集於微量離 心管内，在95°C下加熱10分鐘，再於13,000 xg下離心10分 鐘。上清液轉移至新鮮的微量離心管内，並貯於-20°C下直 到使用為止。 於西方吸潰中，2.5或5微克之總蛋白質在12% SDS-聚丙 烯醯胺凝膠上分離。分出之蛋白質轉移至聚乙烯二氟膜 88794 -55- 1324070 上。膜再於阻斷溶液中（50%脫脂乳粉末，0.02%疊氮化鈉於 PBS)培育 1小時，並於PBS-T(PBS + 0.05% Tween-20)中洗三 次，15分鐘。膜置放在4°C之PBS-T中一夜。在加溫至室溫 之次日，膜在1微克/毫升聚乙烯醇中阻斷30秒。膜於去離 子水中潤洗5次，再於5%牛乳於PBS之溶液中阻斷30分鐘。 一次抗體在5%牛乳/PBS下預先培育30分鐘，再與膜共培 育。 使用數種一次抗體。使用1 : 5000稀釋倍數之抗-[HA]-過 氧化酶抗體（Roche Molecular Biochemicals)以偵測重組體蛋 白質之表現。由於此抗體係共軛至過氧化酶，勿需有二次 抗體，且吸潰物洗滌並以化學發光法展開。所使用的其他 一次抗體為來自Oncogene之單株抗體，其可確認p53(Ab-6)，Bcl-2(Ab-l)及 c-Myc(Ab-2)。p53之單株抗體以 0.1微克 / 毫升之稀釋倍數使用，而Bcl-2及c-Myc之單株抗體則以0.83 微克/毫升之稀釋倍數使用。經與一次抗體共培育60-90分鐘 後，膜在PBS-T中洗3次，15分鐘。二次抗體再稀釋於1%牛 乳/PBS中，並與膜共培育60-90分鐘。當以p53(Ab-6)為一次 抗體時，所使用之二次抗體為山羊抗-老鼠IgG並共軛至鹼 性磷酸酶（Rockland)，在1 : 1000稀釋倍數下。當以Bcl-2 (Ab-1)及c-Myc(Ab-2)為一次抗體時，使用稀釋倍數為1 : 5000之兔子抗-老鼠IgG共軛至過氧化酶（Sigma)。在與二次 抗體共培育後，膜在PBS-T中洗3次。 使用二種偵測方法以展開吸潰物，比色法及化學發光 法。比色方法之使用僅當p53(Ab-6)充作一次抗體時，並配 88794 -56- 1324070 合以鹼性磷酸酶-共軛之二次抗體。具象化經結合之抗體， 係將吸潰物在暗處培育於0.33毫克/毫升硝基藍四銼，0.165 毫克/毫升5-溴-4-氯-3-41哚基磷酸鹽，100 mM NaCl，5 mM MgCl2及100 mM Tris-HCl(pH 9.5)溶液中。停止顏色反應係 將吸潰物培育在2 mM EDTA/PBS中。對其他所有一次抗體 使用化學發光偵測法，包括抗-[HA]-過氧化酶，Bcl-2 (Ab-1) 及c-Myc(Ab-2)。使用ECL Plus Western吸潰偵測套組 (Amersham Pharmacia Biotech)以憤測與過氧化酶共輕之經 結合的抗體。簡言之，膜略吸乾，再培育於暗處加上40 : 1 之試劑A及試劑B混合物，歷5分鐘。膜吸乾，置二片醋酸 酯中間，再曝於X光底片下由10秒變化至10分鐘。 在C0S-7細胞中誘生細胞凋亡 使用二種方法在轉感之COS-7細胞中誘生細胞凋亡：血清 之去除作用，及以放線菌素D，鏈球菌屬（Calbiochem)處理。 在二種處理下，在轉感後40小時移去培養基。在血清飢餓 實驗中，培養基以無血清及無抗生素之DMEM更換。以生 長在無抗生素DMEM，並添加有10% FBS之細胞為對照組。 於放線菌素D誘生細胞凋亡中，培養基以無抗生素之DMEM 取代，其中並添加有10% FBS及1微克/毫升放線菌素D溶於 甲醇中。對照組細胞生長在無抗生素之DMEM中，其中並 添加有10°/〇 FBS及等量之甲醇。於二種方法中，48小時後決 定細胞凋亡之百分率，係以Hoescht或Annexin V-Cy3染色。 以北方吸潰分析也可證實細胞凋亡之誘生，如圖22所示。

Hoescht 染色 88794 -57- 1324070 使用核染，Hoescht，以標記經轉感之c〇S 7細胞之核， 以鑑定細胞凋亡細胞，其中以外形學特色為基礎，如核斷 片及縮凝作用。使用前才製備固定劑，其由無水甲醇及冰 醋酸3 · 1混合物組成。在培養於培養玻片上之c〇S 7細胞培 養基中加入等量之固定劑，並培育2分鐘。自細胞中移去培 養基/固定劑混合物，再丟棄，並於細胞中加入丨毫升之固 定劑。5分鐘後丟棄固定劑，再於細胞中加入丨毫升新鮮的 固定劑，並培育5分鐘。固定劑丢棄，細胞風乾4分鐘再 毫升Hoescht染色（0.5微克/毫升H〇escht 33258於PBS中）。在 暗處培育10分鐘後，丟棄染色溶液，且玻片以去離子水洗3 次歷1分鐘。洗滌後，在細胞中加入1毫升McIivaine's緩衝溶 液（0.021 Μ 檸檬酸，0.058 M Na2HP〇4.7 H20，pH 5.6)，且 在暗處培育20分鐘。丟棄緩衝溶液，細胞風乾5分鐘於暗 處，再移出分隔培養玻片孔洞之各室。在玻片上加入用於 營光之Vectashield覆蓋培養基數滴（Vector Laboratories)，再 蓋上蓋玻片。經染色之細胞在螢光顯微鏡下利用uv濾鏡觀 祭。被鮮明染色之細胞或有斷片核者均計為細胞凋亡者。 Annexin V-Cy3 染色 使用Annexin V-Cy3細胞凋亡偵測套組（sigma)以螢光地 ‘ έ己分泌出之鱗脂酿基絲胺酸或細胞调亡之細胞。使用套 組依在以下變化下依廠商操作指示進行。簡言之，經轉感 之C0S-7細胞培養在皿室培養室之培養玻片上，以PBS洗二 次’以1X結合緩衝溶液洗3次。加入1 5 〇微升染色溶液（1微 克/毫升AnnCy3於IX結合緩衝溶液），且細胞在暗處培育1〇 88794 •58- 1324070 分鐘。染色溶液再移去，細胞以1X結合緩衝溶液洗5次。移 出培養玻片上之室孔洞，在細胞上加入數滴1X結合緩衝溶 液，並覆上蓋玻片。經染色之細胞以螢光顯微鏡分析，利 用綠熱濾鏡以具象化陽性染色（細胞凋亡）細胞之紅色螢 光。計數可見光下之細胞數目可決定總細胞族群。 實例3 本實例證明，以細胞凋亡-特異性eIF-5A及DHS調控細胞. 凋亡。 利用一般步驟及前述實例中所述之方法，圖23是流程圖 說明COS-7細胞瞬時轉感之步驟，其中在無血清培養基中之 細胞，與質體DNA/lipofectAMINE中培育4小時，加入血清， 且細胞再培育40小時。細胞或培育在含有血清之一般培養 基中48小時，再行分析（即未進一步處理），除去血清歷48 小時以誘生細胞凋亡後再分析，或以放線菌素D處理48小時 以誘生細胞.凋亡再分析。 圖22是西方吸潰圖，說明在以pHM6轉感後，外來蛋白質 在COS-7細胞中之瞬時表現。於空白轉感後，或以卩只]^16-LacZ，pHM6-Antisense 3' rF5A(pHM6-反義 3' UTR大鼠細胞 凋亡eIF-5A);或pHM6-有義rF5A(pHM6-全長大鼠細胞凋亡 eIF-5A)轉感後48小時，自COS-7細胞中分離出蛋白質。取 自各樣品之5微克蛋白質，在SDS-PAGE上分級分離，轉移 至PVDF膜，再以抗-[HA]-過氧化酶行西方吸潰法。經結合 之抗體以化學發光法測及，且曝於X光底片下30秒。LacZ(2 列）及有義大鼠細胞调亡e IF - 5 A ( 4列）之表現清楚可見。 88794 -59- 1324070 如上述，COS-7細胞或空白轉感或以pHM6有義rF5A轉感 (pHM6-全長大鼠eiF-5A)。轉感後4〇小時，細胞誘導以進行 細胞凋ττ，係抽離血清歷48小時。利用螢光計均質卡斯蛋 白酶分析套组（Roche Diagnostics)測出在轉感之細胞萃取物 中之卡斯蛋白酶蛋白水解活性。也利用FragEL DNA斷裂細 胞凋ir偵測套組（〇ncogene0,j出DNA斷裂情形其係以標有 螢光素之去氧核苷酸標記所曝出之DNA片段3'-OH端。 另外的COS-7細胞或空白轉感，或以pHM6_有義股rF5A (pHM6-全長大鼠eiF_5A)轉感。轉感後4〇小時，細胞在含有 血清之一般培養基中再生長48小時（未進一步處理），抽離血 清48小時以誘使進行細胞凋亡，或以〇 5微克/毫升放線菌素 D處理48小時以誘使進行細胞凋亡。細胞或染以H〇escht 33258 ’其示出核斷裂並伴有細胞凋亡，或染以Annexin V-Cy3 ’其示出磷脂醯基絲胺酸之曝露並伴有細胞凋亡。染 色&細胞也以螢光顯微術觀察，利用綠色濾鏡再計數以決 定進行細胞调亡之細胞百分率。在可見光下計數總細胞族 群。 圖25說明加強之細胞凋亡’係當c〇s_7細胞以含有全長大 鼠細胞调亡-誘生之eIF-5A(在有義股方向）之pHM6瞬時轉 感時所增加之卡斯蛋白酶活性所反映。大鼠細胞凋亡_誘生 之eIF-5A表現，可造成卡斯蛋白酶活性6〇%之增加。 圖26說明所加強之細胞凋亡，係由以含有全長大鼠細胞 调亡-誘生之eIF-5A(在有義股方向）之pHM6瞬時轉感COS-7 細胞時所增加之DNA斷裂情形所反映。大鼠細胞凋亡-誘生 88794 -60- 1324070 之eIF-5A之表現，可造成DNA斷裂情形273°/。之增加。圖27 說明細胞凋亡之偵測，係由以含有全長大鼠細胞凋亡-誘生 之eIF-5A(在有義股方向）之pHM6瞬時轉感COS-7細胞時所 增加之核斷裂情形所反映。對可表現大鼠細胞凋亡-誘生之 eIF-5A之細胞，斷裂核之發生率較大。圖28說明所加強之 細胞凋亡，由以含有全長大氣細胞凋亡-誘生之elF-5 A(在有 義股方向）之pHM6瞬時轉感之COS-7細胞核斷裂增加所反 映。大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5A，其表現造成核斷裂情形， 分別較非血清飢餓及血清飢餓對照組增加27°/。及63%。 圖2 9說明細胞凋亡偵測，係由含有全長大鼠細胞凋亡-誘 生之eIF-5A(在有義股方向）之pHM6瞬時轉感COS-7細胞 時，磷脂醯基絲胺酸曝露所反應。圖30說明加強細胞凋亡， 係由含有全長大藏細胞凋亡-誘生之elF-5 A(在有義股方向） 之pHM6瞬時轉感COS-7細胞時，磷脂醯基絲胺酸曝露增加 所反映。大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5 A，其表現造成磷脂醯 基絲胺酸曝露，分別較非血清飢餓及血清飢餓對照組增加 140%及 198%。 圖3 1說明加強之細胞凋亡，由含有全長大鼠細胞凋亡-誘 生之elF·5 A(在有義股方向）之pHM6瞬時轉感COS-7細胞 時，增加之核斷裂情形所反映。大鼠細胞凋亡-誘生之 eIF-5 A，其表現造成核斷裂，分別較未處理及處理對照組 增加11 5 %及6 2 %。圖3 2說明在條件下加強細胞调亡之比 較，其中由含有全長大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5 A(在有義股 方向），或未進一步處理或處理使绣生細胞凋亡，之pHM6 88794 -61 - 1324070 瞬時轉感C O S - 7細胞。 實例4 本實例證明，在投予細胞凋亡-特異性eIF-5A及DHS後細 胞凋亡活性之調控。 再者，COS-7細胞或空白地轉感，或轉感以pHM6-LacZ 或pHM6-有義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)並培育40小 時。自各樣品中萃取出之5微克蛋白質樣品，在SDS-PAGE 上分級分離，轉移至PVDF膜，再以可確認Bcl-2之單株抗體 行西方吸潰。以共輛至過氧化酶之兔子抗-老鼠I g G為二次 抗體，再以化學發光偵測結合之抗體並曝於X光底片下。結 果示於圖32。以pHM6-有義rF5A轉感之細胞，較pHM6- LacZ 所轉感者，測及較少的Bcl-2 ;因此，Bcl-2是向下調控。 另外的COS-7細胞或空白轉感，或以pHM6-反義3' rF5A (pHM6-反義之大鼠細胞凋亡-特異的eIF-5A之3'UTR)或 pHM6-有義rF5A(pHM6-全長大鼠細胞凋亡-特異的eIF-5 A) 轉感。轉感後40小時，誘導細胞使行細胞凋亡，係抽離血 清歷48小時。萃取自各樣品之5微克蛋白質樣品，以 SDS-PAGE分級分離，轉移至PVDF膜，再以可確認Bcl-2之 單株抗體行西方吸漬。以共軛至鹼性磷酸酶之兔子抗-老鼠 IgG為二次抗體，再以化學發光偵測結合之抗體並曝於X光 底片下。

同樣地，另外的COS-7細胞或空白轉感，或以PHM6-LacZ 轉感或以pHM6-有義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉感並培 育4〇小時。萃取自各樣品之5微克蛋白質樣品，以SDS-PAGE 88794 -62 - 1324070 分級分離，轉移至PVDF膜，再以可確認p53之單株抗體行 西方吸潰。以共辆至驗性磷酸酶之山羊抗-老鼠IgG為二次 抗體，再以比色法偵測結合之抗體。 最後，COS-7細胞或空白地轉感，或以pHM6-LacZ或以 pHM6-有義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉感，並培育40小 時。萃取自各樣品之5微克蛋白質樣品以SDS-PAGE分級分 離，轉移至PVDF膜，並以可確認p53之單株抗體探測之。 相當的蛋白質吸潰物以抗-[HA]-過氧化酶探測，以決定大 鼠細胞凋亡-特異性elF-5 A表現之水平。使用共輛至驗性磷 酸酶之山羊抗-老鼠IgG為二次抗體，再以化學發光法偵測 結合之抗體。 圖33說明Bcl-2之向下調控，其中COS-7細胞瞬時轉感以 含有全長大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5A(在有義股方向）之 pHM6。上圖說明以考馬斯藍所染色之蛋白質吸潰物；下圖 說明相當的西方吸潰。在以pHM6-有義rF5A所轉感之細胞 中，所測及之Bcl-2較以pHM6-LacZ所轉感者還少。 圖34說明Bcl-2之向上調控，其中COS-7細胞瞬時轉感以 含有全長大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5A(在反義股方向）之 pHM6。上圖說明以考馬斯藍所染色之蛋白質吸潰物；下圖 說明相當的西方吸潰。以pHM6-反義3' rF5 A所轉感之細 胞，其所測及之Bcl-2較以空白轉感或以pHM6-有義rF5A所 轉感者為多。 圖3 5說明c-Myc之向上調控，其中COS-7細胞瞬時轉感以 含有全長大鼠細胞凋亡-誘生之elF-5 A(於有義方向）之 88794 -63 - 1324070 pHM6。上圖說明以考馬斯藍所染色之蛋白質吸潰物；下圖 說明相當的西方吸潰。以pHM6-有義rF5 A所轉感之細胞， 可測及之c-Myc較以pHM6-LacZ或空白轉感者為多。 圖36說明p53之向上調控，其中COS-7細胞瞬時轉感以含 有全長大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5 A(於有義方向）之 pHM6。上圖說明以考馬斯藍所染色之蛋白質吸潰物；下圖 說明相當的西方吸潰。在以ρΗΜ6-有義rF5 A所轉感之細胞 可測及較以pHM6-LacZ或空白對照組所轉感者更多之p53。 圖37說明一旦pHM6-全長大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5A在 COS-7細胞中表現，p53向上調控之相關性。在以抗-[HA]-過氧化酶探測之西方吸潰中，上圖說明以考馬斯藍所染色 之蛋白質吸潰物且下圖說明相當的西方吸潰。第一轉感較 第二轉感可偵測到更多之大鼠細胞凋亡-誘生之eIF-5 A。在 以抗-p53探測之西方吸潰中，A中之上圖說明相當之以考馬 斯藍所染色之蛋白質吸潰物，下圖說明以p53之西方吸潰。 在第一種轉感中所測及之p5 3，由以pHM6-有義rF5 A轉感的 細胞較在pHM6-LacZ或空白對照組所轉感者還多。於大鼠 細胞凋亡-誘生之eIF-5 A較少表現之第二轉感中，於以 pHM6-有義rF5A，pHM6-LacZ或空白對照組所轉感之細胞 中間，p53水平並無可測及之差異。 實例5 本實例證明，細胞凋亡-特異性elF-5 A可在具活性p5 3之細 胞中誘生細胞凋亡（RKO細胞），而無活性p53之細胞（RKO-E6細胞）亦然，顯示細胞凋亡-特異之eIF-5A可經由非P53路 88794.doc -64 - 1324070 徑啟動細胞凋亡。此點也支持吾等之論點，即其在上游作 用，並似乎可殺死各樣不同型式之癌。 本實例也顯示，eIF-5Al之活性位置是蛋白質之羧基末端 (即具有經截斷eIF-5Al之實驗），其大多含有RNA結合功能 部位。 再者，本發明也證明人類eIF-5A2大多是增殖性eIF-5A因 其無法誘生細胞凋亡。因此，咸信在人類資料庫中的二個 eIF-5A基因，細胞凋亡-特異性eIF-5Al是細胞凋亡基因，且 eIF-5A2是增殖性基因。 RK〇及RKO-E6細月包之培養 RKO(美國標準菌種收集所CRL-2577)，可表現野生型p53 之人類結腸癌細胞株，及RKO-E6(美國標準菌種收集所 CRL-25 78)是衍自RKO之細胞株，其中含有穩定整合之人類 乳頭狀瘤病毒E6致癌基因，其可引起正常p53水平及功能之 減低，可用於以轉感為基礎之實驗。RKO及RKO-E6細胞培 養在加有非必需胺基酸，伊耳爾氏鹽及L -穀胺酸之最低營 養要求培養基Eagle (MEM)。培養基中添加以1 0%胚牛血清 (FBS)及100單位青黴素/鏈霉素。細胞生長在37°C之5% C02 及95%空氣下之潮濕環境中。細胞每3至4天繼代培養，係 以0.25°/。胰蛋白酶及1 mM EDTA-溶液分離所黏附之細胞。 所分離之細胞以1 : 10至1 : 12之分裂比例分散至有新鮮培 養基之培養姐中。 人類eIF5A2之選殖 人類eIF5A2以RT-PCR分離自由RKO細胞分離之RNA，所 88794 -65 - 1324070 使用之引子係設計自GenBank中取得之人類eIF5A2序列（編 號XM-1134(H)。圖38提出由RKO細胞所分離之人類eIF-5A 與人類eIF-5A2序列之比對。RNA利用GenElute Mammalian Total RNA Miniprep套組（Sigma)分離自RKO細胞。所使用之 向前引子可擴大具有序列5'AAACTACCATCTCCCCTGCC 3· (SEQ ID ΝΟ:25)之eIF5A2，且反向引子具有序列5’ TGCCCTC AACAGGCTGAAAG 3'(SEQ ID NO:26)。所生成之 936 bp PCR產物繼代選殖至 pGEM-T Easy Vector (Promega)，並定 序。 pGEM-T Easy-eIF5A2構體再充作模板以產生eIF5A2 PCR 片段，使可在架構上繼代選殖至哺乳動物表現載體pHM6 (Roche)»用來擴大人類eIF5A2之向前引子是5' ATCAAGCTT GCCCACCATGGCAGACG 3，(SEQ ID NO:27)，且反向引子是 5' AACGAATTCCATGCCTGATGTTTCCG 3，(SEQ ID NO: 28) 。所生成之505 bp PCR產物再以Hind 3及EcoR 1水解， 並繼代選殖至pHM6之Hind 3及EcoR 1位置。 pHM6-截斷之eIF5Al之構築 為了決定eIF5Al之羧基-末端區對於其細胞凋亡-誘導活 性是否重要，可構築羧基末端刪除之eIF5Al。經截斷的 eIF5Al，可指導合成胺基酸1至127，可利用PCR產生，並 以pBS-大鼠eIF5Al為模板。向前的PCR引子是5' GCCAAGC TTTAATGGCAGATGATTTGG 3' (SEQ ID NO:22)，且反向引 子是 5' TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC 3，(SEQ ID NO: 29) 。所生成之390 bp PCR產物以EcoR 1及Hind 3水解，再 88794 -66- 1324070 繼代選殖至pHM6之EcoR 1及Hind 3位置。 轉感作用 可用於轉感實驗之RKO或RKO-E6細胞，培養在8孔洞室 培養玻片上（Falcon)，以應用於Hoescht染色，或在6孔洞盤 以供流體細胞計數器分析。細胞在添加有10 % F B S但無青 黴素/鏈霉素之MEM培養基中生長至70-80%融合狀。製備足 供8孔洞培養玻片-孔洞用之轉感培養基，係以22微升無血 清MEM稀釋0.425微克質體DNA，且混合物在室溫下培育15 分鐘。0.85微升之轉感試劑，LipofectAMINE (Gibco, BRL)， 稀釋於22微升無血清之MEM中，並在室溫下培育5分鐘。5 分鐘後，取LipofectAMINE混合物於DNA混合物中，並在室 溫下培育30至60分鐘。欲轉感的細胞以無血清之MEM洗一 次，再加44微升MEM至轉感培養基，並將之平覆在細胞上。 細胞再置回生長室中4小時。培育後，加88微升MEM+20% FBS至細胞中。細胞再培養44小時，並以Hoescht 33258如先 前所述地染色。在另一組實驗中，於8孔洞培養玻片上之 RKO或RKO-E6細胞以0.25微克/毫升放線菌素D於轉感後24 小時處理，再20小時後以Hoescht 20。以相同方式進行6孔 洞盤上之轉感，除了所有試劑均增加4.8 1倍。轉感於6孔洞 盤之RKO細胞於轉感後48小時收獲，再如下述行流體細胞 計數分析。 轉感效率之決定 以5-溴-4_氣-3-蜊哚基-β-D-咕喃半乳糖站（X-GAL)染色 經pHM6-LacZ-轉感之細胞可決定轉感效率。染以藍色之細 88794 -67 - 1324070

胞為可表現LacZ之轉感細胞，再以染成藍色之細胞數目除 以細胞總數計算出轉感效率。經轉感的細胞在轉感後染48 小時。細胞以PBS洗二次，再於室溫下以0.5%戊二醛/PBS 中固定10分鐘。細胞以1 mM MgCl2/PBS洗三次，再與染色 /谷液共培育[5 mM K4Fe(CN)6.3H2〇，5 mM K3Fe(CN)6，1 mM

MgCl2, 0_l%x_GAL於PBS]直到出現染成藍色之細胞為止。 Hoescht 染色 使用核染料，Hoescht’來標記出經轉感之rk〇及RK0-E6 細胞之核，以依據核斷裂及縮凝情形鑑定凋亡之細胞。使 用前才製備固定劑’即由3 : 1無水甲醇及冰醋酸之混合物 所組成。在培養玻片上生長之細胞培養基中加入等體積之 固足劑，並培育2分鐘。移出細胞中之培養基/固定劑混合 物，並丟棄，再於細胞中加入丨毫升固定劑。5分鐘後，丟 棄固定劑，於細胞中加入丨毫升新鮮的固定劑，再培育5分 鐘。丟棄固定劑且細胞風乾4分鐘，再加丨毫升H〇escht染料 (0.5微克/毫升H〇escht 33258於PBS)。經在暗處培育10分鐘 後’丢棄染色溶液，且玻片以去離子水洗3次歷1分鐘。洗 滌杈，在細胞中加入丨毫升河川以丨以、緩衝溶液（〇 〇21 Μ檸 樣酸 ’ 0.058 M Na2HP04.7H20 ; pH 5.6)，並在暗處培育 2〇 分鐘。丟棄緩衝溶液，且細胞風乾於暗處5分鐘，再移去分 隔培養玻片孔洞之各室。於玻片上加入數滴用於螢光之

Vectashield覆盖培養基（vect〇i_ Laboratories)，並覆上蓋破 片。染色之細胞在螢光顯微鏡下利用uv濾鏡具象之。將有 鮮明染色或斷裂核之細胞計為凋亡細胞。 88794 -68. 1324070 以流動細胞計偵測DNA斷裂情形 在細胞凋亡中產生之DNA片段，利用螢光素-FragELTM DNAk/f 裂偵測套組（〇nc〇gene Research prociucts)標以有勞 光素之去氧核嘗酸。於轉感後48小時，以跋蛋白酶化回收 在6孔洞培養盤中為各種構體轉感之細胞，再依操作指示固 定及標記之。簡言之，細胞以丨000 X g 4。〇下5分鐘使成團 塊’再於PBS中洗一次（8克/升NaCl，0.2克/升KC1，1.44克/ 升Na2HP〇4及〇·24克/升KH2PO小細胞再懸浮於4%甲醛/PBS 中’並在室溫下培育1 〇分鐘。細胞再次使成團塊，再懸浮 於1毫升80%乙醇中，並貯於4。(3下。於分析當日，1毫升已 固定之細胞（在1 X 1 〇6細胞/毫升）轉移至微量離心管内，細胞 再以1000 X g離心5分鐘使成團塊。成團塊之細胞再懸浮於 200微升 1 X TBS 中（20 mM Tris pH 7.6，140 mM NaCl)並在 室溫下培育1 0-1 5分鐘，細胞再次成團塊，並再懸浮於丨〇〇 微升之20微克/毫升蛋白酶κ中，及於室溫下培育5分鐘。細 胞使成團塊’再懸浮於1 〇〇微升1 X TdT平衡緩衝溶液中， 並在室溫下培育10-30分鐘。細胞再使成團塊（離心），並懸 浮於60微升TdT標記反應混合物中，並在暗處培育1_丨.5小 時。培育之後，細胞離心使成團塊，並以2〇〇微升1 X TBS 洗二次。細胞再懸浮於最終體積〇·5毫升1 X TBS内，並在配 備有4 8 8愛微米氬離子雷射源之流動細胞計上分析。 蛋白質萃取及西方吸潰法 分離自經轉感細胞以供西方吸潰分析之蛋白質，其中先 在PBS中洗滌細胞二次，再加1 50微升熱的SDS凝膠-填料緩 88794 •69· 1324070 衝溶液（50 mM Tris-HCl ’ pH 6·8 ’ 100 mM二硫異赤絲蕩醇’ 2% SDS，0.1 %溴酚藍及1 〇%甘油）。溶胞產物收集在微量離 心管中，加熱至95°C歷1 〇分鐘，再以13，000 X g離心1 〇分鐘。 上清液轉移至新鮮的微量離心管内，貯放在-20°C下直到使 用為止。 於西方吸漬法中，5微克或1 0微克之總蛋白質在12 % SDS-PAGE上分離。分出之蛋白質轉移至聚乙晞二氟化物膜 上。膜再於通斷溶液中培育1小時（5%脫脂乳粉，〇_〇2%疊氮 化鈉於PBS中）再以PBS-T(PBS+0.05% Tween-20)洗三次，歷 15分鐘。膜貯於4°C，PBS-T中一夜。次日於加溫至室溫後， 膜在1微克/毫升聚乙晞醇中阻斷30秒》膜在去離子水中潤 洗5次，再於5°/。牛乳/PBS之溶液中阻斷30秒。在與膜培育 前，一次抗體先在5%牛乳/PBS/0.025% Tween-20之溶液中 預培育3 0分鐘。 膜之吸潰或以來自Oncogene可確認p53之單株抗體 (Ab-6)，或以與人類eiF5Al (其生成自雞）c-末端同質之直接 拮抗合成肽（胺基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基）（SEQ ID NO:30)之多株抗體。p53單株抗體以0.1微克/毫升之稀釋度 使用，拮抗eIF5Al之抗體則以1 : 1000之稀釋度使用。與一 次抗體共培育60-90分鐘後，膜在PBS-T中洗3次，歷15分 鐘。二次抗體再稀釋於1%牛乳中，於PBS/0.025% Tween- 20 中，並與膜共培育60-90分鐘。當以p53(Ab-6)為一次抗體 時’可使用之二次抗體為山羊抗-老鼠IgG共桃至驗性稱酸 酶（Rockland)且在1 : 1〇〇〇稀釋度下。當以抗_eIF5A1為一次 88794 -70- 1324070 抗體時，則使用在1 : 1 〇〇〇〇稀釋倍數下之共軛至過氧化酶 之兔子抗-雞IgY(Gallus Immunotech)。與二次抗體培育後， 膜在PBS-T中洗3次。 使用二種偵測方法以展開吸潰物，比色法及化學發光 法。比色法僅當以p53(Ab-6)為一次抗體並配合鹼性磷酸酶 -共軛之二次抗體時才使用。具象化經結合之抗體係將吸潰 物培育在暗處中之0.33毫克/毫升硝基藍四銼（0.165毫克/毫 升 5-溴-4-氯-3-4 哚基磷酸鹽，100 mM NaCl，5 mM MgCl2 及100 mM Tris-HCl(pH 9.5))之溶液中。停止顏色反應，係 將吸潰物在2 mM EDTA/PBS中培育。針對其他所有的一次 抗體，使用化學發光偵測法，包括抗-[HA]-過氧化酶及抗 eIF5Al。使用 ECL Plus Western吸潰债測套組（Amersham Pharmacia Biotech)以偵測與過氧化酶-共輛之經結合抗 體。簡言之，膜略吸乾，再於暗處與40 : 1試劑A及試劑B 之混合物共培育5分鐘。膜吸乾，置二片醋酸酯紙片中，並 曝於X光底片下，於10秒至30分鐘之充份時間下。 圖39示出在瞬時轉感後，發生在RKO及RKO-E6細胞中凋 亡細胞之百分率。RKO及RKO-E6細胞瞬時感染以pHM6-LacZ或PHM6-eIF5Al。24小時後，細胞以0.25微克/毫升放 射菌素D或等量之甲醇（對照組）處理。細胞以Hoescht在20 小時後染色，再於螢光顯微鏡下利用UV濾鏡觀察。由於冷 縮之染色質而鮮明染色之細胞計為凋亡細胞。上述實驗顯 示，以放射菌素D處理之RKO細胞，並以pHM6-eIF5Al轉感 者，相較於以pHM6-LacZ轉感，而未以放射菌素D處理之細 88794 -71 - 1324070 胞，前者細胞凋亡增加240%。以放射菌素D處理，並以pHM6-eIF5Al轉感之RKO-E6細胞，和以pHM6-LacZ轉感但未以放 射菌素D處理之細胞比較下，細胞凋亡增加1 0 5 %。 圖40示出於瞬時感染後，發生在RKO細胞中細胞凋亡之 百分率。RKO細胞瞬時轉感以pHM6-LacZ，pHM6-eIF5 A1， pHM6-eIF5A2或pHM6-經截斷之eIF5Al。44小時後細胞以 Hoescht染色，再於螢光顯微鏡下利用UV濾鏡觀察。由於冷 縮之染色質而鮮明染色之細胞計為调亡細胞。以pHM6-eIF5Al轉感之細胞，相較於以pHM6-LacZ轉感之對照組細 胞，細胞凋亡增加25%。以pHM6-eIF5A2或pHM6-截斷之 eIF5A1所轉感之細胞，其增加情形並不明顯。 圖41示出瞬時轉感後，發生在RK0細胞之細胞凋亡百分 率。RK0細胞或未被轉感，或為pHM6-LacZ或pHM6-eIF5Al 所瞬時轉感。44小時後，細胞以Hoescht染色，再於螢光顯 微鏡下利用UV濾鏡觀察。由於冷凝染色質所致鮮明染色之 細胞被計為凋亡細胞。於校正過轉感效率後，被pHM6-eIF5Al轉感之細胞中有60%為凋亡細胞。 圖42示出瞬時感染後，RK〇細胞凋亡之流動細胞計數分 析。RK0細胞或未被轉感，或為pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A卜pHM6-eIF5A2或pHM6-截斷之eIF5Al所瞬時轉感。 48小時後回收細胞並固定之。反映出細胞凋亡之斷裂DNA 標以有螢光素-共軛之去氧核甞酸，並在配備有488毫微米 氬離子雷射源之流動細胞計上分析。在E出口下發生之螢光 係來自非-凋亡細胞，且在F出口發生之勞光來自進行細胞 88794 -72- 1324070 凋亡之細胞。表中示出進行細胞凋亡之細胞百分率，依各 出入口高峰下之面積為準所估算。經過在未轉感細胞之背 景細胞凋亡之校正及轉感效率之校正後，為pHM6_ eIF5A1 所轉感的細胞中有80%呈現細胞；周亡。以pHM6- LacZ， pHM6-eIF5A2或pHM6-截斷之eIF5 A1所轉感之細胞，呈現的 僅是背景水平之細胞凋亡。 圖43示出以RKO細胞中萃取出之蛋白質西方吸潰圖，其 係經0.25微克/毫升放線菌素d處理0，3，7，24及48小時。 5微克（於抗-elF5 A1)或1 〇微克（於抗-p53)之總蛋白質在120/〇 SDS-PAGE上分離，並轉移至聚乙稀二氟化物膜上。上圖示 出利用-p53為一次抗體之西方吸潰圖。中圖示出利用抗 -eIF5Al為一次抗體之西方吸潰圖。下圖示出用於抗_61卩5八1 吸潰物之膜，其中以考馬斯藍染色再行化學發光偵測，以 明示出等量之填料。P53及eIF5Al以放線菌素D處理均可向 上調控。 實例6 圖4 7示出在心臟組織上進行的實驗，以模擬人類心跳之 博動’接下來誘生心臟侵襲。圖49示出實驗室裝置。在心 臟瓣膜更換的手術中所移出的一片人類心臟組織，接上電 極。在心臟組織上接上小的法碼，使心博強度之偵測更容 易°電極可提供電流刺激，使組織開始博動。在誘生絕血 前’測度細胞凋亡-特異性eIF-5A(eIF-5a)及增殖性eIF-5A (eIF5b)之基因表現水平。見圖46，在絕血前之心臟組織中， 可產生低水平的eIF-5a及eIF5b，且其水平相當平衡。在此 88794.doc -73 · 1324070 期間，氧及二氧化碳分別以92.5%及7.5%在緩衝溶液中輸送 至心臟。之後’氧水平下降而氮水平上升，以誘生絕血且 最後是"心臟侵襲”。心臟組織停止博動。之後氧水平回至 正常，心臟組織以電刺激再次脈衝，而再次開始博動。在 "心臟侵襲"之後，再次測度細胞凋亡-特異性eIF-5a及增殖 性eIF-5A(eIF5b)之表現水平。此時，細胞凋亡-特異性eIF_5A 表現水平顯著增加，然而增殖性eIF-5A(eIF5b)之表現水平 卻顯著地較少。見圖46。 在"心臟侵襲"之後，心臟無法如此強烈地博動，可由所 接受之法碼較少壓縮/移動示出，由此顯示出心臟組織細胞 因有細胞凋亡-特異性eIF-5 A之存在，而被快速地殺死。 EKG結果示於圖4 8。在圖之左側示出正常的心跳（即絕血 前之心臟組織）。於"心臟侵襲”後（直線），及心跳之再啟動， EKG顯示由於肌肉細胞死亡而使活性下降。EKG示出心跳 強度有相當的損耗。 【圖式簡單說明】 圖1示出大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A 3,端之核苷酸序列 及所衍生之胺基酸序列。 圖2示出大鼠細胞凋亡-特異性eIF_5A cDNA 51端之核苷 酸序列及所衍生之胺基酸序列。 圖3示出大鼠黃體細胞凋亡_特異性eIF_5 a全長cDNA之核 钻酸序列。 圖4示出大鼠細胞调亡-特異性DHS cDNA 3_端之核苷酸 序列及所衍生之胺基酸序列。 88794 -74- 1324070 圖5為大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A cDNA全長核甞 酸序列與人類eIF-5A核：y：酸序列之比對（編號BC000751或 NM_001970，SEQ ID NO:3)。 圖6為大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A cDNA全長核苷 酸序列與人類eIF-5A核：y：酸序列之比對（編號NM-020390， SEQ ID NO:4)。 圖7是大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5 A cDNA與老鼠 eIF-5A核：y：酸序列之比對（編號BC003889)。老鼠核苷酸序列 (編號 BC003 889)是 SEQ ID NO:5。 圖8是大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A之衍生的全長胺 基酸序列與人類eIF-5A衍生之胺基酸序列之比對（編號 BC00075 1 或 NM_001970)。 圖9是大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A衍生之全長胺基 酸序列與人類eIF-5A衍生之胺基酸序列之比對（編號 NM_020390) ° 圖10是大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A衍生之全長胺基 酸序列與老鼠eIF-5A衍生之胺基酸序列之比對（編號 BC003889)。 圖11是大鼠黃體細胞凋亡-特異性DHS cDNA部份長度核 甞酸序列與人類DHS之核#酸序列之比對（編號BC000333 ，SEQ ID NO:8)。 圖12是大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A cDNA之限制舆 圖。 圖13是部份長度大鼠細胞凋亡-特異性DHS cDNA之限制 88794 -75· 1324070 舆圖。 圖14是總RNA以大鼠黃體細胞凋亡-特異性eIF-5A cDNA 經32P-dCTP-標記之3'端所探測之北方吸潰（圖14A)及溴化 乙錠染色凝膠（圖14B)。 圖15是總RNA以大鼠黃體細胞凋亡-特異性DHS cDNA經 32P-dCTP-標記之31端所探測之北方吸潰（圖15A)及溴化乙 錠染色凝膠（圖15B)。 圖16示出DNA階梯狀實驗，其中在注入PGF-2a後檢查超 速排卵之大鼠黃體内細胞凋亡之程度。 圖17是分離自細胞凋亡大鼠黃體之基因體DNA瓊脂糖凝 膠，示出以PGF-2a處理後之DNA階梯狀現象。 圖18是DNA階梯狀實驗，其中大鼠以亞精胺處理後再曝 於前列腺素F-2a(PGF-2a)，再檢查經超速排卵之大鼠黃體 中分散細胞凋亡之程度。 圖1 9示出DNA階梯狀實驗，其中大鼠以亞精胺及/或 PGF-2a處理後，檢查超速排卵之大鼠黃體中細胞凋亡之程 度。 圖20示出以32P-dCTP-標記之部份長度大鼠黃體細胞凋亡 -特異性eIF-5A cDNA所探測之大鼠基因體DNA之南方吸潰 圖。 圖2 1示出pHM6，一種哺乳動物表位標幟表現載體（Roche Molecular Biochemicals) ° 圖22示出COS-7細胞經抽離血清誘生細胞凋亡後，所分離 之總RNA，以32P-dCTP-標記之大鼠黃體細胞凋亡-特異性 88794 -76- 1324070 DHS cDNA之3'-未轉譯區所探測之北方吸潰（圖22A)及溴化 乙錠染色凝膠（圖22B)。 圖23是流程圖說明COS-7細胞瞬時轉感之步驟。 圖24是以pHM6轉感後，外來蛋白質在COS-7細胞中瞬時 表現之西方吸潰圖。 圖2 5說明由卡斯蛋白酶活性所反映之加強的細胞凋亡， 其中COS-7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A在 有義股方向之pHM6所瞬時轉感。 圖26說明由增加之DNA斷裂現象所反映之加強的細胞凋 亡，其中COS-7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5 A在有義股方向之pHM6所瞬時轉感。 圖27說明細胞凋亡之偵測，係由核斷裂增加所反映，其 中C0S-7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A在有 義股方向之ρΗΜ6所瞬時轉感。 圖28說明由核斷裂增加所反映之加強的細胞凋亡，其中 COS-7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A在有義 股方向之pHM6瞬時轉感。 圖29說明由磷脂醯基絲胺酸曝露所反映之細胞凋亡的偵 測，其中COS-7細胞為含有全長大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5A，於有義股方向之ρΗΜ6所瞬時轉感。 圖3 0說明由增加之磷脂趨基絲胺酸曝露所反映之加強的 細胞调亡’其中C Ο S - 7細胞為含有全長大鼠細胞调亡-特異 性eIF-5 A，在有義股方向之ρΗΜ6所瞬時轉感。 圖3 1說明由增加之核斷裂所反映之加強的細胞凋亡，其 88794 -77- 1324070 中COS-7細胞為含有全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5A，於 有義股方向之pHM6所瞬時轉感。 圖32說明加強之細胞凋亡，其中COS-7細胞為含有全長大 鼠細胞凋亡-特異性eIF-5 A，於有義股方向之pHM6所瞬時轉 感。 圖33說明Bcl-2之向下調控，其中COS-7細胞為含有全長 大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5 A，在有義股方向之pHM6所瞬時 轉感。圖33A是考馬斯藍染色之蛋白質吸潰圖；圖33B是相 當的西方吸潰圖。 圖3 4是考馬斯藍染色之蛋白質吸潰圖及相當的西方吸潰 圖，其中COS-7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5A於反義股方向，之pHM6所瞬時轉感，並以Bcl-2為探 針。 圖35是考馬斯藍染色之蛋白質吸漬圖及相當的西方吸潰 圖，其中C Ο S - 7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5 A，於有義股方向，之pHM6所瞬時轉感，並以c-Myc 為探針。 圖3 6是考馬斯藍染色之蛋白質吸漬圖及相當的西方吸潰 圖，其中C Ο S - 7細胞以含有全長大鼠細胞凋亡-特異性 eIF-5 A，於有義股方向之pHM6瞬時轉感，並以p53為探針。 圖37是pHM6-全長大鼠細胞凋亡-特異性eIF-5ASCOS-7 細胞表現之考馬斯藍染色之蛋白質吸潰圖及相當的西方吸 漬圖，其中利用抗-[HA]-過氧化酶探針，及pHM6-全長大鼠 細胞凋亡-特異性eIF-5A於COS-7細胞中之考馬斯藍染色之 88794 -78- 1324070 蛋白質吸潰圖及相當的西方吸潰圖，其中利用p53為探針。 圖38是分離自RKO細胞之人類eIF5A2與人類eIF5A2序列 之比對（Genbank編號 XM_113401)。 圖3 9示出於瞬時轉感後發生在RKO及RKO-E6細胞中之 細胞凋亡百分率。RKO及RKO-E6細胞為pHM6-LacZ或 pHM6-eIF5Al所瞬時轉感。RKO細胞以放線菌素D處理並以 pHM6-eIF5Al轉感，其在細胞凋亡上相較於以pHM6-LacZ 所轉感但未以放線菌素D處理之細胞增加240%。RKO-E6細 胞以放線菌素D處理，並以pHM6-eIF5 A1轉感，其細胞凋亡 之增加相較於以pHM6-LacZ轉感但未以放線菌素D處理之 細胞增加1 0 5 %。 圖40示出於瞬時感染後發生在RKO細胞之細胞凋亡百分 率。RKO細胞以 pHM6-LacZ，pHM6-eIF5Al，pHM6-eIF5A2 或pHM6-截斷之eIF5Al所瞬時轉感。以pHM6-eIF5Al轉感之 細胞在細胞.调亡上較以pHM6-LacZ所轉感者增加25%。對於 以pHM6-eIF5A2或pHM6-截斷之eIF5Al所轉感之細胞，此增 加並不明顯。 圖41於瞬時轉感後發生在RKO細胞上之細胞凋亡百分 率。RKO細胞或未轉感，或為pHM6-LacZ或pHM6-eIF5Al 所瞬時轉感《於校正轉感效率後，被pHM6-eIF5Al所轉感 之細胞中有60%是凋亡的。 圖42提出瞬時轉感後，RKO細胞凋亡之流動細胞計數分 析結果。RKO細胞或未轉感或為pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A卜pHM6-eIF5A2或pHM6-截斷之eIF5Al所瞬時轉感〇 88794.doc -79- 1324070 表中示出進行細胞凋亡之細胞百分率，其以在各入口之高 峰下面積為基礎而計算。於未轉感細胞中之背景細胞凋亡 及轉感效率校正後，以pHM6-eIF5Al轉感的細胞中有80%呈 現出細胞凋亡。為pHM6-LacZ，pHM6-eIF5 A2或pHM6-經截 斷之eIF5Al所轉感之細胞僅呈現背景水平之細胞凋亡。 圖43示出以0.25微克/毫升放射菌素D處理0，3，7，24及 48小時後自RKO細月包萃取之蛋白質西方吸潰圖。上圖示出 利用抗-p53為一次抗體之西方吸潰圖。中圖示出利用抗 -eIF5Al為一次抗體之西方吸潰圖。下圖示出用於抗-eIF5Al 吸潰之膜，其染以考馬斯藍，於化學發光偵測後可明示出 等量之填料。P5 3及elF 5 A1經放線菌素D處理均被向上調控。 圖44之橫線圖示出細胞凋亡-特異性eIF-5A(eIF5a)及增殖 性eIF-5A(eIF5b)均可在心臟組織中表現。心臟組織取自接 受冠狀動脈迴路移植（CABG)之病人。eIF5a之基因表現水平 (淺灰橫線）與eIF5b比較（暗灰橫線）。X軸為被鑑定之病人數 目。Y軸是18s之微微克/毫微克（微微克之傳訊RNA於毫微 克核糖體RNA 18S上）。 圖45橫線圖示出細胞凋亡-特異性eIF-5A(eIF5a)及增殖性 eIF-5A(eIF5b)均表現在心臟組織。心臟組織取自接受瓣膜 置換之病人。eIF5a(淺灰橫線）之基因表現水平與eIF5b(暗灰 色橫線）比較。X軸是病人鑑定數。Y軸是微微克/毫微克之 18s(微微克傳訊RNA於毫微克核糖體RNA 18S)。 .圖46之橫線圖示出由即時PCR測度之細胞凋亡-特異性 eIF-5A(eIF5a)對增殖性eIF-5A(eIF5b)，於絕血前心臟組織及 88794 -80- 1324070 絕血後心臟組織之基因表現水平。Y軸是微微克/毫微克之 1 8s(微微克傳訊RNA於毫微克核糖體RNA 1 8S上）。 圖47圖解示出在心臟組織上進行之實驗。心臟組織曝於 正常氧氣水平下’再測度細胞凋亡-特異性eIF-5 A(eIF5a)及 增殖性eIF-5A(eIF5b)之表現水平。之後，遞送至心臟組織 之氧里減少’因此可5秀生低氧及絕血，最終造成心臟組織 中之侵襲。測度細胞凋亡-特異性eIF-5A(eIF5a)及增殖性 eIF-5A(eIF5b)之表現水平’再與經絕血受損前之心臟組織 表現水平比較。 圖48示出誘生絕血前及後之心臟組織EKGS。 圖49示出貫驗室工作台，上有圖47所示之實驗裝置。 88794 -81 - 1324070 序列表 <uo>美商新諾斯柯科技公司 <120>用於調控細胞凋亡之核酸、多肽及方法 <130 10799/42 <140〉 092129428 <141> 2003-10-23 <150〉10/277,969 <151> 2002-10-23 <160> 30 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1139 '*

<212> DNA <213> 鼠(屬） <220> <221> CDS <222> (33) .. (494) <400> 1 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 Met 1 Ala Asp Asp Leu 5 Asp Phe gag aca gga gat gca ggg gcc tea gcc acc ttc cca atg cag tgc tea 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 ate gtc gag atg tet act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 88794 1324070 gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp * 60 65 70 ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat 293 lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 85 gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tcc ctg etc cag 341 Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin 90 95 100 gac agt ggg gag gta ega gag gac ett cgt ctg ect gag gga gac ett 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate 437 Gly Lys Glu He Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu He 120 125 130 135 aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag gcc 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150 atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534 Met Ala Lys atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594

atttatttga cgttttattc tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654 ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714 ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774 cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834 gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894

ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954 acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014 atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074 atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134 aaaaa 1139

<210> 2 <211> 154 <212> PRT •<213> 鼠(屬） <400> 2

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 15 l〇 15 88794 1324070

Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys He Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe 50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu 工le Gly lie Gin Asp 85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 3 <211> 462 <212> DNA <213> 人 <400> 3

atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 4 <211> 462 <212> DNA <213> 人 <220> <221>經修_的驗基 <222> (455)..(456) <223> a, t, c or g <400> 4 atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 88794 1324070 cagtgctcgg ccttgcgcaa aaaeggette gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 ctgctgacag aaactggtga agttegtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctnngcaa at 462 > > > > 0 12 3 IX 1i IX 2 2 2 2 < < < < 2 6 4 Ά i\ <400> 5 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt etaettegaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa' gatatetgee cgtcgactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggea tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtaegagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 aaggagattg ageagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 6 A 660DN鼠 > > > > 0 12 3 1 1 ·1 1 2 2 2 2 < < < < (1 <220> <221> CDS <222> (1)..(453) <400> 6 get gtg tat tat tgg gee cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pro 15 10 15 gca etc aca gac ggc tea ctg ggt yac atg ate ttt ttc cat tee tat 96

Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac ate gtt gaa gac ctg egg etc ate 144

Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45 aac atg cag gee att ttc gee aag ege act ggg atg ate ate ctg ggt 192

Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60 gga ggc gtg gtc aag cac cac ate gee aat get aac etc atg egg aat 240

Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 · 70 75 80 . · gga get gac tac get gtt tat ate aac aca gee cag gag ttt gat ggc 288

Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly ' 85 90 95 -4- 88794 1324070 tea gac tea gga gee egg cca gat gag get gtc tee tgg ggc aag ate 336

Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110 egg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat get gat gca tet ctg gtt 384

Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125 etc ccc ttg ctg gtg get gag aca ttc gee caa aag gca gat gee ttc 432

Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 aga get gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggettetg 483

Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 aaa 606

<210> 7 <211> 151 <212> PRT <213> 鼠(屬） <400> 7

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pro 15 10 15

Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30

Lys Asn Pro Gly Leu VaX Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45

Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met; lie lie Leu Gly 50 55 60

Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80

Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 85 90 95

Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro· Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110

Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125

Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 88794 1324070

Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 <210> 8 <211> 453 <212> DNA <213> 人 <400> 8 tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac

<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 . <220> … <223> .人工序列之說明：引子 <220> <221>經修飾的驗基 <222> (12) <223> a, t, c or g <400> 9 tcsaarachg gnaagcaygg

<210> 10 <211> 42 -<212> *DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 10 gcgaagcttc catggcC-C^5· gttttttttt tttttttttt tt

<210> 11 <211> 972 <212> DNA <213> 鼠(屬） <220> <221> CDS <222> (1) . . (327) 6- 88794 1324070 <400> 11 teg aag acc ggt aag cac ggc cat gee aag gtc cat ctg gtt ggt att 48

Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 l〇 15 gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat ate tgc ccg teg act cat 96

Asp He Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp He Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144

Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu He Gly 35 40 45 ate cag gat ggg tac eta tcc ctg etc cag gac agt ggg gag gta ega 192 lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60

gag gac ett cgt ctg cct gag gga gac ett ggc aag gag att gag cag 240

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin 65 70 75 80 aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate aca gtg ctg tee gee atg 288

Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 aca gag gag gca get gtt gca ate aag gee atg gca aaa taactggctt 337

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105 ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397 tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457 caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517 gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577

ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637 gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697 tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757 gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817 ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa taitgaiaaeiea aeaLaadaaaa eiaaaa 972

<210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> 鼠(屬) 88794 1324070 <400> 12

Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 1 5 10 15

Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 .Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly 35 40 45 lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin 65 70 75 80

Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu He Leu He Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys X00 105 <210> 13 <211> 24 <212〉·DNA <213>人工序列 <220> <223> 1人工序列之說明：引子 <400> 13 caggtctaga gttggaatcg aagc

<210> 14 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <22Q> <223>人工序列之說明：引子 <400> 14

atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc <210> 15 <211> 489 <212> DNA <2i3> 鼠(屬） <220> <221> CDS <222> (33) . . (485) 88794 53 <400> 15 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 gag aca gga gat gca ggg gcc tea gcc acc ttc cca atg cag tgc tea Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 ate gtc gag atg tet act: teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat Val His Leu Val Gly He Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp • 60 65 70 ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn He Lys Arg Asn 75 80 85 gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tcc ctg etc cag Asp Phe Gin Leu lie Gly He Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin 90 95 100 gac agt ggg gag gta ega gag gac ett cgt ctg cct gag gga gac ett Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu 巨ro Glu Gly Asp Leu 105 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie 120 125 130 135 aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag get Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150 egag 101 149 197 245 293 341 389 437 485 489 <210> 16 <211> 151 <212> PRT<2U>鼠(屬） <400> 16 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 15 10 15 Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 88794 9- 1324070

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe 50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp 8S 90 95 _ Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 145 150 <210> 17 <211> 20 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>〗人工序列之說明：引子 \ <400> 17 gtctgtgtat tattgggccc 20 <210> 18 . <211> 42 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 18 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42

<210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 19 ttgaaggggt gaggaaaa 18 10- 88794 1324070 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>人工序列之說明：引子 : <400> 20 ttgagtggga taaag 15

<210> 21 <211> 18 <212> DNA <220><223>人工序列之說明：引子 <400> 21 aatcatctgc cattttaa 18 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列. <220><223>人工序列之說明：引子 <400> 22 gccaagctta atggcagatg atttgg 26 <210> 23 <211> 25 <212> DNA<213>人工序列 <220><223>人工序列之說明：引子 <400> 23 ctgaattcca gttattttgc catgg 25

<210> 24 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>人工序列之說明：引子 88794 -11 - 271324070 <400> 24 aatgaattcc gccatgacag aggaggc <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列. <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 25 aaactaccat ctcccctgcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 . <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 26 tgccctacac aggctgaaag 20 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列. | <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 27 | atcaagcttg cccaccatgg cagacg| 26 <210> 28 <211> 26 ' <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：引子 <400> 28 aacgaattcc atgcctgatg tttccg 26 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 88794 -12- 251324070 <220> <223> :人工序列之說明··引子 <400> 29 tccgaattcg tacttctgct caatc

<210> 30 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列.· <220> <223>人工序列之說明：合成的肽 <400> 30

Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr 1 5 10 15

Asp -13· 88794

Claims (1)

1324070 第092129428號專利申請案 年月 R修(更)正本 申請專利範圍替換本(98年12月） ，名 拾、申請專利範圍： 一 1. 一種於活體外鑑定哺乳動物組織絕血發生率之方法，此 方法包括 a. 於活體外偵測組織中細胞凋亡-特異性eIF-5A (eIF-5Al)及增殖性 eIF-5A(eIF-5A2)之 mRNA水平， b. 於活體外比較eIF-5Al mRNA與eIF-5A2 mRNA於組 織中之水平，及 c. 於活體外eIF-5Al mRNA相較於eIF-5A2 mRNA有較 高水平即與組織絕血發生率有關聯。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中於活體外的組織是 心臟組織。 88794-981225.doc