TWI310052B - Crystal structure qc 6.5 of soluble glutaminyl cyclase - Google Patents

Description

1310052 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種晶體結構，特別係關於一種麩酸胺環化酵 素的晶體結構。 【先前技術】

在幾種生物活性神經胜肽、荷爾蒙及細胞激素之分泌路徑的 成熟化過程中’ N端焦麩胺酸(N-temiinalPGhi)的形成是重要的 後轉譯或共轉譯修飾。在形成這些調節胜肽的適當構型時，需 要N端焦麩胺酸與其受體結合及/或保護這些胜肽的n端不受 外胜肽分解酶（exopepetidase)分解（Van Coillie等人，

Biochemistry 37: 12672-12680 (1998); Hinke 等人,J. Biol. Chem. 275: 3827-3834 (2000))。N端焦麩胺酸係由其麩胺醯基前驅物的 N端環化所形成。而麵酸胺環化酵素(glutaminyl cyclase, QC)貝1J 係負責此後轉譯修飾的催化劑(Fischer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84·· 3628-3632 (1987); Busby 等人，J. Biol· Chem. 262: 8532-8536 (1987)) ° (^历0 2.3.2.5)係一種轉醯酶批711!^1^6瓜368)，來自動物或 來自植物均有(Fischer 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 84: 3628-3632 (1987); Busby 等人，I Biol· Chem. 262: 8532-8536 (1987); Oberg 等人，Eur.J.Biochem. 258: 214-222 (1998))。在 哺乳類動物的神經内分泌組織中，例如下視丘(hypothalamus)與 腦下垂體(pituitary)可發現高量之QC (Busby等人,J. Biol. Chem. 1310052 262: 8532-8536 (1987); Sykes > FEBS Lett. 455： 159-161 (1999))。無論來自酵母菌或甚至來自人類之Qc，其胺基酸序 列具有高度保留性(highly conserved)。雖然各研究報告顯示來自 動物之QC與來自植物之QC的分子量類似，即介於， 卻發現來自動物的QC具有與來自植物的Qc明顯不同的結構 與蛋白貝穩疋性(Oberg 專人，Eur. J. Biochem. 258. 214-222 (1998); Schilling 等人，Biochemistry 41: 10849-10857 (2002))。截

至目箣雖沒有關於來自細囷QCs的報導，但來自哺乳類動物的 QCs曾被預測應該具有與細菌雙鋅胺基胜肽酶 double-zinc aminopeptidase)有著高度之相似性(schilling 等人,j. Biol. chem. 278: 49773-49779 (2003); Booth # A, BMC biol. 2: 2 (2004))。 數種人類基因性疾病，例如多因性荷爾蒙病變之骨質酥鬆 症，其特徵為骨頭組織之骨質量減少與微結構退化(Stewart等 人，J. Endocrinol. 166: 235-245 (2000))，顯示係由 qc 基因的變 異所造成。QC的編碼基因(QPCT)位在染色體2P22.3上，在此 區域内分析十三個單一核普酸多形性（single nucleotide polymorphism)，顯示與成人女性骨質疏鬆症之易感受性 (osteoporosis susceptibility)有顯著的關聯性(Ezura 等人，J. Bone

Miner. Res. 19: 1296-1301 (2004))。在這些單一核苦酸多形性 中’ R54W在統計上呈現與骨質疏鬆症具有最明顯的關係，並 1310052 顯示其係透過下視丘_腦下垂體_性腺中樞系統影響而發病 (Ezura 等人，J. Bone Miner. Res. 19: 1296-1301 (2004))。

有趣的是，QC也催化N端焦麩胺酸之環化作用，導致焦麵 胺酸的形成(Schilling 等人，FEBS Lett. 563: 191-196 (2004))。此 反應可能與數個斑形成胜肽(plaqUe_forming peptides)之形成有 關，例如其與在阿茲海默症中扮演重要角色的澱粉樣β胜肽 (amyloid-β peptide，Αβ peptide)及類膠原蛋白質阿茲海默殿粉樣 斑成为（collagen-like Alzheimer amyloid plaque component， CLAC)有關(Morgan 等人，pr〇g. Neurobiol. 74: 323-349 (2004); Hashimoto 等人.，EMBO J. 21: 1524-1534 p〇02))。含 N 端焦麩 胺酸的胜肽，例如pGlu3-Ap胜肽，是神經炎性老年斑(neuritic plaques)之核仁内澱粉樣β胜肽的主要部分(Saido等人，Neur〇n 14: 457-466 (1995); Kuo 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 188-191 (1997); Russo 等人，J. Neurochem. 82: 1480-1489 (2002)) °N端焦麩胺酸會增加這些胜肽的疏水性、蛋白質分解 穩定性及神經毒性(Russo 等人，J. Neurochem. 82: 1480-1489 (2002); Harigaya 等人，Biochem. Biophys. Res. Comrmrn. 276: 422-427 (2000)) ’可能造成在數種老年斑塊(seniie piaqUes)累積 過多的焦楚胺酸-殿粉樣β胜狀，因此加速神經退化疾病的發生。 截至目前為止’關於來自人類與動物的QC之特性與結構有 數種不同理論假設。本發明則提供一種游離形式的qC晶體結 1310052 構、QC的活性部位或催化核心的結構、辨識qc之抑制劑的方 去以及合理设计對抗QC相關疾病之抑制劑的結構。 【發明内容】 1 本發明一方面提供舰胺環化酵素_啦_1 Cyclase, QC)的 晶體結構。 本發明另-實侧提供—晶體組成物，其包含—複合物，該 複合物包括至少- QC分子及與該QC分子接合、交互作用或

結合的另'~分子。 本發明另-方面提供—種_麩酸胺環化酵素(Qc)之抑制劑 的綠。該方法包括⑻製備Qc蛋白f，較佳為一具有序列識 另域1中第33至361個胺基酸殘基的胺基酸序列之多肽，其中 =多肽具有-四面分別與序列識別號〗中第⑼、搬、33〇、個 版基酸殘基以及水分子配位之鋅離子之活性雜；⑼使該多狀 f待測抑制劑接觸形成Qc-抑制劑複合物；⑻產生由步驟(b)所 =QC抑粧複合物的三維_ ’針具有可與鋅離子結合的 只Λ A(imidazole nitrogen)之待測抑制劑則鑑識為qC的抑制 劑。 本發明再一方面提供—種製備QC晶體的方法。包括⑻表現

Qc蛋白$，峨化Qc蛋自質；及⑹結晶^蛋白f而形成qc 晶體。 【實施方式】 爲使本發咖容清楚緖，對所使_-些專有名詞定義如 1310052 下。 」‘活性部位”-辭係指在分子體内能與另一分子體進入穩定之 父互作用的特定區域(或原子)。該名詞在特定實施例也係指盘另 -分子直接參與㈣-分子特定結合之大分子岐應部份。在 其他實施例中，-結合部位可包含或定義為在擅叠多狀内一個 或多個胺基酸殘基的三維排列。 “類似物”-辭係指-藥物或化學化合物，其結構與另一藥物 ^ 或化學化合物在某—方面錢，但其化學及生祕質可能類似 或不同。 “座標”或“結構座標’’ 一辭係指由晶體型之蛋白質或蛋白質 複合物原子之單色X射線束繞射所得與其型態有關之數學公式 所導出的卡式座標(Cartesian coordinates)。利用該繞射數據計算 晶體之重複單兀的電子密度圖，接著使用電子密度圖來建立分 子或分子複合物之個別原子的位置。 $ “同源體(h_lQgue)，，—辭係指蛋白質、多肽、寡胜肽或其部 分，具有與序列識別號1所述QC之胺基酸序列同—性 (identity)，或本文中所述的活性部位、或結合蛋白質的任何功 能性或結構性區位，其中序列識別號1為人類Qc的一部分胺 基酸序列。 ς基質”一辭係指酵素所作用的任何分子，根據本發明，該基 質係與QC之活性部位結合而形成QC-基質-複合物。 1310052 ‘‘成熟區位”一辭係指包括QC蛋白質或類似物之一部份或一 片段’其包含活性或催化部位；也就是具有序列識別號1中第 33至361個胺基酸殘基的胺基酸序列之多肽。 “根均方差” 一辭係指平均值誤差平方的算術平均之平方 根’是一種表達趨勢或目標之誤差或變異的方式。

與序列識別號1之多肽序列有關的“變體，，一辭包括一個或 多個胺基酸之替代、變異、修飾、取代、刪除或添加，無論是 取自或得到一個提供具有QC活性之蛋白質的最終多肽序列之 序列。 本發明的揭露内容將使用下列胺基酸的縮寫，A=Ala=丙胺酸 (Alanine)、T=Thr=穌胺酸(Threonine)、V=Val=擷胺酸(Valine)、 C=Cys=半光胺酸(Cystein)、L=Leu=白胺酸(Leucine)、Y=Tyr=赂 胺酸(Tyrosine)、I=Ile=異白胺酸(Isoleucine)、N=Asn=天門冬隨 胺(Asparagine)、P=Pro=脯胺酸(Proline)、Q=Gln=麵胺醯胺 (glutamine)、F=Phe=苯甲胺酸(Phenylalanine)、天門冬胺 酸(Aspartic acid)、W=Trp=色胺酸(Tryptophan)、E=Glu=麩胺酸 (Glutamic acid)、M=Met=甲硫胺酸(Methionine)、K=Lys=離胺酸 (Lysine)、G=Gly=甘胺酸(Glycine)、R=Arg=精胺酸(Arginine)、 S=Ser=絲胺酸(Serine)、H=His=組胺酸(Histidine)。 A.複製、表現及純化 編碼QC的核苷酸序列或其功能性片段、衍生物可插入適合

10 1310052 載體。其包含轉錄與轉譯該插人蛋㈣編碼序列所需元 者使用雜藝習知方法將載體送進所需的宿主細胞中。 關於QC的選殖、表現與純化之方法之詳細内容，請參照美 國專利申請案號11/331J04的内容。 B·晶體結構 X射線結構座標定義了空間中點的獨特構型，熟知此技術之 人士 I輕易瞭解蛋白質或酵素/基合物的—組結構座標為 -組疋義二維構型的點。而只要原子座標間的距離與角度維持 必要性的姻’便可由完全不同組的座標定義相似或相同的構 型。

二維資料可以由單一指令或一組指令產生，如產生三維結構 或結構圖像表示的電腦程式或指令所產生。圖像表示能由市面 上可取得之軟體程式產生或呈現，如SOLVE、RESOLVE (Terwilliger 等人，Methods Enzymol. 374: 22-37 (2003))、Ο (Jones 等人,Acta Ciystallogr.A47: 110-119 (1991))、PROCHECK (Laskowski 等人，J. Appl. Crystallogr. 26: 283-291 (1993))、 MOLSCRIPT (Kraulis 等人，J. appl. crystallogr. 24: 946-950 (1991))、Raster3D (Meirit & Bacon 等人，Methods Enzymol. 277: 505-524 (1997))及 GRASP (Nicholls 等人，Proteins 11: 281-296 (1991))，文中併為相關參考資料的。 本發明提供QC多肽的晶體結構，多肽包括QC蛋白質，較

11 1310052 SUbStrate)具有麵酸胺及麵胺酸環化酵素活性。在阳μ產生的 晶體之非對稱單元包含兩個人類qC分子，彼此之間具有根均 方差(所有C原子)為〇. 368 Α。該球形結構顯示一大小為63 χ % Ml人之-混合α/β折疊。在α螺旋與ρ平面分別具有達鳩與 ⑽的胺基酸殘基，而在310-螺旋區域具有6%的胺基酸殘基。 第3Α圖係顯示人類qC結構的完整圖，其中中心的六個ρ 鏈為橘色，位在頂端、底端與側邊的α螺旋分別為青綠色、紫 紅色與黃色。鋅離子以黃色球體顯*，以球_棍模_alland‘也 model)描繪與鋅配位的殘基，^54(精胺酸54)與硫酸鹽離子。 與催化中心鄰接的捲曲與環部分為綠色，而與活性部位不相連 的部分為灰色，灰點更代表序列識別號丨之第183至188個胺 基酸殘基的不規則區域。第3B圖繪示了人類qc結構之拓樸結 構圖(topology)，其中二級結構元件的色碼與第3A圖相同。

請參照第3A圖與第3B圖兩圖，該結構具有開放的三明治拓 樸結構’其包括由兩個α螺旋(α7與α9)及對面的六個額外α螺 旋(α2, α3, α4, α5, α6與α1〇)所包圍的中心六鏈(3平面，且位於β 平面側邊上其他兩個α螺旋(αΐ與α8)之側面(第3Α圖）。扭曲的 β平面係由兩個反向鏈(βΐ與β2)及四個同向鏈(β3, β4, β5與β6) 所形成’構成分子的疏水核心(hydrophobic core)。該結構的捲曲 與環區域代表所有殘基的42%，其中一半為活性部位的主要成 分(第3B圖）。在pH 6.5與pH 8.0的結構基本上相似，而在pH

13 1310052 、生刀子或其部分之三維結構或三維圖像表示的市面上可 講得或-般公眾可取得之軟體來達成。 q月提i、種識別QC之抑制劑的方法，包括下列步驟： ⑻製備—具有序列識別號1中第33至36i絲酸絲的胺 基酸序列之多肽，其巾該多肽具有—四面分別與序顺別號1 第59、202、330個胺基酸殘基以及水分子配位之鋅離子之 活性部位；

(b) 使该多肽與待測抑制劑接觸形成QC_抑制劑複合物； (c) 產生由步驟(b)所得qC_抑制子複合物的三維模型； 其中具有可與鋅離子結合的咪唑氮(imidaz〇le nitr〇gen)之待 測抑制劑則鑑識為QC的抑制劑。 該活性部位可進一步包括序列識別號1中第201、207、248、 305、325及329個胺基酸殘基。

根據本發明實施例，QC的活性部位包括水分子、一四面分 別與序列識別號1中第159、202、330個胺基酸殘基及序列識 別號1中第160個之胺基酸殘基配位之鋅離子，該序列識別號 1中第160個胺基酸殘基與序列識別號丨中第ι59個胺基酸殘 基形成肽鍵。在另一實施例中’此肽鍵係以多個氫鍵所安定且 具有順式構型。 在又一實施例中’ QC的活性部位並包括由序列識別號1中 第 144、146、154、249、303、321、325 及 329 個胺基酸殘基 15 • «Μ 1310052 所排列的疏水袋(hydrophobicpocket)。此外，活性部位更包括鄰 近疏水袋的硫酸鹽離子，其中硫酸鹽離子係以氫鍵與序列識別 號1中第144、206、207、330個胺基酸殘基及至少兩個水分 子連接。 QC/待測抑制劑複合物的三維資料同樣也可以由單一或一組 才曰令產生，如產生三維結構或結構圖像表示的電腦程式或指 令。可以市面上可取得軟體程式產生或呈現圖像表示，例如用 於決定QC晶體結構及QC/QC基質複合物結構之方法中所述的 軟體程式。 抑制劑包括但不限於咪唑衍生抑制劑，如乙烯基咪唑 (1 -vinylimidazole)、N-苄基咪嗤(1 -benzylimidazole)及 Ν-ω-乙酰 組織胺(Ν-ω-acetylhistamine)。例如，與人類qC之鋅離子具有 良好接合能力並與大型疏水取代基結合的富含電子親核性物 (electron-rich nucle〇phile)也可能是有效QC抑制子的結構基 礎如第5B圖至第5D圖所示，抑制劑的結合造成活性部位袋 内/、個水分子的移除，包括由抑制劑的咪唑氮取代鋅配位的水 分子。 、Qc結構座#或由座標所產㈣三_像表示可以配合電腦 、行不同用途，包括辨識QC的抑制劑。也可使用不同運算方 法巧斷分子或其活性雜的三維結顺全部或部分QC或其活 1生基是否結構相同。熟知此技藝者可使用目前既有的軟體應用 16 1310052 程式實行此方法。 E. 製造麩酸胺環化酵素晶體的方法 本發明提供-雜造人類qc晶體的方法。 根據本發_-實施例，製造域QC晶體的方法包括:⑻ 表現QC蛋白質；⑼純化qC蛋白質；以及⑹結晶蛋白質以 形成人類QC晶體。qC蛋白質較佳係以懸式擴散法 (hangiiig-drOp vapoi· diftUsiGn method)所結晶。 F. 篩選藥物 -旦可能的基質被辨識出來’可從多數大型化學公司市面上 可取得的化合物軸行轉，或者可錄錢（s贼_加 novo)該可能的基質。 當適合的藥物被辨識出來’可生產複合晶體(c〇_crystai)，包 括由QC晶體及藥物所形成之複合物。該複合晶體進行X射線 繞射以決定QC/藥物之複合物的晶體結構。 本發明也涵蓋了基質，較料在此職的抑軸，治療 哺乳類動物(較佳為人類)之特定疾病的方法。 本發明將由以下之實例做進—步·，但不應以此限定本發 明之範圍。 實例1:人類QC的表現與純化 由人類骨鑛cDNA庫(Clontech ,1丨旦从' .,,.λ cft，山不城，加州）以聚合_鏈反 應(1^)放大編碼的eDNA ’ _含之前於台灣專利申

17 1310052 請案第〇94132349號所述之數個修飾的沖⑽表現載體 (Novagen，達雜闕，_)，在切㈣細胞喊現成熟酵 素（殘基33-361)。利用非營養需要型的實驗流程步驟 C__hie __)在大腸#8巾產生料曱砸胺酸 (SeMet-labeled)的蛋自冑。並以原錢自f _之方賴化。此 外’使用快速轉換定位點突變套件伽船哪 mutagenesis kit) (Stratagene，拉荷雅，力〇州)建構人類qC變體， 並以野生型人類QC相同的方式表現並純化。 實例2:人類QC的晶體 將，，’屯化的人類QC ;辰縮至g-ίο毫克/毫升(mg/mL)並於25°c 以懸式擴散法結晶。使用等量的蛋白質溶液及包含i况8 M硫 酸胺、4%二氧陸圜及？116 5之1〇〇遍施8緩衝液的貯存器 (reservoir)產生野生型、標示甲硒胺酸以及突變型人類Qc的菱 形六面晶體。pH 8.0的情況則係以Tris-HCl取代貯存器内的 MES緩衝液。 在結合基質形式的例子中，將E201Q變體的晶體(在pH7〇 成長)浸入包含75%母液、25%甘油及1.1M甦胺酿酸第三丁 基酯的溶液1.5小時，在如表〗所列的不同之同步光束線 (syndirotron beamlines)進行χ射線繞射實驗，在將晶體嵌在X 射線機之前’騎時浸人包含la%甘油(ν/ν)作為冷絲護劑 18 1310052 的母液，使用 HKL 套件(Otwinowski 等人，Meth〇ds Enzym〇1 276: 307-326 (1997))處理並按比例排列所有的繞射資料，這些晶 體的空間群為R32,具有a斗=119人、c=333人的特定單元晶格，

其中非對稱單元包括兩個人類QC分子

波長（A) 空間群 解析度（A) 總觀察値 獨特反射値 平均重複次數<redundaiK：y> 完整度（％) //σ(7) Rtnerge (%) 優質與Z値（SOLVE) 0.9792 497057 84184 SeMet-QC λ2 SeMet-QC λ3 0.9794 0.9750 i?32 50-1.8 (1.86-1.80^ 497051 497136 84209 84238 5.9 (5.6) 100.0(100.0) 25.2 (4.9) 27.4 (4.9) 6.4 (34.1) 6.2 (33.2) 實例3:人類QC的晶體結構決定及修正 利用程式 SOLVE (Terwilliger 等人，Methods Enzymol. 374: 22-3 7 (2003))以多重波長異常繞射定相位法(MuWwavelength anomalous diffraction phasing meth〇d)解析 ρΉ 6 5 的人類 qC 之 結構。在波長0.9792 A(峰區)、0.9794 A(側邊區)及0.9750 A(高 能量偏遠區)(參照表1)收集了解析度範圍在2〇至2 〇 A的多重 波長異常繞射資料後，在非對稱性單元成功的找到所有14個砸 原子位置卩地後進行程式RESOLVE (Terwilliger等人，Methods \

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Enzymd. 374: 22·37 _3))。其中藉由溶解鋪肋⑽偏 flattening)修飾最初電子密度，並且使用解析度5〇至18人的整 個多重波長異常繞射資料自動建立83%以上的蛋白質模型，使 用私式 Ο (Jones •人，Acta Crystallogr. A47: 110-119 (1991))對

照野生型晶體在解析度1.66 A的資料組，手動建置其他模型並 進一步修正。使用修正模型對變體、不同pH值及結合基質與 結合抑制劑形式的同晶型結構定相位。對每一結構，完成以程 式〇完成反覆循環的模型建立及以晶體核磁共振系統 (crystallography NMR system)的演算修正等人，Acta

Crystallogr· D 54: 905-921 (1998))。利用 5%反射計算 R—值。使 用程式PR0CHECK檢查修正之結構化學計量品質(Lask〇wski et al·，J. Appl. Crystallogr· 26: 283-291 (1993))。每一最終精鍊結 構包括人類QC分子所有329個殘基中的323個殘基；第183 至188個殘基為不規則區域。非常規則之水分子位於且併入模 型中。使用例如 MOLSCRIPT (Kraulis 等人，J. appl. crystallogr. 24: 946-950 (1991))、Raster3D (Merrit & Bacon 等人，Methods Enzymol· 277: 505-524 (1997))及 GRASP (Nicholls 等人， Proteins 11·· 281-296 (1991))的程式產生分子圖形。 實例个·人類QC的活性部位結構 活性部位主要係由 α3-α4、β3-α5、β4-β7、β5-α8、α8-α9 及 20 \ 1310052 β6-α10之間的六個環所形成(第3B圖）’催化袋係鄰近中心平行 鏈β3、β4及β5的羧基端侧邊(第3Α圖）’其相當狹窄但透過溶 劑通道(solvent channel)可到溶劑主體。人類QC的單一鋅離子 位於活性部位之袋底並四面以天門冬胺酸殘基159之delta 2位 置的氧(D159 Οδ2)、麩胺酸202之epsilon 1位置的氧(E202 Οεΐ)、 組胺酸330之epsilon 1位置的氮(Η330 Νε2)以及一水分子配 位。此外’其他數個完全保留性殘基(completeiy conserved

residues)，包括緊鄰鋅環境的 E2〇l、W207、D248、D305、F325 及W329(第3C圖)暗示其在催化作用所扮演的角色。如表2所 示’這些胺基酸的突變明顯降低了酵素活性。酸性殘基E2〇1、 D248及D305在pH 6.5及8.0中彼此相向，可能在彼此之間形 成氫鍵。與鋅配位的D159在與隨後的S160之間的胜肽鍵為順 式構型並由包括〇1590δ1-Η140Νε2(2.70人）、 S160Oy-D248O51(2.66 A) ' D1590-水(2.65 人)及 S160N-水(2.80 人)的鼠鍵網所安定。 表2.野生型與突變型人類Q(：的動能參數 ^(mM) pH 7.0~0.79 ±0.13* pH 7.5 0.90 土 0.09 pH 8.0 0.63 ± 0.01 pH 8.5 0.90 土 0.05 pH 8.8 2.06 土 0.62 ^cat (s l)_kcat/Km (mM^s-1) 7·3〇±〇.〇1 9.459 ±1.544 9-76+ 1.47 11.104±2.716 8.63 + 0.48 13.663 ±0.497 9-93 + 0.30 11.044 ±0.331 8-56 ± 1.55 4.319 ±0.544

突费贫R54W K144A FI 46 A E201D 0.76 ± 0.04 l_47±〇.〇2 0.82 土 0.16 12.62 ±2_98 7.35 ± 0.26 11.67 土 0.34 7-91+2.14 〇.87±〇_28 9.704 ±0.824 7.944 ± 0.368 9.536 土 0.769 0.068 + 0.007 21 1310052 丑201(^ W207L 1 -77 土 0.07 〇·43 土 0.01 W207F 0.59 ± 0.05 2.32 ± 0.07 D248Ai Q304L 1.16 + 0.09 9.39 ±1.18 D305L1 F325A 4.67 土 0.24 12.91 土 0.06 W329A 29.53 土 2.29 1.35 + 0.07

ND

0.243 ± 0.002 3.943 ±0.189 ND

8.028 土 0.386 ND 2.772 ± 0.132 0.046 + 0.001 *數値以平均値土標準誤差所—示（樣本數=2 〇Γ 3)· t突變型的檢測是在pH 8.0進行。 咕201(5, D248A及D305L分別具有野生型酵素大約0.001%，大約0.1%及大約〇.〇3 的活性。ND:無法測得

活性部位的疏水袋係由殘基K144、F146、F154、L249、1303、 1321、F325及W329所排成，具有大約13x11 x7A3的大小， 有六個水分子位於袋内，包括與鋅離子配位的水。此外，硫酸 鹽離子位於袋口附近’以氫鍵與Κ144Νζ、Η206Νδ卜W207N、 Η330Νδ1及數個水分子連接(第3C圖）。顯示並標示出活性部位 之殘基’可能的氫鍵與配位鍵分別由青綠色與黃色虛線表示， 綠色虛線繪示序列識別號1中D3〇5與Ε201之間以及ϋ305與 DM8之間可能的非經常出現的氫鍵。 實例5:酵素-抑制劑複合物的結構 製備連接抑_晶_式巾，在2 0的容如腕含人類 的L5 μ1蛋白質溶液與〇 5 μ1抑制劑溶液_ ,混合，以將 娜祕到的晶體進行如實例2所频X射線繞射與方法，以 ==的方法決定與修正一 ^ 丁咖的連接造成活性部位袋内六個水分子的移除， $ 22 1310052 匕括”鋅連接的水分子由抑制劑㈣4氮所取代。抑制劑因其 米坐％上的不㈣更而採不同向，丨乙烯基咖坐的乙烯小部位 ,’、、員71~不_與人類QC的雜部位產生相互作用，因此結合後在 催化衣邊下大工間(第5B圖）。然而，N_节基味唾上的主體疏 水苯％則分別由F325與W329的苯基與t朵群緊密環繞並安定 之(第5C圖）。相反的，Ν_ω_乙酰組織胺的取代基方向幾乎與片 •k G301-3G4的骨幹平行，主要由連制酵素之腿8⑽q綱 | N及Q304 〇的三個額外氫鍵所安定(第5D圖）。人類㈣·乙 稀基米坐複σ物、人類qc/NH米峻複合物以及人類〇 乙醜組織胺複合物的詳細三維結構分別係以存於蛋白資料庫 (網站位置WWW.pdb_〇rg) ’蛋白資料庫識別碼(測仍c〇㈣為 MFZ、2AFX及2AFW的原子結構座標所表徵。 熱知此技術之人士可瞭解可在不惊離其寬廣之發明概念下， # 騎文中所述各實施態樣進行改變。因此也咸知本發明不受限 於所接露之特定實施態樣樹脂，並欲涵蓋下㈣請專利範圍所 載本發明精神及範圍内之修飾。 【圖式簡單說明】 連同所附關式-起_ ’將可瞭解前勒容及發卿細說 明。為了說明本發明之目的’在圖式中說明目前較佳的具體實 施例 '然而’應瞭解的是，本發明不限於所顯示之確切排列及 23 1310052 130 135 140

Tyr Phe Ser His Trp Asn Asn Arg Val Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser 145 150 155 160

Ala Val Pro Cys Ala Met Met Leu Glu Leu Ala Arg Ala Leu Asp Lys 165 170 175

Lys Leu Leu Ser Leu Lys Thr Val Ser Asp Ser Lys Pro Asp Leu Ser 180 185 190

Leu Gin Leu lie Phe Phe Asp Gly Glu Glu Ala Phe Leu His Trp Ser 195 200 205

Pro Gin Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Ala Lys Met Ala 210 215 220

Ser Thr Pro His Pro Pro Gly Ala Arg Gly Thr Ser Gin Leu His Gly 225 230 235 240

Met Asp Leu Leu Val Leu Leu Asp Leu lie Gly Ala Pro Asn Pro Thr 245 250 255

Phe Pro Asn Phe Phe Pro Asn Ser Ala Arg Trp Phe Glu Arg Leu Gin 260 265 270

Ala lie Glu His Glu Leu His Glu Leu Gly Leu Leu Lys Asp His Ser 275 280 285

Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Gin Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly Val lie Gin 290 295 300

Asp Asp His lie Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu 305 310 315 320 lie Pro Ser Pro Phe Pro Glu Val Trp His Thr Met Asp Asp Asn Glu 325 330 335

Glu Asn Leu Asp Glu Ser Thr lie Asp Asn Leu Asn Lys lie Leu Gin 340 345 350

Val Phe Val Leu Glu Tyr Leu His Leu 355 360

Claims (1)

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年月日修(更)正本 第095106425號專利申請索（98年2月） 修正後無劃線之申請專利範圍替換本 十、申請專利範固： 1. 一種人類麵酸胺環化酵素(glutaminyl cydase，QQ 晶體，其具名稱為QC6.5之三維結構，具有R32的 空間群以形成尺寸為a = b = 119〇3 A、c = 332 94人的 單元晶格。 2.如申請專利範圍第1項所述的QC晶體，其中 該晶體X射線繞射以決㈣晶體在解析度大約166 A的原子座標。 如申明專利範圍第1項所述的qc晶體，其中 該晶體包括兩個QC分子。 4.如申請專利範圍第3 該兩個QC分子之間的所有 大約 0.368 A。 項所述的QC晶體，其中 C原子具有根均方差為 禋人類QC/QC基質複合物的晶 曰曰肢 7 巴枯： ()夕肽〃具有序列識別號J中 殘基的胺基酸序列 十1门 同源體、類似物或變體， 5亥夕肽本身可开》成如申嗜直 甲°月專利乾圍第1至4項中杯 一項之QC晶體；以及 貝肀任 ⑻QC基質； 其中該複合物的晶妒右 QC/QCAt 有效X射線繞射以決定 QC/QC基貝複合物在解析 疋 1 22 A的原子座標。 1310052 第095100425號專利申請案（98年2月） 修正後無劃線之申請專利範圍替換本 6.如專利申請範圍第5項所述的複合物的晶 體，其具有R32的空間群以形成大小為a=b=u914 A、c=332.61 A的單元晶格。 7 ·種識別人類QC之抑制劑的方法，包括： (a)製備一多肽具有序列識別號1中第33至361 個胺基酸殘基的胺基酸序列，#十該多肽具有如專 利申請範ϋ第1至4項中任—項之Q c晶體之活性部 位°亥’舌性σ卩位包括鋅離子四面與序列識別號1中 第159、202及330個胺基酸殘基，以及一水分子配 位； QC-抑制劑複合物；以及 (c)產生由步騾（b)所取得之哺乳類動物抑制 劑複合物的三維模型； 其中將具㈣唾氮與鋅離子連接的待測抑制劑識 別為哺乳類動物QC的抑制劑。 8·如專利申請範_7項所述的方法，其中該活 性部位進—步包括序列識職1中第2Gl、2G7、/48、 3〇5、325及329個胺基酸殘基。 9.如申請專利範圍第7項所述的方法’其中該活 性部位進—步包括序列識別號1 _第160個胺基酸 1310052 第095106425號專利申請案（98年2月） 修正後無劃線之申請專利範圍替換本 殘基以一胜肽鍵與序列識別號1中第159個胺基酸 殘基鍵結。 10·如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該 胜肽鍵為複數個氫鍵所穩定的一順式構型胜肽鍵。 11. 如申請專利範圍第1〇項所述的方法，其令該 活性部位進一步包括一疏水袋，由序列識別號i中 第 144、 146、 154、 249、 303、 321、 325 及 329 個 胺基酸殘基所排列。 12. 如申請專利範圍第n項所述的方法，其中該 活性部位進一步包括鄰近該疏水袋的一硫酸鹽離 子，該硫酸鹽離子以氫鍵鍵結序列識別號1中第][44、 206、2G7及33G個胺基酸殘基，以及至少兩個水分 〇 13. —種製造如申請專利範圍第1至4項中任一 項之晶體的方法，包括. (a) 表現該QC蛋白； (b) 純化該QC蛋白；以及 (c) 結晶該QC蛋白1V丑，上、^ 白以形成如專利申請範圍第1至4 項中任一項的晶體。 14·如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該 QC蛋白係以懸式擴散法所結晶。