TWI267372B - Method for preparing alginate capsules - Google Patents
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1267372 九、發明說明·· 【發明所屬之技術領域】 本發明大致上係關於一種製備口服投藥用膠囊之方 法,特別是褐藻膠膠囊。本發明亦提供以該方法製備之褐 藻膠膠囊。 · 【先前技術】 「包膠(encapsulation)」係指將活性成分包覆於聚合 物材料之化學或物理過程,其可對活性成分提供保護及控 制释放,並可方便地遞送該成分。包膠的各種應用、材料 •及技術均已廣泛揭示。微生物的聚合物基質包膠是一項十 分新穎的技術。最常用於包膠生物性物質的羥基聚合物為 褐藻膠、聚丙烯醯胺、鹿角菜膠、瓊脂或瓊脂糖。其中, 僅有褐藻膠及鹿角菜膠可簡易地與被包膠物質一同製做成 球形。這是藉由離子移變成膠(ionotropicgelling )而達 成,亦即,將褐藻膠滴入鈣鹽溶液及將鹿角菜膠滴入鉀鹽 溶液中。 作為包膠材料而δ,褐藻酸辦的簡易性、無毒性、生 φ 物可相容性及低成本使其成為較佳選擇(Sheu及
Marshall,1993,J·⑹伽.从· 557.)。褐藻膠係由各 種藻類萃取而得之D-甘露糖醛酸及L—葡萄糖醛酸 (guluronicacid )之直鏈異多醣。褐藻膠作為支撐材料的 功此性貝主要疋與L_葡刼糖駿酸及d-甘露糖藤酸的組成 及順序有關。二價陽離子如Ca2+傾向於與L-葡萄糖醛酸之 聚合物結合(Krasaekoopt 等人,2003,/咐73: 1267372 us)。褐藻酸鈣的另一項優點則為鈣離子溶出致使褐藻 膠溶解,而在消化道中釋放出内包之微生物。 「益生菌(probiotics )」可定義為活性微生物補充 物,其可改善腸内微生物的平衡。好的益生菌生存力及活 性被視為最佳功能性所必需6益生菌在宿主體内的存活及 增生強烈地影響其益生性質。食品中所添加之益生菌必須 維持代謝穩定性及活性,且通過上消化道後大多數均能存 活’方能在宿主腸内產生有益效果。許多過去研究顯示益 生菌在乳製品(包括優格及發酵乳)中的生存力低落,並 提出各種乳類發酵物的益生菌保護法,其中水膠粒包膠對 於食品及腸道内益生菌生存力的改善有受到研究(Prevost 及 Divies,1988,Mf/c/rn;/*^服; Lacroix 等 k,1990,Applied Microbiology and Biotechnology 32:403-408 ·, Champagne 等人,ί992,Applied and JSnvinmmentaZ Microbiology 58:1429-1434)。
Batich 與 Vaghefi 曾揭示一種將⑵包 膠於褐藻膠或鄰苯二曱酸醋酸纖維素(CAP)微膠囊中之 方法(US 6,242,230 )。然而,Batich的方法需要對所形成 的微膠囊進行後處理,包括於微膠囊上塗覆一或多層聚 -L-離胺酸(用於褐藻膠膠囊)或聚乙烯基咐啶(用於 C AP膠囊)。該%後處理使過程複雜化並衍生額外費用。 因此,目前對於藥物、酵素、微生物或其他物質,特 別是益生菌的包膠,仍有需要發展更有效且方便的方法。 【發明内容】 1267372 本發明提供一種用於製備褐、藻膠膠囊的方法,俾對活 性成分的包膠提供更有效且方便的方法。 依據本發明之一具體實例,提供一種用於製備褐藻膠 膠囊的方法,包括下列步驟: ⑻提供一基質形成溶液,其包含1至3%的褐藻酸鈉、 最高5%的胰酵素消化蛋白質、及最高5%的果寡糖 (FOS ); (b) 使該基質形成溶液成為小滴狀,並將該等小滴導入一 氯化鈣溶液中,以形成褐藻膠膠囊;及 (c) 使所形成之褐藻膠膠囊固化。 又,依據本發明,提供一種褐藻膠膠囊,其係由包含 下列步驟之方法所製備: (a) 提供一基質形成溶液,其包含1至3%的褐藻酸鈉、 最高5%的胰酵素消化蛋白質、及最高5%的FOS ; (b) 使該基質形成溶液成為小滴狀,並將該等小滴導入一 氯化鈣溶液中,以形成褐藻膠膠囊;及 (c) 使所形成之褐藻膠膠囊固化。 本發明之額外特徵及優點將於以下敘述中陳明,且在 某種程度上由該敘述可顯而易見,或可藉由實施本發明而 習得。藉由所附申請專利範圍中特別指明之元件及組合, 即可暸解並獲得本發明之特徵及優點。 須了解以上之概略敘述及以下之詳細敘述均屬示範性 及解釋性,而不對本發明具限制性。 併入本說明書而視為其一部分之所附圖式係例舉本發 1267372 明之一具體實例,其與說明書中之敘述共同用於解釋本發 明之原則。 【實施方式】 本發明提供製備褐藻膠膠囊之新穎方法。依據本發明 製備之褐藻膠膠囊具有增進之安定性,因而可長時間維持 其結構之完整性。因此,本發明之褐藻膠膠囊可對所包膠 之活性成分提供改進之保護效果。 依據本發明,令人驚訝地發現於褐藻膠膠囊之囊壁中 併入益菌質(prebiotics )及胰酵素消化蛋白質可增進膠囊 的強度。本文使用之「益菌質」乙詞係指如異麥芽寡糖 (IMO )及果寡糖(FOS )等無法消化之食物成分,其可 選擇性刺激一或數種腸内細菌之生長及/或活性,因而對 宿主提供有益的影響。較佳者,本發明所用之益菌質為 FOS 〇 本文使用之「胰酵素消化蛋白質」乙詞係指以胰蛋白 酶消化一蛋白質所得之肽片段。較佳者,本發明所用之胰 酵素消化蛋白質為胰酵素消化酪蛋白。 本發明之方法包括下列步驟: ⑻提供一基質形成溶液,其包含1至3%的褐藻酸鈉、 最高5%的胰酵素消化蛋白質、及最高5%的果寡糖 (FOS ); (b) 使該基質形成溶液成為小滴狀’並將該等小滴導入一 氯化鈣溶液中,以形成褐藻膠膠囊;及 (c) 使所形成之褐藻膠膠囊固化。 1267372 本發明之方法係基於Krasaekoopt等人揭示於
International Dairy Journai 】】4: 737-743, 2004 之濟壓 t 膠技 術。欲實施本發明之方法,使用例如針筒將褐蕩酸鈉溶液 做成小滴狀並導入一氯化鈣溶液中,以形成褐藻膠膠囊。 所形成之褐藻膠膠囊尺寸取決於針筒上針頭之直徑。可使 用較小直徑之針頭製造所謂的微膠囊(亦即直徑小於 5,000 μπι 之膠囊)。
本發明之方法在技術上有別於先前技術之點在於將特 定益菌質及肽類併入褐藻膠膠囊之囊壁中。益菌質及肽類 =以最高5%之濃度,在褐藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液反應 前添加至褐藻酸鈉溶液中。本案發明人發現褐藻酸鈉濃度 並非影響本發明褐藻膠膠囊保護效果之因辛,惟本 用之褐藻酸納溶液濃度較佳介於 ^larshall之研究( 1993 ),使用較高褐藻酸納濃度時,膠 囊直徑及保護效果均會增加。然而,如同本發明實例之結 果所示,相較於以3%褐藻酸鈉所形成之傳統褐藻膠膠 囊,以1%褐藻酸鈉所形成之本發明褐藻膠膠囊(即^最 佳生產模型」)可提供更㈣賴效果。因此Γ添加 質及肽類確實可改進褐藻膠膠囊之耐久性。本發明= 現,以1%褐藻酸納所形成但不含益菌質及 : 膠囊十分軟,以至於輕易地就被外力破壞。上述結2膝 盈菌質及肽類可促進褐藻膠膠囊的形成。 又不 另-方面’本發明所用之氯化㈣液濃度較佳 〇.〇5至0.3M。已有報告指出當氯化鈣濃度高於⑽a% 1267372 :氣響所形成褐蕩膠膠囊的強度。本—^ 一如有;;::影響褐藻膠膠囊保、果之因素。 而要’衣備本發明褐藻膠膠囊<㈣<於使用前 由高=以:藉Γ何一般常用 <枝術施行’例如藉 _膠=:::可 輻射滅菌,再將呤\<褐溱酸鈉Μ 滅菌之溶液中:4加入包含其他材料之已經高潘高壓 物質以=!Γ法製備之褐藻膠膠囊可用於包膠各種活性 細胞、藥物’如細菌、病毒、動物或植物 ^ ’ 、真囷、酵素、肽類、核峻、於斗f、土痛 Ξ的ίΐ藥!。本發明之褐藻膠膠囊特別:用於活性益生 、又予。虽益生菌包膠於本發明之褐藻膠 以口服 投予時’其可避開胃液的傷害而抵達腸内:二於腸内發撢 其益生活性。 ^ ^ 降ί用於投予活性物 i你田' / " 1卞狀%之褐藻膠胗” 二他用迓。例如,可製作未包膠活性物質之本發明褐旁
膠囊。此種「無活性」膠囊可供素食者作為取代天然 之食物。 〜 材料與方法 Α·培養條件 長雙又桿菌(m /〇喂; CCRC 146〇5 )、 乾赂乳桿菌鼠李糖亞種(⑽·//奶cos^z’似以/?· ; CCRC 12321 )、雙岐雙叉桿菌(及&拆办w ; 1267372
CCRC 11844 )及嗜酸乳桿菌(L πΖ·~Μ奶;CCRC 14079 )之純;東乾培養物係購自食品工業發展研究所之菌 種保存及研究中心(台灣,新竹)。使用MRS c deMan, RogosaandSharp )壤脂及丙酸鋰慮§ ( Lp-MRS )瓊脂分 別作為乳桿菌及雙又桿菌之選擇性培養基。 於37°C下’將嗜酸乳桿菌及乾酪乳桿菌於乳桿菌mrs 液悲培養基(Difco ,法國)中轉移培養二次;另於4(rc 下之缺氧培養箱中,將長雙叉桿菌及雙岐雙叉桿菌於含 0.05%L-半胱胺酸鹽酸鹽(Sigma,美國)之液態培 養基中轉移培養—次。二十四小時後離心(如⑽q,1〇分 在里 C下)收取培養物’清洗並兩次重新懸浮於生理鹽 水溶液中。將最終細菌數調整為每毫升1〇9個細胞。 B·益生菌的微膠囊包膠 並生菌微膠囊係以Krasaekoopt等人於2004年所揭示之 擠壓包膠技術製備。清洗後,將4% ( v/v )之濃縮培養 物(嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、雙岐雙叉桿菌及長雙叉桿 菌各1% )與含有1%褐藻酸鈉(sigma,美國)、3% 褐藻酸鈉、或「1%褐藻酸鈉混以1%肽類(胰酵素消化 酷蛋白’振芳公司,台灣)及3% F0S (振芳公司,台 灣)」(稱為「最佳生產模型」)之50 mL無菌溶液(於 121°C下高溫高壓滅菌15分鐘)混合。將所得細胞懸浮液 經由0·11針頭注入無菌〇1 MCaCh中。令直徑約〇 5mm之 微膠囊靜置—小時俾使成膠,然後以無菌0.1%蛋白腺溶液 沖洗並保存於4°c下之無菌0.1%蛋白脒溶液中。 1267372 c·益生菌存活力的測定 欲測定益生菌之存活力計數,依據sheuA Marsha11之 方法(Journal of Food Scence· 54: 557-561,1993 )令祓钆 1的 益生菌由微膠囊中釋放出來。將一克微膠囊重新懸浮於9 mL磷酸鹽緩衝液(0·1Μ,ρΗ7·0 )中,然後於鐵胃 (stomacher ; Seward Stomacker 400C9 Brinkmann, Westbury, NY, USA )中均質化15分鐘。以益生菌培養物之十倍數稀釋液 進行晝盤(plate )俾測試培養基的適合度。因此,將一克 樣品以無菌蛋白脒水溶液(0.1%)作十倍數稀釋,接著以 0·1 mL份量之稀釋液畫盤於不同培養基上,重複三次。將 MRS瓊脂之培養盤於37°C下有氧培養72小時俾抑制雙叉桿 卤。LP-MRS 瓊脂(GasPak System; Oxoid Unipath Ltd,
Basingstoke,Hampshire,England )之培養盤則在計數雙叉桿 菌前先於37CC下缺氧培養72小時。紀錄各培養基之族群 (以菌落形成單位(CFU )計)及菌落特徵。 例1 □以祕膠囊包谬之益生菌於牛奶中之存活度 +將混合益生菌(嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、雙岐雙叉 才干囷及長雙叉桿菌各1% ) u自由細胞形式或以微膠囊包 覆之細胞形式添加至牛奶(乳脂肪3·5% ,國立台灣大學, 口北,口/弓)中。將樣品於4°C下貯存16天,測定益生菌 存活力。 如下表所不’於冷藏牛奶中浸泡16天之以最佳生產模 微膠囊f後之放生菌,其存活度相較於自由細胞有顯著 改善。先刖有其他報告指出以褐藻膠微膠囊包膠之益生菌 1267372 有類似結果。 益生菌 培養物 -ii〇g CFU/g 貯存期間 1 (天數) 0 4 8 12 16 自由La 8.57 土 8.42 土 8.02 士. 7.51 土 6.57 土 0.16 0.13 0.07 0.14 0.12 自由Bb 8.11 土 7.83 土 6.82 土 6.11 土 5.89 土 0.09 0.12 0.13 0.09 0.14 mcl 8.12 士 8.15 土 8.10 土 8.10 土 8.03 土 0.11 0.21 0.17 0.18 0.20 MB 8.01 土 8.03 土 7.98 土 7.98 土 7.90 土 0.18 0.09 0.15 0.11 0.14 aL :嗜酸乳桿菌+乾酪乳桿菌 bB :長雙叉桿菌+雙岐雙叉桿菌 :以微膠囊包膠 實例2□貯存試驗 為了瞭解貯存期間益菌質對以微膠囊包膠之益生菌的 影響,μ定經包膠之生物的存活細料數。除了最佳生
產模型之微膠囊外,亦測試含1%及3%褐藻膠之微月 囊。將三種微㈣浸泡於無菌水中並於4Τ下貯存三<| 月’每隔《敎經包膠之益生菌的存活产。、 益生菌計數的結果顯示,如同可能^ 囊配方之存活力均隨貯存期間增加而降低(、Ώ1τ 生產模型微膠囊之益生菌計 6民乂圖η 106⑽g’相對地不含益_質之微ΐ囊 1267372 mj/g。因此’相對於不含㈣質之其他膠囊,於被覆材 料中此人㈤@質導朗存㈣騎包狀线有較 護。 ’、 貝例3 包膠之益生菌於模液試驗( 鹽條件下之存活度 1 ;⑽ 。〗2中所述,將三種微膠囊浸泡於無菌水中並於 4C下財存三個月,每隔兩週測定經包膠 胃液及膽_理後叫輯。 &目在核擬 欲測定對模擬胃液的耐受度,將丨克以微膠囊包 細菌加入含有10 mL指4 、 夕之 被胃液(其係由0.3%胃蛋白酶 (lgma ’關)及〇5%氯化N麵i 成,以1NHC1調整至 尽)所組 耐受度,將以微膠真4 .〇 )之&瓶中。欲測定對膽鹽的 2%牛膽汁粉末膠之細菌加入膽鹽溶液中,其係由 理均於25〇C下之震’吳國)所組成。兩種耐受度處 句歸: 堯瓶(觸卿)中進行一小時。 下貯存後在模擬胃液及膽鹽條件 及3。在貯存後之园存活度的影響分別示於圖2 生產模型之益生相對於不含錢質者,最佳 高的存活細料數。“桿_及雙又桿®均產生了最 貯存8週後仍維持於=生產f型微膠囊之益生菌計數在 3%褐藻膠者則僅有⑽至1〇3CFU/S,相對地含1%及 叉桿菌相較於初始細皰上至10 CFU/g。然而,乳桿菌及雙 之減少’三次處理則::: (】】)均顯示了〗對數循環 …、、、頁者是異。微生物的存活受到低 1267372 pH環境的影響。我們的結果顯示在模擬胃液試驗中,以 褐藻酸鈣作微膠囊包膠可對益生菌提供良好的保護。 我們的初步測試以及其他研究結果顯示,益生菌對酸 的耐受度較對膽鹽為高。據此,一般認為有需要評估以有 潛力的微膠囊包膠之益生菌抵抗膽鹽效果的能力。最佳生 產模型微膠囊之益生菌計數在貯存8週後仍維持於105至 106CFU/g,相對地含1%及3%褐藻膠者則僅有102至 103CFU/g,此結果與模擬胃液試驗之結果類似。乳桿菌及 雙叉桿菌相較於初始細胞計數(圖1 )均顯示了 1對數循 環之減少。 上述有關本發明較佳具體實例之揭示係供例示及描述 之目的。其並非意圖作為完全詳盡之敘述,或將本發明限 制為與所揭示之形式完全相同。本技藝中一般技術者鑒於 上述揭示,即可明白本文所描述之具體實例的諸多變化及 修改。本發明之範圍僅由本文後附之申請專利範圍及其相 當物所界定。 再者,當描述本發明之代表性具體實例時,本說明書 可能以特定之步驟順序呈現本發明之方法及/或製程。然 而,由於該方法或製程並非取決於本文所述之特定步驟順 序,該方法或製程不應為所述之特定步驟順序所限。如同 本技藝中一般技術者所能理解者,其他步驟順序亦為可 能。據此,本說明書中所述之特定步驟順序不應作為加諸 於申請專利範圍之很制。此外,針對本發明之方法及/或 製程之請求項不應限於所撰寫之步驟順序之成果,且熟習 1267372 本技藝者當可理解,該等順序可能有所改變卻仍然位於本 發明之精神及範疇内。 【圖式簡單說明】 現在以本發明之本具體實例作詳細的參照,其實例列 舉於所附圖式中。可能的話,相同或類似部份使用相同的 參考號碼貫穿全部圖式。 圖1顯示膠囊於蒸餾水中貯存12週後之存活度,其中 乳桿菌及雙叉桿菌係依據本發明以三種不同微膠囊配方包 圖2顯示膠囊於蒸餾水中貯存12週後再於模擬胃液中 測試之存活度,其中乳桿菌及雙叉桿菌係依據本發明以三 種不同微膠囊配方包膠。 圖3顯示膠囊於蒸餾水中貯存12週後再於模擬膽鹽中 測試之存活度,其中乳桿菌及雙叉桿菌係依據本發明以三 種不同微膠囊配方包膠。
Claims (1)
1267372 十、申請專利範圍·· 驟:1·—種用於製備褐藻膠膠囊的方法’包括下列步 二:二溶液;其包含……〇的揭 5% 的果酵素消化蛋白質、及最高 該基質形成溶液成為小滴狀 鼠化舰液中,以形成褐藻膠膠囊;亥專小滴導入一 (c)使所形成之褐藻膠勝囊固化。 2·根據申請專利範圍第〗頊夕 消化蛋白質為胰酵素消⑽蛋白。' …其中該胰酵素 3.根據申請專利範圍第;!或2 Jg+ 士 (a)中之基質形成溶液係藉由料uv】^法’其中步驟 粉末添加於含胰酵素消化蛋白質AF(^處理之褐藻酸鈉 液中而製備。 、 US之咼溫高壓減菌溶 4·根據申請專利範圍第 括將一或多種欲包膠之活性=、之方法,進一步包 成溶液中的步驟。 “、、加於步驟⑷中之基質形 5. 根據申請專利範圍第4 活性成分為—生物材料。 負之方法’其中欲包膠之 6. 根據申請專利範圍第 料係選自由下列組成 、^去’其中該生物材 胞、藻類、真菌、酵素、狀類:核;,、⑽ 7·根據申請專利範圍第6項之方法’其中該生物材 1267372 料為細菌。 、,8:根據申請專利範圍第7項之方法,其中該細菌為 ϋ生菌。 9·根據申請專利範圍第8項之方法,其中該益生菌 係選自由下列組成之群··嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、雙岐 雙叉桿菌及長雙叉桿菌。 又 、、、1〇·根據申請專利範圍第6項之方法,其中該生物材 料為酵素。 η·根據申請專利範圍第4項之方法,其中包豚 活性成分為一藥物。 匕胗之 U·根據申請專科範圍第i或2項之方法,其中步驟 ⑼中使用之氯化鈣溶液的濃度介於0.05至0.3M。 根據申明專利範圍弟項之方法,其中步驟⑼ 使用之氯化鈣溶液的濃度為01M。 根據申請專利範圍第2項之方法,其中步驟⑻中 之基貝形成溶液句合 從匕3 1至3/。( W/V )的褐藻酸鈉、P/o wv)的胰酵素消化路蛋白、及3% ( w/v)的刪 方法= 製彳轉囊’其係由申請專雜圍第1項之 褐藻二請3範圍第15項之褐藻膠膠囊,其中該 17 、 3 一或夕種包膠之活性成分。 包膠之活專利範圍第16項之褐藻膠膠囊,其中該 取刀為一生物材料。 18. Μ Μ φ ^ ^ %專利範圍第17項之褐藻膠膠囊,其中該 1267372 生物材料係選自由 物細胞、藻類、直=成之群:細菌、病毒、動物或植 1Q貝真囷、酵素、肽類及核酸。 根據中請專利範圍第18項之褐藻膠膠囊,复中兮 生物材料為細菌。 I /、肀癌 2〇·根據申請專利範圍第19項之褐藻膠膠囊,其忖 細菌為益生菌。 ’、以 21.根據申請專利範圍第2〇項之褐藻膠膠囊,其中該 益生菌係存活的。
22·根據申請專利範圍第2〇或以項之褐藻膠膠囊,其 中該益生菌係選自由下列組成之群:嗜酸乳桿菌、乾酪乳 桿菌、雙岐雙叉桿菌及長雙叉桿菌。
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