TW585918B - Isolated grand fir (Abies grandis) monoterpene synthase protein, replicable expression vectors and host cells comprising nucleotide sequences of said monoterpene synthases, method of enhancing the production of a gymnosperm monoterpene synthase - Google Patents

Isolated grand fir (Abies grandis) monoterpene synthase protein, replicable expression vectors and host cells comprising nucleotide sequences of said monoterpene synthases, method of enhancing the production of a gymnosperm monoterpene synthase Download PDF

Info

Publication number
TW585918B
TW585918B TW87111249A TW87111249A TW585918B TW 585918 B TW585918 B TW 585918B TW 87111249 A TW87111249 A TW 87111249A TW 87111249 A TW87111249 A TW 87111249A TW 585918 B TW585918 B TW 585918B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
leu
ser
glu
ala
arg
Prior art date
Application number
TW87111249A
Other languages
English (en)
Inventor
Joerg Bohlmann
Christopher L Steele
Rodney B Croteau
Original Assignee
Univ Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Washington filed Critical Univ Washington
Application granted granted Critical
Publication of TW585918B publication Critical patent/TW585918B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

M59l8 A7
五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明係關於核酸序列，其編碼得自裸子植物種屬之 單萜合成酶，特別是來自大冷杉（Abies grandis)之單萜合成 晦，該等酶包括檸檬烯合成酶、桂葉烯合成酶及松烯合成 _，本發明亦關於含有該等序列之載體、含有該等序列之 宿主細胞、表現該等序列之植物種子及重組單萜合成酶及 其變異體之製法。 發明背景 針葉樹對抗樹皮甲蟲及與其相關之真菌病源菌的化學 防衛，主要在於組成可誘生的含油樹脂之生物合成 (Johnson，M.A.，and Croteau，R.(1987)in Ecology and Metabolism of Plant Lipids(Fuller，G·，and Nes，W.D.， eds.)pp. 76-91，American Chemial Society Symposium Series 325，Washington，DC ; Gijzen，M. , Lewinsohn， E.，Savage，T.J.，and Croteau，R.B.(1993)in Bioactive Volatile Compounds from Plants(Teranishi，R.，Buttery， R.G·，and Sugisawa，H.，eds.)pp.8-22，American Chemical Society Symposium Series 525，Washington，DC)。防衛分 泌物係為一單結及倍半祐稀煙（松節油）(turpentine)及二fe 樹脂酸類（松香）之複雜混合物，該混合物係於具有特殊構 造的表皮細胞（例如樹脂導管及泡胞）中組成性合成’或於 誘發含油樹脂生成之情況下，於包圍創傷位置的未分化細 胞中合成（Lewinsohn，E·，Gijzen，M·，Savage，T.J·，and 本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（210X297公爱） -6 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
冲5918 A7 __B7_ 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Corteau，R.(1991) Plant Physiol 96 : 38-43)。對樹皮甲蟲 及其相關之真菌關連有毒之針葉樹含油樹脂之揮發成份 (Raffa，K.F·，Berryman，Α·Α.，Simasko，J·，Teal，W. ’ and Wang，B.L. (1985) Environ. Entomol· 14 : 552-556) ’可由多達30種不同的單萜所組成，（Lewinsohn，E. Savage ’ T.J.，Gijzen，Μ·，and Croteau，R· (1993) Phyochem. Anal· 4 : 220-225)，該等單萜包括無環類別（如桂葉烯）、單環類 另U如檸檬烯）及雙環類別（如松烯）（第1圖）。雖然含油樹脂 有毒，但多種樹皮甲蟲種類仍可使用宿主分泌的松節油揮 發物，將多種單萜成份轉成聚集體或性費洛蒙而促進合作 攻擊宿主（Gijzen，M.，Lewinsohn，E.，Savage，T.J·，and Croteau j R.B. (1993) in bioactive Volatile Compounds from Plants(Teranishi，R.，Buttery，R.G.，and Sugisawa，H. ，eds.) pp. 8-22，American Chemical Society Symposium Series 525, Washington，DC; Byers，J.A.，（1995) in Chemical Ecology 〇f Insects 2 (Carde » R.T. 5 and Bell ? W.J. j eds.) pp. 154-213，Chapman and Hall，New York)。大冷杉（Abies grandis)中，樹皮曱蟲的攻擊而誘發單萜類、倍半萜類及二 萜類之生成增加（1^\¥1118〇1111，£.，0扣611，]^.，8&¥&86丁丄 5 and Croteau 5 R. (1991) Plant Physiol. 96 · 38-43 ； Raffa ，K.F.，and Berryman，Α·Α· (1982) Can. Entomol. 114 : 797-810 ; Lewinsohn，E.，Gijzen，M·，and Croteau，R. (1991) Plant Physiol· 96 : 44-49)，此種誘發性防禦可以機械傷害 幼苗樹幹來模擬（Lewinsohn，Ε·，Gijzen，Μ·，Savage T.J· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） -7 - 585918 A7 __B7_ 五、發明説明（3 ) ，and Croteau，R. (1991) Plant Physiol. 96 ·· 38-43 ; Lewinsohn，E.，Gijzen，M.，and Croteau，R· (1991) Plant Physiol. 96 : 44-49 ; Funk，C.，Lewinsohn E.，Stofer Vogel ，B.，Steele C.，and Croteau，R. (1994) Plant Physiol· 106 :999-1005)。因此，大冷杉也發展作為一模式系統，以研 究針葉樹之組成性及誘生性萜生物合成之生物化學及分子 遺傳學的調節作用（Steele，C·，Lewinsohn，E·，and Croteau ，R· (1995) Proc· Natl· Acad. Sci· USA 92 ·· 4164-4168) 〇 大半單萜類係藉合成酶衍生自槐牛兒基二磷酸酯，該 酯係為異戊間二烯路徑之C10中間物，該合成酶催化二價金 屬離子相關之離子化（至第1圖中的1)，及此種基質成為酶 結合沉香基二磷酸酯之異構化作用，該沉香基二磷酸酯環 繞C2_C3旋轉後，進行第二離子化（至第1圖中的2,）接著環 化成α-萜品基陽離子，生成單環及雙環產物路徑之第一環 狀中間物（Croteau，R.，and Cane ’ D.E. (1985) Methods Enzymol. 110 : 383-405 : Croteau，R· (1987) Chem. Rev· 87 :929-954)(第1圖）。無環單萜（如桂葉烯）可藉碳陽離子1或 2之脫質子化獲得，於環狀類別（如檸檬烯及蒎烯）之例子中 ，則需要異構化步驟生成沉香基二磷酸酯，如檸檬烯及蒎 烯之環狀類別之無法直接衍生自槐牛兒基二磷酸酯，係由 於C2-C3之反式雙鍵的幾何阻礙之故（Croteau，R·，and Cane ，D.E. (1985) Methods Enzymol· 110 : 383-405 ; Croteau， R· (1987) Chem. Rev· 87 : 929-954)。多種單萜合成酶經由 改變此種基本機轉催化多種產物，包括無環、單環及雙環 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、可丨 585918 A7 ___B7 _ 五、發明説明（4 ) 類型之合成（Gambliel，H·，and Groteau，R· (1984) J· Biol· Chem. 259 : 740-748 ; Croteau，R.，Satterwhile，D.M.， Cane，D.E·，and Chang，C.C. (1988) J. Biol· Chem. 263 : 10063-10071 ; Croteau，R·，and Satterwhile，D.M· (1989) J. Biol· Chem. 264 : 15309-15315)。例如（·)-檸檬烯合成酶 ，此乃綠薄荷（Mentha spicata)及薄荷（M. x piperita)之主要 單萜合成酶，可產生小量桂葉嫦、（-)_α-松稀及（-)-β-松稀 ，此外也產生單環產物（Rajaonarivony，J.I.M.，Gershenzon ，J.，and Croteau，R· (1992) Arch. Biochem· Biophys· 296 :49-57 ; Colby，S.M.，Alonso，W.R.，Katahira，E.J.， McGarvey，D.J·，and Croteau，R. (1993) J· Biol· Chem· 268 :23016_23024)。相反地，於受傷大冷杉莖萃出物中驗證 出六種不同可誘生之單萜合成酶活性（Gijzen，M.， Lewinsohn » E. 5 and Croteau » R. (1991) Arch. Biochem. Biophys· 289 : 267-273)，這表示此等物種中無環、單環及 雙環單萜類的生成，涉及若干編碼不同催化劑之基因。可 誘生（-)-松稀合成酶已經純化（Lewinsohn，E.，Gijzen，M. ，and Croteau，R. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 293 : 167-173)，且已使用同位素敏感分支實驗驗證出此種酶可 合成（-)-α-及（-)-β-松稀（Wagschal，K.，Savage，T.J.，and Croteau，R· (1991) Tetrahedron 47 : 5933-5944)。 剖析含油樹脂之分子基因控制及檢視大冷杉單萜合成 酶間之結構-功能關係，需要分離編碼此等關鍵酶之cDNA 物種。雖然晚近用以蛋白質為主之選殖策略獲得得自大冷 9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） ^85918 A7 ____B7_ 五、發明説明（5 ) 杉之主要創傷誘生二萜合成酶、松香二烯合成酶之cDNA ’ （Funk，C.，Lewinsohn，E.，StoferVogel，B.，SteeleC· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ’ and Croteau，R. (1994) Plant Physiol· 106 : 999-1005 ; LaFever，R.E.，Stofer Vogel，Β·，and Croteau，R. (1994) Arch. Biochem. Biophys. 313 · 139-149 ； Stofer Vogel j B. ’ Wildung，M.R.，Vogel，G.，and Croteau，R. (1996) J· Biol. Chem· 271 : 23262-23268)，但所有以反錄基因的方法選殖 大冷杉單萜合成酶之嘗試皆失敗（Steele，C.，Lewinsohn ，Ε·，and Croteau，R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 92 :4164-4168)。曾經開發以相似性為基礎之PCR策略作為 替代方法（Steele，C.，Lewinsohn，E.，and Croteau，R. (1995) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 92 : 4164-4168)該方法使用得自 被子植物來源之格合成酶、倍半格合成酶及之二萜合成酶 之序列資訊，該萜合成酶亦即單萜合成酶、㈠-4S-檸檬烯 合成酶，其得自綠薄荷（Mentha spicata，唇形花科）（Colby ，S.M.，Alonso，W.R.，Katahira，E.J.，McGarvey，D.J· ，and Croteau，R. (1993) J. Biol· Chem. 268 : 23016-23024) ，，該倍半萜合成酶亦即5-epi-aristolochene合成酶，得自 於草（Nicotiana tabacum，蘇科）（Facchini，P.J·，and Chappel ^ J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ： 11088-11092) ，及該之二萜合成酶亦即蓖麻烯合成酶，得自蓖麻子 (Ricinus communis，大戟科），（Mau。D.J.D.，and West ，C.A. (1994) Proc· Natl· Acad. Sci. USA 91 : 8497-8501) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -10 - 585918 發明説明 單萜具有顯著之用於預防及治療癌症的潛力。單萜（ 例如扣檬烯、紫蘇醇、香芹酮、栊牛兒醇及法尼醇）不僅可 降低腫瘤罹病率及減慢腫瘤增生，同時據報告，經由引發 、、、田胞凋零私序，可使已經出現的實體腫瘤退化】·j. ari R.S· Boyer 1丄 ’ Gould Μ·Ν·，Jirtle R.L·，Cancer Res·，55 : 979-983，1995)。β類對如乳癌、結腸癌及攝 護腺癌之類的癌症也具有活性。對患有多種惡化癌症之病 人進行之臨床實驗（Seachrist L，J. NIH Res. 8 : 43)確證了 膳食萜類對人體健康效益。但，存在於西式飲食中之萜類 含量，可能不足以達成顯著之預防效果。每日使用結濃縮 劑（1〇_20克/日）做膳食補充，對已經診斷出癌症病例之膳食 療法而言，顯然係最佳策略。本發明係關於經由將得自大 冷杉之相關基因以基因工程處理至產油種子植物（如蓖麻 油（canola)、大豆油及玉米油）中，而在每曰所用之蔬菜油 中產生營養上有益之萜類。 圖式之簡單說明 前述態樣及隨附本發明之多項優點，藉由參照後文詳 細說明及附圖’將更易明瞭，附圖中： 第1圖為示意代表圖，其闡明槐牛兒基二填酸酯藉由得 自大冷杉之單萜合成酶，而轉變成桂葉烯、檸檬烯、 水芹烯、（-)·α-松烯及（-)·β-松烯之機轉。單環及雙環產物 之生成，須將槐牛兒基二磷酸酯初步異構化成沉香基二磷 酸酯。無環化合物須透過碳陽離子1或2以槐牛兒基二鱗酸 酯或沉香基二磷酸酯生成。ΟΡΡ表示二璘酸部份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） ---------------------費…---------------訂…：------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 585918 A7 _B7_ 五、發明説明（7 ) 第2圖為植物萜合成酶之序列比較。以三個字母命名具 有亞群（7>〜至7>功之基因族，該亞群係以成員間胺基酸之 相同性至少為40%來界定。括弧内的數字係參照公開序列 〇 第3圖闡明AG2.2(序列識別編號：1)編碼之重組蛋白質 產物之GLC-MS分析，選殖體AG2.2編碼之蛋白質序列係述 於序列識別編號：2中。當與不含細胞之大腸桿菌XL l-Blue/pGAG2.2萃出物一起培育時，由桅牛兒基二磷酸酯 產生之總戊烷可溶產物之GLC曲線，圖示例說明於（a)，其 針對具Rt=12.22分鐘之單萜產物之質量分段圖（b)，及真正 桂葉烯（c)。 第4圖闡明AG3.18(序列識別編號：3)編碼之重組蛋白 質產物之GLC-MS分析，選殖體AG3.18(序列識別編號：3) 編碼之蛋白質序列示於序列識別編號：4中。當與大腸桿菌 之不含細胞萃出物XL l-Blue/pGAG3.18—起培育時，得自 槐牛兒基二磷酸酯產生之總戊烯可溶產物之GLC曲線圖示 於（a)，其針對具匕=11.34分鐘之單萜產物之質量分段圖（ 選擇離子模態）（b)，及心=13.37分鐘（d)，及真正α-松烯（c) ，及真正β-松稀（e)。 第5圖闡明AG10(序列識別編號：5)編碼重組蛋白質產 物之GLC-MS分析，選殖體AG10(序列識別編號：5)編碼之 蛋白質序列述於序列識別編號：6。當與大腸桿菌 BL21(DE3)/pSBAG10之不含細胞萃出物培育時，由槐牛兒 基二磷酸酯產生之總戊烷可溶產物之G L C圖示例說明於（a) 12 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 __B7_ 五、發明説明（8 ) ，單萜產物之質量分段圖具Rt=13.93分鐘（b)，及真正檸檬 烯（c)〇 發明概述 根據前文說明，編碼得自大冷杉（Abies grandis)之桂葉 稀合成酶、（-)-檸檬稀合成酶及（-)-松稀合成酶之cDNA，已 經被分離及決定序列，且已經推演出對應之胺基酸序列。 因此，本發明係關於經分離之DNA序列，該序列編碼表現 桂葉稀合成酶，如編碼得自大冷杉（Abies grandis)之桂葉烯 合成酶之標示為序列識別編號：1之序列，該序列亦編碼表 現（-)-蒎烯合成酶，如標示為序列識別編號：3之序列，及 該序列編碼得自大冷杉之（-)-蒎烯合成酶；及表現（-)_檸檬 烯合成酶，如標示為序列識別編號：5之序列其編碼得自大 冷杉之（-)-檸檬烯合成酶。其他態樣中，本發明係關於可複 製重組選殖載體，該載體包含核酸序列（例如DNA序列）， 該序列編碼桂葉烯合成酶、（-)-檸檬烯合成酶或（-)-松烯合 成酶之，或編碼鹼基序列，該鹼基序列充份互補於編碼桂 葉烯合成酶（-)-檸檬烯合成酶或（-)-松烯合成酶之DNA或 RNA的至少一部份，因而可與該等DNA或RNA雜交（亦即互 補編碼桂葉烯合成酶、（-)-檸檬烯合成酶或（-)-松烯合成酶 之DNA或RNA分子部份之反訊息RNA或DNA片段，該反訊 息RNA或DNA片段可用聚合酶連鎖反應引子，或作為前 述合成酶或相關基因之探針）。本發明之又另一態樣中，提 供經修改之宿主細胞，該宿主細胞已經被轉形、轉染、感 染及/或注入本發明之重組選殖載體及/或DNA序列。因此 13 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） A7 B7 "發明説明 ’本發明提供桂葉烯合成酶、（-)-檸檬烯合成酶及松烯 合成酶之重組表現，且本發明之構想可用於加速有意義量 之重組桂葉烯合成酶、（-)_檸檬烯合成酶及（_)_松烯合成酶（ 或其主要酶產物）之生產、分離及純化，供隨後使用以獲得 桂葉烯合成酶、（-)_擰檬烯合成酶及（-)-松烯合成酶於植物 、微生物或動物之表現或加強表現；或本發明之構想可用 於需要調節或表現桂葉烯合成酶、（-)_檸檬烯合成酶及（_)_ 松烯合成酶以供生產此等合成酶或其酶產物或其衍生物之 情況下。另一態樣中，本發明係關於操控單萜生產以增進 對昆蟲之抗性及/或積聚油種子中營養上有用之單萜於。 較佳具體例之詳細說明 如此處使用，“胺基酸”一詞表示所有天然的L_a•胺基 酸或其殘基。該胺基酸可以單字母或三字母標示法辨識。 異白胺酸 白胺酸 酪胺酸 苯基丙胺酸 組胺酸 離胺酸 精胺酸 色胺酸 麩胺 天冬醯胺
Asp D Thr T Ser S Glu E Pro P Gly G Ala A Cys C Val V Met M 天冬酸 蘇胺酸 絲胺酸 麩胺酸 脯胺酸 甘胺酸 丙胺酸 半胱胺酸 纈胺酸 蛋胺酸
lie I Leu L Tyr Y Phe F His H Lys K Arg R Trp W Gin Q Asn N 如此處使用“核苷酸”一詞表示DNA或RNA之單體單位 ，其含有糖部份（戊糖）、填酸根及含氮雜環鹼基。驗基經 由糖誓碳（戊糖之1被）聯結至糖部份，而驗基與糖之組人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 r_______B7__ 五、發明説明（1()) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 稱做核苔。驗基之特徵性核苷酸共有四種DNA鹼基，分別 為腺嘌呤（“A”）、鳥糞嘌呤（“G”）、胞嘧啶（“C”)及胸腺嘧啶 (“T”）。肌苔（“I”）為合成鹼基，其可用於替代四種天然鹼基 (A，C ’ G或T中之任一者）。四種rna鹼基為A、G、C及尿 嘴唆（“U”）。此處所述核苔酸序列包含一線性排列的核苷酸 ，該核苔酸藉磷酸二酯鍵聯結於毗鄰戊糖之3，及5，間。 “相同百分比”一詞表示當兩種胺基酸序列或兩種核苷 酸序列以邊靠邊對正時，占據相同相關位置的胺基酸或核 苷酸百分比。 “相似百分比”一詞為統計學上測量兩種被比較之蛋白 質序列的相關程度。相似百分比係由電腦程式基於化學相 似性（例如被比較之胺基酸為酸性、鹼性、疏水性、芳香性 )等及/或演化距離來計算，演化距離之測量，係以最少之 驗基對的改變來測量，對於將成對之被比較的胺基酸之數 值轉變成編碼另一成對被比較的胺基酸之數值係為必要的 。經重複比較全部可能的對正情況以實驗做出兩個序列之 最佳匹配對正後，進行計算（Henik〇ff，s and Henikoff，J.G. ，Proc· Nat’l· Acad· Sci· USA 89 : 10915-10919，1992)。 ‘‘寡核誓酸”表示經由磷酸二酯鍵連接之去氧核糖核苷 酸的短長度單股或雙股序列。寡核苷酸係藉已知之方法合 成及純化（例如於聚丙烯醯胺凝膠純化）。 此處使用“桂葉烯合成酶，，一詞，表示可由槐牛兒基二 礙酸醋產生多種單萜之酶。藉桂葉烯合成酶合成之主要特 徵性單萜為桂葉烯，其至少占桂葉烯合成酶由桅牛兒基二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公贊） -15 - 585918 A7 ------------B7_ 五、發明説明（11 ) 磷酸酯合成之單萜混合物的約60%。 此處使用擰檬烯合成酶，，一詞表示可由槐牛兒基 二磷酸酯產生多種單萜之酶。藉（_)_擰檬烯合成酶合成之主 要特徵性單萜為（-)_擰檬烯，其至少占（-)-檸檬烯合成酶由 槐牛兒基二磷酸酯合成之單萜混合物的約6〇%。 此處使用松烯合成酶，，一詞表示可由槐牛兒基二 麟酸酯產生多種單萜之酶。藉松烯合成酶合成之主要特 徵性單私為（_)_松烯，其至少占（_)_松稀合成酶由槐牛兒基 二碟酸酯合成之單萜混合物之約60%。 縮寫“SSPE”表示用於核酸雜交溶液之緩衝液。20X(20 倍濃縮）備用SSPE緩衝液之製法如下··將175.3克氣化鈉、 27.6克NaH2P〇4H20及7.4克EDTA溶解於800毫升水。pH以 氫氧化鈉調整至pH 7.4。以水將體積調整至1升。 “改變”、“胺基酸序列改變’，、“變異體，，及“胺基酸序列 變異體”等詞表示單萜合成酶分子與其對應之天然的（亦即 天然）單萜合成酶之胺基酸序列比較略有不同者。通常，變 異體至少與對應天然單萜合成酶之同源性約7〇%，以同源 性係為至少約80%為較隹。屬於本發明之單萜合成酶之胺 基酸序列變異體於某些位置有取代、刪除及/或插入。單格 合成酶之序列變異體可用於獲得所需之提昇或降低的酶活 性、修改區域化學及/或立體化學或改變基質利用率及產物 分布。 取代單萜合成酶變異體為在天然單萜合成酶序列中至 少有個胺基酸殘基被去除且在同一個位置插入不同胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 16 -------------------費…------U--------、玎-------------< 费 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 ______B7 五、發明説明（12 ) 者。取代可為單一取代，分子内僅有一個胺基酸被取代； 或可為多重取代，其中同一分子内之2個或以上之胺基酸被 取代。本發明之單萜合成酶分子活性之實質變化，可經由 以電荷及結構以天然胺基酸顯著不同之支鏈取代胺基酸獲 得。此類型取代預其可影響多肽主鏈結構及/或分子於取代 區之電荷或疏水性。 經由以電荷及/或結構與天然分子者類似之支鏈，取代 胺基酸，可預期到本發明單萜合成酶分子活性之中等改變 。此型取代稱做保守取代，大體不會改變多肽主鏈結構或 分子於取代區之電荷或疏水性。 插入單萜合成酶變異體為具有一個或多個胺基酸者， 該一或多個胺基酸緊鄰於天然單萜合成酶分子特定位置之 胺基酸插入。緊鄰胺基酸表示連結至胺基酸之α_羧基或α_ 胺基官能基。插入可為一或多個胺基酸。通常插入包括一 或兩個保守胺基酸。胺基酸之電荷及/或結構類似毗鄰插入 位置之胺基酸者定義為保守。另外，本發明包括電荷與結 構大體與毗鄰插入位置之胺基酸不同之胺基酸之插入。 刪除變異體為天然早萜合成晦分子中一或多個胺基酸 被去除者。通常刪除變異體為於單莊合成酶分子特定區刪 除一或二個胺基酸者。 生物活性及活性”等詞表示本發明之單萜合成酶將 槐牛兒基二磷酸酯轉成一組單萜之能力，其中桂葉烯為藉 桂葉烯合成酶合成之主要特徵性單萜，（-)_擰檬烯為藉 檸檬烯合成酶合成之主要特徵性單萜，及松烯為藉卜)_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂— 585918 A7 B7 五、發明説明（13 ) 松烯合成酶合成之主要特徵性單萜。本發明之單結合成酶 生產之單萜於酶活性檢定分析如實例3所述者測量。本發明 之萜合成酶之胺基酸序列變異體具有所需改變的生物活性 ，包括例如改變反應動力學，基質利用率，產物分布或其 它特性如區域化學及立體化學。 “DNA序列編碼”，“DNA編碼”及“核酸編碼，’等詞表示 沿著一股去氧核糖核酸之去氧核糖核菩酸之順序或序列。 此等去氧核糖核苔酸之順序決定沿著經轉譯多肽鏈胺基酸 之順序。如此，DNA順序編碼胺基酸順序。 “可複製表現載體”及“表現載體”等詞表示一片可插入 一片外來DNA之DNA(通常為雙股）。外來DNA定義為非同 源DNA，此乃宿主體内非天然出現之DNA。載體用於將外 來或非同源DNA轉運入適當宿主細胞内。一但於宿主細胞 ，載體可個別複製或與宿主染色體或並行複製，而產生若 干複本之載體及其經插入（外來）之DNA。此外，載體含有 使外來DNA轉譯成為多肽之必要元件。外來DNA編碼之多 個多肽分子可被快速合成。 “轉形宿主細胞”及“轉形”等詞表示引進DNA至細胞内 。細胞定名為“宿主細胞”，可為原核細胞或真核細胞。典 型原核細胞包括多種大腸桿菌株。典型真核宿主細胞為植 物細胞，如玉米細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或動物細胞。 引進之DNA通常呈含有經插入DNA之載體形式。引進DNA 序列可來自宿主細胞之同種或來自與宿主細胞不同種，或 可為雜交DNA序列，該DNA序列含有部份外來DNA及部份 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 __B7_ 五、發明説明（14 ) 衍生自宿主種屬之DNA。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 下列縮寫用於此處：bp(s)，鹼基對；DEAE，0-二乙 基胺基乙基；DTT，二硫赤絲醇；EDTA，伸乙基二胺四乙 酸；GC，氣相層析；IPTG，異丙基-β-D-硫半乳糖基萜喃 糖苷；LB，Luria_Bertani ; Mopso，3-(N-嗎琳基）-2-經丙烧 磺酸；MS，質譜/質譜術；nt(s)，核笞酸；0RF，開放讀 取架構；PCR，聚合酶連鎖反應；PVDF，聚亞乙烯基二氟 化物；SDS，十二基硫酸鈉；Tris，參（羥甲基）胺基甲烷； UV，紫外光。 根據本發明，由大冷杉（Abies grandis)分離出編碼桂葉 烯合成酶（序列識別編號·· 1)、（-)-松烯合成酶（序列識別編 號·· 3)及（-)-檸檬烯合成酶（序列識別編號：5)之cDNA，且 以下述方式決定序列。基於比較得自綠薄荷之檸檬烯合成 酶（Colby，S.M.，Alonso，W.R. ’ Katahira，E.J. ’ McGarvey ，D.J·，and Croteau，R. (1993) J. Biol· Chem. 268 : 23016-23024)、得自於草之 5-epi-aristolochene 合成酶 (Facchini，P.J·，and Chappell，J. (1992) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 89 : 11088-11092)及得自蓖麻子之蓖麻烯合成酶 (Mau，C.J.D·，and West，C.A. (1994) Proc· Natl. Acad. Sci· USA 91 : 8497-8501)之序列，而辨識出四個守恆區，就該 四區而合成持恆、簡併性引子：引子A(序列識別編號：7) 、引子B(序列識別編號：8)、引子C(序列識別編號：9)及 引子D(序列識別編號：10)。引子A(序列識別編號：7)、B( 序列識別編號：8)、C(序列識別編號：9)及D(序列識別編 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -19 - 585918 A7 B7五、發明説明（15 ) 號：10)為訊息引子，而引子C(序列識別編號：9)為反訊息 引子。藉由採用廣範圍之擴增條件而將各訊息引子A(序列 識別編號：7)、B(序列識別編號：8)及D(序列識別編號： 10)與反訊息引子C(序列識別編號：9)組合用於PCR。藉瓊 脂糖凝膠電泳之PCR反應產物分析顯示，唯有引子C(序列 識別編號：9)及D(序列識別編號：10)之組合，產生約110 bps 之特定PCR產物。 110 bps PCR產物經凝膠純化，接合至質體及轉形體大 腸桿菌XLl-Blue細胞。質體DNA係以41個各別轉形體製備 及決定插入子序列。辨識四種不同之插入子序列已辨識出 來，且標示為探針1(序列識別編號：11)、2(序列識別編號 :12)、4(序列識別編號：13)及5(序列識別編號：14)。探 針1(序列識別編號：11) 、2(序列識別編號：12) 、4(序 列識別編號：13)及5(序列辨識編號：14)用於篩檢由受傷 大冷杉萃取出之mRNA所製造之cDNA存庫，並辨識出可與 各探針雜交之最長選殖體辨識及決定順序。如此，選殖體 AG1.28(序列識別編號：15)為可雜交至探針1(序列識別編 號：11)之最長cDNA選殖體，選殖體AG2.2(序列識別編號 :1)為可雜交至探針2(序列識別編號：12)之最長cDNA選 殖體，選殖體AG4.30(序列識別編號：17)為可雜交至探針 4(序列識別編號：13)之最長cDNA選殖體及選殖體AG5.9( 序列辨識編號：19)為可雜交至探針5(序列辨識編號：14) 之最長cDNA選殖體。 截頭選殖體AG1.28(序列識別編號：15)之大小及序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 20 585918 A7 五、發明説明（ (72%相似性，49%相同性）最接近得自大冷杉之二烯環化 酶，亦即松香二烯合成酶。選殖體AG4.30(序列識別編號 :17)及AG5.9(序列識別編號：19)編碼倍半祐合成梅。選 殖體AG2.2(序列識別編號：丨）之序列及功能分析顯示其編 碼單萜合成皞，亦即桂葉烯合成酶。 將四種新穎祐合成酶cDNA順序AG1 ·28(序列識別編 號·· 15) 、AG2.2(序列識別編號·· 1} 、aG4.30(序列識 別編號· 17)及AG5.9(序列識別編號：19)與松香二烯合成 S|：(Stofer Vogel ’ B.，Wildung，M.R·，Vogel，G·，and Croteau ’ R· (1996) J. Biol· Chem. 271 : 23262-23268)對正，可辨 識出若干守恆序列方式。基於守恆蛋白質序列方式而設計 出兩種新穎訊息PCR引子，亦即引子E(序列識別編號：21) 及引子F(序列識別編號：22)。基於得自松烯合成酶之有限 序列資訊，而設計出新穎的反訊息PCR引子，亦即引子G( 序列識別編號：23)。引子E(序列識別編號：21)及引子G( 序列識別編號：23)之組合，擴增1022 bps cDNA產物，其 標示為探針3(序列識別編號：24)。 探針3(序列識別編號：24)用於篩檢從由受傷大冷杉萃 取之mRNA之cDNA的存庫。105大冷杉λΖΑΡ II cDNA選殖 體與探針3(序列識別編號：24)雜交，獲得兩型信號，該等 信號由約400強陽性選殖體及等數之弱陽性選殖體組成，這 表示探針可辨識出多於一型之cDNA。純化出34個前者選 殖體之及18個後者選殖體、以尺寸（2.0-2.5 kb)選擇出插入 子及從兩端部份定序活體試驗切下之選殖體。提供微弱雜 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS) A4规格（210X297公釐） 21 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .訂· 585918 A7 _ B7_ 五、發明説明（17 ) 交信號之選殖體，顯示出含有與桂葉烯合成酶AG2.2(序列 識別編號：1)相同之插入子，或不含任何與萜合成酶相似 之有意義序列。 產生強雜交信號之選殖體，分成截然不同之序列群， 該等群以選殖體AG3.18(序列識別編號：3)及選殖體AG10( 序列識別編號：5)為代表。AG3.18(序列識別編號：3)及選 殖體AG10(序列識別編號：5)次選殖入質體表現載體，並 於大腸桿菌表現。當使用全部可能之戊間二烯二磷酸酯基 質，試驗誘生細胞萃出物之萜合成酶活性時，僅利用槐牛 兒基二磷酸酯。含AG10(序列識別編號：5)表現構成體之 得自大腸桿菌之萃出物，將槐牛兒基二磷酸酯轉成作為主 產物之檸檬烯-4S對映異構物作為，表示AGIO(序列識別編 號：5)編碼（-)-檸檬烯結合酶。藉由無細胞之含有接合至表 現載體中AG3.18(序列識別編號：3)插入子的大腸桿菌萃出 物，對槐牛兒基二填酸酯產生之單萜產物進行類似之分析 ，顯示出存在有42.58%之α-松烯及β-松烯混合物，此與先 前描述之得自大冷杉之純天然（-)-松烯合成酶的產物比相 同。資料顯示AG3.18(序列識別編號：3)編碼（-)-松烯合成 酶。 編碼（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶，及桂葉烯合 成酶之cDNA之分離，可開發此等功能酶之有效表現系統 ;提供檢視單萜生物合成發展調節之有用工具；許可研究 此等不尋常多產物之反應機構；及許可分離其它（-)-檸檬烯 合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶。（-)-擰檬稀合成 22 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 ___B7_ 五、發明説明（18 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶的（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶cDNA之分離，也可轉 形多種有機體，俾引進單萜合成酶或修改内生性單萜之生 物合成。 . 雖然序列辨識編號：6、序列識別編號：4及序列識別 編號：2所述之（_)-檸檬烯合成酶、（_)-松烯合成酶及桂葉烯 合成酶蛋白質，將酶引導至質體，但可用該項技藝者皆知 的其他轉運序列（參見例如von Heijne et al·，Eur. J. Biochem. 180 · 535-545 5 1989 ； Stryer » Biochemistry » W.H. Freeman and Company，New York，NY，p· 769 [1988])， 取代此等酶各別之預定目標序列（序列識別編號：2、胺基 酸1至61 ;序列識別編號：4、胺基酸1至61 ;序列識別編號 :6，胺基酸1至66)，，來引導（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松 烯合成酶及桂葉烯合成酶至其它細胞或胞外位置。 除序列識別編號：6序列識別編號：4及序列識別編號 :2之（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶胺 基酸序列外，除非受先前技術所限，否則經由刪除、取代 、突變及插入所產生的序列變異體亦被認為屬於本發明之 範圍。本發明之（-)-檸檬烯合成酶，（-)-松烯合成酶，及桂 葉烯合成酶胺基酸序列變異體可以突變之編碼野生型合成 酶的DNA序列構成，例如使用俗稱位置引導突變發生技術 。編碼本發明之單萜合成酶之核酸分子可藉熟習該項技術 者所周知之多種PCR技術突變。例如參考“PCR Strategies”
5 Μ.A. Innis j D.H. Gelfand and J.J. Sninsky » eds. 5 1995 ，Academic Press，San Diego，CA (Chapter 14) ; “PCR 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -23 - 585918 A7 _B7________ 五、發明説明（19 )
Protocols : A Guide to Methods and Applications”，Μ·Α·
Innis，D.H. Gelfand，J.J. Sninsky and T.J. White，eds·' Academic Press，NY (1990) o 藉由非限制性實例，將得自Clontecn公司之轉形體位 置引導突變套件組中所用的兩種引子系統，用於將位 導突變體引進本發明之單萜合成酶基因。於此系統I目# 質體變性後，兩個引子同時環化至質體；其中一個弓1 + β 有所需位置引導之突變，而另一者含有質體内另一點 將 變，該突變導致限制位置消除。然後進行第二股合成’ 此兩種突變緊密連結，所得質體轉形至大腸桿菌mutS# ^ 質體DNA係以相關限制酶從轉形細菌分離出來（藉此使^ 突變質體直線化），然後再轉形成大腸桿菌。此系統許 表現質體直接產生突變，而無需次選殖或產生單股嗜菌# 。兩種突變緊密連結及隨後未突變質體的直線化，造成@ 突變效率，因此只需做最低篩檢。此種方法於初步限制位 置引子合成後，僅需對每個突變位置使用一個新引子類$ 。並非分開準備各個位置突變體，而是合成一組“經設計簡 併，，之寡核苷酸引子，俾同時引進特定位置之所需突變。藉 由透過突變區決定質體DNA序列，可篩檢出轉形體以辨識 出並分類突變選殖體。然後各突變DNA經限切及於突變檢 測增進凝膠（J.T. Baker)受到電泳分析後，證實序列中未出 現其它變化（藉帶移位與未突變對照組比較）。 用pET(或其他）過度表現載體中之經過確認的突變二 倍體，轉形大腸桿菌（如大腸桿菌BL21(DE3)pLysS株），以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） -24 - c請先閲讀背面之法意事項再璘寫本買) ,tr— 585918 A7 --~____B7_____ 五、發明説明（2〇 ) 供用於高度生產突變體蛋白質及以標準程序進行之純化。 FAB-MS映對方法可用於快速檢查突變體表現之可靠度。 此種技術提供定序全體蛋白質之片段，及於序列對正提供 所需可靠度。於此類映對實驗中，蛋白質以蛋白酶消化（ 因此片段為主要興趣所在，故蛋白酶之選擇依據待修改之 特定區而定，，而其餘映對表需與未突變蛋白質之映對表 相同）。割裂段組藉微孔HPLC分段（再度依據待修改之特定 區而決定反相或離子交換，）於各段提供若干肽，肽之分子 重量係由FAB_MS決定。然後比較該質量與預期序列消化 所得肽之分子量，快速確定序列正確性。因此種蛋白質修 改之突變發生方法有方向性，若MS符合預測程度則無需改 變肽順序。若需要確認改變殘基，則CAD-銜接MS/MS可用 於決定所討論之混合物肽或目標肽之序列，該純化目標肽 係純化來用於依修改位置進行鹼除式愛德蒙分解或羧肽酶 Y消化。 特定位置引導突變設計中，通常需要先做非守恆性取 代（例如Ala取代Cys、His或Glu)，以及測定活性是否大為 受損作為結論。然後檢測突變化的蛋白質之性質，且特別 注意作為改變功能之敏感指標的Km&keat動力學參數，從 該等參數，可藉由與天然酶做比較來推演出結合及/或催化 本身之變化。若殘基以此種方式藉由活性之損傷或剔除種 而被證實是重要的，則進行守恆性取代，例如以Asp取代 Glu來改變支鏈長度，Ser取代Cys，或Arg取代His。對於疏 水段，通常改變之尺寸不大，但芳族化合物也可取代烷基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公爱） -25 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、可I π费， 585918 A7 __B7_ 五、發明説明（21 ) 脂鏈。正常產物分布上的變化可指示反應順序之哪個步驟 已被突變改變。疏水袋狀構造之修改可用於改變基質之結 合構造，造成區域化學及/或立體化學之改變。 其他位置引導突變發生技術也可用於本發明之核苷酸 序列。例如，於接合後，DNA之限制核酸内切酶的消化作 用，可用於產生（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉 烯合成酶之刪除變異體，如Sambrook等15.3節所述 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual > 2nd Ed. » Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，NY [1989]) ° 類似策略可用於如Sambrook等（參見上文）於15.3節所述構 成插入變異體。
募核苷酸引導突變發生也可用於製備本發明之取代變 異體。也可用於方便地製備本發明之刪除及插入變異體。 此種技術為該項技術所周知者，且描述於Adelman等（DNA 2 ·· 183 [1983]) ; Sambrook et al.，supra ; “Current Protocols in Molecular Biology”，1991，Wiley (NY)，F.T. Ausubel ，R· Brent，R.E· Kingston，D.D· Mo〇re，J.D. Seidman , J.A. Smith and K. struhl，eds o 通常，將長度至少為25個核苷酸之寡核苷酸用於插入 、刪除或取代（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉婦 合成酶分子中之二或多種核苔酸。最佳寡核苷酸於編碼供 突變之用的核苷酸二侧有12至15個完美匹配的核苔酸。為 了突變野生型（-)-檸檬烯合成酶、（-)_松烯合成酶及桂葉稀 合成酶，募核苔酸於適當雜交條件下退火成為單股DNA模 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） -26 - Γ請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁} •、訂| 585918 A7 _B7_ 五、發明説明（22 ) 版分子。然後加入DNA聚合酶（通常為大腸桿菌DNA聚合酶 I之克諾（Klenow)段）。此種酶使用寡核苷酸做引子而完成 DNA突變股之合成。如此，非同源二倍體分子形成，藉此 其中一股DNA編碼插入載體之野生型合成酶，及第二股 DNA編碼插入同一載體之合成酶的突變形。此種非同源二 倍體分子隨後轉形入適當宿主細胞。 可以若干方式產生具有多於一個被取代的胺基酸之突 變體。若胺基酸接近多肽鏈，則可使用編碼全部所需胺基 酸取代之寡核苔酸，同時使該等接近多肽鏈之胺基酸突變 。但若胺基酸彼此相距某個距離（例如由多於10個胺基酸隔 開），則較難以產生編碼全部所需變化的單一寡核苷酸。取 而帶知的是可使用兩種替代法的其中之一。第一方法中， 產生對各個待取代之胺基酸的各別募核誓酸。然後將募核 苷酸同時退火成單股模版DNA，然後由該模版合成之第二 股DNA會編碼全部所需胺基酸取代。替代方法包括兩回合 或多回合之突變以產生所需之突變體。第一回合係如前述 般用於單一突變體：使用野生型（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松 烯合成酶及桂葉烯合成酶DNA做模版，將一編碼第一所需 之胺基酸取代體的寡核苷酸退火至該模版，然後產生非同 源二倍體DNA分子。第二回合突變則利用第一回合突變所 產生之突變DNA做模版。如此，此模版已含一或多種突變 。然後，將編碼額外所需胺基酸取代體之寡核苔酸退火成 至此模版，且馬上將所得之DNA股編碼來自第一及第二回 合突變之突變體。所得DNA可用於第三回合突變中之模版 27 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 _ B7_ 五、發明説明（23 ) 等。 編碼（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成 酶之基因可合併入產生槐牛兒基二磷酸酯之生物（完整植 物、動物、微生物等）或從該等生物衍生而來的細胞培養產 生槐牛兒基二磷酸酯。可將（-)-檸檬烯合成酶、（-)_松烯合 成酶及桂葉烯合成酶基因引進任一種生物而用於多種用途 ，包括（但非限於）··生產（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成 酶及桂葉烯合成酶，或其產物；產生或修改香味及芳香性 質；改良防衛能力及改變由桂葉烯、（-)-檸檬烯（-)_松烯或 其衍生物媒介之其他生態交互作用。 真核表現系統可用於生產（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯 合成酶及桂葉烯合成酶，原因為其可進行任何所需轉譯後 修改並導引酶至適當膜位置。供此目的使用之代表性真核 表現系統，使用重組桿病毒、Aulographa californica核多 面體病毒（AcNPV ; M.D. Summers and G.E. Smith，A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Inseci Cell Culture Procedures [1986]; Luckow et al. ’ Bio-technology 6 :[1987])以供表現本發明之萜合成酶。以重組桿病 毒减染尾蟲細胞（如種屬Spodoptera furgiperda細胞）可生 產大量單格合成酶蛋白質。此外，桿病毒系統具有其他生 產重組（_)-彳寧檬烯合成酶、（-)-松稀合成酶及桂葉稀合成峰 之重要優點。例如，桿病毒不會影響人類，故可大量安全 地處理。桿病毒系統中，DNA構成體之製備包括編碼（-)-才露樣稀合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶之DNA段及 票準(⑽娜(210Χ297公變) 28 .........I .......訂 ,♦------* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 ____B7 五、發明説明（24 ) — _ 載體。載體包含桿病毒之多面體基因啟動基因區、重組過 程中之適當交叉所需之桿病毒側出序列（側出序列包含毗 鄰啟動子序列的約200-300基對）及可讓構成體在細菌中複 製之細胞來源複製區。建構載體，藉此⑴將DNA段定位於 多面體基因啟動子附近（或可操作地連結至該啟動子或定 位“於該啟動子下游地，，或“在控制下地定位，，）；及（ii)將啟 動基因/單萜合成酶組合側接於2〇〇-3〇〇個邱之桿病毒DNA 的兩側（側出序列）。 為了產生單fe合成酶DNA構成體，而用本文中所述之 方法獲得編碼全長（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂 葉烯合成酶之cDNA選殖體。cdNA構成體於宿主細胞中， 在執行重組條件下，與適當的桿病毒之桿病毒DNA接觸（ 亦即作為於構成體中編碼之啟動子的桿病毒同屬）。所得重 組桿病毒編碼完整之檸檬烯合成酶、松烯合成酶及 桂葉烯合成酶。例如，昆蟲宿主細胞可共同轉染或各別轉 染DNA構成體及功能性桿病毒。然後將所得之重組桿病毒 分離而用於感染細胞以執行單萜合成酶之生產。宿主昆蟲 細胞包括例如Spodptyera frugiperda細胞，該細胞可產生表 現單萜合成酶之桿病毒。然後，在可讓桿病毒編碼檸檬 烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶表現的條件下， 培養以本發明之重組桿病毒感染之昆蟲宿主細胞然後使用 該技藝中已知的方法，從細胞萃取出如此產生之（〇 -檸檬烯 合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶。 其他真核微生物（如酵母菌）可用於實施本發明。發酵 本紙張尺度適用中國國家標準A4規格（21〇χ297公董） 29 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂丨 585918 A7 _B7___ 25 五、發明説明（ ） 酵母Saccharomyces cerevisiae為常用酵母，（雖然也可採用 若干其他株之酵母）。質體YRp7(Stinchcomb et al.，Nature 282 : 39 [1979] ; Kingsman et al·，Gene 7 : 141 [1979]; Tschemper et al·，Gene 10 : 157 [1980])常用做
Saccharomyces之表現載體。質體含有trpl基因，其對無法 於色胺酸生長之酵母突變株[如ATCC No· 44,076株及 PEP4-1 株（Jones，Genetics 85 : 12 [1977])]提供選擇標記。 然後，trpl病變的存在可在沒有色胺酸的情況下提供檢測 轉形的有效環境，該trpl病變的存在係為酵母宿主細胞基 因組的一個特徵。酵母宿主細胞通常使用聚乙二醇方法轉 形，如Hinnen(Proc. Natl. Acad. Sci· USA 75 : 1929 [1978]) 所述般。其他酵母轉形提案述於Gietz et al·，N.A.R· 20(17) 1425(1992) ; Reeves et al·，FEMS 99(2-3) : 193-197，（1992) o 酵母宿主中之適當啟動序列包括3-磷酸甘油酯激酶 (Hitzeman et al·，J. Biol. Chem· 255 : 2073 [1980])或其他 糖解酶（Hess et al·，J· Adv. Enzyme Reg· 7 : 149 [1968]; Holland et al·，Biochemistry 17 : 4900 [1978])之啟動子， 諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸酯去氫酶、己基酶、丙酮酸酯 脫縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酯異構酶、3-磷酸 甘油酯激酶及葡萄糖激酶。適當表現質體的組成中，與此 等基因結合之端末序列，也接合至所需序列之表現載體3’ 中，而提供mRNA之聚腺苷化作用及加端基作用。其他具 有由生長條件控制之轉錄所造成之其他優點的啟動子，係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公董） -30 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
•、可I - 585918 A7 ___B7__ 五、發明説明（26 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 為下列者的啟動子區：醇去氫酶2、異胞色素C、酸性磷酸 酶、氮代謝相關分解酶及前述甘油醛-3-磷酸酯去氫酶，及 對應於麥芽糖及半乳糖利用之酶。任何含酵母相容啟動子 、複製起點及結束序列之質體載體皆適合。 衍生自多細胞生物（如植物之細胞培養）可用做宿主以 實施本發明。可藉由下列方式獲得轉殖基因植物：例如將 編碼（-)-檸檬稀合成梅、（-)-松嫦合成酶，及桂葉稀合成酶 ，及可選擇標記基因例如編碼康黴素抗性之kan基因質體轉 形入含助手 Ti質體之Agrobacterium tumifaciens(如 Hocckema et al·，Nature 303 : 179-181 [983]所述），及將 Agrobacterium細胞與待轉形植物葉切片一起培養（如An et al.，Plant Physiology 81 : 301-305 [1986]所述）。如前所述 ，經培養的植物宿主細胞之轉形通常經由Agrobacterium tumifaciens完成。哺乳類宿主細胞及其他不含剛性細胞膜 障壁之宿主細胞的培養，通常使用磷酸鈣方法轉形（該方法 最初述於Graham and Van der Eb(Virology 52 : 546 [1978]) ，及修改（如上述Sambrook等人之16.32-16.37節所述）。但 ，亦可使用其他將DNA引至細胞内之方法，例如： Polybrene(Kawai and Nishizawa，Mol. Cell. Biol· 4 : 1172 [1984])、原生質體融合（Schaffner，Proc·Natl·Acad·Sci· USA 77 : 2163 [1980])、電穿孔（Neumann et al·，EMBO J. 1 :841 [1982])及直接顯微注射入細胞核（Capecchi，Cell 22 :479 [1980])。此外，動物轉形策略綜論於Monastersky G.M· and Robl，J.M·，Strategies in Transgenic Animal Science 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -31 - 585918 A7 B7 五、發明説明（27 ) ，ASM Press，Washington，D.C.，1995。藉由使細胞生長 於一培養基上透過適當標記來選擇轉形植物癒合組織，， 該培養含有例如基康黴素及適量之植物激素，如萘乙酸及 苄基腺嘌呤，該等供用於癒合組織及細枝之誘生。然後可 使植物細胞再生，並用熟習該項技術者所熟知的方法將所 得之植物轉移至土壤。 此外，調節（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉 烯合成酶產量之基因，可與可誘生之必要啟動子合併入植 物體。本發明之此具體例實施例之實施中，僅對特定外部 或内部刺激產生反應之啟動子係被融合至目標cDNA。因 此，基因除非對特定刺激產生反應，否則不會轉錄。只要 基因不被轉錄，就不產生其基因產物。 可用於本發明實施之反應性啟動子系統之說明實施例 ，為玉米之麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)。GST為一族可解毒 多種疏水親電子化合物之酶，該化合物常用做萌前殺草劑 (Weigand et al.j Plant Molecular Biology 7*235-243 [1986]) 。研究顯示GST直接涉及引發殺草劑耐性增強。此種作用 主要透過特定1.1 kb mRNA轉錄產物媒介。簡言之，玉米 已具有天然無聲基因，其可對外部刺激產生反應，且該反 應可被誘發以產生基因產物。此種基因先前被辨識及選殖 出來。因此，本發明之一具體例中，啟動子由GST反應基 因移出及附著於（-)_檸檬烯合成酶、（-)_松烯合成酶及桂葉 烯合成酶基因（其等先前已經去除天然啟動基因）。此種基 因工程加工基因為對外部化學刺激之啟動子產生反應之啟 32 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 __B7_ 五、發明説明（28 ) 動子與負責成功地生產（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶 及桂葉烯合成酶之基因的組合。 除前述方法外，該項技術中已知若干方法將選殖DNA 轉錄至多種植物種屬，包括裸子植物、被子植物、單子葉 植物及雙子葉植物（參考例如Glick and Thompson，eds.， Methods in Plant Molecular Biology，CRC Press，Boca Raton，Florida [1993])。代表性範例包括以電穿孔加速DNA 被原生質體攝取（Rhodes et al·，Science 240(4849): 204-207 [1988] );以聚乙二醇處理原生質體（Lyznik et al·，Plant Molecular Biology 13:151-161 [1989]);及細胞與載有 DNA 之微喷射器碰撞（Klein et al·，Plant Physiol· 91 : 440-444 [1989] and Boynton et al.，Science 240(4858) : 1534-1538 [1988])。此外，植物轉形策略及技術綜論於Birch，R.G· ，Ann. Rev. Plant Phys· Plant Mol· Biol· 48 : 297(1997); Forester et al·，Exp. Agric. 33 : 15-33 (1997)。略為變化使 此等技術可應用於廣泛多種植物。 各技術有其優缺點。各技術中，得自質體之DNA經基 因工程處理而不僅含有感興趣的基因，也含有可選擇及可 篩檢標記基因。可選擇的標記基因僅用於選擇具有該質體 完整複本之細胞（其構造使感興趣基因及可選擇及可篩檢 基因呈一個單位被移轉）。可篩檢基因可檢查是否僅成功地 培養載有感興趣基因之細胞。常用之可選擇標記基因為新 黴素磷酸轉移酶Π(ΝΡΤ II)。此種基因傳遞康黴素抗性，康 黴素可直接添加至細胞生長培養基。植物細胞通常對康黴 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -33 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
585918 A7 —________B7_____ 五、發明説明（29 ) 素敏感且會導致其死亡。存有NPT II基因可克服康黴素影 響’含此種基因之細胞則保持存活。另一種可用於本發明 實施之可選擇標記基因為可賦與對殺草劑 glufosinate(Basta)產生抗性之基因。常用可篩檢基因為卜 葡萄糖醛苷酶基因（GUS)。此種基因之存在可使用組織化 學反應予以特徵化，其中推定經轉形細胞之樣本以（^^檢 定分析溶液處理。經適當培育後，含GUS基因細胞轉成藍 色。 藉由前述任一種技術將含一或多種基因之質體引進植 物原生質體或癒合組織細胞。若標記基因為可選擇基因， 則在適當細胞毒劑的選擇下，唯有合併有整組DNA的鈿胞 可以存活。一但適當細胞被辨識出來且經繁殖，則植物可 再生。必須測試從轉形植物所來之後代以確保整組DNA成 功整合入植物基因組。 哺乳動物宿主細胞可用於本發明實施，適當哺乳動物 細胞株範例包括藉SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)轉形之 猴腎CVI細胞株；人胚胎腎細胞株2933(0以1^11161&1·，】· Gen· Virol· 36: 59 [1977]);嬰倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞（Urlab and Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216 [1980]);小鼠赛托利氏細胞（TM4, Mather ，：Biol. Repord. 23 : 243 [1980]);猴腎細胞（CVI_76，ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587)
;人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK ，ATCC CCL 34);水牛城大鼠肝細胞（BRL 3 A，ATCC CRL 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） -34 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、可I •费· 585918 A7 _______B7__ 五、發明説明（3〇 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1442);人肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人肝細胞（Hep G2 ’ HB 8065);小鼠乳腺瘤細胞（MMT 060562, ATCC CCL 51) ，大鼠肝細胞瘤細胞（HTC，MI.54，Baumann et al.，J. Cell
Biol. 85 : 1 [1980]);及TRI細胞（1^11^^{&1.，人1111&18 1^.丫· Acad· Sci. 383 : 44 [1982])。此等細胞之表現載體通常（依 需要）包括複製起點、代表性基因前方之啟動子、核糖體結 合位置、RNA結合位置、聚腺菩化作用位置及轉錄終結子 位置之DNA序列。 用於哺乳動物表現載體之啟動子常為病毒來源。病毒 啟動子常衍生自多發瘤病毒、腺病毒2及最常見之猴病毒 40(SV40)。SV40病毒含有兩個定名為早期及晚期啟動子之 啟動子。此二啟動子特別有用原，因為易呈單一DNA段從 病毒獲得，且該段也含有病毒複製的起點（Fiers et al.， Nature 273 : 113 [1978])。也可使用較小或較大SV40 DNA 段，但條件是其等含約250_bp序列，該等序列由Hindlll位 置朝向位在病毒複製起點之Bgll位置延伸。 另外，自然連結外來基因（同源啟動子）之啟動基因也 可使用，但條件是其等需與選用於轉形之宿主細胞株相容 〇 複製起點可以係得自外源性基因，如SV40或其他病毒 (如多發瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，且可被插入選殖 載體中。另擇地，可由宿主細胞染色體複製機轉提供複製 起點。若將含外來基因之載體整合至宿主細胞染色體中， 則後者通常係足夠的。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） '35 - 585918 A7 ________B7_ 五、發明説明（31 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用二次DNA編碼序列可增進（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶於轉形細胞株之產量。二次編 碼序列典型包含二氫葉酸還原酶（DHFR)。野生型DHFR通 常由化學甲胺喋呤（MTX)抑制。DNFR於細胞中之表現程度 會隨添加至經培養之宿主細胞的MTX量改變。DHFR可用 來作為辨識出轉形細胞之選擇標記的特點，使其特別可用 作為二次序列辨識。可用來作為二次序列之兩型DHFR為 野生型DHFR及MTX·抗性DHFR。用於特定宿主細胞之 DHFR類型，視宿主細胞是否有DHFR缺陷而定（如此會造成 宿主細胞内生極低濃度之DHFR，或完全未產生功能性 DHFR) 〇 DHFR缺陷細胞株（如上文戶斤述之Urlaub及Chasin 中所述之CHO細胞株）以野生型DHFR編碼序列轉形。轉形 後，該等DHFR缺陷細胞株表現功能性DHFR，且可於缺養 份次黃嘌呤、甘胺酸及胸腺核苷之培養基生長。而未轉形 細胞就無法於該培養基存活。 MTX-抗性型DHFR可用來作為選擇工具，以從内生正 常量的功能性DHFR之宿主細胞中，選擇出經轉形的宿主 細胞，而該功能性DHFR對MTX具有敏感性。CHO_KI細胞 株（ATCC No· CL 61)具有此等特性，且因此而可用作為供 此種目的之用的細胞株。添加MTX至細胞培養基中，可僅 讓以編碼MTX抗性DHFR之DNA轉形的細胞生長。未轉形 細胞無法存活於此種培養基。 原核細胞也可用做本發明初步選殖步驟之宿主細胞。 特別可用於快速生產大量DNA、生產用於位置導向突變之 本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（210X297公董） -36 - 585918 A7 ____B7_ 五、發明説明（32 ) 單獨DNA模版、同時篩檢出許多突變體以及決定所產生之 突變體的DNA序列。適當原核宿主細胞包括大腸桿菌K12 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
株 94(ATCC No. 31，446)、大腸桿菌株 W3110(ATCC No. 27,325)、大腸桿菌 X1766(ATCC No· 31,537)及大腸桿菌 B ;但多種其他大腸桿菌株（如HB101，JM101、NM522、 NM538、NM539)及多種其他原核細胞之種及屬（如桿菌 類如枯草桿菌）、其他腸細菌科（如傷寒桿菌或Serratia marcesans )及多種假單胞桿菌株也可用做宿主。原核宿主 細胞或其他具剛性細胞壁之宿主細胞，以使用氯化鈣方法 轉形為較佳，該方法如上文所提之Sambrook等人於1.82節 所述。另外，電穿孔可用於此等細胞轉形。原核細胞轉形 技術述於Dower，W.J.，in Genetic Engineering，Principles and Methods，12 : 275-296，Plenum Publishing Corp.，1990 ;Hanahan et al.，Meth· Enxymol.，204 : 63 (1990) o 舉代表例而言，可將編碼（_)-檸檬烯合成酶、（-)-松 烯合成酶或桂葉烯合成酶之cDNA序列移轉至市售之 (His)6*Tag pET載體（得自Novagen公司），以在作為非同 源宿主的大腸桿菌中過度表現。該PET表現質體於高度非 同源表現系統中具有多種優點。所需cDNA插入子對準架 構接合至編碼六個組胺酸之質體載體序列’該序列之後係 為高度特異性蛋白酶辨識位置（凝血酶），該位置接合至目 標蛋白質之胺基端子之密碼子。經表現的融合蛋白質之組 胺酸“嵌段，，促使至固著金屬離子之結合非常緊密，且可使 重組蛋白質藉由固著金屬離子親和層析法快速純化。然後 本紙張尺度適用中國國家標準（0^) A4规格（210X297公爱） -37 - A7 ^ _B7_ 五、發明説明（33 ) 藉由純化蛋白質處理以凝血酶於特定蛋白分解位置裂解組 膝酸前導基因序列，且再度藉固著金屬離子親和層析法純 化0)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯合成酶，本 次使用較淺之咪唑梯度以洗提出重組合成酶，同時留下仍 被吸附之組胺酸段。此種過度表現-純化系統具有高容量、 絶佳解析力並且快速，而且（於凝血酶蛋白質分解前及後） 污染到具有類似結合表現之大腸桿菌蛋白質的機會極低。 熟習該項技藝者顯然易知，含複製子及控制序列（衍生 自與宿主細胞相容種系）之任何質體載體也可用於本發明 之實施。載體通常具有複製位置、標記基因（提供在轉形 細胞中進行基因型選擇）、一或多個啟動子及多聯結子區（ 該區含有若干供外來DNA插入之限制位置）。典型用於轉 形大腸桿菌之質體包括pBR322、pUC18、pUC19、pUCI18 、pUCI19及Bluescript M13，該等皆述於上述之Sambrook 等人文獻之1.12-1.20節。但，也可使用多種其他適當載體 。此等載體含有編碼安比西林及/或四環素抗性基因，該等 基因可使以此等載體轉形之細胞於抗生素的存在下生長。 常用於原核載體之啟動子包括β-内醯胺酶（青黴素酶） 及乳糖啟動子系統（Chang et al·，Nature 375 : 615 [1978] ;Itakura et al.，Science 198 : 1056 [1977] ; Goeddel et al· ，Nature 281 : 544 [1979])，及鹼性磷酸酶系統（Goeddel et al.，Nucl· Acids Res. 8 ·· 4057 [1980] ; EPO Appl. Publ. No. 36,776)以及鹼性磷酸酶系統。雖然此等係為最常用的，但 其他微生物啟動子也曾被使用過，核苷酸序列相關細節已 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公董） -38 - --------------------0^:,…….......、可------------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 --——__B2_ 五、發明説明（34 ) 經公開’此可使熟習該項技藝者將前述啟動子功能性地接 合至質體載體中（參考 Siebenlist et al.，Cell 20: 269 [1980]) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ο 多種通常由細胞分泌之真核蛋白質，含有一種内生分 泌信號序列，該序列係作為胺基酸序列之一部份。因此， 通常存在於胞質中的蛋白質，可經由連結信號序列至該蛋 白質而被鎖定做為分泌目標。此易於藉由將編碼信號序列 之DNA至編碼蛋白質之DNA的5,端，然後於適當宿主細胞 表現此種融合蛋白質來達成。編碼信號序列之DNA可以限 切片段得自於任何編碼具有信號序列之蛋白質的基因。如 此’原核、酵母及真核信號序列可視實施本發明時所使用 之宿主類型而可用於此。編碼若干真核基因信號序列部份 之DNA及胺基酸序列（包括例如人生長激素、前胰島素及 前白蛋白）為已知（參考 Stryer，Biochemistry W.H. Freeman and Company，New York，NY，ρ· 769 [1988])，且可用作 為適當真核宿主細胞中之信號序列。至於例如酸性磷酸酶 (Arima et al·，Nuc· Acids Res· 11 : 1657 [1983])、oc-因子 、鹼性磷酸酶及反錄酶之酵母信號序列，可用於引導酵母 宿主細胞之分泌。得自編碼例如LamB或OmpF(Wong et al· ，Gene 68 : 193 [1988])、MalE，PhoA 或 β-内醯胺酶及其 他基因之原核信號序列可用於使來自原核細胞之蛋白質達 至培養基中。 得自植物、動物及微生物之交換（Trafficking)序列用於 本發明實施中以引導本發明之單萜合成酶蛋白質至胞質、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） -39 - 585918 A7 _B7_ 五、發明説明（35 ) 内質網、微粒體或其他細胞組件，或使蛋白質達至培養基 。此等考慮應用於過度表現（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合 成酶及桂葉烯合成酶，及應用於細胞或完整生物之表現以 使基因產物可於任何期望位置發揮功能。 使用標準重組DNA程序製備含有編碼複製序列、調節 序列、基因型選擇基因之DNA及感興趣之單萜合成酶DNA 的適當載體構造。如熟習該項技藝者所知般，使經分離的 質體及DNA片段以特定順序裂解、修剪及接合在一起以產 生所需載體（例如參考Maniatis，參見上文及Sambrook等， 參見上文）。 如前述，（-)-檸檬烯合成酶、（-)-松烯合成酶及桂葉烯 合成酶變異體以藉由利用位置特異性突變法產生之突變來 生產為較佳。此種方法需要合成及使用特定寡核苷酸，該 寡核苔酸編碼所需突變序列及足量毗鄰核苷酸兩者以使寡 核苷酸可穩定雜交至DNA模版。 參照下列代表性實施例將可更為明暸前文所述，其中“ 質體”係以接在文數標記後小寫P標示。用於本發明之起始 質體可為市售可得者、公眾可取得或可不受限制就可取得 者或可用公開程序以可得之質體組成者。此外，其他等效 之質體已為該項技術所知且對熟習該項技藝者而言係顯然 易明的。 DNA之“消化”，“裂解”或“割裂”表示使用僅作用於 DNA特定位置之酶催化裂解DNA。此等酶稱做限制核酸内 切酶，且沿著每一酶裂解之DNA序列之位置稱做限制位置 40 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 ___B7_ 五、發明説明（％ ) 。本發明使用之限制酶為市售可得且係根據製造商之指示 使用。（亦參考Sambrook等，參見上文之1.60-1.61節及 3.38-3.39節）。 限制消化而來的特定DNA段由之“回收’’或“分離”表示 所得之DNA段，在聚丙烯醯胺或瓊脂凝膠上藉電泳分離、 經由比較其相對於已知分子量之標記DNA段之活動性而 被辨識出來、去除含所需段之凝膠部份及由DNA分離凝膠 。此種程序普遍地為人所知。例如參考Lawn等（Nucleic Acids Res. 9 : 6103-6114 [1982])，及Goeddel et al.(Nucleic Acids Res·，參考上文）。 下列實例僅供舉例說明實施本發明之最佳模態而絕非 限制本發明。此處引述之參考文獻皆併述於此以供參考。 實例1 以PCR為主-產生用於選殖得自大冷杉（Abies grandis)之單 萜合成酶的探針 基質、反應劑及cDNA庫：如前述般製備[1_3H]桅牛兒 基二填酸 g旨（250 Ci/mol)(Croteau，R·，Alonso，W.R·，Koepp ，Α·Ε·，and Johnson，Μ·Α· (1994) Arch· Biochem· Biophys. 309 : 184-192)、[1-3H]法尼基二磷酸酯（125 Ci/mol)(Dehal ，S.S·，and Croteau，R. (1988) Arch· Biochem. Biophys· 261 :346-356)及[1-3H]槐牛兒基槐牛兒基二磷酸酯（120 Ci/mol)(LaFever，R.E.，Stofer Vogel，Β·，and Croteau， R. (1994) Arch. Biochem· Biophys· 313 : 139-149)。萜標標 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210 X 297公釐） 41 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、可 585918 A7 _B7___ 五、發明説明（37 ) 準品係為申請人所有。除非另行陳述，否則所有其他生物 化學品及反應劑係購自Simga化學公司或Aldrich化學公司 。如前述般，使用由創傷大冷杉幼莖分離之mRNA組成 λΖΑΡ II cDNA庫（Stofer Vogel，B.，Wildung，M R.，Vogel ，G.，and Croteau，R. (1996) J. Biol· Chem. 271 : 23262-23268) 〇 以PCR為主產生探針：基於得自綠薄荷之檸檬烯合成 酶（Colby，S.M·，Alonso·，W.R·，Katahira，E.J·，McGarvey ，D.J·，and Croteau，R. (1993) J. Biol· Chem. 268 : 23016-23024)、得自於草之 5-epi_aristolochene 合成酶 (Facchini，P.J.，and Chappell，J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 11088-11092)及得自蓖麻子之蓖麻烯合成酶 (Mau，C.J.D·，and West，C.A. (1994) Proc. Natl, acad· Sci· USA 91 : 8497-8501)之序列的比較，辨識出四個守恆區， 就該等守恆區合成一組致簡併性引子··引子A(序列識別編 號：7)、引子B(序列識別編號：8)、引子C(序列識別編號 :9)、引子D(序列識別編號：10)。引子A(序列識別編號： 7)、引子B(序列識別編號：8)及引子C(序列識別編號：9) 已述明如前（Steele，C.，Lewinsohn，E· and Croteau，R. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4164-4168 (1995));引子 D(序列識別編號：10)係基於前述萜合成酶之守恆胺基酸序 列 DD(T/I)(T/Y/F) D(A/V)Y(A/G)(序列識別編號：25)設計 (Colby，S.M.，Alonso，W.R.，Katahira，E.J.，McGarvey ，D.J.，and Croteau，R. (1993) J. Biol· Chem. 268 ·· 42 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公楚） 585918 A7 〜--------Β7____ 五、發明説明（38 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 23016-23024 > Facchini 5 P.J. » and Chappell j J. (1992) Proc. Natl. Acad· Sci· USA 89 : 11088-11092 ; Mau，C.J.D·，and West，C.A· (1994) Proc· Natl, acad· Sci· USA 91: 8497-8501) o 採用寬廣擴增條件範圍，將各訊息引子A(序列識別編 號：7)、B(序列識別編號：8)及D(序列識別編號·· 10)用於 PCR以與反訊息引子C(序列識別編號：9)組合。PCR係於 總容積為50微升之含有下列者進行：20 mM Tris/HCl(參（ 羥甲基）胺基甲烷/HC1，pH 8.4)、50 mM KCn、5 mM MgCl2 、200 μΜ之各dNTP，1-5 μΜ之各引子、2·5單位Taq聚合 酶(BRL)，及5微升作為模版之純大冷杉醇CDNA存庫噬菌 體(1.5 X 109 pfu/ml)。藉瓊脂凝膠電泳分析PCR反應產物 (Sambrook，J·，Fritsch，E.F·，and Maniatis，T. (1989) Molecular Cloning ' A Laboratory Manual » 2nd Ed. 5 Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)顯示 唯有引子C與D之組合產生約110 bps(鹼基對）之特定PCR 產物。PCR產物經過凝膠鈍化，接合入pT7Blue(Novagen) ，及轉形入大腸桿菌XLl-Blue細胞。以41個個別轉形體製 備質體DNA，並決定插入子之序列（染料具有終結子週期決 定序列，應用生物系統公司）。辨識出四種不同插入子序列 ，該等序列標示為：探針1(序列識別編號：11)、2(序列識 別編號：12)、4(序列識別編號：13)及5(序列識別編號：14) 〇 隨後分離出四種新穎cDNA種系（AG2.18(序列識別編 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） -43 585918 A7 ________B7 五、發明説明（39 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 號：15)、AG2.2(序列識別編號：丨）、aG4.30(序列識別編 號：17)及AG5.9(序列識別編號：19))，其等分別編碼得自 大冷杉之祐合成酶，而該等結合成酶分別對應於探針丨（序 列識別編號：11)、2(序列識別編號：12)、4(序列識別編號 :13)及5(序列識別編號：14)，此種分離許可辨識出額外 三種守恆序列元件，該等序列元件用於設計三個新穎PCR 引子組··引子 E(5’-GGI GA(A/G) A(A/C)(A/G) (A/G)TI ATG GA((A/G) GA(A/G) GC-3’)(序列識別編號·· 21);引子 F(5’-GA(A/G) (C/T)TI CA(A/G) (C/T)TI (A/C/T)(C/G/T)I (A/C)GI TGG TGG-3’）（序列識別編號：22)，及引子 G(5’-CCA (A/G)TT IA(A/G) ICC(C/T)TT IAC(A/G)TC-3，)( 序列識別編號：23)。 簡併性引子写（序列識別編號：21)設計成守恆元件 GE(K/T)(V/I)M(E/D)EA(序列識別編號：26)，及簡併性引 子F(序列識別編號：22)設計成守恆元件 Q(F/Y/D)(I/L)(T/L/R)RWW(序列識別編號：27)，設計方式 係比較5種得自大冷杉之經選殖的萜合成酶序列，該5種萜 合成酶序列為··一種對應於探針2(序列識別編號：12)之單 萜合成酶、兩種對應於探針4(序列識別編號：13)及探針5( 序列識別編號·· 14)之倍半萜合成酶（亦即前述二萜合成酶 )(Stofer Vogel，B·，Wildung，M.R·，Vogel，G.，and Croteau ，R· (1996) J· Biol· Chem· 271 : 23262-23268)截頭萜合成 酶對應於探針1(序列識別編號：11)。簡併性引子G(序列識 別編號·· 23)係根據得自肽之胺基酸序列DVIKG(F/L)NW( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） -44 - 585918 A7 _____B7__ 五、發明説明（40 ) 序列識別編號：28)設計，該肽係以胰蛋白酶消化得自大冷 杉之純（-)-松烯合成而酶產生。引子E(序列識別編號·· 21) 及F(序列識別編號：22)分別與引子G(序列識別編號：23) 組合用於PCR擴增，並用大冷杉莖cDNA存庫作為模版。引 子E(序列識別編號：21)與G(序列識別編號：23)組合獲得 約1020 bp之特定PCR產物。將此種PCR產物接合入pT7Blue 及轉形入大腸桿菌XLl-Blue。質體DNA係由20個各別轉形 體製備及插入子係由兩端決定序列。此一 1022 bp插入子之 序列對全部20個質體而言係為相同，且命名為探針3(序列 識別編號：24)。 實例2 篩檢受傷大冷杉莖cDNA存庫 就存庫篩檢而言，係以PCR擴增、凝膠純化、用 [a-32P]dATP隨機標記放大100毫微克之各探針（Feinberg， Α·Ρ·，and Vogelstein，Β· (1984) Anal. Biochem· 137 : 266-267)，並將該等探針個別用於篩檢模寫濾膜，該濾膜 含105舖於大腸桿菌LE392上之創傷誘發之大冷杉莖cdnA 存庫的溶菌斑。與探針1(序列識別編號：11)、2(序列識別 編號：12)、4(序列識別編號：13)及5(序列識別編號：14) 之雜交，係於65°C之具有0.1% SDS的3X SSPE中進行14小 時。將滤膜以55C之具有0.1% SDS之3χ SSPE洗三次歷 時10分鐘及於-70°C下暴露於科達XAR軟片12小時。全部獲 得陽性信號之λΖΑΡΙΙ選殖體經過第二回合雜交純化（探針 1(序列識別編號：11)獲得25陽性，探針2(序列識別編號： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） 45 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、可I 585918 A7 ----—^ ____B7_ 五、發明説明（41 ) 12)獲知16陽性，探針4(序列識別編號：13)獲得49陽性及 探針5(序列識別編號：14)獲得12陽性）。 與探針3(序列識別編號：24)雜交係如前述進行，但濾 膜以65C之具有0.1% SDS的3x SSPE洗三次歷時10分鐘 時間，隨後曝光。約400 λΖΑρπ選殖體獲得強陽性信號及 其中34株經過6yc之第二回合雜交純化。另外約4〇〇株使用 探針3(序列識別編號：24)獲得弱陽性信號，其中18株經由 45 C歷20 j、時之第一回合雜交來純化。使用全部$種探針分 離之純λΖΑΡ Π選殖體於活體内被切割出來作為
Bluescript II SK(-)嗟卤質體及根據製造商（stratagene)之指 不轉形入大腸桿菌XLOLR。各cdNA插入子之尺寸係使用 T3(序列識別編號：29)及T7(序列識別編號：30)啟動子引 子以PCR決定，選定之插入子（> 1.5 kb)由兩端決定部份序 列。 實例3 大冷多單梓合成酶cDNA於大勝棵菌之袅現及酶檢定分析 除cDNA選殖體AG3.18(序列識別編號：3)及AG3.48( 序列識別編號：31)外，所有部份定序之插入子皆於5，-端 截頭，或不對準架構，或於推定蛋胺酸起始密碼子之過早 終止密碼子上游搪孔。為了功能性表現之目的，辨識2023 bp之插入子段（其由序列辨識編號：1中所述序列之核苷酸 75延伸至2093)及1911 bp插入子段（其由序列識別編號：3 所述序列之核苷酸1延伸至核苷酸1910)，對準架構内次選 殖入pGEX載體（Pharmacia)。一 2016 bp段（由序列識別編號 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） ------------------------------------------、玎------------------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 46 585918 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7____ 42 "" 五、發明說明（） :5所述序列之核苷酸73延伸至核苷酸2088)對準架構次選 殖入pSBETa載體（Schenk，Ρ·Μ·，Baumann，S.，Mattes， R.，and Steinbiss，Η·-Η· (1995) Biotechniques 19，196200) 。為了引進供用於次選殖之適當限制位置，使用引子組合 藉PCR擴增片段，該等引子組合包含2.2-BamHI(5’-CAA AGG GAT CCA GAA TGG CTC TGG-3’)(序列識別編號：33) 及2.2-NotI(5，-AGT AAG CGG CCG CTT TTT AAT CAT ACC CAC-3’）(序列識別編號：34)使用pAG2.2插入子（序列 識別編號：1)做模版；3.18-EcoRI(5’-CTG CAG GAA TTC GGC ACG AGC-3’)（序列識別編號；35)及 3.18-SamI(5,-CAT AGC CCC GGG CAT AGA TTT GAG CTG-3’）(序列識別編號：36)，使用pAG3.18插入子（序列識 別編號：3)做模版；以及，10_NdeI(5’-GGC AGG AAC ΑΤΑ TGG CTC TCC TTT CTA TCG-3’）(序列識別編號：37)及 10-BamHI(5，-TCT AGA ACT AGT GGATCC CCC GGG CTG CAG-3’）(序列識別編號：38)，使用PAG10插入子（序 列識別編號：5)做模版。 PCR反應係以50 μΐ容積之物及依規劃進行，該50 μΐ 容積之物含有 20 mM Tris/HCl(pH 8.8)、10 mM KC 卜 10 mM (NH4)2S04、2 mM MgS04、0.1%Triton X-100、5微克牛血 清白蛋白（BSA)，200 μΜ之各dNTP， 0.1 μΜ之各引子、
2.5單位重組Pfu聚合酶（Stratagene)及1〇〇毫微克質體DNA ;該規劃如下：於94°C變性1分鐘；於60°C環化1分鐘；於 72C延長3.5分鐘；最終於72C延長5分鐘共35週期。PCR 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 47 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
585918 A7 B7 43 五、發明說明（） 產物藉瓊脂凝膠電泳純化並當作二次PCR擴增模版，條件 完全相同，總容積各自為250微升。二次擴增所得產物以前 述限切酶消化，藉超濾離心然後分別接合至 BamHI/Notl-digested pGEX 4T-2 獲得質體 pGAG2.2 ;至 EcoRI/Smal-digested pGEX-4T-3獲得質體pGAG3.18 ;及至 Ndel/BamHI-digested pSBET獲得質體pSBAGlO ;隨後此等 質體轉形入大腸桿菌XLl-Blue或大腸桿菌BL21(DE3)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
就表現而言，使大腸桿菌XLOLR/pAG3.18、大腸桿菌 XLOLR/pAG3.48、大腸桿菌 XLl-Blue/pGAG2.2、大腸桿菌 XLl-Blue/pGAG3.18 及大腸桿菌 BL21 (DE3)/pSBAG10 等 細菌株於37 °C之5毫升LB培養基中生長至 A6〇o=〇.5(Sambrook，J.，Fritsch，E.F·，and Maniatis，T· (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual，2s Ed·，Cold Spring Harbor Labotatory，Cold Spring Harbor，NY)，依載 體決定培養基中是否要補充100微克安比西林/毫升或30微 克康黴素/毫升。然後藉添加1 mM異丙基-1-硫-β-D-半乳糖 萜喃糖苷誘發培養並於20°C生長12小時。藉離心（2〇〇〇x g ，10分鐘）收集細胞並使細胞再懸浮於溶液A或溶液B中’ 該溶液A含有：1毫升單萜合成酶檢定分析緩衝液[50 mM
Tris/HCl (pH 7.5)、500 mM KC1、1 mM M11CI2、5 mM二硫 赤絲醇、0.05%(w/v)NaS03及10%(v/v)甘油]、1毫升倍半 萜合成酶檢定緩衝液[10 mM二鹼基磷酸鉀、1.8 mM—鹼基 磷酸鉀（pH 7.3)、140 mM NaCl、10 mM MgCl〗、5 mM二硫 赤絲醇、0.05%(w/v)NaHS03及10%(v/v)甘油];溶液B含有 48 ------------裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 一 B7 44 五、發明說明（） -----------裳--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :或1毫升二萜合成酶檢定分析培養基[30 mM Hepes(N_2-經乙基六氫吼呀-N，-2-乙烧石黃酸，pH 7·2)，7·5 mM MgCl2 ，5 mM二硫赤絲醇，i〇 μΜ MnCl2，0.05%(w/v)NaHS03 及 10%(v/v)甘油]。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以超音波（Braun-Sonic 2000，顯微探針之最大功率於 0-4°C經歷15秒）破壞細胞，以離心（18,000x g，10分鐘）澄 清均化物，以2.5 μΜ[1_3Η]槐牛兒基二磷酸酯檢定分析1毫 升之所得到的上清液之單萜合成酶活性，以3·5 μΜ[1-3Η] 法尼基二磷酸酶檢定分析1毫升之所得到的上清液之倍半 萜合成酶活性，或以5 μΜ[1-3Η]槐牛兒基槐牛兒基二磷酸 酶檢定分析1亳升之所得到的上清液之之二萜合成酶活性 ，上述者遵照標準程序進行（0：1>(^&11，11.，&11(1€&116，〇上· (1985) Methods Enzymol· 110 : 383-405 ; LaFever，R.E.， Stofer Vogel > B. » and Croteau » R. (1994) Arch. Biochem. Biophys· 313 : 139-149 ; Dehal，S.S·，and Croteau，R. (1988) Arch. Biochem· Biophys. 261 : 346-356)。於單萜合成酶及 倍半萜合成酶檢定分析之例中，培育混合物上方覆蓋1毫升 戊烷以補捉揮發性產物。各例中，於31 °C培育2小時後，反 應混合物以戊烷（3x 1毫升）萃取並使組合之萃出物通過1.5 毫升無水硫酸錢及石夕氧凝膠（Maninckrodt60A)柱，以提供 不含氧化代謝產物之萜烴洗提部分。隨後以3x 1毫升醚洗 提柱以收集氧化產物，並從各洗提部分提出一份以供液體 閃爍計數決定轉化率。 產物辨識：為了獲得足量產物進行放射性GLC(氣液層 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 45 五、發明說明（） 析法）、對掌性毛細管GLC及GLC-MS(質譜/質譜儀法）、製 備規模之酶培育的分析。因此，如前述使用3毫升檢定分析 緩衝液萃取50亳升經培養的細菌細胞來製備酶，萃出物於 31 °C與過量基質培育隔夜。烴部份如前述經由硫酸鎂-矽氧 凝膠洗提分離，濃縮戊烷洗提物以供下列評估之用：前述 毛細管放射性GLC (Croteau，R.，and Satterwhile，D.M. (1990) J· Chromatogr. 500 : 349-354)、光學活性柱毛細管 GLC(Lewinsohn，Ε·，Savage，T.J.，Gijzen，Μ·，and Croteau ，R. (1993) Phytochem. Anal· 4 : 220-225)或組合 GLC-MS[Hewlett-Packard 6890 GC-MSD附有冷卻（40°C)柱 上注射，藉電子衝擊離子化（70 eV)檢測，氦載氣於0.7 psi· ，柱：0.25毫米内徑X 30米融合矽氧與0.25微米5MS膜 (Hewlett-Packard)由3 5 °C (5分鐘維持時間）以每分鐘5 °C程 式規劃至230°C]。 實例4 序列分析 經引子穿梭及聚藏刪除來完全決定重組Bluescdpt質 體及pGEX質體插入子之序列（Sambrook，J.，Fritsch，E.F· » and Maniatis 5 T. (1989) Molecular Cloning ^ A Laboratory Manual » 2d Ed. » Cold Spring Harbor Laboratory J Cold Spring Harbor，NY)，使用之方法為染料去氧終結子週期 決定序列方法（應用生物系統公司）。序列分析係使用威斯 康辛套裝軟體9.0版，威斯康辛州馬里森，遺傳電腦集團 (GCG)進行。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 50 ^--------^---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) M59l8 A7 ___B7_ 五、發明説明（46 ) 實例5 RNA萃取及北方墨點分析 大冷杉幼莖組織於創傷前或創傷後二曰藉標準程序收 獲（0^2611，]\4.，1^\¥1118〇1111，£.，&11(1(1；1*€^&11，尺.（1991)八1：。11· Biochem· Biophys· 289 : 267-273)。分離總RNA (Lewinsohn ’ Ε·，Steele，C.L.，and Croteau，R. (1994) Plant Mol· Biol. Rep· 12 : 20-25)及每條凝膠跑道之20微克的RNA於變性條 件下分離（Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T. (1989) Molecular Cloning ^ A Laboratory Manual » 2d Ed. 5 Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring harbor，NY)並根據 製造商的指示移轉至硝基纖維素膜（Schleicher and Schuell) 。為了製備雜交探針，而以PCR放大1.4-1.5 kb之cDNA片 段，所使用之引子如下：用JB29(5，-CTA CCA TTC CAA TAT CTG-3’）（序列識別編號：39)及引子 2-8(5’-GTT GGA TCT TAG AAG TTC CC-3’）(序列識別編號：40)由 AG2.2( 序列識別編號：1)擴增；使用引子3-9(5，-TTT CCA TTC CAA CCT CTG GG-3’）（序列識別編號；41)及引子 3-ll(5’-CGT AAT GGA AAG CTC TGG CG-3，）(序列識別 編號：42)由AG3· 18(序列識別編號：3)擴增；及使用引子 7-l(5’-CCT TAC ACG CCT TTG GAT GG-3，）（序列識別編 號：43)及引子 7-3(5’-TCT GTT GAT CCA GGA TGG TC-3’)(序列識別編號：44)以AG10(序列識別編號：5)擴增 。探針以[oc- P]dATP 隨機標記（Feinberg，A.P.，and Vogelstein，Β· (1984) Anal· Biochem. 137 : 266-267)。墨點 51 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7 B7 47 五、發明說明（） 於55°C於3x SSPE及0.1%SDS中雜交24小時，以55°C之lx SSPE及0.1%SDS洗滌，及如前述於-80°C進行自動放射線 攝影歷24小時。 實例6 選殖體AG1.28f庠列識別編號：15)、AG2.2f序列綣 號：1)、AG4.3CK庠列識別編號：17)及AG5.9(^列龜 號19)之選殖及特徵化 基於相似性選殖大冷杉格合成酶:大冷杉已經開發作 為針葉樹對創傷及昆蟲攻擊產生反應而經誘發產生樹脂之 研究模式系統（Johnson，Μ·Α· ’ and Croteau，R. (1987) in Ecology and Metabolism of Plant Lipids (Fuller，G.，and Nes，W.D.，eds)pp· 76-91，American Chemical Society Symposium Series 325，Washington，DC ; Gijzen，M·， Lewinsohn，E. ’ Savage，T.J·，and Croteau，R.B. (1993) in Bioactive Volatile Compounds from Plants (Teranishi，R.， Buttery，R.G.，and Sugisawa，H.，eds)pp. 8-22，American Chemical Society Symposium Series 525，Washington，DC ;Raffa，K.F.，and Berryman，Α·Α· (1982) Can· Entomol· 114-797-810 ; Steele，C.，Lewinsohn，E.，and Croteau， R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 ： 4164-4168 ； Lewinsohn，E.，Gijzen，M.，and Croteau，R. (1992) in Regulation of Isopentenoid Metabolism (Nes，W.D.，Parish ，E.J·，and Trzaskos，J.M·，eds)pp· 8-17，American Chemical Society Symposium series 497，Washington，DC) 〇 樹月旨單 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------^裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1^1· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 52 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 48 五、發明說明（） 萜類、倍半萜類及二萜類之化學性及生物合成亦已徹底定 義出來（Lewinsohn，E·’ Savage’ T.J·’ Gijzen’ M·’ and Croteau » R. (1993) Phytochem. Anal. 4 ： 220-225 ； Lewinsohn » E. ，Gijzen，M.，and Croteau，R. (1991) Plant Physiol· 96 : 44-49 ; Funk，C.，Lewinsohn，E.，Stofer Vogel，B.，Sreele C.，and Croteau，R. (1994) Plant Physiol· 106 : 999-1005 ;Gijzen，M.，Lewinsohn，E.，Gijzen，M.，and Croteau ，R· (1992) Arch· Biochem· Biophys· 293 : 167-173 ; LaFever ，R.E·，Stofer Vogel，B.，and Croteau，R. (1994) Arch· Biochem. Biophys. 313 : 139-149 ; Funk，C.，and Croteau ，R. (1994) Arch· Biochem· Biophys· 308 : 258-266);但相 對應之萜合成酶的結構分析及含油樹脂調節之研究需要分 離編碼萜合成酶之cDNA種系。由針葉樹純化蛋白質作為 cDNA分離基礎之成功率有限（Stofer Vogel，B.，Wildung ，M.R·，Vogel，G·，and Croteau，R· (1996) J· Biol. Chem· 271 : 23262-23268)，至目前為止，無法由此等種系選殖出 任何單萜合成酶（Steele，C.，Lewinsohn，E.，and Croteau ，R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4164-4168)。 以同源性為主之PCR策略業經提出作為以蛋白質為主 之選殖萜合成酶的可能替代之道（Steele，C.，Lewinsohn ，Ε·，and Croteau，R. (1995) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 92 :4164-4168) ’該策略係於三種植物來源之祐合成酶可供 使用時才被發現的，該三種植物來源之萜合成酶為：得自 綠薄荷（Mentha spicata，唇形科）之單萜合成酶、（-)-4S-檸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 53 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 585918 A7 B7 49 五、發明說明（） 檬烯合成酶（Colby，S.M·，Alonso，W.R·，Katahira，E.J. ，McGarvey，D.J.，and Croteau，R. (1993) J. Biol. Chem· 268 : 23016-23024);得自菸草（Nicotiana tabacum，茄科) 之倍半合成酶、5-epi-aristolochene合成酶（Facchini，P.j. ，and Chappell，J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 11088-11092);及得自萬麻子（Ricinus communis，大戟科 )之二萜合成酶、蓖麻稀合成酶（Mau，C.J.D.，and West， C.A. (1994) Proc· Natl. Acad· Sci· USA 91 : 8497-8501)。儘 管三種被子植物在分類學上存有距離以及三種酶所使用之 基質、反應機轉及產物類型存有差異，但是比較推定之胺 基酸序列證實了若干守恆區，該等守恆區顯然可用於設計 簡併性PCR引子（參考實例1)。使用得自創傷誘生大冷杉莖 存庫cDNA作為模版，PCR引子C(序列識別編號：9)及D( 序列識別編號：10)擴增對應於四個獨特序列組之產物，該 等產物全部皆顯示出與植物來源經選殖之萜合成酶序列的 顯著相似性。四個不同插入子係標示為探針1(序列識別編 號：11)、2(序列識別編號：12)、4(序列識別編號：13)及 5(序列識別編號：14)，且用於藉溶菌斑雜交來分離出對應 之cDNA選殖體。 使用該四種探針之每一者，由受創傷之大冷杉莖存庫 篩檢出105 cDNA噬菌體溶菌斑，產生四倍陽性數目差，此 最可能反應出對應基因之不同程度的表現。經純化且於活 體内切割之選殖體，其尺寸選定的插入子（> 1.5 kb)由兩端 部份決定序列，且該等插入子顯示分成四個對應於四種雜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 54 585918 A7 B7 心 50 五、發明說明（） -----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 交探針之不同組。因對應於探針1(序列識別編號：11)、4( 序列識別編號：13)及5(序列識別編號：14)之cDNA係於5’-端截頭，所以唯有各組之具最大代表性的插入子之序列完 全定出，該等插入子為：選殖體AG1.28(序列識別編號： 12)、選殖體AG2.2(序列識別編號：1)(名目全長）、，選殖 體AG4.30(序列識別編號·· 17)及選殖體AG5.9(序列識別編 號：19)。選殖體AG1.28(序列識別編號：15)(2424 bps)包 括編碼782胺基酸（序列識別編號：16)之2350核苷酸（nts)之 開放讀取架構（ORF);選殖體AG2.2(序列識別編號：1)(2196 bps)包括編碼627胺基酸（序列識別編號：2)之1881 nts之 ORF ;選殖體AG4.30(序列識別編號：17)(1967 bps)包括編 碼577胺基酸（序列識別編號：18)之1731 nts ORF及選殖體 AG5.9(序列識別編號：19)(H16 bps)包括編碼398胺基酸（ 序列識別編號：20)之1194核苷酸之ORF。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將cDNA選殖體AG1.28(序列識別編號：15)，AG2.2( 序列識別編號：1)、AG4.30(序列識別編號：17)及AG5.9( 序列識別編號：19)做彼此成對比較及與其他經選殖植物萜 合成晦做比較。截頭選殖體AG1.28(序列識別編號：15)之 大小及序列（72%相似性，49%相同性）最類似得自大冷杉 之二烯環化酶、松香二烯環化酶（Stofer Vogel，B.，Wildung ’ M.R. ’ v〇gei , g.，and Croteau，R. (1996) J· Biol· Chem· 271 : 23262-23268)。選殖體AG4.30(序列識別編號：17)及 AG5.9(序列識別編號：19)於胺基酸位準共同具有約80%的 相似性（60%相同性），且距選殖體人〇1.28(序列識別編號： 55 本紙張尺度剌+ _ ^^票準（CNS)A4規格（210 X 297公餐） 585918 A7 B7 51 五、發明說明（） ------------裝 i I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 15)及全長AG2.2(序列識別編號：1)兩者之距離幾乎相等 (65-70%相似性及45-47%相同性之範圍）；AG1.28(序列識 別編號：15)及AG2.2(序列識別編號：丨）間之胺基酸序列相 似性為65%(41%相同性）。考慮人〇4.30(序列識別編號：17) 及AG5.9(序列識別編號：19)之高度同源後，此等比較提示 四種新穎cDNA、AG1.28(序列識別編號：i5)、AG2.2(序列 識別編號：1)、AG4.30(序列識別編號：17)及AG5.9(序列 識別編號·· 19)表示編碼單烯合成酶，倍半烯合成酶及二稀 合成酶之大冷杉烯合成酶基因之三大亞族。 作為桂葉烯合成酶的cDNA選殖體AG2.2(序列識別編 號：1)之辨識：PAG2.2插入子（序列識別編號：丨）顯然為編 碼72,478蛋白質之全長選殖體，pi計算值為6.5。由AG2.2( 序列識別編號：1)編碼之轉譯蛋白質大小（627殘基）(序列識 別編號：2)係落於得自綠薄荷（Colby，S.M.，Alonso，W.R. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，Katahira，E.J·，McGarvey，D.J.，and Croteau，R· (1993) J. Biol. Chem· 268 : 23016-23024)及（Perilla fruiescens (Yuba，A.，Yazaki ’ K. ’ Tabata，M·，Honda，G.，and Croteau ，R· (1996) Arch· Biochem· Biophys· 332 : 280-287)之檸檬 烯合成酶的單萜合成酶前蛋白質之範圍中，但比松香二烯 合成酶（Stofer Vogel，B·，Wildung，M.R·，Vogel，G.，and Croteau，R· (1996) J· Biol· Chem· 271 : 23262-23268)及紫 杉二浠合成酶（\\/41(11111§，]^.11.，&11(1(^1：〇^311，尺.（1996)】· Biol. Chem· 271: 9201-9204)之兩種裸子植物的二萜合成酶 前蛋白質短約240胺基酸。單萜及二萜生物合成酶係被分隔 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 52 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於質體内，而倍半萜之生物合成係為細胞溶質性的（綜論於 Kleinig，H. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40 : 39-53 ; Gershenzon，J.，and Croteau，R. (1993) in Lipid Metabolism in Plants (Moore，T.S. Jr_，ed)pp. 339-388，CRC Press，Boca Raton，FL ; McGarvey，D.J· ，and Croteau，R. (1995) Plant Cell 7，1015-1026);因此 ，單格及二格合成酶係經編碼為載有胺基端過渡肽之前蛋 白質，以供將此等核基因產物運入質體内，於此處進行蛋 白質分解處理成為成熟形（Keegstra，K.，Olsen，J.J·，and Theg，S.M. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40 : 471-501 ; von Heijne，G.，Stepphuhn，J.，and Herrmann (1989) Eur. J. Biochem. 180 : 535-545)。經推定 蛋白質之大小及N-端具有目標序列特徵之結構區（60至70 胺基酸）的存在[該特徵為：富含絲胺酸殘基（16-18%)及低 酸性殘基（4個 Asp 或 Glu)(Keegstra，K·，Olsen，J.J·，and Theg，S.M. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol· 40 : 471-501 ; von Heijne，G.，Stepphuhn，J.，and Hermann (1989) eur· J. Biochem. 180 ·· 535-545)]，提示 AG2.2(序列識別編號：1)編碼單萜合成酶而非倍半萜合成 酶或二萜合成酶。 因pAG2.2含有反向萜合成酶插入子，所以對準架構以 麩胱苷肽S_轉移酶次選殖ORF，以方便最終純化（Bohlmann ，J.，DeLuca，V.，Eilert，U.，and Martin，W· (1995) Plant J. 7 : 491-501 ; Bohlmann，J.，Lins，T.，Martin，W.，and 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 53 五、發明說明（）
Eilert，U. (1996) Plant Physiol. 111 : 507-514)成pGEX-4T-2 ，而產生質體PGAG2.2。重組融合蛋白質於大腸桿菌株 XLl-Blue/pGAG2.2表現，然後萃取及檢定分析單萜合成酶 、倍半萜合成酶及二萜合成酶活性，分別使用氚標記桅牛 兒基二磷酸酯、法尼基二磷酸酯及桅牛兒基桅牛兒基二磷 酸酯作為基質。萜烯之酶產量僅見於以桅牛兒基二磷酸酯 作為基質之例，唯一產物藉放射性GLC及GLC-MS與真正 標準品顯做比較而顯示為桂葉烯（第3圖）。以含有反訊息方 向之AG2.2插入子（序列識別編號：1)的pGEX載體轉形之細 菌，無法於誘生及如前述分離及檢定分析蛋白質時獲得可 檢測到之桂葉烯合成酶活性。雖然桂葉烯為得自綠薄荷之 天然及重組擰檬稀合成峰（Rajaonarivony，J.I.M·， Gershenzon » J. 5 and Croteau » R. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 296 : 49-57 ; Colby，S.M.，Alonso，W.R.，Katahira ，E.J·，McGarvey，D.J·，and Croteau，R. (1993) J· Biol· Chem· 268 : 23016-23024)及若干得自鼠尾草之酶（Croteau，R·， and Satterwhile，D.M. (1989) J. Biol· Chem. 264 ·· 15309-15315)之小量副產物（2%)，但是過去未曾從任何 來源得到過桂葉烯合成酶cDNA。桂葉烯合成酶[該酶為大 冷杉之數種創傷誘生單萜合成酶活性之一（Gijzen，M.， Lewinsohn，Ε·，and Croteau 5 R. (1991) Arch. Biochem. Biophys. 289 : 267-273)]之cDNA選殖及功能性表現，證實 了此種無環單萜係由獨特酶生成而非另一種合成酶之副產 物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 58 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
585918 A7 B7 五、發明説明（54 ) 實例7 編碼（-V松嬌合成酶之選殖體AG3.18i序列識編號：3).在· 編碼（-)-擦樣嫌合成酶之cDNA撰殖體AG10(序列識別編成· =5)之選殖及特徵化 辨識cDNA選殖髏AG3.18(庠列識別編號：3)作為（-)-松烯合成酶及cDNA選碴艚AGIO(庠列識別編號：5)作為 (-)-檸檬烯合成酶••將四種新穎萜合成酶cDNA序列 (AG1.28(序列識別編號：15)、AG2.2(序列識別編號：1)、 AG4.30(序列識別編號：17)及AG5.9(序列識別編號：19)) 與松香二烯合成酶之cDNA序列（Stofer Vogel，B·，Wildung ，M.R.，Vogel，G.，and Croteau，R· (1996) J. Biol. Chem. 271 : 23262-23268)對正，可辨識出得自大冷杉之此種酶之 族中的若干守恆序列的主要部份，其提供擴展以類似性為 主之選擇辦法的基礎。兩種新穎訊息引子E(序列識別編號 :21)及F(序列識別編號·· 22)係根據守恆序列元件設計， 而簡併性反訊息引子G (序列識別編號· 2 3 )係以來自松婦人 成酶之非常有限的胺基酸序列資訊來設計的（參考實例U 。唯有引子E(序列識別編號：21)與G(序列識別編號· 2巧 之組合擴增了 533 bps之特定產物，稱該產物命名 序列識別編號：24)。 1〇5大冷杉λΖΑΡ II cDNA選殖體與探針3(序 號：24)雜交，獲得兩類型由約400強陽性選殖體 &編 陽性選殖體組成的信號，此顯指示探針可辨識多 ’ ;一型以 上之cDNA。前述選殖體之32株及後述選殖體之 18株經純 59 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 55 585918 A7 B7 五、發明説明 化，藉尺寸（2.G_2.5kb)選擇插人子，且由兩端決定活體試 驗中所切狀選殖^料序列。提料 體，顯示出其所含4之選殖 AG2.2(序韻別㈣ ==_合成_殖體 似性。純株·_:二Γ，成•無序列相 、暂… 含有確定向及對準由 版隱Pt質體載體表現之架構的桂葉缔合成梅⑽。於大 腸W中功級地表現此種⑽A，顯示所得之_僅接受 槐牛兒基二磷酸醋作為戊間二浠基二磷酸醋基質，及產生 桂葉稀作為唯"反應產物。此種细，序列識別編號： 31)之發現證實由PGAG22表現AG2 2(序列識別編號^呈 楚胱苔肽s_轉移_融合蛋白質，不影響桂葉稀合成酶之基 質利用率或產物結果。 產生強力雜交信號之選殖體聚集成不同的序列組，該 等組以選殖體AG3.18(序列識別編號：3)(2〇18bp插入子具 有1884 nt之〇RF ;編碼826殘基蛋白質於71，505 Da及pi為 5.5)及AGIO(序列識別編號：5)(2〇89 bp插入子具有ΐ9ΐι扒 之ORF ;編碼637殘基蛋白質於73,477 Da及ρ^6·4)為代表 。AG3.18(序列識別編號·· 3)及AG1〇(序列識別編號：5)連 同桂葉烯合成酶選殖體AG2.2(序列識別編號：1)共同形成 亞族’該亞族以胺基酸位準之最低成對相似性為79% (64 %相同性）為特徵。類似桂葉烯合成酶，AG3.18(序列識別 編號：3)及AG10(序列識別編號：5)編碼60至70胺基酸之 N-端序列，其富含絲胺酸（19-22%及11-15%)而質體過渡肽 之特徵性酸性殘基含量低（分別為4及2)(Keegstra，K.， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
60 585918 A7 — __B7_ 五、發明説明（56 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Olsen，J.J.，and Theg，S.M. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol· Plant Mol· Biol· 40 : 471-501 ; von Heijne，G.，Stepphuhn ，J.，and Hermann (1989) Eur. J· Biochem. 180 : 535-545) o 質體pAG3.18(序列識別編號：3)於供直接由 Bluescript質體表現之架構内，含有推定之萜合成酶ORF， 而AG10(序列識別編號：5)ORF係相反定向。將AG3.18(序 列識別編號：3)及AG10(序列識別編號：5)次選殖入表現載 體而產生質體PGAG3.18及pSBAGlO。於腸桿菌 XLOLR/pAG3.18、大腸桿菌 XLl-Blue/pGAG3.18及大腸桿 菌BL21(DE3)/pSBAG10之菌株中表現重組蛋白質。當使用 全部可能之戊間二烯二磷酸酯基質試驗經誘生細胞之萃出 物的萜合成酶活性時，唯有槐牛兒基二磷酸酯被利用。大 腸桿菌BL21(DE3) /pSBAGlO之萃出物將桅牛兒基二磷酸 酯轉成主要產物檸檬烯及較小量之α_松烯、β-松烯及β-水 芹烯（如放射性-GLC及組合GLC-MS測定般）（第5圖）。於β-環糊精進行對掌性相的毛細管GLC顯示檸檬烯產物為 ㈠-4S-對映異構物及松烯產物係與（-)-(lS : 5S)-對映異構 物相關。雖然光學純質標準不供用於分析，但是立體化學 考慮顯示次要產物β-水芹烯亦為在機制方面與（-)-4S-對映 異構體有關（GambliebH.，andCroteau，R.(1984)J.Biol. Chem. 259 : 740-748 ; Croteau，R.，Satterwhile，D.M.， Cane，D.E.，and Chang，C.C. (1988) J. Biol· Chem. 263 : 10063-10071 ; Wagschal，K.，Savage，T.J·，and Croteau 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -61 - 585918 A7 _B7_ 五、發明説明（57 ) ，R. (1991) Tetrahedron 47 : 5933-5944 ; Croteau，R. ’ Satterwhile，D.M.，Wheeler，C.J.，and Felton，Ν·Μ· (1989) J. Biol· Chem. 264 : 2075-2080 ; LaFever，R.E.，and Croteau ，R. (1993) Arch· Biochem. Biophys· 301 : 361-366)。藉大 腸桿菌 XLOLR/pAG3.18及大腸桿菌 XLl-Blue/pGAG3.18之 無細胞萃出物對桅牛兒基二磷酸酯產生之單萜產物進行類 似分析，證實存有α-松烯及β-松烯之42 : 58%混合物（第4 圖），此種產物比等於先前對大冷杉之純天然（-)-松烯合成 酶所述（Lewinsohn，Ε.，Gijzen，Μ·，and Croteau，R. (1992) Arch, biochem. Biophys· 293 : 167-173)。對掌性相毛細管 GLC如所預期般確認了重組松烯合成酶產物為（-)-(lS ·· 5S)-對映異構物。如先前對天然酶之觀察般，使用重組（-)· 松烯合成酶未檢測得其他單萜烯副產物（1^\¥丨113〇1111，£· j Gijzen ? Μ. > and Croteau 5 R. (1992) Arch. Biochem. Biophys· 293 : 167-173)。 由單一酶生成α-及β-松烯之證據先前經由共同純化研 究及差異抑制及失活化研究以及同位素敏感分支研究得到 證實（Gambliel，Η.，and Coates，R.M·，and Croteau，R. (1994) Arch. Biochem· Biophys. 308 : 477-487 ; Wagschal，Κ·， Savage，T.J·，and Croteau，R. (1991) Tetrahedron 47 : 5933-5944 ; Croteau，R.，Wheeler，C.J·，Cane，D.E·， Ebert，R·，and Ha，H.-J. (1987) Biochemistry 26: 5383-5389) 。松烯合成酶之cDNA選殖最終證實單一酶可生成兩種產 物。由AG3.18(序列識別編號：3)演繹之（-)-松烯合成酶之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公I) - 62 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
585918 A7 ______B7____ 五、發明説明（58 ) 分子量計算值約64,000(排除假定過渡肽），其相當穩合藉 凝膠滲透層析術及SDS-PAGE對大冷杉之天然酶決定之分 子量 63,000(Lewinsohn，E,，Gijzen，M·，and Croteau，R· (1992) Arch. Biochem· Biophys. 293 : 167-173)。 至目前為止檸檬烯合成酶cDNA僅由兩種極為接近的 被子植物選殖（Colby，S.M.，Alonso，W.R·，Katahira，E.J. 5 McGarvey » D.J. ^ and Croteau 5 R. (1993) J. Biol, Chem. 268:23016-23024;Yuba，A.，Yazaki，K.，Tabata，M. ，Honda，G·，and Croteau，R. (1996) Arch· Biochem. Biophys. 332 : 280-287)，且之前未曾報告過松烯合成酶Cdna之分離 。松烯合成酶過去因係為針葉木之主要防衛相關單萜合成 酶而受到相當大注意（Gijzen，M.，Lewinsohn，E·，and Croteau，R. (1991) Arch· Biochem. Biophys· 289 : 267-273 ;Lewinsohn，E.，Gijzen，M.，and Croteau，R· (1992) Arch. Biochem· Biophys. 293 : 167-173)。大冷杉 cDNA存庫中（ 係由得自創傷誘生幼苗莖之mRNA合成），對應松烯合成酶 之選殖體至少比桂葉稀合成酶之選殖體多十倍。此種發現 反應出此等酶於大冷杉幼苗之活性誘生程度之相對比例； 松烯合成酶及檸檬烯合成酶為主要單萜合成酶活性，而桂 葉稀合成酶活性之誘生程度相當低（Gijzen，M.，Lewinsohn ，Ε·，and Croteau，R· (1991) Arch. Biochem. Biophys· 289 :267-273)。可誘生單萜合成酶之cDNA提供針葉樹之以含 油樹脂防衛系統為主之遺傳及分子分析用探針。由未受傷 幼苗莖及受傷後二日之幼苗莖（首度出現酶活性時）萃取出 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4规格（210X297公釐） -63 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂丨 585918 、發明説明
之總RNA，於進行北方墨點分析（第6圖）後，探測出AG2.2( 序列辨識編號：1)、AG3.18(序列辨識編號：3)及AG1〇(序 列辨識編號：5)之cDNA片段，因此證實了單萜合成酶之 mRN A累積增加促成大冷杉之誘生防衛反應。經選殖出來 與防衛有關的單萜合成酶提供若干用於含油組合物之轉殖 基因操作的之可能路徑，以改良植物對樹皮甲蟲及其他病 蟲害之抗性。例如，藉著改變費洛蒙前驅物或捕食者引誘 劑的量來改變含油樹脂之單萜含量，可以化學方式偽裝宿 主並減少昆蟲的聚集，或經由提高對甲蟲及其相關致病真 菌之毒性來減少侵擾（Johnson，Μ·Α·，and Croteau，R· (1987) in Ecloogy and Metabolism of Plant Lipids (Fuller，G·，and Nds，W.D·，eds) pp· 76-91，American Chemical Society symposium Series 325，Washington，DC ; Gijzen，M., Lewinsohn，E.，Savage，T.J·，and Croteau，R.B. (1993) in Bioactive Volatile Compounds from plants (Teranishi，R.， Buttery，R.G·，and Sugisawa，H·，eds) pp· 8-22，American Chemical Society symposium Series 525，Washington，DC ；Byers » J.A. (1995) in Chemical Ecology of Insects 2 (Carde，R.T.，and Bell，W.J·，eds) pp. 154-213，Chapman and Hall，New York) 〇 實例8 由cDNA選殖體AG2.2(庠列辨識編號：Π，AG3.18(序列識 别編號：3)及AGIO(戽列謐別編號：5)編碼重組單萜 之性質 本紙張尺度適用中國國家標準（⑶幻A4規格（210X297公爱） 64 --------------------0^:r, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .、?τ· 585918 A7 ___B7 _ 五、發明説明（6G ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 三種重組酶皆需要Mn2+來表現活性，以Mg2+作為二價 金屬離子之輔助因子大體上是無效的。此種發現證實早期 使用大冷杉及木屋柱松（Pinus contorta)之天然單萜合成酶 所得結果（Lewinsohn，E·，Gijzen，M·，and Croteau，R. (1992) Arch· Biochem· Biophys. 293 : 167-173 ; Savage，T.J·，Hatch ，M.W.，and Croteau，R. (1994) J. Biol. Chem. 269 4012-4020)。相信全部萜合成酶及戊間二烯基轉移酶於反 應順序之離子化步驟中，使用二價金屬離子，（通常為Mg2+ 或Mn2+)中和二磷酸酯離去基之負電荷（Croteau，R. (1987) Chem· Rev· 87 : 929-954 ; Cane，D.E. (1992) Ciba Found· Symp. Ser· 171 : 163-167 ; Poulter，C.D.，and Rilling，H.C· (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds (Porter， J.W.，and Spurgeon，S.L.，eds) Vol. 1，pp. 161-224，Wiley & Sons，New York)，如此所得全部相關序列載有保留富含 天冬酸元件（DDXXD)(序列識別編號：45)考慮涉及二價金 屬離子結合（Stofer Vogel，B·，Wildung，M.R·，Vogel， G.，and Croteau，R. (1996) J. Biol· Chem. 271:23262-23268 ；Ashby5 M.N.» and Edwards 5 P.A. (1990) J. Biol. Chem. 265 :13157-13164 ; Chen，A.，Kroon，P.A.，and Poulter， D.C. (1994) Protein Sci. 3 : 600-607 ; Tarshis，L.C.，Yan ，M.，Poulter，C.D.，and Sacchettini，J.C. (1994) biochemistry 33 : 10871-10877 ; Cane，D.E.，Sohng，J.K. ，Lamberson，C.R·，Rudnicki，S.M.，Wu，Z.，Lioyd， M.D·，Oliver，J.S·，and Hubbard，B.R. (1994) Biochemistry 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -65 - 585918 A7 ____B7_ 五、發明説明（61 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 33:5846-5857;Proctor，R.H.，andHohn，T.M.(1993)J. Biol· Chem· 268 : 4543-4548)。除了此種嚴格且全面性依賴 二價金屬離子，針葉樹之單萜合成酶之獨特之處為其進一 步需要一價陽離子（K+)，此種特點可區別裸子植物單萜合 成酶與其等之來自被子植物的相對應合成酶，且該特點暗 示兩類催化劑間之基本結構及/或機轉存有差異（Savage， T. J·，Hatch，M.W.，and Croteau，R· (1994) J· Biol. Chem· 269 : 4012-4020)。全部三種重組單萜合成酶皆依賴K+，於 約500 mM KC1達到最高活性。已有多種不同類型酶對K+ 需求的報告，包括催化磷酸基裂解或轉移反應之所需 (Suelter，C.H. (1970) Science 168 : 789-794)如 Hsc70 ATPase(Wilbanks » S.M. » and McKay » D.B. (1995) J. Biol. Chem. 270 : 2251-2257)。牛Hsc70 ATPase之晶體結構顯示 出Mg2+及K+直接與基質之磷酸基交互作用，且暗示於 Mg2+及K+與三個活性位置之天冬酸殘基結合（Wilbanks， S.M. ^ and McKay ^ D.B. (1995) J. Biol. Chem. 270 ： 2251-2257)，此令人想起過去認為萜烯合成酶及戊間二烯 轉移酶之守恆性DDXXD功能性區段（序列識別編號：45)具 有與二價陽離子結合的功能，此種功能亦由晚近位置導向 突變發生作用（Marrero，P.F.，Poulter，C.D·，and Edwards ，Ρ·Α· (1992) J· Biol. Chem· 267 : 21873-21878 ; Joly，Α· ，and Edwards, Ρ·Α· (1993) J. Biol. Chem. 268:26983-26989 ;Song，L.，and Poulter，C.D· (1994) Proc· Natl· Acad. Sci· U. S.A. 91 : 3044-3048 ; Koyama，T·，Tajima，M.，Sano 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -66 - 585918 A7 _____B7 _ _ 五、發明説明（62 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，H·，Doi，T·，Koike-Takeshita，A·，Obata，S.，Nishino ，Τ·，and Ogura，Κ· (1996) Biochemistry 35 : 9533-9538) 及藉X光結構分析法尼基二磷酸酯合成酶（Tarshis，L.C.， Yan，Μ·，Poulter，C.D.，and Sacchettini，J.C. (1994) Biochemistry 33 : 10871-10877)證實。 得自大冷杉之桂葉嫦、檸檬稀及松稀合成酶之cDNA 選殖及功能表現代表由相同物種分離多個合成酶基因之第 一範例，提供於無環、單環及雙環單萜產物構造中評估結 構-功能關係之工具，及詳細比較得自植物演化距離遙遠之 植物所得之進行證實為完全相同反應的催化劑（Gambliel ，Η·，and Croteau，R. (1984) J. Biol. Chem. 259 : 740-748 ;Rajaonarivony，J.I.M.，Gershenzon，J.，and Croteau， R· (1992) Arch. Biochem. Biophys. 296 : 49-57; Colby，S.M. » Alonso 5 W.R. ^ Katahira» E. J.5 McGarvey5 D. J.? and Croteau ^ R. (1993) J. Biol. Chem. 268 ： 23016-23024 ； Adam ^ K.-P. ，Crock，J·，and Croteau，R. (1996) Arch· Biochem. Biophys· 332 : 352-356)。晚近由大冷杉獲得編碼倍半萜合成酶及二 萜合成酶之cDNA分離物（Stofer Voge卜 B·，Wildung，M.R· ，Vogel，G.，and Croteau，R. (1996) J. Biol· Chem. 271 :23262-23268)，連同單萜合成酶應也可作為了解此族相 關酶之鏈長度對戊間二烯二磷酸酯基質之特異性之結構基 礎。 實例9 經選殖單結合成酶之序列比較 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -67 - 585918 A7 _B7 五、發明説明（63 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 先前基於使用選擇性胺基酸修改劑保護基質避免失活 化之研究顯示，於不同單萜合成酶範圍之具功能重要性之 半胱胺酸、組胺酸及精胺酸殘基（Rajaonarivony，J.I.M.， Gershenzon，J.，and Croteau，R. (1992) Arch, biochem. Biophys· 296: 49-57; Lewinsohn，E·，gijzen，M.，and Croteau ，R. (1992) Arch· Biochem· Biophys· 293 : 167-173 ; Savage ，T.J·，Hatch，M.W·，and Croteau，R· (1994) J. Biol· Chem_ 269 : 4012-4020 ; Rajaonarivony，J.I.M.，gershenzon，J. ，Miyazaki，J·，and Croteau，R. (1992) Arch· Biochem· Biophys· 299 : 77-82 ; Savage，T.J·，Ichii，H.，Hume， S.D.，Little，D.B.，and Croteau，R· (1994) Arch. Biochem. Biophys· 320 : 257-265)。植物來源之21萜合成酶之序列對 正（Colby，S.M.，Alonso，W.R.，Katahira，E.J·，McGarvey ，D.J·，and Croteau，R. (1993) J. Biol. Chem. 268 : 23016-23024 ; Stofer Vogel，B.，Wildung，M.R.，Vogel ，G.，and Croteau，R. (1996) J. Biol· Chem. 271 : 23262-23268 ； Facchini » P.J. » and Chappell » J. (1992) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 89 : 11088_11092 ; Mau，C.J.D.，and West ^ C.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 ： 8497-8501 ; Yuba，A.，Yazaki，K.，Tabata，M.，Honda ，G.，and Croteau，R. (1996) Arch· Biochem. Biophys. 332 :280-287 ; Wildung，M.R.，and Croteau，R. (1996) J· Biol. Chem. 271 : 9201-9204 ; Yamaguchi，S.，Saito，T.，Abe ，H.，Yamane，H.，Murofushi，N·，and Kamiya，Y· (1996) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） -68 - 585918 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（） Plant J. 10 : 203-213 ; Dudareva，Ν·，Cseke，L.，Blane ，V.M.，and Pichersky，Ε· (1996) Plant Cell 8 : 1137-1148 ;Chen，Χ·-Υ·，Chen，Y.，Hienstein，P.，and Davisson ，V.J· (1995) Arch· Biochem. Biophys· 324 : 255-266 ; Chen ，X.-Y.，Wang，M.，Chen，Y.，Davisson，J.，and Heinstein ，P. (1996) J. Nat. Prod. 59: 944-951; Back，K·，and Chappell ，J· (1995) J. Biol. Chem. 270: 7375-7381)顯示兩種絕對守 恆之精胺酸殘基[該等殘基對應於松烯合成酶（序列識別編 號：4)之Arg184及Arg365]、一種高度守恆半胱胺酸殘基（松 烯合成酶Cys543)(序列識別編號：4)及一種高度守恆組胺酸 殘基（松烯合成酶His186)(序列識別編號：4)。DDXXD功能 性區段（序列識別編號：45)松烯合成酶（Asp379，Asp·及 Asp383)(序列識別編號·· 4)係絕對守恆於全部相關植物之萜 合成酶中，如同對應於松烯合成酶（序列識別編號：4)之 Phe198、Leu248、Glu322、Trp329、Trp460、Pro467之若干其他 胺基酸殘基。 將植物格合成酶之胺基酸序列與彼此比較且以及與選 殖自微生物之若干倍半萜合成酶之演繹序列比較（Proctor ，R.H.，and Hohn，T.M. (1993) J. Biol. Chem. 268 : 4543-4548; Back，Κ·，and Chappell，J· (1995) J. Biol· Chem· 270 : 7375-7381 ; Hohn，T.M.，and Desjardins，Α·Ε· (1992) Mol· Plant-Microbe Interactions 5 : 249-256)。與全部其他 植物萜合成酶比較，得自大冷杉之單萜合成酶與微生物來 源之萜合成酶間，在主要序列中並未存有顯著守恆性，但 ------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 69 經濟部臂慧財產局貝工消费合作社印製 585918 A7 B7 五★發明說明（5、 # 先前辨識為全部萜合成酶共通元件之DDXXD(序列辨識編 號：45)序列除外，及使用相關親電子反應機轉之戊間二烯 基轉移酶除外（0^€^&11，尺.，界1166161：，（1；丄，€&116，〇上· ，Ebert，R.，and Ha，H.-J· (1987) Biochemistry 26 : 5383-5389; Chen，A. ’ Kroon ’ Ρ·A. ’ and Poulter，D.C· (1994) Protein Sci. 3 : 600-607 ; McCaskill，D·，and Croteau，R. (1997) Adv. Biochem. Engineering Biotech· 55 : 108-146)。 目前證據不足以決定植物及微生物萜合成酶是否表示來自 共通祖先之分歧演化（該酶也可能起源於戊間二烯基轉移 酶），或是否類似催化劑造成會聚演化。 實例10 植物種子之簟莊含量及組成變化 根據本發明提供用於增加植物中單萜化合物產量（特 別植物種子）之方法。該方法牵涉以編碼至少一種裸子植物 單萜合成酶之核酸序列轉形植物細胞，該等序列識別編號· :1、序列識別編號：3及序列識別編號：5。該方法具有改 變單萜合成酶生物效果，因而增加單萜產量及提供具有所 需單萜組成之新穎種子油類。藉此方式，轉形種子提供生 產改質油之工廠。可使用改質油本身及/或可分離油中的化 合物。如此，本發明許可生產特定單萜或特定油類。 本發明之編碼單結合成酶之核酸可用於在轉形植物組 織中表現之表現匣。為了改變植物之單萜含量，植物以至 少一個表現匣轉形，該表現匣包含連結至編碼單萜合成酶 核酸序列之轉錄起始區。所提供知此種表現匣具有多個限 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 70 -!111! — · I I (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 585918 A7 产_議翻窗―π _^一 ——___一 Β7 五★發明說明（66> 制位置供編碼單萜合成酶之核酸序列插 广戌^ 又精此该表現 E係處於調節區之轉錄調節之下。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 轉錄引發序列可為宿主之天然或類似序列，戈宿主之 外來或非同源序列。就此方面而言，“外 ^ ^ r果一阔表示轉錄 引發序列未見於轉錄引發區被引進之野生型宿主中。 特別令人感興趣者為與儲存蛋白質(例如―、 crucifedn、p-conglycinin、phase〇Hn，球蛋白等）有關之轉 錄引發區，及脂肪酸生物合成相關蛋白質（如醯基載劑蛋白 (ACP))。參考美國專利5,42〇,〇34(併述於此以供參考）。 轉錄E以（於轉錄之5,至3,方向）包括轉錄及轉譯起始 區、感興趣之裸子植物單萜合成酶DNA序列及植物功能性 之轉錄及轉譯終結區為較佳。終結區可得自轉錄起始區之 相同生物、可得自單萜合成酶DNA之相同生物或可衍生自 其他來源。習知終結區可得自A. tumefaciens之Ti-質體，如 octopine合成酶及nopaline合成酶終結區。其他終結序列述· 於 Guerineau et al.，（1991)，Mol. Gen· Genet.，262 : 141-144 ;Proudfoot，（1991)，Cel卜 64 : 671-674 ; Sanfacon et al. ，（1991)，Genes Dev.，5 : 141-149 ; Mogen et al·，（1990) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 ，Plant Cell，2 : 1261-1272 ; Munroe et al·，（1990)，Gene ，91 : 151-158 ; Balias et al·，（1989)，Nucleic Acids Res. ，17 ·· 7891-7903 ; Joshi et al·，（1987)，Nucleic Acid Res· ，15 : 9627-9639) 〇 本發明之較佳態樣中，使編碼裸子植物單祐合成酶蛋 白質之核酸序列達至質體（如葉綠體）供表現。如此可將核 71 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 五、發明說明（67) 酸序列、編碼裸子植物單萜合成酶蛋白質之序列或蛋白質 插入具有適當質體構成體及調節元件之質體以供表現。另 擇地，可用核轉形之情況為：該表現匣含有編碼過渡肽之 核酸序列以導引感興趣之單萜生物合成酶至該質體。此種 過渡肽為該項技術所已知。例如參考Von Heijne et al· (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 ： 104-126 ； Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264： 17544-17550； della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84 ： 965-968 ； Rome, et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 · 1414-1421 and » Shah et al. (1986) Science 233 : 478-481。編碼本發明之裸子植物單萜 合成酶之核酸序列可利用天然或非同源過渡肽。 構成體包括任何所需調節子，例如植物轉譯性持恆序 列（Joshi，C.P·，（1987)，Nucleic Acids Research，15 : 6643-6653)、插入子（Luehrsen and Walbot，（1991)，Mol. Gen· Genet.，225 : 81-93)等，以可操作之方式連結至編碼本發 明單格合成酶之核酸序列。 匣將5’-前導子序列包括在表現匣内可能有所助益，該 序列會作用以增強轉譯。轉譯前導子已為該項技術所知， 包括例如picornavirus前導子（如EMCV前導子）（腦心肌炎5 ’ 編碼區）（Elroy-Stein，0·，Fuerst，T.R.，and Moss，B· (1989) PNAS USA 86 : 6126-6130)、potyvirus前導子[例如 TEV前 導子（菸草腐蝕病毒）(Allison et al· (1986)、MDMV前導子 (Maize Dwarf Mosale Virus) ; Virology，154 : 9-20)及人免 疫球蛋白重鏈結合蛋白質（BiP)(Macejak，D.C·，and Sarnow 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 72 ------------*裝--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 585918 A7 B7 68 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，P. (1991)，Nature，353 : 90-94)]、得自苜蓿嵌紋病毒之 套膜蛋白質mRNA(AMV RNA 4)之未轉譯前導子（Jobling ，S.A.，and gehrke，L. (1987)，Nature，325 : 622-625) 、菸草嵌紋病毒前導子（TMV)(Gallie，D.R. et al. (1989)， Molecular Biology of RNA，page 237-256)及玉米黃斑病毒 前導子（MCMV)(Lomme 卜 S.A. et al· (1991)，Virology，81 :382_385)。也參考Della-Cioppa et al·，（1987)，Plant Physiology，84 : 965-968 o 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如有需要可合成具有植物較佳密碼子密碼子序列或另 外具有葉綠體較佳密碼子密碼子之序列，依是否要表現感 興趣之單萜合成酶序列來決定。植物較佳密碼子密碼子可 由於特定植物種屬以最大量表現之蛋白質總頻率最高的密 碼子密碼子決定。參考EPA 0359472 ; EPA 0386962 ; WO 91/16432 ； Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 3324-3328 ; and Murray et al· (1989) Nucleic Acids Research 17 : 477-498。藉此方式，核苷酸序列可適合於任 一種植物表現。需了解，編碼裸子植物單萜合成酶蛋白質 之核酸序列之全部或任何部份可最適化或合成。換言之， 也可使用合成或部份最適化序列。供構成葉綠體較佳基因 則參考美國專利5,545,817。 製備轉錄匣時，可操縱多種DNA片段，而提供於正確 取向及正確讀取架構之DNA序列。為了達到此目的，配接 子或連接子可用於接合DNA片段，或其他操縱可用於提供 方便限切位置，去除多餘DNA，去除限切位置，或類似者 73 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 69 五、發明說明（） 。為了達到此目的，可使用試管試驗突變發生、引子修護 、限切、環化、切除、接合等，於此處包括插入、刪除或 取代，例如過渡及轉化。 本發明之重組DNA分子可以此技藝中所了解之多種 方式引進植物細胞。熟習該項技藝者會了解依被鎖定目標 供轉形之植物類別（如單子葉植物或雙子葉植物）來選擇方 法。適當轉形植物細胞方法包括顯微注射（(^088\¥&}^61&1· (1986) BioTechniques 4 : 320-334)、電穿孔（Riggs et al. (1986) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 83 : 5602-5606)、 Agrobacterium 媒介轉形（Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6 ·· 915-921)及泡胞顆粒加速（參考例如 Sanford et al.? U.S. Patent No. 4,945,050； and McCabe et al. (1988) Biotechnology 6 : 923-926)。也參考 Weissinger et al· (1988) Annual. Rev. Genet. 22 : 421-477 ; Sanford et al· (1987) Particulate Science and Technology 5 : 27-37 (onion) ；Christou et al (1988) Plant Physiol. 87* 671-674 (soybean) ;McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soybean) ;Datta et al· (1990) Biotechnology 8 : 736-740 (rice); Klein et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85 : 4305-4309 (maize) ; Klein et al· (1988) Biotechnology 6 : 559-563 (maize) ； Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91 : 440-444 (maize) ; Fronun et al· (1990) Biotechnology 8 : 833-839 ; and Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2 ： 603-618 (maize) ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 74 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
585918 A7 B7 70 五、發明說明（） 另外，植物質體可直接轉形。以有關於高等植物葉綠 體穩定轉形之報告，例如參考SVAB et al· (1990) Proc. natl. Acad. Sci. USA 87： 85268530； SVAB & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 ： 913-917 ； Staub & Miliga (1993) Embo J. 12 : 601-606。該方法依賴粒子搶輸送含適當標記 之DNA，並使DNA透過同質重組達至質體基因組。此種方 法中，質體基因表現可藉由使用質體基因啟動子或藉轉移 活化無聲質體載運之轉殖基因達成，該轉殖基因經定位供 來自一可選擇之啟動子序列（T7 RNA聚合酶辨識者）表現 。無聲質體基因係經由表現得自核表現構成體之特定RNA 聚合酶活化，並使用過渡肽使聚合酶達至質體來活化。組 織特異性表現可於此種方法使用由適當植物組織特異性啟 動子表現之核編碼或質體引導特定RNA聚合酶獲得。此種 系統報告於McBride et al. (1994) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 91 : 7301-7305 〇 可藉多種此技藝中所知的任何方法使已轉形細胞於植 物體内生長。例如參考 McConnick et al·，Plant Cell Reports (1986)，5 : 81-84。隨後此等植物成長，可自行成長或透 過不同植物株成長，所得同源合子或雜交體具有所需辨識 之所需基因型探針。可使兩代或多代生長以確保實驗之基 因形特徵被穩定維持及遺傳，隨後收穫種子而確保達成所 需基因形或其他性質。 至於宿主細胞可使用任何植物變種。特別令人感興趣 者為提供具商業價值種子之植物種屬。大部份會選擇高量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） -75 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 _________B7 五、發明說明（71) 生產、與感興趣之種子特異性產物有關或種子或種子部份 是可食用之種子。本發明實務中，感興趣之種子包括但非 限於油種子如油菜籽、棉子、大豆、紅花子、葵花子、椰 子、棕櫚等；轂類種子如小麥、大麥、燕麥、馬齒莧、亞 麻、黑麥、黑麥小麥雜交種、稻米及玉米；其他食用種子 或附有食用部份之種子包括南瓜、葫瓜、芝麻、罌粟、葡 萄、菊丑、花生、豌豆、四季豆、紅蘿蔔、苜蓿、可可及 咖啡，及木本核果如胡桃、杏仁、美洲胡桃及小藜豆。 實例11 單玆合成酶之方法 本發明包括裸子植物單萜合成晦蛋白質及編碼裸子植 物單萜合成酶蛋白質之核酸分子。本發明之裸子植物單萜 合成酶蛋白質之胺基酸序列各自包括表丨揭示之胺基酸序 列元件中之至少_者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表1 胺基酸 序列 取向 備註 1. 70-77 HSN(L，I，V)WDDD 序列識別編號：46) 僅有F HS製造不良反向引子 2. 148-153 ALDYVV (序列識別編號：47) F及R 3. 306-312 ELAKLEF (序列識別編號：48) F及R 4. 328-333 RW WKES (序列識別編號：49) F及R F引子使用Ser密碼子之第1 K ;R使用Arg密碼子之頭兩個r 罕見單獨） Τ t( 5· 377-383 (V，I，L) L D D Μ Y D (序列識別編號：50) F及R F 6. 377-383 (V，I，L)L D D L Y D (序列識別編號：51) F及R 於381 Μ/L簡併性對單二 而言過高 7. 377-383 (V，I，L) L D D IY D (序列識別編號：52) F及R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 76 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 五λ發明說明（ 72 ) 8. 543-549 C Υ Μ K D (Ν，Η) Ρ R F引子也可使用此種肽構成似 (序列識別編號：53) 肽接近3’端故無用 表1對各肽序列之第一及最末胺基酸殘基陳述之編號 ，為對應由大冷杉之（-)·松烯合成酶（序列識別編號：4)分 離出來之胺基酸序列中的胺基酸殘基之編號。若胺基酸殘 基序列出現於框内（例如表1之（L，I，V))，則框内之第一 個胺基酸殘基為出現於序列辨識編號：4之（-)-松烯合成酶 胺基酸序列。框内第二個胺基酸殘基表示常見於涉及萜合 成之其他大冷杉酶胺基酸序列中對應位置之其他胺基酸殘 基。 表1，字母“F”表示正向PCR反應，亦即可合成訊息核 酸股以編碼裸子植物單萜合成酶之PCR反應。字母“R”表示 反向PCR反應，亦即合成反訊息核酸分子之pcr反應，該 反訊息分子與正向PCR反應合成之訊息核酸股互補。 為了選殖編碼本發明之裸子植物單結合成酶之核酸分 子，對應於表1所述胺基酸序列至少部份之一或多種募核苔 酸分子可用做探針，藉此篩檢得自一或多種裸子植物之基 因組或cDNA存庫。本文中，“對應，，一詞表示寡核苷酸鹼基 序列a)編碼表1所述胺基酸序列之至少一者之全部或部份 ，或b)與編碼表1所述至少一種胺基酸序列之全部或部份之 驗基序列互補。寡核誓酸探針含有合成驗基如肌苷，其可 取代四種天然鹼基，亦即腺嘌呤（“A”），鳥糞嘌呤（“G”）， 胞嘧啶（“C”)及胸腺嘧啶（“T”）中之一者或多者。如此，例如 下列寡核苔酸序列“對應，，三肽序列Μ Μ Μ :
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G χ 297公髮) -~77~I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 73 五、發明說明（） 5’ATGATGATG3’（訊息取向）（序列識別編號：54); 3’TACTACTAC5’（反訊息取向）（序列識別編號：55)及 3’IACIACIAC5’（序列識別編號：56)。 一或多種募核苔酸序列對應表1所述至少一種胺基酸 序列之至少部份可用於根據熟習該項技藝者所周知之方法 篩檢核酸存庫俾辨識本發明之單萜合成酶選殖體。例如參 考Sambrook等，參見上文。根據本發明利用一種或多種對 應於表1所述至少一種胺基酸序列之至少部份之寡核苔酸 篩檢存庫期間’雜交及洗務條件之規定為至少··雜交步驟 ，6x SSPE，40-45°C，歷 36小時；洗滌步驟，3χ SSpE， 45 C ’ 3x 15分鐘洗滌。根據本發明利用一種或多種對應於 表1所述至少一種胺基酸序列之至少一部份之寡核苷酸序 列筛檢存庫過程中’目前較佳雜交及洗滌條件為：雜交步 驟，6x SSPE，40-45°C ’ 歷 36小時；洗滌步驟，〇 1χ SSpE ，65_70°C，3x 15分鐘洗滌。 ------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於前述雜交及洗滌條件下，可與編碼裸子植物單萜合 成酶肽之本發明核酸序列訊息股雜交，對應於表1所述至少 一種胺基酸之寡核苔酸序列範例述於表2。 表2 核酸序列 ~~ 對應於： GTG TCG TTG GAG ACC CTG CTG CTG(序列識別編號：57) 序列識別編號：46 CGG GAG CTG ATG CAG ATG(序列識別 編號：58) 序列識別編號：47 CTC AGA CGG TCC GAG CTC AAG(序 列識別編號：59) 序列識別編號：48 GCC ACC ACC TCC CTC TCG(序歹識另》J 編號：60) 序列識別編號：49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 78 585918 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7 心 74、 五、發明說明（） GAG GAG CTG CTG TAC ATG CTG(序列 識別編號：61) 序列識別編號：50 GAG GAG CTG CTG GAG ATG CTG(序 列識別編號：62) 序列識別編號：51 同理，為了篩檢核酸存庫，可根據熟習該項技藝者所 知方法（例如Sambrook等，參見上文），用序列識別編號：1 、序列識別編號：3及序列識別編號·· 5所述之裸子植物單 萜合成酶選殖體或其部份用作為探針，分離本發明之單萜 合成酶選殖體。根據本發明，篩檢存庫期間，雜交及洗滌 條件之嚴苛度至少為：雜交步驟，6x SSPE緩衝液於45°C 至50°C歷36小時；洗滌步驟，3x SSPE緩衝液於50°C(三次 ，15分鐘洗滌）。根據本發明，於使用序列識別編號：1， 序列識別編號：3及序列識別編號：5或其部份所述裸子植 物單萜合成酶選殖體篩檢存庫期間，目前較佳之雜交及洗 滌條件為：用於雜交步驟，6X SSPE，40-45X：，歷36小時 •，供洗滌步驟，0.1X SSPE，70-75。(：，3x 15分鐘洗滌。 此外，至少兩個寡核苷酸序列（該每一序列對應於至少 一種表1所述核苷酸序列之至少一部份）可用於PCR反應而 產生部份本發明之單萜合成酶選殖體，其可用作為探針以 分離本發明之單萜合成酶全長選殖體。因此，用來作為正 向PCR反應中之探針的寡核苷酸，對應於至少一種表1中所 揭示之具有“F”取向之核苷酸的至少一部份。相反地，可用 來作為反向PCR反應中之探針的寡核苷酸，對應於具有“R，， 取向之至少一種表1中所揭示之胺基酸的至少一部份。pCR 反應可根據此技藝中眾所周知之PCR條件進行，如實例i 本紙張尺度適用T國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） .79 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·1111111 ^ · ----------- ---- 585918 A7 B7 五、發明説明（75 ) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 陳述之PCR反應條件及陳述於“PCR Strategies”，M.A.， Innis，D.H. Gelfand and J.J· Sninsky，eds·，1995，Academic Press，San diego，CA(Chapter 14); “PCR Protocols ·· A Guide to Methods and Applications”，Μ·Α· Irniis，D.H. Gelfand ，J.J. Sninsky and T.J. White，eds.，Academic Press，NY (1990)。本發明之較佳PCR反應條件為 dNTPs 各200 μΜ
MgCl2 5-7 mM F及R引子 各ΙΟΟηΜ- 1 μΜ
Taq聚合酶 1-2單位/反應 cDNA模版 10-100毫微克/反應 緩衝液，PCR等級水，及急冷分離蠟或礦油 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） 80 585918 A7 _B7 五、發明説明（76 ) 較佳熱週期條件為： 變性 94°Cx2分鐘 1週期 變性 94°Cx45 秒 35週期 環化 42°〇55°〇又45秒-1分鐘 35週期 聚合 72°Cx 1-2 分鐘 35週期 腺苷化 72°Cx 10 分鐘 1週期 雖然已經舉例說明本發明之較佳具體例，但顯然易知 可在未悖離本發明之精髓及範圍下做出多種變化。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝丨一 訂— 線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 585918 A7B7 77 五、發明說明（）
SEQUENCE LISTING
<110〉 Croteau, Rodney B Bohlmann, Carl J Steele, Christopher L <120> Monoterpene Synthases from Grand Fir (Abies grandis) <130> WSURI11009 <140> <141> <150〉 60/052,249 <151> 1997-07-11 <160> 62 <170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1 <211> 2196 <212> DNA <213> Abies grandis <220>
<221> CDS <222> (69)..(1952) <223> Clone AG2.2 encoding myrcene synthase <400〉 1 tgccggcacg aggttatctt gagcttcctc catataggcc aacacatatc atatcaaagg 60 — — — — — — — — — — ·—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gagcaaga atg get ctg gtt tet ate tea ccg ttg get teg aaa tet tgc 110 Met Ala Leu Val Ser lie Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys 1 5 10 ctg ege aag teg ttg ate agt tea att cat gaa cat aag cct ccc tat 158 Leu Arg Lys Ser Leu lie Ser Ser lie His Glu His Lys Pro Pro Tyr 15 20 25 30 aga aca ate cca aat ett gga atg cgt agg ega ggg aaa tet gtc aeg 206 Arg Thr lie Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr 35 40 45 cct tcc atg age ate agt ttg gcc acc get gca cct gat gat ggt gta 254 Pro Ser Met Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp Gly Val 50 55 60 caa aga ege ata ggt gac tac cat tcc aat ate tgg gac gat gat ttc 302 Gin Arg Arg lie Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe 65 70 75 ata cag tet eta tea aeg cct tat ggg gaa ccc tet tac cag gaa cgt 350 He Gin Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg 80 85 90 get gag aga tta att gtg gag gta aag aag ata ttc aat tea atg tac 398 Ala Glu Arg Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr 95 100 105 110 82 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 五、發明說明（） ctg gat gat gga aga tta atg agt tcc ttt aat gat etc atg caa ege Leu Asp Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg 115 120 125 446 ett tgg ata gtc gat age gtt gaa cgt ttg ggg ata get aga cat ttc Leu Trp lie Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe 130 135 140 494 aag aac gag ata aca tea get ctg gat tat gtt ttc cgt tac tgg gag Lys Asn Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu 145 150 155 542 gaa aac ggc att gga tgt ggg aga gac agt att gtt act gat etc aac Glu Asn Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser lie Val Thr Asp Leu Asn 160 165 170 590 tea act geg ttg ggg ttt ega act ett ega tta cac ggg tac act gta Ser Thr Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val 175 180 185 190 638 tet cca gag gtt tta aaa get ttt caa gat caa aat gga cag ttt gta Ser Pro Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val 195 200 205 686 tgc tee ccc ggt cag aca gag ggt gag ate aga age gtt ett aac tta Cys Ser Pro Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu 210 215 220 734 _______I---丨·-裝------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tat egg get tec etc att gee ttc cct ggt gag aaa gtt atg gaa gaa Tyr Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu 225 230 235 782 get gaa ate ttc tec aca aga tat ttg aaa gaa get eta caa aag att 830 Ala Glu lie Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie 240 245 250 cca gtc tec get ett tea caa gag ata aag ttt gtt atg gaa tat ggc 878 Pro Val Ser Ala Leu Ser Gin Glu He Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly 255 260 265 270 tgg cac aca aat ttg cca aga ttg gaa gca aga aat tac ata gac aca Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr 275 280 285 926 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ett gag aaa gac acc agt gca tgg etc aat aaa aat get ggg aag aag Leu Glu Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys 290 295 ；i00 ett tta gaa ett gca aaa ttg gag ttc aat ata ttt aac tec tta caa Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin 305 310 315 caa aag gaa tta caa tat ett ttg aga tgg tgg aaa gag teg gat ttg Gin Lys Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu 320 325 330 cct aaa ttg aca ttt get egg cat cgt cat gtg gaa ttc tac act ttg Pro Lys Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu 335 340 345 350 gee tet tgt att gee att gac cca aaa cat tet gca ttc aga eta ggc 974 1022 1070 1118 本紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格（21G X 297公1 ) 1166 585918 A7 B7 — 一五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ala Ser Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly 355 360 365 ttc gcc aaa atg tgt cat ctt gtc aca gtt ttg gac gat att tac gac 1214 Phe Ala Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp 370 375 380 act ttt gga acg att gac gag ctt gaa etc ttc aca tet gca att aag 1262 Thr Phe Gly Thr lie Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys 385 390 395 aga tgg aat tea tea gag ata gaa cac ctt cca gaa tat atg aaa tgt 1310 Arg Trp Asn Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys 400 405 410 gtg tac atg gtc gtg ttt gaa act gta aat gaa ctg aca ega gag geg 1358 Val Tyr Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala 415 420 425 430 gag aag act caa ggg aga aac act etc aac tat gtt ega aag get tgg 1406 Glu Lys Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp 435 440 445 gag get tat ttt gat tea tat atg gaa gaa gca aaa tgg ate tet aat 1454 Glu Ala Tyr Phe Asp Ser Tyr Met Glu Glu Ala Lys Trp He Ser Asn 450 455 460 ggt tat ctg cca atg ttt gaa gag tac cat gag aat ggg aaa gtg age 1502 Gly Tyr Leu Pro Met Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser 465 470 475 tet gca tat ege gta gca aca ttg caa ccc ate etc act ttg aat gca 1550 Ser Ala Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro He Leu Thr Leu Asn Ala 480 485 490 tgg ctt cct gat tac ate ttg aag gga att gat ttt cca tcc agg ttc 1598 Trp Leu Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly He Asp Phe Pro Ser Arg Phe 495 500 505 510 aat gat ttg gca teg tcc ttc ctt egg eta ega ggt gac aca ege tgc 1646 Asn Asp Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys 515 520 525 I：ck： aag yee gat dgg gat cgt ggt gaa gaa get teg tgt ata tea tqt 1694 Tyr Lys Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys 530 535 540 tat atg aaa gac aat cct gga tea acc gaa gaa gat gee etc aat cat 1742 Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His 545 550 555 ate aat gee atg gtc aat gac ata ate aaa gaa tta aat tgg gaa ctt 1790 lie Asn Ala Met Val Asn Asp lie lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu 560 565 570 eta aga tcc aac gac aat att cca atg ctg gee aag aaa cat get ttt 1838 Leu Arg Ser Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe 575 580 585 590 gac ata aca aga get etc cac cat etc tac ata tat ega gat ggc ttt 1886 Asp lie Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 585918 A7 B7 一 80五、發明說明（） 595 600 605 agt gtt gee aac aag gaa aca aaa aaa ttg gtt atg gaa aca etc ett 1934 Ser Val Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu 610 615 620 gaa tet atg ett ttt taa ctataaccat atccataata ataagctcat 1982 Glu Ser Met Leu Phe 625 aatgctaaat tattggeett atgacatagt ttatgtatgt acttgtgtga attcaatcat 2042 atcgtgtggg tatgattaaa aagetagage ttactaggtt agtaacatgg tgataaaagt 2102 tataaaatgt gagttataga gatacccatg ttgaataatg aattacaaaa agagaaattt 2162 atgtagaata agattggaag cttttcaatt gttt 2196 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 2 <211> 627 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 2 Met Ala Leu Val Ser He Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu Arg 1 5 10 15 Lys Ser Leu lie Ser Ser lie His Glu His Lys Pro Pro Tyr Arg Thr 20 25 30 lie Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr Pro Ser 35 40 45 Met Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp G丄y Val Gin Arg 50 55 60 Arg He Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe lie Gin 65 70 75 80 Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg Ala Glu 85 90 95 Arg1 Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr Leu Asp 100 105 110 Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg Leu Trp 115 120 125 He Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe Lys Asn 130 135 140 Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu Glu Asn 145 150 155 160 Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser lie Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser Pro 180 185 190 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — — — — — — — - _ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 言. 585918 A7B7 81五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val Cys Ser 195 200 205 Pro Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arq 210 215 220 Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu 225 230 235 240 lie Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro Val 245 250 255 Ser Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly Trp His 260 265 270 Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Asn Tyr lie Asp Thr Leu Glu 275 280 285 Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys Leu Leu 290 295 300 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin Gin Lys 305 310 315 320 Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu Pro Lys 325 330 335 Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu Ala Ser 340 345 350 Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe Ala 355 360 365 Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe 370 375 380 Gly Thr He Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys Arg Trp 385 390 395 400 Asn Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys Val Tyr 405 410 415 Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala Glu Lys 420 425 430 Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp Glu Ala 435 440 445 Tyr Phe Asp Ser Tyr Met Glu Glu Ala Lys Trp lie Ser Asn Gly Tyr 450 455 460 Leu Pro Met Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser Ser Ala 465 470 475 480 Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala Trp Leu 485 490 495 Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly lie Asp Phe Pro Ser Arg Phe Asn Asp 500 505 510 Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7B7 82五、發明說明（） 515 520 525 Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys Tyr Met 530 535 540 Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn 545 550 555 560 Ala Met Val Asn Asp lie lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg 565 570 575 Ser Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe Asp lie 580 585 590 Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe Ser Val 595 600 605 Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu Glu Ser 610 615 620 Met Leu Phe 625 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 3 <211> 2018 <212> DNA <213> Abies grandis <220> <221> CDS <222> (6)..(1892) <223〉純株AG3_ 18编瑪松烯合成· <400> 3 cagca atg get eta gtt tet acc gca ccg ttg get tcc aaa tea tgc ctg 50 Met Ala Leu Val Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu 15 10 15 cac aaa teg ttg ate agt tet acc cat gag ett aag get etc tet aga 98 I.yy ·'·»«!： l.uti lie Sm Suj: Thr His Glu Leu Lys Aid Luu LJut Aiij 20 25 30 acaatt cca get eta gga atg agt agg ega ggg aaa tet ate act cct 146 Thr lie Pro Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Gly Lys Ser lie Thr Pro 35 40 45 tcc ate age atg age tet acc acc gtt gta acc gat gat ggt gta ega 194 Ser lie Ser Met Ser Ser Thr Thr Val Val Thr Asp Asp Gly Val Arg 50 55 60 aga ege atg ggc gat ttc cat tcc aac etc tgg gac gat gat gtc ata 242 Arg Arg Met Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Val lie 65 70 75 cag tet tta cca aeg get tat gag gaa aaa teg tac ctg gag cgt get 290 Gin Ser Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Arg Ala 80 85 90 95 gag aaa ctg ate ggg gaa gta aag aac atg ttc aat teg atg tea tta 338 Glu Lys Leu lie Gly Glu Val Lys Asn Met Phe Asn Ser Met Ser Leu
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 87 585918 A7 _ B7 ---" 83 五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 100 105 110 gaa gat gga gag tta atg agt ccg etc aat gat etc att caa ege ett 386 Glu Asp Gly Glu Leu Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu lie Gin Arg Leu 115 120 125 tgg att gtc gac age ett gaa cgt ttg ggg ate cat aga cat ttc aaa 434 Trp lie Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly lie His Arg His Phe Lys 130 135 140 gat gag ata aaa teg geg ett gat tat gtt tac agt tat tgg ggc gaa 482 Asp Glu lie Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Glu 145 150 155 aat ggc ate gga tgc ggg agg gag agt gtt gtt act gat ctg aac tea 530 Asn Gly lie Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn Ser 160 165 170 175 act geg ttg ggg ett ega acc eta ega eta cac gga tac ccg gtg tet 578 Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Pro Val Ser 180 185 190 tea gat gtt ttc aaa get ttc aaa ggc caa aat ggg cag ttt tee tgc 626 Ser Asp Val Phe Lys Ala Phe Lys Gly Gin Asn Gly Gin Phe Ser Cys 195 200 205 tet gaa aat att cag aca gat gaa gag ate a^a ggc gtt ctg aat tta 674 Ser Glu Asn lie Gin Thr Asp Glu Glu lie Arg Gly Val Leu Asn Leu 210 215 220 ttc egg gee tee etc att gee ttt cca ggg gag aaa att atg gat gag 722 Phe Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys lie Met Asp Glu 225 230 235 get gaa ate ttc tet acc aaa tat tta aaa gaa gee ctg caa aag att 770 Ala Glu lie Phe Ser Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys IXe 240 245 250 255 ccg gtc tee agt ett teg ega gag ate ggg gac gtt ttg gaa tat ggt 818 Pro Val Ser Ser Leu Ser Arg Glu lie Gly Asp Val Leu Glu Tyr Gly 260 265 2Ί0 tgg cac aca tat ttg ccg ega ttg gaa gca agg aat tac ate caa gtc 866 Trp His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr Tie Gin Val 275 280 285 ttt gga cag gac act gag aac a eg aag tea tat gtg aag age aaa aaa 914 Phe Gly Gin Asp Thr Glu Asn Thr Lys Ser Tyr Val Lys Ser Lys Lys 290 295 300 ett tta gaa etc gca aaa ttg gag ttc aac ate ttt caa tee tta caa 962 Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Gin Ser Leu Gin 305 310 315 aag agg gag tta gaa agt ctg gtc aga tgg tgg aaa gaa teg ggt ttt 1010 Lys Arg Glu Leu Glu Ser Leu Val Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Phe 320 325 330 335 cct gag atg ace ttc tgc ega cat cgt cac gtg gaa tac tac act ttg 1058 Pro Glu Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu 340 345 350 -----------W·裝——(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 84 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 get tee tgc att geg ttc gag cct caa cat tet gga ttc aga etc ggc Ala Ser Cys lie Ala Phe Glu Pro Gin His Ser Gly Phe Arg Leu Gly 355 360 365 ttt gee aag aeg tgt cat ett ate aeg gtt ett gac gat atg tac gac Phe Ala Lys Thr Cys His Leu lie Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp 370 375 380 ace ttc ggc aca gta gac gag ctg gaa etc ttc aca geg aca atg aag Thr Phe Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Thr Met Lys 385 390 395 aga tgg gat ccg tee teg ata gat tgc ett cca gaa tat atg aaa gga Arg Trp Asp Pro Ser Ser lie Asp Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly 400 405 410 415 gtg tac ata geg gtt tac gac acc gta aat gaa atg get ega gag gca Val Tyr He Ala Val Tyr Asp Thr Val Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala 420 425 430 gag gag get caa ggc ega gat aeg etc aca tat get egg gaa get tgg Glu Glu Ala Gin Gly Arg Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Arg Glu Ala Trp 435 440 445 gay get tat att gat teg tat atg caa gaa gca agg tgg ate gee act Glu Ala Tyr lie Asp Ser Tyr Met Gin Glu Ala Arg Trp lie Ala Thr 450 455 460 ggt tac Gtg ccc tee ttt gat gag tac tac gag aat ggg aaa gtt age Gly Tyr Leu Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser 465 470 475 tgt ggt cat ege ata tec gca ttg caa ccc att ctg aca atg gac ate Cys Gly His Arg lie Ser Ala Leu Gin Pro lie Leu Thr Met Asp lie 480 485 490 495 ccc ttt cct gat cat ate etc aag gaa gtt gac ttc cca tea aag ett Pro Phe Pro Asp His lie Leu Lys Glu Val Asp Phe Pro Ser Lys Leu 500 505 510 aac gac ttg gca tgt gee ate ett ega tta ega ggt gat aeg egg tgc Asn Asp Leu Ala Cys Ala lie Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys 515 520 525 tac aag geg gac agg get cgt gga gaa gaa get tee tet ata tea tgt Tyr Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ser He Ser Cys 530 535 540 tat atg aaa gac aat cct gga gta tea gag gaa gat get etc gat cat Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Val Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asp His 545 550 555 ate aac gee atg ate agt gac gta ate aaa gga tta aat tgg gaa ett lie Asn Ala Met lie Ser Asp Val He Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu 560 565 570 575 etc aaa cca gac ate aat gtt ccc ate teg geg aag aaa cat get ttt Leu Lys Pro Asp lie Asn Val Pro lie Ser Ala Lys Lys His Ala Phe 580 585 590 1106 1154 1202 1250 1298 1346 1394 1442 14 90 1538 1586 1634 1682 1730 1778 -----------裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） — 85 —585918 A7 B7 五、發明說明（） gac ate gee aga get ttc cat tac ggc tac aaa tac ega gac ggc tac 1826
Asp lie Ala Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr 595 600 605 age gtt gee aac gtt gaa aeg aag agt ttg gtc aeg aga acc etc ett 1874
Ser Val Ala Asn Val Glu Thr Lys Ser Leu Val Thr Arg Thr Leu Leu 610 615 620 gaa tet gtg cct ttg tag caacagctca aatetatgee etatgetatg 1922
Glu Ser Val Pro Leu 625 tcgggttaaa atatatgtgg aaggtagccg ttggatgtag aggataagtt tgttataatt 1982 taataaagtt gtaatttaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2018
<210> 4 <211> 628 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 4
Met Ala Leu Val Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu His 1 5 10 15
Lys Ser Leu lie Ser Ser Thr His Glu Leu Lys Ala Leu Ser Arg Thr 20 25 30 lie Pro Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Gly Lys Ser lie Thr Pro Ser 35 40 45 lie Ser Met Ser Ser Thr Thr Val Val Thr Asp Asp Gly Val Arg Arg 50 55 60
Arg Met Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Val lie Gin 65 70 75 80
Ser Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Arg Ala Glu 85 90 95
Lys Leu lie Gly Glu Val Lys Asn Met Phe Asn Ser Met Ser Leu Glu 100 105 110
Asp Gly Glu Leu Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu lie Gin Arg Leu Trp 115 120 125
He Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly lie His Arg His Phe Lys Asp 130 135 140 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Glu He Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Glu Asn 145 150 155 160
Gly lie Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175
Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Pro Val Ser Ser 180 185 190
Asp Val Phe Lys Ala Phe Lys Gly Gin Asn Gly Gin Phe Ser Cys Ser 195 200 205 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 ~ 86 一 五、發明說明（）
Glu Asn He Gin Thr Asp Glu Glu lie Arg Gly Val Leu Asn Leu Phe 210 215 220
Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys lie Met Asp Glu Ala 225 230 235 240
Glu lie Phe Ser Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro 245 250 255
Val Ser Ser Leu Ser Arg Glu lie Gly Asp Val Leu Glu Tyr Gly Trp 260 265 270
His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Gin Val Phe 275 280 285
Gly Gin Asp Thr Glu Asn Thr Lys Ser Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu 290 295 300
Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Gin Ser Leu Gin Lys 305 310 315 320
Arg Glu Leu Glu Ser Leu Val Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Phe Pro 325 330 335
Glu Met Thr Phe Gys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu Ala 340 345 350
Ser Cys lie Ala Phe Glu Pro Gin His Ser Gly Phe Arg Leu Gly Phe 355 360 365 八Id Lys Tilt (Jys llis Leu lie Tin. Vd丄 Leu Λί^μ Asp Met Tyi Λϋμ Tl“ 370 375 380
Phe Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Thr Met Lys Arg 385 390 395 400
Trp Asp Pro Ser Ser lie Asp Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val 405 410 415
Tyr lie Ala Val Tyr Asp Thr Val Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala Glu 420 425 430
Glu Ala Gin Gly Arg Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Arg Glu Ala Trp Glu 435 440 445
Ala Tyr lie Asp Ser Tyr Met Gin Glu Ala Arg Trp lie Ala Thr Gly 450 455 460
Tyr Leu Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser Cys 465 470 475 480 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -I I I 11-----· — I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Gly His Arg lie Ser Ala Leu Gin Pro lie Leu Thr Met Asp lie Pro 485 490 495
Phe Pro Asp His lie Leu Lys Glu Val Asp Phe Pro Ser Lys Leu Asn 500 505 510
Asp Leu Ala Cys Ala He Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr 515 520 525 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 91—- — 87 585918 A7 B7 五、發明說明（）
Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Sex lie Ser Cys Tyr 530 535 540
Met Lys Asp Asn Pro Gly Val Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asp His lie 545 550 555 560 -----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Asn Ala Met lie Ser Asp Val lie Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu Leu 565 570 575
Lys Pro Asp lie Asn Val Pro lie Ser Ala Lys Lys Hia Ala Phe Asp 580 585 590
He Ala Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Ser 595 600 605
Val Ala Asn Val Glu Thr Lys Ser Leu Val Thr Arg Thr Leu Leu Glu 610 615 620
Ser Val Pro Leu 625 <210> 5 <211> 2089 <212> DNA <213> Abies grandis <220>
<221> CDS <222> (73)..(1986) <223〉純株AGIO编碼檸樣烯合成誨 * <400> 5 tgccgtttaa tcggtttaaa gaagctacca tagttcggtt taaagaagct accatagttt 60 aggcaggaat cc atg get etc ett tet ate gta tet ttg cag gtt ccc aaa 111 Met Ala Leu Leu Ser He Val Ser Leu Gin Val Pro Lys 1 . 5 10 tcc tgc ggg ctg aaa teg ttg ate agt tcc age aat gtg cag aag get 159
Ser Cys Gly Leu Lys Ser Leu lie Ser Ser Ser Asn Val Gin Lys Ala 15 20 25 etctgt ate tet aca gca gtc cca aca etc aga atg cgt agg ega cag 207
Leu Cys lie Ser Thr Ala Val Pro Thr Leu Arg Met Arg Arg Arg Gin 30 35 40 45 aaa get ctg gtc ate aac atg aaa ttg acc act gta tcc cat cgt gat 255
Lys Ala Leu Val He Asn Met Lys Leu Thr Thr Val Ser His Arg Asp 50 55 60 gat aat ggt ggt ggt gta ctg caa aga ege ata gcc gat cat cat ccc 303 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asp Asn Gly Gly Gly Val Leu Gin Arg Arg lie Ala Asp His His Pro 65 70 75 aac ctg tgg gaa gat gat ttc ata caa tea ttg tcc tea cct tat ggg 351
Asn Leu Trp Glu Asp Asp Phe lie Gin Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly 80 85 90 gga tet teg tac agt gaa cgt get gag aca gtc gtt gag gaa gta aaa 399
Gly Ser Ser Tyr Ser Glu Arg Ala Glu Thr Val Val Glu Glu Val Lys 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 ' 88 — 五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 95 100 105 gag atg ttc aat tea ata cca aat aat aga gaa tta ttt ggt tee caa 447 GLu Met Phe Asn Ser lie Pro Asn Asn Arg Glu Leu Phe Gly Ser Gin 110 115 120 125 aat gat etc ett aca ege ett tgg atg gtg gat age att gaa cgt ctg 495 Asn Asp Leu Leu Thr Arg Leu Trp Met Val Asp Ser lie Glu Arg Leu 130 135 140 ggg ata gat aga cat ttc caa aat gag ata aga gta gee etc gat tat 543 Gly lie Asp Arg His Phe Gin Asn Glu lie Arg Val Ala Leu Asp Tyr 145 · 150 155 gtt tac agt tat tgg aag gaa aag gaa ggc att ggg tgt ggc aga gat 591 Val Tyr Ser Tyr Trp Lys Glu Lys Glu Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp 160 165 170 tet act ttt cct gat etc aac teg act gee ttg geg ett ega act ett 639 Ser Thr Phe Pro Asp Leu Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Arg Thr Leu 175 180 185 ega ctg cac gga tac aat gtg tet tea gat gtg ctg gaa tac ttc aaa 687 Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Ser Asp Val Leu Glu Tyr Phe Lys 190 195 200 205 gat gaa aag ggg cat ttt gee tgc cct gca ate eta acc gag gga cag 735 Asp Glu Lys Gly His Phe Ala Cys Pro Ala lie Leu Thr Glu Gly Gin 210 215 220 ate act aga agt gtt eta aat tta tat egg get tee ctg gtc gee ttt 783 He Thr Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Val Ala Phe 225 230 235 ccc ggg gag aaa gtt atg gaa gag get gaa ate ttc teg gca tet tat 831 Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie Phe Ser Ala Ser Tyr 240 245 250 ttg aaa aaa gtc tta caa aag att ccg gtc tee aat ett tea gga gag 879 Leu Lys Lys Val Leu Gin Lys lie Pro Val Ser Asn Leu Ser Gly Glu 255 260 265 ata gaa tat gtt ttg gaa tat ggt tgg cac aeg aat ttg ccg aga ttg 927 lie'Glu Tyr Val Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Lea 270 275 280 285 gaa gca aga aat tat ate gag gtc tac gag cag age ggc tat gaa age 975 Glu Ala Arg Asn Tyr lie Glu Val Tyr Glu Gin Ser Gly Tyr Glu Ser 290 295 300 tta aac gag atg cca tat atg aac atg aag aag ett tta caa ett gca 1023 Leu Asn Glu Met Pro Tyr Met Asn Met Lys Lys Leu Leu Gin Leu Ala 305 310 315 aaa ttg gag ttc aat ate ttt cac tet ttg caa eta aga gag tta caa 1071 Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe His Ser Leu Gin Leu Arg Glu Leu Gin 320 325 330 tet ate tee aga tgg tgg aaa gaa tea ggt teg tet caa ctg act ttt 1119 Ser lie Ser Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gin Leu Thr Phe 335 340 345 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝——(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 上-D · 585918 A7 B7 — 89 一五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 aca egg cat cgt cac gtg gaa tac tac act atg gca tet tgc att tet 1167 Thr Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Met Ala Ser Cys lie Ser 350 355 360 365 atg ttg cca aaa cat tea get ttc aga atg gag ttt gtc aaa gtg tgt 1215 Met Leu Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Met Glu Phe Val Lys Val Cys 370 375 380 cat ett gta aca gtt etc gat gat ata tat gac act ttt gga aca atg 1263 His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe Gly Thr Met 385 390 395 aac gaa etc caa ett ttt aeg gat gca att aag aga tgg gat ttg tea 1311 Asn Glu Leu Gin Leu Phe Thr Asp Ala lie Lys Arg Trp Asp Leu Ser 400 405 410 aeg aca agg tgg ett cca gaa tat atg aaa gga gtg tac atg gac ttg 1359 Thr Thr Arg Trp Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val Tyr Met Asp Leu 415 420 425 tat caa tgc att aat gaa atg gtg gaa gag get gag aag act caa ggc 1407 Tyr Gin Cys lie Asn Glu Met Val Glu Glu Ala Glu Lys Thr Gin Gly 430 435 440 445 ega gat atg etc aac tat att caa aat get tgg gaa gee eta ttt gat 1455 Arg Asp Met Leu Asn Tyr lie Gin Asn Ala Trp Glu Ala Leu Phe Asp 450 455 460 acc ttt atg caa gaa gca aag tgg ate tee age agt tat etc cca aeg 1503 Thr Phe Met Gin Glu Ala Lys Trp lie Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Thr 465 470 475 ttt gag gag tac ttg aag aat gca aaa gtt agt tet ggt tet ege ata 1551 Phe Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ala Lys Val Ser Ser Gly Ser Arg lie 480 485 490 gee aca tta caa ccc att etc act ttg gat gta cca ett cct gat tac 1599 Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asp Val Pro Leu Pro Asp Tyr 495 500 505 ata ctg caa gaa att gat tat cca tee aga ttc aat gag tta get teg 1647 lie Leu Gin Glu He Asp Tyr Pro Ser Arg Phe Asn Glu Leu Ala Ser 510， 515 520 525 tee ate ett ega eta ega ggt gac aeg ege tgc tac aag geg gat agg 1695 Ser lie Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys Ala Asp Arg 530 535 540 gee cgt gga gaa gaa get tea get ata teg tgt tat atg aaa gac cat 1743 Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ala lie Ser Cys Tyr Met Lys Asp His 545 550 555 cct gga tea ata gag gaa gat get etc aat cat ate aac gee atg ate 1791 Pro Gly Ser lie Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn Ala Met lie 560 565 570 agt gat gca ate aga gaa tta aat tgg gag ett etc aga ccg gat age 1839 Ser Asp Ala lie Arg Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Ser 575 580 585 -----------裝---(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7B7 90五、發明說明（） aaa agt ccc ate tet tee aag aaa cat get ttt gac ate acc aga get 1887 Lys Ser Pro lie Ser Ser Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr Arg Ala 590 595 600 605 ttc cat cat gtc tac aaa tat ega gat ggt tac act gtt tee aac aac 1935 Phe His His Val Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn 610 615 620 gaa aca aag aat ttg gtg atg aaa acc gtt ett gaa cct etc get ttg 1983 Gin Thr i.ys Asn Leu Val Met Lys Thr Val Leu Glu t、n) iwu Aid Leu 625 630 635 taa aaacatatag aatgcattaa aatgtgggaa gtetataate tagactattc 2036 tetatettte ataatgtaga tctggatcftg tattgaactc taaaaaaaaa aaa 2089 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 6 <211> 637 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 6 Met Ala Leu Leu Ser lie Val Ser Leu Gin Val Pro Lys Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Lys Ser Leu lie Ser Ser Ser Asn Val Gin Lys Ala Leu Cys lie 20 25 30 Ser Thr Ala Val Pro Thr Leu Arg Met Arg Arg Arg Gin Lys Ala Leu 35 40 45 Val lie Asn Met Lys Leu Thr Thr Val Ser His Arg Asp Asp Asn Gly 50 55 60 Gly Gly Val Leu Gin Arg Arg lie Ala Asp His His Pro Asn Leu Trp 65 70 75 80 Glu Asp Asp Phe lie Gin Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Ser Glu Arg Ala Glu Thr Val Val Glu Glu Val Lys Glu Met Phe 100 105 110 Asn Ser lie Pro Asn Asn Arg Glu Leu Phe Gly Ser Gin Asn Asp Leu 115 120 125 Leu Thr Arg Leu Trp Met Val Asp Ser lie Glu Arg Leu Gly lie Asp 130 135 140 Arg His Phe Gin Asn Glu lie Arg Val Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser 145 150 155 160 Tyr Trp Lys Glu Lys Glu Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser Thr Phe 165 170 175 Pro Asp Leu Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Leu His 180 185 190 Gly Tyr Asn Val Ser Ser Asp Val Leu Glu Tyr Phe Lys Asp Glu Lys 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 95 -----------裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7B7 91五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 195 200 205 Gly His Phe Ala Cys Pro Ala lie Leu Thr Glu Gly Gin lie Thr Arg 210 215 220 Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Val Ala Phe Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Lys Lys 245 250 255 V.i I ί·υυ Gl.li I,ys l ie Pro Val Sur Asn leu Uui Gly (；t u j|〇 (；l.u '!*yi 260 265 270 Val Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg 275 280 285 Asn Tyr lie Glu Val Tyr Glu Gin Ser Gly Tyr Glu Ser Leu Asn Glu 290 295 300 Met Pro Tyr Met Asn Met Lys Lys Leu Leu Gin Leu Ala Lys Leu Glu 305 310 315 320 Phe Asn lie Phe His Ser Leu Gin Leu Arg Glu Leu Gin Ser lie Ser 325 330 335 Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gin Leu Thr Phe Thr Arg His 340 345 350 Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Met Ala Ser Cys He Ser Met Leu Pro 355 360 365 Lys His Ser Ala Phe Arg Met Glu Phe Val Lys Val Cys His Leu Val 370 375 380 Thr Val Leu Asp Asp He Tyr Asp Thr Phe Gly Thr Met Asn Glu Leu 385 390 395 400 Gin Leu Phe Thr Asp Ala lie Lys Arg Trp Asp Leu Ser Thr Thr Arg 405 410 415 Trp Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val Tyr Met Asp Leu Tyr Gin Cys 420 425 430 lie Asn Glu Met Val Glu Glu Ala Glu Lys Thr Gin Gly Arg Asp Met 435 440 445 Leu Asn Tyr He Gin Asn Ala Trp Glu Ala Leu Phe Asp Thr Phe Met 450 455 460 Gin Glu Ala Lys Trp lie Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Glu 465 470 475 480 •l.yt Leu Lys Asn Ala Lys Val Ser Ser Gly Ser Arg lie Ala Thr Leu 485 490 495 Gin Pro He Leu Thr Leu Asp Val Pro Leu Pro Asp Tyi lie Leu Gin 500 505 510 Glu lie Asp Tyr Pro Ser Arg Phe Asn Glu Leu Ala Ser Ser He Leu 515 520 525 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 96 585918 A7 B7 92 五、發明說明（
Arg Leu Arg Gly Asp Thr Afg Cys Tyr Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly 530 535 540
Glu Glu Ala Ser Ala He Ser Cys Tyr Met Lys Asp His i»ro Gly Sej： 545 550 555 560
He Glu Glu Asp Ala Leu Asn His He Asn Ala Met lie Ser Asp Ala 565 570 575 lie Arg Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arq Pro Asp Ser Lys Ser Pro 580 585 590 lie Ser Ser Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr Arg Ala Phe His His 595 600 605
Val Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn Glu Thr Lys 610 615 620
Asn Leu Val Met Lys Thr Val Leu Glu Pro Leu Ala Leu 625 630 635 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213)人造^列 <220> <223〉人造序列饥明：簡併性募接苷酸引子及其中字母「nj表示肌被酿残棊 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(25) <223〉簡併性募核苷酸引子A其中η表示机胰酸 ____________裝___ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 7 arraygarra nggnrartay aarga 25
<210> 8 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <223> 人造序列說明：簡併性募核«酿TCR引子B其中字母「nj表示肌联醜殘基 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(20) . <223>簡併性募核苷酸RCP引子B其中字母「η」表示肌膝酸殘基 <400> 8 atgytncary tntaygargc 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） Ύ7 585918 A7B7 五、發明說明（ 93 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：簡併性募核苷酿TCR引子C 其中字母「η」表示肌膝醮殘基 <220> <221> misc一feature <222> (1),7(24) <223> PCR引子C其中字母η表示肌胺酸 <400> 9 ctnkynrang gnctratrta ckty 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：簡併性募核苷踉PCR引子D 其中字母「η」表示肌按釀殘基 <220> <221> misc一feature <222〉 （1).7(23) <223〉PCR引子D其中字母η表示肌胺酸 <400> 10 gaygaynnnt wygaygcnya ygg 23 <210> 11 <211> 108 <212〉 DNA <213>人造序列 <400> 11 gatgatgggt ttgatgcgca cggaacccta gatgaattga agctattcac tgaggctgtg 60 agaagatggg acctctcctt tacagacaac ttccccgatt acatgaaa 108 -----------2W-裝---(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 12 <211> 104 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 12 gacgacgggt atgatgcgca tggaacgatt gacgagcttq aactcttcac atctgcaatt 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 98 585918 A7B7 五、發明說明（ aagagatgga attcatcaga gatagacagc ttccccgact atat 104 <210> 13 <211> 105 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 13 gatgatgggt atgatgcgta cggaacgttg gaagaaatca aaatcatgac agagggagtg 60 agacgatggg atctttcgtt gaccgcttnc cccgactata tgaaa 105 <210> 14 <211> 117 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 14 gacgatgggt atgatgcgca tggaaccttg gaccaactca aaatctttac agagggagtg 60 agacgatggg atgtttcgtt ggtagaccac ttnccccgac tacatgcaat ctagacc 117 <210> 15 <211> 2424 <212> DNA <213> Abies grandis <220> <221> CDS <222> (2).. (2350) ^223> lfe#AG1.28 <400> 15 g ggt tat gat ctt gtg cat tct ctt aaa tea cct tat att gat tet agt 49 Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie Aap Soi Sei 1 5 10 15 tac aga gaa ege geg gag gtc ctt gtt age gag att aaa gtg atg ctt 97 Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys Val Met Leu 20 25 30 aat cca get att aca gga gat gga gaa tea atg att act cca tct get 145 Asn Pro Ala lie Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr Pro Ser Ala 35 40 45 tat gac aca gca tgg gta geg agg gtg ccc gee att gat ggc tct get Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Gly Ser Ala 50 55 60 193 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ege ccg caa ttt ccc caa aca gtt gac tgg att ttg aaa aac cag tta 241 Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys Asn Gin Leu 65 70 75 80 aaa gat ggt tea tgg gga att cag tee cac ttt ctg ctg tee gac cgt Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu Ser Asp Arg 85 90 95 289 ctt ctt gee act ctt tct tgt gtt ctt gtg etc ctt aaa tgg aac gtt 337
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -99— -- 95 585918 A7 B7 五、發明說明（）
Leu Leu Ala Thr Leu $er Cys Val Leu Val Leu Leu Lys Trp Asn Val 100 105 110 ggg gat ctg caa gta gag eag gga att gaa ttc ata aag age aat ctg 385 -----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Gly Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys Ser Asn Leu lib 120 L21) gaa eta gta aag gat gaa acc gat caa gat age ttg gta aca gac ttt 433
Glu Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val Thr Asp Phe no lib 140 gag ate ata ttt act tet ctg tta aga gaa get caa tet ctg ege etc 481
Glu lie lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Glu Ala Gin Ser Leu Arg Leu 145 150 155 160 gga ett ccc tac gac ctg cct tat ata cat ctg ttg cag act aaa egg 529
Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr He His Leu Leu Gin Thr Lys Arg 165 170 1*7 5 cag gaa aga tta gca aaa ett tea agg gag gaa att tat geg gtt ccg 577
Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr Ala Val Pro 180 185 190 teg cca ttg ttg tat tet tta gag gga ata caa gat ata gtt gaa tgg 625
Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie Val Glu Trp 195 200 205 gaa ega ata atg gaa gtt caa agt cag gat ggg tet ttc tta age tea 673
Glu Arg lie Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Ser Ser 210 215 220 cct get tet act gcc tgc gtt ttc atg cac aca gga gac geg aaa tgc 721
Pro Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp Ala Lys Cys 225 230 235 240 ett gaa ttc ttg aac agt gtg atg ate aag ttt gga aat ttt gtt ccc 769
Leu Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn Phe Val Pro 245 250 255 tgc ctg tat cct gtg gat ctg ctg gaa ege ctg ttg ate gta gat aat 817
Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie Val Asp Asn 260 265 270 att gta ege ett gga ate tat aga cac ttt gaa aag gaa ate aag gaa 865 lie Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Glu lie Lys Glu 275 280 285 get ett gat tat gtt tac agg cat tgg aac gaa aga gga att ggg tgg 913
Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly lie Gly Trp 290 295 300 ggc aga eta aat ccc ata gca gat ett gag acc act get ttg gga ttt 961 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Gly Arg Leu Asn Pro lie Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala Leu Gly Phe 305 310 315 320 ega ttg ett egg ctg cat agg tac aat gta tet cca gcc att ttt gac 1009
Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala lie Phe Asp 325 330 335 aac ttc aaa gat gcc aat ggg aaa ttc att tgc teg acc ggt caa ttc 1057
Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr Gly Gin Phe 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7B7 96五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 340 345 350 aac aaa gat gta gca age atg ctg aat ett tat aga get tee cag etc 1105 Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gin Leu 355 360 365 gca ttt cgc gga gaa aac att ett gat gaa get aaa age ttc get act 1153 Ala Phe Pro Gly Glu Asn He Leu Asp Glu Ala Lys Ser Phe Ala Thr 370 375 380 aaa tat ttg aga gaa get ett gag aaa agt gag act tee agt gca tgg 1201 Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser Ser Ala Trp 385 390 395 400 aac aac aaa caa aac ctg age caa gag ate aaa tac geg ctg aag act 1249 Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala Leu Lys Thr 405 410 415 tet tgg cat gee agt gtt ccg aga gtg gaa gca aag aga tac tgt caa 1297 Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg Tyr Cys Gin 420 425 430 gtg tat cgc cca gat tat gca cgc ata gca aaa tgc gtt tac aag eta 1345 Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg lie Ala Lys Cys Val Tyr Lys Leu 435 440 445 ccc tac gtg aac aat gaa aag ttt tta gag ctg gga aaa tta gat ttc 1393 Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys Leu Asp Phe 450 455 460 aac att ate cag tee ate cac caa gaa gaa atg aag aat gtt acc age 1441 Asn lie lie Gin Ser lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn Val Thr Ser 465 470 475 480 tgg ttt aga gat teg ggg ttg cca eta ttc acc ttc get egg gag agg 1489 Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala Arg Glu Arg 485 490 495 ccg ctg gaa ttc tac ttc tta gta geg geg ggg acc tat gaa ccc cag 1537 Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr Glu Pro Gin 500 505 510 IdL cjuc cidd tgc aij(j ttc etc ttt uca add yUj ged Lye Lty i：tuj ucl 1 !jH1> Tyr Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys Leu Gin Thr 515 520 525 <Jt t ctej yac gat atg tat gac act tat gga acc eta cjdt gad t:l:y adg 1033 Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Lys 530 535 540 eta ttc act gag get gtg aga aga tgg gac etc tee ttt aca gaa aac 1681 Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe Thr Glu Asn 545 550 555 560 ett cca gac tat atg aaa eta tgt tac caa ate tat tat gac ata gtt 1729 Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr Tyr Asp He Val 565 570 575 cac gag gtg get tgg gag gca gag' aag gaa cag ggg cgt gaa ttg gtc 1777 His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg Glu Leu Val 580 585 590 ------------逋-裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1^1· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ΤϋΓ 585918 A7B7 97五、發明說明（） age ttt ttc aga aag gga tgg gag gat tat ett ctg ggt tat tat gaa 1825 Ser Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Tyr Glu 595 600 605 gaa get gaa tgg tta get get gag tat gtg cct ace ttg gac gag tac 1873 Glu Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu Asp Glu Tyr 610 615 620 ata aag aat gga ate aca tet ate ggc caa cgt ata ett ctg ttg agt 1921 lie Lys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu Leu Leu Ser 625 630 635 640 gga gtg ttg ata atg gat ggg caa etc ett teg caa gag gca tta gag 1969 Gly Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu Ala Leu Glu 645 650 655 aaa gta gat tat cca gga aga cgt gtt etc aca gag ctg aat age etc 2017 Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu Asn Ser Leu 660 665 670 att tee ege ctg geg gat gac aeg aag aca tat aaa get gag aag get 2065 lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala Glu Lys Ala 675 680 685 cgt gga gaa ttg geg tee age att gaa tgt tac atg aaa gac cat cct 2113 Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser lie Glu Cys Tyr Met Lys Asp His Pro 690 695 700 gaa tgt aca gag gaa gag get etc gat cac ate tat age att ctg gag 2161 Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser lie Leu Glu 705 710 715 720 ccg geg gtg aag gaa ctg aca aga gag ttt ctg aag ccc gac gac gtc 2209 Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro Asp Asp Val 725 730 735 cca ttc gee tgc aag aag atg ett ttc gag gag aca aga gtg aeg atg 2257 Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg Val Thr Met 740 745 750 gtg ata ttc aag gat gga gat gga ttc ggt gtt tee aaa tta gaa gtc 2305 Val lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys Leu Glu Val 1 755 760 765 aaa gat cat ate aaa gag tgt etc att gaa ccg ctg cca ctg taa 2350 Lys Asp His lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro Leu 770 775 780 tcaaaatagt tgcaataata attgaaataa tgtcaactat gtttcacaaa aaaaaaaaaa 2410 aaaaaaaaaa aaaa 2424 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· - T * i^i J ，mMt ϋ I 1 ϋ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 16 <211> 782 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 16 Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie Asp Ser Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ΊΌΖ 585918 A7B7 了 98 五'發明說明（） 1 5 10 15 Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys Val Met Leu 20 25 30 Asn Pro Ala lie Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr Pro Ser Ala 35 40 4i) Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Gly Ser Ala 50 55 60 Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys Asn Gin Leu 65 70 75 80 Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu Ser Asp Arg 85 90 95 Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys Trp Asn Val 100 105 110 Gly Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys Ser Asn Leu 115 120 125 Glu Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val Thr Asp Phe 130 135 140 Glu lie lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Glu Ala Gin Ser Leu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin Thr Lys Arg 165 170 175 Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr Ala Val Pro 180 185 190 Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie Val Glu Trp 195 200 205 Glu Arg lie Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Ser Ser 210 215 220 -----------W-裝——(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Fro Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp Ala Lys Cys 225 230 235 240 Leu Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn Phe Val Pro 245 250 255 Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie Val Asp Asn 260 265 270 lie Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Glu lie Lys Glu 275 280 285 Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly He Gly Trp 290 295 300 Gly Arg Leu Asn Pro lie Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala Leu Gly Phe 305 310 315 320 Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala lie Phe Asp 325 330 335
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 103 585918 A7 B7 99 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr Gly Gin Phe 340 345 350 Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gin Leu 355 360 365 Ala Phe Pro Gly Glu Asn He Leu Asp Glu Ala Lys Set: Phe Ala Thr 3V0 375 380 Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser Ser Ala Trp 385 390 395 400 Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu He Lys Tyr Ala Leu Lys Thr 405 410 415 Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg Tyr Cys Gin 420 425 430 Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg He Ala Lys Cys Val Tyr Lys Leu 435 440 445 Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys Leu Asp Phe 450 455 460 Asn lie lie Gin Ser lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn Val Thr Ser 465 470 475 480 Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala Arg Glu Arg 485 490 495 Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr Glu Pro Gin 500 505 510 Tyr Aid Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Aid C：ys Lou Glu Tlu 515 520 525 Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Lys 530 535 540 Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe Thr Glu Asn 545 550 555 560 Leu'Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr Tyr Asp lie Val 565 570 575 His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg Glu Leu Val 580 585 590 Ser Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Tyr Glu 595 600 605 Glu Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu Asp Glu Tyr 610 615 620 lie Lys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu Leu Leu Ser 625 630 635 640 Gly Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu Ala Leu Glu 645 650 655 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂-----*----· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 585918 A7B7 ^ 100五、發明說明（）
Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu Asn Ser Leu 660 665 670 lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala Glu Lys Ala 675 680 685 Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser He Glu Cys Tyr Met Lys Asp His Pro 690 695 700 Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser lie Leu Glu 705 710 715 720 Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro Asp Asp Val 725 730 735 Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg Val Thr Met 740 745 750 Val lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys Leu Glu Val 755 760 765 Lys Asp His lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro Leu 770 775 780 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 17 <211> 1967 <212> DNA <213> Abies grandis <220〉 <221> CDS <222> (3)..(1736) <223> 纯株 AG4.30 <400> 17 tt tct gaa tct tcc ate cct ega ege aca ggg aat cat cac gga aat 47 Ser Glu Ser Ser lie Pro Arg Arg Thr Gly Asn His His Gly Asn 1 5 10 15 gtg tgg gac gat gac etc ata cac tct etc aac teg ccc tat ggg gca 95 Val Trp Asp Asp Asp Leu He His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala 20 25 30 cct gca tat tat gag etc ett caa aag ett att gag gag ate aag cat 143 Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu He Glu Glu He Lys His 35^ . 40 45 tta ett ttg act gaa atg gaa atg gat gat ggc gat cat gat tta ate 191 Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Met Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie 50 55 60 aaa cgt ett cag ate gtt gac act ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga 239 Lys Arg Leu Gin He Val Asp Thr Leu Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg 65 70 75 cat ttt gaa cac gaa ata caa aca get get tta gat tac gtt tac aga 287 His Phe Glu His Glu lie Gin Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg 80 85 90 95 tgg tgg aac gaa aaa ggt ate ggg gag gga tea aga gat tcc ttc age 335 零*裝--------訂-----*--- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 --- 101 一五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Trp Trp Asn Glu Lys Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Phe Ser 100 105 110 aaa gat etc aac get aca get tta gga ttt ege get etc ega ctg cat 383 Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His 115 120 125 ega tat aac gta teg tea ggt gtg ttg aag aat ttc aag gat gaa aac 431 Arg Tyr Asn Val Ser Ser GXy Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn 130 135 140 ggg aag ttc ttc tgc aac ttt act ggt gaa gaa gga aga gga gat aaa 479 Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys 145 150 155 caa gtg aga age atg ttg teg tta ett ega get tea gag att teg ttt 527 Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe 160 165 170 175 ccc gga gaa aaa gtg atg gaa gag gee aag gca ttc aca aga gaa tat 575 Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr 180 185 190 eta aac caa gtt tta get gga cac ggg gat gtg act gac gtg gat caa 623 Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin 195 200 205 age ett ttg gag aga ggt gaa gta ege att gga gtt tee atg get tgc 671 Ser Leu Leu Glu Arg Gly Glu Val Arg lie Gly Val Ser Met Ala Cys 210 215 220 agt gtg ccg aga tgg gag gca agg age ttt etc gaa ata tat gga cac 719 Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu lie Tyr Gly His 225 230 235 aac cat teg tgg etc aag teg aat ate aac caa aaa atg ttg aag tta 767 Asn His Ser Trp Leu Lys Ser Asn lie Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu 240 245 250 255 gee aaa ttg gac ttc aat att ctg caa tgc aaa cat cac aag gag ata 815 Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Lys His His Lys Glu lie 260 265 270 cag ttt att aca agg tgg tgg aga gac teg ggt ata teg cag ctg aat 863 Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp Arg Asp Ser Gly He Ser Gin Leu Asn 275 280 285 ttc tat ega aag ega cac gtg gaa tat tat tet tgg gtt gtt atg tgc 911 Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cys 290 295 300 att ttt gag cca gag ttc tet gaa agt aga att gee ttc gee aaa act 959 lie Phe Glu Pro Glu Phe Ser Glu Ser Arg lie Ala Phe Ala Lys Thr 305 310 315 get ate eta tgt act gtt eta gat gac etc tat gat aeg cac gca aeg 1007 Ala lie Leu Cys Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Ala Thr 320 325 330 335 ttg cat gaa ate aaa ate atg aca gag gga gtg aga ega tgg gat ett 1055 Leu His Glu lie Lys lie Met Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： 585918 A7B7 五 —' ΙΌ2發明說明（） 340 345 350 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 teg trtg aca gat gac etc cca gac tac att aaa att gca ttc cag ttc Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Tyr lie Lys lie Ala Phe Gin Phe 355 360 365 ttc ttc aat aca gtg aat gaa ttg ata gtt gaa ate gtg aaa egg caa Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu Leu He Val Glu lie Val Lys Arg Gin 370 375 380 ggg egg gat atg aca acc ata gtt aaa gat tgc tgg aag ega tac att Gly Arg Asp Met Thr Thr lie Val Lys Asp Cys Trp Lys Arg Tyr lie 385 390 395 gag tet tat ctg caa gaa geg gaa tgg ata gca act gga cat att ccc Glu Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His lie Pro 400 405 410 415 act ttt aac gaa tac ata aag aac ggc atg get age tea ggg atg tgt Thr Phe Asn Glu Tyr lie Lys Asn Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys 420 425 430 att gta aat ttg aat cca ett etc ttg ttg ggt aaa ett etc ccc gac lie Val Asn Leu Asn Pro Leu Leu Leu Leu Gly Lys Leu Leu Pro Asp 435 440 445 aac att ctg gag caa ata cat tet cca tcc aag ate ctg gac etc tta Asn lie Leu Glu Gin lie His Ser Pro Ser Lys lie Leu Asp Leu Leu 450 455 460 gaa ttg aeg ggc aga ate gcc gat gac tta aaa gat ttc gag gac gag Glu Leu Thr Gly Arg lie Ala Asp Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu 465 470 475 aag gaa ege ggg gag atg get tea tet tta cag tgt tat atg aaa gaa Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu 480 485 490 495 aat cct gaa tet aca gtg gaa aat get tta aat cac ata aaa ggc ate Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn Ala Leu Asn His lie Lys Gly lie 500 505 510 ett aat cgt tee ett gag gaa ttt aat tgg gag ttt atg aag cag gat Leu *Asn Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp 515 520 525 agt gtc cca atg tgt tgc aag aaa ttc act ttc aat ata ggt ega gga Ser Val Pro Met Cys Cys Lys Lys Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly 530 535 540 ett caa ttc ate tac aaa tac aga gac ggc tta tac att tet gac aag Leu Gin Phe lie Tyr Lys .Tyr Arg Asp Gly Leu Tyr lie Ser Asp Lys 545 550 555 gaa gta aag gac cag ata ttc aaa att eta gtc cac caa gtt cca atg Glu Val Lys Asp Gin lie Phe Lys lie Leu Val His Gin Val Pro Met 560 565 570 575 gag gaa tag tgatggtctt ggttgtagtt gtctattatg gtatattgea Glu Glu 1103 1151 1199 1247 12 95 1343 1391 1439 1487 1535 1583 1631 1679 1727 1776 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 i 度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7B7 103 五、發明說明（） -----------裝”—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ttgacattta tgcttaaagg tgtttcttaa acgtttaggg cggaccgtta aataagttgg 1836 qaataattaa tatttagaga ctttgtggaa gtgtttaggg cataaaattg cctatggcct 1896 atggcaagct acaaattgaa attgttgtgt ttataatatt tttattttat ttaaaaaaaa 1956 aaaaaaaaaa a 1967
<210> 18 <211> 577 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 18
Ser Glu Ser Ser lie Pro Arg Arg Thr Gly Asn His His Gly Asn Val 15 10 15
Trp Asp Asp Asp Leu He His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro 20 25 30
Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu lie Glu Glu lie Lys His Leu 35 40 45
Leu Leu Thr Glu Met Glu Met Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie Lys 50 55 60
Arg Leu Gin lie Val Asp Thr Leu Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His 65 70 75 80
Phe Glu His Glu He Gin Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Trp 85 90 95
Trp Asn Glu Lys Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Phe Ser Lys 100 105 110
Asp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg 115 120 125
Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn Gly 130 135 140
Lys Phe Phe Cys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys Gin 145 - 150 155 160
Val Arg Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe Pro 165 170 175
Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asn Gin Val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser 195 200 205
Leu Leu Glu Arg Gly Glu Val Arg lie Gly Val Ser Met Ala Cys Ser 210 215 220
Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu lie Tyr Gly His Asn 225 230 235 240
His Ser Trp Leu Lys Ser Asn lie Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 585918 A7B7 104 五、發明說明（ 245 250 255 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Lys His His Lys Glu lie Gin 260 265 270 Phe lie Thr Arg Trp Trp Arg Asp Ser Gly lie Sex Gin Leu Asn Phe 275 280 285 Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cys lie 290 295 300 Phe Glu Pro Glu Phe Ser Glu Ser Arg lie Ala Phe Ala Lys Thr Ala 305 310 315 320 lie Leu Cys Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Ala Thr Leu 325 330 335 His Glu lie Lys lie Met Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser 340 345 350 Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Tyr lie Lys lie Ala Phe Gin Phe Phe 355 360 365 Phe Asn Thr Val Asn Glu Leu lie Val Glu lie Val Lys Arg Gin Gly 370 375 380 Arg Asp Met Thr Thr lie Val Lys' Asp Cys Trp Lys Arg Tyr lie Glu 385 390 395 400 Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His lie Pro Thr 405 410 415 Phe Asn Glu Tyr lie Lys Asn Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys lie 420 425 430 Val Asn Leu Asn Pro Leu Leu Leu Leu Gly Lys Leu Leu Pro Asp Asn 435 440 445 lie Leu Glu Gin lie His Ser Pro Ser Lys lie Leu Asp Leu Leu Glu 450 455 460 Leu Thr Gly Arg He Ala Asp Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu Lys 465 470 475 480 Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn 485 490 495 Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn Ala Leu Asn His lie Lys Gly lie Leu 500 505 510 Asn Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser 515 520 525 Val Pro Met Cys Cys Lys Lys Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu 530 535 540 Gin Phe lie Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Leu Tyr lie Ser Asp Lys Glu 545 550 555 560 Val Lys Asp Gin He Phe Lys lie Leu Val His Gin Val Pro Met Glu 565 570 575 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） tor ----------to-l —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： 585918 A7B7 Γ〇5五、發明說明（）
Glu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 19 <211> 1416 <212> DNA <213> Abies grandis <220> <221〉 CDS <222> (3).. (1199) <223> ^fc^AG5.9 <4()0> 19 aa aaa gtg atg gaa gag gcg aag gca ttc aca aca aat tat eta aag 47 Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Tyr Leu Lys 15 10 15 aaa gtt tta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa age ett ttg 95 Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu Ser Leu Leu 20 25 30 gga gag gtg aag tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc agt gtg cag 143 Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Gin 35 40 45 aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttt gga caa att gat tea 191 Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin lie Asp Ser SO 55 60 gag ett aag teg aat ttg age aaa aaa atg tta gag ttg geg aaa ttg 239 Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu Ala Lys Leu 65 70 75 gac ttc aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg cag att ate 287 Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu Gin lie lie 80 85 90 95 tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tcc ctg aat ttc tat egg 335 Sot Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser Ιΐυ Aid Ser Leu Atm L，hu Tyi /Uij 100 105 110 aaa.tgt tac gtc gaa ttt tac ttt tgg atg get gca gcc ate tec gag 383 Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala lie Ser Glu 115 120 125 ccg gag ttt tet gga age aga gtt gcc ttc aca aaa att get ata ctg 431 Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie Ala lie Leu 130 135 140 atg aca atg eta gat gac ctg tac gat act cac gga acc ttg gac caa 479 Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr Leu Asp Gin 145 150 155 etc aaa ate ttt aca gag gga gtg aga ega tgg gat gtt teg ttg gta 527 Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val Ser Leu Val 160 165 170 175 gag ggc etc cca gac ttc atg aaa att gca ttc gag ttc tgg tta aag 575 Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe Trp Leu Lys 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 情 -----------裝—:[‘----訂-----.---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 B7 ^ Ϊ06 _五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 180 185 190 aca tct aat gaa ttg att get gaa get gtt aaa geg caa ggg caa gat 623 Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly Gin Asp 195 200 205 atg geg gee tac ata aga aaa aat gca tgg gag ega tac ett gaa get 671 Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr Leu Glu Ala 210 215 220 tat ctg caa gat geg gaa tgg ata gee act gga cat gtc ccc acc ttt 719 Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His Val Pro Thr Phe 225 230 235 gat gag tac ttg aat aat ggc aca cca aac act ggg atg tgt gta ttg 767 Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys Val Leu 240 245 250 255 aat ttg att ccg ett ctg tta atg ggt gaa cat tta cca ate gac att 8X5 Asn Leu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro lie Asp lie 260 265 270 ctg gag caa ata ttc ttg ccc tee agg ttc cac cat etc att gaa ttg 863 Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu lie Glu Leu 275 280 285 get tee agg etc gtc gat gac geg aga gat ttc cag geg gag aag gat 911 Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala Glu Lys Asp 290 295 300 cat ggg gat tta teg tgt att gag tgt tat tta aaa gat cat Get gag 959 His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp His Pro Glu 305 310 315 tct aca gta gaa gat get tta aat cat gtt aat ggc etc ett ggc aat 1007 Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu Leu Gly Asn 320 325 330 335 tgc ett ctg gaa atg aat tgg aag ttc tta aag aag cag gac agt gtg 1055 Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin Asp Ser Val 340 345 350 cca etc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttg gca ega age ate 1103 Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg Ser lie 355 360 365 caa ttc atg tac aat caa ggc gat ggc ttc tee att teg aac aaa gtg 1151 Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser Asn Lys Val 370 375 380 ate aag gat caa gtg cag aaa gtt ett att gtc ccc gtg cct att tga 1199 lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro lie 385 390 395 tagtagatac tagatagtag attagtaget attagtattt atttcatatc aatatttact 1259 aatgctgatg atggttaaag tccattcaga ccaatctttg gtttattgga cttaaataaa 1319 tgaattaatt agtttgtttt aaaattgtac tatttactgt tggaaataat gttttcatta 1379 ttgaaataac tagcacaact attttaqtgt qqttgat 1416 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） mr ----------_-裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 585918 A7B7 —-Ϊ07 "五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 20 <211> 398 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 20 Lys Val Met Glu Gla Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Tyr Leu Lys Lys 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu Ser Leu Leu Gly 20 25 30 Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Gin Arg 35 40 45 Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin He Asp Ser Glu 50 55 60 I.eu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp bb 70 75 80 Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu Gin lie lie Ser 85 90 95 Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn Phe Tyr Arg Lys 100 · 105 110 Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala lie Ser Glu Pro 115 120 125 Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie Ala lie Leu Met 130 135 140 Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr Leu Asp Gin Leu 145 150 155 160 Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val Ser Leu Val Glu 165 170 175 Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe Trp Leu Lys Thr 180 185 190 Ser Asn Glu Leu He Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly Gin Asp Met 195 200 205 Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr Leu Glu Ala Tyr 210 215 220 Leu Gin Asp Ala Glu Trp He Ala Thr Gly His Val Pro Thr Phe Asp 225 230 235 240 Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys Val Leu Asn 245 250 255 Leu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro lie Asp lie Leu 260 265 270 Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu lie Glu Leu Ala 275 280 285 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） TT7 -----------裝-—^----訂---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 Λ7 B? 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（10力)
Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala Glu Lys Asp His 290 295 300 Gly Asp Leu Ser Cys He Glu Cys Tyr Leu Lys Asp His Pro Glu Ser 305 310 315 320 Thr Va丄 Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu Leu Gly Asn Cys 325 330 335 Lea Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin Asp Ser Val Pro 340 345 350 Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg Ser He Gin 355 360 365 Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser Asn Lys Val lie 370 375 380 Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro lie 385 390 395· <210> 21 <211〉 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：簡併性募核苷酿PCR5丨子E 其中字母「η」表示乳JK酸殲基 <220> <221> misc—feature ' <222> (1).7(23) <223〉PCR引子E其中字母η表示肌酸 <400> 21 (jcjnfjaramrr tnatggarga rgc 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列说明：簡併性募核苷酸PCR弓丨子F 其中字母「η」表示肌联酸戌基 · <220> <221> misc—feature <222> (1).7(24) <223〉PCR引子F其中字母Π表示肌ft酸 <400> 22 garytncary tnhbnmgntg gtgg 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公簸）
11S --------0^.II (請先閲讀背面之洼意事項再填寫本頁)
、1T 585918 A7B7 109 五、發明說明（ <210> 23 <211> 21 <212> ONA <213〉人造序列· <220> <223> 人造序列說明：簡併性募核苷酸PCRi 其中字母「η」表示肌按酸残基 <220> <221> misc feature <222> (1).7(21) <223〉ρ(χ引子G其中字母η表示肌胺酸 <400> 23 ccarttnarn ccyttnacrt c <210> 24 <211> 533 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 24 ggggaaaaaa tgatggagga agctgaaatc ttctctacca aatatttaaa caaaagattc cggtctccag tctttcgcga gagatcgggg acgttttgga cacacatatt tgccgcgatt ggaagcaagg aattacatcc aagtctttgg gagaacacga agtcatatgt gaagagcaaa aaacttttag aactcgcaaa aacatctttc aatccttact cgcatatccg cattgcaacc cattctgaca cctttcctga tcatatcctc aaggaagttg acttcccatc aaagcttaac gtgccatcct tcgattacga ggtgatacgc ggtgctacaa ggcggacagg aagaagcttc ctctatatca tgttatatga aagacaatcc tggagtatca ctctcgatca tatcaacgcc atgatcagtg acgaagtcaa aggcttcaat 21 agaagccctg 60 atatggttgg 120 acaggacact 180 attggagttc 240 atggacatcc 300 gacttggcat 360 gctcgtggag 420 gaggaagatg 480 tgg 533 -----------裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 25 <211> 8 <212〉 PRT <213>人造序列 <220> <223〉人造序列说明：引子D所植基之保留胺基瞹序列，其中於位置編號3的Xaa表示Ihr或lie， 於位|编號4的Xaa表示lie或Tyr或Phe，於位置编號6的Xaa表示Ala或Val，及於位置編號8 的 Xaa$*Ala 成 Gly
<220> <221> SITE 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -rtr 585918 A7 B7 110 —五、發明說明（） <222> (1)..(8) <223〉引子D序列所植基之保留胲基酸序列 <400> 25 Asp Asp Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Xaa 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213〉人造序列 人造序列說明：引子E所植基之保留胺基绫序列，其中於位置編號3的Xaa表示Lys 或Thr，於位置编就4的Xaa表示Val或lie »於位置編故〇四&8表示(Jlu或Asp <220> <221> SITE <222> (1)..(8) <223〉引子e序列所搲基之保留脒基酸序列 <400> 26 Gly Glu Xaa Xaa Met Xaa Glu Ala 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213>人造序列 <220> .人造序列說明：引子F所植基之保留按基at序列，其中於位置编號2的Xaa表示Phr或Tyr， 或Asp，於位置鎢號3的Xaa表示lie或Leu，於位置编號4的Xaa表示Thr或Leu或Ar« <220> <221> SITE <222> (1) . . (7) <223>引子F序列所搲基之保留按基酸序列 <400> 2Ί Gin Xaa Xaa Xaa Arg Trp Trp 1 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
W 0. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 28 <211〉 8 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉人遶序列說明：引子g所植基之保留胺基龜序列， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ΤΓ5 585918 A7B7 111 五、發明說明（ 其中於位置編號6的Xaa^示Phe或Leu <22 0> <221> SITE<222> (1)..(8) <223》引子G序列所楂基之保留胺基酸序列 <400> 28 Asp Val lie Lys Gly Xaa Asn Trp 1 5 <210> 29 <211> 20 <212> Dm <213〉人造序列 <220〉 <223〉人造序列說明：T3引子募核苷酿序列 <400> 29 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列說明：T7募核苷酸引子序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 30 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <2X0> 31 <211> 2205 <212〉 DNA <213> Abies grandis <220> <221> CDS <222> (57).. (1943) <223〉纯株AG3.48 <400> 31 gttatettga gcttcctcca tataggccaa cacatatcat atcaaaggga gcaaga atg 59 Met 1 get ctg gtt tet ate tea ccg ttg get teg aaa tet tgc ctg ege aag Ala Leu Val Ser lie Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu Arg Lys 5 10 15 107 teg ttg ate agt tea att cat gaa cat aag cct ccc tat aga aca ate 155 Ser Leu He Ser Ser He His Glu His Lys Pro Pro Tyr Arg Thr He 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨11丨丨— ! — · I丨!訂·-------Awi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 B7 Π2 一五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 25 30 cca aat ctt gga atg cgt agg cga ggg aaa tct gtc acg cct tcc atg 203 Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr Pro Ser Met 35 40 45 age ate agt ttg gcc acc get gca cct gat gat ggt gta caa aga ege 251 Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp Gly Val Gin Arg Arg 50 55 60 65 ata ggt gac tac cat tec aat ate tgg gac gat gat ttc ata cag tct 299 He Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe lie Gin Ser 70 75 80 eta tea acg cat tat ggg gaa ccc tct tac cag gaa cgt get gag aga 347 Leu Ser Thr His Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg Ala Glu Arg 85 90 95 tta att gtg gag gta aag aag ata ttc aat tea atg tac ctg gat gat 395 Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr Leu Asp Asp 100 105 110 gga aga tta atg agt tcc ttt aat gat etc atg caa ege ctt tgg ata 443 Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg Leu Trp He 115 120 125 gtc gat age gtt gaa cgt ttg ggg ata get aga cat ttc aag aac gag 491 Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe Lys Asn Glu 130 135 140 145 ata aca tea get ctg gat tat gtt ttc cgt tac tgg gag gaa aac ggc 539 Tie Thr Ser: Ala Leu Asp Tyr Val Phe 八jig Tyr Trp GUi Asn Gly 150 155 160 att gga tgt ggg aga gac agt att gtt act gat etc aac tea act geg 587 He Gly Cys Gly Arg Asp Ser He Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr Ala 165 170 175 ttg ggg ttt cga act ctt cga tta cac ggg tac act gta tct cca gag 635 Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser Pro Glu 180 185 190 gtt tta aaa get ttt caa gat caa aat gga cag ttt gta tgc tcc ccc 683 Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val Cys Ser Pro 195 200 205 ggt cag aca gag ggt gag ate aga age gtt ctt aac tta tat egg get 731 Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 210 215 220 225 tcc etc att gcc ttc cct ggt gag aaa gtt atg gaa gaa get gaa ate 779 Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie 230 235 240 ttc tcc aca aga tat ttg aaa gaa get eta caa aag att cca gtc tcc 827 Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys He Pro Val Ser 245 250 255 get ctt tea caa gag ata aag ttt gtt atg gaa tat ggc tgg cac aca 875 Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly Trp His Thr 260 265 270 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼•裝---ΙΨ « — — — — — I — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 117 : 585918 A7 B7 113 五、發明說明（） aat ttg cca aga ttg Asn Leu Pro Arg Leu 275 gaa Glu gac ace agt gca tgg Asp Thr Ser Ala Trp 290 ett gca aaa ttg gag Leu Ala Lys Leu Glu 310 etc Leu 295 ttc Phe tta caa tat ett ttg Leu Gin Tyr Leu Leu 325 aga Arg aca ttt get egg cat Thr Phe Ala Arg His 340 cgt Arg att gee att gac cca lie Ala lie Asp Pro 355 aaa Lys atg tgt cat ett gtc Met Cys His Leu Val 370 aca Thr 375 aeg att gac gag ett Thr He Asp Glu Leu 390 gaa Glu tea tea gag ata gaa Ser Ser Glu He Glu 405 cac His gtc gtg ttt gaa act Val Val Phe Glu Thr 420 gta Val caa ggg aga aac act Gin Gly Arg Asn Thr •435 etc Leu ttt gat tea tat atg Phe Asp Ser Tyr Met 450 cca aeg ttt qaa gag Pro Thr Phe Glu Glu 470 gaa Glu 455 tac Tyr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ege gta gca aca ttg Arg Val Ala Thr Leu 485 gat tac ate ttg aag Asp Tyr lie Leu Lys 500 caa Gin gga Gly gca aga aat tac ata gac aca ett gag aaa Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr Leu Glu Lys 280 285 aat aaa aat get ggg aag aag ett tta gaa Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys Leu Leu Glu 300 305 aat ata ttt aac tee tta caa caa aag gaa Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin Gin Lys Glu 315 320 tgg tgg aaa gag teg gat ttg cct aaa ttg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu Pro Lys Leu 330 335 cat gtg gaa ttc tac act ttg gee tet tgt His Val Glu Phe Tyr Thr Leu Ala Ser Cys 345 350 cat tet gca ttc aga eta ggc ttc gee aaa His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe Ala Lys 360 365 gtt ttg gac gat att tac gac act ttt gga Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe Gly 380 385 etc ttc aca tet gca att aag aga tgg aat Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys Arg Trp Asn 395 400 ett cca gaa tat atg aaa tgt gtg tac atg Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys Val Tyr Met 410 415 aat gaa ctg aca ega gag geg gag aag act Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala Glu Lys Thr 425 430 aac tat gtt ega aag get tgg gag get tat Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp Glu Ala Tyr 440 445 gaa gca aaa tgg ate tet aat ggt tat ctg Glu Ala Lys Trp lie Ser Asn Gly Tyr Leu 460 465 cat gag aat ggg aaa gtg age tet gca tat His Glu Asn Gly Lys Val Ser Ser Ala Tyr 475 480 ccc ate etc act ttg aat gca tgg ett cct Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala Trp Leu Pro 490 495 att gat ttt cca tee agg ttc aat gat ttg lie Asp Phe Pro Ser Arg Phe Asn Asp Leu 505 5X0 923 971 1019 1067 1115 1163 1211 1259 1307 1355 1403 1451 1499 1547 1595 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---------訂---------φ. ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
—1 IS 585918 A7B7 114 i、發明說明（） gca teg tec ttc ctt egg eta ega ggt gac aca ege tgc tac aag gcc 164 3
Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys Ala 515 520 525 gat agg gat cgt ggt gaa gaa get teg tgt ata tea tgt tat atg aaa 1691
Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys Tyr Met Lys 530 535 540 545 gac aat cct gga tea acc gaa gaa gat gcc etc aat cat ate aat gcc 1739
Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His He Asn Ala 550 555 560 atg gtc aat gac ata ate aaa gaa tta aat tgg gaa ctt eta aga tcc 1787
Met Val Asn Asp He He Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg Ser 565 570 575 aac gac aat att cca atg ctg gcc aag aaa cat get ttt gac ata aca 1835
Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr 580 585 590 aga get etc cac cat etc tac ata tat ega gat ggc ttt agt gtt gcc 1883
Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe Ser Val Ala 595 600 605 aac aag gaa aca aaa aaa ttg gtt atg gaa aca etc ctt gaa tet atg 1931
Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu Glu Ser Met 610 615 620 625 ctt ttt taa eta taaccatatc cataataata agctcataat getaaattat 1983
Leu Phe tggccttatg acatagttta tgtatgtact tgtgtgaatt caatcatatc gtgtgggtat 2043 gattaaaaag ctagagctta ctaggttagt aacatggtga taaaagttat aaaatgtgag 2103 ttatagagat acccatgttg aataatgaat tacaaaaaga gaaatttatg tagaataaga 2163 ttggaagctt ttcaattgtt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2205
<210> 32 <211> 627 <212> PRT <213> Abies grandis -----------裝----^----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 32 Met Ala Leu Val Ser lie Ser X 5 Lys Ser Leu lie Ser Ser lie 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 lie Pro Asn Leu Gly Met Arg 35
Met Ser lie Ser Leu Ala Thr 50 55 Arg lie Gly Asp Tyr His Ser 65 70
Pro His Arg 40 Ala Asn
Leu Glu 25 Arg Ala lie
Ala Ser Lys Ser Cys 10 His Lys Pro Pro Tyr 30 Gly Lys Ser Val Thr 45 Pro Asp Asp Gly Val 60
Trp Asp Asp Asp Phe 75
Leu 15 Arg Pro Gin lie
Arg Thr Ser Arg Gin 80 $1^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585918 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 115 五、發明說明（）
Ser Leu Ser Thr His Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg Ala GIu 85 90 95
Arg Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr Leu Asp 100 105 110
Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg Leu Trp 115 120 125 lie Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe Lys Asn 130 135 140 .Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu Glu Asn 145 150 155 160
Giy lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser He Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175
Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser Pro 180 185 190
Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val Cys Ser 195 200 205
Pro Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg 210 215 220
Ala Ser Leu He Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu 225 230 235 240
He Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro Val 245 250 255
Ser Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly Trp His 260 265 270
Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr Leu Glu 275 280 285
Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys Leu Leu 290 295 300
Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Sep Leu Gin Gin Lys 305- 310 315 320
Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu Pro Lys 325 330 335
Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu Ala Ser 340 345 350
Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe Ala 355 360 365
Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe 370 375 380
Gly Thr lie Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys Arg Trp 385 390 395 400
Asn Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys Val Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------^|^-裝----V----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 B7 116 五、發明說明（ 405 410 415
Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala Glu Lys 420 425 430 9» Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp Glu Ala 435 440 445 Tyr Phe Asp Ser Tyr Met Glu Glu Ala Lys Trp lie Ser Asn Gly Tyr 450 455 460 Leu Pro Thr Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser Ser Ala 465 470 475 480 Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala Trp Leu 485 490 495 Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly He Asp Phe Pro Ser Arg Phe Asn Asp 500 505 510 Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys 515 520 525 Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys He Ser Cys Tyr Met 530 535 540 Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His He Asn 545 550 555 560 Ala Met Val Asn Asp He lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg 565 570 575 Ser Asn Asp Asn He Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe Asp lie * 580 585 590 Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr He Tyr Arg Asp Gly Phe Ser Val 595 600 605 Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu Glu Ser 610 615 Met Leu Phe 625 620 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
ibvil 一：0，s Mi I -I I
<210> 33 <211> 24 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核苷酸引子2.2 BamHI 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 33 caaagggatc cagaatggct ctgg
<210> 34 <2X1> 30 <212〉 DNA 度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） Ύ2Τ 24 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 — TT7 五、發明說明（） <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核苷酸引子2.2 Notl <400> 34 agtaagcggc cgctttttaa tcatacccac 30 <210> 35 <211〉 21 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核苷酸引子3.18 EcoRI <40〇> 35 ctgcaggaat tcggcacgag c <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核苷酸引子3.18 Smal <400> 36 catagccccg ggcatagatt tgagctg 27 <2X0> 37 <211> 30 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核苷酿引子10 Ndel <400> 37 ggcaggaaca tatggctctc ctttctatcg 3〇 <210〉 38 <211> 30 · <212> DNA <213〉人造序列 <220>
<223〉人造序列說明：PCR募核苷鷇引子10 BamHI <400> 38 tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag 3〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------^_wi — V----訂-------.— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -122 - 585918
7 7 A B 8 五、發明說明（ <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR幕核苷酸引子JB29 <400> 39 ctaccattcc aatatctg <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：PCR募核苷酸引子2-8 <400> 40 gttggatctt agaagttccc ο 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 列 loNAf 4 2 D人 >>>> 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < <220〉 <223〉人造序列說明：PCR募核苷酸引子3-9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 41 tttccattcc aacctctggg <210> 42 <211〉 20 <212> DNA <21.3>人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR寨核苷酸引子3-11 <400> 42 cgtaatggaa agctctggcg <210〉 43 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：PCR募核瞀酸子7-1 ο 2 ο 2 ---%| I I 丨訂·---I---I · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 B7 ~ ΓΪ9 五、發明說明（） <_> 43 ccttacacgc ctttggatgg <210> 44 <211> 20 <212> DNA <2U>人造序列 <220> <223>人造序列說明：PCR幕核苷酸引子7-3 <400> 44 tctgttgatc caggatggtc <210> 45 <211〉 5 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉人造序列說明：全部戊間二烯基轉移摩共通之保留胺基酸序列 其中於位置3和4之Xaa表示任何胺基酸 <400> 45
Asp Asp Xaa Xaa Asp 1 5 <210> 46 <211〉 8 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：由此可合成寨核苷釀引子之胺基酸序列其臃交至本發明 之單«合成峰其中於位置4之Xaa表示Leu或lie或Val <400> 46
His Ser Asn Xaa Trp Asp Asp Asp 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：由此可组成簡併性寡核苷酸之胺基时列其鍊交至本發明之單萜合成峰 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------Aw- —Ψ----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 124_- 585918 A7B7 120五、發明說明（） <400> 47 Ala Leu Asp Tyr Val Tyr 1 5 <210> 48 <211〉 7 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：由此可组成簡併性募核苔酸之胺基酸序列其雜交至本發明 之單萜合成酶 <400> 48 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe 1 5 <210> 49 <211〉 6 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：由此可组成簡併性募核苗陵之联基字列其雜交至本發明 之單萜合成酶纯株 <400> 49 Arg Trp Trp Lys Glu Ser 1 5 <210> 50 <2X1> 7 <212> PRT 人造序列 <220> <223〉人造序列說明：由此可艇成簡併性寨核苷酸之联基峡序列其雜交至本發明 之單格合成誨纯株，其中於位置1的Xaa表示Val或lie或Leu — — — — — — — — — — i^^w- I —---^ 11111---(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 50 Xaa Leu Asp Asp Met Tyr Asp 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213〉人造序列 <220> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 125 585918 A7B7 五、發明說明 121() <之23>人造序列說明：由此可組成簡併性募核苷酸之胺基酸序列其雜交至本發明 之單tt合成酶纯株，其中於位置1的Xaa表示Val成lie或Leu <400> 51 Xaa Leu Asp Asp Leu Tyr Asp <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：由此可组成簡併性募核苷鷇之胺基竣序列其雜交至 之單褡合成誨純株，其中於位置1的Xaa表示Val或lie或Leu 本發明 <400> 52 Xaa Leu Asp Asp He Tyr Asp <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉人造序列說明：由此可組成簡併性募核誓ft之胺基It字列其雜交至本發明 之單箱合成酶纯株，其中於位置6的Xaa^示Asn成His ν40ϋ> 53 Cys Tyr Met Lys Asp Xaa Pro 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列說明 對應於肽序列UerMetMet之範例募核苷酸 -----------裝”—,----訂---------(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 54 atgatgatg <21〇> 55 <211> 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） T26 585918 A7 _B7 Ϊ22五、發明說明（） <212> DNA <213〉人造序列 _ <220> <223〉人造序列說明：對應於肽序列MetMetMet之範例募核苷酸 <400> do tactaetac <210> 56 <211> 9 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人糾列說明ϊ對應於肽序列MetMetMet之範例募核苷酸，η為肌按酸 <400> 56 nacnacnac <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：對應於序列識別编號：46所述胺基酿序列之募核苷酸 <220> <221> misc一feature <222> (1).7(24) <223〉對應於序列識別编別：46所述保留肢基齩序列之募核苷醚 <400> 57 gtcjtcgttgg agaccctgct gctg <210> 58 <211> 18 . <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉人造序列說明：對應於序列識別编號：47所述肢基竣序列之募核苷酸 -----------AW- ---If----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(18) <223〉對應於序列識別編別：47所述保留按基酸序列之募核苷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ΤΣΤ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585918 A7 _B7 Ϊ23 五、發明說明（） <400> 58 cgggagctga tgcagatg <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列說明：對應於序列識別编犹：48所舰基料列之糾苷酸 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(21) <223>對應於序列戡別编號：48所述保留胺基酸序列之募核苷酸 <400> 59 ctcgagcggt tcgagctcaa g <210> 60 <211> 18 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：對應於序列識別编號：49所述胺基綾序列之寨核苷酸 <220> <221> misc一feature <222> (1).7(18) <223>對應於序列識別编號：49所述保留按基竣序列之募核苷酸 <400> 60 gccaccacct tcctctcg <210> 61 <211〉 21 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：對應於序列譏別編號：50所述按基酿序列之募核苷酸 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(21) <223〉對應於序列識別編號：50所述保留胺基酸序列之募核苷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------L·^----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A7 _B7 Ϊ24 五、發明說明（） <400> 61 gaggagctgc tgtaGatgct g 21 <210> 62 <211〉 21 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉人造序列說明；對應於序列識號編號;：51所述保留胺基發:序列之募槔苷敌 <22 0> <221> misc—feature <222> (1).7(21) <223〉對應於序列锇號編號：51所述保留胺棊酸序列之募核苷酸 <400> 62 gaggagctgc tggagatget g 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -—訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -ΓΖ9 : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

  1. 585918
    Dfi 六、申請專利乾圍 第871 1 1249號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正日期：92年11月 1. 一種經分離之核苷酸序列，其係編碼大冷杉 以)桂葉烯合成酶，其係選自於由下列所構成之群 組中： (i) 一包含有序列識別編號：1之核苷酸序列之核苔酸 序列： 序列識別編號：1 tgccggcacg aggttatctt gagcttcctc catataggcc aacacatatc atatcaaagg 60 gagcaaga atg get ctg gtt tet ate tea ccg ttg get teg aaa tet tgc 110 Met Ala Leu Val Ser lie Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys 1 5 10 . r --裝·---- (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智砮財產局員工消货合作；： ctg ege aag teg ttg ate agt tea att cat gaa cat aag cct ccc tat Leu Arg Lys Ser Leu lie Ser Ser lie His Glu His Lys Pro Pro Tyr 15 20 25 30 aga aca ate cca aat ett gga atg cgt agg ega ggg aaa tet gtc aeg Axg Thr lie Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr 35 40 45 cct tee atg age ate agt ttg gee acc get gca cct gat gat ggt gta Pro Ser Met Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp Gly Val 50 55 60 caa aga ege ata ggt gac tac cat tee aat ate tgg gac gat gat ttc Gin Arg Arg lie Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe 65 70 75 ata cag tet eta tea aeg cct tat ggg gaa ccc tet tac cag gaa cgt lie Gin Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg 80 85 90 get gag aga tta att gtg gag gta aag aag ata ttc aat tea atg tac Ala Glu Arg Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr 95 100 105 110 158 206 254 302 350 398 585918 AS B8 C8 D8 、申請專利範圍 ctg gat gat gga aga tta atg agt tcc ttt aat gat etc atg caa ege 446 Leu Asp Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg 115 120 125 ett tgg ata gtc gat age gtt gaa cgt ttg ggg ata get aga cat ttc 494 Leu Trp lie Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe 130 135 140 aag aac gag ata aca tea get ctg gat tat gtt ttc cgt tac tgg gag 542 Lys Asn Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu 145 150 155 gaa aac ggc att gga tgt ggg aga gac agt att gtt act gat etc aac 590 Glu Asn Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser lie Val Thr Asp Leu Asn 160 165 170 tea act geg ttg ggg ttt ega act ett ega tta cac ggg tac act gta 638 Ser Thr Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val 175 180 185 190 tet cca gag gtt tta aaa get ttt caa gat caa aat gga cag ttt gta 686 Ser Pro Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val 195 200 205 tgc tec ccc ggt cag aca gag ggt gag ate aga age gtt ett aac tta 734 Cys Ser Pro Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu 210 215 220 tat egg get tec etc att gee ttc cct ggt gag aaa gtt atg gaa gaa 782 Tyr Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu 225 230 235 get gaa ate ttc tec aca aga tat ttg aaa gaa get eta caa aag att 830 Ala Glu lie Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie 240 245 250 cca gtc tec get ett tea caa gag ata aag ttt gtt atg gaa tat ggc 878 Pro Val Ser Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly 255 260 265 270 tgg cac aca aat ttg cca aga ttg gaa gca aga aat tac ata gac aca 926 Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr 275 280 285 ett gag aaa gac acc agt gca tgg etc aat aaa aat get ggg aag aag 974 經濟部智慧叼產局員t乍土 p Leu Glu Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys 2lM) 29ii) :川 U ett tta gaa ett gca aaa ttg gag ttc aat ata ttt aac tec tta caa 1022 Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin 305 310 315 caa aag gaa tta caa tat ett ttg aga tgg tgg aaa gag teg gat ttg 1070 Gin Lys Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu 320 325 330 cct aaa ttg aca ttt get egg cat cgt cat gtg gaa ttc tac act ttg 1118 Pro Lys Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu 335 340 345 350 gee tet tgt att gee att gac cca aaa cat tet gca ttc aga eta ggc 1166 585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 Ala Ser Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly 355 360 365 ttc gee aaa atg tgt cat ett gtc aca gtt ttg gac gat att tac gac Phe Ala Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp 370 375 380 act ttt gga aeg att gac gag ett gaa etc ttc aca tet gca att aag Thr Phe Gly Thr lie Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys 385 390 395 1214 1262 t n as a A 9 po 9 r o t T 4 a 9 9 r a A tea tea gag ata gaa cac ett cca gaa tat atg aaa tgt Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys 405 410 1310 gtg tac atg gtc gtg ttt gaa act gta aat gaa ctg aca ega gag geg Val Tyr Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala 415 420 425 430 gag aag act caa ggg aga aac act etc aac tat gtt ega aag get tgg Glu Lys Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp 435 440 445 1358 1406 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 厂裝 gag get tat ttt gat tea tat atg Glu Ala Tyr Phe Asp Ser Tyr Met 450 t n as a A t r c e t s c e o t 1 6 a I 4 9 p 9 r tT as ay a L a a cl 9 A a u 3 1 9G a u 5 a 1 5 9 G 4 1454 ggt tat ctg cca atg ttt gaa gag tac cat gag aat ggg aaa gtg age Gly Tyr Leu Pro Met Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser 465 470 475 tet gca tat ege gta gca aca ttg caa ccc ate etc act ttg aat gca Ser Ala Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala 480 485 490 tgg ett cct gat tac ate ttg aag gga att gat ttt cca tee agg ttc Trp Leu Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly lie Asp Phe Pro Ser Arg Phe 495 500 505 510 aat gat ttg gca teg tee ttc ett egg eta ega ggt gac aca ege tgc Asn Asp Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys 515 520 525 1502 1550 1598 164 6 --------訂
    djcj tjcc cjal dyg yat cgt gyt cjaa yaa get teg t'yL aid tea tyt Lys Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys 530 535 540 tat atg aaa gac aat cct gga tea acc gaa gaa gat gee etc aat cat Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His 545 550 555 ate aat gee atg gtc aat gac ata ate aaa gaa tta aat tgg gaa ett lie Asn Ala Met Val Asn Asp lie lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu 560 565 570 eta aga tee aac gac aat att cca atg ctg gee aag aaa cat get ttt Leu Arg Ser Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe 575 580 585 590 gac ata aca aga get etc cac cat etc tac ata tat ega gat ggc ttt Asp lie Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe 17 42 1790 1838 1886
    585918 AE B8 C8 D8 六、申請專利範圍 595 600 605 1982 agt gtt gcc aac aag gaa aca aaa aaa ttg gtt atg gaa aca etc ett 1934 Ser Val Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu 610 615 620 gaa tet atg ett ttt taa ctataaccat atccataata ataagctcat Glu Ser Met Leu Phe 625 aatgctaaat tattggeett atgacatagt ttatgtatgt acttgtgtga attcaatcat 2042 atcgtgtggg tatgattaaa aagetagage ttactaggtt agtaacatgg tgataaaagt 2102 tataaaatgt gagttataga gatacccatg ttgaataatg aattacaaaa agagaaattt 2162 atgtagaata agattggaag cttttcaatt gttt 2196 (ii) 一完全互補於序列識別編號：1之核苷酸序列；以 及 (iii) 一核苷酸序列，其基於遺傳密碼簡併性而不同於⑴ 及（ii)之核苷酸序列，且編碼序列識別編號：2之胺基 酸序列： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 Met Ala Leu Val Ser lie Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu Arg 1 5 10 15 Lys Ser Leu lie Ser Ser lie His Glu His Lys Pro Pro Tyr Arq Thr 20 25 30 lie Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr Pro Ser 35 40 45 Met Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp Gly Val Gin Arcj 50 55 60 Arg lie Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe lie Gin 65 70 7 5 80 Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg Ala Glu 85 90 95 Arg Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr Leu Asp 100 105 110 Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg Leu Trp 115 120 125 Tle Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe Lys Asn 130 135 140 Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu Glu Asn 145 150 155 160 Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser lie Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser Pro 180 185 190 (請先閱绿背面之注意事項再填寫本頁) 厂裝--------訂· 585918 經濟部智慧財產局員工消踅合作Η^ρκ A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val Cys Ser 195 200 205 Pro Gly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyi.Ai._cj 210 215 220 Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu 225 230 235 2 <10 lie Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro Val 245 250 255 Ser Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly Trp His 260 265 270 Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr Leu Glu 275 280 285 Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys Leu Leu 290 295 300 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin Gin Lys 305 310 315 320 Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu Pro Lys 325 330 335 Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu Ala Ser 340 345 350 Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe Ala 355 360 365 Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe 370 375 380 Gly Thr lie Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys Arg Trp 390 3915 /100 Asn Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys Val Tyr 405 410 415 Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala Glu Lys 420 425 430 Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp Glu Ala 435 440 445 Tyr Phe Asp Ser Tyr Met Glu Glu Ala Lys Trp lie Ser Asn Gly Tyr 450 455 460 Leu Pro Met Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser Ser Ala 465 470 475 480 Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala Trp Leu 485 490 495 Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly lie Asp Phe Pro Ser Arg Phe Asn Asp 500 505 510 Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys (請先閲讀背面之;i意事項再填寫本頁)
    585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 515 520 525 Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys Tyr Met 530 535 540 Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn 545 550 555 560 Ala Met Val Asn Asp lie lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg 565 570 575 Ser Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe Asp lie 580 585 590 Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe Ser Val 595 600 605 Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu Glu Ser 610 615 620 Met Leu Phe 625 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2. —種經分離之核苷酸序列’其係編碼大冷杉 grawi/以）松稀合成酶，其係選自於由下列所構成之群組 中·· (i) 一包含有序列識別編號：3之核苷酸序列之核苷酸 序列： cagca atg get eta gtt tet acc gca ccg ttg get tee aaa tea tgc ctg 50 Met Ala Leu Val Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu 1 5 10 15 cac aaa teg ttg ate agt tet acc cat gag ett aaq get etc tet aqa 98 Π i .*» l»y：J Am lwu ] iu Sci: Tiu li i 3 G.I u Ijuij l.yu ΛI «j huu /、，q 20 25 30 aca att cca get eta gga atg agt agg ega ggg aaa tet ate act cct 146 Thr lie Pro Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Gly Lys Ser lie Thr Pro 35 40 45 tee ate age atg age tet acc acc gtt gta acc gat gat ggt gta ega 194 Ser lie Ser Met Ser Ser Thr Thr Val Val Thr Asp Asp Gly Val Arg 50 55 60 aga ege atg ggc gat ttc cat tee aac etc tgg gac gat gat gtc ata 242 Arg Arg Met Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Val lie 65 70 75 cag tet tta cca aeg get tat gag gaa aaa teg tac ctg gag cgt get 290 Gin Ser Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Arg Ala 80 85 90 95 gag aaa ctg ate ggg gaa gta aag aac atg ttc aat teg atg tea tta 338 Glu Lys Leu lie Gly Glu Val Lys Asn Met Phe Asn Ser Met Ser Leu (請先M讀背面之;i杳V事項再填寫本頁) 厂裝--------訂i 趣- 經濟部智慧財產局員工;^&4^-:--Lpy
    585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利对圍 100 105 110 gaa gat gga gag tta atg agt ccg etc aat gat etc att caa ege ett 386 Glu Asp Gly Glu Leu Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu lie Gin Arg Leu 115 120 125 tgg att gtc gac age ett gaa cgt ttg ggg ate cat aga cat ttc aaa 434 Trp lie Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly lie His Arg His Phe Lys 130 135 140 gat gag ata aaa teg geg ett gat tat gtt tac agt tat tgg ggc gaa 482 Asp Glu lie Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Glu 145 150 155 aat ggc ate gga tgc ggg agg gag agt gtt gtt act gat ctg aac tea 53(Ί Asn Gly lie Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn Ser 160 165 170 175 act geg ttg ggg ett ega acc eta ega eta cac gga tac ccg gtg tet 578 Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Pro Val Ser 180 185 190 tea gat gtt ttc aaa get ttc aaa ggc caa aat ggg cag ttt tee tgc 626 Ser Asp Val Phe Lys Ala Phe Lys Gly Gin Asn Gly Gin Phe Ser Cys 195 200 205 tet gaa aat att cag aca gat gaa gag ate aga ggc gtt ctg aat tta 674 Ser Glu Asn lie Gin Thr Asp Glu Glu lie Arg Gly Val Leu Asn Leu 210 215 220 ttc egg gee tee etc att gee ttt cca ggg gag aaa att atg gat gag 722 Phe Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys lie Met Asp Glu 225 230 235 get gaa ate ttc tet acc aaa tat tta aaa gaa gee ctg caa aag att 770 Ala Glu lie Phe Ser Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie 240 245 250 255 ccg gtc tee agt ett teg ega gag ate ggg gac gtt ttg gaa tat ggt 818 Pro Va.l Ser Ser Leu Ser Arg Glu lie Gly Asp Va.l Leu Glu Tyr Gly 2G0 2Ή) tgg cac aca tat ttg ccg ega ttg gaa gca agg aat tac ate caa gtc 866 Trp His Tht Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr Tie Gin Val 27b 280 285 ttt gga cag gac act gag aac aeg aag tea tat gtg aag age aaa aaa 914 Phe Gly Gin Asp Thr Glu Asn Thr Lys Ser Tyr Val Lys Ser Lys Lys 290 295 300 ett tta gaa etc gca aaa ttg gag ttc aac ate ttt caa tee tta caa 962 Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Gin Ser Leu Gin 305 310 315 aag agg gag tta gaa agt ctg gtc aga tgg tgg aaa gaa teg ggt ttt 1010 Lys Arg Glu Leu Glu Ser Leu Val Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Phe 320 325 330 335 cct gag atg acc ttc tgc ega cat cgt cac gtg gaa tac tac act ttg 1058 Pro Glu Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu 340 ' 345 350 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 厂裝--------訂 -讀- 經濟部智慧財產局員工消賢会咋'4_卞9
    585918 AS B8 C8 D8 ^、申請專利範圍 經¾邹智慧^i.QP員x_肖腎乂πΐ4·ρ々 get tee tgc at t geg ttc gag cct caa cat tet gga ttc aga etc ggc 1106 Ala Ser Cys lie Ala Phe Glu Pro Gin His Ser Gly Phe Arg Leu Gly 355 360 365 ttt gee aag aeg tgt cat ett ate aeg gtt ett gac gat atg tac gac 1154 Phe Ala Lys Thr Cys His Leu lie Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp 37 0 375 380 acc ttc ggc aca gta gac gag ctg gaa etc ttc aca geg aca atg aag 1202 Thr Phe Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Thr Met Lys 385 390 395 aga tgg gat ccg tee teg ata gat tgc ett cca gaa tat atg aaa gga 1250 Arg Trp Asp Pro Ser Ser lie Asp Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly 400 405 410 415 gtg tac ata geg gtt tac gac acc gta aat gaa atg get ega gag gca 1298 Val Tyr lie Ala Val Tyr Asp Thr Val Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala 420 425 430 gag gag get caa ggc ega gat aeg etc aca tat get egg gaa get tgg 1346 Glu Glu Ala Gin Gly Arg Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Arg Glu Ala Trp 435 440 445 yay gel t:at att gat teg tat atg caa gaa gca agej tyg ate gee act Glu Ala Tyr lie Asp Ser Tyr Met Gin Glu Ala Arg Trp lie Ala Thr 450 455 460 ggt tac ctg ccc tee ttt gat gag tac tac gag aat ggg aaa gtt age 1442 Gly Tyr Leu Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser 465 4 70 4 75 tejt ggt cat ege ata tee gca ttg caa ccc att ctg aca atq cjac a t:(.: 14 90 Cys Gly His Ary i丄e Ser Ala Leu Gin Pro He Leu Thi MeL As μ 丄丄e 480 485 490 495 ccc ttt cct gat cat ate etc aag gaa gtt gac ttc cca tea aag ett 1538 Pro Phe Pro Asp His He Leu Lys Glu Val Asp Phe Pro Ser Lys Leu 500 505 510 aac gac ttg gca tgt gee ate ett ega tta ega ggt gat aeg egg tgc 1586 Asn Asp Leu Ala Cys Ala He Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys 515 520 525 t：ac aag ejeg gac agg get cgt gga gaa gaa get tee tet ata tea tgt 1634 Tyr Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ser lie Ser Cys 530 535 540 tat atg aaa gac aat cct gga gta tea gag gaa gat get etc gat cat 1682 Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Val Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asp His 545 550 555 at: c: aac gee atg ate agt gac gta ate aaa gga tta aat tgg gaa ett 17 30 lie Asn Ala Met lie Ser Asp Val lie Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu 560 565 57 0 575 etc aaa cca gac ate aat gtt ccc ate teg geg aag aaa cat get ttt 17 7 8 Leu Lys Pro Asp He Asn Val Pro lie Ser Ala Lys Lys His Ala Phe 580 585 590 -10-
    585918 8 888 ABCD 1922 t、申請專利範圍 gac ate gee aga get ttc cat tac gQC tac aaa tac ega gac ggc tac 1 ΰ2b Asp lie Ala Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr 595 600 605 age gtt gee aac gtt gaa aeg aag agt ttg gtc aeg aga acc etc ett 1874 Ser Val Ala Asn Val Glu Thr Lys Ser Leu Val Thr Arg Thr Leu Leu 610 615 620 gaa tet gtg cct ttg tag caacagctca aatetatgee etatgetatg Glu Ser Val Pro Leu 625 tcgggttaaa atatatgtgg aaggtagccg ttggatgtag aggataagtt tgttataatt 1982 taataaagtt gtaatttaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2018 (丨丨）一完全互補於序列識別編號·· 3之核苷酸序列；以 及 (Ml)—核苷酸序列，其基於遺傳密碼簡併性而不同於⑴ 及（"）之核I酸序列’且編碼序列識別編號：4之胺基 酸序列： -11 - (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁)
    585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Met Ala Leu Val Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu His 15 10 15 Lys Ser Leu lie Ser Ser Thr His Glu Leu Lys Ala Leu Ser Arg Thr 20 25 30 lie Pro Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Gly Lys Ser lie Thr Pro Ser 35 40 45 lie Ser Met Ser Ser Thr Thr Val Val Thr Asp Asp Gly Val Arg Arg 50 55 60 Arg Met Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Val lie Gin 65 7 0 75 80 Ser Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Arcj Ala Glu 85 90 95 Lys Leu lie Gly Glu Val Lys Asn Met Phe Asn Ser Met Ser Leu Glu 100 105 110 Asp Gly Glu Leu Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu lie Gin Arg Leu Trp 115 120 125 lie Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly lie His Arg His Phe Lys Asp 130 135 140 Glu lie Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Glu Asn 145 150 155 160 Gly lie Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Pro Val Ser Ser 180 185 190 Asp Val Phe Lys Ala Phe Lys Gly Gin Asn Gly Gin Phe Ser Cys Ser 195 200 205 • JI ----- (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部智慧时¾¾員I-肖ft A^lpj/ -12-
    585918 ABCD 六、申請專利範圍 Glu Asn lie Gin Thr Asp Glu Glu lie Arg Gly Val Leu Asn Leu Phe 210 215 220 Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys lie Met Asp Glu Ala ----------Mm—»M----- (請先M讀背面之注音V事項再填寫本頁) 2 2r) 2：30 235 v/i〇 Glu Tie Phe Ser Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro 245 250 W) Val Ser Ser Leu Ser Arg Glu lie Gly Asp Val Leu Glu Tyr Gly Trp 260 265 270 His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Gin Val Phe 275 280 285 Gly Gin Asp Thr Glu Asn Thr Lys Ser Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu 290 295 300 Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Gin Ser Leu Gin Lys 305 310 315 320 Arg Glu Leu Glu Ser Leu Val Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Phe Pro 325 330 335 Glu Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu Ala 340 345 350 Ser Cys He Ala Phe Glu Pro Gin His Ser Gly Phe Arg Leu Gly Phe 355 360 365 AI j Lyd Tlii. Cyts Hi a Leu Qe Tlu Vd丄 八外）八叫> Mol Tyt Λϋμ Thi 370 375 380 f- Phe Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Thr Met Lys Arg 385 390 395 400 Trp Asp Pro Ser Ser lie Asp Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val 405 410 415 Tyr lie Ala Val Tyr Asp Thr Val Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala Glu 420 425 430 Glu Ala Gin Gly Arg Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Arg Glu Ala Trp Glu 435 440 445 Ala Tyr lie Asp Ser Tyr Met Gin Glu Ala Arg Trp lie Ala Thr Gly 450 455 460 Tyr Leu Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser Cys 465 470 475 480 Gly His Arg lie Ser Ala Leu Gin Pro lie Leu Thr Met Asp lie Pro 485 490 495 Phe Pro Asp His lie Leu Lys Glu Val Asp Phe Pro Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Asp Leu Ala Cys Ala lie Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr 515 520 525 i：^! 'i·· i.vi I：v； ·.：：· ：；·· 585918 ABCD 六、申請專利範圍 Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ser lie Ser Cys Tyr 530 535 540 Met Lys Asp Asn Pro Gly Val Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asp His lie 545 550 555 560 Asn Ala Met lie Ser Asp Val lie Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu Leu 565 570 hlb Lys Pro A^p lie Asn Val Pro lie Ser Ala Lys Lys Hi^ Ala Fhe Asp 580 585 590 lie Ala Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Ser 595 600 605 Val Ala Asn Val Glu Thr Lys Ser Leu Val Thr Arg Thr Leu Leu Glu 610 615 620 Ser Val Pro Leu 625 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁)
    -14 - 585918 經濟部智慧时¾¾員X- 肖ί&Γ 乍土卩3 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3. —種經分離之核苷酸序列’其係編碼大冷杉（/以以 以)檸檬烯合成酶，其係選自於由下列所構成之群 組中： (i) 一包含有序列識別編號·· 5之核苷酸序列之核苔酸 序列： tgccgtttaa tcggtttaaa gaagctacca tagttcggtt taaagaagct accat*acjttt; 60 aggcaggaat cc atg get etc ett tet ate gta tet ttg cag gtt ccc aaa 111 Met Ala Leu Leu Ser lie Val Ser Leu Gin Val Pro Lys 1 . 5 10 tee tgc gcjg ctg aaa teg ttg ate agt tee age aat cjtcj cay aag get 1^9 Ser Cys Gly Leu Lys Ser Leu lie Ser Ser Ser Asn Val Gin Lys Ala 15 20 25 etc tgt ate tet aca gca gtc cca aca etc aga atg cgt agg ega cag 201 Leu Cys lie Ser Thr Ala Val Pro Thr Leu Arg Met Arg Arg Arg Gin 30 35 40 45 aaa get ctg gtc ate aac atg aaa ttg acc act gta tee cat cgt gat 255 Lys Ala Leu Val lie Asn Met Lys Leu Thr Thr Val Ser His Arg Asp 50 55 60 gat aat ggt ggt ggt gta ctg caa aga ege ata gee gat cat cat ccc 303 Asp Asn Gly Gly Gly Val Leu Gin Arg Arg lie Ala Asp His His Pro 65 70 75 aac ctg tgg gaa gat gat ttc ata caa tea ttg tee tea cct tat ggg 351 Asn Leu Trp Glu Asp Asp Phe lie Gin Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly 80 85 90 gga tet teg tac agt gaa cgt get gag aca gtc gtt gag gaa gta aaa 399 Gly Ser Ser Tyr Ser Glu Arg Ala Glu Thr Val Val Glu Glu Val Lys -15 -
    585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 95 100 105 gag atg ttc aat tea ata cca aat aat aga gaa tta ttt ggt tee caa 447 Glu Met Phe Asn Ser lie Pro Asn Asn Arg Glu Leu Phe Gly Ser Gin 110 115 120 125 aat gat etc ett aca ege ett tgg atg gtg gat age att gaa cgt ct:(j A 9!; Asn Asp Leu Leu Thr Arg Leu Trp Met Val Asp Ser lie Glu Arg Leu 130 135 140 ggg ata gat aga cat ttc caa aat gag ata aga gta gee etc gat tat 543 Gly lie Asp Arg His Phe Gin Asn Glu lie Arg Val Ala Leu Asp Tyr 145 · 150 155 gtt tac agt tat tgg aag gaa aag gaa ggc att ggg tgt ggc aga gat 591 Val Tyr Ser Tyr Trp Lys Glu Lys Glu Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp 160 165 170 tet act ttt cct gat etc aac teg act gee ttg geg ett ega act ett 639 Ser Thr Phe Pro Asp Leu Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Arg Thr Leu 175 180 185 (.：ija ctg cac gga tac aat gtg tet tea gat gtg ctg gaa !：ac ttc aaa bϋ 1 Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Ser Asp Val Leu Glu Tyr Phe Lys 190 195 200 205 gat gaa aag ggg cat ttt gee tgc cct gca ate eta acc gag gga cag 735 Asp Glu Lys Gly His Phe Ala Cys Pro Ala lie Leu Thr Glu Gly Gin 210 215 220 ate act aga agt gtt eta aat tta tat egg get tee ctg gtc gee ttt 783 He Thr Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Val Ala Phe 225 230 235 ccc ggg gag aaa gtt atg gaa gag get gaa ate ttc teg gca tet tat 831 Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie Phe Ser Ala Ser Tyr 240 245 250 ttg aaa aaa gtc tta caa aag att ccg gtc tee aat ett tea gga gag 879 Leu Lys Lys Val Leu Gin Lys lie Pro Val Ser Asn Leu Ser Gly Glu 255 260 265 ata gaa tat gtt ttg gaa tat ggt tgg cac aeg aat ttg ccg aga ttg 927 lie'Glu Tyr Val Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Leu 270 275 280 285 gaa gca aga aat tat ate gag gtc tac gag cag age ggc tat gaa age 975 Glu Ala Arg Asn Tyr lie Glu Val Tyr Glu Gin Ser Gly Tyr Glu Ser 290 295 300 tta aac gag atg cca tat atg aac atg aag aag ett tta caa ett gca 1023 Leu Asn Glu Met Pro Tyr Met Asn Met Lys Lys Leu Leu Gin Leu Ala 305 310 315 aaa ttg gag ttc aat ate ttt cac tet ttg caa eta aga gag tta caa 1071 Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe His Ser Leu Gin Leu Arg Glu Leu Gin 320 325 330 tet ate tee aga tgg tgg aaa gaa tea ggt teg tet caa ctg act ttt 1119 Ser lie Ser Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gin Leu Thr Phe 335 340 345 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
    -16- I 585918 A8 B8 C8 D8 1215 t s 9 y t c 91 o t a 8 9 V 3 as ay a L cl t a 9 V t e t h t p 9 u al 9G 9 t 5 t e 7 a M 3 六、申請專利範圍 aca egg cat cgt cac gtg gaa tac tac act atg gca tet tgc att tet 1167 Thr Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Met Ala Ser Cys lie Ser 350 355 360 365 atg ttg cca aaa cat tea get ttc aga Met Leu Pro Lys His Ser Ala Phe Arg 370 cat ett gta aca gtt etc gat gat ata tat gac act ttt gga aca atg 1263 His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe Gly Thr Met 385 390 395 aac gaa etc caa ett ttt aeg gat gca att aag aga tgg gat ttg tea 1311 Asn Glu Leu Gin Leu Phe Thr Asp Ala lie Lys Arg Trp Asp Leu Ser 400 405 410 aeg aca agg tgg ett cca gaa tat atg aaa gga gtg tac atg gac ttg 1359 Thr Thr Arg Trp Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val Tyr Met Asp Leu 415 420 425 tat caa tgc att aat gaa atg gtg gaa gag get gag aag act caa ggc 1407 Tyr Gin Cys lie Asn Glu Met Val Glu Glu Ala Glu Lys Thr Gin Gly 430 435 440 445 ega gat atg etc aac tat att caa aat get tgg gaa gee eta ttt gat 1455 Arg Asp Met Leu Asn Tyr lie Gin Asn Ala Trp Glu Ala Leu Phe Asp 450 455 460 acc ttt atg caa gaa gca aag tgg ate tee age agt tat etc cca aeg 1503 Thr Phe Met Gin Glu Ala Lys Trp lie Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Thr 465 470 475 ttt gag gag tac ttg aag aat gca aaa gtt agt tet ggt tet ege ata 1551 Phe Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ala Lys Val Ser Ser Gly Ser Arg lie 480 485 490 gee aca tta caa ccc att etc act ttg gat gta cca ett cct gat tac 1599 Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asp Val Pro Leu Pro Asp Tyr 495 500 505 ata ctg caa gaa att gat tat cca tee aga ttc aat gag tta get teg 1647 lie Leu Gin Glu lie Asp Tyr Pro Ser Arg Phe Asn Glu Leu Ala Ser 510· 515 520 525 tee ate ett ega eta ega ggt gac aeg ege tgc tac aag geg gat agg 1695 Ser lie Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys Ala Asp Arg 530 535 540 gee cgt gga gaa gaa get tea get ata teg tgt tat atg aaa gac cat 1743 ΛId Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ala lie Ser Cys Tyr Met Lys Asp His 545 550 555 cct gga tea ata gag gaa gat get etc aat cat ate aac gee atg ate 1791 Pro Gly Ser lie Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn Ala Met lie 560 565 570 agt gat gca ate aga gaa tta aat tgg gag ett etc aga ccg gat age 1839 Ser Asp Ala lie Arg Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Ser 575 580 585 17 ---- (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
    585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 aaa agt ccc ate tet tee aag aaa cat get ttt gac ate acc aga get 1887 Lys Ser Pro lie Ser Ser Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr Arg Ala 590 595 600 605 ttc cat cat gtc tac aaa tat ega gat ggt tac act gtt tee aac aac 1935 Phe His His Val Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn 610 615 620 qaa aca aag aat ttg gtg atg aaa acc gtt ett gaa cct etc get ttg 1983 01 u Tin l.yj /\:sn Leu Val Met Lyis Thr Val Luu Glii Γι.() Ujii /\Ui l,uu b25 630 635 taa aaacatatag aatgcattaa aatgtgggaa gtetataate tagactattc 203(j tetatetttc ataatgtaga tctggatgtg tattgaactc taaaaaaaaa aaa 2089 (ii) 一完全互補於序列識別編號：5之核苷酸序列；以 及(iii) 一核苷酸序列，其基於遺傳密碼簡併性而不同於⑴ 及（ii)之核苔酸序列’且編碼序列識別編號：6之胺基 酸序列： (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨_ —裝---- -線 -18 - 585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Met Ala Leu Leu Ser lie Val Ser Leu Gin Val Pro Lys Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Lys Ser Leu lie Ser Ser Ser Asn Val Gin Lys Ala Leu Cys lie 20 25 30 Ser Thr Ala Val Pro Thr Leu Arg Met Arg Arg Arg Gin Lys Ala Leu 35 40 45 Val lie Asn Met Lys Leu Thr Thr Val Ser His Arg Asp Asp Asn Gly 50 55 60 Gly Gly Val Leu Gin Arg Arg lie Ala Asp His His Pro Asn Leu Trp 65 Ί0 75 80 Glu Asp Asp Phe lie Gin Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr.Ser Glu Arg Ala Glu Thr Val Val Glu Glu Val Lys Glu Met Phe 100 105 110 Asn Ser lie Pro Asn Asn Arg Glu Leu Phe Gly Ser Gin Asn Asp Leu 115 120 125 Leu Thr Arg Leu Trp Met Val Asp Ser lie Glu Arg Leu Gly lie Asp 130 135 140 Arg His Phe Gin Asn Glu lie Arg Val Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser 145 150 155 160 Tyr Trp Lys Glu Lys Glu Gly He Gly Cys Gly Arg Asp Ser Thr Phe 165 170 175 Pro Asp Leu Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Leu His 180 185 190 Gly Tyr Asn Val Ser Ser Asp Val Leu Glu Tyr Phe Lys Asp Glu Lys -19-
    585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 195 200 205 Gly His Phe Ala Cys Pro Ala lie Leu Thr Glu Gly Gin lie Thr Arg 210 215 220 Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Val Ala Phe Pro Gly Glu 225 230 235 2^10 Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Lys Lys 245 250 255 Va l Luu (JI π l,y.*j l le Pro Vd 1 b’ui As" l.uu i· I y (; I ιι I I（； hi Ty r 260 265 270 Val Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg 275 280 285 Asn Tyr lie Glu Val Tyr Glu Gin Ser Gly Tyr Glu Ser Leu Asn Glu 290 295 300 Met Pro Tyr Met Asn Met Lys Lys Leu Leu Gin Leu Ala Lys Leu Glu 305 310 315 320 Phe Asn lie Phe His Ser Leu Gin Leu Arg Glu Leu Gin Ser lie Ser 325 * 330 335 Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gin Leu Thr Phe Thr Arg His 340 345 350 Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Met Ala Ser Cys lie Ser Met Leu Pro 355 360 365 Lys His Ser Ala Phe Arg Met Glu Phe Val Lys Val Cys His Leu Val 370 375 380 Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe Gly Thr Met Asn Glu Leu 385 390 395 _ Gin Leu Phe Thr Asp Ala lie Lys Arg Trp Asp Leu Ser Thr Thr Arg 405 410 415 Trp Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val Tyr Met Asp Leu Tyr Gin Cys 420 425 430 lie Asn Glu Met Val Glu Glu Ala Glu Lys Thr Gin Gly Arg Asp Met 435 440 445 Asn Tyr lie Gin Asn Ala Trp Glu Ala Leu Phe Asp Thr Phe Met 450 455 460 Gin Glu Ala Lys Trp lie Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Glu 465 470 475 480 'l'yi. Leu Lya Aijn Ala Lys Val Ser Ser Gly Ser Arg 1；丄e AJLa T)ir Leu 485 490 495 G]ii Pro lie Leu Tiir Leu Asp Val Pro Leu Pro Asp Tyi lie L^u G；丄ii 500 505 510 Glu lie Asp Tyr Pro Ser Arg Phe Asn Glu Leu Ala Ser Ser lie Leu 515 520 525 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ -裝--------訂 經濟部智慧財產局員工沾f合作
    585918 A8 B8 C8 D8 o r p r e s s o y 9 L 5 六、申請專利範圍 Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly 530 535 540 Glu Glu Ala Ser Ala lie Ser Cys Tyr Met Lys Asp His Pro Gly Ser 545 550 555 560 lie Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn Ala Met lie Ser Asp Ala 565 570 575 He Arg Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Ser 580 585 lie Ser Ser Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr Arg Ala Phe His His 595 600 605 Val Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn Glu Thr Lys 610 615 620 Asn Leu Val Met Lys Thr Val Leu Glu Pro Leu Ala Leu 625 630 635 e------- (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) •線· -21 _ 585918 A8 E8 C8 D8 9 5 r 6 A X、申請專利範圍 4.如申請專利範圍第1項之經分離之核苷酸序列’其編石馬 序列識別編號：2之胺基酸序列： Met Ala Leu Val Ser lie Ser Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu Arg 15 10 15 Lys Ser Leu lie Ser Ser lie His Glu His Lys Pro Pro Tyr Arg Thr 20 25 30 lie Pro Asn Leu Gly Met Arg Arg Arg Gly Lys Ser Val Thr Pro Ser 35 40 45 Met Ser lie Ser Leu Ala Thr Ala Ala Pro Asp Asp Gly Val Gin Arcj 50 55 60 lie Gly Asp Tyr His Ser Asn lie Trp Asp Asp Asp Phe lie Gin 70 75 80 Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Gin Glu Arg Ala Glu 85 90 95 Arg Leu lie Val Glu Val Lys Lys lie Phe Asn Ser Met Tyr Leu Asp 100 105 110 Asp Gly Arg Leu Met Ser Ser Phe Asn Asp Leu Met Gin Arg Leu Trp 115 120 125 TJ e Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly lie Ala Arg His Phe Lys Asn 130 135 140 Glu lie Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Val Phe Arg Tyr Trp Glu Glu Asn 145 150 155 160 Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser lie Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser Pro 180 185 190 ---------—裝·-- (請先M讀背面之;i意事項再填寫本頁) 七 -22- 585918 AS B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Glu Val Leu Lys Ala Phe Gin Asp Gin Asn Gly Gin Phe Val Cys Ser 195 200 205 ^《----- (請先閱讀背面之;i意事項再填寫本頁) Pro G.ly Gin Thr Glu Gly Glu lie Arg Ser Val Leu Asn Leu Tyi· Atcj 210 215 220 Ala Ser Leu He Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu 225 230 235 240 He Phe Ser Thr Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys He Pro Val 245 250 255 Ser Ala Leu Ser Gin Glu lie Lys Phe Val Met Glu Tyr Gly Trp His 260 265 270 Thr Asn Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Asp Thr Leu Glu 21b 280 285 Lys Asp Thr Ser Ala Trp Leu Asn Lys Asn Ala Gly Lys Lys Leu Leu 290 295 300 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Asn Ser Leu Gin Gin Lys 305 310 315 320 Glu Leu Gin Tyr Leu Leu Arg Trp Trp Lys Glu Ser Asp Leu Pro Lys 325 330 335 Leu Thr Phe Ala Arg His Arg His Val Glu Phe Tyr Thr Leu Ala Ser 340 345 350 Cys lie Ala lie Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe Ala 355 360 365 Lys Met Cys His Leu Val Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe 370 375 380 Gly Thr lie Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala lie Lys Arg Trp 38r) 390 395 400 Asn Ser Ser Glu lie Glu His Leu Pro Glu Tyr Met Lys Cys Val Tyr 405 410 415 Met Val Val Phe Glu Thr Val Asn Glu Leu Thr Arg Glu Ala Glu Lys 420 425 430 Thr Gin Gly Arg Asn Thr Leu Asn Tyr Val Arg Lys Ala Trp Glu Ala 435 440 445 Tyr Phe Asp Ser Tyr Met Glu Glu Ala Lys Trp lie Ser Asn Gly Tyr 450 455 460 Leu Pro Met Phe Glu Glu Tyr His Glu Asn Gly Lys Val Ser Ser Ala 465 470 475 480 Tyr Arg Val Ala Thr Leu Gin Pro lie Leu Thr Leu Asn Ala Trp Leu 485 490 495 Pro Asp Tyr lie Leu Lys Gly lie Asp Phe Pro Ser Arg Phe Asn Asp 500 505 510 Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys
    585918 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 515 520 525 Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys lie Ser Cys Tyr Met 530 535 540 Lys Asp Asn Pro Gly Ser Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn 545 550 555 560 Ala Met Val Asn Asp lie lie Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg 565 570 575 Ser Asn Asp Asn lie Pro Met Leu Ala Lys Lys His Ala Phe Asp lie 580 585 590 Thr Arg Ala Leu His His Leu Tyr lie Tyr Arg Asp Gly Phe Ser Val 595 600 605 Ala Asn Lys Glu Thr Lys Lys Leu Val Met Glu Thr Leu Leu Glu Ser 610 615 620 Met Leu Phe 625 丨裝------ (請先M讀背面之注急事項再填寫本頁) •1^* -24- 585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 5.如申請專利範圍第2項之經分離之核苷酸序列’其編碼 序列識別編號：4之胺基酸序列： Met Ala Leu Val Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Cys Leu His 15 10 15 Lys Ser Leu lie Ser Ser Thr His Glu Leu Lys Ala Leu Ser Arg Thr 20 25 30 lie Pro Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Gly Lys Ser lie Thr Pro Ser 35 40 45 lie Ser Met Ser Ser Thr Thr Val Val Thr Asp Asp Gly Val Arg Arg 50 55 60 Arg Met Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Val lie Gin 65 70 75 80 Ser Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Arg Ala Glu 85 90 9¾ Lys Leu lie Gly Glu Val Lys Asn Met Phe Asn Ser Met Ser Leu Glu 100 105 110 Asp Gly Glu Leu Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu lie Gin Arg Leu Trp 115 120 125 lie Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly lie His Arg His Phe Lys Asp 130 135 140 Glu lie Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Glu Asn 145 150 155 160 Gly lie Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Pro Val Ser Ser 180 185 190 Asp Val Phe Lys Ala Phe Lys Gly Gin Asn Gly Gin Phe Ser Cys Ser 195 200 205 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨*裝 • n n n n n · .線 -25- 585918 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 Glu Asn lie Gin Thr Asp Glu Glu lie Arg Gly Val Leu Asn Leu Phe 210 215 220 Arg Ala Ser Leu lie Ala Phe Pro Gly Glu Lys lie Met Asp Glu Ala 奶 2：30 2 3¾ Glu Tie Phe Ser Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gin Lys lie Pro 245 250 W) Val Ser Ser Leu Ser Arg Glu lie Gly Asp Val Leu Glu Tyr Gly Trp 260 265 270 His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr lie Gin Val Phe 275 280 285 Gly Gin Asp Thr Glu Asn Thr Lys Ser Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu 290 295 300 Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn lie Phe Gin Ser Leu Gin Lys 305 310 315 320 Arg Glu Leu Glu Ser Leu Val Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Phe Pro 325 330 335 Glu Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu Ala 340 345 350 Ser Cys lie Ala Phe Glu Pro Gin His Ser Gly Phe Arg Leu Gly Phe 355 360 365 Aid Lys Tlii. L’yu Hi s Leu Till； Vd.l· L匕'u 八外）八叫）Mul 'l，yt Λυμ Thr 370 375 380 Phe Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Thr Met Lys Arg 385 390 395 Trp Asp Pro Ser Ser lie Asp Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val 405 410 415 Tyr lie Ala Val Tyr Asp Thr Val Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala Glu 420 425 430 Glu Ala Gin Gly Arg Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Arg Glu Ala Trp Glu 435 440 445 Ala Tyr lie Asp Ser Tyr Met Gin Glu Ala Arg Trp lie Ala Thr Gly 450 455 460 Tyr Leu Pro Ser Phe Asp Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser Cys 465 470 475 480 Gly His Arg lie Ser Ala Leu Gin Pro lie Leu Thr Met Asp lie Pro 485 490 495 Phe Pro Asp His lie Leu Lys Glu Val Asp Phe Pro Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Asp Leu Ala Cys Ala lie Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr 515 520 525 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 厂*裝 585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ser lie Ser Cys Tyr 530 535 540 Met Lys Asp Asn Pro Gly Val Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asp His lie 545 550 555 560 Asn Ala Met lie Ser Asp Val lie Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu Leu 565 57 0 57[) Lys Fro Asp lie Asn Val Pro lie Ser Ala Lys Lys Hi^ Ala Phe Asp 580 585 590 lie Ala Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Ser 595 600 605 Val Ala Asn Val Glu Thr Lys Ser Leu Val Thr Arg Thr Leu Leu Glu 610 615 620 Ser Val Pro Leu 625 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -27- 585918 A8 B8 C8 D8 s i H 9 5 Γ 4 A·1 、申請專利範圍 6.如申請專利範圍第3項之經分離之核苷酸序列，其編碼 序列識別編號：6之胺基酸序列： Met Ala Leu Leu Ser lie Val Ser Leu Gin Val Pro Lys Ser Cys Gly 15 10 15 Leu Lys Ser Leu lie Ser Ser Ser Asn Val Gin Lys Ala Leu Cys lie 20 25 30 Ser Thr Ala Val Pro Thr Leu Arg Met Arg Arg Arg Gin Lys Ala Leu 35 40 45 Val lie At;n Met Lys Leu Thr Thr Val Ser His Arg Asp Asp Asn Gly 50 55 60 Gly Gly Val Leu Gin Arg Arg lie Ala Asp His His Pro Asn Leu Trp 65 70 7 5 80 Glu Asp Asp Phe lie Gin Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Ser Glu Arg Ala Glu Thr Val Val Glu Glu Val Lys Glu Met Phe 100 105 110 Asn Ser lie Pro Asn Asn Arg Glu Leu Phe Gly Ser Gin Asn Asp Leu 115 120 125 Leu Thr Arg Leu Trp Met Val Asp Ser lie Glu Arg Leu Gly lie Asp 130 135 140 Phe Gin Asn Glu lie Arg Val Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser 150 155 160 Tyr Trp Lys Glu Lys Glu Gly lie Gly Cys Gly Arg Asp Ser Thr Phe 165 170 175 Pro Asp Leu Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Leu His 180 185 190 Gly Tyr Asn Val Ser Ser Asp Val Leu Glu Tyr Phe Lys Asp Glu Lys (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) !裝--------訂. •線 -28- 585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 200 Gly His Phe Ala Cys Pro Ala lie Leu Thr Glu Gly 210 215 220 205 Gin lie Thr Arg 195 Ser Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Val Ala Phe Pro Gly Glu 22¾ 230 235 ：M0 Lys Val Met Glu Glu Ala Glu lie Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Lys Lys 245 250 255 V,j I l.uu (J! η Ι,γ.·ΰ I I e Pro Veil 八U川 Jvji. (·:; I y 260 265 Val Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn Leu Pro Arg 275 280 Asn Tyr lie Glu Val Tyr Glu Gin Ser Gly Tyr Glu 290 295 300 (;丨 u I I u 270 (；lu Tyi Ala Arg Ser Leu Asn Glu Leu Glu 285 Met Pro Tyr Met Asn Met Lys Lys Leu Leu Gin Leu Ala Lys Leu Glu 305 310 315 320 Phe Asn lie Phe His Ser Leu Gin Leu Arg Glu Leu Gin Ser lie Ser 325 * 330 335 Arg Trp Trp Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gin Leu Thr Phe Thr Arg His 340 345 350 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) f!裝--------訂. Leu Pro Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Met Ala Ser Cys lie Ser Met 355 360 365 Lys His Ser Ala Phe Arg Met Glu Phe Val Lys Val Cys His Leu Val 370 375 380 Thr Val Leu Asp Asp lie Tyr Asp Thr Phe Gly Thr Met Asn Glu Leu 385 390 395 400 Gin Leu Phe Thr Asp Ala lie Lys Arg Trp Asp Leu Ser Thr Thr Arg 405 410 415 Trp Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Val Tyr Met Asp Leu Tyr Gin Cys 420 425 430 lie Asn Glu Met Val Glu Glu Ala Glu Lys Thr Gin Gly Arg Asp Met 435 440 445 I,eu Asn Tyr lie Gin Asn Ala Trp Glu Ala Leu Phe Asp Thr Phe Met 450 455 460 Gin Glu Ala Lys Trp lie Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Glu 465 470 475 480 'I'hr Leu 495 Leu G.Lri lie Leu Tyt Leu )Jys Αϋη Ala Lys Val Ser Ser Gly Ser Arg 485 490 G]" Pro He Leu Thr Leu Asp Val Pro Leu Pro Asp Tyr lie 500 505 510 Glu lie Asp Tyr Pro Ser Arg Phe Asn Glu Leu Ala Ser Ser 515 520 525 585918 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys Tyr Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly 530 535 540 Glu Glu Ala Ser Ala lie Ser Cys Tyr Met Lys Asp His Pro Gly Ser 545 550 555 560 lie Glu Glu Asp Ala Leu Asn His lie Asn Ala Met lie Ser Asp Ala 565 570 575 lie Arg Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Ser Lys Ser Pro 580 585 590 lie Ser Ser Lys Lys His Ala Phe Asp lie Thr Arg Ala Phe His His 595 600 605 Val Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Ser Asn Asn Glu Thr Lys 610 615 620 Asn Leu Val Met Lys Thr Val Leu Glu Pro Leu Ala Leu 625 630 635 ----------^.— (請先Mtt背面之注意事項再填寫本頁)
    •30
TW87111249A 1997-07-11 1998-09-16 Isolated grand fir (Abies grandis) monoterpene synthase protein, replicable expression vectors and host cells comprising nucleotide sequences of said monoterpene synthases, method of enhancing the production of a gymnosperm monoterpene synthase TW585918B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5224997P 1997-07-11 1997-07-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW585918B true TW585918B (en) 2004-05-01

Family

ID=21976364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW87111249A TW585918B (en) 1997-07-11 1998-09-16 Isolated grand fir (Abies grandis) monoterpene synthase protein, replicable expression vectors and host cells comprising nucleotide sequences of said monoterpene synthases, method of enhancing the production of a gymnosperm monoterpene synthase

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1032257A4 (zh)
AU (1) AU8483998A (zh)
CA (1) CA2296664A1 (zh)
TW (1) TW585918B (zh)
WO (1) WO1999002030A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265639B1 (en) * 1998-01-22 2001-07-24 Washington State University Foundation Gymnosperm nucleic acid molecules encoding sesquiterpene synthases and methods of use
AR022383A1 (es) 1998-09-18 2002-09-04 Univ Kentucky Res Found Sintasas
EP1220899A4 (en) * 1999-07-26 2005-03-16 Univ Washington SYNTHETASES OF MONOTERPENE PRODUCED FROM GRANDISSIME FIR (ABIES GRANDIS)
US6818424B2 (en) * 2000-09-01 2004-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of cyclic terpenoids
US9550815B2 (en) 2012-01-23 2017-01-24 University Of British Columbia ABC terpenoid transporters and methods of using the same
US9534227B2 (en) * 2012-05-11 2017-01-03 Donald Danforth Plant Science Center Methods for high yield production of terpenes
US11085046B2 (en) 2015-10-29 2021-08-10 Amyris, Inc. Compositions and methods for production of myrcene
EP3878138B1 (en) * 2018-11-08 2024-05-01 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Dimensioning network services (ns)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4948811A (en) * 1988-01-26 1990-08-14 The Procter & Gamble Company Salad/cooking oil balanced for health benefits
CA2118071C (en) * 1993-10-28 2004-09-14 Rodney B. Croteau Dna encoding limonene synthase from mentha spicata

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999002030A1 (en) 1999-01-21
EP1032257A1 (en) 2000-09-06
CA2296664A1 (en) 1999-01-21
EP1032257A4 (en) 2005-03-16
AU8483998A (en) 1999-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW591108B (en) Mutated hydroxyphenylpyuvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
AU763068B2 (en) Nucleic acids encoding (taxus) geranylgeranyl diphosphate synthase, and methods of use
KR101878899B1 (ko) 테르펜 생합성의 강화를 위한 1-데옥시-d-크실룰로스 5-포스페이트 신타아제 대립유전자
AU741393B2 (en) Geranyl diphosphate synthase from mint (mentha piperita)
AU741619B2 (en) Monoterpene synthases from common sage (salvia officinalis)
US11827915B2 (en) Method for production of novel diterpene scaffolds
US20150059018A1 (en) Methods and compositions for producing drimenol
AU747075B2 (en) Sesquiterpene synthases from grand fir abies grandis, and methods of use
TW585918B (en) Isolated grand fir (Abies grandis) monoterpene synthase protein, replicable expression vectors and host cells comprising nucleotide sequences of said monoterpene synthases, method of enhancing the production of a gymnosperm monoterpene synthase
US6429014B1 (en) Monoterpene synthases from grand fir (Abies grandis)
AU747746B2 (en) Isolation and expression of farnesene synthase from peppermint, mentha x piperita, L.
AU1092201A (en) Geranyl diphosphate synthase large subunit, and methods of use
JP2007517496A (ja) 柑橘類セスキテルペンシンターゼ、その生成方法、及び使用方法
US20140249301A1 (en) Methods for enabling farnesene accumulation in plants and related compositions
AU6238200A (en) Monoterpene synthases from grand fir (abies grandis)
TW201004559A (en) Gene, protein and method for improving aroma production in plants
Class et al. Patent application title: METHODS FOR ENABLING FARNESENE ACCUMULATION IN PLANTS AND RELATED COMPOSITIONS Inventors: John C. Steffens (Chapel Hill, NC, US) Assignees: Chromatin, Inc.
NZ521984A (en) Enzyme and polynucleotides encoding the sesquiterpene synthase, alpha-farnesene synthase