TW527185B - In vivo stain composition, process of manufacture, and methods of use to identify dysplastic tissue - Google Patents

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Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 kl B7 五、發明説明（1 ) 本發明關於新穎的生物染色組合物，其可用在人類活體 局部施用。 尤其是本發明籌劃新穎的甲苯胺藍Ο (“TBO”）染色組合 物，該產物以不同比例含有甲苯胺藍0及特定的甲苯胺藍〇 衍生物。 根據其他方面，本發明關於製造甲苯胺藍0組合物的新 方法，包括這些新穎的甲苯胺藍0產物。 在尚另一方面，本發明關係在體内使用此類新穎的甲苯 胺藍Ο (“TBO”）組合物的方法以鑑定懷疑有異常發育，也就 是説，不正常的組織。 在仍然的另一個及進一步的方面，本發明關於組合物、 使用組合物的體内診斷方法及製造組合物的方法，組合物 特別地適合用來偵測懷疑有異常發育的口腔組織，尤其是 癌及癌前组織。 本發明及其應用的不同具體實例從以下其詳細説明、所 附的申請專利範圍及所附的圖將對熟悉此技者顯而易見。 其中： 附圖的簡要敘述 圖1爲254亳微米（nm)高效能液體層析儀圖，描述一般特 定爲甲苯胺藍〇產物組合物的波學，該組合物先前已知並 可購得； 圖2爲254亳微米（nm)高效能液體層析儀圖，描述特定爲 本發明的一般甲苯胺藍〇產物組合物的波峰；及 圖3爲流程圖，描述我已發明的製造包括本發明之新穎甲 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 苯胺藍Ο產物組合物的甲苯胺藍〇產物的方法。 本發明背景 大邵分的口腔損害是來自創傷。然而，其他的口腔損害 爲異常發育的腫瘤，其中有些爲良性，饵有些則可能爲癌 的或癌前的。除此之外，許多異常發育的損害是很小，且 在例行的目測檢查中容易被牙醫忽略。 已知有一種體内診斷方法可鑑定及播窝可疑的異常發育 口腔组織。此篩選的方法一般敘述在馬旭伯格的美國專利 案4,321，251號及圖西等人的美國專利案5,372,801號中。並 有更新發展的試劑套使醫師能夠更快及容易地進行測試， 而作爲其他例行牙齒治療過程的一部份，並因此可在病人 /又有症狀或當異常發育的損害很小以致在正常的目測檢查 中容易被忽略時鑑定出及/或敘述可疑的位置D 一旦可疑的 異常發育的損害以馬旭伯格的方法鑑定出來時，就可取正 常的活體檢試樣本去做組織檢驗以決定該損害是惡性或癌 m的。實行此項測試的含有先混合的染料及適當量及濃度 的漂洗溶液的試劑套由西拉公司發給執照並可由加拿大的 哲明芬公司購得，其商標名爲歐拉斯根及由英國及澳洲的 使他佛得-米樂貿易公司購得唭商標名爲歐拉斯克林。 先前的技術 目前已發明的，一般可購得的先前技術的甲苯胺藍〇產 物，其有機染料的含量依小販而定都相當的低。—般，# 表甲苯胺藍〇的構形異構體的254毫微米高⑨能液體層析儀 波峰（見實例三的高效能液體層析儀流程）的合併面積在先 ___________ 麵 5明 本紙張尺度適财關家縣（CNS) M規格（加^^公餐—-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 527185 A7 __B7五、發明説明（3 ) 前技術產物中只佔代表所有甲苯胺藍Q及甲苯胺藍〇相關成 分’也就是説甲苯胺藍。及六個甲苯胺藍〇相關成分的兩個 構形異構體，的254毫微米高效能液體層析儀波峰的合併面 積的約三2%_75% 〇 根槔圖1，咼效能液體層析儀波♦ 7及8代表甲苯胺藍〇的 兩個構形異構體（运裡所顯示的爲氯鹽）·· (I)波峰8
1T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} •裝· (II)波峰7
NH2 α '-口 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 高效能液體層析儀波峰5及6已被鑑定爲甲苯胺藍〇的兩個 構形異構體的Ν -去甲基衍生物： (III)波峰6
CH3 Ν咔 α 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α知克格（210X297公釐） 527185 A7 五、發明説明（ 4 (IV)波峰5
Nit α 高效能液體層析儀波峰2及3已被鑑定爲甲苯胺藍〇的兩個 構形異構體的Ν，Ν ·去甲基衍生勒： " (V)波峰3 + CH3 ΝΗ2 α (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
ΝΗ2 (VI)波峰2 C1 南效能液體層析儀波峰1及4所表示的化合物的確實結構尚 未正確地決定出來。 在任何地比率下，在先前技術的甲苯胺藍Ο組合物中， -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4嬈格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 A7 B7 五、發明説明（5 ) 即圖1所表示的典型组合物中，波峰1_4所表示的化合物以 較本發明组合物（見圖2 )高的量出現，且波峰5 _ 8的量比本 發明的甲苯胺藍〇產物較低。由波♦ 5及6所表示的先前技 術的甲苯胺藍〇的構形異構體的兩個N -去甲基衍生物（圖1 ) 出現的量較出現在我的發明的甲苯胺藍〇產物中的低，一 般達有機染料成分的20%。 甲苯胺藍Ο典型的合成方法在丹立克等人於1989年11月30 曰所發表的美國專利案418,055中有其實例。此合成方法爲 一連申的二個氣化步驟：（1)以例如重·絡酸却氧化n，n_二甲 基-p _苯二胺以形成中2 -胺基-5 -二甲墓胺基苯基硫代磺 fei，（2)縮合疏代續與〇 -甲苯胺，形成相對的4丨塔胺疏代 磺酸（indamine thiosulfonic acid);及（3)在如氯化鋅的存在 下’沸騰溫度下約30分鐘，閉環引達胺硫代磺酸以形成甲 苯胺藍Ο。然後冷卻反應混合物，例如以氧化鈉及氯化鋅 處理，而複合並鹽析出閉環反應的甲苯胺藍〇產物以沉澱 甲苯胺藍Ο複合物，例如甲苯胺藍〇/ZnCl2複合物。可藉由 重複的在落解及在沉殿完成純化，例如在熱的氯化鋅水溶 液中再溶解及以氣化納/氯化辞再沉殿。 現在所知，鼓勵使用甲苯胺藍〇做體内異常發育鑑定的 先前的操作者會使用以上所敘述的先前技術的甲苯胺藍〇 產物，也就是説，其中甲苯胺藍0及N-去甲基及N，N-去甲 基衍生物的構形異構體少於染料组合物的80〇/❾及其中構形 異構體的兩個N -去甲基衍生物形成大於染料組合物的2〇% 的組合物。根據我的資料，先前的操作者並沒有查覺到他 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公餐） ilr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 們甲苯胺監〇 ”產物的確實組成’ 1先前技術甲苯胺藍〇 產物的製造並無法再生性地製造他們。事實上，對甲苯胺 藍Ο的性質的晋遍的又獻敘述爲“良好顏色價值的甲苯胺藍 〇 。生物染料委員會指足一種只決定物質的“有機染料成 分的分析滴定方法。在先前技術中仗用此類定義較鬆散的 甲苯胺藍0產物導致不正常的臨床觀察且在得到必須的管 理批准以製造及上市此類產品使其用在人類診斷方法時會 導致嚴重的問題。 本發明的簡要敘述 單地，包含本發明的物質的新組合物爲甲苯胺藍0產 姜，其中甲苯胺監0的構形異構物及這些構形異構物N _去 甲基衍生物含有且甲苯胺藍〇異構物對其N_去甲基衍生物 所出現的比例使代表甲苯胺藍0異構物的254毫微米高效能 液體層析儀波峰的合併面積（根據實例3的高效能液體層析 儀波峰方法決定）對代表其N _去甲基衍生物的波峰的合併 面積至少约6:1。因此，如圖2所敘述，代表甲苯胺藍〇構 形異構物（波峰7及8)的254毫微米高效能液體層析儀波峰 的合併面積至少約爲代表其相對Ν·去甲基衍生物（波峰5及 6)的254毫微米高效能液體層析儀波峰的合併面積的六倍。 在本發明的較佳具體實例中，波净5，6，7及8所表示的成 分相當於產物的有機染料成分的至少約95%。在最特別佳 :具體實例中’波峰8(254毫微米）的面積代表產物的有機 染料成分的至少约58%。 本發明也籌劃-種體内偵測人類異常發育組織的方法， -____________ - 9 - 國家標準(CNS) 丨丨丨. d. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 A7 B7 五、發明説明（7 ) 其包括施用以上所敘述的新穎甲苯胺藍0產物到人類組織 的步驟。 本發明的另一個具體實例爲再生性地製造甲苯胺藍〇組 合物的方法，其中在丹立克合成方法的閉環（第三）步驟之 前加複合劑到反應混合物中，較佳地在方法的第一個氧化 步驟（11，圖3)之前。 先前技術的丹立克方法包括的步驟有： 在第一個反應混合物中氧化N，N-二甲基-p ·苯二胺離子以 形成第一個中間產物，2 -胺基-5 _二甲基胺基苯基硫代磺 酸， 在第二個反應混合物中氧化第一個中間產物並縮和氧化 物與〇 -甲苯胺以形成第二個中間產物，嘭塔胺硫代,績酸， 在第三個反應混合物中氧化第二個中間物以閉嘀嗒胺的 環，形成甲苯胺藍0反應產物，溶解於第三個反應混合物 中， 將複合劑加到前述的第三反應混合物中以形成甲苯胺藍 0 ~複合產物？及 將前述的甲苯胺藍0 -複合產物自前述的第三反應混合物 中分離出來。 我在比先前技術的丹立克所作的改進包含在形成第三反應 混合物更早時加入複合劑的步驟較佳地在形成第二反應混 合物之前。 根據更進一步及現在較佳的具體實例，尤其是用來製造 新穎的本發明的甲苯胺藍〇產物組合物，氧化步驟中反應 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -S'口 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ Β7 五、發明説明（8 ) 一 混合物的溫度須維持在不超過的攝氏1〇度。 在更進一步及現在較佳的具體實例中，特別是用來改良 甲笨胺藍0產物的品質，氧化步驟中反應混合物的酸鹼値 (pH)在第一個反應混合物須維持在約2 8_3 8的範園内〈較佳 地3 ·3)'在罘一個反應混合物約3 · 1 -4· 1的範圍内（較佳地3.6) 及在第三個反應混合物约3.0。 本發明的詳細敘述 如圖1所説明，典型的先前可購得的甲苯胺藍〇具有兩個 代表甲苯胺藍〇的構形異構體的254毫微米高效能液體層析 儀波峰（波峰7及8 )，及兩個已被我發現爲構形異構物的去 甲基衍生物254亳微米高效能液體層析儀波峰（波峰5及 6 )。在此先前的技術產物中，甲苯胺藍〇的構形異構物對 其N -去甲基衍生物的相對量使其構形異構物對其n _去甲基 衍生物的波峰面積比小於4: i。更高的比例，接近或超過 6:1，偶爾會存在分離的先前技術的甲苯胺藍〇產物中，但 此類產物的相對量並不清楚且不被認爲重要。在任何的例 子中，具有如此較高比例的甲苯胺藍〇產物並無法再生性 地由先前技術製造方法來製備。 根據以最近的臨床測試爲基礎的規則需要，用在人類診 斷方法中（一般根據馬旭伯格方法）以偵測異常發育組織的 甲苯胺監Ο其構形異構輪對N -去甲基衍生物的254毫微米高 效能液體層析儀波峰面積比必須至少爲約6:1，也就是説， 合併的254毫微米高效能液體層析儀波峰7及8的面積至少 約比合併的254毫微米高效能液體層析儀波♦ 5及6的面積 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 527185 A7 B7 五、發明説明（9 ) 大六倍多。 極度需要提供能符合人體診斷測試方法需求的甲苯胺藍 〇產物組合物，其中構形異構换對N -去甲基衍生物的254毫 微貧H欠能液體層析儀波峰的面積比至少爲約6:1。而且， 也極度需要提供製造可信任的及再生性的製備此類甲苯胺 藍〇產物的方法，該甲苯胺藍〇產物具有特定的甲苯胺藍〇 異構物對甲苯胺藍〇產物去甲基衍生物的比例，及可信任 的及再生性地製備其他具有較高產率及整體純度的甲苯胺 藍〇產物方法。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 從説明本發明的典型組合物的254毫微米高效能液體層析 儀分析的圖2可明顯看出，甲苯胺藍〇構形異構物對N -去 甲基衍生物的波峰面積比例大於約6· 1，也就是説， 6.68:1，由254毫微米高效能液體層析儀波7及8的合併面 積爲波峰5及6的合併面積的6.68倍多的事實可證明。由高 效能液體層析儀及灼燒試驗所決定，及以乘上本發明的甲 苯胺藍0產物的高效能液體層析儀純度（也就是説，波峰 5 ’ 6，7及8的面積的總和除以總波峰面積）來定義（1〇〇減 掉灼燒殘餘物的百分比）的整體純度與大部分的先前技術組 合物的2-10%相比爲至少大於75〇/〇。在獨立的事件中，相對 的純度可在先前技術產物中得到，但無法再生性地取得。 拫據我的發明的一方面，在第二位置（例如，見式j )有環 甲基的波峰（波峰3，6及8 )面積對在第四位置（例如，見式 II)有環甲基的波峰（波峰2，5及7)面積的比例爲〜2·5··1。相 反地，根據我的所知，在先前技術產物中此比例不超過 -12- 本紙張尺度it用中國國家標準（見格（21〇><297公爱) *~~-- 527185 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) ^~— 1·5:1 。 此波峰7+8 :波峰5+6的面積的高比例及波峰3+64_8 :波峰 2+5+7的面積的高比例的組合據我所知並不存在於任何的先 前技術產物中。因爲波峰8爲基本的甲苯胺藍〇波峰，其結 構取被廣泛接受爲甲苯胺藍〇，然後波峰3，6及§較波峰 2，5及7佳。當然，波峰7及8較波峰5及6佳，波峰5及6接 著較波峰2及3佳。因此，在我的發明的最佳具體實例中， 藏產物滿足這兩個比例準則的組合。 圖3爲説明製備甲苯胺藍〇產物的方法的流程圖，該甲苯 胺藍0產物符合一般根據馬旭伯格方法的臨床使用上的管 理需要。 合成圖3的起始物質10爲可購得的，高純度的ν，Ν-二甲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基，ρ _苯二胺 ： (VII) H3c,
XT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CH^ 第一彳固反應混合物的形成 起始物質io的水溶液爲氧化的11，在酸，硫酸鋁及一試 劑，13(其被相信複合中間產物並用在方法的後期以複合甲 苯胺藍0組合成分），例如，氯化鋅的存在下，較佳地在低 於約10°C，特別是低於約5 °C，藉由與適當的氧化劑12反 應，例如，重酪酸鉀12。然後，加入硫代硫酸鹽離子14的 13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（2丨0>< 297公釐） 527185
Μ B7 五、發明説明（11 ) 來源，例如，硫代硫酸鈉以形成含有第一個中間產物2 -胺 基-5 -二甲基胺基苯基硫代磺酸的第一個反應混合物15 : (VIII) 第二個反應混合物的形成 ^ 然後較佳地在不大於约1(TC的溫度下，第一個反應混合 物15進一步地在縮合步驟18中與另一個氧化劑16，例如， 重酪酸鉀，及甲苯胺化鹽酸17反應，在第二個反應混合物 19中形成第二個中間產物，縮合產物，蜊嗒胺硫代磺酸。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. (IX)
d 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於第二反應混合物19中。 第三個反應混合物的形成 然後在不高於約l〇°C的溫度下，較佳地藉由加入適當的 氧化劑22，例如，重酪酸鉀來進一步地氧化21第二個反應 混合物19。接著加入硫酸銅，氯化鋅複合，酸，並加熱 到100°C以有效閉吲嗒胺環，在第三個反應混合物24中形成 甲苯胺藍0。此時，從第三個反應混合物分離並純化甲苯 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X 297公釐） 527185 A7 B7 五、發明説明（12 ) 胺藍Ο。 甲苯胺藍0的分離」純化 例如，在本發明的方法的現有較佳具體實例中，藉由適 當的複合劑25，例如，氯化鋅複合24自第三個反應混合物 沉澱出甲苯胺監〇以形成複合甲苯胺藍〇 _氯化鋅複鹽。從 液相中過遽出沉澱物26並以氯化鈉溶液27洗滌。洗滌過的 /慮餅然後再氣於28嚴格11體積的水29以形成甲苯胺藍〇溶液 30，然後過濾3 1此甲苯胺藍〇溶液以除去未溶解的不要的 固體32a。然後加入氯化鋅接著加入嚴格2體積/濃度的氯化 鈉33至濾液32中以再次沉澱甲苯胺藍〇_氯化鋅複鹽，用做 説明地（只顯示出構形異構物的其中一個）， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝' (X)
“3 . Η NIC
H3H2 •二· Θ 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 藉由過濾自混合物中分離出甲苯胺藍〇 _氯化鋅複鹽以產生 甲苯胺監0 _氯化鋅/甲苯胺藍〇 -氯化物濾餅34。 1如果用太多的水會阻礙甲苯胺藍〇的分離。如果用太少 的水則（1)所有的甲苯胺藍〇都不會溶解，產率會降低且（2) 會降低產物的純度D 如果用太少的氯化鈉，所有的產物都不會鹽析出來，產 率，奪低。如果用太多的氯化鈉，則會導致與甲苯胺藍〇 — -15- 4 本紙張尺唐i南用中圇 η个你午（) A4現格（210><297公釐） 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 起沉澱出的不純物，降低產物的純度。 如虛線35所指示，可再溶解、過濾、再沉澱及再分離甲 苯胺藍Ο濾餅34多次以達到所須程度的甲苯胺藍〇純度及產 率。然後在例如傳統的對流烘箱及/或眞空烘箱中乾燥35最 後純化的濾餅複合產物34且研磨乾燥的濾餅36並混合37以 得到最後的產物38。最後的甲苯胺藍〇產物含有甲苯胺藍〇 的氯化鋅複鹽（式X )及甲苯胺藍〇的氣鹽（式I及⑴。 在形成第三反應混合物之前，也就是説，氧化峭嗒胺硫 代磺酸並複合所形成的甲苯胺藍〇反應產物以形成甲苯胺 藍〇 -複合物之前，加入複合劑會產生具有改良的甲苯胺藍 〇構形異構物對其N -去甲基產物的比例的甲苯胺藍〇 —複合 產物。如果在形成第三反應混合物之前加入複合劑，則可 得到至少6:1的比例。當然，如那些熟悉此技者所認爲，得 到這些改良的異構物對去甲基衍生物的比例有時也依觀察 其他的過程參數預防措施而定，如以下與本方法發明的較 佳具體實例的發明一起討論的，其合乎改良甲苯胺藍〇 -複 合產物的產率及純度的需要。然而，即使觀察到此其他產 率及純度增加的預防措施，也不會得到所須的異構物對N -去甲基產物的改良比例且也不會得到在第二對第四位置有 甲基的波峰的改良比例，除非至少在形成第三個反應物之 前’也就是説在氧化4丨塔胺硫代續酸並複合所形成的甲苯 胺藍0產物之前。 現在’我相信由於早期形成起始物質及/或硫磺酸及/或 可明顯地提供去甲基的位阻的啕嗒胺硫代磺酸的複合物， -16 - 本紙張尺度適用巾關家辟（CNS ) A4規格（210xT^^y (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 527185 A7 B7 五、發明説明（14 ) 所以較早加入複合劑，也就是説形成第三反應物之前可改 善最終產物的異構物：N -去甲基衍生物比。換句話説，由 於複合物增加的尺寸及結構，所以，其提供了可保護N _甲 基以免進行氧化去甲基反應的大量空間（可能爲電子效 應）。由於所有的三個反應步驟牽涉到氧化及寸能的去甲基 反應’較早形成此複合物是有利的，這鱿是我爲什麼建議 複合劑要儘早出現的原因。 操作實例 提供以下的實例以説明本發明的實際操作，並以此條件 以使熟悉此技者能製造及使用此新穎的甲苯胺藍〇組合 物，以練習使用此甲苯胺藍0組合物的新穎診斷方法，及 練習製備甲苯胺藍0組合物的新穎方法，其一同形成本發 明的各種具體實例’且指示熟悉此技者目前已知最好的操 作本發明的各種具體實例的模式。提供這些實例僅用來説 明而非用來指出本發明範園的極限，發明範圍僅由待決的 申請專利範園來定義。 實例1 製造方法 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此實例説明實行一批甲苯胺藍〇染料產物的商業範園製 備的確實方法，詳細的説明是需要滿足GMP所需的管理條 件，該方法乃根據包含本發明目前已知最好模式的方法。 原料溶液的製備 〈 設備/供應品： A.歐浩司IP15KS天平 -17- 本度適用中國國家標準（CNS ) A4規;^^2Κ)Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 A7 _____〜B7 五、發明説明（15 ) B. AnD HV150KAI天平 C. 費爾般克H90-5150天平 D. 歐浩司WB25/1-20W天平 E·寇爾帕莫（51201-30)及射莫林（825535)攪拌器 F ·取樣設備，如鋼勺，轉筒取樣器，等等。 G·愛倫美氏燒瓶，燒杯，曇，及其他遴當的玻璃器具。 Η ·生/產溶液標籤。 安全： 保護設備，如手套，安全眼鏡，實驗衣及呼吸器根據 MSDS守則在操作化學物時都應該穿戴。 原料溶液製備方法： 將1364.2克（土 5.5克）的美國藥典純水加到氫氯酸，1364.2 克（± 5.5克）中，攪拌直到水變爲澄清。 將1779.1克（土 7.0克）的硫酸鋁十六碳水合物加入2548.9克 (土 10.0克）的美國藥典純水中，攪拌直到溶液變爲澄清。 將7384.6克（土 30.0克）的氯化鋅加到2786.7克（士 11.0克） 的美國藥典純水中，攪拌直到溶液變爲澄清。 將210 L9克（± 8.0克）的重鉻酸鉀加到25203.8克（± 100克） 的美國藥典純水中，攪拌直到溶液變爲澄清。 將1526.6克（土 6·0克）的五結晶水硫代硫酸鈉加到2043.6克 (土 8.0克）的美國藥典純水中，攪拌直到溶液變爲澄清。 將509.7克（土 2.0克）的五結晶水硫酸銅力f到1613·1克（土 6.0克)的美國藥典純水中’攪摔直到溶液變爲澄清。 將600.0克（土 2.0克）的硫酸加到600·0克（土 2.0克）的美國 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇><297公釐） -I I I ϋ I I _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 、1Τ 527185 A7 B7 五、發明説明（16 ) 藥典純水中，攪拌直到溶液變爲澄清。 將70.4公斤（士 250克）的氯化鈉，加到234.4公斤（土 850克） 的美國藥典純水中，攪掉直到溶液變爲澄清。 安全 根據MSDS守則，在操作化學物時需穿孰保護設備如手 套，安全眼鏡，實驗衣及呼吸器。 合成 合成設備及供應品： LFE控制板（3000) 有蓋的20加侖套層玻璃内緣的純化桶（E71224) 兩個有蓋的100加侖套層玻璃内緣的純化桶（Pl，PT-001) (P2, L=13621) FTS環流冷卻器（RC96C032)及500加侖冷藏桶（500CST) 三個卡福瑞摩混合器（BDC-1850) (R1，18500961) (Pl，18501148) (P2, 18501173)，具有軸及葉輪 電閃混合器（L1U08) (201550) 三個熱交換器（加納爾機器）（R1，01960763) (P1，01960764) (P2, 08950727) 三個12KW套層液體循環器（瓦特羅，BLC726C3S20) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 三個循環幫浦（史達莱特，JBHD-62S，C48J2EC15) 美斯福雷克斯數位Peristaltic幫浦（A94〇028〇6) 美斯福雷克斯Peristaltic幫浦（L95003320) 柯爾帕摩 Peristaltic幫浦（B96002074) 諾許過濾單位（70-2038, 43421-1) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 527185 A7 B7 五、發明説明（17 ) 兩個布其勒過濾單位（Z11，624-6, Z10, 441-8) 西門子眞空幫浦（F2BV2) 60加侖有蓋的玻璃内緣收集桶（86854, E164-1186) 空氣壓縮器（DF412-2) (9502312538) 流量控制器（3-5500) (69705069190) 六個分批控制器（34600) (#1，69705069191，#2, 69705069199, #3, 69705069194, #4, 69705058829, #5, 6970508805, #6, 69705069195) 六個流量感應器（#1，69704295165, #2, 69704024995, #3, 69704024分94, #4, 69704025027, #5, 69612178606, ，69703120990) 四個隔膜幫浦（Ml) 四個突波壓縮器（A301H) (#2，15557, #3，15561，#4，15558, #5, 15559) 四個氣體調節器（CFR10) 四個螺線管閥（與氧體調節器一起使用） 四個低流速感應器（FS-500) 三個螺線管閥（EASM5V16W20) 氣體過濾器/調節器（T1R) PTFE/ F06R113AC 過濾介質，聚丙烯（7211-1) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 過濾介質，華特曼級52 藥物醫學管（-18, -82, -90) pH 計；漢娜 9321 (1303675)及歐里翁 620 (001911) 光譜儀 20 (3MU7202070) ( 費許科學眞空烘箱（9502-033) VWR 1370 FM強制空氣烘箱（1370FM) -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 527185 A7 B7 五、發明説明（18 ) 麈/霧呼吸器 湯瑪士威利實驗礤機（3 375-E10) 帕德森-凱莉摻合劑（摻合主人，C416578) 歐浩司TS4KD天平 歐浩司IP15KS天平 美特樂AG 104天平
AnD HV150KA1 天平 費爾般克H90-5150天平 歐浩司AS 123印表機 歐浩司AS142印表機 AD-8121多功能印表機 市民iDP 3 540點矩陣印表機 好立特佩克高效能液體層析儀（10 5 0) 超音波除垢器（8892-DTH，QCC9601 005C) 型K熱電偶溫度記錄器（KTX 6292753, 6355146) 愛倫美氏燒瓶（8升，6升，4升，1升） 燒杯（8升，6升，500毫升，250毫升） 罎(4升，10升，50升） HDPE轉筒（55加侖，100加侖） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 容量瓶（100毫升） 塑性漏斗 巴斯德吸量管及球及容量吸量管（10毫升？ 5毫升）及球 風箱（25毫升，50毫升） 稱量紙 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 527185 A7 B7 i、發明説明（19 ) 刮勺 包裝材料（容器，蓋子，標籤） 原料溶液 合成·步骤1 2 基-5 -二甲基胺基苯基硫代旙齡 ’檢查美國藥典水系統的完整性。將稱好（28,000克土 100.0 克）的美國藥典級純水加到反應器中，並在每分鐘190 土 W轉下攪摔。記錄水被懸浮起來時美國藥典水的導電 度。 * 加入N，N_二甲基·1，4_ 苯二胺（5·128莫耳，720.0 克土 3.0 克）。材料應以粉末加入（沒有塊狀构）。 •加入氫氯酸（6 Ν，1136.9克± 5·0克）。攪拌15分鐘（土 5分 鐘）。 ，根據標準操作方法# LM，007確定pH儀已校正好。以塑性 取樣設備取將近10毫升的反應混合物樣品。標記樣本批 號爲#.IPSla。檢查pH値並記綠。pH値必須爲在25°C 土 5°C 下 2.8到3.8。 ‘ ，加入硫酸鋁六碳水合物溶液（4328.0克土21.0克）。在每分 鐘275土10轉下攪拌1〇分鐘（±5分鐘）。 ，加入氯化鋅溶液（3641.5克士 18.0克）。冷卻到4°C±1°C。 * 一旦溫度（PV1)爲4°C 土1°C。在20分鐘期間内（土 5分鐘）加 入重鉻酸鉀溶液（6532.4克± 32.0克）。完拿加入之後，攪 拌20分鐘（土 5分鐘），然後改變主要方法的設定點（SP1) 至 25〇C。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝-
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2Q ) *當溫度已達到20.0°C 土 3.0°C，加入硫代硫酸鈉五結晶水 溶液（3570.2克土 18.0克）。在25°C下攪摔溶液30分鐘（土 5 分鐘）。 ，改變設定點至60°C，當溫度（PV1)達到60.0°C 土3·〇Ό時， 使反應混合物攪拌5分鐘（土 3分鐘）並改變LFE控制器上 的設定點至10.0。 * 一旦溫度達到13,0°C 土 2.0°C，以塑性取樣設備取將近1〇 毫升的反應混合物樣本。標記樣本批號爲#.IP&lb。檢查 酸鹼（pH)値並記錄。pH必須在25°C±5°C下爲3.1到4.1。 合成：步驟2 Θ丨塔胺硫代磺酸的合成 *稱〇 -甲苯胺（604.4克土 2.5克）並在冰浴中冷卻到18°C 土 3 °C。慢慢地加氫氯酸（6N，1230.7克±5.0克）到〇-甲苯胺。 *從冰浴中移去〇 -甲苯胺氳氯化物並使溶液冷卻至380C克 土 3 °C。加溶液到反應混合物中並擺摔5分鐘（土 3分 鐘）〇 ♦在20分鐘的期間内（土5分鐘）加入重鉻酸鉀溶液（6532.4克 土 32.0克）。當完全加入後攪拌10分鐘（士 5分鐘）。 •改變控制器的設定點（SP1)到60.0。一旦反應混合物溫度 達到60.(TC 土 3 °C，使混合物攪拌25分鐘（土 5分鐘）。形 成含有綠色吲嗒胺的沉澱物。 *以吸量管取將近1 〇毫升的反應混合樣本彳。標尤樣本批说 爲#.IPS2。記錄溶液顏色。 合成··步骤3 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ,0. (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) -裝. 訂 -1¾ 527185 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（21 ) 甲苯胺藍0及甲苯胺藍0氯化鋅複鹽的合成 *設定LFE控制器設定點至7.0。一旦反應混合物溫度達到 10.0°C 土 3°C，在20分鐘的期間（土 5分鐘）内加入重鉻酸 鉀溶液（65 3 2.4克±32.0克）。當完全加入時，攪拌20分 鐘0 -在20分鐘的時間内（土 5分鐘）加入重鉻酸鉀溶液（5225.9克 土 2 6.0克）。當完全加入時，禮拌2 0分鐘（土 5分鐘）。 •以吸量管取將近10毫升的反應混合樣本，標記樣本批號 爲 #.IPS3。 •加氯化鋅溶液（3 641.5克it 18.0克）。在每分鐘3 50 土 10轉下 攪:拌20分鐘（土 5分鐘）° •加入五結晶水 硫酸銅（2122.8克±10.0克）。攪掉15分鐘 (± 5分鐘）。 •以吸量管取將近10毫升的反應混合物樣本。標記樣本批 號爲 #.IPS4。 •改變控制器設定點（SP1)至100.0。一旦反應混合物溫度達 到67.0°C 土 3°C就開始藉由加入整分（500毫升，250毫升， 125毫升，等等。）的硫酸溶液至使pH値爲2、9 士 0.3。每一 次加入後攪拌5到10分鐘並檢測pH。 * 一旦反應混合物溫度達到100.0°C 士 3°C，使混合物攪拌 3 5 ± 5分鐘。 -改變控制器設定點（SP1)至35.0。一旦反參混合物溫度達 到70.0°C 土 3°C，以吸量管取將近10毫升的反應混合物樣 本。標記樣本批號爲#.IPS5。 (請先閲讀背面之注意事 —0 項再填· 裝-- :寫本頁) 訂 4 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（22 ) ’改變控制器的設定點（SP1)至2,5。在4小時内冷卻至2.5°C 並保持在2.5°C 土 2.0°C下4到18小時。 ，以吸量管取將近10毫升的反應混合物樣本。標記樣本批 號爲#.IPS6。記錄溶液顏色。測試pH並記錄。經〇·45微米 的滤紙過〉慮樣本。取將近1 〇 〇笔克的沉?殿物並溶在將近 100毫升的高效能液體層析儀水中。經0.45微米的濾紙過 滤該溶液。標記溶液批號爲HPS7並以逆相高效能液體 層析儀甲苯胺藍Ο分析方法分析樣本。見實例3。記錄結 果。 純化：步驟1 •經適當的過濾介質過濾反應混合物（華特曼級52)。 •當反應器之内沒有東西時，稱童24.0公斤± 150.0克的 30%氯化鈉溶液並加入24.0公斤± 150.0克的美國藥典水 (記錄懸浮的水的導電度）。關上反馬器底部的閥並加 15%氯化鈉溶液到反應器内。大概地攪拌溶液。當完全 過濾時，將NaCl溶液加到過濾單位以漂洗濾餅。收集滤 液到相同的容器並標示批號爲#.HW1(有害廢料1 )。 •根據廢料處理方法處理濾液（批號#.HW1)。 •檢視100加侖玻璃内襯，套層純化桶# 1的狀況並確定桶子 已適當地標示了 CLEANED(清潔的）及曰期，簽名。以 HDPE蓋，卡福拉摩攪拌器，攪拌軸，推進器及插入塑性 熱電偶壁的熱電偶電極來裝備桶子。檢释底部閥爲關閉 且出口被蓋好。 •以批號#·Ρ1Α(純化1A)標示桶子。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝- 丁 、-·" ^7185 A7 B7 五、發明説明（23 ). 令稱重190.0公斤土 1·〇公斤的美國藥典水至HDpE容器中（記 錄懸浮的水的導電度）並將水移到純化桶1。在每分鐘35〇 轉下攪拌該混合物。一旦以NaCl(氯化鈉）完全清洗濾餅 後’就將滤餅在攪;拌中加到純化桶1中。 •禮拌混合物2到4小時。取將近50毫升的樣本（經由底部 的閥）。標記樣本批號#.IPS8。記錄溶液的顏色。 •設定純化桶1 LFE控制器至75.0CSP1)。 *當混合物溫度達到（？¥1)75.0。(：土3。(：時，改變控制器的設 定點至40.0。 9使混合物在40°C，每分鐘350轉的速度下攪拌12到36小 時。 *取將近50毫升的樣本（經由底部閥）。標記樣本批號爲 #.IPS9。記錄溶液的顏色。檢測pH並記錄。以1〇毫升的 吸董管量測1.0毫升的樣本並在1〇0毫升的容量瓶中稀釋 到100毫升。標記樣本批號爲#JPS9A。然後以100毫升的 吸量管取1〇·〇毫升的此溶液並在1〇〇毫升容量瓶中稀釋到 100毫升。標記樣本批號爲# iPS9B。以光譜儀20+測量這 些樣本的吸光値。樣本9B的吸光値應大於等於0.220。 純化：步驟2 *在過濾單位中經由過濾介質過濾混合物。將濾液收到有 蓋的泰瑞德HDPE容器中。 檢測10 0加命玻璃内觀’套層純化桶# 2的狀況並確定桶子 已適當地標記上CLEANED(清潔的）及曰期和簽名。以 HDPE蓋，卡福拉摩禮掉器，揽样轴，推進器及插入塑性 -26- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNs ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝-
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 五、發明説明（24 ) ~ 煞電偶壁的熱電偶電極來裝備桶子。確定底部閥已標示 CLEANED(清潔地），關閉（水平位置）且出口被蓋住。 以批遽#.P 2 A(純化2A)標示插子，並標上日期及簽名。 •當完全過濾時，稱重容器及溶液。減掉歸零的重量。記 錄溶液的重量。計算溶液體積。 (甲苯胺藍0溶液重量·克）（1〇〇 〇毫升甲苯胺藍〇溶液 / 100.42克甲冬胺藍〇溶液）=甲苯胺藍〇溶液的毫升數 •標記鴻餅批號#.HW2(有害廢料2)且根據廢料處理方法處 理。 •以下列的式子稱重相當於以上所記錄的溶液體積的3〇0/〇 氯化納溶液的量： (甲苯胺藍〇溶液的毫升數）（116 91克氯化鈉溶液/ 1〇〇 〇毫 升氯化鈉溶液）二氯化鈉溶液的克數 *樣本约等於10愛升的濾液並檢測其pH値。標示批號爲 #.IPS 10。pH必須爲3.0至4.0。將濾液（以重量）倒入純化桶 2 °在每分鐘3 5 0轉下檀拌溶液。 ψ加入氯化鋅溶液（1636.3克土 6.5克）。 •將氯化鈉溶液（以重量）倒入純化桶2。 •設定純化桶2 LFE控制器至75.0(SP1)。 9當混合物溫度（PV1)達到75.0°C 土 3°C時，改變控制器上的 設定點至5.0。 *在6小時内冷卻到5 °C並在5 °C 土 4 °C下維特4到24小時。 •取將近50毫升的樣本（經由底部的閥）。標記樣本批號爲 #.IPS11.PT2.. -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 527185 A7 B7 五、發明説明（25 ) 處理： i -濾器 •在過濾單位中經由配衡的過濾介質（華特曼級52)過濾混 合物。 ，稱重12公斤土 50克的30%氯化鈉溶液並以12公斤士 50克 的美國藥典水來稀釋（記錄懸浮起來的水的導電度）。藉 由直接將溶液加入瓷漏斗來以15%的氯化鈉溶液清洗濾 餅。當完全過濾時，小心地移去含有甲苯胺藍Ο產物的 滤紙。 •根據廢料處理方法來處理批號#.HW3(有害廢料3 )。 ii. 乾燥 *將甲苯胺藍Ο產物放在烘箱内並在50°C ±3°C下乾燥5 士 1 小時。標記烘箱批號爲#.PRE”DRY(乾燥前）。 *從強制的氣體烘箱移去產物並放入眞空烘箱内。在45°C 士 3 C ’ 2 8"汞拄土 2 ”汞柱下乾燥1 〇 土 2小時。標記烘箱 批號爲#.DRY(乾燥）。 iii. 稱重 •移去產物並稱重甲苯胺藍〇並過濾。減掉過濾器重量並 記錄甲苯胺藍〇重量。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •以不銹鋼刮勺小心地從濾紙移去產物。載上塵/霧呼吸 器。稱重甲苯胺藍。 iv. 研磨 / •將產物移到甲苯胺藍〇完成區域。偵測湯瑪士威利碾磨 機的狀;兄並確疋碾磨機已適當地標示爲乾淨的，及曰 -28-本紙張尺度剌中國標準（cns"] A4規格（ 527185 A7 B7 一_ 〜—— ____ _ 五、發明説明（26 ) 期，簽名。使用0.5毫米的篩子。將乾淨的容器與輸送瀉 物架接觸。室門必須關閉並且門上。 •關閉給料斗底部滑動的蓋子，移去給料斗蓋並加入樣 本。放置給料斗蓋。打開碾磨機並輕輕地打開滑動的蓋 子。將樣本夠慢地進料至碾磨機室内以使碾磨機不會慢 下來或變得阻塞。 •一旦完全地研磨，小心地自輸送瀉物架移去寬口玻璃 瓶。 v. 混合 •檢測佩得森-凱莉實驗室混合器狀況並確定混合器已適當 地檩示了“清潔的，，，及曰期，簽名。 •將甲苯胺藍Ο產物移到混合器容器並關上蓋子，設定計 時器爲15分鐘土 5分鐘。 vi. 測試 取樣產物以測試。以逆相-高效能液體層析儀甲苯胺藍〇 分析方法來分析樣本。記錄結果。 實例2 臨床測試方法 臨床測試溶浚的黎借 此實例説明了在鑑定口腔的異常發育時使用實例1A的甲 苯腔监Ο產物。 將實例1的甲苯胺藍Ο產物，本莓香料劑（IFF木每 IC563457)，三個結晶水的醋酸鈉緩衝劑及雙氧水（30%美 國藥典）防腐劑（見美國專利案5,372,801)溶在純化水（美國 -29 * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填· <寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 527185 A7 B7
五、發明説明（27 ) 藥典），冰醋酸及SD 18乙醇，以產生甲苯胺藍〇測試溶 液，其組成如表A所指示： 表A 成分 重量％ 甲苯胺藍0產物 1.00 香料 • 20 缓衝劑 2.45 防腐劑 .41 醋酸 4.61 乙醇 7.48 水 83.85 (請先閱讀背面之注意事 —0 項再填- 裝—I :寫本頁) 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 100.00 製備1 %重量百分比的純水中醋酸，苯甲酸鈉防腐劑及木 莓香料作爲漂洗前及漂洗後溶液。 遂處方法 病人披上圍兜以保護衣服。因爲希望會有咳痰，所以提 供病人一個10盎司的杯子，該杯子可丟棄在感染性廢科容 器中或其中的内容物可直接倒入水槽排水管以避免染色到 4 Μ 可犯被染到的環境中的表面或物品要從測試區域移 去或蓋上。 進行一可見的口腔癌檢驗，避免使用可使柔軟组織產生 刻痕或切痕的任何工具。在柔軟组織及牙齒的染色前表面 做上標誌。 ’ i人以和攻15愛升的漂洗前溶液漂洗口腔將近20秒並咳 __—_ _ -30- 本紙張尺度適用(CNS) A4規;---
、1T 527185 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（β ) 痰，以除去過多的唾液並提供一致的口腔環境。然後以其 他的漂洗前溶液重複此步驟。 病人然後以水漂洗及漱口 20秒及吐痰。 病人然後以30毫升的甲苯胺藍〇測試溶液漂洗及漱口 1分 鐘並吐疲。 病人然後以15毫升的漂洗後溶液漂洗2〇秒並吐痰。然後 重複此步綠。 病人然後以水漂洗及漱口 20秒並吐痰，然後重複此步 驟。 然後進行口腔的觀察，採用適當的柔軟組織檢驗技術， 包括回縮，平衡好的電閃及放大，如果需要的話。維持藍 色的邵分爲懷疑有損害的部分，記錄位置，大小，形態， 顏色及表面特徵。 爲了避免僞陽性’ 10到14天後病人再回來重複以上的方 法。此段期間可允許第一次檢驗時任何潰瘍或創傷性的損 傷或受刺激的病狀有癒合的時間。第一次檢驗中偵測到的 可疑區域若在第二檢驗後仍呈現陽性染色則被認爲是癌的 或前癌组織，並以組織檢驗來確定此結論。 早期的我核紅血球損害的藍色染色，適常是點彩或不調 和的形式。然後，染料停留在舌背上的不規則乳頭裂缝是 正常的，那並不是陽性的表示。其他會保留藍色染料，但 不被認爲爲陽性的區域包括齒斑，每一坪牙齒的齒齦邊 緣，由於染料從舌背上的的停留的染色轉移的棄軟腭的擴 散染色，及容易分辨的潰瘍性損害。在所有的例子中，以 * 31 « 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 、11 527185 Α7 Β7 五、發明説明（z9 ) 此試驗未被染出藍色但高度的可疑的損害中，就必須進行 組織檢驗。 實例3 高效能液體層析儀方法 此實例敘述分析甲苯胺藍0樣本的方法，用來鑑定，分 析及純度測試。 設備及供應品 乙月青 ’ 1¾效能液體層析儀級 冰醋酸，試劑級 醋酸銨，試劑級 去離子水，適合做高效能液體層析儀分析 pH儀，有標準pH 4.0及7.0缓衝液 實驗室玻璃器具，包括容量瓶及吸量管 超贪波浴 分析天平 磁攪拌器 壓縮氦 有0.4 5微朱尼龍〉慮紙的過遽设備 100微升針筒 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r§3效能液體層析儀及輔助設備，包括 霍立特佩克德系列1050的幫浦，或能夠做同溶高壓流的 相同物。 < 霍立特佩克德系列1050的二極束偵測器，或紫外光波長 偵測器的相同物。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 527185 A7 _______ B7 五、發明説明（30 ) 雈JL特佩克德維克拉系列3圓盤傳動機（電腦控制器）， 具有超VGA 1280螢幕及雷射印表機，或相當的整合記錄 器。 … 非凡，5微米，QDS (3) 100埃，2.5公分X 4.6毫米，或相 當的高效能液體層析儀管柱。 固定-線圈注射器（10或20微升） 管柱加熱器 移動相的製備 將〇·77克的醋酸銨加入1〇00毫升的容量瓶以製備1升的 〇.〇 10Μ醋酸銨溶液。加水，混合以溶解並以水稀釋到標記 處。將0.01Μ的醋酸銨溶液倒入愛倫美氏燒瓶並以磁攪拌器 擾拌。使用之前已用ΡΗ 4.0及7.0缓衝液校正過的pH計，以 醋酸將溶液的pH値調到3.3及3.6之間。經〇·45微米的濾紙過 遽溶液。經0.45微米的尼龍濾紙過濾乙腈，用密理博的過 濾、裝置並加入確實250毫升至攪拌中的醋酸銨水溶液。將此 移動相的儲蓄器放在靠近高效能液體管柱幫浦的位置並以 氦氣清洗。 甲苯胺藍Ο樣本的製備 精確稱重約50毫克的甲苯胺藍〇樣本，放入1〇〇毫升的容 量瓶’並以水稀釋到標記處ό蓋上燒瓶，超音波掁盪3〇分 鐘並混合。這就是約05毫克/毫升的儲備溶液。 將10.0¾升的儲備溶液倒入1〇〇毫升的容章瓶内，以水稀 釋到標記並混合。適當地標記此將近〇 〇5毫克/毫升稀釋的 甲苯胺藍Ο操作溶液。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（〔叫六4^(21(^297公釐)~~ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. 、11 527185 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（31 ) V 層析條件 注射體積-10或20微升 流速-約1.5毫升/分鐘 管柱溫度-40°C 偵測器波長-254毫微米 敏感度及衰減設定：適合所使用的儀器積分-面積反應 樣本的高效能液體層析/儀分析 建立並以流動相流平衡高效能液體層析儀。使用依照美 國藥典XXIII的系統適合度測試以證明所得到的高效能液體 層析儀數據的精準性及精確度° 在每一個分析，評估以下的參數： 精密’· 比較5次注射操作樣本的最小値。相對极準偏 差必須相等或小於2·0〇/ο。如果相對許、、1 \ 知平偏差 大於2.0%但小於波峰5_8的合併 叫镇的3 0% 時，則需做6次注射。 · 以下列方私式计鼻樣本的一個色展 峰7及8 (主要波峰）的底線解析： R = 2 一让2 一;L α wx + w2 其中 二波峰7的停留時間，以亳米計 t2=波峰8的停留時間，以亳米計 w!=波峰7的波峰寬度，以亳米計 wp波峰8的波峰寬度，以毫米計 解析： 譜上的波 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝_ 訂 34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 527185 kl ________ B7 五、發明説明（32 ) ~ 波峰7及8之間的解析必需大於15 c 測量波峰的對稱性以確定波唪下面積的計算 是精確的。以下列方禚式計算樣本的一個色 層譜上的波峰7及8的譜尾因子（τ): Τ 二 Wa〇5 + 2f 其中
Wa(>5 =從波峰高度的底線波峰的5 %所決定的 波峰寬度 * f =介於波峰最大値及在％_的波峰前端的距 離 τ應該是小於3的因子。 記綠色層譜並決定主要波峰（5, 6,7及8)的面積反應，以 及所有出現在色層譜的偵測到（所有非溶劑前的波峰）的不 純波峰。 其他高效能液體層析儀決定 鑑定（甲苯胺藍0藥物物質及藥物產物）： 樣本製備的層析剖面圖應顯示與圖2所説明的色層譜的剖 面圖相同的一般剖面圖（波峰出現及波峰強度）。 相關物質（藥物物質）： 每一個不純物波峰的量（設計爲波峰i，2，3及4的已知 不純物波峰）以在色層譜中面積百分比對上所有波峰的總面 積來計算。 & 甲苯胺藍Ο藥物物質的分析： 決定4個主要甲苯胺藍〇波峰（波峰5_8)的每一個的百分 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 4 527185 A7 B7 五、發明説明（33 ) 比以作爲不純度，也就是説， 、 波峰面積5 · 8的總和 卢7歹欠能〉喪骨豊層才斤j義= -- X 100 所有波峰面積總和 以此條件敘述我的發明以使熟悉此技者能了解並操作 它’已足義出其目前較佳的最好模式’其申請專利範圍 馬： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

  1. 527185 第087101438號專利申請案 中文申請專利範圍替換本（92年1月) 8 8 8 8 A B c D 申請專赳範要
    恭 1. 一種組合物，其含有： 修正補充/ (A)甲苯胺藍Ο的構形異構物，該化合物具有下列結構 及
    h3cn ch3
    CH3 及 (B)該等異構物的N _去甲基衍生物，該化合物具有下列 結構， 及
    代表前述異構物的254毫微米高效能液體層析儀波峰的 合併面積對代表前述N -去甲基衍生物的波峰的合併面 積的比例至少為約6:1。 2. —種組合物’其含有： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 527185 8 8 8 8 A B c D 申請專利範圍 (A)第一組成分，其含有在第2位置具有環甲基的甲苯 胺藍0的構形異構物，該化合物具有下列結構
    其N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結構 h3c、
    NHi and 其N，N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結構 及 (Β)第二組成分，其含有在第4位置具有環甲基的甲苯 胺藍0的構形異構物，該化合物具有下列結構
    ΝΗα, 其N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結構
    NH^and 其N，N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結構 2- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 527185 ABCD 申請專利範圍
    代表前述第一組的254毫微米高效能液體層析儀汲峰的 合併面積對代表前述第二組的高效能液體層析儀波蜂 的合併面積的比例為至少約2.5:1。 3. —種組合物，其含有甲苯胺藍0的構形異構物，該化 合物具有下列結構
    ⑻ 及 (b) 其中該異構物（a)包括該組合物的總有機染料含量至少 5 8%。 4. 根據申請專利範圍第1項的組合物，其係含在液體載體 中施用於組織以鑑定異常發育的組織。 5. —種製造甲苯胺藍Ο (“TBO”）的方法，該方法包括的步 騾有： (A)氧化在第一個反應混合物中之N，N-二甲基_ p -苯二 胺，形成第一個中間產物2 -胺基-5-二甲基胺基苯 -3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 527185 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 基硫代續酸， (B) 氧化前述第一個中間產物並以在第二個反應混合物 中縮合該氧化物與〇 -甲苯胺，形成第二個中間產物 ^塔胺硫代續酸， (C) 氧化前述第二個中間產物，以封閉其啕嗒胺環，形 成溶在第三個反應混合物中的含甲苯胺藍0反應產 物， (D) 添加複合劑到前述第三個反應混合物中，形成甲苯 胺藍0 -複合產物，其溶在前述第三個反應混合物 中， (E) 使前述的甲苯胺藍0 -複合產物從前述第三個反應混 合物中沉澱出，及 (F) 從前述反應混合物中分離出前述曱苯胺藍0 -複合產 物，該化合物具有下列結構
    該異構物之N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結 -4 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
    A B c D 527185 六、申請專利範圍 構
    該異構物N，N -去甲基衍生物，該化合物具有下列結 構
    該改良方法包括在形成前述第三反應混合物之前添加 前述複合劑至反應混合物中。 6. 根據申請專利範圍第5項的方法，其中反應混合物的溫 度維持在不高於約10°C。 7. 根據申請專利範圍第5項的方法，其中反應混合物在第 一個反應混合物中之pH維持在約2.8-3.8，在第二個反 應混合物中為約3.1-4.1，且在第三個反應混合物為約 3.0。 8. —種化合物，其係選自包括甲苯胺藍0的構形異構物 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）
    527185 8 8 8 8 A B c D
    nh2 申請專利範圍 之N -去甲基衍生物，該等化合物具有選自下列之結構 式： ,ch2 及
    m2. 9. 一種化合物，其係選自包括甲苯胺藍Ο的構形異構物 之Ν，Ν-去甲基衍生物，該等化合物具有選自下列之結 構式：
    及
    νη2 10. —種分析甲苯胺藍Ο染料產物的高效能液體層析儀方 法，該方法包括 形成移動相， 形成甲苯胺藍0樣本溶液， 使移動相流在高效能液體層析儀管柱中達到平衡，及 -6 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
    527185 8 8 8 8 A B c D 々、申請專利範圍 將樣本溶液注射至高效能液體層析儀管柱， 其係改良鑑定樣本染料成分及分析並決定前述樣本的 純度，前述改良法包括由含有有機酸的水可溶性鹽的 組合物形成前述移動相。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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