TW458767B - Combined en bloc staining and embedding process - Google Patents
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五、發明說明（】） 發明贵景 鏡檢目二：：：ί光及電子顯微鏡檢兩者的穿透式顯微 把樣品進行一系品及其他材料的製備’正常地是藉由 的產生，而將樣品導致一固體基塊(block) 動地在商業 於其中。正常地，此操作步驟是自 置，伴n :且織處理器中執行’其為複雜的機械裝 昂貴的，：ί Ϊ制及流體傳遞系統。其複雜性使得它們是 疋龐大的及固定的裝置，並不便於攜帶。 -裕·^ :之組織製備方法中，是先將組織以福馬林、戊 料固定，，使得樣品堅固並增加其通透性’肖此我增刀強解二； 液的滲透作用。後續的滲透步驟是 ’谷 的溶劑而逐漸置換，以移除樣===== 在-模子t，並且以額外的石壤圍繞，以產生υ = (tissue block)。微波爐已使用在組織學的實中: 以加速不同物質的滲透。 至甲 用 除了石蠟外，塑膠也廣泛地使用於產生组 膠可以是甲基丙烯酸醋、環氡樹脂聚合 相^ ^塑 =論如…織是以大約相同於在石法 來處理…且織中的水分是以有機溶劑取代，接 第4頁
唤58767 五、發明說明（2) 體聚合物取代。在曱基丙烯酸酯及其他水溶性聚合物的例 子中’脫水的方法可大幅的縮短或排除。通常，以塑膠滲 透的樣品疋發生在一小容器中’其也作為具有過量聚合物 的包埋模子，此聚合物滲透並圍繞著樣品，因此，療透作 用^及包埋作用是結合在—起的。聚合物之混合的前驅物成 伤，藉由各種方法而使其固化（聚合），包括曝露於紫外 光、熱之下，或添加化學催化劑。塑膠操作方法已為光學 及電子顯微鏡檢所接受。 另外’在冷凍切片方法中’新鮮之未固定的組織，迅 速地包埋在一澄清的、水溶性的、半固態的介質中，例如 O.C.T.化合物（Miles公司，Elkhart， IL)，並快速地冷 凍。實施此技術以保存某些組織成份，其可能對極端的溫 度及化學環境（例如’抗原）敏感，或著當组織的顯微鏡檢 必須快速完成時，例如，在一些類型的癌症手術的期間。 ^像上述之Μ固定的"技術’在冷；東切片方法中，水分並 J j I織中萃取出來’反而是保留下來，肖包圍的包埋介 起冷4’形成-固體基塊。這個操作的時 t沒有給參透作用/包埋的介質留下機會用以 4 所以”地’此介質是純粹地作為一支持性的功能 在習知的光學及電子顯微鏡檢中，於某 伴隨著圍繞的包埋材料的樣品之薄切片後， =到玻片或其他支持物。组織切片接 色的或螢光的染料而染色，以用於檢梘 ：：有 包埋的材料在染色前以化學方法移除。 二技術中，
458767 發明說明（3) 另外’用於總體染色的 作用及包埋作用之前，完整 切片從基塊上切割，用於穿 的切割表面本身被顯像。 雖然在一些例子中，已 驟，但組織的染色卻一直是 發明概沭 方法已被引入，其中’在滲透 的樣品藉由沈浸而染色。接著 透式電子顯微鏡檢，或著基塊 結合滲透作用及包埋作用的步 分開地實施。 一般而3 ，本發明特徵為用以製備一有機樣品的方 '，例如，生物組織樣品，用於切割及後續的檢視；此方 法牽涉到結合組織學的染色、滲透作用及包埋作用至單一 的步驟。因此’根據本發明，將樣品沈浸在一組成物，其 包括、.（a) —滲透物質；（b) 一包埋物質，可相同於或不同 於廣透的物質；以及（c) 一化學上與有機樣品結合的染色 :田結合及當不結合樣品時，其顯示不同的可偵測性 在沈浸到此組合物之前，如果不是冷凍的切片，此樣 品較佳地是以一化學固定劑處理。 _；此方法較佳地是使用對環境靈敏的螢光染色劑或染 料，當化學地鍵結或結合至樣品時，其表現一特異的顏色 或波長，但當與包埋介質混合，而樣品不存在時，其不會 表現相同特異的顏色或波長，或著當沒有與樣品結合時， 其不會表現顏色。這使得要清楚地從包埋材料中，區分組 織或其他包埋在基塊中的樣品材料是可能的。 如此處所使用的，名詞’’化學固定劑"是指一化學溶 液，其保存、滲透及協助硬化樣品。"滲透的物質，’是指一
第6頁 五、發明說明（4) 後^ Ϊ ^的液體，其渗透整個組織至分子的層次’然 ^ ，、’固體，以使樣品堅固。"包埋的”或π包埋作 用疋指將滲透的細铀妫石丨—楛_2L + , h W，.且織放到楔子中，亚以一物質圍繞之 二吊疋相同於滲透的物質），其接著硬化以形成一包圍的 巷塊。包埋的物暫m @w κ 質因此作為提供堅固的支持物’並且使得 切割的過程容易會竑。„ +η ΰ Η ρ ^ u ^ ^ ^ % 切片疋指從基塊切割之薄的切 —士，、接者可鑲嵌在玻片或其他支持物上。"染色，，是指以 土的（包括螢光)物質處理組織，其在分 次上 爽結合。 或勺f = 11的’非對環境靈敏的染色劑或染料，與滲透 織5 f 貝扣合’將造成包埋的介質表現出類似於由組 之門斟？沾ϊ ί*或波長，導致在樣品及滲透/包埋的介f 之間對比的喪失。 微籍漆透/包埋的材料之結合，減少製造用於顯 r X:吨匕里組織所需之反應步驟的數目。本發明因此使 昂！之自動化組織操作裝置的產生是可能 a χ —-人，使得真實可攜帶的組織病理實驗室 =可:的。例如，本發明所製造之一緊密壓縮的、野外用 的儀盗，將可廣泛地使用在野戰醫院、環境科學研究、流 订病^十晝’以及其他特殊的環境，例如太空船。在一般 診戶Π:這樣的裝置可納入至小的附屬實驗室中，例如目 前在酉師辦公室中所操作的裝置一般。在此裝置中，他們 可減少浪費及週轉時間於臨床診斷的傳遞，並且在整個醫 療成本上產生大的影響。
第7頁 五、發明說明（5) -------- 田自動化的基塊切片器及影像獲得系統，例如 Surfsce Ιπΐ3.ρ·]ηΓτ μ* /', vng Microscope(吳國專利第 4, 960, 33 0 號， 2 : : Γ為參考賁料）結合時，合成的綜合系統將接受如 傳實驗室的生物檢體（其中，此生物檢體通常已 以八疋对=理過），並產生一診斷級的影像，而不須人力 的/1入這可大幅地減少牽涉到獲得組織病理的診斷之成 本及遲延。 本發明的另一個形態特徵為冷凍切片組織製備方法， ^ ^冷/東延遲約3到6 0分鐘的期間，超過習知的時間（也 就疋，立即冷凍），以致於發生滲透作用藉由介質而進入 組織，使得結合的染色劑/滲透/包埋方法是可能的。 本發明的其他特徵及優點’將從以下較佳實施例之說 明以及申請專利範圍中，將變得顯而易見。 之詳細説明 如以上所提的’本發明使用數種成份，現在更進一步 地詳加討論。 j料（染色杳p 本發明所使用的染料分類為”對環境靈敏性的，，或”異 染性的（metachromatic)11。 對環境靈敏性的染料構成一組組織化學的染色劑，其 中有許多是螢光的。像大部分的螢光色素，這些化合物吸 收特殊波長的光’並且將其以/較長的波長再發散出來。 軒環境靈敏性的染料之光譜性質’是藉由它們的鄰接標的 分子而強烈地影響，使得他們發散的波長改變。因此，當
五、發明說明（6) ' ' — --------- ^ 類型的材料結合時，這些染料會改變顏色。在—些 士疏企’對環境靈敏性的染料僅有在當結合至其標的物時 才^光’否則是不可見的。 以丙對％境靈敏性可藉由許多化學機轉而得到。它通常是 ^ 料結合至聚陰離子（polyanions)而顯現’在此 j t ’杂料可經過各種聚合的狀態，而顯著地改變其光學 盆壯人—用的染色劑0丫咬撥（acridine orange)，可根據 八、’° &的分子類型，表現3種之多的不同顏色。吖啶橙是 組核酸特異性的染色劑中的一種，當沒有結合到DNA或 RNA^時’這些染色劑中有許多是缺乏螢光的，並且因此是 相當4地對環境靈敏的。其他的實例是DAP I (4,，6-二眯基 2 笨基吲 π染（4’，6-diamidino-2-phenylindole))以及 Hoechst 染料33258 和33342 。 另外’染料本身的共價結構也會改變：例如，苯並喔 一吐（benzoxadiazole)衍生物連接到在特定標的化合物上 的疏基（thiol)產生硫醚，其相較於自由的染料分子，顯 示較短的吸收及發散波長。化合物的實例如芘順丁烯二酿 亞胺（pyrene maleimide)以及 >臭雙曼- (bromobimane-)相
關的染色劑’其在未結合的狀態下，幾乎沒有顯示螢光， 但當結合至出現在許多蛋白質的毓基時，卻顯現活化的發 散。 X 螢光色素染料的顏色’可敏銳地對於環境的極性敏 感，相較於出現在標的物的較親水性區域中，這樣的染料 分子’當連接到蛋白質的厭水性區域時’將顯現可僅測的
第9頁 五、發明說明（7) --- 不同之顏色極陡的靈敏性是從染料acryi〇dan和badan， 以及與一般對裱境靈敏的染料pR〇DAN(6_丙醯基〜2_二甲基 胺基萘）中衍生出來的。 對環境的靈敏性也可導源於一榮光色素染料經由營 光共振能量傳遞的現象，而鄰接到第二營光色素染料。個 別的染料分f ’其互相靠近標的分子（大約5〇埃（幻），將 會能量上地交互作用，改變它們的發散特性^此效果已被 使用作為一靈敏性的工具，以測量原子大小的距離，例如 用於肌肉的研究中。 許多適合的對環境靈敏的染料，可從分子探針公司購 得（Molecular Probes, Inc·, Eugene, OR);這些染料及 目錄’可從（ 800 )438-2209的電話中獲得。這些染料中的 大部分是公告的美國專利的主題，其所有的内容在此處納 入為參考資料。分子探針公司生產之對環境靈敏的染料， 其中易於標定蛋白質者是登記在以下3個範_中：笨並噪 二°坐衍生物、萘衍生物以及芘衍生物。 钇埋的介皙 渗透及包埋的介質（其通常是，但不必須是/種物質） 必須與染色劑及染色劑的作用機轉相容。因為本發明所使 用的對環境靈敏的染色劑是親水性的染料，其必須滲透樣 品並與樣品化學結合，滲透/包埋的介質也必須是可與水 混•溶的。不溶於水的聚合物是不被接受的，例如使用在— 些組織學應用的聚合物’因為它們並無染料與介質的混溶 性’而這個混溶性對於一步驟的規劃是必要的。此外，渗
第10頁 458767 五、發明說明（8) 透/包埋的介質是不可終止連接到組織的染料（也就是，不 可抑制染料的螢光發散）。所有這些相容性的問題，可藉 由簡單地混合成份的組合並觀察結果，而可容易地及例行 地解決。 適合的親水性滲透/包埋的聚合物之實例，以及其製 備和使用的方法，是提供於Car s〇n (參見其著作）。一些適 合的介質是水溶性的墩，例如Carbowax(Union Carbide Corp·，Danbury，CT.)、曱基丙烯酸乙二醇酯（glycol methacrylate)、以及瓊脂/ 動物明膠（agar/gelatin)。 一般而言，本發明之在一步驟組成份中的各成份，是 以兩個方式中的一個來混合：（丨）將各成份加到一混合容 器中’混合’然後倒到含有樣品的模子中，或（2 )在將要 加入樣品之前，將各成份在模子中混合，再加入樣品。混 合是以任何習知的方式進行。 實施例 以下的實施例僅作為舉例說明之用，並非用以限制申 請專利範圍之範疇。 實施例1 一個一步驟的組織製備组成份，其中，在樣品中的蛋 白質要被染色，此組成份包含下列成份： ‘料Λ子探針公司的單溴雙曼（monobromobimane) 染色劑，最後在配方中的濃度為〇. 〇2 %。渗透/包埋的介 質.完全效力的甲基丙烯酸乙二醇酯催化的滲透樹脂 (JB-4, Polyscience, inc>i Warrington, PA) 〇
458 7 6 7 五、發明說明（9) 上述的成份在100毫升棕色玻璃容器中，在室溫下溫 和地混合6 0分鐘。將組織樣品置於1 0毫升小管的配方中， 並在4 X：旋轉混合24小時。此滲透的及染色的樣品接著傳 送到具有過量配方的2毫升包埋膠囊，以5, 〇〇〇轉/分鐘 C rpm)離心1 〇分鐘，使樣品容易沈澱下來，並使其在室溫 下聚合（大約1小時）。切片從切片機上硬化的基塊切割下 來’鑲嵌在玻片上’並且在螢光顯微鏡下檢視。 實施例2 一個一步驟的組織製備組成份，其中，在樣品中的核 酸要被染色，此組成份包含下列成份： 染料：吖啶橙’最後在配方中的濃度為0.0 5 %。滲透 /包埋的介質：Carbowax。 上述的成份在1〇〇毫升棕色玻璃容器中，在56到58。〇 溫和地攪拌混合6 0分鐘。維持這些條件，將組織樣品置於 配方中，並以缓慢的旋轉混合6小時。此滲透的及染色的 樣品接著傳送到包埋模子中，並使其在冷卻盤上固化。切 片從切片機上的基塊切割下來，鑲嵌在玻片上，並且藉由 電腦化的螢光顯微鏡顯像D將這些影像以數位化的濾鏡處 理’根據染色的差異性呈色性質而移除所有非核酸的訊 號’包括移除源於介質的任何訊號。另外，先前的 Carbowax藉由添加能吸收的染料而變得不透明，並且顯像 基塊表面的切割面’消除破片的影像（如說明在美國專利 第4,960,330號中的方法）。 實施例3
第12頁 五、發明說明（10) " 一一·- 一個一步驟的組織製備組成份，其中，在樣品中的一 般·.且織元素要被染色，卩用於内部操作的診斷，此組成份 包含下列成份： ^ ^ η 1(4，6~二脒基·~2~苯基吲哚），最後在配方 π尬ΐ 2 2 % (用於染核醆）；與0. 1 %的芘順丁烯二醯 化合物 μ入p取终濃度為0'i%(用於染蛋白質）。滲透/包埋 的介買_ 0. 〜 切σ σ上述的成份在1〇〇毫升棕色玻璃容器中’在室溫 下《和地援拌1小時。從病患直接取得新鮮的組織樣品， I 2遇I 4的配方中’並在實驗室微波爐中緩慢旋轉混合3〇 分鐘’使其容易滲透。此滲透的及染色的樣品接著放置在 金屬塾塊上’並且在放到_2〇〇c冷凍之前，以額外的配方 圍繞之i所得的冷凍基塊在低溫恆溫器中的切片機上切 片，鑲砍在玻片上，並且以數位化的螢光顯微鏡檢來内 操作的診斷。
Claims (1)
- _贫丨#案號88115898_c^年 4月？g曰_修正;^_ 六、申請專利範圍 1. 一種製備有機樣品的方法，該方法包括： 將一樣品沈浸至一組成物中，藉此獲得一適於切割及 後續檢視之包埋樣品，該沈浸組成物包括： 一滲透物質，包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物 或墙； 一包埋物質，可以是相同於或不同於該滲透的物質， 包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物或蠟；以及 一染色劑，化學上與該有機樣品結合，其中，當結合 及當不結合該樣品時，其顯示不同的可偵測性質，以及該 染色劑係選擇自螢光色素、核酸特異性的染色劑、對極性 敏感的染色劑、笨胺染色劑、笨並π惡二β坐衍生物、萘衍生 物及芘衍生物所組成的族群中。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該滲透及包埋 物質是相同的物質。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，當結合及當 不結合該樣品時，該染色劑顯示不同的顏色或螢光波長， 或著當只與該樣品結合時，其顯示一可偵測的顏色或波 長。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該樣品包括生 物組織。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中，當與該樣品 化學結合時，該染色劑以一預定的波長發出螢光，並且當 沒有與該樣品結合時，其不會實質上地發出這樣的螢光。 6. —種組織學組成物，有助益於製備有機樣品，用於 切割及後續的檢視，該組成物包括：l〇e4-2751-PF2ptc 第14頁 _案號88115898_年月曰 修正_ 六、申請專利範圍 一滲透物質，包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物 或蠟； 一包埋物質，可以是相同於或不同於該滲透物質，包 括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物或礙；以及 —染色劑，化學上與該有機樣品結合，其中，當結合 及當不結合該樣品時，其顯示不同的可偵測性質，以及該 染色劑係選擇自螢光色素、核酸特異性的染色劑、對極性 敏感的染色劑、笨胺染色劑、笨並-惡二啥衍生物、萘衍生 物及芘衍生物所組成的族群中。 7. —種製備有機樣品的方法，用於切割及後續的檢 視，該方法包括： (a )沈浸該樣品至一組成物，該组成物包括： 一滲透物質，包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物 或蠟； —包埋物質，可以是相同於或不同於該滲透物質，包 括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物或螺；以及 一染色劑，化學上與該有機樣品結合，其中，當結合 及當不結合該樣品時，其顯示不同的可偵測性質，以及該 染色劑係選擇自螢光色素、核酸特異性的染色劑、對極性 敏感的染色劑、笨胺染色劑、苯並噁二唑衍生物、萘衍生 物及芘衍生物所組成的族群中；然後 (b )冷凍該樣品。 8, 如申請專利範圍第1項之方法，其中在沈浸組成物 硬化之前，將該樣品及沈浸組成物轉移至—包埋模子中。 9. 一種製備有機樣品的方法’該方法包括：]0B4-275!-?F2-ptc 第15頁 案號 88115898 _η 曰 修正 申請專利範圍 將一樣品沈浸至一組成物中，該沈浸 於水的聚合物 一潜透物質，包括可溶 或蠟；以及 一染色劑，化學上與該有機樣 及當不結合該樣品時，其顯示不同 染色劑係選擇自螢光色素、核酸特 敏感的染色劑、笨胺染色劑、苯並 物及芘衍生物所組成的族群中。 1 0.如申請專利範圍第9項之方 更包括一包埋物質，其可以是相同 質。 Π .如申請專利範圍第9 將染色及滲透的樣品沈 —適於切割及後續檢視之包埋樣品 品結合 的可偵 異性的 噁二唑 法，其 於或不 項之方法，更 浸至一包埋物 組成物包括： 、0· C. Τ.化合物 ，其中，當結合 測性質，以及該 染色劑、對極性 衍生物、萘衍生 中該沈浸組成物 同於該滲透物 包括下列步驟： 質中，藉此獲得1 1 0 84-275 1 -Ρ72- ptc 第16頁458767 修正 案號 88115898 四'中文發明摘要（發明之名稱：結合之整體染色及包埋方法） —種用以製備有機樣品’用於切割及後續的檢視之方 法’牽涉到沈浸此樣品至一組成物，此組成物包含：一滲 透物質；一包埋物質’其可以是相同於或不同於該滲透的 物質；以及一化學上與此有機樣品結合的染色劑，其中， 當結合及當不結合此樣品時，此染色劑顯示不同的可偵測 性質。 英文發明摘要（發明之名稱：COMBINED EM BLOC STAINING AND EMBEDDING PROCESS) A method for preparing an organic sample for cutting and subsequent examination, involving immersing the sample in a composition containing: an infiltrating substance; an embedding substance, which can be the same or different from the infiltrating substance; and a stain that chemically associates with the organic sample, wherein the stain exhibits different detectable properties when associated and not associated with the samp 1 e.1084-2751-PF3.ptc 第2頁 _贫丨#案號88115898_c^年 4月？g曰_修正;^_ 六、申請專利範圍 1. 一種製備有機樣品的方法，該方法包括： 將一樣品沈浸至一組成物中，藉此獲得一適於切割及 後續檢視之包埋樣品，該沈浸組成物包括： 一滲透物質，包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物 或墙； 一包埋物質，可以是相同於或不同於該滲透的物質， 包括可溶於水的聚合物、0. C. T.化合物或蠟；以及 一染色劑，化學上與該有機樣品結合，其中，當結合 及當不結合該樣品時，其顯示不同的可偵測性質，以及該 染色劑係選擇自螢光色素、核酸特異性的染色劑、對極性 敏感的染色劑、笨胺染色劑、笨並π惡二β坐衍生物、萘衍生 物及芘衍生物所組成的族群中。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該滲透及包埋 物質是相同的物質。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，當結合及當 不結合該樣品時，該染色劑顯示不同的顏色或螢光波長， 或著當只與該樣品結合時，其顯示一可偵測的顏色或波 長。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該樣品包括生 物組織。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中，當與該樣品 化學結合時，該染色劑以一預定的波長發出螢光，並且當 沒有與該樣品結合時，其不會實質上地發出這樣的螢光。 6. —種組織學組成物，有助益於製備有機樣品，用於 切割及後續的檢視，該組成物包括：l〇e4-2751-PF2ptc 第14頁
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