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經濟部t央揉準局貝工消资合作社印裝 A7 _B7_五、發明説明（ϊ ) 本申講案為申講人於1990年3月10曰提出申諳之先前申 謫案第0 7/493,453號之部份繼讀申請案。 發明之背景 本發明係闞於來自蘇雲金芽孢桿菌，尤其是蘇雲金芽孢 捍菌之多基因菌株，之殺蟲蛋白質之鑑別、定量及純化。 蘇雲金芽孢桿菌（下文簡稱為Bt)為革蘭氏陽性土壤细菌 ，其特激為於生成芽孢時能產生大量结晶性類芽孢包涵艟 。此等包涵體由顯示高度特異殺蟲活性之蛋白質（原毒素） 組成。 已經鑑別出許多具有不同殺嶷範圃之Bt。許多菌株對於 鱗翅目之某些成員之幼蟲具有活性（至目前為止，已鏟定 出Bt菌株對100種以上的鱗翅目昆蟲有活性），亦已知此等 ~菌株對於雙翅目及鞘翅目昆蟲有毒性。 已證實類茅孢包涵體為習用殺嶷劑之有價值替代品。它 們對於檷的昆蟲具有極高毒性，但由於其具專一性，所以對 環境無害。其他目昆蟲、動物及植物'顯然不受該毒性结晶 蛋白質影#。Bt之各種配方被用做生物殺蟲劑Μ控制農田 及森林中害蟲已達二十年Μ上，最近，其被用於控制各種 人類及動物疾病之昆蟲媒介。 Bt產生各種類型之毒素，彼等之確切生化性質鼸菌株之 不同而變化。彼等中有一些，尤其是α-及/3-外毒素，對 於多種昆蟲目或許多细胞類型有毒性。類芽孢结晶包涵體 毒素（亦稱為5-内毒素，為蛋白質），具有較限定及特異 的宿主範困。Bt之结晶包涵體，當被幼蟲攝食後，會溶解 ------；-----^ ^------tr------η (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 4 83.3.10,000 A7 B7 經潦部中央揉隼局員工消費合作社印袈 五、 發明説明 ( 〇 i 一 ) 1 在 幼 巖的W 中 t 並 在 昆 春 中 勝 中 迅 速 進 行 蛋 白 質 分 解 而 _ 1 !/ 換 成 較 小 的 毒 性 多 肽 (分子量範圍為23- 80KD)( >所產生之 1 1 毒 素 物 種 與 宿 主 毘 蟲 之 中 臈 上 皮 m 胞 交 互 作 用 f 於 是 在 细 請 1 先 1 胞 膜 上 產 生 小 孔 並 擾 亂 了 滲 透 壓 平 衡 〇 上 皮 细 胞 膨 脹 及 溶 閲 讀 1 背 1 解 0 幼 蟲 因 此 停 止 進 食 » 最 後 終 於 死 亡 〇 已 證 實 在 易 感 性 面 之 1 注 1 昆 蟲之中腸 上 皮 细 胞 上 存 在 對 Bt 毒 素 具 特 異 高 親 和 力 之 结 合 意 事 1 項 I 部 位 此 可 Μ 說 明 此 等 毒 素 .具 高 度 特 異 性 的 原 因 0 再 填 Λ 寫 近 年 淅 清 楚 了 解 Bt 提 供 m 人 應 大 且 多 m 的 殺 蛋 白 質 家 本 頁 1 族 0 使 用 數 種 實 驗 方 法 所 得 到 之 数 據 頭 示 對 鱗 翅 百 有 毒 性 1 ι 之 Bt 之 許 多 亞 種 之 结 晶 蛋 白 質 基 因 位 於 一 種 或 Μ 上 大 型 質 1 I 體 上 在 一 些 亞 種 中 基 因 可 位 於 染 色 體 上 〇 编 碼 Bt 原 毒 1 1 訂 素 之 基 因 通 常 由 霣 體 瓣 帶 之 事 實 使 得 B t成 為 基 因 m 作 之 * 1 '良 候 選 人 〇 此 造 成 最 近 產 生 能 衷 現 Bt 结 晶 蛋 白 質 基 因 之 對 1 1 昆 蟲 有 抗 性 之 移 轉 基 因 農 作 物 0 1 1 近 年 亦 已 清 楚 了 解 許 多 Bt 菌 株 含 有 数 種 緊 密 相 級之 原 毒 1 > 素 编 碼 基 因 〇 舉 例 之 Bt V a r Ku Γ S t a k i NRD -1 2為三 三基 i I 因 菌 株 0 數 個 此 等 基 因 之 存 在 使 得 單 一 Bt 菌 株 能 生 產 種 数 1 1 胺 基 酸 序 列 彼 此 密 切 相 闞 之 原 毒 素 〇 蛋 白 質 分 解 酶 對 此 等 1 I 原 毒 素 之 混 合 物 之 作 用 不 論 在 試 管 中 或 在 昆 蟲 中 腸 中 均 1 » «1 會 產 生 数 種 毒 素 此 等 毒 素 只 有 少 數 胺 基 酸 殘 基 不 同 因 1 此 使 得 所 得 到 之 毒 素 混 合 物 難 >λ 分 雄 0 不 過 由 於 此 等 小 1 1 差 異 通 常 發 生 在 毒 素 序 列 之 關 鍵 區 9 因 此 可 能 造 成 對 遵 定 1 1 昆 蟲 標 的 具 有 明 顯 不 同 的 毒 性 〇 由 於 Bt 之 多 基 因 菌 株 所 產 1 1 生 之 毒 素 混 合 物 之 姐 成 或 個 別 毒 素 之 表 現 程 度 可能 隱 發 酵 1 1 本紙張尺度適用申BS家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83.3.10,000 ·、3:;·'ι 經濟部中央揉準局負工消費合作社印装 A7 B7五、發明説明（3 ) 條件而變，所Μ其對各種昆蟲之相對毒性亦會隨之而變， 结果多基因Β1;菌株之宿主範圍也随發酵條件而變。所Μ監 測及定量在内毒素结晶中之不同毒素Μ調整多基因生產者 生產最期望毒素之條件得十分重要。 先前技藝已知多種自Bt各種菌株之δ -内毒素纯化殺蟲 毒鬵之方法。所建議之方法包括用蛋白質分解酶諸如胰蛋 白酶或昆蟲消化液消化B t之结晶包涵體，缗而藉各種分析 方法諸如電泳、凝膠過滅及離子交換層析分離水解產物。 不過，此等方法中.無一顯示能分離及純化得自Bt多基因菌 株之密切相鼷毒素。 同樣地曾提議多種定性及定量Bt菌株之特激之方法。其 包含，例如，银毛抗殖之使用，用DNA探針探尋基因，或 '測量RNA生產量。此等方法，雖然在定特激及分類上有用 ，但在定量基因素現及監測既定菌株之生活力或對涸別毒 素訂出分析殺蟲活性、協同作用、膜研究或昆蟲抗性之摞 準上不令人滿意。 更特定而言，在 Fullmer*，C.S.及 Vasserman，R.H.:藉 高效液相層析得到之分析用肽圖譜一應用腸之鈣-结合蛋 白質，J. Biol. Chem. 254, 7208-7212(1979)中，述及 一製作肽圈譜技術，其包含徹底酶消化Μ提供肽之混合物 。肽混合物之分析賴逆相層析進行，連帶使用酸及有櫬溶 劑0 在另一參考文獻[Yamamoto, T.:藉高效液相層析術鑑 別蘇雲金芽孢桿菌之殺蟲毒素* J. Gen. Microbiol· 129 本紙張尺度遑用中國國家揉隼（CNS)A4規格（ 210X297公釐）. -6 - 83. 3.10,000 (請先閲请背面之汰意事項鼻填寫本頁) B7 五、發明説明（4 ) (請先S請背面之注意事項再填寫本頁) ，2595-260 3 ( 1 983)]中，述及用輿Fu liner等人相同之方 法製作肽圖譜。舉例言之，見2601頁’鬮4下第5行，其述 及「代表蛋白_抗性中心之高峯不可能被定位」。其強諝 使用有機溶繭不是會永久降低或完全破壤毒素之生物活性。 又在另一參考文獻[Yamanoto，T·，Ehmann，A., Gonzalez, J.M. <1「，及 Carlton, B.C.:在..蘇霉金芽抱擇 菌科斯塔基（Kurstaki)亞種中锻碼135仟道爾頓殺蟲蛋白 質之三基因之表現，現代生物學17，5-12(1988)]中，亦 遵循相同的肽鬮譜製作法。在該參考文獻中，原毒素於進 行胰蛋白酶水解之前被預純化。水解之後，毒素混合物在 尿素中被變性及藉胰蛋白酶再次消化’然後用逆相”“製 作肽匯譜（肽被溶於酸中及用酸/乙腈混合物溶析。如上述 ，其破壊毒素之生物活性。不幸地，所得到的肽圖譜，若 用單基因棵準判讅多基因菌株之结果，將無法在Kurstaki HD-1菌株中査知cr*yIA(C)[b.6]基因產物之存在。而其他 研究者報告該基因及其蛋白霣毒素為重要組份° 經濟部中央揉率局属工消費合作社印装 再者，在Hernstadt, C.及Wilcox E.之美國專利 4,853,331號（1989年）「對鞘翅目之甲蟲有赛性之蘇雲金 茅孢桿菌毒素基因之選殖及表瑰」中，述及單一基®^遘殖及 薄大腸桿菌宿主细胞生產轚一 Bt蛋白質。該毒素藉親和層 析純化。 相反地，上述技術中無一提供在保留Bt基因所表現之原 毒素之生物活性下，鑑定、定量及純化該毒素之方法°事 實上，此等參考文獻具有不同目的，亦即其目的係製作肽 本紙張尺度逋用中國國家揲隼（CNS ) A4规格（210X 297公釐） -7 83.3.10,000 I 0 ^ L.85. 8. 〇魴_

"一 " I 經濟部中央標準杓Μ工消t合作社印狀 五、發明説明 (5 ) 1 1 in m 素 之 生 物 活 性 被 破 壞 沒 有 關 \k 〇 不 過 {£ 本 發 明 1 1 屮 .-1!： t咕 素 之 生 物 活 性 必 須 大 體 保 留 兀 整 所 以 我 們 不 能 1 使 用 先 J1U 技 m 技 術 使 用 之 逆 相 Η P L C 技 術 0 請 1 1 先 1 發 明 之 簡 要 說 明 閱 讀 1 背 1 本 發 明 提 供 一 種 鑑 定 由 蘇 雲 金 牙 孢 桿 菌 越 因 所 表 現 之 原 ιέ 之 1 注 | 素 V 方 法 該 法 包 含 意 事 1 _ 將 含 U 雲 金 *· * 牙 孢 桿 Μ 基 因 之 物 質 用 蛋 白 質 分 解 酶 在 pH 項 再 1 «JL. 值 為 1 0 -1 2之水性懸浮液屮水解 Μ產生溶解之子诲素 本 頁 1 一 子 毒 素 在 pH值 大 致 維 持 在 1 0 至 12之 範 圍 内 及 水 性 條 、- 1 件 下 ill / — 仃 高 效 陰 離 子 交 換 液 相 層 析 其 中 使 用 只 含 有 — m 1 1 緩 衝 劑 之 第 一 溶 析 劑 Μ 及 於 預 定 時 間 逐 漸 加 入 至 少 一 種 含 1 I 有 溶 祈 劑 及 適 當 塩 之 其 他 溶 析 劑 溶 析 劑 中 塩 濃 度 m 時 間 1 訂 | 之 改 交 為 能 使 生 物 活 性 狀 態 之 子 m 素 與 他 水 解 產 物 分 離 1 1 者 以 及 1 ! — Η 子 毒 素 產 生 之 層 析 訊 號 鑑 疋 原 m 素 需 要 時 亦 可 予 | 以 定 S 〇 應 Υ 解 術 語 厂 子 毒 素 J 可 涵 蓋 原 主 母 素 之 混 合 物 或 個 別 原 1 1 ..：t£ m Μ 其 視 原 料 而 定 〇 因 此 當 使 用 Bt 之 多 摇 因 菌 株 時 得 1 I 到 原 素 之 混 合 物 當 使 用 Bt 之 單 骓 因 菌 株 時 得 到 單 — 1 1 1 原 m 〇 1 因 此 根 據 本 發 明 Μ 已 發 琨 _. 方 法 其 能 將 宋 i B t 之 1 多 基 闪 菌 株 之 密 切 相 關 毒 素 VX 生 物 活 性 狀 態 分 離 鑑 定 及 1 i 純 ib t 根 據 本 發 明 之 方 法 將 來 自 例 如 Bt 之 多 基 因 Μ 1 1 株 之 純 化 蛋 白 質 結 晶 或 祖 製 發 酵 混 合 物 於 pH 值 為 約 10至 約 1 1 1 2 下 (Ml 0 . 5為較佳） 直 接 接 受 蛋 白 分 解 酶 之 作 用 〇 該 蛋 I 1 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） _ g _ 修正頁 297838 燊.-Λ·:,.-.; I: 經洚部中夬樣率局員工消炉合作社印装 ----¾ A7 B7五、發明説明（G ) 白質分解消化導致毒素之釋出，將該毒素用陰離子交換柱 於pH值為10 J1 2下（以10.5-11.5為較佳）進行陰離子交換高 效液相層析（HPLC)。毒素之溶析用具適當pH值且含呈梯度 增加之、塩（較好為氛化納）之緩衝溶液進行。該步驟提供一 層析圖譜，其顯示可清楚鑑別之毒素所特有之高峯’因此 得Μ對原始混合物作定性及定量分析。分離製程可用半製 備或製餚用層析柱按比例進行，因此允許分離大量的純活 性毒素。 雖然本發明最常被用在從Bt之多基因菌株得到之毒素温 合物分離或鑑定個別毒素，但本發明亦可被用於定之軍 基因菌株所得到之單一毒素之特激。當來自之單基因或 多基因菌株之毒素分別被定特戡時，Bt之菌株亦被定特敢。 根據本發明，亦可測定得自已知菌株之已知毒素之表 現度Μ及監測菌株之生活力。 圖之簡單說明 画1代表根據本發明之較佳具賸例，使用蛋白質ΡΑΚ DEAE 5 PW半製備用層析柱層析分離之梯度吠況。 圖2代表於_1所示之梯度吠況及用胰蛋白酶消化Bt v a r . K u r s t a k i NRD-12菌株之類芽抱结晶下’用蛋白質 PAK DEAE 5 PW半製備用層析柱得到之層析圖。 圈3，4及5分別代表於圖1之梯度狀況下，於分離後分別 再注射入圖2之組份B，C及D之曆析圈。 圖6代表根據本發明之另一較佳具體例，使用Mono Q »析柱層析分離之梯度狀況。 (諍先閲請背面之注意事項再填窝本頁) 訂 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CMS ) A4规格（210X297公釐）.-9 83. 3.10,000 ...ϋ.-.-1.· · . 經脊部t央揉窣局貝工消费合作社印装 .1 1 A7 B7五、發明説明（7) 匾7代表圈6所示梯度狀況及用胰蛋白酶消化Bt va「. Kurstaki NRD-12菌株之類茅孢结晶下，使用Mono Q層析 柱所得到之層析圖。 圖8代表圖9所示層析分雜之梯度狀況。 圖9代表與圖2所示者相似之層析圖，其係於圖8之梯度 狀況下甩蛋白質PAK DEAE層析柱得到（毒素輋未予解析）， Μ及 圖1fe 承 1 琴系 B t var . Kurstak i NRD-12菌株之 3種 毒素之胺基酸序列以及自分離之單一蛋白質毒素鑑定到之 肽Η段。 較佳具髓例之說明 根據本發明之一具體例包含下列步驟： ' a )自發酵混合物純化B t內毒素结晶； b )用蛋白分解酶直接消化结晶；Μ及 c)用陰離子交換HPLC分離水解產物。 雖然被蛋白質分解酶消化之物筲通常為自粗製發酵混合 物純化得之结晶性内毒素，但該純化雖然較佳，但非必需 。在陰離子交換HPLC溶析圖譜中毒素所特有之可辨別高峯 亦可用酶消化前之發酵醪所分離到之粗製Bt物質得到。 然後將純化结晶或洗過之粗製物質直接用蛋白質分解梅 (諸如胰蛋白《、胰凝乳蛋白酶或彈性酶）水解。胰蛋白酶 為較佳梅。昆蟲腸液，諸如來自绦蟲（Bombyx mori)之勝 液亦有效。各待定酶由於對內毒素蛋白質具有獨持的特異 性，因此產生略微不同的毒素組。可使用市售酶製劑。酶 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐）. ~ 1〇 ~ 83. 3.10,000 ------------^ ^------^------1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .--y'v

I A7 B7 經洚部中夬橾隼局身工^’合作杜印裝 五、 發明説明 ( 8 ) 1 1 m 之 澹 度 範 圍 為 〇. Γ-2牽克/ 奄 升 9 Η 1毫克/ 奄 升 為 較佳。 1 1- 1 用 蛋 白 質 分· 解 酶 消 化 内 毒 素 之 溫 度 並 不 重 要 可從20 1 1 變 化 至 40 t 以 約 37 為 較 佳 〇 水 解 之 時 間 亦 不 重要* 但 /«—X 請 1 1 先 l 應 長 至 足 >λ 確 保 在 既 定 pH值 、 溫 度 及 酶 濃 度 下 幾 乎完全 釋 閲 讀 1 背 1 出 毒 素 〇 對 胰 蛋 白 m 消 化 而 言 ， 消 化 之 時 間 為 約 10分鑲 至 面 之 1 注 1 12小 時 0 意 事 1 1 水 解 可 在 具 有 特 定 範 圍 pH值 之 未 媛 衝 或 缓 衝 溶 液中進 行 各 ά. Λ 窝 0 適 當 溶 液 之 例 有 3- 環 己 胺 基 -1 -丙磺酸/Na 0H缓 衝液 頁 1 (CAPS) 硼 酸 塩 媛 衡 液 或 未 缓 衝 之 Ha 0H溶 液 〇 並 非所有 溶. 1 1 液 均 同 樣 有 效 0 既 然 水 解 時 釋 出 之 毒 素 顯 然 為 疏 水性且 難 1 I 溶 於 水 中 溶 液 較 好 含 有 能 幫 助 毒 素 蛋 白 質 分 解 溶解之 組 1 1 訂 份 0 該 組 份 之 — 例 為 3- 環 己 胺 基 -1 -丙磺酸（CAPS)。較佳 1 、溶 液 為 pH 值 為 1 0 .5之 0 . 1 Μ CAPS/Na 0H 缓 衝 液 〇 1 1 水 解 後 將 反 應 混 合 物 之 固 鱧 組 份 移 除 例 如 藉觼心 及 1 遇 濾 0 濾 液 (上層液） 之 樣 品 被 用 於 HPLC 分 析 〇 小 丸藉對 比 1 η 顯 微 鏡 檢 査 時 應 不 含 任 何 可 辨 別 的 包 涵 膻 (為完全消化之 I 1 表 激 0 1 1 蛋 白 質 水 解 產 物 之 HPLC 分 離 提 供 一 指 紋 γ»τ _ 譜 藉其可 鑑 1 1 定 及 定 量 毒 素 〇 為 了 使 毒 素 具 有 足 夠 的 溶 解 度 分離必 須 1 .-I 在 pH值 不 低 於 約 10 之 下 進 行 9 較 好 於 10 .5 至 11 .5 之下進 行· 1 0 另 一 方 面 pH值 不 應 高 於 約 12 以 免 毒 素 變 性 及確保 層 1 析 柱 逋 當 操 作 〇 在 指 定 之 pH值 之 下 毒 素 分 子 m 負電且 分 1 1 離 >λ 液 相 -固相陰維子交換層析進行 =HPLC技術之使用使 1 1 得 分 離 能 在 短 時 間 内 達 成 0 1 1 本纸張尺度逋用中國國家梂準（CNS〉A4规格（210X297公釐）. -1 1 — 83. 3.10,000 297838 A7 B7 經济部中夬棣奉局貝工消旁合作社印製 五、 發明説明 ( 9 1 應 注 意 雖 然 根 據 本 發 明 之 毒 素 分 雜 可 在 所 示 寬 廣 範 圍 肉 1 ι· 之 任 何 pH 值 下 進 行 但 pH 值 增 至 較 佳 範 圍 (10 . 5至1 1 . 5) 之 1 1 上 會 增 加 被 分 離 蛋 白 質 變 性 之 危 險 Μ 及 對 層 析 柱 造 成 不 可 請 i 先 J 逆 的 損 害 0 另 一 方 面 pH值 降 至 10 .5以 下 增 加 毒 素 在 HPLC 閲 讀 1 背 1 層 析 柱 中 沉 澱 (至少部份沉澱） 之 危 險 沉 m 對 定 量 測 定 之 面 之 注 1 可 信 度 有 不 利 影 響 〇 基 於 此 等 理 由 t pH 值 在 約 10 .5 至 11 .5 意 1 l 之 範 圍 內 被 認 為 最 佳 〇 -S- Λ 寫 装 填 陰 離 子 交 換 劑 之 層 析 柱 被 用 於 分 雜 0 弱 及 強 陰 離 子 本 頁 1 交 換 劑 皆 可 被 使 用 0 >λ 弱 陰 離 子 交 換 劑 為 較 佳 0 Μ 二 乙 基 1 1 胺 乙 基 聚 (甲基丙烯酸甲酯） 為 持 佳 〇 1 I 毒 素 自 層 析 柱 之 m 析 係 在 室 溫 下 用 適 當 緩 衝 液 進 行 其 1 1 訂 中 增 加 塩 (諸如氛化納） 之 梯 度 0 所 用 之 缓 衝 液 負 責 使 溶 析 1 、劑 維 持 所 m 之 pH 值 〇 1 1 不 過 不 僅 是 缓 衝 液 之 pH值 缓 衝 液 之 組 成 對 成 份 分 維 1 I 亦 很 重 要 〇 在 較 佳 具 體 例 中 使 用 0 . 05H CAPS/Na 0Η 媛 m 1 气 液 (ρΗ = 10 .5 ) >不過應了解使用新穎溶析條件之替代媛衝 I | % 統 可 能 會 被 發 現 0 1 1 塩 之 梯 度 吠 況 對 所 用 層 析 柱 而 言 為 專 —* 性 的 〇 此 等 梯 度 1 1 通 常 藉 使 用 一 系 列 塩 濃 度 逐 漸 增 加 之 缓 m 液 及 按 預 訂 次 序 1 及 預 定 時 間 引 進 而 達 成 0 1 分 雛 所 用 之 塩 應 與 曆 析 柱 頗 強 的 结 合 但 不 應 與 被 分 維 1 之 蛋 白 質 结 合 或 對 其 有 不 利 影 響 〇 適 當 塩 之 例 包 括 氛 化 納 1 1 氯 化 鉀 氛 化 铵 及 乙 酸 納 〇 .亦 可 使 用 溴 化 物 及 碘 化 物 〇 1 1 Μ 氯 化 納 為 較 佳 0 — 些 塩 例 如 鈣 堪 會 與 — 些 蛋 白 質 结 1 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X 297公釐）. -1 2 - 83. 3· 10,000 A7 B7 經济部中央樣窣局爲工消費合作社印裝 五、 發明説明（ί〇) 1 合 及 影 響 蛋 白 質 之 性 質 〇 所 以 此 等塩 不適當。逋 當 塩 之 選 1 擇 對 精 於 本 技 藝 的 人 沒 有 問 題 0 1 1 根 據 本 發 明 之 最 佳 實 施 例 1 層 析柱 之溶析於水 解 後 分 二 請 1 先 J 階 段 實 施 〇 第 一 溶 析 液 為 0 . 05M C A P S / N a 0 Η 緩衝：液（p Η = 閲 請 1 背 1 11 .5 ) 第二溶析液為0 .05Μ CAPS/NaOH緩銜液及0 . 5M 面 之 注 1 Na CL (ρΗ = 11 .5 ) >二種溶析液被同時引進層析柱中 其方 意 1 | 式 為使第二溶析液於25至40分鐘期間呈0-3 3 %線性增加 ▲ Λ 窝 此 視 樣 品 之 性 質 而 定 0 該 步 m 之 後為 20-50分鐘之塩濃度 本 頁 1 恆 定 期 此 時 毒 素 被 溶 析 0 1 1 收 集 對 應 於 毒 素 % 之 溶 析 份 然後 將濃縮及再 注 入 層 析 I 1 柱 9 >λ 確 認 被 分 離 之 毒 素 及 其 純 度。 當使用半製 備 或 製 備 1 1 訂 用 層 析 柱 進 行 分 離 時 具 活 性 之 原始 毒素可被分 維 及 收 集0 1 - 藉 蛋 白 質 分 解 酶 水 解 内 毒 素 结 晶之 原毒素而快 速 鑑 定 、 1 1 定量及纯化毒素之方法在本技S提供可觀的利益 0 其 提 供 1 與 已 知 菌 株 迅 速 比較而篩選及測試新穎Bt之方法 0 其 亦 允 1 气 許1試操縱發酵 條 伴 Μ 使 多 基 因菌 株偏好生產 最 期 望 之 I 蛋 白 質 〇 其 亦 使 生 產 者 能 分 析 出 競爭 者之菌株所 生 產 之 Bt 1 1 毒 素 之 特 激 0 既 然 被 分 離 的 毒 素 可以 純化及活化 形 式 被 收 1 1 集 該 法 允 許 測 試Μ特異及控制方式製備之個別 純 化 毒 素 1 .-I 及 個 別 毒 素 之 混 合 物 〇 雖 然 本 發 明之方法對Bt之 多 基 因 菌 1 株 而 ~^r 特 別 有 價 值 但 顧然亦可應用於Bt之單基因 菌 株 及 -* | 1 用 於 分 析 來 自 選殖Bt基 因 (例如在大腸桿菌中者） 之 包 涵 體。 1 1 菁 榦 1 1 實 施 例 1 1 1 本紙張尺度遑用中國國家揉準（CNS > A4洗格（210X 297公釐）. -1 3 - 83.3.10,000 :兒· •''λ5 經濟部t央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（η) 白v a r . K u r s t a k i NRD-12多基因菌株分離及單離毒 ! · 1 .類芽孢结晶之純化 純化结晶按照下列文獻所述之步驟製備（例如Carey等人 > Biochim Biophys. Acta, 872, 169(1986)) ° 2 .胰蛋白酶消化 將懸浮於0.1M CAPS/NaOH缓衝液（pH 10.5)之20毫克/毫 升NRD-12结晶恝浮液用1毫克/毫升市售胰蛋白酶處理。將 反應混合物於室溫下攪拌整夜並於10,OOOrpm下難心15分 鐘。將傾出之上清液經由過·滅極限為0.22wm之膜過濾。 3 .用弱陰難子交換劑施行HPLC分離 分維使用設有自動注射器及光電二極管檢测器之瓦特斯 '990溶劑輸送糸統進行。使用蛋白質PAK DEAE 5PV陰離子 交換層析柱（7.5X7.5mm分析用柱，或21.5X 150mm半製備 用柱，Waters)。注射體積一l-20,000Wh;流速一4毫升/ 分鐘。 組合溶析梯度使用3種媛衝液： A ： 0.05M CAPS pH 10.5 B ： 0.0 5 M CAPS pH 10 . 5 + 0 . 17M NaC 1 C ： 0.05M CAPS pH 10.5+0.5M NaC 1 本紙張尺度逋用中國國家揉準（〇奶）入4规格（210父297公釐）. -1 4 - 83.3.10,000 -----------^ ^------tr------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（12) 梯度表： 時間[分鐘]流速[毫升/分鐘]

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%C 開始20.00 35.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 79.00 80.00 4.00 4.00 4.00 4 . 00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 0.50 100.0 0.0 0 . 0 100.00.0 100.0 0 . 0.0 90.0 1 0 .0 100. 100.0 100 0.0 10.0 0.0 100.00.0 100.0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 所用梯度條件被示於圖1中。圖2顯示於此等梯度條件下 胰蛋白酶消化之層析圖·，其中被分離毒素之輋MB、C及D 標記。B峯對應於cryIA(a)[4.5]基因毒素，C峯對應於 ^乂1冉（1))[5.3]基因產物及[)輋代表（：〇14((；)[6.6]基因產 物。層析柱之狀況或者pH值或塩濃度之微小改變會使某些 蛋白質之駐留時間位移數分鐘。如圖2所示，分離約於溶 析之最初60分鐘發生。接下來之溶析係為了清潔，層析柱及 使其再生，Μ供進行接績之分離。 在比較試驗中，如圖8所說明者，當使用蛋白質ΡΑΚ DEAE 5PW分析用餍析柱且塩澹度之線性梯度於30分鐘期間 從0增至0.5Μ時，未觀察到毒素分離。於此等梯度狀況下 ，胰蛋白酶消化之層析圖被示於圖9中。環繞峯7之區域含 Λ I. 經濟部中夬樣準局員工消費合作社印製 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 15 83. 3.10,000 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、 發明説明 (1 3) 1 有 毒 素 〇 1 4 . 毒 素 之 分 離 及 純 化 1 1 白 HPLC 溶 析 物 收 集 對 a*n 懕 於 B， C及 D峯之部份 用5 0 a V 請 1 先 J 聚 乙 二 醇 /3 .5KD a極限透析管濃縮，然後再注射入HPLC柱 閲 讀 1 背 1 以 確 定 純 度 0 個 別 層 析 nsft 圖 被 示 於 圖3， 4及5中c 重覆注射- 1¾ 之 注 1 分 雜 過 程 可 得 到 純 度 為 100¾ 之 單 離毒 素。 意 事 1 項 | 5 . 毒 素 鑑 定 之 確 認 再 填 Λ 將 如 上 述 分 離 及 纯 化 之 毒 素 用 CNBr 打斷及 令 生 成 之 片 段 罵 本 1 進 SDS- 聚 丙 烯 醯 胺 凝 膠 電 泳 (SDS -PAGE)。凝 膠 被 電 吸 漬 在 v_y 1 1 聚 偏 nm 二 氟 乙 烯 膜 上 〇 將 膜 中 之 肽 帶染 色，切 下 顯 現 之 肽 帶 1 I 並 將 待 檢 之 Η 段 用 應 用 生 物 系 统 475 A 蛋白質 定 序 系 統 定 序 1 1 訂 列 該 糸 統 包 含 470 A氣 相 定 序 器 ，其 設有具 900 A 控 制 資 料 1 ^分 析 模 數 之 連 線 1 20 A PTH分 析 器 0 1 1 對 Bt V a r * Ku Γ S t a k ί NRD -12之三基因菌株而言 三種 1 1 候 選 蛋 白 質 白 HPLC 溶 析 物 分 離 出 (分別為圖2 t 3 4及 5中 1 之 B ，C及 D峯） Ο 對 此 等 蛋 白 質 SDS- P AG E 顯 示 種 不 同 Ι 的 斷 裂 圖 譜 〇 將 各 斷 裂 圖 譜 中 之 個別 帶定序 列 後 發 現 與 1 1 三 種 毒 素 之 每 一 個 之 獨 特 序 列 對 應之 胺基酸 序 列 '0 此 等 序 1 1 列 從 個 別 基 因 之 已 藉 實 驗 決 定 之 DNA序列可Μ得知 ) 1 .-1 圖 1 0 顯 示 三 種 被 胰 蛋 白 酶 活 化 之毒 素之序 列 且 其 按 眧 相 1 同 的 序 列 區 段 排 列 彼 等 被 △ 叩 名 為c r y I A ( a ) [4 .5 ] 1 C Γ yI A(b ) [5 • 3 ]及c r y U (C )[6 . 6] 〇圖 10中下 方 被 盡 線 之 序 1 1 列 對 應 於 已 被 單 離 及 定 序 列 之 肽 ，其 大部份 含 有 獨 特 的 胺 1 1 基 酸 序 列 » 該 序 列 僅 為 一 種 蛋 白 質所 獨有。 1 1 -16 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐〉 81 3.10,000 -I- 讓 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五 、發明説明（J .: 0 1 6 . 被 檢 定 之 Bt 菌 株 1 1- 1 Bt 之 下 列 菌 株 之 毒 素 按 昭 上述方式被檢 定： 1 1 Bt V a r Ku Γ S t a k i HD- 1 (ATCC寄存號碼 33679 ； 台灣食 請 ί i 先 品 工 業 發 展 研 究 所 寄 存 號 碼 14616) (3種蛋 白質） 閲 1 背 1 Bt v a r . κ U Γ s t a k i NRD- 12 (NRRL寄存號碼HD- 945 ) 之 注 1 (3 種 蛋 白 質 ) 意 事 1 I Bt V a r • Ku Γ S t a k i. HD- 73 (ATCC寄存號碼35866 ; 台 灣 食 再 填 乂 品 工 業 發 展 研 究 所 寄 存 號 碼 14713) (1 種蛋 白質） 寫 本 頁 ▲ 1 Bt V a r * e η to mo C 1 d u s ( NR R L 寄存號碼 B - 4 0 4 6 ; 台 灣 食 品 1 I 工 業 發 展 研 究 所 寄 存 Otto m 碼 1 4376 ) (2種蛋白 質） 1 I Bt V a r a i z a w a i HD -33 ( 2種蛋白質） 1 1 訂 B t V a r * Ku r S t a k i A 20 (3種蛋白質） 1 'K 及 三 種 含 有 單 一 Bt 基 因 及 產生單一毒素 產物之 大 腸 桿 菌 1 1 纯 系 被 檢 定 Ο 此 等 基 因 之 每 一個對應於天 然 HD-1 菌 株 之 三 1 1 種 基 因 之 ...... 0 大 腸 桿 菌 毒 素 與對應之HD-1 毒素之 滯 留 時 間 1 相 同 〇 1 I 7 . 用 強 陰 離 子 交 換 劑 進 行 之 其他HPLC分離 1 | 該 分 離 用 具 有 -CH 2 -N (CH3) 3帶電基之Mo no Q HR 5/ 5 1 1 (Pha Γ Π1 a c i a )陰離子交換層析柱進行；注射體積1 -2 0， 000 1 .-I 公 升 » 流 速 — 1毫升/ 分 鐘 0 1 下 列 二 種 緩 衝 液 之 溶 析 梯 度如下： 1 1 A 0 .05M CAPS pH 1 0 . 5 1 1 B 0 .0 5M CAPS pH 1 0 . 5 - h 〇 .5M NaC 1 1 1 1 1 本紙張又度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（21 OX 297公釐） -17 83.3.10,000 五、發明説明（1 5 ) 梯度表： A7 B7 時間[分鐘] 流速[毫升/分鐘] %h %B 開始 1 . 0 100.0 0.0 35.00 1.0 0.0 100.0 40.00 1 . 0 0.0 100.0 45.00 1.0 100.0 0.0 49.00 1.0' 100.0 0.0 50.00 0.1 100.0 0.0 經濟部中央揉準局負工消费合作社印製 所用梯度條件被示於圖6中。圖7顯示於此等梯度條件下 胰蛋白酶消化層析圖，其中峯10，11及12約出現於溶析之 22與28分鐘之間，其所對應之毒素分別為CryIA(a)[4.5] ，cryIA(b)[5.3]及cryIA(c)[6.6]基因產物。如圖6所示 、者，分離於氯化納之線性梯度從0增至0.5M之35分鐘期間 内發生。 實施例2 用與實施例1相同之方法分析下列Bt菌株及鑑定基因產 物，不過用二種緩衝液根據下列梯度表進行溶析。亦使用 弱陰離子交換劑。 A ： 0.05M CAPS pH 11.5 B ： 0.05M CAPS/NaOH + 0.5M NaC 1 pH 11 . 5 ---1--^-----------訂------^ 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 18 83. 3.10,000 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 五、發明説明（1G) 供分析用之梯度表 時間 [分鐘.] 流速[毫升/分鐘] %^ 〇 開 始 1 100 0 2 1 100 0 40 1 67 33 41 0.5 67 33 60 0.5 67 33 61 1 67 33 65 1 0 100 70 1 100 0 7 1 0.1 100 0 梯度時間可視樣品之性質在25-40分鐘間變化 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •Λ 訂 气！ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1 9 - 83. 3.10,000 JR-·! 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 :...^1 A7 B7 五、發明説明（17) 结果藉顯微定序列及生物测定確證： 菌 株· 被表現之基因 相對 比率％ Bt v a r Kurstak i, HD-1 c r y I A ( a ) 28 c r y I A ( b ) 39 c r y I A ( c ) 33 Bt v a r Kurstaki HRD-12 c r y I A ( a ) 41 cry I A (b) 3 6 c r y I A ( c ) 23 Bt v a r Kurstak i A -2 0 c r y I A ( a ) 17 c r y I A ( b ) 17 c r y I A ( c ) 66 Bt v a r entoraocidus c r y I A ( a ) 40 c r y I A ( b ) <5 c r y I A ( c ) <5 c r y I B <5 c r y I C 50 B t v a r Kurstaki HD-73 c r y I A ( c ) 100 HD -2 c「yIC( + 4其他蛋白質） 25 c r y I A ( c ) 33 Bt v a r thuringiensis c r y I B Bt v a r tenebrionis cry I I IA >90 Bt v a r israelensis cr y h 30 (+4其他蛋白質）（在c ry IVC + D 混合 物中） 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 ~ 83. 3.10,000 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Claims (1)

1. 申請專利範圍

   δδ. 7. 30 修正本 種分離及鑑定由蘇雲金芽孢桿菌基因所表琨之蛋白 用 質 物 之 素 原 之 性 活 物 : 生 含有 包之 I 法Μ10 該桿為 , 孢 值 法：牙ΡΗ 方金在 之雲酶 素蘇解 毒 含 分 原將：Η 類一白 質蛋 產 Μ 解 水 液 浮0 性 水 之 條 性 水 及 内 III0 之 2 -IX Μ ο 1Α 在 持 維 致 大 值 ， Ρ 素在 毒素 子毒 之?-解 今、 溶 I 生 植含 ia 有 一 含少 I、 -'二 ry vvil 用入 使加 屮.漸 其 逐 ’ 間 析時 層 定 相預 液於 換及 交 Μ 子劑 離析 陰溶 效一 高第 行 之 il劑 下 衝 件緩 間述 時分 隨物 度 產 濃解 塩 水 中他 劑 W 析與 溶素 ’ 毒 劑子 析 之 溶態 他狀 L% hr^ J Mu 之活 塩物 當生 適使 及能 劑為 ΙΓΓ變 溶改 有 之 及 Μ 者 素 0 原 定 鑑 號 析 層 之 生 產 素 毒 子 予 可 亦0 要 (請先閱讀背面之注意事項再填窩本頁) 定 Μ 用 破 »vf 該 及 M 琨 M表 圍M 範予 利株 專菌 0 之φ Μ 如桿 2 抱 法 方 之 項 金 雲 蘇 山 闪 基 該 中 W、 微 特 之 株 0 β 定 經濟部中央標準局員工消f合作社印裝 圍菌別 範因個 利基之 專多素 請為毒 中株原 如1¾之 3 之現Hl^ 桿 孢 芽 金 雲 蘇 該 中 其 法 方 之 項 2 Α'η 穿 ρ/. 因 0 基徵 別特 ΙΙΑΙ之 各 株 自 菌 得該 離定 \JΛ、' ΝΝ ί li用 法被 該而 及素 Μ 毒 %子 法MJ法 方ί方 之之 之 項丨項 知 已 為 株：，白0^0 *- 該纟該 Hr ^ Hr t 0 I 其，.其 力 r/ Ji 之 株0 及 度 琨 表 之 因 第越第 圍定圍 範測範 利於利 專用專 身皮身 ir·νη° 屮法φ 如淡如 4X5 0 原 類 琨 表 因 基 菌 桿 孢 穿 金 雲 蘇 之 殖 選 彼如物 由 β 生 驟 步 之 素 毒 第 別 圍個 範之 利態 專狀 請性 申活 法 方 之 項 化 純 及 绍 分 含 包 尚 其 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標羋局眞工消费合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 7 .如屮請專利範圍第1項之方法，其中含有原毐素之物 質為蘇雲金芽孢桿菌之類芽孢结晶。 8 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該含原毒素之物 質為分離自發酵液之蘇雲金芽孢桿菌之粗製發酵混合物。 9 .如申_專利範圍第1項之方法，其中該蛋白質分解酶 選自Μ蛋白酶、凝乳胰蛋白酶、彈性蛋白酶及毘蟲腸液。 1 0 .如申請專利範圍第9項之方法•其中湏白質分解酶為 胰蛋ί丨酶。 1 1 .如屮誚専利範圍范1 0頂之方法，Κ屮水解ώ接於Ρ丨丨 值為約1 0 . 5下進行。 1 2 .如申_專利範圍第1 1項之方法，其中水解& 0 . 1 Μ 3 -環己胺越-卜丙磺酸/ N a ϋ丨丨媛衡液中進行。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中水解溫度為 約2 0至約4 0 C下進行。 14 .如申請專利範圍第1 2項之方法，其中層析在ρ丨丨值為 ]0 . 5 V 1 1 . 5 下進行。 1 5 .如φ請專利範圍第1 4項之方法，其中層析茌0 . 0 5 Μ 3 -環L胺基-1 -丙磺酸/ N a 0丨1嬢衝液中進行。 1 6 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該塩為氯化納。 1 7 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該陰離子交換劑 為弱险離子交換劑。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之方法，其中該陰離子交換 劑為二乙胺乙基聚（甲基丙烯酸甲酯）。 1 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中险離子交換劑為 本紙張尺度適甩中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） —2 从取 、1τ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局負工消费合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 強陰離子交換劑。 2 0 .如申請專利範圍第1 9項之方法，其中陰離子交換劑 含有2甲銨甲基。 2 1 .如申請專利範圍第1項之方法，其中層析在與進行水 ’解之μ Η 1大致相同之p丨丨值下進行。 2 2 .如申請專利範圍第2 1項之方法，Κ中令水解後之溶 液直接進行層析。 2 3 .如申請專利範圍第1項之方法·其中高效液相層析訊 號藉與已知蘇雲金芽孢桿菌基因所表現之原毒素用相同蛋 白質分解酶於相同條件下水解後*於相同條件下進行陰離 子高效液相層析所得到之層析訊號比較而鑑定。 2 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其中含有原毒素之物 質在μ I丨值為1 0 . 5之0 . 1 Μ 3 -環己胺基-卜丙磺酸/ N a 0丨丨媛衡 液中用胰蛋白酶水解，將水解後之溶液在二乙胺乙基聚（ 甲基丙烯酸甲酯）上直接進行層析·第-溶析劑為P丨丨值為 1 0 . 5之0 . 0 5 Μ 3 -環己胺基-1 -丙磺酸/ N a 0丨丨鍰衝液，第二溶 析劑為含有0 . 1 7 Μ氯化納之相同媛衝液，此二溶祈劑被同 時引追且引進之方式為使第二溶析劑之量於約2 0分鐘期間 從0姒性增加至1 0 0 %，第三溶析劑為含有0 . 5 Μ氯納之相 同緩衝液，其於第二溶析劑之虽到達1 0 0纟後約1 5分鐘開始 引進，第三溶析劑之量於約1 5分鐘期間從0線性增加至1 0 S；。 2 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其中含原毒素之物質 在Ρ丨丨值為1 0 . 5之0 . 1 Μ 3 ~環己胺基-1 -丙磺酸/ N a Ο Η媸衝液 中用腴蛋白酶水解，水解後之溶液在含有三甲銨甲基之樹 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) J 訂 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 脂上点接進行層析，第一溶析劑為丨丨值為1 0 . 5之0 . 0 5 Μ 3 -環己胺基-1 -丙磺酸/ N a () 1丨緩衝液，第二溶析劑為含有0 . 5 Μ 缄iL·納之相同緩衝液，此二溶析劑被同時引進且引進之方 式為使第二溶析劑之1於約3 5分鐘期間從0線性增加至 10 0¾ 2 6 .如申請專利範圍第2 5項之方法，其中第二溶析劑於 超過約3 0分鐘期間被引進。 2 7 .如申請專利範圍第1項之方法，其中含封原毐素之物 質在P丨丨值為1 0 . 5之0 . 1 Μ 3 -環己胺基-；1 -丙磺酸/ N a 0丨彳嫒衡 液中用胰蛋白酶水解，水解後之溶液直接在含旮三屮銨屮 基之樹脂上進行層析，第一溶析劑為P Η值為1 1 . 5之0 . 0 5 Μ 3 _環己胺基-1 -丙磺酸/ N a 0 Η鍰衝液，第二溶析劑為含有 0 . 5 Μ铽化納之相同鍰衝液，二種溶析劑被同時引進且引進 之方式為使第二溶析劑之量於約4 0分鐘期間從0線性增加 至 3 3¾。 ----------------訂---^ — I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標苹局員工消费合作社印製 _ 4 ··· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）