TW202408478A - 治療脂肪肝疾病之醫藥組合及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種治療脂肪肝疾病之醫藥組合及其用途。該醫藥組合包括二甲雙胍(Metformin)以及1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖，藉由二者之協同作用，可大幅提升肝細胞中甘氨酸N-甲基轉移酶(Glycine N-methyltransferase,GNMT)的表現，同時減少肝細胞中油滴的累積，更可克服二甲雙胍單獨治療下所產生之問題，因而可運用於脂肪肝疾病之治療。
Description
本發明係關於一種醫藥組合，尤其是一種利用於治療脂肪肝疾病之醫藥組合及其用途。
一般所稱「脂肪肝」乃一種病理狀況，通常指個體其肝總重量中之脂肪佔有5%以上的情形。脂肪肝的發生一般與飲食、環境以及個人體質相關，常見於過量飲酒以及肥胖、糖尿病或高血脂等患者，主要原因是血液帶來過多脂肪酸到肝臟，或因其他生理作用、代謝機制，導致肝細胞無法及時代謝，而以三酸甘油脂的型式囤積於肝細胞細胞質中形成油滴。所謂「非酒精性脂肪肝疾病」(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)，係指廣範的肝臟疾病，包括初始的肝脂肪變性(liver steatosis，即一般所謂單純性脂肪肝)，繼續發展下肝臟開始有發炎現象之非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，以至於肝臟產生結瘢之肝纖維化與進程至晚期之肝硬化。依目前研究所知，非酒精性脂肪肝疾病也有可能發展為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。此外，另有因為酗酒所造成之「酒精性脂肪肝疾病」(Alcoholic fatty liver disease,AFLD)，其臨床症狀表徵及組織病理學與前述非酒精性脂肪肝疾病類似。在過去的研究中發現，只要每天飲用約40g以上的酒精，連續喝5至10天，就會產生酒精性脂肪肝，如果連續喝5至10年，就同樣會使肝細胞受損成為酒精性肝炎，並通常比非酒精性肝炎提早進展至肝硬化。
由於代謝症候群人數的迅速增加，近20年來非酒精性脂肪肝疾病的患病率急劇上升，並且將持續增加。非酒精性脂肪肝疾病是全球最常見的肝臟疾病，在美國，估計約有近8000萬至1億人患有此病，而其中之
25%正進展為脂肪肝炎，若不持續控制，將導致不可逆之後續病症惡化。非酒精性脂肪肝疾病起因於熱量過度攝取、缺乏身體活動、胰島素抵抗和遺傳等因素，目前尚無臨床批准用於治療非酒精性脂肪肝疾病的藥物，因此運動和飲食控制是目前減輕症狀的唯一有效方法。然而，愈來愈多的證據顯示，肝粒線體功能障礙對於非酒精性脂肪肝疾病的發病機制至關重要。儘管多年來在瞭解非酒精性脂肪肝疾病的發病機制上有許多重大進展，但導致肝細胞內脂質積累的主要代謝異常機制仍知之甚少。
據研究，非酒精性脂肪肝疾病患者中，甘氨酸N-甲基轉移酶(Glycine N-methyltransferase，以下簡稱GNMT)的濃度含量被發現大幅下調而降低，這種情形也發生在慢性肝病的早期階段。此外，在酒精性脂肪硬化病患者中，同樣也有甘氨酸N-甲基轉移酶表現量降低的情形(Matias A.Avila et al.,(2000),Reduced mRNA abundance of the main enzymes involved in methionine metabolism in human liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma,J.of Hepatology 33,907-914)。而GNMT是調節S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)代謝機制的一重要酵素，也是肝癌的抑癌基因。另一方面，GNMT也被發現會與電子傳遞鏈的複合物II(Complex II)交互作用，而脂肪變性將導致粒線體膜電位之變化，因此GNMT對於粒線體適當功能的表現似乎有其關聯。然而，目前關於GNMT是否可參與非酒精性或酒精性脂肪肝疾病的治療上卻無任何相關的研究。
儘管過去曾有以二甲雙胍(1,1-Dimethylbioguanide，或稱Metformin)、維生素E等針對非酒精性脂肪肝疾病進行的大型臨床試驗，但尚未發現有效的治療方法。二甲雙胍是第二型糖尿病的一線藥物，已被發現具有抗衰老和抗癌作用。依據先前之研究，二甲雙胍對非酒精性脂肪肝疾病的作用可以略微改善肝功能和體重指數(body mass index,BMI)，但無法改善非酒精性脂肪肝疾病患者之肝組織狀態(Li,Y.,Liu,L.,Wang,B.,Wang,J.,et al.,(2013)Metformin in non-alcoholic fatty liver disease：A systematic review and meta-analysis.Biomed Rep.1,57-64.)。在另一項研究中，亦僅發現二甲雙胍雖可使血脂和葡萄糖含量降低，但同樣無法改善非酒精性脂肪肝疾病患者的肝組織狀態(Haukeland,J.W.,Konopski,Z.,
Eggesb
,H.B.,von Volkmann,H.L,et al.,(2009).Metformin in patients with non-alcoholic fatty liver disease：a randomized,controlled trial.Scand J Gastroenterol.44,853-60)。相較之下，以二甲雙胍治療非酒精性脂肪肝疾病患者，其效果似乎優於處方飲食或維生素E的施用，但從活體組織檢查或血清轉氨酶的檢測結果卻發現此結果並未完全被支持。在另一項研究中，當以二甲雙胍和維生素E試驗是否可降低兒童和青少年非酒精性脂肪肝疾病患者的ALT濃度時，結果卻是二者均不優於安慰劑的效果(Lavine,J.E,Schwimmer,J.B.,Van Natta,M.L.,Molleston,J.P.,et al.,(2011)Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network.Effect of vitamin E or metformin for treatment of nonalcoholic fatty liver disease in children and adolescents：the TONIC randomized controlled trial.JAMA.305,1659-68)。因此，二甲雙胍單獨運用於非酒精性脂肪肝疾病治療並未見有意義之效果。
因此，若能以先前二甲雙胍在非酒精性脂肪肝疾病治療之研究基礎上，儘管其效果極微，倘進而能夠找出與其相互匹配而增加或協同產生療效之其他化合物或成分，將可對非酒精性或甚至酒精性脂肪肝疾病進行有效之控制或改善，而造福廣大族群之健康。
鑑於先前利用二甲雙胍治療非酒精性脂肪肝疾病臨床試驗效果之有限性，本發明目的之一在於提供一種能夠結合二甲雙胍之藥物組合，藉由與其他化合物或成分之合併施用，提升二甲雙胍對非酒精性脂肪肝疾病之療效，或透過與二甲雙胍之協同作用，產生非酒精性脂肪肝疾病治療上的有意義效果。本發明另一目的之一在於藉由適當的醫藥組合治療，可在非酒精性脂肪肝疾病之初期，改善或回復脂肪肝、脂肪肝炎的病理症狀，以減輕或避免病程繼續發展為肝纖維化或肝硬化。本發明的再一目的之一在於藉由可調控GNMT濃度的特性，使細胞代謝中之GNMT濃度回升，因而亦可利用於酒精性脂肪肝、脂肪肝炎之改善與治療。
為了達成前述之目的，在本發明之一實施例中，提供一種治療脂肪肝疾病之醫藥組合，包括二甲雙胍以及1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖
(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl beta-D-glucopyranoside，以下簡稱PGG)。在本發明實施例之一態樣中，該二甲雙胍可以有效劑量給予。
在本發明的另一實施例中，前述醫藥組合中該二甲雙胍以及該1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖可為個別劑型。
在本發明的一實施例中，所述醫藥組合中該二甲雙胍以及該1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖之劑量可分別為約135~165mg/kgbw與約270~330mg/kgbw，較佳為二甲雙胍與該1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖之劑量可分別為約150mg/kgbw與約300mg/kgbw。
在本發明的一實施例中，所述醫藥組合之給予可至少每天一次。
在本發明的一實施例中，所述該醫藥組合可以口服方式給予。
在本發明的一實施例中，所述該醫藥組合之組合藥劑可為錠劑、膠囊、溶液劑或粉劑等，但並不僅限於此。
在本發明的一實施例中，所述該醫藥組合可進一步包括食品或營養補充品。
在本發明的另一實施例中，提供一種包括二甲雙胍以及1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖之醫藥組合於製備在一個體中治療脂肪肝疾病藥物之用途。
在本發明一所述用途的實施例中，該脂肪肝疾病係非酒精性脂肪肝疾病。
在本發明的再一所述用途的實施例中，該脂肪肝疾病係單純脂肪肝、脂肪肝炎、肝纖維化或肝硬化。
在本發明一所述用途的實施例中，該醫藥組合之給予可促進苷氨酸-N-甲基轉移酶(GNMT)之表現。
在本發明的一所述用途的實施例中，該個體可包括哺乳動
物，較佳為人類。
藉由本發明二甲雙胍與PGG的醫藥組合，其施用後二者之協同作用，除大幅提升肝細胞中GNMT的表現外，可同時減少肝細胞中油滴的累積，更可克服二甲雙胍單獨治療下所產生的耗氧抑制作用，因而可運用於脂肪肝疾病各階段進程之預防或治療。
圖1顯示小鼠分組治療試驗後之體重和生化分析結果圖。其分別表示圖(A)體重、(B)ALT(GPT)、(C)AST(GOT)、(D)總膽固醇、(E)三酸甘油脂、與(F)葡萄糖之結果；#表p<0.05(相對於控制組a)，*表p<0.05(相對於HFD對照組b)。
圖2顯示小鼠分組治療試驗後肝切片的組織病理學分析結果圖。其中，圖(A)為H&E染色結果，圖(B)則為肝組織中GNMT的免疫組織化學染色結果。
圖3顯示Mahlavu肝癌細胞中GNMT與c-Myc基因mRNA的表現變化結果圖。其中，(A)組圖未加油酸，(B)組圖則加有油酸；*表p<0.05，**表p<0.01，***表p<0.001。
圖4顯示Mahlavu肝癌細胞中GNMT與c-Myc蛋白質的表現變化結果圖。其中，(A)組圖未加油酸，(B)組圖則加有油酸；*表p<0.05，**表p<0.01，***表p<0.001。
圖5顯示小鼠肝組織與粒線體中GNMT的表現狀況結果圖。其中，圖(A)為肝組織中GNMT的mRNA表現狀況，圖(B)為從小鼠肝組織所分離的粒線體中GNMT蛋白質的表現狀況；*表p<0.05。
圖6顯示PGG和二甲雙胍組合治療後之協同作用效果。其中，圖(A)為Mahlavu肝癌細胞以不同劑量PGG處理後之最大呼吸容量(OCR)值，圖(B)則顯示以PGG和二甲雙胍處理Mahlavu肝癌細胞後其線粒體的功能分析結果；PGG和二甲雙胍的組合治療恢復了原本二甲雙胍單獨處理時對
Mahlavu細胞粒線體功能的抑製作用，圖(C)為單獨以二甲雙胍或二甲雙胍
和PGG組合治療的HFD小鼠模型其初代肝細胞中的線粒體功能分析。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例與圖式係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍。
定義
本文中使用的名詞、名稱或術語定義，僅係用於描述特定具體實施例，並非為本案之限制界定。
除非另有定義，本文中所述之技術方法、科學術語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解之一般涵義相同。與本文所述類似或等同的任一方法和材料都可用於本發明之實施方式，本文所描述係代表性的方法和材料。
除非另有指明，本發明說明書與申請專利範圍中所述之成分濃度、重量、劑量、反應溫度、壓力、時間等條件的數值應被理解為在所有情況下皆有術語「約」所修飾。因此，除非有特定指名，本發明說明書與申請專利範圍中闡述的數值將依本發明之目的性質而視為可變化的近似值。
本文中所述之「有效劑量」指當給予患者用於治療疾病或其他不良醫療症狀時，係足以對該疾病或症狀具有有益效果的劑量。有效劑量將視選擇的化合物、組成物或醫藥組合等藥劑類型，疾病或症狀及其嚴重性，以及患者的年齡、體重等而有所調整。
本文中所述之醫藥組合可指用於組合之治療活性劑為相同劑型，或分別為不同劑型。例如治療活性劑中其一為口服劑型，而另一治療活性劑為腸胃外給予的溶液劑型。
本文中所述之「治療」指緩和、減輕、改善或消除個體疾病之至少一種症狀。在本發明之含義內，所述之「治療」亦表示阻止、延遲疾病臨床表現及/或降低疾病發展或疾病惡化的風險。
本文中所述之「患者」或「個體」包括哺乳動物，可為人類與非人類動物。
實施例1 醫藥組合
本實施例中醫藥組合所使用之1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖(PGG)係一取自台灣One Biopharmaceutical公司之化合物，而二甲雙胍(Metformin)，於係購自美國BioVision公司，其化合物型態為鹽酸二甲雙胍化合物(1,1-dimethylbioguanide hydrochloride)。無論PGG或Metformin皆可使用原化合物或其鹽，因此後述PGG或Metformin可指原化合物或其鹽。
實施例2 動物試驗
本實施例中，動物試驗係以C57BL/6小鼠進行體內試驗，並對試驗之小鼠餵食以高脂飲食(high fat diet,HFD)，以驗證醫藥組合對脂肪堆積之作用效果。取用之C57BL/6雄性小鼠係購自台灣國家實驗動物中心，所有動物實驗均按照高雄醫學大學實驗動物照護和使用委員會所審查和批准的實驗動物照護和使用指南與規定進行試驗。首先，取八週大的小鼠分為以下五組(每組10隻)：(a)控制組；(b)高脂飲食組(HFD)；(c)以二甲雙胍治療的高脂飲食組(HFD+Metformin)；(d)以PGG治療的高脂飲食組(HFD+PGG)；以及(e)以PGG與二甲雙胍合併治療的高脂飲食組(HFD+PGG+Metformin)。整個實驗過程中，將以標準飲食餵食控制組a的小鼠直至犧牲，其他用於b~e組的小鼠則先一同餵食以高脂飲食4個月後，隨機分為前述b~e四組，繼續餵食高脂飲食，並依各組設定以指示的醫藥組合成分開始進行治療1.5個月直至犧牲。
治療試驗所用之鹽酸二甲雙胍係先溶於水，而PGG則溶於0.5%之羧甲基纖維素鈉鹽(carboxymethyl cellulose sodium salt,CMC,Sigma-Aldrich，美國)。治療小鼠時係以口服灌胃方式給予，每天一次，PGG之施用劑量約300mg/kgbw，而鹽酸二甲雙胍之施用劑量約150mg/kgbw。施用時程係在上午10點依各組設定給予PGG或等體積的羧甲基纖維素鈉鹽(CMC)作為對照，並在當日下午6點依各組設定給予鹽酸二甲雙胍或等體積的水作為對照。每天持續給予治療共約1.5個月直至犧牲。PGG與鹽酸二甲
雙胍之給予間隔約可為6~8小時，例如間隔6、7或8小時。此外，PGG與鹽酸二甲雙胍之劑量可於約10%之範圍內增減。
實施例2.1 動物血液生化分析
前述5組小鼠犧牲前，使小鼠先禁食12小時後，從其尾動脈採集血液樣本，以進行血液生化分析。從中所獲得之血清樣本則置於-80℃下保存備用。分析時，使用生化分析儀(FUJI DRI-CHEM NX500i，Fujifilm,日本)測量血清中之丙胺酸轉胺酶(Glutamic Pyruvic Transaminase，簡稱GPT，或稱Alanine amino Transferase，簡稱ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(Glutamic Oxaloacetic Transaminase，簡稱GOT，或稱Aspartate amino Transferase，簡稱AST)、葡萄糖、三酸甘油脂(triglyceride)和總膽固醇(T-cholesterol)等含量之數值，其結果如圖1所示。
由圖1可知，餵食以HFD之對照組b，小鼠體重大幅增加，但以Metformin與PGG合併治療餵食以HFD的小鼠之後(e組)，其在體重上已大幅減輕，回復至相當於控制組a之體重。且e組體重減輕之幅度，也比單獨以Metformin或PGG治療之c、d組之效果好。因此，藉由Metformin與PGG合併治療的確可顯著降低因高脂飲食所誘發之體重增加。此外，對於因高脂飲食所誘發丙胺酸轉胺酶(ALT)與葡萄糖提升之情形，在e組亦有明顯減低之趨勢。由此結果顯示，藉由Metformin與PGG合併治療，可減低肝臟之損傷並影響肝臟的代謝穩態。
實施例2.2 動物組織病理分析
為了進一步確認治療時對肝組織之脂肪變化的影響，係進行肝組織之染色檢測。實施例2中各組小鼠犧牲後取出其肝組織，以10%福馬林固定，隨後包埋於石蠟中。之後依據台灣小鼠診所(國家綜合小鼠表現型暨藥物測試中心，台北，台灣)的標準流程，以H&E染色方式(hematoxylin and eosin stain)對肝臟切片進行染色，其結果如圖2(A)所示。
此外，同時進行免疫組織化學染色，以確認治療時是否對GNMT基因之表現產生影響。首先，將脫蠟的肝臟切片以2.5%的過氧化氫甲醇(methanolic hydrogen peroxide)處理，使內源性的過氧化物酶的活性喪
失。隨後，將切片以anti-GNMT蛋白質抗體(14-1，YMAC Bio Tech，台灣)進行染色，再以N-Histofine Mousestain套組(Nichirei Biosciences，東京，日本)進行檢測。接著，將該切片以3-3'二氨基聯苯胺(3-3' diaminobenzidine,DAB)(Dako，米蘭，義大利)呈色，最後以蘇木精(hematoxylin)(Dako)進行對比染色。控制組a則使用一般小鼠抗血清代替前述之anti-GNMT蛋白質抗體。切片染色結果如圖2(B)所示。
請參閱圖2，圖2係小鼠分組治療試驗後肝切片的組織病理學分析結果圖。由(A)圖H&E染色結果可知，餵食HFD的情況促進小鼠肝細胞中油滴的累積(b組)。對比於單獨使用Metformin或PGG之治療組(c或d組)，Metformin和PGG的合併治療(HFD+Metformin+PGG，e組)顯著反轉了HDF所導致的油滴積累情況。此外，由(B)圖免疫組織化學分析結果可知，GNMT蛋白質在控制組a之小鼠肝臟中正常大量表現，但在餵食以HFD之小鼠(b組)肝臟中的表現卻大幅降低(染色區域稀疏)。然而經過PGG或Metformin的治療後，染色區域顯著回復，特別是在Metformin和PGG合併治療之e組，GNMT蛋白質的染色結果也更優於控制組a。另外，同時進行GNMT之mRNA表現檢測以進行確認，請先參閱圖5(A)，也可發現Metformin和PGG合併治療之e組，其mRNA之表現提升比例相對於控制組a高達約60%，而相對於未治療之高脂飲食對照組b而言，則更大幅增加約160%。從上述結果可確認，藉由Metformin和PGG的合併治療，可使肝細胞中GNMT之表現大幅提升，扭轉因為肝脂肪堆積下使GNMT表現受抑制而使濃度低下之問題。
實施例2.3 Mahlavu肝癌細胞中GNMT與c-Myc基因、蛋白質之表現分析
如前所述，在免疫組織化學染色分析上可確認Metformin和PGG合併治療後可回復GNMT基因之表現，因此針對肝細胞進行GNMT mRNA與蛋白質表現進行試驗，以進一步確認GNMT實際之表現狀況。同時，也對由肝組織分離出之粒線體進行GNMT蛋白質濃度變化檢測，以驗證合併治療後在粒線體中對GNMT表現之影響。另一方面，由於過去研究發現GNMT能夠抑制肝細胞癌，因此亦利用Mahlavu肝癌細胞(Mahlavu hepatocarcinoma)測試以Metformin、PGG治療下對GNMT基因以及致癌基因c-Myc表現的影響。測試時，PGG施用之濃度為約0.05mg/ml(約0.053mM)，
Metformin為5mM，而用以模擬脂肪肝細胞狀態所加入之油酸(oleic acid)則為0.5mM。
檢測基因所表現之mRNA數量，可以一般常見之反轉錄PCR進行檢測。首先，使用TRIzol(Invitrogen；Carlsbad,CA)由待測組織或細胞樣本中分離出總RNA。之後使用Tetro cDNA Synthesis套組(BIOLINE；Taunton,Massachusetts)將RNA反轉錄為cDNA，再以KAPA SYBR FAST qPCR套組(Kapa Biosystems；Wilmington,Massachusetts)加上待測基因以及β-actin基因(作為內部對照)之引子對進行即時PCR。
另一方面，為檢測蛋白質之表現量，可以免疫印漬法進行。首先將取得之組織或細胞加入RIPA裂解緩衝液(含50mM Tris(pH 7.5)、150mM氯化鈉、1%Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5%脫氧膽酸鈉，並添加有蛋白酶和磷酸酶抑製劑(含1mM苯甲磺酰氟(PMSF)、10ug/mL亮肽素(leupeptin)、50ug/mL甲苯磺酰賴氨酸氯甲基酮(TLCK)、50ug/mL甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)、1ug/mL抑肽酶(aprotinin)、1mM氟化鈉(NaF)、5mM焦磷酸鈉(NaPPi)和10mM原釩酸鈉(Na3VO4))進行均質化，將細胞、組織裂解。接著將處理後之裂解總蛋白離心分離，以SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉漬，再以一般免疫呈色方式進行定量。免疫呈色所使用之抗體主要是能夠辨識目標蛋白的單株抗體，於本實施例中，所使用之抗體可為anti-GNMT蛋白質抗體(14-1，YMAC Bio Tech，台灣)、anti-MYC抗體(D84C12,Cell Signaling)和anti-β-actin抗體(AC-15，Sigma-Aldrich)。
請先參閱圖3與圖4，該二圖分別為Mahlavu肝癌細胞中GNMT與c-Myc的mRNA與蛋白質表現變化之結果圖。請參見圖3(A)與4(A)，在未加入油酸之情形下，由定量反轉錄PCR之結果可知，以PGG或Metformin與PGG合併治療下，皆可顯著提升GNMT的mRNA和其蛋白質的表現，特別是在Metformin與PGG合併治療下，其對GNMT的mRNA和其蛋白質的提升幅度分別高達約101%與42%。在相同的處理下，則可顯著減少c-Myc的mRNA和其蛋白質的表現，特別是在Metformin與PGG合併治療下，其降低的幅度更為明顯。
當加入油酸以模擬脂肪肝的情況時，請參見圖3(B)與4(B)，GNMT的mRNA和其蛋白質表現大幅降低，但經Metformin或/與PGG治療後，GNMT的mRNA和其蛋白質表現已明顯回復，特別是以Metformin和PGG合併治療時其上調幅度更為顯著。相較之下，c-Myc的mRNA和其蛋白質的表現，在加入有油酸之情況下大幅上調，但以Metformin或/與PGG治療後，c-Myc的mRNA和其蛋白質的表現則顯然受到抑制而顯著下調，特別是以Metformin和PGG合併治療時其下調幅度更為顯著。由上述結果可知，藉由Metformin與PGG的合併治療，能夠促進GNMT的表現，進而反轉脂肪肝所導致GNMT表現下調之問題，同時也能夠抑制致癌基因c-Myc的表現。
實施例2.4 肝組織中GNMT基因表現之分析
請參閱圖5，圖5係為小鼠肝組織與粒線體中GNMT的表現狀況結果圖。由圖5(A)可知，餵食高脂飲食之b組使小鼠肝組織中GNMT基因的表現大幅降低，但經由c、d、e三治療組之作用，無論是單獨治療以PGG、Metformin，或Metformin與PGG之組合，均能顯著促進GNMT mRNA的表現，特別是Metformin和PGG合併治療之e組，其提升比例相對於控制組a高達約60%，對於未治療之高脂飲食對照組b而言，則更大幅增加約160%，足見Metformin和PGG合併治療更能使高脂飲食的小鼠之GNMT基因表現回復正常值且表現更為提升。
另一方面，觀察從小鼠肝組織分離的粒線體中之GNMT蛋白質表現，請參閱圖5(B)，可發現餵食高脂飲食後(b組)，略微降低了粒線體中GNMT蛋白質之表現，但同樣在c、d、e三治療組中，都可使GNMT蛋白質的表現增加並超過控制組a與高脂飲食對照組b，其中Metformin和PGG合併治療之e組其提升比例相對於控制組a則可達約6%，相對於未治療之高脂飲食對照組b則增加約10.4%。
從上述結果可知，以Metformin和PGG合併治療之下，因為二者之協同作用，其對於GNMT表現之提升效果係顯著優於Metformin、PGG個別之效果，而透過Mahlavue肝癌細胞之測試，則可確認本發明以Metformin和PGG合併治療後，在脂肪肝脂肪囤積之情況下，能夠回復GNMT之正常
表現，配合前述之組織學上之檢測結果，可證明本發明Metformin和PGG之醫藥組合，確實能夠改善或治療非酒精性脂肪肝疾病之病症。藉此對GNMT表現提升之作用機制，對於酒精性脂肪肝疾病應亦有相仿之效果。
實施例2.5 小鼠中Metformin與PGG之協同作用
由於脂肪過度堆積會造成氧化傷害，其中包含產生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)而造成粒線體膜電位受損，因此以下將以海馬(Seahorse)XF細胞之粒線體進行壓力測試。另一方面，由於Metformin會與磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作用，而AMPK可調節粒線體之功能，經動物實驗發現Metformin可促使GNMT移位(translocation)至粒線體中，故加入PGG合併測試後，耗氧抑制若能被上調回升，即可證實藉由PGG之協同作用，可回復以Metformin治療時耗氧被抑制之問題。
首先準備Mahlavu肝癌細胞，將其接種在24孔的Seahorse XFp細胞培養微型培養盤(Agilent，美國)上，每孔約接種3x104的Mahlavu肝癌細胞。在測試前12小時，將XFp感測管(Agilent，美國)浸泡在500μL之校準溶液中，並置於黑暗且無二氧化碳的培養箱中培養。之後，以油酸和含有治療藥物的DMEM培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco；其含有10%胎牛血清(FBS)與青黴素(Penicillin)/鏈黴素(Streptomycin)/L-谷氨酰胺(L-Glutamine)/非必需氨基酸(Nonessential Amino Acid,NEAA))替換上清液後繼續培養。前述試驗之濃度如下：0.5mM油酸(OA，Sigma Aldrich，美國)，50ng/mL PGG(約0.053mM)，5mM Metformin。在48小時油酸和治療藥物處理後，以200μL測試培養基(不含碳酸氫鈉的DMEM，並將pH值調節至7.4)替換先前含有治療藥物的上清液。接著將粒線體測試藥物(1.5μM寡黴素(Oligomycin)、3.5μM FCCP和0.5μM雷帕黴素(Rapamycin))裝入校準管中，在海馬生物能量分析儀(Seahorse XF)內進行探針與前述校準管之效準，並開始進行測試，測試開始時將校準盤更換為培養盤，測試結果如圖6所示。
請參閱圖6，如圖(A)顯示，經過48小時不同濃度PGG藥物的
給予，Mahlavu肝癌細胞之最大呼吸容量(OCR)測定結果與濃度呈現劑量效應關係。特別是在0.83μM的濃度下，相較於控制組，可使細胞增加1.3倍的OCR(以第44.3分鐘之OCR數值為比較基準)。
為了進一步確認PGG的作用對粒線體的影響，進一步以海馬生物能量分析儀測定Mahlavu肝癌細胞經以Metformin治療後對胞內粒線體功能上的影響。海馬生物能量分析儀可透過施予不同藥物以抑制電子傳遞鏈上的不同複合物(Complex)，以進行粒線體功能的測定，其測定指標為耗氧率(Oxygen Consumption Rate,OCR)，如以X軸之時間軸劃分，第0~18.5分鐘為基礎呼吸階段(basal respiratory condition)，第18.5~44.3分鐘為加入寡黴素以測定質子漏失(proton leak)與非粒線體氧氣消耗(non-mitochondrial oxygen consumption)階段，第44.3~70.13分鐘為加入FCCP以測定最大呼吸容量(maximum respiration capacity)之階段，第70.13~95.94分鐘則為加入魚藤酮(Retenone)以測定非粒線體氧氣消耗階段。請參閱圖6(B)，在24小時Metformin(0.625mM)治療後所導致之OCR降低，在加入PGG(0.83μM)經過21小時之作用下被回復。由圖中亦可發現，在第9.91、18.5分鐘時，Metformin與PGG之合併作用使OCR提升率相較於單獨Metformin作用，分別提升約25%與27%。此相同的效果也在非酒精性脂肪肝疾病小鼠模型之體內試驗獲得驗證。請參閱圖6(C)，由Metformin與PGG合併治療(Metformin：150mg/kg/天；PGG：300mg/kg/天，共40天)非酒精性脂肪肝疾病小鼠時，其OCR值顯著高於單獨以Metformin治療之HFD小鼠，增加約45%。
藉由前述OCR之檢測，更堅實確認加入PGG之療後，對於Metformin施用時所產生之耗氧抑制作用有明顯之回復效果，亦即，透過二者合併治療，透過其協同之加乘作用，其效果相較於單獨Metformin之治療不但極其顯著，更能彌平Metformin單獨治療下所產生之問題。
透過前述實施例之試驗結果可知，本發明之醫藥組合的確能夠減輕、改善或甚至消除脂肪肝之病症，因而得利用於非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝疾病之治療，並可避免或延緩脂肪肝惡化之進程，而減少發展至肝纖維化或肝硬化的高風險。
本發明實施例之醫藥組合PGG與Metformin可為個別劑型或相同劑型，亦即可分別給予不同的劑型。劑型可包括但不限於：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、膠囊等。前述醫藥組合PGG與Metformin，可為原化合物或其鹽，並可進一步分別包含有藥學上可接受之載劑。前述藥學上可接受之載劑於不影響本發明醫藥組合個別成分之作用、效果之情況下，通常可選擇添加以下適於醫藥品之成分，例如：賦形劑、稀釋劑、結合劑、添加劑、增黏劑、穩定劑、乳化劑、香料、著色劑、分散劑、崩解劑、懸浮劑、界面活性劑、防腐劑等，但並不僅限於此。另外，前述醫藥組合之成分物依照其劑型可以口服、注射等方式加以給予。
此外，依據本發明實施例之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，亦可進一步添加應用於食品組成物中，例如一般食品、保健食品或營養補充品。此外，該食品組成物可包含所屬技術領域具有通常知識者所熟知的生理上可接受的載劑，該些載劑可包括但不限於：前述各種藥學上可接受之載劑，以及醣類、蛋白質、脂肪、食物纖維、維生素或其他配合物。
綜合以上試驗結果，本發明實施例所提供之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，能夠誘發並促進GNMT基因之表現，並抑制Metformin單獨治療所產生之問題，對於肝細胞脂肪之清除具明顯療效。藉此更可將本發明應用於食品組成物中，從一般飲食或保健飲食的每日保養，預防、減緩或阻擋脂肪之累積，避免因脂肪肝惡化為不可逆之肝纖維化或肝硬化。
Claims (10)
- 一種治療脂肪肝疾病之醫藥組合，包括二甲雙胍以及1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖。
- 如請求項1所述之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，其中該二甲雙胍以及該1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖係個別劑型。
- 如請求項1所述之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，其中該二甲雙胍以及該1,2,3,4,6-O-五沒食子醯葡萄糖之劑量分別為約150mg/kgbw與約300mg/kgbw。
- 如請求項1所述之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，其中該醫藥組合之給予係至少每天一次。
- 如請求項1所述之治療脂肪肝疾病之醫藥組合，其中該醫藥組合係以口服方式給予。
- 一種以請求項1所述之醫藥組合於製備在一個體中治療脂肪肝疾病藥物之用途。
- 如請求項6所述之用途，其中該脂肪肝疾病係非酒精性脂肪肝。
- 如請求項7所述之用途，其中該脂肪肝疾病係單純性脂肪肝、脂肪肝炎、肝纖維化或肝硬化。
- 如請求項6所述之用途，其中該醫藥組合係可促進苷氨酸-N-甲基轉移酶(Glycine N-methyltransferase)之表現。
- 如請求項6所述之用途，其中該個體包括哺乳動物。
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