TW202400665A - 對ras新生抗原具有專一性之結合蛋白及其用途 - Google Patents

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菲利普 Ｄ 格林伯格
蒂亞娜 馬蒂諾夫
瑞秋 佩雷特
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Abstract

本揭露內容提供用於靶向Ras抗原以例如治療或預防癌症的組成物及方法。所揭露的實施例包括結合蛋白，諸如結合至Ras抗原:HLA複合物的T細胞受體。 所揭露的結合蛋白對抗原高度敏感，從而能夠誘導宿主T細胞在肽抗原之低濃度下活化。在某些實施例中，本揭露內容之結合蛋白對於(i)來自人類蛋白質體的胺基酸序列及/或(ii)對於人類HLA對偶基因無同種異體反應性、基本上無同種異體反應性，且/或同種異體反應性的風險低。可將編碼此類結合蛋白的聚核苷酸引入宿主細胞(諸如T細胞)中，且該細胞可用於治療各種癌症的免疫療法中。

Description

對RAS新生抗原具有專一性之結合蛋白及其用途
本發明係有關於對RAS新生抗原具有專一性之結合蛋白及其用途。
發明背景
Ras家族蛋白質係小GTP酶，其參與細胞內的訊息傳輸，包括例如細胞增殖的轉導。例示性RAS蛋白包括KRAS (亦稱為C-K-RAS、CFC2、K-RAS2A、K-RAS2B、K-RAS4A、K-RAS4B、KI-RAS、KRAS1、KRAS2、NS、NS3、RALD、RASK2、K-ras、KRAS原癌基因、GTP酶及c-Ki-ras2)、HRAS以及NRAS。中斷負向生長訊息傳導的RAS蛋白突變可引起細胞的連續增殖。KRAS為多種人類癌症(包括黑色素瘤、子宮內膜癌、甲狀腺癌、胰臟癌、大腸直腸癌、乳癌、卵巢癌及肺癌，以及骨髓白血病的一些情形，諸如AML)中最頻繁突變之原癌基因之一。已開發出靶向KRAS G12C的藥理學抑制劑，但癌症對此等抑制劑的初始抗性及適應性抗性已有報導(例如Awad等人, NEJM 384:2382-2393 (2021))。需要靶向突變型RAS蛋白的新穎療法。
依據本發明之一實施例，係特地提出一種結合蛋白，其包含： (a)  一T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域，其包含SEQ ID NOs.:16、17、42及43中之任一者中所示的互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；及/或 (b)  一TCR β鏈可變(Vβ)區域，其包含SEQ ID NOs.:26、27、52及53中之任一者中所示的CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體， 其中該結合蛋白能夠結合至一肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO.:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO.:3)或由該胺基酸序列組成且其中該HLA包含HLA-A*11。
較佳實施例之詳細說明
本揭露內容大體上係關於對Ras新生抗原具有專一性之結合蛋白、表現其的經修飾之宿主(例如免疫)細胞、編碼該等結合蛋白的聚核苷酸，及有關用途。突變的Ras蛋白(例如KRAS、NRAS、HRAS)可產生新生抗原，包括全長KRAS蛋白(SEQ ID NO.: 1；UniProt KB P01116)之位置12或全長NRAS蛋白(SEQ ID NO.: 78；Uniprot KB P01111)之位置12或全長HRAS蛋白(SEQ ID NO.: 79；Uniprot KB P01112)之位置12的G→V突變。
在本揭露內容中，提供能夠結合至Ras新生抗原的結合蛋白。在某些態樣中，提供結合蛋白(及包含異源聚核苷酸的宿主細胞，諸如免疫細胞，該異源聚核苷酸編碼本揭露內容之Ras專一性結合蛋白)，該等結合蛋白包含TCR Vα區域及TCR Vβ區域，其中該等結合蛋白能夠結合至Ras肽抗原:HLA複合物，其中Ras肽抗原包含SEQ ID NOs: 2或3中之任一者中所示的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11，諸如HLA-A*11:01。
所揭露的結合蛋白對抗原高度敏感，在某些實施例中能夠誘導宿主T細胞在肽抗原濃度低的情況下活化。在表現結合蛋白之(例如CD8+或CD4+) T細胞群或樣本的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-9 M (例如在-9 M與-10 M之間)]肽存在下具有活化標記物 Nur77的半數最大表現。在表現結合蛋白之(例如CD8+或CD4+) T細胞群或樣本的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-10 M (例如在-10 M與-11 M之間)]存在下具有CD137的半數最大表現。在表現結合蛋白之(例如CD8+或CD4+) T細胞群或樣本的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-10 M (例如在-10 M與-11 M之間)]肽存在下具有IFN-γ的半數最大表現。
表現根據本揭露內容之結合蛋白的宿主(例如T)細胞在表現突變型KRAS之癌細胞株存在下活化(例如如根據CD137的表現所測定)，該等癌細胞株包括OVCAR5 (卵巢漿液性腺癌)、DAN-G (胰臟腺癌)、CFPAC1 (胰臟腺癌)、SW480 (大腸癌)、SW527 (乳癌)及NCI-H441 (肺腺癌)細胞株。
在一些實施例中，表現根據本揭露內容之結合蛋白的宿主細胞(例如T細胞，諸如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)能夠在活體外專一性殺滅表現突變型KRAS之細胞(例如SW480細胞，諸如以8:1效應子:標靶比率、4:1效應子:標靶比率或2:1效應子:標靶比率)逾144小時，包括當在再攻擊背景下、在第72小時添加額外的腫瘤細胞(亦即，額外的表現突變型KRAS之細胞)時。
在某些實施例中，本揭露內容之結合蛋白對於(i)來自人類蛋白質體的胺基酸序列及/或(ii)對於人類HLA對偶基因無同種異體反應性、基本上無同種異體反應性，且/或同種異體反應性的風險低。
在本文所揭示之任一實施例中，結合蛋白可為人類的、人源化的或嵌合的。亦提供編碼結合蛋白的聚核苷酸、包含聚核苷酸的載體，及包含聚核苷酸及/或載體且/或表現結合蛋白的宿主細胞。本發明所揭露之結合蛋白及宿主細胞(例如T細胞、NK細胞、NK-T細胞)適用於治療與KRAS新生抗原相關的疾病或病症，諸如癌症。本發明所揭露之結合蛋白亦可結合至人類NRAS或人類HRAS中所產生的G12V抗原，該等蛋白質在殘基G12附近的區域中包含與KRAS一致的序列。因此，所揭露的組成物適用於治療與包含G12V突變之KRAS新生抗原、包含G12V突變之NRAS新生抗原或包含G12V突變之HRAS新生抗原或其任何組合相關的疾病或病症。
亦提供本發明所揭露之結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞及有關組成物的方法及用途，其用於治療與如本文所提供之KRAS、NRAS及/或HRAS突變相關的疾病或病症。
亦提供包含以下之方法：將編碼本發明所揭露之結合蛋白的聚核苷酸引入(或將包含聚核苷酸之載體引入)宿主細胞中或引入多個宿主細胞或宿主細胞群或樣本中。在一些實施例中，聚核苷酸或載體進一步編碼：包含CD8共受體α鏈之胞外部分的多肽；包含CD8共受體β鏈之胞外部分的多肽，或二者。在某些實施例中，該或該等宿主細胞包含T細胞，諸如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。在某些實施例中，一或多個宿主細胞包含初代T細胞。在某些實施例中，該或該等宿主細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，方法進一步包含培養該或該等宿主細胞。在一些實施例中，該或該等宿主細胞來自患有與KRAS G12V或NRAS G12V或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的個體。在一些實施例中，該疾病或病症包含癌症。在一些實施例中，個體的HLA-A11 (諸如HLA-A*11:01)表現呈陽性。在某些實施例中，該或該等宿主細胞來自健康個體。在一些實施例中，該方法係在活體外執行。在其他實施例中，該方法係離體執行。亦提供藉由該方法產生的宿主細胞、宿主細胞群或宿主細胞樣本。在一些實施例中，宿主細胞群包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者。在一些實施例中，方法進一步包含選擇CD8+ T細胞與CD4+ T細胞且將其合併，以提供包含約1:1比率之CD8+ T細胞與CD4+ T細胞的組成物。
在更詳細地闡述本揭露內容之前，提供本文中使用之某些術語的定義可有助於理解其。本揭露內容中闡述了其他定義。
在本說明書中，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所述範圍內之任何整數值及適當時其分率(諸如整數之十分之一及百分之一)。此外，除非另外指明，否則本文所述之與諸如聚合物亞單元、尺寸或厚度之任何物理特點相關的任何數值範圍應理解為包括所述範圍內之任何整數。如本文所用，除非另外指明，否則術語「約」意謂指定範圍、值或結構之±20%。應理解，如本文所用，術語「一(a/an)」係指所列舉組分中之「一或多者」。使用選擇性連接詞(例如「或」)應理解為意謂替代方案中之一者、兩者或其任何組合。如本文所用，術語「包括」、「具有」及「包含」同義地使用，該等術語及其變化形式意欲被理解為非限制性的。
另外，應理解，本申請案揭露了由本文所述之結構及取代基之各種組合衍生的個別化合物或化合物群組，其揭露的程度如同各化合物或化合物群組被個別地闡述一般。因此，特定結構或特定取代基之選擇係在本揭露內容之範疇內。
術語「主要由……組成」不等同於「包含」，且係指主張之指定材料或步驟，或實質上不影響所主張之標的物之基本特徵的材料或步驟。舉例而言，當區域、區、模組或蛋白質之特定胺基酸序列包括延伸、缺失、突變或其組合(例如位於胺基端或羧基端或各區域之間的胺基酸)且其組合佔區域、區、模組或蛋白質之長度的至多20% (例如至多15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)且基本上不影響區域、區、模組或蛋白質之活性(例如結合蛋白之標靶結合親和力或親合力)(亦即，活性降低不大於50%，諸如不大於40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%)時，蛋白質區域、區或模組(例如結合區域、鉸鏈區、連接子模組)或蛋白質(其可具有一或多個區域、區或模組)「主要由該胺基酸序列組成」。
如本文所用，「蛋白質」或「多肽」係指胺基酸殘基之聚合物。蛋白質適用於天然存在之胺基酸聚合物，以及其中一或多個胺基酸殘基為天然存在之相應胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。在一些實施例中，「肽」(例如肽抗原)係指長度約8至10個胺基酸殘基的聚合物。
如本文所用，「造血前驅細胞」為可來源於造血幹細胞或胎兒組織的細胞，其能夠進一步分化為成熟細胞類型(例如免疫系統細胞)。例示性造血前驅細胞包括具有CD24 LoLin -CD117 +表型之彼等細胞或在胸腺中發現之彼等細胞(稱為前驅胸腺細胞)。
如本文所用，「免疫系統細胞」意謂免疫系統中來源於骨髓造血幹細胞之任何細胞，其產生二個主要譜系：骨髓前驅細胞(其產生骨髓細胞，諸如單核球、巨噬細胞、樹突細胞、巨核細胞及顆粒球)及淋巴前驅細胞(其產生淋巴細胞，諸如T細胞、B細胞及自然殺手(NK)細胞)。例示性免疫系統細胞包括CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、調節T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞及樹突細胞。巨噬細胞及樹突細胞可稱為「抗原呈現細胞」或「APC」，其為特殊化細胞，當與肽複合之APC表面上的主要組織相容複合物(MHC)受體與T細胞表面上的TCR相互作用時，該等特殊化細胞可活化T細胞。
「T細胞」或「T淋巴球」為免疫系統細胞，其在胸腺中成熟且產生T細胞受體(TCR)。T細胞可為原生的(「T N」；不暴露於抗原；相較於T CM(本文所述)，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127及CD45RA的表現增強，及CD45RO的表現減少或無表現)、記憶T細胞(T M)(遭遇過抗原且長期存活)，包括幹細胞記憶T細胞，以及效應細胞(遭遇過抗原，具細胞毒性)。T M可進一步分成中樞記憶T細胞亞群(T CM，表現CD62L、CCR7、CD28、CD95、CD45RO及CD127)及效應記憶T細胞亞群(T EM，表現CD45RO；CD62L、CCR7、CD28及CD45RA的表現減少)。效應T細胞(T E)係指遭遇過抗原的CD8 +細胞毒性T淋巴球，其表現CD45RA，相較於T CM具有減少的CD62L、CCR7及CD28表現，且對顆粒酶及穿孔素呈陽性(例如在刺激後)。輔助T細胞(T H)為CD4 +細胞，其藉由釋放細胞介素來影響其他免疫細胞之活性。CD4 +T細胞可活化及抑制適應性免疫反應，且誘導彼等二種功能中之哪一種將取決於例如轉錄因子以及其他細胞及訊息的存在。T細胞可使用已知技術收集，且各種亞群或其組合可藉由已知技術富集或耗乏，諸如藉由親和力結合至抗體、流動式細胞測量術或免疫磁性選擇。其他例示性T細胞包括調節性T細胞，諸如CD4 +CD25 +(Foxp3 +)調節性T細胞及Treg17細胞，以及Tr1、Th3、CD8 +CD28 -及Qa-1限制性T細胞。
「T細胞受體」(TCR)係指具有可變結合區域、恆定區域、跨膜區及短胞質尾的免疫球蛋白超家族成員；參見例如Janeway等人, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease 第3版, Current Biology Publications, 第433頁, 1997)，其能夠特異性結合至與MHC受體結合的抗原肽。TCR可發現於細胞表面上或發現呈可溶形式且通常包含雜二聚體，其具有α及β鏈(分別亦稱為TCRα及TCRβ)，或γ及δ鏈(分別亦稱為TCRγ及TCRδ)。在某些實施例中，編碼本揭露內容之結合蛋白(例如TCR)的聚核苷酸可經密碼子最佳化，以增強特定宿主細胞中的表現，諸如免疫系統細胞、造血幹細胞、T細胞、初代T細胞、T細胞株、NK細胞或自然殺手T細胞(Scholten等人, Clin. Immunol.119:135, 2006)。可表現本揭露內容之結合蛋白及TCR的例示性T細胞包括CD4 +T細胞、CD8 +T細胞及其有關亞群(例如原生、中樞記憶、幹細胞記憶、效應記憶)。
如同免疫球蛋白(例如抗體)，TCR鏈之胞外部分(例如α鏈、β鏈)可含有二個免疫球蛋白區域：N端之可變區域(例如α鏈可變區域或V α，β鏈可變區域或V β；典型地基於Kabat編號之胺基酸1至116 (Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，美國健康及人類服務部(US Dept. Health and Human Services)，公共衛生處(Public Health Service)，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，1991，第5版)，及一個鄰近於細胞膜之恆定區域(例如α鏈恆定區域或C α，典型地為依據Kabat之5個胺基酸117至259，β鏈恆定區域或C β，典型地為依據Kabat之胺基酸117至295)。另外，如同免疫球蛋白，可變區域含有藉由構架區(FRs)分隔的互補決定區(CDRs)(參見例如Jores等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA87:9138, 1990; Chothia等人, EMBO J.7:3745, 1988；亦參見Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003)。本揭露內容中使用之TCR來源可來自各種動物物種，諸如人類、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動物。
術語「可變區」或「可變區域」係指免疫球蛋白超家族結合蛋白的區域(例如TCR α鏈或β鏈(γδ TCR的γ鏈及δ鏈))，該區域參與免疫球蛋白超家族結合蛋白(例如TCR)對抗原的結合。原生TCR之α鏈及β鏈的可變區域(分別為Vα及Vβ)通常具有類似結構，各區域包含一般守恆的四個骨架區(FR)及三個CDR。Vα區域係由二個各別DNA區段、可變基因區段及接合基因區段(V-J)編碼；Vβ區域係由三個各別DNA區段、可變基因區段、多樣性基因區段及接合基因區段(V-D-J)編碼。單一Vα或Vβ區域可足以賦予抗原結合專一性。另外，可藉由利用來自結合抗原之TCR的Vα或Vβ區域分別篩選互補Vα或Vβ區域的文庫來分離出結合特定抗原的TCRs。
術語「互補決定區」及「CDR」與「高變區」或「HVR」同義且在此項技術中已知指免疫球蛋白(例如TCR)可變區內的胺基酸序列。CDRs賦予抗原特異性及結合親和力且一級胺基酸序列藉由骨架區彼此隔開。一般而言，各TCR α鏈可變區中存在三個CDR (αCDR1、αCDR2、αCDR3 (亦分別標識為CDR1α、CDR2α及CDR3α))且各TCR β鏈可變區中存在三個CDR (βCDR1、βCDR2、βCDR3 (亦分別標識為CDR1β、CDR2β及CDR3β))。TCR中的CDR3被認為是負責識別經處理之抗原的主要CDR。一般而言，CDR1及CDR2主要或完全與MHC相互作用。
CDR1及CDR2係在TCR可變區編碼序列之可變基因區段內編碼，而CDR3係由跨越Vα之可變及接合區段的區域編碼或由跨越Vβ之可變、多樣性及接合區段的區域編碼。因此，若已知Vα或Vβ之可變基因區段的屬性，則可推導出其相應CDR1及CDR2的序列；例如根據如本文所述的編號方案來推導。由於在重組過程期間發生核苷酸添加及損失，因此相較於CDR1及CDR2，CDR3 (尤其是CDR3β)典型地具有顯著更大的多樣性。
可根據編號方案(例如Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia及Aho)比對TCR可變區域序列，從而允許對等效殘基位置進行註釋且使用例如ANARCI軟體工具比較不同分子(2016, Bioinformatics 15:298-300)。編號方案為TCR可變區域中的骨架區及CDR提供了標準化定界。在某些實施例中，本揭露內容之CDR係根據IMGT編號方案標識或定義(Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003; imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php)。在一些實施例中，CDR (例如CDR3)係根據IMGT接合定義加以標識或定義。在一些實施例中，CDR (例如CDR3，或結合蛋白的所有六個CDR)係根據IMGT定義(或方案或方法)加以標識或定義。根據IMGT標識或定義的CDR實例提供於SEQ ID NOs.: 14至17 (參考11N4A之Vα或TCRα)、24至27 (參考TCR 11N4A之Vβ或TCRβ)、40至43 (參考TCR 11N6之Vα或TCRα)，及50至53 (參考TCR 11N6之Vβ或TCRβ)。在一些實施例中，本揭露內容之CDR (或結合蛋白之所有六個CDR)係根據Kabat編號方案或方法標識或定義。在一些實施例中，本揭露內容之CDR (或結合蛋白之所有六個CDR)係根據Chothia編號方案或方法標識或定義。在一些實施例中，本揭露內容之CDR (或結合蛋白之所有六個CDR)係根據EU編號方案或方法標識或定義。在一些實施例中，本揭露內容之CDR (或結合蛋白之所有六個CDR)係根據增強型Chothia編號方案或方法標識或定義。在一些實施例中，本揭露內容之CDR (或結合蛋白之所有六個CDR)係根據Aho編號方案或方法標識。
本揭露內容中使用之TCR來源可來自多種動物物種中之任一者，諸如人類、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動物。TCR恆定區域序列可來自例如人類、小鼠、有袋動物(例如負鼠、袋狸、袋鼠)、鯊魚或非人類靈長類動物。在某些較佳實施例中，TCR恆定區域序列為人類序列或包含人類序列之工程化變異體。TCR恆定區域可經工程改造以例如改良成對、表現、穩定性或其任何組合。參見例如Cohen等人 , Cancer Res,2007; Kuball等人 , Blood2007; 及Haga-Friedman等人 , Journal of Immunology2009 。TCRCα及Cβ之工程改造實例包括使原生胺基酸突變為半胱胺酸，以便在一個TCR恆定區域之所引入半胱胺酸與另一TCR恆定區域之原生半胱胺酸之間形成二硫鍵。此類突變可包括例如Cα中的T48C、Cβ中的T57C或S57C，或二者。亦提供如下實施例：其中同源TCR恆定區域包含突變，使得例如一個TCR恆定區域(例如Cα及Cβ之一)包含引入的所謂「空腔」(例如可藉由用具有較小側鏈的一或多個胺基酸置換一或多個原生胺基酸而獲得)且另一個TCR恆定區域(例如Cα及Cβ中之另一者)包含補償性的所謂「隆凸」(例如可藉由用具有較大側鏈的一或多個胺基酸置換一或多個原生胺基酸而獲得)，類似於用於促進抗體重鏈優先成對的「臼包杵」組態。亦提供如下實施例：其中使TCR恆定區域胺基酸突變以引入或修改電荷特性，以便有利於突變的恆定區域成對。Voss等人, J. Immunol 180(1):391-401 (2008) doi.org/10.4049/jimmunol.180.1.391中提供為了藉由臼包杵型機制或藉由電荷成對機制促進專一性成對而可產生於Cα及Cβ中之突變實例；亦參見美國專利第9,062,127號。此等文件中所述之TCR恆定區域突變、突變的TCR恆定區域及用於鑑別突變位的方法以引用的方式併入本文中。
改良穩定性的突變可包括Cα跨膜域中之突變：序列LSVIGF突變為序列LLVIVL (「L-V-L」突變；參見Haga-Friedman等人, J Immunol 188:5538-5546 (2012)，其中的TCR突變及突變型TCR恆定區域序列以引用的方式併入本文中)。
如本文所用，術語「CD8共受體」或「CD8」意謂呈α-α均二聚體或α-β雜二聚體形式的細胞表面醣蛋白CD8。CD8共受體有助於細胞毒性T細胞(CD8 +)之功能，且經由其細胞質酪胺酸磷酸化路徑進行訊息傳導來發揮作用(Gao及Jakobsen, Immunol. Today21:630-636, 2000；Cole及Gao, Cell. Mol. Immunol.1:81-88, 2004)。存在五(5)種人類CD8β鏈同功型(參見UniProtKB標識符P10966)及單一人類CD8α鏈同功型(參見UniProtKB標識符P01732)。
「CD4」為免疫球蛋白共受體醣蛋白，其有助於CD4+細胞之TCR與抗原呈現細胞通信(參見Campbell及Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings第六版, 2002))。CD4發現於免疫細胞之表面上，諸如T輔助細胞、單核球、巨噬細胞及樹突細胞，且包括細胞表面表現之四個免疫球蛋白區域(D1至D4)。在抗原呈現期間，CD4連同TCR複合物一起被募集以結合至MHCII分子之不同區域(CD4結合MHCII β2，而TCR複合物結合MHCII α1/β1)。不希望受理論束縛，咸信緊密近接TCR複合物允許CD4相關激酶分子使存在於CD3之細胞質區域上的免疫受體酪胺酸活化模體(ITAMs)發生磷酸化。此活性被認為擴增由活化TCR產生的訊息，以便產生或募集各種類型之免疫系統細胞，包括T輔助細胞，及免疫反應。
在某些實施例中，TCR發現於T細胞(或T淋巴球)之表面上且與CD3複合物締合。「CD3」為六條鏈之多蛋白複合物(參見Abbas及Lichtman，2003；Janeway等人，第172及178頁，1999)，其與T細胞中之抗原訊息傳導相關。在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈、二條CD3ε鏈、及CD3ζ鏈之均二聚體。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈為免疫球蛋白超家族的有關細胞表面蛋白，其含有單一免疫球蛋白區域。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈之跨膜區帶負電，咸信此允許此等鏈與T細胞受體鏈之帶正電區締合。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈之胞內尾各自含有單個守恆模體(已知為以免疫受體酪胺酸為主的活化模體或ITAM)，而各CD3ζ鏈具有三個守恆模體。不希望受理論束縛，咸信ITAMs對於TCR複合物的訊息傳導能力具有重要作用。如本揭露內容中使用的CD3可來自多種動物物種，包括人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。
如本文所用，「TCR複合物」係指CD3與TCR締合而形成的複合物。舉例而言，TCR複合物可由以下構成：CD3γ鏈、CD3β鏈、二條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之均二聚體、TCRα鏈、及TCRβ鏈。或者，TCR複合物可由以下構成：CD3γ鏈、CD3β鏈、二條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之均二聚體、TCRγ鏈、及TCRβ鏈。
如本文所用，「TCR複合物之組分」係指TCR鏈(亦即，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3鏈(亦即，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)，或由二條或更多條TCR鏈或CD3鏈形成的複合物(例如TCRα與TCRβ之複合物、TCRγ與TCRδ之複合物、CD3ε與CD3δ之複合物、CD3γ與CD3ε之複合物，或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ及二條CD3ε鏈之子TCR複合物)。
「嵌合抗原受體」(CAR)係指一種融合蛋白，其經工程改造以含有二個或更多個天然存在之胺基酸序列、區域或模體，該等序列、區域或模體以天然不發生或天然不發生於宿主細胞中的方式連接在一起，該融合蛋白當存在於細胞表面時可充當受體。CARs可包括胞外部分，該胞外部分包含抗原結合區域(例如獲自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，諸如衍生自或獲自對癌症抗原具有專一性之TCR的TCR結合區域、衍生自或獲自抗體的scFv、或衍生自或獲自來自NK細胞之殺手免疫受體的抗原結合區域)，該抗原結合區域連接至跨膜區域及一或多個胞內訊息傳導區域(任擇地含有共刺激域)(參見例如Sadelain等人, Cancer Discov., 3(4):388 (2013)；亦參見Harris及Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016)；Stone等人, Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014)；及Walseng等人, Scientific Reports 7:10713 (2017)，其中CAR構築體及其製備方法以引用的方式併入本文中)。本揭露內容之特異性結合至Ras抗原(例如在肽:HLA複合物之上下文中)的CARs包含TCR Vα區域及Vβ區域。
本揭露內容之任何多肽由聚核苷酸序列編碼時可包含「訊息肽」(亦稱為前導序列、前導肽或過渡肽)。訊息肽使新合成的多肽靶向其在細胞內部或外部的適當位置(例如插入或定域於細胞膜中，或由細胞分泌，或包含於細胞內)。在一些情況下，訊息肽具有約15至約22個胺基酸的長度。可在定域(例如插入膜)或分泌期間或在定域或分泌完成後自多肽移除訊息肽。在一些實施例中，訊息肽自多肽完全移除。在一些實施例中，訊息肽之少於全部、但典型地不多於一個、二個、三個、四個、五個或六個胺基酸保留於多肽且訊息肽的其餘部分移除。具有訊息肽之多肽在本文中稱為「前蛋白」，而訊息肽移除之多肽在本文中稱為「成熟」蛋白或多肽。在本文所揭露之任一實施例中，結合蛋白或融合蛋白包含或為成熟蛋白，或為或包含前蛋白。
「連接子」係指連接二種蛋白質、多肽、肽、區域、區或模體的胺基酸序列，其可提供與二個子結合區域之相互作用相容的間隔功能，使得所得多肽保持對標靶分子的專一性結合親和力(例如scTCR)或保持訊息傳導活性(例如TCR複合物)。在某些實施例中，連接子包含例如約2至約35個胺基酸，或約4至約20個胺基酸，或約8至約15個胺基酸，或約15至約25個胺基酸。例示性連接子包括甘胺酸-絲胺酸連接子。
如本文所用，「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之免疫原性分子。此免疫反應可涉及專一性免疫勝任細胞(例如T細胞)的抗體產生、活化或二者。抗原(免疫原性分子)可為例如肽、醣肽、多肽、醣多肽、聚核苷酸、多醣、脂質或其類似物。顯而易見的是，抗原可合成、重組產生或來源於生物樣本。可含有一或多種抗原之例示性生物樣本包括組織樣本、腫瘤樣本、細胞、生物體液或其組合。抗原可由細胞產生，該等細胞已經修飾或經基因工程改造以表現抗原，或內源性(例如未經修飾或未經人工干預的基因工程改造)表現具有免疫原性的突變或多形性。
如本文所用，「新生抗原」係指宿主細胞產物，其所含的結構變化、變異或突變形成了先前在個體之基因體(亦即，個體之健康組織的樣本)中尚未觀測到或尚未被宿主免疫系統「發現」或識別的新抗原或抗原表位，其：(a)已藉由細胞的抗原處理及轉運機制處理且與MHC (例如HLA)分子締合而呈現至細胞表面上；以及(b)引發免疫反應(例如細胞(T細胞)反應)。新生抗原可來源於例如編碼的聚核苷酸，該等聚核苷酸具有產生變化或突變產物的變化(取代、添加、缺失)；或來源於外源核酸分子或蛋白質插入細胞，或來源於暴露於引起遺傳變化的環境因素(例如化學、放射)。新生抗原可單獨地源自腫瘤抗原，或可源自腫瘤抗原或與腫瘤抗原相關。「腫瘤新生抗原」(或「腫瘤專一性新生抗原」)係指一種蛋白質，其包含與腫瘤細胞或腫瘤內之多個細胞相關、源自或產生於腫瘤細胞或腫瘤內之多個細胞內的新生抗原決定子。腫瘤新生抗原決定子發現於例如含有由腫瘤細胞(例如胰臟癌、肺癌、大腸直腸癌) DNA編碼之一或多種體細胞突變或染色體重排的抗原腫瘤蛋白或肽，以及來自與病毒相關腫瘤(例如子宮頸癌、一些頭頸癌)相關之病毒開放閱讀框的蛋白質或肽。當提及包含如本文中所揭露之突變的Ras抗原時，術語「抗原」與「新生抗原」在本文中可互換使用。
術語「表位」或「抗原表位」包括被同源結合分子(諸如免疫球蛋白、T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體或其他結合分子、區域或蛋白質)識別且專一性結合的任何分子、結構、胺基酸序列或蛋白質決定子。表位決定子一般含有化學活性表面類別的分子，諸如胺基酸或糖側鏈，且可具有特有的三維結構特徵以及荷質比特徵。
如本文所用，術語「KRAS (或NRAS或HRAS)抗原(或新生抗原)」或「KRAS (或NRAS或HRAS)肽抗原(或新生抗原)」或「KRAS (NRAS或HRAS)肽」係指KRAS或NRAS或HRAS蛋白的天然或合成產生之肽部分，其長度在約7個胺基酸、約8個胺基酸、約9個胺基酸或約10個胺基酸至約20個胺基酸範圍內，且包含由G12 (例如G12V)突變引起的至少一個胺基酸變異(其中位置12係參考SEQ ID NO: 1中所示之全長KRAS蛋白序列；且亦分別參考SEQ ID NOs.: 78及79中所示之全長NRAS及HRAS蛋白序列)，該肽可與MHC (例如HLA)分子形成複合物，且本揭露內容之對KRAS或NRAS或HRAS肽:MHC (例如HLA)複合物具有專一性的結合蛋白可專一性結合至諸如複合物。例示性KRAS (或NRAS或HRAS)抗原包含具有胺基酸序列SEQ ID NO.: 2或3的肽、主要由該肽組成或由該肽組成。
「主要組織相容複合物」(MHC)係指將肽抗原遞送至所有有核細胞之細胞表面的醣蛋白。I類MHC分子為雜二聚體，其具有跨膜α鏈(具有三個α區域)及非共價締合之β 2微球蛋白。II類MHC分子由二個跨膜醣蛋白α及β構成，二者均跨膜。各鏈包含二個區域。I類MHC分子將來源於胞溶質之肽遞送至細胞表面，在細胞表面上，肽:MHC複合物被CD8 +T細胞識別。II類MHC分子將來源於囊泡系統之肽遞送至細胞表面，在細胞表面上，其被CD4 +T細胞識別。人類MHC稱為人類白血球抗原(HLA)。對應於「I類」MHC的HLAs呈現來自細胞內部的肽且包括例如HLA-A、HLA-B及HLA-C。對偶基因包括例如HLA A*11，諸如HLA-A*11:01。對應於「II類」MHC的HLAs呈現來自細胞外部的肽且包括例如HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ及HLA-DR。
抗原呈現細胞(APC)(諸如樹突細胞、巨噬細胞、淋巴球或其他細胞類型)處理抗原且APC將抗原呈現至T細胞(包括免疫相容性(例如共享與抗原呈現相關之MHC基因的至少一種對偶基因形式) APC與T細胞之間的侷限於主要組織相容複合物(MHC)之呈現)的原理已良好確立(參見例如Murphy, Janeway's Immunobiology (第8版) 2011 Garland Science, NY; 第6、9及16章)。舉例而言，來源於胞溶質的經處理抗原肽(例如腫瘤抗原、細胞內病原體)一般具有約7個胺基酸至約11個胺基酸的長度且將與I類MHC (HLA)分子締合，而囊泡系統(例如細菌、病毒)中處理的肽一般具有約10個胺基酸至約25個胺基酸不等的長度且與II類MHC (HLA)分子締合。
如本文所用，術語「KRAS專一性結合蛋白」係指一種蛋白質或多肽，諸如TCR、scTv、scTCR或CAR，其結合至KRAS肽抗原或NRAS肽抗原或HRAS肽抗原(或結合至例如細胞表面上的KRAS或NRAS或HRAS肽抗原:HLA複合物)，而不結合至不含有KRAS或NRAS或HRAS肽抗原的肽且不結合至含有此類肽的HLA複合物。
本揭露內容之結合蛋白，諸如TCRs、scTvs、scTCRs及CARs，含有對標靶具有專一性之結合區域。如本文所用，「結合區域」(亦稱為「結合區」或「結合部分」)係指一種分子或其一部分(例如肽、寡肽、多肽、蛋白質)，其具有與標靶(例如KRAS或NRAS或HRAS肽，或KRAS或NRAS或HRAS肽:MHC複合物)專一性及非共價締合、聯合或組合的能力。結合區域包括生物分子、分子複合物(亦即，包含二個或更多個生物分子之複合物)或其他感興趣之標靶的天然存在、合成、半合成或重組產生之結合搭配物。例示性結合區域包括免疫球蛋白可變區或包含其的單鏈構築體(例如單鏈TCR (scTCR)或scTv)。
在某些實施例中，Ras專一性結合蛋白以小於約10 -8M、小於約10 -9M、小於約10 -10M、小於約10 -11M、小於約10 -12M或小於約10 -13M之K d或以與本文所提供之例示性Ras專一性結合蛋白(諸如本文所提供之任一種Ras專一性TCRs)展現的親和力大約相同、至少大約相同或大於該親和力或約等於該親和力的親和力結合至KRAS (或NRAS或HRAS)肽(或KRAS (或NRAS或HRAS):HLA複合物)，例如藉由相同分析所量測。在某些實施例中，Ras專一性結合蛋白包含Ras專一性免疫球蛋白超家族結合蛋白或其結合部分。
如本文所用，「專一性結合」或「對……具有專一性」係指結合蛋白(例如TCR抗體)或結合區域(或其融合蛋白)與標靶分子以等於或大於10 5M -1之親和力或K a(亦即，以1/M為單位之特定結合相互作用之平衡締合常數) (對於此締合反應，其等於締合速率[K on]與解離速率[K off]之比率)締合或聯合，而不與樣本中之任何其他分子或組分明顯締合或聯合。結合蛋白或結合區域(或其融合蛋白)可分類為「高親和力」結合蛋白或結合區域(或其融合蛋白)或「低親和力」結合蛋白或結合區域(或其融合蛋白)。「高親和力」結合蛋白或結合區域係指Ka為至少10 7M -1、至少10 8M -1、至少10 9M -1、至少10 10M -1、至少10 11M -1、至少10 12M -1或至少10 13M -1之彼等結合蛋白或結合區域。「低親和力」結合蛋白或結合區域係指K a為至多10 7M -1、至多10 6M -1、至多10 5M -1之彼等結合蛋白或結合區域。或者，親和力可定義為特定結合相互作用之平衡解離常數(K d)，其單位為M (例如10 -5M至10 -13M)。
在某些實施例中，受體或結合區域可具有「增強的親和力」，其係指經選擇或經工程改造之受體或結合區域對標靶抗原的結合比野生型(或親代)結合區域更強。舉例而言，增強的親和力可歸因於對標靶抗原之K a(平衡締合常數)高於野生型結合區域，歸因於對標靶抗原之K d(解離常數)小於野生型結合區域，歸因於對標靶抗原之解離速率(koff)小於野生型結合區域，或其組合。
已知多種分析用於鑑別專一性結合特定標靶的本揭露內容之結合區域及測定結合區域或融合蛋白親和力，諸如西方墨點法、ELISA、分析型超速離心、光譜法及表面電漿子共振(Biacore®)分析(參見例如Scatchard等人, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949；Wilson, Science 295:2103, 2002；Wolff等人, Cancer Res. 53:2560, 1993；及美國專利第5,283,173號、第5,468,614號或等效物)。亦可使用例如當結合蛋白結合至經標記之HLA-肽複合物或經標記之HLA-肽複合物多聚體(例如四聚體)時所觀測的螢光強度來評估結合及結合親和力。
在某些實施例中，獨自的KRAS (或NRAS或HRAS)專一性結合區域(亦即，不具有KRAS (或NRAS或HRAS)專一性結合蛋白的任何其他部分)可為可溶的且可以小於約10 -8M、小於約10 -9M、小於約10 -10M、小於約10 -11M、小於約10 -12M或小於約10 -13M的K d結合至KRAS (或NRAS或HRAS)(或KRAS (或NRAS或HRAS)肽，或KRAS (或NRAS或HRAS)肽:HLA複合物)。在特定實施例中，KRAS (或NRAS或HRAS)專一性結合區域包括KRAS (或NRAS或HRAS)專一性scTCR (例如單鏈αβTCR蛋白質，諸如包含Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vα或Vα-L-Vβ-Cβ，其中Vα及Vβ分別為TCRα及β可變區域，Cα及Cβ分別為TCRα及β恆定區域，且L為連接子，諸如本文所述之連接子)。在一些實施例中，KRAS (或NRAS或HRAS)專一性結合區域包括KRAS (或NRAS或HRAS)專一性scTv (例如單鏈TCR可變區域蛋白質，諸如Vα-L-Vβ或Vβ-L-Vα，其中Vα及Vβ分別為TCRα及β可變區域，且L為連接子，諸如本文所述之連接子)。
如本文所用，術語「功能親合力」係指對指定濃度之配位體之活體外免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、NK-T細胞)反應的生物學量測值或活化臨限值，其中生物學量測值可包括細胞介素產生(例如IFN-γ產生、IL-2產生等)、細胞毒性活性、活化標記物(例如CD137、Nur77)及增殖。舉例而言，活體外對低抗原劑量作出生物學(免疫學)反應(例如產生細胞介素、展現細胞毒性活性或增殖)的T細胞被視為具有高功能親合力，而具有較低功能親合力的T細胞在誘發類似於高親合力T細胞的免疫反應之前需要較高量的抗原。應理解，功能親合力不同於親和力及親合力。親和力係指結合蛋白與其抗原/配位體之間的任何指定鍵強度。一些結合蛋白為多價的且結合至多種抗原，在此情況下，總連接強度為親合力。
功能親合力與免疫反應的有效性之間存在多種關聯。一些離體研究已顯示不同T細胞功能(例如增殖、細胞介素產生等)可以不同臨限值觸發(參見例如Betts等人, J. Immunol. 172:6407, 2004; Langenkamp等人, Eur. J. Immunol. 32:2046, 2002)。影響功能親合力的因素可包括(a) TCR對pMHC複合物的親和力，亦即，TCR與pMHC之間的相互作用強度(Cawthon等人, J. Immunol. 167:2577, 2001)；(b) TCR及在一些實施例中CD4或CD8共受體於宿主細胞上的表現位準；(c)訊息傳導分子的分佈及組成(Viola及Lanzavecchia, Science 273:104, 1996)，以及減弱T細胞功能及TCR訊息傳導之分子的表現位準。
指定的暴露時間之後，在基線與最大反應之間誘導半數最大反應(例如宿主細胞產生細胞介素或活化標記物；結合至經標記肽:HLA多聚體時的螢光強度)所必需的抗原濃度被稱為「半數最大有效濃度」或「EC50」。EC50值一般呈現為莫耳濃度(莫耳/公升)量，但其通常換算成如下對數 - log 10(EC50)。舉例而言，若EC50等於1 µM (10 -6M)，則log 10(EC50)值為-6。另一使用值為pEC50，其定義為EC50的負對數(-log 10(EC50))。在以上實例中，等於1 µM的EC50具有6的pEC50值。在某些實施例中，本揭露內容之結合蛋白的功能親合力將包含結合蛋白促進T細胞活化及/或產生IFNγ的能力量測值，其可使用此項技術中已知及本文所述之分析量測。在某些實施例中，功能親合力將包含結合蛋白在結合至抗原後活化宿主細胞(諸如T細胞)之能力的量測值。
本文所揭露之結合蛋白可包含高功能親合力，其可例如促進針對甚至較低含量的(例如HLA-A*11:01)呈現KRAS G12突變型肽(諸如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之KRAS G12V突變型肽)誘發免疫細胞效應功能(例如活化、增殖、細胞介素產生及/或細胞毒性)。
在一些實施例中，結合蛋白對KRAS G12 (例如G12V)突變型肽的log10EC50為約-6.0或更小、約-6.1或更小、約-6.2或更小、約-6.3或更小、約-6.4或更小、約-6.5或更小、約-6.6或更小、約-6.7或更小、約-6.8或更小、約-6.9或更小、約-7.0或更小、約-7.1或更小、約-7.2或更小、約-7.3或更小、約-7.4或更小、約-7.5或更小、約-7.6或更小、約-7.7或更小、約-7.8或更小、約-7.9或更小、約-8.0或更小、約-8.1或更小、約-8.2或更小、約-8.3或更小、約-8.4或更小、約-8.5或更小、約-8.6或更小、約-8.7或更小、約-8.8或更小、約-8.9或更小、約-9或更小、約-9.1或更小、約-9.2或更小、約-9.3或更小、約-9.4或更小、約-9.5或更小、約-9.6或更小、約-9.7或更小、約-9.8或更小、約-9.9或更小、或約-10或更小。
在一些實施例中，本文所揭露之宿主細胞包含結合蛋白(例如TCR)，該結合蛋白以小於約100 mM、小於約10 mM、小於約1 mM、小於約500 μM、小於約100 μM、小於約50 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約4 μM、小於約3 μM、小於約2 μM、小於約1 μM、小於約900 nM、小於約800 nM、小於約700 nM、小於約600 nM、小於約500 nM、小於約400 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約1 nM、小於約900 pM、小於約800 pM、小於約700 pM、小於約600 pM、小於約500 pM、小於約400 pM、小於約300 pM、小於約200 pM、小於約100 pM、小於約90 pM、小於約80 pM、小於約70 pM、小於約60 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約30 pM、小於約20 pM、小於約10 pM、小於約5 pM或小於約1 pM的EC50 (例如表現結合蛋白之T細胞群達到半數最大活化時的肽劑量)結合至結合蛋白的標靶抗原(例如KRAS G12突變型肽，諸如KRAS G12V突變型肽，例如存在於肽:HLA (例如HLA-A*11:01)複合物中)。可藉由分析測定EC50，以鑑別T細胞群達到半數最大活化時的肽劑量，例如在各種濃度之突變型肽存在下暴露於標靶細胞後的活化標記物(例如CD137、CD69、顆粒酶B、CD107a、IFN-γ、TNF-a、IL-12、Nur77、細胞介素、介白素、干擾素)表現所反映。
在一些實施例中，本文所揭露之宿主細胞包含結合蛋白(例如TCR)，該結合蛋白以至少約100 mM、至少約10 mM、至少約1 mM、至少約500 μM、至少約100 μM、至少約50 μM、至少約10 μM、至少約5 μM、至少約4 μM、至少約3 μM、至少約2 μM、至少約1 μM、至少約900 nM、至少約800 nM、至少約700 nM、至少約600 nM、至少約500 nM、至少約400 nM、至少約300 nM、至少約200 nM、至少約100 nM、至少約90 nM、至少約80 nM、至少約70 nM、至少約60 nM、至少約50 nM、至少約40 nM、至少約30 nM、至少約20 nM、至少約10 nM、至少約5 nM、至少約1 nM、至少約900 pM、至少約800 pM、至少約700 pM、至少約600 pM、至少約500 pM、至少約400 pM、至少約300 pM、至少約200 pM、至少約100 pM、至少約90 pM、至少約80 pM、至少約70 pM、至少約60 pM、至少約50 pM、至少約40 pM、至少約30 pM、至少約20 pM、至少約10 pM、至少約5 pM或至少約1 pM的EC50 (例如表現結合蛋白之T細胞群達到半數最大活化時的肽劑量)結合至結合蛋白的標靶抗原(例如KRAS G12突變型肽，諸如KRAS G12V突變型肽，例如存在於肽:HLA (例如HLA-A*11:01)複合物中。
在一些實施例中，結合蛋白(例如TCR)以小於約100 mM、小於約10 mM、小於約1 mM、小於約500 μM、小於約100 μM、小於約50 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約4 μM、小於約3 μM、小於約2 μM、小於約1 μM、小於約900 nM、小於約800 nM、小於約700 nM、小於約600 nM、小於約500 nM、小於約400 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約1 nM、小於約900 pM、小於約800 pM、小於約700 pM、小於約600 pM、小於約500 pM、小於約400 pM、小於約300 pM、小於約200 pM、小於約100 pM、小於約90 pM、小於約80 pM、小於約70 pM、小於約60 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約30 pM、小於約20 pM、小於約10 pM、小於約5 pM或小於約1 pM的KD結合標靶(例如KRAS G12突變型肽，諸如KRAS G12V突變型肽，例如存在於肽:HLA (例如HLA-A*11:01)複合物中)。
亦考慮了融合蛋白，其包含本揭露內容之scTCR或scTv，該scTCR或scTv連接至抗體(例如IgG (1、2、3、4)、IgE、IgD、IgA、IgM及其變異體)或其片段(例如在一些實施例中，保持結合至一或多種Fc受體、C1q、蛋白質A、蛋白質G或其任何組合的片段)的恆定區域(例如重鏈恆定區域或其組合，諸如Fc、CH2、CH3、CH4及/或CH1)，且包括免疫球蛋白重鏈單體及多聚體，諸如Fc二聚體；參見例如Wong等人, J. Immunol. 198:1增刊(2017)。包含突變的變異型Fc多肽已為人所知且在本揭露內容內予以考慮，該等突變增強、減少或消除對例如FcRn或其他Fc受體的結合或被例如FcRn或其他Fc受體結合。
在某些實施例中，本揭露內容之結合蛋白或融合蛋白(例如TCR、scTCR、CAR)係由宿主細胞(例如異源性表現結合蛋白或融合蛋白的T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現。此類宿主細胞對KRAS (或NRAS或HRAS)肽抗原或KRAS (或NRAS或HRAS)肽抗原:HLA複合物的親合力可如下測定：例如使宿主細胞暴露於肽，或暴露於肽:HLA複合物(例如作為四聚體組織化)，或暴露於將肽(任擇地以肽:HLA複合物)呈現至宿主細胞的抗原呈現細胞(APC)，且接著量測宿主細胞活性，諸如細胞介素(例如IFN-γ；TNFα)的產生或分泌；宿主細胞訊息傳導或活化組分(例如CD137 (4-1BB))的表現；宿主細胞的增殖；或APC的殺滅(例如利用標記鉻釋放分析)。
如本文所用，「核酸」或「核酸分子」或「聚核苷酸」係指藉由例如聚合酶鏈反應(PCR)或活體外轉譯而產生的去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、聚核苷酸、其片段中之任一者，且亦指藉由接合、剪斷、核酸內切酶作用或核酸外切酶作用中之任一者產生的片段。在某些實施例中，本揭露內容之核酸係藉由PCR產生。核酸可由單體構成，該等單體為天然存在之核苷酸(諸如去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸)、天然存在之核苷酸類似物(例如天然存在之核苷酸的α-鏡像異構形式)，或二者的組合。經修飾之核苷酸可在糖部分、或嘧啶或嘌呤鹼部分中具有修飾或可具有糖部分或嘧啶或嘌呤鹼部分之置換。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或此類鍵之類似物連接。磷酸二酯鍵之類似物包括硫代膦酸酯、二硫代膦酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。核酸單體可包含硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵或硒代磷酸酯鍵，或其任何組合。核酸分子可為單股或雙股核酸。
術語「分離」意謂材料自其原始環境(例如若其為天然存在的，則為天然環境)中移除。舉例而言，存在於活動物中的天然存在之核酸或多肽未經分離，但與天然系統中之一些或所有共存材料分離的相同核酸或多肽經分離。此類核酸可為載體之一部分且/或此類核酸或多肽可為組成物(例如細胞溶解物)之一部分，且仍經分離，因為此類載體或組成物不為核酸或多肽之天然環境的一部分。在一些實施例中，提供分離的結合蛋白、聚核苷酸、載體或宿主細胞。術語「基因」意謂參與產生多肽鏈之DNA區段；其包括編碼區之前及之後的區域(「前導序列及尾序列」)以及介於個別編碼區段(外顯子)之間的介入序列(內含子)。
如本文所用，術語「重組」、「工程化」及「修飾」係指細胞、微生物、核酸分子、多肽、蛋白質、質體或載體已藉由引入外源核酸分子而經修飾，或係指細胞或微生物已藉由人工干預而經基因工程改造，亦即，藉由引入異源核酸分子而經修飾，或係指細胞或微生物已改變，使得內源性核酸分子或基因的表現受到控制、異常調節或具組成性，其中此類變異或修飾可藉由基因工程引入。人類產生的基因變異可包括例如引入編碼一或多種蛋白質或酶的核酸分子(其可包括表現控制元件，諸如啟動子)，或其他核酸分子添加、缺失、取代，或細胞遺傳物質的其他功能破壞或添加。例示性修飾包括來自參考分子或親代分子之異源或同源多肽之編碼區或其功能片段中的修飾。
如本文所用，「突變」係指一種核酸分子或多肽分子的序列相較於參考或野生型核酸分子或多肽分子分別發生變化。突變可導致序列發生若干不同類型的變化，包括核苷酸或胺基酸之取代、插入或缺失。在某些實施例中，突變為一個或三個密碼子或胺基酸的取代、1個至約5個密碼子或胺基酸的缺失，或其組合。
「守恆取代」在此項技術中被認為是一個胺基酸取代具有類似特性之另一胺基酸。例示性守恆取代在此項技術中已熟知(參見例如WO 97/09433第10頁；Lehninger, Biochemistry, 第2版; Worth Publishers, Inc. NY, NY, 第71-77頁, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, 第8頁, 1990)。
在某些實施例中，相較於參考序列，根據本揭露內容的蛋白質(例如結合蛋白、免疫原性肽)包含變異序列(例如相較於本文所揭露之參考TCR CDR (例如CDR3β)的變異TCR CDR (例如CDR3β))。如本文所用，「變異」胺基酸序列、肽或多肽可指相較於參考胺基酸序列，具有一個、二個或三個胺基酸取代、缺失及/或插入的胺基酸序列(或肽或多肽)。在某些實施例中，變異胺基酸序列、肽或多肽保持與參考分子基本上相同的功能(例如對肽:HLA複合物的結合專一性及親和力)；例如，如本文中所揭露之變異TCR片段保持參考TCR結合片段之抗原結合專一性及親和力的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、或100%。
「變化的區域」或「變化的蛋白質」係指與野生型模體、區、區域、肽、多肽或蛋白質(例如野生型TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRα恆定區域、TCRβ恆定區域)具有至少85% (例如至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%)之非一致序列一致性的模體、區、區域、肽、多肽或蛋白質。
變化的區域或變化的蛋白質或衍生物可包括以相同胺基酸之所有可能密碼子選項為主的彼等物及以守恆胺基酸取代為主的密碼子選項。舉例而言，以下六組各自含有彼此為守恆取代的胺基酸：1)丙胺酸(ala；A)、絲胺酸(ser；S)、蘇胺酸(thr；T)；2)天冬胺酸(asp；D)、麩胺酸(glu；E)；3)天冬醯胺酸(asn；N)、麩醯胺酸(gln；Q)；4)精胺酸(arg；R)、離胺酸(lys；K)；5)異白胺酸(ile；I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(met；M)、纈胺酸(val；V)；及6)苯丙胺酸(phe；F)、酪胺酸(tyr；Y)、色胺酸(trp；W)。(亦參見WO97/09433第10頁；Lehninger, Biochemistry, 第2版, Worth Publishers, Inc., NY, NY, 第71-77頁, 1975; Lewin Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, 第8頁, 1990; Creighton，Proteins，W.H. Freeman and Company 1984)。另外，使被編碼序列中之單個胺基酸或小百分比之胺基酸發生變異、添加或缺失的個別取代、缺失或添加亦為「守恆取代」。
術語「構築體」係指含有重組核酸分子之任何聚核苷酸。「轉殖基因」或「轉殖基因構築體」係指含有二個或更多個基因的構築體，該等基因依照自然界中未發現的佈置可操作地連接。術語「可操作地連接(operably-linked)」(或本文中「可操作地連接(operably linked)」)係指二個或更多個核酸分子締合成單一核酸片段，使得一者之功能受另一者影響。舉例而言，當啟動子可影響編碼序列之表現時，啟動子與彼編碼序列可操作地連接(亦即，編碼序列處於啟動子之轉錄控制下)。「不連接」意謂締合的遺傳元件彼此不緊密締合，且一者之功能不影響另一者。在一些實施例中，存在於轉殖基因中的基因可操作地連接至表現控制序列(例如啟動子)。
構築體(例如轉殖基因)可存在於載體(例如細菌載體、病毒載體)中或可整合至基因體中。「載體」為能夠輸送另一核酸分子之核酸分子。載體可為例如質體、黏質體、病毒、RNA載體或線性或環狀DNA或RNA分子，其可包括染色體、非染色體、半合成或合成核酸分子。例示性載體為能夠自主複製(游離型載體)或表現連接至其之核酸分子的載體(表現載體)。適用於本揭露內容之組成物及方法中的載體進一步描述於本文中。
如本文所用，術語「表現」係指以核酸分子(諸如基因)之編碼序列為主，藉以產生多肽的過程。該過程可包括轉錄、轉錄後控制、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後控制、轉譯後修飾，或其任何組合。
在將核酸分子插入細胞中之上下文中，術語「引入」意謂「轉染」、「轉型」或「轉導」，且包括提及將核酸分子併入真核或原核細胞中，其中該核酸分子可併入細胞之基因體(例如染色體、質體或粒線體DNA)中，轉化成自主複製子或短暫表現(例如經轉染之mRNA)。
如本文所用，「異源」或「外源」核酸分子、構築體或序列係指對於宿主細胞而言非原生的核酸分子或核酸分子之一部分，但可與來自宿主細胞之核酸分子或核酸分子之一部分同源。異源或外源核酸分子、構築體或序列之來源可來自不同屬或物種。在某些實施例中，異源或外源核酸分子係藉由例如結合、轉型、轉染、轉導、電穿孔或類似方式添加(亦即，非內源的，或非原生的)至宿主細胞或宿主基因體中，其中所添加的分子可整合至宿主基因體中或以染色體外遺傳物質形式存在(例如質體或自複製載體之其他形式)且可存在於多個複本中。另外，「異源」係指由引入宿主細胞中之外源核酸分子編碼的非原生酶、蛋白質或其他活性，即使宿主細胞編碼同源蛋白質或活性。此外，包含「修飾」或「異源」聚核苷酸或結合蛋白的細胞包括該細胞的後代，不論該後代自身是否經轉導、經轉染或以另外方式被操縱或改變。
如本文所述，超過一種異源或外源核酸分子可作為各別核酸分子、作為多個個別控制的基因、作為多順反子核酸分子、作為編碼融合蛋白之單一核酸分子或其任何組合引入宿主細胞中。舉例而言，如本文中所揭露，宿主細胞可經修飾以表現一或多種異源或外源核酸分子，該等核酸分子編碼對Ras抗原肽具有專一性之所需TCR (例如TCRα及TCRβ)且如本文中所揭露，任擇地亦編碼CD8共受體多肽，該多肽包含α鏈、β鏈或其一部分，諸如能夠結合至MHC的胞外部分。當二個或更多個外源核酸分子引入宿主細胞中時，應理解，二個或更多個外源核酸分子可作為單一核酸分子(例如於單一載體上)、於各別載體上引入，在單個部位或多個部位整合至宿主染色體中，或其任何組合。所提及之異源核酸分子或蛋白質活性的數目係指編碼核酸分子的數目或蛋白質活性的數目，而不一定指引入宿主細胞中之各別核酸分子的數目。
如本文所用，術語「內源」或「原生」係指通常存在於宿主細胞中的基因、蛋白質或活性。此外，相較於親代基因、蛋白質或活性，突變、過度表現、改組、複製或以其他方式改變的基因、蛋白質或活性對於該特定宿主細胞而言，仍被視為內源或原生的。舉例而言，來自第一基因的內源控制序列(例如啟動子、轉譯衰減序列)可用於改變或調節第二原生基因或核酸分子的表現，其中第二原生基因或核酸分子的表現或調節不同於親代細胞的正常表現或調節。
術語「同源」或「同源物」係指發現於或來源於宿主細胞、物種或株系之分子或活性。舉例而言，異源或外源核酸分子可與原生宿主細胞基因同源，且可任擇地具有變化的表現位準、不同序列、變化的活性或其任何組合。
如本文所用，術語「序列一致性」係指將序列對準且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比且不考慮任何守恆取代作為序列一致性之一部分之後，與參考序列中之胺基酸殘基或核鹼基一致(分別)之一個序列中之胺基酸殘基或核鹼基的百分比。可利用如Altschul等人(1997), Nucl. Acids Res.25:3389-3402所定義的NCBI BLAST 2.0軟體產生序列一致性百分比值，其中各參數設置成預設值。另外或可替代地，可測定二個序列之間的序列一致性程度，例如使用針對此目的而設計之電腦程式，諸如全域或局部比對算法來比較該二個序列。非限制性實例包括BLASTp、BLASTn、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、GAP、BESTFIT、Needle (EMBOSS)、Stretcher (EMBOSS)、GGEARCH2SEQ、Water (EMBOSS)、Matcher (EMBOSS)、LALIGN、SSEARCH2SEQ或另一種適合方法或算法。全域比對算法，諸如Needleman及Wunsch算法，可用於將二個序列在其整個長度上比對，從而最大化匹配數目且最小化空位數目。可使用預設設置。
為了產生二個胺基酸序列的相似度評分，可使用評分矩陣，其將正分賦予一些不一致胺基酸(例如守恆胺基酸取代、物理化學特性相似的胺基酸，及/或在直系同源物、同源物或旁系同源物中展現頻繁取代的胺基酸)，評分矩陣之非限制性實例包括PAM30、PAM70、PAM250、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOUM62、BLOSUM80及BLOSUM90。
亦考慮了本揭露內容之核酸分子的變異體。變異型核酸分子與如本文所述之定義或參考聚核苷酸之核酸分子至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%一致且較佳至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.9%一致，或在嚴格雜交條件下與聚核苷酸雜交，該等嚴格雜交條件為0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，約65-68℃；或0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及50%甲醯胺，約42℃。核酸分子變異體保持編碼結合蛋白或其結合區域的能力，該結合蛋白或其結合區域具有本文所述之功能，諸如結合標靶分子。
術語「分離」意謂材料自其原始環境(例如若其為天然存在的，則為天然環境)中移除。舉例而言，存在於活動物中的天然存在之核酸或多肽未經分離，但與天然系統中之一些或所有共存材料分離的相同核酸或多肽經分離。此類核酸可為載體之一部分且/或此類核酸或多肽可為組成物(例如細胞溶解物)之一部分，且仍經分離，因為此類載體或組成物不為核酸或多肽之天然環境的一部分。術語「基因」意謂參與產生多肽鏈之DNA區段；其包括編碼區之前及之後的區域(「前導序列及尾序列」)以及介於個別編碼區段(外顯子)之間的介入序列(內含子)。
在一些情況下，如本文所用，術語「變異體」係指所提及之全長序列之至少一個片段，更特定言之，一或多個胺基酸或核酸序列，相對於全長序列，其在一端或二端被截斷一或多個胺基酸。此類片段包括或編碼具有原始序列或其變異體之至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200個連續胺基酸的肽。變異體之總長度可為至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸。
在一些實施例中，術語「變異體」不僅指至少一個片段，而且指包括胺基酸序列的多肽或其片段，該胺基酸序列與所提及之參考胺基酸序列或其片段至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%一致，其中除多肽之生物活性或摺疊或結構所必需之胺基酸之外的胺基酸缺失或經取代，一或多個此類必需胺基酸係以守恆方式置換，且/或胺基酸以保持多肽之生物活性的方式添加。目前先進技術包括可用於比對二個指定核酸或胺基酸序列及計算一致性程度之多種方法(參見例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 第3版)。在一些實施例中，可使用Clustal W軟體，該軟體使用預設設置(Larkin, M. A.等人(2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)。
在某些實施例中，變異體可另外包括化學修飾，例如同位素標記或共價修飾，諸如糖基化、磷酸化、乙醯化、去羧基化、瓜胺酸化、羥基化及其類似修飾。已知且一般將使用多肽修飾方法，以免消除或實質上減少多肽的所需活性。
在一實施例中，術語核酸分子之「變異體」包括互補股與參考或野生型核酸雜交(例如在嚴格條件下)的核酸。一般技術者可容易確定雜交反應之「嚴格度」，且一般為經驗計算，此視探針長度、洗滌溫度及鹽濃度而定。一般而言，探針愈長，則正確黏接需要的溫度愈高，而較短探針則非如此。雜交一般依賴於變性DNA使存在於低於其解鏈溫度之環境中之互補股再黏接的能力：探針與可雜交序列之間的所需同源性程度愈高，則可使用的相對溫度愈高。因此，較高的相對溫度傾向於使反應條件更嚴格，而較低溫度則非如此。關於雜交反應嚴格度的其他細節及解釋，參見Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc。此外，關於如何藉由雜交來鑑別DNA序列，熟習此項技術者可遵循手冊Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany及Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W.,及Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260中所提供的說明。在一實施例中，任何雜交均應用嚴格條件，亦即，僅當探針與標靶序列70%或更大一致時才發生雜交。與標靶序列一致性程度較低的探針可雜交，但此類雜合體不穩定且在洗滌步驟中、在嚴格條件下移除，例如將鹽濃度降低至2× SSC或任擇地且隨後降低至0.5× SSC，而溫度為例如約50℃至68℃、約52℃至68℃、約54℃至68℃、約56℃至68℃、約58℃至68℃、約60℃至68℃、約62℃至68℃、約64℃至68℃、或約66℃至68℃。在一實施例中，溫度為約64℃至68℃或約66℃至68℃。可將鹽濃度調節至0.2× SSC或甚至0.1× SSC。與參考或野生型序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.5%一致性程度的核酸序列可經分離。在一實施例中，如本文所用，術語核酸序列變異體係指根據遺傳密碼之簡併，與參考核酸序列編碼相同胺基酸序列及其變異體的任何核酸序列。
「功能變異體」係指與本揭露內容之親代或參考化合物在結構上相似或在結構上基本相似的多肽或聚核苷酸，但在一些情形下，在組成方面稍微不同(例如一個鹼基、原子或官能基不同、添加或移除；或一或多個胺基酸突變、插入或缺失)，因此，該多肽或所編碼的多肽能夠以至少50%效率、較佳以親代多肽之活性位準的至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或至少100%執行所編碼之親代多肽的至少一種功能。換言之，當在所選分析中，諸如在用於量測宿主細胞之結合親和力(例如量測締合常數(Ka)或解離常數(KD)的Biacore®或四聚體染色)、親合力或活化的分析中，相較於親代或參考多肽，本揭露內容之多肽或所編碼多肽之功能變異體的效能顯示不大於50%的降幅時，該功能變異體具有「相似的結合」、「相似的親和力」或「相似的活性」。如本文所用，「功能部分」或「功能片段」係指僅包含親代或參考化合物之區域、模體、一部分或片段的多肽或聚核苷酸，且多肽或所編碼的多肽保持與親代或參考化合物之區域、一部分或片段相關的至少50%活性，較佳保持親代多肽之活性位準的至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或至少100%，或提供生物學益處(例如效應功能)。
當在所選分析中，諸如在用於量測結合親和力或量測效應功能(例如細胞介素釋放)的分析中，相較於親代或參考多肽，功能部分或片段的效能顯示不大於50%的降幅(相較於親代或參考多肽，親和力差值較佳不大於20%或10%，或不大於對數差值)時，本揭露內容之多肽或所編碼多肽的「功能部分」或「功能片段」具有「相似結合」或「相似活性」。考慮了特別揭露之結合蛋白及聚核苷酸的功能變異體。
「變化的區域」或「變化的蛋白質」係指與野生型模體、區、區域、肽、多肽或蛋白質(例如野生型TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRα恆定區域或TCRβ恆定區域)具有至少85% (例如至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%)之非一致序列一致性的模體、區、區域、肽、多肽或蛋白質。 結合蛋白
在一個態樣中，本揭露內容提供一種結合蛋白，其包含T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域及TCR β鏈可變(Vβ)區域，其中該結合蛋白能夠結合至肽:HLA複合物，其中該肽包含SEQ ID NO.: 2或SEQ ID NO.: 3中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11，任擇地包含HLA-A*11:01。在本發明所揭露之任一實施例中，結合蛋白可異源地由人類免疫系統細胞(諸如T細胞)表現。
在某些實施例中，Vα區域及/或Vβ區域各自獨立地為人類的、人源化的或嵌合的，且較佳各自為人類的。在一些實施例中，Vα區域為人類的且Vβ區域為人類的。本文所揭露之結合蛋白、組成物及方法可使用來源於人類個體的Vα區域、Vβ區域或其CDR，例如經由對來自人類個體的經分離T細胞或其群體定序。相對於來自其他來源(諸如單一人類HLA對偶基因轉殖基因小鼠)的可變區域及CDRs，自人類個體分離出的TCR Vα區域、Vβ區域及其CDR可具有有利特性。舉例而言，來源於人類個體的Vα區域、Vβ區域及CDRs可在活體內已根據一組完整人類HLA分子所呈現之基本上完整人類肽體經歷負向胸腺選擇，此可降低結合蛋白與其他人類自身抗原交叉反應的可能性。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白對本文所揭露之一或多個HLA對偶基因(例如表3中的HLA對偶基因之一或任何組合)所呈現的人類蛋白質體基本上無反應性。反應性可藉由任何適合的方法測定，諸如本申請案之實例5至7及13中所揭露的彼等方法。在一些實施例中，在500 nM或更低、400 nM或更低、300 nM或更低、200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低、10 nM或更低、5 nM或更低、或1 nM或更低的肽濃度下，觀測到或預測到經結合蛋白轉導之T細胞對一或多個HLA對偶基因所呈現的人類蛋白質體無顯著反應。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白對肽:HLA複合物基本上無反應，其中該肽包含SEQ ID NOs.: 118至148中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。在一些實施例中，HLA包含HLA-A*11。在其他實施例中，HLA包含HLA-A*11:01。
在一些實施例中，結合蛋白包含來源於(例如鑑別於)患有疾病(諸如癌症)之個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變區域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於患有本文所揭露之癌症之人類個體之T細胞的一或多個可變區域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於患有與KRAS G12突變(諸如KRAS G12V或G12D突變)相關之疾病之個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變區域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變區域或一或多個CDR，該個體具有包含KRAS G12突變(諸如KRAS G12V或G12D突變)的細胞。
在一些實施例中，結合蛋白包含來源於健康個體(例如健康人類個體)之T細胞的一或多個可變區域或一或多個CDR。在一些實施例中，健康個體缺乏專一性病理學診斷(例如疾病診斷，諸如癌症診斷)。在一些實施例中，健康個體缺乏專一性病理學診斷，但包含不同的病理學診斷，例如缺乏癌症診斷，但包含高血壓或II型糖尿病的診斷。
本發明所揭露之結合蛋白能夠異源地由宿主細胞(諸如人類免疫細胞，諸如T細胞)表現。另外，本發明所揭露之結合蛋白的表現可將有利特性賦予宿主細胞；例如對本揭露內容之Ras抗原:HLA複合物具有結合專一性、在呈現Ras抗原:HLA之腫瘤細胞或類似物存在下改善活化、增殖或殺滅活性。
舉例而言，在某些實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，任擇地，CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，該免疫細胞能夠專一性殺滅HLA-A*11:01 +腫瘤細胞，該腫瘤細胞表現包含或由SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列組成的肽。可測定目標細胞的殺滅，例如用Incucyte®生物成像平台(Essen Bioscience)測定。在某些實施例中，此平台係使用活化的凋亡蛋白酶及經標記(例如RapidRed或NucRed)的腫瘤細胞訊息，其中量測重疊面積且增加的重疊面積等同於細胞凋亡所致的腫瘤細胞死亡。亦可使用4小時分析來測定殺滅，其中將標記鉻( 51Cr)負載於標靶細胞，且量測上清液中的 51Cr，例如在與表現本揭露內容之結合蛋白的免疫細胞共培育4小時之後量測。在某些實施例中，可利用0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、25:1、50:1或100:1或類似者之效應子:標靶細胞比率進行殺滅分析。
在本發明所揭露之任一實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，任擇地CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，免疫細胞當在HLA-A11:01 +腫瘤細胞存在下時、任擇地進一步在外源IFN-γ存在下具有升高的Nur77表現，該腫瘤細胞表現包含或由SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列組成的肽，其中Nur77表現相較於以下升高：(i)當參考免疫細胞在腫瘤細胞存在下時，不表現結合蛋白之參考免疫細胞(亦即，細胞類型與表現結合蛋白之免疫細胞相同，且另外在表型及/或基因型上與表現結合蛋白之免疫細胞至少基本上相同或在功能上等效的參考免疫細胞)的Nur77表現；及/或(ii)當腫瘤細胞不存在時及/或當表現肽:HLA複合物之抗原呈現細胞不存在時，表現結合蛋白之免疫細胞的Nur77表現，其中該肽包含SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中HLA任擇地為HLA-A*11:01。可測定Nur77表現，例如使用包含Nur77基因座的轉殖基因表現構築體測定，該基因座可操作地連接至編碼報導基因構築體的序列；例如dTomato (參見Ahsouri及Weiss, J Immunol198(2):657-668 (2017))。
在本發明所揭露之任一實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，任擇地CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，該免疫細胞當在HLA-A*02 +腫瘤細胞存在下時、任擇地進一步在外源IFN-γ存在下具有升高的CD137 (亦稱為4-1BB)表現，該腫瘤細胞表現包含或由SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列組成的肽，其中CD137表現相較於以下升高：(i)當參考免疫細胞在腫瘤細胞存在下時，不表現結合蛋白之參考免疫細胞的CD137表現；及/或(ii)當在腫瘤細胞不存在下時及/或當在表現肽:HLA複合物之抗原呈現細胞不存在下時，表現結合蛋白之免疫細胞的CD137表現，其中該肽包含SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中HLA任擇地為HLA-A*11:01。可使用例如流動式細胞測量術、使用經標記之抗CD137抗體測定CD137表現。在某些實施例中，利用16小時分析來量測CD137，其中將免疫細胞與肽或表現該肽的標靶細胞共培育或用肽或表現該肽的標靶細胞刺激。
在本發明所揭露之任一實施例中：(i)結合蛋白係由免疫細胞的異源聚核苷酸編碼；(ii)免疫細胞包含人類CD8 +T細胞、人類CD4+ T細胞或二者；(iii)表現包含或由SEQ ID NO.: 2或3中所示之胺基酸序列組成之肽的腫瘤細胞為HLA-A*11:01 +；及/或(iv)腫瘤細胞包含OVCAR5 (卵巢漿液性腺癌)、DAN-G (胰臟腺癌)、CFPAC1 (胰臟腺癌)、SW480 (大腸癌)、SW527 (乳癌)或NCI-H441 (肺腺癌)細胞。
在某些實施例中，結合蛋白能夠獨立於或在CD8不存在下結合至肽:HLA複合物。CD8非依賴性結合可藉由CD8陰性細胞(例如CD4 +T細胞、傑卡特細胞(Jurkat cell)或類似細胞)對結合蛋白的表現且鑑別細胞對標靶的結合來測定。在一些實施例中，提供的結合蛋白包含：(a) T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域，其包含SEQ ID NOs.: 16、17、42及43中之任一者中所示的互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；及/或(b) TCR β鏈可變(Vβ)區域，其包含SEQ ID NOs.: 26、27、52及53中之任一者中所示的CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體，其中該結合蛋白能夠結合至肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 3)、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中HLA包含HLA-A*11。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11:01。結合蛋白可包含Vα區域及Vβ區域。
Vα區域及/或Vβ區域可為人類的、人源化的或嵌合的，且較佳為人類的。
在某些實施例中，結合蛋白包含(i) SEQ ID NOs.:17及27中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii)SEQ ID NOs.: 16及26中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii) SEQ ID NOs.:53及43中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(iv) SEQ ID NOs.:52及42中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體。在某些實施例中，結合蛋白包含(i) SEQ ID NOs.: 17及27中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列；(ii) SEQ ID NOs.: 16及26中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列；(iii) SEQ ID NOs.: 53及43中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列；或(iv) SEQ ID NOs.: 52及42中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列。
在一些實施例中，結合蛋白進一步：(i)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iv)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(v) (i)至(iv)之任何組合。
在一些實施例中，結合蛋白進一步：(i)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列；(ii)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列；(iii)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列；(iv)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列；或(v) (i)至(iv)之任何組合。
在一些實施例中，結合蛋白進一步：(i)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列；(ii)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列；(iii)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列；及(iv)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列。
在某些實施例中，結合蛋白包含SEQ ID NOs.: 14、15、16或17、24、25及26或27中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
在其他實施例中，結合蛋白包含SEQ ID NOs.: 40、41、42或43、50、51及52或52中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法或編號方案自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列中鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法或編號方案自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法或編號方案自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由EU方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由EU方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由EU方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由EU方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法或編號方案(包括用於CDR3的IMGT及/或IMGT接合)自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法或編號方案(包括用於CDR3的IMGT及/或IMGT接合)自SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列、SEQ ID NO.: 30中所示之胺基酸序列、SEQ ID NO.: 155中所示之胺基酸序列或其組合鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO.: 30或SEQ ID NO.: 155中所示之胺基酸序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由IMGT方法自SEQ ID NO.: 30或SEQ ID NO.: 155中所示之胺基酸序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法或編號方案自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法或編號方案自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49或其組合之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Aho方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 13之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Aho方法自SEQ ID NO: 23之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及/或CDR3α，以及藉由Aho方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及/或CDR3β。在一些實施例中，本文所揭露之結合蛋白包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的CDR1α、CDR2α及CDR3α，以及藉由Aho方法自SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的CDR1β、CDR2β及CDR3β。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR1α，其包含SEQ ID NO: 14或40之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR1α序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR2α，其包含SEQ ID NO: 15或41之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR2α序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR3α，其包含SEQ ID NO: 16、17、42或43之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR3α序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR1β，其包含SEQ ID NO: 24或50之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR1β序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR2β，其包含SEQ ID NO: 25或51之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR2β序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR3β，其包含SEQ ID NO: 26、27、52或53之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR3β序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR1α，相對於SEQ ID NO: 14或40之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR1α序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR2α，相對於SEQ ID NO: 15或41之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR2α序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR3α，相對於SEQ ID NO: 16、17、42或43之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR3α序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR1β，相對於SEQ ID NO: 24或50之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR1β序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR2β，相對於SEQ ID NO: 25或51之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR2β序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：CDR3β，相對於SEQ ID NO: 26、27、52或53之胺基酸序列，其包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR3β序列。取代可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 14或40之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR1α；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR1α序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 15或41之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR2α；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR2α序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 16、17、42或43之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR3α；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的CDR3α序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 24或50之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR1β；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR1β序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 25或51之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR2β；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR2β序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含：相對於SEQ ID NO: 26、27、52或53之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的CDR3β；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的CDR3β序列。插入及/或缺失可發生於CDR之N端、CDR之C端、CDR之胺基酸序列內，或其組合。
本文所揭露之結合蛋白可包含一或多個骨架區(FR)。舉例而言，結合蛋白可包括包含三個CDRs及四個FRs的可變區域，或各自包含三個CDRs及四個FRs的二個可變區域。說明性FR胺基酸序列由SEQ ID NOs: 91至117及153提供。結合蛋白中所用的骨架區可為哺乳動物骨架區。結合蛋白中所用的骨架區可為人類骨架區。結合蛋白中所用的骨架區可為工程化骨架區。
結合蛋白可包含本文所揭露之FR1、FR2及FR3及/或FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vα，該Vα包含：FR1，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 91、103及115中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；FR2，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 92、104中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；FR3，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 93、95、105、107中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；及FR4，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 94、96、106及108中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體。在一些實施例中，結合蛋白包括包含SEQ ID NO.: 115中所示之胺基酸序列的Vα。在一些實施例中，結合蛋白包括包含SEQ ID NO.: 91中所示之胺基酸序列的Vα。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ，該Vβ包含：FR1，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 97、109及153中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；FR2，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 98、110中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；FR3，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 99、101、111、113中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體；及FR4，其包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NOs: 100、102、112、114、116及117中之任一者中所示之胺基酸序列或其變異體。
在一些實施例中，結合蛋白包括包含SEQ ID NO.: 153中所示之胺基酸序列的Vβ。在一些實施例中，結合蛋白包括包含SEQ ID NO.: 97中所示之胺基酸序列的Vβ。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由Kabat方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由Kabat方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由Chothia方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由Chothia方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由EU方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由EU方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由IMGT方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由IMGT方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由增強型Chothia方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由增強型Chothia方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含藉由Aho方法或編號方案自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 39之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含藉由Aho方法自SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 49之可變區域序列鑑別出的FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR1：SEQ ID NO: 91、103或115之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR1序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR2：SEQ ID NO: 92或104之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR2序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR3：SEQ ID NO: 93、95、105或107之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR3序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR4：SEQ ID NO: 94、96、106或108之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR4序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR1：SEQ ID NO: 97或109之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR1序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR2：SEQ ID NO: 98或110之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR2序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR3：SEQ ID NO: 99、101、111或113之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR3序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：包含、主要由以下組成或由以下組成的FR4：SEQ ID NO: 100、102、112、114、116或117之胺基酸序列；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR4序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 91、103或115之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR1；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR1序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 92或104之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR2；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR2序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 93、95、105或107之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR3；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR3序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 94、96、106或108之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR4；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR4序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 97或109或153之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR1；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR1序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 98或110之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR2；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR2序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 99、101、111或113之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR3；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR3序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 100、102、112、114、116或117之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸取代的FR4；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR4序列。取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。取代可為守恆的、非守恆的，或其組合。在一些實施例中，取代為守恆的。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 91、103或115之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR1；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR1序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 92或104之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR2；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR2序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 93、95、105或107之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR3；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR3序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vα區域，該Vα區域包含：相對於SEQ ID NO: 94、96、106或108之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR4；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 13或39之可變區域鑑別出的FR4序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 97或109或153之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR1；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR1序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 98或110之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR2；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR2序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 99、101、111或113之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR3；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR3序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含Vβ區域，該Vβ區域包含：相對於SEQ ID NO: 100、102、112、114、116或117之胺基酸序列，包含至多一個、至多二個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個胺基酸插入及/或缺失的FR4；或藉由Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia或Aho方法自SEQ ID NO: 23或49之可變區域鑑別出的FR4序列。插入及/或缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。
結合蛋白可包含TCRα FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3或FR4區域；TCRβ FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3或FR4區域，或其組合。
在一些實施例中：(i) Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13或39中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；且/或(ii) Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23或154或49中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
在一些實施例中，Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23或154中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
在一些實施例中，Vα區域包含與SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
在某些實施例中，Vα區域包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且Vβ區域包含SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在某些實施例中，結合蛋白包含TCRβ鏈且該TCRβ鏈包含緊接在SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列之N端的胺基酸K-A。在某些實施例中，Vα區域包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列且Vβ區域包含SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，Vα區域係由SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列組成且Vβ區域係由SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列組成。在某些實施例中，Vα區域主要由SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列組成且Vβ區域主要由SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，提供包含TCR α鏈及TCR β鏈的結合蛋白，其中TCR α鏈包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列且TCR β鏈包含SEQ ID NO.: 23或154中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供能夠結合至肽:HLA複合物的結合蛋白，其中該肽包含、主要由或由SEQ ID NO.: 2或SEQ ID NO.: 3組成且其中HLA任擇地為HLA-A*11，進一步任擇地為HLA-A*11:01。在某些實施例中，結合蛋白包含第一多肽及第二多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO.: 23或154中所示之胺基酸序列。第一多肽可為或包含TCRα鏈且/或第二多肽可為或包含TCRβ鏈。在一些實施例中，第一多肽為或包含TCRα鏈且/或第二多肽為或包含TCRβ鏈。
在某些實施例中，Vα區域包含SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且Vβ區域包含SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在某些實施例中，Vα區域包含SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列且Vβ區域包含SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，Vα區域係由SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列組成且Vβ區域係由SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列組成。在某些實施例中，Vα區域主要由SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列組成且Vβ區域主要由SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，提供包含TCR α鏈及TCR β鏈的結合蛋白，其中TCR α鏈包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列且TCR β鏈包含SEQ ID NO.: 23或154中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供包含TCR α鏈及TCR β鏈的結合蛋白，其中TCR α鏈包含SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列且TCR β鏈包含SEQ ID NO.: 30中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供包含TCR α鏈及TCR β鏈的結合蛋白，其中TCR α鏈包含SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列且TCR β鏈包含SEQ ID NO.: 155中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供能夠結合至肽:HLA複合物的結合蛋白，其中該肽包含、主要由或由SEQ ID NO.: 2或SEQ ID NO.: 3組成且其中HLA任擇地為HLA-A*11，進一步任擇地為HLA-A*11:01。在某些實施例中，結合蛋白包含第一多肽及第二多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO.: 20中所示之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO.: 155中所示之胺基酸序列。第一多肽可為或包含TCRα鏈且/或第二多肽可為或包含TCRβ鏈。在一些實施例中，第一多肽為或包含TCRα鏈且/或第二多肽為或包含TCRβ鏈。
在一些實施例中，可變區域包含相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者具有一或多個插入、缺失及/或取代的胺基酸序列。
舉例而言，可變區域可包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸插入。
在一些實施例中，可變區域包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，可變區域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸插入。
一或多個插入可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個插入可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
在一些實施例中，可變區域包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸缺失。
在一些實施例中，可變區域包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸缺失。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，可變區域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸缺失。
一或多個缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個缺失可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
在一些實施例中，可變區域包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸取代。
在一些實施例中，可變區域包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NOs: 13、23、39及49中之任一者，可變區域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
一或多個取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個取代可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
結合蛋白可進一步包含TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)。TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)可為人類的。TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)可為哺乳動物的。TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)可為哺乳動物(例如人類)恆定區域之工程化變異體。在一些實施例中，Cα為人類Cα之工程化變異體且/或Cβ為人類Cβ之工程化變異體。在一些實施例中，Cα為人類Cα之工程化變異體且Cβ為人類Cβ之工程化變異體。
在一些實施例中，Cα包含與SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施例中，Cβ包含與SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70至73中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70至73中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在某些實施例中，Cα及Cβ包含與(i) SEQ ID NOs.: 18及28中分別所示之胺基酸序列；(ii) SEQ ID NOs.: 19及29中分別所示之胺基酸序列；(iii) SEQ ID NOs.: 44及54中分別所示之胺基酸序列；或(iv) SEQ ID NOs.: 45及55中分別所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該等胺基酸序列組成，或包含(i) SEQ ID NOs.: 18及28中分別所示之胺基酸序列；(ii) SEQ ID NOs.: 19及29中分別所示之胺基酸序列；(iii) SEQ ID NOs.: 44及54中分別所示之胺基酸序列；或(iv) SEQ ID NOs.: 45及55中分別所示之胺基酸序列或由該等胺基酸序列組成。
結合蛋白可包含(i) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之胞外區域；(ii) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之跨膜區域；及/或(iii) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之細胞質區域。結合蛋白可包含全長或基本上全長TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈及/或TCR δ鏈。
在一些實施例中，結合蛋白包含TCR α鏈及TCR β鏈，其中TCR α鏈及TCR β鏈包含與(i) SEQ ID NOs.:12及22中分別所示；(ii) SEQ ID NOs.:20及30中分別所示；(iii) SEQ ID NOs.: 12及30中分別所示；(iv) SEQ ID NOs.:20及22中分別所示；(v) SEQ ID NOs.:38及48中分別所示；(vi) SEQ ID NOs.:46及56中分別所示；(vii) SEQ ID NOs.: 38及56中分別所示；或(viii) SEQ ID NOs.: 46及48中分別所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該等胺基酸序列組成；或包含(i) SEQ ID NOs.:12及22中分別所示；(ii) SEQ ID NOs.:20及30中分別所示；(iii) SEQ ID NOs.: 12及30中分別所示；(iv) SEQ ID NOs.:20及22中分別所示；(v) SEQ ID NOs.:38及48中分別所示；(vi) SEQ ID NOs.:46及56中分別所示；(vii) SEQ ID NOs.: 38及56中分別所示；或(viii) SEQ ID NOs.: 46及48中分別所示之胺基酸序列或由該等胺基酸序列組成。
在一些實施例中，提供第一多肽及第二多肽，其中(i)第一多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO.: 83、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且(ii)第二多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO.: 85、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，其中第一多肽與第二多肽可締合以形成多肽二聚體。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有一或多個插入、缺失及/或取代。
舉例而言，結合蛋白可包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸插入。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸插入。
一或多個插入可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個插入可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸缺失。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸缺失。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸缺失。
一或多個缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個缺失可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸取代。
在一些實施例中，結合蛋白包含胺基酸序列，相對於SEQ ID NOs: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，該胺基酸序列具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
一或多個取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個取代可為鄰接的、非鄰接的或其組合。
在本發明所揭露之任一實施例中，結合蛋白可包含TCR、單鏈TCR (scTCR)、scTv或嵌合抗原受體(CAR)。用於產生工程化TCR的方法描述於例如Bowerman等人 , Mol. Immunol., 46(15):3000 (2009)，其技術以引用之方式併入本文中。製備CARs的方法已知於此項技術中且描述於例如美國專利第6,410,319號；美國專利第7,446,191號；美國專利公開案第2010/065818號；美國專利第8,822,647號；PCT公開案第WO 2014/031687號；美國專利第7,514,537號；及Brentjens等人, 2007, Clin. Cancer Res. 13:5426，該等文獻中的技術以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，結合蛋白包含可溶性TCR，該可溶性TCR任擇地與對CD3蛋白具有專一性之結合區域(例如scFv)融合。參見 Elie Dolgin, Nature Biotechnology 40:441-449 (2022)。
在本發明所揭露之任一實施例中，編碼結合蛋白的聚核苷酸可進一步包含：(i)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體α鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼的多肽為或包含CD8共受體α鏈；(ii)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體β鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼的多肽為或包含CD8共受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。不受理論束縛，在某些實施例中，相較於結合蛋白獨自的表現，具有結合至HLA分子之功能的結合蛋白與CD8共受體蛋白質或其一部分的共表現或並行表現可改良宿主細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞，任擇地CD4 +T細胞)的一或多種所需活性。應理解，編碼結合蛋白的聚核苷酸及編碼CD8共受體多肽的聚核苷酸可存在於單一核酸分子上(例如在同一表現載體中)，或可存在於宿主細胞中之各別核酸分子上。
在本發明所揭露之任一實施例中，CD8共受體α鏈可包含、主要由或由SEQ ID NO.: 87或訊息肽移除的SEQ ID NO.: 87組成。編碼SEQ ID NO.: 87之聚核苷酸之一實例提供於SEQ ID NO.: 88中。在一些實施例中，CD8共受體α鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO.: 87或訊息肽移除的SEQ ID NO.: 87具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
在本發明所揭露之任一實施例中，CD8共受體β鏈可包含、主要由或由SEQ ID NO.: 89或訊息肽移除的SEQ ID NO.: 89組成。編碼SEQ ID NO.: 89之聚核苷酸之一實例提供於SEQ ID NO.: 90中。在一些實施例中，CD8共受體β鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO.: 89或訊息肽移除的SEQ ID NO.: 89具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
在某些其他實施例中，聚核苷酸包含：(a)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體α鏈之胞外部分；(b)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體β鏈之胞外部分；及(c)編碼自裂解肽的聚核苷酸，該自裂解肽安置於(a)之聚核苷酸與(b)之聚核苷酸之間。在其他實施例中，聚核苷酸包含編碼自裂解肽且安置於以下二者之間的聚核苷酸：(1)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸之間；及/或(2)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸之間。
在另外其他實施例中，聚核苷酸可包含可操作地同框連接(operably linked in-frame)的以下各者：(i) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnBP)；(ii) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnBP)；(iii) (pnBP)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnCD8β)；(iv) (pnBP)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnCD8α)；(v) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnBP)-(pnSCP2)-(pnCD8β)；或(vi) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnBP)-(pnSCP2)-(pnCD8α)，其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnBP為編碼結合蛋白的聚核苷酸，且其中pnSCP1及pnSCP2各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的(例如P2A、T2A、F2A、E2A)。應理解，自裂解肽可包含其N端及/或C端的連接子。連接子之一實例為GSG。在一些實施例中，提供包含N端GSG連接子的T2A肽。在一些實施例中，GSG-T2A序列包含、主要由或由SEQ ID NO.: 82組成。在一些實施例中，GSG-P2A序列包含、主要由或由SEQ ID NO.: 74組成。
在某些實施例中，所編碼的結合蛋白包含TCRα鏈及TCRβ鏈，其中聚核苷酸包含編碼自裂解肽的聚核苷酸，該自裂解肽安置於編碼TCRα鏈的聚核苷酸與編碼TCRβ鏈的聚核苷酸之間。在其他實施例中，聚核苷酸包含可操作地同框連接的以下各者：(i) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnTCRβ)-(pnSCP3)-(pnTCRα)；(ii) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnTCRβ)-(pnSCP3)-(pnTCRα)；(iii) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnTCRα)-(pnSCP3)-(pnTCRβ)；(iv) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnTCRα)-(pnSCP3)-(pnTCRβ)；(v) (pnTCRβ)-(pnSCP1)-(pnTCRα)-(pnSCP2)-(pnCD8α)-(pnSCP3)-(pnCD8β)；(vi) (pnTCRβ)-(pnSCP1)-(pnTCRα)-(pnSCP2)-(pnCD8β)-(pnSCP3)-(pnCD8α)；(vii) (pnTCRα)-(pnSCP1)-(pnTCRβ)-(pnSCP2)-(pnCD8α)-(pnSCP3)-(pnCD8β)；(viii) (pnTCRα)-(pnSCP1)-(pnTCRβ)-(pnSCP2)-(pnCD8β)-(pnSCP3)-(pnCD8α)，其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnTCRα為編碼TCR α鏈的聚核苷酸，其中pnTCRβ為編碼TCR β鏈的聚核苷酸，且其中pnSCP1、pnSCP2及pnSCP3各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的。在一些實施例中，SCP1包含SEQ ID NO.: 82，SCP2包含SEQ ID NO.: 74，且SCP3包含SEQ ID NO.: 74。
另外或可替代地，編碼結合蛋白的聚核苷酸可編碼安置於二個其他多肽之間(例如TCRβ鏈與TCRα鏈之間)的弗林蛋白酶裂解位或其他蛋白酶裂解位。
在某些實施例中，本揭露內容之所編碼多肽包含一或多個接合胺基酸。「接合胺基酸」或「接合胺基酸殘基」係指多肽之二個相鄰模體、區或區域之間(諸如結合區域與相鄰恆定區域之間或TCR鏈與相鄰自裂解肽之間)的一或多個(例如2至約10個)胺基酸殘基。接合胺基酸可源於以下各者：編碼融合蛋白之構築體的設計(例如在編碼融合蛋白之核酸分子構築期間，使用限制酶部位而產生的胺基酸殘基)；或本揭露內容之所編碼結合蛋白之一或多個區域相鄰的例如自裂解肽裂解(例如安置於TCR α鏈與TCR β鏈之間的P2A肽，其自裂解可使α鏈、TCR β鏈或二者中留下一或多個接合胺基酸)。
在其他實施例中，結合蛋白作為轉殖基因構築體之一部分表現，該構築體編碼且/或本揭露內容之宿主細胞可編碼：一或多種其他輔助蛋白，諸如安全開關蛋白；標籤、選擇標記物；CD8共受體β鏈；CD8共受體α鏈或二者；或其任何組合。適用於編碼且表現結合蛋白及輔助組分(例如安全開關蛋白、選擇標記物、CD8共受體β鏈或CD8共受體α鏈中之一或多者)的聚核苷酸及轉殖基因構築體描述於PCT申請案PCT/US2017/053112中，其中的聚核苷酸、轉殖基因構築體及輔助組分(包括核苷酸及胺基酸序列)以引用的方式併入本文中。應理解，本揭露內容之任何或所有結合蛋白、安全開關蛋白、標籤、選擇標記物、CD8共受體β鏈或CD8共受體α鏈可由單一核酸分子編碼或可由位於或存在於各別核酸分子上的聚核苷酸序列編碼。
例示性安全開關蛋白包括例如截斷的EGF受體多肽(huEGFRt)，其缺乏胞外N端配位體結合區域及胞內受體酪胺酸激酶活性，但保留其原生胺基酸序列，具有I型跨膜細胞表面定域且對醫藥級抗EGFR單株抗體西妥昔單抗(Erbitux) tEGF受體具有構形完整的結合表位(tEGFr; Wang等人, Blood118:1255-1263, 2011)；凋亡蛋白酶多肽(例如iCasp9; Straathof等人, Blood105:4247-4254, 2005; Di Stasi等人, N. Engl. J. Med.365:1673-1683, 2011; Zhou及Brenner, Exp. Hematol.pii:S0301-472X(16)30513-6. doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011)；RQR8 (Philip等人, Blood124:1277-1287, 2014)；來源於人類c-myc蛋白(Myc)的10胺基酸標籤(Kieback等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA105:623-628, 2008)；及標記物/安全開關多肽，諸如RQR (CD20 + CD34；Philip等人, 2014)。
適用於本揭露內容之經修飾宿主細胞的其他輔助組分包含允許鑑別、分選、分離、富集或追蹤細胞的標籤或選擇標記物。舉例而言，可自樣本中分選出具有所需特徵之經標記宿主細胞(例如抗原專一性TCR及安全開蛋白質)以脫離未標記之細胞且更有效地活化且擴增以便包括於所需純度之產物中。
如本文所用，術語「選擇標記物」包含賦予細胞可鑑別之變化的核酸構築體(及所編碼之基因產物)，從而允許偵測及正向選擇經包含選擇標記物之聚核苷酸轉導的免疫細胞。RQR為包含CD20之主要胞外環及二個最小CD34結合部位的選擇標記物。在一些實施例中，編碼RQR的聚核苷酸包含編碼16胺基酸CD34最小表位的聚核苷酸。在一些實施例中，CD34最小表位係CD8共受體莖區域(Q8)之胺基端位置併入。在其他實施例中，CD34最小結合位序列可與CD20之標靶表位組合以形成T細胞的緊湊標記物/自殺基因(RQR8)(Philip等人, 2014，該文獻以引用的方式併入本文中)。此構築體允許選擇表現該構築體的宿主細胞，例如CD34專一性抗體結合至磁性珠粒(Miltenyi)且使用臨床上接受的醫藥抗體利妥昔單抗(rituximab)，從而選擇性地使表現轉殖基因的工程化T細胞缺失(Philip等人, 2014)。
其他例示性選擇標記物亦包括通常不表現於T細胞上之若干種截斷I型跨膜蛋白：截斷的低親和力神經生長因子、截斷的CD19及截斷的CD34 (參見例如Di Stasi等人, N. Engl. J. Med.365:1673-1683, 2011; Mavilio等人, Blood83:1988-1997, 1994; Fehse等人, Mol. Ther.1:448-456, 2000；該等文獻各自全文併入本文中)。CD19及CD34之適用特徵為現成Miltenyi CliniMACs TM選擇系統的可獲得性，其在臨床級分選中可靶向此等標記物。然而，CD19及CD34為相對較大的表面蛋白，其可對載體封裝容量及整合載體的轉錄效率產生重負。亦可使用含有胞外非訊息傳導區域或各種蛋白質(例如CD19、CD34、LNGFR)的表面標記物。可使用任何選擇標記物且應為優良製造規範(Good Manufacturing Practices)可接受的。在某些實施例中，選擇標記物與編碼感興趣之基因產物(例如本揭露內容之結合蛋白，諸如TCR或CAR)的聚核苷酸一起受到表現。選擇標記物之其他實例包括例如報導因子，諸如GFP、EGFP、β-gal或氯黴素(chloramphenicol)乙醯基轉移酶(CAT)。在某些實施例中，選擇標記物(諸如CD34)係由細胞表現且CD34可用於選擇、富集或分離(例如藉由免疫磁性選擇)用於本文所述方法中之感興趣之經轉導細胞。如本文所用，CD34標記物有別於抗CD34抗體，或例如scFv、TCR或結合至CD34的另一抗原識別部分。
在某些實施例中，選擇標記物包含RQR多肽、截斷的低親和力神經生長因子(tNGFR)、截斷的CD19 (tCD19)、截斷的CD34 (tCD34)或其任何組合。
關於RQR多肽，不希望受理論束縛，咸信距宿主細胞表面的距離對於RQR多肽充當選擇標記物/安全開關而言具有重要作用(Philip等人, 2010 (同上))。在一些實施例中，所編碼的RQR多肽包含於所編碼之CD8共受體的β鏈、α鏈或二者中，或任一者或二者的片段或變異體中。在特定實施例中，經修飾之宿主細胞包含編碼iCasp9的異源聚核苷酸及編碼重組CD8共受體蛋白質的異源聚核苷酸，該共受體蛋白質包含含有RQR多肽的β鏈且進一步包含CD8 α鏈。
在一些實施例中，所編碼的CD8共受體包括α鏈或其片段或變異體。人類CD8共受體α鏈前驅體的胺基酸序列已知且提供於例如UniProtKB-P30433 (亦參見UniProtKB-P31783；UniProtKB-P10732；及UniProtKB-P10731)。在一些實施例中，所編碼的CD8共受體包括β鏈或其片段或變異體。人類CD8共受體β鏈前驅體的胺基酸序列已知且提供於例如UniProtKB-P10966 (亦參見UniProtKB-Q9UQ56；UniProtKB-E9PD41；UniProtKB Q8TD28；及UniProtKB-P30434；及UniProtKB-P05541)。
本揭露內容的經分離之聚核苷酸可進一步包含編碼如本文中所揭露之安全開關蛋白、選擇標記物、CD8共受體β鏈或CD8共受體α鏈的聚核苷酸，或可包含編碼其任何組合的聚核苷酸。
在本發明所揭露之任一實施例中，聚核苷酸可經密碼子最佳化以便表現於宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞包含人類免疫系統細胞，諸如T細胞、NK細胞或NK-T細胞(Scholten等人, Clin. Immunol.119:135, 2006)。密碼子最佳化可使用已知的技術及工具進行，例如使用GenScript® OptimumGene TM工具或GeneArt (Life Technologies)。密碼子最佳化序列包括部分密碼子最佳化序列(亦即，一或多個密碼子經最佳化以在宿主細胞中表現)及完全密碼子最佳化序列。應瞭解，在其中聚核苷酸編碼超過一種多肽(例如TCR α鏈、TCR β鏈、CD8共受體α鏈、CD8共受體β鏈及一或多種自裂解肽)的實施例中，各種多肽可獨立地完全密碼子最佳化、部分密碼子最佳化或未經密碼子最佳化。
用於例示性結合蛋白「11N4A」及「11N6」的胺基酸及聚核苷酸序列顯示於表1中。 表1： 與TCRs 11N4A及11N6有關的某些聚核苷酸及胺基酸序列
TCR
   11N4A 11N6
聚核苷酸序列
具有訊息肽的TCR α鏈，原始聚核苷酸 5 33
具有訊息肽、經cys修飾的TCR α鏈 86   
具有訊息肽的TCR β鏈，原始聚核苷酸 6 34
具有訊息肽、經cys修飾的TCR β鏈 84   
TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(A) 7 35
TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(B) 8 --
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(A) 9 36
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(B) 10 --
胺基酸序列
具有訊息肽的TCR α鏈，原始 11 37
不具有訊息肽的TCR α鏈，原始 12 38
不具有訊息肽的TCR α鏈可變區域 13 39
TCR α鏈可變區域，CDR1α 14 40
TCR α鏈可變區域，CDR2α 15 41
TCR α鏈可變區域，CDR3α - IMGT接合 16 42
TCR α鏈可變區域，CDR3α - IMGT 17 43
TCR α鏈恆定區域，原始 18 44
TCR α鏈恆定區域，經cys修飾 19 45
不具有訊息肽、經cys修飾的TCR α鏈 20 46
具有訊息肽、經cys修飾的TCR α鏈 85   
具有訊息肽的TCR β鏈，原始 21 47
不具有訊息肽的TCR β鏈，原始 22 48
不具有訊息肽的TCR β鏈可變區域 23 49
TCR β鏈可變區域，CDR1β 24 50
TCR β鏈可變區域，CDR2β 25 51
TCR β鏈可變區域，CDR3β-IMGT接合 26 52
TCR β鏈可變區域，CDR3β-IMGT 27 53
TCR β鏈恆定區域，原始 28 54
TCR β鏈恆定區域，經cys修飾 29 55
不具有訊息肽、經cys修飾的TCR β鏈 30 56
具有訊息肽、經cys修飾的TCR β鏈 83   
TCRβ-P2A-TCRα 31 57
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα 32 58
亦提供一種聚核苷酸，其包含(i)表現控制序列，該表現控制序列可操作地連接至(ii)編碼SEQ ID NOs.: 17、27、16、26、53、43、52及42中之任一者中所示之胺基酸序列的序列。表現控制序列對於(ii)之序列而言可為異源的。(ii)之序列可經密碼子最佳化，例如用於人類T細胞中的表現。 載體
在另一態樣中，本揭露內容提供一種表現載體，其包含可操作地連接至表現控制序列的如本文所提供之任何聚核苷酸。
本文亦提供包含本揭露內容之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體。載體之一些實例包括質體、病毒載體、黏質體及其他。一些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)，而其他載體可整合至宿主細胞之基因體中，或在引入宿主細胞中後促進聚核苷酸插入之整合且從而連同宿主基因體一起複製(例如慢病毒載體、反轉錄病毒載體)。此外，一些載體能夠引導可操作地連接至其之基因的表現(此等載體可稱為「表現載體」)。根據有關實施例，應進一步理解，若將一或多種藥劑(例如編碼如本文所述之多肽的聚核苷酸)共投予個體，則各藥劑可駐存於各別或同一載體中，且可將多個載體(各含有不同藥劑或相同藥劑)引入細胞或細胞群中或投予個體。
在某些實施例中，本揭露內容之聚核苷酸可操作地連接至載體之某些元件。舉例而言，可操作地連接聚核苷酸序列，該等聚核苷酸序列係為了實現與其接合之編碼序列之表現及處理而必需的。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；高效RNA處理訊息，諸如剪接及聚腺苷酸化訊息；使細胞質mRNA穩定之序列；增大轉譯效率之序列(亦即，Kozak共同序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及可能存在的增強蛋白質分泌之序列。若表現控制序列與感興趣之基因及以反式或在一定距離起作用以控制感興趣之基因的表現控制序列鄰接，則可操作地連接表現控制序列。
在某些實施例中，載體包含質體載體或病毒載體(例如選自慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體之載體)。病毒載體包括反轉錄病毒；腺病毒；細小病毒(例如腺相關病毒)；冠狀病毒；負股RNA病毒，諸如正黏液病毒(例如流感病毒)、棒狀病毒(例如狂犬病及水皰性口炎病毒)、副黏液病毒(例如麻疹及仙台)；正股RNA病毒，諸如小核糖核酸病毒及α病毒；及雙股DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型及2型單純疱疹病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、細胞巨大病毒)及痘病毒(例如牛痘、禽痘及金絲雀痘)。其他病毒包括例如諾沃克病毒(Norwalk virus)、披衣病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒及肝炎病毒。反轉錄病毒之實例包括禽白血病-肉瘤病毒、哺乳動物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV病毒群、慢病毒及泡沫病毒屬(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology第三版, B. N. Fields等人編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
「反轉錄病毒」為具有RNA基因體之病毒，該RNA基因體使用反轉錄酶反轉錄成DNA，反轉錄的DNA接著併入宿主細胞基因體中。「γ反轉錄病毒屬」係指反轉錄病毒科之屬。γ反轉錄病毒之實例包括小鼠幹細胞病毒、鼠類白血病病毒、貓科動物白血病病毒、貓科動物肉瘤病毒及禽類網狀內皮增殖病病毒。如本文所用，「慢病毒載體」意謂用於遞送基因的以HIV為主之慢病毒載體，其可為整合的或非整合的，具有相對較大的封裝容量，且可轉導一系列不同的細胞類型。通常在三種(封裝、包膜及轉移)或更多種質體短暫轉染至生產細胞中之後產生慢病毒載體。如同HIV，慢病毒載體經由病毒表面糖蛋白與細胞表面上之受體的相互作用而進入標靶細胞。進入後，病毒RNA經歷由病毒反轉錄酶複合物介導的反轉錄。反轉錄產物為雙股線性病毒DNA，其為用於病毒整合至感染細胞之DNA中的受質。在一些實施例中，慢病毒載體為自身不活化慢病毒載體。自身不活化慢病毒載體可包含修飾以防止載體之5'長末端重複序列(LTR)中的增強子及啟動子元件轉移至經轉導的細胞，例如在病毒基因體之3'LTR中包含缺失，在一輪反轉錄之後，該缺失轉移至5'LTR中，使得原病毒不含LTR衍生的增強子或啟動子元件。在一些實施例中，慢病毒載體為第三代慢病毒載體。第三代慢病毒載體可使用分成二個或更多個質體的封裝系統，例如一個質體編碼Rev且一個質體編碼Gag及Pol。第三代慢病毒載體可使用缺乏Tat或不需要Tat表現且實際上包含例如與轉移質體上之異源啟動子融合之嵌合5' LTR的的封裝系統。
在某些實施例中，病毒載體可為γ反轉錄病毒屬，例如莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MLV)衍生之載體。在其他實施例中，病毒載體可為更複雜的反轉錄病毒衍生之載體，例如慢病毒衍生之載體。HIV-1衍生之載體屬於此類別。其他實例包括衍生自HIV-2、FIV、馬傳染性貧血病毒、SIV及梅迪-維斯納病毒(Maedi-Visna virus) (綿羊慢病毒)之慢病毒載體。使用反轉錄病毒及慢病毒病毒載體及封裝細胞、以含有TCR或CAR轉殖基因之病毒顆粒轉導哺乳動物宿主細胞的方法為此項技術中已知的且先前已描述於例如美國專利8,119,772；Walchli等人 , PLoS One 6:327930, 2011；Zhao等人 , J. Immunol. 174:4415, 2005；Engels等人 , Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003；Frecha等人 , Mol. Ther. 18:1748, 2010；及Verhoeyen等人 , Methods Mol. Biol. 506:97, 2009。反轉錄病毒及慢病毒載體構築體及表現系統亦可市購。其他病毒載體亦可用於遞送聚核苷酸，包括DNA病毒載體，包括例如以腺病毒為主之載體及以腺相關病毒(AAV)為主之載體；衍生自單純疱疹病毒(HSVs)之載體，包括擴增子載體、複製缺乏型HSV及減毒的HSV (Krisky等人, Gene Ther. 5:1517, 1998)。
開發用於基因治療用途之其他載體亦可聯合使用本揭露內容之組成物及方法使用。此類載體包括衍生自桿狀病毒及α-病毒之載體(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. 第209-40頁，於Friedmann T.編The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab)，或質體載體(諸如睡美人(Sleeping Beauty)或其他轉座子載體)。
當病毒載體基因體包含待作為各別轉錄本在宿主細胞中表現的多個聚核苷酸時，病毒載體亦可在二個(或更多個)轉錄本之間包含允許雙順反子或多順反子表現的其他序列。病毒載體中所用之此類序列的實例包括內部核糖體進入位(IRES)、弗林蛋白酶裂解位、病毒2A肽或其任何組合。
在某些實施例中，載體能夠將聚核苷酸或轉殖基因構築體遞送至宿主細胞(例如造血前驅細胞或人類免疫系統細胞)。在特定實施例中，載體能夠將聚核苷酸或轉殖基因構築體遞送至人類免疫系統細胞，諸如CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、幹細胞記憶T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、樹突細胞或其任何組合。在其他實施例中，載體能夠將轉殖基因構築體遞送至初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。在一些實施例中，編碼本揭露內容之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體可進一步包含聚核苷酸，該聚核苷酸編碼可用於在宿主細胞中執行染色體剔除的核酸酶(例如CRISPR-Cas核酸內切酶或如本文中所揭露之另一種核酸內切酶)或編碼可用於將治療性聚核苷酸或轉殖基因或其一部分在基因置換療法或基因修復療法中遞送至宿主細胞的核酸酶。或者，用於染色體剔除或基因置換或基因修復療法的核酸酶可獨立於編碼本揭露內容之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體遞送至宿主細胞。
在某些實施例中，載體能夠將聚核苷酸遞送至宿主細胞。在其他實施例中，宿主細胞為造血前驅細胞或人類免疫系統細胞。在另外其他實施例中，人類免疫系統細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4- CD8-雙陰性T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、巨噬細胞、單核球、樹突細胞或其任何組合。在又其他實施例中，T細胞為初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
在本發明所揭露之任一實施例中，載體為病毒載體。在某些實施例中，病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
可使用的以轉座子為主之系統之實例包括(但不限於)睡美人(sleeping beauty)(例如來源於類鮭魚之基因體)；背馱(例如來源於鱗翅目細胞及/或避光鼠耳蝠(Myotis lucifugus))；水手(例如來源於果蠅)；青蛙王子(例如來源於斑點青蛙(Rana pipiens))；Tol2 (例如來源於青鱂魚)；及spinON。 宿主細胞
本文亦提供編碼及/或表現結合蛋白(及任擇地，一或多種輔助蛋白，諸如轉導標記物、CD8共受體多肽或類似物，如本文所提供)的宿主細胞。在某些實施例中，提供經修飾以包含本揭露內容之聚核苷酸及/或表現載體且/或表現本揭露內容之結合蛋白的宿主細胞。
任何適合的宿主細胞可經修飾以包括編碼本揭露內容之結合蛋白的異源聚核苷酸，包括例如免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞，或經修飾以包括異源聚核苷酸的NK-T細胞。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞或二者。已描述以所需核酸轉染/轉導T細胞的方法(例如美國專利申請公開案第US 2004/0087025號)，其使用具有所需標靶專一性之T細胞、採用授受性轉移程序(例如Schmitt等人 , Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett等人 , Mol. Ther. 17:742, 2009; Till等人 , Blood 112:2261, 2008; Wang等人 , Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball等人 , Blood 109:2331, 2007; US 2011/0243972; US 2011/0189141; Leen等人 , Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007)，因此依據本文中之教示內容，考慮對此等方法進行調適以適應本發明所揭露之實施例。
任何適當方法可用於轉染或轉導細胞，例如T細胞，或投予本發明方法之聚核苷酸或組成物。用於遞送聚核苷酸至宿主細胞的已知方法包括例如使用陽離子聚合物、脂質樣分子及某些商業產品，諸如IN-VIVO-JET PEI。其他方法包括離體轉導、注射、電穿孔、DEAE-聚葡萄糖、音波負載、脂質體介導之轉染、受體介導之轉導、微彈轟擊、轉座子介導之轉移及其類似方法。轉染或轉導宿主細胞之其他方法係使用本文中更詳細所述的載體。
在某些實施例中，宿主細胞或經修飾之細胞包含造血前驅細胞、幹細胞(例如iPSC)及/或人類免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。在其他實施例中，免疫細胞包含CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4- CD8-雙陰性T細胞、γδ T細胞或其任何組合。在某些其他實施例中，免疫細胞包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。在某些其他實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或二者包含：(i)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體α鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼的多肽為或包含CD8共受體α鏈；(ii)編碼多肽的聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體β鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼的多肽為或包含CD8共受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
宿主細胞可為周邊血液單核細胞(PBMC)。宿主細胞可為淋巴細胞。宿主細胞可為淋巴球。宿主細胞可為T細胞。宿主細胞可為αβ T細胞(是否表現或不表現內源α-β TCR)。宿主細胞可為γδ T細胞(是否表現或不表現內源γ-δ TCR)。宿主細胞可為B細胞。宿主細胞可為自然殺手(NK)細胞。宿主細胞可為自然殺手T (NKT)細胞。宿主細胞可為哺乳動物細胞。宿主細胞可為人類細胞。
宿主細胞可為初代細胞。宿主細胞可為永生化細胞。宿主細胞可為細胞株。宿主細胞可由幹細胞(例如經誘導之多能幹細胞(iPSC)、胚胎幹細胞、造血幹細胞(HSC)或類似幹細胞)分化而成。
在任一前述實施例中，宿主細胞(例如免疫細胞)可經修飾以減少或排除一或多種內源基因的表現，該等內源基因編碼參與免疫訊息傳導或其他有關活性的多肽。例示性基因剔除包括編碼PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、FasL、HLA分子、TCR分子或類似物的彼等基因。不希望受理論束縛，接受經修飾之免疫細胞的同種異體宿主可識別作為外來物質的某些內源性表現之免疫細胞蛋白質，從而可引起經修飾之免疫細胞(例如HLA對偶基因)消除，或可下調經修飾之免疫細胞(例如PD-1、LAG-3、CTLA4、FasL、TIGIT、TIM3)的免疫活性，或可干擾本揭露內容之異源性表現之結合蛋白的結合活性(例如經修飾之T細胞的內源TCR，其結合非Ras抗原且從而干擾經修飾之免疫細胞結合表現Ras抗原的細胞)。
因此，減少或消除此類內源基因或蛋白質之表現或活性可改良經修飾之細胞在自體或同種異體宿主環境中之活性、耐受性或持久性，且可允許該等細胞的投予成為通用的(例如投予任何接受者，不論HLA類型)。在某些實施例中，經修飾之細胞為供體細胞(例如同種異體)或自體細胞。在某些實施例中，本揭露內容之經修飾細胞包含編碼PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、FasL、HLA組分(例如編碼α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白的基因)或TCR組分(例如編碼TCR可變區或TCR恆定區的基因)之一或多種基因的染色體基因剔除(參見例如Torikai等人, Nature Sci. Rep. 6:21757 (2016); Torikai等人, Blood 119(24):5697 (2012); 及Torikai等人 , Blood 122(8):1341 (2013)，其基因編輯技術、組成物及授受性細胞療法以全文引用之方式併入本文中)。
如本文所用，術語「染色體基因剔除」係指基因改變劑或所引入的抑制劑在宿主細胞中阻止(例如減少、延遲、抑制或消除)宿主細胞產生功能活性內源多肽產物。引起染色體基因剔除之改變可包括例如引入無義突變(包括形成過早終止密碼子)、錯義突變、基因缺失及股斷裂，以及抑制宿主細胞中之內源基因表現之抑制性核酸分子的異源表現。
在某些實施例中，染色體基因剔除或基因敲入係藉由對宿主細胞之染色體編輯來實現。可使用例如核酸內切酶進行染色體編輯。如本文所用，「核酸內切酶」係指能夠催化聚核苷酸鏈內之磷酸二酯鍵裂解的酶。在某些實施例中，核酸內切酶能夠裂解標靶基因，從而不活化或「剔除」標靶基因。核酸內切酶可為天然存在、重組、經基因修飾或融合的核酸內切酶。由核酸內切酶引起之核酸股斷裂通常經由同源重組或非同源末端接合(NHEJ)之不同機制修復。在同源重組期間，供體核酸分子可用於供體基因「敲入」、標靶基因「剔除」，且任擇地經由供體基因敲入或標靶基因剔除事件使標靶基因不活化。NHEJ為易錯修復過程，其通常引起DNA序列在裂解位之變化，例如至少一個核苷酸的取代、缺失或添加。NHEJ可用於「剔除」標靶基因。核酸內切酶之實例包括鋅指核酸酶、TALE核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大範圍核酸酶及大範圍TAL。
如本文所用，「鋅指核酸酶」(ZFN)係指包含與非專一性DNA裂解區域(諸如Fokl核酸內切酶)融合之鋅指DNA結合區域的融合蛋白。約30個胺基酸的各鋅指模體結合至DNA的約3個鹼基對，且可改變某些殘基處的胺基酸以改變三重序列專一性(參見例如Desjarlais等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993; Wolfe等人, J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999)。多個鋅指模體可串聯連接以對所需DNA序列(諸如長度在約9至約18個鹼基對範圍內之區域)產生結合專一性。作為背景，ZFN藉由催化基因體中形成部位專一性DNA雙股斷裂(DSB)來介導基因體編輯，且藉由同源定向修復來促進包含與基因體同源之側接序列的轉殖基因靶向整合至DSB位。或者，由ZFN產生之DSB可經由非同源末端接合(NHEJ)修復來剔除標靶基因，非同源末端接合為一種易錯的細胞修復路徑，導致裂解位之核苷酸插入或缺失。在某些實施例中，基因剔除包含使用ZFN分子產生的插入、缺失、突變或其組合。
如本文所用，「轉錄活化因子樣效應核酸酶」(TALEN)係指包含TALE DNA結合區域及DNA裂解區域(諸如FokI核酸內切酶)之融合蛋白。「TALE DNA結合區域」或「TALE」由一或多個TALE重複區域/單元構成，其各自一般具有高度守恆的33至35胺基酸序列，其中第12及第13個胺基酸趨異。TALE重複區域參與TALE對標靶DNA序列的結合。趨異的胺基酸殘基，稱為重複可變二殘基(RVD)，與專一性核苷酸識別相關。已確定用於此等TALEs識別DNA的天然(典型)代碼，因此，TALE之位置12及13處之HD (組胺酸-天冬胺酸)序列引起TALE結合至胞嘧啶(C)，NG (天冬醯胺-甘胺酸)結合至T核苷酸，NI (天冬醯胺-異白胺酸)結合至A，NN (天冬醯胺-天冬醯胺)結合至G或A核苷酸，且NG (天冬醯胺-甘胺酸)結合至T核苷酸。非標準(非典型) RVD亦已知(參見例如美國專利公開案第US 2011/0301073號，其中的非典型RVD以全文引用的方式併入本文中)。TALENs可用於引導T細胞基因體中之部位專一性雙股斷裂(DSB)。非同源末端接合(NHEJ)將DNA自雙股斷裂(其中供黏接用的序列重疊很少或沒有)之二側接合，從而引入剔除基因表現之錯誤。或者，同源定向修復可在DSB位引入轉殖基因，其限制條件為轉殖基因中存在同源側接序列。在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合且使用TALEN分子產生。
如本文所用，「成簇規律間隔短回文重複序列/Cas」(CRISPR/Cas)核酸酶系統係指一種系統，其採用CRISPR RNA (crRNA)引導之Cas核酸酶、經由鹼基配對互補性來識別基因體內之標靶部位(稱為原型間隔子)，且若互補標靶序列之3'之後緊接著守恆的短原型間隔子相關模體(PAM)，則裂解DNA。依據Cas核酸酶之序列及結構，CRISPR/Cas系統分類為三種類型(亦即，I型、II型及III型)。I型及III型中之crRNA引導之監督複合物需要多個Cas亞單元。研究最多的II型系統包含至少三個組分：RNA引導之Cas9核酸酶、crRNA及反式作用crRNA (tracrRNA)。tracrRNA包含雙螺旋體形成區。crRNA及tracrRNA形成雙螺旋體，其能夠與Cas9核酸酶相互作用，且經由crRNA上之間隔子與標靶DNA上之PAM上游的原型間隔子之間的沃森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)，將Cas9/crRNA:tracrRNA複合物引導至標靶DNA上之特定部位。Cas9核酸酶裂解的雙股斷裂位於由crRNA間隔子界定之區域內。藉由NHEJ之修復導致插入及/或缺失，從而破壞標靶基因座之表現。或者，可經由同源定向修復在DSB位引入具有同源側接序列之轉殖基因。crRNA及tracrRNA可經工程改造為單嚮導RNA (sgRNA或gRNA) (參見例如Jinek等人, Science 337:816-21, 2012)。此外，嚮導RNA之與標靶部位互補的區域可經改變或程式化以靶向所需序列(Xie等人, PLOS One 9:e100448, 2014；美國專利申請公開案第US 2014/0068797號、美國專利申請公開案第US 2014/0186843號；美國專利第8,697,359號及PCT公開案第WO 2015/071474號；該等問下各自以引用的方式併入)。在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合且使用CRISPR/Cas核酸酶系統產生。
例示性gRNA序列及使用其剔除編碼免疫細胞蛋白之內源基因的方法包括Ren等人, Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017)中所述之彼等實例，其中之gRNAs、CAS9 DNAs、載體及基因剔除技術特此以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，「大範圍核酸酶」亦稱為「歸巢核酸內切酶」，係指以大的識別部位(約12至約40個鹼基對之雙股DNA序列)為特徵的去氧核糖核酸內切酶。依據序列及結構模體，大範圍核酸酶可分成五個家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒及PD-(D/E)XK。例示性大範圍核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII，其識別序列已知(參見例如美國專利第5,420,032號及第6,833,252號; Belfort等人, Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon等人, Gene 82:115-118, 1989; Perler等人, Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble等人, J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996; Argast等人, J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998)。
在某些實施例中，天然存在之大範圍核酸酶可用於促進標靶的部位專一性基因體修飾，該標靶選自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、FasL、HLA編碼基因或TCR組分編碼基因。在其他實施例中，對標靶基因具有新穎結合專一性的工程化大範圍核酸酶用於部位專一性基因體修飾(參見例如Porteus等人, Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman等人, J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat等人, Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier等人, Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth等人, Nature 441:656-659, 2006; Paques等人, Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007；美國專利公開案第US 2007/0117128號；第US 2006/0206949號；第US 2006/0153826號；第US 2006/0078552號；及第US 2004/0002092號)。在其他實施例中，使用已經TALENs之模組化DNA結合區域修飾的歸巢核酸內切酶產生染色體基因剔除，以製造稱為megaTAL之融合蛋白。MegaTALs不僅可用於剔除一或多種標靶基因，而且當與編碼感興趣之多肽的外源供體模板組合使用時，引入(敲入)異源或外源聚核苷酸。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含將抑制性核酸分子引入包含異源聚核苷酸的宿主細胞(例如免疫細胞)中，該異源聚核苷酸編碼專一性結合至腫瘤相關抗原的抗原專一性受體，其中該抑制性核酸分子編碼標靶專一性抑制劑且其中所編碼的標靶專一性抑制劑抑制宿主細胞中的內源基因表現(例如PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、FasL、HLA組分或TCR組分，或其任何組合)。
在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合且使用CRISPR/Cas核酸酶系統或鹼基編輯系統產生(Komor, A. C.; Kim, Y. B.; Packer, M. S.; Zuris, J. A.; Liu, D. R. Nature 533, 420-424 (2016)。簡言之，鹼基編輯為一種基因體編輯方法，其使用CRISPR系統的組分以及其他酶以將點突變直接引入細胞DNA或RNA中而不產生雙股DNA斷裂。某些DNA鹼基編輯劑包含與核鹼基去胺酶融合的催化失能核酸酶及一些情況下的DNA醣苷酶抑制劑。RNA鹼基編輯劑使用靶向RNA的組分發揮類似的功能。鹼基編輯劑使一個鹼基或鹼基對直接轉化成另一個鹼基或鹼基對，從而能夠在非分裂細胞中高效安裝點突變而不產生非所需的過量編輯副產物。參見例如Rees H等人, Nature Reviews Genetics(2018)。
在使用基因剔除程序或藥劑後，可藉由宿主免疫細胞之DNA定序直接確認染色體基因剔除。染色體基因剔除亦可依據基因剔除後缺乏基因表現(例如缺乏由基因編碼之mRNA或多肽產物)來推斷。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含HLA組分基因的剔除，該HLA組分基因選自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因或β2微球蛋白基因。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含TCR組分基因的剔除，該TCR組分基因選自TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因或其組合。
在一些實施例中，相較於對照細胞群(例如表現對相同標靶抗原具有專一性之對照結合蛋白的細胞)，包含本文所揭露之結合蛋白的宿主細胞群對結合蛋白之標靶抗原展現的功能親合力增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍或至少5000倍。宿主細胞可包含結合標靶抗原(例如KRAS G12突變型肽，諸如KRAS G12V突變型肽，例如存在於肽:HLA複合物中)的結合蛋白(例如包含本文所揭露之Vα及Vβ區及/或CDR的TCR)。親合力的增加可例如藉由以下分析測定：在暴露於表現或呈現標靶抗原的標靶細胞後，用於測定活化標記物(例如CD137、CD69、顆粒酶B、CD107a、IFN-γ、TNF-a、IL-12、細胞介素、介白素、干擾素)表現的分析；及/或測定EC50 (例如T細胞群達到半數最大活化時的肽劑量)的分析。在一些實施例中，宿主細胞與對照細胞均為T細胞，且宿主細胞及對照細胞群可包含組成或數量相同、大約相同或基本上相同的T細胞類型(例如CD4+、CD8+或二者)。
在一些實施例中，相較於對照細胞群(例如表現對相同標靶抗原具有專一性之對照結合蛋白的細胞)，包含本文所揭露之結合蛋白的宿主細胞群對標靶細胞展現的殺滅增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍或至少1000倍。標靶細胞的殺滅可例如藉由活體外細胞毒性分析加以測定，例如效應子/標靶比率為約0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、25:1、50:1或100:1。在一些實施例中，宿主細胞與對照細胞均為T細胞，且宿主細胞及對照細胞群可包含組成或數量相同、大約相同或基本上相同的T細胞類型(例如CD4+、CD8+或二者)。
在一些實施例中，相較於對照細胞群(例如表現對相同標靶抗原具有專一性之對照結合蛋白的細胞)，包含本文所揭露之結合蛋白的宿主細胞群的活化增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍或至少5000倍。活化可例如藉由以下分析測定：在暴露於表現或呈現標靶抗原的標靶細胞後，測定活化標記物(例如CD137、CD69、顆粒酶B、CD107a、IFN-γ、TNF-a、IL-12、細胞介素、介白素、干擾素)表現的分析。在一些實施例中，宿主細胞與對照細胞均為T細胞，且宿主細胞及對照細胞群可包含組成或數量相同、大約相同或基本上相同的T細胞類型(例如CD4+、CD8+或二者)。
在一些實施例中，包含本文所揭露之結合蛋白的宿主細胞群對耗竭具有抗性，例如在活體外多次再攻擊後(例如至少50小時、至少100小時、至少150小時、至少200小時或至少250小時，任擇地為一或多次再攻擊)，展現有效的腫瘤細胞殺滅，或活體內展現持久的腫瘤生長控制。
在一些實施例中，相較於對照細胞群，包含本文所揭露之結合蛋白的宿主細胞群對耗竭具有抗性，例如在活體外多次再攻擊後(例如至少50小時、至少100小時、至少150小時、至少200小時或至少250小時，任擇地為一或多次再攻擊)展現優異的腫瘤細胞殺滅作用，或活體內展現優異的腫瘤生長控制。在一些實施例中，宿主細胞與對照細胞均為T細胞，且宿主細胞及對照細胞群可包含組成或數量相同、大約相同或基本上相同的T細胞類型(例如CD4+、CD8+或二者)。 宿主細胞組成物及單位劑量
在另一態樣中，本文提供包含本揭露內容之經修飾之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組成物及單位劑量。
在某些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%的經修飾CD8 +T細胞，其中單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞(亦即，相較於PBMC數目類似的患者樣本，單位劑量中存在小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%或小於約1%的初始T細胞群)。
在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約50%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約50%的經修飾CD8 +T細胞，其中該宿主細胞組成物或單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。在其他實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約60%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約60%的經修飾CD8 +T細胞，其中單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。在另外其他實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約70%的工程化CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約70%的工程化CD8 +T細胞，其中單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約80%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約80%的經修飾CD8 +T細胞，其中該宿主細胞組成物或單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約85%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約85%的經修飾CD8 +T細胞，其中該宿主細胞組成物或單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含(i)組成物與(ii)組成物約1:1比率的組合，該(i)組成物包含至少約90%的經修飾CD4 +T細胞，該(ii)組成物包含至少約90%的經修飾CD8 +T細胞，其中該宿主細胞組成物或單位劑量含有數量減少的初始T細胞或基本上無初始T細胞。
在一些實施例中，組成物包含CD4+細胞群，該細胞群包含(i)至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%的經修飾CD4+ T細胞。在一些實施例中，組成物進一步包含CD8+細胞群，該細胞群包含(ii)至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%的經修飾CD8+ T細胞。
在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含約1:1比率、約1:2比率、約1:3比率、約1:4比率、約1:5比率、約1:6比率、約1:7比率、約1:8比率、約1:9比率、約1:10比率、約2:1比率、約3:1比率、約4:1比率、約5:1比率、約6:1比率、約7:1比率、約8:1比率、約9:1比率、約10:1比率、約3:2比率或約2:3比率的CD4+對CD8+ T細胞(例如經修飾以包含或表現本文所揭露之結合蛋白的CD4+ T細胞相對於經修飾以包含或表現本文所揭露之結合蛋白的CD8+ T細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含至少1:1、至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5、至少1:6、至少1:7、至少1:8、至少1:9、至少1:10、至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少3:2或至少2:3的CD4+對CD8+ T細胞比率。
在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含至多1:1、至多1:2、至多1:3、至多1:4、至多1:5、至多1:6、至多1:7、至多1:8、至多1:9、至多1:10、至多2:1、至多3:1、至多4:1、至多5:1、至多6:1、至多7:1、至多8：1、至多9:1、至多10:1、至多3:2或至多2:3的CD4+對CD8+ T細胞比率。
在一些實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含約1:10與10:1之間、1:10與8:1之間、1:10與7:1之間、1:10與6:1之間、1:10與5:1之間、1:10與4:1之間、1:10與3:1之間、1:10與2:1之間、1:10與1:1之間、1:10與1:2之間、1:10與1:3之間、1:10與1:4之間、1:10與1:5之間、1:10與1:7之間、1:5與10:1之間、1:5與8:1之間、1:5與7:1之間、1:5與6:1之間、1:5與5:1之間、1:5與4:1之間、1:5與3:1之間、1:5與2:1之間、1:5與1:1之間、1:5與1:2之間、1:5與1:3之間、1:5與1:4之間、1:3與10:1之間、1:3與8:1之間、1:3與7:1之間、1:3與6:1之間、1:3與5:1之間、1:3與4:1之間、1:3與3:1之間、1:3與2:1之間、1:3與1:1之間、1:3與1:2之間、1:2與10:1之間、1:2與8:1之間、1:2與7:1之間、1:2與6:1之間、1:2與5:1之間、1:2與4:1之間、1:2與3:1之間、1:2與2:1之間、1:2與1:1之間、1:1與10:1之間、1:1與8:1之間、1:1與7:1之間、1:1與6:1之間、1:1與5:1之間、1:1與4:1之間、1:1與3:1之間、1:1與2:1之間、2:1與10:1之間、2:1與8:1之間、2:1與7:1之間、2:1與6:1之間、2:1與5:1之間、2:1與4:1之間、2:1與3:1之間、3:1與10:1之間、3:1與8:1之間、3:1與7:1之間、3:1與6:1之間、3:1與5:1之間、3:1與4:1之間、5:1與10:1之間、5:1與8:1之間、5:1與7:1之間或5:1與6:1之間的CD4+/CD8+ T細胞比率。
組成物、宿主細胞組成物或單位劑量中的CD4+ T細胞可為經修飾或經工程改造(例如使用本文所揭露之載體或聚核苷酸)以表現本文所揭露之CD8共受體的CD4+ T細胞。
應瞭解，本揭露內容之宿主細胞組成物或單位劑量可包含如本文所述之任何宿主細胞或宿主細胞之任何組合。在某些實施例中，例如宿主細胞組成物或單位劑量包含經修飾之CD8+ T細胞、經修飾之CD4+ T細胞或二者，其中此等T細胞經修飾以編碼對Ras肽:HLA-A*11:01複合物具有專一性之結合蛋白。另外或替代地，本揭露內容之宿主細胞組成物或單位劑量可包含如本文所述的任何宿主細胞或宿主細胞組合且可進一步包含表現結合蛋白的經修飾細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)，該結合蛋白對不同抗原具有專一性(例如不同Ras抗原，或來自不同蛋白質或標靶的抗原，諸如BCMA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙醯基GD2、O乙醯基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A (例如包括MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A4)、間皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、結合至HLA的腫瘤或病原體相關肽、結合至HLA的hTERT肽、結合至HLA的酪胺酸酶肽、結合至HLA的WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、HA 1-H、Robo1、α-胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40、PRAME及SSX-2，或類似物)。舉例而言，單位劑量可包含表現專一性結合至Ras-HLA複合物之結合蛋白的經修飾CD8 +T細胞及表現專一性結合至PSMA抗原之結合蛋白(例如CAR)的經修飾CD4 +T細胞(及/或經修飾CD8 +T細胞)。亦應瞭解，本文所揭露之任一種宿主細胞可以組合療法投予。
在本文所述的任一實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含數目相等或大致相等的工程化CD45RA -CD3 +CD8 +及經修飾之CD45RA -CD3 +CD4 +T M細胞。
在本文所述的任一實施例中，宿主細胞組成物或單位劑量包含一或多種細胞群(例如CD4+或CD8+細胞)，該等細胞群已經歷CD62L正向選擇，例如以改良活體內持久性。
宿主細胞可離體、活體外或活體內經基因工程改造以包含或表現結合蛋白。在一些實施例中，宿主細胞離體經基因工程改造以表現結合蛋白。在一些實施例中，宿主細胞在活體外經基因工程改造以表現結合蛋白。在一些實施例中，宿主細胞在活體內經基因工程改造以表現結合蛋白。 用途
在其他態樣中，本揭露內容提供用於治療或預防個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症復發的方法。此類疾病或病症包括例如癌症，諸如實體癌及血液惡性病。在某些例示性實施例中，該疾病或病症包含胰臟癌或癌瘤，任擇地，胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；大腸癌；大腸直腸腺癌；肺癌，任擇地，非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地，皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌瘤；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌瘤；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌瘤；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。可藉由本文所揭露之組成物或方法治療的疾病或病症包括本文所揭露之癌症的晚期或轉移形式。
「治療(treat)」或「治療(treatment)」或「改善(ameliorate)」係指對個體(例如人類或非人類哺乳動物，諸如靈長類動物、馬、貓、犬、山羊、小鼠或大鼠)之疾病、病症或病狀的醫學管理。一般而言，包含本揭露內容之組成物(例如包含結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞、宿主細胞組成物、單位劑量及/或免疫原性多肽)的適當劑量或治療方案係以足以誘發治療或預防效益的量投予。治療性或防治性/預防性益處包括臨床結果改善；與疾病相關之症狀減輕或緩解；症狀的發生減少；生活品質改善；無病狀態延長；疾病程度減弱；疾病狀態穩定疾病進展延遲；緩解；存活；存活期延長；或其任何組合。
如本文所用，「治療有效量」或「有效量」係指足以產生治療作用之組成物之量，包括統計學上顯著的臨床結果改善；與疾病相關之症狀減輕或緩解；症狀的發生減少；生活品質改善；無病狀態較長；疾病程度減弱；疾病狀態穩定；疾病進展延遲；緩解；存活；或存活期延長。當提及獨自投予的個別活性成分或表現單一活性成分的細胞時，治療有效量係指該成分或表現該成分之細胞獨自的作用。當提及組合時，治療有效量係指活性成分或組合之輔助活性成分與表現活性成分之細胞的組合量，不論連續或同時投予均產生治療作用。組合亦可為表現超過一種活性成分的細胞。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑或載劑」或「生理學上可接受之賦形劑或載劑」係指生物學上相容之媒劑，例如生理鹽水，其在本文中更詳細地描述，適於投予人類或其他非人類哺乳動物個體，且一般認為安全或不引起嚴重不良事件。
如本文所用，「統計顯著性」係指當使用司徒頓氏t檢驗(Students t-test)或其他適當統計檢驗計算時，p值為0.050或更小，且指示所量測的特定事件或結果不大可能偶然出現。
可藉由本發明治療之個體一般為人類及其他靈長類動物個體，諸如用於獸醫學目的之猴及猿。在任一前述實施例中，個體可為人類個體。個體可為雄性或雌性且可為任何適齡(包括嬰兒、幼年、青年、成年及老年)個體。個體可為哺乳動物。根據本揭露內容之組成物可以熟習醫學技術者所確定的適於治療疾病、病狀或病症的方式投予。在任一上述實施例中，如本文所述的經修飾之宿主細胞、宿主細胞組成物或單位劑量靜脈內、腹膜內、瘤內投予骨髓、淋巴結或腦脊髓液以便遇到標靶細胞(例如白血病細胞)。組成物的適當劑量、適合持續時間及投予頻率將依據諸如以下因素確定：患者的病狀；疾病、病狀或病症的大小、類型及嚴重度；活性成分的特定形式；及投予方法。
如本文所用，術語「授受性免疫療法(adoptive immune therapy)」或「授受性免疫療法(adoptive immunotherapy)」係指投予天然存在的或經基因工程改造的疾病專一性或抗原專一性免疫細胞(例如T細胞)。授受性細胞免疫療法可為自體的(免疫細胞來自接受者)、同種異體的(免疫細胞來自相同物種的供給者，該供給者不為接受者)或同基因型的(免疫細胞來自在基因上與接受者一致或在基因上與接受者基本上一致的供給者，例如單合子性雙胎)。
在一些實施例中，個體(例如個體中的至少一個細胞)表現Ras抗原，該Ras抗原包含或由SEQ ID NOs: 2至3中之任一者中所示的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，個體為HLA-A*11 +(例如HLA-A*11:01 +)。
在某些實施例中，方法包含在投予根據本揭露內容之療法之前，確定個體的一或多種HLA類型及/或鑑別Ras抗原的存在。在一些實施例中，確定個體的該或該等HLA類型及/或Ras抗原(例如G12V突變)的存在之後投予療法，例如至少部分地依據HLA類型及/或Ras抗原的存在來投予療法。在一些實施例中，方法進一步包含在投予之前，對個體腫瘤中的KRAS G12對偶基因進行基因分型。在一些情況下，在投予之前，確定個體攜載KRAS G12V對偶基因。
HLA對偶基因的表現可藉由例如基因定序(例如高通量下一代定序(NGS))測定。HLA表現的此基因測定在本文中稱為「HLA分型」且可在授權進行HLA分型的臨床實驗室中經由分子途徑測定。在一些實施例中，使用PCR擴增、隨後高通量NGS及隨後確定HLA來執行HLA分型。本文中，可確定主要HLA基因座(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C等)的HLA單倍型。
可使用任何已知方法(包括例如蛋白質或核酸測試)執行HLA分型。核酸測試之實例包括以序列為主之分型(SBT)及使用序列專一性寡核苷酸探針(SSOP)或序列專一性引子(SSP)。在某些實施例中，使用PCR擴增、隨後高通量下一代定序(NGS)及隨後確定HLA來執行HLA分型。在一些實施例中，使用可經由Scisco Genetics (sciscogenetics.com/pages/technology.html，其內容以全文引用的方式併入本文中)獲得的系統執行序列分型。用於HLA分型的其他方法包括例如Mayor等人, PLoS One 10(5):e0127153 (2015)中所揭露的彼等方法，該等方法及試劑以引用的方式併入本文中。
在特定實施例中，方法包括當個體表現HLA-A*11:01時，投予包含經修飾之CD8+及/或經修飾之CD4+ T細胞的組成物，該等T細胞包含編碼如本文所提供之第二結合蛋白的異源聚核苷酸。
在宿主細胞組成物或單位劑量的情況下，其中的細胞數量為至少一個細胞(例如一個經修飾之CD8 +T細胞亞群(例如任擇地包含記憶及/或初始CD8 +T細胞)；一個經修飾之CD4 +T細胞亞群(例如任擇地包含記憶及/或初始CD4 +T細胞))或更典型地大於10 2個細胞，例如多達10 4個、多達10 5個、多達10 6個、多達10 7個、多達10 8個、多達10 9個或超過10 10個細胞。在某些實施例中，細胞以約10 4至約10 10個細胞/m 2之範圍、較佳約10 5或約10 9個細胞/m 2之範圍投予。在一些實施例中，投予的劑量包含多達約3.3×10 5個細胞/kg。在一些實施例中，投予的劑量包含多達約1×10 6個細胞/kg。在一些實施例中，投予的劑量包含多達約3.3×10 6個細胞/kg。在一些實施例中，投予的劑量包含多達約1×10 7個細胞/kg。在某些實施例中，經修飾的免疫細胞係以包含多達約5×10 4個細胞/kg、5×10 5個細胞/kg、5×10 6個細胞/kg或多達約5×10 7個細胞/kg的劑量投予個體。在某些實施例中，經修飾的免疫細胞係以包含至少約5×10 4個細胞/kg、5×10 5個細胞/kg、5×10 6個細胞/kg或多達約5×10 7個細胞/kg的劑量投予個體。細胞數目將視組成物預定的最終用途及其中包括的細胞類型而定。舉例而言，經修飾以含有結合蛋白的細胞可包含含有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多此類細胞的細胞群。對於本文提供的用途而言，細胞的體積一般為1公升或更小，500 ml或更小，250 ml或更小，或100 ml或更小。在實施例中，所需細胞之密度典型地大於10 4個細胞/ml且一般大於10 7個細胞/ml，一般為10 8個細胞/ml或更大。細胞可以單次輸注形式或在一定時間範圍內以多次輸注形式投予。臨床上相關數目個免疫細胞可分成多次輸注，其累積地等於或超過10 6、10 7、10 8、10 9、10 10或10 11個細胞。在某些實施例中，經修飾之免疫細胞的單位劑量可與來自同種異體供給者的造血幹細胞共投予(例如同時或同期)。在一些實施例中，單位劑量中所包含的一或多種經修飾之免疫細胞對於個體而言為自體的。
在一些實施例中，單位劑量包含、主要由或由多個單位劑量組成，該等單位劑量包含、主要由或由以下組成：至少5 x10^7、至少1 x10^8、至少5 x10^8、至少1x10^9、至少2.5 x10^9、至少5 x10^9、至少1 x10^10、至少1.5 x10^10、至少2 x10^10、至少3 x10^10、至少5 x10^10或至少1 x10^11個活宿主細胞，例如編碼、包含或表現如本文中所揭露之結合蛋白的活宿主細胞。
在一些實施例中，單位劑量包含、主要由或由多個單位劑量組成，該等單位劑量包含、主要由或由以下組成：至多1 x10^8、至多5 x10^9、至多1 x10^10、至多1.5 x10^10、至多2 x10^10、至多2.5 x10^10、至多3 x10^10、至多4 x10^10、至多5 x10^10、至多1 x10^11、至多5 x10^11或至多2 x10^12個活宿主細胞，例如編碼、包含或表現如本文中所揭露之結合蛋白的活宿主細胞。
在一些實施例中，單位劑量包含、主要由或由多個單位劑量組成，該等單位劑量包含、主要由或由以下組成：約1x10^8、約5x10^8、約1x10^9、約2x10^9、約3x10^9、約4x10^9、約5x10^9、約6x10^9、約7x10^9、約8x10^9、約9x10^9、約1x10^10、約1.1x10^10、約1.2x10^10、約1.3x10^10、約1.4x10^10、約1.5x10^10、約1.6x10^10、約1.7x10^10、約1.8x10^10、約1.9x10^10、約2x10^10、約3x10^10、約4x10^10、約5x10^10、約7.5x10^10、約10x10^10或約1x10^11個活宿主細胞，例如編碼、包含或表現如本文中所揭露之結合蛋白的活宿主細胞。
在一些實施例中，單位劑量包含、主要由或由多個單位劑量組成，該等單位劑量包含、主要由或由以下組成：約1x10^8至約1x10^11、約1x10^8至約5x10^10、約1x10^8至約2x10^10、約1x10^8至約1.5x10^10、約1x10^8至約1x10^10、約1x10^8至約5x10^9、約1x10^9至約1x10^11、約1x10^9至約5x10^10、約1x10^9至約2x10^10、約1x10^9至約1.5x10^10、約1x10^9至約1x10^10、約1x10^9至約5x10^9、約5x10^9至約1x10^11、約5x10^9至約5x10^10、約5x10^9至約2x10^10、約5x10^9至約1.5x10^10、約5x10^9至約1x10^10、約1x10^10至約1x10^11、約1x10^10至約5x10^10、約1x10^10至約2x10^10、約1x10^10至約1.5x10^10、約1.5x10^10至約1x10^11、約1.5x10^10至約5x10^10、或約1.5x10^10至約2x10^10個活宿主細胞，例如編碼、包含或表現如本文中所揭露之結合蛋白的活宿主細胞。
在一些實施例中，接受經修飾之免疫細胞的個體先前已接受淋巴球耗乏化學療法。在其他實施例中，淋巴球耗乏化學療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。
在一些實施例中，方法進一步包含將如本文中所揭露之免疫檢查點分子抑制劑投予個體。
亦考慮醫藥組成物(亦即，組成物)，其包含如本文中所揭露之組成物(結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞、宿主細胞組成物、單位劑量及/或免疫原性多肽)及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。適合的賦形劑包括水、生理鹽水、右旋糖、甘油或其類似物及其組合。在實施例中，包含如本文所揭露之融合蛋白或宿主細胞的組成物進一步包含適合的輸注介質。適合的輸注介質可為任何等張性介質調配物，典型地可使用標準生理鹽水、Normosol R (Abbott)或Plasma-Lyte A (Baxter)、5%右旋糖水溶液或林格氏乳酸鹽(Ringer's lactate)。輸注介質可補充有人類血清白蛋白或其他人類血清組分。
醫藥組成物可以熟習醫學技術者所確定的適於待治療(或預防)之疾病或病狀的方式投予。組成物的適當劑量及適合持續時間及投予頻率將依據諸如以下因素來確定：患者的健康狀況、患者的體型(亦即，體重、質量或身體面積)、患者病狀的類型及嚴重度、活性成分的特定形式及投予方法。一般而言，適當劑量及治療方案提供組成物的量足以提供治療及/或預防益處(諸如本文所述，包括改善之臨床結果，諸如更頻繁的完全或部分緩解，或更長的無病存活期及/或總存活期，或症狀嚴重度減輕)。
醫藥組成物的有效量係指在必需之劑量及時段的情況下，足以達成如本文所述之所需臨床結果或有益治療的量。有效量可以一或多次投予遞送。若投予已知或確認患有疾病或疾病狀態之個體，則提及治療時可使用術語「治療量」，而「預防有效量」可用於描述向易患或有出現疾病或疾病狀態(例如復發)之風險的個體投予有效量作為預防過程。
本文所述之醫藥組成物可提供於單位劑量或多劑量容器(諸如密封的安瓿或小瓶)中。此類容器可加以冷凍以便在輸注至患者之前保持調配物的穩定性。劑量將變化，但如本文所述之經修飾免疫細胞的較佳投予劑量為約10 4個細胞/m 2、約5 x 10 4個細胞/m 2、約10 5個細胞/m 2、約5 x 10 5個細胞/m 2、約10 6個細胞/m 2、約5 x 10 6個細胞/m 2、約10 7個細胞/m 2、約5 x 10 7個細胞/m 2、約10 8個細胞/m 2、約5 x 10 8個細胞/m 2、約10 9個細胞/m 2、約5 x 10 9個細胞/m 2、約10 10個細胞/m 2、約5 x 10 10個細胞/m 2，或約10 11個細胞/m 2。在某些實施例中，單位劑量包含劑量為約10 4個細胞/m 2至約10 11個細胞/m 2的如本文所述之經修飾宿主細胞。開發適合的給藥及治療方案以在多種治療方案中使用本文所述之特定組成物，包括例如非經腸或靜脈內投予或調配物。
若本發明組成物非經腸投予，則該組成物亦可包括無菌水性或油性溶液或懸浮液。適合的非經腸可接受之無毒稀釋劑或溶劑包括水、林格氏溶液、等張鹽溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或與水混合之聚乙二醇。水性溶液或懸浮液可進一步包含一或多種緩衝劑，諸如乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或酒石酸鈉。當然，用於製備任何劑量單位調配物之任何材料應為醫藥學上純的且在所用量下基本上無毒。另外，活性化合物可併入持續釋放製劑及調配物中。如本文所用，單位劑型係指作為單位劑量適用於待治療之個體的實體不連續單元；各單元可含有經計算可產生所需效果的預定量之工程化免疫細胞或活性化合物與適當醫藥載劑。
一般而言，適當的劑量及治療方案以足以提供益處之量提供活性分子或細胞。此類反應可根據所治療之個體中確立與未治療之個體相比改善的臨床結果(例如更頻繁的完全或部分緩解，或更長的無病存活期)來監測。預先存在的針對腫瘤蛋白之免疫反應的增加一般與改善的臨床結果相關。此類免疫反應一般可使用例行的標準增殖、細胞毒性或細胞介素分析來評價。
對於預防用途而言，劑量應足以預防與疾病或病症相關之疾病、延遲其發作或減輕其嚴重度。根據本文所述之方法投予的免疫原性組成物之預防益處可如下確定：執行臨床前(包括活體外及活體內動物研究)及臨床研究，且藉由適當的統計學、生物學及臨床方法及技術分析自其獲得之資料，其皆可由熟習此項技術者容易實施。
如本文所用，組成物之投予係指將其遞送至個體，不論遞送途徑或模式。投予可連續地或間歇地及非經腸實現。組成物可局部(例如瘤內)或全身性(例如靜脈內)投予。投予可用於治療已確認為患有公認病狀、疾病或疾病狀態之個體，或用於治療易患或有出現此類病狀、疾病或疾病狀態之風險的個體。與輔助療法共投予可包括同時及/或以任何順序及任何給藥時程依序遞送多種藥劑(例如含有一或多種細胞介素的經修飾免疫細胞；免疫抑制療法，諸如鈣調神經磷酸酶抑制劑、皮質類固醇、微管抑制劑、低劑量之黴酚酸前藥或其任何組合)。
在某些實施例中，向個體投予多次劑量的本文所述之組成物，其可以約二週至約四週之間的投予間隔投予。
本揭露內容之治療或預防方法可作為治療過程或療程之一部分投予個體，該治療過程或療程可包含本發明所揭露的單位劑量、細胞或組成物投予之前或之後的其他療法。舉例而言，在某些實施例中，接受經修飾之免疫細胞之單位劑量的個體正接受或先前已接受造血細胞移植(HCT；包括清髓性及非清髓性HCT)。用於執行HCT的技術及方案在此項技術中已知且可包含移植任何適合的供體細胞，諸如來源於臍帶血、骨髓或周邊血液的細胞、造血幹細胞、移動的幹細胞或來自羊膜液的細胞。因此，在某些實施例中，本揭露內容之經修飾免疫細胞可與使用造血幹細胞的經改良HCT療法一起或在其之後不久投予。在一些實施例中，HCT包含供體造血細胞，該造血細胞包含編碼HLA組分之基因的染色體剔除、編碼TCR組分之基因的染色體剔除，或二者。
在其他實施例中，個體在接受組成物或HCT之前，先前已接受淋巴球耗乏化學療法。在某些實施例中，淋巴球耗乏化學療法包含調理療程，該調理療程包含環磷醯胺、氟達拉濱、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。
根據本揭露內容之方法可進一步包括以組合療法投予一或多種其他藥劑來治療疾病或病症。舉例而言，在某些實施例中，組合療法包含聯合免疫檢查點抑制劑(並行、同時或依序)投予本揭露內容之組成物。在一些實施例中，組合療法包含聯合免疫檢查點刺激劑投予本揭露內容之組成物。在其他實施例中，組合療法包含聯合第二療法(諸如化學治療劑、放射療法、手術、抗體或其任何組合)投予本揭露內容之組成物。
如本文所用，術語「免疫抑制劑(immune suppression agent)」或「免疫抑制劑(immunosuppression agent)」係指提供抑制訊息以有助於控制或抑制免疫反應的一或多種細胞、蛋白質、分子、化合物或複合物。舉例而言，免疫抑制劑包括部分或完全阻斷免疫刺激；減少、防止或延遲免疫活化；或增加、活化或上調免疫抑制的彼等分子。靶向(例如使用免疫檢查點抑制劑)的例示性免疫抑制劑包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G (CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制性細胞介素(例如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精胺酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg細胞或其任何組合。
免疫抑制劑抑制劑(亦稱為免疫檢查點抑制劑)可為化合物、抗體、抗體片段或融合多肽(例如Fc融合物，諸如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反義分子、核糖核酸酶或RNAi分子，或低分子量有機分子。在本文所揭露之任一實施例中，方法可包含單獨或呈任何組合形式的本揭露內容之組成物與以下免疫抑制組分中之任一者的一或多種抑制劑。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與PD-1抑制劑組合使用，例如PD-1專一性抗體或其結合片段，諸如皮立珠單抗(pidilizumab)、尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、MEDI0680 (先前為AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任何組合。在其他實施例中，本揭露內容之組成物與PD-L1專一性抗體或其結合片段組合使用，諸如BMS-936559、度伐魯單抗(durvalumab) (MEDI4736)、阿特珠單抗(atezolizumab) (RG7446)、阿維魯單抗(avelumab) (MSB0010718C)、MPDL3280A或其任何組合。亦考慮了賽咪單抗(cemiplimab)；IBI-308；尼沃單抗 + 瑞拉利單抗(relatlimab)；BCD-100；坎立珠單抗(camrelizumab)；JS-001；斯巴達珠單抗(spartalizumab)；替雷利珠單抗(tislelizumab)；AGEN-2034；BGBA-333 + 替雷利珠單抗；CBT-501；多塔利單抗(dostarlimab)；度伐魯單抗 + MEDI-0680；JNJ-3283；鹽酸帕唑帕尼(pazopanib hydrochloride) + 派立珠單抗；皮立珠單抗；REGN-1979 + 賽咪單抗；ABBV-181；ADUS-100 + 斯巴達珠單抗(spartalizumab)；AK-104；AK-105；AMP-224；BAT-1306；BI-754091；CC-90006；賽咪單抗 + REGN-3767；CS-1003；GLS-010；LZM-009；MEDI-5752；MGD-013；PF-06801591；Sym-021；替雷利珠單抗 + 帕米帕尼(pamiparib)；XmAb-20717；AK-112；ALPN-202；AM-0001；拮抗阿茲海默症之PD-1的抗體；BH-2922；BH-2941；BH-2950；BH-2954；拮抗實體腫瘤之CTLA-4及PD-1的生物製劑；靶向腫瘤之PD-1及LAG-3的雙專一性單株抗體；BLSM-101；CB-201；CB-213；CBT-103；CBT-107；細胞免疫療法 + PD-1抑制劑；CX-188；HAB-21；HEISCOIII-003；IKT-202；JTX-4014；MCLA-134；MD-402；mDX-400；MGD-019；拮抗腫瘤之PDCD1的單株抗體；拮抗腫瘤之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的溶瘤病毒；OT-2；PD-1拮抗劑 + 羅派干擾素(ropeginterferon) α-2b；PEGMP-7；PRS-332；RXI-762；STIA-1110；TSR-075；靶向腫瘤之HER2及PD-1的疫苗；靶向腫瘤及自體免疫病症之PD-1的疫苗；XmAb-23104；抑制腫瘤之PD-1的反義寡核苷酸；AT-16201；抑制腫瘤之PD-1的雙專一性單株抗體；IMM-1802；拮抗實體腫瘤及血液學腫瘤之PD-1及CTLA-4的單株抗體；尼沃單抗生物類似藥；激動腫瘤之CD278及CD28且拮抗腫瘤之PD-1的重組蛋白質；激動自體免疫病症及發炎病症之PD-1的重組蛋白質；SNA-01；SSI-361；YBL-006；AK-103；JY-034；AUR-012；BGB-108；抑制實體腫瘤之PD-1、Gal-9及TIM-3的藥物；ENUM-244C8；ENUM-388D4；MEDI-0680；拮抗轉移性黑色素瘤及轉移性肺癌之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的單株抗體；靶向腫瘤之CTLA-4及PD-1的單株抗體；拮抗NSCLC之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1及TIM-3的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的單株抗體；抑制血液惡性病及實體腫瘤之PD-1及VEGF-A的重組蛋白質；拮抗腫瘤之PD-1的小分子；Sym-016；英比珠單抗(inebilizumab) + MEDI-0680；靶向轉移性黑色素瘤之PDL-1及IDO的疫苗；針對神經膠母細胞瘤的抗PD-1單株抗體 + 細胞免疫療法；拮抗腫瘤之PD-1的抗體；抑制血液惡性病及細菌感染之PD-1/PD-L1的單株抗體；抑制HIV之PD-1的單株抗體；或抑制實體腫瘤之PD-1的小分子。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與LAG3抑制劑組合使用，諸如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任何組合。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與CTLA4抑制劑組合使用。在特定實施例中，本揭露內容之組成物與CTLA4專一性抗體或其結合片段組合使用，諸如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白(例如阿巴西普(abatacept)、貝拉西普(belatacept))或其任何組合。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與B7-H3專一性抗體或其結合片段組合使用，諸如伊諾珠單抗(enoblituzumab) (MGA271)、376.96或二者。B7-H4抗體結合片段可為例如 Dangaj等人, Cancer Res. 73:4820, 2013中所述之scFv或其融合蛋白以及美國專利第9,574,000號及PCT專利公開案第WO/201640724A1號及第WO 2013/025779A1號中所述之彼等物。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與CD244抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與BLTA、HVEM、CD160或其任何組合之抑制劑組合使用。抗CD-160抗體描述於例如PCT公開案第WO 2010/084158號中。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與TIM3抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與Gal9抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與腺苷訊息傳導抑制劑(諸如誘餌腺苷受體)組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與A2aR抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與KIR抑制劑(諸如利瑞魯單抗(lirilumab) (BMS-986015))組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與抑制性細胞介素(典型地為除TGFβ以外之細胞介素)或Treg發育或活性之抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與以下組合使用：IDO抑制劑，諸如左-1-甲基色胺酸、艾卡哚司他(epacadostat) (INCB024360；Liu等人, Blood 115:3520-30, 2010)、依布硒啉(ebselen) (Terentis等人, Biochem. 49:591-600, 2010)、吲哚莫德(indoximod)、NLG919 (Mautino等人, American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 2013年4月6至10日)、1-甲基-色胺酸(1-MT)-替拉紮明(1-methyl-tryptophan (1-MT)-tirapazamine)或其任何組合。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與以下組合使用：精胺酸酶抑制劑，諸如N(ω)-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羥基-降-l-精胺酸(降NOHA)、L-NOHA、2(S)-胺基-6-硼己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱胺酸(BEC)或其任何組合。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與VISTA抑制劑(諸如CA-170 (Curis, Lexington, Mass.))組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與以下組合使用：TIGIT抑制劑，諸如COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canada)；CD155抑制劑，諸如COM701 (Compugen)；或二者。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與PVRIG、PVRL2或二者之抑制劑組合使用。抗PVRIG抗體描述於例如PCT公開案第號WO 2016/134333中。抗PVRL2抗體描述於例如PCT公開案第WO 2017/021526號中。
在某些實施例中，本揭露內容之醫藥組成物與LAIR1抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5或其任何組合之抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本揭露內容之組成物與增強刺激性免疫檢查點分子活性的藥劑(亦即，促效劑)組合使用。舉例而言，本揭露內容之組成物可與以下組合使用：CD137 (4-1BB)促效劑(諸如烏瑞蘆單抗(urelumab))、CD134 (OX-40)促效劑(諸如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、CD27促效劑(諸如CDX-1127)、CD28促效劑(諸如TGN1412、CD80或CD86)、CD40促效劑(諸如CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122促效劑(諸如IL-2)、GITR促效劑(諸如PCT專利公開案第WO 2016/054638號中所述之人源化單株抗體)、ICOS (CD278)促效劑(諸如GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8或其任何組合)。在本文所揭露之任一實施例中，方法可包含單獨或以任何組合形式投予本揭露內容之組成物與刺激性免疫檢查點分子之一或多種促效劑，包括前述中之任一者。
在某些實施例中，組合療法包含本揭露內容之組成物及第二療法，該第二療法包含以下中之一或多者：對由非發炎實體腫瘤所表現之癌症抗原具有專一性之抗體或其抗原結合片段、放射治療、手術、化學治療劑、細胞介素、RNAi或其任何組合。
在某些實施例中，組合治療方法包含投予本揭露內容之組成物及進一步投予放射治療或手術。放射療法為此項技術中熟知的且包括X射線療法，諸如γ照射及放射性藥物療法。適合於治療個體之指定癌症的手術及手術技術為一般技術者所熟知的。
在某些實施例中，組合治療方法包含投予本揭露內容之組成物及進一步投予化學治療劑。化學治療劑包括但不限於染色質功能抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、微管抑制藥物、DNA損傷劑、抗代謝物(諸如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及經糖修飾之類似物)、DNA合成抑制劑、DNA相互作用藥劑(諸如嵌入劑)及DNA修復抑制劑。說明性化學治療劑包括但不限於以下群組：抗代謝物/抗癌劑，諸如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)及阿糖胞苷(cytarabine))及嘌呤類似物；葉酸拮抗劑及有關抑制劑(巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噴司他汀(pentostatin)及2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine)))；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物，諸如長春花生物鹼(長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine))；微管干擾劑，諸如紫杉烷(紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel))、長春新鹼(vincristin)、長春鹼(vinblastin)、諾考達唑(nocodazole)、埃博黴素(epothilones)及溫諾平(navelbine)、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxins)(依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA損傷劑(放線菌素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、蒽環黴素(anthracyclines)、博萊黴素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、賽特杉(Cytoxan)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六甲密胺奧沙利鉑(hexamethylmelamineoxaliplatin)、異環磷醯胺(iphosphamide)、美法侖(melphalan)、甲基二(氯乙基)胺(merchlorehtamine)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亞硝基脲(nitrosourea)、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(taxol)、紫杉德(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及依託泊苷(etoposide)(VP 16))；抗生素，諸如更生黴素(放線菌素D (actinomycin D))、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)(阿黴素(adriamycin))、艾達黴素(idarubicin)、蒽環黴素(anthracyclines)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博來黴素(bleomycins)、普卡黴素(plicamycin)(光神黴素(mithramycin))及絲裂黴素(mitomycin)；酶(L-天冬醯胺酶，其使L-天冬醯胺全身性代謝且使細胞喪失合成其自身天冬醯胺的能力)；抗血小板藥劑；抗增殖/抗有絲分裂烷基化劑，諸如氮芥(nitrogen mustards)(二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及類似物、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙烯亞胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylmelamines)(六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)及噻替派(thiotepa))、烷基磺酸鹽-白消安(busulfan)、亞硝基脲(nitrosoureas)(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)及類似物、鏈脲菌素(streptozocin))、三氮烯-達卡巴嗪(dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，諸如葉酸類似物(甲胺喋呤(methotrexate))；鉑配位錯合物(順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin))、丙卡巴肼(procarbazine)、羥脲(hydroxyurea)、米托坦(mitotane)、胺魯米特(aminoglutethimide)；激素、激素類似物(雌激素、他莫昔芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide))及芳香酶抑制劑(來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝劑(肝素、合成肝素鹽及凝血酶之其他抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(諸如組織纖維蛋白溶酶原活化因子、鏈球菌激酶(streptokinase)及尿激酶(urokinase))、阿司匹靈(aspirin)、雙吡大莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、克羅匹多(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab)；抗遷移藥劑；抗分泌藥劑(布瑞汀(breveldin))；免疫抑制劑(環孢靈(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470、染料木素(genistein))及生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、纖維母細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管收縮素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab))；嵌合抗原受體；細胞週期抑制劑及分化誘導劑(維甲酸(tretinoin))；mTOR抑制劑、拓樸異構酶抑制劑(小紅莓(doxorubicin)(阿黴素(adriamycin))、安吖啶(amsacrine)、喜樹鹼(camptothecin)、道諾黴素(daunorubicin)、更生黴素、艾尼西德(eniposide)、表柔比星(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、艾達黴素(idarubicin)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)及米托蒽醌(mitoxantrone)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮質類固醇(皮質酮(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲潑尼龍(methylpednisolone)、普賴蘇(prednisone)及潑尼龍(prenisolone))；生長因子訊息轉導激酶抑制劑；粒線體功能障礙誘導劑；毒素，諸如霍亂毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸環化酶毒素或白喉毒素(diphtheria toxin)，及凋亡蛋白酶活化劑；及染色質干擾劑。
細胞介素可用於操控宿主免疫反應朝向抗癌活性。參見例如Floros及Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015。適用於促進免疫抗癌或抗腫瘤反應的細胞介素包括例如單獨的或與本揭露內容之組成物呈任何組合的IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24及GM-CSF。
本文亦提供調節授受性免疫療法的方法，其中該等方法包含將安全開關蛋白之同源化合物以有效地消除個體中之先前已投予之經修飾宿主細胞的量投予先前已接受本揭露內容之經修飾宿主細胞的個體，該經修飾宿主細胞包含編碼安全開關蛋白的異源聚核苷酸。
在某些實施例中，安全開關蛋白包含tEGFR且同源化合物為西妥昔單抗，或安全開關蛋白包含iCasp9且同源化合物為AP1903 (例如二聚AP1903)，或安全開關蛋白包含RQR多肽且同源化合物為利妥昔單抗，或安全開關蛋白包含myc結合區域且同源化合物為對myc結合區域具有專一性之抗體。
在其他態樣中，提供製造本揭露內容之組成物或單位劑量的方法。在某些實施例中，方法包含將(i)經本揭露內容之載體轉導之宿主細胞的等分試樣與(ii)醫藥學上可接受之載劑合併。在某些實施例中，本揭露內容之載體係用於轉染/轉導供授受性轉移療法(例如靶向癌症抗原)使用的宿主細胞(例如T細胞)。
在一些實施例中，方法進一步包含在等分試樣之前，培養經轉導之宿主細胞及選擇併有(亦即，表現)載體的經轉導細胞。在其他實施例中，方法包含在培養及選擇之後且在等分試樣之前，擴增經轉導之宿主細胞。在本發明方法之任一實施例中，可將製成的組成物或單位劑量冷凍或低溫保存以便後續使用。任何適當的宿主細胞可用於製造根據本發明方法的組成物或單位劑量，包括例如造血幹細胞、T細胞、初代T細胞、T細胞株、NK細胞或NK-T細胞。在特定實施例中，方法包含的宿主細胞為CD8 +T細胞、CD4 +T細胞或二者。
亦提供單獨或以任何組合服用的結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組成物、單位劑量及免疫原性多肽中之任一者，用於治療個體之與KRAS G12D突變或KRAS G12V或NRAS G12D突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變或HRAS G12D突變相關的疾病或病症。
亦提供單獨或以任何組合服用的結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組成物、單位劑量及免疫原性多肽中之任一者，用於製造供治療個體之疾病或病症用的藥劑，該疾病或病症與KRAS G12D突變或KRAS G12V或NRAS G12D突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變或HRAS G12D突變相關。
在某些實施例中，疾病或病症包含癌症。在一些實施例中，癌症為實體癌症或血液惡性病。在某些實施例中，疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌瘤；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。在一些實施例中，方法包含本發明組成物的非經腸或靜脈內投予。在一些實施例中，方法包含向個體投予多次劑量的結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組成物、單位劑量及/或免疫原性多肽。
在某些實施例中，以約二週至約四週之間的投予間隔投予多次劑量。
在某些實施例中，組成物包含經修飾之宿主細胞。在一些實施例中，方法包含將經修飾之宿主細胞以約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg之劑量投予個體。
在某些實施例中，其中該方法進一步包含向個體投予細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
在某些實施例中，個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或刺激性免疫檢查點媒介物(stimulatory immune checkpoint agent)之促效劑。
亦提供包含將編碼本揭露內容之結合蛋白的聚核苷酸引入宿主(例如T)細胞中的方法。
本揭露內容亦提供以下非限制性所列實施例。
實施例1.  一種結合蛋白，其包含： (a) T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域，其包含SEQ ID NOs.: 16、17、42及43中之任一者中所示的互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；及/或 (b) TCR β鏈可變(Vβ)區域，其包含SEQ ID NOs.: 26、27、52及53中之任一者中所示的CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體， 其中該結合蛋白能夠結合至肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 3)、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成且其中該HLA包含HLA-A*11。
實施例2.  如實施例1之結合蛋白，其中該HLA包含HLA-A*11:01。
實施例3.  如實施例1或2之結合蛋白，其中該Vα區域及/或該Vβ區域為人類的、人源化的或嵌合的，且較佳為人類的。
實施例4.  如實施例1至3中任一例之結合蛋白，其包含(i) SEQ ID NOs.: 17及27中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii) SEQ ID NOs.: 16及26中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii) SEQ ID NOs.: 53及43中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(iv) SEQ ID NOs.: 52及42中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體。
實施例5.  如實施例1至4中任一例之結合蛋白，其：(i)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iv)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(v) (i)至(iv)之任何組合。
實施例6.  如實施例1至5中任一例之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.: 14、15、16或17、24、25及26或27中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
實施例7.  如實施例1至5中任一例之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.: 40、41、42或43、50、51及52或53中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
實施例8.  如實施例1至7中任一例之結合蛋白，其中： (i)該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13或39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及/或 (ii)該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23或49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例9.  如實施例1至8中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，其中任擇地，該結合蛋白包含SEQ ID NO.: 154中所示之胺基酸序列。
實施例10.    如實施例1至8中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例11. 如實施例1至10中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且該Vβ區域包含SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，其中任擇地，該結合蛋白包含如SEQ ID NO.: 154所示的胺基酸序列。
實施例12.    如實施例1至10中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成且該Vβ區域包含SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例13.    如實施例1至12中任一例之結合蛋白，其進一步包含TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)。
實施例14.    如實施例13之結合蛋白，其中該Cα包含與SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
實施例15.    如實施例13或14之結合蛋白，其中該Cβ包含與SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
實施例16.    如實施例13至15中任一例之結合蛋白，其中該Cα及該Cβ包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i) SEQ ID NOs.: 18及28； (ii) SEQ ID NOs.: 19及29； (iii) SEQ ID NOs.: 44及54；或 (iv) SEQ ID NOs.: 45及55。
實施例17.    如實施例1至16中任一例之結合蛋白，其包含TCR α鏈及TCR β鏈，其中該TCR α鏈及該TCR β鏈包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i)   SEQ ID NOs.: 12及22； (ii)  SEQ ID NOs.: 20及30或155； (iii) SEQ ID NOS.: 12及30或155； (iv) SEQ ID NOs.: 20及22； (v)  SEQ ID NOs.: 38及48； (vi) SEQ ID NOs.: 46及56； (vii)   SEQ ID NOs.: 38及56；或 (viii)  SEQ ID NOs.: 46及48。
實施例18.    如實施例1至17中任一例之結合蛋白，其中該結合蛋白包含TCR、單鏈TCR (scTCR)、單鏈T細胞受體可變片段(scTv)或嵌合抗原受體(CAR)。
實施例19.    如實施例18之結合蛋白，其中該結合蛋白包含TCR。
實施例20.    一種經分離之聚核苷酸，其編碼如實施例1至19中任一例之結合蛋白。
實施例21.    如實施例20之聚核苷酸，其包含與SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的聚核苷酸，或包含SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成，或其任何組合。
實施例22.    如實施例20或21之聚核苷酸，其進一步包含： (i)編碼多肽之聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體α鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含CD8共受體α鏈； (ii)編碼多肽之聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體β鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含CD8共受體β鏈；或 (iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
實施例23. 如實施例22之聚核苷酸，其包含： (a)編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸； (b)編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸；及 (c)編碼自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於(a)之聚核苷酸與(b)之聚核苷酸之間。
實施例24. 如實施例22或23之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於以下二者之間： (1)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸；及/或 (2)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸。
實施例25.    如實施例22至24中任一例之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (iii) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)； (iv) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)； (v)  (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)；或 (vi) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnBP為編碼結合蛋白的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1及pnSCP 2各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的。
實施例26.    如實施例22至25中任一例之聚核苷酸，其中所編碼的結合蛋白包含TCRα鏈及TCRβ鏈，其中聚核苷酸包含安置於編碼TCRα鏈之聚核苷酸與編碼TCRβ鏈之聚核苷酸之間的編碼自裂解肽之聚核苷酸。
實施例27.    如實施例26之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (iii) (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (iv) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (v)  (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (vi) (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)； (vii)   (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (viii)  (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnTCRα為編碼TCR α鏈的聚核苷酸， 其中pnTCRβ為編碼TCR β鏈的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1、pnSCP 2及pnSCP 3各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的。
實施例28.    如實施例20至27中任一例之聚核苷酸，其編碼與SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57及58中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57及58中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例29.    如實施例28之聚核苷酸，其編碼(i)與SEQ ID NO.: 11中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 11中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.: 21中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 21中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例30.    如實施例29之聚核苷酸，其編碼(i)與SEQ ID NO.: 37中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 37中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.: 47中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 47中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例31.    如實施例20至30中任一例之聚核苷酸，其為或包含經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現的聚核苷酸序列，其中任擇地，宿主細胞為人類免疫系統細胞，且其中進一步任擇地為T細胞。
實施例32.    一種表現載體，其包含可操作地連接至表現控制序列的如實施例20至31中任一例之聚核苷酸。
實施例33.    如實施例32之表現載體，其中該載體能夠將聚核苷酸遞送至宿主細胞。
實施例34.    如實施例33之表現載體，其中該宿主細胞為造血前驅細胞或人類免疫系統細胞。
實施例35.    如實施例34之表現載體，其中該人類免疫系統細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、巨噬細胞、單核球、樹突細胞或其任何組合。
實施例36.    如實施例35之表現載體，其中該T細胞為初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
實施例37.    如實施例32至36中任一例之表現載體，其中該載體為病毒載體。
實施例38.    如實施例37之表現載體，其中該病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
實施例39.    一種宿主細胞，其經修飾以包含如實施例20至31中任一例之聚核苷酸及/或如實施例32至38中任一例之表現載體，及/或經修飾以表現如實施例1至19中任一例之結合蛋白。
實施例40.    如實施例39之宿主細胞，其中該經修飾之細胞包含造血前驅細胞及/或人類免疫細胞。
實施例41.    如實施例40之宿主細胞，其中該免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。
實施例42.    如實施例41之宿主細胞，其中該免疫細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合， 其中任擇地，該免疫細胞包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞，其中進一步任擇地，該CD4 +T細胞、該CD8 +T細胞或二者均包含(i)編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含CD8共受體α鏈；(ii)編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含CD8共受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
實施例43.    如實施例39至42中任一例之宿主細胞，其中經修飾之細胞包含PD-1基因、LAG3基因、TIM3基因、CTLA4基因、HLA組分基因、TIGIT基因、TCR組分基因、FasL基因或其任何組合之染色體基因剔除。
實施例44.    如實施例43之宿主細胞，其中染色體基因剔除包含HLA組分基因的剔除，該HLA組分基因選自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因或β2微球蛋白基因。
實施例45.    如實施例33或34之宿主細胞，其中染色體基因剔除包含TCR組分基因的剔除，該TCR組分基因選自TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因或其組合。
實施例46.    一種組成物，其包含如實施例39至45中任一例之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
實施例47.    如實施例46之組成物，其包含至少約30%經修飾CD4 +T細胞，以約1:1比率與(ii)包含至少約30%經修飾CD8 +T細胞之組成物組合。
實施例48.    如實施例46或47之組成物，其中該組成物基本上不含初始T細胞。
實施例49.    一種組成物，其包含： (i)如實施例1至19中任一例之結合蛋白； (ii)如實施例20至31中任一例之聚核苷酸； (iii)如實施例32至38中任一例之表現載體；及/或 (iv)如實施例39至45中任一例之宿主細胞， 及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
實施例50.    一種用於治療個體之疾病或病症的方法，該疾病或病症與KRAS G12V突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關，該方法包含向該個體投予有效量的： (i)如實施例1至19中任一例之結合蛋白； (ii)如實施例20至31中任一例之聚核苷酸； (iii)如實施例32至38中任一例之表現載體； (iv)如實施例39至45中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，且其中任擇地，該宿主細胞對於該個體而言為自體的、同種異體的或同基因型的；及/或 (v)如實施例46至49中任一例之組成物。
實施例51.    如實施例50之方法，其中該疾病或病症包含癌症，其中該癌症任擇地為實體癌症或血液惡性病。
實施例52.    如實施例50或51之方法，其中該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌瘤；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
實施例53.    如實施例50至52中任一例之方法，其中該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物非經腸或靜脈內投予該個體。
實施例54.    如實施例50至53中任一例之方法，其中該方法包含將(i)至(v)中之任一者或多者的多次劑量投予該個體。
實施例55.    如實施例54之方法，其中以約二週至約四週的投予間隔投予多次劑量。
實施例56.    如實施例50至55中任一例之方法，其中該組成物包含宿主細胞或包含宿主細胞的組成物，且其中該方法包含將該宿主細胞或組成物以約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg之劑量投予個體。
實施例57.    如實施例50至56中任一例之方法，進一步包含在投予該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物之前，確定該個體表現HLA-A*11，任擇地HLA-A*11:01。
實施例58.    如實施例50至57中任一例之方法，其中該方法進一步包含將細胞介素投予該個體。
實施例59.    如實施例58之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
實施例60.    如實施例50至59中任一例之方法，其中該個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或刺激性免疫檢查點媒介物之促效劑。
實施例61.    如實施例1至19中任一例之結合蛋白，如實施例20至31中任一例之聚核苷酸，如實施例32至38中任一例之表現載體，如實施例39至45中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，及/或如實施例46至49中任一例之組成物，其用於治療個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的方法，其中任擇地，該疾病或病症包含癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
實施例62.    如實施例1至19中任一例之結合蛋白，如實施例20至31中任一例之聚核苷酸，如實施例32至38中任一例之表現載體，如實施例39至45中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，及/或如實施例46至49中任一例之組成物，其用於製造供治療個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的藥劑，其中任擇地，該疾病或病症包含癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
實施例1a. 一種結合蛋白，其包含： (a) T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域，其包含SEQ ID NOs.: 16、17、42及43中之任一者中所示的互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；及/或 (b) TCR β鏈可變(Vβ)區域，其包含SEQ ID NOs.: 26、27、52及53中之任一者中所示的CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體， 其中該結合蛋白能夠結合至肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO.: 3)、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成且其中該HLA包含HLA-A*11。
實施例2a. 如實施例1a之結合蛋白，其中該HLA包含HLA-A*11:01。
實施例3a. 如實施例1a或2a之結合蛋白，其中該Vα區域及/或該Vβ區域為人類的、人源化的或嵌合的，且較佳為人類的。
實施例4a. 如實施例1a至3a中任一例之結合蛋白，其包含(i) SEQ ID NOs.: 17及27中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii) SEQ ID NOs.: 16及26中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii) SEQ ID NOs.: 53及43中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(iv) SEQ ID NOs.: 52及42中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體。
實施例5a. 如實施例1a至4a中任一例之結合蛋白，其：(i)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii)在Vα區域中包含SEQ ID NO.: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iv)在Vβ區域中包含SEQ ID NO.: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(v) (i)至(iv)之任何組合。
實施例6a. 如實施例1a至5a中任一例之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.: 14、15、16或17、24、25及26或27中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
實施例7a. 如實施例1a至5a中任一例之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.: 40、41、42或43、50、51及52或53中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
實施例8a. 如實施例1a至7a中任一例之結合蛋白，其中： (i)該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13或39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成；及/或 (ii)該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23或49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例9a. 如實施例1a至8a中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例10a.  如實施例1a至8a中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例11a.  如實施例1a至10a中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.: 13中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成且該Vβ區域包含SEQ ID NO.: 23中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例12a.  如實施例1a至10a中任一例之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.: 39中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成且該Vβ區域包含SEQ ID NO.: 49中所示之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。
實施例13a.  如實施例1a至12a中任一例之結合蛋白，其進一步包含TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或TCR β鏈恆定區域(Cβ)。
實施例14a.  如實施例13a之結合蛋白，其中該Cα包含與SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
實施例15a.  如實施例13a或14a之結合蛋白，其中該Cβ包含與SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
實施例16a.  如實施例13a至15a中任一例之結合蛋白，其中該Cα及該Cβ包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i)   SEQ ID NOs.: 18及28； (ii)  SEQ ID NOs.: 19及29； (iii) SEQ ID NOs.: 44及54；或 (iv) SEQ ID NOs.: 45及55。
實施例17a.  如實施例13a至16a中任一例之結合蛋白，其中該Cα、該Cβ或二者均包含促進該Cα與該Cβ優先配對的修飾。
實施例18.    如實施例13a至16a中任一例之結合蛋白，其中該Cα及該Cβ各自包含促進該Cα與該Cβ優先配對的經引入之半胱胺酸殘基。
實施例19a.  如實施例13a至16a中任一例之結合蛋白，其中該Cα包含T48C取代且該Cβ包含S57C取代，以促進該Cα與該Cβ的優先配對。
實施例20a.  如實施例1a至19a中任一例之結合蛋白，其包含TCR α鏈及TCR β鏈，其中該TCR α鏈及該TCR β鏈包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i)   SEQ ID NOs.: 12及22； (ii)  SEQ ID NOs.: 20及30； (iii) SEQ ID NOS.:12及30； (iv) SEQ ID NOs.: 20及22； (v)  SEQ ID NOs.: 38及48； (vi) SEQ ID NOs.: 46及56； (vii)   SEQ ID NOs.: 38及56； (viii)  SEQ ID NOs.:46及48；或 (ix) SEQ ID NOs.: 85及83。
實施例21a.  如實施例1a至20a中任一例之結合蛋白，其中該結合蛋白包含TCR、單鏈TCR (scTCR)、單鏈T細胞受體可變片段(scTv)或嵌合抗原受體(CAR)。
實施例22a.  如實施例21a之結合蛋白，其中該結合蛋白包含TCR。
實施例23a.  如實施例1至22a中任一例之結合蛋白，其中該結合蛋白在對該肽之功能親合力的CD137表面表現分析中包含至多100 nM、至多50 nM、至多25 nM、至多10 nM、至多1 nM、至多750 pM、至多500 pM、至多250 pM、至多100 pM、至多75 pM或至多60 pM的EC50。
實施例24a.  一種經分離之聚核苷酸，其編碼如實施例1a至23a中任一例之結合蛋白。
實施例25a.  如實施例24a之聚核苷酸，其包含與SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的聚核苷酸，或包含SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成，或其任何組合。
實施例26a.  如實施例24a或25a之聚核苷酸，其進一步包含： (i)編碼多肽之聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體α鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含CD8共受體α鏈； (ii)編碼多肽之聚核苷酸，該多肽包含CD8共受體β鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含CD8共受體β鏈；或 (iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
實施例27a.   如實施例26a之聚核苷酸，其包含： (a)編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸； (b)編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸；及 (c)編碼自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於(a)之聚核苷酸與(b)之聚核苷酸之間。
實施例28a.   如實施例26a或27a之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於以下二者之間： (1)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸；及/或 (2)編碼結合蛋白的聚核苷酸與編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸。
實施例29a.  如實施例26a至28a中任一例之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (iii) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)； (iv) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)； (v)  (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)；或 (vi) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnBP為編碼結合蛋白的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1及pnSCP 2各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的。
實施例30a.  如實施例26a至29a中任一例之聚核苷酸，其中所編碼的結合蛋白包含TCRα鏈及TCRβ鏈，其中聚核苷酸包含安置於編碼TCRα鏈之聚核苷酸與編碼TCRβ鏈之聚核苷酸之間的編碼自裂解肽之聚核苷酸。
實施例31a.  如實施例30a之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (iii) (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (iv) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (v)  (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (vi) (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)； (vii)   (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (viii)  (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnCD8β為編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸， 其中pnTCRα為編碼TCR α鏈的聚核苷酸， 其中pnTCRβ為編碼TCR β鏈的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1、pnSCP 2及pnSCP 3各自獨立地為編碼自裂解肽的聚核苷酸，其中聚核苷酸及/或所編碼的自裂解肽任擇地為相同或不同的。
實施例32a.  如實施例31a之聚核苷酸，其中pnSCP1編碼T2A肽，pnSCP2編碼P2A肽且pnSCP3編碼P2A肽。
實施例33a.  如實施例24a至32a中任一例之聚核苷酸，其編碼與SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57、58、84、86、88及90中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57、58、84、86、88及90中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例34a.  如實施例33a之聚核苷酸，其編碼(i)與SEQ ID NO.: 11中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 11中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.: 21中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 21中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例35a.  如實施例33a之聚核苷酸，其編碼(i)與SEQ ID NO.: 37中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 37中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.: 47中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.: 47中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
實施例36a.  如實施例24a至35a中任一例之聚核苷酸，其為或包含經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現的聚核苷酸序列，其中任擇地，宿主細胞為人類免疫系統細胞，且其中進一步任擇地為T細胞。
實施例37a.  一種表現載體，其包含可操作地連接至表現控制序列的如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸。
實施例38a.  如實施例37a之表現載體，其中該表現控制序列包含MSCV啟動子。
實施例39a.  如實施例37a或實施例38a之表現載體，其中該表現控制序列驅動單一mRNA的表現，該單一mRNA編碼CD8共受體α鏈之胞外部分、CD8共受體β鏈之胞外部分、TCR α鏈及TCR β鏈。
實施例40a.  如實施例37a至39a中任一例之表現載體，其中該載體能夠將聚核苷酸遞送至宿主細胞。
實施例41a.  如實施例40a之表現載體，其中該宿主細胞為造血前驅細胞或人類免疫系統細胞。
實施例42a.  如實施例41a之表現載體，其中該人類免疫系統細胞為CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、巨噬細胞、單核球、樹突細胞或其任何組合。
實施例43a.  如實施例42a之表現載體，其中該T細胞為初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
實施例44a.  如實施例37a至43a中任一例之表現載體，其中該載體為病毒載體。
實施例45a.  如實施例44之表現載體，其中該病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
實施例46a.  如實施例44a之表現載體，其中病毒載體為自身不活化的慢病毒載體。
實施例47a.  如實施例44a或實施例46a之表現載體，其中該病毒載體為第三代慢病毒載體。
實施例48a.  一種宿主細胞，其經修飾以包含如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸及/或如實施例37a至47a中任一例之表現載體，及/或經修飾以表現如實施例1a至23a中任一例之結合蛋白。
實施例49a.  如實施例48a之宿主細胞，其中經修飾之細胞包含造血前驅細胞及/或人類免疫細胞。
實施例50a.  如實施例49a之宿主細胞，其中該免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。
實施例51a.  如實施例50a之宿主細胞，其中該免疫細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合， 其中任擇地，該免疫細胞包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞，其中進一步任擇地，該CD4 +T細胞、該CD8 +T細胞或二者均包含(i)編碼包含CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含CD8共受體α鏈；(ii)編碼包含CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含CD8共受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
實施例52a.  如實施例48a至51a中任一例之宿主細胞，其中經修飾之細胞包含PD-1基因、LAG3基因、TIM3基因、CTLA4基因、HLA組分基因、TIGIT基因、TCR組分基因、FasL基因或其任何組合之染色體基因剔除。
實施例53a.  如實施例52a之宿主細胞，其中染色體基因剔除包含HLA組分基因的剔除，該HLA組分基因選自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因或β2微球蛋白基因。
實施例54a.  如實施例52a或53a之宿主細胞，其中染色體基因剔除包含TCR組分基因的剔除，該TCR組分基因選自TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因或其組合。
實施例55a.  一種組成物，其包含如實施例48a至54a中任一例之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
實施例56a.  如實施例55a之組成物，其包含至少約30%經修飾CD4 +T細胞，以約1:1比率與(ii)包含至少約30%經修飾CD8 +T細胞之組成物組合。
實施例57a.  如實施例55a或56a之組成物，其中該組成物基本上不含初始T細胞。
實施例58a.  一種組成物，其包含： (v)  如實施例1a至23a中任一例之結合蛋白； (vi) 如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸； (vii)   如實施例37a至47a中任一例之表現載體；及/或 (viii)  如實施例48a至54a中任一例之宿主細胞， 及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
實施例59a.  一種用於治療個體之疾病或病症的方法，該疾病或病症與KRAS G12V突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關，該方法包含向該個體投予有效量的： (i)如實施例1至23a中任一例之結合蛋白； (ii)如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸； (iii)如實施例37a至47a中任一例之表現載體； (iv) 如實施例48a至54a中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，且其中任擇地，該宿主細胞對於該個體而言為自體的、同種異體的或同基因型的；及/或 (v)  如實施例55a至58a中任一例之組成物。
實施例60a.  如實施例59a之方法，其中該疾病或病症包含癌症，其中該癌症任擇地為實體癌症或血液惡性病。
實施例61a.  如實施例59a或60a之方法，其中該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌瘤；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
實施例62a. 如實施例59a至61a中任一例之方法，其中該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物非經腸或靜脈內投予該個體。
實施例63a. 如實施例59a至62a中任一例之方法，其中該方法包含將(i)至(v)中之任一者或多者的多次劑量投予該個體。
實施例64a. 如實施例63a之方法，其中以約二週至約四週的投予間隔投予多次劑量。
實施例65a.  如實施例59a至64a中任一例之方法，其中該組成物包含宿主細胞或包含宿主細胞的組成物，且其中該方法包含將該宿主細胞或組成物以約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg之劑量投予個體。
實施例66a.  如實施例59a至65a中任一例之方法，其中該方法包含向該個體投予至少5x10^8、至少1x10^9、至少5x10^9、至少1x10^10、至少1.5x10^10、至少2x10^10或至少5x10^10個包含結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
實施例67a.  如實施例59a至65a中任一例之方法，其中該方法包含向該個體投予至少5x10^9、至少1x10^10、至少1.5x10^10、至少2x10^10、至少5x10^10、至少1x10^11或至少5x10^11個包含結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
實施例68a.  如實施例59a至65a中任一例之方法，其中該方法包含向該個體投予約5x10^9、約6x10^9、約7x10^9、約8x10^9、約9x10^9、約1x10^10、約1.1x10^10、約1.2x10^10、約1.3x10^10、約1.4x10^10、約1.5x10^10、約1.6x10^10、約1.7x10^10、約1.8x10^10、約1.9x10^10或約2x10^10個包含結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
實施例69a.  如實施例59a至65a中任一例之方法，其中該方法包含向該個體投予約5 x10^9至約1 x10^11、約5 x10^9至約5 x10^10、約5 x10^9至約2 x10^10、約5 x10^9至約1.5 x10^10、約5 x10^9至約1 x10^10、約1 x10^10至約1 x10^11、約1 x10^10至約5 x10^10、約1 x10^10至約2 x10^10、或約1 x10^10至約1.5 x10^10個包含結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
實施例70a.  如實施例59a至69a中任一例之方法，進一步包含在投予該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物之前，確定該個體表現HLA-A*11，任擇地HLA-A*11:01。
實施例71a. 如實施例59a至70a中任一例之方法，其中該方法進一步包含將細胞介素投予該個體。
實施例72a. 如實施例71a之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
實施例73a. 如實施例59a至72a中任一例之方法，其中該個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或刺激性免疫檢查點媒介物之促效劑。
實施例74a.  如實施例1a至23a中任一例之結合蛋白，如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸，如實施例37a至47a中任一例之表現載體，如實施例48a至54a中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，及/或如實施例55a至58a中任一例之組成物，其用於治療個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的方法，其中任擇地，該疾病或病症包含癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
實施例75a.  如實施例1a至23a中任一例之結合蛋白，如實施例24a至36a中任一例之聚核苷酸，如實施例37a至47a中任一例之表現載體，如實施例48a至54a中任一例之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或二者，及/或如實施例55a至58a中任一例之組成物，用於製造供治療個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的藥劑，其中任擇地，該疾病或病症包含癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
序列 SEQ ID NO:1 - wt KRAS全長(UniProt: P01116) MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL PSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ RVEDAFYTLV REIRQYRLKK ISKEEKTPGC VKIKKCIIM SEQ ID NO:2 - KRAS 7-16 G12V VVVGAVGVGK SEQ ID NO:3 - KRAS 8-16 G12V VVGAVGVGK SEQ ID NO:4 - TCR 11N4A之KRAS 8-16 G12V結合模體 x-V-G-A-x-G-x-x-K SEQ ID NO:5 - 具有訊息肽的TCR 11N4A α鏈 - 原始(WT)核苷酸序列 atggccatgctcctgggggcatcagtgctgattctgtggcttcagccagactgggtaaacagtcaacagaagaatgatgaccagcaagttaagcaaaattcaccatccctgagcgtccaggaaggaagaatttctattctgaactgtgactatactaacagcatgtttgattatttcctatggtacaaaaaataccctgctgaaggtcctacattcctgatatctataagttccattaaggataaaaatgaagatggaagattcactgtcttcttaaacaaaagtgccaagcacctctctctgcacattgtgccctcccagcctggagactctgcagtgtacttctgtgcagcaagtggggtttcaggaaacacacctcttgtctttggaaagggcacaagactttctgtgattgcaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctga SEQ ID NO:6 - 具有訊息肽的TCR 11N4A β鏈 - 原始(WT)核苷酸序列 atgggctccaggctgctctgttgggtgctgctttgtctcctgggagcaggcccagtaaaggctggagtcactcaaactccaagatatctgatcaaaacgagaggacagcaagtgacactgagctgctcccctatctctgggcataggagtgtatcctggtaccaacagaccccaggacagggccttcagttcctctttgaatacttcagtgagacacagagaaacaaaggaaacttccctggtcgattctcagggcgccagttctctaactctcgctctgagatgaatgtgagcaccttggagctgggggactcggccctttatctttgcgccagcagcgtcgggactgtggagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctag SEQ ID NO:7 - TCR 11N4A TCRβ-P2A-TCRα聚核苷酸 - 密碼子最佳化A 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SEQ ID NO:8 - 11N4A TCRβ-P2A-TCRα聚核苷酸 - 密碼子最佳化B 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SEQ ID NO:9 - CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N4A TCRβ-P2A-TCRα聚核苷酸 - 密碼子最佳化A ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCTAGACCCAGCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACAGAACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAACTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGAGCAATCCTACCAGCGGCTGCAGCTGGCTGTTTCAGCCTAGAGGTGCTGCCGCCTCTCCTACCTTTCTGCTGTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCCGCCGAAGGACTGGACACCCAGAGATTCAGCGGCAAGAGACTGGGCGACACCTTCGTGCTGACCCTGAGCGACTTCAGAAGAGAGAACGAGGGCTACTACTTCTGCAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAGGCGGAGAGTGTGCAAGTGCCCTAGACCTGTGGTCAAGAGCGGCGACAAGCCTAGCCTGAGCGCCAGATATGTTGGCAGCGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTTACATGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGAGGCCTAGACTGTGGCTGCTTCTGGCTGCCCAGCTGACAGTGCTGCACGGCAATTCTGTCCTGCAGCAGACCCCTGCCTACATCAAGGTGCAGACCAACAAGATGGTCATGCTGAGCTGCGAGGCCAAGATCAGCCTGTCCAACATGCGGATCTACTGGCTGCGGCAGAGACAGGCCCCTAGCTCTGATAGCCACCACGAGTTTCTGGCCCTGTGGGATTCTGCCAAGGGCACCATTCACGGCGAGGAAGTGGAACAAGAGAAGATCGCCGTGTTCCGGGACGCCAGCAGATTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCCGAGGACAGCGGCATCTATTTCTGCATGATCGTGGGCAGCCCCGAGCTGACATTTGGCAAGGGAACACAGCTGAGCGTGGTGGACTTCCTGCCTACTACAGCCCAGCCTACCAAGAAGTCTACCCTGAAGAAACGCGTGTGCAGACTGCCCAGGCCTGAGACACAAAAGGGCCCTCTGTGCAGCCCTATCACACTGGGATTGCTGGTGGCTGGCGTTCTGGTCCTGCTGGTGTCTCTGGGAGTTGCCATCCACCTGTGCTGTAGAAGAAGGCGGGCCAGACTGCGGTTCATGAAGCAGTTCTACAAAGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAACAAGCCGGCGACGTCGAGGAAAATCCTGGACCTATGGGCTCTAGACTGTTGTGTTGGGTTCTGCTGTGTCTGCTTGGAGCTGGACCTGTGAAAGCTGGAGTTACCCAGACACCCAGATATCTGATCAAGACCAGAGGACAGCAGGTGACACTGAGCTGTAGCCCTATTTCTGGCCACAGGAGCGTTAGCTGGTATCAGCAAACACCCGGGCAGGGACTACAATTTCTATTCGAGTACTTCAGCGAGACCCAGCGGAATAAGGGCAATTTTCCTGGCAGATTTAGCGGCAGGCAGTTCAGCAACAGCAGAAGCGAGATGAACGTGAGCACCCTGGAATTAGGCGATTCTGCTCTGTACCTGTGTGCCTCTTCTGTGGGAACAGTGGAGCAGTACTTTGGCCCCGGCACGAGACTGACAGTGACAGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGCACCGACCCCCAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGTCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCTGCTGAGGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCGGTTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGGCCATGTTACTAGGAGCGAGCGTGCTGATTCTGTGGTTACAGCCTGATTGGGTGAACTCTCAGCAGAAGAACGACGATCAGCAGGTGAAGCAGAATAGCCCCTCTCTGTCTGTGCAGGAGGGCAGAATCTCTATCCTGAATTGCGACTACACCAACAGCATGTTCGACTATTTTCTGTGGTACAAAAAATACCCCGCCGAGGGCCCTACATTCCTGATCAGCATCAGCTCTATCAAGGACAAGAACGAGGATGGCAGATTTACCGTGTTCCTGAACAAGAGCGCCAAGCACCTGAGCCTGCACATTGTGCCTTCTCAACCTGGCGATTCTGCTGTGTACTTTTGTGCTGCCTCTGGAGTGAGCGGCAATACACCTCTAGTGTTCGGGAAGGGCACAAGACTGTCTGTTATTGCAAACATTCAAAACCCCGACCCTGCTGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTCAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:10 - CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N4A TCRβ-P2A-TCRα聚核苷酸 - 密碼子最佳化B ATGGCATTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCCAGCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACAGAACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAACTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGAGCAATCCTACCAGCGGCTGCAGCTGGCTGTTTCAGCCTAGAGGTGCTGCCGCCTCTCCTACCTTTCTGCTGTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCCGCCGAAGGACTGGACACCCAGAGATTCAGCGGCAAGAGACTGGGCGACACCTTCGTGCTGACCCTGAGCGACTTCAGAAGAGAGAACGAGGGCTACTACTTCTGCAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAGGCGGAGAGTGTGCAAGTGCCCTAGACCTGTGGTCAAGAGCGGCGACAAGCCTAGCCTGAGCGCCAGATATGTTGGCAGCGGAGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGAGGCCTAGACTGTGGCTGCTTCTGGCTGCCCAGCTGACAGTGCTGCACGGCAATTCTGTCCTGCAGCAGACCCCTGCCTACATCAAGGTGCAGACCAACAAGATGGTCATGCTGAGCTGCGAGGCCAAGATCAGCCTGTCCAACATGCGGATCTACTGGCTGCGGCAGAGACAGGCCCCTAGCAGCGATTCTCACCACGAGTTTCTGGCCCTGTGGGATAGCGCCAAGGGAACCATTCACGGCGAGGAAGTGGAACAAGAGAAGATCGCCGTGTTCCGGGACGCCAGCAGATTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCCGAGGACAGCGGCATCTATTTCTGCATGATCGTGGGCAGCCCCGAGCTGACATTTGGCAAGGGAACACAGCTGAGCGTGGTGGACTTCCTGCCTACTACAGCCCAGCCTACCAAGAAGTCTACCCTGAAGAAACGCGTGTGCAGACTGCCCAGGCCTGAGACACAAAAGGGCCCTCTGTGCAGCCCTATCACACTGGGATTGCTGGTGGCTGGCGTTCTGGTCCTGCTGGTTTCTCTGGGAGTTGCCATCCACCTGTGCTGCAGACGCAGAAGGGCCAGACTGCGGTTCATGAAGCAGTTCTACAAAGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAACAAGCCGGCGACGTCGAAGAAAATCCTGGACCAATGGGCAGCAGACTGCTGTGCTGGGTTCTGCTGTGTCTGCTTGGAGCCGGACCTGTGAAAGCTGGCGTGACCCAGACACCTAGATACCTGATCAAGACCAGAGGCCAGCAAGTGACACTGAGCTGTAGCCCCATCAGCGGCCACAGAAGCGTGTCCTGGTATCAGCAGACTCCTGGACAGGGCCTGCAGTTCCTGTTCGAGTACTTCTCCGAGACACAGAGGAACAAGGGCAACTTCCCCGGCAGATTCTCCGGCAGACAGTTCAGCAACTCCCGCAGCGAGATGAACGTGTCCACACTGGAACTGGGAGATAGCGCCCTGTACCTGTGTGCCTCTTCTGTGGGAACCGTGGAACAGTACTTCGGCCCTGGCACAAGACTGACCGTGACCGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCACCTGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGATCTCTCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTATCCCGATCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGTACCGATCCTCAGCCACTGAAAGAGCAGCCCGCTCTGAACGACAGCAGATACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGGTGTCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCTGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTTCTGTCTGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAAGCCACTCTGTACGCCGTGTTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGATTCTAGAGGCGGATCCGGAGCCACAAATTTCTCACTGCTGAAGCAGGCCGGGGATGTTGAGGAAAACCCAGGACCTATGGCTATGCTGCTGGGAGCCTCTGTGCTGATCCTGTGGCTGCAACCCGATTGGGTCAACAGCCAGCAGAAGAACGACGACCAGCAAGTCAAGCAGAACAGCCCCAGCCTGAGCGTGCAAGAGGGCAGAATCAGCATCCTGAACTGCGACTACACCAACTCTATGTTCGACTACTTTCTGTGGTACAAGAAGTACCCCGCCGAGGGACCCACCTTCCTGATCAGCATCAGCAGCATCAAGGACAAGAACGAGGACGGCCGGTTCACCGTGTTTCTGAACAAGAGCGCCAAGCACCTGAGCCTGCACATCGTGCCTTCTCAGCCTGGCGATAGCGCCGTGTACTTTTGTGCTGCCAGCGGCGTGTCAGGCAACACCCCTCTGGTTTTTGGCAAGGGCACACGCCTGTCCGTGATCGCCAACATTCAGAACCCTGATCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGTCCGATTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGTCCTGAGTCCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAATCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTCAGACTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:11 - 11N4A TCR α鏈 - 原始蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:12 - 11N4A TCR α鏈 - 原始蛋白質，不具有訊息肽 QQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:13 - 11N4A TCR α鏈可變區域，不具有訊息肽 QQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIA SEQ ID NO:14 - 11N4A TCR α鏈可變區域CDR1α NSMFDY SEQ ID NO:15 - 11N4A TCR α鏈可變區域CDR2α ISSIKDK SEQ ID NO:16 - 11N4A TCR α鏈可變區域CDR3α - IMGT接合 CAASGVSGNTPLVF SEQ ID NO:17 - 11N4A TCR α鏈可變區域CDR3α - IMGT AASGVSGNTPLV SEQ ID NO:18 - 11N4A TCR α鏈恆定區域(原始蛋白質) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:19 - 11N4A TCR α鏈恆定區域(經cys修飾之蛋白質) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:20 - 11N4A TCR α鏈，不具有訊息肽，經cys修飾 QQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:21 - 11N4A TCR β鏈 - 原始蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:22 - 11N4A TCR β鏈 - 原始蛋白質，不具有訊息肽 GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:23 - 11N4A TCR β鏈可變區域，不具有訊息肽 GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:24 - 11N4A TCR β鏈可變區域CDR1β SGHRS SEQ ID NO:25 - 11N4A TCR β鏈可變區域CDR2β YFSETQ SEQ ID NO:26 - 11N4A TCR β鏈可變區域CDR3β – IMGT接合 CASSVGTVEQYF SEQ ID NO:27 - 11N4A TCR β鏈可變區域CDR3β - IMGT ASSVGTVEQY SEQ ID NO:28 - 11N4A TCR β鏈恆定區域(原始蛋白質) EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG* SEQ ID NO:29 -11N4A TCR β鏈恆定區域(經cys修飾之蛋白質) EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:30 - 11N4A TCR β鏈，不具有訊息肽(經cys修飾之蛋白質) GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:31 - 11N4A TCRβ-P2A-TCRα - 蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:32 CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N4A TCRβ-P2A-α - 蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:33 -- 11N6 TCRα – 原始核苷酸序列 Atggaaactctcctgggagtgtctttggtgattctatggcttcaactggctagggtgaacagtcaacagggagaagaggatcctcaggccttgagcatccaggagggtgaaaatgccaccatgaactgcagttacaaaactagtataaacaatttacagtggtatagacaaaattcaggtagaggccttgtccacctaattttaatacgttcaaatgaaagagagaaacacagtggaagattaagagtcacgcttgacacttccaagaaaagcagttccttgttgatcacggcttcccgggcagcagacactgcttcttacttctgtgctacggaccctatgaacaccaatgcaggcaaatcaacctttggggatgggactacgctcactgtgaagccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctga SEQ ID NO:34 --11N6 TCRβ - 原始核苷酸序列 atgggcaccaggctcctctgctgggcggccctctgtctcctgggagcagaactcacagaagctggagttgcccagtctcccagatataagattatagagaaaaggcagagtgtggctttttggtgcaatcctatatctggccatgctaccctttactggtaccagcagatcctgggacagggcccaaagcttctgattcagtttcagaataacggtgtagtggatgattcacagttgcctaaggatcgattttctgcagagaggctcaaaggagtagactccactctcaagatccaacctgcaaagcttgaggactcggccgtgtatctctgtgccagcagcccctacggggggagcgtctcctacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctag SEQ ID NO:35 -11N6 TCRβ-P2A-α 密碼子最佳化 ATGGGCACAAGACTTCTCTGTTGGGCTGCACTGTGCTTGCTTGGAGCTGAGCTGACAGAAGCTGGAGTTGCCCAATCTCCTAGGTACAAGATCATCGAGAAGCGGCAGTCTGTGGCCTTTTGGTGCAATCCCATTAGCGGACATGCCACCCTGTACTGGTATCAGCAAATTCTGGGACAGGGCCCTAAACTGCTGATCCAGTTCCAGAATAACGGCGTGGTGGACGATTCTCAACTGCCTAAGGACCGGTTTTCTGCCGAGAGACTGAAAGGCGTTGATAGCACCCTGAAGATCCAACCTGCCAAACTGGAGGATTCTGCCGTGTACCTGTGTGCTAGCAGCCCTTATGGAGGATCTGTGTCTTATGAGCAGTACTTCGGACCTGGCACCAGACTGACCGTGACTGAAGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGCACCGACCCCCAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGTCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCTGCTGAGGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCGGTTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGGAGACACTGCTTGGCGTATCACTGGTGATTCTGTGGCTGCAACTGGCTAGAGTGAACTCTCAGCAGGGAGAAGAGGATCCTCAAGCTCTGAGCATTCAGGAAGGCGAAAACGCAACCATGAATTGCTCATACAAGACCAGCATCAACAACCTGCAGTGGTACCGGCAGAATAGCGGAAGAGGACTGGTTCACCTGATTTTAATCAGGTCTAATGAAAGGGAGAAGCACAGCGGCAGACTGAGAGTTACCCTGGACACATCCAAGAAATCTTCTTCTCTGCTGATTACAGCCTCTAGAGCCGCCGATACAGCCAGCTACTTTTGTGCCACAGATCCCATGAACACCAATGCCGGAAAGAGCACATTCGGCGATGGCACAACCCTGACAGTTAAGCCCAATATCCAGAATCCCGATCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTCAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:36 - CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N6 TCRβ-P2A-α 密碼子最佳化 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCTAGACCCAGCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACAGAACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAACTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGAGCAATCCTACCAGCGGCTGCAGCTGGCTGTTTCAGCCTAGAGGTGCTGCCGCCTCTCCTACCTTTCTGCTGTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCCGCCGAAGGACTGGACACCCAGAGATTCAGCGGCAAGAGACTGGGCGACACCTTCGTGCTGACCCTGAGCGACTTCAGAAGAGAGAACGAGGGCTACTACTTCTGCAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAGGCGGAGAGTGTGCAAGTGCCCTAGACCTGTGGTCAAGAGCGGCGACAAGCCTAGCCTGAGCGCCAGATATGTTGGCAGCGGAGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTTACATGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGAGGCCTAGACTGTGGCTGCTTCTGGCTGCCCAGCTGACAGTGCTGCACGGCAATTCTGTCCTGCAGCAGACCCCTGCCTACATCAAGGTGCAGACCAACAAGATGGTCATGCTGAGCTGCGAGGCCAAGATCAGCCTGTCCAACATGCGGATCTACTGGCTGCGGCAGAGACAGGCCCCTAGCTCTGATAGCCACCACGAGTTTCTGGCCCTGTGGGATTCTGCCAAGGGCACCATTCACGGCGAGGAAGTGGAACAAGAGAAGATCGCCGTGTTCCGGGACGCCAGCAGATTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCCGAGGACAGCGGCATCTATTTCTGCATGATCGTGGGCAGCCCCGAGCTGACATTTGGCAAGGGAACACAGCTGAGCGTGGTGGACTTCCTGCCTACTACAGCCCAGCCTACCAAGAAGTCTACCCTGAAGAAACGCGTGTGCAGACTGCCCAGGCCTGAGACACAAAAGGGCCCTCTGTGCAGCCCTATCACACTGGGATTGCTGGTGGCTGGCGTTCTGGTCCTGCTGGTGTCTCTGGGAGTTGCCATCCACCTGTGCTGTAGAAGAAGGCGGGCCAGACTGCGGTTCATGAAGCAGTTCTACAAAGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAACAAGCCGGCGACGTCGAGGAAAATCCTGGACCTATGGGCACAAGACTTCTCTGTTGGGCTGCACTGTGCTTGCTTGGAGCTGAGCTGACAGAAGCTGGAGTTGCCCAATCTCCTAGGTACAAGATCATCGAGAAGCGGCAGTCTGTGGCCTTTTGGTGCAATCCCATTAGCGGACATGCCACCCTGTACTGGTATCAGCAAATTCTGGGACAGGGCCCTAAACTGCTGATCCAGTTCCAGAATAACGGCGTGGTGGACGATTCTCAACTGCCTAAGGACCGGTTTTCTGCCGAGAGACTGAAAGGCGTTGATAGCACCCTGAAGATCCAACCTGCCAAACTGGAGGATTCTGCCGTGTACCTGTGTGCTAGCAGCCCTTATGGAGGATCTGTGTCTTATGAGCAGTACTTCGGACCTGGCACCAGACTGACCGTGACTGAAGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGCACCGACCCCCAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGTCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCTGCTGAGGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCGGTTCCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTTAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGACCTATGGAGACACTGCTTGGCGTATCACTGGTGATTCTGTGGCTGCAACTGGCTAGAGTGAACTCTCAGCAGGGAGAAGAGGATCCTCAAGCTCTGAGCATTCAGGAAGGCGAAAACGCAACCATGAATTGCTCATACAAGACCAGCATCAACAACCTGCAGTGGTACCGGCAGAATAGCGGAAGAGGACTGGTTCACCTGATTTTAATCAGGTCTAATGAAAGGGAGAAGCACAGCGGCAGACTGAGAGTTACCCTGGACACATCCAAGAAATCTTCTTCTCTGCTGATTACAGCCTCTAGAGCCGCCGATACAGCCAGCTACTTTTGTGCCACAGATCCCATGAACACCAATGCCGGAAAGAGCACATTCGGCGATGGCACAACCCTGACAGTTAAGCCCAATATCCAGAATCCCGATCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTCAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:37 - 11N6 TCR α鏈 - 原始蛋白質，其中訊息肽加下劃線 METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:38 - 11N6 TCR α鏈 - 原始蛋白質，不具有訊息肽 QQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:39 - 11N6 TCR α鏈可變區域，不具有訊息肽 QQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKP SEQ ID NO:40 - 11N6 TCR α鏈可變區域CDR1α TSINN SEQ ID NO:41 -11N6 TCR α鏈可變區域CDR2α IRSNERE SEQ ID NO:42--11N6 TCR α鏈可變區域CDR3α – IMGT接合 CATDPMNTNAGKSTF SEQ ID NO:43--11N6 TCR α鏈可變區域CDR3α - IMGT ATDPMNTNAGKST SEQ ID NO:44--11N6 TCR α鏈恆定區域(原始蛋白質) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:45 --11N6 TCR α鏈恆定區域(經cys修飾之蛋白質) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:46 - 11N6 TCR α鏈，不具有訊息肽，經cys修飾 QQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:47 - 11N6 TCR β鏈 - 原始蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:48 - 11N6 TCR β鏈 - 原始蛋白質，不具有訊息肽 GVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:49 - 11N6 TCR β鏈可變區域，不具有訊息肽 GVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO: 50 - 11N6 TCR β鏈可變區域CDR1β SGHAT SEQ ID NO:51 -11N6 TCR β鏈可變區域CDR2β FQNNGV SEQ ID NO:52 -- 11N6 TCR β鏈可變區域CDR3β – IMGT接合 CASSPYGGSVSYEQYF SEQ ID NO:53-- 11N6 TCR β鏈可變區域CDR3β - IMGT ASSPYGGSVSYEQY SEQ ID NO:54 11N6 TCR β鏈恆定區域(原始蛋白質) EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:55 -11N6 TCR β鏈恆定區域(經cys修飾之蛋白質) EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:56 -11N6 TCR β鏈(經cys修飾之蛋白質) GVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:57 -11N6 TCRβ-P2A-α – 蛋白質，其中訊息肽加下劃線 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:58 - CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N6 TCRβ-P2A-α -蛋白質， 其中訊息肽加下劃線 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:59 - TCR BNT Vβ，具有訊息肽 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLADIYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:60 - TCR BNT Vα，具有訊息肽 METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDRQSSGDKLTFGTGTRLAVRP SEQ ID NO:61 - (TCR 220_21 Vα) GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEPIIGGNTPLVFGKGTRLSVIAN SEQ ID NO:62 (TCR 220_21 Vβ) GAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSSEGLAGGPTAGELFFGEGSRLTVL SEQ ID NO:63 (TCR 129_5 Vα) AQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFWYVQSPGQGLQLLLKYFSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVGASGTYKYIFGTGTRLKVLAN SEQ ID NO:64 (TCR 129_5 Vβ) DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLALSYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:65 - [保留] SEQ ID NO:66 -[保留] SEQ ID NO:67 -[保留] SEQ ID NO:68 -[保留] SEQ ID NO: 69 - TCR Cα胺基酸序列，其經工程改造以包括蘇胺酸→半胱胺酸及LVL突變 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:70 -- TRBC1胺基酸序列(UniProt KB P01850) EDLNKVFPPEV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFFPDHV ELSWWVNGKE VHSGVSTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSVSYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDF SEQ ID NO:71 -- TRBC1胺基酸序列(經cys修飾) EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO:72 - TRBC2胺基酸序列(UniProt KB A0A5B9) EDLKNVFPPKV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFYPDHV ELSWWVNGKE VHSGVSTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSESYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDSRG SEQ ID NO:73 - TRBC2胺基酸序列(經cys修飾) EDLKNVFPPKV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFYPDHV ELSWWVNGKE VHSGVCTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSESYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDSRG (SEQ ID NO.: 74)豬鐵士古病毒-1 2A (P2A)自裂解肽，具有N端GSG連接子 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO.: 75)明脈扁刺蛾病毒2A (T2A)自裂解肽 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR (SEQ ID NO.: 76)馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)自裂解肽 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO.: 77)口蹄疫病毒2A (F2A)自裂解肽，具有N端G-S-G連接子 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO.:78) NRAS (Uniprot KB P01111) MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNSKSF ADINLYREQI KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL PTRTVDTKQA HELAKSYGIP FIETSAKTRQ GVEDAFYTLV REIRQYRMKK LNSSDDGTQG CMGLPCVVM (SEQ ID NO.:79) HRAS (Uniprot KB P01112) MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHQYREQI KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL AARTVESRQA QDLARSYGIP YIETSAKTRQ GVEDAFYTLV REIRQHKLRK LNPPDESGPG CMSCKCVLS (SEQ ID NO.:80) KRAS 8-16野生型(G12) VVGAGGVGK (SEQ ID NO.:81) KRAS 7-16野生型(G12) VVVGAGGVGK (SEQ ID NO: 82) T2A自裂解肽，具有N端GSG連接子 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 83)具有訊息肽(經cys修飾之蛋白質)的11N4A TCR β鏈，其中訊息肽加下劃線 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG (SEQ ID NO: 84)編碼具有訊息肽(經cys修飾之蛋白質)之11N4A TCR β鏈的聚核苷酸 ATGGGCAGCAGACTGCTGTGCTGGGTTCTGCTGTGTCTGCTTGGAGCCGGACCTGTGAAAGCTGGCGTGACCCAGACACCTAGATACCTGATCAAGACCAGAGGCCAGCAAGTGACACTGAGCTGTAGCCCCATCAGCGGCCACAGAAGCGTGTCCTGGTATCAGCAGACTCCTGGACAGGGCCTGCAGTTCCTGTTCGAGTACTTCTCCGAGACACAGAGGAACAAGGGCAACTTCCCCGGCAGATTCTCCGGCAGACAGTTCAGCAACTCCCGCAGCGAGATGAACGTGTCCACACTGGAACTGGGAGATAGCGCCCTGTACCTGTGTGCCTCTTCTGTGGGAACCGTGGAACAGTACTTCGGCCCTGGCACAAGACTGACCGTGACCGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCACCTGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGATCTCTCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTATCCCGATCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGTACCGATCCTCAGCCACTGAAAGAGCAGCCCGCTCTGAACGACAGCAGATACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGGTGTCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCTGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTTCTGTCTGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAAGCCACTCTGTACGCCGTGTTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGATTCTAGAGGCG (SEQ ID NO: 85) 11N4A TCR α鏈(經cys修飾之蛋白質)，其中訊息肽加下劃線 MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO: 86)編碼具有訊息肽(經cys修飾)之11N4ATCR α鏈的聚核苷酸 ATGGCTATGCTGCTGGGAGCCTCTGTGCTGATCCTGTGGCTGCAACCCGATTGGGTCAACAGCCAGCAGAAGAACGACGACCAGCAAGTCAAGCAGAACAGCCCCAGCCTGAGCGTGCAAGAGGGCAGAATCAGCATCCTGAACTGCGACTACACCAACTCTATGTTCGACTACTTTCTGTGGTACAAGAAGTACCCCGCCGAGGGACCCACCTTCCTGATCAGCATCAGCAGCATCAAGGACAAGAACGAGGACGGCCGGTTCACCGTGTTTCTGAACAAGAGCGCCAAGCACCTGAGCCTGCACATCGTGCCTTCTCAGCCTGGCGATAGCGCCGTGTACTTTTGTGCTGCCAGCGGCGTGTCAGGCAACACCCCTCTGGTTTTTGGCAAGGGCACACGCCTGTCCGTGATCGCCAACATTCAGAACCCTGATCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGTCCGATTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGTCCTGAGTCCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAATCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTCAGACTGTGGTCCAGCTGA (SEQ ID NO: 87) CD8α，其中訊息肽加下劃線(胺基酸) MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV (SEQ ID NO: 88)編碼CD8α (具有訊息肽)的聚核苷酸 ATGGCATTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCCAGCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACAGAACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAACTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGAGCAATCCTACCAGCGGCTGCAGCTGGCTGTTTCAGCCTAGAGGTGCTGCCGCCTCTCCTACCTTTCTGCTGTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCCGCCGAAGGACTGGACACCCAGAGATTCAGCGGCAAGAGACTGGGCGACACCTTCGTGCTGACCCTGAGCGACTTCAGAAGAGAGAACGAGGGCTACTACTTCTGCAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACAACAACCCCTGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAGGCGGAGAGTGTGCAAGTGCCCTAGACCTGTGGTCAAGAGCGGCGACAAGCCTAGCCTGAGCGCCAGATATGTT (SEQ ID NO: 89) CD8β，其中訊息肽加下劃線 MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYK (SEQ ID NO: 90)編碼具有訊息肽之CD8β的聚核苷酸 ATGAGGCCTAGACTGTGGCTGCTTCTGGCTGCCCAGCTGACAGTGCTGCACGGCAATTCTGTCCTGCAGCAGACCCCTGCCTACATCAAGGTGCAGACCAACAAGATGGTCATGCTGAGCTGCGAGGCCAAGATCAGCCTGTCCAACATGCGGATCTACTGGCTGCGGCAGAGACAGGCCCCTAGCAGCGATTCTCACCACGAGTTTCTGGCCCTGTGGGATAGCGCCAAGGGAACCATTCACGGCGAGGAAGTGGAACAAGAGAAGATCGCCGTGTTCCGGGACGCCAGCAGATTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCCGAGGACAGCGGCATCTATTTCTGCATGATCGTGGGCAGCCCCGAGCTGACATTTGGCAAGGGAACACAGCTGAGCGTGGTGGACTTCCTGCCTACTACAGCCCAGCCTACCAAGAAGTCTACCCTGAAGAAACGCGTGTGCAGACTGCCCAGGCCTGAGACACAAAAGGGCCCTCTGTGCAGCCCTATCACACTGGGATTGCTGGTGGCTGGCGTTCTGGTCCTGCTGGTTTCTCTGGGAGTTGCCATCCACCTGTGCTGCAGACGCAGAAGGGCCAGACTGCGGTTCATGAAGCAGTTCTACAAA SEQ ID NO: 91 - 11N4A α FR1 (IMGT)DQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYT SEQ ID NO: 92 - 11N4A α FR2 (IMGT)FLWYKKYPAEGPTFLIS SEQ ID NO: 93 - 11N4A α FR3 (IMGT)NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFC SEQ ID NO: 94 - 11N4A α FR4 (IMGT)FGKGTRLSVIA SEQ ID NO: 95 - 11N4A α FR3 (IMGT 接合 )NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYF SEQ ID NO: 96 - 11N4A α FR4 (IMGT 接合 )GKGTRLSVIA SEQ ID NO: 97 – 來自 11N4A β FR1 的序列 (IMGT)GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPI SEQ ID NO: 98 - 11N4A β FR2 (IMGT)VSWYQQTPGQGLQFLFE SEQ ID NO: 99 - 11N4A β FR3 (IMGT)RNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLC SEQ ID NO: 100 – 來自 11N4A β FR4 的序列 (IMGT)FGPGTRLTV SEQ ID NO: 101 - 11N4A β FR3 (IMGT 接合 )RNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYL SEQ ID NO: 102 - 11N4A β FR4 的序列 (IMGT 接合 )GPGTRLTV SEQ ID NO: 103 - 11N6 α FR1 (IMGT)QQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYK SEQ ID NO: 104 - 11N6 α FR2 (IMGT)LQWYRQNSGRGLVHLIL SEQ ID NO: 105 - 11N6 α FR3 (IMGT)KHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFC SEQ ID NO: 106 - 11N6 α FR4 (IMGT)FGDGTTLTVKP SEQ ID NO: 107 - 11N6 α FR3 (IMGT 接合 )KHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYF SEQ ID NO: 108 - 11N6 α FR4 (IMGT 接合 )GDGTTLTVKP SEQ ID NO: 109 - 11N6 β FR1 (IMGT)GVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPI SEQ ID NO: 110 - 11N6 β FR2 (IMGT)LYWYQQILGQGPKLLIQ SEQ ID NO: 111 - 11N6 β FR3 (IMGT)VDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLC SEQ ID NO: 112 - 11N6 β FR4 (IMGT)FGPGTRLTVT SEQ ID NO: 113 - 11N6 β FR3 (IMGT 接合 )VDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYL SEQ ID NO: 114 - 11N6 β FR4 (IMGT 接合 )GPGTRLTVT SEQ ID NO: 115 – 包含 11N4A α FR1 的序列 (IMGT)QQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYT SEQ ID NO: 116 - 11N4A β FR4 (IMGT)FGPGTRLTVT SEQ ID NO: 117 - 11N4A β FR4 (IMGT 接合 )GPGTRLTVT SEQ ID NO: 118 - CRNS1 肽VVGAGGVSK SEQ ID NO: 119 – RASE 肽VVGASGVGK SEQ ID NO: 120 - RAB7B 肽IVGAIGVGK SEQ ID NO: 121 - [ 保留 ] SEQ ID NO: 122 - ITA8 肽IVGAFGTGK SEQ ID NO: 123 - MIRO2 肽VVGARGVGK SEQ ID NO: 124 - ARRD4 肽AVGAEGRVK SEQ ID NO: 125 - SMC5 肽IVGANGTGK SEQ ID NO: 126 - MOGS 肽EVGAKGQLK SEQ ID NO: 127 - GKN2 肽NVGAGGCAK SEQ ID NO: 128 - AFDDT 肽QMGAAGSGR SEQ ID NO: 129 - ANKR9 肽PVGAAGSAR SEQ ID NO: 130 - CFTR 肽VAGSTGAGK SEQ ID NO: 131 - DYH2 肽IVGCTGSGK SEQ ID NO: 132 - EP300 肽MNGSIGAGR SEQ ID NO: 133 - FOXA2 肽AAGAAGSGK SEQ ID NO: 134 - HTR5B 肽ASGAVGSAK SEQ ID NO: 135 - LARP1 肽AAGAAGAGR SEQ ID NO: 136 - MED1 肽NVGSTGVAK SEQ ID NO: 137 - MOD5 肽ILGATGTGK SEQ ID NO: 138 - MRP5 肽ICGSVGSGK SEQ ID NO: 139 - NAL12 肽MQGAAGIGK SEQ ID NO: 140 - PCGF6 肽TAGSVGAAK SEQ ID NO: 141 - RAB4B 肽VIGSAGTGK SEQ ID NO: 142 - SCGR4 肽TCGSCGCGY SEQ ID NO: 143 - 3HIDH 肽VSGGVGAAR SEQ ID NO: 144 - AFDDT-2 肽PMGGTGSGR SEQ ID NO: 145 - BOLA3 肽ISGGCGAMY SEQ ID NO: 146 - DYH9 肽VVGGAGTGK SEQ ID NO: 147 - KRA53 肽SCGGCGSGY SEQ ID NO: 148 - SHRM1 肽VNGSVGISR SEQ ID NO: 149 - 丙胺酸掃描肽搜尋字串 ， 9 聚體V-X-G-A-X-G-X-X-K SEQ ID NO: 150 - 丙胺酸掃描肽搜尋字串 ， 10 聚體X-X-V-G-A-V-G-X-X-K SEQ ID NO: 151 - 丙胺酸掃描肽搜尋字串 ， 9 聚體X-X-G-A-X-G-X-X-K SEQ ID NO: 152 - Xscan 肽搜尋字串[ANCQIMPSTV]-[ANCQILMSTV]-G-[CSA]-[ACQHIMTV]-G-[ACISTV]-[AEMG]-[RYK] SEQ ID NO: 153 - 11N4A β FR1 (IMGT)KAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPI SEQ ID NO: 154 - KRAS G12V 專一性結合蛋白多肽序列KAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO: 155 - KRAS G12V 專一性結合蛋白多肽序列KAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 實例 實例1 自健康供給者的T細胞譜系中鑑別出KRAS G12V專一性TCRs
產生來源於HLA-A11陽性健康供給者PBMCs的樹突細胞，照射且用KRAS-G12V 7-16及KRAS-G12V 8-16肽進行脈衝。將此等細胞與自體CD8 +T細胞一起培育8至10天以誘導抗原專一性CD8+ T細胞活化/擴增。此等多株T細胞株接著用經肽脈衝且經照射的自體PBMCs再刺激且擴增8至10天二次，以進一步擴增抗原專一性殖株。對來自15位HLA匹配供給者中之每一者的十種CD8+ T細胞株執行此方法。(Ho WY, Nguyen HN, Wolfl M, Kuball J, Greenberg PD. In vitro methods for generating {CD8}+ {T}-cell clones for immunotherapy from the naïve repertoire. J Immunol Methods. 2006;310(1):40-52. doi:10.1016/j.jim.2005.11.023)。 圖 1A。
為了鑑別出具有強結合的TCRs，T細胞用濃度滴定的同源KRAS G12V肽刺激隔夜且藉由流動式細胞測量術評估CD137上調。藉由流動式細胞測量術細胞分選來分離出表現CD137的細胞且執行TCRβ譜系分析(Adaptive Biotechnologies)。鑑別出CD137+群體中高度富集、對低濃度肽有反應的TCR殖株型，且藉由對類似分選的群體進行10x單一細胞RNAseq分析(10x基因體學)來測定TCRα/β配對。 ( 圖1B)相較於經低濃度肽及高濃度肽處理的全體未分選細胞，對CD137+分選群體中之殖株型富集的代表性分析。 ( 圖1C)以P2A連接的表現卡匣形式組裝且合成來自經鑑別之殖株型的成對TCRα/β序列且經由慢病毒轉導至報導體Jurkat細胞中，該等細胞在 Nur77基因座的控制下表現GFP ( Nur77-GFP-Jurkats)。與經所示濃度遞減之肽脈衝的A11標靶細胞培養隔夜之後，藉由分析GFP表現來評估各種TCR的肽劑量依賴反應。 ( 圖1D)藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線，且使用Graphpad Prism計算EC50值。 實例2 初代CD8 +T細胞中所表現之KRAS-G12V專一性TCRS的功能親合力
初代CD8+ T細胞用KRAS-G12V專一性TCRs轉導，分選純化且擴增。分選純化的T細胞接著與濃度遞減的KRAS-G12V 8-16肽一起培養隔夜且藉由流動式細胞測量術評估CD137表現。藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線，且使用Graphpad Prism計算EC50值。 圖2A 、2B。在此實驗中，將TCR 11N4A與KRAS G12V專一性TCR「220_21」(本文中參見SEQ ID NOs.: 61及62)及美國核准前公開案第US 2021/0340215A1號之具有由SEQ ID NOs.: 54 (Vα)及57 (Vβ)編碼之可變區域的TCR「BNT」(本文中亦參見SEQ ID NOs.: 59及60)進行比較。所有TCRs均由TCRβ-P2A-TCRα表現卡匣中的慢病毒編碼。
利用類似分析對TCR 11N4A與220_21及其他TCRs進行比較，從而量測肽抗原劑量反應以獲知IFN-γ表現。 圖2C。 圖 2D-2F顯示TCR 11N4A的其他功能親合力資料。
TCR 11N4A表現於人類初代CD8+ T細胞中且在功能親合力研究中藉由CD137表面表現分析進一步測試。TCR 11N4A對KRAS G12V 8-169聚體(VVGAVGVGK；SEQ ID NO.: 3)展現強功能親合力，而對KRAS G12V 7-1610聚體(VVVGAVGVGK；SEQ ID NO.: 2)肽展現較弱的功能親合力程度，二者均在肽溶離資料庫(Choi等人, 2021)中鑑別出，其EC50分別為59.5 pM及18.75 nM。相比之下，TCR 11N4A對野生型KRAS 9聚體(VVGAGGVGK；SEQ ID NO: 80)或10聚體(VVVGAGGVGK；SEQ ID NO: 81)肽無反應性，而對侷限於腫瘤的KRASG12V抗原展現專一性 ( 圖 2G)。 實例3 KRAS-G12V專一性TCR轉導的T細胞識別表現KRAS-G12V的腫瘤細胞株
初代CD8+ T細胞用KRAS-G12V專一性TCRs轉導，分選純化且擴增。分選純化的T細胞與表現突變型KRAS-G12V的腫瘤細胞株一起培養隔夜。與1 mg/ml KRAS-G12V 8-16肽一起培養的T細胞作為陽性對照納入。必要時首先轉導腫瘤株系以表現HLA-A11且根據HLA-A11表現進行分選純化。藉由量測回應於TCR訊息傳導的CD137表現來評估T細胞反應 ( 圖3A 及3B)。圖3C顯示跨越多種腫瘤細胞株之內源KRAS G12V呈現使未轉導之T細胞或11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化T細胞活化。藉由量測回應於TCR訊息傳導的CD137表現來評估活化。相較於未轉導之T細胞，11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化T細胞顯示增強的活化。
以下功效及安全研究中使用的11N4A-TCR細胞產物(除指定的情況之外)係利用欲用於患者的方法產生。簡言之，健康供給者PBMCs首先利用磁性珠粒經歷CD4正向選擇。接著經由CD62L正向選擇來純化得自CD4選擇之含有大部分CD8+ T細胞的陰性溶離份流過物。CD62L選擇確保活體內持久性改善之CD8+ T細胞亞群(包括初始、中樞記憶及幹細胞記憶)的下游轉導(Berger等人, 2008；Gattinoni等人, 2011；Wherry及Ahmed, 2004)。匯集的CD4+與CD4- CD62L+細胞以1:1比率調配且用IL-2、IL-21及TransAct (抗CD3/CD28)刺激二天，隨後用11N4A-TCR慢病毒轉導。細胞進一步在IL-2的外源添加下擴增且10天後收集以構成11N4A-TCR「模擬(simulated)」之產物，其定義為類似於臨床製造方法產生、但不用於輸注至人體的細胞。
為了證實11N4A-TCR模擬之產物可對內源性表現且呈現的KRAS G12V肽有反應，測試表現HLA-A*11:01及KRAS G12V抗原的一組腫瘤細胞株，其針對旨在用於1期研究的適應症而衍生( 圖3D，左) 來源於二位不同健康供給者的11N4A-TCR模擬之產物藉由與表現KRAS G12V的所有測試腫瘤細胞株共培養來專一性活化，而來自同一供給者的未轉導T細胞展現最小的活化( 圖3D，右)。重要的是，不表現KRAS G12V突變的二種癌細胞株PANC1及HUCCT1作為11N4A-TCR T細胞活化的陰性對照納入，僅觀測到背景活性 ( 圖 3D，右)。另外，在與所述腫瘤細胞株共培養之後，評估11N4A-TCR效應子細胞介素產生( 圖 3E)。所有腫瘤細胞株在與表現KRAS G12V的細胞株一起培養之後誘導不同但顯著的IFNγ、TNFα及IL-2分泌，而陰性對照腫瘤細胞不誘導11N4A-TCR T細胞分泌細胞介素。除抗原專一性T細胞活化及效應子細胞介素產生之外，11N4A-TCR T細胞對表現KRAS G12V之腫瘤細胞起反應而專一性增殖( 圖 3F)。表現KRAS G12V的所有測試腫瘤細胞株引起11N4A-TCR產物的增殖增強，而陰性對照腫瘤細胞類似於未轉導之T細胞對照，僅誘導背景增殖。
該組測試腫瘤細胞株展現廣泛範圍的KRAS G12V表現，如西方墨點分析所測定( 圖3G，左)。對各種細胞株中之KRAS G12V表現與管家蛋白GAPDH的比較分析揭露跨越該組腫瘤細胞株之KRAS G12V表現的多樣性(圖3G，右)，其可接近於臨床環境下跨越患者群體之所預期KRAS G12V表現的多樣性。如上所示( 圖3D-3F)，11N4A-TCR能夠對表現KRAS G12V的所有腫瘤細胞株均有反應，甚至對展現所測試之細胞株之最低KRAS G12V表現的NCI-H441亦有反應。此等資料表明，作為對患者中所預期之可變KRAS G12V表現的反應，11N4A-TCR具有活化及介導抗腫瘤活性的潛力。 實例4 表現KRAS-G12V專一性TCRS的CD8 +T細胞專一性殺滅表現KRAS-G12V的腫瘤細胞株
將紅色螢光SW480細胞(表現KRAS-G12V的腫瘤細胞株，其經轉導以表現HLA-A11)與如所示經TCR轉導的T細胞共培養且藉由活細胞成像、使用IncuCyte S3顯微鏡及套裝軟體隨時間進行計數。藉由每孔紅色標靶細胞總面積相較於未處理孔的減小來指示CD8 +T細胞的細胞毒性。第72小時添加額外的腫瘤細胞以評估TCR介導經轉導之T細胞在持久性抗原存在下對腫瘤細胞的溶解。利用三種愈來愈嚴格的效應子:標靶細胞比率，在T細胞具限制性時的條件下量測相對的TCR介導性腫瘤溶解。資料顯示於 圖 4C中。來自另一實驗的資料顯示於 圖 4B中。
初始研究評估11N4A-TCR工程化初代CD4+及CD8+ T細胞(不具有CD8 α/β共受體)針對SW527、SW620及CFPAC-1腫瘤細胞株的功效。在即時腫瘤可視化分析中，即使在相同分析內進行重複的腫瘤攻擊之後，11N4A-TCR工程化初代CD8+ T細胞亦顯著消除所有腫瘤細胞株的活體外生長及存活( 圖4D)。隨後使用跨越二位供給者之表現CD8 α/β共受體的11N4A-TCR模擬之產物進行研究，在活體外細胞毒性分析中跨越代表臨床環境中所預期之適應症的一大組KRAS G12V腫瘤細胞株進行測試。11N4A-TCR展現針對所有腫瘤細胞株的穩固細胞毒性活性( 圖4E-4G)。值得注意的是，11N4A-TCR針對NCI-H441展現強細胞毒性活性，NCI-H441在藉由西方墨點分析測試的所有腫瘤細胞株中具有最低的KRAS G12V表現( 圖 3G)。與所述的活化及增殖研究一致( 圖3D-3F)，11N4A-TCR對不表現KRAS G12V突變的二種陰性對照癌細胞株PANC1及HUCCT1不展現細胞毒性活性。 實例5 表徵TCR 11N4A之肽結合模體的突變掃描
為了評估TCR 11N4A之交叉反應性的可能性，執行突變掃描以鑑別對於TCR結合而言關鍵的肽殘基。(圖5A)合成其中同源KRAS-G12V肽之各殘基改變成丙胺酸的肽。同源9聚體肽的位置4 (10聚體肽的位置5)已含有丙胺酸，因此產生在此位置含有甘胺酸或蘇胺酸的肽。將TCR 11N4A轉導之Nur77-GFP-Jurkats與經1 mg/ml各種肽脈衝的HLA-A11+ B-LCL細胞一起培養隔夜，隨後對GFP表現進行流動式細胞測量術分析。在9聚體之位置1、5、7或8及10聚體之相應位置含有取代的肽仍可誘發表現TCR 11N4A之細胞的反應，表明TCR 11N4A可識別在此等位置具有其他胺基酸的肽(圖5A及5B)。(圖5C) 使用ScanProsite (prosite.expasy.org/scanprosite/)、利用搜尋字串：x-V-G-A-x-G-x-x-K (SEQ ID NO.:4)搜尋人類蛋白質體中的相似模體。所得潛在交叉反應性肽顯示於圖5D中，其中自IEDB (NetPanMHC4.1)預測的HLA-A11結合資料用百分位數秩(愈低則愈佳)及評分(愈高則愈佳)顯示。此等資料包括各以多種蛋白質出現的二種肽(RASE及RSLBB；野生型RAS蛋白RASH、RASK及RASN)。 實例6 11N4A對潛在交叉反應性肽之反應性的分析
( 圖6A 、6B)將TCR 11N4A轉導之供給者源CD8 +T細胞與所鑑別之潛在交叉反應性肽中之每一者或同源KRAS-G12V肽(1 mg/ml)一起培養隔夜，且藉由流動式細胞測量術評估誘導活化的CD137表現。除RAB7B衍生之肽的反應位準低(＜20%)之外，未偵測到來自任何肽的反應。 ( 圖6C)為了進一步評估TCR 11N4A針對RAB7B肽的功能親合力，將分選純化的經TCR 11N4A轉導之T細胞與濃度遞減的KRAS-G12V 8-16肽或RAB7B肽一起培養隔夜且藉由流動式細胞測量術評估CD137表現。藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線，且使用Graphpad Prism計算EC50值 ( 圖 6D)。
RAB7B肽的EC50計算值為約35 mg/ml，此為非常高的肽濃度，其使得標靶細胞表面上之載有肽之MHC的密度比典型細胞之表面上所呈現之任何特定肽/HLA-A2複合物的密度大若干個數量級。細胞通常以據報導在每個細胞10至150種肽/MHC複合物(就呈現良好的若干自身肽而言)範圍內的密度呈現一系列不同的經處理之細胞蛋白質(Bossi G, Gerry AB, Paston SJ, Sutton DH, Hassan NJ, Jakobsen BK. Examining the presentation of tumor-associated antigens on peptide-pulsed T2 cells. Oncoimmunology. 2013;2(11):e26840; Liddy N, Bossi G, Adams KJ, Lissina A, Mahon TM, Hassan NJ等人, Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med. 2012;18(6):980-7; Purbhoo MA, Sutton DH, Brewer JE, Mullings RE, Hill ME, Mahon TM等人, Quantifying and imaging NY-ESO-1/LAGE-1-derived epitopes on tumor cells using high affinity T cell receptors. J Immunol. 2006;176(12):7308-16.)。為了具體表徵肽濃度與T2細胞呈現表位之間的關係，Jakobson及同事使用與單分子螢光顯微法耦合的可溶性高親和力TCRs定量經肽脈衝之T2細胞上的經充分表徵之若干自身肽。(Bossi G, Gerry AB, Paston SJ, Sutton DH, Hassan NJ, Jakobsen BK. Examining the presentation of tumor-associated antigens on peptide-pulsed T2 cells. Oncoimmunology. 2013;2(11):e26840)。此分析的結果表明，為了接近於所呈現抗原的生理含量，肽濃度必需在較低的奈莫耳濃度範圍(1至10 nM)內。
相比之下，即使在10 mg/ml (約10 mM)的高劑量下，觀測到經TCR 11N4A轉導之T細胞僅出現低位準反應(約25% T細胞有反應，相比之下，＞80%的T細胞對同源KRAS-G12V肽有反應)。重要的是，在100 nM或更低的肽濃度下，觀測到經TCR 11N4A轉導之T細胞無反應。此等資料支持，經TCR 11N4A轉導之T細胞對RAB7B肽不具有足以識別經天然處理及呈現之表位的親和力。
為了進一步評估TCR交叉反應性的可能性，將表現TCR 11N4A的CD8+ T細胞與全面的一組位置掃描肽(172種肽)一起培養隔夜，該等掃描肽在同源KRAS G12V肽的各位置含有每個可能胺基酸的取代。圖示為對各種肽有反應的表現CD137之T細胞的百分比 ( 圖 6E)，如根據肽位置組織化。
根據此等資料確定潛在交叉反應性肽模體，且藉由使用ScanProsite (prosite.expasy.org/scanprosite/)搜尋人類蛋白質體來鑑別與模體匹配的肽。在此分析中，誘發大於15%之反應的肽視為陽性。利用ScanProsite搜尋而鑑別出的潛在交叉反應性肽顯示於表 ( 圖6F ， 左)中。RAB7B，突變掃描分析中經鑑別具有交叉反應性的唯一肽，亦為驗證此分析類型之效用的xscan分析中鑑別出的唯一肽。合成所鑑別出的其他肽且以100 ng/ml添加至分選純化的初代CD8 +T細胞中，該等T細胞經轉導以表現TCR 11N4A或TCR 11N4A+CD8αβ。培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評估誘導活化的CD137表現。對於其他所鑑別出之肽中的任一者均未偵測到反應性 ( 圖 6F ，右)。
執行進一步研究，且結果支持TCR 11N4A不識別候選的人類自身肽。使用所述丙胺酸及Xscan資料，利用搜尋字串鑑別出人類蛋白質體中的所有潛在交叉反應性自身肽。將丙胺酸掃描的搜尋字串(X-X-G-A-X-G-X-X-K (9聚體) (SEQ ID NO.:151)或X-X-V-G-A-V-G-X-X-K (10聚體) (SEQ ID NO.:150))及Xscan ([ANCQIMPSTV]-[ANCQILMSTV]-G-[CSA]-[ACQHIMTV]-G-[ACISTV]-[AEMG]-[RYK]) (SEQ ID NO.:152)輸入ScanProsite資料庫(prosite.expasy.org/scanprosite/)且使用NetMHCpan 4.1鑑別出經預測可潛在地結合至HLA-A*11:01的自身肽( 表 2；(Andreatta及Nielsen, 2016))。
表2顯示潛在交叉反應性肽的分析結果，該等肽藉由電腦模擬分析所鑑別。將丙胺酸掃描的搜尋字串(V-X-G-A-X-G-X-X-K (9聚體) (SEQ ID NO.:149)或X-X-V-G-A-V-G-X-X-K (10聚體) (SEQ ID NO.:150))及Xscan ([ANCQIMPSTV]-[ANCQILMSTV]-G-[CSA]-[ACQHIMTV]-G-[ACISTV]-[AEMG]-[RYK]) (SEQ ID NO.:152)針對人類蛋白質體輸入ScanProsite資料庫(prosite.expasy.org/scanprosite/)以鑑別出正常組織中所表現的潛在自反應性肽。未鑑別出與10聚體丙胺酸掃描搜尋字串匹配的肽。由NetMHCpan 4.1計算的IEDB評分估算所鑑別出之肽結合至HLA-A*11:01對偶基因的可能性，其中較高的評分表示結合的可能性較大。 表2：
基因名稱 序列 HLA 搜尋 IEDB 評分
依據丙胺酸掃描搜尋
CRNS1 VVGAGGVSK (SEQ ID NO.:118) HLA-A*11:01 0.74512
RASE VVGASGVGK (SEQ ID NO.:119) HLA-A*11:01 0.690829
RAB7B IVGAIGVGK (SEQ ID NO.:120) HLA-A*11:01 0.688497
RASH (與SEQ ID NO.: 80之KRAS肽相同) VVGAGGVGK (SEQ ID NO.:80) HLA-A*11:01 0.638055
ITA8 IVGAFGTGK (SEQ ID NO.:122) HLA-A*11:01 0.561758
MIRO2 VVGARGVGK (SEQ ID NO.:123) HLA-A*11:01 0.480429
ARRD4 AVGAEGRVK (SEQ ID NO.:124) HLA-A*11:01 0.328175
SMC5 IVGANGTGK (SEQ ID NO.:125) HLA-A*11:01 0.308533
MOGS EVGAKGQLK (SEQ ID NO.:126) HLA-A*11:01 0.113675
GKN2 NVGAGGCAK (SEQ ID NO.:127) HLA-A*11:01 0.06972
依據 XScan 搜尋
AFDDT QMGAAGSGR (SEQ ID NO.:128) HLA-A*11:01 0.00474
ANKR9 PVGAAGSAR (SEQ ID NO.:129) HLA-A*11:01 0.002816
CFTR VAGSTGAGK (SEQ ID NO.:130) HLA-A*11:01 0.150817
DYH2 IVGCTGSGK (SEQ ID NO.:131) HLA-A*11:01 0.069626
EP300 MNGSIGAGR (SEQ ID NO.:132) HLA-A*11:01 0.002772
FOXA2 AAGAAGSGK (SEQ ID NO.:133) HLA-A*11:01 0.271597
HTR5B ASGAVGSAK (SEQ ID NO.:134) HLA-A*11:01 0.701693
LARP1 AAGAAGAGR (SEQ ID NO.:135) HLA-A*11:01 0.036351
MED1 NVGSTGVAK (SEQ ID NO.:136) HLA-A*11:01 0.425281
MOD5 ILGATGTGK (SEQ ID NO.:137) HLA-A*11:01 0.116715
MRP5 ICGSVGSGK (SEQ ID NO.:138) HLA-A*11:01 0.0073
NAL12 MQGAAGIGK (SEQ ID NO.:139) HLA-A*11:01 0.248652
PCGF6 TAGSVGAAK (SEQ ID NO.:140) HLA-A*11:01 0.271228
RAB4B VIGSAGTGK (SEQ ID NO.:141) HLA-A*11:01 0.401558
RAB7B IVGAIGVGK (SEQ ID NO.:120) HLA-A*11:01 0.688497
SCGR4 TCGSCGCGY (SEQ ID NO.:142) HLA-A*11:01 0.000111
3HIDH VSGGVGAAR (SEQ ID NO.:143) HLA-A*11:01 0.07473
AFDDT-2 PMGGTGSGR (SEQ ID NO.:144) HLA-A*11:01 0.000336
BOLA3 ISGGCGAMY (SEQ ID NO.:145) HLA-A*11:01 0.005069
DYH9 VVGGAGTGK (SEQ ID NO.:146) HLA-A*11:01 0.496638
KRA53 SCGGCGSGY (SEQ ID NO.:147) HLA-A*11:01 0.000368
SHRM1 VNGSVGISR (SEQ ID NO.:148) HLA-A*11:01 0.010494
KRAS G12V 8-16 (參考) VVGAVGVGK (SEQ ID NO.:3) HLA-A*11:01 0.755168
使用實例13中所述的11N4A-TCR模擬之T細胞產物，使用類似於藥品臨床製造的方法執行其他研究。使用跨越2位供給者的11N4A-TCR模擬之T細胞產物，對藉由丙胺酸掃描模體鑑別出的所有10種自身肽進行再測試。對於任何肽(甚至RAB7B)而言，未偵測到11N4A-TCR出現顯著的T細胞活化( 圖 6G ，左)。另外，測試依據XScan模體鑑別出的所有12種自身肽(包括RAB7B)，且針對任何肽偵測的11N4A-TCR模擬之T細胞產物無顯著的T細胞活化( 圖 6G，右)。 實例7 具有或不具有CD8AB之TCR 11N4A的同種異體反應性篩選顯示對表現共同HLA對偶基因的B-LCLS無同種異體反應性
( 圖7A 、7B)為了確定TCR 11N4A是否對共同的非A11 HLA對偶基因展現同種異體反應性，將分選純化的初代CD8+ T細胞用編碼獨自11N4A TCR的構築體轉導，或用除編碼11N4A TCR α鏈及β鏈之外亦編碼CD8α及CD8β基因的替代構築體轉導，且與表現一組通常發現於美國人口中之不同HLA對偶基因的一組B-LCL細胞株一起培養隔夜。培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評估誘導活化的CD137表現。
亦評估覆蓋美國人口中＞95%之最常見HLA對偶基因的大型類淋巴母細胞細胞株文庫，其中對經工程改造以表現TCR 11N4A的T細胞未偵測到同種異體反應性反應。表現11N4A的T細胞未展現細胞介素非依賴性生長，其中產物細胞數目的快速下降與未轉導之T細胞對照不可區分。由於11N4A-TCR使用患者自體細胞作為T細胞工程的起始材料，因此預期患者T細胞的內源TCR譜系無同種異體反應性反應。另外，使用表現人類群體中所發現之多種共同HLA對偶基因的經EBV轉型之人類B類淋巴母細胞細胞株(B-LCL)文庫(下 表 3)評估表現11N4A及CD8α/β共受體之人類初代T細胞的潛在I類MHC HLA同種異體反應性。由於B-LCLs通常不表現KRAS G12V，因此預期其不會觸發11N4A-TCR識別，即使是HLA-A*11:01陽性B-LCLs。簡言之，健康供給者來源的T細胞用11N4A + CD8α/β共受體轉導且個別地與各B-LCL共培養，隨後利用CD137表面表現來評估T細胞活化。 表3：
LCL 株系 HLA-A HLA-B HLA-C
JWP A*02:01:01 A*33:01:01 B*07:02:01 B*15:01:01 C*03:04:01 C*07:02:01
MS A*11:01:01 A*11:01:01 B*13:01:01 B*15:25:01 C*04:03:01 C*12:02:02
JAS A*01:01:01 A*68:01:01 B*44:02:01 B*55:01:01 C*03:03:01 C*05:01:01
LCL-19 A*02:06:01 A*26:01:01 B*35:01:01 B*38:01:01 C*04:01:01 C*12:03:01
LCL-12 A*02:01:01 A*31:01:02 B*18:01:01 B*40:01:02 C*03:04:01 C*07:01:01
LCL-8 A*02:01:01 A*68:01:01 B*45:01:01 B*58:02:01 C*06:02:01 C*16:01:01
LCL-25 A*23:01:01 A*23:01:01 B*41:01:01 B*51:01:01 C*15:02:01 C*17:01:01
LCL-5 A*24:02:01 .A*02:06:01 B*40:02:01 B*55:02:01 C*01:02:01 C*15:02:01
LCL-24 A*02:02:01 A*29:02:01 B*15:16:01 B*44:03:01 C*14:02:01 C*16:01:01
LCL-7 A*24:02:01 A*31:01:02 B*35:01:01 B*52:01:01 C*04:01:01 C*12:02:02
LCL-2 A*24:02:01 A*24:02:01 B*48:01:01 B*54:01:01 C*01:02:01 C*08:03:01
PAJ A*01:01:01 A*03:01:01 B*08:01:01 B*49:01:01 C*07:01:01 C*07:01:01
X028 A*02:01:01 A*03:01:01 B*07:02:01 B*44:02:01 C*05:01:01 C*07:02:01
LCL-18 A*02:01:01 A*25:01:01 B*08:01:01 B*44:02:01 C*05:01:01 C*07:01:01
LCL-4 A*24:02:01 A*29:01:01 B*07:05:01 B*27:02:01 C*02:02:02 C*15:05:02
LCL-10 A*34:02:01 A*74:01:01 B*08:01:01 B*15:03:01 C*02:10:01 C*07:01:01
LCL-23 A*32:01:01 A*68:02:01 B*08:01:01 B*44:02:01 C*01:02:01 C*07:01:01
LCL-3 A*30:01:01 A*68:02:01 B*42:01:01 B*42:01:01 C*17:01:01 C*17:01:01
LCL-16 A*03:01:01 A*03:01:01 B*27:05:02 B*56:01:01 C*01:02:01 C*02:02:02
LCL-20 A*01:01:01 A*11:01:01 B*50:01:01 B*51:01:01 C*06:06:01 C*15:02:01
LCL-13 A*02:01:01 A*02:05:01 B*15:01:01 B*49:01:01 C*03:03:01 C*07:01:01
LCL-6 A*02:05:01 A*68:02:01 B*14:02:01 B*58:01:01 C*07:18:01 C*08:02:01
LCL-17 A*01:01:01 A*03:01:01 B*08:01:01 B*35:01:01 C*04:01:01 C*07:01:01
LCL-9 A*36:01:01 A*74:01:01 B*53:01:01 B*57:03:01 C*04:01:01 C*07:01:02
X009 A*02:01:01 A*23:01:01 B*27:05:02 B*44:03:01 C*01:02:01 C*04:01:01
LCL-11 A*30:01:01 A*33:01:01 B*53:01:01 B*81:01:01 C*04:01:01 C*08:04:01
DUCAF A*30:02:01:01    B*18:01:01:01    C*05:01:01:01   
KAS116 A24:02:01:01    B*51:01:01:01    C*12:03:01:01   
SAVC A*03:01:01:01    B*07:02:01    C*07:02:01:03   
KAS011 A*01:01:01:01    B*37:01:01    C*06:02:01:01   
WT8 A*03:01:01:01    B*07:02:01    C*07:02:01:03   
VAVY A*01:01:01:01    B*08:01:01:01    C*07:01:01:01   
SA A*24:02:01:01    B*07:02:01    C*07:02:01:03   
MGAR A*26:01:01:01    B*08:01:01:01    C*07:01:01:01   
SCHU A*03:01:01:01    B*07:02:01    C*07:02:01:03   
JBUSH A*32:01:01    B*38:01:01    C*12:03:01:01   
QBL A*26:01:01:01    B*18:01:01:01    C*05:01:01:01   
DEU A*31:01:02:01    B*35:01:01:02    C*04:01:01:01   
為了在1期研究中評估此B-LCL文庫的覆蓋範圍是否充分代表了臨床上相關患者群體的HLA基因多樣性，自BeTheMatch網站(Gragert等人, 2013)提取描述個別人種(非裔美國黑人、亞洲及太平洋島民、白種人、拉丁美洲人、美國原住民)之五個寬泛術語的美國HLA對偶基因頻率。使用此等術語，自美國2020年普查中獲得單人種與多人種中鑑別有反應者的人口統計計數值。將普查中作為多人種鑑別的有反應者數除以鑑別之人種數，且將彼等分率計數添加至各別的單人種總數中。使用此方法計算所報告之美國各人種的分率。根據美國人口中之各人種的分率來調節每種人種的BeTheMatch HLA對偶基因頻率。自每種基因座(HLA-A、HLA-B及HLA-C)的B-LCL文庫中提取一組獨特的HLA對偶基因且將對偶基因頻率加總。根據哈迪-溫伯格模型(Hardy-Weinberg model)將加總的對偶基因頻率換算成基因型頻率，以計算文庫所代表的人口覆蓋率。 表 4中顯示含有至少一種亦存在於各HLA基因座(A、B及C)之B-LCL細胞株文庫內的美國人口百分比。對於HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因而言，＞96.2%的美國人口具有此等對偶基因中的至少一者。表明此等值充分代表了具有臨床相關性之美國人口的遺傳多樣性。 表4：在各HLA基因座含有B-LCL細胞株中所含之對偶基因中之至少一者的美國人口百分比
基因座 B-LCL 文庫中的美國人口覆蓋率
HLA-A 99.6%
HLA-B 96.2%
HLA-C 99.7%
實例8 表現TCR 11N4A及CD8共受體之CD4+ T細胞的專一性殺滅活性
( 圖8)CD4+及CD8+ T細胞經轉導以表現TCR 11N4A及CD8αβ共受體。利用IncuCyte分析來評估工程化T細胞針對mKRAS:HLA-A11+腫瘤細胞的殺滅活性。 實例9 初代11N4A TCR及CD8ΑΒ共受體工程化T細胞針對各種腫瘤細胞株的細胞毒性
( 圖11A 、11B 、11C 、11D)指定HLA-A11+ (表現KRAS G12V之腫瘤細胞株)獨自(僅腫瘤細胞)在即時腫瘤可視化分析中、在未轉導之初代T細胞(UTD)存在下或在經TCR 11N4A及CD8αβ共受體(11N4A TCR + CD8αβ)轉導之初代T細胞存在下的生長動力學。將經Incucyte Nuclight Rapid Red標記的腫瘤細胞(SW480、SW527及SW620腫瘤細胞)或表現綠色螢光蛋白的腫瘤細胞(CFPAC1腫瘤細胞)獨自或與經TCR轉導之T細胞或未轉導之T細胞一起以指定的效應子/標靶比率培養長達192小時，且量測總紅色目標面積(對於SW480、SW527及SW620腫瘤細胞)或綠色目標面積(對於CFPAC腫瘤細胞)作為整個研究期間之腫瘤細胞生長及生存力的量度，正如所指示。效應子:標靶比率在此實驗中係嚴格的，例如，效應子:標靶比率就SW527腫瘤細胞而言為0.5:1且就CFPAC、SW480及SW620而言分別為2:1。在指定的時間點添加額外的腫瘤細胞以評估工程化T細胞在多次腫瘤攻擊之後繼續反應的能力。結果表明，即使在多次腫瘤攻擊之後，工程化T細胞亦展現穩固的癌症殺滅且因此不容易發生T細胞耗竭。 實例10 11N4A TCR及CD8ΑΒ共受體工程化T細胞的活體內抗腫瘤功效
( 圖12A 、12B 、12C)經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導的初代CD4+及CD8+ T細胞在SW527、SW620及CFPAC腫瘤攻擊模型中誘導穩固的活體內抗腫瘤活性。6至8週齡NSG免疫功能不全小鼠分別皮下接種腫瘤細胞株：SW527 (來源於乳癌)、CFPAC (來源於胰臟癌)及SW620 (來源於大腸癌)。在腫瘤接種後的第7天(SW527)、第10天(CFPAC)及第9天(SW620)，將小鼠隨機分組且每組五隻小鼠IV分別給予未轉導之初代T細胞對照及經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導的初代T細胞。具體而言，接種SW527腫瘤細胞的小鼠組投予3x10 6個經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導的T細胞；接種CFPAC1腫瘤細胞的小鼠組投予1x10 7個經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導的T細胞；且接種SW620腫瘤細胞的小鼠組投予3x10 6個經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導的T細胞。藉由卡尺量測來追蹤腫瘤動力學。結果表明，TCR 11N4A及CD8αβ共受體工程化T細胞誘導來源於不同癌症類型之多個活體內腫瘤模型出現穩固的抗腫瘤活性。 實例11 11N4A TCR及CD8ΑΒ共受體工程化CD4+及CD8+ T細胞之活體外及活體內抗腫瘤功效
( 圖13A)追蹤表現HLA-A11+ KRAS G12V之CFPAC-1腫瘤細胞株在以下細胞存在下、在2:1效應子/標靶比率下的188小時生長動力學：11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞(顯示為「CD4 +TCR」)、11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞(顯示為「CD8 +TCR」)，或1:1比率之11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞與CD8+ T細胞(顯示為「CD4 +TCR + CD8 +TCR」)。CFPAC1腫瘤細胞表現綠色螢光蛋白，從而能夠藉由Incucyte Zoom使188小時的腫瘤生長可視化。在指定的時間點添加額外的腫瘤細胞以評估11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化T細胞在多次腫瘤攻擊之後繼續反應的能力。結果表明，含有CD4+與CD8+ T細胞亞群的11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化群組展現最高的腫瘤控制。不受理論束縛，此表明CD8+與CD4+ T細胞之間存在協同的反應，其中CD4+ T細胞可能表現11N4A與CD8αβ共受體以作為對KRAS G12V抗原的反應且觸發輔助活性以支持CD8+ T細胞殺滅。
( 圖13B)6至8週齡NSG免疫功能不全小鼠腹膜內接種1.25x10^5個CFPAC1-Luc腫瘤細胞，該等腫瘤細胞表現螢光素酶用於腫瘤生長的活體內偵測。小鼠隨機分組且在第10天(7x10^6個T細胞)及第21天(8x10^6個T細胞)用模擬物治療或腹膜內用以下治療(N=5)：11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞(顯示為「CD4 +TCR」)、11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞(顯示為「CD8 +TCR」)，或1:1比率的11N4A TCR及CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞及CD8+ T細胞(顯示為「CD4 +TCR + CD8 +TCR」)。藉由腫瘤細胞冷光之全身IVIS成像來追蹤腫瘤動力學。結果表明含有CD4+與CD8+ T細胞亞群的群組展現最高的腫瘤控制，且不受理論束縛，表明表現11N4A與CD8αβ共受體的CD4+ T細胞對KRAS G12V抗原有反應且觸發輔助活性以支持活體內CD8+ T細胞殺滅。
為了測試CD8α/β共受體與TCR 11N4A在工程化T細胞中的共表現是否會引起藥理學活性改善，將來自健康供給者的CD4+及CD8+ T細胞個別地用慢病毒構築體轉導，該等構築體含有TCR 11N4A或TCR 11N4A與CD8α/β共受體的組合。對於各種構築體而言，測試單獨CD4+ T細胞、單獨CD8+ T細胞、或1:1比率之CD4+:CD8+ T細胞在效應子/標靶比率低及重複腫瘤再攻擊的條件下針對KRAS G12V陽性卵巢癌細胞株OVCAR5的細胞毒性活性。儘管含有TCR 11N4A的個別或組合T細胞亞群僅展現較弱的細胞毒性活性( 圖13C)，但含有TCR 11N4A與CD8α/β共受體組合的所有群組之殺滅活性均得到顯著改善( 圖13D)。值得注意的是，表現CD8α/β共受體及TCR 11N4A的單獨CD4+ T細胞群組展現顯著的抗腫瘤活性，對於CD4+ T細胞而言，此為不尋常的。藉由添加CD8α/β共受體亦觀測到單獨CD8+ T細胞群組的抗腫瘤活性改善，且此改善可歸因於CD8α/β共受體的較高表現，從而增強對KRAS G12V標靶的結合親和力。重要的是，CD8+與CD4+ T細胞組合的群組展現最穩固的抗腫瘤活性且支持如下假設：TCR 11N4A + CD8α/β共受體T細胞(1:1：CD4+/CD8+)產物引起的協同CD4+/CD8+ T細胞反應能夠產生CD4+ T細胞輔助活性，該輔助活性在惡劣的腫瘤微環境中可維持抗腫瘤反應( 圖13D)。針對不表現KRAS G12V標靶抗原的胰臟細胞株PANC1測試表現TCR 11N4A與CD8α/β共受體組合的相同T細胞亞群，該等T細胞亞群不展現任何殺滅活性( 圖13E)，證明TCR 11N4A介導脫靶效應的可能性低，即使在添加CD8α/β共受體之後亦如此。 實例12 TCR 11N4A T細胞不展現細胞介素非依賴性生長
可使用T細胞工程改造用的第三代自身不活化慢病毒載體遞送TCR 11N4A，該載體為臨床研究中展現廣泛經驗及安全的平台(Milone及O'Doherty, 2018)。此等先進慢病毒載體優先插入內含子中，而非優先插入活性基因的啟動子中。另外，進行細胞介素非依賴性生長研究，以評估慢病毒插入TCR 11N4A所致之T細胞轉型的風險，該風險可潛在地導致骨髓增生病症( 圖 17)。結果顯示，類似於未轉導之(UTD)對照，跨越二位供給者的11N4A-TCR模擬之T細胞產物之細胞數目在缺乏細胞介素之情況下隨時間下降。D8至D35，任一種測試產物的活細胞計數均偵測不到。此等資料表明，TCR 11N4A轉型事件的低可能性可引起細胞產物的異常生長。
圖14亦支持經TCR 11N4A及CD8αβ共受體轉導之T細胞的安全性。移除外源細胞介素的支持之後，類似於未轉導之野生型T細胞，經TCR 11N4A + CD8αβ共受體轉導的T細胞在活體外不顯示細胞介素非依賴性生長。如細胞介素非依賴性生長分析所評估，具有TCR 11N4A及CD8αβ共受體的初代T細胞不顯示致瘤轉型的可能性，進一步支持TCR 11N4A的安全性。 實例13 來自RAB7B之潛在交叉反應性肽的其他特徵
為了充分評估11N4A-TCR對RAB7B的潛在交叉反應性，使用來源於二位供給者的模擬之T細胞產物進行其他研究。測試KRAS G12V及RAB7B之其他肽劑量滴定研究，以評估11N4A-TCR模擬之T細胞產物的反應性。模擬之T細胞產物與上述初始RAB7B劑量滴定研究不同之處在於，製造時使用包括CD8α/β共受體的最終構築體設計。在二位供給者中，在RAB7B存在下僅偵測到背景T細胞活化( 圖 15)，此與 圖 11一致。11N4A-TCR模擬之T細胞產物對RAB7B缺乏反應性，即使在高濃度的肽存在下亦缺乏反應性，可反映出較高親合力的CD8 +T細胞被較低親合力的CD4 +T細胞包涵體稀釋，但對於11N4A-TCR模擬之T細胞產物而言代表了一種臨床級製造方法。進行其他研究以進一步評估TCR 11N4A對天然處理及呈現之RAB7B的潛在交叉反應性。轉導HeLa或HEK293細胞以過度表現全長RAB7B及HLA-A*11:01。由於RAB7B可能被不同的組織依賴性蛋白酶體亞單元處理，因此測試表現標準蛋白酶體的HEK293細胞，該標準蛋白酶體具有或不具有外源表現的免疫蛋白酶體亞單元(Lahman等人, 2022)。將個別CD4 +或CD8 +11N4A-TCR或未轉導之T細胞產物與HeLa或表現不同蛋白酶體亞單元的HEK293細胞共培養一段時間且評估CD137 T細胞活化。對於表現RAB7B之測試細胞株中之任一者或PANC1陰性對照而言，未偵測到T細胞活化( 圖 16)。陽性對照CFPAC-1 KRAS G12V陽性腫瘤細胞株能夠活化CD4 +或CD8 +11N4A-TCR T細胞，如先前所述。
總之，11N4A對RAB7B的交叉反應性僅在使用高濃度的RAB7B肽時及在不完全代表11N4A-TCR產物的工程化T細胞產物中偵測到。使用11N4A-TCR模擬之T細胞產物進行的其他研究藉由肽劑量滴定或根據HEK293或HeLa細胞中過度表現、內源性處理及呈現之RAB7B抗原未偵測到RAB7B交叉反應性。對潛在RAB7B脫靶抗原之此全面評估表明，根據生理學表現，TCR 11N4A與此標靶發生交叉反應的可能性低。
上述各種實施例可加以組合以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或申請案資料表單中所列的所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物，包括2022年5月13日提申的美國臨時專利申請案第63/342,025號、2022年10月21日提申的美國臨時專利申請案第63/380,551號及2023年3月6日提申的美國臨時專利申請案第63/488,758號，均以全文引用的方式併入本文中。必要時，可以潤飾實施例之態樣以採用多個專利、申請案及公開案之構思，從而提供又另外的實施例。
可根據以上詳細說明來對實施例進行此等及其他變更。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限於說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能實施例以及此類申請專利範圍有權主張的等效物之完整範疇。因此，申請專利範圍不受本揭露內容限制。
無
圖1A 至1E係關於鑑別來自健康人類供給者之T細胞譜系的KRAS G12V專一性T細胞受體(TCR)。 ( 圖1A)(左圖)示意性顯示自供給者樣本中鑑別出侷限於HLA-A11之突變型KRAS (mKRAS)專一性T細胞株的方法及(右圖)表現mKRAS專一性TCR之CD8+ T細胞在缺乏(左)或存在(右) mKRAS G12V肽之情況下的TNFα產生。 ( 圖1B)(上圖)用於分選mKRAS反應性CD8+ T細胞及定序以及(下圖)對異源性表現mKRAS專一性TCR之CD8+ T細胞進行工程改造的方法示意圖。分離出五十六種mKRAS專一性TCR (G12V專一性或G12D專一性)，且執行敏感性及細胞毒性分析。 ( 圖1C)T細胞殖株在存在及缺乏KRAS G12V突變型肽之情況下的富集倍數。 ( 圖1D)經TCR轉導之T細胞在活體外、在 Nur77基因座控制下、在不同濃度之KRAS G12V突變型肽存在下的活化，如根據表現GFP之T細胞的百分比所評估。T細胞經轉導以表現TCR，如圖例所示。 ( 圖1E)Log EC50 KRAS G12V 9聚體肽值(表示經TCR轉導之T細胞為了產生其 Nur77表現之半數最大反應而必需的KRAS G12V肽濃度)。
圖2A 至2C顯示TCR 11NA4 (參見表1)之功能親合力與TCR 220_21 (SEQ ID NOs.: 61 (Vα)及62 (Vβ)中所示的V區域胺基酸序列)及TCR「BNT」(SEQ ID NO.: 60中所示的Vα區域胺基酸序列(含有訊息肽)；SEQ ID NO.: 59中所示的Vβ區域胺基酸序列(含有訊息肽))之功能親合力的比較情況。 ( 圖2A)在指定濃度之KRAS G12V肽存在下，表現CD137的經TCR轉導之初代CD8+ T細胞之百分比； ( 圖2B)TCR針對KRAS G12V肽的log EC50； ( 圖2C)在指定濃度之KRAS G12V肽存在下，表現IFN-γ的經TCR轉導之初代CD8+ T細胞的百分比。
圖2D 至2F顯示TCR 11N4A的功能親合力(根據宿主T細胞的CD137表現加以評估)。 圖 2D展現經TCR 11N4A轉導的T細胞識別KRAS G12V 9聚體及10聚體肽； 圖 2E顯示TCR針對KRAS G12V9聚體(左)及10聚體(右)肽的log EC50；數值請參見圖2D中的曲線且顯示TCR 11N4A具有強功能親合力(低皮莫耳濃度EC50)；且 圖 2F顯示TCR 11N4A不識別KRAS G12G野生型肽。在圖2E中，圖上的y軸數值(由下至上)為：-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5。在圖2F中，圖上的y軸數值(由下至上)為：0、20、40、60、80、100；x軸文字(自左至右)：無肽；G12V 7-1810聚體；G12V 8-189聚體；G12G 7-18WT；G12G 8-18WT。
圖2G顯示表現TCR 11N4A之經轉導T細胞被活化以作為對突變型KRAS G12V肽的專一性反應，但對野生型KRAS G12G 9聚體或10聚體肽則無反應。使分選純化之表現TCR 11N4A的供給者T細胞群暴露於1 µg/mL的突變型KRAS G12V 9聚體、野生型KRAS G12G 9聚體或10聚體或無肽對照16小時，且根據CD137 (4-1BB)表現評估T細胞活化。
圖3A 至3G顯示表現HLA-A11+ KRAS G12V之腫瘤細胞株被TCR轉導之T細胞識別(根據表現CD137之經TCR轉導之T細胞的百分比評估)。「UT」=未轉導之陰性對照。 圖 3C顯示跨越多種腫瘤細胞株之內源KRAS G12V呈現使未轉導之T細胞或11N4A-TCR與CD8αβ共受體工程化T細胞活化。
在圖3D至3F中，11N4A-TCR T細胞顯示為「FH-KRAS-TCR」。 圖 3D顯示跨越一組不同腫瘤細胞株之經內源性處理及呈現之KRAS G12V抗原使11N4A-TCR細胞活化。(左圖)此研究中所用之腫瘤細胞株的描述。(右圖)表現HLA-A*11:01及KRAS G12V之指定腫瘤細胞株與來自二名健康供給者(D1及D2)之未轉導或11N4A-TCR T細胞以1:1的效應子:標靶比率培養20小時。藉由流動式細胞測量術CD137表面染色來量測T細胞活化。 圖 3E顯示11N4A-TCR細胞分泌效應細胞介素以作為對跨越一組不同腫瘤細胞株之經內源性處理及呈現之KRAS G12V抗原的反應。將表現HLA-A*11:01及KRAS G12V的指定腫瘤細胞株與來自二名健康供給者(D1及D2)的未轉導或11N4A-TCR T細胞一起培養20小時。自圖3D所示之共培養活化分析中收集上清液且藉由ELISA分析IFNγ、TNFα及IL-2細胞介素分泌。IU = 基於IFNγ重組蛋白標準曲線計算的國際單位。 圖 3F顯示11N4A-TCR T細胞增殖以作為對跨越一組不同腫瘤細胞株之經內源性處理及呈現之KRAS G12V抗原的反應。表現HLA-A*11:01及KRAS G12V之指定腫瘤細胞株與來自二名健康供給者(D1及D2)之未轉導或11N4A-TCR T細胞以1:1的效應子:標靶比率培養6天。藉由流動式細胞測量術淋巴球計數來量測T細胞增殖。T細胞計數以淋巴球計數/µL作圖。 圖 3G顯示所測試的一組不同腫瘤細胞株展現一系列的KRAS G12V抗原表現。(左圖)指定腫瘤細胞株的西方墨點分析。自腫瘤細胞製備細胞溶解物，相對於細胞數目標準化。使用KRAS G12V專一性抗體(MA5-42375，Invitrogen)，且GAPDH專一性抗體用作內參考物(AB9483，Abcam)。(右圖)左側為西方墨點資料的密度測定分析，其對所測試之全部腫瘤細胞株的KRAS G12V表現/GAPDH表現比率進行定量。
圖4A 至4G係關於表現KRAS G12V專一性TCR的CD8+ T細胞在Incuyte殺滅分析中專一性殺滅表現HLA-A11+ KRAS G12V的腫瘤細胞株。在此分析中，紅色目標面積指示存在腫瘤細胞。 ( 圖4A)示意性繪示缺乏mKRAS專一性T細胞之情況下的mKRAS腫瘤細胞生長。 ( 圖4B)IncuCyte®殺滅分析中的mKRAS+/HLA-A11+腫瘤細胞生長曲線。測試條件為單獨的腫瘤細胞、腫瘤細胞 + 經轉導以表現TCR 11N4A的T細胞，及經轉導以表現比較物TCR 220_21的腫瘤細胞。y軸上的紅色目標面積顯示腫瘤細胞生長。第72小時添加額外的腫瘤細胞。 ( 圖4C)得自另一殺滅分析實驗的資料。T細胞與SW480腫瘤細胞株係以指定的效應子:標靶比率存在。 ( 圖4D)經11N4A轉導之初代CD4+及CD8+ T細胞對跨越多種腫瘤細胞攻擊的SW527、SW620及CFPAC-1腫瘤細胞株具有細胞毒性。在即時腫瘤可視化分析中，在11N4A轉導(各圖中的下方曲線)或未轉導(各圖中的上方曲線)之初代T細胞存在下，指定的表現HLA-A*11:01+、KRAS G12V之腫瘤細胞株的生長動力學。表現紅色螢光蛋白(SW527及SW620腫瘤細胞)或綠色螢光蛋白(CFPAC-1腫瘤細胞)的腫瘤細胞與TCR轉導或未轉導之T細胞以10:1效應子/標靶比率培養大約145小時，報告腫瘤匯合作為整個研究期間之腫瘤細胞生長/生存力的量度，正如所指示。在大約第50及90小時添加額外的腫瘤細胞。 ( 圖4E) 至( 圖4G) ：11N4A-TCR細胞對一組不同腫瘤細胞株具有細胞毒性。在即時腫瘤可視化分析中，與來自二名健康供給者(D1及D2)之未轉導或11N4A-TCR T細胞一起培養的各種指定之表現HLA-A*11:01+、KRAS G12V之腫瘤細胞株的生長動力學。表現紅色螢光蛋白的腫瘤細胞獨自培養或與11N4A-TCR T細胞以10:1效應子:標靶比率培養96小時。報告根據總紅色目標面積所量測的腫瘤細胞匯合度(標記為腫瘤細胞匯合度)作為整個研究期間之腫瘤細胞生長/生存力的量度，正如所指示。在(E)至(G)中，11N4A-TCR T細胞顯示為「FH-KRAS-TCR」。
圖5A 至5D係關於使用KRAS G12 9聚體及10聚體肽進行的誘變掃描實驗，以表徵TCR 11N4A之肽結合模體。( 圖5A)在G12V肽(顯示為「G12V WT」)或指定位置之胺基酸經丙胺酸、甘胺酸或蘇胺酸置換之G12V肽變異體存在下，表現 Nur77-GFP之經TCR轉導之T細胞的百分比，如所指示。上圖：KRAS G12 9聚體肽之突變掃描結果。下圖：KRAS G12 10聚體肽之突變掃描結果。 ( 圖5B)在指定的9聚體肽存在下，表現活化標記物 Nur77(連接至報導基因)之經11N4A轉導之CD8+ T細胞的百分比。 ( 圖5C)用於鑑別含有與TCR 11N4A結合模體相似之序列之人類蛋白質體序列的工作流程示意圖及工作流程結果。 ( 圖5D)利用圖5C中所示之工作流程搜尋人類蛋白質體的結果。對來自人類蛋白質體的肽進行評分，以預測對HLA-A11的結合。
圖6A 至6G顯示TCR 11N4A在人體中的自體反應性風險低。 ( 圖6A 、圖6B)經11N4A轉導之T細胞對一組潛在交叉反應性肽的反應性(參見圖5B)。 ( 圖6C)肽劑量-反應曲線及 ( 圖6D)經11N4A轉導之T細胞針對RAB7B肽(相對於同源KRAS G12V肽)的負log EC50計算值。 ( 圖6E)作為對與全面的一組位置掃描肽(172種肽)一起培養隔夜的反應，表現CD137的經11N4A轉導之CD8+ T細胞之百分比，該等位置掃描肽在同源KRAS G12V肽之各位置含有每個可能胺基酸的取代。在此分析中，誘發大於15%之反應的肽視為陽性。( 圖6F)(左圖)根據由( 圖6E)之資料鑑別的潛在交叉反應性模體，經由搜尋ScanProsite鑑別出的潛在交叉反應性肽。(右圖)分選純化之初代CD8+ T細胞的CD137表現(藉由流動式細胞測量術測定)，該等T細胞經轉導以表現TCR 11N4A或TCR 11N4A + CD8αβ且與100 ng/ml潛在交叉反應性肽一起培養隔夜。 ( 圖6G)TCR 11N4A在活體外不引起交叉反應性肽反應。使用經11N4A-TCR肽刺激之T細胞進行T細胞活化分析，該等T細胞由二名健康供給者的PBMC產生。將TCR 11N4A-T細胞與1 µg/ml的各種指定肽一起培育18小時，隨後對CD137表現進行流動式細胞測量術分析以作為T細胞活化的量度。(左圖)利用丙胺酸掃描模體鑑別的人類自身肽及(右圖)利用XScan掃描模體鑑別的人類自身肽(參見表2)。
圖7A 及7B係關於為了評估TCR 11N4A之潛在同種異體反應性而進行的篩選。 ( 圖7A)將表現不同HLA對偶基因的B類淋巴母細胞株(B-LCL)與經11N4A轉導之CD8+ T細胞一起培育且評估T細胞的反應性，如根據IFN-γ或CD137的表現所測定。 ( 圖7B)同種異體反應性篩選結果：在CD8αβ存在(上圖)或不存在(下圖)下，針對表現共同HLA對偶基因之B-LCLs的經CD137+ 11N4A轉導之T細胞之百分比。
圖8顯示經工程改造以表現TCR 11N4A與CD8αβ共受體之CD8+及CD4+ T細胞針對mKRAS:HLA-A11+腫瘤細胞的殺滅活性。
圖9A 至9J顯示與TCR 11N4A有關的核苷酸序列( 圖9A 至9G)及胺基酸序列( 圖9H 至9J)以及編碼或包含其的表現構築體。
圖10A 至10H顯示與TCR 11N6有關的核苷酸序列( 圖10A 至10E)及胺基酸序列( 圖10F 至10H)以及編碼或包含其的表現構築體。
應理解，圖9A至10H中所示的序列並非皆含有或註釋圖例中指示的每個序列特徵。CDR3序列係根據IMGT接合定義顯示。
圖11A 至11D顯示在重複的腫瘤攻擊分析中，初代11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化T細胞針對多種腫瘤細胞株的細胞毒性，該等腫瘤細胞株包括SW527 ( 圖11A)、CFPAC ( 圖11B)、SW480 ( 圖11C)及SW620 ( 圖11D)。T細胞(「E」)與標靶細胞(「T」)處於指定的E:T比率。
圖12A 至12C顯示在SW527 ( 圖12A)、CFPAC ( 圖12B)及SW620 ( 圖12C)腫瘤攻擊模型中，經工程改造以表現11N4A TCR與CD8αβ共受體之初代CD4+及CD8+ T細胞的活體內穩固抗腫瘤活性。
圖13A 至13E繪示相較於11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞或11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞的單一療法，11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞與11N4A TCR與CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞之組合療法的活體外及活體內抗腫瘤功效改善。 ( 圖13A)量測表現HLA-A11+ KRAS G12V之CFPAC-1腫瘤細胞株在11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞、11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞、或11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD4+及CD8+ T存在下的生長動力學； ( 圖13B)在未轉導之CD4+及CD8+T細胞、11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD4+ T細胞、11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD8+ T細胞、或11N4A TCR-CD8αβ共受體工程化CD4+及CD8+T細胞分別腹膜內治療之後，量測NSG免疫功能不全小鼠中所接種之CFPAC-Luc腫瘤細胞的腫瘤動力學。 ( 圖13C) 至( 圖13E) ：CD8αβ共受體(其亦可書寫為「CD8α/β」共受體)與I類TCR的組合使TCR工程化T細胞的抗腫瘤反應改善。在單獨的初代CD4 +T細胞、單獨的CD8 +T細胞、或經TCR 11N4A ( 圖13C)或TCR 11N4A + CD8αβ共受體( 圖13D)轉導之組合CD4 +/CD8 +T細胞(1:1比率)存在下，表現HLA-A*11:01 +、KRAS G12V之腫瘤細胞株(OVCAR-5)的生長動力學。不表現KRAS G12V的陰性對照腫瘤細胞株(PANC1)用於( 圖13E)。表現紅色螢光蛋白的腫瘤細胞獨自培養或與經TCR轉導之T細胞以1:1效應子/標靶比率培養172小時，且報告根據NucLight Red總紅色目標面積量測的腫瘤細胞匯合度作為整個研究期間之腫瘤細胞生長/生存力的量度，正如所指示。第72小時及第108小時添加額外的腫瘤細胞。
圖14顯示經TCR 11N4A與CD8αβ共受體轉導之T細胞在活體外不顯示細胞介素非依賴性生長。
圖15顯示11N4A-TCR模擬之T細胞產物對RAB7B肽無反應。為了評估自二名供給者產生之11N4A-TCR模擬之T細胞產物的反應性，跨越10至0.00001 mg/mL測試KRAS G12V索引肽(陽性對照)及RAB7B的肽劑量。歷時16小時將9聚體及10聚體KRAS G12V及RAB7B肽以滴定劑量外源添加至11N4A-TCR T細胞中，隨後藉由流動式細胞測量術分析T細胞的CD137表現。
圖16顯示11N4A-TCR模擬之T細胞產物對過度表現、內源性處理及呈現之RAB7B無反應。為了表現HLA-A11及RAB7B全長蛋白質，對表現標準物(SP)或免疫蛋白質體(IP)亞單元的HEK293細胞或希拉細胞(HeLa cells)進行工程改造。CFPAC-1 (KRAS G12V +)及PANC1 (KRAS G12V -)分別用作陽性及陰性對照。將分選的CD4 +或CD8 +11N4A-TCR或未轉導的(UTD) T細胞產物與各細胞株共培養16小時，隨後藉由流動式細胞測量術分析T細胞的CD137表現。在此圖中，11N4A-TCR T細胞顯示為「FH-KRAS-TCR」。
圖17顯示11N4A-TCR模擬之產物在缺乏細胞介素的情況下不展現細胞生長。11N4A-TCR T細胞產物富含KRAS-G12V A11-四聚體陽性T細胞且在二名供給者中用含有抗CD3及抗CD28珠粒的X VIVO 15 + 5%血清置換培養基 + 100 U/mL IL-2擴增10天。來自同一供給者之未轉導初代T細胞(UTD)類似地並行擴增10天。第10天洗滌細胞且再懸浮於X VIVO 15 + 缺乏細胞介素的5%血清培養基中且量測35天的細胞生長動力學。在圖17中，11N4A-TCR T細胞顯示為「FH-KRAS-TCR」。
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Claims (75)

  1. 一種結合蛋白，其包含： (a)  一T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)區域，其包含SEQ ID NOs.:16、17、42及43中之任一者中所示的互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；及/或 (b)  一TCR β鏈可變(Vβ)區域，其包含SEQ ID NOs.:26、27、52及53中之任一者中所示的CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體， 其中該結合蛋白能夠結合至一肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO.:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO.:3)或由該胺基酸序列組成且其中該HLA包含HLA-A*11。
  2. 如請求項1之結合蛋白，其中該HLA包含HLA-A*11:01。
  3. 如請求項1或2之結合蛋白，其中該Vα區域及/或該Vβ區域為人類的、人源化的或嵌合的，且較佳為人類的。
  4. 如請求項1至3中任一項之結合蛋白，其包含(i) SEQ ID NOs.: 17及27中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii) SEQ ID NOs.: 16及26中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii) SEQ ID NOs.: 53及43中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(iv) SEQ ID NOs.: 52及42中分別所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或具有一個、二個或三個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其：(i)在該Vα區域中包含SEQ ID NO.:14或40中所示之CDR1α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(ii)在該Vα區域中包含SEQ ID NO.:15或41中所示之CDR2α胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iii)在該Vβ區域中包含SEQ ID NO.:24或50中所示之CDR1β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；(iv)在該Vβ區域中包含SEQ ID NO.:25或51中所示之CDR2β胺基酸序列，或具有一個或二個胺基酸取代、任擇地守恆胺基酸取代的其變異體；或(v) (i)至(iv)之任何組合。
  6. 如請求項1至5中任一項之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.:14、15、16或17、24、25及26或27中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
  7. 如請求項1至5中任一項之結合蛋白，其包含SEQ ID NOs.: 40、41、42或43、50、51及52或53中分別所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合蛋白，其中： (i)該Vα區域包含與SEQ ID NO.:13或39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且/或 (ii)該Vβ區域包含與SEQ ID NO.:23或49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  9. 如請求項1至8中任一項之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.:13中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.:23中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  10. 如請求項1至8中任一項之結合蛋白，其中該Vα區域包含與SEQ ID NO.:39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且其中該Vβ區域包含與SEQ ID NO.:49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  11. 如請求項1至10中任一項之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.:13中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該Vβ區域包含SEQ ID NO.:23中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  12. 如請求項1至10中任一項之結合蛋白，其中該Vα區域包含SEQ ID NO.:39中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且該Vβ區域包含SEQ ID NO.:49中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  13. 如請求項1至12中任一項之結合蛋白，其進一步包含一TCR α鏈恆定區域(Cα)及/或一TCR β鏈恆定區域(Cβ)。
  14. 如請求項13之結合蛋白，其中該Cα包含與SEQ ID NOs.:18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.:18、19、44、45及69中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  15. 如請求項13或14之結合蛋白，其中該Cβ包含與SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含SEQ ID NOs.: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  16. 如請求項13至15中任一項之結合蛋白，其中該Cα及該Cβ包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i)   SEQ ID NOs.:18及28； (ii)  SEQ ID NOs.:19及29； (iii) SEQ ID NOs.:44及54；或 (iv) SEQ ID NOs.:45及55。
  17. 如請求項13至16中任一項之結合蛋白，其中該Cα、該Cβ或二者均包含促進該Cα與該Cβ優先配對的修飾。
  18. 如請求項13至16中任一項之結合蛋白，其中該Cα及該Cβ各自包含促進該Cα與該Cβ優先配對的經引入之半胱胺酸殘基。
  19. 如請求項13至16中任一項之結合蛋白，其中該Cα包含T48C取代且該Cβ包含S57C取代，以促進該Cα與該Cβ的優先配對。
  20. 如請求項1至19中任一項之結合蛋白，其包含TCR α鏈及TCR β鏈，其中該TCR α鏈及該TCR β鏈包含與以下中分別所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，或包含以下中分別所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i)   SEQ ID NOs.:12及22； (ii)  SEQ ID NOs.: 20及30； (iii) SEQ ID NOS.:12及30； (iv) SEQ ID NOs.:20及22； (v)  SEQ ID NOs.:38及48； (vi) SEQ ID NOs.: 46及56； (vii)   SEQ ID NOs.:38及56；或 (viii)  SEQ ID NOs.:46及48。
  21. 如請求項1至20中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白包含一TCR、一單鏈TCR (scTCR)、一單鏈T細胞受體可變片段(scTv)，或一嵌合抗原受體(CAR)。
  22. 如請求項21之結合蛋白，其中該結合蛋白包含一TCR。
  23. 如請求項1至22中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在對該肽之功能親合力的一CD137表面表現分析中包含至多100 nM、至多50 nM、至多25 nM、至多10 nM、至多1 nM、至多750 pM、至多500 pM、至多250 pM、至多100 pM、至多75 pM或至多60 pM的EC50。
  24. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至23中任一項之結合蛋白。
  25. 如請求項24之聚核苷酸，其包含與SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的聚核苷酸，或包含SEQ ID NOs.: 5-10及33-36中之任一者中所示的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成，或其任何組合。
  26. 如請求項24或25之聚核苷酸，其進一步包含： (i)編碼一多肽之聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含一CD8共受體α鏈； (ii)編碼一多肽之聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體β鏈之胞外部分，其中任擇地，所編碼之該多肽為或包含一CD8共受體β鏈；或 (iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
  27. 如請求項26之聚核苷酸，其包含： (a)編碼包含一CD8共受體α鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸； (b)編碼包含一CD8共受體β鏈之胞外部分之多肽的聚核苷酸；及 (c)編碼一自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於(a)之聚核苷酸與(b)之聚核苷酸之間。
  28. 如請求項26或27之聚核苷酸，其進一步包含編碼一自裂解肽的聚核苷酸，該聚核苷酸安置於以下二者之間： (1)編碼一結合蛋白的聚核苷酸與編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分；及/或 (2)編碼一結合蛋白的聚核苷酸與編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體β鏈之胞外部分。
  29. 如請求項26至28中任一項之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接(operably linked in-frame)的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnBP)； (iii) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)； (iv) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)； (v)  (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)；或 (vi) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnBP)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分， 其中pnCD8β為編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分， 其中pnBP為編碼一結合蛋白的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1及pnSCP 2各自獨立地為編碼一自裂解肽的聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼的該等自裂解肽任擇地為相同或不同的。
  30. 如請求項26至29中任一項之聚核苷酸，其中所編碼的該結合蛋白包含一TCRα鏈及一TCRβ鏈，其中該聚核苷酸包含安置於編碼一TCRα鏈之聚核苷酸與編碼一TCRβ鏈之聚核苷酸之間的編碼一自裂解肽之聚核苷酸。
  31. 如請求項30之聚核苷酸，其包含可操作地同框連接的以下各者： (i)   (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (ii)  (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRβ)-(pnSCP 3)-(pnTCRα)； (iii) (pnCD8α)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (iv) (pnCD8β)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnTCRα)-(pnSCP 3)-(pnTCRβ)； (v)  (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (vi) (pnTCRβ)-(pnSCP 1)-(pnTCRα)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)； (vii)   (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnSCP 3)-(pnCD8β)； (viii)  (pnTCRα)-(pnSCP 1)-(pnTCRβ)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnSCP 3)-(pnCD8α)， 其中pnCD8α為編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分， 其中pnCD8β為編碼一多肽的聚核苷酸，該多肽包含一CD8共受體α鏈之胞外部分， 其中pnTCRα為編碼一TCR α鏈的聚核苷酸， 其中pnTCRβ為編碼一TCR β鏈的聚核苷酸， 且其中pnSCP 1、pnSCP 2及pnSCP 3各自獨立地為編碼一自裂解肽的聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼的該等自裂解肽任擇地為相同或不同的。
  32. 如請求項31之聚核苷酸，其中該pnSCP1編碼一T2A肽，該pnSCP2編碼一P2A肽且該pnSCP3編碼一P2A肽。
  33. 如請求項24至32中任一項之聚核苷酸，其編碼與SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57及58中之任一者中所示的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NOs.: 11、21、37、47、31、32、57及58中之任一者中所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
  34. 如請求項33之聚核苷酸，其編碼：(i)與SEQ ID NO.:11具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.:11中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.:21中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.:21中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
  35. 如請求項33之聚核苷酸，其編碼：(i)與SEQ ID NO.:37中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.:37中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列，及(ii)與SEQ ID NO.:47中所示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO.:47中所示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的胺基酸序列。
  36. 如請求項24至35中任一項之聚核苷酸，其為或包含經密碼子最佳化以便在一宿主細胞中表現的聚核苷酸序列，其中任擇地，該宿主細胞為一人類免疫系統細胞，且其中進一步任擇地為一T細胞。
  37. 一種表現載體，其包含可操作地連接至一表現控制序列的如請求項24至36中任一項之聚核苷酸。
  38. 如請求項37之表現載體，其中該表現控制序列包含一MSCV啟動子。
  39. 如請求項37或請求項38之表現載體，其中該表現控制序列驅動一單一mRNA的表現，該單一mRNA編碼該CD8共受體α鏈之胞外部分、該CD8共受體β鏈之胞外部分、該TCR α鏈及該TCR β鏈。
  40. 如請求項37至39中任一項之表現載體，其中該載體能夠將該聚核苷酸遞送至一宿主細胞。
  41. 如請求項40之表現載體，其中該宿主細胞為一造血前驅細胞或一人類免疫系統細胞。
  42. 如請求項41之表現載體，其中該人類免疫系統細胞為一CD4 +T細胞、一CD8 +T細胞、一CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、一γδ T細胞、一自然殺手細胞、一自然殺手T細胞、一巨噬細胞、一單核球、一樹突細胞或其任何組合。
  43. 如請求項42之表現載體，其中該T細胞為一初始T細胞、一中樞記憶T細胞、一效應記憶T細胞或其任何組合。
  44. 如請求項37至43中任一項之表現載體，其中該載體為一病毒載體。
  45. 如請求項44之表現載體，其中該病毒載體為一慢病毒載體或一γ反轉錄病毒載體。
  46. 如請求項44之表現載體，其中該病毒載體為一自身不活化的慢病毒載體。
  47. 如請求項44或請求項46之表現載體，其中該病毒載體為一第三代慢病毒載體。
  48. 一種宿主細胞，其經修飾以包含如請求項24至36中任一項之聚核苷酸及/或如請求項37至47中任一項之表現載體，及/或經修飾以表現如請求項1至23中任一項之結合蛋白。
  49. 如請求項48之宿主細胞，其中該經修飾之細胞包含一造血前驅細胞及/或一人類免疫細胞。
  50. 如請求項49之宿主細胞，其中該免疫細胞包含一T細胞、一NK細胞、一NK-T細胞、一樹突細胞、一巨噬細胞、一單核球或其任何組合。
  51. 如請求項50之宿主細胞，其中該免疫細胞包含一CD4 +T細胞、一CD8 +T細胞、一CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、一γδ T細胞、一初始T細胞、一中樞記憶T細胞、一幹細胞記憶T細胞、一效應記憶T細胞或其任何組合， 其中任擇地，該免疫細胞包含一CD4 +T細胞及一CD8 +T細胞，其中進一步任擇地，該CD4 +T細胞、該CD8 +T細胞或二者均包含(i)編碼包含一CD8共受體α鏈之胞外部分之一多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含一CD8共受體α鏈；(ii)編碼包含一CD8共受體β鏈之胞外部分之一多肽的聚核苷酸，其中任擇地，所編碼的該多肽為或包含一CD8共受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
  52. 如請求項48至51中任一項之宿主細胞，其中該經修飾之細胞包含一PD-1基因、一LAG3基因、一TIM3基因、一CTLA4基因、一HLA組分基因、一TIGIT基因、一TCR組分基因、一FasL基因或其任何組合之染色體基因剔除。
  53. 如請求項52之宿主細胞，其中該染色體基因剔除包含一HLA組分基因的剔除，該HLA組分基因選自一α1巨球蛋白基因、一α2巨球蛋白基因、一α3巨球蛋白基因、一β1微球蛋白基因或一β2微球蛋白基因。
  54. 如請求項52或53之宿主細胞，其中該染色體基因剔除包含一TCR組分基因的剔除，該TCR組分基因選自一TCR α可變區基因、一TCR β可變區基因、一TCR恆定區基因或其組合。
  55. 一種組成物，其包含如請求項48至54中任一項之宿主細胞及一醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  56. 如請求項55之組成物，其包含至少約30%經修飾CD4 +T細胞，以約1:1比率與(ii)包含至少約30%經修飾CD8 +T細胞之一組成物組合。
  57. 如請求項55或56之組成物，其中該組成物基本上不含初始T細胞。
  58. 一種組成物，其包含： (ix) 如請求項1至23中任一項之結合蛋白； (x)  如請求項24至36中任一項之聚核苷酸； (xi) 如請求項37至47中任一項之表現載體；及/或 (xii)   如請求項48至54中任一項之宿主細胞， 及一醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  59. 一種用於治療一個體之一疾病或病症的方法，該疾病或病症與KRAS G12V突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關，該方法包含向該個體投予有效量的： (i)   如請求項1至23中任一項之結合蛋白； (ii)  如請求項24至36中任一項之聚核苷酸； (iii) 如請求項37至47中任一項之表現載體； (iv) 如請求項48至54中任一項之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含一CD8+ T細胞、一CD4+ T細胞或二者，且其中任擇地，該宿主細胞對於該個體而言為自體的、同種異體的或同基因型的；及/或 (v)  如請求項55至58中任一項之組成物。
  60. 如實施例59之方法，其中該疾病或病症包含一癌症，其中該癌症任擇地為一實體癌症或一血液惡性病。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
  62. 如請求項59至61中任一項之方法，其中該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物非經腸或靜脈內投予至該個體。
  63. 如請求項59至62中任一項之方法，其中該方法包含將(i)至(v)中之任一者或多者的多次劑量投予至該個體。
  64. 如請求項63之方法，其中以約二週至約四週的投予間隔投予該等多次劑量。
  65. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該組成物包含該宿主細胞或包含該宿主細胞的組成物，且其中該方法包含將該宿主細胞或組成物以約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg之劑量投予至該個體。
  66. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投予至少5x10^8、至少1x10^9、至少5x10^9、至少1x10^10、至少1.5x10^10、至少2x10^10或至少5x10^10個包含該結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
  67. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投予至多5x10^9、至多1x10^10、至多1.5x10^10、至多2x10^10、至多5x10^10、至多1x10^11或至多5x10^11個包含該結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
  68. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投予約5x10^9、約6x10^9、約7x10^9、約8x10^9、約9x10^9、約1x10^10、約1.1x10^10、約1.2x10^10、約1.3x10^10、約1.4x10^10、約1.5x10^10、約1.6x10^10、約1.7x10^10、約1.8x10^10、約1.9x10^10或約2x10^10個包含該結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
  69. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投予約5x10^9至約1x10^11、約5x10^9至約5x10^10、約5x10^9至約2x10^10、約5x10^9至約1.5x10^10、約5x10^9至約1x10^10、約1x10^10至約1x10^11、約1x10^10至約5x10^10、約1x10^10至約2x10^10、或約1x10^10至約1.5x10^10個包含該結合蛋白的活宿主細胞，任擇地以單次劑量投予。
  70. 如請求項59至69中任一項之方法，進一步包含在投予該結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組成物之前，確定該個體表現HLA-A*11，任擇地HLA-A*11:01。
  71. 如請求項59至70中任一項之方法，其中該方法進一步包含將一細胞介素投予至該個體。
  72. 如請求項71之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
  73. 如請求項59至72中任一項之方法，其中該個體已接受或正接受一免疫檢查點抑制劑及/或一刺激性免疫檢查點媒介物(stimulatory immune checkpoint agent)之一促效劑。
  74. 如請求項1至23中任一項之結合蛋白，如請求項24至36中任一項之聚核苷酸，如請求項37至47中任一項之表現載體，如請求項48至54中任一項之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含一CD8+ T細胞、一CD4+ T細胞或二者，及/或如請求項55至58中任一項之組成物，其用於治療一個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之一疾病或病症的方法中，其中任擇地，該疾病或病症包含一癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
  75. 如請求項1至23中任一項之結合蛋白，如請求項24至36中任一項之聚核苷酸，如請求項37至47中任一項之表現載體，如請求項48至54中任一項之宿主細胞，其中任擇地，該宿主細胞包含一CD8+ T細胞、一CD4+ T細胞或二者，及/或如請求項55至58中任一項之組成物，其用於製造供治療一個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之一疾病或病症的藥劑，其中任擇地，該疾病或病症包含一癌症，其中進一步任擇地，該癌症為實體癌症或血液惡性病，且其中任擇地，該疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，任擇地為胰管腺癌(PDAC)；大腸直腸癌或癌瘤；肺癌，任擇地為非小細胞肺癌；膽道癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，任擇地為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(任擇地為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良的甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星狀細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；套細胞淋巴瘤；不可分類的骨髓發育不良/骨髓增生性腫瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；難治性貧血伴隨過量芽細胞-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關的AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；大腸癌；大腸直腸腺癌；甲狀腺乳頭狀癌；或其晚期或轉移形式。
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