TW202332685A - 冠狀病毒疫苗配製品 - Google Patents

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景輝 田
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Abstract

本文公開了適合於在疫苗中使用的冠狀病毒刺突（S）蛋白和包含所述冠狀病毒刺突蛋白的奈米顆粒。所述奈米顆粒呈遞來自包圍洗滌劑核心並與之締合的病原體的抗原，從而產生增強的穩定性和良好的免疫原性。還公開了所述疫苗和奈米顆粒的劑量、配製品和用於製備所述疫苗和奈米顆粒的方法。

Description

冠狀病毒疫苗配製品
本公開文本總體上涉及非天然存在的冠狀病毒（CoV）刺突（S）多肽以及包含所述多肽的奈米顆粒和疫苗，其可用於刺激免疫反應。所述奈米顆粒提供了任選地與洗滌劑核心締合的抗原（例如，醣蛋白抗原），並且通常使用重組方法產生。所述奈米顆粒具有改善的穩定性和增強的表位呈遞。本公開文本還提供了含有所述奈米顆粒的組合物、用於產生所述組合物的方法以及刺激免疫反應的方法。
感染性疾病仍然是遍及全世界的問題。儘管在開發針對一些病原體的疫苗方面已取得進展，但許多病原體仍對人類健康構成威脅。突發急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的爆發已導致全球650萬人死亡。SARS-CoV-2冠狀病毒與在過去17年中已導致數百人死亡的嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）屬於同一病毒家族。SARS-CoV-2導致疾病COVID-19。
期望開發預防威脅生命的感染性疾病（像SARS-CoV-2冠狀病毒）或減輕其嚴重性的疫苗。然而，由於病原體的逃避機制非常複雜並且難以穩定疫苗，因此人類疫苗的開發仍然具有挑戰性。最佳地，疫苗必須同時誘導阻斷或中和感染原的抗體，並且在各種環境（包括不能製冷的環境）中保持穩定。
相關申請的交叉引用
本申請要求以下申請的優先權：2021年11月30日提交的美國申請號63/284,497；2021年12月21日提交的美國申請號63/292,120；2021年12月23日提交的美國申請號63/293,519；2022年4月19日提交的美國申請號63/332,530；以及2022年7月5日提交的美國申請號63/367,678。將這些申請的內容出於所有目的通過引用以其整體併入本文。
電子提交的文字文件的說明
電子序列表（F22W1248TW-SEQ LISTING-ST26.xml；大小： 631,719位元組；建立日期：2023年03月29日）的內容通過引用以其整體併入本文。
本公開文本提供了適用於誘導針對SARS-CoV-2的免疫反應的非天然存在的CoV S多肽。本公開文本還提供了含有所述醣蛋白的奈米顆粒以及刺激免疫反應的方法。
本公開文本還提供了適用於誘導針對多種冠狀病毒的免疫反應的CoV S多肽，所述冠狀病毒包括SARS-CoV-2、中東呼吸症候群（MERS）和嚴重急性呼吸症候群（SARS）。
本文提供了CoV S多肽，其包含： 具有滅活的弗林蛋白酶切割位點的S1次單元，其中所述S1次單元包含N末端結構域（NTD）、受體結合結構域（RBD）、次結構域1和次結構域2（SD1/2），其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7）；其中所述NTD任選地包含選自以下的一個或多個修飾： 選自胺基酸11-14、56、57、130、131、132、144、145、198、199、228、229、230、231、234、235、236、237、238、239、240及其組合的一個或多個胺基酸的缺失；以及 選自胺基酸5、6、7、11、12、13、14、51、53、54、56、57、62、63、67、70、82、125、129、131、132、133、134、139、143、144、145、170、177、197、198、199、200、201、202、209、229、233、239、240、244、245及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述RBD任選地包含選自胺基酸326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、419、426、427、431、432、433、439、440、447、464、465、471、473、477、480、481、483、485、488、492及其組合的一個或多個胺基酸的突變；並且 其中所述SD1/2結構域任選地包含選自534、557、591、600、601、626、642、645、664、666、668及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 S2次單元，其中胺基酸973和974是脯胺酸，其中所述S2次單元任選地包含選自以下的一個或多個修飾： 從676-685、676-702、702-711、775-793、806-815及其組合的一個或多個胺基酸的缺失；以及 選自688、691、703、751、783、843、846、875、937、941、956、968、969、1014、1058、1105、1163、1186及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 自TMCT的一個或多個胺基酸的缺失；以及在(i)(a)-(c) 和 (ii)(a)-(c) 中的修飾中的任一種的組合； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
在實施例中，所述一個或多個修飾選自：(i) 選自6、14、54、70、82、129、133、134、139、143、144、170、197、199、200、239、244、326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、427、431、432、433、439、447、464、465、471、473、477、480、483、485、488、492、534、591、601、626、642、645、666、668、691、751、783、843、941、956、968和1186的一個或多個胺基酸的突變；(ii) 選自11、12、13、56、57、130、131、132、144、145和198的一個或多個胺基酸的缺失；(iii) 具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；以及在 (i)-(iii) 中的修飾的組合，其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。在實施例中，所述一個或多個修飾選自：T6I、T6R、A14S、A54V、V70A、T82I、G129D、H133Q、K134E、W139R、E143G、F144L、Q170E、I197V、L199I、V200E、V200G、G239V、G244S、G326D、G326H、R333T、L355I、S358F、S358L、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、V432P、G433S、L439R、L439Q、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、F473S、F477S、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、T591I、D601G、G626V、H642Y、N645S、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入、及其組合；其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
在實施例中，本文提供了包含選自以下的修飾的組合的CoV S醣蛋白：
A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；
T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56、以及胺基酸57的缺失；
T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；
T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失；
T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；
T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 (xviii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失；其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。在實施例中，所述CoV S醣蛋白與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的NTD與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的NTD是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的RBD與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的RBD是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的S1次單元與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的S1次單元是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的S2次單元與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的S2次單元是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的SD1/2與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的SD1/2是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白的NTD、RBD、S1次單元、S2次單元和SD1/2中的每一種與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的對應NTD、RBD、S1次單元、S2次單元和SD1/2是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，所述CoV S醣蛋白包含蛋白標籤。在實施例中，所述蛋白標籤在所述醣蛋白的N末端。在實施例中，所述蛋白標籤在所述醣蛋白的C末端。在實施例中，所述蛋白標籤選自多麩胺酸標籤、FLAG標籤、HA標籤、多His標籤（具有約5-10個組胺酸）（SEQ ID NO: 101）、六組胺酸標籤（SEQ ID NO: 100）、8X-His標籤（具有八個組胺酸）（SEQ ID NO: 102）、Myc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶標籤、綠色螢光蛋白標籤、麥芽糖結合蛋白標籤、硫氧還蛋白標籤、Fc標籤或其組合。在實施例中，所述CoV S醣蛋白包含N末端信號肽。在實施例中，所述N末端信號肽選自SEQ ID NO: 5、117、154和193中的任一個。
在實施例中，本文提供了包含本文所述的CoV S醣蛋白的核酸。在實施例中，所述核酸與SEQ ID NO: 196、197、198、199、201、202、204、206、208、210、212、214或216中的任一個的核酸是至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在實施例中，本文提供了包含如請求項18或19所述的核酸的載體。
在實施例中，本文提供了包含本文所述的CoV S醣蛋白和非離子型洗滌劑核心的奈米顆粒。在實施例中，在4ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。在實施例中，在25ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。在實施例中，在37ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。在實施例中，在4ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約65 nm或從約30 nm至約50 nm的Zavg直徑。在實施例中，在25ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約65 nm或從約30 nm至約50 nm的Zavg直徑。在實施例中，在37ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約120 nm、從約30 nm至約80 nm或從約30 nm至約60 nm的Zavg直徑。在實施例中，在4ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。在實施例中，在25ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。在實施例中，在37ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。在實施例中，所述非離子型洗滌劑選自聚山梨醇酯20（PS20）、聚山梨醇酯40（PS40）、聚山梨醇酯60（PS60）、聚山梨醇酯65（PS65）和聚山梨醇酯80（PS80）。在實施例中，所述非離子型洗滌劑是PS80。
在實施例中，本文提供了一種表現本文所述的CoV醣蛋白的細胞。在實施例中，所述細胞是昆蟲細胞。
在實施例中，本文提供了一種免疫原性組合物，其包含至少一種本文所述的CoV S醣蛋白或如本文所述的奈米顆粒和醫藥上可接受的緩衝液。在實施例中，所述組合物包含兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同的CoV S醣蛋白。在實施例中，至少一種CoV S醣蛋白包含選自以下的修飾的組合：        (i) A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；(ii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；(iii) T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；(iv) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；(v) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；(vi) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(vii) V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(viii) V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(ix) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(x) T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；(xi) T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失；(xii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(xiii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(xiv) T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失；(xv) T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失；(xvi) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；(xvii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 (xviii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失。在實施例中，所述免疫原性組合物包含與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的至少一種CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含與SEQ ID NO: 87的CoV S醣蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含與SEQ ID NO: 85-89、105、106和112-115的CoV S醣蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，所述免疫原性組合物包含至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種血球凝集素（HA）醣蛋白，其中每種HA醣蛋白來自不同的流感毒株。在實施例中，所述免疫原性組合物包含呼吸道合胞病毒（RSV）融合（F）醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含：(i) 與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第一CoV S醣蛋白，和 (ii) 與SEQ ID NO: 175的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第二CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含從約1 µg至約50 µg、從約3 µg至約25 µg、從約5 µg至約25 µg或從約5 µg至約100 µg的CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含從約1 µg至約50 µg、從約3 µg至約25 µg、從約5 µg至約25 µg或從約5 µg至約100 µg的每種CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含約5 µg的CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含約5 µg的每種CoV S醣蛋白。在實施例中，所述免疫原性組合物包含佐劑。在實施例中，所述佐劑是皂苷佐劑。在實施例中，所述皂苷佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中：第一iscom顆粒包含皂樹（Quillaja Saponaria Molina）的級分A，且不包含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C，且不包含皂樹的級分A。在實施例中，皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%。在實施例中，皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。在實施例中，分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約85%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。在實施例中，分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計50%-96%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。在實施例中，所述免疫原性組合物包含從約25 µg至約100 µg的佐劑。在實施例中，所述免疫原性組合物包含約50 µg的佐劑。
本文提供了一種包含本文所述的免疫原性組合物的載藥注射器。在實施例中，本文提供了一種刺激針對SARS-CoV-2或異源SARS-CoV-2毒株的免疫反應的方法，其包括向受試者投予本文所述的免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量的所述免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予第一劑量的所述免疫原性組合物和在所述第一劑量後約三週投予第二劑量的所述免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予第一劑量的所述免疫原性組合物和在所述第一劑量後約21天投予第二劑量的所述免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予第一劑量的所述免疫原性組合物和在所述第一劑量後約28天投予第二劑量的所述免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予至少三個劑量的所述免疫原性組合物，其中在所述第一劑量或所述第二劑量後至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月或至少24個月投予第三劑量的所述免疫原性組合物。在實施例中，所述方法包括投予不同於所述第一免疫原性組合物的第二免疫原性組合物。在實施例中，所述第二免疫原性組合物包含編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，所述第二免疫原性組合物包含至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種血球凝集素（HA）醣蛋白，其中每種HA醣蛋白來自不同的流感毒株。在實施例中，所述第二免疫原性組合物包含與所述第一免疫原性組合物相比不同的CoV S醣蛋白。在實施例中，所述第二免疫原性組合物包含呼吸道合胞病毒（RSV）融合（F）蛋白。在實施例中，將所述免疫原性組合物肌內投予。在實施例中，所述方法包括投予在載藥注射器中的免疫原性組合物。在實施例中，所述方法預防COVID-19的功效在投予所述免疫原性組合物後至少約2個月、至少約2.5個月、至少約3個月、至少約3.5個月、至少約4個月、至少約4.5個月、至少約5個月、至少約5.5個月、至少約6個月、至少約6.5個月、至少約7個月、至少約7.5個月、至少約8個月、至少約8.5個月、至少約9個月、至少約9.5個月、至少約10個月、至少約10.5個月、至少約11個月、至少約11.5個月、至少約12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月或至少24個月內是從約50%至約99%、從約50%至約95%、從約50%至約90%、從約50%至約85%、從約50%至約80%、從約60%至約99%、從約65%至約95%、從約65%至約90%、從約65%至約85%、從約69%至約81%、從約60%至約95%、從約60%至約90%、從約60%至約85%、從約60%至約80%、從約40%至約99%、從約40%至約95%、從約40%至約90%、從約40%至約85%、從約40%至約80%、從約40%至約75%、從約40%至約70%、從約40%至約65%、從約40%至約55%或從約40%至約50%。在實施例中，所述方法預防COVID-19的功效在投予所述免疫原性組合物後長達約2個月、長達約2.5個月、長達約3個月、長達約3.5個月、長達約4個月、長達約4.5個月、長達約5個月、長達約5.5個月、長達約6個月、長達約6.5個月、長達約7個月、長達約7.5個月、長達約8個月、長達約8.5個月、長達約9個月、長達約9.5個月、長達約10個月、長達約10.5個月、長達約11個月、長達約11.5個月、長達約12個月、長達13個月、長達14個月、長達15個月、長達16個月、長達17個月、長達18個月、長達19個月、長達20個月、長達21個月、長達22個月、長達23個月或長達24個月內是從約50%至約99%、從約50%至約95%、從約50%至約90%、從約50%至約85%、從約50%至約80%、從約60%至約99%、從約65%至約95%、從約65%至約90%、從約65%至約85%、從約69%至約81%、從約60%至約95%、從約60%至約90%、從約60%至約85%、從約60%至約80%、從約40%至約99%、從約40%至約95%、從約40%至約90%、從約40%至約85%、從約40%至約80%、從約40%至約75%、從約40%至約70%、從約40%至約65%、從約40%至約55%或從約40%至約50%。在實施例中，所述異源SARS-CoV-2毒株具有選自B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1的PANGO譜系。在實施例中，所述異源SARS-CoV-2毒株具有α、β、γ、δ、ε、ι、κ、ζ、μ或ο的世界衛生組織標記。本文提供了一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2、異源SARS-CoV-2毒株、流感病毒或其組合的免疫反應的方法，其包括投予本文所述的免疫原性組合物。本文提供了一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2、異源SARS-CoV-2毒株、流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）或其組合的免疫反應的方法，其包括投予本文所述的免疫原性組合物。
定義
如本文和所附申請專利範圍所用，單數形式“一個/一種（a）”、“一個/一種（an）”和“所述（the）”包括複數指代物，除非上下文另外明確地規定。因此，例如，提及“一種蛋白質”可以指一種蛋白質或這種蛋白質的混合物，並且提及“所述方法”包括提及熟習此項技術者已知的等同步驟和/或方法，等等。
如本文所用，術語“佐劑”是指當與免疫原組合使用時增加或以其他方式改變或修飾針對所述免疫原誘導的免疫反應的化合物。免疫反應的修飾可以包括強化或擴大抗體免疫反應和細胞免疫反應中任一者或兩者的特異性。
如本文所用，當在數值之前時，術語“約”或“大約”指示所述值加或減10%的範圍。例如，“約100”涵蓋90和110。
如本文所用，術語“免疫原”、“抗原”和“表位”是指能夠引發免疫反應的物質，諸如蛋白質（包括醣蛋白）和肽。
如本文所用，“免疫原性組合物”是包含抗原的組合物，其中向受試者投予所述組合物導致在所述受試者中產生針對所述抗原的體液免疫反應和/或細胞免疫反應。
如本文所用，“次單元”組合物（例如疫苗）包括一種或多種來自病原體的選定抗原，但不是全部抗原。這樣的組合物基本上不含完整的病毒或此類細胞或顆粒的裂解物，並且通常由至少部分純化的（通常基本上純化的）來自所述病原體的免疫原性多肽製備。通常使用杆狀病毒系統，通常以重組方式製備本文公開的次單元組合物中的抗原。
如本文所用，“基本上”是指這樣分離物質（例如化合物、多核苷酸或多肽），使得所述物質形成包含其的樣品的大多數百分比。例如，在樣品中，基本上純化的組分構成所述樣品的85%，優選85%-90%，更優選至少95%-99.5%，並且最優選至少99%。如果組分基本上被替代，則在樣品中剩餘的量小於或等於約0.5%至約10%，優選小於約0.5%至約1.0%。
如本文所用，術語“治療”（“treat”、“treatment”和“treating”）是指用於獲得有益或期望的結果（例如，臨床結果）的方法。出於本公開文本的目的，有益或期望的結果可以包括抑制或壓制感染或疾病的開始或進展；改善感染或疾病的症狀或減輕其發展；或其組合。
如本文所用，“預防”（“prevention”）與“防預”（“prophylaxis”）可互換使用，並且可以意指完全預防感染或疾病，或預防這種感染或疾病的症狀的發展；延遲感染或疾病或其症狀的發作；或降低隨後發展的感染或疾病或其症狀的嚴重程度。
如本文所用，“有效劑量”或“有效量”是指免疫原的這樣的量，所述量足以誘導減輕病原體感染的至少一種症狀的免疫反應。可以例如通過測量中和分泌抗體和/或血清抗體的量，例如通過噬斑中和、補體結合、酶聯免疫吸附（ELISA）或微量中和測定來確定有效劑量或有效量。
如本文所用，術語“疫苗”是指用於誘導針對病原體的免疫反應的免疫原性組合物，諸如源自所述病原體的免疫原，所述免疫反應提供保護性免疫力（例如，保護受試者免於所述病原體感染和/或降低由所述病原體感染引起的疾病或病症的嚴重性的免疫力）。保護性免疫反應可以包括抗體和/或細胞介導的反應的形成。取決於上下文，術語“疫苗”也可以指投予至受試者以產生保護性免疫力的免疫原懸浮液或溶液。
如本文所用，術語“受試者”包括人和其他動物。通常，受試者是人。例如，受試者可以是成人、青少年、兒童（2歲至14歲）、嬰兒（出生至2歲）或新生兒（多至2個月）。在特定態樣，受試者多至4個月大或多至6個月大。在多態樣，成人是約65歲或更大或約60歲或更大的年長者。在多態樣，受試者是孕婦或打算懷孕的婦女。在其他態樣，受試者不是人；例如非人靈長類動物；例如，狒狒、黑猩猩、大猩猩或獼猴。在某些態樣，受試者可以是寵物，諸如狗或貓。
在多態樣，受試者是免疫功能受損的。在實施例中，對免疫功能受損的受試者投予引起免疫抑制的藥物。引起免疫抑制的藥物的非限制性例子包括皮質類固醇（例如，潑尼松）、烷基化劑（例如，環磷醯胺）、抗代謝藥（例如，硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤）、移植相關的免疫抑制藥物（例如，環孢菌素、他克莫司、西羅莫司或嗎替麥考酚酯）、米托蒽醌、化療劑、甲胺蝶呤、腫瘤壞死因子（TNF）-阻斷劑（例如，依那西普、阿達木單抗、英夫利昔單抗）。在實施例中，所述免疫功能受損的受試者被病毒（例如，人類免疫缺陷病毒或愛潑斯坦-巴爾病毒）感染。在實施例中，所述病毒是呼吸道病毒，如呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒或小核糖核酸病毒。在實施例中，所述免疫受損的受試者患有獲得性免疫缺陷症候群（AIDS）。在實施例中，所述免疫受損的受試者是人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者。在實施例中，免疫功能受損的受試者是由於被設計用於預防炎症或防止移植排斥的治療方案而免疫功能受損。在實施例中，所述免疫受損的受試者是已經接受移植物的受試者。在實施例中，所述免疫受損的受試者已經經歷了放射療法或脾切除術。在實施例中，所述免疫受損的受試者已被診斷為患有癌症、自身免疫病、結核病、物質使用障礙（例如，酒精、阿片類物質或可卡因使用障礙）、中風或腦血管疾病、實體器官或血液幹細胞移植、鐮狀細胞病、地中海貧血、自身免疫性淋巴增殖症候群（ALPS）、自身免疫性多內分泌腺症候群1型（APS-1）、NF-κB相關B細胞增殖和T細胞失能（BENTA）疾病、半胱天冬酶8缺陷狀態（CEDS）、慢性肉芽腫病（CGD）、常見變異型免疫缺陷病（CVID）、先天性中性粒細胞減少症候群、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）缺陷、DOCK8缺陷、GATA2缺陷、伴有免疫缺陷的醣基化障礙、高免疫球蛋白E症候群（HIES）、高免疫球蛋白M症候群、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、干擾素γ缺陷、介白素12缺陷、介白素23缺陷、白細胞粘附缺陷症、脂多醣反應性米色樣錨蛋白（LRBA）缺陷、PI3激酶疾病、PLCG2相關抗體缺陷和免疫失調（PLAID）、重症聯合免疫缺陷（SCID）、STAT3顯性負性疾病、STAT3功能獲得性疾病、疣、低丙球蛋白血症、感染、和骨髓粒細胞缺乏（WHIM）症候群、Wisckott-Aldrich症候群（WAS）、X連鎖無丙種球蛋白血症（XLA）、X連鎖淋巴組織增殖性疾病（XLP）、尿毒癥、營養不良或XMEN疾病。在實施例中，所述免疫受損的受試者是當前吸煙者或曾經吸煙者。在實施例中，所述免疫受損的受試者患有B細胞缺陷、T細胞缺陷、巨噬細胞缺陷、細胞介素缺陷、吞噬細胞缺陷、吞噬細胞功能異常、補體缺陷或其組合。
在實施例中，所述受試者超重或肥胖。在實施例中，超重受試者具有≥ 25 kg/m 2且＜ 30 kg/m 2的體重指數（BMI）。在實施例中，肥胖受試者具有≥ 30 kg/m 2的BMI。在實施例中，所述受試者患有精神健康病症。在實施例中，所述精神健康病症是抑鬱症、精神分裂症或焦慮症。
如本文所用，術語“醫藥上可接受的”意指由美國聯邦政府或州政府的監管機構批准或在美國藥典、歐洲藥典或其他公認藥典中列出用於哺乳動物，且更特別地用於人。這些組合物可以用作用於在脊椎動物中誘導保護性免疫反應的疫苗和/或抗原組合物。
如本文所用，術語“約”意指加或減所指示數值的10%。
如本文所用，術語“NVX-CoV2373”是指包含BV2373刺突醣蛋白（SEQ ID NO: 87）以及級分A和級分C iscom基質（例如，MATRIX-M TM）的疫苗組合物。
如本文所用，術語“修飾”當提及CoV S多肽時是指CoV S多肽的一個或多個胺基酸的突變、缺失或添加。CoV S多肽內修飾的位置可以基於將多肽的序列與SEQ ID NO: 1（含有信號肽的CoV S多肽）或SEQ ID NO: 2（缺少信號肽的成熟CoV S多肽）比對來確定。
在本文與“異源SARS-CoV-2毒株”可互換使用的術語SARS-CoV-2“變種”是指包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的SARS-CoV S多肽相比具有一個或多個修飾。例如，與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變種可以具有至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個、至少約7個、至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個、或至少約35個修飾。例如，與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變種可以具有至少一個並且多至2個、多至3個、多至4個、多至5個、多至6個、多至7個、多至8個、多至9個、多至10個、多至11個、多至12個、多至13個、多至14個、多至15個、多至16個、多至17個、多至18個、多至19個、多至20個、多至21個、多至22個、多至23個、多至24個、多至25個、多至26個、多至27個、多至28個、多至29個、多至30個、多至31個、多至32個、多至33個、多至34個、多至35個修飾、多至40個修飾、多至45個修飾、多至50個修飾、多至55個修飾、多至60個修飾、多至65個修飾、多至70個修飾、多至75個修飾、多至80個修飾、多至85個修飾、多至90個修飾、多至95個修飾或多至100個修飾。在多態樣，與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽相比，SARS-CoV-2變種可以具有在約2個與約35個之間的修飾、在約5個與約10個之間的修飾、在約5個與約20個之間的修飾、在約10個與約20個之間的修飾、在約15個與約25個之間的修飾、在約20個與30個之間的修飾、在約20個與約40個之間的修飾、在約25個與約45個之間的修飾、在約25個與約100個之間的修飾、在約25個與約45個之間的修飾、在約35個與約100個之間的修飾。
在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約70%與約99.9%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約70%與約99.5%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約90%與約99.9%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約90%與約99.8%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約95%與約99.9%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約95%與約99.8%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株是包含如下CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒，所述CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽具有在約95%與約99%之間的同一性。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有α、β、γ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、μ或ο的世界衛生組織標記。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有選自B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1的PANGO譜系。以下文獻描述了Pango譜系命名，並且通過引用以其整體併入本文：O’Toole等人 BMC Genomics, 23, 121 (2022)。
在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有ο的世界衛生組織標記。在實施例中，與SEQ ID NO: 2的野生型SARS-CoV-2 S多肽相比，具有ο的世界衛生組織標記的異源SARS-CoV-2毒株具有至少35個修飾。在實施例中，與SEQ ID NO: 2的野生型SARS-CoV-2 S多肽相比，具有ο的世界衛生組織標記的異源SARS-CoV-2毒株具有從35至55個、從35至65個、從35至75個、從35至85個、從35至95個、或從35至105個修飾。在實施例中，所述修飾選自T6I、T6R、A14S、A54V、V70A、T82I、G129D、H133Q、K134E、W139R、E143G、F144L、Q170E、I197V、L199I、V200E、V200G、G239V、G244S、G326D、G326H、R333T、L355I、S358F、S358L、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、V432P、G433S、L439R、L439Q、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、F473S、F477S、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、T591I、D601G、G626V、H642Y、N645S、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入、及其組合。
在實施例中，變種的CoV S多肽包含選自以下的修飾的組合： A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失； T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； 胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失以及胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H或P668R、T703I、S969A和D1105H； D67A、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； D67A、D202G、胺基酸228-230中1、2或3個胺基酸的缺失、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； D67A、L229H、R233I、N488Y、K404N、E471K、D601G和A688V； L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F； W139C和L439； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、T82I、G129D、Y132H、E143G、A209V、K404N、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、W51H、H53W、G129D、E143G、D200V、L201R、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、K404N、L439R、T465K、E471Q、D601G、P668R和D937N； Q39R、A54V、E471K；D601G、Q664H、F875L以及胺基酸56、57、131、132中的1、2、3或4個缺失； T82I、D240G、E471K、D601G和A688V； L439R、E471Q、D601G、P668R和Q1058H； G62V、T63I、R233N、L439Q、F477S、D601G、T846N以及胺基酸234-240中的1、2、3、4、5或6個缺失； T82I、Y131S、Y132N、R333K、E471K、N488Y、D601G、P668H和D937N；以及 G129D、G326D、S360P、S362F、K404N、N427K、T465K、E471A或E471K、Q480K或Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H和N953K。 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
本文所述的免疫原性組合物或疫苗組合物的術語“功效”是指與未投予免疫原性組合物的組相比，投予免疫原性組合物的組中疾病（例如，COVID-19）的減輕百分比。在實施例中，使用以下等式計算功效（E）：E (%) = (1 – RR) × 100，其中RR = 投予所述免疫原性組合物的組與未投予所述免疫原性組合物的組之間的相對發病風險率。在實施例中，本文所述的免疫原性組合物具有針對SARS-CoV-2病毒或異源SARS-CoV-2毒株的功效，所述功效為至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、在約50%與約99%之間、在約50%與約98%之間、在約60%與約99%之間、在約60%與約98%之間、在約70%與約98%之間、在約70%與約95%之間、在約70%與約99%之間、在約80%與約99%之間、在約80%與約98%之間、在約80%與約95%之間、在約85%與約99%之間、在約85%與約98%之間、在約85%與約95%之間、在約90%與約95%之間、在約90%與98%之間、或在約90%與約99%之間。 含有冠狀病毒（ CoV ）刺突（ S ）蛋白的疫苗組合物
本公開文本提供了非天然存在的冠狀病毒（CoV）刺突（S）多肽、含有CoV S多肽的奈米顆粒、以及含有非天然存在的CoV S多肽或含有CoV S多肽的奈米顆粒的免疫原性組合物和疫苗組合物。在實施例中，本文提供了使用CoV S多肽、奈米顆粒、免疫原性組合物和疫苗組合物來刺激針對SARS-CoV-2病毒或異源SARS-CoV-2毒株的免疫反應的方法。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有選自B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1的PANGO譜系。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有α、β、γ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、μ或ο的世界衛生組織標記。
本文還提供了製造所述奈米顆粒和疫苗組合物的方法。有利地，所述方法提供了基本上沒有被其他蛋白質污染的奈米顆粒，所述其他蛋白質是諸如與蛋白質在昆蟲細胞中的重組表現相關的蛋白質。在實施例中，表現發生在杆狀病毒/Sf9系統中。
CoV S 多肽抗原
本公開文本的疫苗組合物含有非天然存在的CoV S多肽。CoV S多肽可以源自冠狀病毒，包括但不限於SARS-CoV-2，例如源自SARS-CoV-2、源自MERS CoV和源自SARS CoV。在實施例中，CoV S多肽源自異源SARS-CoV-2毒株。
與SARS-CoV S蛋白相比，SARS-CoV-2 S蛋白在S1/S2切割位點中具有四個胺基酸插入，從而產生多鹼基RRAR弗林蛋白酶樣切割基序。SARS-CoV-2 S蛋白被合成為無活性前體（S0），其在弗林蛋白酶切割位點處被蛋白水解切割成S1次單元和S2次單元，這些次單元保持非共價連接以形成融合前三聚體。SARS-CoV-2 S蛋白的S2結構域包含融合肽（FP）、兩個七肽重複區（HR1和HR2）、跨膜（TM）結構域和胞質尾（CT）。SARS-CoV-2 S蛋白的S1結構域折疊成四個不同的結構域：N末端結構域（NTD）和含有受體結合結構域（RBD）的C末端結構域以及兩個次結構域SD1和SD2。融合前SARS-CoV-2 S蛋白三聚體在S蛋白受體結合和切割後經歷從融合前到融合後構形的結構重排。
在實施例中，由於轉譯後醣基化，所述CoV S多肽是醣蛋白。所述醣蛋白包含信號肽、S1次單元、S2次單元、NTD、RBD、兩個次結構域（SD1和SD2，在 圖 46A- 圖 46B中標記為SD1/2並且在本文中稱為“SD1/2”）、完整或修飾的融合肽，HR1結構域、HR2結構域、TM和CD中的一種或多種。在實施例中，每個結構域的胺基酸在 圖 2和 圖 46A（根據SEQ ID NO: 1示出）、 圖 46B（根據SEQ ID NO: 2示出）和 圖 3（對應於SEQ ID NO: 1示出）中給出。在實施例中，每個結構域可以與如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中的每個結構域的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性。每個結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的那些相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約20個、或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。每個結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的那些相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。應注意， 圖 2和 圖 3展示了成熟肽中不存在的13個胺基酸的N末端信號肽。所述CoV S多肽可以用於刺激針對天然CoV刺突（S）多肽的免疫反應。
在實施例中，修飾天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），從而產生非天然存在的CoV刺突（S）多肽（ 圖 1）。在實施例中，所述CoV刺突（S）醣蛋白包含S1次單元和S2次單元，其中所述S1次單元包含NTD、RBD、SD1/2和無活性的弗林蛋白酶切割位點（胺基酸669-672），並且其中所述S2次單元包含胺基酸973和974的突變； 其中所述NTD任選地包含選自以下的一個或多個修飾： 選自胺基酸11-14、56、57、130、131、132、144、145、198、199、228、229、230、231、234、235、236、237、238、239、240及其組合的一個或多個胺基酸的缺失； 選自胺基酸5、6、7、11、12、13、14、51、53、54、56、57、62、63、67、70、82、125、129、131、132、133、134、139、143、144、145、170、177、197、198、199、200、201、202、209、229、233、239、240、244、245及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述RBD任選地包含選自胺基酸326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、419、426、427、431、432、433、439、440、447、464、465、471、473、477、480、481、483、485、488、492及其組合的一個或多個胺基酸的突變； 其中所述SD1/2結構域任選地包含選自534、557、591、600、601、626、642、645、664、666、668及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 S2次單元，其中胺基酸973和974是脯胺酸，其中所述S2次單元任選地包含選自以下的一個或多個修飾： 一個或多個胺基酸從676-685、676-702、702-711、775-793、806-815及其組合的缺失； 選自688、691、703、751、783、843、846、875、937、941、956、968、969、1014、1058、1105、1163、1186及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (c) 一個或多個胺基酸從TMCT的缺失；其中CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。 在實施例中，所述CoV刺突（S）醣蛋白包含S1次單元和S2次單元，其中所述S1次單元包含NTD、RBD、SD1/2和無活性的弗林蛋白酶切割位點（胺基酸669-672），其中所述S2次單元包含胺基酸973和974到脯胺酸的突變；並且其中CoV S醣蛋白包含選自以下的修飾的組合： A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失； T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失。
圖 3示出了稱為BV2378的CoV S多肽，其具有無活性弗林蛋白酶切割位點、缺失的融合肽（例如，胺基酸819-828的缺失）、K986P和V987突變，其中胺基酸相對於SEQ ID NO: 1編號。成熟BV2378多肽缺少信號肽的一個或多個胺基酸，所述信號肽為SEQ ID NO: 1的胺基酸1-13。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽以融合前構形存在。在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含柔性HR2結構域。除非另外提及，否則結構域的柔性通過透射電子顯微術（TEM）和2D類別取平均值來確定。電子密度的降低對應於柔性結構域。 CoV S 多肽抗原 - 對 S1 次單元的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 121的胺基酸序列的S1次單元的一個或多個修飾。
所述S1次單元的胺基酸序列（SEQ ID NO: 121）示於下文。
QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S1次單元具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.5%同一性的S1次單元。所述S1次單元與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S1次單元的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個、多至約30個胺基酸、多至約35個胺基酸、多至約40個胺基酸、多至約45個胺基酸、或多至約50個胺基酸的缺失、插入或突變。所述S1次單元與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S1次單元相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述S1次單元可以含有表1A中所示的修飾的任何組合。
表 1A
對 S1(SEQ ID NO: 121) 的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸14-685和SEQ ID NO: 2的胺基酸1-672
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 在 SEQ ID NO: 2 內的位置 在 SEQ ID NO: 121 內的位置 潛在修飾
14-305 1-292 1-292 -              多至約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或292個胺基酸的缺失
18 5 5 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
19 6 6 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成異白胺酸
20 7 7 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸
24 11 11 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              缺失
25 12 12 -              胺基酸脯胺酸-脯胺酸-丙胺酸(PPA)在胺基酸25之後插入 -              缺失
26 13 13 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              缺失
27 14 14 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
52 39 39 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸
64 51 51 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
66 53 53 -              突變成色胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸
67 54 54 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸
69 56 56 -              胺基酸的缺失
70 57 57 -              胺基酸的缺失 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
75 62 62 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸
76 63 63 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸
80 67 67 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸
83 70 70 -              突變成丙胺酸
95 82 82 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸
138 125 125 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
142 129 129 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸
143 130 130 -              胺基酸的缺失
144 131 131 -              胺基酸的缺失 -              突變成絲胺酸
145 132 132 -              胺基酸的缺失 -              突變成組胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
146 133 133 -              突變成芳香族胺基酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸 -              突變成麩醯胺酸
147 134 134 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸
152 139 139 -              突變成半胱胺酸 -              突變成甲硫胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸
156 143 143 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸
157 144 144 -              胺基酸的缺失 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
158 144 144 -              胺基酸的缺失
183 170 170 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸
190 177 177 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成半胱胺酸
210 197 197 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
211 198 198 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              胺基酸的缺失
212 199 199 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              胺基酸的缺失
213 200 200 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成脯胺酸 -              突變成甘胺酸 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸
214 201 201 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸 -              胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)在214之後插入
215 202 202 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸 -              胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)在215之後插入
222 209 209 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸
241-244 228-231 228-231 -              1、2、3或4個胺基酸的缺失
242 229 229 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
246 233 233 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸
247 234 234 -              胺基酸的缺失
248 235 235 -              胺基酸的缺失
249 236 236 -              胺基酸的缺失
250 237 237 -              胺基酸的缺失
251 238 238 -              胺基酸的缺失
252 239 239 -              胺基酸的缺失 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
253 240 240 -              突變成甘胺酸 -              胺基酸的缺失
257 244 244 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
258 245 245 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
339 326 326 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸 -              突變成組胺酸
346 333 333 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成絲胺酸
368 355 355 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
371 358 358 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成苯丙胺酸
373 360 360 -              突變成脯胺酸
375 362 362 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
376 363 363 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸
405 392 392 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
408 395 395 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
417 404 404 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
432 419 419 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
439 426 426 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
440 427 427 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
444 431 431 -              突變成蘇胺酸 -              突變成絲胺酸
445 432 432 -              突變成脯胺酸
446 433 433 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
452 439 439 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸
453 440 440 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
460 447 447 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
477 464 464 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
478 465 465 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
484 471 471 -              突變成丙胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸
486 473 473 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
490 477 477 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
493 480 480 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
494 481 481 -              突變成脯胺酸
496 483 483 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
498 485 485 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
501 488 488 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
505 492 492 -              突變成組胺酸
547 534 534 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
570 557 557 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸
604 591 591 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
613 600 600 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
614 601 601 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸
639 626 626 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸
655 642 642 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
658 645 645 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
677 664 664 -              突變成組胺酸
679 666 666 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
681 668 668 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
682-685 669-672 669-672 -              無活性的弗林蛋白酶切割位點(參見表1E)
CoV S 多肽抗原 - 對 S1 次單元 -NTD 的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對NTD的一個或多個修飾。在實施例中，所述NTD具有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列，其對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸14-305或SEQ ID NO: 2的胺基酸1-292。
NTD的胺基酸序列（SEQ ID NO: 118）示於下文。
QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKS
在實施例中，所述NTD具有SEQ ID NO: 45的胺基酸序列，其對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸14至331或SEQ ID NO: 2的胺基酸1-318。NTD的胺基酸序列（SEQ ID NO: 45）示於下文。
QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPN
在實施例中，所述NTD和RBD重疊多至約1個胺基酸、多至約5個胺基酸、多至約10個胺基酸、或多至約20個胺基酸。
在實施例中，如本文所提供的NTD可以在C末端延伸多至5個胺基酸、多至10個胺基酸、多至15個胺基酸、多至20個胺基酸、多至25個胺基酸、或多至30個胺基酸。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的NTD具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的NTD。所述NTD與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的NTD的胺基酸序列相比可以具有多至約1個胺基酸、多至約2個胺基酸、多至約3個胺基酸、多至約4個胺基酸、多至約5個胺基酸、多至約10個胺基酸、多至約15個胺基酸、多至約20個胺基酸、多至約25個胺基酸、或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述NTD與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的NTD相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述CoV S多肽含有一個或多個胺基酸從N末端結構域（NTD）（對應於SEQ ID NO: 2的胺基酸1-292）中的缺失。在實施例中，所述CoV S多肽含有NTD的多至約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或292個胺基酸的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有一個或多個胺基酸從NTD（對應於SEQ ID NO: 2的胺基酸1-318）中的缺失。在實施例中，所述CoV S多肽含有SEQ ID NO: 2的NTD的胺基酸1-318的缺失。在實施例中，NTD的缺失增強了CoV刺突（S）多肽的蛋白質表現。在實施例中，具有NTD缺失的CoV S多肽具有由SEQ ID NO: 46、48、49、51、52和54表示的胺基酸序列。在實施例中，具有NTD缺失的CoV S多肽由選自SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 53的分離的核酸序列編碼。
在實施例中，所述NTD可以含有表1B中所示的修飾的任何組合。所述修飾相對於供參考的成熟S多肽序列SEQ ID NO: 2示出。
表 1B
對 NTD(SEQ ID NO: 118) 的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸14-305和SEQ ID NO: 2的胺基酸1-292
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 SEQ ID NO: 2 殘基 SEQ ID NO: 118 或 SEQ ID NO: 45 殘基 修飾  
14-305 1-292 1-292 -              多至約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或292個胺基酸的缺失  
18 5 5 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸  
19 6 6 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成異白胺酸  
20 7 7 -              變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸  
24 11 11 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              缺失  
25 12 12 -              胺基酸脯胺酸-脯胺酸-丙胺酸(PPA)在胺基酸25之後插入 -              缺失  
26 13 13 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              缺失  
27 14 14 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸  
52 39 39 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸  
64 51 51 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸  
66 53 53 -              突變成色胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸  
67 54 54 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸  
69 56 56 -              胺基酸的缺失  
70 57 57 -              胺基酸的缺失 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸  
75 62 62 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸  
76 63 63 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸  
80 67 67 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸  
83 70 70 -              突變成丙胺酸  
95 82 82 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸  
138 125 125 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸  
142 129 129 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸  
143 130 130 -              胺基酸的缺失  
144 131 131 -              胺基酸的缺失 -              突變成絲胺酸  
145 132 132 -              胺基酸的缺失 -              突變成組胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸  
146 133 133 -              突變成芳香族胺基酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸  
147 134 134 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸  
152 139 139 -              突變成半胱胺酸 -              突變成甲硫胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸  
156 143 143 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸  
157 144 144 -              胺基酸的缺失 -              突變成白胺酸  
158 144 144 -              胺基酸的缺失  
183 170 170 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸  
190 177 177 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成半胱胺酸  
210 197 197 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸  
211 198 198 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              胺基酸的缺失  
212 199 199 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              胺基酸的缺失  
213 200 200 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成脯胺酸 -              突變成甘胺酸 -              突變成麩胺酸 -              突變成天門冬胺酸  
214 201 201 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸 -              胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)在214之後插入  
215 202 202 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸 -              胺基酸麩胺酸-脯胺酸-麩胺酸(EPE)在215之後插入  
222 209 209 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸  
241-244 228-231 228-231 -              1、2、3或4個胺基酸的缺失  
242 229 229 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸  
246 233 233 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸  
247 234 234 -              胺基酸的缺失  
248 235 235 -              胺基酸的缺失  
249 236 236 -              胺基酸的缺失  
250 237 237 -              胺基酸的缺失  
251 238 238 -              胺基酸的缺失  
252 239 239 -              胺基酸的缺失 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸  
253 240 240 -              突變成甘胺酸 -              胺基酸的缺失  
257 244 244 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸  
258 245 245 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸  
CoV S 多肽抗原 - 對 S1 次單元 -RBD 的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對RBD的一個或多個修飾。
在實施例中，所述RBD具有SEQ ID NO: 126的胺基酸序列，其對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸331-527或SEQ ID NO: 2的胺基酸318-514。
所述RBD的胺基酸序列（SEQ ID NO: 126）示於下文：
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP
在實施例中，所述RBD具有SEQ ID NO: 116的胺基酸序列，其對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸335-530或SEQ ID NO: 2的胺基酸322-517。
所述RBD的胺基酸序列（SEQ ID NO: 116）示於下文。
LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKS
在實施例中，如本文所提供的RBD可以在N末端或C末端延伸多至1個胺基酸、多至5個胺基酸、多至10個胺基酸、多至15個胺基酸、多至20個胺基酸、多至25個胺基酸或多至30個胺基酸。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的RBD具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的RBD。所述RBD與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的RBD的胺基酸序列相比可以具有多至約1個胺基酸、多至約2個胺基酸、多至約3個胺基酸、多至約4個胺基酸、多至約5個胺基酸、多至約10個胺基酸、多至約15個胺基酸、多至約20個胺基酸、多至約25個胺基酸、或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述RBD與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的RBD相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述CoV S多肽在RBD中具有至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個突變。在實施例中，所述RBD可以含有如表1C中所示的修飾的任何組合。
表 1C
對 RBD(SEQ ID NO: 126) 的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸331-527和SEQ ID NO: 2的胺基酸318-514
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 在 SEQ ID NO: 2 內的位置 在 SEQ ID NO: 126 內的位置 潛在修飾
339 326 9 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸 -              突變成組胺酸
346 333 16 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成絲胺酸
368 355 38 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
371 358 41 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
373 360 43 -              突變成脯胺酸
375 362 45 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
376 363 46 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸
405 392 75 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
408 395 78 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
417 404 87 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成蘇胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
432 419 102 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
439 426 109 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
440 427 110 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
444 431 114 -              突變成蘇胺酸 -              突變成絲胺酸
445 432 115 -              突變成脯胺酸
446 433 116 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
452 439 122 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸
453 440 123 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
460 447 130 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
477 464 147 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
478 465 148 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
484 471 154 -              突變成丙胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸 -              突變成麩醯胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸
486 473 156 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
490 477 160 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
493 480 163 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
494 481 164 -              突變成脯胺酸
496 483 166 -              突變成絲胺酸 -              突變成蘇胺酸
498 485 168 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
501 488 171 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
505 492 175 -              突變成組胺酸
CoV S 多肽抗原 - 對 SD1/2 的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 122的胺基酸序列的SD1/2的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸542-681或SEQ ID NO: 2的胺基酸529-668。
所述SD1/2的胺基酸序列（SEQ ID NO: 122）示於下文。
NFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSP
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的SD1/2具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的SD1/2。所述SD1/2與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的SD1/2的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述SD1/2與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的SD1/2相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述CoV S多肽在SD1/2中具有至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個突變。在實施例中，所述SD1/2可以含有如表1D中所示的修飾的任何組合。
表 1D
對 SD1/2(SEQ ID NO: 122) 的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸542-681或SEQ ID NO: 2的胺基酸529-668
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 在 SEQ ID NO: 2 內的位置 在 SEQ ID NO: 122 內的位置 潛在修飾
547 534 6 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
570 557 29 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸
604 591 63 -              突變成異白胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成β支鏈胺基酸
613 600 72 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
614 601 73 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸
639 626 98 -              突變成擷胺酸 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸
655 642 114 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
658 645 117 -              突變成絲胺酸
677 664 136 -              突變成組胺酸
679 666 138 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
681 668 140 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
547 534 6 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
570 557 29 -              突變成天門冬胺酸 -              突變成麩胺酸
613 600 72 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
614 601 73 -              突變成甘胺酸 -              突變成丙胺酸
655 642 114 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
677 664 136 -              突變成組胺酸
679 666 138 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
CoV S 多肽抗原 - 對弗林蛋白酶切割位點的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有通過一個或多個突變滅活的弗林蛋白酶位點（RRAR），其對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸682-685或SEQ ID NO: 2的胺基酸669-672。弗林蛋白酶切割位點的滅活防止弗林蛋白酶切割CoV S多肽。在實施例中，本文所述的含有滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽被表現為單鏈。
在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的胺基酸中一個或多個突變為任何天然胺基酸。在實施例中，所述胺基酸是L-胺基酸。胺基酸的非限制性例子包括丙胺酸、精胺酸、甘胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、擷胺酸、異白胺酸、白胺酸、酪胺酸、色胺酸和苯丙胺酸。
在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的胺基酸中的一個或多個突變為麩醯胺酸。在實施例中，1、2、3或4個胺基酸可以突變為麩醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的一個突變為麩醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的兩個突變為麩醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的三個突變為麩醯胺酸。
在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的胺基酸中的一個或多個突變為丙胺酸。在實施例中，1、2、3或4個胺基酸可以突變為丙胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的一個突變為丙胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的兩個突變為丙胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的三個突變為丙胺酸。
在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的胺基酸中的一個或多個突變為甘胺酸。在實施例中，1、2、3或4個胺基酸可以突變為甘胺酸。在實施例中，天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的一個突變為甘胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的兩個突變為甘胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的三個突變為甘胺酸。
在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的胺基酸中的一個或多個突變為天門冬醯胺酸。例如，1、2、3或4個胺基酸可以突變為天門冬醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的一個突變為天門冬醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的兩個突變為天門冬醯胺酸。在實施例中，構成天然弗林蛋白酶切割位點的精胺酸中的三個突變為天門冬醯胺酸。
包含在所述CoV S多肽內的滅活的弗林蛋白酶位點的胺基酸序列的非限制性例子見於表1E中。
表 1E
弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列 有活性或無活性的弗林蛋白酶切割位點
RRAR (SEQ ID NO: 6) 有活性
QQAQ (SEQ ID NO: 7) 無活性
QRAR (SEQ ID NO: 8) 無活性
RQAR (SEQ ID NO: 9) 無活性
RRAQ (SEQ ID NO: 10) 無活性
QQAR (SEQ ID NO: 11) 無活性
RQAQ (SEQ ID NO: 12) 無活性
QRAQ (SEQ ID NO: 13) 無活性
NNAN (SEQ ID NO: 14) 無活性
NRAR (SEQ ID NO: 15) 無活性
RNAR (SEQ ID NO: 16) 無活性
RRAN (SEQ ID NO: 17) 無活性
NNAR (SEQ ID NO: 18) 無活性
RNAN (SEQ ID NO: 19) 無活性
NRAN (SEQ ID NO: 20) 無活性
AAAA (SEQ ID NO: 21) 無活性
ARAR (SEQ ID NO: 22) 無活性
RAAR (SEQ ID NO: 23) 無活性
RRAA (SEQ ID NO: 24) 無活性
AAAR (SEQ ID NO: 25) 無活性
RAAA (SEQ ID NO: 26) 無活性
ARAA (SEQ ID NO: 27) 無活性
GGAG (SEQ ID NO: 28) 無活性
GRAR (SEQ ID NO: 29) 無活性
RGAR (SEQ ID NO: 30) 無活性
RRAG (SEQ ID NO: 31) 無活性
GGAR (SEQ ID NO: 32) 無活性
RGAG (SEQ ID NO: 33) 無活性
GRAG (SEQ ID NO: 34) 無活性
GSAS (SEQ ID NO: 97) 無活性
GSGA (SEQ ID NO: 111) 無活性
在實施例中，代替有活性的弗林蛋白酶切割位點（SEQ ID NO: 6），本文所述的CoV S多肽含有滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，滅活的弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列由SEQ ID NO: 7-34或SEQ ID NO: 97中的任一個表示。在實施例中，滅活的弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列為QQAQ（SEQ ID NO: 7）。在實施例中，滅活的弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列為GSAS（SEQ ID NO: 97）。在實施例中，滅活的弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列為GSGA（SEQ ID NO: 111）。在實施例中，滅活的弗林蛋白酶切割位點的胺基酸序列為GG、GGG（SEQ ID NO: 127）、GGGG（SEQ ID NO: 128）或GGGGG（SEQ ID NO: 129）。
CoV S 多肽抗原 - 對 S2 次單元的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的S2次單元的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸686-1273或SEQ ID NO: 2的胺基酸673-1260。
所述S2次單元的胺基酸序列（SEQ ID NO: 120）示於下文。
SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S2次單元具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的S2次單元。所述S2次單元與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S2次單元的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個、或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述S2次單元與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的S2次單元相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述S2次單元可以含有如表1F中所示的修飾的任何組合。
表 1F
對 S2 （ SEQ ID NO: 120 ）的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸686-1273和SEQ ID NO: 2的胺基酸673-1260
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 在 SEQ ID NO: 2 內的位置 在 SEQ ID NO: 120 內的位置 可能的修飾
689-698 676-685 4-13 -              多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約6個、多至約7個、多至約8個、多至約9個或多至約10個胺基酸的缺失
701 688 16 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成蘇胺酸
704 691 19 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸
715-724 702-711 30-39 -              多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約6個、多至約7個、多至約8個、多至約9個或多至約10個胺基酸的缺失
716 703 31 -              突變成β支鏈胺基酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成異白胺酸
764 751 79 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
788-806 775-793 103-121 -              多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約6個、多至約7個、多至約8個、多至約9個、多至約10個、多至約11個、多至約12個、多至約13個、多至約14個、多至約15個、多至約16個、多至約17個、多至約18個或多至約19個胺基酸的缺失
796 783 111 -              突變成酪胺酸 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成色胺酸
819-828 806-815 134-143 -              多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約6個、多至約7個、多至約8個、多至約9個或多至約10個胺基酸的缺失
856 843 171 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
859 846 174 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
888 875 203 -              突變成白胺酸 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸
950 937 265 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
954 941 269 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸
969 956 284 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
981 968 296 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
982 969 297 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸 -              突變成蘇胺酸
986 973 301 -              突變成脯胺酸 -              突變成甘胺酸
987 974 302 -              突變成脯胺酸 -              突變成甘胺酸
1027 1014 342 -              突變成異白胺酸 -              突變成擷胺酸 -              突變成絲胺酸
1071 1058 386 -              突變成組胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成離胺酸
1118 1105 433 -              突變成組胺酸 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
1176 1163 491 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
1199 1186 514 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
1214-1237 1201-1224 1-24 -              TM的一個或多個胺基酸的缺失
1238-1273 1225-1260 1-36 -              CD的一個或多個胺基酸的缺失
在實施例中，所述CoV S多肽含有缺失，其對應于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸676-685內的一個或多個缺失。在實施例中，天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸676-685中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸缺失。在實施例中，胺基酸676-685內的胺基酸的缺失是連續的，例如胺基酸676和677缺失或者胺基酸680和681缺失。在實施例中，胺基酸676-685內的胺基酸的缺失是非連續的，例如胺基酸676和680缺失或者胺基酸677和682缺失。在實施例中，含有對應於胺基酸676-685內的一個或多個缺失的缺失的CoV S多肽具有選自SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 63的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有缺失，其對應于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸702-711內的一個或多個缺失。在實施例中，天然SARS-CoV-2刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸702-711中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸缺失。在實施例中，胺基酸702-711內的胺基酸的一個或多個缺失是連續的，例如胺基酸702和703缺失或者胺基酸708和709缺失。在實施例中，胺基酸702-711內的胺基酸的缺失是非連續的，例如胺基酸702和704缺失或者胺基酸707和710缺失。在實施例中，含有對應於胺基酸702-711內的一個或多個缺失的缺失的CoV S多肽具有選自SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有缺失，其對應于天然CoV S多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸775-793內的一個或多個缺失。在實施例中，天然SARS-CoV-2刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸775-793中的多至約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個胺基酸缺失。在實施例中，胺基酸775-793內的胺基酸的一個或多個缺失是連續的，例如胺基酸776和777缺失或者胺基酸780和781缺失。在實施例中，胺基酸775-793內的胺基酸的缺失是非連續的，例如胺基酸775和790缺失或者胺基酸777和781缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有融合肽（SEQ ID NO: 104）的缺失，所述融合肽對應於SEQ ID NO: 2的胺基酸806-815。在實施例中，CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的融合肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸缺失。在實施例中，融合肽內的胺基酸的缺失是連續的，例如胺基酸806和807缺失或者胺基酸809和810缺失。在實施例中，融合肽內的胺基酸的缺失是非連續的，例如胺基酸806和808缺失或者胺基酸810和813缺失。在實施例中，含有對應于融合肽的一個或多個胺基酸的缺失的CoV S多肽具有選自SEQ ID NO: 66、77和105-108的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽在天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的Lys-973處含有突變。在實施例中，Lys-973突變為任何天然胺基酸。在實施例中，Lys-973突變為脯胺酸。在實施例中，Lys-973突變為甘胺酸。在實施例中，在胺基酸973處含有突變的CoV S多肽選自SEQ ID NO: 84-89、105-106和109-110。
在實施例中，所述CoV S多肽在天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的Val-974處含有突變。在實施例中，Val-974突變為任何天然胺基酸。在實施例中，Val-974突變為脯胺酸。在實施例中，Val-974突變為甘胺酸。在實施例中，在胺基酸974處含有突變的CoV S多肽選自SEQ ID NO: 84-89、105-106和109-110。
在實施例中，所述CoV S多肽在天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的Lys-973和Val-974處含有突變。在實施例中，Lys-973和Val-974突變為任何天然胺基酸。在實施例中，Lys-973和Val-974突變為脯胺酸。在實施例中，在胺基酸973和974處含有突變的CoV S多肽選自SEQ ID NO: 84-89、105-106、109-110、175、220和217-228。
CoV S 多肽抗原 - 對 S2 次單元 -HR1 結構域的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 119的胺基酸序列的HR1結構域的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸912-984或SEQ ID NO: 2的胺基酸889-971。
所述HR1結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 119）示於下文。
MAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR1結構域具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的HR1結構域。所述HR1結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR1結構域的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述HR1結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR1結構域相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，所述HR1結構域可以含有如表1G中所示的修飾的任何組合。
表 1G
對 HR1(SEQ ID NO: 119) 的修飾* SEQ ID NO: 1的胺基酸912-984和SEQ ID NO: 2的胺基酸889-971)
在 SEQ ID NO: 1 內的位置 在 SEQ ID NO: 2 內的位置 在 SEQ ID NO: 119 內的位置 可能的修飾
950 937 49 -              突變成天門冬醯胺酸 -              突變成麩醯胺酸
954 941 53 -              突變成組胺酸
969 956 68 -              突變成離胺酸 -              突變成精胺酸 -              突變成組胺酸
981 968 80 -              突變成苯丙胺酸 -              突變成酪胺酸 -              突變成色胺酸
982 969 81 -              突變成丙胺酸 -              突變成甘胺酸 -              突變成蘇胺酸
CoV S 多肽抗原 - 對 S2 次單元 -HR2 結構域的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 125的胺基酸序列的HR2結構域的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸1163-1213或SEQ ID NO: 2的胺基酸1150-1200。
所述HR2結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 125）示於下文。
DVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR2結構域具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的HR2結構域。所述HR2結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR2結構域的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述HR2結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的HR2結構域相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
CoV S 多肽抗原 - 對 TM 結構域的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 123的胺基酸序列的TM結構域的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸1214-1237或SEQ ID NO: 2的胺基酸1201-1224。
所述TM結構域的胺基酸序列（SEQ ID NO: 123）示於下文。
WYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCM
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的TM結構域具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的TM結構域。所述TM結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的TM結構域的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述TM結構域與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的TM結構域相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽缺少整個TM結構域。在實施例中，所述CoV S多肽包含TM結構域。
CoV S 多肽抗原 - 對 CT 的修飾
在實施例中，所述CoV S多肽含有對具有SEQ ID NO: 124的胺基酸序列的CT的一個或多個修飾，所述胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸1238-1273或SEQ ID NO: 2的胺基酸1225-1260。
所述CT的胺基酸序列（SEQ ID NO: 124）示於下文：
TSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
在實施例中，本文所述的CoV S多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的CT具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性的CT。所述CT與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的CT的胺基酸序列相比可以具有多至約1個胺基酸、多至約2個胺基酸、多至約3個胺基酸、多至約4個胺基酸、多至約5個胺基酸、多至約10個胺基酸、多至約15個胺基酸、多至約20個胺基酸、多至約25個胺基酸、或多至約30個胺基酸的缺失、插入或突變。所述CT與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的CT相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、或在約25個與30個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽缺少CT。在實施例中，所述CoV S多肽包含CT。
在實施例中，所述CoV S多肽包含TM和CT。在實施例中，所述CoV刺突（S）多肽含有一個或多個胺基酸從跨膜和胞質尾（TMCT）（對應於胺基酸1201-1260）中的缺失。所述TMCT的胺基酸序列由SEQ ID NO: 39表示。在實施例中，具有TMCT的一個或多個殘基的缺失的CoV S多肽具有增強的蛋白質表現。在實施例中，具有來自TMCT的一個或多個缺失的CoV刺突（S）多肽具有選自SEQ ID NO: 40、41、42、52、54、59、61、88和89的胺基酸序列。在實施例中，具有來自TM-CD的一個或多個缺失的CoV S多肽由選自SEQ ID NO: 39、43、53和60的分離的核酸序列編碼。
CoV S 多肽抗原 - 突變的非限制性組合
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56和57的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸131和132的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56和131的缺失。在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸57和131的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56、57和131的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56和132的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸57和132的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56、57和132的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2）的胺基酸56、57、131和132的缺失。
在實施例中，所述CoV S多肽含有使CoV S多肽的融合前構形穩定的突變。在實施例中，所述CoV S多肽含有使融合前構形穩定的脯胺酸或甘胺酸取代。這種策略已經用於開發融合前穩定的MERS-CoV S蛋白，如以下文獻中所述，所述文獻各自通過引用以其整體併入本文：Proc Natl Acad Sci USA. 2017年8月29日;114(35):E7348-E7357；Sci Rep. 2018年10月24日;8(1):15701；美國公開號2020/0061185；以及PCT申請號PCT/US2017/058370。
在實施例中，所述CoV S多肽含有在Lys-973和Val-974處的突變以及滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，所述CoV S多肽含有Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變、具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。含有在Lys-973和Val-974處的突變以及滅活的弗林蛋白酶切割位點的示例性CoV S多肽描繪在 圖 8中。在實施例中，含有Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 86或87的胺基酸序列和SEQ ID NO: 96的核酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有在Lys-973和Val-974處的突變、滅活的弗林蛋白酶切割位點、以及融合肽的一個或多個胺基酸的缺失。在實施例中，所述CoV S多肽含有Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變、具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、以及融合肽的一個或多個胺基酸的缺失。在實施例中，含有Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變、滅活的弗林蛋白酶切割位點、以及融合肽的一個或多個胺基酸的缺失的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 105或106的胺基酸序列。在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Leu-5至苯丙胺酸的突變、Thr-7至天門冬醯胺酸的突變、Pro-13至絲胺酸的突變、Asp-125至酪胺酸的突變、Arg-177至絲胺酸的突變、Lys-404至蘇胺酸的突變、Glu-471至離胺酸的突變、Asn-488至酪胺酸的突變、His-642至酪胺酸的突變、Thr-1014至異白胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Trp-139至半胱胺酸的突變、Leu-439至精胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 1），所述CoV S多肽含有Trp-152至半胱胺酸的突變、Leu-452至精胺酸的突變、Ser-13至異白胺酸的突變、Lys-986和Val-987至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Lys-404至蘇胺酸或天門冬醯胺酸的突變、Glu-471至離胺酸的突變、Asn-488至酪胺酸的突變、Leu-5至苯丙胺酸的突變、Asp-67至丙胺酸的突變、Asp-202至甘胺酸的突變、胺基酸229-231中的一個或多個的缺失、Arg-233至異白胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，具有Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 112的胺基酸序列。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Asp-601至甘胺酸的突變、Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，具有Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 113的胺基酸序列。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有胺基酸56、57和131的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）、GSAS（SEQ ID NO: 96）或GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，具有胺基酸56、57和131的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 114的胺基酸序列。在實施例中，具有胺基酸56、57和131的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）或GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 136的胺基酸序列。在實施例中，具有胺基酸56、57和131的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 138的胺基酸序列。在一些實施例中，具有SEQ ID NO: 114或SEQ ID NO: 136的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 135的核酸序列的核酸編碼。在一些實施例中，具有SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 138的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 139的序列的核酸編碼。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有胺基酸56、57和132的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，具有胺基酸56、57和132的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 114的胺基酸序列。
在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 2），所述CoV S多肽含有Asn-488至酪胺酸的突變、Asp-67至丙胺酸的突變、Leu-229至組胺酸的突變、Asp-202至甘胺酸的突變、Lys-404至天門冬醯胺酸的突變、Glu-471至離胺酸的突變、Ala-688至擷胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。在實施例中，具有Asn-488至酪胺酸的突變、Asp-67至丙胺酸的突變、Leu-229至組胺酸的突變、Asp-202至甘胺酸的突變、Lys-404至天門冬醯胺酸的突變、Glu-471至離胺酸的突變、Ala-688至擷胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GSAS（SEQ ID NO: 96）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 115的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H、T703I、S969A和D1105H，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有GG的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有GG的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述具有一個或多個修飾的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 144的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 144的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 145的序列的核酸編碼。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述具有一個或多個修飾的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 144的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 144的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 145的序列的核酸編碼。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 150的序列的核酸編碼。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、K404N、E471K、N488Y、L5F、D67A、D202G、L229H、D601G、A688V和胺基酸229-231的缺失，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列。在實施例中，所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有GG的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、K404N、E471K和N488K，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、K404N、E471K和N488Y。在實施例中，所述CoV S多肽是具有一個或多個修飾的CoV S多肽的RBD，所述一個或多個修飾選自K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、K404N、E471K和N488K，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽是具有一個或多個修飾的CoV S多肽的RBD，所述一個或多個修飾選自K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、K404N、E471K和N488Y，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點、D601G、E404N、E471K和N488Y。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點和D601G突變，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 133的胺基酸序列，所述修飾選自：K973P、V974P、具有GG的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點和D601G突變。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GG）、K404N、E471K、N488K、D67A、D202G、L229H、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 132或SEQ ID NO: 141的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7）或GG）、K404N、E471K、N488K、D67A、D202G、L229H、D601G和A688V。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 132的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 131的核酸序列的核酸編碼。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 132的胺基酸序列的CoV S多肽由具有SEQ ID NO: 142的核酸序列的核酸編碼。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、W139C和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述包含K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、W139C和L439R修飾的CoV S多肽表現為含有具有SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽。在實施例中，所述CoV S多肽包含選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、D601G、W139C和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽包含K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、D601G、W139C和L439R修飾，並且表現為含有具有SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽。
在實施例中，所述CoV S多肽包含選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點、D601G、L5F、D67A、D202G、胺基酸229-231的缺失、R233I、K404N、E471K、N488Y和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、W139C、S481P、D601G和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、W139C、D601G和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、W139C、S481P和D601G，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 153的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、W139C、S481P、D601G和L439R。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的CoV S多肽包含具有SEQ ID NO: 117的胺基酸序列的信號肽。在實施例中，所述具有SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的CoV S多肽包含具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、E471K、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 156的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、E471K、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽包含具有SEQ ID NO: 154或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、E471K、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、S464N、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽具有SEQ ID NO: 158的胺基酸序列，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、S464N、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述含有一個或多個修飾的CoV S多肽包含SEQ ID NO: 154的信號肽，所述一個或多個修飾選自：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、T82I、D240G、S464N、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸131的缺失、N488Y突變、A557D突變、D601G突變、P668H突變、T703I突變、S969A突變和D1105H突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸132的缺失、N488Y突變、A557D突變、D601G突變、P668H突變、T703I突變、S969A突變和D1105H突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、D67A突變、L229H突變、R233I突變、A688V突變、N488Y突變、K404N突變、E471K突變和D601G突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K973P、V974P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、L5F突變、T7N突變、P13S突變、D125Y突變、R177S突變、K404T突變、E471K突變、N488Y突變、D601G突變、H642Y突變、T1014I突變和T1163F突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K986P、V987P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、S13I突變、W152C突變和L452R突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K986P、V987P、滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））、S13I突變、W152C突變和L452R突變，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列、缺乏N末端信號肽的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K986P、V987P、A67V、T95I、G142D、L212I、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、H679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F，胺基酸69、70、143、144、145和211的缺失，以及胺基酸EPE在胺基酸214與215之間的插入，任選地其中滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7），其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。在實施例中，具有一個或多個上述修飾的CoV S多肽缺乏N末端信號肽。在實施例中，所述CoV S多肽具有SEQ ID NO: 159的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有選自以下的一個或多個修飾：K986P、V987P、A67V、T95I、G142D、L212I、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、H679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F，任選地其中滅活的弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7），其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。在實施例中，具有一個或多個上述修飾的CoV S多肽缺乏N末端信號肽。在實施例中，所述CoV S多肽具有SEQ ID NO: 160的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽是SEQ ID NO: 159或167中的任一個。在實施例中，所述CoV S多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO: 159或167中的任一個具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性。在實施例中，所述CoV S多肽是SEQ ID NO: 160或170中的任一個。在實施例中，所述CoV S多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO: 160或170中的任一個具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%同一性。在實施例中，所述CoV S多肽由SEQ ID NO: 161、162、163、164、165、166、168、169、171和172中任一個的核酸編碼。在實施例中，SEQ ID NO: 160、170、159或167中任一個的CoV S多肽缺乏N末端信號肽。例如，CoV S多肽包含SEQ ID NO: 160、170、159或167的多肽序列，所述序列在MFVFLVLLPLVSS（SEQ ID NO: 5）的C末端。
在實施例中，所述CoV S多肽含有如下表中描述的一組修飾，其中所述修飾相對於SEQ ID NO: 1編號。在實施例中，所述CoV S多肽含有如下表中描述的一組修飾；滅活的弗林蛋白酶切割位點（任選地其中弗林蛋白酶切割位點是QQAQ（SEQ ID NO: 7））以及K986P和V987P修飾，其中所述修飾相對於SEQ ID NO: 1編號。
   修飾組合1 修飾組合2 修飾組合3 修飾組合4 修飾組合5 修飾組合6
突變 T19R T95I G142D Y145H E156G A222V K417N L452R T478K D614G P681R D950N A67V T95I,G142D G339D S371L S373P S375F K417N,E484K T478K,N501YN440K,Q493K G446S,Q498R Y505H, T547K D614G,H655Y N679K, P681HN764K,D796Y N856J,Q954H N969K,L981 T19R G142D E156G K417N N439K L452R T478K E484K N501Y D614G P681R D950N W258I W64H H66W D213V L214R T19R G142D E156G K417N N439K L452R T478K E484K N501Y D614G P681R D950N W258I T19R G142D E156G K417N L452R T478K E484Q D614G P681R D950N D80A D215G L242H K417N E484K N501Y D614G A701V
缺失 插入 F157 del R158 del H69-V70 del 143-145del 211-212del EPE在214與215之間插入 F157 del R158 del F157 del R158 del F157 del R158 del
在實施例中，所述CoV刺突（S）多肽包含多肽連接子。在實施例中，所述多肽連接子含有甘胺酸和絲胺酸。在實施例中，所述連接子具有約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%的甘胺酸。
在實施例中，所述多肽連接子具有重複序列(SGGG) n（SEQ ID NO: 91），其中n是1至50的整數（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50）。在實施例中，所述多肽連接子具有對應於SEQ ID NO: 90的胺基酸序列。
在實施例中，所述多肽連接子具有重複序列(GGGGS) n（SEQ ID NO: 93），其中n是1至50的整數（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50）。
在實施例中，所述多肽連接子具有重複序列(GGGS) n（SEQ ID NO: 92），其中n是1至50的整數（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50）。
在多態樣，所述多肽連接子是聚(Gly)n連接子，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19或20。在其他實施例中，所述連接子選自：二肽、三肽和四肽。在實施例中，所述連接子是選自丙胺酸-絲胺酸（AS）、白胺酸-麩胺酸（LE）和絲胺酸-精胺酸（SR）的二肽。
在實施例中，所述多肽連接子包含天然存在的CoV S多肽或本文公開的CoV S多肽的1個與100個之間的連續胺基酸。在實施例中，所述多肽連接子具有對應於SEQ ID NO: 94的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV刺突（S）多肽包含折疊子。在實施例中，所述TMCT被折疊子替代。在實施例中，折疊子引起CoV刺突（S）多肽三聚化。在實施例中，所述折疊子是本領域已知的胺基酸序列。在實施例中，所述折疊子具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列。在實施例中，所述折疊子是T4次要纖維蛋白（fibritin）三聚化基序。在實施例中，T4次要纖維蛋白三聚化結構域具有SEQ ID NO: 103的胺基酸序列。在實施例中，所述折疊子的胺基酸序列通過多肽連接子與CoV刺突（S）多肽隔開。多肽連接子的非限制性例子見於整個本公開文本。
在實施例中，本公開文本提供了包含冠狀病毒S蛋白的片段的CoV S多肽以及包含所述多肽的奈米顆粒和疫苗。在實施例中，冠狀病毒S蛋白的片段的長度在10與1500個胺基酸之間（例如長度為約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、約1000、約1050、約1100、約1150、約1200、約1250、約1300、約1350、約1400、約1450或約1500個胺基酸）。在實施例中，所述冠狀病毒S蛋白的片段選自受體結合結構域（RBD）、次結構域1、次結構域2、上螺旋、融合肽、連接區、七肽重複區1、中央螺旋、七肽重複區2、NTD和TMCT。
在實施例中，所述CoV S多肽包含RBD和次結構域1。在實施例中，包含RBD和次結構域1的CoV S多肽是SEQ ID NO: 1的胺基酸319至591。
在實施例中，所述CoV S多肽含有冠狀病毒S蛋白的片段，其中所述冠狀病毒S蛋白的片段是RBD。RBD的非限制性例子包括SARS-CoV-2的RBD（胺基酸序列 = SEQ ID NO: 69）、SARS的RBD（胺基酸序列 = SEQ ID NO: 70）和MERS的RBD（胺基酸序列 = SEQ ID NO: 71）。
在實施例中，所述CoV S多肽含有通過多肽連接子連接的兩個或更多個RBD。在實施例中，所述多肽連接子具有SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 94的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個RBD。
在一些實施例中，所述CoV S多肽含有通過多肽連接子連接的兩個或更多個SARS-CoV-2 RBD。在實施例中，含有兩個或更多個SARS-CoV-2 RBD的抗原具有對應於SEQ ID NO: 72-75之一的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有SARS-CoV-2 RBD和SARS RBD。在實施例中，所述CoV S多肽包含SARS-CoV-2 RBD和SARS RBD，其中各RBD由多肽連接子分開。在實施例中，包含SARS-CoV-2 RBD和SARS RBD的CoV S多肽具有選自SEQ ID NO: 76-79的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S多肽含有SARS-CoV-2 RBD和MERS RBD。在實施例中，所述CoV S多肽包含SARS-CoV-2 RBD和MERS RBD，其中各RBD由多肽連接子分開。
在實施例中，所述CoV S多肽包含SARS RBD和MERS RBD。在實施例中，所述CoV S多肽包含SARS RBD和MERS RBD，其中各RBD由多肽連接子分開。
在實施例中，所述CoV S多肽包含SARS-CoV-2 RBD、SARS RBD和MERS RBD。在實施例中，所述CoV S多肽含有SARS-CoV-2 RBD、SARS RBD和MERS RBD，其中各RBD由多肽連接子分開。在實施例中，包含SARS-CoV-2 RBD、SARS RBD和MERS RBD的CoV S多肽具有選自SEQ ID NO: 80-83的胺基酸序列。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽表現為具有N末端信號肽。在實施例中，所述N末端信號肽具有SEQ ID NO: 5（MFVFLVLLPLVSS）的胺基酸序列。在實施例中，所述N末端信號肽具有SEQ ID NO: 117（MFVFLVLLPLVSI）的胺基酸序列。在實施例中，所述N末端信號肽具有SEQ ID NO: 154（MFVFFVLLPLVSS）的胺基酸序列。在實施例中，所述N末端信號肽具有SEQ ID NO: 193（MFGFLVLLPLVSS）的胺基酸序列。在實施例中，所述信號肽可以被使得能夠表現CoV S蛋白的任何信號肽替代。在實施例中，CoV S蛋白信號肽胺基酸中的一個或多個可以缺失或突變。保持起始的甲硫胺酸殘基以起始表現。在實施例中，所述CoV S多肽由選自以下的核酸序列編碼：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214和SEQ ID NO: 216。在實施例中，相對于天然CoV刺突（S）信號多肽（SEQ ID NO: 5），所述CoV S多肽的N末端信號肽在Ser-13處含有突變。在實施例中，Ser-13突變為任何天然胺基酸。在實施例中，Ser-13突變為丙胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、白胺酸、蘇胺酸或擷胺酸。在實施例中，Ser-13突變為異白胺酸。
所述CoV S蛋白在宿主細胞中表現後，N末端信號肽被切割以提供成熟CoV蛋白序列（SEQ ID NO: 2、4、38、41、44、48、51、54、58、61、63、65、67、73、75、78、79、82、83、85、87、89、106、110、132、133、114、138、141、144、147、151、153、156、158、174、175、176、181-184、186、188、190、195、217-228和233-236）。在實施例中，所述信號肽被宿主細胞蛋白酶切割。在多態樣，可以從宿主細胞中分離全長蛋白質，隨後切割信號肽。
在表現和純化期間從具有對應於SEQ ID NO: 1、3、36、40、42、46、49、52、56、59、62、64、66、72、74、76、77、80、81、84、86、87、105、107、88、109、130、134、136、137、140、143、146、149、152、155、157、159、160、173、177-180、185、189、191、194、200、203、205、207、209、211、213、215和229-232的胺基酸序列的CoV刺突（S）多肽中切割信號肽後，獲得具有選自SEQ ID NO: 2、4、38、41、44、48、51、54、58、61、63、65、67、73、75、78、79、82、83、85、106、108、89和110、112-115、132、133、114、138、141、144、147、151、153、156、158、174、175、176、181-184、186、188、190、195、217-228和233-236的胺基酸序列的成熟多肽，並且將其用於產生CoV S奈米顆粒疫苗或CoV S奈米顆粒。
有利地，相對于天然CoV刺突（S）蛋白，所公開的CoV S多肽可以具有增強的蛋白質表現和穩定性。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽含有相對于天然冠狀病毒S蛋白（SEQ ID NO: 2）的進一步修飾。在實施例中，本文所述的冠狀病毒S蛋白展現出與天然冠狀病毒S蛋白至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少99%的同一性。熟習此項技術者將使用已知技術來計算重組冠狀病毒S蛋白與天然蛋白或本文所述的任何CoV S多肽的同一性百分比。例如，可以使用可線上獲得的工具CLUSTALW2或基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）來計算同一性百分比。可以將以下默認參數用於CLUSTALW2配對比對：蛋白質權重矩陣 = Gonnet；空位開放 = 10；空位延伸 = 0.1。
在實施例中，本文所述的CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 181-184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 217-228和SEQ ID NO: 233-236中任一個的胺基酸序列的CoV S多肽是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的。CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 181-184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 217-228和SEQ ID NO: 233-236中任一個的胺基酸序列的CoV S多肽的胺基酸序列相比可以具有多至約1個、多至約2個、多至約3個、多至約4個、多至約5個、多至約10個、多至約15個、多至約20個、多至約25個、多至約30個、多至約35個、多至約40個、多至約45個或多至約50個胺基酸的缺失、插入或突變。CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 181-184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 217-228和SEQ ID NO: 233-236中任一個的胺基酸序列的CoV S多肽相比可以具有在約1個與約5個之間的胺基酸、在約3個與約10個之間的胺基酸、在約5個與10個之間的胺基酸、在約8個與12個之間的胺基酸、在約10個與15個之間的胺基酸、在約12個與17個之間的胺基酸、在約15個與20個之間的胺基酸、在約18個與23個之間的胺基酸、在約20個與25個之間的胺基酸、在約22個與約27個之間的胺基酸、在約25個與30個之間的胺基酸、在約30個與35個之間的胺基酸、在約35個與40個之間的胺基酸、在約40個與45個之間的胺基酸或在約45個與50個之間的胺基酸的缺失、插入或突變。在實施例中，本文所述的CoV S多肽與具有SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 181-184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 217-228和SEQ ID NO: 233-236中任一個的胺基酸序列的冠狀病毒S多肽相比包含約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個或約25個取代。
在實施例中，所述冠狀病毒S多肽在N末端、C末端、或N末端和C末端兩者處延伸。在多態樣，所述延伸物是對諸如純化或檢測等功能有用的標籤。在多態樣，所述標籤含有表位。例如，所述標籤可以是多麩胺酸標籤、FLAG標籤、HA標籤、多His標籤（具有約5-10個組胺酸）（SEQ ID NO: 101）、六組胺酸標籤（SEQ ID NO: 100）、8X-His標籤（具有八個組胺酸）（SEQ ID NO: 102）、Myc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶標籤、綠色螢光蛋白標籤、麥芽糖結合蛋白標籤、硫氧還蛋白標籤或Fc標籤。在其他態樣，所述延伸物可以是與蛋白質融合以增強表現的N末端信號肽。儘管此類信號肽通常在細胞中表現期間被切割，但一些奈米顆粒可以含有具有完整信號肽的抗原。因此，當奈米顆粒包含抗原時，所述抗原可以含有延伸物，因此當摻入奈米顆粒中時可以是融合蛋白。出於計算與序列的同一性的目的，不包括延伸物。在實施例中，所述標籤是蛋白酶切割位點。蛋白酶切割位點的非限制性例子包括HRV3C蛋白酶切割位點、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、內肽酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、腸激酶、因子Xa、顆粒酶B、TEV蛋白酶和凝血酶。在實施例中，所述蛋白酶切割位點是HRV3C蛋白酶切割位點。在實施例中，所述蛋白酶切割位點包含SEQ ID NO: 98的胺基酸序列。
在實施例中，所述CoV S醣蛋白包含融合蛋白。在實施例中，所述CoV S醣蛋白包含N末端融合蛋白。在實施例中，所述CoV S醣蛋白包含C末端融合蛋白。在實施例中，所述融合蛋白涵蓋可用於蛋白質表現、純化或檢測的標籤。在實施例中，所述標籤是多His標籤（具有約5-10個組胺酸）、Myc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶標籤、綠色螢光蛋白標籤、麥芽糖結合蛋白標籤、硫氧還蛋白標籤、Strep標籤、Twin-Strep標籤或Fc標籤。在實施例中，所述標籤是Fc標籤。在實施例中，所述Fc標籤是單體、二聚體或三聚體的。在實施例中，所述標籤是六組胺酸標籤，例如含有六個組胺酸的多His標籤（SEQ ID NO: 100）。在實施例中，所述標籤是具有SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的Twin-Strep標籤。
在實施例中，所述CoV S多肽是包含另一種冠狀病毒蛋白的融合蛋白。在實施例中，所述另一種冠狀病毒蛋白來自相同的冠狀病毒。在實施例中，所述另一種冠狀病毒蛋白來自不同的冠狀病毒。
在多態樣，所述CoV S蛋白可以是截短的。例如，N末端可以被截短約10個胺基酸、約30個胺基酸、約50個胺基酸、約75個胺基酸、約100個胺基酸或約200個胺基酸。代替N末端或除了N末端之外，C末端可以是截短的。例如，C末端可以被截短約10個胺基酸、約30個胺基酸、約50個胺基酸、約75個胺基酸、約100個胺基酸或約200個胺基酸。出於計算與具有截短的蛋白質的同一性的目的，在蛋白質的剩餘部分上測量同一性。 含有 CoV 刺突（ S ）多肽的奈米顆粒
在實施例中，使用成熟CoV S多肽抗原來產生包含冠狀病毒S奈米顆粒的疫苗。在實施例中，本公開文本的奈米顆粒包含本文所述的CoV S多肽。在實施例中，本公開文本的奈米顆粒包含與洗滌劑核心締合的CoV S多肽。洗滌劑的存在通過形成組織並呈遞抗原的核心來促進奈米顆粒的形成。在實施例中，所述奈米顆粒以含有組裝成多寡聚醣蛋白-洗滌劑（例如PS80）奈米顆粒的CoV S多肽，其中頭部區域向外突出並且疏水區域和PS80洗滌劑形成被醣蛋白包圍的中央核心。在實施例中，所述CoV S多肽固有地含有或適於含有跨膜結構域以促進將所述蛋白質締合到洗滌劑核心中。在實施例中，所述CoV S多肽含有頭部結構域。 圖 10示出了本公開文本的CoV S多肽的示例性結構。主要地，CoV S多肽三聚體的跨膜結構域與洗滌劑締合；然而，多肽的其他部分也可以相互作用。有利地，所述奈米顆粒具有改善的對環境脅迫的抗性，使得由於在洗滌劑周圍組織蛋白質的多個拷貝，它們提供增強的穩定性和/或改善的對免疫系統的呈遞。
在實施例中，所述洗滌劑核心是非離子型洗滌劑核心。在實施例中，所述CoV S多肽與非離子型洗滌劑核心締合。在實施例中，所述洗滌劑選自聚山梨醇酯-20（PS20）、聚山梨醇酯-40（PS40）、聚山梨醇酯-60（PS60）、聚山梨醇酯-65（PS65）和聚山梨醇酯-80（PS80）。
在實施例中，所述洗滌劑是PS80。
在實施例中，所述CoV S多肽形成三聚體。在實施例中，所述CoV S多肽奈米顆粒由圍繞非離子型洗滌劑核心的多個多肽三聚體構成。在實施例中，所述奈米顆粒含有至少約1個或多個三聚體。在實施例中，所述奈米顆粒含有刺突蛋白的至少約5個三聚體至約30個三聚體。在實施例中，每個奈米顆粒可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或15、20、25或30個三聚體，包括在中間的所有值和範圍。本文公開的組合物可以含有具有不同數量的三聚體的奈米顆粒。例如，組合物可以含有三聚體的數量範圍從2-9的奈米顆粒；在實施例中，組合物中的奈米顆粒可以含有2-6個三聚體。在實施例中，所述組合物含有奈米顆粒的異源群體，每個奈米顆粒具有2至6個三聚體，或者每個奈米顆粒具有2至9個三聚體。在實施例中，所述組合物可以含有基本上均質的奈米顆粒群體。例如，所述群體可以含有約95%的具有5個三聚體的奈米顆粒。
本文公開的奈米顆粒的細微性具有一定範圍。在實施例中，本文公開的奈米顆粒的細微性的Z-ave尺寸範圍為從約20 nm至約60 nm、約20 nm至約50 nm、約20 nm至約45 nm、約20 nm至約35 nm、約20 nm至約30 nm、約25 nm至約35 nm、約25 nm至約45 nm、約30 nm至約120 nm、約30 nm至約80 nm、約30 nm至約60 nm、約30 nm至約65 nm、或從約30 nm至約50 nm。除非另外說明，否則使用Zetasizer NanoZS（Malvern，英國）通過動態光散射（DLS）來測量細微性（Z-ave）。
在實施例中，與包含野生型CoV S多肽的奈米顆粒相比，包含本文公開的CoV S多肽的奈米顆粒具有減小的細微性。在實施例中，所述CoV S多肽的細微性小至少約40%，例如細微性小至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%或至少約85%。
包含本文公開的CoV S多肽的奈米顆粒在尺寸、形狀和質量方面比包含野生型CoV S多肽的奈米顆粒更均勻。多分散性指數（PDI）是異源性的度量，除非另外說明，否則使用Malvern Setasizer通過動態光散射來測量。在實施例中，本文測量的顆粒具有從約0.1至約0.45，例如約0.1、約0.2、約0.25、約0.29、約0.3、約0.35、約0.40或約0.45的PDI。在實施例中，本文測量的奈米顆粒的PDI比包含SEQ ID NO: 2的野生型CoV S多肽的奈米顆粒的PDI小至少約25%，例如小至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%。
與野生型CoV S多肽或其奈米顆粒相比，所述CoV S多肽和包含所述多肽的奈米顆粒具有改善的熱穩定性。除非另外說明，否則使用差示掃描量熱法（DSC）來測量CoV S多肽的熱穩定性。轉變焓（ΔHcal）是使CoV S多肽展開所需的能量。在實施例中，與野生型CoV S多肽相比，所述CoV S多肽具有增加的ΔHcal。在實施例中，CoV S多肽的ΔHcal是野生型CoV S多肽的ΔHcal的約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍。
在本文公開的疫苗組合物中可以包括若干種奈米顆粒類型。在多態樣，所述奈米顆粒類型是以各向異性棒的形式，其可以是二聚體或單體。在其他態樣，所述奈米顆粒類型是球形寡聚體。在又其他態樣，所述奈米顆粒可以被描述為中間體奈米顆粒，其具有介於前兩種類型之間的沈降特性。可以通過控制產生過程期間的洗滌劑和蛋白質濃度來調節奈米顆粒類型的形成。可以通過測量沈降係數來確定奈米顆粒類型。
含有 CoV S 多肽抗原的奈米顆粒的產生
本公開文本的奈米顆粒是非天然存在的產物，其組分在自然界中不會一起出現。通常，本文公開的方法使用洗滌劑交換方法，其中使用第一洗滌劑來分離蛋白質，然後將所述第一洗滌劑交換成第二洗滌劑以形成奈米顆粒。
所述奈米顆粒中所含的抗原通常通過在宿主細胞中重組表現而產生。可以使用標準重組技術。在實施例中，使用杆狀病毒系統在昆蟲宿主細胞中表現所述CoV S多肽。在實施例中，所述杆狀病毒是組織蛋白酶-L敲除的杆狀病毒、幾丁質酶敲除的杆狀病毒。任選地，所述杆狀病毒是組織蛋白酶-L和幾丁質酶兩者的雙重敲除。在昆蟲細胞表現系統中可以獲得高水準的表現。昆蟲細胞的非限制性例子是草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（Sf）細胞（例如Sf9、Sf21）、粉紋夜蛾（Trichoplusiani）細胞（例如High Five細胞）和果蠅（Drosophila）S2細胞。在實施例中，在任何合適的宿主細胞中產生本文所述的CoV S多肽。在實施例中，所述宿主細胞是昆蟲細胞。在實施例中，所述昆蟲細胞是Sf9細胞。
典型的轉染和細胞生長方法可以用於培養所述細胞。可以根據本領域熟知的方法將載體（例如，包含編碼融合蛋白的多核苷酸的載體）轉染到宿主細胞中。例如，可以通過磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染和採用多胺轉染試劑的轉染來實現將核酸引入真核細胞中。在一個實施例中，所述載體是重組杆狀病毒。
使宿主細胞生長的方法包括但不限於分批、補料分批、連續和灌注細胞培養技術。細胞培養意指細胞在生物反應器（發酵室）中的生長和繁殖，在所述生物反應器中細胞繁殖並表現蛋白質（例如重組蛋白）以用於純化和分離。通常，細胞培養是在生物反應器中在無菌、受控的溫度和大氣條件下進行。生物反應器是可以監測環境條件如溫度、大氣、攪拌和/或pH的用於培養細胞的室。在一個實施例中，所述生物反應器是不銹鋼室。在另一個實施例中，所述生物反應器是預滅菌的塑膠袋（例如Cellbag®，Wave Biotech，新澤西州布裡奇沃特）。在其他實施例中，所述預滅菌的塑膠袋是約50 L至3500 L的袋。
含有 CoV 刺突（ S ）蛋白抗原的奈米顆粒的提取和純化
在宿主細胞生長後，可以使用洗滌劑和純化方案從宿主細胞中收穫蛋白質。一旦宿主細胞已生長48小時至96小時，則從培養基中分離細胞，並且添加含洗滌劑的溶液以溶解細胞膜，從而使蛋白質釋放到洗滌劑提取物中。Triton X-100和TERGITOL®壬基酚乙氧基化物（也稱為NP-9）各自是用於提取的優選洗滌劑。可以將洗滌劑添加至約0.1%至約1.0%的最終濃度。例如，所述濃度可以是約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.5%、約0.7%、約0.8%或約1.0%。範圍可以是約0.1%至約0.3%。在多態樣，所述濃度是約0.5%。
在其他態樣，不同的第一洗滌劑可以用於從宿主細胞中分離所述蛋白質。例如，所述第一洗滌劑可以是雙(聚乙二醇雙[咪唑基羰基])、壬苯醇醚-9、雙(聚乙二醇雙[咪唑基羰基])、BRIJ®聚乙二醇十二烷基醚35、BRIJ®聚乙二醇 (3) 十六烷基醚56、BRIJ®醇乙氧基化物72、BRIJ®聚乙二醇2硬脂基醚76、BRIJ®聚乙二醇單油烯基醚92V、BRIJ®聚氧乙烯 (10) 油烯基醚97、BRIJ®聚乙二醇十六烷基醚58P、CREMOPHOR® EL蓖麻油聚氧乙烯醚、十乙二醇單十二烷基醚、N-癸醯基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D吡喃葡萄醣苷、癸基β-D-麥芽吡喃醣苷、正十二烷醯基-N-甲基葡糖醯胺、正十二烷基α-D-麥芽醣苷、正十二烷基β-D-麥芽醣苷、正十二烷基β-D-麥芽醣苷、七乙二醇單癸基醚、七乙二醇單十二烷基醚、七乙二醇單十四烷基醚、正十六烷基β-D-麥芽醣苷、六乙二醇單十二烷基醚、六乙二醇單十六烷基醚、六乙二醇單十八烷基醚、六乙二醇單十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA -630、甲基-6-0-(N-庚基胺基甲醯基)-α-D-吡喃葡萄醣苷、九乙二醇單十二烷基醚、N-壬醯基-N-甲基葡糖胺、N-壬醯基N-甲基葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇單十二烷基醚、八乙二醇單十六烷基醚、八乙二醇單十八烷基醚、八乙二醇單十四烷基醚、辛基-β-D吡喃葡萄醣苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二醇單十二烷基醚、五乙二醇單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單十八烷基醚、五乙二醇單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯雙(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂草苷（Saponin from Quillaja bark）、SPAN® 20脫水山梨糖醇月桂酸酯、SPAN® 40脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、SPAN® 60脫水山梨糖醇硬脂酸酯、SPAN® 65脫水山梨糖醇三硬脂酸酯、SPAN® 80脫水山梨糖醇單油酸酯、SPAN® 85脫水山梨糖醇三油酸酯、TERGITOL®二級醇乙氧基化物15-S-12型、TERGITOL®二級醇乙氧基化物15-S-30型、TERGITOL®二級醇乙氧基化物15-S-5型、TERGITOL®二級醇乙氧基化物15-S-7型、TERGITOL®二級醇乙氧基化物15-S-9型、TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-10型、TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-4型、TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-40型、TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-7型、TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-9型、TERGITOL®支鏈二級醇乙氧基化物TMN-10型、TERGITOL®支鏈二級醇乙氧基化物TMN-6型、TRITON TMX-100聚乙二醇叔辛基苯基醚或其組合。
然後可以使用離心從細胞碎片中分離所述奈米顆粒。在實施例中，可以使用諸如採用氯化銫、蔗糖和碘克沙醇的梯度離心。其他技術可以用作替代或補充，例如標準純化技術，包括例如離子交換層析、親和層析和凝膠過濾層析。
例如，第一柱可以是離子交換層析樹脂，諸如FRACTOGEL® EMD基於甲基丙烯酸酯的聚合物珠TMAE（EMD Millipore）；第二柱可以是小扁豆（Lens culinaris）凝集素親和樹脂；並且第三柱可以是陽離子交換柱，諸如FRACTOGEL® EMD基於甲基丙烯酸酯的聚合物珠SO3（EMD Millipore）樹脂。在其他態樣，陽離子交換柱可以是MMC柱或Nuvia C Prime柱（Bio-Rad Laboratories, Inc）。優選地，本文公開的方法不使用洗滌劑提取柱；例如疏水相互作用柱。這樣的柱通常在純化期間用於去除洗滌劑，但可能對此處公開的方法產生負面影響。
含有 CoV S 多肽抗原的奈米顆粒的洗滌劑交換
為了形成奈米顆粒，用於從宿主細胞中提取蛋白質的第一洗滌劑基本上被第二洗滌劑替代以得到奈米顆粒結構。NP-9是優選的提取洗滌劑。通常，當通過HPLC測量時，所述奈米顆粒不含可檢測的NP-9。所述第二洗滌劑通常選自PS20、PS40、PS60、PS65和PS80。優選地，所述第二洗滌劑是PS80。
在特定態樣，使用親和層析以結合醣蛋白（經由其碳水化合物部分）來進行洗滌劑交換。例如，親和層析可以使用豆類凝集素柱。豆類凝集素是最初在植物中鑒定出的蛋白質，並且發現其與碳水化合物殘基特異性地且可逆地相互作用。參見例如，Sharon和Lis, “Legume lectins--a large family of homologous proteins,” FASEB J. 1990年11月;4(14):3198-208；Liener, “The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine,” Elsevier, 2012。合適的凝集素包括伴刀豆球蛋白A（con A）、豌豆凝集素、紅豆草凝集素和小扁豆凝集素。小扁豆凝集素由於其結合特性是用於洗滌劑交換的優選柱。凝集素柱可商購獲得；例如，Capto小扁豆凝集素可以從GE Healthcare獲得。在某些態樣，小扁豆凝集素柱可以使用重組凝集素。在分子水準上，認為碳水化合物部分與小扁豆凝集素結合，釋放蛋白質的胺基酸以在洗滌劑周圍聚結，導致形成洗滌劑核心，從而提供具有多個抗原拷貝（例如，醣蛋白寡聚體）的奈米顆粒，所述醣蛋白寡聚體可以是錨定在洗滌劑中的二聚體、三聚體或四聚體。在實施例中，所述CoV S多肽形成三聚體。在實施例中，所述CoV S多肽三聚體錨定在洗滌劑中。在實施例中，每個CoV S多肽奈米顆粒含有至少一個與非離子型核心締合的三聚體。
當在洗滌劑交換期間與蛋白質一起培育形成奈米顆粒時，洗滌劑在早期純化步驟期間可以以多至約0.1%（w/v）存在，並且使此量降低以獲得具有最佳穩定性的最終奈米顆粒。例如，所述非離子型洗滌劑（例如，PS80）可以是約0.005%（v/v）至約0.1%（v/v），例如約0.005%（v/v）、約0.006%（v/v）、約0.007%（v/v）、約0.008%（v/v）、約0.009%（v/v）、約0.01%（v/v）、約0.015%（v/v）、約0.02%（v/v）、約0.025%（v/v）、約0.03%（v/v）、約0.035%（v/v）、約0.04%（v/v）、約0.045%（v/v）、約0.05%（v/v）、約0.055%（v/v）、約0.06%（v/v）、約0.065%（v/v）、約0.07%（v/v）、約0.075%（v/v）、約0.08%（v/v）、約0.085%（v/v）、約0.09%（v/v）、約0.095%（v/v）或約0.1%（v/v）PS80。在實施例中，所述奈米顆粒含有約0.03%至約0.05% PS80。在實施例中，所述奈米顆粒含有約0.01%（v/v）PS80。
在實施例中，對經純化的CoV S多肽進行透析。在實施例中，在純化後進行透析。在實施例中，在包含磷酸鈉、NaCl和PS80的溶液中對所述CoV S多肽進行透析。在實施例中，包含磷酸鈉的透析溶液含有在約5 mM與約100 mM之間的磷酸鈉，例如約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM或約100 mM磷酸鈉。在實施例中，包含磷酸鈉的溶液的pH為約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4或約7.5。在實施例中，包含氯化鈉的透析溶液包含約50 mM NaCl至約500 mM NaCl，例如約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約110 mM、約120 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM、約310 mM、約320 mM、約330 mM、約340 mM、約350 mM、約360 mM、約370 mM、約380 mM、約390 mM、約400 mM、約410 mM、約420 mM、約430 mM、約440 mM、約450 mM、約460 mM、約470 mM、約480 mM、約490 mM或約500 mM NaCl。在實施例中，包含PS80的透析溶液包含約0.005%（v/v）、約0.006%（v/v）、約0.007%（v/v）、約0.008%（v/v）、約0.009%（v/v）、約0.01%（v/v）、約0.015%（v/v）、約0.02%（v/v）、約0.025%（v/v）、約0.03%（v/v）、約0.035%（v/v）、約0.04%（v/v）、約0.045%（v/v）、約0.05%（v/v）、約0.055%（v/v）、約0.06%（v/v）、約0.065%（v/v）、約0.07%（v/v）、約0.075%（v/v）、約0.08%（v/v）、約0.085%（v/v）、約0.09%（v/v）、約0.095%（v/v）或約0.1%（v/v）PS80。在實施例中，所述透析溶液包含約25 mM磷酸鈉（pH 7.2）、約300 mM NaCl和約0.01%（v/v）PS80。
可以使用如下蛋白質進行洗滌劑交換，將所述蛋白質如上文所討論地純化，並且純化、冷凍儲存，然後解凍以進行洗滌劑交換。
本文公開的組合物的穩定性可以按多種方式測量。在一種方法中，可以製備肽圖譜，以在設計成通過類比苛刻的儲存條件來脅迫奈米顆粒的各種處理後確定抗原蛋白的完整性。因此，穩定性的度量是與對照樣品相比脅迫樣品中抗原肽的相對豐度。例如，可以通過將含有CoV S多肽的奈米顆粒暴露於各種pH、蛋白酶、鹽、氧化劑（包括但不限於過氧化氫）、各種溫度、冷凍/解凍循環和攪拌來評價所述奈米顆粒的穩定性。 圖 12A- 圖 12B示出了BV2373（SEQ ID NO: 87）和BV2365（SEQ ID NO: 4）在多種脅迫條件下保持與hACE2結合。認為醣蛋白錨定在洗滌劑核心中的位置通過減少不希望的相互作用而提供增強的穩定性。例如，可以通過遮罩作用來實現針對基於蛋白酶的降解的改善的保護，由此以本文公開的摩爾比將醣蛋白錨定在核心中導致了空間位阻，從而阻斷蛋白酶進入。也可以通過監測完整蛋白質來測量穩定性。 圖 33和 圖 34比較了含有分別具有SEQ ID NO: 109和87的胺基酸序列的CoV多肽的奈米顆粒。 圖 34表明，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CoV S多肽在純化期間示出特別好的穩定性。 圖 34的多肽包含具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的弗林蛋白酶切割位點。 含有 CoV S 多肽抗原的疫苗組合物
本公開文本提供了例如在奈米顆粒中包含CoV S多肽的疫苗組合物。在多態樣，疫苗組合物可以包含具有抗原的奈米顆粒，所述抗原來自同一病毒物種的超過一種病毒株。在另一個實施例中，本公開文本提供了包含一個或多個容器的藥物包裝或套組，所述一個或多個容器裝有疫苗組合物的一種或多種組分。
本文公開的組合物可以預防性地或治療性地使用，但是通常將是預防性的。因此，本公開文本包括用於治療或預防感染的方法。所述方法涉及向受試者投予治療量或預防量的本公開文本的免疫原性組合物。優選地，藥物組合物是提供保護作用的疫苗組合物。在其他態樣，所述保護作用可以包括在一定百分比的暴露人群中改善與感染相關的症狀。例如，與未經處理/治療的受試者相比，所述組合物可以預防或減輕選自以下的一種或多種病毒疾病症狀：發熱、疲勞、肌肉疼痛、頭痛、喉嚨痛、嘔吐、腹瀉、皮疹、腎和肝功能受損的症狀、內出血和外出血。
可以在存在各種賦形劑、緩衝液等的情況下將所述奈米顆粒配製用於作為疫苗投予。例如，所述疫苗組合物可以含有磷酸鈉、氯化鈉和/或組胺酸。磷酸鈉可以按約10 mM至約50 mM、約15 mM至約25 mM、或約25 mM存在；在特定情況下，存在約22 mM的磷酸鈉。組胺酸可以以約0.1%（w/v）、約0.5%（w/v）、約0.7%（w/v）、約1%（w/v）、約1.5%（w/v）、約2%（w/v）或約2.5%（w/v）存在。氯化鈉（當存在時）可以為約150 mM。在某些組合物中，氯化鈉可以按較高濃度（例如從約200 mM至約500 mM）存在。在實施例中，氯化鈉以高濃度（包括但不限於約200 mM、約250 mM、約300 mM、約350 mM、約400 mM、約450 mM或約500 mM）存在。
在實施例中，本文所述的奈米顆粒在某些pH水準下具有改善的穩定性。在實施例中，所述奈米顆粒在微酸性pH水準下是穩定的。例如，所述奈米顆粒在微酸性pH（例如從pH 5.8至pH 7.0）下是穩定的。在實施例中，所述奈米顆粒和含有奈米顆粒的組合物在範圍從約pH 5.8至約pH 7.0的pH（包括約pH 5.9至約pH 6.8、約pH 6.0至約pH 6.5、約pH 6.1至約pH 6.4、約pH 6.1至約pH 6.3或約pH 6.2）下可以是穩定的。在實施例中，本文所述的奈米顆粒和組合物在中性pH（包括從約pH 7.0至約pH 7.4）下是穩定的。在實施例中，本文所述的奈米顆粒和組合物在微鹼性pH（例如從約pH 7.0至約pH 8.5、從約pH 7.0至約pH 8.0或從約pH 7.0至約pH 7.5，包括在中間的所有值和範圍）下是穩定的。 佐劑
在某些實施例中，本文公開的組合物可以與一種或多種佐劑組合以增強免疫反應。在其他實施例中，所述組合物是在沒有佐劑的情況下製備的，因此可用來作為無佐劑組合物投予。有利地，當作為單劑量投予時，本文公開的無佐劑組合物可以提供保護性免疫反應。誘導穩健的免疫反應的無鋁佐劑組合物尤其可用於約60歲及以上的成人。
基於鋁的佐劑
在實施例中，所述佐劑可以是鋁佐劑（alum）（例如AlPO 4或Al(OH) 3）。通常，所述奈米顆粒基本上結合至鋁佐劑。例如，所述奈米顆粒可以是至少80%結合、至少85%結合、至少90%結合或至少95%結合至鋁佐劑。通常，在組合物中，所述奈米顆粒是92%至97%結合至鋁佐劑。每劑存在的鋁佐劑的量通常在約400 µg至約1250 µg之間的範圍內。例如，所述鋁佐劑可以以每劑約300 µg至約900 µg、約400 µg至約800 µg、約500 µg至約700 µg、約400 µg至約600 µg或約400 µg至約500 µg的量存在。通常，對於120 µg蛋白奈米顆粒的劑量，鋁佐劑以約400 µg存在。 皂苷佐劑
含有皂苷的佐劑也可以與本文公開的免疫原組合。皂苷是源自皂樹（Quillaja saponaria Molina）樹皮的醣苷。通常，使用多步純化過程製備皂苷，從而產生多種級分。如本文所用，術語“來自皂樹的皂苷級分”一般用於描述皂樹的半純化或確定的皂苷級分或其基本上純的級分。 皂苷級分
用於產生皂苷級分的若干種方法是合適的。級分A、B和C描述於美國專利號6,352,697中，並且可以如下製備。通過層析分離來自Quil A（一種粗水性皂樹提取物）的親脂級分，並且將其用水中的70%乙腈洗脫以回收親脂級分。然後通過半製備型HPLC分離這種親脂級分，使用在酸性水中的從25%至60%乙腈的梯度進行洗脫。在本文中稱為“級分A”或“QH-A”的級分是或對應於在大約39%乙腈下洗脫的級分。在本文中稱為“級分B”或“QH-B”的級分是或對應於在大約47%乙腈下洗脫的級分。在本文中稱為“級分C”或“QH-C”的級分是或對應於在大約49%乙腈下洗脫的級分。關於級分純化的另外資訊可見於美國專利號5,057,540。當如本文所述製備時，皂樹的級分A、B和C各自表示具有可定義特性的化學上緊密相關分子的組或家族。獲得所述級分的層析條件使得就洗脫曲線和生物活性而言批次間重現性是高度一致的。
已經描述了其他皂苷級分。級分B3、B4和B4b描述於EP 0436620中。級分QA1-QA22是描述的EP03632279 B2，Q-VAC（Nor-Feed, AS 丹麥），皂樹（Quillaja saponaria Molina）Spikoside（lsconova AB，Ultunaallén 2B，756 51 烏普薩拉，瑞典）。可以使用EP 0 3632 279 B2中的級分QA-1、QA-2、QA-3、QA-4、QA-5、QA-6、QA-7、QA-8、QA-9、QA-10、QA-11、QA-12、QA-13、QA-14、QA-15、QA-16、QA-17、QA-18、QA-19、QA-20、QA-21、和QA-22，尤其是QA-7、QA-17、QA-18、和QA-21。如EP 0 3632 279 B2中（尤其是在第6頁以及在第8頁和第9頁中的實例1中）所述獲得所述級分。
本文所述並用於形成佐劑的皂苷級分通常是基本上純的級分；也就是說，所述級分基本上不存在來自其他材料的污染。在特定態樣，基本上純的皂苷級分可以含有按重量計至多40%、按重量計至多30%、按重量計至多25%、按重量計至多20%、按重量計至多15%、按重量計至多10%、按重量計至多7%、按重量計至多5%、按重量計至多2%、按重量計至多1%、按重量計至多0.5%或按重量計至多0.1%的其他化合物，如其他皂苷或其他佐劑材料。
ISCOM 結構
皂苷級分可以以稱為ISCOM（免疫刺激複合物）的籠狀顆粒的形式投予。ISCOM可以如EP0109942B1、EP0242380B1和EP0180546 B1中所述製備。在特定實施例中，可以使用轉運和/或乘客抗原，如EP 9600647-3（PCT/SE97/00289）中所述。
基質佐劑
在實施例中，所述ISCOM是ISCOM基質複合物。所述ISCOM基質複合物包含至少一種皂苷級分和脂質。所述脂質至少是固醇，諸如膽固醇。在特定態樣，所述ISCOM基質複合物還含有磷脂。所述ISCOM基質複合物還可以含有一種或多種其他免疫調節（佐劑活性）物質，不一定是醣苷，並且可以如EP0436620B1中所述產生，將所述專利通過引用以其整體併入本文。
在其他態樣，所述ISCOM是ISCOM複合物。ISCOM複合物含有至少一種皂苷、至少一種脂質和至少一種抗原或表位。所述ISCOM複合物含有通過洗滌劑處理締合的抗原，使得一部分抗原整合到顆粒中。相比之下，ISCOM基質被配製為與抗原的混合物，並且ISCOM基質顆粒與抗原之間的締合通過靜電和/或疏水相互作用來介導。
根據一個實施例，整合到ISCOM基質複合物或ISCOM複合物中的皂苷級分或也整合到ISCOM或ISCOM基質複合物中或與其混合的至少一種另外的佐劑選自皂樹的級分A、級分B或級分C、皂樹的半純化製劑、皂樹的純化製劑或任何經純化的次級分（例如，QA 1-21）。
在特定態樣，每個ISCOM顆粒可以含有至少兩種皂苷級分。可以使用不同皂苷級分的重量%的任何組合。可以使用任何兩種級分的重量%的任何組合。例如，所述顆粒可以分別含有任何重量%的級分A和任何重量%的另一種皂苷級分，諸如粗皂苷級分或級分C。因此，在特定態樣，每個ISCOM基質顆粒或每個ISCOM複合物顆粒可以含有按重量計0.1%至99.9%、按重量計5%至95%、按重量計10%至90%、按重量計15%至85%、按重量計20%至80%、按重量計25%至75%、按重量計30%至70%、按重量計35%至65%、按重量計40%至60%、按重量計45%至55%、按重量計40%至60%或按重量計50%的一種皂苷級分（例如級分A）以及在每種情況下其餘補至100%的另一種皂苷（例如任何粗級分或任何其他級分，例如級分C）。所述重量被計算為皂苷級分的總重量。ISCOM基質複合物和ISCOM複合物佐劑的例子公開於美國公開的申請號2013/0129770中，將所述申請通過引用以其整體併入本文。
在特定實施例中，所述ISCOM基質或ISCOM複合物包含按重量計5%-99%的一種級分（例如級分A）和其餘按重量計補至100%的另一種級分（例如粗皂苷級分或級分C）。所述重量被計算為皂苷級分的總重量。
在另一個實施例中，所述ISCOM基質或ISCOM複合物包含按重量計40%至99%的一種級分（例如級分A）和按重量計1%至60%的另一種級分（例如粗皂苷級分或級分C）。所述重量被計算為皂苷級分的總重量。
在又另一個實施例中，所述ISCOM基質或ISCOM複合物包含按重量計70%至95%的一種級分（例如，級分A）和按重量計30%至5%的另一種級分（例如，粗皂苷級分或級分C）。所述重量被計算為皂苷級分的總重量。在其他實施例中，來自皂樹的皂苷級分選自QA 1-21中的任一種。
除了含有皂苷級分的混合物的顆粒之外，ISCOM基質顆粒和ISCOM複合物顆粒各自都可以僅使用一種皂苷級分形成。本文公開的組合物可以含有多種顆粒，其中每種顆粒僅含有一種皂苷級分。也就是說，某些組合物可以含有一種或多種不同類型的ISCOM-基質複合物顆粒和/或一種或多種不同類型的ISCOM複合物顆粒，其中每種單獨的顆粒含有來自皂樹的一種皂苷級分，其中一種複合物中的皂苷級分與另一種複合物顆粒中的皂苷級分不同。
在特定態樣，一種類型的皂苷級分或粗皂苷級分可以整合到一種ISCOM基質複合物或顆粒中，並且另一種類型的基本上純的皂苷級分或粗皂苷級分可以整合到另一種ISCOM基質複合物或顆粒中。組合物或疫苗可以包含至少兩種類型的複合物或顆粒，每種類型具有一種類型的整合到物理上不同的顆粒中的皂苷。
在所述組合物中，可以使用ISCOM基質複合物顆粒和/或ISCOM複合物顆粒的混合物，其中將一種皂苷級分皂樹和另一種皂苷級分皂樹分開摻入不同的ISCOM基質複合物顆粒和/或ISCOM複合物顆粒中。
各自具有一種皂苷級分的ISCOM基質或ISCOM複合物顆粒可以按重量%的任何組合存在於組合物中。在特定態樣，組合物可以含有按重量計0.1%至99.9%、按重量計5%至95%、按重量計10%至90%、按重量計15%至85%、按重量計20%至80%、按重量計25%至75%、按重量計30%至70%、按重量計35%至65%、按重量計40%至60%、按重量計45%至55%、按重量計40%至60%或按重量計50%的含有第一皂苷級分的ISCOM基質或複合物，其餘部分由含有不同皂苷級分的ISCOM基質或複合物構成。在多態樣，所述其餘部分是一種或多種ISCOM基質或複合物，其中每種基質或複合物顆粒僅含有一種皂苷級分。在其他態樣，所述ISCOM基質或複合物顆粒可以含有多於一種皂苷級分。
在特定組合物中，第一ISCOM基質或ISCOM複合物顆粒中唯一的皂苷級分是級分A，並且第二ISCOM基質或ISCOM複合物顆粒中唯一的皂苷級分是級分C。
在實施例中，分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。
優選的組合物包含含有級分A的第一ISCOM基質和含有級分C的第二ISCOM基質，其中級分A ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約70%，並且級分C ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約30%。在另一種優選的組合物中，級分A ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約85%，並且級分C ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約15%。在另一種優選的組合物中，級分A ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約92%，並且級分C ISCOM基質占總皂苷佐劑重量的約8%。因此，在某些組合物中，級分A ISCOM基質存在的範圍為所述組合物中皂苷佐劑總重量的約70%至約85%，並且級分C ISCOM基質存在的範圍為約15%至約30%。在某些組合物中，級分A ISCOM基質存在的範圍為所述組合物中皂苷佐劑總重量的約70%至約92%，並且級分C ISCOM基質存在的範圍為約8%至約30%。在實施例中，分別地，級分A ISCOM基質占佐劑中級分A ISCOM基質和級分C ISCOM的重量之和的按重量計50%-96%，並且級分C ISCOM基質占剩餘部分。在特別優選的組合物（在本文中稱為MATRIX-M TM）中，級分A ISCOM基質以所述組合物中皂苷佐劑總重量的約85%存在，並且級分C ISCOM基質以約15%存在。MATRIX-M TM可以可互換地稱為Matrix-M1。
示例性QS-7和QS-21級分、其生產及其用途描述於美國專利號5,057,540、6,231,859、6,352,697、6,524,584、6,846,489、7,776,343和8,173,141中，這些專利通過引用併入本文。
在實施例中，可以另外或替代地使用其他佐劑。包括在以下文獻中所述的任何佐劑設想在本公開文本的範圍內：Vogel等人, “A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第2版),”（出於所有目的通過引用以其整體併入本文）。其他佐劑包括完全弗氏佐劑（免疫反應的非特異性刺激劑，含有殺死的結核心分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis））、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。其他佐劑包括GMCSP、BCG、MDP化合物（如thur-MDP和nor-MDP）、CGP（MTP-PE）、脂質A和單磷醯脂質A（MPL）、MF-59、RIBI（其含有從細菌中提取的三種組分）、MPL、海藻糖二黴菌酸酯（TDM）和在2%角鯊烯/TWEEN®聚山梨醇酯80乳劑中的細胞壁骨架（CWS）。在實施例中，所述佐劑可以是少層狀（paucilamellar）脂質囊泡；例如NOVASOMES®。NOVASOMES®是範圍從約100 nm至約500 nm的少層狀非磷脂囊泡。它們包含BRIJ®醇乙氧基化物72、膽固醇、油酸和角鯊烯。已經顯示NOVASOMES®是有效的佐劑（參見美國專利號5,629,021、6,387,373和4,911,928）。 投予和劑量
在實施例中，本公開文本提供了用於引發針對一種或多種冠狀病毒的免疫反應的方法。在實施例中，所述反應是針對SARS-CoV-2病毒、MERS和SARS中的一種或多種。在實施例中，所述反應是針對異源SARS-CoV-2毒株。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有α、β、γ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、μ或ο的世界衛生組織標記。在實施例中，異源SARS-CoV-2毒株具有選自B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1的PANGO譜系。所述方法涉及向受試者投予免疫有效量的含有奈米顆粒或含有重組CoV刺突（S）多肽的組合物。有利地，本文公開的蛋白質誘導一種或多種特別有用的抗冠狀病毒反應。
在實施例中，將所述奈米顆粒或CoV S多肽與佐劑一起投予。在多態樣，在沒有佐劑的情況下投予所述奈米顆粒或CoV S多肽。在多態樣，所述佐劑可以諸如通過非共價相互作用結合至所述奈米顆粒。在其他態樣，將所述佐劑與所述奈米顆粒共同投予，但是所述佐劑和奈米顆粒基本上不相互作用。
在實施例中，所述奈米顆粒或CoV S多肽可以用於預防和/或治療SARS-CoV-2感染、異源SARS-CoV-2毒株感染、SARS感染或MERS感染中的一種或多種。因此，本公開文本提供了用於引發針對SARS-CoV-2病毒、異源SARS-CoV-2病毒、MERS和SARS中的一種或多種的免疫反應的方法。所述方法涉及向受試者投予免疫有效量的含有奈米顆粒或CoV S多肽的組合物。有利地，本文公開的蛋白質誘導特別有用的抗冠狀病毒反應。
在實施例中，本文所述的奈米顆粒或CoV S多肽具有針對SARS-CoV-2病毒或異源SARS-CoV-2毒株的功效，所述功效是在約50%與約99%之間、在約80%與約99%之間、在約75%與約99%之間、在約80%與約95%之間、在約90%與約98%之間、在約75%與約95%之間、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。
本文公開的組合物可以經由全身途徑或粘膜途徑或透皮途徑投予或直接投予到特定組織中。如本文所用，術語“全身投予”包括腸胃外投予途徑。特別地，腸胃外投予包括皮下、腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內或胸骨內注射、靜脈內或腎臟透析輸注技術。通常，全身腸胃外投予是肌內注射。如本文所用，術語“粘膜投予”包括口服、鼻內、陰道內、直腸內、氣管內、腸和眼部投予。優選地，投予是肌內的。
可以以單劑量方案或多劑量方案投予組合物。可以在初次免疫方案或在加強免疫方案中使用多劑量。在實施例中，投予約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個劑量。在多劑量時間表中，可以通過相同或不同的途徑投予各個劑量，例如腸胃外初次免疫和粘膜加強免疫、粘膜初次免疫和腸胃外加強免疫等。在多態樣，在第一劑量後約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月（1年）、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年或約10年後投予加強劑量。在實施例中，在投予初始劑量後每年投予加強劑量。在實施例中，在投予先前劑量後3週或4週投予後續加強劑量。在實施例中，第一劑量在第0天投予，並且加強劑量在第21天投予。在實施例中，第一劑量在第0天投予，並且加強劑量在第28天投予。在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第21天投予加強劑量，並且在投予第一劑量或第二劑量後約六個月投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，並且在第28天投予加強劑量，並且在投予第一劑量後約六個月投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第21天投予加強劑量，並且在投予第二劑量後約六個月投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，並且在第28天投予加強劑量，並且在投予第二劑量後約六個月投予第二加強劑量。
在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第21天投予加強劑量，並且在投予第一劑量或第一加強劑量後約1年投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第28天投予第一加強劑量，並且在投予第一劑量後約1年投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第21天投予加強劑量，並且在投予第二劑量後約1年投予第二加強劑量。在實施例中，在第0天投予第一劑量，在第28天投予第一加強劑量，並且在投予第二劑量後約1年投予第二加強劑量。在實施例中，在第一加強劑量後6個月至24個月或12個月至24個月投予第二加強劑量。
在實施例中，加強劑量包含與初始劑量相同的免疫組合物。在實施例中，加強劑量包含與初始劑量不同的免疫組合物。在實施例中，所述不同的免疫組合物是SARS-CoV-2刺突醣蛋白、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，加強劑量包含初始組合物。在實施例中，初始劑量包含SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S醣蛋白），並且加強劑量包含相同的SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白）。在實施例中，初始劑量包含SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白），並且加強劑量包含不同的SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 132的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S醣蛋白）。
在實施例中，初始劑量包含SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白和具有SEQ ID NO: 132的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白）的組合。在實施例中，加強劑量包含SARS-CoV-2 S醣蛋白（例如，具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白和具有SEQ ID NO: 132的胺基酸序列的SARS CoV-2 S醣蛋白）的組合。在實施例中，初始劑量包含SARS-CoV-2 S醣蛋白、編碼SARS-CoV-2 S醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，初始劑量包含SARS-CoV-2刺突醣蛋白、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒，並且加強劑量包含一種或多種SARS-CoV-2 S醣蛋白。
在實施例中，如以µg測量的劑量可以是包括溶質的劑量的總重量、或CoV S多肽奈米顆粒的重量、或CoV S多肽的重量。使用蛋白質濃度測定（A280或ELISA）來測量劑量。
包括用於小兒投予的抗原劑量可以在約5 µg至約25 µg、約1 µg至約300 µg、約90 µg至約270 µg、約100 µg至約160 µg、約110 µg至約150 µg、約120 µg至約140 µg或約140 µg至約160 µg的範圍內。在實施例中，所述劑量為約120 µg，與鋁佐劑一起投予。在多態樣，小兒劑量可以在約1 µg至約90 µg的範圍內。在實施例中，CoV刺突（S）多肽的劑量為約1 µg、約2 µg、約3 µg、約4 µg、約5 µg、約6 µg、約7 µg、約8 µg、約9 µg、約10 µg、約11 µg、約12 µg、約13 µg、約14 µg、約15 µg、約16 µg、約17 µg、約18 µg、約19 µg、約20 µg、約21、約22、約23、約24、約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約40 µg、約50、約60、約70、約80、約90 約100 µg、約110 µg、約120 µg、約130 µg、約140 µg、約150 µg、約160 µg、約170 µg、約180 µg、約190 µg、約200 µg、約210 µg、約220 µg、約230 µg、約240 µg、約250 µg、約260 µg、約270 µg、約280 µg、約290 µg或約300 µg，包括在中間的所有值和範圍。在實施例中，CoV S多肽的劑量為5 µg。在實施例中，CoV S多肽的劑量為25 µg。在實施例中，CoV S多肽的劑量對於初始劑量和加強劑量是相同的。在實施例中，CoV S多肽的劑量對於初始劑量和加強劑量是不同的。
可以在有或沒有佐劑的情況下向某些群體投予。在某些態樣，組合物可以不含添加的佐劑。在此類情形下，可以將劑量增加約10%。
在實施例中，本文所述的免疫原性組合物以載藥注射器提供。當在載藥注射器中製備免疫原性組合物時，在投予前將CoV S多肽和佐劑組合。
在實施例中，與非天然存在的CoV S多肽一起投予的佐劑的劑量為約1 µg至約100 µg，例如約1 µg、約2 µg、約3 µg、約4 µg、約5 µg、約6 µg、約7 µg、約8 µg、約9 µg、約10 µg、約11 µg、約12 µg、約13 µg、約14 µg、約15 µg、約16 µg、約17 µg、約18 µg、約19 µg、約20 µg、約21 µg、約22 µg、約23 µg、約24 µg、約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg、約75 µg、約76 µg、約77 µg、約78 µg、約79 µg、約80 µg、約81 µg、約82 µg、約83 µg、約84 µg、約85 µg、約86 µg、約87 µg、約88 µg、約89 µg、約90 µg、約91 µg、約92 µg、約93 µg、約94 µg、約95 µg、約96 µg、約97 µg、約98 µg、約99 µg或約100 µg的佐劑。在實施例中，佐劑的劑量為約50 µg。在實施例中，所述佐劑是皂苷佐劑，例如MATRIX-M TM。
在實施例中，投予的劑量的體積為約0.1 mL至約1.5 mL，例如約0.1 mL、約0.2 mL、約0.25 mL、約0.3 mL、約0.4 mL、約0.5 mL、約0.6 mL、約0.7 mL、約0.8 mL、約0.9 mL、約1.0 mL、約1.1 mL、約1.2 mL、約1.3 mL、約1.4 mL或約1.5 mL。在實施例中，投予的劑量的體積為0.25 mL。在實施例中，投予的劑量的體積為0.5 mL。在實施例中，投予的劑量的體積為0.6 mL。
在針對MERS、SARS或SARS-CoV-2冠狀病毒的疫苗的特定實施例中，所述劑量可以包含以下濃度的CoV S多肽：約1 µg/mL至約50 µg/mL、10 µg/mL至約100 µg/mL、約10 µg/mL至約50 µg/mL、約175 µg/mL至約325 µg/mL、約200 µg/mL至約300 µg/mL、約220 µg/mL至約280 µg/mL或約240 µg/mL至約260 µg/mL。
在另一個實施例中，本公開文本提供了配製疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物誘導針對哺乳動物的感染或其至少一種疾病症狀的免疫，所述方法包括向所述組合物中添加有效劑量的奈米顆粒或CoV S多肽。所公開的CoV S多肽和奈米顆粒可用於製備刺激免疫反應的組合物，所述免疫反應賦予針對感染原的免疫或實質性免疫。因此，在一個實施例中，本公開文本提供了在受試者中誘導針對感染或其至少一種疾病症狀的免疫的方法，其方法包括投予至少一個有效劑量的奈米顆粒和/或CoV S多肽。
在實施例中，將所述CoV S多肽或包含所述多肽的奈米顆粒與另外的免疫原性組合物組合投予。在實施例中，所述另外的免疫原性組合物誘導針對SARS-CoV-2的免疫反應。在實施例中，將所述另外的免疫原性組合物在所公開的CoV S多肽或包含所述多肽的奈米顆粒的約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天或約31天內投予。在實施例中，將所述另外的組合物與第一劑量的包含CoV S多肽或含有所述多肽的奈米顆粒的組合物一起投予。在實施例中，將所述另外的組合物與加強劑量的包含CoV S多肽或含有所述多肽的奈米顆粒的組合物一起投予。
在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。
在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含編碼CoV S多肽的mRNA。在實施例中，所述mRNA編碼在SEQ ID NO: 1的位置986和987處包含脯胺酸取代的CoV S多肽。在實施例中，所述mRNA編碼包含完整弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述mRNA編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和完整弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述mRNA編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和無活性的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述mRNA編碼具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CoV S多肽。在實施例中，編碼CoV S多肽的mRNA被封裝在脂質奈米顆粒中。包含編碼CoV S多肽的mRNA的示例性免疫原性組合物描述於Jackson等人 N. Eng. J. Med. 2020.針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗的初步報導，其通過引用以其整體併入本文。在實施例中，將包含編碼CoV S多肽的mRNA的組合物以25 µg、100 µg或250 µg的劑量投予。
在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含編碼CoV S多肽的腺病毒載體。在實施例中，所述AAV載體編碼野生型CoV S多肽。在實施例中，所述AAV載體編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和完整弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述AAV載體編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和無活性的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述AAV載體編碼具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CoV S多肽。以下出版物描述了包含編碼CoV S多肽的腺病毒載體的免疫原性組合物，其各自通過引用以其整體併入本文：van Doremalen N.等人 A single dose of ChAdOx1 MERS provides protective immunity in rhesus macaques. Science Advances, 2020；van Doremalen N.等人 ChAdOx1 nCoV-19 vaccination prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. bioRxiv, (2020)。
在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含去氧核糖核酸（DNA）。在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含質體DNA。在實施例中，所述質體DNA編碼CoV S多肽。在實施例中，所述DNA編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和完整弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述DNA編碼包含在SEQ ID NO: 1的位置986和987處的脯胺酸取代和無活性的弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽。在實施例中，所述DNA編碼具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CoV S多肽。在實施例中，所述DNA編碼具有SEQ ID NO: 174或SEQ ID NO: 175的胺基酸序列的CoV S多肽。在實施例中，所述另外的免疫原性組合物包含滅活的病毒疫苗。
在實施例中，將CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒投予至已經或先前已經具有證實的由SARS-CoV-2或異源SARS-CoV-2毒株引起的感染的患者。SARS-CoV-2或異源SARS-CoV-2毒株的感染可以通過核酸擴增測試（例如，聚合酶鏈式反應）或血清學測試（例如，對於針對SARS-CoV-2病毒抗原的抗體的測試）來確認。在實施例中，在患者被診斷為患有COVID-19後至少約3天、至少約1週、至少約2週、至少約3週、至少約4週，向患者投予CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒。在實施例中，在患者被診斷為患有COVID-19後1週與1年之間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月或約1年，向患者投予CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒。在實施例中，在患者被診斷為患有COVID-19後1週與20年之間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年、約11年、約12年、約13年、約14年、約15年、約16年、約17年、約18年、約19年或約20年，向患者投予CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒。
在實施例中，在患者已被投予第一免疫原性組合物之後投予CoV S多肽或包含其的奈米顆粒。第一免疫原性組合物的非限制性例子包括SARS-CoV-2刺突醣蛋白、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。在實施例中，在投予第一免疫原性組合物之後約1週與約1年之間、在約1週與1個月之間、在約3週與4週之間、在約1週與5年之間、在約1年與約5年之間、在約1年與約3年之間、在約3年與約5年之間、在約5年與約10年之間、在約1年與約10年之間或在約1年與約2年之間投予CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒。在實施例中，在投予第一免疫原性組合物之後約1週與約1年之間，例如在投予第一免疫原性組合物之後約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月或約1年投予CoV S多肽或包含CoV S多肽的奈米顆粒。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒可用于製備免疫原性組合物以刺激賦予針對MERS、SARS、SARS-CoV-2和異源SARS-CoV-2毒株中的一種或多種的免疫力或實質性免疫的免疫反應。粘膜免疫力和細胞免疫力兩者都可以有助於針對感染和疾病的免疫力。上呼吸道局部分泌的抗體是抵抗天然感染的主要因子。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）參與保護上呼吸道，並且血清IgG參與保護下呼吸道。感染誘導的免疫反應預防相同病毒或抗原性相似的病毒株再感染。用本文公開的奈米顆粒免疫後在宿主中產生的抗體也可以投予於其他宿主，從而在受試者中提供被動投予。
在實施例中，CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：選自胺基酸11-14、56、57、130、131、132、144、145、198、199、228、229、230、231、234、235、236、237、238、239、240、676-685、676-702、702-711、775-793、806-815及其組合的一個或多個胺基酸的缺失；(b) 選自胺基酸5、6、7、11、12、13、14、51、53、54、56、57、62、63、67、70、82、125、129、131、132、133、134、139、143、144、145、170、177、197、198、199、200、201、202、209、229、233、239、240、244、245、326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、419、426、427、431、432、433、439、440、447、464、465、471、473、477、480、481、483、485、488、492、534、557、591、600、601、626、642、645、664、666、668、688、691、703、751、783、843、846、875、937、941、956、968、969、1014、1058、1105、1163、1186及其組合的一個或多個胺基酸的突變；或 (c) 具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入；其中CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H、T703I、S969A、D1105H、N426K和Y440F，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H、T703I、S969A和D1105H，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：胺基酸229-231的缺失、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：胺基酸229-231的缺失、L5F、D67A、D202G、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對含有具有選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對具有包含選自以下的一個或多個修飾的S蛋白的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：W139C和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述包含W139C和L439R修飾的CoV S多肽表現為含有具有SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽。在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對具有選自以下的一個或多個修飾的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：D601G、W139C和L439R，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述包含D601G、W139C和L439R修飾的CoV S蛋白或奈米顆粒表現為含有具有SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的信號肽。
在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對具有選自以下的一個或多個修飾的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：D601G、L5F、D67A、D202G、胺基酸229-231的缺失、R233I、K404N、E471K、N488Y和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。在實施例中，所述CoV S蛋白或包含CoV S蛋白的奈米顆粒誘導針對具有選自以下的一個或多個修飾的SARS-CoV-2病毒的交叉中和抗體：L5F、D67A、D202G、胺基酸229-231的缺失、R233I、K404N、E471K、N488Y和A688V，其中所述胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽編號。
在實施例中，本公開文本提供了產生高親和力抗MERS-CoV、抗SARS-CoV和抗SARS-CoV-2病毒抗體中的一種或多種的方法。通過用本文公開的奈米顆粒免疫而產生的高親和力抗體通過以下方式來產生：向動物投予包含S CoV多肽或含有S CoV多肽的奈米顆粒的免疫原性組合物，從所述動物中收集血清和/或血漿，並且從血清/和或血漿中純化抗體。在一個實施例中，所述動物是人。在實施例中，所述動物是雞、小鼠、豚鼠、大鼠、兔、山羊、人、馬、羊或牛。在一個實施例中，所述動物是牛或馬。在另一個實施例中，所述牛或馬動物是轉基因的。在又另一個實施例中，所述轉基因牛或馬動物產生人抗體。在實施例中，所述動物產生單株抗體。在實施例中，所述動物產生多株抗體。在一個實施例中，所述方法還包括投予佐劑或免疫刺激化合物。在另一個實施例中，向人受試者投予經純化的高親和力抗體。在一個實施例中，所述人類受試者有感染MERS、SARS和SARS-CoV-2中的一種或多種的風險。
在實施例中，將所述CoV S蛋白或奈米顆粒與流感醣蛋白或包含流感醣蛋白的奈米顆粒或呼吸道合胞病毒（RSV）融合（F）醣蛋白共同投予。在實施例中，將所述CoV S蛋白或奈米顆粒與RSV F醣蛋白、流感醣蛋白或其組合共同配製。合適的醣蛋白和奈米顆粒描述於美國公開號2018/0133308和美國公開號2019/0314487中，將其中的每個公開案通過引用以其整體併入本文。在實施例中，將所述CoV S蛋白或奈米顆粒與以下各項共同投予：(a) 洗滌劑-核心奈米顆粒，其中所述洗滌劑-核心奈米顆粒包含來自B型流感毒株的重組流感血球凝集素（HA）醣蛋白；和 (b) 血球凝集素皂苷基質奈米顆粒（HaSMaN），其中所述HaSMaN包含來自A型流感毒株的重組流感HA醣蛋白和ISCOM基質佐劑。在實施例中，將所述CoV S蛋白或奈米顆粒與包含非離子型洗滌劑核心和流感HA醣蛋白的奈米顆粒共同投予，其中所述流感HA醣蛋白含有從非離子型洗滌劑核心向外突出的頭部區域和與非離子型洗滌劑核心締合的跨膜結構域，其中所述流感HA醣蛋白是HA0醣蛋白，其中所述流感HA醣蛋白的胺基酸序列與天然流感HA蛋白的胺基酸序列具有100%同一性。在實施例中，將所述流感醣蛋白或奈米顆粒與所述CoV S蛋白或奈米顆粒共同配製。
在一些實施例中，本公開文本提供了用於包含CoV S醣蛋白和佐劑（例如皂苷佐劑）的免疫原性組合物的共同配製（即，載藥注射器或預混合）策略。目前使用的典型疫苗投予策略是床邊混合配製品。也就是說，疫苗組合物和佐劑分開儲存，並且在投予前混合。疫苗的預混合、共同配製或載藥注射器策略較不常見，歸因於考慮到抗原（例如，CoV S醣蛋白）的穩定性及其後續免疫原性能力。本公開文本提供了可以提前預混合和儲存的免疫原性組合物。所公開的疫苗接種策略和配製可以改善疫苗接種的效率，並且可以降低床邊混合失誤的風險，同時保持總體安全性和免疫原性。
可以使用各種容器來儲存和運輸預混合配製品，所述容器包括用於單次投予的注射器和塑膠安瓿。在一些情況下，塑膠安瓿可以使用吹-灌-封製造技術或方法製造。通常，吹-灌-封（BFS）製造方法包括擠出塑膠材料（例如，樹脂）以形成型坯，然後將所述型坯放入模具中並切割成適當尺寸。然後使用填充針或芯棒使塑膠充氣，這又產生了基本上與模具形狀一致的中空安瓿。一旦充氣，就可以將所需體積的液體注入安瓿中，可以將填充針或芯棒移除，並且可以將安瓿密封。因此，BFS可以是無需直接人為干預而可以在無菌環境中發揮性能的自動化過程。
在一些情況下，無菌製造含有所需液體的無菌安瓿的能力可以使BFS製造的安瓿特別適合製藥工業。然而，BFS技術不能與所有的醫藥液體、產品等相容。例如，一些已知的BFS製造方法包括在塑膠仍然相對熱時將液體或產品遞送到安瓿中，這會對溫度敏感的液體和/或產品如疫苗、生物製品等產生不利影響。然而，冷BFS技術的進步增加了合適產品、液體等的種類，允許一些疫苗、生物製品和/或其他溫度敏感藥物容納在BFS安瓿中。
在一些情況下，BFS安瓿可以具有至少部分地基於所需用途和/或經配置的安瓿所容納的所需醫藥液體或劑量的尺寸、形狀和/或配置。例如，一些已知的BFS安瓿可以包括刺穿頂部、擰開頂部、包括陽或陰魯爾連接子的頂部和/或類似物。一些已知的BFS安瓿可以具有基於經配置以安置在其中的液體或劑量的體積的尺寸和/或形狀。此外，一些已知的BFS安瓿可以製造成多個臨時連接的安瓿的條狀物，這可以增加製造、包裝和/或儲存效率和/或類似性能。
在實施例中，本文所述的免疫原性組合物以載藥注射器提供。當在載藥注射器中製備免疫原性組合物時，在投予前將抗原和佐劑組合。在實施例中，所述載藥注射器含有CoV S醣蛋白和佐劑（例如皂苷佐劑）。在實施例中，載藥注射器含有CoV S醣蛋白和皂苷佐劑，其中所述佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中第一iscom顆粒包含皂樹的級分A且不含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C且不含皂樹的級分A；其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%。在實施例中，載藥注射器含有CoV S醣蛋白和皂苷佐劑，其中所述佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中第一iscom顆粒包含皂樹的級分A且不含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C且不含皂樹的級分A；其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。在實施例中，載藥注射器含有CoV S醣蛋白和皂苷佐劑，其中所述佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中第一iscom顆粒包含皂樹的級分A且不含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C且不含皂樹的級分A；其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約75%，並且皂樹的級分C占其餘部分。
實例 實例 1 冠狀病毒刺突（ S ）多肽奈米顆粒的表現和純化
已在杆狀病毒表現系統中表現了天然冠狀病毒刺突（S）多肽（SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2）和CoV刺突多肽（其具有對應於SEQ ID NO: 3、4、38、41、44、48、51、54、58、61、63、65、67、73、75、78、79、82、83、85、87、106、108、89、112-115、132、133、114、138、141、144、147、151、153、156、158、174-176、186、188、190、195、217-228、233-236的胺基酸序列），並且挑選並確認了表現冠狀病毒刺突（S）多肽的重組噬斑。在每種情況下，信號肽是SEQ ID NO: 5。 圖 4和 圖 9示出了CoV刺突多肽BV2364、BV2365、BV2366、BV2367、BV2368、BV2369、BV2373、BV2374和BV2375的成功純化。表2示出了上述CoV刺突多肽的序列特徵。
表 2 ：選定的 CoV 刺突多肽
CoV S 多肽 SEQ ID NO.
BV2364 48
BV2365 4
BV2361 / BV2366 2
BV2367 63
BV2368 65
BV2369 67
BV2373 配製成在本文中稱為“NVX-CoV2373”的組合物 87
BV2374 85
BV2374 58
BV2384 110
BV2425 114
BV2426 115
BV2438 132
BV2423 133
BV2425 114
BV2425-2 138
BV2439 141
BV2441 144
BV2442 147
BV2443 151
BV2448 153
BV1.526NY-1 156
BV1.526NY-2 158
BV2508 174
BV2509 175
BV2465 176
BV2457 181
BV2472 182
BV2480 183
BV2481 184
BV2523 195
BV2540 192
BV2541 190
BV2515 188
BV2542 186
BV2515-1 217
BV2523-1 218
BV2540-1 222
BV2541-1 221
BV2549 219
BV2542-2 220
BV2562 225
BV2559 223
BV2577 224
BV2578 226
BV2589 227
BV2590 228
BV2592 233
XBB.1 234
BV2591 235
BN.1 236
另外，產生由SEQ ID NO: 161、162、163、164、165、166、168、169、171、172、196-199、201、202、204、206、208、210、212、214和216中任一個的核酸編碼的CoV S多肽。另外，產生了包含SEQ ID NO: 87、159、167、160、170、174、175、186、188、190、195、217-228、233-236的多肽序列的CoV S多肽，所述多肽序列在具有SEQ ID NO: 5、154、193或117中任一個的胺基酸序列的信號肽的C末端。
野生型BV2361蛋白（SEQ ID NO: 2）與人血管收縮素轉換酶2前體（hACE2）結合。進行了生物膜層干涉測量術和ELISA，以評估CoV S多肽的結合。 生物膜層干涉測量術（ BLI ）
使用Octet QK384系統（Pall Forté Bio，加利福尼亞州弗里蒙特）進行了BLI實驗。將His標記的人ACE2（2 μg mL-1）固定在帶鎳的Ni-NTA生物感測器尖端上。在基線後，將含SARS-CoV-2 S蛋白的樣品連續稀釋2倍，並且允許其締合600秒，然後再使其解離900秒。使用Octet軟體HT 101:1全域曲線擬合分析資料。
CoV S多肽BV2361、BV2365、BV2369、BV2365、BV2373、BV2374和BV2509保留與hACE2結合的能力（ 圖 5 、圖 11A- 圖 11C 、圖 65A- 圖 65B）。解離動力學表明，在不存在流體相S蛋白的情況下，如通過觀察900秒的最小解離或無解離所證實的，S蛋白保持緊密結合（ 圖 11A- 圖 11C）。
此外，結合是特異性的。野生型CoV S蛋白BV2361以及CoV S多肽BV2365和BV2373不結合MERS-CoV受體二肽基肽酶IV（DPP4）。此外，MERS S蛋白不與人血管收縮素轉化酶2前體（hACE2）結合（ 圖 6和 圖 11D- 圖 11F） 。 ELISA
通過ELISA確認了CoV S多肽對hACE2的特異性。將九十六孔板在4ºC下用100 μL SARS-CoV-2刺突蛋白（2 μg/mL）包被過夜。用含有0.05% Tween（PBS-T）緩衝液的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌板，並將其用TBS Startblock封閉緩衝液（ThermoFisher, Scientific）封閉。將His標記的hACE2和hDPP4受體連續稀釋3倍（5-0.0001 μg mL-1），並且在室溫下將其添加到包被的孔中持續2小時。用PBS-T洗滌版。添加最適稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）綴合的抗組胺酸，並且通過添加3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺過氧化物酶底物（TMB，T0440-IL，Sigma，美國密蘇里州聖路易斯）來顯色。用SpectraMax Plus板讀取器（Molecular Devices，美國加利福尼亞州桑尼維爾）在450 nm的OD下讀取板，並且用SoftMax軟體分析資料。使用GraphPad Prism 7.05軟體通過4參數擬合來計算EC50值。
ELISA結果表明，野生型CoV S多肽（BV2361）、BV2365和BV2373蛋白特異性地結合hACE2，但未能結合由MERS-CoV使用的hDPP-4受體（IC 50＞ 5000 ng mL-1）。野生型CoV S多肽和BV2365以相似的親和力結合至hACE2（IC 50= 36-38 ng/mL），而BV2373在1/2的濃度下達到50%的hACE2結合的飽和（IC 50= 18 ng/mL）（ 圖 7 、圖 11D- 圖 11F）。 蛋白質和奈米顆粒產生
通過感染Sf9昆蟲細胞來擴增重組病毒。在約0.6 MOI（感染複數 = 病毒ffu或pfu/細胞）下用杆狀病毒感染昆蟲細胞培養物。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。通過在約800 x g下離心15分鐘澄清約30 mL的粗細胞收穫物。如下所述將含有冠狀病毒刺突（S）蛋白的所得粗細胞收穫物純化為奈米顆粒。
為了產生奈米顆粒，將非離子表面活性劑TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-9用於膜蛋白提取方案中。經由通過陰離子交換層析、小扁豆凝集素親和/HIC和陽離子交換層析進一步純化粗提取物。通過洗滌劑處理使洗滌過的細胞裂解，然後對其進行低pH處理，這導致BV和Sf9宿主細胞DNA和蛋白質沈澱。使中和的低pH處理裂解液澄清，並且在進行第二次低pH處理之前在陰離子交換和親和層析上進一步純化。
使用親和層析來去除Sf9/BV蛋白、DNA和NP-9，並且濃縮冠狀病毒刺突（S）蛋白。簡言之，小扁豆凝集素是一種含有鈣和錳的金屬蛋白，其可逆地結合含有葡萄糖或甘露糖的多醣和醣基化蛋白。將含冠狀病毒刺突（S）蛋白的陰離子交換流過級分載入到小扁豆凝集素親和層析樹脂（Capto小扁豆凝集素，GE Healthcare）上。醣基化冠狀病毒刺突（S）蛋白選擇性地結合至樹脂，而非醣基化蛋白和DNA在柱流過物中被去除。通過含有高鹽和低摩爾濃度的甲基α-D-吡喃甘露醣苷（MMP）的緩衝液去除弱結合的醣蛋白。
還使用柱洗滌物來將NP-9洗滌劑用表面活性劑聚山梨醇酯80（PS80）進行洗滌劑交換。用高濃度的MMP將冠狀病毒刺突（S）多肽以奈米顆粒結構從小扁豆凝集素柱中洗脫。在洗脫後，將冠狀病毒刺突（S）蛋白三聚體組裝成由包含在洗滌劑核心中的冠狀病毒刺突（S）蛋白三聚體和PS80構成的奈米顆粒。 實例 2 冠狀病毒刺突（ S ）多肽奈米顆粒疫苗在小鼠中的免疫原性
使用雌性BALB/c小鼠（7-9週齡；Harlan Laboratories Inc.，馬里蘭州弗雷德里克）評價了如實例1所述的包含SEQ ID NO: 87的CoV S多肽（也稱為“BV2373”）的冠狀病毒刺突（S）蛋白組合物在鼠類模型中的免疫原性和毒性。在存在和不存在皂苷佐劑（例如，MATRIX-M TM）的情況下評價了組合物。含有MATRIX-M TM的組合物含有5 µg的MATRIX-M TM。將含有不同劑量（包括0.01 µg、0.1 µg、1 µg和10 µg）的冠狀病毒刺突（S）多肽的疫苗作為單劑量（也稱為單次初次免疫劑量）（研究第14天）或作為間隔14天（研究第0天和第14天）的兩個劑量（也稱為初次免疫/加強免疫方案）肌內投予。安慰劑組用作非免疫對照。在研究第-1天、第13天、第21天和第28天收集血清進行分析。在一次（單劑量）或兩次（兩個劑量）免疫後42天，用SARS-CoV-2鼻內攻擊接種疫苗的動物和對照動物。 疫苗免疫原性
用0.1-10 μg BV2373和MATRIX-M TM的單次初免劑量免疫的動物具有升高的抗S IgG力價，其在單次免疫後21-28天檢測到（ 圖 13B） 。用10 μg劑量的BV2373和MATRIX-M TM免疫的小鼠產生了阻斷hACE2受體與CoV S蛋白結合的抗體和在單次初免劑量後21-28天檢測到的病毒中和抗體（ 圖 14和 圖 15）。用初次免疫/加強免疫方案（兩個劑量）免疫的動物具有顯著升高的抗S IgG力價，其在所有劑量水準下在加強免疫後7-16天均檢測到（ 圖 13A）。用BV2373（1 μg和10 μg）和MATRIX-M TM免疫的動物在免疫後具有相似的高抗S IgG力價（分別地，GMT = 139,000和84,000）。與在沒有佐劑的情況下用10 μg BV2373免疫的小鼠相比，用BV2373（0.1 μg、1 μg或10 μg）和MATRIX-M TM免疫的小鼠具有顯著（p ≤ 0.05和p ≤ 0.0001）更高的抗S IgG力價（ 圖 13A）。這些結果表明了由MATRIX-M TM佐劑提供10倍至100倍劑量節省的可能性。此外，用兩個劑量的BV2373和MATRIX-M TM免疫產生了高力價抗體，其在所有劑量水準下均阻斷hACE2受體與S蛋白結合（IC50 = 218 - 1642）並中和SARS-CoV-2對Vero E6細胞的致細胞病變效應（CPE）（CPE的100%阻斷 =7680 - 20,000）（ 圖 14和 圖 15）。 SARS CoV-2 攻擊
為了評價保護性免疫的誘導，用SARS-CoV-2攻擊了免疫的小鼠。由於小鼠不支援野生型SARS-CoV-2病毒的複製，因此在初始疫苗接種後第52天，用表現hACE2的腺病毒（Ad/hACE2）鼻內感染小鼠以允許其複製。向小鼠鼻內接種1.5 x 10 5pfu的SARS-CoV-2，在各鼻孔之間分50 μL。在感染當天稱量受攻擊的小鼠，並且在感染後每天稱重持續7天。在感染後4天和7天，處死來自疫苗接種組和對照組各自的5只小鼠，並且收穫肺並準備進行肺組織學檢查。
通過噬斑測定對病毒力價進行了定量。簡言之，使用1.0 mm玻璃珠（Sigma Aldrich）和Beadruptor（Omini International Inc.）在PBS中使所收穫的肺均質化。將勻漿添加到Vero E6近匯合培養物中，並且使用6點稀釋曲線通過計數噬斑形成單位（pfu）來測定SARS-CoV-2病毒力價。
在感染後4天，經安慰劑處理的小鼠具有10 4SARS-CoV-2 pfu/肺，而在沒有MATRIX-M TM的情況下用BV2363免疫的小鼠具有10 3pfu/肺（ 圖 16）。僅BV2373加MATRIX-M TM初次免疫的小鼠展現出病毒力價的劑量依賴性降低，其中在感染後第4天，10 μg BV2373劑量的接受者沒有可檢測的病毒。與接種安慰劑的小鼠相比，接受1 μg、0.1 μg和0.01 μg BV2373劑量的小鼠均顯示出力價顯著降低。在初次免疫/加強免疫組中，用10 μg、1 μg和0.1 μg劑量免疫的小鼠具有幾乎不可檢測的肺病毒載量，而0.01 µg組相對於安慰劑動物顯示降低1個對數的降低。
體重減輕與病毒載量的發現結果平行。與未接種疫苗的安慰劑動物相比，接受單劑量的BV2373（0.1 μg、1 μg和10 μg）和MATRIX-M TM的動物顯示出顯著預防體重減輕（ 圖 17A）。在所有劑量水準下，接受初免和加強劑量加佐劑的小鼠也均展現出顯著預防體重減輕（ 圖 17B- 圖 17C）。評價了佐劑的存在對預防體重減輕的作用。相對於安慰劑，接受初次免疫/加強免疫（兩個劑量） + 佐劑的小鼠顯著被保護免於體重減輕，而在沒有佐劑的情況下免疫的組則沒有（ 圖 17C）。這些結果表明，BV2373賦予預防SARS-CoV-2，並且與較低的血清學反應相關的低劑量疫苗不會加劇體重減輕或展現出疾病加重。
在感染後第4天和第7天評價了肺組織病理學（ 圖 18A和 圖 18B）。在感染後第4天，經安慰劑免疫的小鼠顯示出在大氣道中的上皮細胞剝蝕以及由混合炎性細胞群包圍的肺泡隔增厚。在整個肺中觀察到外周小動脈成套有炎性細胞，其主要由嗜中性粒細胞和巨噬細胞組成。到感染後第7天，經安慰劑處理的小鼠顯示細支氣管周炎症和外周小動脈成套增加。肺泡隔增厚在整個肺泡隔中仍伴有彌漫性間質性炎症增加（ 圖 18B）。
經BV2373免疫的小鼠在感染後第4天和第7天都顯示出肺部病理以劑量依賴性方式顯著降低。與安慰劑小鼠相比，僅初次免疫組在10 μg和1 μg劑量下顯示炎症減少，其中支氣管和小動脈周圍炎症減少。在較低劑量的僅初次免疫組中，肺部炎症類似於安慰劑組，與體重減輕和肺部病毒力價相關。對於所有測試劑量，初次免疫/加強免疫免疫組都顯示肺部炎症顯著降低，這再次與肺部病毒力價和體重減輕資料相關。在第4天和第7天，基本上保留大支氣管和小支氣管中的上皮細胞，其中細支氣管脫落和病毒感染跡象最小。用10 μg、1 μg和0.1 µg劑量免疫的動物的小動脈具有最少的炎症，其中在0.01 µg劑量的情況下僅觀察到適度的成套，類似於安慰劑。在接受較高劑量的動物中肺泡炎症減少，其中僅較低的0.01 μg劑量與炎症相關（ 圖 18A- 圖 18B）。這些資料證明，BV2373減少攻擊後的肺部炎症，並且甚至引起最小或沒有引起可檢測的中和活性的BV2373的劑量和方案也與對病毒的炎性反應加劇不相關。此外，疫苗不會在受攻擊的小鼠中引起疫苗相關的增強型呼吸系統疾病（VAERD）。 T 細胞反應
評價了包含SEQ ID NO: 87的CoV S多肽的疫苗組合物對T細胞反應的影響。以間隔21天的2個劑量用10 μg BV2373加或不加5 μg MATRIX-M TM肌內免疫BALB/c小鼠（每組N = 6）。在第二次免疫後7天（研究第28天）收集脾臟。未接種疫苗的組（N = 3）用作對照。
通過ELISPOT TM酶聯免疫吸附測定和細胞內細胞介素染色（ICCS）測量來自第二次免疫後7天（研究第28天）收集的脾臟的抗原特異性T細胞反應。與單獨的BV2373相比，在用BV2373和MATRIX-M TM免疫的小鼠的脾臟中，離體刺激後IFN-γ分泌性細胞的數量增加了20倍（p = 0.002），如通過ELISPOT TM測定所測量的（ 圖 19）。為了分開檢查CD4+和CD8+ T細胞反應，與表面標記物染色組合進行了ICCS測定。所示出的資料在CD44hi CD62L-效應記憶T細胞群上進行門控。與在沒有佐劑的情況下免疫的小鼠相比，在來自用BV2373免疫的小鼠的脾臟中IFN-γ+、TNF-α+和IL-2+細胞介素分泌性CD4+和CD8+ T細胞的頻率顯著更高（p ＜ 0.0001）（ 圖 20A- 圖 20C和 圖 21A- 圖 21C）。此外，與在不存在佐劑的情況下免疫的小鼠相比，在來自經BV2373/MATRIX-M TM免疫的小鼠的脾臟中同時產生至少兩種或三種細胞介素的多功能性CD4+和CD8+ T細胞的頻率也顯著增加（p ＜ 0.0001）（ 圖 20D- 圖 20E和 圖 21D- 圖 21E）。用BV2373/MATRIX-M TM免疫在CD4+和CD8+ T細胞群內都產生了更高比例的多功能表型（例如，分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2中的多於一種的T細胞）。在記憶CD4+ T細胞中檢測到的多功能表型的比例高於在CD8+ T細胞中的比例（ 圖 22）。
還分別通過ICCS和ELISPOT TM測定了CD4+ T細胞的2型細胞介素IL-4和IL-5分泌。與單獨用BV2373免疫相比，用BV2373/MATRIX-M TM免疫還增加了2型細胞介素IL-4和IL-5分泌（2倍），但程度小於1型細胞介素產生的增強（例如IFN-γ增加20倍）（ 圖 23A- 圖 23C）。這些結果表明，MATRIX-M TM佐劑的投予使CD4+ T細胞偏向產生Th1反應。
通過測量脾臟中CD4+濾泡輔助性T（TFH）細胞和生發中心（GC）B細胞的頻率來評估免疫對生發中心形成的影響。MATRIX-M TM投予顯著增加了脾臟中TFH細胞（CD4+ CXCR5+ PD-1+）的頻率（p = 0.01）以及GC B細胞（CD19+GL7+CD95+）的頻率（p = 0.0002）（ 圖 24A- 圖 24B和 圖 25A- 圖 25B）。 實例 3 冠狀病毒刺突（ S ）多肽奈米顆粒疫苗在橄欖狒狒中的免疫原性
評估了包含BV2373的疫苗組合物在狒狒中的免疫原性。通過肌內（IM）注射以間隔21天的兩個劑量投予一系列劑量（1 μg、5 μg和25 μg）的BV2373和50 μg MATRIX-M TM佐劑來免疫成年橄欖狒狒。為了評估MATRIX-M TM在非人靈長類動物中的輔助活性，在沒有MATRIX-M TM的情況下用25 μg的BV2373免疫另一組動物。在所有劑量水準下，在用BV2373/MATRIX-M TM免疫的動物中，在單次初次免疫的21天內均檢測到抗S蛋白IgG力價（GMT = 1249-19,000）。在所有劑量水準下，加強免疫後1至2週（第28天和第35天）內，抗S蛋白IgG力價均增加超過一個對數（GMT = 33,000-174,000）。 （圖 26A ）。
用BV2373（5 μg或25 μg）和MATRIX-M TM單次免疫後，在動物中檢測到低水準的hACE2受體阻斷抗體（GMT = 22-37）。在用BV2373/MATRIX-M TM免疫的所有組中，在加強免疫的一至二週內，受體阻斷抗體力價均顯著增加（GMT = 150-600）（ 圖 26B）。在用BV2373/MATRIX-M TM單次免疫後，在所有劑量組中，病毒中和抗體均升高（GMT = 190-446）。單獨用25 μg BV2373免疫的動物沒有可檢測的阻斷S蛋白與hACE2結合的抗體（ 圖 26C）。加強免疫後一週，中和力價增加6倍至8倍（GMT = 1160-3846）。第二次免疫後，中和力價再增加25倍至38倍（GMT = 6400-17,000）（ 圖 26C）。抗S IgG水準與中和抗體力價之間存在顯著相關性（p ＜ 0.0001）（ 圖 27）。佐劑化疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性與實例2的結果一致，並且進一步支持MATRIX-M TM在促進中和抗體的產生和劑量節省中的作用。
在第二次免疫後7天（第28天）收集PBMC，並且通過ELISPOT測定測量了T細胞反應。來自用BV2373（5 μg或25 μg）和MATRIX-M TM免疫的動物的PBMC具有最高數量的IFN-γ分泌性細胞，其是單獨用25 μg BV2373或BV2373（1 μg）和MATRIX-M TM免疫的動物的所述數量的5倍（ 圖 28）。通過ICCS分析，用BV2373（5 μg）和MATRIX-M TM免疫顯示出IFN-γ+、IL-2+和TNF-α+ CD4+ T細胞的最高頻率（ 圖 2 9A- 圖 29C）。這種趨勢對於同時產生至少兩種或三種1型細胞介素的多功能性CD4+ T細胞也是如此（ 圖 29D- 圖 29E）。 實例 4. 冠狀病毒刺突（ S ）多肽奈米顆粒疫苗的結構表徵
使用透射電子顯微術（TEM）和二維（2D）類別取平均值來確定BV2373的超微結構。負染色的BV2373的高放大率（67,000倍和100,000倍）TEM圖像顯示出對應於S蛋白同三聚體的顆粒。
自動拾取方案用於構築2D類別平均圖像（Lander G.C.等人 J Struct Biol. 166, 95-102 (2009)；Sorzano C.O.等人, J Struct Biol.148, 194-204 (2004).）。對同三聚體結構進行的兩輪2D類別取平均值揭示出了具有15 nm長度和13 nm寬度的三角形顆粒外觀（ 圖 10 ，左上方）。將最近解析的SARS-CoV-2刺突蛋白（EMD ID：21374）的cryoEM結構覆蓋在2D BV2373圖像上顯示出與冠形S1（NTD和RBD）和S2莖的良好符合（ 圖 10 ，左下方）。在2D圖像中同樣明顯的是從與NTD/RBD冠相對的三聚體結構的尖端突出的微弱投影（ 圖 10 ，右上方）。使用較大盒尺寸進行的2D類別取平均值表明，這些微弱的投影形成了S三聚體與無定形結構之間的連接。（ 圖 10 ，右下方）。
動態光散射（DLS）表明，與BV2365（33.4 nm）和BV2373（27.2 nm）的小2倍的細微性相比，野生型CoV S蛋白具有69.53 nm的Z-avg粒徑。多分散性指數（PDI）表明，與野生型刺突蛋白（PDI = 0.46）相比，BV2365和BV2373顆粒在尺寸、形狀和質量方面總體上是均勻的（PDI = 0.25-0.29）（表3）。
表 3 ： SARS-CoV-2 三聚體刺突蛋白的細微性和熱穩定性
SARS-CoV-2 S 蛋白 差示掃描量熱法 (DSC) 動態光散射 (DLS)
T max(ºC) 1 ΔHcal (kJ/mol) Z-avg 直徑 2 (nm) PDI 3
野生型 58.6 153 69.53 0.46
BV2365 61.3 466 33.40 0.25
BV2373 60.4 732 27.21 0.29
1T max：熔解溫度 2Z-avg：Z平均細微性 3PDI：多分散性指數
通過差示掃描量熱法（DSC）測定了S三聚體的熱穩定性。野生型CoV S蛋白的熱轉變溫度（T max= 58.6ºC）與分別為T max= 61.3ºC和60.4ºC的BV2365和BV2373相似（表3）。更重要的是，與展開WT刺突蛋白所需的較低焓（ΔHcal = 153 kJ/mol）相比，展開BV2365和BV2373變體所需的轉變焓增加3-5倍（分別為ΔHcal = 466和732 kJ/mol）。這些結果與和WT刺突蛋白的熱穩定性相比BV2365和BV2373的熱穩定性得到改善一致（表3）。
通過動態光散射評價了CoV刺突（S）多肽奈米顆粒疫苗的穩定性。使用各種pH、溫度、鹽濃度和蛋白酶來比較CoV刺突（S）多肽奈米顆粒疫苗與含有天然CoV刺突（S）多肽的奈米顆粒疫苗的穩定性。 實例 5. 冠狀病毒刺突（ S ）多肽奈米顆粒疫苗的穩定性
通過動態光散射評價了CoV刺突（S）多肽奈米顆粒疫苗的穩定性。使用各種pH、溫度、鹽濃度和蛋白酶來比較CoV刺突（S）多肽奈米顆粒疫苗與含有天然CoV刺突（S）多肽的奈米顆粒疫苗的穩定性。在不同的環境脅迫條件下使用hACE2捕獲ELISA評估了沒有2-脯胺酸取代的BV2365和具有兩個脯胺酸取代的BV2373的穩定性。將BV2373在極端pH下（在pH 4和pH 9下48小時）、伴隨長時間攪拌（48小時）和通過冷凍/解凍（2個循環）以及在升高的溫度下（在25ºC和37ºC下48小時）培育對hACE2受體結合沒有影響（IC50 = 14.0 - 18.3 ng mL-1）。
使用過氧化氫的氧化條件將hACE2與BV2373的結合降低8倍（IC50 = 120 ng mL-1）（ 圖 12A）。沒有2-脯胺酸取代的BV2365不太穩定，如通過在多種條件下hACE2結合的顯著損失所確定的（ 圖 12B）。
比較了BV2384（SEQ ID NO: 110）和BV2373（SEQ ID NO: 87）的穩定性。BV2384具有GSAS（SEQ ID NO: 97）的弗林蛋白酶切割位點序列，而BV2373具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的弗林蛋白酶切割位點。如通過SDS-PAGE和蛋白質印跡所展現的，與BV2373相比，BV2384顯示出廣泛的降解（ 圖 32）。此外，與BV2373（ 圖 34）相比，掃描光密度測定法和回收率資料展現了全長CoV S蛋白BV2384的意外損失 、較低的純度和回收率（ 圖 33）。 實例 6 在食蟹猴中的免疫反應
評估了BV2373在食蟹猴SARS-CoV-2感染模型中誘導的免疫反應。第1-6組按表4所示進行處理。
表 4 ：食蟹猴研究的第 1-6 組
組 (N=4) BV2373 劑量 MATRIX-M TM劑量 免疫(天數) 抽血 (天數) 攻擊 (天數)
1 安慰劑 - 0、21 0、21、33 35
2 2.5 µg 25 µg 0、21 0、21、33 35
3 5 µg 25 µg 0 0、21、33 35
4 5 µg 50 µg 0、21 0、21、33 35
5 5 µg 50 µg 0 0、21、33 35
6 25 µg 50 µg 0、21 0、21、33 35
投予包含BV2373的疫苗導致誘導抗CoV-S抗體（ 圖 35A），包括中和抗體（ 圖 35B）。在投予一個（ 圖 38A）或兩個劑量（ 圖 38B ）的BV2373後誘導了抗CoV-S抗體。投予包含BV2373的疫苗還導致產生阻斷CoV S蛋白與hACE2結合的抗體（ 圖 38C和 圖 38D）。在投予BV2373後，食蟹猴中抗CoV S多肽IgG力價與hACE2抑制力價之間存在顯著相關性（ 圖 38E）。通過致細胞病變效應（CPE）（ 圖 40A）和噬斑減少中和測試（PRNT）（ 圖 40B）評價了BV2373誘導中和抗體產生的能力。資料揭示，與對照相比，表4的疫苗配製品產生了SARS-CoV-2中和力價。
將包含能夠在食蟹猴中誘導抗CoV-S抗體和阻斷hACE2與CoV S蛋白結合的抗體的BV2373的疫苗與人恢復期血清進行了比較。資料揭示，與人恢復期血清相比，BV2373疫苗配製品誘導了優異的抗CoV S多肽和hACE2抑制力價（ 圖 39）。
BV2373疫苗配製品還引起了SARS-CoV-2病毒複製的減少（ 圖 36A- 圖 36B）。在用感染性病毒攻擊後2天和4天（d2pi和d4pi），在支氣管灌洗液（BAL）中評估病毒RNA（ 圖 36A，對應於存在的總RNA）和病毒次基因體RNA（sgRNA）（ 圖 36B，對應於複製病毒）水準。大多數受試者未示出病毒RNA。在第2天，在一些受試者中測量到少量RNA。到第4天，除了接受2.5 µg最低劑量的兩名受試者以外，都未測量到RNA。除了同樣接受最低劑量的1名受試者以外，在2天或4天均未檢測到次基因體RNA。在感染後2天和4天（d2pi和d4pi）通過鼻拭子評估病毒RNA（ 圖 37A）和病毒次基因體（sg）RNA（ 圖 37B）。大多數受試者未示出病毒RNA。在第2天和第4天，在一些受試者中測量到少量RNA。在2天或4天均未檢測到次基因體RNA。受試者在第0天進行免疫，並且在用兩個劑量的組中在第0天和第21天進行免疫。這些資料表明，疫苗將鼻總病毒RNA降低100-1000倍，並將sgRNA降低至不可檢測的水準，並且確認對疫苗的免疫反應將阻斷病毒複製並防止病毒傳播。 實例 7 CoV S 多肽奈米顆粒疫苗在人中的評價
在131名18-59歲健康參與者的隨機、觀察者盲性、安慰劑對照的1期臨床試驗中評估了包含BV2373的疫苗的安全性和功效。參與者進行了兩次肌內注射免疫，間隔21天。參與者接受加或不加MATRIX-M TM的BV2373（n = 106）或安慰劑（n = 25）。組A-E按表5所示進行處理。 圖 41示出了臨床終點的評價的時間線。
表 5 ： 1 期人類研究的組 A-E
組 (N=25) 參與者 第0天 第21天(+ 5天)
隨機 標記 BV2373 劑量 MATRIX-M TM劑量 BV2373 劑量 MATRIX-M TM劑量
A 25 - 0 µg 0 µg 0 µg 0 µg
B 25 - 25 µg 0 µg 25 µg 0 µg
C 25 3 5 µg 50 µg 5 µg 50 µg
D 25 3 25 µg 50 µg 25 µg 50 µg
E 25 - 25 µg 50 µg 0 µg 0 µg
總體反應原性是輕度的，並且疫苗接種耐受性良好。在用BV2373和MATRIX-M TM處理的患者中，局部反應原性更為常見（ 圖 42A- 圖 42B）。
評價了加和不加MATRIX-M TM的BV2373的免疫原性。疫苗接種後21天，所有疫苗方案均檢測到抗CoV-S抗體（ 圖 43A）。包含MATRIX-M TM的疫苗方案的幾何平均倍數上升（GMFR）超過了未佐劑化BV2373誘導的幾何平均倍數上升。第二次疫苗接種後7天（第28天），抗CoV-S力價相對於第一次疫苗接種時觀察到的反應再增加了八倍，並且在14天（第35天）內反應又再次增加超過一倍，達到GMFR相對於用單獨BV2373觀察到的GMFR是大約100倍。用BV2373/MATRIX-M TM單次疫苗接種達到的抗CoV-S力價水準與無症狀（暴露）COVID-19患者中的水準相似。第二次疫苗接種達到的GMEU水準超過了門診治療的COVID-19患者的恢復期血清六倍，達到了與COVID‑19住院治療患者的恢復期血清相似的水準，並且超過總恢復期血清抗CoV-S抗體近六倍。兩劑量5 µg和25 µg BV2373/MATRIX-M TM方案的反應是相似的。這突出了佐劑（MATRIX-M TM）使得能夠節省劑量的能力。
在用BV2373處理的所有組中均誘導了中和抗體（ 圖 43B）。用BV2373和MATRIX-M TM方案處理的組展現出的GMFR為單獨用BV2373處理的組的大約五倍（ 圖 43B）。與在沒有佐劑的情況下進行單次疫苗接種相比，在有佐劑的情況下進行第二次疫苗接種對中和抗體力價具有深遠的影響，誘導＞ 100倍的升高。當與恢復期血清相比時，用BV2373/MATRIX-M TM進行第二次疫苗接種達到的GMT水準是門診治療的COVID-19患者的四倍，其水準跨越COVID-19住院治療患者的水準，並且超過了總體恢復期血清GMT四倍。
從具有需要醫療護理的臨床症狀的COVID-19患者獲得的恢復期血清展現出隨著疾病嚴重性增加而增加的成比例的抗CoV-S IgG和中和力價（ 圖 43A- 圖 43B）。
在用BV2373和MATRIX-M TM處理的患者中觀察到中和抗體力價與抗CoV-S IgG之間的強相關性（r = 0.9466， 圖 44C），類似於在用恢復期血清治療的患者中觀察到的情況（r = 0.958）（ 圖 44A）。在投予未佐劑化BV2373的受試者中未觀察到這種相關性（r = 0.7616）（ 圖 44B）。5 µg和25 µg BV2373/MATRIX-M TM（表5的組C-E）均展現出相似的兩劑量反應幅度，並且當利用兩劑量方案時，使用任一測定測量表明每名參與者都進行了血清轉化。
16名參與者（組A至D各四名參與者）的T細胞反應表明，在用BV2373刺激後，在IFN-γ、IL-2和TNF-α產生方面，BV2373/MATRIX-M TM方案誘導了抗原特異性多功能性CD4+ T細胞反應。存在對Th1細胞介素產生的強烈偏向（ 圖 45A- 圖 45D）。 實例 8 下一代 CoV S 多肽奈米顆粒的表現、純化和評價
在杆狀病毒表現系統中表現具有SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的CoV S多肽，並且挑選並確認表現冠狀病毒刺突（S）多肽的重組噬斑。根據實例1中所述的方法純化包含所述蛋白質的奈米顆粒。具有SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190和SEQ ID NO: 192的序列的經純化SARS-CoV-2 S蛋白的tris乙酸凝膠示於 圖 75A中。經純化BV2373（SEQ ID NO: 87）的tris乙酸凝膠示於 圖 75B中。 圖 76A- 圖 76E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 76A）；SEQ ID NO: 186（ 圖 76B）；SEQ ID NO: 190（ 圖 76C）；SEQ ID NO: 192（ 圖 76D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 76E）的胺基酸序列的蛋白質的細微性分佈，如通過動態光散射（DLS）所測定。DLS參數見下表。
SEQ ID NO: Z-Avg ( 大小， d.nm) PDI 濃度 (mg/Ml)
188 40.42 ± 1.067 0.2103 ± 0.0068 0.1
186 39.01± 0.684 0.2158 ± 0.00819 0.1
190 33.0 ± 0.421 0.225 ± 0.00287 0.1
192 36.84 ± 0.6845 0.258 ± 0.008192 0.1
87 32 ± 1.0 0.17 ± 0.04 0.1
圖 77A- 圖 77E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 77A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 77B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 77C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 77D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 77E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的HPLC-SEC跡線。每種蛋白質的濃度和每種蛋白質的滯留時間示於下表中。
SEQ ID NO: 蛋白質濃度 (mg/Ml) 滯留時間 (min)
188 0.492 8.281
186 1.0 8.181
190 0.99 8.040
192 1.04 8.054
87 0.484 7.913
圖 78A- 圖 78E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 78A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 78B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 78C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 78D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 78E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的結合動力學。
圖 79A- 圖 79E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 79A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 79B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 79C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 79D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 79E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白與hACE2的結合。 圖 80A- 圖 80E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 80A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 80B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 80C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 80D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 80E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的熱穩定性。
SEQ ID NO: 實驗中使用的蛋白質濃度 (mg/mL) T m1 T m2 ΔH1 ΔH2
188 0.95 59.89 63.75 352.3 886.0
186 1.0 55.67 62.07 180. 950.4
190 0.99 59.46 64.10 517.8 1525
192 1.04 58.87ºC 63.28ºC 106.4 1367.0
87 0.83 56.75 63.08 517.0 1330.0
每種蛋白質的特徵的概述見下表。
變體 純度 % 產率 (mg/L) 產量 mg rS/(g WCW) hACE2 結合動力學 (k a)(1/Ms) hACE2 結合 ELISA EC50 ： ng/ml DSC Tm-1(ºC) ΔH 1(kJ/mol) DLS Z- 平均值 (nm) PDI
SEQ ID NO: 188 97.9 6.01 0.34 4.33E+04 8.28ng/ml Tm 263.28 ΔH 21332.0 53.19 ± 0.2679 0.2355 ± 0.01124
SEQ ID NO: 195 97.6 4.1 0.264 2.70E+04 16.7ng/ml Tm 262.65 ΔH 21172 40.54 ± 0.8775 0.2501 ± 0.000906
SEQ ID NO: 186 93.3 4.6 0.295 1.62E+04 29.2ng/ml Tm 262.07 ΔH 2950.4 39.01 ± 0.6845 0.2158 ± 0.008192
SEQ ID NO: 190 97.8 6.32 0.322 1.35E+04 14.1ng/ml Tm 264.10 ΔH 21525 33.3 ± 0.303 0.207 ± 0.0121
SEQ ID NO: 192 98.92 5.7 0.359 3.76E+04 5.78ng/ml Tm 263.28 ΔH 21367 36.84 ± 0.6845 0.258 ± 0.008192
在杆狀病毒表現系統中表現具有SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115和SEQ ID NO: 175的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S多肽，並且挑選並確認表現冠狀病毒刺突（S）多肽的重組噬斑。使用具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的N末端信號肽來表現具有SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115和SEQ ID NO: 175的序列的SARS-CoV-2 S多肽。
具有SEQ ID NO: 112的序列的SARS-CoV-2 S多肽包含Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
具有SEQ ID NO: 113的序列的SARS-CoV-2 S多肽包含Asp-601至甘胺酸的突變、Asn-488至酪胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
具有SEQ ID NO: 114的序列的SARS-CoV-2 S多肽包含胺基酸56、57和131的缺失、Asn-488至酪胺酸的突變、Ala-557至天門冬胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Pro-668至組胺酸的突變、Thr-703至異白胺酸的突變、Ser-969至丙胺酸的突變、Asp-1105至組胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ（SEQ ID NO: 7）的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
具有SEQ ID NO: 115的序列的SARS-CoV-2 S多肽包含Asn-488至酪胺酸的突變、Asp-67至丙胺酸的突變、Leu-229至組胺酸的突變、Asp-202至甘胺酸的突變、Lys-404至天門冬醯胺酸的突變、Glu-471至離胺酸的突變、Ala-688至擷胺酸的突變、Asp-601至甘胺酸的突變、Lys-973和Val-974至脯胺酸的突變以及具有QQAQ的胺基酸序列的滅活的弗林蛋白酶切割位點。
如實例1中產生SARS-CoV-2 S多肽奈米顆粒。如實例2-7中評價前述SARS-CoV-2 S的穩定性和免疫原性。 實例 9 BV2373 和皂苷佐劑誘導針對異源 SARS-CoV-2 毒株的保護性免疫反應
目的：我們在英國33個地點在接受了兩次間隔21天的肌內5 µg劑量的BV2373和皂苷佐劑（級分A和級分C iscom基質，在本實例中也稱為MATRIX-M TM）或安慰劑（1 : 1）的18-84歲成人中進行了一項3期、隨機、觀察者設盲、安慰劑對照試驗。主要功效終點是在第二次疫苗接種後7天發作的病毒學證實的輕度、中度或重度COVID-19。
共有15,187名參與者被隨機化，其中7569名參與者接受了BV2373和MATRIX-M TM，並且7570名參與者接受了安慰劑；27.8%為65歲或以上，並且4%具有SARS-CoV-2感染的基線血清學證據。BV2373和MATRIX-M TM接受者中有10例COVID-19，並且安慰劑接受者中有96例，且在第二次疫苗接種後至少7天症狀發作；BV2373和MATRIX-M TM在預防COVID-19方面的有效性為89.7%（95%信賴區間，80.2至94.6）。有五例重度COVID-19，所有病例均在安慰劑組中報告。事後分析揭示，針對原型SARS-CoV-2毒株和B.1.1.7變種的功效分別為96.4%（73.8至99.5）和86.3%（71.3至93.5）。原型SARS-CoV-2毒株包含具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S蛋白。B.1.1.7變種包含具有胺基酸56、57和131的缺失以及N488Y、A557D、D601G、P668H、T703I、S969A和D1105H的突變的CoV S蛋白，其中CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。在包括具有合併症的參與者和≥ 65歲的參與者的各亞組之間的疫苗功效是相似的。反應原性通常是輕度和短暫的，並且在投予了BV2373和MATRIX-M TM的組中更頻繁地發生。嚴重不良事件發生率在兩組中較低且相似。BV2373和MATRIX-M TM的兩劑量方案對原型和B.1.1.7變種的摻混物具有89.7%功效，且安全性特徵與其他授權的COVID-19疫苗的安全性特徵相似。
方法：試驗設計和參與者：我們評估了間隔21天肌內投予的兩個5 µg劑量的BV2373和MATRIX-M TM或安慰劑的安全性和有效性。這項3期試驗在英國的33個招募地點進行。有資格的參與者是18至84歲（含）的男性和非妊娠女性，他們是健康的或患有穩定的慢性醫學病症，包括但不限於人類免疫缺陷病毒以及心臟和呼吸系統疾病。篩查時評估的健康狀況是基於病史、生命體征和體檢。關鍵排除標準包括有記錄的COVID-19病史、使用免疫抑制療法的治療或診斷為患有免疫缺陷病。
根據預先生成的隨機化時間表，使用集中的互動式回應技術系統將參與者經由區組隨機化以1 : 1比率隨機分配以接受間隔21天的兩個劑量的BV2373和MATRIX-M TM或安慰劑（生理鹽水）。隨機化按地點和年齡 ≥ 65歲進行分層。在一項400人的子研究中，參與者接受與所述第一劑量一起的伴隨劑量的季節性流感疫苗。這是一項觀察者設盲的研究。
每次接種疫苗後，參與者在研究地點保持觀察至少30分鐘以監測是否存在任何急性反應。在參與者的亞組（徵集性不良事件亞組）中，在每個劑量後的7天內經由電子日誌收集徵集性局部和全身性不良事件。評估了所有參與者從第一劑量直到第二劑量後28天的非徵集性不良事件；評估了從第一劑量直到第二劑量後1年的嚴重不良事件、特別關注的不良事件和醫療護理不良事件。報告了接受至少一個劑量的疫苗或安慰劑的所有參與者的安全性資料。
安全性和功效：主要終點是BV2373和MATRIX-M TM針對首次出現的病毒學證實的在基線時血清陰性的參與者中第二次疫苗接種後至少7天發作的症狀性輕度、中度或重度COVID-19的功效。症狀性COVID-19是根據美國食品和藥物管理局（FDA）標準定義的。
在整個試驗過程中監測疑似COVID-19的症狀，並使用COVID-19電子症狀日誌（流感患者報告的結局[FLU-PRO ©]問卷）收集其至少10天。在COVID-19的疑似症狀發作時，在3天的時間內每天收集鼻子和咽喉的呼吸道樣本以確認SARS-CoV-2感染。使用聚合酶鏈式反應（PCR）測試（UK DHSC實驗室）與Thermo TaqPath™系統（Thermo Fisher Scientific，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州，美國）進行病毒學證實。
在接受至少一個劑量的BV2373和MATRIX-M TM或安慰劑的所有參與者中分析安全性並進行描述性總結。還通過FDA毒性分級標準和每次注射後的持續時間總結了徵集性局部和全身性不良事件。非徵集性不良事件使用監管活動醫學詞典（MedDRA）23.1版按首選術語和系統器官類別進行編碼，並按嚴重程度和與研究疫苗的關係進行總結。
依據對於實現主要終點的統計顯著性所預期的事件總數設計並驅動試驗– 100例輕度、中度或重度Covid-19病例的目標。選擇用於最終分析的100例目標數量以提供 ＞ 95%把握度（power）以實現70%或更高的疫苗功效。基於使用Pocock邊界條件的總預期主要終點的約50%（50個事件）的累積，對功效進行了單次中期分析。在對於主要終點的總體單側I型錯誤率0.025下進行了對於主要目標的中期和最終分析的主要（假設檢定）事件驅動的分析。在基線時呈血清陰性、接受了兩個劑量的研究疫苗或安慰劑、沒有影響主要終點的重大方案偏差，並且在第二次注射後6天內沒有確認的症狀性Covid-19病例的參與者（符合方案功效群體）中分析了主要終點。疫苗功效定義為E（%）= (1 - RR) ×100，其中RR = 兩個研究組（BV2373和MATRIX-M TM或安慰劑）之間的發病率的相對風險。平均疾病發病率被報告為1000人中每年的發病率。估計的RR及其信賴區間（CI）是使用泊松回歸在穩健誤差方差下得出的。針對無效假設：H0：疫苗功效 ≤ 30%進行了主要終點的假設檢定。成功標準需要拒絕無效假設以證明統計上顯著的疫苗功效。
在2020年9月28日至11月28日之間，篩選了16,645名參與者，並將15,187名參與者隨機化（ 圖 47）。共有15,139名參與者接受了至少一個劑量的BV2373和Matrix-M TM（7569）或安慰劑（7570），其中14,039名參與者（BV2373和MATRIX-M TM組中的7020和安慰劑組中的7019）滿足對於符合方案功效群體的標準。在符合方案功效群體中基線人口統計學在BV2373和MATRIX-M TM與安慰劑組之間平衡良好，其中48.4%為女性，94.5%為白人，0.4%為黑人或非裔美國人，0.8%為西班牙人或拉丁美洲人，並且44.6%具有至少一種合併症病症（基於疾病控制和預防中心[CDC]定義）。這些參與者的中值年齡為56歲，並且27.9%為 ≥ 65歲。表6提供了臨床試驗參與者的基線人口統計學的總結。
表6：臨床試驗參與者的人口統計學和基線特徵
BV2373 和 MATRIX-M TMn=7020 安慰劑 n = 7019 總計 N = 14,039
年齡，歲 中值 範圍    56.0 18, 84    56.0 18, 84    56.0 18, 84
   年齡組，n (%) 18-64歲 ≥ 65歲    5067 (72.2) 1953 (27.8)    5062 (72.1) 1957 (27.9)    10129 (72.1) 3910 (27.9)
   性別，n（%） 男性 女性       3609 (51.4) 3411 (48.6)       3629 (51.7) 3390 (48.3)       7238 (51.6) 6801 (48.4)
   種族或族群，n (%) 白人 黑色人種或非裔美國人 亞洲人 美洲印第安人或阿拉斯加土著人 夏威夷土著人或其他太平洋島民 多重 未報告 其他 丟失 西班牙人或拉丁美洲人    6625 (94.4) 26 (0.4) 201 (2.9) 4 (＜0.1) 1 (＜0.1) 70 (1.0) 85 (1.2) 4 (＜0.1) 4 63 (0.9)       6635 (94.5) 26 (0.4) 212 (2.9) 0 0 59 (0.8) 79 (1.1) 6 (＜0.1) 2 51 (0.7)       13260 (94.5) 52 (0.4) 413 (2.9) 4 (＜0.1) 1 (＜0.1 136 (0.9) 176 (1.2) 11 (＜0.1) 8 114 (0.8)   
   SARS-CoV-2血清學狀況，n (%) 陰性 陽性 丟失       6964 (99.2%) 0 56       6944 (98.9) 0 75       13908 (99.1) 0 131
   BMI，kg/m 2，n (%) ＞ 30.0：肥胖       313 (4.5)          323 (4.6)       636 (4.5)   
   合併症狀態* 是 否    3117 (44.4) 3903 (55.6)    3143 (44.8) 3876 (55.2)    6260 (44.6) 7779 (55.4)
SD，標準差；體重指數（BMI）計算為重量（kg）除以身高（m）的平方。百分比是基於每次處理內和總體上設定的符合方案功效分析。*合併症受試者是那些被鑒定的具有被報告為病史的合併症病症的至少一種或具有篩查BMI值大於30 kg/m 2的人。
徵集性不良事件亞組包括2714名參與者。總體而言，BV2373和MATRIX-M TM接受者在第一劑量（59.4%相比於20.9%）和第二劑量（80.2%相比於17.0%）兩個劑量之後報告徵集性局部不良事件的頻率均高於安慰劑接受者（ 圖 50）。
在BV2373和MATRIX-M TM接受者中，在第一劑量（54.9%和30.7%）和第二劑量（76.6%和51.9%）兩個劑量之後最常報告的局部不良事件均為注射部位壓痛和疼痛，其中大多數事件在嚴重程度方面為1級（輕度）或2級（中度），並且平均持續時間較短（在第一劑量後2.3天和1.7天，並且在第二劑量後2.8天和2.2天）。較年輕的BV2373和MATRIX-M TM接受者（18至64歲）比較年長的BV2373和MATRIX-M TM接受者（≥ 65歲）更頻繁地報告徵集性局部不良事件。
總體而言，BV2373和MATRIX-M TM接受者在第一劑量（47.6%相比於37.9%）和第二劑量（64.6%相比於30.8%）兩個劑量之後報告徵集性全身性不良事件的頻率均高於安慰劑接受者（ 圖 50）。在BV2373和MATRIX-M TM接受者中，在第一劑量（24.5%、22.3%和20.5%）和第二劑量（40.7%、41.1%和41.0%）兩個劑量之後最常報告的全身性不良事件均為頭痛、肌肉疼痛和疲勞，其中大多數事件在嚴重程度方面為1級或2級，並且平均持續時間較短（在第一劑量後1.6天、1.5天和1.9天，並且在第二劑量後1.9天、1.8天和1.9天）。在第一劑量後在兩名BV2373和MATRIX-M TM參與者中報告了4級全身性不良事件，並且在第二劑量後在一名BV2373和MATRIX-M TM參與者中報告了4級全身性不良事件。較年輕的疫苗接種者比較年長的疫苗接種者更頻繁地報告全身性不良事件，並且在劑量2後比在劑量1後更頻繁地報告全身性不良事件。值得注意的是，在第一劑量和第二劑量後在2.3%和5.1%的BV2373和MATRIX-M TM參與者中報告了發熱（體溫 ≥ 38ºC），其中在第一劑量和第二劑量後分別在0.4%和0.6%的參與者中報告了3級發熱（39ºC-40ºC）；在每個劑量的疫苗後均報告了一次4級發熱（＞ 40ºC）。
截至最終功效分析的資料截止日期接受了至少一個劑量的疫苗或安慰劑的所有15,139名參與者均針對非徵集性不良事件進行評估。在BV2373和MATRIX-M TM接受者中未記錄設定的不良事件的頻率高於安慰劑接受者（25.3%相比於20.5%），其中重度不良事件（1.0%相比於0.8%）、嚴重不良事件（0.5%相比於0.5%）、醫療護理不良事件（3.8%相比於3.9%）、導致疫苗中斷的不良事件（0.3%相比於0.3%）或導致研究中斷的不良事件（0.2%相比於0.2%）、潛在的免疫介導的醫學病症（＜ 0.1相比於＜ 0.1%）以及與COVID-19相關的特別關注的不良事件（0.1%相比於0.3%）具有相似頻率。在BV2373和MATRIX-M TM接受者中報告了一個相關的嚴重不良事件（心肌炎），這被認為是一種潛在的免疫介導的病症；獨立的SMC認為所述事件很可能是病毒性心肌炎。參與者得到恢復。沒有過敏性反應發作，並且也沒有疫苗相關的疾病加重的跡象。報告了兩例COVID-19相關的死亡，一例在BV2373和MATRIX-M TM組中且在接受單個疫苗劑量後7天症狀發作，並且另一例在安慰劑組中。
在符合方案功效群體中的14,039名參與者中，有10例病毒學證實的、症狀性輕度、中度或重度COVID-19且在疫苗接受者中第二劑量後至少7天發作（每1000人年有6.53人；95% CI：3.32至12.85）以及在安慰劑接受者中為96例（每1000人年有63.43人；95% CI：45.19至89.03），疫苗功效為89.7%（95% CI，80.2至94.6； 圖 49）。在 ≥ 65歲的患有輕度、中度或重度Covid-19的10例病例中，一例已經接受過BV2373和MATRIX-M TM並且九例已經接受過安慰劑。在五名參與者中發生了重度COVID-19，其中沒有人接受過BV2373和MATRIX-M TM，並且五名已經接受過安慰劑。符合方案疫苗接種者中沒有住院治療或死亡。≥ 65歲參與者中的疫苗功效為88.9%（95% CI，12.8至98.6），並且在劑量1之後14天的功效為83.4%（95% CI，73.6至89.5）（ 圖 49）。對主要終點的事後分析鑒定了29、66和11例Covid-19，其中分離毒株分別為SARS CoV-2原型毒株、SARS-CoV-2 B.1.1.7變種或未知毒株。未知樣品是那些使用非DHSC PCR測試進行PCR測試（例如，在當地醫院實驗室）的樣品，其中未進行變種測定。針對原型毒株的疫苗功效為96.4%（95% CI，73.8至99.4），而針對B.1.1.7變種的功效為86.3%（95% CI，71.3至93.5）。（ 圖 49）。
討論：發現間隔21天給予的BV2373和MATRIX-M TM的兩劑量方案是安全的，並且針對由原型和B.1.1.7變種二者引起的症狀性COVID-19的有效性為89.7%。本研究中累積病例的時間允許針對包括B.1.1.7變種在內的不同毒株的疫苗功效進行事後評估，所述變種現在在英國以外廣泛傳播，並且預計很快將在美國成為最主要的毒株。已知這種變種比先前的毒株更具傳染性，並且與更高的病死率相關，這強調了對有效疫苗的需求。這是第一個在3期試驗中證明對B.1.1.7變種具有高疫苗功效（86.3%）的疫苗。儘管所述研究沒有把握評估對於單獨SARS-CoV-2毒株的功效，但BV2373和皂苷佐劑對在試驗參與者中檢測到的所有毒株均顯示出顯著功效。特別地，針對原型毒株測定的96.4%功效點估計值與對於BNT161b2 mRNA 疫苗（95.0%）和mRNA-1273疫苗（94.1%）報告的針對該毒株的功效相似，並且高於腺病毒載體疫苗所顯示的功效。
最後，BV2373和皂苷佐劑組合物也顯示出針對B.1.351變種的功效。
預防重度疾病（包括住院治療、重症監護和死亡）是疫苗接種計畫的重要目標，並且BV2373和皂苷佐劑的兩劑量方案顯示出非常高的功效，類似於對於其他獲得許可的Covid-19疫苗所報告的功效。另外，BV2373和皂苷佐劑在第一劑量後提供的保護水準與其他COVID-19疫苗的保護水準在相似範圍內。在BV2373和皂苷佐劑的1/2期研究期間觀察到的有利的安全性特徵在該3期試驗中得到證實。反應原性一般為輕度或中度，並且在老年受試者中反應不太常見且較輕，並且在第二劑量後更常見。注射部位壓痛和疼痛、疲勞、頭痛和肌肉疼痛是最常報告的局部和全身性不良事件，並且在使用疫苗的情況下比安慰劑更常見。疫苗組和安慰劑組中的嚴重不良事件發生率相似（各為0.5%），並且沒有因接種疫苗而導致的死亡。
該試驗的結果提供了進一步的證據證明由原型SARS-CoV-2和SARS-CoV-2變種B.1.1.7引起的COVID-19可以通過免疫來預防，為基於蛋白質的佐劑化疫苗提供了第一個證據。這些資料證實BV2373和皂苷佐劑可以在標準冰箱溫度下儲存，此外，可以誘導對刺突蛋白抗原的廣泛表位反應。這種廣泛的反應提供了對一系列異源SARS-CoV-2毒株的保護性功效。 實例 10 BV2438 和皂苷佐劑誘導針對異源 SARS-CoV-2 毒株的保護性免疫反應
目的：評價了與皂苷佐劑的組合的含有重組CoV刺突（rS）蛋白BV2438（SEQ ID NO: 132）、BV2373（SEQ ID NO: 87）或兩者的組合物的免疫原性和體內保護。所述皂苷佐劑含有兩種iscom顆粒，其中：第一iscom顆粒包含皂樹的級分A而不包含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C而不包含皂樹的級分A。級分A和級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計85%和15%。
評價了單獨或與前述皂苷佐劑組合的BV2438和BV2373免疫方案針對SARS-CoV-2/WA1、SARS-CoV-2/B.1.1.7和SARS-CoV-2/B.1.351毒株的功效。SARS-CoV-2/WA1毒株具有含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S多肽。SARS-CoV-2/B.1.1.7毒株具有包含胺基酸69、70和144的缺失以及N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H的突變的CoV S多肽，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。SARS-CoV-2/B.1.351毒株具有包含D80A、L242H、R246I、A701V、N501Y、K417N、E484K和D614G的突變的CoV S多肽，其中所述CoV S多肽相對於具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2 S多肽編號。
方法：
細胞和病毒：病毒和細胞如前所述進行處理（18）。簡而言之，將Vero E6細胞（ATCC# CRL 1586）在補充有10%（v/v）胎牛血清（Gibco）、1%（v/v）青黴素/鏈黴素（Gemini Bio-產品）和1%（v/v）L-麩醯胺酸（2 mM終濃度，Gibco）的DMEM（Quality Biological）（Vero培養基）中培養。將細胞在37ºC和5% CO2下維持。SARS-CoV-2/WA1由CDC（BEI #NR-52281）提供。SARS-CoV-2/B.1.17和SARS-CoV-2/B.1.351由約翰霍普金斯大學的Andy Pekosz博士慷慨提供。當CPE開始可見時，通過感染Vero E6細胞兩天來製備兩種病毒的原液。通過離心收集和澄清培養基然後進行等分以在-80ºC下儲存。如前所述，使用Vero E6細胞通過噬斑測定測定原液的力價。
SARS-CoV-2 蛋白表現：SARS-CoV-2構築體由全長S醣蛋白基因序列（GenBank MN908947核苷酸21563-25384）合成產生。全長S基因經過密碼子優化以在草地貪夜蛾（Sf9）細胞中表現，並由GenScript（Piscataway，新澤西州，美國）合成產生。QuikChange Lightning定點誘變套組（Agilent）用於產生兩種刺突蛋白變體：弗林蛋白酶切割位點（682-RRAR-685）突變為682-QQAQ-685以具有蛋白酶抗性，並且在位置K986P和V987P（2P）處的兩個脯胺酸取代被引入以產生雙突變體BV2373。為了生成基於B.1.351變種的重組刺突構築體，還引入了以下點突變：D60A、D215G、L242H、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。在苜蓿銀紋夜蛾多角體啟動子的轉錄控制下，在pFastBac杆狀病毒轉移載體（Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州）中的BamHI-HindIII位點之間選殖了全長S基因。重組杆狀病毒構築體經噬斑純化，並且製備主種子原液並將其用於產生工作病毒原液。使用快速力價套組（Clontech，山景城，加利福尼亞州）測定杆狀病毒主原液力價和工作原液力價。通過以≤ 0.01噬斑形成單位（pfu）/細胞的感染複數（MOI）感染Sf9細胞來製備重組杆狀病毒原液。
表現和純化：如前所述，在Sf9細胞中產生SARS-CoV-2 S蛋白。簡而言之，將細胞在無血清培養基中擴增並用重組杆狀病毒感染。將細胞在27 ºC± 2ºC下培養，並在感染後68-72小時通過離心（4000 × g 15 min）收穫。將細胞沈澱物懸浮於含有白抑酶肽的25 mM Tris HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl和0.5%-1.0%（v/v）聚氧乙烯壬基苯酚（NP-9，TERGITOL®）NP-9中。用含有NP-9洗滌劑的Tris緩衝液從質膜提取S蛋白，通過以10,000 x g離心30 min澄清。通過TMAE陰離子交換和小扁豆凝集素親和層析純化S蛋白。中空纖維切向流過濾用於在25 mM磷酸鈉（pH 7.2）、300 mM NaCl、0.02%（v/v）聚山梨醇酯80（PS 80）中配製100-150 μg mL-1的純化刺突蛋白。通過用Gel-Code Blue試劑（Pierce，羅克福德，伊利諾州）染色的4%-12%梯度SDS-PAGE評價純化的S蛋白，並使用OneDscan系統（BD Biosciences，羅克維爾，馬里蘭州）通過掃描光密度測定法測定純度。
差示掃描量熱法：樣品（分別為：BV2426批次01Feb21和BV2373批次15Dec20；rS-B.1.351BV2438和rS-WU1BV2373）和相應的緩衝液以每分鐘1ºC的速度從4ºC加熱到120ºC，並且在NanoDSC（TA Instruments，紐卡斯爾，德拉瓦州）中測量差熱容量變化。進行單獨的緩衝液掃描以獲得基線，從樣品掃描中減去基線以產生基線校正的曲線。峰頂點所在的溫度是轉變溫度（Tmax），並且峰下面積提供轉變焓（ΔHcal）。
透射電子顯微術和 2D 類平均：電子顯微術由NanoImaging Services（聖地牙哥，加利福尼亞州）使用配備有FEI Eagle 4k x 4k CCD相機的在120keV下運行的FEI Tecani T12電子顯微鏡進行。將SARS-CoV-2 S蛋白在配製品緩衝液中稀釋至2.5 µg mL-1。將樣品（3 µL）施加至硝酸纖維素支撐的400目銅網格，並用鈾醯形式染色。在多個尺度上獲取每個網格的圖像以評估樣品的整體分佈。以150,000倍（X nm/圖元）和92,000倍（0.16 nm/圖元）的標稱放大倍率獲取高放大倍率圖像。這些圖像是在-2.0 µm至-1.5 µm（110,000倍）的標稱散焦和約25 e/Å 2的電子劑量下獲取的。
對於類平均，從92,000倍高放大倍率圖像識別出顆粒，然後如前所述進行比對和分類。
通過生物發光成像（BLI）測定SARS-CoV-2 S與hACE2受體結合的動力學：使用Octet QK384系統（Pall Forté Bio，菲蒙市，加利福尼亞州）通過生物膜層干涉測量術（BLI）測定S蛋白受體結合動力學。將His標記的人ACE2（2 μg mL-1）固定在帶鎳的Ni-NTA生物感測器尖端上。在基線後，SARS-CoV-2 rS蛋白溶液在動力學緩衝液中在300 nM至4.7 nM的範圍內連續稀釋2倍，允許締合600 sec，然後再解離600-900 sec。使用Octet軟體HT 10.0通過1 : 1全域曲線擬合分析資料。
小鼠研究設計：雌性BALB/c小鼠（7-9週齡，17-22克，每組N = 20只）通過肌內（IM）注射進行免疫，其中單獨的、組合的或作為異源初次免疫/加強免疫的與5 μg基於皂苷的Matrix-M™佐劑（Novavax, AB，烏普薩拉，瑞典）一起的rS-WU1BV2373、rS-B.1.351BV2438的兩個劑量間隔14天（研究第0天和第14天）。安慰劑組被注射作為陰性對照的疫苗配製品緩衝液。在研究第-1天、第14天、第21天和第32天收集血清進行分析。接種疫苗的動物和對照動物在研究第46天用SARS-CoV-2進行鼻內攻擊。 為了評估基質-皂苷佐劑介導的細胞反應，用上述相同的方案對雌性BALB/c小鼠組（每組N = 8只）進行IM免疫，其中注射間隔21天。在第二次免疫後7天（研究第28天）收集脾臟。未接種疫苗的組（N = 5）用作對照。
狒狒研究設計：將九隻成年狒狒（研究開始時為10-16歲）隨機分為4組，每組2-3只，並通過IM注射1、5或25 μg rS下的rS-WU1BV2373與50 μg基質-皂苷佐劑進行免疫。一個單獨的組用25 μg rS在無佐劑的情況下進行免疫。在該初次免疫系列中對動物進行疫苗接種，且2個劑量間隔21天。初次免疫系列後的免疫原性結果如前所述（15）。大約一年（45週）後，所有動物都用一個或兩個3 μg劑量的rS-B.1.351BV2438與50 μg基質-皂苷佐劑加強免疫。在加強免疫之前和之後收集血清和PBMC以測量抗體和細胞介導的免疫反應。
小鼠中的 SARS-CoV-2 攻擊：通過腹膜內注射50 μL在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中的甲苯噻嗪（0.38 mg/小鼠）和氯胺酮（1.3 mg/小鼠）的混合物來麻醉小鼠。小鼠鼻內接種在50 μL中的7 × 104 pfu的B.1.117或1 × 105 pfu的B.1.351 SARS-CoV-2毒株。在感染當天稱量受攻擊的小鼠，並且在感染後每天稱重持續4天。在感染後第2天和第4天，從每個疫苗接種組和對照組處死5只小鼠，並收穫肺以通過噬斑測定測定病毒力價，並通過qRT-PCR測定病毒RNA水準。
SARS-CoV-2 噬斑測定：通過使用1.0 mm玻璃珠（Sigma Aldrich）和Beadruptor（Omini International Inc.）在PBS（Quality Biological Inc.）中使收穫的肺勻漿化來量化SARS-CoV-2肺力價。將勻漿添加到Vero E6近匯合培養物中，並且使用6點稀釋曲線通過計數噬斑形成單位（pfu）來測定SARS-CoV-2病毒力價。
通過 ELISA 測定抗 SARS-CoV-2 刺突 IgG：使用ELISA測定抗SARS-CoV-2 S IgG力價。簡而言之，用1.0 µg mL-1的SARS-CoV-2刺突蛋白包被96孔微量滴定板（ThermoFischer Scientific，羅契斯特市，紐約州，美國）。用PBS-T洗滌板並將其用TBS Startblock封閉緩衝液（ThermoFisher, Scientific）封閉。將小鼠、狒狒或人血清樣品連續稀釋（10-2至10-8）並添加至封閉板，然後在室溫下培育2小時。培育後，用PBS-T洗滌板並添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgG或山羊抗人IgG（Southern Biotech，伯明罕，阿拉巴馬州，美國）持續1小時。用PBS-T洗滌板並添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺過氧化物酶底物（TMB，T0440-IL，Sigma，聖路易斯，密蘇里州，美國）。用TMB終止溶液（ScyTek Laboratories, Inc. 猶他州洛根城）終止反應。用SpectraMax Plus板讀取器（Molecular Devices，美國加利福尼亞州桑尼維爾）在450 nm的OD下讀取板，並且用SoftMax軟體分析資料。使用SoftMax Pro 6.5.1 GxP軟體通過4-參數擬合來計算EC50值。使用GraphPad Prism 7.05軟體繪製單獨動物抗SARS-CoV-2 S IgG力價和組幾何平均力價（GMT）和95%信賴區間（± 95% CI）。
hACE2 受體阻斷抗體：通過ELISA測定人ACE2受體阻斷抗體。將九十六孔板在4ºC下用1.0 μg mL-1 SARS-CoV-2 S蛋白包被過夜。在用PBS-T洗滌並用StartingBlock（TBS）封閉緩衝液（ThermoFisher Scientific）封閉後，將來自免疫的小鼠、狒狒或人組的連續稀釋血清添加至包被的孔中，並在室溫下培育1小時。洗滌後，在室溫下向孔中添加30 ng mL-1的組胺酸標記的hACE2（Sino Biologics，中國北京市）保持1小時。洗滌後，添加HRP綴合的抗組胺酸IgG（Southern Biotech, Birmingham，伯明罕，阿拉巴馬州，美國），然後洗滌並添加TMB底物。用SpectraMax Plus板讀取器（Molecular Devices，桑尼維爾，加利福尼亞州，美國）在450 nm的OD下讀取板，並且用SoftMax Pro 6.5.1 GxP軟體分析資料。使用SoftMax Pro程式中的以下方程式計算每個樣品的每個稀釋度的抑制%：100-[(平均結果/陽性對照下的對照值)*100]。 生成血清稀釋度與抑制%的關係圖，並通過4參數邏輯（4PL）曲線擬合至資料進行曲線擬合。在SoftMax Pro程式中測定了hACE2與SARS-CoV-2 S蛋白（BV2373或BV2438）的50%抑制（IC50）時的血清抗體力價。
通過噬斑減少中和力價測定（ PRNT ）測定的 SARS-CoV-2 中和力價：如前所述處理PRNT（20）。簡而言之，將血清樣品在DMEM（Quality Biological）中以1 : 40的初始稀釋度和1 : 2的連續稀釋度稀釋，總共11次稀釋。每個板上都包括無血清對照。然後將SARS-CoV-2以1 : 1添加至每個稀釋物中，以達到每個噬斑測定孔50 PFU的目標，並在37ºC（5.0% CO2）下培育1 h。然後通過噬斑測定來測定樣品力價，並與未處理對照相比確定中和力價。在PRISM（GraphPad，聖地牙哥，加利福尼亞州）中將4參數邏輯曲線擬合至這些中和資料，並基於該曲線擬合計算中和50%病毒所需的稀釋度（PRNT50）。
表面和細胞內細胞介素染色：對於表面染色，首先將鼠脾細胞與抗CD16/32抗體一起培育以阻斷Fc受體。為了表徵濾泡輔助性T細胞（Tfh），將脾細胞與以下抗體或染料一起培育：BV650綴合的抗CD3、APC-H7綴合的抗CD4、FITC綴合的抗CD8、Percp-cy5.5綴合的抗CXCR5、APC綴合的抗PD-1、Alexa Fluor 700綴合的抗CD19、PE綴合的抗CD49b（BD Biosciences，聖約瑟，加利福尼亞州）和黃色LIVE/DEAD®染料（Life Technologies，紐約州）。為了染色生發中心（GC）B細胞，將脾細胞用FITC綴合的抗CD3、PerCP-Cy5.5綴合的抗B220、APC綴合的抗CD19、PE-cy7綴合的抗CD95和BV421綴合的抗GL7（BD Biosciences）和黃色活性染料（LIVE/DEAD®）（Life Technologies，紐約州）進行標記。
對於鼠脾細胞的細胞內細胞介素染色（ICCS），將細胞以每孔2 × 106個細胞在96孔U型底板中培養。用rS-WU1BV2373或rS-B.1.351BV2438刺突蛋白刺激細胞。將板在37ºC下培育6 h，最後4 h在BD GolgiPlug™和BD GolgiStop™（BD Biosciences）的存在下培育。用針對CD3（BV650）、CD4（APC-H7）、CD8（FITC）、CD44（Alexa Fluor 700）和CD62L（PE）（BD Pharmingen，加利福尼亞州）的鼠抗體和黃色LIVE/DEAD®染料標記細胞。用Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）固定後，將細胞與PerCP-Cy5.5綴合的抗IFN-γ、BV421綴合的抗IL-2、PE-cy7綴合的抗TNF-α和APC綴合的抗IL-4（BD Biosciences）一起培育。使用LSR-Fortessa或FACSymphony流式細胞儀（Becton Dickinson，聖地牙哥，加利福尼亞州）獲取所有染色的樣品，並使用FlowJo軟體Xv10版（Tree Star Inc.，阿什蘭，俄勒岡）分析資料。
對於狒狒PBMC的ICS，在圖5A中列出的時間點收集的PBMC如上所述用rS-WU1BV2373或rS-B.1.351BV2438進行刺激。用人/NHP抗體BV650綴合的抗CD3、APC-H7綴合的抗CD4、FITC綴合的抗CD8、BV421綴合的抗IL-2、PerCP-Cy5.5綴合的抗IFN-γ、PE-cy7綴合的抗TNF-α、APC綴合的抗IL-15、BV711綴合的抗IL-13（BD Biosciences）和黃色LIVE/DEAD®活性染料標記細胞。
酶聯免疫吸附測定（ELISA）：按照製造商對於小鼠IFN-γ和IL-5 ELISpot套組（3321-2H和3321-2A，Mabtech，辛辛那提，俄亥俄州）的程式進行鼠IFN-γ和IL-5 ELISpot測定。簡而言之，在用抗IFN-γ或抗IL-5抗體預包被的板中用rS-WU1BV2373或rS-B.1.351BV2438刺激200 μL體積中的4 × 10 5個脾細胞。檢測二抗為殖株RS-6A2 IFN-γ和殖株TRFK4。每個刺激條件一式三份進行。將測定板在37ºC下在5% CO2培養箱中培養24-48 h，並使用BD ELISpot AEC底物組（BD Biosciences，聖地牙哥，加利福尼亞州）進行顯影。使用ELISpot讀取器和ImmunoSpot軟體v6（Cellular Technology, Ltd.，謝克海茨，俄亥俄州）對斑點進行計數和分析。通過減去培養基對照中的背景數量獲得IFN-γ或IL-5分泌性細胞的數量。圖中顯示的資料是一式三份孔的平均值。
類似地，使用來自Mabtech的NHP IFN-γ和人IL-4測定套組進行狒狒IFN-γ和IL-4測定。對於IFN-γ，使用包被抗體人IFN-γ 3420-2H和檢測抗體殖株7-B6-1。對於IL-4，使用包被抗體人IL-43410-2H（殖株IL4-I）和檢測抗體殖株IL4-II。一式三份地進行測定。
統計分析：使用GraphPad Prism 8.0軟體（拉荷亞，加利福尼亞州）進行統計分析。如圖所示繪製單獨動物的血清抗體力價和幾何平均力價（GMT）和95%信賴區間（95% CI）或平均值 ± SEM。對log10轉化資料進行普通單因素方差分析與Tukey多重比較事後檢定，以評價組間差異的統計顯著性。P值 ≤ 0.05被認為是統計上顯著的。
BV2438 抗原的生物物理特性、結構和功能：純化的BV2438在還原並進行SDS-PAGE時遷移，且預期分子量為約170 kDa（ 圖 52A）。通過差示掃描量熱法（DSC）比較了BV2438與BV2373的熱穩定性；與原型BV2373蛋白相比，BV2438的主峰顯示熱轉變溫度（T max）增加4ºC，且轉變焓（ΔHCal）為1.3倍高，表明BV2438具有增加的穩定性（ 圖 52B，表7）。對16,049個顆粒的透射電子顯微術（TEM）結合兩輪二維（2D）類平均用於確認BV2438的超微結構。高放大倍率（92,000x和150,000x）TEM圖像揭示長15 nm且寬11 nm的燈泡形顆粒外觀，這與SARS-CoV-2刺突三聚體的融合前形式一致（PDB ID 6VXX； 圖 52C）。這與我們先前對於原型BV2373蛋白所觀察到的一致。
為了確認變體刺突蛋白構築體BV2438的功能特性，如前所述使用生物膜層干涉測量術（BLI）測定該rS蛋白與hACE2受體的結合。發現BV2438與hACE2以3.94 × 10 4的結合常數（Ka）緊密且穩定地結合，其表示與hACE2的締合是與原型蛋白BV2373（Ka = 1.08 × 10 4）相比的3.6倍。這兩種蛋白質的解離常數基本相同（對於BV2438和BV2373分別為1.46 × 10 -7和1.56 × 10 -7）。我們還如前所述使用ELISA評估BV2438與hACE2的結合。在該測定中，BV2438在比原型構築體BV2373（EC 50= 9.4 ng/mL）略低的濃度（EC 50= 8.0 ng/mL）下得到了50%的hACE2飽和度，證實了與BV2373對於hACE2的親和力相比，BV2438展現出更高的對於hACE2的親和力（表7）。
表 7 ： SARS-CoV-2 重組刺突蛋白的熱穩定性和 hACE2 結合
SARS-CoV-2 rS 蛋白 差示掃描量熱法 (DSC) hACE2 結合
T max(ºC) ΔHcal (kJ mol -1) 生物膜層干涉測量術測定的 hACE2 結合動力學 hACE2 ELISA (EC 50, ng/mL)
K a(1/Ms) K dis(1/s)
BV2438 67.24 725.1 3.94 × 10 4 1.46 × 10 -7 8.0
BV2373 63.21 546.0 1.08 × 10 4 1.56 × 10 -7 9.4
T max，熔解溫度；K a，結合常數；K dis，解離常數；EC 50，半最大結合。
在小鼠中的 BV2438 免疫原性：我們評估了與皂苷佐劑一起配製的BV2438和BV2373的抗體和細胞介導的免疫原性。為了評估抗體介導的免疫原性，小鼠組（n = 20）用BV2373或BV2438作為初次免疫和加強免疫二者均進行了免疫，其中用BV2373作為初次免疫以及BV2438作為加強免疫，或其中將兩種疫苗組合在二價配製品中以進行初次免疫和加強免疫疫苗接種。安慰劑組接受作為陰性對照的疫苗配製品緩衝液。在單價免疫組中，在第0天和第14天肌內注射1 µg的rS和5 µg的皂苷佐劑。對於二價免疫，每次免疫時投予1 µg的每種rS構築體（總共2 µg rS）以及5 µg的皂苷佐劑。研究設計示於 圖 53中。用4種疫苗方案中的任何一種進行免疫的小鼠顯示出在疫苗接種後第21天通過ELISA測定的針對B.2刺突和B.1.351刺突的抗體力價升高。用BV2373或BV2438進行單價疫苗接種產生的抗S（WU1）IgG力價顯著低於二價疫苗接種或異源疫苗接種，但兩者降低的IgG力價均不超過2倍（ 圖 54A， 圖 54B）。相反，與所有其他免疫方案相比，單獨使用BV2373免疫導致顯著更低的針對B.1.351刺突的力價；使用單價BV2438或二價rS免疫導致抗B.1.351刺突IgG力價在所測試的方案中最高，且在這些方案之間力價沒有顯著差異（ 圖 54A ，圖 54B）。正如預期的那樣，安慰劑組中的動物展現出不可檢測的抗B.2刺突和抗B.1.351刺突IgG力價。
還評估了來自小鼠的血清抑制刺突與hACE2結合的能力。所有免疫方案均導致在第21天產生了阻斷hACE2與CoV刺突多肽結合的抗體，且在任何組之間無顯著差異（ 圖 54C ，圖 54D）。然而，單獨使用BV2373免疫導致顯著更低的能夠破壞B.1.351刺突與hACE2之間的結合的血清力價；BV2373單獨免疫組中的力價比BV2438單獨免疫組中的力價低4.6倍（p ＜ 0.0001），並且比接受二價rS的組中的力價低3.1倍（p ＜ 0.0001）。
我們接下來評估了不同疫苗接種方案中的中和抗體力價。在噬斑減少中和力價測定（PRNT 50）中，使用SARS-CoV-2/WA1、SARS-CoV-2/B.1.1.7和SARS-CoV-2/B.1.351毒株評估從疫苗接種後第32天從疫苗接種動物收集的血清。來自單價BV2373組的血清對3種病毒株中的每一種都顯示出相似的中和抗體力價。與B.2毒株相比，來自用單價BV2438免疫的小鼠的血清產生了升高的對B.1.351和B.1.1.7毒株的中和抗體力價（ 圖 54E）。與B.2毒株相比，異源疫苗組產生了類似升高的對B.1.351和B.1.17毒株的中和抗體力價，二價BV2373/BV2438疫苗接種方案也是如此。
在 BALB/c 小鼠中針對 SARS-CoV-2 的 BV2438 保護：評價了如 圖 53中所述進行疫苗接種的小鼠產生針對用B.1.1.7或B.1.351攻擊的保護性免疫的能力。雖然SARS-CoV-2/武漢1（B.2）毒株不會在野生型小鼠中複製，但B.1.1.7和B.1.351毒株在刺突ORF中具有501Y突變，從而允許刺突蛋白與小鼠ACE2結合並進入細胞。在疫苗接種後第46天，小鼠鼻內接種7 × 10 4PFU的B.1.17（每組n = 10只小鼠）或1 × 10 5PFU的B.1.351（每組n = 10只小鼠）。在整個攻擊後時間段每天對小鼠稱重，在感染後第2天和第4天（研究第48天和第50天），通過吸入異氟烷吸入處死每組5只小鼠。然後通過噬斑形成測定評估每只小鼠的肺的病毒載量，並通過RT-PCR評估病毒RNA。感染B.1.1.7的安慰劑BALB/c小鼠體重沒有減輕，並且在感染這種SARS-CoV-2毒株的任何疫苗接種組中都沒有觀察到體重減輕。對於B.1.351感染的小鼠，截至用B.1.351感染之後第4天，在安慰劑接種組中觀察到20%的體重減輕（ 圖 55A ，圖 55B）。用任一方案進行疫苗接種的所有小鼠被保護免於在感染B.1.351後體重減輕，證明了該模型中保護的臨床相關性。
在感染後第2天，安慰劑組中的B.1.1.7感染的小鼠展現出4 × 10 4pfu/g肺，在安慰劑疫苗接種組中截至感染之後第4天降至不可檢測的水準。在用任何BV2373或BV2438方案免疫後，在感染之後第2天或第4天沒有可檢測到的活病毒，證明在疫苗接種後病毒載量減少超過5個對數並且被保護免於感染（ 圖 55C ，圖 55D）。在感染之後第2天，假疫苗接種組中的B.1.351感染的小鼠展現出8 × 10 8pfu/g肺，截至感染之後第4天降至2 × 10 5pfu/g肺。在用任何rS方案免疫後，在B.1.351感染的小鼠中在感染之後第2天或第4天沒有可檢測到的活病毒。這證明病毒力價顯著降低，其中在假疫苗接種的小鼠中截至感染之後第2天病毒載量降低 ＞ 5個對數（ 圖 55C ，圖 55D）。還針對在攻擊後次基因體（sgRNA）SARS-CoV-2 mRNA產生評估了肺RNA。相對於各個安慰劑組中的水準，我們發現在感染兩種毒株之後第2天和第4天免疫的小鼠中的肺sgRNA水準降低 ＞ 99%（ 圖 55E ，圖 55F ）。
這些結果證實了與皂苷佐劑一起配製並作為單價、二價或異源方案投予的BV2373和BV2438在小鼠中賦予了針對SARS-CoV-2的兩種毒株B.1.1.7和B.1.351的保護。連同體重減輕的減少、高中和抗體力價以及消除小鼠肺中的病毒複製，我們證明了通過變體刺突靶向疫苗實現的高度保護性疫苗反應。
BV2438 在小鼠中的細胞介導的免疫原性：BALB/c小鼠組（n = 8只/組）用相同的上述BV2373或BV2438方案進行免疫，但間隔21天（ 圖 56A）。向陰性對照組（n = 4）注射疫苗配製品緩衝液。在加強免疫之後7天，在研究第28天收穫脾臟。收集脾細胞並進行ELISpot和細胞內細胞介素染色（ICS）以檢查用BV2373或BV2438刺激後的細胞介素分泌。酶聯免疫吸附測定（ELISA）顯示在所有疫苗接種方案後與IL-5產生性細胞的數量相比更多的IFN-γ產生性細胞的數量，這表明Th1偏斜反應（ 圖 56B- 圖 56D）。在用任一rS刺激後，通過ICS觀察到強烈的Th1反應，如通過表現IFN-γ、IL-2或TNF-α的CD4+ T細胞和表現所有3種細胞介素的多功能CD4+ T細胞的存在所測量的 （圖 56E ，圖 57A- 圖 57E ）。也存在表現Th2細胞介素IL-4但對IL-2和TNF-α呈陰性的CD4+ T細胞，但其比例低於對於Th1細胞介素所觀察到的比例（ 圖 57A- 圖 57E ）。對於用BV2373或BV2438刺激後測試的任何細胞介素，在疫苗接種組之間沒有觀察到細胞介素陽性細胞數量的顯著差異。
濾泡輔助性T細胞（CSCR5+PD-1+CD4+）傾向于代表更大百分比的CD4+ T細胞，但與安慰劑組動物相比，在疫苗接種的動物中未觀察到統計上顯著的升高（ 圖 56F）。類似地，通過使用流式細胞術測定CD19+ B細胞中GL7+CD95+細胞的百分比來評價生發中心形成，但與安慰劑組相比，在疫苗接種組中觀察到更高百分比的生發中心B細胞的趨勢，只有用單價BV2438方案免疫的動物顯示出顯著更高的比例（與安慰劑組相比，p = 0.049； 圖 56G）。
在狒狒中用 BV2373 初次免疫之後一年用 BV2373 加強免疫誘導的記憶反應：小的狒狒群組（總共n = 9）進行了使用BV2373的初次免疫系列（1 µg、5 µg或25 µg rS與50 µg皂苷佐劑，或25 µg未佐劑化rS）。大約一年後，所有動物都用一個或兩個劑量的3 µg BV2438與50 µg皂苷佐劑加強免疫以檢查產生的免疫反應（ 圖 58A）。在第一次BV2438加強免疫之後七天，最初接受佐劑化BV2373的動物展現出強烈的記憶反應，如通過高於最初在初次免疫系列期間在峰值免疫反應下所觀察到的水準的抗S（WU1）IgG力價水準所展現（ 圖 58B）。這種反應似乎並沒有被第二加強劑量的BV2438進一步加強，但本研究中使用的小樣本量阻止了有意義的定量分析。在初次免疫系列期間接受未佐劑化BV2373的動物展現出對用BV2438加強免疫的較弱反應，但仍展現出升高的抗S（WU1）IgG反應。BV2438加強免疫引發了針對BV2373和BV2438的可比較的抗體力價，其中最初接受未佐劑化BV2373的動物展現出較弱的反應（ 圖 58C ，圖 58D）。
還在加強免疫前、以及用1或2個劑量的BV2438加強免疫後7、21、35和89天評價了能夠破壞野生型CoV S蛋白（SEQ ID NO: 2）或B.1.351 rS與hACE2之間相互作用的血清抗體力價。與對於抗S IgG力價觀察到的相似，在初次免疫系列期間接受佐劑化疫苗的動物在BV2438加強免疫之後7天展現出強烈的hACE2抑制性抗體反應，儘管在加強免疫前具有不可檢測的力價。與BV2438-hACE2阻斷抗體的水準相比，對於BV2373-hACE2阻斷抗體的力價略高，但小樣本量阻礙了有意義的定量分析。在初次免疫系列期間接受未佐劑化疫苗的動物在BV2438加強免疫後展現出較低的hACE2阻斷力價（ 圖 58E）。
通過測試血清中和WA1、B.1.351和B.1.1.7的能力，通過活病毒微量中和測定分析中和抗體力價。在BV2438加強免疫之前收集的血清對所有這些病毒具有不可檢測的中和抗體水準。截至疫苗接種之後7天，檢測到中和所有3種毒株的高力價抗體，並且該抗體反應直到疫苗接種之後35天仍保持高位。在初次免疫系列中用未佐劑化BV2373免疫的動物顯示出顯著較低的抗體水準以及更廣泛的中和力價範圍（ 圖 58F）。總之，這些資料證明甚至在初次疫苗接種系列之後1年仍具有穩健持久的抗體反應。 在狒狒中第一BV2438加強劑量之後7天也觀察到表現3種Th1細胞介素的多功能T細胞，並且這些反應在第一加強劑量之後35天仍保持（ 圖 58G和 圖 59A- 圖 59G ）。
通過來自 BV2373 疫苗接種的成人的血清中和 SARS-CoV-2 變種：一種含有BV2373和皂苷佐劑的疫苗目前正在全球（包括在B.1.1.7和B.1.351流行的地區）進行臨床試驗。我們評估了這些試驗中來自個體的血清中和USA-WA1、B.1.1.7和B.1.351的能力。使用PRNT 50讀數進行微量中和測定（ 圖 60A ，圖 60B）。在第二劑量的疫苗後，評估了來自臨床試驗參與者的三十個隨機選擇的血清樣品。在比較WA1相比於B.1.1.7時，大多數血清樣品的中和活性沒有變化；只有1個樣品具有針對B.1.1.7的中和抗體力價的統計上顯著的變化。WA1相比於B.1.351中和力價顯示中和力價範圍增加，其中30個樣品中有五個顯示中和降低，與PRNT 50測定中的平均值相差1個標準差。該資料證明與B.1.1.7相比，在一小部分接受BV2373和皂苷佐劑的疫苗接種者中，對B.1.351的中和降低。
討論：我們已經證明，使用通過皂苷佐劑進行佐劑化的B.1.351刺突變體的全長、穩定的融合前SARS-CoV-2刺突醣蛋白疫苗可以誘導高水準的功能性免疫，並保護小鼠免於B.1.1.7和B.1.351 SARS-CoV-2毒株二者的危害。用BV2438對小鼠或非人靈長類動物進行免疫誘導了抗S抗體、hACE2受體抑制性抗體和SARS-CoV-2中和抗體。另外，BV2438疫苗誘導了CD4 +T細胞反應，誘導了生發中心形成並提供了針對B.1.351和B.1.1.7攻擊的保護。
在小鼠中，用B.1.351變體定向疫苗進行疫苗接種後產生的抗體能夠同等程度地抑制hACE2與變體刺突或原始刺突之間的結合，表明這種變體定向疫苗可以有效地“向後”保護免於原始SARS-CoV-2毒株的危害。
對來自我們試驗的人疫苗血清的分析展現了穩健的抗體反應和最小的中和損失。我們觀察到，與B.1.1.7和WA1相比，B.1.351病毒不會顯著降低中和，儘管有證據表明南非的WA1試驗參與者中的突破性感染。所有突破性感染均為B.1.351。因此，含有單個或多個變體rS疫苗的加強免疫疫苗接種將增加抗體水準並擴大對如本工作所示的變種的覆蓋範圍。 實例 11 BV2373 和皂苷佐劑在單次加強劑量之後誘導針對異源 SARS-CoV-2 毒株的保護性免疫反應
參與者：招募年齡 ≥ 18至 ≤ 84 歲的健康男性和女性參與者以入組本研究。如果參與者的體重指數為17至35 kg/m 2，能夠在入組之前提供知情同意書，並且（對於女性參與者）同意保持不活躍的異性戀或使用經批准的避孕形式，則參與者有資格。有嚴重急性呼吸症候群（SARS）病史或確診為COVID-19、嚴重慢性醫學病症（例如，糖尿病、充血性心力衰竭、自身免疫性病症、惡性腫瘤）或目前正在針對未確診的疾病進行評估（這可能導致新的診斷）的參與者被排除在研究之外。懷孕或哺乳期女性也被排除在外。
隨機化：患者被隨機分配為五組。在五個處理組中，一個是安慰劑對照組（A組）；並且兩個是活性疫苗組，其被考慮用加強免疫進行另外的疫苗接種（B組和C組）。大約6個月後，被隨機化以在第0天和第21天（B組）接受兩個劑量的BV2373（5 μg）和皂苷佐劑（50 μg）或在第0天接受一個劑量的BV2373（5 μg）和皂苷佐劑（50 μg）且在第21天接受安慰劑（C組）的同意的參與者以1 : 1重新隨機化以在第189天接受單次加強劑量的BV2373和相同劑量水準的皂苷佐劑（B2組和C2組）或安慰劑（B1組或C1組）‑。B組參與者是本實例的主要焦點。
目的和方法：我們在18至84歲的健康成人中進行了一項2期、隨機、觀察者設盲、安慰劑對照試驗，這些成人接受了三次肌內注射5 µg劑量的BV2373和50 µg皂苷佐劑（級分A和級分C iscom基質，在本實例中也稱為MATRIX-M TM）或安慰劑（1 : 1）。第一劑量和第二劑量間隔21天投予。第一劑量和第二劑量被稱為“初次疫苗接種系列”。第三劑量（“加強”劑量）在初次疫苗接種系列之後約6個月投予。所有三個劑量的注射體積均為0.5 mL。評估了安全性和免疫原性參數，包括針對原始SARS-CoV-2毒株和選擇變種（B.1.351 [β]、B.1.1.7 [α]、B.1.617.2 [δ]和B.1.1.529 [ο]）的IgG、MN 50和hACE2抑制的測定。
參與者使用電子日誌記錄疫苗接種當天的反應原性，之後再記錄6天。在接受加強免疫之後28天收集血液樣品以用於免疫原性分析，此時還進行了安全性隨訪。免疫反應的測量包括對於血清免疫球蛋白G（IgG）抗體、中和抗體活性（抑制濃度 ＞50% [MN 50]的微量中和測定）和人血管收縮素轉化酶2（hACE2）受體結合抑制的測定。使用合格的IgG酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測對於SARS‑CoV-2 rS蛋白抗原具有特異性的血清IgG抗體水準。使用合格的野生型病毒MN測定測量對於SARS-CoV-2病毒具有特異性的中和抗體‑。收集了原始和β變種SARS-CoV-2毒株二者的血清IgG和MN 50測定資料。符合目的的功能性hACE2抑制測定和抗rS（抗重組刺突）IgG活性測定二者均用於分析對SARS-CoV-2的原始毒株、B.1.351（β）、B.1.1.7（α）、B.1.617.2（δ）和B1.1.529（ο）變異株的反應。
安全性結局包括在加強免疫之後7天內參與者報告的反應原性事件，以及截至加強免疫之後28天發生的非徵集性不良事件。通過徵集性局部和全身性不良事件分別記錄了加強免疫反應原性。記錄了從加強免疫疫苗接種到加強免疫之後28天的徵集性不良事件。還收集了有關不良事件是否嚴重、是否與疫苗接種相關、是否與COVID-19相關、是否為潛在的免疫介導的醫學病症（PIMMC）或是否導致中斷或計畫外就診的資料。在加強免疫之前立即以及之後28天收集用於免疫原性分析的參與者樣品。
統計資料：分析包括來自B組中的參與者的在初次疫苗接種系列期間和之後（第0天、第21天、第35天、第105天和第189天）獲得的安全性和免疫原性資料，以用於與在接受加強劑量之後28天（第217天）從B2組收集的資料進行比較。結果還按參與者年齡組進行了分析：≥ 18至 ≤ 84歲、≥ 18至 ≤ 59歲和≥ 60至 ≤ 84歲。
安全性分析包括所有接受BV2373和皂苷佐劑的單次加強免疫注射（B2組）或安慰劑（B1組）的參與者。安全性分析表示為具有截至每次疫苗接種之後7天分析的徵集性局部和全身性不良事件以及截至加強免疫之後28天非徵集性不良事件的參與者的數量和百分比。
結果：共篩選1610名參與者。除了三名參與者之外全部被隨機化為B組（n = 257）的參與者在他們的初次疫苗接種系列中接受了兩個劑量的BV2373和皂苷佐劑，並被考慮進行相同劑量水準下單次加強劑量的研究（ 圖 68）。B組參與者在第189天重新隨機化，其中210名同意的參與者按1 : 1分配以在B2組（n = 104）中接受BV2373和皂苷佐劑的單次加強免疫或在B1組（n = 106）中接受安慰劑。在B2組中，除一名參與者外，所有參與者都接受了作為加強免疫的活性疫苗。B1組中除六名參與者外所有參與者都接受了作為加強免疫的安慰劑；在其餘六名參與者中，四名未接受任何加強免疫（其中一名因持續的不良事件而出於安全性的考慮被包括在B1組中），並且兩名參與者錯誤地接受了作為加強免疫的活性疫苗，並在B2組進行了安全性評估。A組中除一名參與者外，所有參與者都接受了全部三個劑量的安慰劑，且其餘參與者接受了作為加強劑量的活性疫苗。
除了B1組（58%）中女性參與者的比例高於B2組（45%）之外，活性（B2組）與安慰劑（B1組）加強免疫組之間的人口統計學和基線特徵總體上是平衡的（表8）。在A、B1和B2組中，中值年齡為約57歲，並且45%的參與者年齡 ≥ 60至 ≤ 84歲。大多數參與者是白人（87%）和非西班牙人或拉丁美洲人（95%）。基線SARS-CoV-2血清狀態主要為陰性（98%）。
徵集性局部和全身性反應原性事件的安全性報告顯示在BV2373和皂苷佐劑的全部三個劑量下都是增加的趨勢（ 圖 69A- 圖 69B）。加強免疫後，B2組中的參與者報告任何局部反應（壓痛、疼痛、腫脹和紅斑）的發生率為82.5%（13.4% ≥ 3級），相比之下，在初次疫苗接種系列後為70.0%（5.2% ≥ 3級）。4級局部反應很少見，且B2組中的一名參與者報告了兩個事件（疼痛和壓痛），相比之下，在初次疫苗接種系列後沒有參與者報告。加強免疫後，局部反應是短暫的，其中除紅斑（2.5天）外，所有事件的中值持續時間為2.0天。在初次疫苗接種系列後，局部反應也是短暫，其中疼痛和壓痛的中值持續時間為2.0天且紅斑和腫脹的中值持續時間為1.0天。
全身性反應顯示出相似的模式，其中任何事件（疲勞、頭痛、肌肉疼痛、不適、關節疼痛、噁心/嘔吐和發熱）的發生率為76.5%（15.3% ≥ 3級），相比之下，在初次疫苗接種系列後為52.8%（5.6% ≥ 3級）。4級全身性反應很少見，其中B2組中的一名參與者報告了三個事件（頭痛、不適和肌肉疼痛），相比之下，在初次疫苗接種系列後沒有參與者報告。加強免疫後，全身性反應在本質上是短暫的，其中所有事件的中值持續時間為1.0天，但肌肉疼痛持續時間為2.0天。在初次疫苗接種系列後，所有全身性反應也是短暫的，其中所有事件的中值持續時間為1.0天。
當與較年輕的成人（≥ 18至 ≤ 59歲）相比時，在初次疫苗接種系列或加強劑量後，在較年長的成人（≥ 60至 ≤ 84歲）中的局部和全身性反應原性事件不太頻繁且不太嚴重。在較年輕的群組中，分別在84.9%（18.9% ≥ 3級）和84.9%（26.4% ≥ 3級）的參與者中報告了加強免疫後的局部和全身性反應，相比之下，在較年長的群組中分別為79.5%（6.8% ≥ 3級）和66.7%（2.2% ≥ 3級）的參與者。
總計了在活性加強免疫的參與者（B2組）、安慰劑加強免疫的參與者（B1組）和在整個研究期間接受三個劑量的安慰劑的參與者（A組）中的徵集性不良事件。截至加強免疫之後28天，與僅接受安慰劑的參與者（A組）相比，最初接受活性疫苗用於其初次疫苗接種系列的參與者（B2組和B1組）經歷了徵集性不良事件的更高發生率，分別有12.4%、12.7%、和11.0%的參與者報告了此類事件。對於非徵集性重度不良事件也觀察到類似的趨勢（分別為5.7%、3.9%和2.4%）。報告的其他類型的AE包括醫療護理AE（需要醫療保健就診的事件；MAAE）、潛在的免疫介導的醫學病症（PIMMC）、與COVID 19相關的事件和嚴重不良事件（SAE）。
總體而言，三組中活性加強免疫的參與者發生MAAE的頻率略高（B2、B1和A組分別為30.5%、26.1%和23.2%），且少數參與者報告了相關事件（分別為1.9%、0%和1.2%）。在整個研究中，被認為是PIMMC的事件很少見，其中B2組和A組中的一名參與者各自報告了一個事件；這兩個事件都被評估為與研究處理無關。沒有參與者報告與COVID-19相關的不良事件。
SAE在整個研究中也不常見，分別發生在B2、B1和A組中的5.7%、3.3%和1.6%的參與者中，且所有事件均被評估為與研究處理無關。
對於B2和B1組參與者的SAE的評價未顯示出與活性加強免疫的關係，因為在劑量1、劑量2和加強免疫之後SAE分別發生在B2組中的0%、4.8%和1.0%的參與者中以及B1組中的0%、2.0%和2.0%的參與者中。
在初次疫苗接種系列（第35天）至第189天后，觀察到B組IgG和MN50幾何平均力價（GMT）的下降（分別地對於IgG，43,905個ELISA單位[EU]至6,064 EU；且對於MN50，1,470至63）。加強免疫後二十八天（第217天），IgG和MN50力價與加強免疫前力價和初次免疫系列產生的第35天力價相比穩健地增加（ 圖 70 ，圖 71）。
對於原始SARS-CoV-2毒株，血清IgG GMT從初次疫苗接種系列（第35天）後的43,905 EU增加至加強免疫（第217天）後的204,367 EU，約4.7倍。與較年輕的成人（4.1倍）相比，在較年長的成人（5.1倍）中觀察到加強免疫後的更高倍數增加。類似地，特定於原始SARS-CoV-2毒株的MN50測定GMT經歷相同的各自時間點從1,470增加至6,023，約4.1倍；且在較年長的成人和較年輕的成人中分別為4.0倍和3.8倍的增加。
對於β變種，IgG GMT從加強免疫前第189天的4,317 EU增加至第217天的175,190 EU，反映了加強免疫後約40.6倍的增加。這些力價是第35天對於原始毒株觀察到的力價的4倍（GMT 175,190 EU相比於43,905 EU）。β變種MN50測定資料顯示，從加強免疫前（第189天）至加強免疫後（第217天）的力價約50.1倍的相似倍數增加（GMT 13相比於661），但力價低於在第35天對於原始毒株所觀察到的力價（GMT 661相比於1,470）。（表9，表10）。
開發了兩種測定以使用第35天（B組）和第217天（B2組）的參與者血清評估針對另外的SARS-CoV-2變種的免疫反應。使用功能性hACE2抑制測定來比較針對原始毒株（與SEQ ID NO: 1相比，包含具有D614G突變的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒）以及SARS-CoV-2的δ、β、α和ο變種的活性。以相應的順序，觀察到hACE2抑制力價的6倍、6.6倍、10.8倍、8.1倍和19.9倍增加（表12A、表12B、 圖 67A- 圖 67D）。 圖 67D示出青少年中的hACE2抑制力價。比較相同的SARS-CoV-2毒株之間的抗rS IgG活性的第二種測定發現，在加強免疫後觀察到5.4倍（原始）、11.1倍（δ）、6.5倍（β）、9.7倍（α）和9.34倍（ο）的力價（表11A、表11B、 圖 66A- 圖 66B）。
結果：在初次兩個劑量系列後大約6個月，投予單次加強劑量的疫苗導致反應原性事件的增量式增加以及顯著增強的免疫原性。
在第189天加強免疫之前，當與第35天初次疫苗接種系列後採集的樣品相比時，免疫的參與者中抗SARS-CoV-2抗體力價顯著降低（B組IgG和MN 50GMT分別從43,905 EU降至6,064 EU以及從1,470降至63）。中和抗體的存在強烈表明了保護免於症狀性COVID-19的危害。
在本研究中，對於原始疫苗毒株以及最近的SARS-CoV-2變種（包括α、β和δ），評估了對加強免疫的抗體反應。對於原始毒株，第217天的IgG力價比加強免疫前第189天的力價高約34倍，而加強免疫後的中和抗體力價增加約96倍。加強免疫後的IgG和MN力價均比第35天初次兩劑量系列後觀察到的力價高 ＞ 4倍，這是值得注意的，因為第35天的力價對應於英國3期研究（89.7%）以及美國/墨西哥3期研究（90.4%）中的高水準的臨床功效。按年齡組細分時，對於較年長的成人（≥ 60至 ≤ 84歲）觀察到的倍數增加高於較年輕的成人（≥ 18至 ≤ 59歲）。這一發現表明，加強劑量可能在較年長的成人中有額外的益處，因為他們在初次兩個劑量疫苗接種系列後的抗體反應低於在較年輕的成人中觀察到的抗體反應。
對於β變種，在加強免疫後觀察到IgG和MN抗體力價的40至50倍增加，並且IgG力價比初次疫苗接種系列後對於原始毒株所觀察到的力價高約4倍。與IgG的觀察結果不同，加強免疫後β變種的MN 50GMT低於初次疫苗接種系列後對於原始毒株的那些（GMT 661相比於1,470），這與已知的對於該變種的降低的中和反應一致。
對於SARS-CoV-2的δ和ο變種，當將加強免疫後第217天的力價與第35天的力價進行比較時，觀察到功能性hACE2抑制力價的6.6倍（δ）和19.9倍（ο）增加。在這些相同時間點比較的抗rS IgG活性發現9.7倍（δ）和9.34倍（ο）更高的與加強免疫相關的力價。
與先前的劑量相比，在第6個月加強劑量之後，局部和全身性反應原性的發生率均更高，這反映了在第三劑量下觀察到的增加的免疫原性。然而，3級或更高分級事件的發生率仍然相對較低，其中只有10%的參與者記錄了疲勞（12.2%）。總共報告了五個4級（可能危及生命）徵集性局部和全身性不良事件。所有這五個事件（疼痛、壓痛、頭痛、不適和肌肉疼痛）均由活性加強免疫組中的同一參與者報告，同時發生了與疫苗相關的藥物超敏反應的不良事件。藥物超敏反應事件的嚴重程度被評估為輕度。參與者沒有為此事件尋求任何醫療護理，並且參與者的所有症狀在6天的時間內消退。
表13示出了用於與SEQ ID NO: 1相比具有D614G突變的SARS-CoV-2病毒、SARS-CoV-2 δ變種或SARS-CoV-2 ο變種的99%的中和的幾何平均力價。圖72示出了實例11的包含BV2373和皂苷佐劑的免疫原性組合物針對抗含有D614G突變的SARS-CoV-2毒株、B.1.617.2（δ變種）和B. 1.1.529（ο變種）的中和抗體99（neut99）值。
總體而言，在初次免疫系列之後約6個月投予的單次加強劑量的BV2373和皂苷佐劑誘導了體液抗體的顯著增加，其比兩項3期研究中與高水準功效相關的抗體力價高 ＞ 4倍，同時還顯示出可接受的安全性特徵。這些發現支持在加強免疫計畫中使用所述疫苗。
表 8 ： A 、 B1 和 B2 組的人口統計學和基線特徵
參數 A 組 N = 172 B1 組 N = 102 B2 組 N = 105
年齡 ( 歲 )
平均值(SD) 51.9 (17.23) 52.0 (16.99) 51.7 (17.12)
中值 56.0 57.5 58.0
Min，Max 18, 83 19, 80 19、82
年齡組 (n [%])
18至59歲 95 (55.2) 55 (53.9) 57 (54.3)
60至84歲 77 (44.8) 47 (46.1) 48 (45.7)
性別 (n [%])
男性 100 (58.1) 43 (42.2) 58 (55.2)
女性 72 (41.9) 59 (57.8) 47 (44.8)
種族 (n [%])
白人 151 (87.8) 86 (84.3) 93 (88.6)
黑色人種或非裔美國人 2 (1.2) 3 (2.9) 3 (2.9)
亞洲人 15 (8.7) 10 (9.8) 7 (6.7)
美洲印第安人或阿拉斯加土著人 2 (1.2) 1 (1.0) 1 (1.0)
多重 2 (1.2) 1 (1.0) 1 (1.0)
丟失 0 1 (1.0) 0
族群 (n [%])
西班牙人或拉丁美洲人 11 (6.4) 3 (2.9) 1 (1.0)
不是西班牙裔或拉丁裔 161 (93.6) 97 (95.1) 104 (99.0)
未知 0 2 (2.0) 0
基線 BMI (kg/m2)
平均值(SD) 27.29 (4.207) 26.69 (4.060) 27.43 (4.040)
中值 27.40 26.50 27.10
Min，Max 17.7, 35.0 17.3, 34.9 18.2、34.9
基線 SARS-CoV-2 狀態 (n [%])
陰性 169 (98.3) 101 (99.0) 102 (97.1)
陽性 2 (1.2) 1 (1.0) 3 (2.9)
未確定 1 (0.6) 0 0
BMI = 體重指數；SARS-CoV-2 = 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2；SD = 標準差 A = 第0天、第21天和第189天安慰劑 B1 = 第0天和第21天5 µg BV2373 + 50 µg皂苷佐劑以及第189天安慰劑 B2 = 第0天、第21天和第189天5 µg BV2373 + 50 µg皂苷佐劑 安全性分析組中的參與者根據所接受的處理進行計數，以適應處理錯誤。
表 9 ：接受 BV2373 和皂苷佐劑的參與者按研究日針對原始和 β 變種 SARS-CoV-2 毒株的初次免疫和加強免疫疫苗接種後的血清 IgG 幾何平均力價
年齡組 血清 IgG GMT （ EU [95% CI] ）
第 35 天 原始毒株 第 189 天 原始毒株 第 217 天 原始毒株 第 189 天 β 變種 第 217 天 β 變種
所有參與者， 18至84歲 43,905 (37,500, 51,403) 6,064 (4,625, 7,952) 204,367 (164,543, 253,828) 4,317 (3,261, 5,715) 175,190 (139,895, 219,391)
參與者 18至59歲 65,255 (55,747, 76,385) 8,102 (6,041, 10,866) 270,224 (214,304, 340,736) 6,310 (4,642, 8,578) 226,103 (176,090, 290,321)
參與者 60至84歲 28,137 (21,617, 36,623) 4,238 (2,631, 6,826) 144,440 (99,617, 209,431) 2,700 1,682, 4,333) 127,601 (86,809, 187,561)
CI = 信賴區間；ELISA = 酶聯免疫吸附測定；EU = ELISA單位；GMT = 幾何平均力價
表 10 ：接受 BV2373 和皂苷佐劑的參與者按研究日針對原始和 β 變種 SARS-CoV-2 毒株的初次免疫和加強免疫疫苗接種後的中和抗體活性
年齡組 MN 50GMT(95% CI)
第 35 天 原始毒株 第 189 天 原始毒株 第 217 天 原始毒株 第 189 天 β 變種 第 217 天 β 變種
所有參與者， 18至84歲 1,470 (1,008, 2,145) 63 (49, 81) 6,023 (4,542, 7,988) 13 (11, 15) 661 (493, 886)
參與者 18至59歲 2,281 (1,414, 3,678) 80 (56, 114) 8,568 (6,646, 11,046) 14 (11, 18) 871 (656, 1,156)
參與者 60至84歲 981 (560, 1,717) 47 (33, 65) 3,936 (2,341, 6,620) 12 (10, 15) 469 (270, 816)
CI = 信賴區間；GMT = 幾何平均力價；MN 50= 抑制濃度 ＞ 50%下的微量中和測定
表 11A ：隨時間而變的抗 CoV S IgG
抗 rS BV2373 力價 (EC50) ( 與 SEQ ID NO: 1 相比，包含具有 D614G 突變的刺突蛋白的 SARS-CoV 2 病毒 ) 抗 rS BV2465 力價 (EC50) (δ) 抗 rS BV2438 力價 (EC50) (β) 抗 rS BV2425 力價 (EC50) (α) 抗 rS BV2509 (EC50) (ο)
D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D35 D217
GM T 166 60742 5361 327758 156 26097 3143 290782 161 40416 4066 264321 156 24333 2739 235145 11119 103800
下95%CI 134 42176 3782 225862 144 17501 1952 195349 139 28091 2767 177965 143 15234 1777 152897 7668 67398
下95%CI 206 87481 7599 475623 169 38916 5059 432836 188 58147 5975 392582 171 38865 4223 361636 16121 159860
GMFR (D35-D217) GMFR : 5.4 (CI – 3.34 – 8.71) GMFR : 11.1 (CI – 6.5 – 19.1) GMFR : 6.54 (CI – 3.97 – 10.8) GMFR : 9.7 (CI – 5.56 – 11.9) GMFR: 9.34 (CI – 8.79 – 9.91)
GMFR (D189-D217) GMFR : 61.2 (CI – 38.9 – 96.4) GMFR : 92.6 (CI – 52.8 – 162.4) GMFR : 65.0 (CI – 40.0 – 105.4) GMFR : 85.9 (CI – 50.4 – 146.1) GMFR: 73.5 (CI—38.5 —140.2)
表 11B ：接受 BV2373 和皂苷佐劑的參與者按研究日針對原始和變種 SARS-CoV-2 毒株的初次免疫和加強免疫疫苗接種後的 rS IgG 幾何平均力價
參 數 抗 rS IgG 活性 (EC 50)
原始 δ β α ο
第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天
GM T (95% CI) 60,742 (42,176, 87,481) 327,758 (225,862, 475,623) 26,097 (17,501, 38,916) 290,782 (195,349, 432,836) 40,416 (28,091, 58,147) 264,321 (177,965, 392,582) 24,333 (15,234, 38,865) 235,145 (152,897, 361,636) 11,119 (7,668, 16,121) 103,800 (67,398, 159,860)
GMFR (95% CI) 5.4 (3.34, 8.71) 11.1 (6.5, 19.1) 6.54 (3.97, 10.8) 9.7 (5.56, 11.9) 9.34 (8.79, 9.91)
抗rS IgG = 抗重組刺突免疫球蛋白G抗體；CI = 信賴區間；GMFR = 幾何平均倍數上升；GMT = 幾何平均力價；SARS-CoV-2 = 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2
表 12A ：隨時間而變的 50% hACE2 抑制力價
抗 rS BV2373 RI 力價 ( 與 SEQ ID NO: 1 相比，包含具有 D614G 突變的刺突蛋白的 SARS-CoV 2 病毒 ) 抗 rS BV2465 RI 力價 (δ) 抗 rS BV2438 RI 力價 (β) 抗 rS BV2425 RI 力價 (α) 抗 rS BV2509 RI 力價 (EC50) (ο)
D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D0 D35 D189 D217 D35 D189 D217
GM T 10 119.6 13.3 723.1 10 40.0 10.9 265.3 10 24.6 10.8 265.2 10 28.7 10.7 234.4 14.5 10.66 214
下 95% CI 10 78.7 10.03 533.5 10 27.03 9.12 192.9 10 16.7 9.18 189.3 10 20.0 9.30 170.2 11.2 9.52 140.2
下 95% CI 10 181.9 17.6 980.0 10 59.5 12.99 364.7 10 36.04 12.8 371.5 10 41.05 12.3 322.8 18.7 11.93 326.8
GMFR (D35-D217) GMFR : 6.1 (CI – 3.79 – 9.89) GMFR : 6.61 (CI – 4.34 – 10.09) GMFR : 10.8 (CI – 7.1 – 16.4) GMFR : 8.1 (CI – 5.56 – 11.9) GMFR : 14.8 (CI – 7.74 – 21.37)
GMFR (D189-D217) GMFR : 54.4 (CI – 37.0 – 79.8) GMFR : 24.4 (CI – 16.6– 35.7) GMFR : 24.5 (CI – 16.5 – 36.4) GMFR : 21.9 (CI – 15.07– 31.9) GMFR : 20.1 (CI – 10.56 – 29.25)
表 12B ：接受 BV2373 和皂苷佐劑的參與者按研究日針對原始和變種 SARS-CoV-2 毒株的初次免疫和加強免疫疫苗接種後的 hACE2 抑制幾何平均力價
參數 hACE2 抑制力價 (IC 50)
原始 δ β α ο
第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天 第 35 天 第 217 天
GMT (95% CI) 119.6 (78.7, 181.9) 723.1 (533.5, 980.0) 40.0 (27.03, 59.5) 265.3 (192.9, 364.7) 24.6 (16.7, 36.04) 265.2 (189.3, 371.5) 28.7 (20.0, 41.05) 234.4 (170.2, 322.8) 9.35 (6.326, 13.83) 186.6 (116.4, 299.2)
GMFR (95% CI) 6.1 (3.79, 9.89) 6.61 (4.34, 10.09) 10.8 (7.1, 16.4) 8.1 (5.56, 11.9) 19.95 (18.4, 21.6)
CI = 信賴區間；GMFR = 幾何平均倍數上升；GMT = 幾何平均力價；hACE2 = 人血管收縮素轉化酶2；SARS-CoV-2 = 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2
表 13 ：用於具有 D614G 突變的 SARS-CoV-2 病毒、 B.1.617-2 δ 變種和 SARS-CoV-2 ο 變種的中和的幾何平均力價
具有 D614G 突變的 SARS-CoV-2 病毒 Neut99 力價 δ Neut99 力價 (B.617.2) ο Neut99 力價 (B.1.529)
D35 D217 D35 D217 D35 D217
GMT 853 13123 331.6 4629 231.9 823.2
下 95%CI 490.2 7619 212 2961 169.4 530.8
上 95%CI 1484 22603 518.5 7236 317.7 1277
GMFR (D35-D217) GMFR : 15.4 (CI – 15.5 – 15.2) GMFR : 13.9 (CI – 13.95 – 13.96) GMFR : 3.6 (CI – 3.13 – 4.0)
實例 12 含有 (i) BV2373 、 Bv2509 或其組合以及 (ii) 皂苷佐劑的組合物誘導針對異源 SARS-CoV-2 毒株的保護性免疫反應
目的和方法：評價了與皂苷佐劑的組合的含有重組CoV刺突（rS）蛋白BV2509（SEQ ID NO: 175）、BV2373（SEQ ID NO: 87）或兩者的組合物的免疫原性和體內保護。所述皂苷佐劑含有兩種iscom顆粒，其中：第一iscom顆粒包含皂樹的級分A而不包含皂樹的級分C；並且第二iscom顆粒包含皂樹的級分C而不包含皂樹的級分A。級分A和級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計85%和15%。每種組合物含有5 µg皂苷佐劑。在第0天和第14天用前述組合物對小鼠進行免疫。將rS蛋白以0.1 µg的劑量或1 µg的劑量投予。
在免疫後28天，從小鼠收集血清以用於微量中和測定。用於血清中和測定的方案在下文。
血清微量中和測定。將血清樣品在56ºC熱滅活30分鐘以去除補體，並使其平衡至室溫，之後進行處理以用於中和力價測定。將樣品連續稀釋於補充有10%（v/v）胎牛血清（熱滅活，Sigma）、1%（v/v）青黴素/鏈黴素（Gemini Bio-產品）和1%（v/v）L-麩醯胺酸（2 mM終濃度，Gibco）的DMEM（Quality Biological）中。然後將稀釋板運輸至BSL-3實驗室，並且將100 µL的SARS CoV-2變種（即ο BA1變種、δ變種或WA1變種）添加至每個孔，從而在轉移至96孔滴定板後導致0.01的感染複數（MOI）。每個板上都包括未處理的僅病毒對照。然後將樣品/病毒混合物在37ºC（5.0% CO2）下培育1小時，之後轉移至具有匯合VeroE6細胞的96孔滴定板。將滴定板在37ºC（5.0% CO2）下培育72小時，之後對板中的每個孔進行致細胞病變效應（CPE）測定。顯示CPE的第一個樣品稀釋度被報告為中和所測試SARS-CoV-2的濃度（數字上表示為100%）的＞ 99%所需的最小樣品稀釋度（neut99）。
結果：圖73示出與對照組合物相比，含有rS蛋白的組合物中和了ο BA1變種、δ變種或WA1變種。含有 (i) BV2509和BV2373的組合或(ii) 僅BV2509的組合物對ο毒株的中和優於含有 (iii) 僅BV2373的組合物。含有 (i) BV2509和BV2373的組合或(ii) 僅BV2373的組合物對δ毒株的中和優於含有 (iii) 僅BV2509的組合物。
免疫後28天，將小鼠用SARS-CoV-2 ο BA1變種或SARS-CoV-2 WA1變種攻擊。圖74A-圖74B示出了在用SARS CoV-2 ο BA1變種（圖74A）或WA1變種（圖74B）攻擊後兩天，在小鼠肺中的病毒載量。與安慰劑相比，每種組合物降低了病毒載量。 實例 13 SARS-CoV-2 S 蛋白表現和純化方法的評價
目的：評價SARS-CoV-2 S蛋白表現和純化的不同方法。評價通過每種方法產生的SARS-CoV-2 S蛋白的純度和產量。任選地，通過用Gel-Code Blue試劑（Pierce，羅克福德，伊利諾州）染色的4%-12%梯度SDS-PAGE評價純化的S蛋白，並使用OneDscan系統（BD Biosciences，羅克維爾，馬里蘭州）通過掃描光密度測定法測定純度。
方法1：在Sf9細胞中產生SARS-CoV-2 S蛋白。簡而言之，將細胞在無血清培養基中擴增並用重組杆狀病毒感染。將細胞在27ºC± 2ºC下培養，並在感染後68-72小時通過離心（4000 × g 15 min）收穫。將細胞沈澱物懸浮於含有白抑酶肽的25 mM Tris HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl和0.5%-1.0%（v/v）聚氧乙烯壬基苯酚（NP-9，TERGITOL®）NP-9中。用含有NP-9洗滌劑的Tris緩衝液從質膜提取S蛋白，通過以10,000 x g離心30 min澄清。通過TMAE陰離子交換和小扁豆凝集素親和層析純化S蛋白。中空纖維切向流過濾用於在25 mM磷酸鈉（pH 7.2）、300 mM NaCl、0.02%（v/v）聚山梨醇酯80（PS80）中配製100-150 μg mL -1的純化SARS-CoV-2 S蛋白。
方法2：通過感染Sf9昆蟲細胞擴增表現SARS-CoV-2 S蛋白的重組病毒。在約3.0 MOI（感染複數 = 病毒ffu或pfu/細胞）下用杆狀病毒感染昆蟲細胞培養物。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。通過在約800 x g下離心15分鐘澄清約30 mL的粗細胞收穫物。將含有冠狀病毒刺突（S）蛋白的所得粗細胞收穫物純化為奈米顆粒。為了產生奈米顆粒，將非離子表面活性劑TERGITOL®壬基酚乙氧基化物NP-9用於膜蛋白提取方案中。經由通過陰離子交換層析、小扁豆凝集素親和/HIC和陽離子交換層析進一步純化粗提取物。通過洗滌劑處理使洗滌過的細胞裂解，然後對其進行低pH處理，這導致BV和Sf9宿主細胞DNA和蛋白質沈澱。使中和的低pH處理裂解液澄清，並且在進行第二次低pH處理之前在陰離子交換和親和層析上進一步純化。使用親和層析來去除Sf9/BV蛋白、DNA和NP-9，並且濃縮冠狀病毒刺突（S）蛋白。簡言之，小扁豆凝集素是一種含有鈣和錳的金屬蛋白，其可逆地結合含有葡萄糖或甘露糖的多醣和醣基化蛋白。將含冠狀病毒刺突（S）蛋白的陰離子交換流過級分載入到小扁豆凝集素親和層析樹脂（Capto小扁豆凝集素，GE Healthcare）上。醣基化冠狀病毒刺突（S）蛋白選擇性地結合至樹脂，而非醣基化蛋白和DNA在柱流過物中被去除。通過含有高鹽和低摩爾濃度的甲基α-D-吡喃甘露醣苷（MMP）的緩衝液去除弱結合的醣蛋白。
還使用柱洗滌物來將NP-9洗滌劑用表面活性劑聚山梨醇酯80（PS80）進行洗滌劑交換。用高濃度的MMP將冠狀病毒刺突（S）多肽以奈米顆粒結構從小扁豆凝集素柱中洗脫。
方法3：通過感染Sf9昆蟲細胞擴增表現SARS-CoV-2 S蛋白的重組病毒。在約0.6 MOI（感染複數 = 病毒ffu或pfu/細胞）下用杆狀病毒感染昆蟲細胞培養物。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。將細胞沈澱物懸浮於含有白抑酶肽的25 mM Tris HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl和1.5%（v/v）聚氧乙烯壬基苯酚（NP-9，TERGITOL®）NP-9中。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。將大約30 mL的粗細胞收穫物通過在大約800 x g下離心20分鐘來澄清。通過TMAE陰離子交換和小扁豆凝集素親和層析純化S蛋白。用於TMAE陰離子交換層析的載入pH是8.0，並且電導率是7.4 mS/cm。用於小扁豆凝集素親和層析的平衡緩衝液是25 mM Tris、50 mM NaCl、0.02% NP-9，pH 8。將SARS-CoV-2 S蛋白稀釋於1.2 M MMP中。
方法4：通過感染Sf9昆蟲細胞擴增表現SARS-CoV-2 S蛋白的重組病毒。在約0.6 MOI（感染複數 = 病毒ffu或pfu/細胞）下用杆狀病毒感染昆蟲細胞培養物。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。將細胞沈澱物懸浮於含有白抑酶肽的50 mM Tris HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl和1.5%（v/v）聚氧乙烯壬基苯酚（NP-9，TERGITOL®）NP-9中。感染後48小時-72小時收穫培養物和上清液。將大約30 mL的粗細胞收穫物通過在大約800 x g下離心20分鐘來澄清。通過TMAE陰離子交換和小扁豆凝集素親和層析純化S蛋白。用於TMAE陰離子交換層析的載入pH是7.9，並且電導率是7.3 mS/cm。用於小扁豆凝集素親和層析的平衡緩衝液是25 mM Tris、50 mM NaCl、0.02% NP-9，pH 8。將SARS-CoV-2 S蛋白稀釋於1.2 M MMP中。 編號實施例1.     一種冠狀病毒（CoV）刺突（S）醣蛋白，其包含 (i)具有滅活的弗林蛋白酶切割位點的S1次單元，其中所述S1次單元包含N末端結構域（NTD）、受體結合結構域（RBD）、次結構域1和次結構域2（SD1/2），其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7）； 其中所述NTD任選地包含選自以下的一個或多個修飾： (a)選自胺基酸11-14、56、57、130、131、132、144、145、198、199、228、229、230、231、234、235、236、237、238、239、240及其組合的一個或多個胺基酸的缺失； (b)選自胺基酸5、6、7、11、12、13、14、51、53、54、56、57、62、63、67、70、82、125、129、131、132、133、134、139、143、144、145、170、177、197、198、199、200、201、202、209、229、233、239、240、244、245及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (c)具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述RBD任選地包含選自胺基酸326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、419、426、427、431、432、433、439、440、447、464、465、471、473、477、480、481、483、485、488、492及其組合的一個或多個胺基酸的突變； 其中所述SD1/2結構域任選地包含選自534、557、591、600、601、626、642、645、664、666、668及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (ii)S2次單元，其中胺基酸973和974是脯胺酸， 其中所述S2次單元任選地包含選自以下的一個或多個修飾： (a)一個或多個胺基酸從676-685、676-702、702-711、775-793、806-815及其組合的缺失； (b)選自688、691、703、751、783、843、846、875、937、941、956、968、969、1014、1058、1105、1163、1186及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (c)自TMCT的一個或多個胺基酸的缺失； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。 2.     根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含胺基酸676-685的缺失。 3.   根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含胺基酸702-711的缺失。 4.   根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含胺基酸806-815的缺失。 5.   根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含胺基酸775-793的缺失。 6. 根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含所述NTD的胺基酸1-292的缺失。 7.   根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含跨膜和胞質尾（TMCT）的胺基酸1201-1260的缺失。 8.   根據實施例1所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含選自SEQ ID NO: 85-89、105、106和112-115的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。 9.   根據實施例1至8中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含信號肽，任選地其中所述信號肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。 10. 根據實施例1至9中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含C末端融合蛋白。 11. 根據實施例10所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中所述C末端融合蛋白是六組胺酸標籤。 12. 根據實施例10所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中所述C末端融合蛋白是折疊子。 13. 根據實施例12所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中所述折疊子具有對應於SEQ ID NO: 68的胺基酸序列。 14. 根據實施例1-13中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中ΔHcal是野生型CoV S醣蛋白（SEQ ID NO: 2）的ΔHcal的至少2倍。 15. 根據實施例1-14中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中 所述S2次單元、NTD、RBD和SD1/2各自與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S醣蛋白的相應次單元或結構域是95%相同的。 16. 根據實施例1-14中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中 所述S2次單元、NTD、RBD和SD1/2各自與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S醣蛋白的相應次單元或結構域是97%相同的。 17. 根據實施例1-14中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中 所述S2次單元、NTD、RBD和SD1/2各自與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S醣蛋白的相應次單元或結構域是99%相同的。 18. 根據實施例1-14中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中 所述S2次單元、NTD、RBD和SD1/2各自與具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CoV S醣蛋白的相應次單元或結構域是99.5%相同的。 19. 一種編碼根據實施例1-18中任一項所述的S醣蛋白的分離的核酸。 20. 一種包含根據實施例19所述的核酸的載體。 21. 一種奈米顆粒，其包含根據實施例1-18中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白。 22. 根據實施例21所述的奈米顆粒，其中所述奈米顆粒的Zavg直徑在約20 nm與約35 nm之間。 23. 根據實施例21所述的奈米顆粒，其中所述奈米顆粒的多分散性指數為約0.2至約0.45。 24. 一種表現根據實施例1-18或76-78中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白的細胞。 25. 一種免疫原性組合物，其包含一種或多種根據實施例1-18或76-78所述的冠狀病毒S醣蛋白和醫藥上可接受的緩衝液。 26. 根據實施例25所述的免疫原性組合物，其包含佐劑。 27. 根據實施例26所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中： 第一iscom顆粒包含皂樹的級分A，且不包含皂樹的級分C；並且 第二iscom顆粒包含皂樹的級分C，且不包含皂樹的級分A。 28. 根據實施例27所述的免疫原性組合物，其中： 皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%；或 其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。 29. 根據實施例27所述的免疫原性組合物，其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。 30. 根據實施例27所述的免疫原性組合物，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約85%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。 31. 根據實施例25-30中任一項所述的免疫原性組合物，其包含一種至約10種冠狀病毒S醣蛋白，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種冠狀病毒S醣蛋白。 32. 根據實施例27所述的免疫原性組合物，其包含具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的第一CoV S醣蛋白。 33. 根據實施例25-32中任一項所述的免疫原性組合物，其包含一種或多種具有如下胺基酸序列的CoV S醣蛋白，所述胺基酸序列與SEQ ID NO: 186、188、190、192、195、174和175中的任一個具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。 34. 根據實施例26所述的免疫原性組合物，其中將所述佐劑以約50 µg的劑量投予。 35. 根據實施例25-30中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物包含：(i) 與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第一冠狀病毒S醣蛋白，和 (ii) 與SEQ ID NO: 175的多肽具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第二冠狀病毒S醣蛋白。 36. 一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2的免疫反應的方法，所述方法包括投予根據實施例25-30中任一項所述的疫苗組合物。 37. 根據實施例31所述的方法，其中向所述受試者在第0天投予第一劑量，並且在第21天投予加強劑量。 38. 根據實施例31所述的方法，其中向所述受試者投予約5 µg與約25 µg之間的冠狀病毒S醣蛋白。 39. 根據實施例31所述的方法，其中向所述受試者投予約5 µg的冠狀病毒S醣蛋白。 40. 根據實施例31-34中任一項所述的方法，其中肌內投予所述疫苗組合物。 41. 根據實施例31、33、34和35中任一項所述的方法，其中投予單劑量的所述疫苗組合物。 42. 根據實施例31-35中任一項所述的方法，其中投予多劑量的所述疫苗組合物。 43. 根據實施例31-37中任一項所述的方法，其中將所述疫苗組合物與流感醣蛋白共同投予。 44. 一種免疫原性組合物，其包含： 包含具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的冠狀病毒S（CoV S）醣蛋白和非離子型洗滌劑核心的奈米顆粒； 醫藥上可接受的緩衝液；以及 佐劑。 45. 根據實施例44所述的免疫原性組合物，其包含約3 µg至約25 µg的CoV S醣蛋白。 46. 根據實施例45所述的免疫原性組合物，其包含約5 μg的CoV S醣蛋白。 47. 根據實施例44所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑是皂苷佐劑。 48. 根據實施例47所述的免疫原性組合物，其中所述皂苷佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中： 第一iscom顆粒包含皂樹的級分A，且不包含皂樹的級分C；並且 第二iscom顆粒包含皂樹的級分C，且不包含皂樹的級分A。 49. 根據實施例48所述的免疫原性組合物，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計50%-96%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。 50. 根據實施例48所述的免疫原性組合物，其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%。 51. 根據實施例48所述的免疫原性組合物，其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。 52. 根據實施例48所述的免疫原性組合物，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約85%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。 53. 根據實施例47所述的免疫原性組合物，其包含約50 μg的皂苷佐劑。 54. 根據實施例44所述的免疫原性組合物，其中所述非離子型洗滌劑核心選自聚山梨醇酯20（PS20）、聚山梨醇酯40（PS40）、聚山梨醇酯60（PS60）、聚山梨醇酯65（PS65）和聚山梨醇酯80（PS80）。 55. 根據實施例44-54中任一項所述的免疫原性組合物，其還包含另外的SARS-CoV-2 S醣蛋白。 56. 根據實施例44-54中任一項所述的免疫原性組合物，其還包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種另外的SARS-CoV-2 S醣蛋白。 57. 根據實施例44-56中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述另外的SARS-CoV-2 S醣蛋白選自與SEQ ID NO: 186、188、190、192、195、174和175中的任一個具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的一種或多種醣蛋白。 58. 一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2或異源SARS-CoV-2毒株的免疫反應的方法，所述方法包括投予根據實施例25-35或44-57中任一項所述的免疫原性組合物。 59. 根據實施例58所述的方法，其包含約3 µg至約25 µg的CoV S醣蛋白。 60. 根據實施例59所述的方法，其包含5 μg的CoV S醣蛋白。 61. 根據實施例58所述的方法，其中所述免疫原性組合物包含皂苷佐劑。 62. 根據實施例61所述的方法，其中所述皂苷佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中： 第一iscom顆粒包含皂樹的級分A，且不包含皂樹的級分C；並且 第二iscom顆粒包含皂樹的級分C，且不包含皂樹的級分A。 63. 根據實施例62所述的方法，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計50%-96%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。 64. 根據實施例62所述的方法，其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%。 65. 根據實施例58所述的方法，其包含約50 μg的皂苷佐劑。 66. 根據實施例58所述的方法，其中所述非離子型洗滌劑選自聚山梨醇酯20（PS20）、聚山梨醇酯40（PS40）、聚山梨醇酯60（PS60）、聚山梨醇酯65（PS65）和聚山梨醇酯80（PS80）。 67. 根據實施例58所述的方法，其中向所述受試者在第0天投予第一劑量，並且在第21天投予加強劑量。 68. 根據實施例58所述的方法，其中投予單劑的所述免疫原性組合物。 69. 根據實施例58所述的方法，其包括投予不同於所述第一免疫原性組合物的第二免疫原性組合物。 70. 根據實施例69所述的方法，其中所述第二免疫原性組合物包含編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。 71. 根據實施例58所述的方法，其中所述異源SARS-CoV-2毒株選自Cal.20C SARS-CoV-2毒株、P.1 SARS-CoV-2毒株、B.1.351 SARS-CoV-2毒株、B.1.1.7 SARS-CoV-2毒株和B.1.1.529 SARS-CoV-2毒株。 72. 根據實施例47所述的方法，其中所述免疫原性組合物預防冠狀病毒疾病-19（COVID-19）的功效為大於約50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。 73. 根據實施例47所述的方法，其中所述免疫原性組合物預防冠狀病毒疾病-19（COVID-19）的功效為在約50%與約99%之間；在約50%與約95%之間；在約75%與約95%之間；在約75%與約99%之間；在約90%與約99%之間；在約80%與約99%之間；和在約80%與約95%之間。 74. 一種誘導針對異源SARS-CoV-2毒株的保護性免疫反應的方法，所述方法包括向受試者投予包含具有SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的冠狀病毒S（CoV S）醣蛋白和非離子型洗滌劑核心的奈米顆粒、醫藥上可接受的緩衝液以及 (iii) 皂苷佐劑，其中所述異源SARS-CoV-2毒株與包含SEQ ID NO: 1的刺突多肽的SARS-CoV-2毒株相比具有約1個至約35個修飾。 75. 根據實施例74所述的方法，其中所述異源SARS-CoV-2毒株與包含SEQ ID NO: 1的刺突多肽的SARS-CoV-2毒株相比具有從約1個至約20個修飾；從約1個至約10個修飾；從約10個至約20個修飾；從約5個至約15個修飾；從約5個至約10個修飾。 76. 根據實施例1-18中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含與SEQ ID NO: 159、167、160、170、174、175、176、或181-184、186、188、190、192或195中的任一個至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%相同的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成。 77. 根據實施例1-18中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其包含SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、192或195中任一個的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成。 78. 根據實施例1-18中任一項所述的冠狀病毒S醣蛋白，其中所述醣蛋白由SEQ ID NO: 161、162、163、164、165、166、168、169、171和172中任一個的核酸編碼。 79. 一種編碼冠狀病毒S醣蛋白的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO: 161、162、163、164、165、166、168、169、171和172中任一個的核酸序列或由所述核酸序列組成。 80. 一種編碼冠狀病毒S醣蛋白的核酸，所述冠狀病毒S醣蛋白具有與SEQ ID NO: 159、167、160、170、174、175、176、或181-184、186、188、190、192或195中的任一個至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%相同的胺基酸序列。 81. 一種包含根據實施例79或80所述的核酸的載體或細胞。 82. 一種冠狀病毒S醣蛋白，其具有與SEQ ID NO: 186、188、190、192、195、174和175中的任一個具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列。 83. 一種免疫原性組合物，其包含根據實施例82所述的CoV S醣蛋白和醫藥上可接受的緩衝液。 84. 一種免疫原性組合物，其包含第一CoV S醣蛋白和第二CoV S醣蛋白以及醫藥上可接受的緩衝液，所述第一CoV S醣蛋白具有與SEQ ID NO: 186、188、190、192、174和175中的任一個具有95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列，所述第二CoV S醣蛋白與SEQ ID NO: 87具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。 85. 根據實施例83或84所述的免疫原性組合物，其包含佐劑。 86. 根據實施例83-85中任一項所述的免疫原性組合物，其包含皂苷佐劑。 通過引用併入
將本文引用的所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案和專利申請都出於所有目的通過引用以其整體而併入。然而，提及本文引用的任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案和專利申請並非且不應被視為承認或以任何形式暗示其構成有效的現有技術或形成世界上任何國家的公共常識的部分。出於所有目的，將以下專利文件通過引用以其整體併入本文：國際公開號2021/154812；國際公開號2022/203963；國際公開號2022/235663；國際公開號2004/004762；國際公開號2019/183063；和國際公開號2017/041100。
無
本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。具有一副或多副彩色附圖的本專利或專利申請公開文本的副本將在請求和支付必要費用後由主管局提供。 圖 1示出了SARS-CoV-2刺突（S）蛋白的野生型胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）的示意圖。弗林蛋白酶切割位點RRAR（SEQ ID NO: 6）以粗體突出顯示，並且信號肽加底線。 圖 2示出了SARS-CoV-2 S多肽的一級結構，其具有無活性弗林蛋白酶切割位點、融合肽缺失以及K986P和V987P突變。結構域位置相對於來自含有信號肽的SARS-CoV-2的野生型CoV S多肽的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）編號。 圖 3示出了BV2378 CoV S多肽的一級結構，其具有無活性弗林蛋白酶切割位點、胺基酸819-828的融合肽缺失以及K986P和V987P突變。結構域位置相對於來自含有信號肽的SARS-CoV-2的野生型CoV S多肽的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）編號。 圖 4示出了CoV S多肽BV2364、BV2365、BV2366、BV2367、BV2368、BV2369、BV2373、BV2374和BV2375的純化。資料揭示具有含有QQAQ的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7）的無活性弗林蛋白酶切割位點的BV2365（SEQ ID NO: 4）和BV2373（SEQ ID NO: 87）被表現為單鏈（S0）。相比之下，含有完整弗林蛋白酶切割位點的CoV S多肽（例如BV2364、BV2366和BV2374）被切割，如通過切割產物S2的存在所證實的。 圖 5通過生物膜層干涉測量術示出了CoV S多肽BV2361、BV2365、BV2369、BV2365、BV2373和BV2374與人血管收縮素轉化酶2前體（hACE2）結合。 圖 6通過生物膜層干涉測量術示出了來自SARS-CoV-2的BV2361不結合MERS-CoV受體二肽基肽酶IV（DPP4），並且MERS S蛋白不與人血管收縮素轉化酶2前體（hACE2）結合。 圖 7通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）示出了BV2361與hACE2結合。 圖 8示出了BV2373 CoV S多肽的一級結構和對弗林蛋白酶切割位點的修飾K986P和V987P。 圖 9示出了野生型CoV S多肽以及CoV S多肽BV2365和BV2373的純化。 圖 10示出了覆蓋在SARS-CoV-2刺突蛋白（EMB ID：21374）的冷凍電子顯微術（cryoEM）結構上的BV2373 CoV S多肽的cryoEM結構。 圖 11A- 圖 11F示出了CoV S刺突多肽BV2365和BV2373與hACE2結合。生物膜層干涉測量術揭示，BV2365（ 圖 11B）和BV2373（ 圖 11C）以與野生型CoV S多肽（ 圖 11A）相似的解離動力學結合hACE2。ELISA示出，野生型CoV S多肽（ 圖 11D）和BV2365（ 圖 11E）以相似的親和力結合hACE2，而BV2373以更高的親和力結合hACE2（ 圖 11F）。 圖 12A- 圖 12B示出了脅迫條件（如溫度、兩個冷凍/解凍循環、氧化、攪拌和pH極端值）對CoV S多肽BV2373（ 圖 12A）和BV2365（ 圖 12B）與hACE2的結合的影響。 圖 13A- 圖 13B示出了在用兩個劑量（ 圖 13A）和一個劑量（ 圖 13B）的0.1 µg至10 µg的BV2373、加或不加級分A和級分C iscom基質（例如，MATRIX-M TM）免疫小鼠後13天、21天和28天的抗CoV S多肽IgG力價。 圖 14示出了在用一個劑量或兩個劑量的0.1 µg至10 µg的BV2373、加或不加MATRIX-M TM免疫的小鼠中阻斷hACE2相互作用的抗體的誘導。 圖 15示出了在用一個劑量或兩個劑量的0.1 µg至10 µg的BV2373、加或不加MATRIX-M TM免疫的小鼠中檢測到的病毒中和抗體。 圖 16示出了用單劑量的BV2373或兩個劑量的BV2373間隔14天、加或不加MATRIX-M TM免疫的Ad/CMV/hACE2小鼠的肺中的病毒載量（SARS-CoV-2）。 圖 17A- 圖 17C示出了用BV2373免疫後小鼠展現出的體重減輕。 圖 17A示出了用單一0.01 µg、0.1 µg、1 µg或10 µg的BV2373 + MATRIX-M TM免疫對體重減輕的影響。 圖 17B示出了用兩個劑量的BV2373（0.01 µg、0.1 µg、1 µg） + MATRIX-M TM免疫對體重減輕的影響。 圖 17C示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用兩個劑量的BV2373（10 µg）免疫對體重減輕的影響。 圖 18A- 圖 18B示出了BV2373在感染SARS-CoV-2後四天（ 圖 18A）或七天（ 圖 18B）對小鼠肺組織病理學的影響。 圖 19示出了與在存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的小鼠相比，在不存在佐劑的情況下用BV2373免疫的小鼠的脾臟中離體刺激後IFN-γ分泌性細胞的數量。 圖 20A- 圖 20E示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的小鼠的脾臟中細胞介素分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 20A示出了IFN-γ分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 20B示出了TNF-α分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 20C示出了IL-2分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 20D示出了分泌選自IFN-γ、TNF-α和IL-2的兩種細胞介素的CD4+ T細胞的頻率。 圖 20E示出了表現IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD4+ T細胞的頻率。 圖 21A- 圖 21E示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的小鼠的脾臟中細胞介素分泌性CD8 +T細胞的頻率。 圖 21A示出了IFN-γ分泌性CD8 +T細胞的頻率。 圖 21B示出了TNF-α分泌性CD8 +T細胞的頻率。 圖 21C示出了IL-2分泌性CD8 +T細胞的頻率。 圖 20D示出了分泌選自IFN-γ、TNF-α和IL-2的兩種細胞介素的CD8 +T細胞的頻率。 圖 21E示出了表現IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD8 +T細胞的頻率。 圖 22展示了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的小鼠的脾臟中表現選自IFN-γ、TNF-α和IL-2的一種（單一）、兩種（雙重）或三種（三重）細胞介素的CD4 +或CD8 +細胞的頻率。 圖 23A- 圖 23C展示了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫對CD4 +T細胞分泌2型細胞介素的影響。 圖 23A示出了IL-4分泌性細胞的頻率。 圖 23B示出了IL-5分泌性CD4 +細胞的頻率。 圖 23C示出了IFN-γ分泌性與IL-4分泌性CD4 +T細胞的比率。 圖 24A- 圖 24B通過評估CD4 +濾泡輔助性T細胞（TFH）的存在展示了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫小鼠對生發中心形成的影響。 圖 24A示出了脾臟中CD4 +濾泡輔助性T細胞的頻率，並且 圖 24B示出了CD4 +濾泡輔助性T細胞的表型（例如CD4 +CXCR5 +PD-1 +）。 圖 25A- 圖 25B通過評估生發中心（GC）B細胞的存在展示了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫小鼠對生發中心形成的影響。 圖 25A示出了脾臟中GC B細胞的頻率，並且 圖 25B揭示了CD4 +濾泡輔助性T細胞的表型（例如CD19 +GL7 +CD-95 +）。 圖 26A- 圖 26C示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫對橄欖狒狒的抗體反應的影響。 圖 26A示出了用BV2373免疫後狒狒中的抗SARS-CoV-2 S多肽IgG力價。 圖 26B示出了在存在MATRIX-M TM的情況下用5 µg或25 µg的BV2373單次免疫後在狒狒中hACE2受體阻斷抗體的存在。 圖 26C示出了用BV2373和MATRIX-M TM單次免疫後病毒中和抗體的力價。 圖 27示出了用BV2373免疫後橄欖狒狒中抗SARS-CoV-2 S多肽IgG與中和抗體力價之間的顯著相關性。 圖 28示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的橄欖狒狒的外周血單個核細胞（PBMC）中IFN-γ分泌性細胞的頻率。 圖 29A- 圖 29E示出了在存在或不存在MATRIX-M TM的情況下用BV2373免疫的橄欖狒狒的PBMC中細胞介素分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 29A示出了IFN-γ分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 29B示出了IL-2分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 29C示出了TNF-α分泌性CD4+ T細胞的頻率。 圖 29D示出了分泌選自IFN-γ、TNF-α和IL-2的兩種細胞介素的CD4+ T細胞的頻率。 圖 29E示出了表現IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD4+ T細胞的頻率。 圖 30示出了冠狀病毒刺突（S）蛋白（SEQ ID NO: 109）（BV2384）的示意圖。弗林蛋白酶切割位點GSAS（SEQ ID NO: 97）加單底線，並且K986P和V987P突變加雙底線。 圖 31示出了冠狀病毒刺突（S）蛋白（SEQ ID NO: 86）（BV2373）的示意圖。弗林蛋白酶切割位點QQAQ（SEQ ID NO: 7）加單底線，並且K986P和V987P突變加雙底線。 圖 32示出了CoV S多肽BV2373（SEQ ID NO: 87）和BV2384（SEQ ID NO: 109）的純化。 圖 33示出了純化後BV2384（SEQ ID NO: 109）純度的掃描光密度測定圖。 圖 34示出了純化後BV2373（SEQ ID NO: 87）純度的掃描光密度測定圖。 圖 35A- 圖 35B展示了回應於BV2373和MATRIX-M TM的投予抗S抗體（ 圖 35A）和中和抗體（ 圖 35B）的誘導。向食蟹猴投予一個或兩個劑量（第0天和第21天）的2.5 μg、5 μg或25 μg的BV2373加25　μg或50　μg MATRIX-M TM佐劑。對照既未接受BV2373又未接受MATRIX-M TM。在第21天和第33天測量抗體。 圖 36A- 圖 36B展示了本文公開的疫苗配製品對SARS-CoV-2病毒複製的減少，如在食蟹猴的支氣管肺泡灌洗液（BAL）中所評估的。如圖所示，向食蟹猴投予BV2373和MATRIX-M TM。受試者在第0天進行免疫，並且在用兩個劑量的組中在第0天和第21天進行免疫。第37天用1x10 4pfu SARS-CoV-2病毒攻擊受試動物。在用感染性病毒攻擊後2天和4天（d2pi和d4pi），在支氣管灌洗液（BAL）中評估病毒RNA（ 圖 36A，對應於存在的總RNA）和病毒次基因體RNA（ 圖 36B，對應於複製病毒）水準。大多數受試者未示出病毒RNA。在第2天，在一些受試者中測量到少量RNA。到第4天，除了接受2.5 µg最低劑量的兩名受試者以外，都未測量到RNA。除了同樣接受最低劑量的1名受試者以外，在2天或4天均未檢測到次基因體RNA。 圖 37A- 圖 37B展示了本文公開的疫苗配製品對SARS-CoV-2病毒複製的減少，如在食蟹猴的鼻拭子中所評估的。如圖所示，向食蟹猴投予BV2373加MATRIX-M TM。受試者在第0天進行免疫，並且在用兩個劑量的組中在第0天和第21天進行免疫。第37天用1x10 4SARS-CoV-2病毒攻擊受試動物。在感染後2天和4天（d2pi和d4pi）通過鼻拭子評估病毒RNA（ 圖 37A）和病毒次基因體（sg）RNA（ 圖 37B）。大多數受試者未示出病毒RNA。在第2天和第4天，在一些受試者中測量到少量RNA。在2天或4天均未檢測到次基因體RNA。受試者在第0天進行免疫，並且在用兩個劑量的組中在第0天和第21天進行免疫。這些資料表明，疫苗將鼻總病毒RNA降低100-1000倍，並將sgRNA降低至不可檢測的水準，並且確認對疫苗的免疫反應將阻斷病毒複製並防止病毒傳播。 圖 38A- 圖 38B示出了用一個劑量（ 圖 38A）或兩個劑量（ 圖 38B）的BV2373和25 µg或50 µg的MATRIX-M TM免疫食蟹猴後21天和35天的抗CoV S多肽IgG力價。 圖 38C- 圖 38D示出了用一個劑量（ 圖 38C）或兩個劑量（ 圖 38D）的BV2373（5 µg）和MATRIX-M TM（25 µg或50 µg）免疫食蟹猴後21天和35天食蟹猴的hACE2抑制力價。 圖 38E示出了在投予BV2373和MATRIX-M TM後在食蟹猴中抗CoV S多肽IgG力價與hACE2抑制力價之間的顯著相關性。示出了表4的第2-6組的數據。 圖 39示出了在用兩個劑量的BV2373和MATRIX-M TM免疫後或在用表4的恢復期人血清（第2、4和6組）免疫後35天食蟹猴的抗CoV S多肽力價和hACE2抑制力價。這些資料表明，用BV2373和MATRIX-M TM免疫的食蟹猴的抗CoV S多肽和hACE2抑制力價優於用恢復期血清免疫的食蟹猴。 圖 40A- 圖 40B顯示了用BV2373和MATRIX-M TM免疫的食蟹猴的SARS-CoV-2中和力價，如通過致細胞病變效應（CPE）（ 圖 40A）和噬斑減少中和測試（PRNT）（ 圖 40B）所測定的。 圖 41示出了評價包含BV2373和任選的MATRIX-M TM的疫苗的安全性和功效的臨床試驗的投予時間。AESI表示特別關注的不良事件。MAEE表示醫療護理不良事件，並且SAE表示嚴重不良事件。 圖 42A- 圖 42B示出了在評價包含BV2373和MATRIX-M TM的疫苗的臨床試驗中患者經歷的局部（ 圖 42A）和全身性（ 圖 42B）不良事件。在表5中標識了組A-E。資料表明，疫苗具有良好的耐受性和安全性。 圖 43A- 圖 43B示出了在評價包含BV2373和MATRIX-M TM的疫苗的臨床試驗中免疫參與者後21天和35天的抗CoV S多肽IgG（ 圖 43A）和中和（ 圖 43B）力價。水準條分別表示四分位距（IRQ）和中值曲線下面積。須端點等於低於或高於中值 ± 1.5倍IQR的最大值和最小值。恢復期血清圖包括來自美國貝勒醫學院（Baylor College of Medicine）的PCR確認的COVID-19參與者的樣本（29個樣本用於ELISA且32個樣本用於微量中和（MN IC ＞99））。COVID-19的嚴重性表示為住院治療患者的紅色標記（包括重症監護環境）、門診治療患者的藍色標記（在急診科收集的樣品）和無症狀（暴露）患者的綠色標記（從接觸/暴露評估中收集的樣品）。 圖 44A- 圖 44C示出了在投予恢復期血清（ 圖 44A）、兩個25 µg劑量的BV2373（ 圖 44B）和兩個劑量（5 µg和25 µg）的BV2373加MATRIX-M TM（ 圖 44C）的患者中抗CoV S多肽IgG與中和抗體力價之間的相關性。在用恢復期血清治療或佐劑化BV2373處理的患者中在中和抗體力價與抗CoV-S IgG力價之間觀察到很強的相關性，而在不存在佐劑的情況下用BV2373處理的患者中並未觀察到。 圖 45A- 圖 45D示出了在A組（安慰劑， 圖 45A）、B組（25 µg BV2373， 圖 45B）、C組（5 µg BV2373和50 µg MATRIX-M TM， 圖 45C）和D組（25 µg BV2373和50 µg MATRIX-M TM， 圖 45D）中在用BV2373刺激後參與者的產生T輔助1（Th1）細胞介素干擾素-γ（IFN‑γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及介白素（IL）-2和T輔助2（Th2）細胞介素IL-5和IL‑13指示的細胞介素的抗原特異性CD4+ T細胞的頻率。Th1細胞介素圖中的“任何2”意指可以同時產生兩種類型的Th1細胞介素的CD4 +T細胞。“全部3”指示同時產生IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD4 +T細胞。Th2圖中的“兩者”意指可以同時產生Th2細胞介素IL-5和IL-13的CD4 +T細胞。 圖 46A示出了含有信號肽的野生型SARS-CoV-2 S多肽的一級結構，其相對於SEQ ID NO: 1編號。 圖 46B示出了沒有信號肽的野生型SARS-CoV-2 S多肽的一級結構，其相對於SEQ ID NO: 2編號。 圖 47示出了3期臨床試驗中受試者的隨機化，所述臨床試驗評價了與級分A和級分C iscom基質（MATRIX-M TM）佐劑組合的BV2373的功效、免疫原性和安全性。 圖 48是Kaplan-Meyer圖，其顯示了受試者在接種與級分A和級分C iscom基質（MATRIX-MTM）組合的BV2373或安慰劑後經歷的症狀性COVID-19的發生率（累積事件率（%））。 圖 49示出了與級分A和級分C iscom基質（MATRIX-M TM）組合的BV2373針對包含具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CoV S多肽的SARS-CoV-2或者包含具有胺基酸69、70和144的缺失以及N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H的突變的CoV S多肽的異源B.1.1.7 SARS-CoV-2毒株的疫苗功效。 圖 50是示出了在使用與級分A和級分C iscom基質（MATRIX-M TM）組合的BV2373（標記為“A”）或安慰劑（標記為“B”）的第一疫苗接種劑量（標記為“疫苗接種1”）和第二疫苗接種劑量（標記為“疫苗接種2”）之後受試者所經歷的不良事件的圖。 圖 51示出了BV2438 CoV S多肽的示意圖。結構元件包括可切割信號肽（SP）、N末端結構域（NTD）、受體結合結構域（RBD）、次結構域1和2（SD1和SD2）、S2切割位點（S2’）、融合肽（FP）、七肽重複區1（HR1）、中央螺旋（CH）、七肽重複區2（HR2）、跨膜結構域（TM）和胞質尾（CT）。與具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CoV S多肽相比的胺基酸變化在線性圖下方以黑色文本示出。 圖 52A示出了用考馬斯藍染色純化的全長BV2438的還原SDS-PAGE凝膠，其示出預期分子量約170 kD的主要蛋白質產物。 圖 52B示出了掃描光密度測定法的圖。 圖 52C示出了BV2438的負染色透射電子顯微照片。BV2438形成長度為15 nm且寬度為11 nm的界限清楚的燈泡形顆粒（左圖）。三聚體展現出與PS-80膠束連接的8 nm柔性連接子（左圖）。類平均圖像顯示rS-B.1.351三聚體與在2D圖像上疊加的融合前SARS-CoV-2三聚體刺突蛋白胞外域（PDB ID 6VXX）的低溫EM解析結構的良好擬合（中間圖）。右圖示出了兩個錨定至PS-80膠束中的BV2438三聚體。 圖 53示出了實例10的小鼠研究設計。在初次免疫/加強免疫方案中的第0天和第14天，使用重組S（rS）BV2438（SA）或BV2373（WU）蛋白的各種組合對小鼠組（n = 20只/組）進行免疫。小鼠用BV2438進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫並且用BV2438進行加強免疫，或用二價BV2373 + BV2438進行初次免疫和加強免疫。對於每次單價免疫的抗原劑量為1 µg rS，或對於二價免疫後的每個構築體為1 µg rS（總共2 µg rS）。所有抗原劑量均與5 µg皂苷佐劑一起投予。對照組接受配製品緩衝液（安慰劑）。在圖中列出的時間點收集血清和組織。 圖 54A- 圖 54B示出了在實例10的小鼠研究的第21天收集的血清中的抗SARS-CoV-2 S IgG血清力價。ELISA用於測量針對武漢-Hu-1刺突蛋白（ 圖 54A）或B.1.351刺突蛋白（ 圖 54B）的抗體力價。條形指示幾何平均力價（GMT），並且誤差條表示每組的95%信賴區間（CI）。單獨動物力價用有色符號指示。 圖 54C- 圖 54D示出了在第21天收集的血清中的能夠破壞SARS-CoV-2受體hACE2與武漢-Hu-1刺突蛋白（ 圖 54C）或B.1.351刺突蛋白（ 圖 54D）之間的結合的功能性抗體力價（通過ELISA測量）。條形指示幾何平均力價（GMT），並且誤差條表示每組的95%信賴區間（CI）。單獨動物力價用有色符號指示。 圖 54E示出了使用PRNT測定來測定的在第32天從n = 5只動物/組收集的血清中的SARS-CoV-2中和抗體力價。評價了血清中和SARS-CoV-2 USA-WA1、B.1.351變種或B.1.1.7變種的能力。條形指示幾何平均力價（GMT），並且誤差條表示每組的95%信賴區間（CI）。單獨動物力價用符號指示。通過對log 10轉化的資料進行單因素方差分析與Tukey事後檢定來分析統計顯著性。 圖 55A- 圖 55F示出了用基於武漢-Hu-1或B.1.351的SARS-CoV-2 rS免疫針對用活的SARS-CoV-2 B.1.351或B.1.1.7病毒攻擊的保護性功效。研究設計描述於 圖 53中。用活的SARS-CoV-2 B.1.351（左圖）或B.1.1.7（右圖）攻擊免疫的小鼠（n = 10只/組）。在攻擊之後四天內每天對小鼠稱重，並計算它們相對於攻擊日的體重的體重減輕百分比。 圖 55A和 圖 55B用符號示出了平均體重減輕百分比。誤差條表示平均值的標準誤差。攻擊後2天處死一半小鼠，並對肺組織進行噬斑形成測定以測定肺病毒力價（ 圖 55C 、圖 55D）。在攻擊後4天處死其餘小鼠。 圖 55E和 圖 55F示出了肺組織中SARS-CoV-2次基因體RNA的水準，並表示為攻擊後第2天RNA相對於相應安慰劑組中平均值的倍數變化。水準條表示每個時間點n = 5只小鼠的組平均倍數變化，並且誤差條表示標準差。 圖 56A- 圖 56H示出了在小鼠中用BV2373或BV2438方案免疫後誘導的細胞介導的免疫。 圖 56A示出了小鼠研究設計。在初次免疫/加強免疫方案中第0天和第21天，用基於BV2373或BV2438的SARS-CoV-2 rS的各種組合對小鼠組（n = 8只/組）進行免疫。小鼠用BV2438進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫並且用BV2438進行加強免疫，或用二價BV2373和BV2438進行初次免疫和加強免疫。對於每次單價免疫的抗原劑量為1 µg rS，或對於二價免疫後的每個構築體為1 µg rS（總共2 µg rS）。所有免疫均與5 µg Matrix-M1佐劑一起投予。對照組接受配製品緩衝液（安慰劑，n = 5）。在第28天收穫脾臟以用於細胞收集。用BV2373或BV2438刺激脾細胞，然後進行ELISA以確定IFN-γ陽性細胞為代表性Th1細胞介素（ 圖 56B）且IL-5陽性細胞為代表性Th2細胞介素（ 圖 56C）。來自 圖 56B和 圖 56C的資料用於計算對免疫的反應的Th1/Th2平衡（ 圖 56D）。 圖 56E示出量化了使用細胞內細胞介素染色時對三種Th1細胞介素（IFN-γ、IL-2和TNF-α）染色呈陽性的多功能CD4+ T細胞的數量並將其表示為每10 6個CD4+ T細胞中三重細胞介素陽性的細胞的數量。 圖 56F示出了濾泡輔助性T細胞的量化。通過測定所有CD4+ T細胞中PD-1+CXCR5+細胞的百分比來量化濾泡輔助性T細胞。 圖 56G示出了通過使用流式細胞術確定CD19+ B細胞中GL7+CD95+細胞的百分比來評價生發中心形成。灰色條表示平均值並且誤差條表示標準差。單獨動物資料用有色符號示出。門控策略的例子示於 圖 56H 。實驗組之間的差異通過單因素方差分析與Tukey事後檢定進行評價（ 圖 56B中的資料在分析前經過log 10轉化）。P值 ＜ 0.05被認為是統計上顯著的；**** = p ＜ 0.0001。 圖 57A- 圖 57E示出了來自用BV2373或BV2438免疫的CD4+和CD8+ T細胞反應。在初次免疫/加強免疫方案中第0天和第21天，用BV2373或BV2438的各種組合對小鼠組（n = 8只/組）進行免疫。小鼠用BV2438進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫和加強免疫，用BV2373進行初次免疫並且用BV2438進行加強免疫，或用二價BV2373和BV2438進行初次免疫和加強免疫。對於每次單價免疫的抗原劑量為1 µg rS，或對於二價免疫後的每個構築體為1 µg rS（總共2 µg rS）。所有抗原劑量均與5 µg皂苷佐劑一起投予。對照組接受配製品緩衝液（安慰劑，n = 5）。在第28天收穫脾臟以用於細胞收集。用rS-WU1或rS-B.1.351刺激分離的脾細胞，然後進行細胞內細胞介素染色以確定CD4+ T細胞是否對IFN-γ（ 圖 57A）、IL-2（ 圖 57B）、TNF-α（ 圖 57C）或IL-4（ 圖 57D）呈陽性。為了檢查CD8+ T細胞反應，用對應於整個武漢-Hu-1刺突蛋白序列的肽庫刺激細胞，然後對IFN-γ、IL-2和TNF-α進行ICS（ 圖 57E）。 圖 58A- 圖 58G示出了在狒狒中用BV2373免疫後大約一年一個或兩個加強BV2438劑量的免疫原性。 圖 58A示出了研究設計。小的狒狒群組（n = 2-3只/組）在第0天和第21天（分別為第0週和第3週）用1 µg、5 µg或25 µg BV2373與皂苷佐劑一起或25 µg未佐劑化BV2373進行初始免疫。大約1年後，所有動物在第318天和第339天（分別為第45週和第48週）用一個或兩個劑量的3 µg BV2438與50 µg皂苷佐劑一起進行加強免疫。 圖 58B示出了研究過程中的抗CoV S IgG力價。單獨動物的力價隨時間示出，不同顏色的符號和線條表示初始rS-WU1免疫系列的不同劑量組。分析BV2438加強免疫前（第303天）以及加強免疫後7、21、35和81天收集的血清以通過ELISA測定抗rS-WU1（ 圖 58C）和抗rS-B.1.351（ 圖 58D）IgG力價（水平線表示平均值），通過ELISA測定能夠破壞rS-WU1或rS-B.1.351與hACE2受體之間相互作用的抗體力價（ 圖 58E，水平線表示平均值），以及使用PRNT測定來測定能夠中和SARS-CoV-2毒株USA-WA1、B.1.351和B.1.1.7的抗體力價（ 圖 58F，灰色條表示幾何平均值，並且誤差條表示95%信賴區間）。用BV2373或BV2438刺激後，用細胞內細胞介素染色評價對3種Th1細胞介素（IFN-γ、IL-2和TNF-α）呈陽性的多功能CD4+ T細胞的存在（ 圖 58G）。灰色條表示平均值，並且有色符號表示單獨動物資料。 圖 59A- 圖 59G示出了狒狒中對BV2438加強免疫的單獨細胞介素反應。小的狒狒群組（n = 2-3只/組）在第0天和第21天（分別為第0週和第3週）用1 µg、5 µg或25 µg BV2373與50 µg皂苷佐劑一起或25 µg未佐劑化BV2373進行免疫。大約1年後，所有動物在第318天和第339天（分別為第45週和第48週）用一個或兩個劑量的3 µg BV2438與50 µg皂苷佐劑一起進行加強免疫。在加強免疫前（第303天；第43週）、第一次rS-B.1.351加強免疫後7天（第325天；第46週）和第一次rS-B.1.351加強免疫後35天（第353天；第50週）收集PBMC。用BV2373或BV2438刺激PBMC並對其進行ELISA以測量作為Th1細胞介素的IFN-γ產生性細胞（ 圖 59A）和作為Th2細胞介素的IL-4產生性細胞（ 圖 59B）。也用BV2373或BV2438刺激CD4+ T細胞，然後對其進行ICS以測量產生IFN-γ（ 圖 59C）、IL-2（ 圖 59D）、TNF-α（ 圖 59E）、IL-5（ 圖 59F）和IL-13（ 圖 59G）的細胞。 圖 60A- 圖 60B示出了來自用BV2373免疫的人受試者的SARS-CoV-2變種中和力價。與B.1.1.7（ 圖 60A）和B.1.351（ 圖 60B）相比，對來自臨床研究參與者（n = 30）的血清樣品進行PRNT測定以確定針對USA-WA1的中和抗體的存在。單獨受試者的力價用黑色圓圈示出，線條將個體針對USA-WA1的力價與他們針對相應變種的力價連接在一起。 圖 61繪製了從SARS-CoV-2變種（例如B.1.1.529（“ο”）、δ或β變種）占經測序的SARS-CoV-2感染的1%時起的天數與由南非變種引起的SARS-CoV-2感染的百分比的關係。該圖示出ο變種傳播更迅速並且超過其他變種。 圖 62示出了在南非茨瓦內SARS-CoV-2陽性測試從1%增加至30%。ο變種首先發現於2021年11月11日，表明增加的陽性測試由ο變種引起。 圖 63示出了與具有SEQ ID NO: 1的序列的SARS-CoV-2蛋白的S蛋白相比，SARS-CoV-2 ο變種的S蛋白中的突變。 圖 64示出了在SARS-CoV-2 ο變種的S蛋白內的突變的位置。ο變種含有RBD和NTD中的多個突變；鄰近弗林蛋白酶切割位點的突變（H655Y；N679K；P681H）；胺基酸105-107的缺失；以及核衣殼中的R203K和G204R突變。 圖 65A- 圖 65D示出了CoV S刺突多肽BV2373（ 圖 65A）和BV2509（ 圖 65B）以相似的結合動力學結合hACE2。ELISA示出BV2373多肽（ 圖 65C）和BV2509（ 圖 65D）以相似的親和力結合hACE2。 圖 66A- 圖 66B示出了對於以下SARS-CoV-2變種在用BV2373和皂苷佐劑加強免疫之前和之後的抗S蛋白IgG力價：(i) 與具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的蛋白質相比，具有含有D614G突變的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒；(ii) SARS-CoV-2 α毒株、SARS-CoV-2 β毒株、SARS-CoV-2 δ毒株、和SARS-CoV-2 ο毒株。 圖 66A示出了從第35天到第217天的倍數增加。 圖 66B示出了從第189天到第217天的倍數增加。 圖 67A- 圖 67D示出了對於以下SARS-CoV-2變種在用BV2373和皂苷佐劑加強免疫之前和之後的功能性hACE2抑制：(i) 與具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的蛋白質相比，具有含有D614G突變的CoV S多肽的SARS-CoV-2病毒；(ii) SARS-CoV-2 α毒株、SARS-CoV-2 β毒株、SARS-CoV-2 δ毒株、和SARS-CoV-2 ο毒株。 圖 67A示出了從第35天到第217天的倍數增加。 圖 67B示出了從第189天到第217天的倍數增加。 圖 67C示出了從第35天到第217天的倍數增加。 圖 67D示出了在青少年中的功能性hACE2抑制。與成人相比，青少年（12-18歲）展現出2.4-4倍的針對變種的功能性免疫反應。 圖 68示出了實例11中描述的試驗參與者的加強免疫用劑的圖。 圖 69A- 圖 69B示出了實例11中所述試驗的B2組中患者的局部（ 圖 69A）和全身性（ 圖 69B）反應原性。 圖 70示出了在實例11中描述的患者截至研究日對原始SARS-CoV-2毒株的血清IgG力價。 圖 71示出了在實例11中描述的患者截至研究日對於原始SARS-CoV-2毒株的中和抗體活性。 圖 72示出了實例11的包含BV2373和皂苷佐劑的免疫原性組合物針對抗含有D614G突變的SARS-CoV-2毒株、B.1.617.2（δ變種）和B. 1.1.529（ο變種）的中和抗體99（neut99）值。 圖 73示出了包含BV2373、BV2509或其組合和皂苷佐劑的免疫原性組合物（參見實例12）針對SARS-CoV-2 ο BA.1變種、WA1變種和δ變種的中和抗體99（neut99）值。 圖 74A- 圖 74B示出了在用SARS CoV-2 ο BA.1變種（圖74A）或WA1變種（圖74B）攻擊後兩天，在小鼠肺中的病毒載量。與安慰劑相比，每種組合物降低了病毒載量。根據實例12中的方法對小鼠進行免疫。 圖 75A- 圖 75E示出了具有SEQ ID NO: 186（ 圖 75A）、SEQ ID NO: 188（ 圖 75B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 75C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 75D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 75E）的序列的經純化SARS-CoV-2 S蛋白的Tris乙酸凝膠。 圖 76A- 圖 76E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 76A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 76B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 76C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 76D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 76E）的胺基酸序列的蛋白的細微性分佈。（參見實例8） 圖 77A- 圖 77E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 77A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 77B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 77C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 77D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 77E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的HPLC-SEC跡線。 圖 78A- 圖 78E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 78A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 78B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 78C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 78D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 78E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的結合動力學。 圖 79A- 圖 79E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 79A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 79B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 79C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 79D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 79E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白與hACE2的結合。 圖 80A- 圖 80E示出了具有SEQ ID NO: 188（ 圖 80A）、SEQ ID NO: 186（ 圖 80B）、SEQ ID NO: 190（ 圖 80C）、SEQ ID NO: 192（ 圖 80D）和SEQ ID NO: 87（ 圖 80E）的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的熱穩定性。 圖 81示出了具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 188和SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的晶體結構。
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無。

Claims (75)

  1. 一種冠狀病毒（CoV）刺突（S）醣蛋白，其包含： (i)具有滅活的弗林蛋白酶切割位點的S1次單元，其中所述S1次單元包含N末端結構域（NTD）、受體結合結構域（RBD）、次結構域1和次結構域2（SD1/2），其中所述滅活的弗林蛋白酶切割位點具有QQAQ的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7）； 其中所述NTD任選地包含選自以下的一個或多個修飾： (a)選自胺基酸11-14、56、57、130、131、132、144、145、198、199、228、229、230、231、234、235、236、237、238、239、240及其組合的一個或多個胺基酸的缺失；以及 (b)選自胺基酸5、6、7、11、12、13、14、51、53、54、56、57、62、63、67、70、82、125、129、131、132、133、134、139、143、144、145、170、177、197、198、199、200、201、202、209、229、233、239、240、244、245及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (c)具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述RBD任選地包含選自胺基酸326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、419、426、427、431、432、433、439、440、447、464、465、471、473、477、480、481、483、485、488、492及其組合的一個或多個胺基酸的突變；並且 其中所述SD1/2結構域任選地包含選自534、557、591、600、601、626、642、645、664、666、668及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (ii)S2次單元，其中胺基酸973和974是脯胺酸， 其中所述S2次單元任選地包含選自以下的一個或多個修飾： (a)從676-685、676-702、702-711、775-793、806-815及其組合的一個或多個胺基酸的缺失；以及 (b)選自688、691、703、751、783、843、846、875、937、941、956、968、969、1014、1058、1105、1163、1186及其組合的一個或多個胺基酸的突變；以及 (c)自TMCT的一個或多個胺基酸的缺失； 以及在(i)(a)-(c) 和 (ii)(a)-(c) 中的修飾中的任一種的組合； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
  2. 如請求項1所述的CoV S醣蛋白，其包含選自以下的一個或多個修飾： (i)選自6、14、54、70、82、129、133、134、139、143、144、170、197、199、200、239、244、326、333、355、358、360、362、363、392、395、404、427、431、432、433、439、447、464、465、471、473、477、480、483、485、488、492、534、591、601、626、642、645、666、668、691、751、783、843、941、956、968和1186的一個或多個胺基酸的突變； (ii)選自11、12、13、56、57、130、131、132、144、145和198的一個或多個胺基酸的缺失；以及 (iii)具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
  3. 如請求項1或2所述的CoV S醣蛋白，其包含選自以下的一個或多個修飾：T6I、T6R、A14S、A54V、V70A、T82I、G129D、H133Q、K134E、W139R、E143G、F144L、Q170E、I197V、L199I、V200E、V200G、G239V、G244S、G326D、G326H、R333T、L355I、S358F、S358L、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、V432P、G433S、L439R、L439Q、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、F473S、F477S、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、T591I、D601G、G626V、H642Y、N645S、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白包含選自以下的修飾的組合： (i)   A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (ii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (iii)      T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (iv)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (v)  T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (vi)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (vii)    V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (viii)  V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (ix)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56、以及胺基酸57的缺失； (x)  T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (xi)       T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (xii)    T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xiii)  T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xiv)   T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失； (xv)     T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； (xvi)   T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xvii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 (xviii)         T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； 其中所述CoV S醣蛋白的胺基酸相對於具有SEQ ID NO: 2的序列的多肽編號。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白的NTD與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的NTD是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白的RBD與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的RBD是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白的S1次單元與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的S1次單元是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白的S2次單元與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的S2次單元是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述CoV S醣蛋白的SD1/2與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的SD1/2是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述NTD、RBD、S1次單元、S2次單元和SD1/2中的每一種與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個的對應NTD、RBD、S1次單元、S2次單元和SD1/2是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  12. 如請求項1-11中任一項所述的CoV S醣蛋白，其包含蛋白標籤。
  13. 如請求項12所述的CoV S醣蛋白，其中所述蛋白標籤在所述醣蛋白的N末端。
  14. 如請求項12所述的CoV S醣蛋白，其中所述蛋白標籤在所述醣蛋白的C末端。
  15. 如請求項12-14中任一項所述的CoV S醣蛋白，其中所述蛋白標籤選自多麩胺酸標籤、FLAG標籤、HA標籤、多His標籤（具有約5-10個組胺酸）（SEQ ID NO: 101）、六組胺酸標籤（SEQ ID NO: 100）、8X-His標籤（具有八個組胺酸）（SEQ ID NO: 102）、Myc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶標籤、綠色螢光蛋白標籤、麥芽糖結合蛋白標籤、硫氧還蛋白標籤、Fc標籤或其組合。
  16. 如請求項1-15中任一項所述的CoV S醣蛋白，其包含N末端信號肽。
  17. 如請求項16所述的CoV S醣蛋白，其中所述N末端信號肽選自SEQ ID NO: 5、117、154和193中的任一個。
  18. 一種核酸，其包含如請求項1-17中任一項所述的CoV S醣蛋白。
  19. 如請求項18所述的核酸，其中所述核酸與SEQ ID NO: 196、197、198、199、201、202、204、206、208、210、212、214或216中的任一個的核酸是至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  20. 一種載體，其包含如請求項18或19所述的核酸。
  21. 一種奈米顆粒，其包含如請求項1-17中任一項所述的CoV S醣蛋白和非離子型洗滌劑核心。
  22. 如請求項21所述的奈米顆粒，其中在4ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。
  23. 如請求項21或22所述的奈米顆粒，其中在25ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。
  24. 如請求項21-23中任一項所述的奈米顆粒，其中在37ºC下儲存約一個月後，如通過差示掃描量熱法所測定，所述奈米顆粒的熔解溫度是至少55ºC、至少56ºC、至少57ºC、至少58ºC、至少59ºC、至少60ºC、至少61ºC、至少62ºC、至少63ºC、至少64ºC、至少65ºC、或從約55ºC至約65ºC。
  25. 如請求項21-24中任一項所述的奈米顆粒，其中在4ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約65 nm或從約30 nm至約50 nm的Zavg直徑。
  26. 如請求項21-25中任一項所述的奈米顆粒，其中在25ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約65 nm或從約30 nm至約50 nm的Zavg直徑。
  27. 如請求項21-26中任一項所述的奈米顆粒，其中在37ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約30 nm至約120 nm、從約30 nm至約80 nm或從約30 nm至約60 nm的Zavg直徑。
  28. 如請求項21-27中任一項所述的奈米顆粒，其中在4ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。
  29. 如請求項21-28中任一項所述的奈米顆粒，其中在25ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。
  30. 如請求項21-29中任一項所述的奈米顆粒，其中在37ºC下儲存約一個月後，如通過動態光散射所測定，所述奈米顆粒具有從約0.1 nm至約0.4 nm、從約0.15 nm至約0.35 nm或從約0.2 nm至約0.45 nm的多分散性指數。
  31. 如請求項21-30中任一項所述的奈米顆粒，其中所述非離子型洗滌劑選自聚山梨醇酯20（PS20）、聚山梨醇酯40（PS40）、聚山梨醇酯60（PS60）、聚山梨醇酯65（PS65）和聚山梨醇酯80（PS80）。
  32. 如請求項31所述的奈米顆粒，其中所述非離子型洗滌劑是PS80。
  33. 一種細胞，其表現如請求項1-17中任一項所述的CoV S醣蛋白。
  34. 如請求項33所述的細胞，其中所述細胞是昆蟲細胞。
  35. 一種免疫原性組合物，其包含至少一種如請求項1-17中任一項所述的CoV S醣蛋白或如請求項21-32中任一項所述的奈米顆粒和醫藥上可接受的緩衝液。
  36. 如請求項35所述的免疫原性組合物，其包含兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同的CoV S醣蛋白。
  37. 如請求項35或36所述的免疫原性組合物，其中至少一種CoV S醣蛋白包含選自以下的修飾的組合： (i)          A54V、T82I、G129D、L199I、G326D、S358L、S360P、S362F、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、胺基酸130的缺失、胺基酸131的缺失、胺基酸132的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (ii)        T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (iii)      T6R、A14S、T82I、G129D、E143G、L199I、G326D、S358L、S360P、K404N、N427K、G433S、S464N、T465K、E471A、Q480R、G483S、Q485R、N488Y、Y492H、T534K、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、N843K、Q941H、N956K、L968F、胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、胺基酸198的缺失、以及具有EPE的胺基酸序列的三肽在胺基酸214與215之間的插入； (iv)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、K404N、N427K、L439Q、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、S691L、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (v)         T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、S464N、T465K、E471A、Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (vi)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、D601G、H642Y、N645S、N666K、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (vii)    V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、G626V、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (viii)  V3G、T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (ix)       T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56、以及胺基酸57的缺失； (x)         T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (xi)       T6I、A14S、G129D、K134E、W139R、F144L、I197V、V200G、G244S、G326H、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、G433S、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、Q485R、N488Y、Y492H、T591I、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、D1186N、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、以及胺基酸13的缺失； (xii)    T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N645S、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xiii)  T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xiv)   T6I、A14S、V70A、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G239V、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、以及胺基酸131的缺失； (xv)     T6I、A14S、G129D、H133Q、Q170E、V200E、G326H、R333T、L355I、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、V432P、G433S、N447K、S464N、T465K、E471A、F473S、F477S、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失； (xvi)   T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失； (xvii) T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、K431T、L439R、N447K、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、以及胺基酸57的缺失；以及 (xviii)         T6I、A14S、G129D、V200G、G326D、R333T、S358F、S360P、S362F、T363A、D392N、R395S、K404N、N427K、L439R、S464N、T465K、E471A、F473V、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H、N956K、胺基酸11的缺失、胺基酸12的缺失、胺基酸13的缺失、胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失、以及胺基酸131的缺失。
  38. 如請求項35-37中任一項所述的免疫原性組合物，其中至少一種CoV S醣蛋白與SEQ ID NO: 174、175、186、188、190、195、217-228和233-236中的任一個是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。
  39. 如請求項35-38中任一項所述的免疫原性組合物，其中至少一種CoV S醣蛋白包含選自以下的修飾的組合： (xix) 胺基酸56的缺失、胺基酸57的缺失以及胺基酸131的缺失、N488Y、A557D、D601G、P668H或P668R、T703I、S969A和D1105H； (xx) D67A、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxi) D67A、D202G、L229H、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxii) D67A、D202G、胺基酸228-230中1、2或3個胺基酸的缺失、K404N、E471K、N488Y、D601G和A688V； (xxiii) D67A、L229H、R233I、N488Y、K404N、E471K、D601G和A688V； (xxiv) L5F、T7N、P13S、D125Y、R177S、K404T、E471K、N488Y、D601G、H642Y、T1014I和V1163F； (xxv) W139C和L439； (xxvi) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxvii) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxviii) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、T82I、G129D、Y132H、E143G、A209V、K404N、L439R、T465K、D601G、P668R和D937N； (xxix) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； (xxx) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、W51H、H53W、G129D、E143G、D200V、L201R、W245I、K404N、N426K、L439R、T465K、E471K、N488Y、D601G、P668R和D937N； (xxxi) 胺基酸144的缺失、胺基酸145的缺失、T6R、G129D、E143G、K404N、L439R、T465K、E471Q、D601G、P668R和D937N； (xxxii) Q39R、A54V、E471K；D601G、Q664H、F875L以及胺基酸56、57、131、132中的1、2、3或4個缺失； (xxxiii) T82I、D240G、E471K、D601G和A688V； (xxxiv) L439R、E471Q、D601G、P668R和Q1058H； (xxxv) G62V、T63I、R233N、L439Q、F477S、D601G、T846N以及胺基酸234-240中的1、2、3、4、5或6個缺失； (xxxvi) T82I、Y131S、Y132N、R333K、E471K、N488Y、D601G、P668H和D937N；以及 (xxxvii) G129D、G326D、S360P、S362F、K404N、N427K、T465K、E471A或E471K、Q480K或Q480R、Q485R、N488Y、Y492H、D601G、H642Y、N666K、P668H、N751K、D783Y、Q941H和N953K。
  40. 如請求項35-39中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物包含與SEQ ID NO: 87的CoV S醣蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的CoV S醣蛋白。
  41. 如請求項35-40中任一項所述的免疫原性組合物，其包含與SEQ ID NO: 85-89、105、106和112-115的CoV S醣蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的CoV S醣蛋白。
  42. 如請求項35-41中任一項所述的免疫原性組合物，其包含編碼SARS-Cov-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-Cov-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。
  43. 如請求項35-42中任一項所述的免疫原性組合物，其包含至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種血球凝集素（HA）醣蛋白，其中每種HA醣蛋白來自不同的流感毒株。
  44. 如請求項35-43中任一項所述的免疫原性組合物，其包含呼吸道合胞病毒（RSV）融合（F）醣蛋白。
  45. 如請求項35-44中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物包含 (i) 與SEQ ID NO: 87的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第一CoV S醣蛋白，和 (ii) 與SEQ ID NO: 175的多肽具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的第二CoV S醣蛋白。
  46. 如請求項35-45中任一項所述的免疫原性組合物，其包含從約1 µg至約50 µg、從約3 µg至約25 µg、從約5 µg至約25 µg或從約5 µg至約100 µg的CoV S醣蛋白。
  47. 如請求項35-45中任一項所述的免疫原性組合物，其包含從約1 µg至約50 µg、從約3 µg至約25 µg、從約5 µg至約25 µg或從約5 µg至約100 µg的每種CoV S醣蛋白。
  48. 如請求項35-46中任一項所述的免疫原性組合物，其包含約5 µg的CoV S醣蛋白。
  49. 如請求項35-45中任一項所述的免疫原性組合物，其包含約5 µg的每種CoV S醣蛋白。
  50. 如請求項35-49中任一項所述的免疫原性組合物，其包含佐劑。
  51. 如請求項50所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含至少兩種iscom顆粒，其中： 第一iscom顆粒包含皂樹的級分A，且不包含皂樹的級分C；並且 第二iscom顆粒包含皂樹的級分C，且不包含皂樹的級分A。
  52. 如請求項51所述的免疫原性組合物，其中： 皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約85%和按重量計約15%。
  53. 如請求項51所述的免疫原性組合物，其中皂樹的級分A和皂樹的級分C分別占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計約92%和按重量計約8%。
  54. 如請求項51所述的免疫原性組合物，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計至少約85%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。
  55. 如請求項51所述的免疫原性組合物，其中分別地，皂樹的級分A占在所述佐劑中皂樹的級分A和皂樹的級分C的重量之和的按重量計50%-96%，並且皂樹的級分C占剩餘部分。
  56. 如請求項50-55中任一項所述的免疫原性組合物，其包含從約25 µg至約100 µg的佐劑。
  57. 如請求項50-55中任一項所述的免疫原性組合物，其包含約50 µg的佐劑。
  58. 一種載藥注射器，其包含如請求項35-57中任一項所述的免疫原性組合物。
  59. 一種刺激針對SARS-CoV-2或異源SARS-CoV-2毒株的免疫反應的方法，其包括向受試者投予如請求項35-57中任一項所述的免疫原性組合物。
  60. 如請求項59所述的方法，其包括投予1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量的所述免疫原性組合物。
  61. 如請求項59或60所述的方法，其包括投予第一劑量的所述免疫原性組合物和在所述第一劑量後約三週投予第二劑量的所述免疫原性組合物。
  62. 如請求項59-61中任一項所述的方法，其包括投予第一劑量的所述免疫原性組合物和在所述第一劑量後約21天投予第二劑量的所述免疫原性組合物。
  63. 如請求項59-62中任一項所述的方法，其包括投予至少三個劑量的所述免疫原性組合物，其中在所述第一劑量或所述第二劑量後至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月或至少24個月投予第三劑量的所述免疫原性組合物。
  64. 如請求項59-63中任一項所述的方法，其包括投予不同於所述第一免疫原性組合物的第二免疫原性組合物。
  65. 如請求項64所述的方法，其中所述第二免疫原性組合物包含編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的mRNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的質體DNA、編碼SARS-CoV-2刺突醣蛋白的病毒載體或滅活的SARS-CoV-2病毒。
  66. 如請求項64所述的方法，其中所述第二免疫原性組合物包含至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種血球凝集素（HA）醣蛋白，其中每種HA醣蛋白來自不同的流感毒株。
  67. 如請求項64所述的方法，其中所述第二免疫原性組合物包含與所述第一免疫原性組合物相比不同的CoV S醣蛋白。
  68. 如請求項59-67中任一項所述的方法，其中將所述免疫原性組合物肌內投予。
  69. 如請求項59-68中任一項所述的方法，其包括投予在載藥注射器中的所述免疫原性組合物。
  70. 如請求項59-69中任一項所述的方法，其中所述方法預防COVID-19的功效在投予所述免疫原性組合物後至少約2個月、至少約2.5個月、至少約3個月、至少約3.5個月、至少約4個月、至少約4.5個月、至少約5個月、至少約5.5個月、至少約6個月、至少約6.5個月、至少約7個月、至少約7.5個月、至少約8個月、至少約8.5個月、至少約9個月、至少約9.5個月、至少約10個月、至少約10.5個月、至少約11個月、至少約11.5個月、至少約12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月或至少24個月內是從約50%至約99%、從約50%至約95%、從約50%至約90%、從約50%至約85%、從約50%至約80%、從約60%至約99%、從約65%至約95%、從約65%至約90%、從約65%至約85%、從約69%至約81%、從約60%至約95%、從約60%至約90%、從約60%至約85%、從約60%至約80%、從約40%至約99%、從約40%至約95%、從約40%至約90%、從約40%至約85%、從約40%至約80%、從約40%至約75%、從約40%至約70%、從約40%至約65%、從約40%至約55%或從約40%至約50%。
  71. 如請求項59-69中任一項所述的方法，其中所述方法預防COVID-19的功效在投予所述免疫原性組合物後長達約2個月、長達約2.5個月、長達約3個月、長達約3.5個月、長達約4個月、長達約4.5個月、長達約5個月、長達約5.5個月、長達約6個月、長達約6.5個月、長達約7個月、長達約7.5個月、長達約8個月、長達約8.5個月、長達約9個月、長達約9.5個月、長達約10個月、長達約10.5個月、長達約11個月、長達約11.5個月、長達約12個月、長達13個月、長達14個月、長達15個月、長達16個月、長達17個月、長達18個月、長達19個月、長達20個月、長達21個月、長達22個月、長達23個月或長達24個月內是從約50%至約99%、從約50%至約95%、從約50%至約90%、從約50%至約85%、從約50%至約80%、從約60%至約99%、從約65%至約95%、從約65%至約90%、從約65%至約85%、從約69%至約81%、從約60%至約95%、從約60%至約90%、從約60%至約85%、從約60%至約80%、從約40%至約99%、從約40%至約95%、從約40%至約90%、從約40%至約85%、從約40%至約80%、從約40%至約75%、從約40%至約70%、從約40%至約65%、從約40%至約55%或從約40%至約50%。
  72. 如請求項59-71中任一項所述的方法，其中所述異源SARS-CoV-2毒株具有選自B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、AY、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.3、P.2、B.1.621或B.1.621.1的PANGO譜系。
  73. 如請求項59-72中任一項所述的方法，其中所述異源SARS-CoV-2毒株具有α、β、γ、δ、ε、ι、κ、ζ、μ或ο的世界衛生組織標記。
  74. 一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2、異源SARS-CoV-2毒株、流感病毒或其組合的免疫反應的方法，其包括投予如請求項43所述的免疫原性組合物。
  75. 一種在受試者中刺激針對SARS-CoV-2、異源SARS-CoV-2毒株、流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）或其組合的免疫反應的方法，其包括投予如請求項43或44所述的免疫原性組合物。
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