TW202330629A - 包含ＳＩＲＰα突變體的融合蛋白 - Google Patents

包含ＳＩＲＰα突變體的融合蛋白 Download PDF

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丁曉然
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談彬
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Abstract

本發明關於一種雙功能融合蛋白，其包含特異性結合CLDN18.2的第一結合域，以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域，其中，該第二結合域具有以下特性中的至少一項：(a)以4×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合；(b)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；(c)不引起凝血反應；以及(d)抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。

Description

包含SIRPα突變體的融合蛋白
本發明關於生物醫藥領域，具體的關於一種結合CD47和CLDN18.2的多功能融合蛋白，及其在治療疾病和/或病症中的應用。
CD47蛋白是一種跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族成員，除正常組織細胞表達CD47以外，許多腫瘤細胞過度表達CD47。腫瘤細胞表面的CD47與巨噬細胞表面的SIRPα相結合會阻止巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，這被視為腫瘤逃避機體免疫監視的一種機制。阻斷CD47蛋白和SIRPα的相互作用，可抑制腫瘤增長。
緊密連接蛋白為表達於上皮及內皮中且形成決定緊密連接滲透性的細胞旁障壁及微孔的緊密連接膜蛋白家族。緊密連接蛋白18同型2(CLDN18.2)，即緊密連接蛋白18蛋白的剪接變異體，為表達於短壽命經分化胃上皮細胞上的胃系抗原。在許多癌症中都能檢測到緊密連接蛋白的表達失調，並且可能導致腫瘤發生和癌症侵襲。在胰腺導管腺癌、食道腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、膽管腺癌和膽管癌中，CLDN18.2的表達升高。
本發明提供了一種雙功能融合蛋白，其包含特異性結合CLDN18.2的部分和特異性結合CD47蛋白的部分。本發明所述的融合的蛋白能夠有效抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
一方面，本發明提供了一種融合蛋白，其包含：特異性結合CLDN18.2的第一結合域；以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域；其中，該第二結合域具有以下特性中的至少一項：(a)以4×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合；(b)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；(c)不引起凝血反應；以及(d)抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
在某些實施方式中，該第二結合域包含人SIRPα變體1的突變體，該突變體與SEQ ID NO：22的第33位至第149位胺基酸序列相比，包含一個或多個位置的胺基酸殘基突變。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸位置處的胺基酸突變：L44、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109和V132。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61和E77胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61、K83和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61、G109和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61、D95、L96、G109和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含V93和R107胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含L44和I61胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含L44和E77胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含Q82、K83和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含E77和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸突變：
(1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100和V132；
(2)I61、E77、Q82、K83和E84；
(3)I61、V63、K83、E84和V132；
(4)I61、E77、E84、R107和V132；
(5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；
(6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；
(7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；
(8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；
(9)I61；
(10)I61、D95、L96、G109和V132；
(11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；
(12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；
(13)E77、L96、N100、G109和V132；
(14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；
(15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；
(16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；
(17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；
(18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；
(19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；
(20)I61、V63、E77、Q82和E84；以及
(21)L44、I61、E77、Q82、K83、E84和V132。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸取代：L44V、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84Q/K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61L/V/F和E77Q/N/I的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61L/V/F和V132I/S的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61L/V/F、K83R和E84Q/D/H的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61L/V/F、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含I61L/V/F、D95H、L96S、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含V93A和R107N的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含L44V和I61L/V/F的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含L44V和E77Q/N/I的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含Q82S/R/G/N、K83R和E84Q/K/H/D/R/G的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含E77Q/N/I和V132I/S的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含選自下組的胺基酸突變：
(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；
(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；
(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；
(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；
(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；
(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；
(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；
(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；
(9)I61L；
(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；
(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；
(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；
(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；
(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；
(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；
(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；
(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；
(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；
(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；
(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G；以及
(21)L44V、I61F、E77I、Q82R、K83R、E84Q和V132I。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體還包含一個或多個糖基化位點改造。
在某些實施方式中，該糖基化位點改造包含糖基化位點突變。
在某些實施方式中，該糖基化位點突變位於N110位置處。
在某些實施方式中，該糖基化突變包含N110A的胺基酸取代。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該突變體包含SEQ ID NO：1-21中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白的第一結合域包含靶向CLDN18.2的抗原結合蛋白。
在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包含抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、dAb、分離的互補決定區CDR、Fv和scFv。
在某些實施方式中，該CLDN18.2包含人CLDN18.2。
在某些實施方式中，該第一結合域包含重鏈可變區(VH)中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含VH，該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含免疫球蛋白單可變結構域。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白單可變結構域包含VHH。
在某些實施方式中，該融合蛋白中的該第一結合域包含VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VHH包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VHH包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VHH包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VHH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含重鏈恆定區Fc片段。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自IgG。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG。
在某些實施方式中，該IgG選自下組：IgG1和IgG4。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區Fc片段包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白的第一結合域位於該第二結合域的N端。
在某些實施方式中，該融合蛋白還包含連接子，該連接子位於該第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。
在某些實施方式中，該連接子包含如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含至少2個該第二結合域。
在某些實施方式中，該融合蛋白的每個該第二結合域分別位於該第一結合域的C端。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含至少一條多肽鏈，其中該多肽鏈包含SEQ ID NO：30-35中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含兩條多肽鏈，每條多肽鏈包含SEQ ID NO：30-35中任一項所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明還提供了一種免疫綴合物，其包含該融合蛋白。
另一方面，本發明還提供了一個或多個核酸分子，其編碼該融合蛋白或該免疫綴合物。
另一方面，本發明還提供了該一種載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本發明還提供了該醫藥組成物，其包含該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、以及視需要地藥學上可接受的載劑。
另一方面，本發明還提供了細胞，其包含該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子或該載體。
另一方面，本發明還提供了製備該融合蛋白的方法，其包括在使得該融合蛋白能夠表達的條件下培養該細胞。
另一方面，本發明還提供了該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、該載體、該醫藥組成物、該細胞在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療疾病和/或病症。
在某些實施方式中，該疾病和/或病症包含與CLDN18.2相關的疾病和/或病症。
在某些實施方式中，該與CLDN18.2相關的疾病和/或病症包括涉及表達CLDN18.2的細胞的疾病或與表達CLDN18.2的細胞相關的疾病。
在某些實施方式中，該疾病和/或病症包括腫瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和/或膽囊癌。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本發明的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本發明的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本發明的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本發明所涉及發明的精神和範圍。相應地，本發明的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本發明所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本發明所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明如下：
圖1顯示的是本發明所述融合蛋白的結構示例。
圖2顯示的是本發明所述融合蛋白與CD47的結合結果。
圖3A-圖3B顯示的是本發明所述融合蛋白與Raji細胞的結合結果。
圖4顯示的是本發明所述融合蛋白與293T/CLDN18.2細胞的結合結果。
圖5顯示的是本發明所述融合蛋白阻斷CD47/SIRPα相互作用的結果。
圖6顯示的是本發明所述融合蛋白的ADCC活性檢測。
圖7A-圖7B顯示的是本發明所述融合蛋白與紅細胞結合活性檢測。
圖8顯示的是治療開始後小鼠293T/CLDN18.2細胞異體移植模型的生長曲線。
以下由特定的具體實施例說明本發明發明的實施方式，所屬技術領域具有通常知識者可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本發明發明的其他優點及效果。
術語定義
在本發明中，術語“融合蛋白”通常指由兩個或更多個連接在一起的部分的多肽或蛋白。其中每個部分可以是具有不同特性的多肽或蛋白。該特性可以是生物學性質，例如體外或體內活性。該性質也可以是簡單的化學或物理性 質，例如與靶分子的結合，反應的催化等。這兩個部分可以藉由單個肽鍵或藉由肽接頭直接連接。融合蛋白可藉由重組DNA技術人工製備。例如，編碼該兩個或更多個蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此連接而形成融合基因或融合的核酸分子，該融合基因或融合的核酸分子可編碼該融合蛋白。該融合基因的翻譯可以產生單一多肽，其可以具有融合前的該兩個或更多個蛋白或多肽中至少一個、甚至每一個的性質。
在本發明中，術語“特異性結合”或“特異性的”通常指可測量的和可再現的相互作用，例如靶標和抗體之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體可以是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體。在某些實施方案中，抗體特異性結合蛋白質上的表位，該表位在不同種屬的蛋白質中是保守的。在某些實施方案中，特異性結合包括但不要求排他性地結合。
在本發明中，術語“結合域”通常是可以特異性結合和/或識別靶標(例如抗原)上的特定表位的結構域。在本發明中，術語“結構域”通常是指蛋白質亞基結構中明顯分開的緊密球狀結構區域。例如，多肽鏈首先可以是在某些區域相鄰的胺基酸殘基形成有規則的二級結構，然後，又可以由相鄰的二級結構片段組裝在一起形成超二級結構，在此基礎上多肽鏈可以折疊成近似於球狀的三級結構。對於較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往可以由兩個或多個在空間上可明顯區分的、相對獨立的區域性結構締合而成三級結構，這種相對獨立的區域性結構可以稱為結構域。
在本發明中，術語“第一結合域”和“第二結合域”中的該“第一”、“第二”可以只是為了在描述上進行區分。
在本發明中，術語“CD47蛋白”通常是指整聯蛋白相關蛋白(IAP)，其為一種屬於免疫球蛋白超家族的多次跨膜受體。例如，CD47蛋白可與膜整合素(membrane integrins)結合，並與其配體凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)和信號調節蛋白α(signal-regulatory protein alpha,SIRPα)結合。CD47蛋白廣泛表達於細胞膜表面。在本發明中，該CD47蛋白可包括人CD47的任何變體、同種型和物種同系物。人CD47蛋白的胺基酸序列在GenBank中作為CEJ95640.1列出。該CD47蛋白可以由細胞天然表達或在用CD47基因轉染的細胞上表達。
在本發明中，術語“SIRPα”通常是指來自SIRP家族的調節性膜糖蛋白，其可作為CD47蛋白的配體。在本發明中，該SIRPα可包括人SIRPα。
在本發明中，術語“人SIRPα結構域”通常是指野生型、內源的成熟形式的人SIRPα、其片段或功能性變體。在人類中，發現SIRPα蛋白主要有兩種形式，一種形式(變體1或V1型)的胺基酸序列作為NCBI RefSeq NP_542970.1列出(殘基31-504構成成熟型)。另一種形式(變體2或V2型)與該變體1或V1型有13個胺基酸不同並且胺基酸序列在GenBank中作為CAA71403.1列出。這種兩種形式的SIRPα構成了存在於人類中的大約80%的各種類型的SIRPα。在本發明中，術語“抗原結合蛋白”通常指脫離了其天然存在狀態的具有抗原結合能力的蛋白。該“分離的抗原結合蛋白”可以包含結合抗原的部分和視需要地，允許抗原結合部分採用促進該抗原結合部分結合抗原的構象的框架或構架部分。抗原結合蛋白可以包含例如抗體來源的蛋白框架區(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的備選蛋白框架區或人工框架區。此類框架包括，但不限於包含被引入例 如以穩定抗原結合蛋白的三維結構的突變的抗體來源的框架區以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架區。
在本發明中，術語“CDR”也稱“互補決定區”，通常指抗體可變結構域中的區域，其序列是高度可變的和/或形成結構定義環。通常，抗體包括六個CDR；在VH中三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些實施方案中，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在缺乏輕鏈的情況下，其功能也能夠正常且穩定。參見，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。抗體CDR可以藉由多種編碼系統來確定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、綜合考慮Kabat/Chothia等。這些編碼系統為本領域內已知，具體可參見，例如，http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。
在本發明中，術語“可變結構域”與“可變區”可以互換使用，通常指抗體重鏈和/或輕鏈的一部分。重鏈和輕鏈的可變結構域可以分別稱為“VH”和“VL”(或者分別稱為“VH”和“VL”)。這些結構域通常是抗體的變化最大的部分(相對於相同類型的其它抗體)，且包含抗原結合位點。
在本發明中，術語“抗體”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。除非另外被術語“完整的”修飾，如在“完整的抗體”中，為了本發明的目的，術語“抗體”也包括抗體片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原結合功能(例如，特異性結合CLDN18.2)的其它抗體片段。
在本發明中，術語“抗原結合片段”通常指具有特異結合抗原(例如，CLDN18.2)能力的一個或多個片段。在本發明中，該抗原結合片段可以包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在本發明中，術語“Fab”通常指抗體的抗原結合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗體。抗體經木瓜蛋白酶消化後產生兩個相同的抗原結合片段，即“Fab”片段，和殘餘的“Fc”片段(即Fc區，同上)。Fab片段可以由一條完整的L鏈與一條重鏈的可變區和該H鏈(VH)的第一恆定區(CH1)組成。在本發明中，術語“Fab'片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段。例如，Fab'片段可以包括所有輕鏈，所有重鏈可變區以及重鏈的所有或部分第一和第二恆定區。例如，Fab'片段還可包括重鏈的部分或所有。在本發明中，術語“F(ab')2”通常指藉由胃蛋白酶消化完整抗體所產生的抗體片段。F(ab')2片段含有由二硫鍵維持在一起的兩個Fab片段和部分鉸鏈區。F(ab')2片段具有二價抗原結合活性並且能夠交聯抗原。在本發明中，術語“Fv片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段，包括所有或部分重鏈可變區和輕鏈可變區，並且缺乏重鏈恆定區和輕鏈恆定區。重鏈可變區和輕鏈可變區包括例如CDR。在本發明中，術語“scFv”通常指包含至少一個包括輕鏈的可變區抗體片段和至少一個包括重鏈的可變區的抗體片段的融合蛋白，其中該輕鏈和重鏈可變區是鄰接的(例如經由合成接頭例如短的柔性多肽接頭)，並且能夠以單鏈多肽形式表達，且其中該scFv保留其所來源的完整抗體的特異性。除非特別說明，否則如本發明中使用的那樣，scFv可以以任何順序(例如相對於多肽的N末端和C末端)具有該VL和VH可變區，scFv可以包括VL-接頭-VH或可以包括VH-接頭-VL。在本發明中，術語“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原結合片段，參考例如 Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，參考Holt等人，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及參考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公佈的專利申請。術語“dAb”通常包括sdAb。術語“sdAb”通常指單域抗體。單域抗體通常指僅由抗體重鏈可變區(VH結構域)或抗體輕鏈的可變區(VL)組成的抗體片段，在某些情況下，單域抗體還可以包含重鏈恆定區。
在本發明中，術語“單株抗體”通常指單分子組成的抗體分子製備物。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。
在本發明中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本發明中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體的CDR區以外的部分或全部胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白 恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如羊駝，小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。
在本發明中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本發明中，該變體可以為，在該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合CLDN18.2的抗體或其片段)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本發明中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合CLDN18.2的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有 至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本發明中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST算法的描述可參見S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
在本發明中，術語“CLDN18.2”、或“Claudin18.2”可以互換使用，通常指細胞連接密蛋白Claudin18的亞型2。該術語涵蓋“全長”、未加工的 CLDN18.2以及由細胞加工所產生的任何形式的CLDN18.2。CLDN18.2可以包括完整的CLDN18.2及其片段，其功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物以及具有至少一個與CLDN18.2共同表位的類似物。
通常情況下，在多肽鏈中，胺基與多肽鏈中的另一個羧基相連可以使其成為一個鏈，但是在蛋白質的兩個末端，分別剩餘沒有成肽鍵的胺基酸殘基，分別是攜帶游離的胺基的多肽鏈末端和攜帶羧基的多肽鏈末端。在本發明中，術語“N端”通常是指胺基酸殘基攜帶游離的胺基的多肽鏈的末端。在本發明中，術語“C端”通常是指胺基酸殘基攜帶游離的羧基的多肽鏈的末端。
在本發明中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本發明中，術語“免疫綴合物”通常是指綴合了一個或多個異源分子(包括但不限於細胞毒素)的具有免疫功能的多肽分子。在本發明中，“綴合”和“連接”、“融合”在本發明中可以互換使用，並且通常是指將兩個或更多個化學元素、序列或組分連接在一起，例如藉由包括化學綴合或重組手段。該異源分子可以是細胞毒素、化療藥物等。例如，將本發明該融合蛋白綴合一個或多個異源分子(例如，細胞毒素)可以得到該免疫綴合物。
在本發明中，術語“載體”指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬 菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
在本發明中，術語“醫藥組成物”通常指用於預防/治療疾病或病症的組成物。該醫藥組成物可以包含本發明所述的分離的抗原結合蛋白、本發明所述的核酸分子、本發明所述的載體和/或本發明所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。此外，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下優選地對接受者無毒。本發明的醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
在本發明中，術語“藥學上可接受的載劑”通常包括藥劑學可接受的載劑、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。
在本發明中，術語“腫瘤”通常是指哺乳動物中的機體(例如，細胞或其組成部分)在各種致瘤因子作用下，局部組織細胞增生所形成的贅生物。在本發明中，腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。在本發明中，該腫瘤可以包含胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和/或膽囊癌。
在本發明中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
在本發明中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
融合蛋白
一方面，本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白可以包含第一結合域以及第二結合域。該第一結合域可以特異性結合CLDN18.2；該第二結合域可以特異性結合CD47蛋白，其中該第二結合域可以具有以下特性中的至少一項：(a)以4×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合；(b)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；(c)不引起凝血反應；以及(d)能夠抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
在某些實施方式中，該第二結合域可以包含SIRPα變體1的突變體或其片段。該突變體與SEQ ID NO：22的第33位至第149位胺基酸序列相比，包含一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)位置的胺基酸殘基突變。其中該胺基酸殘基突變可以包含胺基酸殘基的取代、缺失或添加。其中該胺基酸的位置由SEQ ID NO：22所示的胺基酸位置來確定。例如，I61通常指以SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列為基準的第61位胺基酸。在本發明中，SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列可以指人SIRPα變體1(SEQ ID NO：22)的第33-149位胺基酸殘基，即SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的第一個胺基酸的位置編號為“第33位”。
在本發明中，該SIRPα變體1的突變體可以包括在SIRPα變體1的第33位至第149位胺基酸序列中含有一個或多個胺基酸突變。例如，該SIRPα變體1的突變體可以包含在SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列中含有一個或多個胺基酸突變。例如，本發明中該SIRPα變體1的突變體，與SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列相比，包含一個或多個胺基酸突變。
在本發明中，該融合蛋白能夠同時結合腫瘤相關抗原和CD47蛋白，從而起到治療疾病和/或病症的作用。
在本發明中，術語“第一結合域”通常是指可以特異性結合CLDN18.2的結構域。術語“第二結合域”通常是指可以特異性結合CD47蛋白的結構域。
特異性結合CD47的第二結合域
在本發明中，該突變體(例如特異性結合CD47蛋白的人SIRPα變體1的突變體)在包含選自下組的一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸殘基處包含胺基酸取代：L44、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109和V132。
例如，該突變體可以包含L44位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含I61位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V63位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含E77位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含Q82位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含K83位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含E84位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V93位的胺基酸突變。例如，在該突變體可以包含D95位的胺基酸突變。例如，該突變體可以 包含L96位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含K98位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含N100位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含R107位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含G109位的胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V132位的胺基酸突變。
在本發明中，該胺基酸取代中胺基酸殘基的位置是以SEQ ID NO：22所示胺基酸序列為基準確定的殘基編號。
“胺基酸取代Xn”是指在相應於SEQ ID NO：22所示胺基酸序列中第n位的殘基X處發生胺基酸取代，其中n為正整數，X為任意胺基酸殘基的縮寫。例如，“胺基酸取代I61”表示在相應於SEQ ID NO：22所示胺基酸序列中第61位的殘基I處發生胺基酸取代。
本發明中，該胺基酸取代可以為非保守取代。該非保守取代可包括以非保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有不同側鏈大小或不同特性(例如，疏水性)的胺基酸殘基。
本發明中，該胺基酸取代也可以為保守取代。該保守取代可包括以保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有相同或相似側鏈大小或者相同或相似特性(例如，仍為親水性)的胺基酸殘基。這樣的保守取代通常不會對所產生的蛋白質的結構或功能帶來很大影響。在本發明中，作為該融合蛋白或其片段的胺基酸序列變體可包括不顯著改變蛋白質結構或其功能(例如，阻斷CD47與特異性結合CD47蛋白的人SIRPα變體1的突變體)的保守胺基酸取代。
作為示例，下述各組中每組內各胺基酸間的相互取代在本發明中可被認為是保守取代：具有非極性側鏈的胺基酸組：丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸。不帶電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸，半胱胺酸，酪胺酸，天冬醯胺和穀胺醯胺。帶負電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：天冬胺酸和谷胺酸。帶正電荷的鹼性胺基酸：賴胺酸、精胺酸和組胺酸。帶苯基的胺基酸：苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸。
在本發明中，該突變體可以在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：(1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100和V132；(2)I61、E77、Q82、K83和E84；(3)I61、V63、K83、E84和V132；(4)I61、E77、E84、R107和V132；(5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；(6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；(7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；(8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；(9)I61；(10)I61、D95、L96、G109和V132；(11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；(12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；(13)E77、L96、N100、G109和V132；(14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；(15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；(16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；(17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；(18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；(19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；(20)I61、V63、E77、Q82和E84；以及(21)L44、I61、E77、Q82、K83、E84和V132。
在本發明中，該突變體可以包含選自下組的一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個) 胺基酸取代：L44V、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84Q/K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在本發明中，胺基酸取代“XnY/Z”是指相應於SEQ ID NO：22所示胺基酸序列中第n位的殘基X被取代為胺基酸殘基Y或者胺基酸殘基Z，其中n為正整數，X、Y和Z分別獨立地為任意胺基酸殘基的縮寫，且X不同於Y或Z。例如，胺基酸取代“I61L/V/F”是指相應於SEQ ID NO：22所示胺基酸序列中第61位的殘基I被取代為胺基酸殘基L、V或F。
例如，該突變體可以包含L44V胺基酸突變。例如，該突變體可以包含I61L、I61V或I61F胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V63I胺基酸突變。例如，該突變體可以包含E77I、E77N、E77Q、E77K、E77H、E77M、E77R、E77V或E77L胺基酸突變。例如，該突變體可以包含Q82S、Q82R、Q82G或Q82N胺基酸突變。例如，該突變體可以包含K83R胺基酸突變。例如，該突變體可以包含E84Q、E84K、E84H、E84D、E84R或E84G胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V93L或V93A胺基酸突變。例如，該突變體可以包含D95H、D95R或D95E胺基酸突變。例如，該突變體可以包含L96S或L96T胺基酸突變。例如，該突變體可以包含K98R胺基酸突變。例如，該突變體可以包含N100G、N100K、N100D或N100E胺基酸突變。例如，該突變體可以包含R107N或R107S胺基酸突變。例如，該突變體可以包含G109R或G109H胺基酸突變。例如，該突變體可以包含V132L、V132R、V132I或V132S胺基酸突變。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61和E77。例如，該突變體可以包含I61L/V/F和E77Q/N/I的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61和V132。例如，該突變體可以包含I61L/V/F和V132I/S的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61和E84。例如，該突變體可以包含I61L/V/F和E84D/H的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61、K83和E84。例如，該突變體可以包含I61L/V/F、K83R和E84Q/D/H的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61、D95和L96。例如，該突變體可以包含I61L/V/F、D95H和L96S的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61、D95、L96、G109和V132。例如，該突變體可以包含I61L/V/F、D95H、L96S、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：I61、G109和V132。例如，該突變體可以包含I61L/V/F、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：V93和R107。例如，該突變體可以包含V93A和R107N的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：L44和I61。例如，該突變體可以包含L44V和I61L/V/F的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：L44和E77。例如，該突變體可以包含L44V和E77Q/N/I的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代：Q82、K83和E84。例如，該突變體可以包含Q82S/R/G/N、K83R和E84Q/K/H/D/R/G的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含在以下胺基酸位置處具有取代；E77和V132。例如，該突變體可以包含E77Q/N/I和V132I/S的胺基酸取代。
在本發明中，該突變體可以包含選自下組的胺基酸取代：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；(9)I61L；(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G；和(21)L44V、I61F、E77I、Q82R、K83R、E84Q和V132I。
在本發明中，在人SIRPα變體1的截短結構域(如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，即人SIRPα變體1的胺基酸序列中的第33-149位殘基)的基 礎上，分別包含上述(1)-(21)的胺基酸取代組的SIRPα變體1的突變體可依次被命名為M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135、M145和M169。
在本發明中，該突變體還可以包含一個或多個糖基化位點改造。該改造包含藉由人工手段使得糖基化位點發生改變。例如，該糖基化位點改造包含糖基化位點突變。在某些實施方式中，該糖基化位點突變位於N110位置處。某些實施方式中，該糖基化位點突變包含N110A。
在本發明中，該突變體(例如特異性結合CD47蛋白的人SIRPα變體1的突變體)與SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列相比，在包含選自下組的一個或多個胺基酸殘基處包含胺基酸取代：L44、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109、N110和V132。
在本發明中，該融合蛋白中的該突變體可以在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：(1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100、N110和V132；(2)I61、E77、Q82、K83、E84和N110；(3)I61、V63、K83、E84、N110和V132；(4)I61、E77、E84、R107\N110和V132；(5)I61、V63、E77、K83、E84、N100和N110；(6)I61、E77、Q82、K83、E84、R107和N110；(7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109、N110和V132；(8)I61、E77、Q82、K83、E84、V132和N110；(9)I61和N110；(10)I61、D95、L96、G109、N110和V132；(11)I61、D95、L96、K98、G109、N110和V132；(12)I61、E77、E84、V93、R107、N110和V132；(13)E77、L96、N100、G109、N110和V132；(14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100、N110和V132；(15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、N110和V132；(16)I61、E77、Q82、 K83、E84、V93和N110；(17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98、N100和N110；(18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100、G109和N110；(19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98、N100和N110；(20)I61、V63、E77、Q82、E84和N110；以及(21)L44V、I61F、E77I、Q82R、K83R、E84Q、N110A和V132I。
在本發明中，該融合蛋白中的該突變體可以包含選自下組的胺基酸取代：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G、N110A和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和N110A；(3)I61F、V63I、K83R、E84K、N110A和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N、N110A和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D、N100G和N110A；(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H、R107S和N110A；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R、N110A和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D、N110A和V132L；(9)I61L和N110A；(10)I61F、D95H、L96S、G109H、N110A和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H、N110A和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N、N110A和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H、N110A和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D、N110A和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D、N110A和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H、V93A和N110A；(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R、N100E和N110A；(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D、G109R和N110A；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、 N100G和N110A；(20)I61L、V63I、E77N、Q82G、E84G和N110A；以及(21)L44V、I61F、E77I、Q82R、K83R、E84Q、N110A和V132I。
在本發明中，在人SIRPα變體1的截短結構域(如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，即人SIRPα變體1的胺基酸序列中的第33-149位殘基)的基礎上，分別包含上述(1)-(21)的胺基酸取代組的SIRPα變體1的突變體可依次被命名為M1N、M5N、M12N、M35N、M37N、M41N、M57N、M67N、M81N、M82N、M84N、M91N、M99N、M102N、M111N、M122N、M126N、M130N、M135N、M145N和M169N。該SIRPα變體1的突變體可依次包含如SEQ ID NO：1-21所示的胺基酸序列。在本發明中，該SIRPα變體1的突變體可包含與SEQ ID NO：1-21中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同源性的胺基酸序列。
特異性結合CLDN18.2的第一結合域
在本發明中，該第一結合域包含抗原結合蛋白。在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。在某些實施方式中，該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab')2、F(ab)2、dAb、分離的互補決定區CDR、Fv和scFv。
在某些實施方式中，該抗原結合蛋白能夠結合CLDN18.2。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含抗體重鏈可變區的至少一個CDR，該抗體重鏈可變區可以包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。例如，該CDR可以藉由IMGT編號方案劃分得到。
在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含HCDR2，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含HCDR1，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。該HCDR1可以包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含VH，所示VH可以包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含免疫球蛋白單可變結構域。在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含VHH。例如，該抗原結合蛋白可以包含VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。例如，該CDR可以藉由IMGT編號方案劃分得到。
在本發明中，該VHH可以包含HCDR3，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在本發明中，該VHH可以包含HCDR2，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在本發明中，該VHH可以包含HCDR1，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本發明中，該VHH可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在本發明中，該抗原結合蛋白可以包含抗體重鏈恆定區Fc片段。在本發明中，該抗原結合蛋白的重鏈恆定區可以源自IgG。在本發明中，該重鏈恆定區可以源自人IgG。在本發明中該IgG可以選自IgG1和IgG4。在本發明中，該抗體重鏈恆定區Fc區可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
第一結合域和第二結合域的連接方式
在本發明中，該第一結合域可以位於該第二結合域的N端。例如，該第一結合域的C端可以與該第二結合域的N端直接或間接相連。例如，該第一結合域的C端可以藉由連接子間接連接於該第二結合域的N端。例如，該第一結合域的C端也可以直接連接於第二結合域的N端。
在本發明中，該融合蛋白還可以包含連接子，該連接子可以位於該第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。例如，在該融合蛋白中，第一結合域的C端可以連接連接子的N端，連接子的C端可以連接第二結合域的N端。例如，在該融合蛋白中，從N端到C端，可以依次包含第一結合域、連接子和第二結合域。
在本發明中，該連接子可以包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在某些情形中，該融合蛋白可以包含至少2個(例如，至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、 至少10個、或更多)該第二結合域。在本發明中，該每個該第二結合域可以分別位於該第一結合域的C端。在本發明中，該2個以上的第二結合域可以分別直接或間接連接於該第一結合域的C端。
在本發明中，該融合蛋白可以包含特異性結合CLDN18.2的第一結合域，以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域，其中該第二結合域可以包含人SIRPα變體1的突變體，特異性結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段或變體的C端可以直接或間接連接人SIRPα變體1的突變體的N端。例如，該第二結合域可以包含至少2個人SIRPα變體1的突變體，且2個人SIRPα變體1的突變體的N端分別連接特異性結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段或變體的C端。
在本發明中，該融合蛋白可以包含至少一條多肽鏈，其中該多肽鏈從N端到C端可依次包含能夠特異性結合CLDN18.2的VHH、Fc結構域、連接子和人SIRPα變體1的突變體。在本發明中，該融合蛋白可以包含兩條多肽鏈，其中每條多肽鏈可分別從N端到C端依次包含能夠特異性結合CLDN18.2的VHH、Fc結構域、連接子和人SIRPα變體1的突變體。例如，該融合蛋白可以包含兩條多肽鏈，該兩條多肽鏈可以包含相同的胺基酸序列，例如，如SEQ ID NO：30-35中任一項所示的胺基酸序列。
例如，如圖1所示，該融合蛋白的第一結合域可以包含NA3S-H1，該融合蛋白的第二結合域可以包含人SIRPα變體1的突變體。該第一結合域和該第二結合域可以藉由連接子相連接。該連接子可以包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
例如，該融合蛋白的該多肽鏈從N端到C端可分別依次包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
免疫綴合物、核酸分子、載體和細胞及製備方法
另一方面，本發明還提供了免疫綴合物，其包含該融合蛋白。例如，該免疫綴合物可以為融合蛋白-藥物綴合物(ADC)，其中本發明所述的融合蛋白與一種或多種治療劑綴合，該治療劑包括但不限於細胞毒性劑、放射性毒性劑(例如，放射性同位素)和/或免疫抑制劑(例如，藉由抑制免疫應答等途徑殺傷細胞的任何藥劑)等。在某些實施方式中，該治療劑可以為能夠治療腫瘤相關的疾病或病症的治療劑。
該綴合可藉由肽連接子(例如，可切割連接子)或其它方式進行，例如，該連接子可以為酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子等。
另一方面，本發明提供了一個或多個分離的核酸分子其編碼該融合蛋白或者該免疫綴合物。例如，該一個或多個核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗體或其抗原結合片段，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本發明所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
重組DNA和分子選殖技術包括由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和由T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及由Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的那些技術。簡而言之，可從基因組DNA片段、cDNA和RNA製備該核酸，所有這些核酸可直接從細胞中提取或藉由各種擴增方法(包括但不限於PCR和RT-PCR)重組產生。
核酸的直接化學合成通常涉及將3'-封閉的和5'-封閉的核苷酸單體依次添加至生長中的核苷酸聚合物鏈的末端5'-羥基，其中每次添加藉由親核攻擊所添加的單體的3'-位上的生長鏈的末端5'-羥基來實現，該單體通常是磷衍生物，諸如磷酸三酯、亞磷醯胺等。參見，例如，Matteuci等，Tet.Lett.521：719(1980)；屬於Caruthers等的美國專利第4,500,707號；和屬Southern等的美國專利第5,436,327號和第5,700,637號；在另一方面，本發明提供了包含本發明的分離的多核苷酸的載體。該載體可以是任何線性核酸、質粒、噬菌粒、黏粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體的非限制性實例可包括逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒。在一些實施方案中，該載體是表達載體，例如，噬菌體展示載體。
另一方面，本發明提供一個或多個載體，其包含該核酸分子。例如，該載體可以包含本發明所述的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯 序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本發明中，適當的啟動子可包括，例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本發明所述的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。在某些實施方式中，該載體可以為表達載體。
該載體還可含有一個或多個選擇標記基因，其在表達後賦予可用於選擇或以其它方式鑑定攜帶載體的宿主細胞的一個或多個表型性狀。用於真核細胞的合適的選擇標記的非限制性實例包括二氫葉酸還原酶和新黴素抗性。
另一方面，本發明提供一種細胞，該細胞包含該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、或該載體。該細胞可以是宿主細胞。例如，該細胞可以包括如下許多細胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細胞，如酵母細胞或曲黴菌等真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等昆蟲細胞，或者如纖維原細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK 293細胞或人細胞的動物細胞。
例如，可藉由多種已建立的技術將該載體穩定地或瞬時引入宿主細胞。例如，一種方法涉及氯化鈣處理，其中藉由鈣沉澱引入載體。也可以按照類似方法使用其它鹽，例如磷酸鈣。另外，可以用電穿孔(即，施加電流以增加 細胞對核酸的滲透性)。轉化方法的其它實例包括顯微注射、DEAE葡聚糖介導的轉化和在乙酸鋰存在下的熱休克。脂質複合物、脂質體和樹狀聚合物也可用於轉染宿主細胞。
在將異源序列引入宿主細胞中時，可實施多種方法來鑑定已向其中引入了載體的宿主細胞。一種示例性選擇方法包括將單個細胞繼代培養以形成單個菌落，然後測試所需蛋白質產物的表達。另一種方法需要基於藉由載體內包含的選擇標記基因的表達賦予的表型性狀選擇含有異源序列的宿主細胞。
例如，將本發明的各種異源序列引入宿主細胞可藉由方法諸如PCR、Southern印跡或Northern印跡融合來確認。例如，可從所得宿主細胞製備核酸，並且可使用對目標序列是特異的引子，藉由PCR擴增特定目標序列。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳，然後用溴化乙錠、SYBR Green溶液等染色，或用UV檢測來檢測DNA。或者，可在融合反應中使用對目標序列是特異的核酸探針。特定基因序列的表達可以藉由與PCR，Northern印跡融合或藉由使用與編碼的基因產物反應的抗體的免疫測定的反轉錄檢測相應的mRNA來確定。示例性免疫測定包括但不限於ELISA、放射免疫測定和夾心免疫測定。
此外，將本發明的各種異源序列引入宿主細胞可以藉由異源序列編碼的酶(例如，酶促標誌物)的酶促活性來確認實。可藉由本領域已知的多種方法測定酶。通常，酶促活性可藉由產物的形成或正在研究的酶促反應的受質的轉化來確定。該反應可在體外或體內進行。
另一方面，本發明提供一種製備該融合蛋白的方法，其可以包括在使得該融合蛋白能夠表達的條件下培養該細胞。例如，可藉由使用適當的培養 基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是所屬技術領域具有通常知識者所瞭解的。
在某些情形中，該方法還可包括分離和/或純化該融合蛋白的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本發明所述的融合蛋白。
組成物和應用
另一方面，本發明提供一種組成物，該組成物包含該融合蛋白、該免疫綴合物、或該核酸分子，以及視需要地藥學上可接受的賦形劑。
例如，該藥學上可接受的賦形劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本發明中，可按照本領域的常規技術手段將該組成物與藥學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的輔劑和賦形劑配製在一起，例如按照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995中公開的技術進行操作。
在本發明中，該組成物可被配製用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥、在腫瘤部位的原位給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
例如，該組成物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本發明的組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展，可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
例如，本發明所述的組成物可以為適於口服給藥的形式，如片劑、膠囊劑、丸劑、粉劑、緩釋製劑、溶液劑、混懸劑、或者用於腸胃外注射，如無菌溶液劑、混懸劑或乳劑，或者用於軟膏或乳膏局部給藥或作為栓劑直腸給藥。該組成物可以是適合精確劑量單次給藥的單位劑量形式。該組成物可以進一步包含常規的藥物載體或賦形劑。此外，該組成物可以包括其他藥物或藥劑、載體、佐劑等。
本發明所述的組成物可以包含治療有效量的該融合蛋白。該治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的病症或病症(例如腫瘤)和/或其任何併發症而所需的劑量。該劑量的具體量/濃度可以根據施用方法和患者需要而變化，並且可以基於例如患者體積，黏度和/或體重等來確定。應當理解的是，基於特定患者，製劑和/或疾病的狀況，所屬技術領域具有通常知識者(例如，醫生或藥劑師)可以方便地調整這些特定劑量。
在本發明中，術語“治療”或“醫治”或“緩解”或“改善”在本發明中可互換使用，並且是指獲得有益或所需的結果(包括但不限於治療益處和/或預防益處)的方法。在本發明中，治療益處通常是指根除或減輕所治療的潛在病症的嚴重性。此外，藉由根除、減輕嚴重性或減少與潛在病症相關的一種或多種生理症狀的發生率，以使得在受試者中觀察到改善(儘管受試者仍然可能受到潛在病症折磨)來實現治療益處。對於預防益處，可向處於發展特定疾病的風險中的受試者，或報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者施用組成物，即使可能尚未進行該疾病的診斷。
另一方面，本發明提供了該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、該載體、該組成物、或該細胞在製備藥物中的用途，其中該藥物可以用於預防和/或治療疾病和/或病症。
另一方面，本發明提供了該融合蛋白、免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物或細胞，其用於預防和/或治療疾病和/或病症。
另一方面，本發明提供了一種預防和/或治療疾病和/或病症的方法，該方法包括向受試者施用本發明所述的融合蛋白、免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物或細胞。
另一方面，本發明提供了一種抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，該方法可包括使本發明所述的融合蛋白或組成物與該腫瘤或腫瘤細胞接觸。例如，該接觸可在體外發生。
另一方面，本發明提供了一種可以抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，其可以包括向有需要的受試者施用有效量的該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、該載體、該組成物、或該細胞。
在本發明中，該疾病和/或病症可以包括與CLDN18.2相關的疾病和/或病症。
在本發明中，該與CLDN18.2相關的疾病和/或病症包括涉及表達CLDN18.2的細胞的疾病或與表達CLDN18.2的細胞相關的疾病。
在本發明中，該腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。
在本發明中，該腫瘤可以包括胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和/或膽囊癌。
另一方面，本發明提供了該融合蛋白、該免疫綴合物、該核酸分子、該載體、該組成物、或該細胞，其可以預防和/或治療疾病和/或病症。
在本發明中，術語“受試者”通常是指人或非人動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、牛、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本發明發明的各個技術方案，而不用於限制本發明發明的範圍。
實施例
實施例1 構建融合蛋白
參照如圖1所示的融合蛋白結構，以CS001為例，從N端到C端，選用選擇連接子1(胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示)，依次連接Claudin18.2奈米抗體NA3S-H1、連接子和SIRPα突變體M91N(胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示)，其中M91N的N端和NA3S-H1的重鏈的C端藉由連接子連接，得到融合蛋白CS001。
CS002、CS003、CS004、CS005、CS006在CS001基礎上將M91N按照表1替換成相應的SIRPα突變體002N、M5N、M169N、M82N以及M84N。其中，002N為將SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列進行N110A突變所得。
奈米抗體NA3S-H1的HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：25所示，VHH的胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示。IgG Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
表1各融合蛋白的構成
Figure 111145248-A0202-12-0045-1
實施例2 與雙抗原結合的活性檢測
(1)ELISA評價雙功能融合蛋白和CD47的結合活性。
將CD47(CD47 Protein,Human,Recombinant(ECD,His Tag)，Sino Biological)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG Fc二抗(Goat anti-human IgG Fc antibody,horseradish peroxidase(HRP)conjugate,affinity purified，Invitrogen)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙功能融合蛋白與CD47的結合能力。
結果如圖2所示。圖2顯示雙功能融合蛋白CS001與CD47的結合能力最強，CS002和CS003與CD47的結合能力相似且最弱。
(2)流式評價雙功能融合蛋白和CD47陽性細胞株Raji細胞的結合活性。
收集人淋巴瘤腫瘤細胞Raji，按照每管5×105個細胞加至1.5mL EP管中；加入不同濃度的雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌後，加入PE螢光標記的羊抗人IgG Fc二抗(Goat Anti-Human IgG Fc Secondary Antibody，Invitrogen)，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌2遍；每管加入400μL 1%多聚甲醛固定液(Solarbio)固定細胞，混勻後上機檢測PE螢光的相對螢光強度及陽性率，分析雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006與Raji細胞的結合能力。
結果如圖3A-3B所示。圖3A-3B顯示雙功能融合蛋白CS001與CD47陽性腫瘤細胞Raji的結合能力最強，CS002與Raji細胞的結合能力最弱。
(3)以Claudin18.2奈米抗體NA3S-H1為對照，流式評價雙功能融合蛋白和過表達人Claudin18.2基因的HEK-293T細胞(簡稱293T/CLDN18.2)的結合活性。
收集293T/CLDN18.2細胞，按照每管5×105個細胞加至1.5mL EP管中；加入不同濃度的雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，以及Claudin18.2奈米抗體NA3S-H1，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌後，加入PE螢光標記的羊抗人IgG Fc二抗(Goat Anti-Human IgG Fc Secondary Antibody，Invitrogen)，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌2遍；每管加入400μL 1%多聚甲醛固定液(Solarbio)固定細胞，混勻後上機檢測PE螢光的相對螢光強度及陽性率，分析雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006與293T/CLDN18.2細胞的結合能力。
結果如圖4所示。圖4顯示所有雙功能融合蛋白與293T/CLDN18.2細胞的結合能力相似，同奈米抗體NA3S-H1。
實施例3 阻斷CD47/SIRPα相互作用的活性分析
ELISA評價雙功能融合蛋白阻斷CD47/SIRPα相互作用的生物學活性。
將SIRPα(Recombinant Human SIRPA,Sino Biological)包被酶聯板，1ug/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記Biotin-CD47(Recombinant Human CD47-biotin，嘉暄生物)至終濃度2ug/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006對CD47/SIRPα的阻斷作用。
從圖5中可以看出，雙功能融合蛋白CS001競爭性阻斷CD47與SIRPα結合的能力最強，CS002的阻斷能力最弱。
實施例4 ADCC活性分析
以Claudin18.2奈米抗體NA3S-H1為對照，Claudin18.2陽性細胞株293T/CLDN18.2為靶細胞，過表達人FcγRIIIa基因及NFAT螢光報告基因的Jurkat細胞(簡稱Jurkat-ADCC細胞)為效應細胞，用報告基因法評價雙功能融合蛋白的ADCC活性。
收集293T/CLDN18.2細胞，按照每管2×104個細胞加入96孔細胞培養板中；收集Jurkat-ADCC細胞，按照每管1.2×105個細胞加入96孔細胞培養板中；加入不同濃度的功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，以及Claudin18.2奈米抗體NA3S-H1，37℃培養箱中孵育6小時；每孔加入100μL螢光素酶檢測溶液，室溫避光反應10min後，用酶標儀讀取化學發光的相對螢光強度值(RLU)，分析雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006的ADCC活性。
結果如圖6所示。圖6顯示所有雙功能融合蛋白均具有相似的ADCC活性，且活性同奈米抗體NA3S-H1。
實施例5 結合紅細胞的活性分析
流式評價雙功能融合蛋白和健康人紅細胞的結合活性。
收集健康人紅細胞，按照每管1×106個細胞加至1.5mL EP管中；加入不同濃度的雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌後，加入PE螢光標記的羊抗人IgG Fc二抗(Goat Anti-Human IgG Fc Secondary Antibody，Invitrogen)，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗滌2遍；每管加入400μL 1%多聚甲醛固定液(Solarbio)固定細胞，混勻後上機檢測PE螢光的相對螢光強度及陽性率，分析雙功能融合蛋白CS001、CS002、CS003、CS004、CS005和CS006與人紅細胞結合的能力。
結果如圖7A-7B所示。圖7A-7B顯示雙功能融合蛋白均可以不同程度的與紅細胞結合。CS001與紅細胞結合的能力最強，CS003與紅細胞結合的能力最弱。
實施例6 雙功能融合蛋白體內抑制腫瘤活性
利用過表達Claudin18.2基因的HEK-293T細胞(293T/CLDN18.2)異體移植SCID小鼠模型，評價雙功能融合蛋白抑制腫瘤活性的效果。
將293T/CLDN18.2細胞接種於雌性SCID小鼠右側肩部皮下，共接種24隻，在腫瘤生長至100mm3左右時分組給藥，共8組，每組3隻，分別為Vehicle組、IMAB362(20mg/kg)組、NA3S-H1(10mg/kg)組、M91-Fc(10mg/kg)組、NA3S-H1+M91-Fc(10+10mg/kg)組、CS001(15mg/kg)組、CS002(15mg/kg)組、CS004(15mg/kg)組，尾靜脈注射給藥，每週給藥二次，給藥三週。每週測量腫瘤體積及體重，記錄荷瘤鼠體重和腫瘤體積的變化與給藥時間的關係。實驗結束時，將荷瘤鼠安樂死，剝離腫瘤稱重、拍照。計算腫瘤生長抑制率TGITV(%)並進行統計學分析。
結果如圖8所示，圖8顯示，IMAB362、NA3S-H1、M91-Fc、NA3S-H1+M91-Fc、CS001、CS002、CS004組的腫瘤生長抑制率分別為40%、54%、36%、53%、34%、96%、97%，各治療組腫瘤體積均顯著低於空白對照組(p<0.05)，顯示出顯著的抗腫瘤作用，有效地抑制了腫瘤生長。CS002和CS004組腫瘤體積相似，且在所有治療組中最小，顯著低於M91-Fc(p<0.01)、NA3S-H1(p<0.01)及NA3S-H1+M91-Fc組(p<0.05)，顯示其抑制腫瘤活性優於單藥組及聯合用藥組。治療期間，荷瘤鼠對測試物IMAB362、NA3S-H1、M91-Fc、NA3S-H1+M91-Fc、CS001、CS002、CS004均表現出很好的耐受性，各組小鼠體重正常，無異常表現，一般狀態良好。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本發明所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域 具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方式的範圍內。
TW202330629A_111145248_SEQL.xml

Claims (73)

  1. 一種融合蛋白，其包含：
    特異性結合CLDN18.2的第一結合域；以及
    特異性結合CD47蛋白的第二結合域；
    其中，胎第二結合域具有以下特性中的至少一項：
    (a)以4×10-8M或更低的KD值與CD47蛋白相結合；
    (b)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；
    (c)不引起凝血反應；以及
    (d)能夠抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
  2. 如請求項1所述的融合蛋白，其中該第二結合域包含人SIRPα變體1的突變體，其中該突變體與SEQ ID NO：22的第33位至第149位胺基酸序列相比，包含一個或多個位置的胺基酸殘基突變。
  3. 如請求項2所述的融合蛋白，其中該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸位置處的胺基酸突變：L44、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109和V132。
  4. 如請求項2或3所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61和E77胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  5. 如請求項2至4中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  6. 如請求項2至5中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  7. 如請求項2至6中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61、K83和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  8. 如請求項2至7中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61、G109和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  9. 如請求項2至8中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61、D95、L96、G109和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  10. 如請求項2至9中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含V93和R107胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  11. 如請求項2至10中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含L44和I61胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  12. 如請求項2至11中任一項所述的融合蛋白，其中該突變包含L44和E77胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  13. 如請求項2至12中任一項所述的融合蛋白，其中該突變包含Q82、K83和E84胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  14. 如請求項2至13中任一項所述的融合蛋白，其中該突變包含E77和V132胺基酸殘基處的胺基酸取代。
  15. 如請求項2至14中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸突變：
    (1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100和V132；
    (2)I61、E77、Q82、K83和E84；
    (3)I61、V63、K83、E84和V132；
    (4)I61、E77、E84、R107和V132；
    (5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；
    (6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；
    (7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；
    (8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；
    (9)I61；
    (10)I61、D95、L96、G109和V132；
    (11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；
    (12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；
    (13)E77、L96、N100、G109和V132；
    (14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；
    (15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；
    (16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；
    (17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；
    (18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；
    (19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；
    (20)I61、V63、E77、Q82和E84；以及
    (21)L44、I61、E77、Q82、K83、E84和V132。
  16. 如請求項2至15中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸取代：L44V、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84Q/K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
  17. 如請求項2至16中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61L/V/F和E77Q/N/I的胺基酸取代。
  18. 如請求項2至17中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61L/V/F和V132I/S的胺基酸取代。
  19. 如請求項2至18中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61L/V/F、K83R和E84Q/D/H的胺基酸取代。
  20. 如請求項2至19中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61L/V/F、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
  21. 如請求項2至20中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含I61L/V/F、D95H、L96S、G109H和V132I/S的胺基酸取代。
  22. 如請求項2至21中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含V93A和R107N的胺基酸取代。
  23. 如請求項2至22中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含L44V和I61L/V/F的胺基酸取代。
  24. 如請求項2至23中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含L44V和E77Q/N/I的胺基酸取代。
  25. 如請求項2至24中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含Q82S/R/G/N、K83R和E84Q/K/H/D/R/G的胺基酸取代。
  26. 如請求項2至25中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含E77Q/N/I和V132I/S的胺基酸取代。
  27. 如請求項2至26中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含選自下組的胺基酸突變：
    (1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；
    (2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；
    (3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；
    (4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；
    (5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；
    (6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；
    (7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；
    (8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；
    (9)I61L；
    (10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；
    (11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；
    (12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；
    (13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；
    (14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；
    (15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；
    (16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；
    (17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；
    (18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；
    (19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；
    (20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G以及
    (21)L44V、I61F、E77I、Q82R、K83R、E84Q和V132I。
  28. 如請求項2至27中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體還包含一個或多個糖基化位點改造。
  29. 如請求項28所述的融合蛋白，其中該糖基化位點改造包含糖基化位點突變。
  30. 如請求項29所述的融合蛋白，其中該糖基化位點突變位於N110位置處。
  31. 如請求項29至30中任一項所述的融合蛋白，其中該糖基化位點突變包含N110A的胺基酸取代。
  32. 如請求項2至31中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含SEQ ID NO：1至21中任一項所示的胺基酸序列。
  33. 如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含靶向CLDN18.2的抗原結合蛋白。
  34. 如請求項33所述的融合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體或其抗原結合片段。
  35. 如請求項34所述的融合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  36. 如請求項34至35中任一項所述的融合蛋白，其中該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、dAb、分離的互補決定區CDR、Fv和scFv。
  37. 如請求項1至36中任一項所述的融合蛋白，其中該CLDN18.2包含人CLDN18.2。
  38. 如請求項1至37中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含重鏈可變區(VH)中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
  39. 如請求項1至38中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
  41. 如請求項1至40中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
  42. 如請求項1至41中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含VH，該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
  43. 如請求項1至42中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含免疫球蛋白單可變結構域。
  44. 如請求項43所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白單可變結構域包含VHH。
  45. 如請求項1至44中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
  46. 如請求項44或45所述的融合蛋白，其中該VHH包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
  47. 如請求項44至46中任一項所述的融合蛋白，其中該VHH包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
  48. 如請求項44至47中任一項所述的融合蛋白，其中該VHH包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
  49. 如請求項44至48中任一項所述的融合蛋白，其中該VHH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
  50. 如請求項1至49中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含重鏈恆定區Fc片段。
  51. 如請求項50所述的融合蛋白，其中該重鏈恆定區源自IgG。
  52. 如請求項50或51所述的融合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG。
  53. 如請求項51或52所述的融合蛋白，其中該IgG選自下組：IgG1和IgG4。
  54. 如請求項50至53中任一項所述的融合蛋白，其中該重鏈恆定區Fc片段包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
  55. 如請求項1至54中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域位於所述第二結合域的N端。
  56. 如請求項1至55中任一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白還包含連接子，該連接子位於該第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。
  57. 如請求項56所述的融合蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
  58. 如請求項1至57中任一項所述的融合蛋白，其包含至少2個該第二結合域。
  59. 如請求項58所述的融合蛋白，其中每個該第二結合域分別位於所述第一結合域的C端。
  60. 如請求項1至59中任一項所述的融合蛋白，其包含至少一條多肽鏈，其中該多肽鏈包含SEQ ID NO：30至35中任一項所示的胺基酸序列。
  61. 如請求項1至60中任一項所述的融合蛋白，其包含兩條多肽鏈，該兩條多肽鏈包含相同的胺基酸序列。
  62. 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白。
  63. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白或如請求項62所述的免疫綴合物。
  64. 一種載體，其包含如請求項63所述的核酸分子。
  65. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白、如請求項62所述的免疫綴合物、如請求項63所述的核酸分子，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
  66. 一種細胞，其包含如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白、如請求項62所述的免疫綴合物、如請求項63所述的核酸分子或如請求項64所述的載體。
  67. 一種製備如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白的方法，其包括在使得所述融合蛋白能夠表達的條件下培養如請求項66所述的細胞。
  68. 一種如請求項1至61中任一項所述的融合蛋白、如請求項62所述的免疫綴合物、如請求項63所述的核酸分子、如請求項64所述的載體、如 請求項65所述的醫藥組成物或如請求項66所述的細胞在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療疾病和/或病症。
  69. 如請求項如請求項68所述的用途，其中該疾病和/或病症包含與CLDN18.2相關的疾病和/或病症。
  70. 如請求項如請求項68或69所述的用途，其中該與CLDN18.2相關的疾病和/或病症包括涉及表達CLDN18.2的細胞的疾病或與表達CLDN18.2的細胞相關的疾病。
  71. 如請求項如請求項68至70中任一項所述的用途，其中該疾病和/或病症包括腫瘤。
  72. 如請求項如請求項71所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  73. 如請求項如請求項71或72所述的用途，其中該腫瘤包括胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和/或膽囊癌。
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