TW202328203A - 靶向ｃｄ４７／４－１ｂｂ之蛋白質複合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於靶向CD47和4-1BB之蛋白質複合物及其使用方法。在一個態樣中，該等蛋白質複合物包含一或多個CD47結合域以及一或多個4-1BB結合域，該一或多個CD47結合域包含SIRPα胞外區之全部或一部分，該一或多個4-1BB結合域包含4-1BBL胞外區中之全部或一部分。

Description

靶向CD47/4-1BB之蛋白質複合物及其使用方法

本揭示案係關於靶向CD47及4-1BB之蛋白質複合物以及其使用方法。

信號調節蛋白α（SIRPα）為SIRP家族中之調節性膜醣蛋白。其主要由骨髓細胞表現且亦由幹細胞或神經元表現。SIRPα充當抑制性受體且與廣泛表現之跨膜蛋白CD47相互作用。此相互作用負向控制固有免疫細胞之效應子功能，如宿主細胞吞噬。SIRPα在巨噬細胞膜上橫向擴散且聚集在吞噬突觸處以與CD47結合，此抑制由巨噬細胞進行之細胞骨架密集型吞噬過程。

CD47藉由與信號調節蛋白α（SIRPα）之N端結合提供「別吃」信號。已發現CD47在許多不同腫瘤細胞中過表現。靶向CD47及/或SIRPα可用於癌症免疫療法。然而，由於CD47亦在紅血球（RBC）及血小板上表現，因此抑制CD47/SIRPα相互作用可能導致RBC及血小板之吞噬。因此，需要開發靶向CD47/SIRPα路徑之毒性有限之癌症療法。

本揭示案係關於靶向CD47及4-1BB之蛋白質複合物以及其使用方法。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包括：（a）Fc；（b）CD47結合域；以及（c）4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）結合域。

在一些實施例中，CD47結合域可與表現CD47之細胞（例如，癌細胞）結合及/或阻斷CD47與信號調節蛋白α（SIRPα）之間的相互作用。在一些實施例中，CD47結合域為或包括SIRPα胞外域。在一些實施例中，SIRPα胞外域為人SIRPα胞外域。在一些實施例中，CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，4-1BB結合域可與表現4-1BB之免疫細胞（例如，T細胞）結合及/或可刺激T細胞活化及增殖。在一些實施例中，4-1BB結合域為或包括4-1BBL胞外域。在一些實施例中，4-1BBL胞外域為人類4-1BBL胞外域。在一些實施例中，4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，Fc為人類IgG4 Fc。

在一些實施例中，CD47結合域與Fc中之CH2域之N端連接，視情況藉由鉸鏈區。在一些實施例中，4-1BB結合域與Fc中之CH2域之N端連接，視情況藉由鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區為人類IgG4鉸鏈區，該人類IgG4鉸鏈區視情況具有根據EU編號之S228P突變。在一些實施例中，4-1BB結合域與Fc中之CH3域之C端連接，視情況藉由連接肽。在一些實施例中，Fc包括第一CH3域及第二CH3域，在一些實施例中，任意一個或兩個CH3域包括一或多個選自以下之胺基酸殘基：360E、409W、347R、399V及405T（EU編號）。

在一些實施例中，蛋白質複合物包括兩個或更多個CD47結合域。在一些實施例中，蛋白質複合物包括兩個或更多個4-1BB結合域。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包括：（a）第一多肽，該第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽、第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域；以及（b）第二多肽，該第二多肽自N端至C端包括：第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第三4-1BB結合域。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:7至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一Fc區包括與SEQ ID NO:20至少80%一致之序列，且第二Fc區包括與SEQ ID NO:21至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一連接肽及/或第二連接肽包括與SEQ ID NO:13至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域藉由第三連接肽連接，在一些實施例中，第三連接肽包括與SEQ ID NO:14至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一多肽包括與SEQ ID NO:1至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且第二多肽包括與SEQ ID NO:2至少80%、90%、95%或100%一致之序列。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包括：（a）第一多肽，第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽及第一4-1BB結合域；以及（b）第二多肽，該第二多肽自N端至C端包括：第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第二4-1BB結合域。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:8至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一Fc區及第二Fc區包括與SEQ ID NO:19至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一連接肽及/或第二連接肽包括與SEQ ID NO:15至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一多肽包括與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且第二多肽包括與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%或100%一致之序列。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包括：（a）第一多肽，第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、第二CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區及第一Fc區；以及（b）第二多肽，第二多肽自N端至C端包括：第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域、第三4-1BB結合域、視情況存在之第二鉸鏈區及第二Fc區。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:9至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一Fc區包括與SEQ ID NO:20至少80%一致之序列，且第二Fc區包括與SEQ ID NO:21至少80%、90%、95%或100%一致之序列。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二4-1BB結合域藉由第一連接肽連接，在一些實施例中，第一連接肽包括與SEQ ID NO:14至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域藉由第二連接肽連接，且第二4-1BB結合域及第三4-1BB結合域藉由第三連接肽連接，在一些實施例中，第二連接肽及/或第三連接肽包括與SEQ ID NO:16至少80%一致之序列。在一些實施例中，第一多肽包括與SEQ ID NO:4至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且第二多肽包括與SEQ ID NO:5至少80%、90%、95%或100%一致之序列。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種核酸，其包括編碼本文中所描述之蛋白質複合物之聚核苷酸。在一些實施例中，該核酸為DNA（例如，cDNA）或RNA（例如，mRNA）。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種載體，其包括本文中所描述之核酸中之一或多者。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種細胞，其包括本文中所描述之載體。在一些實施例中，該細胞為CHO細胞。在一個態樣中，本揭示案係關於一種細胞，其包括本文中所描述之核酸中之一或多者。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種產生蛋白質複合物之方法，該方法包括（a）在足以使本文中所描述之細胞產生蛋白質複合物之條件下培養細胞；以及（b）收集由細胞產生之蛋白質複合物。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種抗體-藥物結合物，該抗體-藥物結合物包括本文中所描述之蛋白質複合物，該抗體-藥物結合物與治療劑共價結合。在一些實施例中，該治療劑為細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之包括本文中所描述之蛋白質複合物之組合物或本文中所描述之抗體-藥物結合物。在一些實例中，該個體具有表現CD47之癌細胞。在一些實施例中，該癌症為卵巢癌、頭頸鱗狀細胞癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、白血病、乳癌、小細胞肺癌、淋巴瘤或大腸直腸癌。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種降低腫瘤生長速率之方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量之包括本文中所描述之蛋白質複合物之組合物或本文中所描述之抗體-藥物結合物接觸。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種殺死腫瘤細胞之方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量之包括本文中所描述之蛋白質複合物之組合物或本文中所描述之抗體-藥物結合物接觸。

在一個態樣中，本揭示案係關於一種醫藥組合物，其包括本文中所描述之蛋白質複合物以及醫藥學上可接受之載劑。

如本文所用，術語「蛋白質複合物」或「蛋白質構築體」係指具有一或多種多肽之複合物。在一些實施例中，蛋白質複合物具有兩種或更多種多肽，其中多肽可彼此締合，由此形成二聚體或多聚體。

如本文所用，術語「CD47結合域」係指可與CD47結合之蛋白質域。在一些實施例中，CD47結合域可為抗CD47抗體、其抗原結合片段（例如，scFv或VHH）或CD47結合蛋白或其部分。在一些實施例中，CD47結合域可具有一或多個自穩定域。在一些實施例中，該CD47結合域包括SIRPα胞外域或由其組成。該SIRPα可為野生型SIRPα、人類SIRPα、源自野生型SIRPα之多肽（例如，具有突變）或其一部分（例如，SIRPα之胞外區或SIRPα之IgV域）。在一些實施例中，源自野生型SIRPα之多肽可具有一或多個突變。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括SIRPα之基本上整個胞外區或其變異體或由其組成。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括SIRPα之IgV域或其變異體或由其組成。在一些實施例中，IgV域具有一或多個突變。在一些實施例中，SIRPα胞外域具有一或多個突變。

如本文所用，術語「4-1BB結合域」係指可與4-1BB結合之蛋白質域。在一些實施例中，4-1BB結合域可為抗4-1BB抗體、其抗原結合片段（例如，scFv或VHH）或4-1BB結合蛋白或其部分。在一些實施例中，4-1BB結合域可具有一或多個自穩定域。在一些實施例中，4-1BB結合域包括4-1BBL胞外域或由其組成。4-1BBL可為野生型4-1BBL、人類4-1BBL、源自野生型4-1BBL之多肽（例如，具有突變）或其一部分（例如，4-1BBL之胞外區）。在一些實施例中，源自野生型4-1BBL之多肽可具有一或多個突變。在一些實施例中，4-1BBL胞外域包括4-1BBL之基本上整個胞外區或其變異體或由其組成。在一些實施例中，4-1BBL胞外域包括4-1BBL之胞外區之一部分或其變異體。在一些實施例中，4-1BBL胞外域具有一或多個突變。

如本文所用，術語「癌症」係指具有自主生長能力之細胞。此類細胞之實例包含具有以使細胞生長迅速激增為特徵之異常狀態或狀況之細胞。該術語意欲包含癌性生長，例如腫瘤；致癌過程、轉移性組織及惡性轉化細胞、組織或器官，而不論組織病理學類型或侵襲性階段。亦包含各種器官系統之惡性腫瘤，如呼吸系統、心血管系統、腎臟系統、生殖系統、血液系統、神經系統、肝臟系統、胃腸道系統及內分泌系統；以及腺癌，其包含惡性腫瘤，如大多數大腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睾丸腫瘤、肺非小細胞癌及小腸癌。「自然出現」之癌症包含並非藉由將癌細胞移植至個體體內來實驗性誘導之任何癌症，且包含例如自發出現之癌症、由於患者暴露於致癌物質所引起之癌症、由插入轉基因致癌基因或剔除腫瘤抑制基因而引起之癌症以及由於感染，例如病毒感染，所引起之癌症。術語「癌（carcinoma）」係此項技術中公認的且係指上皮或內分泌組織之惡性腫瘤。術語亦包含癌肉瘤，該癌肉瘤包含由癌性組織及肉瘤組織構成之惡性腫瘤。「腺癌」係指源自腺體組織之癌或其中腫瘤細胞形成可識別之腺體結構之癌。術語「肉瘤」係此項技術中公認的，且係指間充質衍生之惡性腫瘤。術語「造血腫瘤性病症」包含涉及造血起源之增生性細胞/腫瘤性細胞之疾病。造血性腫瘤病症可能由骨髓系、淋巴系或紅血球系或其前驅細胞引起。血液癌為開始於如骨髓等成血組織或免疫系統細胞之癌症。血液癌之實例包含例如白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤等。

如本文所用，術語「個體」及「患者」在整個說明書中可互換使用，且描述提供根據本發明之方法進行治療之動物、人類或非人類。在本揭示案中設想了獸醫應用及非獸醫應用。人類患者可為成年人類或青少年（例如，18歲以下之人類）。除了人類，患者包含但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、雪貂、貓、狗及靈長類動物。包含例如非人類靈長類動物（例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等）、嚙齒動物（例如，大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、雪貂、兔子）、兔類動物、豬類動物（例如，豬、小型豬）、馬、犬、貓、牛及其他家畜動物、農場動物以及動物園動物。

如本文所使用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代至少兩個胺基酸中之任意長度之胺基酸之聚合物。

如本文所用，術語「聚核苷酸」、「核酸分子」及「核酸序列」在本文中可互換使用以指代至少兩個核苷酸中之任意長度之核苷酸之聚合物，且包含但不限於DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及其修飾。

除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬領域之技術者通常理解之相同之含義。本文描述了用於在本發明中使用之方法及材料；亦可使用此項技術中已知之其他合適的方法及材料。該等材料、方法及實例僅為說明性且不意欲為限制性。本文提及之全部出版物、專利申請案、專利案、序列、資料庫條目及其他參考文獻均以全文引用之方式併入。在發生衝突之情況下，應以本說明書（包含定義）為準。

由以下詳細描述及圖式以及申請專利範圍，本發明之其他特徵及優點將顯而易見。

相關申請之交互參照本揭示案主張2021年12月23日提交之美國臨時專利申請案序列號63/293,225之優先權及權利，該美國臨時專利申請案以全文引用之方式併入本文中。

序列表本申請案含有已以電子方式提交之命名為52246-0003WO1_SL_ST26.xml之XML檔案之序列表。創建於2022年12月5日之XML檔案之大小為30,554個位元組。XML檔案中之材料以全文引用之方式併入本文中。

本揭示案提供了與CD47及4-1BB結合之蛋白質複合物。此等蛋白質複合物可用於同時靶向CD47/SIRPα路徑及4-1BB/4-1BBL路徑。結果表明該等蛋白質複合物可與表現CD47之癌細胞有效結合且阻斷內源性SIRPα與CD47之間的相互作用，由此誘導先天免疫反應（例如，巨噬細胞對癌細胞之吞噬）。另在一個態樣中，蛋白質複合物顯示出與RBC細胞或血小板之最小結合，由此抑制藉由抗CD47抗體莫洛利單抗（magrolimab）觀測到的對宿主細胞之清除。另外，蛋白質複合物可刺激表現4-1BB之免疫細胞（例如，T細胞）活化、增殖及細胞介素釋放。特定言之，蛋白質複合物不會過度誘導可能導致肝毒性之細胞介素釋放，這一點使用抗4-1BB抗體烏瑞蘆單抗已觀測到。

因此，本文中所描述之蛋白質複合物可用於癌症治療，其中腫瘤免疫原性及抗原呈現藉由增加由巨噬細胞進行之吞噬（例如，藉由滅活CD47介導之吞噬抑制）得到增強；且T細胞活化藉由活化4-1BB信號路徑得到增強。此類蛋白質複合物對於克服對抗PD-1/PD-L1療法之抗性尤其有用。

SIRPα 胞外域信號調節蛋白α（SIRPα、SIRPa、Sirpa或CD172A）為跨膜蛋白。其具有包括三個Ig樣域之胞外區及含有免疫受體基於酪胺酸之抑制模體之細胞質區，該免疫受體基於酪胺酸之抑制模體介導蛋白質酪胺酸磷酸酶SHP1及SHP2之結合。SIRPα之酪胺酸磷酸化受各種生長因子及細胞介素以及整合素介導之細胞與胞外基質蛋白之黏附調節。SIRPα在諸如巨噬細胞及樹突狀細胞之骨髓細胞中尤其豐富，而在T細胞、B細胞、NK細胞及NKT細胞中僅少量表現。

SIRPα之胞外區可與其配位體CD47相互作用。巨噬細胞上之SIRPα與紅血球上之CD47之相互作用阻止巨噬細胞在活體外及活體內對Ig調理之紅血球之吞噬。吞噬細胞上之SIRPα與相鄰細胞上表現之CD47之連接引起SIRPα細胞質免疫受體基於酪胺酸之抑制模體之磷酸化，從而導致SHP-1及SHP-2磷酸酶之募集。一種由此產生之下游效應係防止肌球蛋白-IIA在吞噬突觸處積累且因此抑制吞噬。因此，CD47-SIRPα相互作用以陰性免疫檢查點之形式用於發送「別吃我」信號，以確保健康之自體細胞不會被不當吞噬。然而，在幾乎所有類型之腫瘤中亦已發現CD47之過表現，此等腫瘤中之一些腫瘤包含急性骨髓性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）、膀胱癌及乳癌。此種對巨噬細胞之負調節可藉由阻斷CD47與SIRPα之結合而被最小化。因此，阻斷CD47/SIRPα相互作用之藥劑既可促進抗體依賴性細胞吞噬（ADCP），且在一些情況下亦可觸發抗體依賴性細胞毒性（ADCC），由此可用於治療各種癌症。

阻斷CD47/SIRPα相互作用可促進細胞吞噬，由此可用於治療各種癌症。其觸發先天免疫對癌細胞之識別及消除。靶向CD47或SIRPα之藥劑可用於治療各種腫瘤及癌症，例如，固態腫瘤、惡性血液病（例如，復發性或難治性惡性血液病）、急性骨髓性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、乳癌、膀胱癌、卵巢癌及小細胞肺癌腫瘤。

另外，SIRPα起到抑制由巨噬細胞對表現CD47之宿主細胞之活體內清除之作用，該等宿主細胞包含紅血球及血小板。CD47-SIRPα相互作用亦表現出對於造血幹細胞上之移植至關重要。阻斷CD47/SIRPα相互作用可能導致正常紅血球意外死亡，此可能導致貧血且引發炎症。因此，調節SIRPα靶向劑與CD47之相互作用極其重要，例如，以對紅血球之受限或受控之作用。

SIRPα及其功能之詳細描述可見於例如Yanagita等人, 「Anti-SIRPα antibodies as a potential new tool for cancer immunotherapy」 JCI insight 2.1 (2017)；Seiffert等人, 「Signal-regulatory protein α (SIRPα) but not SIRPβ is involved in T-cell activation, binds to CD47 with high affinity, and is expressed on immature CD34+ CD38− hematopoietic cells」 Blood 97.9 (2001): 2741-2749中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。

人類SIRPα係信號調節蛋白（SIRP）之成員。信號調節蛋白係介導必需細胞表面蛋白相互作用及信號轉導之細胞表面Ig超家族蛋白。SIRP均含有N端胞外區、單個跨膜域及C端胞內區。

人類SIRPα之胞外區（UniProt標識符：P78324）具有IgV域、Ig樣C1-1型域及Ig樣C1-2型域。其對應於人類SIRPα蛋白（SEQ ID NO:23；NP_542970.1）之胺基酸32-137、胺基酸148-247及胺基酸254-348。胺基酸1-30為信號肽。人類SIRPα亦具有長胞內域，該長胞內域包括兩個假定免疫受體基於酪胺酸之抑制模體（ITIM）。SIRPα ITIM之活化遞送負向調節細胞反應之抑制信號。

在一些實施例中，蛋白質複合物包括一或多個CD47結合域。在一些實施例中，CD47結合域包括SIRPα胞外域或由其組成。如本文所用，「SIRPα胞外域」係指SIRPα之胞外區之全部或一部分，其中胞外區之該部分可與CD47結合。SIRPα胞外域可具有一或多個蛋白質域，該一或多個蛋白質域可獨立摺疊且形成自穩定結構。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括選自IgV域、Ig樣C1-1型域及Ig樣C1-2型域之一或多個域或由其組成。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括IgV域或由其組成。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括IgV域及Ig樣C1-1型域或由其組成。在一些實施例中，SIRPα胞外域包括IgV域、Ig樣C1-1型域及Ig樣C1-2型域或由其組成。

在一些實施例中，本文中所描述之SIRPα胞外域包含與人類SIRPα蛋白（GenBank寄存編號：AAH26692.1；SEQ ID NO:24）之胺基酸31-148至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之CD47結合域或SIRPα結構域包含與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之CD47結合域或SIRPα胞外域包含人類SIRPα蛋白之IgV域。在一些實施例中，本文中所描述之CD47結合域或SIRPα胞外域包含小鼠SIRPα蛋白之IgV域。

4-1BBL 胞外域4-1BBL（亦稱為4-1BB配位體、TNFSF9、CD137L、腫瘤壞死因子配位體超家族成員9）為主要位於諸如IFN-γ活化之巨噬細胞、CD40配位體活化之B細胞、單核球、T細胞、樹突狀細胞（DC）及B細胞之抗原呈現細胞上之TNF超家族之II型跨膜蛋白。細胞膜上之4-1BBL可傳輸反向信號，由此抑制活化之T細胞之增殖且誘導其凋亡。反向信號亦可誘導單核球活化、促進IL-6、IL-8及TNF-Ade之分泌且延長細胞存活。另外，反向信號可刺激源自CD34+造血幹細胞之DC之成熟。北方墨點轉漬法(Northern blot)分析揭示了在大腦、胎盤、肺部、骨骼肌及腎臟中以及活化之T細胞、轉化之B細胞及單核球株中之多個4-1BBL轉錄本。

4-1BBL之膜形式以三聚體之形式存在，且在與其受體在T細胞上接合時，其遞送強大的共刺激信號。發現4-1BBL在包含人類及小鼠兩者之DC及巨噬細胞以及活化之B細胞在內之專職性APC刺激後進行表現。人類4-1BBL訊息早在藉由固定之CD3單株抗體（mAb）刺激後30分鐘便能偵測到且在1小時時達到峰值。4-1BBL亦以高水準存在於具有血液病之一些患者之血清中以及一些癌細胞株中。

4-1BBL及其功能之詳細描述可在例如Cheuk, Adam TC等人, 「Role of 4-1BB: 4-1BB ligand in cancer immunotherapy」 Cancer Gene Therapy11.3 (2004): 215-226；以及Li, Yan等人, 「Limited cross-linking of 4-1BB by 4-1BB ligand and the agonist monoclonal antibody Utomilumab」 Cell Reports25.4 (2018): 909-920，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。

根據UniProt資料庫（UniProt ID：P41273），人類TNFSF9之細胞質區對應於SEQ ID NO:17之胺基酸1-28，人類TNFSF9之跨膜區對應於SEQ ID NO:17之胺基酸29-49，且人類TNFSF9之胞外區對應於SEQ ID NO:17之胺基酸50-254。

在一些實施例中，蛋白質複合物包括一或多個4-1BB結合域。在一些實施例中，4-1BB結合域包括4-1BBL胞外域或由其組成。如本文所用，「4-1BBL胞外域」係指4-1BBL之胞外區之全部或一部分，其中胞外區之該部分可與4-1BB結合。4-1BBL胞外域可具有一或多個蛋白質域，該一或多個蛋白質域可獨立摺疊且形成自穩定結構。

在一些實施例中，4-1BB結合域為4-1BBL胞外域。在一些實施例中，本文中所描述之4-1BBL胞外域包含與人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸64-254、90-241或88-243至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之4-1BBL胞外域包含與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之4-1BBL胞外域包含TNF同源域（THD），該TNF同源域對應於SEQ ID NO:17之胺基酸90-241或88-243。

靶向 CD47 及 4-1BB 之蛋白質複合物本揭示案提供可與CD47特異性結合之蛋白質複合物。在一些實施例中，此等蛋白質複合物可阻斷CD47/SIRPα信號傳導路徑，由此增加免疫反應。在一些實施例中，此等蛋白質複合物可引發吞噬。

本揭示案亦提供可與4-1BB特異性結合之蛋白質複合物。在一些實施例中，此等蛋白質複合物可刺激4-1BB/4-1BBL信號傳導路徑，由此增加免疫反應。在一些實施例中，此等蛋白質複合物可誘導T細胞活化、增殖及/或細胞介素釋放。

在一個態樣中，本揭示案提供一種蛋白質複合物或一種蛋白質構築體，其包括Fc、一或多個CD47結合域以及一或多個4-1BB結合域或由其組成。如本文所用，術語「Fc」係指抗體（例如，IgG、IgE、IgM、IgA或IgD）之片段可結晶區。術語「Fc區」或「Fc區序列」係指重鏈肽中形成Fc區之重鏈恆定域（例如，CH2及CH3）。在一些實施例中，蛋白質複合物或蛋白質構築體包括1個、2個、3個、4個、5個或6個CD47結合域。在一些實施例中，蛋白質複合物或蛋白質構築體包括1個、2個、3個、4個、5個或6個4-1BB結合域。

在一些實施例中，蛋白質複合物或蛋白質構築體包括Fc、與分化47（CD47）之叢集特異性結合之第一域以及與腫瘤壞死因子受體超家族成員9（4-1BB）特異性結合之第二域或由其組成。

在一些實施例中，第一域可與表現CD47之細胞（例如，癌細胞）結合及/或可阻斷CD47與信號調節蛋白α（SIRPα）之間的相互作用。在一些實施例中，第一域包括SIRPα之胞外區之全部或一部分。在一些實施例中，SIRPα為人類SIRPα。在一些實施例中，第一域包括與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，第二域可與表現4-1BB之免疫細胞（例如，T細胞）結合及/或可刺激T細胞活化及增殖。在一些實施例中，第二域包括腫瘤壞死因子配位體超家族成員9（4-1BBL）之胞外區之全部或一部分。在一些實施例中，4-1BBL為人類4-1BBL。在一些實施例中，第二域包括與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，Fc為人類IgG4 Fc。在一些實施例中，第一域與Fc中之CH2域之N端連接，視情況藉由鉸鏈區。在一些實施例中，第二域與Fc中之CH2域之N端連接，視情況藉由鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區為人類IgG4鉸鏈區，該人類IgG4鉸鏈區視情況具有根據EU編號之S228P突變。

在一些實施例中，第二域與Fc中之CH3域之C端連接，視情況藉由連接肽。

在一些實施例中，Fc包括第一CH3域及第二CH3域。在一些實施例中，每個CH3域包括一或多個EW-RVT突變。在一些實施例中，蛋白質複合物包括兩個或更多個第一域。在一些實施例中，蛋白質複合物包括兩個或更多個第二域。

在一些實施例中，CD47結合域或4-1BB結合域藉由本文中所描述之連接肽序列或鉸鏈區序列中之任一者與Fc區連接。

蛋白質複合物之一些實施例展示於圖1中。其在下文中詳細描述。

HCB201-A 在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包含第一多肽及第二多肽。第一多肽較佳自N端至C端包含第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽、第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域。第二多肽較佳自N端至C端包含第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第三4-1BB結合域。具有HCB201-A格式之例示性蛋白質複合物之示意結構在 圖 1A中示出。

在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα之胞外域之全部或一部分，例如，人類SIRPα蛋白（GenBank寄存編號：AAH26692.1；SEQ ID NO:24）之胺基酸31-148；或SEQ ID NO:6。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係相同的。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα（例如，人類SIRPα）之IgV域。在一些實施例中，SIRPα IgV域包含一或多個突變。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係不同的。

在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含4-1BBL之胞外域之全部或一部分，例如，人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸64-254、90-241或88-243；或SEQ ID NO:7-9中之任一者。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含對應於SEQ ID NO:17之胺基酸90-241或88-243之TNF同源域（THD）。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域係相同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域係不同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域藉由第三連接肽連接。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域可形成分子內三聚體。

在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含免疫球蛋白之鉸鏈區之全部或一部分，例如，人類IgG4鉸鏈區（SEQ ID NO:18）。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含與SEQ ID NO:18至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係相同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係不同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含根據EU編號位於位置228處之脯胺酸。

在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係相同的且可形成Fc均二聚體。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區包含免疫球蛋白之Fc區之全部或一部分，例如，人類IgG4 Fc區（SEQ ID NO:19）。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係不同的。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可藉由引入一或多個突變而形成Fc異二聚體。在一些情況下，第一Fc區及/或第二Fc區可包含一或多個EW/RVT突變。例如，第一Fc區可包含根據EU編號位於位置360處之麩胺酸及位於位置409處之色胺酸；第二Fc區可包含根據EU編號位於位置347處之精胺酸、位於位置399處之纈胺酸及位於位置405處之蘇胺酸。在一些實施例中，第二Fc區亦包含根據EU編號位於位置454處之用於與第一Fc區形成二硫鍵之半胱胺酸。在一些實施例中，第一Fc區包含與SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且第二Fc區包含與SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可使用其他技術，例如，藉由引入一或多個旋鈕入孔（KIH）殘基形成Fc異二聚體。EW-RVT及其他異二聚體Fc技術之細節可見於例如Ha等人, 「Immunoglobulin Fc heterodimer platform technology: from design to applications in therapeutic antibodies and proteins」 Frontiers In Immunology 7 (2016): 394中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽、第二連接肽及/或第三連接肽包含與SEQ ID NO:13-16中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽、第二連接肽及/或第三連接肽包含與GGGGS（SEQ ID NO:25）或GSGGSG（SEQ ID NO:26）之一或多個（例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個）重複序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第一CD47結合域與第一鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第二CD47結合域與第二鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基由用於限制性酶消化之序列（例如，NheI）編碼。

在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO:1至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO:2至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

HCB201-B 在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包含第一多肽及第二多肽。第一多肽較佳自N端至C端包含第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽及第一4-1BB結合域。第二多肽較佳自N端至C端包含第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第二4-1BB結合域。具有HCB201-B格式之例示性蛋白質複合物之示意結構在 圖 1B中示出。

在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα之胞外域之全部或一部分，例如，人類SIRPα蛋白（GenBank寄存編號：AAH26692.1；SEQ ID NO:24）之胺基酸31-148；或SEQ ID NO:6。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係相同的。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα（例如，人類SIRPα）之IgV域。在一些實施例中，SIRPα IgV域包含一或多個突變。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係不同的。

在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域包含4-1BBL之胞外域之全部或一部分，例如，人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸64-254、90-241或88-243；或SEQ ID NO:7-9中之任一者。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域包含對應於SEQ ID NO:17之胺基酸90-241或88-243之TNF同源域（THD）。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域係相同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域係不同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及/或第二4-1BB結合域包含與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之三個蛋白質複合物可形成第一4-1BB結合域之分子間三聚體。在一些實施例中，本文中所描述之三個蛋白質複合物可形成第二4-1BB結合域之分子間三聚體。

在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含免疫球蛋白之鉸鏈區之全部或一部分，例如，人類IgG4鉸鏈區（SEQ ID NO:18）。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含與SEQ ID NO:18至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係相同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係不同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含根據EU編號位於位置228處之脯胺酸。

在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係相同的且可形成Fc均二聚體。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區包含免疫球蛋白之Fc區之全部或一部分，例如，人類IgG4 Fc區（SEQ ID NO:19）。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係不同的。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可藉由引入一或多個突變而形成Fc異二聚體。在一些情況下，第一Fc區及/或第二Fc區可包含一或多個EW/RVT突變。例如，第一Fc區可包含根據EU編號位於位置360處之麩胺酸及位於位置409處之色胺酸；第二Fc區可包含根據EU編號位於位置347處之精胺酸、位於位置399處之纈胺酸及位於位置405處之蘇胺酸。在一些實施例中，該第二Fc區亦包含根據EU編號位於位置454處之用於與第一Fc區形成二硫鍵之半胱胺酸。在一些實施例中，第一Fc區包含與SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且第二Fc區包含與SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可使用其他技術，例如，藉由引入一或多個旋鈕入孔（KIH）殘基形成Fc異二聚體。

在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽及/或第二連接肽包含與SEQ ID NO:13-16中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽及/或第二連接肽包含與GGGGS（SEQ ID NO:25）或GSGGSG（SEQ ID NO:26）之一或多個（例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個）重複序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第一CD47結合域與第一鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第二CD47結合域與第二鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基由用於限制性酶消化之序列（例如，NheI）編碼。

在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO:3至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO:3至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

HCB201-C 在一個態樣中，本揭示案係關於一種蛋白質複合物，其包含第一多肽及第二多肽。第一多肽較佳自N端至C端包含第一CD47結合域、第二CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區及第一Fc區。第二多肽較佳自N端至C端包含第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域、第三4-1BB結合域、視情況存在之第二鉸鏈區及第二Fc區。具有HCB201-C格式之例示性蛋白質複合物之示意結構在 圖 1C中示出。

在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα之胞外域之全部或一部分，例如，人類SIRPα蛋白（GenBank寄存編號：AAH26692.1；SEQ ID NO:24）之胺基酸31-148；或SEQ ID NO:6。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係相同的。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一CD47結合域及/或第二CD47結合域包含SIRPα（例如，人類SIRPα）之IgV域。在一些實施例中，SIRPα IgV域包含一或多個突變。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域係不同的。在一些實施例中，第一CD47結合域及第二CD47結合域藉由第一連接肽連接。

在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含4-1BBL之胞外域之全部或一部分，例如，人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸64-254、90-241或88-243；或SEQ ID NO:7-9中之任一者。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含對應於SEQ ID NO:17之胺基酸90-241或88-243之TNF同源域（THD）。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域係相同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域係不同的。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域包含與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域及/或第三4-1BB結合域可形成分子內三聚體。在一些實施例中，第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域藉由第二連接肽連接。在一些實施例中，第二4-1BB結合域及第三4-1BB結合域藉由第三連接肽連接。

在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含免疫球蛋白之鉸鏈區之全部或一部分，例如，人類IgG4鉸鏈區（SEQ ID NO:18）。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含與SEQ ID NO:18至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係相同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及第二鉸鏈區係不同的。在一些實施例中，第一鉸鏈區及/或第二鉸鏈區包含根據EU編號位於位置228處之脯胺酸。

在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係相同的且可形成Fc均二聚體。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區包含免疫球蛋白之Fc區之全部或一部分，例如，人類IgG4 Fc區（SEQ ID NO:19）。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區係不同的。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可藉由引入一或多個突變而形成Fc異二聚體。在一些情況下，第一Fc區及/或第二Fc區可包含一或多個EW/RVT突變。例如，第一Fc區可包含根據EU編號位於位置360處之麩胺酸及位於位置409處之色胺酸；第二Fc區可包含根據EU編號位於位置347處之精胺酸、位於位置399處之纈胺酸及位於位置405處之蘇胺酸。在一些實施例中，該第二Fc區亦包含根據EU編號位於位置454處之用於與第一Fc區形成二硫鍵之半胱胺酸。在一些實施例中，第一Fc區包含與SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且第二Fc區包含與SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc區及/或第二Fc區可使用其他技術，例如，藉由引入一或多個旋鈕入孔（KIH）殘基形成Fc異二聚體。

在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽、第二連接肽及/或第三連接肽包含與SEQ ID NO:13-16中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之第一連接肽、第二連接肽及/或第三連接肽包含與GGGGS（SEQ ID NO:25）或GSGGSG（SEQ ID NO:26）之一或多個（例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個）重複序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第二CD47結合域與第一鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基（例如，丙胺酸及絲胺酸，自N端至C端）插入在第三4-1BB結合域與第二鉸鏈區之間。在一些實施例中，至少1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基由用於限制性酶消化之序列（例如，NheI）編碼。

在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO:5至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

蛋白質複合物之特性在一些實施例中，蛋白質複合物可包括本文中所描述之任何CD47結合域及/或4-1BB結合域。本揭示案亦提供核酸，其包括編碼本文所描述之多肽之聚核苷酸。

為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，對序列進行比對以用於最佳比較之目的（例如，可在第一及第二胺基酸或核酸序列中之一者或兩者中引入空位以用於最佳比對，且出於比較之目的，可忽略非同源序列）。出於比較之目的而比對之參考序列之長度為參考序列之長度之至少80%，且在一些實施例中為至少90%、95%或100%。然後將對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一序列中之位置被與在第二序列中之對應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則此等分子在該位置處係相同的。兩個序列之間的一致性百分比係由該等序列共有的相同位置的數量之函數，考慮空位之數量及每個空位之長度，需要引入該函數以進行兩個序列之最佳比對。例如，序列之比較以及兩個序列之間的一致性百分比的確定可使用其中空位罰分為12、空位延伸罰分為4且移碼空位罰分為5之Blossum 62評分矩陣來完成。

本文中所描述之蛋白質複合物可包含抗體之Fc。此等抗體可屬於任何類型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY）類別或子類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE1、IgE2）。在一些實施例中，Fc區源自人類IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）。在一些實施例中，Fc區為IgG4 Fc區（例如，人類IgG4 Fc區）。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物藉由抗體鉸鏈區（例如，IgG、IgE鉸鏈區）與Fc區連接。另外，Fc區域可經修飾以提供所期望之效應子功能或血清半衰期。

本文中所描述之蛋白質複合物可阻斷CD47與在免疫細胞上表現之內源性SIRPα之間的結合。在一些實施例中，藉由與CD47結合，本文中所描述之蛋白質複合物可抑制CD47（例如，在腫瘤細胞上表現）與在免疫細胞（例如，骨髓細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞）上表現之內源性SIRPα之結合，由此阻斷CD47/SIRPα路徑，從而上調免疫反應且促進吞噬。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可使免疫細胞（例如，骨髓細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、抗原呈現細胞）之免疫反應、活性或數量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可與CD47（例如，人類CD47、猴CD47或小鼠CD47）以小於0.1 s ^-1、小於0.01 s ^-1、小於0.001 s ^-1、小於0.0001 s ^-1或小於0.00001 s ^-1之解離速率（koff）結合。在一些實施例中，解離速率（koff）大於0.01 s ^-1、大於0.001 s ^-1、大於0.0001 s ^-1、大於0.00001 s ^-1或大於0.000001 s ^-1。在一些實施例中，動力學結合速率（kon）大於1×10 ²/Ms、大於1×10 ³/Ms、大於1×10 ⁴/Ms、大於1×10 ⁵/Ms或大於1×10 ⁶/Ms。在一些實施例中，動力學結合速率（kon）小於1×10 ⁵/Ms、小於1×10 ⁶/Ms或小於1×10 ⁷/Ms。親和力可以由動力學速率常數之商（KD = koff/kon）推導。在一些實施例中，KD小於1×10 ^-6M、小於1×10 ^-7M、小於1×10 ^-8M、小於1×10 ^-9M或小於1×10 ^-10M。在一些實施例中，KD小於300 nM、200 nM、100 nM、50nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、900 pM、800 pM、700 pM、600 pM、500 pM、400 pM、300 pM、200 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM、50 pM、40 pM、30 pM、20 pM或10 pM。在一些實施例中，KD大於1×10 ^-7M、大於1×10 ^-8M、大於1×10 ^-9M、大於1×10 ^-10M、大於1×10 ^-11M或大於1×10 ^-12M。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可與4-1BB（例如，人類4-1BB、猴4-1BB或小鼠4-1BB）以小於0.1 s ^-1、小於0.01 s ^-1、小於0.001 s ^-1、小於0.0001 s ^-1或小於0.00001 s ^-1之解離速率（koff）結合。在一些實施例中，解離速率（koff）大於0.01 s ^-1、大於0.001 s ^-1、大於0.0001 s ^-1、大於0.00001 s ^-1或大於0.000001 s ^-1。在一些實施例中，動力學結合速率（kon）大於1×10 ²/Ms、大於1×10 ³/Ms、大於1×10 ⁴/Ms、大於1×10 ⁵/Ms或大於1×10 ⁶/Ms。在一些實施例中，動力學結合速率（kon）小於1×10 ⁵/Ms、小於1×10 ⁶/Ms或小於1×10 ⁷/Ms。親和力可以由動力學速率常數之商（KD = koff/kon）推導。在一些實施例中，KD小於1×10 ^-6M、小於1×10 ^-7M、小於1×10 ^-8M、小於1×10 ^-9M或小於1×10 ^-10M。在一些實施例中，KD小於300 nM、200 nM、100 nM、50 nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、900 pM、800 pM、700 pM、600 pM、500 pM、400 pM、300 pM、200 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM、50 pM、40 pM、30 pM、20 pM或10 pM。在一些實施例中，KD大於1×10 ^-7M、大於1×10 ^-8M、大於1×10 ^-9M、大於1×10 ^-10M、大於1×10 ^-11M或大於1×10 ^-12M。

用於量測親和力之通用技術包含例如ELISA、RIA及表面電漿子共振（SPR）。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可與猴CD47及/或小鼠CD47結合。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物不可與猴CD47及/或小鼠CD47結合。

在一些實施例中，確定熱穩定性。本文中所描述之蛋白質複合物之Tm可大於60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94或95℃。在一些實施例中，Tm小於60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94或95℃。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之腫瘤生長抑制百分比（TGI%）大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之腫瘤生長抑制百分比小於60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。TGI%可在治療開始後例如3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天確定，或在治療開始後1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月確定。如本文所用，腫瘤生長抑制百分比（TGI%）係使用以下公式計算： TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100 Ti為第i天治療組之平均腫瘤體積。T0為第零天治療組之平均腫瘤體積。Vi為第i天對照組之平均腫瘤體積。V0為第零天對照組之平均腫瘤體積。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之腫瘤抑制作用與抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9-G4）或抗SIRPα抗體（例如，CC-95251）類似。Hu5F9-G4在例如Sikic等人, 「First-in-human, first-in-class phase I trial of the anti-CD47 antibody Hu5F9-G4 in patients with advanced cancers」 Journal of Clinical Oncology 37.12 (2019): 946中描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之腫瘤抑制作用為抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9-G4）或抗SIRPa抗體（例如，CC-95251）之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍或5倍。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之腫瘤抑制作用為hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草（Trillium））之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍或5倍。hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草），亦命名為TTI-622，之細節。hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草）之胺基酸序列在SEQ ID NO:11中示出。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物具有功能性Fc。在一些實施例中，Fc來自人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4。在一些實施例中，功能性Fc之效應子功能係抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC）。在一些實施例中，功能性Fc區之效應子功能為吞噬。在一些實施例中，功能性Fc區之效應子功能為ADCC及吞噬。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質構築體具有不具備效應子功能之Fc區。在一些實施例中，Fc為人類IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc不具有功能性Fc區。例如，Fc區具有LALA突變（EU編號中為L234A及L235A突變）或LALA-PG突變（EU編號中為L234A、L235A、P329G突變）。

可對Fc區進行一些其他修飾。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區中，由此允許此區中之鏈間二硫鍵形成。由此產生之同源二聚體融合蛋白在活體外及/或活體內可具有任何增加之半衰期。

在一些實施例中，IgG4具有S228P突變（EU編號）。S228P突變防止活體內及活體外IgG4 Fab臂交換。

在一些實施例中，所提供之Fc區具有缺乏與Fc區（直接或間接）連接之岩藻醣之碳水化合物結構。例如，此類Fc區組合物中之岩藻醣之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻醣之量係藉由計算Asn297處之相對於如藉由MALDI-TOF質譜法量測之與Asn 297連接之所有醣結構（例如，複合、雜合及高甘露糖結構）之總和之糖鏈內之岩藻醣之平均量確定的，例如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指在Fc區中大致位於位置297（Fc區殘基之Eu編號；或Kabat編號中之位置314）處之天冬醯胺殘基；然而，由於Fc區序列中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即，位置294與300之間。此類岩藻醣基化變異體可具有改良之ADCC功能。在一些實施例中，為了降低聚糖異質性，可將Fc區進一步工程改造以用丙胺酸（N297A）替代位置297處之天冬醯胺。

在一些實施例中，在藉由基於蛋白質A之親和力層析法及/或尺寸排阻層析法進行純化之後，HPLC-SEC之主峰占本文中所描述之蛋白質複合物之至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可與人類表現CD47之腫瘤細胞（例如，人類CD47 tf CHO-S細胞或FaDu細胞）以相比於該抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少110%或至少120%之親和力結合。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可與RBC細胞或血小板（例如，來自人類供體）以相比於抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）之親和力小於90%、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於10%、小於5%、小於3%或小於1%之親和力結合。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物不誘導血球凝集。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可以抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）之最低濃度之500倍、2000倍、5000倍、20000倍或50000倍之最低濃度誘導血球凝集。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可阻斷CD47（例如，人類CD47或其片段）與SIRPα（例如，人類SIRPα或其片段）之間的相互作用。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可阻斷人類表現CD47之細胞（例如，CD47 tf CHO-S細胞或FaDu細胞）與人類SIRPα之間的相互作用。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之阻斷能力為相比於該抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）之至少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%或至少150%。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可誘導由小鼠巨噬細胞（例如，Raw264.7細胞）對表現CD47之腫瘤細胞（例如，FaDu細胞）之吞噬。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物誘導表現CD47之腫瘤細胞之吞噬之EC50值小於30 nM、小於20 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於4 nM、小於3 nM、小於2 nM或小於1 nM。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物誘導表現CD47之腫瘤細胞之吞噬的EC50值與抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）之EC50值類似（例如，為至少80%、85%、90%或95%）。在一些實施例中，相比於抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9），本文中所描述之蛋白質複合物誘導由小鼠巨噬細胞（例如，Raw264.7細胞）對RBC細胞之吞噬之能力較弱（例如，小於80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%）。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可誘導由人類巨噬細胞（例如，MDM細胞）對表現CD47之腫瘤細胞（例如，Jurkat細胞）之吞噬。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物誘導吞噬之能力與抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9）之能力類似（例如，為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%）。在一些實施例中，相比於抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9），本文中所描述之蛋白質複合物誘導由人類巨噬細胞（例如，MDM細胞）對RBC細胞之吞噬之能力較弱（小於80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%）。

CD47在包含紅血球之多種細胞類型上之內源性表現產生了強大的「抗原沉默」，該抗原沉默可能限制靶向CD47之療法之功效。因此，本文中所描述之蛋白質複合物誘導對RBC細胞及/或血小板之吞噬之較弱能力可能增加蛋白質複合物之活體內功效。另外，相比於抗CD47參考抗體（例如，Hu5F9），蛋白質複合物可以較低劑量水準及/或不太頻繁之給藥方案投與。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可使免疫細胞（例如，細胞表面上表現4-1BB之T細胞）及癌細胞（例如，表現CD47之癌細胞）緊密接近，由此促進癌細胞之消除且促進免疫細胞活化、增殖及/或細胞介素釋放。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物（例如，HCB201-B）可在存在表現CD47之癌細胞時活化表現4-1BB之免疫細胞（例如，T細胞）。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物之免疫細胞活化能力為hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草）之免疫細胞活化能力之至少1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可促進T細胞增殖，該T細胞增殖係預先活化的，例如由CD3/CD28珠粒。例如，相比於對照抗體（例如，抗4-1BB抗體烏托魯單抗及烏瑞蘆單抗；或hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）），蛋白質複合物可使預先活化之T細胞數量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，相比於對照抗體（例如，抗4-1BB抗體烏托魯單抗及烏瑞蘆單抗；或hSIRPα-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）），本文中所描述之蛋白質複合物可使細胞介素（例如，IFN-γ及/或IL-2）產生增加至少1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍或10000倍。

在一些實施例中，由人類PBMC釋放之由本文中所描述之蛋白質複合物誘導之細胞介素（例如，IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α及/或IFN-γ）比由固定的抗CD3（UCHT-1）或PHA之可溶形式誘導之細胞介素少30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一些實施例中，由巨噬細胞（例如，MDM細胞）分泌之由本文中所描述之蛋白質複合物誘導之細胞介素（例如，TNF-α及IL-27）比由抗4-1BB抗體烏瑞蘆單抗誘導之細胞介素少80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物不誘導人類活體內之細胞介素風暴。在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物並非超級促效劑。細胞介素風暴及超級促效劑之細節可見於例如Shimabukuro-Vornhagen, A.等人, 「Cytokine release syndrome」 Journal for ImmunoTherapy of Cancer 6.1 (2018): 1-14中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本文中所描述之蛋白質複合物可抑制腫瘤生長。

在一些實施例中，相比於不具有連接肽之相同分子，本文中所描述之連接肽可增加HCB201蛋白之溶解度。在一些實施例中，相比於不具有連接肽之相同分子，本文中所描述之連接肽可增加連接之結構域（例如，4-1BB結合域或CD-47結合域）之可撓性。

製備蛋白質複合物之方法本文中所描述之蛋白質複合物之變異體可藉由將適當的核苷酸變化引入編碼多肽或其部分之DNA中或藉由肽合成來製備。此類變異體包含例如胺基酸序列內殘基之缺失、插入或取代。

可進行篩選以增加CD47結合域及4-1BB結合域之結合親和力。可進行缺失、插入及/或組合之任何組合以獲得對靶標具有增加之結合親和力之變異體。引入變異體中之胺基酸變化亦可改變多肽或將新的轉譯後修飾引入多肽中，如改變（例如，增加或減少）醣基化位點之數量、改變醣基化位點之類型（例如，改變胺基酸序列，使得藉由細胞中存在之酶連接不同之糖）或引入新的醣基化位點。

CD47結合域及/或4-1BB結合域可源自任何動物物種，包含哺乳動物。結合域變異體之非限制性實例包含源自人類、靈長類動物（例如，猴及猿）、奶牛、豬、馬、綿羊、駱駝科動物（例如，駱駝及美洲駝）、雞、山羊及嚙齒動物（例如，大鼠、小鼠、倉鼠及兔）之序列。

本揭示案亦提供包含本文所揭示之經分離之聚核苷酸（例如，編碼本文所揭示之多肽之聚核苷酸）之重組載體（例如，表現載體）、引入重組載體（亦即，使得宿主細胞含有聚核苷酸及/或包括聚核苷酸之載體）之宿主細胞以及藉由重組技術產生重組多肽或其片段。

如本文所用，「載體」係在將載體引入宿主細胞中時能夠將一或多種感興趣之聚核苷酸遞送至宿主細胞之任何構築體。「表現載體」能夠在已引入表現載體之宿主細胞中遞送及表現一或多種感興趣之聚核苷酸作為經編碼之多肽。因此，在表現載體中，感興趣之聚核苷酸經定位以用於藉由以下在載體中進行表現：在載活體內或在該宿主細胞之位於感興趣之聚核苷酸之整合位點處或附近或側翼之基因體中與諸如啟動子、增強子及/或poly-A尾之調節元件可操作地連接，使得將在引入有表現載體之宿主細胞中對感興趣之聚核苷酸進行轉譯。

可藉由此項技術中已知之方法將載體引入宿主細胞中，例如電致孔、化學轉染（例如，DEAE-葡聚糖）、轉形、轉染以及感染及/或轉導（例如，使用重組病毒）。因此，載體之非限制性實例包含病毒載體（其可用於產生重組病毒）、裸DNA或RNA、質體、黏接質體、噬菌體載體以及與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體。

在一些實施例中，本文所揭示之聚核苷酸（例如，編碼本文所揭示之多肽之聚核苷酸）係使用病毒表現系統（例如，牛痘或其他痘病毒、逆轉錄病毒或腺病毒）引入的，此可能涉及使用非病原性（缺陷型）、能夠進行複製之病毒，或可使用複製缺陷型病毒。用於將DNA摻入此類表現系統中之技術係一般熟習此項技術者眾所周知的。DNA亦可為「裸的」。裸DNA之攝取可藉由將DNA包被至可生物降解之珠粒上來增加，該等珠粒被高效地轉運至細胞中。

為了進行表現，可將包括本文所揭示之編碼多肽之聚核苷酸之DNA插入物與適當的啟動子（例如，異源啟動子）操作性地連接，該啟動子如但不限於噬菌體λ PL啟動子、大腸桿菌（ E. coli）lac、trp及tac啟動子、SV40早期及晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR之啟動子。其他適合的啟動子係熟習此項技術者已知的。在一些實施例中，啟動子係巨細胞病毒（CMV）啟動子。表現構築體可進一步含有轉錄起始、終止之位點，且在轉錄區域中含有用於轉譯之核糖體結合位點。由構築體表現之成熟轉錄物之編碼部分可包含起始於開始處之轉譯以及適當定位於待轉譯之多肽之端部處之終止密碼子（UAA、UGA或UAG）。

如所指示，表現載體可包含至少一種可選擇標記物。此類標記物包含用於真核細胞培養之二氫葉酸還原酶抗性或新黴素抗性，以及用於在大腸桿菌及其他細菌中培養之四環素或胺苄青黴素抗性基因。適合的宿主之代表性實例包含但不限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌屬（ Streptomyces）及鼠傷寒沙門氏菌（ Salmonella typhimurium）細胞；真菌細胞，如酵母細胞；昆蟲細胞，若蠅S2及夜蛾Sf9細胞；動物細胞，如CHO、COS、Bowes黑色素瘤及HK 293細胞；以及植物細胞。本文中所描述之宿主細胞之適合的培養基及條件係此項技術中已知的。

用於細菌之非限制性載體包含：pQE70、pQE60及pQE-9，其可自Qiagen獲得；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，其可自Stratagene獲得；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，其可自Pharmacia獲得。非限制性真核載體包含：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1及pSG，其可自Stratagene獲得；以及pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL，其可自Pharmacia公司獲得。其他適合的載體對於熟習此項技術者將係顯而易見的。

適於使用之非限制性細菌啟動子包含大腸桿菌lacI及lacZ啟動子、T3及T7啟動子、gpt啟動子、λ PR及PL啟動子以及trp啟動子。合適的真核啟動子包含CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期及晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒LTR之啟動子，如勞氏肉瘤病毒（RSV）之啟動子，以及金屬硫蛋白啟動子，如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。

在酵母釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）中，可使用許多含有諸如α因子、醇氧化酶及PGH之組成型或誘導型啟動子之載體。

可藉由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電致孔、轉導、感染或其他方法實現將構築體引入宿主細胞中。此類方法在許多標準實驗室手冊中進行描述，如Davis等人, Basic Methods In Molecular Biology (1986)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。

可藉由將增強子序列插入載體中來增加由高級真核細胞進行之對編碼本揭示案之多肽之DNA之轉錄。增強子係DNA之，通常為約10 bp至300 bp之起到增加既定宿主細胞類型中的啟動子之轉錄活性的作用之順式作用元件。增強子之實例包含位於鹼基對100至270處之複製起點之後側之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點之後側上之多瘤增強子及腺病毒增強子。

為了使經轉譯之蛋白質分泌至內質網之腔、周質空間或胞外環境中，可將適當的分泌信號併入所表現多肽中。該等信號對多肽可為內源性的，或其亦可為異源性信號。

多肽可以經修飾之形式，如融合蛋白（例如，GST-融合物）或用組胺酸標籤表現，且不僅可包含分泌信號，而且亦可包含額外的異源性功能區。例如，可將額外的胺基酸，尤其帶電胺基酸之區添加至多肽之N端，以改良在純化期間或在隨後之處理及儲存期間在宿主細胞中之穩定性及持久性。又，可將肽部分添加至多肽中以促進純化。可在最終製備多肽之前將此類區移除。將肽部分添加至多肽以尤其引起分泌或排泄、改良穩定性且促進純化係此項技術中之熟知及常規技術。

治療方法本揭示案之蛋白質構築體或多肽可用於各種治療目的。

在一個態樣中，本揭示案提供用於治療個體之癌症之方法、降低隨著時間之推移個體之腫瘤之體積增加之速率之方法、降低發生轉移之風險之方法或降低個體發生另外的轉移之風險之方法。在一些實施例中，治療可停止、減緩、延遲或抑制癌症之進展。在一些實施例中，治療可使個體之癌症之一或多種症狀之數量、嚴重程度及/或持續時間減少。

在一個態樣中，本揭示案之特徵在於包含向有需要之個體（例如，患有癌症或者被標識為或被診斷為患有癌症之個體）投與治療有效量之本文所揭示之蛋白質構築體或多肽之方法，該癌症為例如乳癌（例如，三陰性乳癌）、類癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、膠質瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、大腸直腸癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系統惡性腫瘤。在一些實施例中，癌症係不可切除之黑色素瘤或轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、小細胞肺癌（SCLC）、膀胱癌或轉移性激素難治性前列腺癌。在一些實施例中，個體患有固態腫瘤。在一些實施例中，癌症係頭頸鱗狀細胞癌（SCCHN）、腎細胞癌（RCC）、三陰性乳癌（TNBC）或大腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係黑色素瘤、胰臟癌、間皮瘤、血液系統惡性腫瘤，尤其為非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病或晚期固態腫瘤。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物及方法可用於治療具有罹患癌症之風險之患者。患有癌症之患者可用此項技術中已知之各種方法來鑑定。

如本文所用，「有效量」意謂足以產生有益或所期望結果之量或劑量，該有益或所期望結果包含停止、減慢、延緩或抑制疾病，例如，癌症之進展。有效量將根據例如被投與蛋白質構築體或多肽、包括編碼蛋白質構築體或多肽之聚核苷酸之載體及/或其組合物之個體之年齡及體重、症狀之嚴重程度及投與之途徑而變化，且因此投與可根據個人類情況而確定。

可以一次或多次投藥來投與有效量。舉例而言，蛋白質構築體或多肽之有效量為足以在活體外改善、阻止、穩定、逆轉、抑制、減緩及/或延緩患者之癌症之進展之量，或為足以在活體外改善、停止、穩定、逆轉、減緩及/或延緩細胞（例如，活檢細胞、本文中所描述之癌細胞中之任何癌細胞或細胞株（例如，癌細胞株））之增殖之量。如此項技術中所瞭解，有效量可變化，尤其取決於患者病史以及其他因素，如所使用之蛋白質構築體或多肽之類型（及/或劑量）。

用於投與本文所揭示之蛋白質構築體或多肽、編碼蛋白質構築體或多肽之聚核苷酸及/或組合物之有效量及時程可憑經驗確定，且做出此類確定在此項技術中之技術範圍內。熟習此項技術者將理解，必須投與之劑量將根據例如將接受本文所揭示之蛋白質構築體或多肽、聚核苷酸及/或組合物之哺乳動物、投與途徑、所使用之本文所揭示之聚核苷酸及/或組合物之特定類型以及投與於哺乳動物之其他藥物而變化。

有效量之蛋白質構築體及/或多肽之典型每日劑量為0.1 mg/kg至100 mg/kg（毫克/公斤患者體重）。在一些實施例中，劑量可小於100 mg/kg、10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg或0.1 mg/kg。在一些實施例中，劑量可大於10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg或0.1 mg/kg。在一些實施例中，劑量為約10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg或1 mg/kg。在一些實施例中，劑量為約1 mg/kg至10 mg/kg、約1 mg/kg至5 mg/kg或約2 mg/kg至5 mg/kg。

在本文中所描述之任何方法中，蛋白質構築體或多肽可至少每週一次（例如，每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每天一次、每天兩次或每天三次）投與個體。

在一些實施例中，可在投與蛋白質構築體或多肽之前或之後向個體投與一或多種額外治療劑。在一些實施例中，該一或多種額外治療劑投與個體，使得一或多種額外治療劑與蛋白質構築體或多肽在個體體內之生物活性時段存在重疊。

在一些實施例中，可向個體投與一或多種額外治療劑。額外治療劑可包括一或多種抑制劑，該一或多種抑制劑係選自由以下組成之群：B-Raf之抑制劑、EGFR抑制劑、MEK之抑制劑、ERK之抑制劑、K-Ras之抑制劑、c-Met之抑制劑、間變性淋巴瘤激酶（ALK）之抑制劑、磷脂醯肌醇3-激酶（PI3K）之抑制劑、Akt之抑制劑、mTOR之抑制劑、雙重PI3K/mTOR抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）之抑制劑、異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）及/或異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）之抑制劑。在一些實施例中，該額外治療劑為吲哚胺2,3-雙加氧酶-1)（IDO1）之抑制劑（例如，艾卡哚司他（epacadostat））。

在一些實施例中，額外治療劑可包括一或多種抑制劑，該一或多種抑制劑係選自由以下組成之群：HER3之抑制劑、LSD1之抑制劑、MDM2之抑制劑、BCL2之抑制劑、CHK1之抑制劑、活化之hedgehog信號傳導路徑之抑制劑、使雌激素受體選擇性降解之藥物。

在一些實施例中，額外治療劑可包括一或多種選自由以下組成之群之治療劑：曲貝替定（Trabectedin）、納布紫杉醇（nab-paclitaxel）、特伯納尼（Trebananib）、帕唑帕尼（Pazopanib）、西地尼布（Cediranib）、帕博西尼（Palbociclib）、依維莫司（everolimus）、氟嘧啶（fluoropyrimidine）、IFL、瑞格拉非尼（regorafenib）、溶血素（Reolysin）、愛甯達（Alimta）、立克癌（Zykadia）、索坦（Sutent）、替西羅莫司（temsirolimus）、阿昔替尼（axitinib）、依維莫司、索拉非尼（sorafenib）、帕唑帕尼（Votrient）、帕唑帕尼（Pazopanib）、IMA-901、AGS-003、卡博替尼（cabozantinib）、長春氟寧（Vinflunine）、Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺（Temazolomide）、IL-2、IFNa、長春花鹼、沙利度胺（Thalomid）、達卡巴 （dacarbazine）、環磷醯胺、來那度胺（lenalidomide）、阿紮胞苷（azacytidine）、來那度胺、硼替佐米（bortezomid）、氨柔比星（amrubicine）、卡非佐米（carfilzomib）、普拉曲沙（pralatrexate）及恩紮滔林（enzastaurin）。

在一些實施例中，額外治療劑可包括一或多種選自由以下組成之群之治療劑：佐劑、TLR促效劑、腫瘤壞死因子（TNF）α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS促效劑、靶向CX3CL1之治療、靶向CXCL9之治療、靶向CXCL10之治療、靶向CCL5之治療、LFA-1促效劑、ICAM1促效劑及選擇素促效劑。

在一些實施例中，向個體投與卡鉑、納布紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI。

在一些實施例中，額外治療劑為抗OX40抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗SIRPα抗體、抗CD47抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體或抗GITR抗體。在一些實施例中，額外治療劑為抗CD20抗體（例如，利妥昔單抗（rituximab））或抗EGF受體抗體（例如，西妥昔單抗（cetuximab））。

醫藥組合物及投與途徑本文亦提供含有本文中所描述之蛋白質構築體或多肽之醫藥組合物。醫藥組合物可以此項技術中已知之任何方式調配。

醫藥組合物經調配以與其預期投與途徑（例如，靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內）相容。組合物可包含無菌稀釋劑（例如，無菌水或鹽水）、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑、抗菌劑或抗真菌劑，如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及等滲劑，如糖（例如，右旋糖）、多元醇（例如，甘露醇或山梨醇）或鹽（例如，氯化鈉）或其任何組合。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。組合物之製劑可調配且封裝在安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。在需要之情況下（例如，在可注射調配物中），可例如藉由使用塗層（如卵磷脂或界面活性劑）來維持適當之流動性。藥劑之吸收可藉由包含延緩吸收之藥劑（例如，單硬脂酸鋁及明膠）來延長。可替代地，可藉由植入物及微囊化遞送系統實現控釋，該等系統可包含可生物降解之生物相容性聚合物（例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸）。

含有本文中所描述之蛋白質構築體或多肽之組合物可經調配以用於以劑量單位形式（亦即，含有預定量之活性化合物之實體離散單元，以便於投與及劑量均勻）腸胃外（例如，靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內）投與。

用於腸胃外投與之醫藥組合物較佳為無菌的且基本上等滲的，且係在良好生產規範（GMP）條件下製造的。醫藥組合物可以單位劑型（亦即，單次投與之劑量）提供。醫藥組合物可使用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調配。調配物取決於所選之投與途徑。對於注射，抗體可在水溶液中調配，較佳在生理上相容之緩衝液中調配，以減少注射部位之不適。溶液可含有調配劑，如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。可替代地，蛋白質構築體或多肽可呈凍乾形式以用於在使用之前與合適的媒劑（例如，無菌的無熱原水）一起構造。

組合物之毒性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物（例如，猴）中之標準藥物程序來確定。例如，可確定LD50（對50%之群體致死之劑量）及ED50（在50%之群體中治療有效之劑量）：治療指數為LD50:ED50之比率。表現出高治療指數之藥劑係較佳的。在藥劑表現出不期望之副作用的情況下，應注意使潛在的損害最小化（亦即，減少不良副作用）。毒性及治療功效可藉由其他標準藥物程序來確定。

例示性劑量包含每公斤個體之體重毫克或微克量之本文中所描述之蛋白質構築體或多肽中之任一者（例如，約1 µg/kg至約500 mg/kg；約100 µg/kg至約500 mg/kg；約100 µg/kg至約50 mg/kg；約10 µg/kg至約5 mg/kg；約10 µg/kg至約0.5 mg/kg；約1 µg/kg/至約50 µg/kg；約1 mg/kg至約10 mg/kg；或約1 mg/kg至約5 mg/kg）。雖然此等劑量涵蓋廣泛範圍，但一般熟習此項技術者將理解，治療劑之效力可變化，且有效量可藉由此項技術中已知之方法來確定。典型地，首先投與相對低之劑量，且主治衛生保健專業人員或獸醫專業人員（在治療應用之情況下）或研究人員（當仍在研發階段工作時）可隨後且逐漸增加劑量，直到獲得適當的反應為止。另外，應理解的是，對任何特定個體之特點劑量水準將取決於多種因素，包含所採用之特定化合物之活性、個體之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食、投與時間、投與途徑、排泄率及半衰期。

醫藥組合物可與投藥說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。本揭示案亦提供製造用於本文中所描述之各種用途之蛋白質構築體或多肽之方法。

實例在以下實例中進一步描述本發明，該等實例不限制申請專利範圍中所描述之本發明之範疇。

實例 1 ：設計具有 SIRPα x 4-1BBL 格式之基於 Fc 之設計師生物製劑（ FBDB™ ）設計及開發了不同的雙靶向FBDB™格式，以（1）改善由巨噬細胞進行之抗原呈現，且（2）增強耗盡之T細胞在腫瘤內之再活化。

各格式含有至少兩種不同類型的與IgG之Fc區（例如，人類IgG4）直接或間接連接之結合域。兩種類型的結合域為：（1）一或多個SIRPα胞外域，其可藉由誘導吞噬刺激抗原呈現；（2）一或多個4-1BBL胞外域，其可與4-1BB在腫瘤抗原特異性T細胞上結合，從而刺激其擴增、細胞介素產生及溶細胞效應子功能之開發。例如，SIRPα胞外域可藉由阻斷腫瘤細胞上之CD47與巨噬細胞上之SIRPα之相互作用來逆轉對巨噬細胞之抑制；4-1BBL胞外域可與其在耗竭之T細胞上之受體4-1BB結合，且提供用於T細胞活化及擴增之共刺激信號。

設計了三種雙靶向格式之FBDB™，如 圖 1A- 圖 1C中所示。HCB201-A（示意結構在 圖 1A中示出）包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，該等多肽鏈分別具有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列。兩條多肽鏈均包含人類IgG4 Fc之人類IgG4鉸鏈區、CH2區及CH3區，而第一多肽鏈之CH3區包含根據EU編號之K360E及R409W突變，且第二多肽鏈之CH3區包含根據EU編號之Q347R、D399V及F405T突變。第一多肽鏈及第二多肽鏈亦分別命名為EW鏈及RVT鏈。兩條鏈可形成EW-RVT Fc異二聚體（或「AjouFc」）。另外，第一多肽鏈包含：一個SIRPα胞外域（SEQ ID NO:6；其中序列與人類SIRPα蛋白（GenBank寄存編號：AAH26692.1；SEQ ID NO:24）之胺基酸31-148相同），該SIRPα胞外域與人類IgG4（根據EU編號具有S228P突變）之鉸鏈區之N端連接；以及兩個4-1BBL胞外域（SEQ ID NO:7；其中序列與人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸64-254相同），該兩個4-1BBL胞外域藉由連接肽（SEQ ID NO:13）與人類IgG4 Fc之CH3區之C端連接。兩個4-1BBL胞外域藉由連接肽（SEQ ID NO:14）連接。第二多肽鏈包含：一個SIRPα胞外域（SEQ ID NO:6），該SIRPα胞外域與IgG4（根據EU編號具有S228P突變）之鉸鏈區之N端連接；以及一個4-1BBL胞外域（SEQ ID NO:7），該4-1BBL胞外域藉由連接肽（SEQ ID NO:13）與人類IgG4 Fc之CH3區之C端連接。

HCB201-B（示意結構在 圖 1B中示出）包含兩個相同的多肽鏈，且每個多肽鏈具有SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列。特定言之，每個多肽鏈包含人類IgG4 Fc之人類IgG4之鉸鏈區、CH2區及CH3區。SIRPα胞外域（SEQ ID NO:6）與人類IgG4（根據EU編號具有S228P突變）之鉸鏈區之N端連接，且一個4-1BBLv2胞外域（SEQ ID NO:8；其中序列與人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸90-241相同）藉由連接肽（SEQ ID NO:15）與人類IgG4 Fc之CH3域之C端連接。

HCB201-C（示意結構在 圖 1C中示出）包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，該多肽鏈分別具有SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列。兩條多肽鏈均包含人類IgG4 Fc之人類IgG4鉸鏈區、CH2區及CH3區，而第一多肽鏈之CH3區包含根據EU編號之K360E及K409W突變，且第二多肽鏈之CH3區包含根據EU編號之Q347R、D399V及F405T突變。因此，第一多肽鏈及第二多肽鏈亦分別命名為EW鏈及RVT鏈。兩條鏈可形成EW-RVT Fc異二聚體（或「AjouFc」）。另外，第一多肽鏈包含兩個SIRPα胞外域（SEQ ID NO:6），該兩個SIRPα胞外域與人類IgG4（根據EU編號具有S228P突變）之鉸鏈區之N端連接。兩個SIRPα胞外域藉由連接肽（SEQ ID NO:14）連接。第二多肽包含三個4-1BBLv3胞外域（SEQ ID NO:9；其中序列與人類4-1BBL蛋白（NCBI寄存編號：NP_003802.1；SEQ ID NO:17）之胺基酸88-243相同）。三個4-1BBLv3胞外域藉由兩個連接肽（SEQ ID NO:16）連接。

將經表現之蛋白質藉由蛋白質A柱，之後藉由HPLC-SEC（高效液相層析法與尺寸排阻層析法結合；Agilent）進行純化；且量測高分子量峰之百分比（HMW%）、主峰之百分比（主%）及低分子量峰之百分比（LMW%）。如下表所示，可以高純度收穫HCB201蛋白。另外，對HCB201-A、HCB201-B及HCB201-C之胺基酸序列使用去免疫工具進行分析（免疫表位資料庫及分析源；Dhanda等人, 「Development of a strategy and computational application to select candidate protein analogues with reduced HLA binding and immunogenicity」 Immunology 153.1 (2018): 118-132）以識別免疫原區。未識別到免疫原性。 表 1.

格式	MW （ kDa ）	pI	SEC 分級後
HMW%	主要 %	LMW%
HCB201-A	141.565	6.24	13.9	84.47	1.63
HCB201-B	112.839	6.71	2.90	97.10	0
HCB201-C	120.090	6.90	6.28	93.72	0

實例 2 ：確定 CD47 tf CHO-S 及表現 CD47 之腫瘤細胞之全細胞結合能力為了確定HCB201蛋白與在細胞表面上表現之CD47之全細胞結合能力，使用了表現人類CD47之經轉染之CHO-S細胞（CD47 tf CHO-S）或下咽癌FaDu細胞作為靶細胞。將細胞與經連續稀釋之HCB201蛋白（以指示濃度）在FACS緩衝液（補充有4%胎牛血清（FBS）之磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））中在4℃下一起培育30分鐘。培育後，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次。然後，將細胞與R-藻紅蛋白-AffiniPure山羊抗人類IgG（Jackson ImmunoResearch，目錄號：109-115-098）在4℃下一起培育30分鐘。使用CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter Inc., CA, USA）對樣品進行分析。

如 圖 2A- 圖 2B所示，相比於HCB201-A，HCB201-B及HCB201-C表現出與表現CD47之細胞之結合能力更高。使用抗CD47參考抗體Hu5F9及SIRPα-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）作為陽性對照。SIRPα-G4Fc-wt包含兩條相同的多肽鏈，且每條多肽鏈之胺基酸序列在SEQ ID NO:10中示出。特定言之，每條多肽鏈自N端至C端包含SIRPα胞外區、人類IgG4鉸鏈區及人類IgG4 Fc。使用peG4Fc-4-1BBL作為陰性對照。peG4Fc-4-1BBL包含兩條相同的多肽鏈，且每條多肽鏈具有SEQ ID NO:11中示出之胺基酸序列。特定言之，每條多肽鏈自N端至C端包含人類IgG4鉸鏈區、人類IgG4 Fc及4-1BBL胞外區。「pe」代表表現載體pEE12.4。

實例 3 ：確定 SIRPα 配位體阻斷能力為了確定HCB201蛋白之SIRPα配位體阻斷能力，使用CD47 tf CHO-S或FaDu細胞作為靶細胞進行基於流式細胞術之測定。特定言之，將HCB201蛋白以指示濃度在FACS緩衝液（補充有4% FBS之PBS）中連續稀釋。將生物素化之SIRPα-Fc（胺基酸序列在SEQ ID NO:12中示出）添加至FACS緩衝液中直到最終濃度為10-20 nM。將相等體積的HCB201蛋白質溶液及生物素化之SIRPα-Fc溶液在4℃下混合且添加至靶細胞持續30分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，然後與鏈黴親和素PE一起培育30分鐘（eBioscience, CA, USA）。使用CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter Inc., CA, USA）對樣品進行分析。使用Hu5F9及SIRPa-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）作為陽性對照。使用peG4Fc-4-1BBL作為陰性對照。

如 圖 3A- 圖 3B所示，HCB201-B及HCB201-C顯示出與抗CD47參考抗體Hu5F9相似之SIRPα配位體阻斷活性。另外，HCB201-B及HCB201-C之SIRPα配位體阻斷活性比HCB201-A之阻斷活性更強效。

實例 4 ：確定 RBC 或血小板之全細胞結合能力為了確定HCB201蛋白之RBC或血小板結合能力，將人類RBC或血小板與經連續稀釋之HCB201蛋白以指示濃度在FACS緩衝液（補充有4% FBS之PBS）中在4℃下一起培育30分鐘。培育後，將RBC或血小板用FACS緩衝液洗滌兩次。然後，將細胞與R-藻紅蛋白-AffiniPure山羊抗人類IgG（Jackson ImmunoResearch，目錄號：109-115-098）在4℃下一起培育30分鐘。使用CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter Inc., CA, USA）對樣品進行分析。使用Hu5F9及SIRPa-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）作為陽性對照。使用peG4Fc-4-1BBL作為陰性對照。

如 圖 4A- 圖 4B所示，相比於抗CD47參考抗體Hu5F9，HCB201-A、HCB201-B及HCB201-C表現出顯著更弱之RBC及血小板結合活性，此表明HCB201蛋白誘導受體介導之吞噬，亦稱為「抗原沉默」之風險較低，該抗原沉默係由Hu5F9誘導之主要副作用。相比於其他淋巴細胞，RBC及血小板構成了血液中之主要細胞群體。高RBC或血小板結合可影響藥代動力學及對腫瘤部位之定位。在此，HCB201蛋白與RBC及血小板之低結合活性可減少此類副作用且增強腫瘤靶向之機會。此外，HCB201蛋白與RBC之低結合活性亦可減少巨噬細胞對RBC之吞噬，由此減少使用Hu5F9觀測到的主要副作用。

實例 5 ：誘導巨噬細胞對表現 CD47 之癌細胞或 RBC 之吞噬為了確定由HCB201蛋白誘導之對癌細胞或RBC之巨噬細胞之吞噬，進行了如下吞噬測定。簡言之，將表現CD47之Jurkat或FaDu細胞用CFSE（羧基螢光素琥珀醯亞胺酯）染料進行標記，且與HCB201蛋白一起以指示濃度在37℃下培育30分鐘。然後將溶液與Raw 264.7小鼠巨噬細胞或人類單核球源性巨噬細胞（MDM）一起以1:1之細胞-細胞比在37℃下培育2小時。培育後，分別用PE-青色素7結合之F4/80抗體（eBioscience）對小鼠巨噬細胞進行染色，且用PE-青色素7結合之CD14抗體（eBioscience）對人類巨噬細胞進行染色。藉由計算CFSE+ F4/80+細胞占總F4/80+細胞之百分比（對於Raw264.7）或CFSE+ CD14+細胞占總CD14+細胞之百分比（對於MDM）來評估HCB201蛋白誘導吞噬之能力。

如 圖 5A- 圖 5B所示，相比於抗CD47參考抗體Hu5F9，HCB201-B表現出對表現CD47之FaDu細胞相似之吞噬活性但對RBC弱得多之吞噬活性。如 圖 5C- 圖 5D所示，相比於Hu5F9，HCB201-B表現出對表現CD47之Jurkat細胞類似之MDM介導之吞噬活性且對RBC相對較弱之吞噬活性。此等結果表明，HCB201-B可誘導癌細胞上之大量吞噬，且相比於抗CD47抗體Hu5F9保持更好的安全概況。

實例 6 ：驗證在 4-1BB 經轉染之細胞上的 HCB201-B 觸發之報導基因活性基於細胞之報導基因測定經設計以確定由HCB201-B藉由交聯效應誘導之NF-kB活性。 圖 6A繪示實驗程序之示意圖。特定言之，將30 nM HCB201-B以指示濃度連續稀釋（3倍），且與1×10 ⁵個表現CD47之CHO-S或FaDu細胞在37℃下培育30分鐘。培育後，將CD47 tf CHOS或FaDu細胞用PBS洗滌，且隨後與1×10 ⁵個表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat細胞一起培育5小時。藉由HCB201-B在表現CD47之CHO-S或FaDu細胞與表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat之間進行交聯可誘導對NF-κB之顯著活化，該活化可藉由生物螢光偵測儀偵測到。

如 圖 6B所示，HCB201-B藉由在表現CD47之CHO-S細胞及表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat細胞上之SIRPα-CD47介導之交聯活性顯著觸發NF-κB報導基因活性。如 圖 6C所示，HCB201-B藉由在表現CD47之FaDu細胞及表現4-1BB之NF-kB-Luc Jurkat細胞上之SIRPα-CD47介導之交聯活性顯著觸發NF-κB報導基因活性。使用SIRPα-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）及peG4Fc-4-1BBL作為陰性對照。結果表明，HCB201-B可藉由SIRPα-CD47介導之交聯活性極大地觸發表現4-1BB之NF-kB-Luc Jurkat細胞之報導基因活性。

實例 7 ：誘導 T 細胞增殖及細胞介素釋放HCB201蛋白誘導之T細胞增殖及細胞介素釋放確定如下。如 圖 7A所示，將抗體或蛋白質首先稀釋至3.33 nM（低劑量）、10 nM（中劑量）或30 nM（高劑量）。簡言之，將1×10 ⁵個/孔之T細胞由CD3/CD28珠粒以1:1之細胞-珠粒比活化3天。然後將經預先活化之T細胞添加至96孔板中且與抗體或蛋白質一起以指示濃度培育5天。培育後，收集細胞以藉由CellTiter-Glo®細胞活力測定來確定T細胞增殖，且收集培養上清液以進行IL-2及IFN-γ確定。根據製造商之說明書藉由人類IL-2 ELISA MAX ^TMDeluxe及人類IFN-γ ELISA MAX ^TMDeluxe套組（BioLegend）量測IL-2及IFN-γ之量。使用SIRPα-G4Fc-wt（延齡草TTI-662）、peG4Fc-4-1BBL及HLX02（Henlius開發之抗HER2抗體）作為陰性對照。使用抗4-1BB抗體烏托魯單抗（PF-05082566）及烏瑞蘆單抗（BMS-663513）作為參考抗體。

如 圖 7B所示，相比於陰性對照，HCB201-A及HCB201-B顯著誘導T細胞增殖。如 圖 7C所示，相比於用單獨的抗CD3抗體或與其他抗體或蛋白質一起處理之T細胞之INF-γ產生水準，HCB201-A及HCB201-B顯著增加INF-γ產生。如 圖 7D所示，相比於用單獨的抗CD3抗體或與其他抗體或蛋白質一起處理之T細胞之IL-2產生水準，HCB201-B顯著誘導IL-2產生。結果表明，HCB201-B可以極大誘導T細胞增殖及細胞介素釋放。

實例 8 ：誘導細胞介素自人類 PBMC 釋放為了評估HCB201-B活體外誘導細胞介素釋放症候群（CRS）之潛力，細胞介素釋放測定（CRA）如下進行。簡言之，將人類PBMC（外周血液單核細胞）與HCB201-B一起培育，該HCB201-B以660 nM或6.6 nM之濃度固定或溶解在96孔板中持續3天。根據製造商之說明書，藉由多分析物流動測定（LEGENDplex™，BioLegend）量測由PBMC釋放之可溶性IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ之濃度。使用可溶形式之PHA（聚羥基脂肪酸酯）及固定之抗CD3（UCHT-1）作為陽性對照。UCHT-1之免疫刺活化性可在交聯時觸發。

如 圖 8A- 圖 8E所示，相比於陽性對照，固定之HCB201-B未過度誘導細胞介素自人類PBMC釋放。如 圖 9A- 圖 9E所示，相比於陰性對照，可溶性HCB201-B未過度誘導細胞介素自人類PBMC釋放。以上結果表明，HCB201-B並非超級促效劑且在人類活體內誘導細胞介素風暴之風險較低。

實例 9 ：確定炎性細胞介素自巨噬細胞之釋放先前之報告顯示出烏瑞蘆單抗（BMS-663513），亦即Bristol-Myers Squibb開發之全人類IgG4單株抗體，誘導炎性肝毒性。如Eskiocak, U.等人, 「Differentiated agonistic antibody targeting CD137 eradicates large tumors without hepatotoxicity」 JCI insight 5.5 (2020)中所揭示，用10 μg/ml CpG ODN-SL01（雙莖環ODN）對初級人類單核球源性巨噬細胞（MDM）進行刺激，該CpG ODN-SL01係在特定序列上下文中含有未甲基化之CpG二核苷酸（CpG模體）之合成寡核苷酸。經刺激之MDM細胞被TLR9識別，從而產生強烈的免疫刺激作用。烏瑞蘆單抗在48小時培育後進一步加劇了作用，藉由TNF-α及IL-27分泌水準增加而證實。

由於可由抗4-1BB抗體烏瑞蘆單抗誘導之炎性肝毒性，因此實驗經設計以評估炎性細胞介素TNF-α及IL-27自巨噬細胞之分泌。特定言之，將1×10 ⁴個細胞/孔之MDM細胞接種在96孔板上，然後用1 μg/ml LPS（脂多醣）進行刺激。將MDM細胞然後與抗體及HCB201蛋白一起以指示濃度培育48小時。收集培養上清液以分別藉由TNF-α ELISA MAX ^TMDeluxe套組（BioLegend）及人類IL-27 DuoSet ELISA套組（R&D system）確定TNF-α及IL-27水準。使用烏瑞蘆單抗作為陽性對照。使用抗4-1BB抗體烏托魯單抗，亦即全人類IgG2單株抗體，作為陰性對照。

如 圖 10A- 圖 10B所示，相比於烏瑞蘆單抗，HCB201-B未增強TNF-α及IL-27之分泌。此結果表明HCB201-B誘導肝毒性之風險較低。

作為總結， 圖 11A- 圖 11C繪示如上文所論述之活體外測定結果。與其他HCB201蛋白或對照抗體相比，HCB201-B之表現CD47之細胞結合及SIRPα配位體阻斷活性更強。此外，相比於抗CD47抗體Hu5F9，HCB201B顯示出在腫瘤細胞上誘導巨噬細胞介導之吞噬之能力相似，且在人類RBC上誘導巨噬細胞介導之吞噬之風險較低。4-1BB報導基因測定及基於T細胞之測定亦表明HCB201-B可顯著誘導表現4-1BB之細胞之活化、T細胞增殖及細胞介素釋放。所有此等資料表明，相比於HCB201-A、HCB201-C以及對照抗體或蛋白質，HCB201-B之性質更好。

其他實施例應理解，雖然已結合詳細描述對本發明進行了描述，但先前描述旨在說明而非限制本發明之範疇，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍之範疇界定。其他態樣、優點及修改屬於以下申請專利範圍之範疇內。

圖1A繪示HCB201-A之示意結構。 圖1B繪示HCB201-B之示意結構。 圖1C繪示HCB201-C之示意結構。 圖2A繪示HCB201蛋白與CD47 tf CHO-S細胞之全細胞結合結果。 圖2B繪示HCB201蛋白與表現CD47之FaDu細胞之全細胞結合結果。 圖3A繪示SIRPα配位體在CD47 tf CHO-S細胞上對HCB201蛋白之阻斷結果。 圖3B繪示SIRPα配位體在表現CD47之FaDu細胞上對HCB201蛋白之阻斷結果。 圖4A繪示HCB201蛋白之RBC結合結果。 圖4B繪示HCB201蛋白之血小板結合結果。 圖5A繪示針對表現CD47之FaDu細胞Raw264.7小鼠巨噬細胞對HCB201蛋白之誘導之吞噬活性。HCB201-B及Hu5F9表現出最高吞噬活性，之後係SIRPα-G4Fc-wt、HCB201-A及HCB201-C。 圖5B繪示針對人類RBC細胞Raw264.7小鼠巨噬細胞對HCB201蛋白之誘導之吞噬活性。Hu5F9表現出比HCB201-B、HCB201-C、HCB201-A及SIRPα-G4Fc-wt顯著更高之吞噬活性。 圖5C繪示針對表現CD47之Jurkat細胞人類單核球源性巨噬細胞（MDM）對HCB201-B之誘導之吞噬活性。Hu5F9表現出最高吞噬活性，之後係HCB-201-B，然後係SIRPα-G4Fc-wt。 圖5D繪示針對人類RBC細胞人類單核球源性巨噬細胞（MDM）對HCB201-B之誘導之吞噬活性。Hu5F9表現出比HCB201-B及SIRPα-G4Fc-wt顯著更高之吞噬活性。 圖6A繪示基於細胞之報導基因測定之示意圖。量測了HCB201蛋白在表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat細胞中誘導NF-kB活化之交聯效應。 圖6B繪示在藉由HCB201蛋白交聯後表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat細胞之生物發光信號。HCB201蛋白與CD47 tf CHO-S細胞一起預培育。 圖6C繪示在藉由HCB201蛋白交聯後表現4-1BB之NF-κB-Luc Jurkat細胞之生物發光信號。HCB201蛋白與表現CD47之FaDu細胞一起預培育。 圖7A繪示所使用之抗體及蛋白質之濃度。 圖7B繪示3.33 nM、10 nM或30 nM（自左至右）之所測試抗體或蛋白質處理後之增殖結果。 圖7C繪示由3.33 nM、10 nM或30 nM（自左至右）之所測試抗體或蛋白質處理之T細胞之IFN-γ產生結果。將抗體（HLX02、PF-05082566、BMS-663513）、蛋白質（SIRPα-G4Fc-wt及peG4Fc-4-1BBL）及融合蛋白候選物（HCB201-A及HCB202-B）與1 μg/ml抗CD3抗體（OKT3）一起添加。 圖7D繪示由3.33 nM、10 nM或30 nM（自左至右）之所測試抗體或蛋白質處理之T細胞之IL-2產生結果。將抗體（HLX02、PF-05082566、BMS-663513）、蛋白質（SIRPα-G4Fc-wt及peG4Fc-4-1BBL）及融合蛋白候選物（HCB201-A及HCB202-B）與1 μg/ml抗CD3抗體（OKT3）一起添加。 圖8A-8E繪示自PBMC釋放之由6.6 nM或660 nM固定之（或板結合之）HCB201-B誘導之細胞介素之濃度。使用了板結合之抗CD3抗體UCHT-1及可溶性PHA作為陽性對照。使用了可溶性UCHT-1作為陰性對照。細胞介素分別誘導可溶性IL-2、IL-6、IL-10、TNFα及IFN-γ。 圖9A-9E繪示自PBMC釋放之由6.6 nM或660 nM可溶性HCB201-B誘導之細胞介素之濃度。使用了板結合之抗CD3抗體UCHT-1及可溶性PHA作為陽性對照。使用了可溶性UCHT-1作為陰性對照。細胞介素分別誘導可溶性IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ。 圖10A繪示由用300 nM、30 nM或3 nM（自左至右）HCB201蛋白處理之人類MDM細胞分泌之TNF-α濃度。使用了烏瑞蘆單抗（Urelumab）作為陽性對照。使用了SIRPα-G4Fc-wt及烏托魯單抗（utomilumab）作為陰性對照。 圖10B繪示由用300 nM、30 nM或3 nM（自左至右）HCB201蛋白處理之人類MDM細胞分泌之IL-27濃度。使用了烏瑞蘆單抗作為陽性對照。使用了SIRPα-G4Fc-wt及烏托魯單抗（utomilumab）作為陰性對照。 圖11A-11C繪示表，其彙總了活體外測定結果。 圖12列出了本揭示案中論述之序列。

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Claims (55)

1. 一種蛋白質複合物，其包括： （a）Fc； （b）CD47結合域；以及 （c）4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）結合域。
2. 如請求項1之蛋白質複合物，其中該CD47結合域能夠與表現CD47之細胞（例如，癌細胞）結合及/或能夠阻斷CD47與信號調節蛋白α（SIRPα）之間的相互作用。
3. 如請求項1或2之蛋白質複合物，其中該CD47結合域為或包括SIRPα胞外域。
4. 如請求項3之蛋白質複合物，其中該SIRPα胞外域為人類SIRPα胞外域。
5. 如請求項4之蛋白質複合物，其中該CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
6. 如請求項1至5中任一項之蛋白質複合物，其中該4-1BB結合域能夠與表現4-1BB之免疫細胞（例如，T細胞）結合及/或能夠刺激T細胞活化和增殖。
7. 如請求項1至6中任一項之蛋白質複合物，其中該4-1BB結合域為或包括4-1BBL胞外域。
8. 如請求項7之蛋白質複合物，其中該4-1BBL胞外域為人4-1BBL胞外域。
9. 如請求項8之蛋白質複合物，其中該4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:7、8或9至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
10. 如請求項1至9中任一項之蛋白質複合物，其中該Fc為人IgG4 Fc。
11. 如請求項1至10中任一項之蛋白質複合物，其中該CD47結合域與該Fc中之CH2域之N端連接，視情況存在之視情況藉由鉸鏈區。
12. 如請求項1至11中任一項之蛋白質複合物，其中該4-1BB結合域與該Fc中之CH2域之N端連接，視情況存在之視情況藉由鉸鏈區。
13. 如請求項11或12之蛋白質複合物，其中該鉸鏈區為人類IgG4鉸鏈區，該人類IgG4鉸鏈區視情況存在之視情況具有根據EU編號之S228P突變。
14. 如請求項1至11中任一項之蛋白質複合物，其中該4-1BB結合域與該Fc中之CH3域之C端連接，視情況存在之視情況藉由連接肽。
15. 如請求項1至14中任一項之蛋白質複合物，其中該Fc包括第一CH3域和第二CH3域，其中任意一個或兩個CH3域包括一或多個選自以下之胺基酸殘基：360E、409W、347R、399V及405T（EU編號）。
16. 如請求項1至15中任一項之蛋白質複合物，其中該蛋白質複合物包括兩個或更多個CD47結合域。
17. 如請求項1至16中任一項之蛋白質複合物，其中該蛋白質複合物包括兩個或更多個4-1BB結合域。
18. 一種蛋白質複合物，其包括： （a）第一多肽，該第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽、第一4-1BB結合域及第二4-1BB結合域；以及 （b）第二多肽，該第二多肽自N端至C端包括：第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第三4-1BB結合域。
19. 如請求項18之蛋白質複合物，其中該第一CD47結合域及/或該第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
20. 如請求項18或19之蛋白質複合物，其中該第一4-1BB結合域、該第二4-1BB結合域及/或該第三4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:7至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
21. 如請求項18至20中任一項之蛋白質複合物，其中該第一鉸鏈區及/或該第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。
22. 如請求項18至21中任一項之蛋白質複合物，其中該第一Fc區包括與SEQ ID NO:20至少80%一致之序列，且該第二Fc區包括與SEQ ID NO:21至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
23. 如請求項18至22中任一項之蛋白質複合物，其中該第一連接肽及/或該第二連接肽包括與SEQ ID NO:13至少80%一致之序列。
24. 如請求項18至23中任一項之蛋白質複合物，其中該第一4-1BB結合域及該第二4-1BB結合域係藉由第三連接肽連接，其中該第三連接肽包括與SEQ ID NO:14至少80%一致之序列。
25. 如請求項18至24中任一項之蛋白質複合物，其中該第一多肽包括與SEQ ID NO:1至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且該第二多肽包括與SEQ ID NO:2至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
26. 一種蛋白質複合物，其包括： （a）第一多肽，該第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區、第一Fc區、視情況存在之第一連接肽及第一4-1BB結合域；以及 （b）第二多肽，該第二多肽自N端至C端包括：第二CD47結合域、視情況存在之第二鉸鏈區、第二Fc區、視情況存在之第二連接肽及第二4-1BB結合域。
27. 如請求項26之蛋白質複合物，其中該第一CD47結合域及/或該第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
28. 如請求項26或27之蛋白質複合物，其中該第一4-1BB結合域及/或該第二4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:8至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
29. 如請求項26至28中任一項之蛋白質複合物，其中該第一鉸鏈區及/或該第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。
30. 如請求項26至29中任一項之蛋白質複合物，其中該第一Fc區及該第二Fc區包括與SEQ ID NO:19至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
31. 如請求項26至30中任一項之蛋白質複合物，其中該第一連接肽及/或該第二連接肽包括與SEQ ID NO:15至少80%一致之序列。
32. 如請求項26至31中任一項之蛋白質複合物，其中該第一多肽包括與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且該第二多肽包括與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
33. 一種蛋白質複合物，其包括： （a）第一多肽，該第一多肽自N端至C端包括：第一CD47結合域、第二CD47結合域、視情況存在之第一鉸鏈區及第一Fc區；以及 （b）第二多肽，該第二多肽自N端至C端包括：第一4-1BB結合域、第二4-1BB結合域、第三4-1BB結合域、視情況存在之第二鉸鏈區及第二Fc區。
34. 如請求項33之蛋白質複合物，其中該第一CD47結合域及/或該第二CD47結合域包括與SEQ ID NO:6至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
35. 如請求項33或34之蛋白質複合物，其中該第一4-1BB結合域、該第二4-1BB結合域及/或該第三4-1BB結合域包括與SEQ ID NO:9至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
36. 如請求項33至35中任一項之蛋白質複合物，其中該第一鉸鏈區及/或該第二鉸鏈區包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之序列。
37. 如請求項33至36中任一項之蛋白質複合物，其中該第一Fc區包括與SEQ ID NO:20至少80%一致之序列，且該第二Fc區包括與SEQ ID NO:21至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
38. 如請求項33至37中任一項之蛋白質複合物，其中該第一CD47結合域及該第二4-1BB結合域係藉由第一連接肽連接，其中該第一連接肽包括與SEQ ID NO:14至少80%一致之序列。
39. 如請求項33至38中任一項之蛋白質複合物，其中該第一4-1BB結合域及該第二4-1BB結合域係藉由第二連接肽連接，且該第二4-1BB結合域及該第三4-1BB結合域係藉由第三連接肽連接，其中該第二連接肽及/或該第三連接肽包括與SEQ ID NO:16至少80%一致之序列。
40. 如請求項33至39中任一項之蛋白質複合物，其中該第一多肽包括與SEQ ID NO:4至少80%、90%、95%或100%一致之序列，且該第二多肽包括與SEQ ID NO:5至少80%、90%、95%或100%一致之序列。
41. 一種核酸，其包括編碼如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物之聚核苷酸。
42. 如請求項41之核酸，其中該核酸為DNA（例如，cDNA）或RNA（例如，mRNA）。
43. 一種載劑，其包括如請求項41或42之核酸中之一或多者。
44. 一種細胞，其包括如請求項43之載劑。
45. 如請求項44之細胞，其中該細胞為CHO細胞。
46. 一種細胞，其包括如請求項41或42之核酸中之一或多者。
47. 一種產生蛋白質複合物之方法，該方法包括： （a）     在足以使如請求項44至46中任一項之細胞產生該蛋白質複合物之條件下培養該細胞；以及 （b）     收集由該細胞產生之該蛋白質複合物。
48. 一種抗體-藥物結合物，其包括如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物，該抗體-藥物結合物與治療劑共價結合。
49. 如請求項48之抗體藥物結合物，其中該治療劑為細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。
50. 一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之包括如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物之組合物或如請求項48或49之抗體-藥物結合物。
51. 如請求項50之方法，其中該個體患有表現CD47之癌細胞。
52. 如請求項50或51之方法，其中該癌症為卵巢癌、頭頸鱗狀細胞癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、白血病、乳癌、小細胞肺癌、淋巴瘤或大腸直腸癌。
53. 一種降低腫瘤生長速率之方法，該方法包括 使腫瘤細胞與有效量之包括如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物之組合物或如請求項48或49之抗體-藥物結合物接觸。
54. 一種殺死腫瘤細胞之方法，該方法包括 使腫瘤細胞與有效量之包括如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物之組合物或如請求項48或49之抗體-藥物結合物接觸。
55. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至40中任一項之蛋白質複合物以及醫藥學上可接受之載劑。