TW202325337A - 乳鐵蛋白組合物及使用方法 - Google Patents

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克里斯托弗 赫勒博
強納森 斯內德克
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美商臘克提阿益康有限責任公司
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Abstract

本發明提供包含乳鐵蛋白之組合物,尤其係包含自天然生乳源純化之乳鐵蛋白的醫藥調配物。本發明亦提供其製造方法及使用方法。

Description

乳鐵蛋白組合物及使用方法
乳鐵蛋白業經被探索其抗微生物特性之背景。然而,乳鐵蛋白製劑通常來源於先前經加工及/或先前經處理之乳製品,諸如巴氏殺菌乳源,或以重組方式產生。此類產生策略可導致乳鐵蛋白之特性相對於未經加工及/或未經處理之乳源中發現的特性變化,諸如變性、生物活性降低、鐵結合能力降低、糖基化改變及/或轉譯後修飾之保持力缺乏。另外,可獲得之經純化之乳鐵蛋白產品通常含有顯著雜質。
該領域缺乏針對保持乳鐵蛋白天然生物活性的乳鐵蛋白製劑及調配物,包括通常不含雜質(例如,其他蛋白質、酶、內毒素、傳染性蛋白顆粒(prions)等)之乳鐵蛋白,其包括醫藥學上可接受(例如FDA可註冊)之乳鐵蛋白製劑及調配物,尤其用於傷口護理及其他應用領域。
本文提供包含乳鐵蛋白之醫藥組合物。本文亦提供包含乳鐵蛋白之組合物。
在一些態樣中,本文提供包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至口腔或鼻腔。在一些態樣中,該醫藥組合物經調配以用於將乳鐵蛋白保持在頰黏膜中。在一些態樣中,該醫藥組合物經調配以用於遞送至細胞的細胞外基質(ECM)中。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配為錠劑。在一些態樣中,該錠劑調配為經口可溶或崩解錠劑。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配為鼻用噴霧劑。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配為口嚼錠。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配為口服薄膜。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配為口含錠。
在一些態樣中,該口腔或鼻腔包含鼻咽。
本文亦提供一種包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至開放性傷口或潰瘍。在一些態樣中,該醫藥組合物經調配以用於遞送至皮膚、黏膜、眼、結締組織、胃腸道及/或肺組織。在一些態樣中,該傷口包含開放性傷口或潰瘍。在一些態樣中,該潰瘍為靜脈潰瘍或動脈潰瘍。
在一些態樣中,該傷口選自由以下組成之群:燒傷、咬傷、割傷、感染、潰瘍及其組合。在一些態樣中,該燒傷選自由以下組成之群:熱燒傷、化學燒傷、電燒傷、輻射燒傷、摩擦燒傷及其組合。在一些態樣中,該割傷選自由以下組成之群:穿刺、裂傷、擦傷、切口(本質上可為手術切口)、切除及其組合。在一些態樣中,該潰瘍為靜脈潰瘍或動脈潰瘍。
在一些態樣中,該醫藥組合物包含生物黏合劑。
在一些態樣中,該醫藥組合物調配成選自由以下組成之群的遞送形式:止血膠棉、水凝膠、輸注繃帶、散劑、噴霧劑及吸入形式。
本文亦提供一種包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至胃腸道。在一些態樣中,該醫藥組合物調配成包含微膠囊化之遞送形式。在一些態樣中,其中醫藥組合物調配成包含腸溶包衣之遞送形式。
本文亦提供一種包含乳鐵蛋白之組合物,其中該組合物經調配以用於遞送至口腔、鼻腔、傷口、眼腔及/或胃腸道。在一些態樣中,該傷口包含開放性傷口或潰瘍。在一些態樣中,該潰瘍為靜脈潰瘍或動脈潰瘍。
在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含賦形劑。
在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含硬酯醯反丁烯二酸鈉、卡波姆(carbomer)、氫氧化鈉、甘油、苯甲酸鈉、苯甲酸、檸檬酸及/或其組合。在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、糖醇、蔗糖素及/或其組合。在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含異麥芽酮糖醇、微晶纖維素、羥甲基纖維素鈉及/或其組合。在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含粉糖、膠基、玉米糖漿、阿拉伯膠(gum Arabic)及/或其組合。在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含HiG PWD-04、囊封粉狀調味劑、無水或天然咖啡鹼、囊封蔗糖素或蔗糖素、囊封乙醯磺胺酸鉀(Acesulfame-K)及阿斯巴甜(Aspartame)、阿斯巴甜、乙醯磺胺酸鉀、三乙酸甘油酯、二氧化矽及/或其組合。
在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含凝聚劑。在一些態樣中,凝聚劑包含凝血酶、支鏈澱粉、高嶺土及/或其組合。
在一些態樣中,該醫藥組合物或組合物包含收斂劑。在一些態樣中,該收斂劑選自由以下組成之群:礬、阿拉伯膠(acacia)、鼠尾草(sage)、西洋蓍草(yarrow)、北美金縷梅(witch hazel)、月桂莓(bayberry)、蒸餾醋、柿子、綠茶、紅茶、檸檬酸、蔓越莓汁及/或萃取物、葡萄柚汁及/或萃取物、無機酸及其組合。
在一些態樣中,乳鐵蛋白為牛乳鐵蛋白。在一些態樣中,乳鐵蛋白尚未經處理。在一些態樣中,乳鐵蛋白尚未經化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理。在一些態樣中,乳鐵蛋白尚未經熱處理。在一些態樣中,乳鐵蛋白尚未在50℃或更高、51℃或更高、52℃或更高、53℃或更高、54℃或更高或55℃或更高的溫度下經熱處理。在一些態樣中,乳鐵蛋白尚未在55℃或更高之溫度下經熱處理。
經純化之乳鐵蛋白包含如藉由圓偏光二色性評估之天然構形。
在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白包含如藉由差示掃描熱量測定(DSC)評估之天然構形。在一些態樣中,天然構形包含缺鐵乳鐵蛋白及/或富鐵乳鐵蛋白構形。在一些態樣中,缺鐵乳鐵蛋白構形具有60.2 +/- 0.8℃之熔融溫度峰且/或富鐵乳鐵蛋白構形具有88.38 +/- 0.8℃之熔融溫度峰。
在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白中的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能夠結合鐵。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白中的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%能夠結合鐵。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白中的至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%能夠結合鐵。在一些態樣中,藉由DSC評估結合鐵之能力。
在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白包含轉譯後修飾。在一些態樣中,轉譯後修飾包含糖基化。
在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白包含至少79000-86000 Da之平均分子量。
在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白經乾燥。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白已藉由冷凍乾燥/凍乾、流體化床乾燥或低溫噴霧乾燥進行乾燥。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白經由乳鐵蛋白純化保持液體形式。
在一些態樣中,組合物進一步包含鐵分子。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白與鐵分子複合。在一些態樣中,鐵分子包含Fe2+或Fe3+。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白與銅、鋅、錳及/或鎵分子複合。在一些態樣中,經純化之乳鐵蛋白與鋅分子複合。
在一些態樣中,組合物包含5 EU/kg或更低含量的內毒素。
在一些態樣中,乳鐵蛋白自尚未經處理之天然乳製品純化。在一些態樣中,在純化乳鐵蛋白之前,天然乳製品尚未經加工。在一些態樣中,在純化乳鐵蛋白之前,天然乳製品尚未經化學處理、酶處理、酸處理或熱處理。在一些態樣中,在純化乳鐵蛋白之前,天然乳製品尚未經熱處理。在一些態樣中,熱處理包含50℃或更高、51℃或更高、52℃或更高、53℃或更高、54℃或更高或55℃或更高之溫度。在一些態樣中,熱處理包含55℃或更高之溫度。
在一些態樣中,乳鐵蛋白已自天然乳製品純化,在純化乳鐵蛋白之前,該天然乳製品已分離成脫脂乳及乳油。在一些態樣中,脫脂乳及乳油之分離包含冷碗分離。在一些態樣中,乳鐵蛋白已自天然乳製品純化,在純化乳鐵蛋白之前,該天然乳製品已經酸處理。在一些態樣中,酸處理包含移除不溶酪蛋白。在一些態樣中,酸處理係在4.0或更高之pH下進行。
本文亦提供一種製造本文所提供之任一種醫藥組合物或組合物的方法。在一些態樣中,該方法包含選自由層析、過濾及乾燥組成之群的一或多個步驟。在一些態樣中,該方法包含層析、過濾及乾燥步驟中之各者。
本文亦提供一種治療疾病或病狀之方法,該方法包含投與本文所提供之任一種醫藥組合物或組合物。在一些態樣中,該疾病或病狀選自由以下組成之群:病原性疾病、胃腸道(GI)感染、傷口感染、過敏性病狀、發炎病狀及其組合。
本文亦提供一種治療病原性疾病之方法,該方法包含向個體投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
在一些態樣中,該投與為防治性的。在一些態樣中,該個體處於暴露於病原體之風險下。在一些態樣中,該個體已暴露於病原體。在一些態樣中,該個體已診斷患有病原體感染。
本文亦提供一種降低病原性疾病風險的方法,該方法包含向個體投與本文所提供之醫藥組合物或組合物中之任一者。在一些態樣中,降低病原性疾病風險的方法包含向個體之傷口投與醫藥組合物或組合物。在一些態樣中,該個體已暴露於病原體且/或已診斷患有病原體感染。
在一些態樣中,病原體包含經口及/或經鼻傳播之微生物。在一些態樣中,該病原體包含經空氣傳播之微生物。
在一些態樣中,該病原體包含病毒。在一些態樣中,該病毒包含冠狀病毒。在一些態樣中,該冠狀病毒為SARS-CoV-2。
在一些態樣中,該病原體包含細菌。
在一些態樣中,該病原體包含真菌。
在一些態樣中,治療該疾病或病狀包含防治性治療該疾病或病狀。
本文亦提供一種降低感染風險的方法,該方法包含向個體投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。在一些態樣中,該個體之傷口處於感染風險下。
本文亦提供一種促進組織之傷口癒合的方法,該方法包含向個體組織之傷口投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。在一些態樣中,該傷口選自由以下組成之群:燒傷、割傷、感染、潰瘍及其組合。在一些態樣中,該燒傷選自由以下組成之群:熱燒傷、化學燒傷、電燒傷、輻射燒傷、摩擦燒傷及其組合。在一些態樣中,該割傷選自由以下組成之群:穿刺、裂傷、擦傷、切口、切除及其組合。在一些態樣中,該組織為皮膚、肺組織或其組合。在一些態樣中,該方法包含治療選自由以下組成之群的疾病或病狀:病原性疾病、胃腸道(GI)感染、傷口感染、過敏性病狀、發炎病狀及其組合。在一些態樣中,治療該疾病或病狀包含防治性治療該疾病或病狀。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2022年1月28日申請之美國臨時申請案第63/304,434號及2021年8月23日申請之美國臨時申請案第63/236,204號的權益,該等申請案各自之全部內容以引用之方式併入本文中用於所有目的。 定義
除非另外規定,否則申請專利範圍及說明書中所用之術語定義如下。
如本文中可互換使用之「未加工之乳製品」或「未加工之含乳鐵蛋白乳製品」係指由哺乳動物乳腺產生且直接自哺乳動物收集的天然液態泌乳產品,其未施用額外加工(例如過濾、管柱/樹脂純化及/或乳分離)及/或處理步驟(例如化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理)。
如本文中可互換使用之「未處理之乳製品」或「未處理之含乳鐵蛋白乳製品」係指一種乳製品,其尚未經歷處理步驟(例如化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理),但包括已經歷一或多種潛在機械加工步驟(例如過濾、管柱/樹脂純化及/或乳分離)。
除非上下文有特別陳述或顯而易見,否則如本文中所用,術語「約」應理解為在此項技術中之正常容限範圍內,例如在平均值之2個標準差內。約可理解為在所述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。本文中提供之數值有時可被視為藉由術語約修飾,其中上下文明確顯示該修飾所涵蓋之範圍與本發明之可操作性及申請專利範圍之定義一致。
比較序列之最佳比對可例如藉由以下進行:Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法;Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法;Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法;此等算法之電腦化實施方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.);或目視檢查(通常參見Ausubel等人)。
適合於測定序列一致性百分比及序列相似性之算法的一個實例為BLAST算法,其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。執行BLAST分析之軟體為可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。 乳鐵蛋白
本文提供包括經純化之乳鐵蛋白的組合物。一般而言,本文中乳鐵蛋白係指自未加工之乳製品(例如生乳)獲得之哺乳動物乳鐵蛋白的純化形式。
本文中之經純化之組合物的乳鐵蛋白通常為牛乳鐵蛋白,例如自牛乳源純化。例示性牛乳鐵蛋白(bLF)分子包括但不限於:CAS登記號146897-68 -9及描述於Mead及Tweedie (Nucleic Acids Res. 1990年12月11日;18(23):7167.)及Pierce等人(Eur J Biochem. 1991年2月26日;196(1):177-84.)中之彼等分子,其各自以引用之方式併入本文中用於所有目的。牛(家牛)乳鐵蛋白的例示性非限制性全長胺基酸序列提供如下:MKLFVPALLSLGALGLCLAAPRKNVRWCTISQPEWFKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAFALECIRAIAEKKADAVTLDGGMVFEAGRDPYKLRPVAAEIYGTKESPQTHYYAVAVVKKGSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSAGWVIPMGILRPYLSWTESLEPLQGAVAKFFSASCVPCIDRQAYPNLCQLCKGEGENQCACSSREPYFGYSGAFKCLQDGAGDVAFVKETTVFENLPEKADRDQYELLCLNNSRAPVDAFKECHLAQVPSHAVVARSVDGKEDLIWKLLSKAQEKFGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALGFLRIPSKVDSALYLGSRYLTTLKNLRETAEEVKARYTRVVWCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADALNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENRKTSKYSSLDCVLRPTEGYLAVAVVKKANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGRDPKSRLCALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAVVSRSDRAAHVKQVLLHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYVTAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR (SEQ ID NO:1;GenBank登錄號AAA30610.1)。
乳鐵蛋白可為全長乳鐵蛋白(例如SEQ ID NO: 1)之片段。片段包括生物活性片段。如本文所用,「生物活性」係指蛋白質具有對應天然蛋白質之一或多種生物活性,包括(但不限於)酶活性、抗微生物活性(例如抗細菌、抗真菌及/或抗病毒活性)、鐵結合/螯合活性、免疫調節行為(例如消炎活性)、生長調節及細胞表面親和力、創傷癒合,或本文所述或此項技術中已知之乳鐵蛋白之任一其他代謝活性。舉例而言,乳鐵蛋白通常被分泌出來且生物活性片段可包括分泌形式,諸如缺乏信號肽的乳鐵蛋白之「經加工」片段。作為說明性實例,由SEQ ID NO: 1表示之乳鐵蛋白包括信號肽MKLFVPALLSLGALGLCLA (SEQ ID NO: 2;SEQ ID NO: 1之胺基酸1-19)。因此,乳鐵蛋白之生物活性片段可包括缺乏信號肽的乳鐵蛋白(例如SEQ ID NO: 1之胺基酸20-708)。
乳鐵蛋白可為乳鐵蛋白同功異型物,諸如乳鐵蛋白α (LFα)、乳鐵蛋白β (LFβ)或乳鐵蛋白γ (LFγ)同功異型物。
乳鐵蛋白的胺基酸序列可與SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列或其生物活性片段(例如分泌形式,諸如缺乏信號肽的SEQ ID NO: 1之胺基酸20-708)至少75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO: 1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少95%一致的胺基酸序列。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO: 1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少96%一致的胺基酸序列。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO :1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少97%一致的胺基酸序列。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO: 1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少98%一致的胺基酸序列。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO: 1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少99%一致的胺基酸序列。乳鐵蛋白可具有與如SEQ ID NO: 1所闡述之胺基酸序列或其生物學活性片段至少99.5%一致的胺基酸序列。
乳鐵蛋白可具有保守性取代。「保守性取代」或「保守性胺基酸取代」係指胺基酸被化學上或功能上藉由類似的胺基酸取代。保守性取代為此項技術中熟知的,例如描述於 Proteins: Structures and Molecular Properties第2版(1993) W. H. Freeman & Co., New York, NY中,其以引用的方式併入本文中用於所有目的。 轉譯後修飾
在作為源材料之未加工乳製品中發現的乳鐵蛋白通常包括轉譯後修飾。不希望受理論所束縛,本文所描述之純化策略及方法經設計以減少、最小化或免除破壞天然轉譯後修飾,參考用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中發現之彼等修飾。舉例而言,本文所描述之純化策略及方法減少、最小化或免除化學處理、酶處理、酸處理、熱處理(例如巴氏滅菌(pasteurization))及/或能夠破壞天然轉譯後修飾之任何其他處理。
轉譯後修飾可為涉及乳鐵蛋白生物活性之彼等修飾。一般而言,通常產生於外源性表現系統(諸如細菌或酵母)中的重組產生乳鐵蛋白缺乏轉譯後修飾及/或天然產生之乳鐵蛋白的轉譯後修飾。轉譯後修飾包括(但不限於)糖基化、磷酸化及乙醯化。轉譯後修飾尤其可包括糖基化(例如N連接糖基化),諸如天冬醯胺233、281、368、476及/或545處之糖基化,其可包括-乙醯基神經胺酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙醯基葡萄胺糖及/或N-乙醯基半乳胺糖。轉譯後修飾可為天然存在及/或非天然存在的(例如,在純化之後修飾,諸如藉由熟習此項技術者已知之活體外方法)。轉譯後修飾包括全長乳鐵蛋白之加工,諸如信號序列之移除,如上文所描述。
未修飾之分泌乳鐵蛋白通常具有約78 kDa之分子量。天然轉譯後修飾可產生範圍為至多約86 kDa之分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有大於約78 kDa之分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少79 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少80 kDa之分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少81 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少82 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少83 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少84 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少85 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有至少86 kDa的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有79-86 kDa之間的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有82-84 kDa之間的分子量。經純化之乳鐵蛋白可具有82-85 kDa之間的分子量。
評估轉譯後修飾之方法為熟習此項技術者已知,諸如質譜法或抗體介導之方法(例如使用識別轉譯後修飾之抗體,諸如ELISA及/或二維西方墨點分析)。 蛋白質構形
在未加工之乳製品中發現之乳鐵蛋白的構形狀態通常視為乳鐵蛋白之天然構形。通常用於純化乳鐵蛋白之乳源的各種處理(諸如巴氏滅菌)一般視為能夠使蛋白質變性。不希望受理論所束縛,本文所描述之純化策略及方法經設計以減少、最小化或免除破壞天然構形狀態,參考用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中發現之構形狀態。舉例而言,本文所描述之純化策略及方法減少、最小化或免除化學處理、酶處理、酸處理、熱處理(例如巴氏滅菌)及/或能夠使乳鐵蛋白變性之任何其他處理。
評估構形狀態之方法為熟習此項技術者已知,諸如圓偏光二色性、x射線結晶或抗體介導之方法(例如使用識別構形狀態之抗體及/或非變性西方墨點分析)。 鐵複合
乳鐵蛋白包括兩個鐵結合域(亦稱為球狀葉)。不希望受理論所束縛,鐵結合特性可介導及/或影響抗微生物生物活性,諸如微生物殺滅、防止微生物進入、螯合、微生物消除及/或抑制生長。
鐵結合的乳鐵蛋白稱為富鐵乳鐵蛋白且不含鐵的乳鐵蛋白稱為缺鐵乳鐵蛋白,且在一些情況下可在生物活性方面不同,諸如其抗細菌活性或其他特性,諸如富鐵乳鐵蛋白對熱誘導變化的抗性相對於缺鐵乳鐵蛋白增強。未加工乳製品中之乳鐵蛋白通常發現於無鐵形式與鐵結合形式之定義比率內。舉例而言,牛乳中之乳鐵蛋白一般有20-30%的乳鐵蛋白以鐵結合形式存在,且人乳中一般有6-8%以鐵結合形式存在。本文組合物中經純化之乳鐵蛋白中的鐵結合型富鐵乳鐵蛋白可在定義範圍內。經純化之乳鐵蛋白可在20-30%富鐵乳鐵蛋白之間。經純化之乳鐵蛋白可在6-8%富鐵乳鐵蛋白之間。經純化之乳鐵蛋白可大於30%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可小於6%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可為至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可為至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可為100%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可小於20%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可大於8%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或9%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可小於11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%富鐵乳鐵蛋白。經純化之乳鐵蛋白可100%為不含鐵的缺鐵乳鐵蛋白形式。
差示掃描量熱法(DSC)可用於評估經純化之乳鐵蛋白採取其富鐵乳鐵蛋白形式的能力,例如評估經純化之乳鐵蛋白結合鐵的能力。舉例而言,結合鐵之能力可藉由以下方式評估:在經純化之乳鐵蛋白存在下添加過量鐵,接著進行DSC以評估與缺鐵乳鐵蛋白及富鐵乳鐵蛋白相關之相對峰。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,如藉由DSC所評估,其中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,如藉由DSC所評估,其中至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,如藉由DSC所評估,其中至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中100%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,如藉由DSC所評估(例如,在過量鐵存在下唯一可觀測到的峰為富鐵乳鐵蛋白相關峰),其中100%之經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。
差示掃描熱量測定(DSC)可用於評估經純化之乳鐵蛋白之熔融溫度峰,尤其是缺鐵乳鐵蛋白及/或富鐵乳鐵蛋白之熔融溫度峰。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中與缺鐵乳鐵蛋白相關之熔融溫度峰為60.2 +/- 0.8℃。經純化之乳鐵蛋白及/或劑量配方可包括經純化之乳鐵蛋白,其中與富鐵乳鐵蛋白相關之熔融溫度峰為88.38 +/- 0.8℃。
呈富鐵乳鐵蛋白形式之乳鐵蛋白通常結合天然乳源中的兩個三價鐵(Fe 3+)離子。本文組合物中的經純化之乳鐵蛋白可結合至除三價鐵離子外的金屬離子,包括(但不限於)銅、鋅、錳及/或鎵。經純化之乳鐵蛋白可結合至鋅離子。經純化之乳鐵蛋白可結合至Fe 2+離子。結合至除三價鐵離子外之金屬離子的經純化之乳鐵蛋白可為本文所描述之三價鐵結合型乳鐵蛋白的富鐵乳鐵蛋白或缺鐵乳鐵蛋白形式中之任一者,例如,本文所描述之富鐵乳鐵蛋白與缺鐵乳鐵蛋白形式之定義比率中之任一者。
乳鐵蛋白之構形狀態(例如富鐵乳鐵蛋白及缺鐵乳鐵蛋白構形)中的金屬離子(例如Fe 3+)可達成不同飽和度。舉例而言,缺鐵乳鐵蛋白中的鐵離子飽和度通常小於5%,而富鐵乳鐵蛋白中的飽和度通常為約100%。未加工乳製品中之牛乳鐵蛋白通常具有15-20%鐵飽和度。
控制富鐵乳鐵蛋白與缺鐵乳鐵蛋白形式之定義比率的方法為熟習此項技術者已知的。舉例而言,控制三價鐵離子、除三價鐵離子外之金屬離子及/或基於非三價鐵的鐵及/或鐵衍生之分子的濃度的方法為此項技術中已知的,諸如添加或移除(例如,如Majka等人[Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 405, 第5191-5200頁 (2013)]中所述,其以引用的方式併入本文中用於所有目的)。
評估經純化之乳鐵蛋白結合金屬離子之能力的方法為熟習此項技術者已知,諸如化學分析及/或吸收光譜法。舉例而言,不希望受理論束縛,處理製程(例如通常用於工業純化中之製程)及/或重組生產製程可改變乳鐵蛋白之金屬結合能力(例如經由鐵結合域的變性)。
評估富鐵乳鐵蛋白與缺鐵乳鐵蛋白形式之比率的方法為熟習此項技術者已知,諸如化學分析及/或吸光度光譜法(例如,如Majka等人[Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 405, 第5191-5200頁 (2013)]中所述,其以引用的方式併入本文中用於所有目的)。
在一非限制性實例中,差示掃描熱量測定(DSC)提供一種評估經純化之乳鐵蛋白結合金屬離子的能力及評估富鐵乳鐵蛋白與缺鐵乳鐵蛋白形式之比率的方法。DSC方法為熟習此項技術者已知。 乳製品純化
純化方法可減少、最小化或免除化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理。純化方法可減少化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理。純化方法可最小化化學處理、酶處理、酸處理、及/或熱處理。純化方法可免除化學處理、酶處理、酸處理及/或熱處理。純化方法可減少、最小化或免除化學處理。純化方法可減少、最小化或免除酶處理。純化方法可減少、最小化或除去酸處理。純化方法可減少、最小化或免除熱處理。純化方法可減少化學處理、酶處理、酸處理及熱處理中之各者。純化方法可最小化化學處理、酶處理、酸處理及熱處理中之各者。純化方法可免除化學處理、酶處理、酸處理及熱處理中之各者。純化方法可免除化學處理、酶處理及酸處理中之各者。純化方法可免除化學處理、酶處理及熱處理中之各者。
一般而言,本文所提供的用於產生經純化之乳鐵蛋白的方法不包括工業純化製程中典型的熱處理(例如巴氏滅菌),其可破壞天然構形狀態(例如變性),參考用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中發現的構形狀態。工業純化製程中所用之典型熱處理可為約63℃或更高。熱處理可為50℃或更高,51℃或更高,52℃或更高,53℃或更高,54℃或更高,或55℃或更高。熱處理可為70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高、85℃或更高、90℃或更高、95℃或更高或100℃或更高。純化方法可包括相對於工業純化製程中典型之熱處理,在減少、最小化或免除破壞天然構形狀態(參考用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中發現之構形狀態)的溫度下執行製程。純化方法可包括相對於工業純化製程中典型之熱處理,在減少、最小化或免除乳鐵蛋白生物活性的溫度下執行製程,該等生物活性參考用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中發現之生物活性。純化方法可包括在冷藏溫度下(例如在小於15℃之溫度下,諸如在2至15℃之間的溫度內)接收天然乳源。本文所描述之純化方法可包括小於50℃之熱處理。舉例而言,可在一或多個純化步驟期間使乳源升溫,例如升溫至高於37℃但不超過55℃之溫度。加熱可包括高於37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃之溫度。加熱可包括高於37℃之溫度及低於55℃之溫度。加熱可包括高於40℃之溫度及低於55℃之溫度。加熱可包括高於45℃之溫度及低於55℃之溫度。加熱可包括高於50℃之溫度及低於55℃之溫度。加熱可包括高於37℃的溫度且50℃或更低、51℃或更低、52℃或更低、53℃或更低、54℃或更低或55℃或更低之溫度。加熱可包括高於40℃的溫度且50℃或更低、51℃或更低、52℃或更低、53℃或更低、54℃或更低或55℃或更低之溫度。加熱可包括高於45℃的溫度且50℃或更低、51℃或更低、52℃或更低、53℃或更低、54℃或更低或55℃或更低之溫度。本文所描述之純化方法可包括50℃或更低、51℃或更低、52℃或更低、53℃或更低、54℃或更低或55℃或更低之熱處理。本文所描述之純化方法可包括在純化期間維持溫度低於50℃或更低、51℃或更低、52℃或更低、53℃或更低、54℃或更低或55℃或更低。在純化期間維持溫度可包括在整個純化中維持溫度。在純化期間維持溫度可包括在純化製程之一或多個個別步驟(例如層析、過濾及/或乾燥步驟)中維持溫度。所維持之溫度可包括純化製程之一或多個個別步驟所特有的不同溫度(例如不同溫度範圍)。
純化方法可包括酸處理。不希望受理論所束縛,酸處理可用於移除酪蛋白,諸如在純化乳鐵蛋白之前在能夠促使酪蛋白變得不溶於溶液的pH下處理天然乳源或衍生物。一般而言,本文提供之用於產生經純化之乳鐵蛋白的酸處理不包括破壞天然構形狀態(例如使乳鐵蛋白變性)及/或減少乳鐵蛋白生物活性(參考分別發現於用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中的構形狀態或生物活性)的酸處理。純化方法可包括4.0或更大之pH的酸處理。純化方法可包括3.0或更大之pH的酸處理。
純化方法可包括層析。純化方法可包括離子交換層析法。層析方法(諸如離子交換層析)為熟習此項技術者已知。本文所描述之純化方法將一般包括陽離子交換層析。除陽離子交換層析之外,純化方法亦可包括離子交換層析步驟(諸如陽離子及陰離子交換層析),包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。用於離子交換層析法之樹脂及基質為此項技術中已知的。舉例而言,陽離子交換樹脂包括(但不限於)聚甲基丙烯酸酯及瓊脂糖基質。純化方法可包括高壓液相層析(HPLC)。
層析方法一般而言包括一或多個平衡及/或再生步驟。平衡及再生步驟之說明性非限制性實例包括(1)用逆滲透水沖洗;(2)用化學純1 M NaCl沖洗;及(3)再次用逆滲透水沖洗。
層析方法一般而言包括負載步驟。一般而言,所負載體積係基於樹脂之預定結合容量及生乳原料之天然乳鐵蛋白含量估計。
層析方法一般而言包括一或多個溶離步驟,例如在離子交換層析中將經純化之乳鐵蛋白自樹脂/管柱溶離。溶離方法為熟習此項技術者已知。溶離方法可包括兩個或更多個溶離步驟。不希望受理論所束縛,多個溶離步驟可用於首先溶離出污染物(例如除乳鐵蛋白以外的任何其他產物)且接著溶離出所需產物(例如乳鐵蛋白)。
溶離方法可包括在不同鹽濃度下之兩個或更多個溶離步驟。不希望受理論所束縛,可進行一或多個初始溶離步驟(例如在含有所需經純化之乳鐵蛋白之溶離步驟之前的溶離步驟)以移除不合需要之蛋白質及其他污染物。
溶離方法可包括0.2 M-0.7 M之間的化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。一般而言,進行0.2 M-0.7 M之間的化學純NaCl溶液之第一溶離步驟以移除不合需要之蛋白質及其他污染物。不希望受理論所束縛,第一溶離可藉由監測污染物(諸如乳過氧化酶及生乳原料中原有之其他酶)之存在的UV-Vis光譜測定法及/或比色分析來監測完成。舉例而言,可進行0.2 M至0.7 M之化學純NaCl溶液之間的第一溶離步驟,直至UV-Vis光譜測定法偵測到自樹脂溶離之蛋白質缺乏為止。
溶離方法可包括0.2 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.25 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.30 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.35 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.40 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.45 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.50 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.55 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.6 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.65 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括0.7 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟。溶離方法可包括低於1 M之化學純NaCl溶液的第一溶離步驟。
溶離方法可包括1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。一般而言,使用1 M化學純NaCl溶液之溶離將使乳鐵蛋白自樹脂溶離。溶離方法可包括約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。
溶離方法可包括0.2 M-0.7 M之間的化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.2 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.25 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.3 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.35 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.40 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.45 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.50 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.55 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括小於1 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。
溶離方法可包括0.25 M-0.7 M之間的化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.20 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.25 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.30 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.35 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.40 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.45 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.50 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.55 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.60 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.65 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。溶離方法可包括0.70 M化學純NaCl溶液之第一溶離步驟及約1 M化學純NaCl溶液之第二溶離步驟。
溶離方法可包括在不同pH水準、溶離梯度下之兩個或更多個溶離步驟。溶離方法可包括在不同鹽濃度、不同pH水準以及其組合下之兩個或更多個溶離步驟。溶離方法可包括溶離梯度。溶離方法可包括鹽溶離梯度。溶離方法可包括pH溶離梯度。溶離方法可包括鹽及pH溶離梯度兩者。
對於上述離子交換層析步驟(例如平衡再生、負載及/或溶離)中之各者而言,熟習此項技術者將瞭解到適當流體速度,例如視樹脂、裝置、生乳原料等之選擇而定。
純化方法可包括過濾。過濾方法為熟習此項技術者已知。純化方法可包括微過濾(通常係指使用膜孔尺寸為0.1至10 µm之過濾)。微過濾可包括1-10 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括10 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括1-10 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括0.1-1 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括0.1 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括1 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括0.1、0.2、0.3、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及/或1 µm之膜孔尺寸。微過濾可包括陶瓷過濾器。
純化方法可包括超過濾(通常係指使用膜孔尺寸為0.01至0.1 µm之過濾)。亦可藉由分子量截斷尺寸來提及超過濾系統,該等分子量截斷尺寸經設計以供滲透物與保留物之間之基於尺寸的分離。超過濾系統可包括5-30 kDa系統。超過濾系統可包括5 kDa系統。超過濾系統可包括10 kDa系統。超過濾系統可包括15 kDa系統。超過濾系統可包括20 kDa系統。超過濾系統可包括25 kDa系統。超過濾系統可包括30 kDa系統。
純化方法可包括微過濾及超過濾兩者,包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。純化方法可包括多種微過濾及/或超過濾步驟,包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。作為說明性非限制性實例,可在離子交換層析之前使用第一預過濾微過濾步驟(例如用10 µm過濾器),可在離子交換層析之後使用第二微過濾步驟(例如用0.1-1.4 µm過濾器),隨後進行超過濾步驟(例如用5-30 kDa)。
純化方法可包括層析及過濾之組合,包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。純化方法可包括多種層析及/或過濾步驟之組合,包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。純化方法可包括微過濾、超過濾及離子交換層析之組合,包括以任何順序及/或作為一或多種額外純化製程分開執行。在一說明性非限制性實例中,純化方法可包括離子交換層析(包括溶離),接著微過濾且隨後超過濾。在另一說明性非限制性實例中,純化方法可包括微過濾,接著進行離子交換層析(包括溶離),隨後進行額外的微過濾,且接著進行超過濾。
純化方法可包括將生乳製品分離成乳製品衍生物,諸如將天然乳源分離成脫脂乳及乳油。舉例而言,生乳製品可在層析及/或過濾之前分離成乳製品衍生物。將生乳製品分離成乳製品衍生物的方法為熟習此項技術者已知,包括(但不限於)冷碗分離。
在乳鐵蛋白純化之後,可乾燥純化產物。一般而言,本文所提供的乾燥方法不包括可破壞天然構形狀態(例如使乳鐵蛋白變性)及/或減少乳鐵蛋白生物活性(參考分別發現於用於乳鐵蛋白純化之天然乳源中的構形狀態或生物活性)的處理。乾燥乳鐵蛋白之方法為熟習此項技術者已知,包括(但不限於)冷凍乾燥/凍乾、流體化床乾燥及/或低溫噴霧乾燥。 純度評估
天然乳源(包括牛乳)通常含有除乳鐵蛋白以外的若干蛋白質組分,包括但不限於乳過氧化酶、溶菌酶、酪蛋白、免疫球蛋白、乳白蛋白及乳球蛋白。天然乳源亦可含有其他組分,諸如脂肪及內毒素。一般而言,本文所提供之純化方法減少、最小化或除去除乳鐵蛋白以外之組分。不希望受理論所束縛,移除額外組分中之一或多者可改良乳鐵蛋白生物活性及/或改良安全性。
本文提供乳鐵蛋白組合物,相對於未加工之含乳鐵蛋白乳製品中存在的比率,該等乳鐵蛋白組合物中的乳鐵蛋白質量百分比增加。
可藉由質譜法評估乳鐵蛋白百分比,包括(但不限於)基質輔助雷射解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜法及/或線性阱四極桿軌道阱雙分壓阱質譜法。一般而言,藉由質譜法之評估包含量化對應於乳鐵蛋白之峰下面積及不對應於乳鐵蛋白之峰下面積。在一些情況下,乳鐵蛋白可與多個峰相關,諸如對應於乳鐵蛋白之電離峰。對應於乳鐵蛋白之峰可包括對應於轉譯後經修飾(例如糖基化)之全長乳鐵蛋白的峰。對應於轉譯後經修飾之全長乳鐵蛋白的峰一般在約80,000-86,000 m/z範圍內。轉譯後經修飾之全長乳鐵蛋白的準確峰可變化,諸如反映不同糖基化狀態。在一些情況下,為了有包容性,m/z在79000-90000之間的峰可視為對應於乳鐵蛋白。不對應於乳鐵蛋白之峰下面積包括全部其他峰,但約41,500 m/z (例如,m/z在41000-42000之間)之乳鐵蛋白相關電離峰可能除外。不對應於乳鐵蛋白之峰下面積可包括m/z在18000至80000之間的峰(除m/z在41000-42000之間的峰以外)。亦可在乳鐵蛋白與對應於乳過氧化酶之峰(例如m/z在77000與78000之間的峰)之間進行特定比較。不對應於乳鐵蛋白之峰下面積可包括m/z在18000-45000之間的峰(除m/z在41000-42000之間的峰以外)。線性阱四極桿軌道阱雙分壓阱質譜法亦可量化樣品中乳鐵蛋白相對於其他組分之百分比。舉例而言,四極桿軌道阱雙分壓阱質譜法可經由測定肽譜匹配(PSM)之百分比來量化乳鐵蛋白之百分比。
可藉由液相層析(諸如高效液相層析(HPLC))評估乳鐵蛋白百分比。藉由液相層析之評估可包括量化對應於乳鐵蛋白之峰下面積及不對應於乳鐵蛋白之峰下面積。
評估涉及峰量化時,不對應於未加工之含乳鐵蛋白乳製品中存在之乳鐵蛋白的一或多個峰下面積可低於經純化之乳鐵蛋白組合物的偵測極限。在一些情況下,不對應於乳鐵蛋白之各峰下面積可低於偵測極限。
可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)評估乳鐵蛋白百分比。在一些情況下,ELISA可區分天然蛋白質構形中乳鐵蛋白之百分比,諸如藉由使用特異性結合乳鐵蛋白之天然蛋白質構形的抗體。
純化乳鐵蛋白時欲減少、最小化或除去之通常存在於未加工乳源中的特定組分為乳過氧化酶。另外,乳過氧化酶常常以可偵測量存在於藉由典型工業方法生產之經純化之乳鐵蛋白組合物中。
本文提供乳鐵蛋白組合物,其中至少70%之組合物為經純化之乳鐵蛋白。組合物包括其中至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少75%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少80%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少85%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少90%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少95%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少約100%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少91%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少92%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少93%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少94%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少95%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少96%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少97%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少98%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。組合物包括其中至少99%組合物為經純化之乳鐵蛋白的彼等組合物。
本文提供乳鐵蛋白組合物,相對於未加工之含乳鐵蛋白乳製品中的比率,該等乳鐵蛋白組合物中的乳鐵蛋白:乳過氧化酶比率增加。乳鐵蛋白:乳過氧化酶比率可根據熟習此項技術者已知之方法評估,諸如本文所描述之純度評估方法(例如質譜法、HPLC及/或ELISA)。舉例而言,評估可包括量化對應於乳鐵蛋白之一或多個峰下面積及對應於乳過氧化酶之峰下面積。
可減少、最小化或除去存在於天然乳源中或潛在地存在於天然乳源中之內毒素。不希望受理論所束縛,移除內毒素可改良經純化之乳鐵蛋白組合物的安全性。評估內毒素含量之方法為熟習此項技術者所已知。
本文亦提供評估經純化之乳鐵蛋白組合物之純度的方法,諸如使用本文所描述之純度評估方法中之任一者。 醫藥組合物
本文提供醫藥組合物,其包含本文所描述之經純化之乳鐵蛋白組合物中之任一者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
如本文所用,「醫藥組合物」意欲涵蓋適合於投與個體(諸如哺乳動物,尤其人類)之組合物。一般而言,「醫藥組合物」為無菌的,且較佳不含能夠在個體體內引起不期望之反應的污染物((例如,醫藥組合物中之化合物為醫藥級)。醫藥組合物可經設計以經由多種不同投與途徑投與有需要之個體或患者,包括(但不限於)體表投與途徑,諸如皮膚(例如傷口)、黏膜、呼吸道、經口(包括胃腸道)及鼻調配物。
「醫藥學上可接受之賦形劑」、「醫藥學上可接受之稀釋劑」、「醫藥學上可接受之載劑」及「醫藥學上可接受之佐劑」意謂可用於製備醫藥組合物之賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑,其一般為安全、無毒且在生物學上或其他方面皆非不期望的,且包括獸醫用途以及人類醫藥用途可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑。如說明書及申請專利範圍中所使用之「醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑」包括一種及超過一種此類賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑。
對於醫藥應用,乳鐵蛋白可併入於經口可溶調配物中。此可包括(但不限於)經口可溶錠劑、口含錠、口嚼錠、口服薄膜或在賦形劑粉末中直接施用乳鐵蛋白。醫藥上可接受之賦形劑包括(但不限於)硬酯醯反丁烯二酸鈉、檸檬酸、木糖醇(Xylisorb XTAB 240)、山梨糖醇(Neosorb XTAB 200S或Neosorb P60 W)、甘露糖醇、麥芽糖醇(Sweetpearl P300 DC)及/或其他糖醇,包括其任何組合。不希望受理論束縛,經口可溶調配物可促使乳鐵蛋白保持在口及鼻咽中以用於乳鐵蛋白之局部靶向。可使用此項技術已知之技術製備經口可溶調配物,諸如流體化床乾燥或耦聯之任何其他乾燥技術以將產物壓製成最終劑型。口服調配物可包括生物黏合劑。可適用之生物黏合劑為熟習此項技術者已知,諸如Duan等人(Applications of Bioadhesives: A Mini Review; Front Bioeng Biotechnol. 2021; 9: 716035.)中所述之彼等生物黏合劑,該文獻以引用的方式併入本文中用於所有目的。口服調配物可包括收斂劑。可適用之收斂劑為熟習此項技術者已知,包括但不限於礬、阿拉伯膠、鼠尾草、西洋蓍草、北美金縷梅、月桂莓、蒸餾醋、柿子、綠茶、紅茶、檸檬酸、蔓越莓汁及/或萃取物、葡萄柚汁及/或萃取物或無機酸。
口服調配物可尤其適用於胃腸道應用。口服調配物(包括用於胃腸道應用之口服調配物)可包括微膠囊化乳鐵蛋白。口服調配物(包括用於胃腸道應用之口服調配物)可包括微膠囊化醫藥組合物,該等醫藥組合物包含本文所描述之任一種經純化之乳鐵蛋白組合物,包括腸溶包衣調配物。口服調配物(包括用於胃腸道應用之口服調配物)可包括微膠囊化(例如腸溶包衣多成分調配物)醫藥組合物,該等醫藥組合物包含本文所描述之任一種經純化之乳鐵蛋白組合物與一或多種其他活性劑之組合。微膠囊化形式為熟習此項技術者已知,諸如Singh等人(Microencapsulation: A promising technique for controlled drug delivery; Res Pharm Sci. 2010年7月-12月; 5(2): 65–77.)所述之彼等形式,該文獻以引用的方式併入本文中用於所有目的。
對於針對傷口癒合之醫藥應用,乳鐵蛋白可併入促使乳鐵蛋白與傷口接觸之調配物中。傷口可為個體組織之任何損傷。損傷包括(但不限於)燒傷(例如,火/熱、化學、電、輻射[諸如紫外輻射或放射性輻射]、摩擦等)、割傷(例如,穿刺、裂傷、擦傷、切口[諸如手術切口]、切除等)、感染及潰瘍。傷口可包括開放性傷口。傷口可包括潰瘍,諸如靜脈或動脈潰瘍。多種形式損傷可同時存在。舉例而言,作為例示性非限制性實例,損傷可包括共同存在的燒傷與感染,或共同存在的割傷與感染。組織包括(但不限於)皮膚及肺組織。多種組織之損傷可同時存在。舉例而言,作為說明性非限制性實例,損傷可包括皮膚及肺組織兩者之損傷。促進乳鐵蛋白與傷口接觸之調配物可包括生物黏合劑。可適用之生物黏合劑為熟習此項技術者已知,諸如本文所描述之彼等生物黏合劑。傷口癒合型調配物之遞送形式包括(但不限於)止血膠棉、水凝膠、輸注繃帶、散劑、噴霧劑及吸入形式(例如噴霧器、吸入器及霧化形式)。
對於針對促進抗微生物用途之醫藥應用,乳鐵蛋白可併入促進乳鐵蛋白之抗微生物活性的調配物中。抗微生物用途可包括治療活動性感染。抗微生物用途可包括防治性預防及/或治療感染。舉例而言,防治性預防及/或治療感染可包括在感染產生之前施用至傷口。
調配物及/或遞送形式可促進乳鐵蛋白之多種用途及/或特性。作為非限制性說明性實例,調配物可促進乳鐵蛋白之傷口癒合與抗微生物特性,諸如可促進細胞生長且預防微生物生物膜形成之調配物或遞送形式。
乳鐵蛋白亦可併入通常視為食品之調配物中,以用於此等產品(稱作「醫療食品」)之藥物治療目的。此等應用包括併入口嚼錠或其他咀嚼產品中以用於乳鐵蛋白之緩慢釋放。醫療食品調配物(諸如口嚼錠)可包括賦形劑,諸如木糖醇、粉糖、膠基、山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖素及/或玉米糖漿,包括任何組合。對於口嚼錠而言,乳鐵蛋白可併入整個口嚼錠中或作為口嚼錠外部之塗層。醫療食品調配物可使用此項技術已知之技術製備,諸如流體化床乾燥或任何其他乾燥技術及最終使用膠基製備以形成最終劑型。
調配物可包括硬酯醯反丁烯二酸鈉、卡波姆、氫氧化鈉、甘油、苯甲酸鈉、苯甲酸、檸檬酸及/或其組合。調配物可包括木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、糖醇、蔗糖素及/或其組合。調配物可包括異麥芽酮糖醇、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或其組合。調配物可包括粉糖、膠基、玉米糖漿、阿拉伯膠及/或其組合。調配物可包括HiG PWD-04、囊封粉狀調味劑、無水或天然咖啡鹼、囊封蔗糖素或蔗糖素、囊封乙醯磺胺酸鉀及阿斯巴甜、阿斯巴甜、乙醯磺胺酸鉀、三乙酸甘油酯、二氧化矽及/或其組合。
調配物可包括凝聚劑,包括(但不限於)凝血酶、支鏈澱粉、高嶺土及/或其組合。
醫藥組合物(包括經口可溶調配物及醫療食品)可具有最佳化pH以最大化蛋白質之穩定性及活性。劑型(包括使用所選賦形劑)可有助於提高蛋白質之生物可用性、穩定性及/或生物活性。 治療及風險預防/降低方法
本文提供治療疾病或病狀的方法,其經由投與治療有效量之本文所描述之任何醫藥組合物來達成,諸如為了遞送至口腔、鼻腔或其他組織(例如,皮膚或肺組織)而調配的任一種醫藥組合物。疾病或病狀包括(但不限於)病原性疾病、胃腸道(GI)感染、傷口感染、過敏及發炎病狀。
本文亦提供經由投與治療有效量之本文所描述之任一種經純化之乳鐵蛋白組合物來調節免疫反應(例如促進消炎活性)的方法,包括投與本文所描述之任一種醫藥組合物。術語「調節」涵蓋生物活性之維持、生物活性之抑制(部分或完全)及生物活性之刺激/活化(部分或完全)。該術語亦涵蓋降低或增加(例如增強)生物活性。舉例而言,投與治療有效量之經純化之乳鐵蛋白可經由促進消炎活性(例如在發炎疾病之情況下)來減少發炎。
如本文所用,術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理學效應,諸如預防、風險降低、改善及/或消退感染,諸如病毒、真菌(例如酵母菌)或細菌感染。就完全或部分預防疾病或其症狀而言,治療可為防治性治療,及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言,治療可為治療性的。治療涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何治療,且包括:(a)防治性治療(完全或部分預防)可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病的個體(例如處於感染風險下之個體中)發生的疾病或疾病症狀;(b)抑制該疾病(例如消除感染及/或使其降低至低於可偵測界限);及(c)緩解疾病(例如,降低與感染相關之微生物負載)。
本文亦提供用於降低病原性疾病風險之方法,該方法包含向個體投與本文所描述之任一種醫藥組合物或組合物。舉例而言,降低病原性疾病之風險可包括(但不限於)將本文所描述之醫藥組合物或組合物投與處於病原體感染之風險下的傷口。處於病原性疾病風險下之個體可能已暴露於病原體。處於病原性疾病風險下之個體可能已診斷患有病原體感染。
「治療有效量」或「有效量」意謂當投與哺乳動物或其他個體以治療疾病、病狀或病症時,足以對疾病、病狀或病症實現此類治療的化合物之量。「治療有效量」將視化合物、疾病及其嚴重程度及待治療之個體之年齡、體重等而變化。
本發明化合物可單獨或與額外活性劑組合投與個體。術語「藥劑」、「化合物」及「藥物」在本文中可互換使用。該方法可進一步包括同時或依次共投與第二藥劑,例如小分子、抗體、抗體片段、抗體-藥物結合物、適體、蛋白質、抗生素、抗病毒劑、抗微生物劑、抗細菌劑、抗真菌劑及/或疫苗。在一些實施例中,該方法進一步包括對個體執行放射療法。
術語「共投與」及「組合」包含同時、並行或依序而無特定時間限制地投與兩種或更多種治療劑。在一個實施例中,藥劑同時存在於細胞中或個體體內,或同時發揮其生物或治療性效果。在一個實施例中,治療劑存在於同一組合物或單位劑型中。在其他實施例中,治療劑存在於各別組合物或單位劑型中。如本文所用之術語「單位劑型」係指適合作為人類及動物個體之單位劑量的實體不連續單元,各單元含有預定量的化合物(例如如本文所描述之胺基嘧啶化合物)以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或媒劑,該預定量經計算為足以產生所需作用的量。單位劑型之規格視所用特定化合物及欲達成之作用及與宿主中之與各種化合物相關的藥效動力學而定。在某些情況下,相對於單獨的任一組分,該組合提供增強的作用;在一些情況下,相對於該等組分之組合或累加效應,該組合提供超累加或協同效應。對於多次劑量而言,兩種藥劑可直接交替給與,或一種藥劑之兩次或更多次劑量可例如與另一藥劑的單次劑量交替給與。
本文亦提供一種治療病原性疾病之方法。該方法可以包括向個體投與醫藥組合物,諸如本文所描述之任一種醫藥組合物(例如,為了遞送至口腔或鼻腔而調配的任一種醫藥組合物)。投與可為防治性的。個體可處於暴露於病原體之風險下。舉例而言,降低暴露於病原體之風險的方法可包括(但不限於)向處於病原體感染之風險下的傷口投與。個體可能已暴露於病原體。個體可能已診斷患有病原體感染。
病原體包括(但不限於)經口及/或經鼻傳播之微生物。病原體包括(但不限於)經空氣傳播之微生物。病原體包括(但不限於)病毒,諸如冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)。病原體包括(但不限於)細菌及/或真菌(例如酵母菌)。
本文亦提供促進傷口癒合之方法(例如,經由促進消炎活性、促進細胞生長及/或預防感染),其經由投與治療有效量之本文所描述之任一種經純化的乳鐵蛋白組合物來達成,包括投與本文所描述之任何醫藥組合物。 製造方法
本文提供本文所描述之任一種經純化之乳鐵蛋白組合物的方法,包括本文所描述之任一種醫藥組合物。方法包括「乳製品純化」章節中所描述之任一純化步驟,包括其中所描述之步驟的組合。說明性非限制性實例描述於本文中之實例章節中。 實例
下文為執行本發明之特定實施例之實例。該等實例僅出於說明性目的而提供,且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已儘力確保關於所用數字(例如量、溫度等)之準確性,但當然應該允許一些實驗誤差及偏差。
除非另外指明,否則本發明將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、DNA重組技術及藥理學習知方法實施。該等技術在文獻中有完整解釋。參見例如T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman及Company, 1993);A.L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc., 現行版);Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第二版, 1989); Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey及Sundberg Advanced Organic Chemistry 第三版(Plenum Press) A及B卷(1992) 實例1. 乳鐵蛋白純化
1中所示純化乳鐵蛋白。簡言之,使生乳(未處理乳,例如在純化乳鐵蛋白之前未經化學、酶、酸或熱處理)(1)在進入工業標準乳加工工作流程中之前分流;(2)流經離子交換樹脂/管柱,其中流出物通常返回至標準乳加工工作流程,且收集含乳鐵蛋白溶離液;(3)過濾所收集之溶離液;及(4)加工經純化之乳鐵蛋白。值得注意地,所有其他已知乳鐵蛋白純化製程以工業標準乳加工工作流程之後獲得的乳源開始,該工作流程通常包括巴氏熱滅菌。另外,未加工之天然乳製品(例如生乳)用作源材料,因此,相比於以重組方式產生之乳鐵蛋白,乳鐵蛋白包括可能涉及生物活性的相關轉譯後修飾。
使用層析管柱分離及純化牛乳鐵蛋白以保留其天然轉譯後修飾、糖基化及結合鐵。管柱負載有所選陽離子交換樹脂、聚甲基丙烯酸酯或瓊脂糖基質,且藉由(1)用逆滲透水沖洗;(2)用化學純1 M NaCl沖洗;及(3)再次用逆滲透水沖洗來平衡及再生。
在分離、脫脂、加熱及/或巴氏滅菌之前,自乳製品運輸或倉儲容器直接獲得未處理、未加工的生全牛乳(從擠奶計小於24小時)。自生初乳(RC)與生全乳(RM)純化乳鐵蛋白。
用10 µm過濾器從乳中過濾出大顆粒,且升溫至高於37℃且在低於63℃之溫度下(通常視為巴氏滅菌之起始溫度)保持且負載至層析管柱中。負載之體積係基於預定結合容量及生乳原料之天然乳鐵蛋白含量的估計。在負載製程期間,所有流過物返回至巴氏滅菌平衡槽以使原料返回至工廠,隨後分離及巴氏滅菌。
一旦負載完成,即用逆滲透水沖洗樹脂以移除尚未結合至樹脂之任何剩餘的乳化合物。第1次溶離包括用化學純NaCl溶液(0.2-0.7 M)洗滌樹脂且藉由監測污染物(諸如生乳原料原有的乳過氧化酶及其他酶類)存在的UV-Vis光譜測定法及比色分析來監測且評估其完成(亦即,自樹脂溶離之蛋白質缺乏)。詳言之,執行第1次NaCl溶離直至溶離份中不再存在乳過氧化酶(一般為主要污染物),如藉由過氧化酶比色分析使用比色過氧化酶基質所評估。第1次溶離之溶離份保留在分離容器中。接著用逆滲透水沖洗樹脂。第2次溶離用1 M NaCl進行以移除經分離之乳鐵蛋白。第2次溶離之溶離份保留於分離容器中,且隨後(1)經陶瓷微過濾過濾器(0.1-1.4 µm)過濾;且(2)使用超過濾系統(5-30 kDa)濃縮。
脫鹽的溶離份隨後不僅凍乾,而且可直接送入流體化床乾燥器中以在醫藥級賦形劑上乾燥。根據本文中所描述之方法製備之經純化之乳鐵蛋白稱為:Hyacinth乳鐵蛋白(「Hyacinth」);乳鐵蛋白(單獨且無伴隨詞語「實驗室級」或「市售補充劑級」;ODT-SC210;及API-E2。各種名稱可指根據本文所描述之各種方法產生的經純化之乳鐵蛋白。 實例2. 乳鐵蛋白純度評估
評估根據 實例 1產生之經純化之乳鐵蛋白的純度。
通常,SDS-PAGE凝膠用於評估參考級蛋白質衍生產物之純度,包括參考級乳鐵蛋白。然而,SDS-PAGE凝膠因產生放大的純度結果(此視實驗條件而定)而名聲不佳(Kurien及Scofield Methods Mol Biol. 2012; 869: 633-640)。因此,使用質譜法、HPLC及ELISA之更敏感方法評估純度。
藉由MALDI-TOF質譜法評估乳鐵蛋白純度。將乾燥樣品以10 mg/mL之濃度溶解於水中。將溶解的樣品與等體積的飽和芥子酸混合在含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈中。將樣品/基質混合物(2 µL)置於M1P 384磨光的MALDI鋼盤上。在陽離子模式中、在m/z 2001-20162 Da (2-20 kDa)、10039-40026 Da (10-40 kDa)及19780-100000 Da (20 kDa-100 kDa)下獲得MALDI質譜。使用蛋白質校準標準II (Bruker)在此等質量範圍內校準儀器。使用F1exAnalysis 3.4 (Bruker Daltonics, Billerica, MA)分析MS光譜。
2A 2B展示根據 實例 1自兩種不同天然生乳源(初乳及全乳)純化之乳鐵蛋白的純度結果,如由MALDI-TOF (約18k Da-100 kDa)所評估,且分別在 1A 1B中量化。高於約80,000 m/z之主峰對應於糖基化乳鐵蛋白,而位於約41,500 m/z處之峰對應於乳鐵蛋白之電離峰。值得注意地,與乳過氧化酶相關之典型污染峰(約78,000 m/z)低於偵測極限。質譜法特徵曲線之量化揭露,針對18 kDa-100 kDa範圍內之定量峰所測定之大於75%的相對曲線下面積(AUC)對應於80-85 kDa之間的所需糖基化乳鐵蛋白峰,且當包括約41,500 m/z處之電離峰(選用於量化之峰,換言之,被認為高於背景雜訊之真實峰,藉由F1exAnalysis 3.4所測定)時,將近100%對應於乳鐵蛋白。因此,結果表明本文所描述之純化方法自多種天然生乳製品產生高純度乳鐵蛋白。 1A - MALDI-TOF 之量化 ( 生初乳 )
m/z S/N 強度 面積 相對峰面積 (%)
41651.98 11 1344 1.53x10 6 22.95
83033.27 20 2266 5.14x10 6 77.05
1B - MALDI-TOF 之量化 ( 生全乳 )
m/z S/N 強度 面積 相對峰面積 (%)
41734.817 9 374 4.17x10 5 16.95
83202.581 22 882 2.04x10 6 83.05
亦如上藉由MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)評估非處方(OTC)乳鐵蛋白補充劑[Jarrow配方] ( 3A)及作為實驗室試劑級產品[Sigma牛初乳乳鐵蛋白]登廣告之乳鐵蛋白來源( 3B 3C)的純度,且分別量化在 2A 2B 2C中。相比於根據 實例 1產生之乳鐵蛋白,質譜法特徵曲線揭露OTC補充劑及實驗室試劑級乳鐵蛋白來源之污染峰(尤其是乳過氧化酶) (參見 3B在77806 m/z之峰)。質譜法特徵曲線之量化揭露,針對18 kDa-100 kDa範圍內之定量峰所測定之相對AUC中分別僅有25.3%、52.3%及11.9%對應於80-85kDa 之間的所需糖基化乳鐵蛋白峰。即使考慮到約41,500 m/z處之乳鐵蛋白電離峰,組合的相對AUC中分別僅有33.5%、66.4%及15.9%對應於乳鐵蛋白。因此,結果表明本文所描述之純化方法產生的乳鐵蛋白純度高於可用OTC補充劑及實驗室試劑級乳鐵蛋白來源。 2A - MALDI-TOF OTC 補充劑的量化 ( 3A)
m/z S/N 強度 面積 相對峰面積 (%)
20345.22 12 2229 452079 2.2
20708.48 6 1107 203598 1.0
22599.98 16 2835 2.30E+06 11.4
22607.87 16 2835 2.30E+06 11.4
22610.23 16 2835 2.30E+06 11.4
22612.58 16 2835 2.30E+06 11.4
25330.59 10 1717 2.10E+06 10.5
33454.51 5 830 462461 2.3
38691.72 4 579 372891 1.9
41819.75 10 1559 l.65E+06 8.2
49570 4 593 583820 2.9
83412.65 17 2204 5.08E+06 25.3
2B - MALDI-TOF 市售試劑#1 的量化 ( 3B )
m/z S/N 面積 相對峰面積 (%)
19287 16 1.05E+06 4.6
20664 9 948774 4.1
26702 4 381374 1.6
27849 9 878698 3.8
33513 12 1.64E+06 7.1
38663 5 1.13E+06 4.9
41652 16 3.27E+06 14.1
46357 3 453094 2.0
77806 5 1.27E+06 5.5
83027 37 1.21E+07 52.3
2C - MALDI-TOF 市售試劑 #2 的量化 ( 3C)
m/z S/N 面積 相對峰面積 (%)
18235 4 270406 0.7
19561 21 3.52E+06 9.6
21103 53 6.43E+06 17.6
22602 31 7.13E+06 19.5
23855 99 1.16E+07 31.6
32405 3 747098 2.0
33527 3 471200 1.3
34932 3 641140 1.8
41777 5 1.45E+06 4.0
83110 10 4.37E+06 11.9
亦藉由線性阱四極桿軌道阱雙分壓阱質譜法評估乳鐵蛋白純度。如 4所示且在 3A中量化,根據 實例 1產生之乳鐵蛋白的軌道阱雙分壓阱質譜法特徵曲線揭露大於80%之所鑑別肽譜匹配(PSM)對應於所需乳鐵蛋白。相比之下,如 3B中所示,OTC補充劑之線性阱軌道阱雙分壓阱質譜法特徵曲線揭露僅約62%之所鑑別PSM對應於乳鐵蛋白。值得注意地,約11%之所鑑別PSM對應於主要污染物乳過氧化酶。因此,結果表明本文所描述之純化方法產生高純度的乳鐵蛋白且純度高於其他可供使用的乳鐵蛋白來源。 3A - 線性阱 / 軌道阱 ( Velos/Orbitrap ) 之量化 ( 4)
蛋白質 覆蓋度 % # PSM 總計 %
乳運鐵蛋白OS=家牛OX=9913 GN=LTF PE=1 SV=2 71 517 82.19
補體因子B OS=家牛OX=9913 GN=CFB PE=1 SV=2 33 25 3.97
殼質酶-3-樣蛋白質1 OS=家牛OX=9913 GN=CHI3L1 PE=1 SV=3 46 24 3.82
β-1,4-半乳糖基轉移酶1 OS=家牛OX=9913 GN=B4GALT1 PE=1 SV=3 33 19 3.02
血清轉鐵蛋白OS=家牛OX=9913 GN=TF PE=2 SV=1 5 18 2.86
聚合免疫球蛋白受體OS=家牛OX=9913 GN=PIGR PE=2 SV=1 22 14 2.23
β-2-微球蛋白OS=家牛OX=9913 GN=B2M PE=1 SV=2 49 12 1.91
3B - 線性阱 / 軌道阱對 OTC 補充劑之量化
蛋白質 覆蓋度 % # PSM 總計 %
乳運鐵蛋白OS=家牛OX=9913 GN=LTF PE=1 SV=2 78 693 61.93
乳過氧化酶OS=家牛OX=9913 GN=LPO PE=1 SV=1 50 121 10.81
血清轉鐵蛋白OS=家牛OX=9913 GN=TF PE=2 SV=1 52 69 6.17
葉酸受體α OS=家牛OX=9913 GN=FOLR1 PE=1 SV=3 49 38 3.40
β-乳球蛋白OS=家牛OX=9913 GN=LGB PE=1 SV=3 47 25 2.23
血管生成素1 OS=家牛OX=9913 GN=ANG1 PE=1 SV=4 37 21 1.88
胱抑素OS=家牛OX=9913 GN=CST3 PE=1 SV=2 45 19 1.70
白蛋白OS=家牛OX=9913 GN=ALB PE=1 SV=4 29 19 1.70
補體因子H OS=家牛OX=9913 GN=CFH PE=1 SV=3 24 19 1.70
黃嘌呤去氫酶/氧化酶OS=家牛OX=9913 GN=XDH PE=1 SV=4 18 18 1.61
蛋白質S100-A9 OS=家牛OX=9913 GN=S100A9 PE=1 SV=3 34 16 1.43
糖基化依賴性細胞黏附分子1 OS=家牛OX=9913 GN=GLYCAM1 PE=1 SV=2 22 15 1.34
核糖核酸酶胰臟OS=家牛OX=9913 GN=RNASE1 PE=1 SV=1 55 13 1.16
脂多糖結合蛋白OS=家牛OX=9913 GN=LBP PE=2 SV=1 26 13 1.16
蛋白質S100-A12 OS=家牛OX=9913 GN=S100A12 PE=1 SV=3 53 10 0.89
纖維母細胞生長因子結合蛋白1 OS=家牛OX=9913 GN=FGFBP1 PE=1 SV=1 23 10 0.89
亦藉由ELISA評估乳鐵蛋白純度。如 5所示,當負載按重量計相同量之蛋白質時,相對於現有研究標準,根據 實例 1產生之乳鐵蛋白(「Hyacinth」)在抗體結合方面展現30%增加。因此,資料證明,相對於其他研究級參考產品,Hyacinth蛋白質純化之蛋白質(API-E2)使天然構形蛋白質狀態達成更大純度及/或保持更大分數。
藉由HPLC、使用Thermo Fisher U3000蛋白質純化系統以及使用NaCl梯度、裝填有Cytiva BigBeads之Tricorn 5/150管柱評估乳鐵蛋白純度。如 5B所示,藉由HPLC加工之API-E2證實對應於乳鐵蛋白之單峰,指示約100%純度。
資料證明相對於現有可用試劑, 實例 1之純化方法獲得更大純度之乳鐵蛋白,尤其是其減少乳過氧化酶所致之污染的能力。 實例3. 根據細胞外基質締合評估乳鐵蛋白活性
出現感染需要病毒進展之多步過程。首先,一旦病毒藉由結合至宿主細胞外基質(ECM)中之硫酸乙醯肝素(HS)蛋白多糖而進入宿主,則其靶向細胞,促進病毒粒子結合至其在細胞表面上的特異性受體。隨後,病毒在宿主細胞內部內化且複製。雖然抗病毒藥物通常聚焦於抑制關鍵病毒複製蛋白或細胞表面上之特定受體,但結合ECM中之HS的非特異性細胞靶向機制亦可受到抑制,干擾或防止病毒結合至靶細胞。由於此路徑為相對非特異性的且需要包覆暴露細胞之ECM,因此利用此方法之傳統治療劑通常必須以相對較高的局部濃度給與以便達成最大功效且一般受雜質及/或毒性影響。因此,具有較大純度(例如符合醫藥級標準)之乳鐵蛋白製劑將提供顯著減少之劑量。另外,相對於乳鐵蛋白在生乳中之活性,以保持天然功能(例如保持天然構形、轉譯後修飾、鐵結合能力等)之方式製備將保持乳鐵蛋白之功效。此等製劑(例如如實例1中製備)允許乳鐵蛋白以比其他乳鐵蛋白產品更大的能力來使用、儲存、調配及/或遞送。
為評估乳鐵蛋白之生物活性,尤其是其作為抗病毒劑之潛力,評估與ECM之結合。根據 實例 1產生經純化之乳鐵蛋白。使Caco-2細胞(人源細胞培養物)在接種蓋玻片之後生長三天,使得細胞可增殖,且ECM可充分發展。經純化之乳鐵蛋白隨後在37℃下以不同濃度添加至細胞中維持兩小時以允許其按理論結合。為了直接觀測API之定位,吾等使用免疫螢光(IF)成像且將API與E鈣黏素(細胞膜標誌物)均染色。
6所示,隨著濃度增加,觀測到經純化之乳鐵蛋白在ECM處增濃。亦在低濃度下觀測到內部初始定位,但鑒於乳鐵蛋白具有已知細胞內作用且受體允許其攝取,因此預期乳鐵蛋白部分地定位於細胞內空間。為量化API之定位,量測恰好在E鈣黏素標記外部/沿著E鈣黏素標記以及細胞內部之螢光信號的絕對強度。如 7所示,對乳鐵蛋白定位之量化證實隨著濃度增加,在ECM處增濃。結果指示經純化之乳鐵蛋白展現與ECM結合之生物活性。
接著根據標準方案培養初代口頰細胞(參見例如Russo等人 Cytotechnology. 2016年10月; 68(5): 2105-2114;該文獻以引用的方式併入本文中用於所有目的)。對於API-E2乳鐵蛋白及市售實驗室級標準物而言,乳鐵蛋白在培養基中以100 μg/mL之最終濃度在37℃下添加1小時,大致在先前已發現API-E2乳鐵蛋白開始使所培養細胞之結合飽和的濃度下添加。如先前描述進行免疫螢光成像。如 8所示, API-E2乳鐵蛋白在此等條件下顯示沿著口頰細胞之ECM的強結合(頂列)。然而,市售實驗室級標準物在相同條件(底部列)下顯示乳鐵蛋白對ECM的締合有限。結果強有力地表明,就關鍵宿主細胞ECM締合而言,API-E2乳鐵蛋白更強及生物活性更大,此為蛋白質抗病毒活性及生物膜緩和抗生素活性所必需的。 實例4. SARS-CoV-2抗病毒活性
進行細胞病變效應(CPE)降低分析以評估經純化之乳鐵蛋白針對SARS-CoV-2的抗病毒活性。
將Vero E6細胞以80-100%匯合細胞密度接種於96孔細胞培養盤中。在37℃下以1 mg/mL之濃度開始,將細胞與SC210之3倍連續稀釋液一起培育2小時。隨後,用模擬物感染細胞(對化合物之細胞毒性的分析)或以0.001的MOI、在總容積為150 µl的培養基中用根據 實例 1產生之經純化之乳鐵蛋白、試劑級乳鐵蛋白或瑞德西韋(Remdesivir)感染細胞。在感染後三天如下評估細胞存活率:用中性紅色染料染色細胞兩小時,在50:50 Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇中萃取染料30分鐘,且在OD 540 nm下讀出光學密度以測定EC50 (50%有效抗病毒濃度)。如 9所示且在 4中量化,經純化之乳鐵蛋白抑制病毒生長,包括在濃度比類似研究級參考產物更低的情況下。結果證實根據 實例 1產生之經純化之乳鐵蛋白對SARS-CoV-2病毒感染的抑制比試劑級更佳,表明生物活性及/或純度增強。 4 - SARS-CoV-2 EC50
化合物 EC50 (µM)
乳鐵蛋白(「Hyacinth」) 0.09
乳鐵蛋白(「試劑」) 0.14
瑞德西韋 4.5
實例5. 藉由差示掃描熱量測定評估乳鐵蛋白生物活性
乳鐵蛋白具有與其抗微生物活性相關之多種關鍵生物活性,包括鐵螯合及宿主細胞結合之重要活性。天然地,乳鐵蛋白具有鐵結合形式(富鐵乳鐵蛋白)與無鐵形式(缺鐵乳鐵蛋白)。鑒於乳鐵蛋白強力結合至鐵,因此不希望受理論束縛,富鐵乳鐵蛋白應比缺鐵乳鐵蛋白實質上更穩定。
根據熟習此項技術者已知的標準DSC方案(參見例如Hinz等人「MEASUREMENT AND ANALYSIS OF RESULTSOBTAINED ON BIOLOGICAL SUBSTANCES WITH DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY」;其以引用的方式併入本文中用於所有目的),使用nanoDSC (TA Instruments, Lindon, UT),使用差示掃描熱量測定(DSC),經由監測乳鐵蛋白樣品之展開溫度來評估富鐵乳鐵蛋白及缺鐵乳鐵蛋白形式。
如本文所描述產生之API-E2乳鐵蛋白(10 mg/mL)藉由DSC評估。如 10(實線)所示,API-E2乳鐵蛋白展現兩個峰:左側的較大峰對應於缺鐵乳鐵蛋白,而較小峰對應於富鐵乳鐵蛋白。缺乏其他峰指示缺乏污染物及雜質且可評估API E2為約100%。結果指示鐵穩定化乳鐵蛋白的存在導致在DSC分析中轉變至較高變性溫度。因此,DSC分析展現區分既定樣品中之缺鐵乳鐵蛋白及富鐵乳鐵蛋白形式的能力。另外,缺乏其他峰亦指示API-E2乳鐵蛋白之純度。API-E2缺鐵乳鐵蛋白峰之Tm為60.2 +/- 0.8 C且ΔH為466.1 +/- 9.2 kJ/mol。API-E2富鐵乳鐵蛋白峰之Tm為88.38 +/- 0.8 C且ΔH為632.7 +/- 7.2 kJ/mol。富鐵乳鐵蛋白天然地占總API-E2乳鐵蛋白之8.74 +/- 1.39%,其中缺鐵乳鐵蛋白占測試樣品中之其餘部分。然而,富鐵乳鐵蛋白百分比可為天然可變的。API-E2經此技術計算含有幾乎100%純度之乳鐵蛋白。 5. DSC 鐵結合特性的量化
   缺鐵乳鐵蛋白 富鐵乳鐵蛋白
Tm 60.2 +/- 0.8 C 88.38 +/- 0.8 C
ΔH 466.1 +/- 9.2 kJ/mol 632.7 +/- 7.2 kJ/mol
總計% 91.26 +/- 1.39% 8.74 +/- 1.39%
亦對經熱處理之API-E2乳鐵蛋白進行分析。API-E2乳鐵蛋白在50-100℃範圍內加熱。值得注意地,DSC分析中所用之熱量範圍與工業中在純化乳鐵蛋白之前通常所用之溫度(例如大於63℃)相當。如 10(虛線)所示,經熱處理之API-E2乳鐵蛋白展現兩個可偵測峰之缺失,指示缺鐵乳鐵蛋白及富鐵乳鐵蛋白形式均在熱處理之後完全變性。
進一步使用DSC分析來評估乳鐵蛋白生物活性,特定言之,API-E2乳鐵蛋白之鐵結合能力。以1000倍莫耳過量向API-E2乳鐵蛋白中添加氯化鐵(FeCl3)。在過量鐵存在下,API-E2乳鐵蛋白使鐵結合至其開放的鐵結合位點。若API-E2已經由製備保持其生物活性,則預期全部缺鐵乳鐵蛋白轉變成更穩定之富鐵乳鐵蛋白形式,如根據其對應DSC峰的存在所測定。如 11A所示, API-E2乳鐵蛋白在過量鐵不存在的情況下展現兩個峰:左側的較大峰對應於缺鐵乳鐵蛋白,而右側的較小峰對應於富鐵乳鐵蛋白。在添加過量鐵後,100%可用的缺鐵乳鐵蛋白轉變成富鐵乳鐵蛋白形式,如目前觀測到的乳鐵蛋白單峰(右峰)及偵測不到的缺鐵乳鐵蛋白峰所證實。結果指示使用本文所描述之方法產生的API-E2乳鐵蛋白完全保留了鐵結合生物活性。
亦藉由DSC在用於評估以上API-E2之條件下評估實驗室級標準乳鐵蛋白及市售補充劑級乳鐵蛋白。如 11B所示,實驗室級標準乳鐵蛋白峰顯著小於針對API-E2觀測到且不太明確之彼等峰,以及含有歸因於雜質之1個額外峰。曲線具有非特異性上升斜率,如通常在樣品中高度存在變性蛋白質之產物中所觀測到。缺鐵乳鐵蛋白與富鐵乳鐵蛋白峰比率估計值就此結果而言幾乎相等,指示在加工期間引起缺鐵乳鐵蛋白損失。同樣,缺鐵乳鐵蛋白與富鐵乳鐵蛋白峰均在低溫下變性(分別為55及85℃),證明不穩定程度由於先前化學、酶及/或熱處理而較高且失去鐵結合能力。亦如 11B中所示,市售補充劑級乳鐵蛋白(底線)未展現可偵測之峰,指示產物完全變性或不存在乳鐵蛋白分子。 實例6. 藉由pH測試評估乳鐵蛋白對唾液細菌之生物活性
唾液細菌(包括乳桿菌屬、乳球菌屬及變形鏈球菌)在生長期間產生酸。此酸化很大程度上與齲齒相關,尤其當其產生低於5.5之pH時,此為臨床上相關臨限值。此等細菌之漿液用蔗糖處理以刺激生長以及改變API-E2乳鐵蛋白之濃度。在添加蔗糖及API-E2乳鐵蛋白之後,經由滴定法將pH調節至7且隨後在接下來的6小時期間監測pH變化。
12所示,在不處理API-E2乳鐵蛋白之情況下且在蔗糖存在下,唾液細菌產生酸,使得pH在4小時內降低至低於5.5。然而,在蔗糖存在下,在使用1 mg/ml或10 mg/mL API-E2乳鐵蛋白的情況下,pH在5.5以上保持整個6小時測試期。結果指示API-E2的存在使得細菌酸產生以濃度依賴性方式減少,指示API-E2乳鐵蛋白之抗微生物生物活性。 實例7. 藉由家禽表面處理來評估乳鐵蛋白生物活性
如所上文描述,在pH測試中,用存在於漿液中的唾液人類細菌(包括乳桿菌屬、乳球菌屬、變形鏈球菌及牙齦卟啉單胞菌)接種雞胸肉,且在37℃下靜置6天。
13所示,在無處理之情況下,雞胸肉在6天窗口結束時被生長的細菌塗覆。然而,在用3 mg/mL API-E2乳鐵蛋白處理的情況下,在6天之後未觀測到任何細菌群落之可偵測生長,指示在表面處理之後API-E2乳鐵蛋白的抗微生物生物活性。 實例8. 根據抑制區評估乳鐵蛋白生物活性
進行抑制區測試以評估API-E2乳鐵蛋白之生物活性。將具有大腸桿菌之盤與100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL及0.1 μg/mL API-E2乳鐵蛋白一起培養,添加至紙圈中且允許其擴散出來。
14所示,在100 μg/mL及10 μg/mL API-E2乳鐵蛋白之擴散區以及1 μg/mL之有限抑制區中發現完全抑制,指示API-E2乳鐵蛋白之抗微生物生物活性。在0.1 μg/mL下未看到抑制區。 實例9. 藉由LPO活性評估乳鐵蛋白生物活性
利用在過氧化酶活性存在下變成藍色之分子來開發針對乳過氧化酶(LPO)活性之酶分析。
15所示,對於藉由M/S驗證存在之經純化之LPO標準物而言,此產生強陽性反應( 15#3)。對於如本文所描述經純化之API-E2 Lf而言,M/S與酶分析皆未偵測到LPO ( 15#1)。然而,對於市售Sigma實驗室級標準物(L9507)而言,吾等發現藉由M/S可發現污染物LPO,但其未引起陽性酶反應( 15#2)。此指示藉由前述方法產生之乳鐵蛋白導致用此等條件處理的蛋白質之生物活性整體缺失。然而,在本文所描述之方法中,每當M/S可偵測到LPO時,亦觀測到對應酶活性。僅在LPO自乳鐵蛋白完全移除或接近完全移除(M/S偵測不到)的樣品中,未觀測到酶活性。此指示,API-E2乳鐵蛋白產品達成極高純度且本文所描述之純化方法的所有純化步驟皆廣泛保持蛋白質活性。 等效物
儘管本發明已參照較佳實施例及各種替代實施例加以具體顯示且描述,但應瞭解,在不背離本發明之精神及範疇之情況下,熟習相關技術者可在其中作出形式及細節的各種變更。 參考文獻併入
本說明書正文內引用之所有參考文獻、頒佈專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。
1繪示本文所描述之乳鐵蛋白純化方法之一特定實施例。簡言之,使生乳(未處理乳,例如在純化乳鐵蛋白之前未經化學、酶、酸或熱處理)(1)在進入工業標準乳加工工作流程中之前分流;(2)流經離子交換樹脂/管柱,其中流出物通常(例如若生乳生產者要求/需要)返回至標準乳加工工作流程,且收集含乳鐵蛋白溶離液;(3)過濾所收集之溶離液;及(4)加工經純化之乳鐵蛋白。
2A顯示根據 實例 1產生之乳鐵蛋白的MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)純度評估。所用源材料為生初乳(RC)。
2B顯示根據 實例 1產生之乳鐵蛋白的MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)純度評估。所用源材料為生全乳(RM)。
3A顯示非處方(OTC)乳鐵蛋白補充劑之MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)純度評估。
3B顯示購買之實驗室試劑級乳鐵蛋白的MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)純度評估。
3C顯示購買之實驗室試劑級乳鐵蛋白的MALDI-TOF (約18 kDa-100 kDa)純度評估。
4顯示根據 實例 1產生之乳鐵蛋白的軌道阱雙分壓阱質譜法純度評估。
5顯示根據 實例 1產生之乳鐵蛋白及所購買之實驗室試劑級乳鐵蛋白的ELISA純度評估。
6藉由免疫螢光(IF)成像顯示乳鐵蛋白在ECM處之增濃。
7顯示ECM處之乳鐵蛋白增濃的量化。
8藉由免疫螢光(IF)成像顯示乳鐵蛋白在初代口頰細胞中之ECM處的增濃。
9顯示在API-E2存在下之Sars-CoV-2 CPE降低分析。
10顯示評估API-E2乳鐵蛋白(10 mg/mL)之差示掃描熱量測定(DSC)分析曲線圖,包括經熱處理之形式。
11A顯示評估API-E2乳鐵蛋白在過量鐵不存在及存在下的DSC分析曲線圖。
11B顯示評估實驗室級標準乳鐵蛋白及市售補充劑級乳鐵蛋白的DSC分析曲線圖,該DSC分析曲線圖覆疊於API-E2乳鐵蛋白之曲線圖(參見 10)上。
12顯示乳鐵蛋白在API-E2存在下針對唾液細菌之生物活性的評估,該評估為pH隨時間之評估。
13顯示用人類唾液細菌接種且在37℃下擱置6天的未處理之家禽(左)或經API-E2處理之家禽(右)圖片。
14顯示進行抑制測試的區域以評估API-E2乳鐵蛋白對大腸桿菌之生物活性。
15顯示乳過氧化酶(LPO)活性概述及不同乳鐵蛋白樣品(包括API-E2)之結果。
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Claims (101)

  1. 一種包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至口腔或鼻腔。
  2. 如請求項1之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於將乳鐵蛋白保持在口頰黏膜中。
  3. 如請求項1或2之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至細胞之細胞外基質(extra-cellular matrix;ECM)中。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配呈錠劑。
  5. 如請求項4之醫藥組合物,其中該錠劑調配呈經口可溶或崩解錠劑。
  6. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配呈鼻用噴霧劑。
  7. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配呈口嚼錠。
  8. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配呈口服薄膜。
  9. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配呈口含錠。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物,其中該口腔或鼻腔包含鼻咽。
  11. 一種包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至傷口。
  12. 如請求項11之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至皮膚、眼、結締組織、黏膜、胃腸道及/或肺組織。
  13. 如請求項11之醫藥組合物,其中該傷口包含開放性傷口或潰瘍。
  14. 如請求項13之醫藥組合物,其中該潰瘍為靜脈潰瘍或動脈潰瘍。
  15. 如請求項11至13中任一項之醫藥組合物,其中該傷口係選自由以下組成之群:燒傷、咬傷、割傷、感染、潰瘍及其組合。
  16. 如請求項15之醫藥組合物,其中該燒傷選自由以下組成之群:熱燒傷、化學燒傷、電燒傷、輻射燒傷、摩擦燒傷及其組合。
  17. 如請求項15之醫藥組合物,其中該割傷選自由以下組成之群:穿刺、裂傷、擦傷、切口、切除及其組合。
  18. 如請求項11至17中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物包含生物黏合劑。
  19. 如請求項11至18中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配成選自由以下組成之群的遞送形式:止血膠棉、水凝膠、輸注繃帶、散劑、噴霧劑及吸入形式。
  20. 一種包含乳鐵蛋白之醫藥組合物,其中該醫藥組合物經調配以用於遞送至胃腸道。
  21. 如請求項20之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配成包含微膠囊化之遞送形式。
  22. 如請求項20或21之醫藥組合物,其中該醫藥組合物調配成包含腸溶包衣之遞送形式。
  23. 一種包含乳鐵蛋白之組合物,其中該組合物經調配以用於遞送至口腔、鼻腔、傷口、眼腔及/或胃腸道。
  24. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含賦形劑。
  25. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含硬酯醯反丁烯二酸鈉、卡波姆(carbomer)、氫氧化鈉、甘油、苯甲酸鈉、苯甲酸、檸檬酸及/或其組合。
  26. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、糖醇、蔗糖素及/或其組合。
  27. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含異麥芽酮糖醇、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或其組合。
  28. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含粉糖、膠基、玉米糖漿、阿拉伯膠及/或其組合。
  29. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含HiG PWD-04、囊封粉狀調味劑、無水或天然咖啡鹼、囊封蔗糖素或蔗糖素、囊封乙醯磺胺酸鉀及阿斯巴甜(Aspartame)、阿斯巴甜、乙醯磺胺酸鉀、三乙酸甘油酯、二氧化矽及/或其組合。
  30. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含凝聚劑。
  31. 如請求項30之醫藥組合物或組合物,其中該凝聚劑包含凝血酶、支鏈澱粉、高嶺土及/或其組合。
  32. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該醫藥組合物或組合物包含收斂劑。
  33. 如請求項32之醫藥組合物或組合物,其中該收斂劑選自由以下組成之群:礬、阿拉伯膠、鼠尾草(sage)、西洋蓍草(yarrow)、北美金縷梅(witch hazel)、月桂莓、蒸餾醋、柿子、綠茶、紅茶、檸檬酸、蔓越莓汁及/或萃取物、葡萄柚汁及/或萃取物、無機酸及其組合。
  34. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白為牛乳鐵蛋白。
  35. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白尚未經處理。
  36. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白尚未經化學處理、酶處理、酸處理或熱處理。
  37. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白尚未經熱處理。
  38. 如請求項35至37中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白尚未在50℃或更高、51℃或更高、52℃或更高、53℃或更高、54℃或更高或55℃或更高的溫度下經熱處理。
  39. 如請求項35至37之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白尚未在55℃或更高之溫度下經熱處理。
  40. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白包含如藉由圓偏光二色性評估之天然構形。
  41. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白包含如藉由差示掃描熱量測定(Differential Scanning Calorimetry;DSC)所評估之天然構形。
  42. 如請求項41之醫藥組合物或組合物,其中該天然構形包含缺鐵乳鐵蛋白及/或富鐵乳鐵蛋白構形。
  43. 如請求項42之醫藥組合物或組合物,其中該缺鐵乳鐵蛋白構形具有60.2+/- 0.8℃之熔融溫度峰且/或該富鐵乳鐵蛋白構形具有88.38+/- 0.8℃之熔融溫度峰。
  44. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白能夠結合鐵。
  45. 如請求項44之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能夠結合鐵。
  46. 如請求項44之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%能夠結合鐵。
  47. 如請求項44之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白的至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%能夠結合鐵。
  48. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物或組合物,其中結合鐵之能力係藉由DSC評估。
  49. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白包含轉譯後修飾。
  50. 如請求項49之醫藥組合物或組合物,其中該轉譯後修飾包含糖基化。
  51. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白包含至少79000至86000 Da之平均分子量。
  52. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白經乾燥。
  53. 如請求項52之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白藉由冷凍乾燥/凍乾、流體化床乾燥或低溫噴霧乾燥進行乾燥。
  54. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白經由乳鐵蛋白純化作用以液體形式保持。
  55. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該組合物進一步包含鐵分子。
  56. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白與鐵分子複合。
  57. 如請求項55或56之醫藥組合物或組合物,其中該鐵分子包含Fe 2+或Fe 3+
  58. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白與銅、鋅、錳及/或鎵分子複合。
  59. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該經純化之乳鐵蛋白與鋅分子複合。
  60. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該組合物包含5 EU/kg或更低含量的內毒素。
  61. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白係自尚未經處理之天然乳製品純化。
  62. 如請求項61之醫藥組合物或組合物,其中該天然乳製品在該乳鐵蛋白純化之前尚未經加工。
  63. 如請求項61之醫藥組合物或組合物,其中該天然乳製品在該乳鐵蛋白純化之前尚未經化學、酶、酸或熱處理。
  64. 如請求項61之醫藥組合物或組合物,其中該天然乳製品在該乳鐵蛋白純化之前尚未經熱處理。
  65. 如請求項63或64中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該熱處理包含50℃或更高、51℃或更高、52℃或更高、53℃或更高、54℃或更高或55℃或更高之溫度。
  66. 如請求項63或64之醫藥組合物或組合物,其中該熱處理包含55℃或更高之溫度。
  67. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白係純化自在該乳鐵蛋白純化之前已分離成脫脂乳及乳油的天然乳製品。
  68. 如請求項67之醫藥組合物或組合物,其中該分離成脫脂乳及乳油包含冷碗分離。
  69. 如上述請求項中任一項之醫藥組合物或組合物,其中該乳鐵蛋白係純化自在該乳鐵蛋白純化之前經酸處理的天然乳製品。
  70. 如請求項69之醫藥組合物或組合物,其中該酸處理包含移除不溶酪蛋白。
  71. 如請求項69或70之醫藥組合物或組合物,其中該酸處理係在4.0或更高的pH下進行。
  72. 一種製造上述醫藥組合物或組合物中之任一者的方法。
  73. 如請求項72之方法,其中該方法包含一或多個選自由層析、過濾及乾燥組成之群的步驟。
  74. 如請求項72之方法,其中該方法包含層析、過濾及乾燥步驟中之各者。
  75. 如請求項72至74中任一項之方法,其中該方法包含壓製成劑型。
  76. 一種治療疾病或病狀之方法,該方法包含投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
  77. 如請求項76之方法,其中該疾病或病狀選自由以下組成之群:病原性疾病、胃腸道(GI)感染、傷口感染、過敏性病狀、發炎病狀及其組合。
  78. 一種治療病原性疾病之方法,該方法包含向個體投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
  79. 如請求項76至78中任一項之方法,其中該投與為防治性的。
  80. 如請求項79之方法,其中該個體處於暴露於病原體之風險下。
  81. 如請求項79之方法,其中該個體已暴露於病原體。
  82. 如請求項78之方法,其中該個體已診斷患有病原體感染。
  83. 一種降低病原性疾病之風險的方法,該方法包含向個體投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
  84. 如請求項83之方法,其中降低病原性疾病之風險包含向該個體之傷口投與醫藥組合物或組合物。
  85. 如請求項83或84之方法,其中該個體已暴露於病原體且/或已診斷患有病原體感染。
  86. 如請求項77至85中任一項之方法,其中該病原體包含經口及/或經鼻傳播之微生物。
  87. 如請求項77至86中任一項之方法,其中該病原體包含經空氣傳播之微生物。
  88. 如請求項77至87中任一項之方法,其中該病原體包含病毒。
  89. 如請求項88之方法,其中該病毒包含冠狀病毒。
  90. 如請求項89之方法,其中該冠狀病毒為SARS-CoV-2。
  91. 如請求項80至87中任一項之方法,其中該病原體包含細菌或真菌。
  92. 如請求項76至91中任一項之方法,其中治療該疾病或病狀包含防治性治療該疾病或病狀。
  93. 一種降低感染風險之方法,該方法包含向個體投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
  94. 如請求項93之方法,其中該個體之傷口處於該感染之風險下。
  95. 一種促進組織之傷口癒合的方法,該方法包含向個體組織之傷口投與上述醫藥組合物或組合物中之任一者。
  96. 如請求項95之方法,其中該傷口選自由以下組成之群:燒傷、割傷、感染、潰瘍及其組合。
  97. 如請求項96之方法,其中該燒傷選自由以下組成之群:熱燒傷、化學燒傷、電燒傷、輻射燒傷、摩擦燒傷及其組合。
  98. 如請求項96之方法,其中該割傷選自由以下組成之群:穿刺、裂傷、擦傷、切口、切除及其組合。
  99. 如請求項95至98中任一項之方法,其中該組織為皮膚、肺組織或其組合。
  100. 如請求項95至99中任一項之方法,其中該方法包含治療選自由以下組成之群的疾病或病狀:病原性疾病、胃腸道(GI)感染、傷口感染、過敏性病狀、發炎病狀及其組合。
  101. 如請求項100之方法,其中治療該疾病或病狀包含防治性治療該疾病或病狀。
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