TW202323301A

TW202323301A - 經工程改造之ｐｄ－１抗體及其用途

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Publication number: TW202323301A
Application number: TW111143871A
Authority: TW
Inventors: 克里斯多夫帕路奇; 林恩穆芮
Original assignee: 英商米羅比奧有限公司
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2022-11-17
Publication date: 2023-06-16
Also published as: CA3236294A1; CN118284624A; AU2022392804A1; IL312215A; MX2024006098A; EP4433507A2; CO2024006215A2; WO2023089377A2; KR20240099461A; CR20240208A; PE20241755A1; US20230312743A1; DOP2024000090A; WO2023089377A3; AR127729A1

Abstract

在一些態樣中，本文提供結合至PD-1之抗體。在一些情況下，本文所提供之抗體促效PD-1信號傳導。在一些情況下，本文所提供之抗體具有經修飾之Fc區。在其他態樣中，本文提供與結合至PD-1之抗體相關的組成物、使用方法、製造方法、及套組。

Description

經工程改造之PD-1抗體及其用途

無

在一些態樣中，本文揭示一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與特異性結合至PD-1之抗體接觸及促效該免疫細胞中之PD-1信號傳導，其中該抗體包含：包含胺基酸取代之Fc區，且其中該胺基酸取代導致該對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)相較於缺乏該胺基酸取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對該免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。

在一些態樣中，本文揭示一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與特異性結合至PD-1並增強該免疫細胞之表面上之該PD-1與PD-L1的交互作用之抗體接觸。在一些情況下，抗體包含Fc區，且其中Fc區包含胺基酸取代。在一些情況下，胺基酸取代導致對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏胺基酸取代之親本分子降低，且其中抗體相較於親本分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。

在該方法之一些實施例中，針對PD-1表現性調節T細胞之ADCC係如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定為降低。

在該方法之一些實施例中，抗體不會導致針對PD-1表現性調節T細胞之顯著ADCC，如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定。

在該方法之一些實施例中，抗體不會活化自然殺手(NK)細胞。

在該方法之一些實施例中，抗體包含：包含重鏈可變區之重鏈及包含輕鏈可變區之輕鏈。在該方法之一些實施例中，重鏈可變區包含互補決定區(CDR)，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在該方法之一些實施例中，Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。

在一些態樣中，本文揭示一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與抗體接觸，該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中：(i)該重鏈包含：包含CDR之重鏈可變區，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；(ii)該輕鏈包含：包含CDR之輕鏈可變區，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；且(iii)該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。

在該方法之一些實施例中，輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在該方法之一些實施例中，重鏈可變區包含重鏈互補決定區1 (CDRH1)、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在該方法之一些實施例中，輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1 (CDRL1)、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在該方法之一些實施例中，重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列。

在該方法之一些實施例中，輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列。

在該方法之一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7至11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在該方法之一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12至16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在該方法之一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 18中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在該方法之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 19中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在該方法之一些實施例中，Fc區係衍生自人類IgG1。在該方法之一些實施例中，Fc區包含與SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在該方法之一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體(diabody)。

在該方法之一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區形成單鏈可變片段(ScFv)，其可操作地連接至Fc區。

在該方法之一些實施例中，抗體係選自由下列所組成之群組：人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及多特異性抗體。在該方法之一些實施例中，抗體係單株的。

在該方法之一些實施例中，抗體將免疫細胞之活化降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、或50%。

在該方法之一些實施例中，抗體將免疫細胞之活化降低約10%至50%、10%至40%、10%至30%、10%至20%、10%至15%、20%至50%、20%至40%、或20%至30%。

在該方法之一些實施例中，免疫細胞包含T細胞、B細胞、或巨噬細胞。在該方法之一些實施例中，免疫細胞包含抗原特異性T細胞。

在該方法之一些實施例中，Fc區選擇性結合至FcγR2B。在該方法之一些實施例中，抗體以小於5 µM、4 µM、3 µM、或2 µM之KD結合至人類FcγR2B，如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在該方法之一些實施例中，抗體以超過5 µM或10 µM之KD結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在該方法之一些實施例中，抗體以至少15 µM之KD結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在該方法之一些實施例中，抗體以至少50 µM之KD結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在該方法之一些實施例中，抗體以至少80 µM之KD結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少2:1、3:1、4:1、5:1、或6:1。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少6:1。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係約6:1。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少10:1、15:1、20:1、40:1、或50:1。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少40:1。在該方法之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係約40:1。在該方法之一些實施例中，比率係藉由表面電漿共振在37℃下判定。

在一些態樣中，本文揭示一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)並促效PD-1信號傳導，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，其中該Fc區包含胺基酸取代，該胺基酸取代導致針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。

在一些態樣中，本文揭示一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，且其中該抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用。在抗體之一些情況下，Fc區包含胺基酸取代，該胺基酸取代導致對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏胺基酸取代之親本分子降低，且其中抗體相較於親本分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在抗體之一些實施例中，輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在抗體之一些實施例中，Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。

在一些態樣中，本文揭示一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，且其中：(i)該重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；(ii)該輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；且(iii)該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。

在抗體之一些實施例中，抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用。

在抗體之一些實施例中，PD-1與PD-L1之間的交互作用係如藉由實例10中所述之檢定所判定為增強。

在抗體之一些實施例中，相較於包含IgG1之Fc區之其他方面相同的分子，抗體誘導降低的針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，且其中抗體相較於其他方面相同的分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。在抗體之一些實施例中，針對PD-1表現性調節T細胞之ADCC係如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定為降低。在抗體之一些實施例中，抗體不會導致針對PD-1表現性調節T細胞之顯著ADCC，如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體不會活化自然殺手(NK)細胞。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區包含重鏈互補決定區1 (CDRH1)、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在抗體之一些實施例中，輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1 (CDRL1)、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列。

在抗體之一些實施例中，輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7至11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在抗體之一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12至16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在抗體之一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 18中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在抗體之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 19中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在抗體之一些實施例中，Fc區係衍生自人類IgG1。在抗體之一些實施例中，Fc區包含與SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體。

在一些實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含可操作地連接至Fc區之重鏈可變區，且其中輕鏈包含輕鏈可變區。

在抗體之一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區形成單鏈可變片段(ScFv)，其可操作地連接至Fc區。

在抗體之一些實施例中，抗體係人源化抗體。

在抗體之一些實施例中，抗體係人類抗體。

在抗體之一些實施例中，抗體係選自由下列所組成之群組：人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及多特異性抗體。

在抗體之一些實施例中，抗體係單株的。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、或40 nM之KD結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於60 nM之KD結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於40 nM之KD結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於5000 nM、4000 nM、2000 nM、1000 nM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、或200 nM之KD結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於600 nM之KD結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體以小於300 nM之KD結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在抗體之一些實施例中，抗體促效在免疫細胞之表面上表現之人類PD-1。

在抗體之一些實施例中，免疫細胞係T細胞。

在抗體之一些實施例中，抗體與在免疫細胞之表面上表現之人類PD-1的結合使該細胞之增殖相對於未被該抗體結合之可相比的免疫細胞減少。在抗體之一些實施例中，細胞係T細胞。在抗體之一些實施例中，細胞活化之降低係藉由實例4中所述之NFAT-報導子檢定測量。在抗體之一些實施例中，細胞活化之降低係藉由實例5中所述之破傷風類毒素活化檢定或病毒肽活化檢定測量。在抗體之一些實施例中，其中細胞增殖之減少係藉由實例6中所述之抗CD3/28活化檢定測量。在抗體之一些實施例中，細胞增殖之減少係在免疫細胞靠近PD-L1表現性細胞時測量。在抗體之一些實施例中，細胞增殖之減少係藉由實例8中所述之檢定測量。在抗體之一些實施例中，細胞增殖之減少係在體外或體內測量。在抗體之一些實施例中，細胞增殖之減少係至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、或50%。在抗體之一些實施例中，細胞增殖之減少係約10%至50%、10%至40%、10%至30%、10%至20%、10%至15%、20%至50%、20%至40%、或20%至30%。

在抗體之一些實施例中，Fc區選擇性結合至FcγR2B。在抗體之一些實施例中，抗體以小於5 µM、4 µM、3 µM、或2 µM之KD結合至人類FcγR2B，如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在抗體之一些實施例中，抗體以至少2 µM、1 µM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、或5 nM之KD結合至人類FcγR2B。在抗體之一些實施例中，抗體以200 nM至5 µM、400 nM至4 µM、500 nM至3.5 µM、800 nM至3 µM、1 µM至5 µM、1 µM至4.5 µM、1 µM至4 µM、1 µM至3.5 µM、1 µM至3 µM、1 µM至2.5 µM、或1 µM至2 µM之KD結合至人類FcγR2B。在抗體之一些實施例中，抗體以超過5 µM或10 µM之KD結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在抗體之一些實施例中，抗體以至少15 µM之KD結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在抗體之一些實施例中，抗體以至少50 µM之KD結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在抗體之一些實施例中，抗體以至少80 µM之KD結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少2:1、3:1、4:1、5:1、或6:1。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少6:1。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係約6:1。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少10:1、15:1、20:1、40:1、或50:1。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少40:1。在抗體之一些實施例中，抗體與人類FcγR2B之結合親和力對抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係約40:1。在抗體之一些實施例中，比率係藉由表面電漿共振在37℃下判定。

在一些態樣中，本文揭示一種經單離核酸，其包含一或多種編碼能夠形成本文所揭示之抗體之多肽的核苷酸序列。

在一些態樣中，本文揭示一種載體，其包含一或多種編碼能夠形成本文所揭示之抗體之多肽的核苷酸序列。

在一些態樣中，本文揭示一種宿主細胞，其包含一或多種編碼重鏈及輕鏈之胺基酸序列的核酸分子，當該核酸分子表現時能夠形成本文所揭示之抗體。

在一些態樣中，本文揭示一種方法，其包含將本文所揭示之宿主細胞在生產抗體之條件下培養。

在一些態樣中，本文揭示一種方法，其包含(a)提供宿主細胞，該宿主細胞包含一或多種編碼重鏈及輕鏈之胺基酸序列的核酸分子，當該核酸分子表現時能夠形成本文所揭示之抗體；(b)培養表現所編碼之胺基酸序列之該宿主細胞；及(c)單離該抗體。

在一些態樣中，本文揭示一種免疫接合物，其包含與藥劑接合之本文所揭示之抗體。

在一些態樣中，本文揭示一種醫藥組成物，其包含治療有效量的本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物、及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。

在一些態樣中，本文揭示一種用於治療疾病或病況之醫藥組成物，其包含治療有效量的本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物、及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。

在一些態樣中，本文揭示一種套組，其包含在容器中之本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物。

在套組之一些情況下，套組進一步包含含有本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物之使用說明的資訊材料。

在一些態樣中，本文揭示一種治療有需要之對象之疾病或病況的方法，其包含向該對象投予治療有效量的本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物、或向該對象投予本文所揭示之醫藥組成物。在該方法之一些情況下，疾病或病況包含與PD-1相關之疾病或病況。在一些情況下，疾病或病況包含急性瀰漫性腦脊髓炎(ADEM)、艾迪森氏病(Addison's disease)、過敏、圓禿、肌萎縮性脊髓側索硬化症、ANCA血管炎、僵直性脊椎炎、抗磷脂質症候群、氣喘、異位性皮膚炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫胰臟炎、自體免疫多內分泌症候群、貝賽特氏病(Behcet’s disease)、大疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid)、腦性瘧疾、慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、乳糜瀉、克隆氏症(Crohn's disease)、庫欣氏症候群(Cushing's Syndrome)、疱疹樣皮膚炎、皮肌炎、第1型糖尿病、嗜酸性肉芽腫性多血管炎、膽囊疾病、移植物抗宿主疾病、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、化膿性汗腺炎、IgG4相關之疾病、發炎性腸道疾病(IBD)、發炎性纖維化(inflammatory fibrosis)、腸躁症候群、幼年型關節炎、川崎病(Kawasaki disease)、白血病、狼瘡性腎炎、萊姆關節炎(lyme arthritis)、淋巴瘤、淋巴增生病症、腦膜腦炎、多發性硬化症、重症肌無力、骨髓瘤、無放射影像確認之中軸性脊椎關節炎(non-radiographic axial spondyloarthritis, nr-AxSpA)、視神經脊髓炎、骨關節炎、骨盆腔發炎性疾病、天疱瘡、腹膜炎、藏毛疾病、多發性肌炎、原發性膽汁性膽管炎、原發性硬化性膽管炎、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、高安氏動脈炎(Takayasu’s arteritis)、顳動脈炎、移植排斥、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑、及伏格特-小柳-原田氏症(Vogt-Koyanagi-Harada disease)。在一些情況下，對象係人類對象。

在一些態樣中，本文揭示一種下調對象之免疫反應的方法，其包含向該對象投予本文所揭示之抗體、向該對象投予本文所揭示之免疫接合物、或向該對象投予本文所揭示之醫藥組成物。

在一些態樣中，本文揭示一種抑制表現PD-1之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與本文所揭示之抗體或本文所揭示之免疫接合物接觸。在一些情況下，免疫細胞包含T細胞、B細胞、或巨噬細胞。在一些情況下，免疫細胞包含抗原特異性T細胞。在一些情況下，對象係人類對象。 以引用方式併入

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本申請案主張2021年11月19日申請之美國臨時專利申請案第63/281,404號之優先權，其全文併入本文中。序列表之參照

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在一些態樣中，本文揭示一種抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)並促效PD-1信號傳導。在一些情況下，本文所揭示之PD-1抗體可作用為PD-1之促效劑，藉以調節由PD-1調控之免疫反應。

在一些情況下，本文所揭示之促效劑抗PD-1抗體包含具有胺基酸取代之Fc區，該胺基酸取代導致對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏Fc區胺基酸取代之親本分子降低，但相較於親本分子，則維持或增強該抗體對PD-1信號傳導之促效效應。在一些情況下，本文所揭示之抗PD-1抗體之Fc區胺基酸取代導致對FcγR2B之結合選擇性增強，例如，相較於其他類型的Fc受體，對FcγR2B具有相對較高的結合親和力，且結合親和力之差異高於缺乏胺基酸取代之親本分子。用語「FcγR2B」、「FcgR2B」、及「FcgammaR2B」、及「FcγRIIB」在本文中可互換使用且係指Fc受體之相同亞型。

不希望受某些理論束縛，本文所揭示之抗PD-1抗體之Fc區胺基酸取代可增強抗體對FcγR2B之結合選擇性。在人類中存在一種抑制性Fcγ受體(FcγR2B)，而其他Fcγ受體均可遞送免疫活化性信號（例如FcγR1、FcγR2A、FcγR3A、及FcγR3B）。此等活化性FcR可促成抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)，其可導致目標表現性細胞之除盡。據認為，將Fc與FcγR2B之結合選擇性增加可增強本文所揭示之PD-1促效抗體在抑制免疫反應方面之有效性，而不會誘發發炎性FcR信號傳導，且不會除盡PD-1表現性調節T細胞。此外，在一些情況下，選擇性結合至FcγR2B可促進通過在PD-1表現性細胞上之PD-1及通過在FcγR2B表現細胞上之FcγR2B的雙向抑制性信號傳導，其可強化抗體之免疫抑制效應。相反地，在一些情況下，由於在肝竇上皮細胞中FcγR2B之周轉，所以對該受體非常高的親和力可能不利地影響抗體半衰期(Ganesan et al. J Immunol.2012 Nov 15; 189(10):4981-8. doi: 10.4049/jimmunol.1202017)，如由FcγR2B增強之IgG1抗體XmAb7195所證實，該抗體以7.74 nM之K _D結合至FcγR2B (Chu et al. J Allergy Clin Immunol. 2012 Apr; 129(4):1102-15. doi: 10.1016/j.jaci.2011.11.029.)，且據Xencor報告在1a期試驗中具有3.9天之平均體內半衰期（美國胸腔學會(American Thoracic Society, ATS) 2016 International Conference in San Francisco, CA - A6476: Poster Board Number 407），相較於野生型IgG1之大約21天之平均半衰期(Morell et al.J Clin Invest.1970; 49(4):673–680. doi: 10.1172/JCI106279)。因此，雖然對PD-1促效抗體而言，對FcγR2B之選擇性及足夠的結合以支持促效作用可能係所欲的，但在治療背景下，對FcγR2B之過高親和力可能係非所欲的，因為潛在的、隨之而來的半衰期縮短將很可能需要更頻繁的給藥。不希望受某些理論束縛，本文所揭示之抗PD-1抗體之Fc區胺基酸取代可增強抗體對FcγR2B之結合選擇性，同時避免對FcγR2B之過高親和力並保留抗體之所欲半衰期。

在一些情況下，所揭示之促效劑抗PD-1抗體在促進向免疫細胞及/或免疫系統之抑制性信號傳導、下調免疫細胞反應方面較現行抗體更有效。在一些情況下，本文所揭示之PD-1抗體增強PD-1與PD-L1之結合。在一些情況下，本文所揭示之PD-1抗體即使靠近PD-L1亦促進免疫細胞中之PD-1信號傳導。本文所揭示之PD-1抗體可特別有用於治療免疫系統介導、及/或PD-1相關之病症、或由異常免疫病理產生或具有癌性起源(cancerous origin)之疾病。PD-1相關之病症可包括將一或多種類型的免疫細胞中PD-1表現及/或活性失調表現為一種症狀的病症，或係由一或多種類型的免疫細胞中PD-1表現及/或活性之失調造成。

在一些態樣中，本文揭示關於PD-1抗體之方法、系統、醫藥組成物、組成物、治療之方法、套組、及製造之方法。

應理解的是，本文所述之各種實施例之一個、一些、或所有性質皆可應用於任何態樣中，除非內容另有明確規定。此外，可組合各種實施例以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣對所屬技術領域中具有通常知識者將變得顯而易見。本發明之此等及其他實施例係藉由以下詳細描述進一步描述。定義

如本文中所使用，用語「促效劑(agonist)」、「促效的(agonistic)」、「促效(agonize)」、及其他語法上之等效物係指或關於可結合至受體或任何其他蛋白質目標、並活化或增強受體或蛋白質目標之活性、或幫助起始受體或蛋白質目標之活化的劑。在一些情況下，促效劑可促進其結合的受體或其他蛋白質目標，以誘導生物反應，例如信號轉導或其他細胞活性之改變。如本文中所使用，PD-1促效抗體（或抗體片段）係指結合至在免疫細胞之表面上表現之PD-1並增強其至免疫細胞（包括但不限於T細胞、巨噬細胞、及/或B細胞）之抑制性信號的抗體（或抗體片段）。

在本揭露中，在本文中以措辭「包含(comprising)」描述態樣時，亦提供以用語「由……所組成(consisting of)」及/或「基本上由……所組成(consisting essentially of)」描述之其他類似態樣。本文所述之所有定義，無論是否具體提及，皆應解讀為係指如在整個說明書及隨附申請專利範圍中所使用之定義。

在整個說明書及隨附申請專利範圍中，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確規定。例如，用語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。

在本揭露中，本文所述之各種實施例之一個、一些、或所有性質皆可應用於任何態樣中，除非內容另有明確規定。此外，可組合各種實施例以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣對所屬技術領域中具有通常知識者將變得顯而易見。本發明之此等及其他實施例係藉由本文中之詳細描述進一步描述。

在整個說明書及隨附申請專利範圍中，且除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語皆具有與本揭露相關之所屬技術領域中具有通常知識者普遍理解的相同意義。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press為所屬技術領域中具有通常知識者提供本揭露中所使用之許多用語的通用辭典。

胺基酸在本文中可藉由其普遍已知的三個字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學化命名委員會推薦之一個字母符號提及。同樣地，核苷酸可藉由其普遍接受的單字母代碼提及。

除非另有指示，否則抗體之可變域、CDR、及構架區(FR)中胺基酸之編號依照以下文獻中所闡述之Kabat定義：Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)。

用語「約(about)」或「大約(approximately)」意指在特定值之可接受的誤差範圍內，如由所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分取決於該值係如何測量或判定的，亦即測量系統之限制。例如，「約」可意指依據所屬技術領域中之實務在1或多於1個標準偏差內。替代地，「約」可意指在給定值之至多20%、至多10%、至多5%、或至多1%內的範圍。替代地，特別是關於生物系統或程序，該用語可意指在一值之一數量級內，例如在5倍內、或在2倍內。在申請案及申請專利範圍中描述特定值時，除非另有說明，否則應假設用語「約(about)」意指在該特定值之可接受的誤差範圍內。

用語「多肽(polypeptide)」、「寡肽(oligopeptide)」、「肽(peptide)」、及「蛋白質(protein)」在本文中可互換使用，以指任何長度的胺基酸之聚合物。聚合物可係直鏈或支鏈的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可被非胺基酸中斷。該等用語亦涵蓋已經自然修飾或被干預修飾之胺基酸聚合物；例如，雙硫鍵形成、醣基化、脂化(lipidation)、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾，諸如與標示組分接合。在該定義內亦包括例如含有一或多個胺基酸類似物（包括例如非天然胺基酸等）以及所屬技術領域中已知之其他修飾的多肽。應理解的是，因為如本文所述之多肽係基於抗體，所以多肽可作為單鏈或締合鏈(associated chains)出現。

用語「胺基酸(amino acid)」係指天然、非天然、及合成胺基酸，包括但不限於D或L光學異構物兩者、及胺基酸類似物、及擬肽物。使用標準單字母或三字母代碼指定胺基酸。

「變體(variant)」當應用於蛋白質時係與天然生物活性蛋白質具有序列同源性之蛋白質，其保留生物活性蛋白質之至少一部分的治療及/或生物活性。例如，相較於參考生物活性蛋白質，變體蛋白質可共有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%胺基酸序列同一性、或在至少70%與99%之間的任何範圍。如本文中所使用，用語「生物活性蛋白質部份」包括經故意修飾之蛋白質，例如藉由定點誘變、編碼基因之合成、插入、或意外地通過突變。

在多肽之上下文中，「直鏈序列(linear sequence)」或「序列(sequence)」係在多肽中沿胺基至羧基端方向上之胺基酸順序，其中在多肽之一級結構中，序列中彼此相鄰的殘基係連續的。「部分序列(partial sequence)」係多肽之一部分的直鏈序列，已知其在一或兩個方向上包含額外殘基。

如在本文中可互換使用之「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸(nucleic acid)」係指任何長度的核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可係去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基、及/或其類似物、或可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中的任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合之後諸如藉由與標示組分接合來進一步修飾。其他類型的修飾包括例如「封端(cap)」、用類似物取代一或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，諸如例如具有不帶電荷鍵聯（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoamidate)、胺甲酸酯等）及具有帶電荷鍵聯（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）者、含有側接部份（諸如例如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等））者、具有嵌入劑（例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等）者、含有螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）者、含有烷化劑者、具有經修飾之鍵聯（例如α變旋異構核酸(alpha anomeric nucleic acid)等）者、以及（多種）多核苷酸之未經修飾之形式。此外，任何通常存在於糖中之羥基可例如由膦酸酯基團、磷酸酯基團置換、由標準保護基保護、或活化以準備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可接合至固體支撐物。5’及3’端OH可經磷酸化、或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部份取代。其他羥基亦可經衍生成標準保護基。多核苷酸亦可含有所屬技術領域中通常已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-、或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖（諸如阿拉伯糖、木糖、或來蘇糖）、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環狀類似物、及無鹼基核苷類似物（諸如甲基核糖苷）。一或多個磷酸二酯鍵聯可被替代鍵聯基置換。此等替代鍵聯基包括但不限於其中磷酸酯被P(O)S（「硫代酸酯(thioate)」）、P(S)S（「二硫代酸酯(dithioate)」）、(O)NR ₂（「醯胺酯(amidate)」）、P(O)R、P(O)OR’、CO、或CH ₂（「甲縮醛(formacetal)」）置換的實施例，其中各R或R’獨立地係H或可選地含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基、或芳烷基之經取代或未經取代之烷基（1至20個C）。並非多核苷酸中之所有鍵聯皆需要相同。前面的描述適用於本文中所提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。

抗體之「可變區(variable region)」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區，單獨或組合。重鏈及輕鏈之可變區各自由四個構架區(FR)所組成，該等構架區係由三個亦被稱為高度變異區之互補決定區(CDR)連接。各鏈中之CDR係藉由FR緊密的保持在一起，且與來自其他鏈之CDR促成抗體之抗原結合位點之形成。有至少兩種用於判定CDR之技術：(1)基於跨物種序列變異性之方法（亦即Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)）；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-lazikani et al (1997) J. Molec.Biol.273:927-948))。如本文中所使用，CDR可指藉由任一方法或藉由兩種方法之組合定義之CDR。

抗體之「恆定區(constant region)」係指抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區，單獨或組合。

「宿主細胞(host cell)」包括可係或已係包含外源性多核苷酸之（多個）載體之接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且由於自然、偶然、或故意突變，所以後代不一定與原始親本細胞完全同一（在形態或在基因體DNA補體上）。宿主細胞包括在體內用本揭露之（多種）多核苷酸轉染之細胞。

用語「Fc區(Fc region)」係用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可係天然序列Fc區或變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可有所變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區定義為自位置Cys226處、或自位置Pro230處之胺基酸殘基延伸至其羧基端。Fc區中殘基之編號係如Kabat中之EU索引編號。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991。免疫球蛋白之Fc區通常包含兩個恆定域CH2及CH3。

「天然序列Fc區(native sequence Fc region)」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列同一的胺基酸序列。「變體Fc區(variant Fc region)」包含因至少一個胺基酸修飾而不同於天然序列Fc區的胺基酸序列，其仍保留天然序列Fc區之至少一種效應功能。在一些情況下，變體Fc區相較於天然序列Fc區或親本多肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有約一個至約十個胺基酸取代、例如約一個至約五個胺基酸取代。在一些情況下，本文中之變體Fc區與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區擁有至少約80%序列同一性。在一些情況下，本文中之變體Fc區與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區擁有至少約90%序列同一性。在一些情況下，本文中之變體Fc區與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區擁有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列同一性及在該等範圍之間的序列同一性。

「個體(individual)」或「對象(subject)」係哺乳動物，例如人類。哺乳動物亦包括但不限於農畜、運動動物(sport animal)、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠、及大鼠。

如本文中所使用，「載體(vector)」意指構築體，其能夠在宿主細胞中遞送及表現一或多種所關注之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體、或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、包封於微脂體中之DNA或RNA表現載體、及某些真核細胞（諸如生產細胞(producer cell)）。

用語「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指足以產生有益或所欲結果之藥劑的量。治療有效量可取決於下列中之一或多者而有所變化：受治療之對象及疾病病況、對象之體重及年齡、疾病病況之嚴重性、及投予方式及類似者，其可容易地由所屬技術領域中具有通常知識者判定。用語「有效量」亦適用於藉由適當成像方法提供用於偵測之影像的劑量。具體劑量可取決於下列中之一或多者而有所變化：所選擇之特定藥劑、所依循之給藥方案、是否與其他化合物組合投予、投予時機、待成像之組織、及攜帶其之實體遞送系統。活性劑之有效量可以單次劑量或多次劑量投予。抗體之治療有效量係在約0.001至約25 mg/kg體重之範圍內，例如約0.01至約25 mg/kg體重、約0.1至約20 mg/kg體重、或約1至約10 mg/kg。可根據需要調整劑量，以配合觀察到之治療效果及/或最有效的提供治癒、預防、控制症狀、及類似者，如由所屬技術領域中具有通常知識者所判定。適當劑量係由治療醫師或所屬技術領域中具有通常知識者基於臨床適應症選擇。組分在本文中可描述為具有至少有效量、或至少有效產生諸如與特定目標或目的（諸如本文所述之任何目標或目的）相關之所欲結果的量。本文中之所欲治療結果可包括但不限於治療、減輕、或治癒病症、癌症、免疫相關之疾病、PD-1相關之病症、及/或免疫相關病理及類似者之任何症狀，如本說明書及/或隨附申請專利範圍中所述。

如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」或「醫藥可接受之賦形劑(pharmaceutical acceptable excipient)」包括當與活性成分組合時，允許該成分保留生物活性且與對象之免疫系統無反應性的任何材料。實例包括但不限於任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑（諸如油/水乳劑）、及各種類型的潤濕劑。氣溶膠或腸胃外投予之例示性稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水溶液或生理食鹽水(0.9%)。在一些情況下，包含此類載劑之組成物係藉由熟知的習知方法調配（參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；及Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing, 2000）。

在整個說明書及隨附申請專利範圍中，除非另有指示，否則如本文所述之本揭露之方法及系統可採用所屬技術領域中實施者之技能範圍內的分子生物學（包括重組技術）、細胞生物學、生物化學、微陣列、及定序技術之習知技術及描述。此類習知技術包括聚合物陣列合成、寡核苷酸之雜交及連接、寡核苷酸之定序、及使用標示偵測雜交。可藉由參考本文中之實例具體說明合適的技術。然而，當然亦可使用等效的習知程序。此類習知技術及描述可見於以下標準實驗室手冊中，諸如Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series(Vols. I-IV) (1999)；Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual(2003)；Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual(2003)；Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2006)；及Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012)（全部皆來自Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Stryer, L., Biochemistry(4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995)；Gait, “ Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” IRL Press, London (1984)；Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry,6 ^thEd., W.H. Freeman Pub., New York (2012)；R.I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6 ^thEd., Wiley-Blackwell (2010)；及Berg et al., Biochemistry,5 ^thEd., W.H.Freeman Pub., New York (2002)，所有其等之全文出於所有目的以引用方式併入本文中。在描述本發明組成物、研究工具、及系統及方法之前，應理解的是，本揭露不限於所述之特定系統及方法、組成物、目標、及用途，因此當然可有所變化。亦應理解的是，本文中所使用之用語僅出於描述特定態樣之目的且不意欲限制本揭露之範疇，其將僅受隨附申請專利範圍限制。

除非另有說明，否則如本文中所使用之用語「抗PD-1抗體(anti-PD-1 antibody)」或分子係指能夠特異性結合至PD-1之抗體或其結合片段。

在本揭露中，「抗體(antibody)」係指免疫球蛋白分子，其能夠通過位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原識別位點而特異性結合至目標（諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等）。如本文中所使用，該用語包括特異性結合至抗原且包含功能性或非功能性FcR結合位點之免疫球蛋白分子。如本揭露中所使用，該用語不僅涵蓋完整的多株或單株抗體，且亦涵蓋其片段（諸如Fab、Fab'、F(ab')2、雙價抗體）Fv片段、及單鏈(ScFv)突變體，其含有抗原識別位點或抗原結合位點，並具有結合至抗原之能力。抗原結合抗體或免疫球蛋白片段係所屬技術領域中熟知的；此類片段可具有功能性或非功能性Fc受體結合位點。此外，如本文中所使用，該用語不僅限於完整的多株或單株抗體、多特異性抗體（諸如由至少兩種完整抗體產生之雙特異性抗體或多特異性抗體）、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、移植抗體、人類抗體、及包含抗原結合位點之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子，只要抗體展現所欲生物活性即可。

有五種主要類別的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且此等中之數種可進一步分為亞類（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。將對應於不同類別的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為阿爾法、德他、艾普西龍、伽馬、及繆。不同類別的免疫球蛋白之次單元結構及三維構形係熟知的。除非受上下文限制而另有規定，否則本發明之抗體可來自抗體之此等類別或亞類中之一者。對應於不同類別的抗體之重鏈恆定域一般係分別藉由對應的小寫希臘字母α、δ、ε、γ、及µ表示。來自任何脊椎動物物種的抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指派為兩種截然不同類型（稱為卡帕(κ)及拉目達(λ)）中之一者。

在整個說明書及隨附申請專利範圍中，「Fc受體」及「FcR」係描述結合至抗體之Fc區的受體。FcR係綜述於Ravetch and Kinet, 1991, Ann.Rev. Immunol., 9:457-92；Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34；及de Haas et al., 1995, J. Lab.Clin.Med., 126:330-41。「FcR」亦包括新生兒受體(neonatal receptor) FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587；及Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249）。

無論在本文中之任何地方使用，「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上同源的抗體群體中獲得之抗體。大致上，除了可能少量存在之可能天然存在的突變之外，構成該群體之個別抗體係相同的。單株抗體具高度特異性，其針對單一抗原位點。此外，與多株抗體製劑（其一般包括針對不同決定位（表位）之不同抗體））相反，各單株抗體係針對抗原上之單一決定位。修飾語「單株」指示自實質上同源的抗體群體中獲得之抗體的特徵，且不應將其解讀為需要藉由任何特定方法生產抗體。例如，根據本揭露使用之單株抗體可首先藉由Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495所述之融合瘤方法製成，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製成。單株抗體亦可使用例如McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554中所述之技術自所產生之噬菌體庫中單離。

無論在本文中之任何地方使用，「抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity)」及「ADCC」係指細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞（例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、及巨噬細胞）辨識在目標細胞上之結合抗體且隨後造成目標細胞之裂解。可使用體外ADCC檢定評估所關注分子之ADCC活性，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述者、或本揭露之實例 7中所述者。可用於此類檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。替代地或額外地，可在體內評估所關注分子之ADCC活性，例如在諸如Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656中所揭示之動物模型中。

「補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity)」及「CDC」係指在補體存在下目標之裂解。補體活化路徑係由補體系統之第一組分(C1q)與以同源抗原複合之分子（例如抗體）的結合起始。為評估補體活化，可執行例如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.Methods, 202:163 (1996)中所述之CDC檢定。

「特異性結合」至表位之抗體係所屬技術領域中充分理解之用語，且判定此類特異性結合之方法亦係所屬技術領域中熟知的。若分子與特定細胞、蛋白質、或物質之反應或締合比其與替代細胞、蛋白質、或物質之反應或締合更頻繁、更迅速、具有更長持續時間、及/或具有更大親和力，則稱該分子展現出「特異性結合」。若抗體以比其與其他物質結合更大的親和力、親合力(avidity)、更容易、及/或以更長持續時間結合至目標，則該抗體「特異性結合」或「優先結合」至目標。例如，特異性或優先結合至PD-1之抗體係以比其結合至其他表位更大的親和力、親合力、更容易、及/或以更長持續時間結合此表位之抗體。作為進一步實例，特異性或優先結合至第一目標之抗體（或其他部份）可能會或可能不會特異性或優先結合至第二目標。因此，「特異性結合」或「優先結合」不一定需要（儘管其可能包括）排他性結合。通常而言（但不一定），提及結合意指優先結合。

當應用於蛋白質時，「片段(fragment)」係天然生物活性蛋白質之截短形式，其可保留或不保留至少一部分的治療及/或生物活性。在本文中，當用以提及抗體時，用語「抗體片段(antibody fragment)」、「其抗原結合片段(antigen-binding fragment thereof)」、及「其片段(fragment thereof)」可互換使用。 序列同一性

關於抗PD-1抗體序列或本文中所識別之任何其他胺基酸序列的序列同一性係定義為查詢序列(query sequence)中與第二參考多肽序列或其部分之胺基酸殘基同一的胺基酸殘基之百分比，其係在比對序列並引入間隙（若需要）之後以達成最大序列同一性百分比，且不考慮將任何保守性取代作為序列同一性之一部分。出於判定胺基酸序列同一性百分比之目的的比對可以在所屬技術領域中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign (DNASTAR)軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於測量比對之適當參數，包括在所比較的序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。同一性百分比可在整個經定義多肽序列之長度上測量，或可在較短的長度上測量，例如，在從較長、經定義多肽序列取得之片段長度上測量，例如至少15個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少70個、或至少150個連續殘基之片段。此類長度僅係例示性的，且應理解的是，由本文、表格、圖式、或序列表中所示之序列支持的任何片段長度皆可用以描述可在其上測量同一性百分比的長度。在一些實施例中，同一性百分比係相對於標註之參考序列（諸如本文所提供之序列）之全長判定。例如，本揭露之兩個胺基酸序列（或其較短長度）之間的序列比較可藉由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)線上提供之電腦程式Blastp（蛋白質-蛋白質BLAST）進行。給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列同一性百分比（其可替代地表述為給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B具有一定百分比的胺基酸序列同一性）係由下式計算：

其中X係藉由序列比對程式BLAST在A及B之程式比對中評分為同一匹配之胺基酸殘基數目，且其中Y係A或B中較短者之胺基酸殘基總數目。

當進行比對以獲得最大對應時，若兩個多核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則將該兩個序列稱為「同一」。二個序列之間的比較一般藉由在比較窗中比較序列以識別及比較具有序列相似性之局部區域來執行。 程式性細胞死亡1 (PD-1)

在一些態樣中，本文提供關於結合並促效PD-1之抗體或其抗原結合片段的組成物及方法，PD-1係可存在於活化淋巴球（包括T細胞、自然殺手細胞、B細胞、及單核球）之表面上及骨髓細胞之表面上的受體。PD-1路徑可係調控PD-1表現性免疫細胞之反應的關鍵免疫檢查點。

不希望受某些理論之束縛，PD-1路徑之活化可能導致免疫細胞活化之抑制。將阻斷PD-1信號傳導之抗體用於癌症患者中以促進抗腫瘤免疫反應。

程式性細胞死亡蛋白1（PD-1或CD279）係免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白質及B7-CD28家族之成員。其可由單個胞外IgV樣域、單次跨膜區、及含有ITIM及ITSM之胞質尾所組成。在一些情況下，其在細胞表面上係單體，因為其缺乏在CD28、CTLA4、及ICOS中發現之胞外半胱胺酸，該胞外半胱胺酸允許此等分子形成共價同二聚體。在一些情況下，PD-1亦在整個免疫系統之細胞上表現，包括CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、NKT細胞、單核球、巨噬細胞、及樹突細胞。其可在急性活化之T細胞上短暫地上調並在耗竭之T細胞(exhausted T-cell)上持續地上調。PD-1可結合至稱為PD-L1（PD-L1、CD279、或B7-H1）及PDL-2（CD273或B7-DC）之兩個配體，其等各自在其胞外區中含有兩個IgSF域。PD-L1可在專業抗原呈現細胞(APC)（諸如DC、巨噬細胞、及B細胞）上持續表現且可在發炎期間在非造血細胞上經誘導以限制組織損傷，但亦常在癌細胞上上調，使其能夠阻抑抗腫瘤免疫反應。

當結合至其配體時，PD-1之胞內酪胺酸模體可變為磷酸化，且磷酸化ITSM可募集蛋白磷酸酶SHP2（且可能還有SHP1）。一旦經募集至細胞表面，SHP2藉由將活化受體（特別是CD28）之ITAM及活化信號傳導之其他下游介導物去磷酸化來負向調控細胞信號傳導。除抑制T細胞之活化之外，PD-1信號傳導亦可在調節T細胞(Treg)之產生中起作用。如本文中所使用，用語「PD-1信號傳導(PD-1 signaling)」可指PD-1之胞內酪胺酸模體之磷酸化、蛋白磷酸酶SHP2及/或SHP1之募集、或活化受體之ITAM或活化信號傳導之其他下游介導物之去磷酸化中之一或多者。在一些情況下，本文所揭示之抗體促進PD-1信號傳導，例如，促進抗體結合的PD-1分子或抗體未結合的PD-1分子（但該抗體結合至在相同細胞表面上表現之另一PD-1分子）之胞內酪胺酸模體之磷酸化、SHP2及/或SHP1之募集、或活化受體之ITAM或活化信號傳導之其他下游介導物之去磷酸化中之一或多者。

在一些態樣中，本文提供抗體、組成物、其用途、及製造其之方法，其可規避一些前述及與現有抗PD-1抗體相關之所屬技術領域中已知的其他問題。在一些實施例中，本文提供PD-1促效抗體，其能夠觸發PD-1信號傳導以結合至效應T細胞上之PD-L1，而不會除盡PD-1表現性調節T細胞、或對PD-1表現性調節T細胞具有最小的除盡效應。

不希望受某些理論束縛，在自體免疫疾病中，PD-L1表現可藉由發炎性環境上調(Keir et al. 2008)(Garcia-Diaz et al. 2017)，其使PD-1在此等病理條件下已完全接合之可能性增加，因而提供促效抗體之額外益處的有限範圍。然而，在一些態樣中，本文提供PD-1促效抗體，其即使在由其天然配體PD-L1之受體接合存在下亦可提供額外抑制性信號。在一些實施例中，本文所揭示之PD-1促效抗體對靠近PD-L1表現性細胞或PD-L1本身、與PD-L1接觸、或具有與PD-L1接合之PD-1受體的PD-1表現性免疫細胞具有抑制效應。 抗體序列

在本揭露中，本文提供用於生產PD-1促效抗體或其抗原結合片段或功能片段之組成物、治療劑、套組、載體、核酸序列、製造、培養、及/或方法，該抗體或其抗原結合片段或功能片段在Fc區(FcR)中具有增強對抑制性Fc受體FcγR2B (CD23B)之選擇性的突變，藉以增強PD-1活化之生物效應，例如抑制該抗體結合的表現PD-1分子之免疫細胞之活性或增殖、或促進PD-1表現性免疫細胞反應之下調。在一些情況下，PD-1促效抗體增強PD-1與PD-L1之間的交互作用。在一些情況下，PD-1促效抗體促進由PD-L1結合觸發的PD-1之下游信號傳導。在一些情況下，PD-1促效抗體在沒有增加或增強的PD-1與PD-L1之間的交互作用之情況下促進PD-1之下游信號傳導。在一些情況下，PD-1促效抗體在PD-L1與PD-1之結合不存在下活化或增強PD-1信號傳導。

在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段（例如經單離抗體）特異性結合至PD-1並增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1之交互作用。

在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段（例如經單離抗體）係包含重鏈可變區、輕鏈可變區、及Fc區之PD-1抗體，且PD-1抗體之Fc區包含增強對抑制性Fc受體FcγR2B之選擇性的胺基酸取代，藉以增強PD-L1介導之PD-1之觸發，並增加PD-1/PD-L1交互作用，導致針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該取代之親本分子降低。

在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗體片段（例如經單離抗體）係包含重鏈可變區、輕鏈可變區、及Fc區之PD-1抗體。在一些實施例中，PD-1抗體之重鏈可變區包含CDR，該CDR包含與如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些實施例中，PD-1抗體之重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些實施例中，PD-1抗體之輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含與如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些實施例中，PD-1抗體之輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些實施例中，PD-1抗體之Fc區係衍生自IgG1分子（例如人類IgG1分子）且在根據EU索引編號之位置238處包含自脯胺酸(P)至天冬胺酸(D)之胺基酸取代。

在一些情況下，抗體（或抗原結合片段，此後稱為「抗體」，以代表全長抗體或抗體之抗原結合片段）之重鏈可變區之CDR包含與如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的序列。在一些情況下，抗體之重鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列。在一些情況下，抗體之CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有一個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體之重鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有兩個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體之重鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有三個胺基酸修飾。

在一些情況下，本文所提供之抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDRH)，其中CDRH1具有與如SEQ ID NO:1中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，CDRH2具有與如SEQ ID NO:2中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，且CDRH3具有與SEQ ID NO: 3中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，本文所提供之抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDRH)，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之重鏈可變區中，CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列。在一些情況下，在抗體之重鏈可變區中，CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且具有一個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之重鏈可變區中，CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且具有兩個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之重鏈可變區中，CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且具有三個胺基酸修飾。

在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含具有如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾的CDR。在一些情況下，抗體之輕鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列。在一些情況下，抗體之輕鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有一個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體之輕鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有兩個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體之輕鏈可變區之CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有三個胺基酸修飾。

在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區，其中CDRL1具有與如SEQ ID NO: 4中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，CDRL2具有與如SEQ ID NO: 5中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，且CDRL3具有與如SEQ ID NO: 6中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區，其中CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之輕鏈可變區中，CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列。在一些情況下，在抗體之輕鏈可變區中，CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列，且具有一個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之輕鏈可變區中，CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列，且具有兩個胺基酸修飾。在一些情況下，在抗體之輕鏈可變區中，CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列，且具有三個胺基酸修飾。

在一些情況下，本文所提供之抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDRH)，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾；且該輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區，其中CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，CDRH1具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列，且CDRH3具有SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區，其中CDRL1具有如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列。

在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。

在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體，或此後稱為「抗體」）包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少85%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少90%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少95%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少99%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少100%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%及至多100%之間的任何範圍之同一性的序列。

在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列，且VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少80%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少85%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少90%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少95%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少99%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含與如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列具有至少100%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少80%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少85%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少90%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少95%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少99%同一性的序列。在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VL包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列具有至少100%同一性的序列。

在一些情況下，本文所提供之抗體（例如經單離抗體）包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、及SEQ ID NO: 11中任一者所示之序列，且VL包含如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16中任一者所示之序列。

在具體實施例中，本說明書及隨附申請專利範圍中所揭示之重鏈或輕鏈亦可包含恆定區。若分子係全長IgG型抗體分子，則重鏈可包含三個恆定域。

在一個態樣中，本文所提供之抗體包含Fc區，其中該Fc區係衍生自人類IgG1。在一些情況下，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。在其他態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%同一性的序列。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%同一性的序列。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少85%同一性的序列。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少90%同一性的序列。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少95%同一性的序列。在一個態樣中，本文所提供之抗體之Fc區包含胺基酸取代，其中在根據EU索引編號之位置238處用天冬胺酸(D)置換脯胺酸，且進一步包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少99%同一性的序列。在一個態樣中，Fc區包含與如SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少100%同一性的序列。

在一些情況下，本文所揭示之抗體包含重鏈可變區及包含胺基酸取代之Fc區，其中重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體包含重鏈可變區(VH)及包含胺基酸取代之Fc區，其中VH包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列。在一些情況下，促效抗體包含VH及包含胺基酸取代之Fc區，其中VH包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有1個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體包含VH及包含胺基酸取代之Fc區，其中VH包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有2個胺基酸修飾。在一些情況下，抗體包含VH及包含胺基酸取代之Fc區，其中VH包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有3個胺基酸修飾。

在一些情況下，促效抗體包含輕鏈可變區(VL)及包含胺基酸取代之Fc區，其中輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。在實施例之一個態樣中，促效抗體包含VL及包含胺基酸取代之Fc區，其中VL區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列。在實施例之一個態樣中，促效抗體包含VL及包含胺基酸取代之Fc區，其中VL區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有1個胺基酸修飾。在實施例之一個態樣中，促效抗體包含VL及包含胺基酸取代之Fc區，其中VL區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有2個胺基酸修飾。在實施例之一個態樣中，促效抗體包含VL及包含胺基酸取代之Fc區，其中VL區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有3個胺基酸修飾。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其等形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體。 效應功能

在一些情況下，本文所揭示之抗體促效PD-1，例如在免疫細胞（諸如T細胞、B細胞、或巨噬細胞）之表面上表現之人類PD-1。在一些情況下，本文所揭示之抗體結合至在效應免疫細胞之表面上表現之PD-1，且使效應免疫細胞之活化及/或增殖相對於未被該抗體結合之可相比的免疫細胞減少。

在一些情況下，本文所揭示之抗體結合至在免疫細胞上表現之PD-1並抑制細胞之活化及/或增殖。在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至在免疫細胞上表現之PD-1，且當免疫細胞靠近PD-L1表現性細胞時減少免疫細胞之活化及/或增殖。在一些情況下，本文所揭示之抗體在周圍環境中大量PD-L1存在下對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有促效效應。不希望受某些理論束縛，在一些情況下，在自體免疫疾病中，PD-L1表現係藉由發炎性環境上調(Keir et al. Annu Rev Immunol. 2008;26:677-704. doi: 10.1146/ annurev.immunol.26.021607.090331; Garcia-Diaz et al. Cell Rep. 2017 May 9; 19(6):1189-1201. doi: 10.1016/j.celrep.2017.04.031)，且因此，在此類發炎性環境中，PD-1可能已經與周圍PD-L1完全接合，使靶向PD-1之已知促效抗體之額外益處的範圍有限。根據本揭露之一些實施例之抗體即使靠近PD-L1表現性細胞亦可進一步促進免疫細胞中之PD-1信號傳導，表明本文所揭示之抗體可特別有用於下調免疫反應（例如，在自體免疫疾病之背景下），因而可用於治療與過度免疫反應相關之病症（例如自體免疫疾病）。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至在免疫細胞上表現之PD-1，且在PD-L1與抗體結合的PD-1分子之結合不存在下減少免疫細胞之活化及/或增殖。

在一些情況下，本文所揭示之抗體對免疫細胞之活化及/或增殖的抑制效應可藉由NFAT-報導子檢定測量，諸如實例 4中所述者。例如，NFAT-報導子檢定可用Jurkat T細胞進行，細胞經工程改造以在NFAT反應元件(NFAT response-element)之控制下表現螢光素酶。在一些情況下，將在NFAT反應元件之控制下表現螢光素酶之Jurkat T細胞與經組態以刺激Jrukat T細胞之刺激細胞一起培養，刺激細胞諸如如前述表現抗CD3「T細胞刺激劑」(T cell stimulator, TCS)構築體(Leitner et al. 2010)及表現人類FcγR2B之鼠類BW5147細胞、或如前述表現抗CD3「T細胞刺激劑」(TCS)構築體(Leitner et al. 2010)及表現人類FcγR2B之HEK293T細胞。將Jurkat T細胞與刺激細胞、加上測試抗體（例如根據本揭露之一些實施例之例示性PD-1抗體）、或同型對照、或一些其他對照PD-1抗體共培養一段時間。在與測試抗體或對照培養一段時間（諸如3小時、6小時、9小時、或12小時）之後，可收集細胞以用於螢光素酶檢定。可將發光信號定量作為Jurkat T細胞活化之指標。

在一些情況下，本文所揭示之抗體對免疫細胞（例如T細胞）之活化及/或增殖的抑制效應可藉由免疫細胞活化檢定（例如破傷風類毒素活化檢定或病毒肽活化檢定）測量，諸如實例 5中所述者。例如，可收集免疫細胞（諸如人類周邊血液單核細胞(PBMC)）並用破傷風類毒素（例如0.5 µg/mL）或病毒肽（例如CEF HLA I類肽–來自巨細胞病毒(cytomegalovirus)、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、及流感之市售肽之匯集混合物）在PD-L1/2阻斷抗體（例如各5 µg/mL）及一定濃度的測試PD-1抗體（例如根據本文之一些實施例之例示性抗體）、或同型對照、或一些其他對照抗體存在下刺激。在與測試抗體培養一段時間（例如24小時、48小時、72小時、96小時、或一週）之後，可藉由ELISA或任何其他適當方法評估細胞之干擾素（例如IFNγ）釋放（在上清液或細胞培養基中）。可測量干擾素釋放作為免疫細胞活化之指標。在一些情況下，亦可將未受刺激處理（例如破傷風類毒素處理或病毒肽處理）之干擾素生產作為未經刺激之背景從經處理之干擾素生產中扣除。

在一些情況下，本文所揭示之抗體對免疫細胞（例如T細胞）之活化及/或增殖之抑制效應可藉由抗CD3/28活化檢定測量，諸如實例 6中所述者。例如，可收集免疫細胞（諸如人類周邊血液單核細胞(PBMC)）並用可溶性抗CD3及抗CD28抗體（例如最終濃度各自為0.5 ng/mL）在一定濃度的測試PD-1抗體（例如根據本文之一些實施例之例示性抗體）、或同型對照、或一些其他對照抗體存在下刺激。在與抗體培養一段時間（例如24小時、48小時、72小時、或96小時）之後，可藉由流式細胞術或任何其他方法評估在CD4 T細胞上之CD25表現作為T細胞活化之標記。

在一些情況下，本文所揭示之抗體對免疫細胞（例如T細胞）之活化及/或增殖之抑制效應可藉由細胞增殖、細胞介素生產、趨化因子生產、或免疫細胞之任何其他活化標記測量。本文所述之抑制百分比係藉由將用主題抗體處理之細胞中免疫細胞活化標記之讀出相對於其他方面相同但用同型對照處理或未用主題抗體處理之細胞中免疫細胞活化標記之讀出進行標準化來測量。在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至在免疫細胞上表現之PD-1並將免疫細胞之活化及/或增殖減少至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、或50%。

在一些情況下，就免疫細胞活化（例如T細胞活化）之抑制而言，本文所揭示之抗體具有至多約0.5 nM、至多約0.2 nM、至多約0.15 nM、至多約0.1 nM、至多約0.09 nM、至多約0.08 nM、至多約0.07 nM、至多約0.06 nM、至多約0.05 nM、至多約0.04 nM、至多約0.03 nM、至多約0.02M、或至多約0.01 nM之IC50。在一些情況下，就免疫細胞活化（例如T細胞活化）之抑制而言，本文所揭示之抗體具有約0.5 nM、約0.2 nM、約0.15 nM、約0.1 nM、約0.09 nM、約0.08 nM、約0.07 nM、約0.06 nM、約0.05 nM、約0.04 nM、約0.03 nM、約0.02M、或約0.01 nM之IC50。就免疫細胞活化（例如T細胞活化）之抑制而言，本文所揭示之抗體之IC50可在免疫細胞檢定中測量，諸如以上及實例中所述者。

在一些情況下，本文提供一種使用本文所揭示之抗體抑制表現PD-1之免疫細胞的方法。該方法可包括使表現PD-1之免疫細胞與抗體接觸、及將免疫細胞之活化及/或增殖減少約10%至50%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約10%至40%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約10%至30%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約10%至20%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約10%至15%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約20%至50%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約20%至40%。在一些情況下，該方法導致免疫細胞之活化及/或增殖降低約或20%至30%。

在一些情況下，本文所揭示之抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用。例如，在一些情況下，本文所揭示之抗體增強PD-L1與該抗體結合的PD-1分子之結合。在一些情況下，本文所揭示之抗體增強PD-L1與在免疫細胞之表面上未被該抗體結合的一或多種PD-1分子之結合，而該抗體結合至在免疫細胞之表面上之其他PD-1分子。在一個實施例中，本文所揭示之抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用，如藉由檢定所判定，諸如實例 10中所述者。在一些情況下，本文所揭示之抗體將在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用增強至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、300%、400%、500%、或甚至更多。

在一些情況下，本文所揭示之抗體相較於包含IgG1之未經修飾Fc區的其他方面相同的分子具有降低的針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之誘導，同時相較於包含IgG1之未經修飾Fc區的其他方面相同的分子對PD-1信號傳導具有相同或增強的促效效應。在一些情況下，本文所揭示之抗體具有降低的針對PD-1表現性調節T細胞之ADCC，如藉由自然殺手細胞活化檢定所判定，諸如實例 7中所述者。在一些情況下，當將本文所揭示之抗體投予至對象時，抗體不會導致針對PD-1表現性調節T細胞之顯著ADCC，如藉由體外（諸如實例 7中所述者）或體內檢定所判定。在一些情況下，本文所揭示之抗體相較於包含IgG1之未經修飾Fc區的其他方面相同的分子不會造成自然殺手細胞去顆粒作用，或造成去顆粒作用之水平降低。在一些情況下，本文所揭示之抗體相較於包含IgG1之未經修飾Fc區的其他方面相同的分子不會導致調節T細胞之死亡，或導致調節T細胞之死亡水平降低。在一些實施例中，本文所揭示之抗體相較於包含IgG1之未經修飾Fc區的其他方面相同的分子不會造成自然殺手細胞去顆粒作用或調節T細胞之死亡，或造成自然殺手細胞去顆粒作用或調節T細胞之死亡降低。可例如藉由如實例 7中所述之檢定在體內或體外測量對自然殺手細胞去顆粒作用及/或調節T細胞之死亡的效應。 結合親和力

人源化抗PD-1抗體變體對人類或食蟹獼猴PD-1受體或另一種動物之PD-1之結合親和力可藉由k _a、k _d、或K _D表徵。如本文中所使用，用語「k _a」係意欲指抗體與抗原締合之速率常數。如本文中所使用，用語「k _d」係意欲指抗體從抗體/抗原複合物解離之速率常數。如本文中可互換使用，用語「K _D」或「KD」係意欲指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。出於本揭露之目的，K _D係定義為二個動力學速率常數之比率k _a/k _d。平衡解離常數愈小，主題抗體及PD-1彼此結合愈緊。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體以小於200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、或40 nM之K _D結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一個態樣中，本文所揭示之抗體以小於5000 nM、4000 nM、2000 nM、1000 nM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、或200 nM之K _D結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相較於缺乏Fc區取代之親本分子擁有增加的與FcγR2B之結合及降低的與一或多種活化Fcγ受體（諸如FcγR2A（例如131R同種異型或131H同種異型）或FcγR1A）之結合。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相較於缺乏Fc區胺基酸取代之親本分子擁有增加的與FcγR2B/ FcγR2A（例如131R同種異型或131H同種異型）之結合之比率。在一些情況下，相較於缺乏Fc區取代之親本分子，增加的結合FcγR2B/ FcγR2A（例如131R同種異型或131H同種異型）之比率係至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.8、2、2.2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、或150倍。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段之Fc區以相對於包含缺乏上述胺基酸取代之Fc區之可相比的對照抗體更高的親和力結合至FcγR2B。在一些情況下，抗體以至多約5 µM（例如約5 µM至0.1 µM）之解離常數(K _D)結合至FcγR2B，如藉由表面電漿共振(SPR)所判定。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或抗原結合片段之Fc區(FcR)選擇性結合至FcγR2B。在一些情況下，抗體以至多5 µM之K _D結合至FcγR2B，如藉由表面電漿共振(SPR)所判定。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或抗原結合片段以小於5 µM、4 µM、3 µM、或2 µM之K _D結合至人類FcγR2B，如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。在一些情況下，本文所揭示之抗體或抗原結合片段以至少2 µM、1 µM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、或5 nM之K _D結合至人類FcγR2B。在一些情況下，本文所揭示之抗體或抗原結合片段以200 nM至5 µM、400 nM至4 µM、500 nM至3.5 µM、800 nM至3 µM、1 µM至5 µM、1 µM至4.5 µM、1 µM至4 µM、1 µM至3.5 µM、1 µM至3 µM、1 µM至2.5 µM、或1 µM至2 µM之K _D結合至人類FcγR2B。

在一些情況下，抗體以相對於親本分子更低或相等的親和力結合至FcγR2A（例如131R同種異型或131H同種異型），親本分子為缺乏Fc取代之等效抗體，該Fc取代賦予抗體分子增加的與FcγR2B之結合，因而增強FcγR2B之信號傳導。

在一些情況下，當抗體包含P238D取代時，抗體以相對於包含在位置238（EU索引）處包含脯胺酸之Fc區之可相比的對照抗體更低或相等的親和力結合至FcγR2A（131R同種異型）。

在一些情況下，抗體以超過5 µM之K _D結合至FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以超過10 µM之K _D結合至FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以至少15 µM之K _D結合至FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以至少20 µM之K _D結合至FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以15 µM至25 µM之K _D結合至FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在一些情況下，抗體以至少50 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以至少75 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以至少80 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以至少90 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以約50 µM至約100 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。在一些情況下，抗體以約75 µM至約125 µM之K _D結合至FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。

在一些情況下，抗體擁有3或更大之[抗體對FcγR2A (131R)之K _D值/抗體對FcγR2B之K _D值]，諸如至少4、5、6、7、8、9、或10。合適地，如藉由表面電漿共振(SPR)所判定。

在一些情況下，抗體擁有10或更大之[抗體對FcγR2A(131H)之K _D值]/ [抗體對FcγR2B之K _D值]，諸如至少15、20、25、30、35、40、45、或50。合適地，如藉由表面電漿共振(SPR)所判定。

在一些情況下，抗體擁有3或更大之[抗體對FcγR2A (131R)之K _D值/抗體對FcγR2B之K _D值]（諸如至少4、5、6、7、8、9、或10）、及/或10或更大之[抗體對FcγR2A(131H)之K _D值] / [抗體對FcγR2B之K _D值]（諸如至少15、20、25、30、35、40、45、或50）。合適地，如藉由表面電漿共振(SPR)所判定。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相較於缺乏對野生型序列之Fc區取代之親本分子擁有增加的與FcγR2B/ FcγR1A之結合之比率。在一些情況下，相較於缺乏Fc區取代之親本分子，增加的結合FcγR2B/ FcγR1A之比率係至少1.1、1.2、1.5、2、5、10、50、100、150、200、250倍。

關於相較於缺乏Fc區取代之親本分子，其意指相較於具有除申請專利範圍中所述之胺基酸之外相同的胺基酸序列之抗體，申請專利範圍中所述之胺基酸代表相對於野生型Fc之Fc取代。因此，可測量具有或不具有所述Fc取代之抗體分子與FcγR2B之結合，且可選地可例如藉由SPR測量具有或不具有所述Fc取代之抗體分子與活化Fcγ受體（諸如FcγR2A（例如131R同種異型或131H同種異型）或FcγR1A）之結合。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相較於缺乏對野生型序列之Fc區取代之親本分子具有增加的[結合FcγR1A之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率。在一些情況下，變體分子之[結合FcγR1A之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率係缺乏Fc取代之親本分子之[結合FcγR1A之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率的至少1.1、1.2、1.5、2、5、6、7、8、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、或10000倍。

在一些情況下，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相較於缺乏對野生型序列之Fc區取代之親本分子具有增加的[結合FcγR2A (131R)之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率。在一些情況下，變體分子之[結合FcγR2A (131R)之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率係缺乏Fc取代之親本分子之[結合FcγR1A之K _D值]/[結合FcγR2B之K _D值]之比率的至少1.1、1.2、1.5、2、5、10、50、或100倍。

在本文所提供之一些實施例中，抗PD-1抗體之人源化變體各自與人類PD-1、食蟹獼猴PD-1、或另一種動物之PD-1之結合親和力係藉由表面電漿共振測量。可使用Biacore ^®表面電漿共振(SPR)系統(GE Healthcare, Chicago IL)以測量主題抗體之結合親和力。例示性SPR分析系統包括但不限於Biacore X100、Biacore T200、Biacore 3000、或Biacore 4000儀器、及市售感測晶片系列。在Biacore系統之典型應用中，交互作用動力學係藉由在一範圍的分析物濃度內監測交互作用隨時間之變化，接著將整個數據集擬合至描述交互作用之數學模型來分析。締合階段（在樣本注射期間）含有締合及解離程序兩者之資訊，而在解離階段期間（在樣本注射之後，當緩衝劑流移除解離之分析物分子時）僅發生解離。所屬技術領域中具有通常知識者可根據製造商手冊選擇或判定用於進行結合親和力檢定之適當參數及/或條件。在一些實施例中，主題抗體之結合親和力係藉由表面電漿共振在37℃下判定。在一些情況下，人源化抗體變體與人類或食蟹獼猴PD-1之結合親和力及動力學係藉由使用Biacore 8K (Cytiva)之表面電漿共振(SPR)判定，諸如實例 2中所揭示。 抗體工程改造

在一些情況下，本文所揭示之抗體包含人類抗體。在一些實施例中，本文所揭示之抗體包含單株人源化抗體、嵌合抗體、或多特異性抗體。在一些情況下，本文所揭示之抗體包含單株抗體。

本文所體現之抗體可係單株抗體、嵌合抗體、人類或人源化抗體。如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」意欲包括具有可變區之抗體，其中構架區及CDR區兩者皆係衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如，藉由體外隨機或定點誘變或藉由體內體細胞突變引入之突變）。然而，如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」不意欲包括其中已將衍生自另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系的CDR序列移植至人類構架序列上的抗體。用語「人源化抗體(humanized antibody)」係意欲指其中已將衍生自另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系的CDR序列移植至人類構架序列上的抗體。可在人類構架序列內進行額外的構架區修飾。用語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係意欲指其中可變區序列係衍生自一種物種而恆定區序列係衍生自另一物種的抗體，諸如其中可變區序列係衍生自小鼠抗體而恆定區序列係衍生自人類抗體的抗體。在一些實施例中，本文所提供之抗體係單株抗體。

主題抗體可藉由融合瘤程序或重組DNA程序製備。如Kohler & Milstein (Nature, 256:495 (1975))之方法中所述，在製備融合瘤之細胞融合步驟中使用之抗體生產細胞係用抗原（PD-1、其部分肽、或表現其等之細胞）免疫之動物（例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、山羊）的脾臟細胞、淋巴結細胞、周邊血液白血球等。亦可能使用藉由使抗原在培養基中作用於事先從未經免疫之動物中單離之上述細胞或淋巴球上而獲得之抗體生產細胞。作為骨髓瘤細胞，可使用公開已知的各種細胞株。若抗體生產細胞及骨髓瘤細胞可相互融合，則其等可來源於不同動物物種。在一些情況下，其等具有相同動物物種來源。例如，融合瘤係藉由自抗原免疫之小鼠獲得之脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞之間的細胞融合來產生，且後續篩選可獲得產生針對PD-1之單株抗體的融合瘤。針對PD-1之單株抗體可藉由融合瘤之培養物或自被投予融合瘤之哺乳動物之腹水產生。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體係人源化抗體。在製造人源化抗體中，構架殘基之選擇在保留高結合親和力方面可為至關重要的。原則上，來自任何HuAb之構架序列可作為CDR移植之模板；然而，已證實直接將CDR置換成此構架可能導致對抗原之結合親和力的顯著損失。Glaser et al. (1992) J. Immunol.149:2606；Tempest et al. (1992) Biotechnology 9:266；及Shalaby et al.(1992) J. Exp.Med.17:217。HuAb與原始muAb之同源性愈高，人類構架將可能降低親和力的畸變(distortion)引入鼠類CDR中之可能性愈低。基於針對抗體序列資料庫之序列同源性檢索，HuAb IC4提供與muM4TS.22良好的構架同源性，儘管其他高度同源的HuAb也可能合適，尤其是來自人類亞群I之κ L鏈或來自人類亞群III之H鏈。Kabat et al.(1987)。各種電腦程式諸如ENCAD (Levitt et al.(1983) J. Mol.Biol.168 :595)可用以預測V區之理想序列。因此，本發明涵蓋具有不同V區之HuAb。判定合適的V區序列並最佳化此等序列係在所屬技術領域中具有通常知識者之技能範圍內。用於獲得具有降低免疫原性之抗體的方法亦描述於美國專利第5,270,202號及EP 699,755中。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體包含重鏈可變區及該輕鏈可變區，其等形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體。

在一個態樣中，本文所揭示之抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含可操作地連接至該Fc區之該重鏈可變區，且其中輕鏈包含該輕鏈可變區。在一個特徵中，本文所揭示之抗體係人源化抗體。在一個態樣中，本文所揭示之抗體係人類抗體。在另一實施例中，本文所揭示之抗體係選自由下列所組成之群組：人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及多特異性抗體。在一些情況下，本文所揭示之抗體係單株抗體。人源化

在一些實施例中，本文提供抗體變體，其包含人源化VH及VL域之任何潛在組合。在一些實施例中，本文所提供之抗體包含：包含人類構架序列之PD-1促效抗體之VH的人源化變體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：包含人類構架序列之PD-1促效抗體之VL的人源化變體。

人源化的抗體可保留對抗原之高親和力及其他有利的生物性質。為了達成此目標，在一個實例中，PD-1人源化抗體係藉由使用親本及人源化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人源化產物之程序來製備。三維免疫球蛋白模型係所屬技術領域中具有通常知識者熟悉的。可用電腦程式繪示及展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構形結構。此等展示之檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，及分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自共有(consensus)序列及導人(import)序列中選擇FR殘基並組合，從而達成所欲抗體特徵，諸如對（多種）目標抗原之親和力增加。

在一些情況下，可變重(VH)鏈包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列。在一些情況下，人源化VH鏈包含人類構架IGHV1-24*01。在一些實施例中，人源化VH鏈包含與SEQ ID NO: 8中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，人源化VH鏈包含與SEQ ID NO: 9中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在又另一實施例中，人源化VH鏈包含人類構架IGHV7-4-1*02。在一些實施例中，人源化VH鏈包含與SEQ ID NO: 10中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，人源化VH鏈包含與SEQ ID NO: 11中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。

在一些情況下，可變輕(VL)鏈包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列。在一些情況下，人源化VL鏈包含人類構架IGKV1-39*01。在一些實施例中，人源化VL鏈包含與SEQ ID NO:13中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些情況下，人源化VL鏈包含人類構架IGKV3-11*01。在一些實施例中，人源化VL鏈包含與SEQ ID NO: 14中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，人源化VL鏈包含與SEQ ID NO: 15中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，人源化VL鏈包含與SEQ ID NO: 16中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%序列同一性的胺基酸序列。突變

在本文所提供之一些實施例中，如本文所述之PD-1抗體可具有相對於參考序列之一或多個突變或修飾。突變或修飾可係缺失、插入、或添加、或對胺基酸殘基之置換或取代。「缺失(deletion)」係指由於缺少一或多個胺基酸殘基所致之胺基酸序列之改變。「插入(insertion)」或「添加(addition)」係指如相較於參考序列，由添加一或多個胺基酸殘基所致之胺基酸序列之改變。「置換(replacement)」或「取代(substitution)」係指一或多個胺基酸被不同胺基酸置換。在本揭露之上下文中，主題抗體或其部分相對於參考序列之突變可藉由將主題抗體或其部分與參考序列進行比較來判定。可根據所屬技術領域中任何已知方法進行序列之最佳比對以進行比較。

可藉由突變位點識別突變。突變位點係在參考序列上發生修飾（諸如缺失、添加、或取代）之位置。參考序列上之胺基酸殘基係從N端至C端編號，且突變位點係其上發生缺失、添加、或取代之胺基酸殘基之編號。例如，參考序列上之位置26係從N端開始第26個胺基酸殘基所在的位置。抗體接合物

在一些實施例中，本文所揭示之抗體或其片段係與血清白蛋白融合。與血清白蛋白之融合可改善如本文所述之主題抗體之藥物動力學。例如，主題抗體或其片段可與血清白蛋白融合。血清白蛋白係球狀蛋白質，其係哺乳動物中最豐富的血液蛋白質。血清白蛋白係在肝臟中產生且構成約血液血清蛋白質之一半。其係單體且可溶於血液中。在一些實施例中，主題抗體或其片段可與血清白蛋白融合。在進一步實施例中，血清白蛋白係人類血清白蛋白(HSA)。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體或其片段係與對血清白蛋白展示結合活性的白蛋白結合肽融合，以增加主題抗體或其片段之半衰期。可用於本文中之白蛋白結合肽包括但不限於例如Dennis et al., J. Biol.Chem.277:35035-35043, 2002及Miyakawa et al., J. Pharm.Sci.102:3110-3118, 2013中所述者。在一些實施例中，白蛋白結合肽係與本文所述之主題抗體或其片段在基因上融合。在進一步實施例中，白蛋白結合肽係通過化學手段（例如化學接合）附接至本文所述之主題抗體或其片段。在一些實施例中，白蛋白結合肽可與本文所述之主題抗體或其片段之N端或C端融合。白蛋白結合肽之C端可通過肽鍵與主題抗體之N端直接融合。替代地，白蛋白結合肽之N端可通過肽鍵與主題抗體或其片段之C端直接融合。在進一步實施例中，可使用習知化學接合技術將白蛋白結合肽之C端的羧酸與主題抗體或其片段之內部胺基酸殘基融合。

在一些實施例中，本文所揭示之PD-1抗體或其片段係與聚合物融合，例如聚乙二醇(PEG)。抗體或其片段可經聚乙二醇化，以例如增加抗體或其片段之生物（例如血清）半衰期。為了將抗體聚乙二醇化，一般使抗體或其片段在使一或多個PEG基團變成附接至抗體或其片段之條件下與聚乙二醇(PEG)（諸如PEG之反應性酯或醛衍生物）反應。在一些情況下，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子（或類似的反應性水溶性聚合物）之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文中所使用，用語「聚乙二醇(polyethylene glycol)」意欲涵蓋已用以衍生其他蛋白質之任何形式的PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基、或芳氧基-聚乙二醇、或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。用於將蛋白質聚乙二醇化之方法可使用諸如例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384中所揭示者。在一些實施例中，聚合物（例如PEG）可使用習知化學方法（例如化學接合）在N端或C端處、或在內部位置處共價附接至本文所述之主題抗體或其片段。不受理論束縛，PEG部份一旦附接至如本文所述之抗體，可促成水溶性、溶液中之高流動性、無毒性及低免疫原性、延長循環壽命、增加穩定性、易於從體內清除、及改變體內分布。

可使用其他半衰期延長技術以增加主題抗體或其片段之血清半衰期，包括但不限於XTEN (Schellenberger et al., Nat. Biotechnol.27:1186-1192, 2009)及Albu標籤(Trussel et al., Bioconjug Chem.20:2286-2292, 2009)。

在一些實施例中，本文所揭示之aPD-1抗體或其片段係與化學官能部份接合。一般而言，該部份係能夠產生可偵測信號的標示。此等接合抗體或其片段可用於例如偵測系統中，諸如腫瘤負荷之定量、及轉移性病灶之成像及腫瘤成像。此類標示在所屬技術領域中係已知的且包括但不限於放射性同位素、酶、螢光化合物、化學發光化合物、生物發光化合物受質輔因子、及抑制劑。關於描述此類標示之使用的專利實例，參見美國專利第3,817,837號；第3,850,752號；第3,939,350號；第3,996,345號；第4,277,437號；第4,275,149號；及第4,366,241號。該等部份可共價連接至如本文所述之抗體或其片段，或通過二級試劑（諸如二級抗體、蛋白質A、或生物素-抗生物素蛋白複合物）重組連接、或接合至抗體或其片段。

其他官能部份包括信號肽、增強或降低免疫反應性之劑、促進與固體支撐物偶合之劑、疫苗載劑、生物反應調節劑、順磁標示、及藥物。信號肽係短的胺基酸序列，其引導新合成之蛋白質通過細胞膜，通常為真核細胞中之內質網、及細菌之內膜或內膜及外膜兩者。信號肽一般係在多肽之N端部分且一般在多肽在細胞中之生物合成與分泌之間被酶移除。此類肽可併入主題抗體或其片段中，以允許合成分子之分泌。

增強免疫反應性之劑包括但不限於細菌超級抗原。促進與固體支撐物偶合之劑包括但不限於生物素或抗生物素蛋白。免疫原載劑包括但不限於任何生理學上可接受之緩衝劑。生物反應調節劑包括細胞介素，特別是腫瘤壞死因子(TNF)、介白素2、介白素4、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、及γ-干擾素。

降低免疫反應性之劑包括但不限於消炎劑及免疫抑制劑。消炎劑包括非類固醇消炎藥物(NSAID)及皮質類固醇。NSAID包括但不限於水楊酸鹽，諸如乙醯水楊酸；二氟尼索(diflunisa)、水楊酸、及雙柳酸；丙酸衍生物，諸如伊布洛芬(ibuprofen)；萘普生(naproxen)；右布洛芬(dexibuprofen)、右酮洛芬(dexketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、奧沙普秦(oxaprozin)、非諾洛芬(fenoprofen)、洛索洛芬(loxoprofen)、及酮洛芬(ketoprofen)；乙酸衍生物，諸如吲哚美辛(indomethacin)、雙氯芬酸(diclofenac)、妥美丁(tolmetin)、乙醯氯芬酸(aceclofenac)、舒林酸(sulindac)、萘丁美酮(nabumetone)、依托度酸(etodolac)、及酮洛酸(ketorolac)；烯醇酸衍生物，諸如吡羅昔康(piroxicam)、氯諾昔康(lornoxicam)、美洛昔康(meloxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替諾昔康(tenoxicam)、保泰松(phenylbutazone)、及哚昔康(droxicam)；鄰胺苯甲酸衍生物，諸如甲芬那酸(mefenamic acid)、氟芬那酸(flufenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、及托芬那酸(tolfenamic acid)；選擇性COX-2抑制劑，諸如塞內昔布(celecoxib)、蘆美昔布(lumiracoxib)、羅菲昔布(rofecoxib)、依他昔布(etoricoxib)、凡第昔布(valdecoxib)、非羅昔布(firocoxib)、及帕瑞昔布(parecoxib)；磺醯苯胺，諸如尼美蘇來(nimesulide)；及其他諸如氯尼辛(clonixin)、及利克飛龍(licofelone)。皮質類固醇包括但不限於可體松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可體松、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、潑尼松(prednisone)、及潑尼松龍(prednisolone)。免疫抑制劑包括但不限於羥氯喹、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、D-青黴胺(D-penicillamine)、口服用金化合物(oral gold compound)、注射用金化合物(injectable gold compound)（肌內注射）、米諾四環素(minocycline)、金硫蘋果酸鈉(sodium gold thiomalate)、金諾芬(auranofin)、D-青黴胺、氯苯紮利(lobenzarit)、布西拉明(bucillamine)、阿克他利(actarit)、環磷醯胺、硫唑嘌呤(azathioprine)、胺甲葉酸(methotrexate)、咪唑立賓(mizoribine)、環孢素(cyclosporine)、及他克莫司(tacrolimus)。

合適的藥物部份包括抗贅瘤劑。非限制性實例係放射性同位素、長春花生物鹼(vinca alkaloid)（諸如長春鹼、長春新鹼及硫酸長春地辛(vindesine sulfate)）、阿黴素、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、達卡巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、杜諾黴素鹽酸鹽(duanorubicin hydrochloride)、艾黴素鹽酸鹽(d5oxorubicin hydrochloride)、依妥普賽(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、洛莫司汀(lomustine)、甲氮芥鹽酸鹽(mechlororethamine hydrochloride)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤、胺甲喋呤、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、丙卡巴鹽酸鹽(procarbaze hydrochloride)、鏈球黴素(streptozotocin)、紫杉醇、硫鳥嘌呤(thioguanine)、及尿嘧啶芥末(uracil mustard)。

包括單鏈分子之免疫毒素可藉由重組方式產生。有多種免疫毒素可供使用，且方法可見於例如Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, Thorpe et al.(1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190；Vitatta (1987) Science 238:1098-1104；及Winter and Milstein (1991) Nature 349:293-299。合適的毒素包括但不限於蓖麻毒素、放射性核素、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、假單胞菌屬外毒素A (pseudomonas exotoxin A)、白喉毒素、蓖麻毒素A鏈、真菌毒素諸如侷限麴菌素(restrictocin)及磷脂酶。大致上參見"Chimeric Toxins,「Olsnes and Pihl, Pharmac.Ther.15:355-381 (1981)；及"Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,」eds.Baldwin and Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press (1985)。

化學官能部份可例如藉由建立編碼抗體及官能部份之融合基因來重組地製造。替代地，抗體或其片段可藉由各種已充分建立之化學程序中之任一者與該部份化學結合。例如，當該部份係蛋白質時，可使用各種偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、亞胺基硫烷鹽(iminothiolane) (IT)、亞胺酯之雙官能衍生物（諸如亞胺酸二甲酯HCl (dimethyl adipimidate HCl)）、活性酯（諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸酯）、醛類（諸如戊二醛(glutareldehyde)）、雙疊氮化合物（諸如雙-(對疊氮苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）、及雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。連接子可係促進細胞毒性藥物在細胞中之釋放的「可裂解連接子(cleavable linker)」。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、二甲基連接子、或含雙硫鍵連接子(Chari et al.Cancer Research, 52: 127-131 (1992))。該等部份可共價連接，或可通過二級試劑（諸如二級抗體、蛋白質A、或生物素-抗生物素蛋白複合物）接合。關於順磁部份及其與抗體之接合之實例，參見例如Miltenyi et al.(1990) Cytometry 11:231-238。

在一些實施例中，本文所揭示之PD-1抗體或其片段係雙特異性抗體。雙特異性抗體係對至少兩種不同表位具有結合特異性之抗體。如本文所述之雙特異性抗體可係辨識在PD-1上不同表位之雙特異性抗體、或其中抗原結合位點中之一者辨識PD-1且另一抗原結合位點辨識PD-1以外的抗原之雙特異性抗體。 核酸分子

在一些實施例中，本文所述之抗體係由一或多種核酸分子編碼。在一個情況下，抗體係由單一核酸分子編碼。在其他情況下，抗體係由二或更多種核酸分子編碼。例如，由於抗原結合位點係由重鏈可變多肽區及輕鏈可變多肽區域在一起所形成，所以兩個可變（重鏈及重鏈）多肽區係由不同的核酸分子編碼。替代地，例如，在ScFv之情況下，其係由相同的核酸分子編碼。

根據本揭露之一些態樣，提供一或多種編碼根據本揭露之一些實施例之抗體或其抗原結合片段的核酸分子。

從編碼本文所提供之抗體的（多種）多肽之一級胺基酸序列中，所屬技術領域中具有通常知識者能夠判定編碼該（等）多肽之合適的（多種）核苷酸序列，且若需要，判定密碼子最佳化核苷酸序列（例如，參見Mauro and Chappell. Trends Mol Med. 20(11):604-613, 2014）。

根據本揭露之一些態樣，提供一種經單離核酸，其包含編碼本揭露之重鏈可變區多肽或輕鏈可變區多肽的核苷酸序列。本揭露之重鏈可變多肽或輕鏈可變多肽係指包括構成抗原結合位點之一部分的胺基酸之個別多肽鏈。在一些情況下，多肽亦包含其他域，諸如恆定域、鉸鏈區、及Fc區，諸如包含一或多個Fc受體結合位點者。

根據本揭露之一些態樣，提供一種經單離核酸，其包含一或多種編碼能夠形成本揭露之抗體或抗原結合片段之多肽的核苷酸序列。在具體實施例中，多肽亦可包含其他域，諸如恆定域、鉸鏈區、及Fc區，諸如包含一或多個Fc受體結合位點者。

在一個情況下，核酸分子僅編碼包含抗體或其片段之VL域之多肽序列。在一些情況下，核酸分子僅編碼包含抗體或其片段之VH域之多肽序列。在其他情況下，核酸分子編碼能夠形成本揭露之抗體或其抗體片段且含有VH及VL域兩者之多肽序列。

編碼本揭露之抗體或其抗原結合片段之（多種）核酸分子可係載體（諸如質體載體、黏質體載體、或病毒載體、或人工染色體）或可係該載體之一部分，該載體可包含其他功能區（元件），諸如一或多個啟動子、一或多個起點或複製、一或多個選擇標記、及一或多個一般在表現載體中發現之其他元件。編碼蛋白質（包括抗體）之核酸之選殖及表現已充分建立且完全在所屬技術領域中具有通常知識者之技能範圍內。載體

根據本揭露之一些態樣，提供一種載體，其包含根據本揭露之一些實施例之核酸。在具體實施例中，載體係質體載體、黏質體載體、病毒載體、或人工染色體。

本揭露之核酸包括載體核酸（包含編碼能夠形成本揭露之抗體或其抗原結合片段之多肽的核苷酸序列），可呈經純化/單離之形式。

編碼本揭露之抗體或其抗原結合片段之經單離/純化之核酸將不含或實質上不含與其自然締合之材料，諸如在其自然環境、或在製備其（當此製備係藉由在體外或體內實行重組DNA技術時）之環境（例如細胞培養物）中發現之其他蛋白質或核酸。

在一些實施例中，本揭露之核酸係大於80%、諸如大於90%、大於95%、大於97%、及大於99%純的。

因此，根據本揭露之一些態樣，提供一種載體，其包含編碼本揭露之重鏈可變多肽或輕鏈可變多肽之核酸或核苷酸序列。在一具體實施例中，載體包含編碼重鏈及輕鏈可變區兩者之核酸。在一些實施例中，多肽包含其他域，諸如恆定域、鉸鏈區、及Fc區，諸如包含一或多個Fc受體結合位點者。

在一些實施例中，將本揭露之核酸及/或載體引入宿主細胞中。例如，對於真核細胞，合適的技術包括磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖酐、電穿孔、微脂體介導之轉染、及使用反轉錄病毒或其他病毒（例如牛痘，或對於昆蟲細胞為桿狀病毒）轉導。在一個態樣中，在宿主細胞（特別是真核細胞）中引入核酸使用病毒或基於質體之系統。在一些情況下，質體系統係以游離基因形式(episomally)維持。在其他情況下，將質體系統併入宿主細胞中或併入人工染色體中。在一具體實施例中，併入係藉由在單個或多個基因座處隨機整合一或多個複本。在一些實施例中，併入係藉由在單個或多個基因座處靶向整合一或多個複本之。對於細菌細胞，合適的技術包括例如氯化鈣轉化、電穿孔、及使用噬菌體之轉染。

在一個實施例中，將本揭露之核酸整合至宿主細胞之基因體（例如染色體）中。在一具體實施例中，整合係根據標準技術藉由納入促進與基因體之重組的序列來促進。 宿主細胞

本揭露之進一步態樣提供一種宿主細胞，其含有如本文所揭示之核酸。在一些實施例中，此類宿主細胞係在體外。在一些實施例中，此類宿主細胞係在培養物中。

在一些情況下，宿主細胞來自任何物種，諸如細菌或酵母。在其他情況下，宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如人類細胞或嚙齒動物細胞，例如HEK293T細胞或CHO-K1細胞。

因此，根據本揭露之一些態樣，提供一種宿主細胞，其包含根據本揭露之一些實施例之核酸序列或載體。

在一些情況下，處理宿主細胞以造成或允許從核酸表現本揭露之蛋白質，例如藉由在用於表現編碼核酸之條件下培養宿主細胞。在一些實施例中，純化所表現之產物係藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法達成。

在一些實施例中，本揭露之核酸包括載體核酸（包含編碼本揭露之抗體或其抗原結合片段之多肽的核苷酸序列），存在於經單離之宿主細胞中。在一些情況下，宿主細胞係宿主細胞之選殖群體之一部分。如本文中所使用，提及宿主細胞亦涵蓋細胞之選殖群體。選殖群體係從單個親本宿主細胞中生長出來的群體。在一些情況下，宿主細胞係來自任何合適的生物體。在一些情況下，宿主細胞係例如細菌、真菌、或哺乳動物細胞。

在一些實施例中，宿主細胞有助於擴增載體核酸（諸如用質體）。在一具體實施例中，宿主細胞作為生物工廠以表現形成本文所述之PD-1抗體或其片段的本揭露之（多種）多肽。在一個情況下，用於擴增載體核酸之合適的宿主係細菌或真菌細胞，諸如大腸桿菌細胞或釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)細胞。在其他情況下，用於表現本揭露之蛋白質（亦即構成本揭露之PD-1抗體或其片段之多肽）之合適的宿主係哺乳動物細胞，諸如HEK293T或CHO-K1細胞。在一具體實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如HEK293T或CHO-K1細胞。

各種宿主表現載體系統皆適合表現如本文所述之PD-1抗體或其片段。不同宿主細胞具有用於蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾的特徵性及特異性機制。選擇適當的細胞系或宿主系統以確保對本揭露之蛋白質的正確修飾及加工。在一些實施例中，使用擁有用於基因產物之初級轉錄本之適當加工、醣基化、及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、HEK、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0、CRL7O3O、及HsS78Bst細胞。 抗體製造

本文所揭示之PD-1抗體或其片段可藉由選殖編碼來自融合瘤或B細胞或抗體及/或抗體片段庫之任何形式之主題抗體或肽的DNA，將殖株整合至合適的載體中，且將載體轉導至宿主細胞中作為重組抗體生產（例如P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. 192:767-775 (1990)）。因此，在一個態樣中，本文提供一種經單離多核苷酸，其編碼本揭露之抗體或其片段。

對應於現有抗體之L或H鏈之各種區的核苷酸序列可使用習知技術（包括但不限於雜交、PCR、及DNA定序）容易地獲得並定序。生產單株抗體之融合瘤細胞作為抗體核苷酸序列之一個來源。生產一系列單株抗體之大量融合瘤細胞可自公共或私有儲存庫獲得。最大的貯藏機構係美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，其提供多樣的經充分表徵之融合瘤細胞系保藏。替代地，抗體核苷酸可自經免疫或未經免疫之囓齒動物或人類獲得，及自器官（諸如脾臟）及周邊血液淋巴球獲得。用於萃取及合成抗體核苷酸之具體技術係描述於Orlandi et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86: 3833-3837、Larrick et al. 1989) biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250-1255；Sastry et al. (1989) Proc.Natl.Acad. Sci., U.S.A. 86: 5728-5732；及美國專利第5,969,108號。

PD-1抗體核苷酸序列亦可經修飾，例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定區之編碼序列取代同源非人類序列。以此方式，製備保留原始抗體之結合特異性的嵌合抗體。

此外，編碼PD-1抗體或其功能片段之重鏈及/或輕鏈之多核苷酸可經受密碼子最佳化，以使主題抗體或其功能片段在所欲宿主細胞中達成最佳化表現。例如，在密碼子最佳化之一個方法中，天然密碼子被來自一組參考基因之最常見密碼子取代，其中將各胺基酸之密碼子轉譯速率設計為高的。下列文獻中描述用於產生表現所欲蛋白質之密碼子最佳化多核苷酸之其他例示性方法，其可應用於PD-1抗體或其功能片段之重鏈及/或輕鏈：Kanaya et al., Gene, 238:143-155 (1999)、Wang et al., Mol.Biol.Evol., 18(5):792-800 (2001)、美國專利第5,795,737號、美國公開案2008/0076161、及WO 2008/000632。

本揭露之PD-1抗體之多核苷酸包括編碼例示性多肽之功能等效物及其片段之多核苷酸。功能等效物可係具有保守性胺基酸取代之多肽、包括融合物之類似物、及突變體。

由於遺傳密碼之簡併性(degeneracy)，因此在L及H序列、以及適用於構築本揭露之多核苷酸及載體之異二聚化序列之核苷酸中存在相當大的變異。此等變異涵蓋在本揭露中。

當有需要時，重組多核苷酸可包含促進偵測基因產物之表現及純化的異源序列。此類序列之實例包括編碼報導子蛋白之序列，報導子蛋白諸如β-半乳糖苷酶、β-內醯胺脢、氯黴素乙醯轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、及其衍生物。促進純化的其他異源序列可針對表位編碼，諸如Myc、HA（衍生自流感病毒血球凝集素）、His-6、FLAG、或免疫球蛋白之Fc部分、麩胱甘肽S-轉移脢(GST)、及麥芽糖結合蛋白(MBP)。

多核苷酸可與各種如上所述之化學官能部份接合。常用之部份包括能夠產生可偵測信號的標示、信號肽、增強或降低免疫反應性之劑、促進與固體支撐物偶合之劑、疫苗載劑、生物反應調節劑、順磁標示、及藥物。該等部份可以重組方式或藉由所屬技術領域中已知的其他手段共價連接至多核苷酸。

多核苷酸可包含額外序列（諸如在相同轉錄單位內之額外編碼序列）、控制元件（諸如啟動子、核糖體結合位點、及多腺苷酸化位點）、在相同或不同啟動子控制下之額外轉錄單位、允許宿主細胞之選殖、表現、及轉化之序列、及如根據本文所述之各種實施例中任一者可能所欲的任何此類構築體。

多核苷酸可使用化學合成、重組選殖方法、PCR、或其任何組合獲得。所屬技術領域中具有通常知識者可使用本文所提供之序列數據，以藉由採用DNA合成儀或自商業服務訂購獲得所欲多核苷酸。

可將包含所欲序列之多核苷酸插入合適的載體中，其繼而可引入合適的宿主細胞中以進行複製、擴增、及表現。因此，在一個態樣中，本文提供各種載體，其包含一或多種本揭露之多核苷酸。亦提供一種表現載體之選擇性庫，其包含至少一種編碼主題體抗體之載體。

在一些態樣中，本文提供一種多核苷酸序列，其編碼本文所揭示之抗體或其片段之重鏈或輕鏈之至少一部分。在一些態樣中，本文提供一種載體，其包含本文所揭示之多核苷酸序列。

本揭露之載體通常被分類成選殖及表現載體。選殖載體可用於獲得其含有的多核苷酸之複製複本，或作為將多核苷酸儲存在貯藏所中以供未來回復之手段。表現載體（及含有此等表現載體之宿主細胞）可用以獲得自其含有的多核苷酸產生之多肽。合適的選殖及表現載體包括所屬技術領域中任何已知者，例如用於細菌、哺乳動物、酵母、昆蟲、及噬菌體展示表現系統之選殖及表現載體。

合適的選殖載體可根據標準技術構築，或選自所屬技術領域中可得之大量選殖載體。雖然所選之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而有所變化，但可用的選殖載體將通常具有自我複製之能力、可擁有特定限制性核酸內切酶之單一目標、或可攜帶標記基因。合適的實例包括質體及細菌病毒，例如pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、pUC18、mp18、mp19、噬菌體DNA（包括絲狀及非絲狀噬菌體DNA）、及穿梭載體（諸如pSA3及pAT28）。此等及其他選殖載體可購自商業供應商，諸如Clontech、BiORad、Stratagene、及Invitrogen。

含有此等核酸之表現載體可用於獲得宿主載體系統以產生蛋白質及多肽。一般而言，此等表現載體可在宿主生物體中作為游離基因體或作為染色體DNA之整合部分複製。合適的表現載體包括質體、病毒載體，包括噬菌粒(phagemid)、腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、黏質體等。有許多適用於在真核細胞（包括酵母、禽類、及哺乳動物細胞）中表現之表現載體可供使用。表現載體之一個實例係pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)，其中轉錄係由巨細胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子驅動。兩類特別可用於表現如本文所述之主題抗體的表現載體係噬菌體展示載體及細菌展示載體。

本揭露之載體可包含表現編碼抗體所需之轉錄或轉譯控制序列。合適的轉錄或轉譯控制序列包括但不限於複製起點、啟動子、增強子、抑制子結合區、轉錄起始位點、核糖體結合位點、轉譯起始位點、及轉錄及轉譯之終止位點。

可將表現載體轉移至宿主細胞，接著培養經轉染之細胞以生產主題抗體或其功能片段。因此，在一個態樣中，本文提供宿主細胞，其含有編碼主題抗體或其功能片段之多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至異源啟動子。宿主細胞可與兩種表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈衍生之多肽，且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。兩種載體可含有相同選擇標記，其使重鏈及輕鏈多肽之表現相等。替代地，可使用編碼且能夠表現重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。在此類狀況下，輕鏈可被置於重鏈之前，以避免過量的無毒重鏈（Proudfoot, 1986, Nature 322:52；及Kohler, 1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197-2199）。

可利用各種宿主表現載體系統以表現主題抗體或其功能片段（參見例如美國專利第5,807,715號）。此類宿主表現系統代表可藉由其產生並隨後純化所關注之編碼序列的媒劑，但亦代表當用適當核苷酸編碼序列轉化或轉染時可原位表現主題抗體分子的細胞。此等包括但不限於用含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA、或黏質體DNA表現載體轉化之微生物，諸如細菌（例如大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis)）；用含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉化之酵母（例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)）；用含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體（例如桿狀病毒）感染之昆蟲細胞系統；用重組病毒表現載體（例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV；菸草鑲嵌病毒(tobacco mosaic virus, TMV)）感染或用含有抗體編碼序列之重組質體表現載體（例如Ti質體）轉化之植物細胞系統；或帶有重組表現構築體之哺乳動物細胞系統（例如COS、CHO、BHK、293、NSO、及3T3細胞），重組表現構築體含有衍生自哺乳動物細胞基因體之啟動子（例如金屬硫蛋白啟動子）或衍生自哺乳動物病毒之啟動子（例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子）。例如，哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)）與載體（諸如來自人類巨細胞病毒之主要中間早期基因啟動子(major intermediate early gene promoter)元件）結合係有效的抗體表現系統（Foecking et al., 1986, Gene 45:101；及Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。在一些實施例中，抗體或其片段係在CHO細胞中生產。

對於細菌系統，可取決於所表現之抗體分子之預期用途有利地選擇許多表現載體。例如，當要生產大量此類抗體或其片段以用於產生抗體分子之醫藥組成物時，引導高水平表現易於純化之融合蛋白質產物的載體可為所欲的。此類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791)，其中抗體編碼序列可個別地連接至框內具有lac Z編碼區之載體中，以產生融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem.24:5503-5509)；及類似者。pGEX載體亦可用以表現作為具有麩胱甘肽5-轉移脢(GST)之融合蛋白質的外來多肽。大致上，此類融合蛋白係可溶性且可藉由吸附並結合至基質麩胱甘肽瓊脂珠，接著在游離麩胱甘肽存在下之洗提而容易地自裂解之細胞中純化。pGEX載體經設計成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點，使得所選殖之目標基因產物可從GST部份中釋放。

在昆蟲系統中，加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)可用作表現外來基因之載體。該病毒生長於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中。抗體或功能片段編碼序列可個別選殖至病毒之非必要區（例如多角體蛋白基因）中並置於AcNPV啟動子（例如多角體蛋白啟動子）之控制下。

在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多基於病毒之表現系統。在其中將腺病毒用作表現載體之情況下，可將所關注之抗體編碼序列連接至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物（例如晚期啟動子及三聯前導序列(tripartite leader sequence)）。接著可將此嵌合基因藉由體外或體內重組插入腺病毒基因體中。插入病毒基因體之非必要區（例如E1或E3區）將產生存活且能夠在受感染宿主中表現抗體分子之重組病毒（例如參見Logan & Shenk, 1984, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359）。亦可使用特定起始信號以用於有效轉譯所插入之抗體編碼序列。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必需與所欲編碼序列之閱讀框相符，以確保整個插入物之轉譯。此等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可具有各種起源，包括天然及合成兩者。表現效率可藉由納入適當轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強。（參見例如Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol.153:51-544）。

對於植物細胞，所屬技術領域中有各種載體遞送技術可供使用。宿主細胞可呈整株植物、經單離細胞、或原生質體之形式。用於將載體引入植物細胞中之說明性程序包括農桿菌屬(agrobacterium)介導之植物轉化、原生質體轉化、基因轉移至花粉中、注射到生殖器官中、及注射到未成熟胚胎中。如對所屬技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的，此等方法中之各者具有不同的優點及缺點。因此，將載體引入特定植物物種中之一個特定方法不一定對另一種植物物種最有效。

此外，可選擇調節插入序列之表現或以所欲特定方式修飾並加工基因產物的宿主細胞株。蛋白質產物之此類修飾（例如醣基化）及加工（例如切割）可能對抗體或功能片段之功能係重要的。不同宿主細胞具有用於蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾的特徵性及特異性機制。可選擇適當的細胞系或宿主系統以確保所表現之外來蛋白質的正確修飾及加工。為此，可使用擁有用於基因產物之初級轉錄本之適當加工、醣基化、及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NSO（鼠類骨髓瘤細胞系，其不會內源性產生任何免疫球蛋白鏈）、CRL7O3O、及HsS78Bst細胞。

為了長期、高產率的產生重組蛋白質，穩定表現係較佳的。例如，可將穩定表現抗體或其功能片段之細胞系工程改造。可將宿主細胞用藉由適當表現控制元件（例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等）所控制之DNA及選擇標記轉化，而不是使用含有病毒複製起點之表現載體。在引入外來DNA後，可使經工程改造之細胞在經富集培養基中生長1至2天，接著切換至選擇性培養基中。重組質體中之選標性標記賦予選擇抗性且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中並生長以形成聚集體(foci)，其繼而可選殖至細胞系中並擴增。此方法可有利地用以工程改造表現抗體分子之細胞系。

可使用許多選擇系統，包括但不限於使用下列之系統：單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al., 1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)、及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17)基因，分別在tk-、hgprt-、或aprt-細胞中。此外，可使用抗代謝物抗性(antimetabolite resistance)作為下列基因之選擇基礎：dhfr，其賦予胺甲喋呤抗性(Wigler et al., 1980, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 77(6):3567-70；O'Hare et al., 1981, Proc. Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；麩醯胺酸合成酶(GS)，其係負責使用麩胺酸及氨生物合成麩醯胺酸之酶(Bebbington et al., 1992, Biuotechnology 10:169)；gpt，其賦予黴酚酸抗性(Mulligan & Berg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其賦予胺基糖苷G-418抗性（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215）；及hygro，其賦予濕黴素抗性((Santerre et al., 1984, Gene 30:147)。可應用重組DNA技術方法以選擇所欲重組殖株，且此類方法係描述於例如Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；及於Chapters 12 and 13, Dracopoli et al.(eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.150: 1，其等之全文以引用方式併入本文中。抗體分子之表現水平可藉由載體擴增來增加（綜述參見Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)）。當在表現抗體或其功能片段之載體系統中之標記係可擴增的時，增加在宿主細胞培養物中存在之抑制劑水平將增加標記基因複本之數量。由於擴增區與抗體基因相連，所以抗體之生產亦將增加(Crouse et al., 1983, Mol.Cell.Biol.3:257)。

一旦抗體分子已藉由重組表現生產，可藉由用於純化免疫球蛋白分子之任何合適的方法來純化抗體分子，例如藉由層析法（例如，離子交換層析法、親和力層析法（特別是針對在蛋白質A之後的特異性抗原之親和力層析法）、及篩分管柱層析法）、離心、差異溶解度(differential solubility)、或藉由用於蛋白質純化之任何其他標準技術。此外，主題抗體或其功能片段可與本文所提供或以其他方式在所屬技術領域中已知促進純化之異源多肽序列融合。例如，主題抗體或其功能片段可通過重組方式添加多-組胺酸標籤（His-標籤）、FLAG-標籤、血球凝集素標籤（HA-標籤）、或myc-標籤等市售標籤並利用合適的純化方法來純化。 治療方法

在另一態樣中，本文提供使用本文所揭示之抗體或其功能片段在體外、離體、或體內抑制免疫細胞之方法。在一些情況下，免疫細胞係T細胞、B細胞、巨噬細胞、或任何其他免疫細胞。在一些情況下，免疫細胞係效應T細胞。在一些情況下，免疫細胞係抗原特異性T細胞。在一些情況下，本文所揭示之方法適用於治療有需要之對象。在一些情況下，該方法包含向有需要之對象投予本文所揭示之抗體或其片段。在一些情況下，該方法包含在體外抑制免疫細胞及將免疫細胞轉移至有需要之對象。

在另一態樣中，本發明之抗體可用作將另一種治療劑或細胞毒性劑（例如，毒素）遞送至表現PD-1之細胞的靶向劑。該方法包括投予與治療劑或細胞毒性劑偶合之抗PD-1抗體或在允許抗體與在細胞表面上表現之PD-1結合的條件下投予。

在另一態樣中，本文提供使用本文所揭示之抗體或其功能片段治療有需要之對象之疾病或病況的方法。在一些情況下，主題方法適用之疾病或病況係與PD-1或PD-L1信號傳導相關。在一些情況下，疾病或病況係發炎性病症、自體免疫病症、及/或與過度或非所欲之免疫反應相關。

在一些實施例中，本揭露提供一種治療有需要之哺乳動物（例如人類）之發炎性病症的方法，其包含向哺乳動物投予治療有效量的本揭露之抗體。在一些情況下，發炎性病症係多發性硬化症。在其他情況下，發炎性病症係自體免疫疾病。在一些情況下，疾病或病況係成年發作型斯蒂爾氏病(adult-onset Still's disease)；酒精性肝炎、酒精性脂肪性肝炎(alcoholic steatohepatitis)、酒精性肝病、氣喘、包括過敏原誘導之氣喘、大疱性類天疱瘡(BP)氣喘、非過敏原誘導之氣喘、過敏及過敏性病況（諸如過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性結膜炎、過敏性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis)、及過敏性神經炎(allergic neuritis)）、食物過敏、異體移植體排斥、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、ANCA血管炎、抗腎小球基底膜病(anti-glomerular basement membrane disease, Anti-GBM)、抗磷脂質症候群、口瘡口炎、闌尾炎、關節炎、自體免疫疾病、萎縮性甲狀腺炎(atrophic thyroiditis)、自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)（免疫全血球減少症(immune pancytopenia)、陣發性夜間型血色素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)）、自體免疫性多發性內分泌病(autoimmune polyendocrinopathies)、自體免疫性血小板減少症（特發性血小板減少性紫癲(idiopathic thrombocytopenic purpura)、免疫介導之血小板低下症(immune-mediated thrombocytopenia)、自體免疫肝炎、惡性貧血（艾迪森氏病）、及自體免疫甲狀腺疾病、自體發炎性疾病、體染色體顯性多囊腎病(ADPKD)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis, AS)、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、貝賽特氏病或症候群、蜂灸誘導之發炎(bee sting-induced inflammation)、布勞症候群(Blau syndrome)、滑囊炎、巴雷特氏食道症(Barrett's esophagus)、博萊黴素誘導之肺纖維化(bleomycin induced pulmonary fibrosis)、阻塞性細支氣管炎；心肌肥厚症、麩質敏感性腸病(gluten-sensitive enteropathy)（乳糜瀉）、化學刺激誘導之發炎、脈絡膜視網膜炎、伴隨脂質營養不良及高溫之慢性非典型性嗜中性球皮膚病(chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperature, CANDLE)症候群、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、慢性胰臟炎、慢性前列腺炎、慢性復發性多病灶骨髓炎(chronic recurrent multifocal osteomyelitis)、瘢痕性禿髮、結腸炎、複雜性局部疼痛症候群(complex regional pain syndrome)、慢性肝內或肝外膽汁鬱積性疾病(chronic intrahepatic or extrahepatic cholestatic disease)、結膜炎、結締組織疾病、結締組織疾病相關之間質性肺病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease, CTD-ILD)、角膜潰瘍、隱熱蛋白相關之週期症候群(cryopyrin-associated periodic syndrome)、皮膚紅斑性狼瘡(cutaneous lupus erythematosus, CLE)、囊性纖維化、介白素1受體拮抗劑缺乏症(deficiency of the interleukin-1 receptor antagonist, DIRA)、IL36R拮抗劑缺乏症(deficiency of IL36R antagonist, DITRA)、皮膚炎、糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)（糖尿病腎病變）、憩室炎、盤狀紅斑性狼瘡(discoid lupus erythematosus)、藥物誘導之遲發型皮膚過敏性反應(drug induced delayed type cutaneous allergic reaction)、腦炎、食道炎、嗜酸性腸胃道疾病(eosinophilic gastrointestinal disorder, EGID)，諸如嗜酸性食道炎(eosinophilic esophagitis, EoE)、嗜酸性腸胃炎、嗜酸性結腸炎；家族性寒冷性蕁麻疹(familial cold urticarial)、家族性地中海型發熱病、瘻管性克羅恩病(fistulizing Crohn’s disease)、巨大細胞動脈炎、腎小球性腎炎、痛風、痛風性關節炎、移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease, GVHD)、肉芽腫性肝炎(granulomatous hepatitis)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome, GBS)、葛瑞夫茲氏病、橋本氏甲狀腺炎；亨偌-絲奇恩賴氏紫癜(Henoch-Schönlein purpura)、化膿性汗腺炎(hidradenitis suppurativa, HS)、透明膜疾病(hyaline membrane disease)、發炎性反應亢進(hyperactive inflammatory response)、嗜酸性白血球增多症候群(hypereosinophilic syndrome, HES)、伴隨反覆發熱之高免疫球蛋白D症(hyperimmunoglobulinemia D with recurrent fever, HIDS)、超敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis, Hp)、免疫球蛋白(IgA)腎病變、IgG4-相關之疾病、免疫複合物腎炎(immune complex nephritis)、免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura, ITP)、發炎、CNS發炎、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease, IBD)、呼吸道（上呼吸道或下呼吸道）發炎性疾病（諸如發炎性肺病、支氣管炎、鼻竇炎）、發炎性缺血性事件（諸如中風或心搏停止）、發炎性肝病、發炎性肌肉病變、發炎性神經性病變、發炎性疼痛、昆蟲咬傷誘導之發炎(insect bite-induced inflammation)、間質性膀胱炎、虹膜炎、刺激誘導之發炎、幼年型關節炎、幼年型類風濕性關節炎、角膜炎、腎臟移植排斥、腎臟疾病、腎臟纖維化、腎臟機能不全、白血球黏附缺乏症(leukocyte adhesion deficiency)、呂佛勒氏症候群(Loeffler's syndrome)、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎(LN)、肝臟纖維化、非酒精性脂肪肝；肝臟缺血；脂質及脂蛋白病症；肥大細胞活化症候群、肥大細胞增多症(mastocytosis)、腦膜炎、顯微性結腸炎(microscopic colitis)、混合型結締組織疾病、侷限性硬皮病(morphea)或侷限性硬皮病變種、穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome)（蕁麻疹-耳聾-澱粉樣變性症(urticaria deafness amyloidosis)）、黏膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、壞死性小腸結腸炎、新生兒發作型多系統發炎性疾病(neonatal onset multisystem inflammatory disease, NOMID)、鼻瘜肉症、血管增生性青光眼、神經炎、非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、無放射影像確認之中軸性脊椎關節炎(nr-AxSpA)、非囊性纖維化支氣管擴張(non-cystic fibrosis bronchiectasis, non-CFB)、肝臟阻塞性或慢性發炎性病症；眼部過敏、視神經炎、器官移植排斥、退化性骨關節炎(osteoarthritis, OA)、耳炎、胰腺炎(pancreatitis)、全結腸炎、骨盆腔發炎性疾病(pelvic inflammatory disease)、尋常型天疱瘡(pemphigus vulgaris, PV)、大疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid, BP)、心包膜炎、牙周炎、PFAPA（週期性發熱、口瘡口炎、咽炎、淋巴腺炎(periodic fever, aphthous stomatitis, pharyngitis, adenitis)）、植物刺激誘導之發炎、肺囊蟲感染(pneumocystis infection)、肺炎(pneumonia/pneumonitis)、毒長春籐/漆酚油誘導之發炎(poison ivy/ urushiol oil-induced inflammation)、多發結節性動脈炎、多軟骨炎(polychondritis)、多囊性腎病(polycystic kidney disease, PCKD)、風濕性多肌痛(polymyalgia rheumatic)、多發性肌炎、囊炎(pouchitis)、直腸炎、直腸乙狀結腸炎(proctosignmoiditis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis, PsA)、肺動脈高血壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)、肺纖維化、化膿性無菌性關節炎(pyogenic sterile arthritis)、搔癢病、再灌注損傷及移植排斥、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、萊特爾氏病(Reiter's disease)、反應性關節炎、腎臟移植排斥、再灌注損傷、風濕病心臟炎(rheumatic carditis)、風濕性疾病、風濕熱、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、鼻炎、鼻炎性乾癬、類肉瘤病(sarcoidosis)、施尼茲勒氏症候群(Schnitzler syndrome)、鞏膜炎、硬化症（諸如全身性硬化症(systemic sclerosis, SSc)）、皮脂溢(seborrhea)、敗血病、敗血性休克、修格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、發炎性皮膚疾病或病況，諸如痤瘡、圓禿、異位性皮膚炎、酒糟性皮膚炎、濕疹、皮膚炎、皮膚炎內毒血症(dermatitis endotoxemia)、皮肌炎(dermatomyositis)、鬱血性皮膚炎(stasis dermatitis)、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、皮膚刺激、皮疹、皮膚敏感（接觸性皮炎或過敏性接觸性皮炎）、硬皮症、乾癬、尋常型乾癬(psoriasis vulgaris)、乾癬性關節炎；脊椎狹窄症、脊椎關節病變(spondyloarthropathy)、滑液膜發炎、全身性發炎反應症候群(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、全身性肥大細胞疾病(systemic mast cell disease, SMCD)、全身性血管炎、全身性發作型幼年特發性關節炎(systemic-onset juvenile idiopathic arthritis)、顳動脈炎、肌腱炎、腱鞘炎(tenosynovitis)、甲狀腺炎(thyroditis)、移殖排斥、腎小管間質性腎炎(tubulointerstitial nephritis)、腎小管功能障礙(tubular disfunction)、高安氏動脈炎(Takayasu arteriti)、毒性表皮壞死鬆解症(toxic epidermal necrolysis)、蕁麻疹、子宮肌瘤、葡萄膜炎、葡萄膜視網膜炎(uveoretinitis)、血管炎、血管炎(NHLBI)、白斑病(vitiligo)、或韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)。在一些情況下，疾病或病況係痤瘡、酸誘導之肺損傷(acid-induced lung injury)、艾迪森氏病、腎上腺增生(adrenal hyperplasia)、腎上腺皮質功能不全(adrenocortical insufficiency)、老年性黃斑部退化(age-related macular degeneration)、老化、酒精性肝疾病、阿滋海默氏病(Alzheimer's disease)、狹心症、血管纖維瘤(angiofibroma)、無汗外胚層發育不全(anhidrotic ectodermal dysplasia)、腹水症(ascites)、麴菌病(aspergillosis)、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)、動脈粥狀硬化斑塊(atherosclerotic plaque)、澱粉樣變性症(amyloidosis)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、血管性水腫(angioedema)、急性心肌梗塞；抗原-抗體複合物介導之疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(alpha-1-antitrypsin deficiency)；背痛、炭疽桿菌感染(Bacillus anthracis infection)、貝爾氏麻痹症(Bell’s palsy)、鈹中毒(berylliosis)、骨痛、灼痛、大疱性類天疱瘡、癌症、腕隧道症候群(carpal tunnel syndrome)、卡索氏病(Castleman's disease)、分解代謝症(catabolic disorder)、白內障(cataract)、大腦動脈瘤(cerebral aneurysm)、器官移植併發症、角膜移殖血管增生(corneal graft neovascularization)、隱球菌病(cryptococcosis)、非惡性過度增生症(non-malignant hyperproliferative disorder)；惡性過度增生性症；肝細胞癌；結腸腺瘤；息肉症；結腸腺癌；乳癌；胰臟腺癌(pancreatic adenocarcinoma)、慢性心臟衰竭、早產兒慢性肺病(chronic lung disease of prematurity)、心血管代謝症候群、心血管疾病、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema)、異常血脂症(dyslipidemia)；子宮內膜異位(endometriosis)、內毒血症(endotoxemia)、嗜酸性GI疾病(eosinophilic GI disease, EGID)、嗜酸性食道炎(EoE)、嗜酸性白血球肺炎、上髁炎(epicondylitis)、表皮溶解水皰症(epidermolysis bullosa)、多形性紅斑(erythema multiforme)、紅血球母細胞減少症(erythroblastopenia)、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(familial amyloidotic polyneuropathy)、胎兒宮內生長受限(fetal growth retardation)、肌肉纖維疼痛(fibromyalgia)、青光眼、神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)、腎小球疾病(glomerular disease)、腸疾病(gut disease)、生長板損傷(growth plate injuries)、脫髮、帶狀疱疹及單純疱疹(herpes zoster and simplex)、低形成性及其他貧血(hypoplastic and other anemias)、頭部損傷、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、及E型肝炎、疱疹；頭痛、聽覺損失、心臟病、血管瘤、血友病性關節病(hemophilic joint)、遺傳週期性發熱症候群(hereditary periodic fever syndrome)、遺傳性結締組織病症(heritable disorders of connective tissue)、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、高氨血症(hyperammonemia)、高鈣血症(hypercalcemia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、肝炎、髖關節置換(hip replacement)、肥厚性骨形成(hypertropic bone formation)、超敏性肺炎、遺傳性果糖不耐受症(hereditary fructose intolerance)、高血壓、高尿酸血症(hyperuricemia)、特發性脫髓鞘性多發性神經病變(idiopathic demyelinating polyneuropathy)、包括病毒疾病之感染性疾病諸如AIDS（HIV感染）、魚鱗癬(ichthyosis)、色素失調症（incontinentia pigmenti, IP，布-西二氏症候群(Bloch–Siemens syndrome)）、特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)、感染性單核白血球增多症(infectious mononucleosis)、缺血/再灌注、胰島素抗性、關節置換、由寄生蟲感染引起之腎損傷、鉤端螺旋體症(leptospirosis)、硬化性苔癬(lichen sclerosus, LS)、扁平苔癬(lichen planus)、藍伯-伊頓重症肌無力候(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、萊姆病(Lyme disease)、肝衰竭（包括急性肝衰竭）、肌肉萎縮(muscle wasting)、肌肉營養不良(muscular dystrophy)、馬凡氏症候群(Marfan syndrome, MFS)、腦膜瘤(meningioma)、間皮瘤(mesothelioma)、多器官損傷症候群、重症肌無力(myasthenia gravis, MG)、骨髓化生不良症候群(myelodysplastic syndrome)、代謝症候群、多發性硬化症、腎病變症候群(nephrotic syndrome)、神經病理學疾病(neuropathological disease)、核因子κB必須調節因子(nuclear factor-kappa B essential modulator, NEMO)缺乏症候群、肥胖症、奧斯勒-韋伯症候群(Osler-Weber syndrome)、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、骨壞死(osteonecrosis)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、先天性厚甲症(pachyonychia congenita)、佩吉特氏病(Paget’s disease)、佩吉特氏骨病、帕金森氏病(Parkinson's disease)、週期性發熱、百日咳(pertussis)、原發性肺高壓、壞疽性膿皮病(pyoderma gangrenosum)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生(pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、腹膜子宮內膜異位(peritoneal endometriosis)、結節性癢疹(prurigo nodularis)、心理社會應激病(psychosocial stress disease)、肺病、肺高壓、呼吸窘迫症候群(respiratory distress syndrome)、腎疾病、視網膜疾病(retinal disease)、晶狀體後纖維組織增生(retrolental fibroplasia)、腎臟移植排斥(renal transplant rejection)、針對藥物誘導之范康尼氏症候群之腎臟保護(renal protection against drugs inducing Fanconi’s syndrome)、由呼吸道融合病毒所引起之呼吸道疾病(respiratory tract illness caused by respiratory syncytial virus)、鼻竇炎；輻射誘導之纖維化、類肉瘤病(sarcoidosis)、嚴重疼痛、呼吸中止症(sleep apnea)、脊髓佝僂症(scoliosis)、鐮狀細胞貧血(sickle cell anemia)、運動損傷、扭傷及拉傷、曬傷、脊髓損傷、塞紮里症候群(Sézary syndrome)、二氧化矽誘導之疾病（矽肺病）、蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage)、結核病(tuberculosis)、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關之週期性症候群(tumor necrosis factor (TNF) receptor associated periodic syndrome, TRAPS)、血栓症；創傷性腦損傷、組織移植、第1型或第2型糖尿病併發症、弓蟲病(toxoplasmosis)、血小板減少症、砂眼、血管再狹窄、人工呼吸器誘導之肺損傷(ventilator induced lung injury)；惠氏病(Whipple's disease)、或2,8-二羥基腺嘌呤腎病變(2,8-dihydroxyadenine nephropathy)。

主題抗體可治療的疾病或病況之實例包括但不限於急性瀰漫性腦脊髓炎(ADEM)、艾迪森氏病、過敏、圓禿、肌萎縮性脊髓側索硬化症、ANCA血管炎、僵直性脊椎炎、抗磷脂質症候群、氣喘（包括過敏性氣喘）、異位性皮膚炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫胰臟炎、自體免疫多內分泌症候群、貝賽特氏病、大疱性類天疱瘡、腦性瘧疾、慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變、乳糜瀉、克隆氏症、庫欣氏症候群、皮肌炎、第1型糖尿病、嗜酸性肉芽腫性多血管炎、移植物抗宿主疾病、葛瑞夫茲氏病、格巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、化膿性汗腺炎、IgG4相關之疾病、發炎性纖維化（例如硬皮症、肺纖維化、及肝硬化）、幼年型關節炎、川崎病、白血病、狼瘡性腎炎、淋巴瘤、淋巴增生病症、多發性硬化症、重症肌無力、骨髓瘤、無放射影像確認之中軸性脊椎關節炎(nr-AxSpA)、視神經脊髓炎、骨關節炎、天疱瘡、多發性肌炎、原發性膽汁性膽管炎、原發性硬化性膽管炎、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、修格連氏症候群、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、高安氏動脈炎、顳動脈炎、移植排斥、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑、及伏格特-小柳-原田氏症。在一些情況下，疾病或病況包含類風濕性關節炎。在一些情況下，疾病或病況包含多發性硬化症。

在一些情況下，治療有需要之對象之疾病或病況的方法包含向對象投予治療有效量的本文所揭示之促效抗體、向對象投予包含治療有效量的本文所揭示之抗體之醫藥組成物、或免疫接合物、及至少一種醫藥上可接受之賦形劑，其中疾病或病況進一步包含感染、與感染相關之內毒素性休克(endotoxic shock associated with infection)、關節炎、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、全身性發作型幼年特發性關節炎(JIA)、發炎性腸道疾病(IBD)、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、氣喘、異位性皮膚炎、骨盆腔發炎性疾病、阿滋海默氏病、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、腸躁症候群、多發性硬化症、僵直性脊椎炎、皮肌炎、葡萄膜炎、佩洛尼氏疾病(Peyronie's disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛疾病、腹膜炎(peritonitis)、乾癬、血管炎、手術沾黏、中風、第I型糖尿病、萊姆關節炎、腦膜腦炎(meningoencephalitis)、免疫介導之中樞及周邊神經系統之發炎性病症(immune mediated inflammatory disorders of the central and peripheral nervous system)、自體免疫病症、胰腺炎、手術創傷、移植物抗宿主疾病、移植排斥、心臟病、骨質再吸收(bone resorption)、燒傷病人、心肌梗塞、佩吉特氏病、骨質疏鬆症、敗血病、肝/肺纖維化、牙周炎、胃酸過少症(hypochlorhydia)、實體腫瘤（腎細胞癌）、肝癌、多發性骨髓瘤、攝護腺癌、膀胱癌、胰臟癌、神經系統癌、及B細胞惡性腫瘤（例如卡索氏病、某些淋巴瘤、慢性淋巴球白血病、及多發性骨髓瘤）、狼瘡性腎炎、及骨關節炎。在一些情況下，疾病或病況包含修格連氏症候群。在一些情況下，疾病或病況包含發炎性腸道疾病(IBD)。在一些情況下，疾病或病況包含全身性紅斑性狼瘡(SLE)。在一些情況下，疾病或病況包含狼瘡性腎炎(LN)。在一些情況下，疾病或病況包含血管炎，諸如抗嗜中性球細胞質抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA)相關之(ANCA)血管炎。在一些情況下，疾病或病況包含移植物抗宿主疾病(GvHD)。在一些情況下，疾病或病況包含第1型糖尿病。在一些情況下，疾病或病況包含貝賽特氏症候群。在一些情況下，疾病或病況包含敗血病。在一些情況下，疾病或病況包含骨關節炎(OA)。在一些情況下，疾病或病況包含全身性硬化症(SSc)。在一些情況下，疾病或病況包含皮肌炎。在一些情況下，疾病或病況包含乾癬性關節炎(PsA)。在一些情況下，疾病或病況包含IgG4相關之疾病。在一些情況下，疾病或病況包含無放射影像確認之中軸性脊椎關節炎(nr-AxSpA)。在一些情況下，疾病或病況包含多發性肌炎。在一些情況下，疾病或病況包含高安氏動脈炎。

在一些實施例中，本揭露提供一種治療有需要之哺乳動物之癌症的方法，其包含向哺乳動物投予治療有效量的本揭露之抗體。在一些情況下，癌症係肝細胞癌。在其他情況下，癌症係急性骨髓性白血病、胸腺癌、腦癌、肺癌、鱗狀細胞癌、皮膚癌、眼癌、視網膜母細胞瘤、眼球內黑色素瘤、口腔及口咽癌、膀胱癌、胃癌、胃癌、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、頭癌、頸癌、腎臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、食道癌、睪丸癌、婦科癌、甲狀腺癌、CNS癌、PNS癌、AIDS相關之癌症（例如淋巴瘤及卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)）、或病毒誘導之癌症。

在一些實施例中，待治療之對象係哺乳動物，諸如人類。在一些實施例中，待治療之對象係人類。在其他情況下，哺乳動物係小鼠、大鼠、貓、狗、兔、豬、綿羊、馬、牛、山羊、沙鼠、倉鼠、天竺鼠、猴、或任何其他哺乳動物。許多此類哺乳動物可為所屬技術領域中已知之作為用於某些疾病或病症（包括發炎性疾病、實體腫瘤、及/或其他癌症）之臨床前模型的對象（例如Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol.170:793；Kerbel, 2003 Canc. Biol. Therap. 2(4 Suppl 1):S134；Man et al., 2007 Canc. Met. Rev. 26:737；Cespedes et al., 2006 Clin. TransL Oncol. 8:318）。

在另一態樣中，本揭露提供使用本揭露之PD-1抗體與第二藥劑結合治療哺乳動物之疾病或病況的方法。第二藥劑可與抗體一起、在抗體之前、或在抗體之後投予。在一些實施例中，第二藥劑係作用以和緩本文所述之發炎性病況之症狀的藥劑。消炎劑包括非類固醇消炎藥物(NSAID)及皮質類固醇。NSAID包括但不限於水楊酸鹽，諸如乙醯水楊酸；二氟尼索、水楊酸、及雙柳酸；丙酸衍生物，諸如伊布洛芬；萘普生；右布洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、奧沙普秦、非諾洛芬、洛索洛芬、及酮洛芬；乙酸衍生物，諸如吲哚美辛、雙氯芬酸、妥美丁、乙醯氯芬酸、舒林酸、萘丁美酮、依托度酸、及酮洛酸；烯醇酸衍生物，諸如吡羅昔康、氯諾昔康、美洛昔康、伊索昔康、替諾昔康、保泰松、及哚昔康；鄰胺苯甲酸衍生物，諸如甲芬那酸、氟芬那酸、甲氯芬那酸、及托芬那酸；選擇性COX-2抑制劑，諸如塞內昔布、蘆美昔布、羅菲昔布、依他昔布、凡第昔布、非羅昔布、及帕瑞昔布；磺醯苯胺，諸如尼美蘇來；及其他諸如氯尼辛、及利克飛龍。皮質類固醇包括但不限於可體松、地塞米松、氫化可體松、甲基潑尼松龍、潑尼松、及潑尼松龍。

在一些實施例中，第二藥劑係免疫抑制劑。可與主題抗體組合使用的免疫抑制劑包括但不限於羥氯喹寧、柳氮磺吡啶、來氟米特、依那西普、英利昔單抗、阿達木單抗、D-青黴胺、口服用金化合物、注射用金化合物（肌內注射）、米諾四環素、金硫蘋果酸鈉、金諾芬、D-青黴胺、氯苯紮利、布西拉明、阿克他利、環磷醯胺、硫唑嘌呤、胺甲葉酸、咪唑立賓、環孢素、及他克莫司。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防類風濕性關節炎。此類劑之非限制性實例包括疾病修飾抗風濕藥物(DMARDS)，諸如羥氯喹、柳氮磺吡啶、胺甲喋呤、及來氟米特；TNF抑制劑（例如，依那西普、阿達木單抗、英利昔單抗、戈利木單抗(golimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)）、T細胞共刺激抑制劑（例如，阿巴西普(abatacept)）、IL-6受體抑制劑（例如，托西利單抗(tocilizumab)、沙瑞盧單抗(sarilumab)）、抗CD20抗體（例如，利妥昔單抗(rituximab)）；及JAK抑制劑（例如，托法替尼(tofacitinib)、巴瑞克替尼(baricitinib)、優帕替尼(upadacitinib)）；NSAID，諸如伊布洛芬、萘普生、及雙氯芬酸；COX-2抑制劑，諸如塞內昔布及依他昔布；類固醇及皮質類固醇，例如潑尼松龍及可體松；及已知用於治療及/或預防此類病況之生物劑，包括例如依那西普（例如，ENBREL）、英利昔單抗（例如，REMICADE）、阿達木單抗（例如，HUMIRA）、阿那白滯素(anakinra)（例如，KINARET）、阿巴西普（例如，ORENCIA）、利妥昔單抗（例如，RITUXAN）、賽妥珠單抗（例如，CIMZIA）、戈利木單抗（例如，SIMPONI）、及托西利單抗（例如，ACTEMRA）。在一些實施例中，本揭露之化合物係與兩種可用於治療及/或預防風濕病學病況之額外治療劑投予。在一些實施例中，可用於治療及/或預防風濕病學病況之劑包括本揭露之化合物及兩種額外治療劑（諸如胺甲喋呤+來氟米特、胺甲喋呤+柳氮磺吡啶、胺甲喋呤+環孢素、胺甲喋呤+羥氯喹）及三聯療法治療劑（羥氯喹+柳氮磺吡啶+胺甲喋呤、羥氯喹+柳氮磺吡啶+來氟米特）。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防全身性紅斑性狼瘡(SLE)或狼瘡性腎炎(LN)。此類劑之非限制性實例包括抑制免疫系統之活性的免疫抑制藥物及批准用於治療SLE之劑，諸如羥氯喹、類固醇及皮質類固醇（例如，潑尼松、甲基潑尼松龍）、貝利木單抗(belimumab)、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、環磷醯胺、黴芬酸酯(mycophenolate/mycophenolate mofetil)、環孢素、來氟米特、伏環孢素(voclosporin)、阿巴西普、阿利弗魯單抗(anifrolumab)、利妥昔單抗、NSAIDS（諸如萘丁美酮鈉及伊布洛芬）、抗瘧疾藥（諸如羥氯喹）、鈣調磷酸酶抑制劑、及他克莫司。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療LN，諸如潑尼松+黴酚酸類似物、潑尼松+黴酚酸鈉潑尼松+環磷醯胺、潑尼松+他克莫司、潑尼松+伏環孢素、潑尼松+貝利木單抗+黴酚酸類似物、潑尼松+貝利木單抗+環磷醯胺、潑尼松+利妥昔單抗。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療LN，諸如潑尼松+黴酚酸類似物、潑尼松+黴酚酸鈉、潑尼松+硫唑嘌呤、潑尼松+他克莫司、潑尼松+環孢素、潑尼松+咪唑立賓。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防骨關節炎(OA)。此類劑之非限制性實例包括非類固醇消炎藥(NSAID)、局部辣椒素、關節內糖皮質素注射劑、乙醯胺酚、度洛西汀(duloxetine)、特拉嗎竇(tramadol)、及可注射皮質類固醇，諸如甲基潑尼松龍乙酸酯、乙酸特安皮質醇(triamcinolone acetate)、貝皮質醇乙酸酯(betamethasone acetate)及貝皮質醇磷酸鈉、六丙酮特安皮質醇、及地塞米松。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防胃腸病學病況諸如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)或克隆氏症(Crohn’s disease, CD)。此類劑之非限制性實例包括英利昔單抗、阿達木單抗、戈利木單抗、維多珠單抗、托法替尼、優特克單抗、那他珠單抗、美沙拉嗪、重氮鍵結之5-ASA、柳氮磺吡啶、巴柳氮、奧沙拉嗪、皮質類固醇（諸如布地奈德）、氫化可體松、甲基潑尼松龍、及潑尼松；免疫抑制劑或免疫調節劑，諸如硫唑嘌呤及6-甲巰嘌呤、環孢素、及胺甲喋呤。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防肺臟病學病況，諸如特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)或間質性肺病(ILD)。此類劑之非限制性實例包括尼達布尼(nitendanib)、吡非尼酮(pirfenidone)、皮質類固醇（諸如潑尼松）、其他風濕藥物，包括黴芬酸酯（例如，CellCept ^®）、硫唑嘌呤（例如，Imuran ^®）、來氟米特（例如，ARAVA ^®）、利妥昔單抗（例如，RITUXAN ^®）、環磷醯胺（例如，CYTOXAN ^®）、他克莫司（例如，PROGRAF ^®），減少胃酸的藥劑，諸如H-2受體拮抗劑或質子泵抑制劑，諸如拉索米唑(lansoprazole)（例如，PREVACID ^®24HR）、奧美拉唑(omeprazole)（例如，Prilosec OTC）及泮托拉唑(pantoprazole)（例如，PROTONIX ^®）。

在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防肝臟病學或腎臟病學病況，諸如NAFLD、NASH、DKD、或CKD。此類劑之非限制性實例包括甲福明(metformin)、鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2抑制劑(sodium–glucose cotransporter-2 inhibitor, SGLT2i)、用於血糖控制之藥物療法、DPP-4抑制劑、胰島素、磺醯脲、TZD（噻唑烷二酮(thiazolidinedione)）、α-葡萄糖苷酶抑制劑、SGLT2抑制劑（例如，恩格列淨(empagliflozin)、坎格列淨(canagliflozin)、達格列淨(dapagliflozin)）、升糖素樣肽-1受體促效劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonist, GLP-1 RA)（例如，利西拉肽(lixisenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、索馬魯肽(semaglutide)、艾塞那肽(exenatide)、阿必魯肽(albiglutide)、德拉魯泰(dulaglutide)）、DPP-4抑制劑（例如，沙格列汀(saxagliptin)、阿格列汀(alogliptin)、西他列汀(sitagliptin)、利拉利汀(linagliptin)）、一或多種用於治療高血壓之劑（諸如血管緊縮素轉化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制劑及血管緊縮素2受體阻斷劑(angiotensin 2 receptor blocker, ARB)）、支持減重或控制血糖之劑、膽固醇降低劑（例如，斯他汀(statin)）、非奈利酮(finerenone)、及用於治療糖尿病之劑，諸如α葡萄糖苷酶抑制劑（例如，阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose)）。

在一些實施例中，第二藥劑係有用的，在一些實施例中，第二藥劑可用於治療及/或預防皮膚病況，諸如異位性皮膚炎(AD)。此類劑之非限制性實例包括局部皮質類固醇(topical corticosteroid, TCS)（例如，地奈德(desonid)、氫化可體松、氟洛皮質醇(luocinolon)、特安皮質醇(triamcinolone)、貝皮質醇二丙酸脂）、局部鈣調磷酸酶抑制劑(topical calcineurin inhibitor, TCI)（例如，他克莫司、吡美莫司(pimecrolimus)）、局部抗微生物劑及抗菌劑、環孢素、胺甲喋呤、黴芬酸酯、干擾素γ、磷酸二酯酶4 (phosphodiesterase 4, PDE4)抑制劑（諸如克立硼羅(crisaborole)）、JAK抑制劑（例如，盧佐替尼(ruxolitinib)、優帕替尼、阿布羅替尼(abrocitinib)）、全身性糖皮質素（例如，潑尼松）、度匹單抗(dupilumab)、及抗IL-13抗體（例如，塔羅金單抗(tralokinumab)）。

本發明之又其他態樣提供所揭示之抗體用於偵測生物樣本中PD-1之存在的用途。所偵測之PD-1之量可能與PD-1之表現水平相關，其繼而與對象中免疫細胞之活化狀態相關（例如活化T細胞、B細胞、及單核球）。

本文所揭示之抗體待投予之具體劑量可取決於所選擇之特定抗體、所依循之給藥方案、是否與其他藥劑組合投予、投予時機、所投予之組織、及攜帶其之實體遞送系統而有所變化。在一些實施例中，抗體係在一治療週期之療程期間在平均每週約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100 mg之範圍內投予至對象。

在一些實施例中，抗體係在一治療週期之療程期間以平均每天大於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、或10 mg之量投予至對象。例如，抗體係在一治療週期之療程期間以平均每天在約6與10 mg之間、在約6.5與9.5 mg之間、在約6.5與8.5 mg之間、在約6.5與8 mg之間、或在約7與9 mg之間的量投予至對象。

在一些實施例中，單次劑量的抗體係以約0.01 mg/kg至50 mg/kg之範圍內投予至對象，諸如約、小於約、或超過約0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg、0.06 mg/kg、0.07 mg/kg、0.08 mg/kg、0.09 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、或50 mg/kg。在一些實施例中，單次劑量的抗體係以約0.01 mg/kg至10 mg/kg之範圍內投予至對象，諸如0.01 mg/kg至0.1 mg/kg、0.01 mg/kg至1 mg/kg、0.01 mg/kg至0.5 mg/kg、0.05 mg/kg至0.1 mg/kg、0.05 mg/kg至0.5 mg/kg、0.05 mg/kg至1 mg/kg、0.05 mg/kg至5 mg/kg、0.1 mg/kg至0.5 mg/kg、0.1 mg/kg至1 mg/kg、0.1 mg/kg至5 mg/kg、0.1 mg/kg至10 mg/kg、0.5 mg/kg至1 mg/kg、0.5 mg/kg至5 mg/kg、0.5 mg/kg至10 mg/kg、1 mg/kg至5 mg/kg、1 mg/kg至10 mg/kg、或5 mg/kg至10 mg/kg。抗體之劑量可係約、至少約、或至多約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000 mg或mg/kg、或可衍生於其中之任何範圍。設想到，mg/kg之劑量係指每公斤(kg)的對象總重量之抗體毫克(mg)量。設想到，當給予患者多劑量時，該等劑量之量可變化或其可為相同。

在一些實施例中，抗體係以每天約0.01 mg/kg至50 mg/kg之範圍內投予至對象，諸如每天約、小於約、或超過約0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg、0.06 mg/kg、0.07 mg/kg、0.08 mg/kg、0.09 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、或50 mg/kg。在一些實施例中，抗體係以每週約0.1 mg/kg至400 mg/kg之範圍內投予至對象，諸如每週約、小於約、或超過約0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、或400 mg/kg。在一些實施例中，抗體係以每月約0.4 mg/kg至1500 mg/kg之範圍內投予至對象，諸如每月約、小於約、或超過約0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、或1000 mg/kg。在一些實施例中，抗體係以每週約0.1 mg/m ²至200 mg/m ²之範圍內投予至對象，諸如每週約、小於約、或超過約1 mg/m ²、5 mg/m ²、10 mg/m ²、15 mg/m ²、20 mg/m ²、25 mg/m ²、30 mg/m ²、35 mg/m ²、40 mg/m ²、45 mg/m ²、50 mg/m ²、55 mg/m ²、60 mg/m ²、65 mg/m ²、70 mg/m ²、75 mg/m ²、100 mg/m ²、125 mg/m ²、150 mg/m ²、175 mg/m ²、或200 mg/m ²。目標劑量可以單次劑量投予。替代地，目標劑量可以約或超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30次、或更多次劑量投予。例如，每週約1 mg/kg之劑量可在週之療程期間以每週約1 mg/kg之劑量每週遞送、每兩週投予約2 mg/kg、或每四週投予約4 mg/kg。投予時程表可根據本文所述之任何方案，包括本文所述之任何投予時程表重複。在一些實施例中，抗體係以約0.1 mg/m ²至500 mg/m ²之範圍內投予至對象，諸如約、小於約、或超過約1 mg/m ²、5 mg/m ²、10 mg/m ²、15 mg/m ²、20 mg/m ²、25 mg/m ²、30 mg/m ²、35 mg/m ²、40 mg/m ²、45 mg/m ²、50 mg/m ²、55 mg/m ²、60 mg/m ²、65 mg/m ²、70 mg/m ²、75 mg/m ²、100 mg/m ²、130 mg/m ²、135 mg/m ²、155 mg/m ²、175 mg/m ²、200 mg/m ²、225 mg/m ²、250 mg/m ²、300 mg/m ²、350 mg/m ²、400 mg/m ²、420 mg/m ²、450 mg/m ²、或500 mg/m ²。 醫藥組成物

在另一態樣中，本文提供醫藥組成物，其包含本文所揭示之抗PD-1抗體或其功能片段、及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。醫藥上可接受之載劑或賦形劑可包括但不限於惰性固體稀釋劑及填料、稀釋劑、無菌水溶液及各種有機溶劑、滲透增強劑、增溶劑、及佐劑。此等組成物可根據用於製備醫藥上可用的組成物之已知方法調配。在所屬技術領域中具有通常知識者熟知且容易取得之許多來源中描述配方。例如， Remington's Pharmaceutical Science(Martin E.W., Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19 ^thed., 1995)描述可結合本發明使用之配方。

本文所揭示之醫藥組成物可例如呈適用於口服投予之形式，如錠劑、膠囊、丸劑、粉劑、持續釋放配方、溶液、懸浮液；呈適用於腸胃外注射之形式，如無菌溶液、懸浮液、或乳劑；呈適用於局部投予之形式，如軟膏或乳膏；或呈適用於直腸投予之形式，如栓劑。持續釋放製劑之合適的實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性(semipermeable)基質，該等基質呈成形物品之形式，例如，膜、或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美國專利第3,773,919號）、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、非降解型乙烯-乙酸乙烯酯、降解型乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT ^™（包含乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)之注射用微球）、及聚-D-(-)-3-羥丁酸。一些持續釋放配方能夠在數週至數個月、或甚至長達數年期間持續釋放分子。在一些實施例中，主題醫藥組成物釋放如本文所述之主題抗體持續至少數週，諸如至少1週、2週、3週、或4週。在進一步實施例中，主題醫藥組成物在數個月期間持續釋放如本文中所描述之主題抗體，諸如持續至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、或6個月。

本文所揭示之醫藥組成物可呈適用於單次投予精確劑量之單位劑型(unit dosage form)。醫藥組成物可進一步包含抗體或其功能片段作為活性成分且可包括習知之醫藥載劑或賦形劑。此外，該醫藥組成物可包括其他藥用或醫藥劑、載劑、佐劑等。

例示性腸胃外投予形式包括活性多肽及/或PEG修飾之多肽於無菌水溶液（例如，丙二醇水溶液或右旋糖溶液）中之溶液或懸浮液。若有需要，此類劑型可用鹽類（諸如組胺酸及/或磷酸鹽）合適地緩衝。

適用於投予之配方包括例如，水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、制菌劑、及使配方與預期接受者之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。

配方係存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密封之安瓿及小瓶，且可儲存於使用前僅需要無菌液體載劑（例如注射用水）之條件的冷凍乾燥(freeze-dried)（凍乾(lyophilized)）條件中。即時注射溶液(extemporaneous injection solution)及懸浮液可從無菌粉末、顆粒、錠劑等製備。

在一些實施例中，本揭露提供一種用於注射之醫藥組成物，其含有主題抗體或其功能片段、及適用於注射之醫藥賦形劑。在此類組成物中之劑之例示組分及量係如本文所述。

可併入本揭露之組成物以藉由注射來投予之形式包括具有芝麻油、玉米油、棉籽油、或花生油、以及酏劑、甘露醇、右旋糖、或無菌水溶液、及類似的醫藥媒劑之水性或油性懸浮液、或乳劑。

於鹽水中之水溶液可用於注射。亦可採用乙醇、甘油、丙二醇、液體聚乙二醇、及其類似者（及其合適的混合物）、環糊精衍生物、及植物油。適當流動性可例如藉由以下來維持：例如在分散液之情況下使用包衣（諸如卵磷脂）來維持所需之粒徑、及/或藉由使用界面活性劑。預防微生物之作用可藉由各種抗細菌及抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞、及類似物來實現。

無菌注射用溶液可藉由將本揭露之抗體或其功能片段以所欲之量與上文所列舉之各種其他成分併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。大致上，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌注射用溶液之無菌粉劑之情況下，某些所欲之製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其從其先前無菌過濾之溶液中產出具有活性成分加上任何額外所欲成分之粉劑。

在一些實施例中，本揭露提供一種用於口服投予之醫藥組成物，其含有本揭露之抗體或其功能片段、及適用於口服投予之醫藥賦形劑。

在一些實施例中，本文提供一種用於口服投予之固體醫藥組成物，其含有：(i)有效量的本揭露之抗體或其功能片段；可選地(ii)有效量的第二藥劑；及(iii)適用於口服投予之醫藥賦形劑。在一些實施例中，組成物進一步含有：(iv)有效量的第三藥劑。

在一些實施例中，醫藥組成物係適用於口服攝取之液體醫藥組成物。適用於口服投予之醫藥組成物可呈現為離散劑型（諸如各自含有呈粉末或顆粒之形式的預定量的活性成分的膠囊、扁囊劑(cachet)、或錠劑、或液體、或氣溶膠噴霧劑）、溶液、或於水性或非水性液體中之懸浮液、水包油乳劑、或油包水液體乳劑。此類劑型可藉由任何藥劑學之方法製備，且一般而言包括使活性成分與構成一或多種必要成分的載劑聯合之步驟。大致上，組成物係藉由將活性成分與液體載劑或細分之固體載劑或兩者均勻且緊密地混合來製備，接著若有需要，則將產物成形成所欲形式。

本揭露進一步涵蓋包含活性成分之無水醫藥組成物及劑型，因為水可助長一些多肽之降解。例如，在所屬醫藥技術領域中可添加水（例如，5%）作為模擬長期儲存之手段，以判定諸如儲存壽命或配方隨時間之穩定性等特徵。無水醫藥組成物及劑型可使用無水或含低水分之成分及低水分或低濕度條件製備。若預期在製造、包裝、及/或儲存期間會與水分及/或潮濕大量接觸，則含有乳糖之醫藥組成物及劑型可製成無水。可製備無水醫藥組成物並儲存使得其維持無水性質。因此，無水組成物可係使用已知防止暴露於水之材料包裝，使得其可包括在合適的處方集套組(formulary kit)中。合適的包裝之實例包括但不限於密封之箔片、塑膠或類似者、單位劑量容器、泡殼包裝(blister pack)、及條帶包裝(strip pack)。

本揭露之抗體可根據習知醫藥配製技術與醫藥載劑於緊密混合物中組合。取決於投予所欲之製劑形式，載劑可採取各式各樣的形式。在製備用於口服劑型之組成物時，任何常用醫藥介質均可採用作為載劑，諸如例如在口服液體製劑（諸如懸浮液、溶液、及酏劑）或氣溶膠之情況下為水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑、著色劑、及類似者；或在口服固體製劑之情況下可使用載劑諸如澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑、及崩解劑，在一些實施例中不使用乳糖。例如，就固體口服製劑而言，合適的載劑包括粉劑、膠囊、及錠劑。若有需要，錠劑可藉由標準水性或非水性技術來包覆。

適用於醫藥組成物及劑型中之黏合劑包括但不限於玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、或其他澱粉、明膠、天然及合成膠（諸如阿拉伯膠）、藻酸鈉、藻酸、其他藻酸鹽、粉狀黃蓍膠、瓜爾膠、纖維素及其衍生物（例如，乙基纖維素、乙酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉）、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、預糊化澱粉、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、及其混合物。

適用於醫藥組成物及劑型中之填料之實例包括但不限於滑石粉、碳酸鈣（例如，顆粒或粉末）、微晶纖維素、粉狀纖維素、葡萄糖結合劑(dextrate)、高嶺土、甘露醇、矽酸、山梨醇、澱粉、預糊化澱粉、及其混合物。

崩解劑可用於組成物中，以提供當暴露於水性環境中時崩解之錠劑。過多崩解劑可能會產生可能在瓶中崩解之錠劑。太少可能不足以發生崩解，且可能因此改變（多種）活性成分從劑型中釋放之速率及程度。因此，可使用既不太少也不太多，不會有害地改變（多種）活性成分之釋放的足量的崩解劑來形成劑型。所使用之崩解劑之量可基於配方類型及投予模式而變化，且所屬技術領域中具有通常知識者可容易地辨別。在醫藥組成物中可使用約0.5至約15重量百分比的崩解劑、或約1至約5重量百分比的崩解劑。可用於形成醫藥組成物及劑型的崩解劑包括但不限於洋菜(agar-agar)、藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、聚克立林鉀、乙醇酸澱粉鈉、馬鈴薯或樹薯澱粉、其他澱粉、預糊化澱粉、其他澱粉、黏土、其他藻素、其他纖維素、膠、或其混合物。

可用於形成醫藥組成物及劑型的潤滑劑包括但不限於硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕質礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、月桂基硫酸鈉、滑石粉、氫化植物油（例如，花生油、棉花籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及大豆油）、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、洋菜、或其混合物。額外潤滑劑包括例如syloid矽膠、合成二氧化矽之凝結型氣溶膠(coagulated aerosol)、或其混合物。可以可選地以少於醫藥組成物之約1重量百分比的量添加潤滑劑。

當需要水性懸浮液及/或酏劑用於口服投予時，其中之活性成分可與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料組合，且若有需要，可與乳化劑及/或懸浮劑以及此類稀釋劑（諸如水、乙醇、丙二醇、甘油、及其各種組合）一起組合。

錠劑可未經包覆或藉由已知技術包覆以在胃腸道中延時崩解及吸收，從而提供較長期間的持續作用。例如，可採用延時材料，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。口服使用之配方亦可呈現為硬明膠膠囊，其中活性成分係與惰性固體稀釋劑（例如，碳酸鈣、磷酸鈣、或高嶺土）混合，或呈現為軟明膠膠囊，其中活性成分係與水或油介質（例如，花生油、液體石蠟、或橄欖油）混合。

可用於形成醫藥組成物及劑型的界面活性劑包括但不限於親水性界面活性劑、親脂性界面活性劑、及其混合物。亦即，可採用親水性界面活性劑之混合物，可採用親脂性界面活性劑之混合物，或可採用至少一種親水性界面活性劑及至少一種親脂性界面活性劑之混合物。

具有較低HLB值之界面活性劑係較親脂性或疏水性的，且在油中具有較大的溶解度，而具有較高HLB值之界面活性劑則係較親水性的，且在水溶液中具有較大的溶解度。親水性界面活性劑通常被認為係具有大於約10之HLB值的化合物，以及HLB標度通常不適用的陰離子、陽離子、或兩性離子化合物。類似地，脂質性（亦即，疏水性）界面活性劑係具有等於或小於約10之HLB值的化合物。然而，界面活性劑之HLB值僅係通常用於調配工業、醫藥、及化妝品乳劑之粗略指南。

親水性界面活性劑可為離子性或非離子性。合適的離子性界面活性劑包括但不限於烷基銨鹽；夫西地酸(fusidic acid)鹽；胺基酸、寡肽、及多肽之脂肪酸衍生物；胺基酸、寡肽、及多肽之甘油酯衍生物；卵磷脂及氫化卵磷脂；溶血卵磷脂及氫化溶血卵磷脂；磷脂質及其衍生物；溶血磷脂質及其衍生物；肉鹼(carnitine)脂肪酸酯鹽；烷基硫酸鹽；脂肪酸鹽；多庫酯鈉(sodium docusate)；醯基乳酸鹽(acyl lactylate)；單及二甘油酯之單及二乙醯化酒石酸酯；琥珀酸化單及二甘油酯；單及二甘油酯之檸檬酸酯；及其混合物。

在前述群組中，作為實例之方式，離子性界面活性劑包括：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂質、溶血磷脂質、及其衍生物；肉鹼脂肪酸酯鹽；烷基硫酸鹽；脂肪酸鹽；多庫酯鈉(sodium docusate)；醯基乳酸酯；單及二甘油酯之單及二乙醯化酒石酸酯；琥珀酸化單及二甘油酯；單及二甘油酯之檸檬酸酯；及其混合物。

離子性界面活性劑可係下列之離子化形式：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂醯絲胺酸、PEG-磷脂醯乙醇胺、PVP-磷脂醯乙醇胺、脂肪酸之乳醯酯(lactylic esters of fatty acid)、硬脂醯-2-乳醯乳酸酯、硬脂醯乳醯乳酸酯、琥珀醯化單甘油酯、單/二甘油酯之單/二乙醯化酒石酸酯、單/二甘油酯之檸檬酸酯、膽醯肌胺酸(cholylsarcosine)、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉荳蔻酸酯、棕櫚酸酯、油酸酯、蓖麻油酸酯、亞麻油酸酯、次亞麻油酸酯、硬脂酸酯、月桂基硫酸酯、十四基硫酸酯(teracecyl sulfate)、多庫酯、月桂醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、肉荳蔻醯肉鹼、及其鹽及混合物。

親水性非離子性界面活性劑可包括但不限於烷基葡萄糖苷；烷基麥芽糖苷；烷基硫代葡萄糖苷(alkylthioglucoside)；月桂酸聚乙二醇甘油酯(lauryl macrogolglyceride)；聚氧伸烷基烷基醚，諸如聚乙二醇烷基醚；聚氧伸烷基烷基酚，諸如聚乙二醇烷基酚；聚氧伸烷基烷基酚脂肪酸酯，諸如聚乙二醇脂肪酸單酯及聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧伸烷基山梨糖醇脂肪酸酯，諸如聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯；多元醇與由下列所組成之群組中之至少一個成員的親水性轉酯作用(hydrophilic transesterification)產物：甘油酯、植物油、氫化植物油、脂肪酸、及固醇(sterol)；聚氧乙烯固醇、其衍生物、及類似物；聚乙氧基化(polyoxyethylated)維生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯及多元醇與由三甘油脂、植物油、及氫化植物油所組成之群組中之至少一個成員的親水性轉酯作用產物。多元醇可為甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、新戊四醇、或醣。

其他親水性非離子性界面活性劑包括但不限於PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25三油酸甘油酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20月桂酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-20硬脂酸甘油酯、PEG-20油酸甘油酯、PEG-30油酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-40月桂酸甘油酯、PEG-40棕櫚仁油、PEG-50氫化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氫化蓖麻油、PEG-60氫化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸酯/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸酯/辛酸甘油酯、聚甘油-10月桂酸酯、PEG-30膽固醇、PEG-25植物固醇、PEG-30大豆固醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40山梨糖醇油酸酯、PEG-80山梨糖醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂醚、POE-23月桂醚、POE-10油醚、POE-20油醚、POE-20硬脂醚、生育酚PEG-100琥珀酸酯、PEG-24膽固醇、聚甘油-10油酸酯(polyglyceryl-10oleate)、Tween 40、Tween 60、蔗糖單硬脂酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單棕櫚酸酯、PEG 10至100壬基酚系列、PEG 15至100辛基酚系列、及帕洛沙姆(poloxamer)。

僅作為實例之方式，合適的親脂性界面活性劑包括：脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙醯化甘油脂肪酸酯；低級醇(lower alcohol)脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；山梨糖醇脂肪酸酯；聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯；固醇及固醇衍生物；聚氧乙基化固醇及固醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；單-及二-甘油酯之乳酸衍生物；多元醇與由下列所組成之群組中之至少一個成員的疏水性轉酯作用(hydrophobic transesterification)產物：甘油酯、植物油、氫化植物油、脂肪酸、及固醇；油溶性維生素/維生素衍生物；及其混合物。在此群組中，例示性親脂性界面活性劑包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、及其混合物，或係多元醇與由下列所組成之群組中之至少一個成員之疏水性轉酯化作用產物：植物油、氫化植物油、及三酸甘油酯。

在一些情況下，該組成物包括增溶劑以確保化合物之良好增溶及/或溶解，並使化合物之沉澱最小化。此對於非口服使用之組成物（例如用於注射之組成物）可係特別有利的。亦可添加增溶劑以增加親水性藥物及/或其他組分（諸如界面活性劑）之溶解度，或將組成物維持為穩定或均勻的溶液或分散液。

合適的增溶劑之實例包括但不限於下列：醇及多元醇，諸如乙醇、異丙醇、丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其異構物、甘油、新戊四醇、山梨醇、甘露醇、卡必醇(transcutol)、二甲基異山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素、及其他纖維素衍生物、環糊精及環糊精衍生物；具有約200至約6000之平均分子量的聚乙二醇之醚，諸如四氫呋喃甲醇PEG醚（四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)）或甲氧基PEG；醯胺及其他含氮之化合物，諸如2-吡咯啶酮、2-哌啶酮、ε-己內醯胺、N-烷基吡咯啶酮、N-羥基烷基吡咯啶酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己內醯胺、二甲基乙醯胺、及聚乙烯吡咯啶酮；酯，諸如丙酸乙酯、檸檬酸三丁酯、乙醯基檸檬酸三乙酯、乙醯基檸檬酸三丁酯、檸檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇單乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己內酯及其異構物、δ-戊內酯及其異構物，β-丁內酯及其異構物；及其他所屬技術領域中已知之增溶劑，諸如二甲基乙醯胺、二甲異山梨醇、N-甲基吡咯啶酮、單辛精(monooctanoin)、二乙二醇單乙醚、及水。

亦可使用增溶劑之混合物。實例包括但不限於三乙酸甘油酯、檸檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、N-羥乙基吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基環糊精、乙醇、聚乙二醇200至100、四氫呋喃聚乙二醇醚、卡必醇、丙二醇、及二甲基異山梨醇。例示性增溶劑包括山梨醇、甘油、三乙酸甘油酯、乙醇、PEG-400、四氫呋喃聚乙二醇醚、及丙二醇。

可包括的增溶劑之量並無特別限制。給定的增溶劑之量可限於生物可接受之量，其可由所屬技術領域中具有通常知識者容易地判定。在一些情況下，包括遠超過生物可接受之量的增溶劑之量可為有利的（例如，以使藥物之濃度最大化），且在向對象提供組成物前，使用習知技術（諸如蒸餾或蒸發）來移除過量增溶劑。因此，若存在增溶劑，則以藥物及其他賦形劑之合併重量計，增溶劑可係在10重量%、25重量%o、50重量%、100重量%、或至多約200重量%之重量比率。若有需要，則亦可使用非常少量的增溶劑，諸如5%、2%、1%、或甚至更少。典型而言，增溶劑可以約1重量%至約100重量%、更典型地約5重量%至約25重量%之量存在。

組成物可進一步包括一或多種醫藥上可接受之添加劑及賦形劑。此類添加劑及賦形劑包括但不限於防黏劑、消泡劑、緩衝劑、聚合物、抗氧化劑、防腐劑、螯合劑、黏度調節劑、張力調節劑(tonicifier)、調味劑、著色劑、氣味劑、遮光劑(opacifier)、懸浮劑、黏合劑、填料、塑化劑、潤滑劑、及其混合物。

此外，可將酸或鹼併入組成物中以促進加工、增強穩定性、或其他原因。醫藥上可接受之鹼的實例包括胺基酸、胺基酸酯、氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鋁、碳酸鈣、氫氧化鎂、矽酸鋁鎂、合成矽酸鋁、合成單方解石(synthetic hydrocalcite)、氫氧化鋁鎂、二異丙基乙胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三異丙醇胺、三甲胺、參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)、及類似者。亦合適者的鹼係下列醫藥學上可接受之酸之鹽：諸如乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、烷烴磺酸(alkanesulfonic acid)、胺基酸、抗壞血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、檸檬酸、脂肪酸、甲酸、丁烯二酸、葡萄糖酸、氫醌磺酸(hydroquinosulfonic acid)、異抗壞血酸、乳酸、順丁烯二酸、草酸、對溴苯磺酸(para-bromophenylsulfonic acid)、丙酸、對甲苯磺酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、單寧酸、酒石酸、硫代乙醇酸、甲苯磺酸、尿酸、及其類似者。亦可使用多質子酸之鹽，諸如磷酸鈉、磷酸氫二鈉、及磷酸二氫鈉。當鹼係鹽時，陽離子可係任何合宜且醫藥上可接受之陽離子，諸如銨、鹼金屬、鹼土金屬、及類似者。實例可包括但不限於鈉、鉀、鋰、鎂、鈣、及銨。

合適的酸係醫藥上可接受之有機酸或無機酸。合適的無機酸之實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸、及類似者。合適的有機酸之實例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、烷烴磺酸、胺基酸、抗壞血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、檸檬酸、脂肪酸、甲酸、丁烯二酸、葡萄糖酸、氫醌磺酸、異抗壞血酸、乳酸、順丁烯二酸、甲磺酸、草酸、對溴苯磺酸、丙酸、對甲苯磺酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、單寧酸、酒石酸、硫代乙醇酸、甲苯磺酸、尿酸、及其類似物。

在本揭露之另一態樣中，提供套組，其包含含有本揭露之抗體組成物之單位劑量及使用說明書。套組可進一步包含一或多個單位劑量，其含有一或多種額外試劑（諸如如上述之免疫抑制試劑）、或如本文所述之一或多種額外抗體（例如，具有結合至抗原上不同於第一人類抗體之抗原決定基的互補活性的人類抗體）。套組一般包括標籤，其指示套組內容物之預期用途。用語標籤包括套組上供應或與套組一起供應、或套組以任何方式隨附之任何書面或記錄材料。

本揭露之套組亦可包括診斷劑及/或其他治療劑。在一些情況下，套組包括本揭露之抗體及診斷劑，其可用於診斷對象之如本文所述之疾病、病況、或病症之狀態或存在的診斷方法中。 醫療用途

在另一態樣中，本文提供用於療法中之本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物、包含本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物之醫藥組成物。合適地，本文提供用於如本文所揭示之治療方法中之本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物、或包含本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物之醫藥組成物。

在另一態樣中，本文提供一種本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物、或包含本揭露之抗體或抗原結合片段或免疫接合物之醫藥組成物於製造用於療法（諸如用於如本文所揭示之治療方法）中之藥劑的用途。 序列表

SEQ ID NO: 1，CDRH1，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 TYPIE SEQ ID NO: 2，CDRH2，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 NFHPYNDDTKYNEKFQG SEQ ID NO: 3，CDRH3，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 ENYGSHGGFVY SEQ ID NO: 4，CDRL1，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 RASSSVISSYLH SEQ ID NO: 5，CDRL2，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 STSNLAS SEQ ID NO: 6，CDRL3，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 QQYNSYPLT SEQ ID NO: 17，人類IgG1之Fc，具有P238D突變，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 THTCPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 18，重鏈，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAFGYTFTTYPIEWMRQAPGKGLEWIGNFHPYNDDTKYNEKFQGRVTLTVDKSSTTVYMELSSLRSEDTAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 19，輕鏈，分子類型：蛋白質，生物體：合成構築體 ENQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVISSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 實例

提供下列實例以進一步說明本揭露之一些實施例，但不意欲限制本揭露之範疇；藉由其等之例示性本質將理解的是，可替代地使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他程序、方法、或技術。 實例1 ：Fc 受體交互作用對例示性抗PD-1 抗體之促效劑功能的效應

在報導子檢定中探究例示性抗人類PD-1促效抗體（於2015年11月10日公告之美國專利第9,181,342號中所述之殖株19小鼠IgG1）之信號傳導效應，在檢定中將在NFAT反應元件之控制下產生螢光素酶的PD-1表現性Jurkat T細胞與如前述之表現抗CD3「T細胞刺激劑」(TCS)構築體之BW5147細胞一起培養(Leitner et al. 2010)。為了探究Fc受體交互作用在抗體促效作用中之角色，檢定係用僅表現TCS構築體之BW5147細胞或用亦經轉染以表現小鼠FcγR2B之BW5147細胞執行。

在96孔U底盤中每孔添加5×10 ⁴個Jurkat報導子細胞（Promega目錄號J1250b），並與5×10 ⁴個BW5147細胞、加上PD-1抗體或同型對照於總體積為80 µL之檢定緩衝劑(RPMI 1640 + 1% FCS)中共培養。從200nM向下以1比3稀釋執行抗體之9點稀釋系列。在37℃下之加濕CO ₂培養箱中培養6小時之後，將盤從培養箱中移出並平衡至室溫10分鐘。使用Bio-Glo ^™螢光素酶檢定系統(Promega)定量所產生之螢光素酶之量（作為T細胞活化之量度）；將80 µl Bio-Glo ^™螢光素酶檢定試劑添加至各孔中，且將盤在室溫下培養10 min。使用CLARIOstar Plus (BMG Labtech)定量發光。

當使用表現小鼠FcγR2B之刺激細胞時，PD-1抗體殖株19造成T細胞活化顯著降低，且IC50為0.13nM（圖 1A）。當使用不表現Fc受體之刺激細胞時，殖株19對T細胞活化沒有影響（圖 1B）。 實例2 ：例示性抗PD-1 抗體之人源化

將殖株19之VH及VL序列與人生殖系序列之資料庫進行比對，且選擇同源序列作為用於人源化之構架。IGHV1-24*01或IGHV7-4-1*02係用作VH域之構架，且IGKV1-39*01或IGKV3-11*01係用作VL域之構架。

將VH及VL序列通過CDR移植演算法運行，以將來自鼠類抗體殖株19之CDR轉移至所選之人類生殖系序列上。為了實現結構引導之人源化，建立殖株19鼠類VH及VL之模型，且為了保持結合完整性，使用結構引導之方法判定哪些構架胺基酸要保留在人源化抗體構架中。表 1總結所產生之VH及VL序列。

所生產之抗體變體係由人源化VH及VL域之所有潛在組合所組成。變體係在人類IgG1κ同型上生產。人源化抗體變體與人類或食蟹獼猴PD-1之結合親和力及動力學係藉由使用Biacore 8K (Cytiva)之表面電漿共振(SPR)判定。使用人類抗體捕捉套組(Cytiva)，以用多株抗人類IgG塗佈S系列CM5感測晶片(Cytiva)。接著抗PD-1抗體被捕捉至生物感測器表面上，且同型對照抗體被捕捉於參考通道中。接著在單循環動力學分析中，在37℃下在緩衝劑（10 mM Hepes、150 mM NaCl、0.005% v/v界面活性劑P20，pH 7.4，HBS-P）中將各種濃度的單體可溶性人類PD-1胞外域或可溶性食蟹獼猴PD-1胞外域注射在經固定之抗體上。在減去參考及空白之後，使用BiaEvaluation軟體(Cytiva)擬合締合及解離速率，並計算解離常數。表2顯示各人源化變體與人類及食蟹獼猴PD-1之結合K _D。 表1. 例示性PD-1 促效抗體可變區之序列

	名稱	人類構架	序列	SEQ ID NO	分子類型	生物體
親本	VH	-	QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKAFGYTFTTYPIEWMKQNHGKSLEWIGNFHPYNDDTKYNEKFKGKAKLTVEKSSTTVYLELSRLTSDDSAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSG	7	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VH1	IGHV1-24*01	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAFGYTFTTYPIEWMRQAPGKGLEWIGNFHPYNDDTKYNEKFQGRVTLTVDKSSTTVYMELSSLRSEDTAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSS	8	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VH2	IGHV1-24*01	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAFGYTFTTYPIEWVRQAPGKGLEWMGNFHPYNDDTKYNEKFQGRVTMTVDKSTTTVYMELSSLRSEDTAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSS	9	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VH3	IGHV7-4-1*02	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAFGYTFTTYPIEWMRQAPGQGLEWIGNFHPYNDDTKYNEGFTGRFVLSVDKSSTTVYLQISSLKAEDTAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSS	10	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VH4	IGHV7-4-1*02	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAFGYTFTTYPIEWVRQAPGQGLEWMGNFHPYNDDTKYNEGFTGRFVFSVDKSVTTVYLQISSLKAEDTAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTVSS	11	蛋白質	合成構築體

親本	VL	-	ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVISSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPDRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYNSYPLTFGAGTKLEIK	12	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VL1	IGKV1-39*01	ENQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVISSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK	13	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VL2	IGKV1-39*01	ENQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVISSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRGYPLTFGGGTKLEIK	14	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VL3	IGKV3-11*01	ENVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVISSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK	15	蛋白質	合成構築體
人源化	hu-VL4	IGKV3-11*01	ENVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVISSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNRATGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK	16	蛋白質	合成構築體

表2. 例示性PD-1 促效抗體之結合親和力

抗體ID	VH 名稱	VL 名稱	人類PD-1 結合K _D (nM)	食蟹獼猴PD-1 結合K _D (nM)
親本	VH	VL	53.7	318
humCL19v1	hu-VH1	hu-VL1	31.5	278
humCL19v2	hu-VH1	hu-VL2	1010	3410
humCL19v3	hu-VH1	hu-VL3	37.3	236
humCL19v4	hu-VH1	hu-VL4	32	199
humCL19v5	hu-VH2	hu-VL1	57.6	440
humCL19v6	hu-VH2	hu-VL2	2000	15200
humCL19v7	hu-VH2	hu-VL3	64.5	565
humCL19v8	hu-VH2	hu-VL4	58.9	369
humCL19v9	hu-VH3	hu-VL1	44.8	251
humCL19v10	hu-VH3	hu-VL2	670	8460
humCL19v11	hu-VH3	hu-VL3	52.5	249
humCL19v12	hu-VH3	hu-VL4	47.5	253
humCL19v13	hu-VH4	hu-VL1	160	1000
humCL19v14	hu-VH4	hu-VL2	80200	79200
humCL19v15	hu-VH4	hu-VL3	49000	101000
humCL19v16	hu-VH4	hu-VL4	161	896

實例3 ：Fc 突變對結合至FcγR2B 之選擇性的影響

人源化變體humCL19v1係在hIgG1、hIgG4、或一系列不同Fc突變之hIgG1恆定區域上重組生產，且藉由表面電漿共振（在37℃下於緩衝劑HBS-EP+ pH7.4中）評估其等與人類FcγR2B或兩種高度同源之FcγR2A同種異型之結合。

以重組表現之FcR（僅胞外域）作為分析物使用Biacore 8K藉由表面電漿共振評估交互作用。簡言之，使用GE Healthcare胺偶合套組將重組人類PD-1胞外域共價固定至CM5 S系列感測晶片之所有通道的兩個流動槽。接著在各通道之流動槽2中捕捉待評估之humCL19v1 Fc變體（大約500至1000反應單位(response unit)）。接著藉由注射不同濃度的FcR並測量平衡結合來執行穩態親和力分析。使用雙重參考(double referencing)（減去參考Fc1之信號且亦減去來自空白零濃度注射之信號）。自朗繆爾曲線(Langmuir curve)（繪製平衡結合對分析物濃度之圖，以判定半最大結合所需之濃度）計算K _D值。各變體與不同Fc受體之結合K _D值係顯示於表3中。在所測試之Fc變體中，僅P238D突變使與FcγR2B之結合的選擇性相對於與兩種FcγR2A同種異型之結合的選擇性增強。此突變導致適度增加與FcγR2B之結合且顯著減少與兩種FcγR2A同種異型之結合。 表3. 例示性抗體之結合親和力

	結合K _D(nM)	FcγR2B: FcγR2A (131R)之結合親和力的比率
	FcγR2B	FcγR2A 131R	FcγR2A 131H
hIgG1	4.10	1.36	1.95	0.33
hIgG4	3.31	2.55	7.16	0.77
hIgG1 P238D	2.79	17.50	90.30	6.27
hIgG1 L235N	59.00	12.30	13.50	0.21
hIgG1 L235H	13.60	3.67	3.96	0.27
hIgG1 V266M	1.54	0.58	6.28	0.37
hIgG1 S239V	3.60	1.62	3.13	0.45
hIgG1 S239I	3.99	1.65	3.38	0.41
hIgG1 Y300N	6.32	2.22	2.83	0.35
hIgG1 P271Y	20.60	9.70	8.85	0.47

實例4 ：在NFA 報導子檢定中P238D 突變之PD-1 抗體在抑制T 細胞活化方面與IgG1 抗體一樣有效

為了評估P238D突變是否影響humCL19v1之促效劑功能，使用Jurkat報導子檢定。將humCL19v1之未突變IgG1版本及前述之IgG1同型促效抗體進行比較，IgG1同型促效抗體包括PD1AB6 (WO 2017/058859 A1)、PD1B1094 (WO 2018/226580 A2)、抗體1 (WO 2019/168745 A1)、及ANB030 (WO 2020/247628 A2)。此等抗體係自各別專利申請案中所提供之序列重組生產。將在NFAT反應元件之控制下產生螢光素酶的Jurkat T細胞與如前述之表現抗CD3「T細胞刺激劑」(TCS)構築體(Leitner et al. 2010)及表現人類FcγR2B之BW5147細胞一起培養。

在96孔U底盤中每孔添加5x10^4個Jurkat報導子細胞（Promega目錄號J1250b），並與5x104個BW5147細胞、加上PD-1抗體或同型對照於總體積為80 µL之檢定緩衝劑(RPMI 1640 + 1% FCS)中共培養。測試各PD-1抗體之單次高劑量(10 µg/ml)。

在37℃下之加濕CO2培養箱中培養6小時之後，將盤從培養箱中移出並平衡至室溫10分鐘。使用Bio-Glo ^™螢光素酶檢定系統(Promega)定量所產生之螢光素酶之量（作為T細胞活化之量度）；將80 µl Bio-Glo ^™螢光素酶檢定試劑添加至各孔中，且將盤在室溫下培養10 min。使用CLARIOstar Plus (BMG Labtech)定量發光。

所測試之所有PD-1抗體相較於同型對照顯著降低T細胞活化。humCL19v1之野生型IgG1或P238D突變版本之間沒有顯著差異（圖 2A）。

在另一組實驗中，使用最佳化T細胞報導子檢定以評估humaCL19v1之P238D突變版本之效力。T細胞報導子檢定與此實例中之上述檢定類似，但用人類HEK293T刺激細胞置換鼠類BW5147刺激細胞。將在NFAT反應元件之控制下產生螢光素酶的Jurkat T細胞與如前述之表現抗CD3「T細胞刺激劑」(TCS)構築體(Leitner et al. 2010)及表現人類FcγR2B之HEK293T細胞一起培養。

在平底96孔盤中每孔接種4x10^4個HEK293T刺激細胞。在16小時之後，將培養基移除，且每孔添加於總體積為80 µL之檢定緩衝劑(RPMI 1640 + 1% FCS)中之5x10^4個Jurkat報導子細胞（Promega目錄號J1250b）、加上PD-1抗體或同型對照。從5 µg/ml開始測試5倍連續稀釋的抗體。

在37℃下之加濕CO ₂培養箱中培養6小時之後，將盤從培養箱中移出並平衡至室溫10分鐘。使用Bio-Glo ^™螢光素酶檢定系統(Promega)定量所產生之螢光素酶之量（作為T細胞活化之量度）；將80 µl Bio-Glo ^™螢光素酶檢定試劑添加至各孔中，且將盤在室溫下培養10 min。使用CLARIOstar Plus (BMG Labtech)定量發光。如圖 2B中所示，humCL19v1 P238D抑制T細胞活化高達84%，如藉由NFAT誘導之發光信號所評估，其中IC50為0.0278nM。 實例5 ：在T 細胞活化檢定中P238D 突變之PD-1 抗體在抑制初代T 細胞活化方面與IgG1 抗體一樣有效

在一組實驗中，使用破傷風類毒素活化檢定以評估例示性抗體對T細胞活化之抑制效應。將來自健康供體之總人類周邊血液單核細胞(PBMC)（96 U底盤每孔400,000個細胞）在PD-L1/2阻斷抗體（各5 µg/mL）及1 µg/ml的PD-1促效抗體或同型對照存在下用破傷風類毒素(0.5 µg/mL)刺激。在37℃、5% CO2下培養96小時之後，藉由上清液之ELISA評估IFNγ釋放。評估6名供體，且藉由在各供體中標準化至在測試抗體不存在下用破傷風類毒素活化之細胞中之IFNg水平來校對數據。

所測試之抗體包括P238D突變之humCL19v1、humCL19v1之未突變IgG1版本、及前述之IgG1同型促效抗體，其包括PD1AB6 (WO 2017/058859 A1)及抗體1 (WO 2019/168745 A1)。此等抗體係自各別專利中所提供之序列重組生產。

所測試之供體中破傷風類毒素(TT)誘導之IFNg生產相較於沒有TT之PBMC平均增加大約2倍。IgG1同型對照略微降低IFNg生產。相較於同型對照，humCL19v1 P238D、humCL19v1 IgG1、及PD1AB6皆顯著降低IFNg生產。humCL19v1之野生型IgG1或P238D突變版本之間沒有顯著差異（圖 3A）。

在另一組實驗中，使用病毒肽活化檢定以評估例示性抗體對免疫細胞活化之抑制效應。將來自健康供體之總人類周邊血液單核細胞(PBMC)（96 U底盤每孔500,000個細胞）在5 µg/mL布雷非德菌素A（Biolegend目錄號420601）及1 µg/ml PD-1抗體或P238D突變之hIgG1同型對照、或無抗體存在下用2 µg/mL CEF HLA I類肽（來自巨細胞病毒、艾司坦-巴爾病毒、及流感之肽之匯集混合物，Mabtech目錄號3618-1）刺激。在37℃、5% CO2下培養16小時之後，使用胞內流式細胞術評估在CD8 T細胞群內之IFNγ生產細胞的百分比。評估18名供體。藉由使用以下公式在各供體中進行標準化來校對數據：

(在抗體存在下之細胞介素生產–未經刺激之背景值) / (在無抗體之情況下經刺激細胞中之細胞介素生產–未經刺激之背景值)。

相較於沒有CEF肽之PBMC培養物，在所測試之供體中CEF肽誘導CD8 IFNg生產T細胞平均增加4倍。humCL19v1 P238D相較於無抗體對照顯著降低IFNg（平均63%）。（圖 3B）。 實例6 ：在抗CD3/28 活化檢定中P238D 突變之PD-1 抗體在抑制初代T 細胞活化方面與IgG1 抗體一樣有效

將來自健康供體之總人類周邊血液單核細胞(PBMC)（96 U底盤每孔100,000個細胞）在1 µg/ml PD-1促效抗體或同型對照存在下用可溶性抗CD3及抗CD28抗體（最終濃度各為0.5 ng/mL）刺激。在37℃、5% CO ₂下培養72小時之後，藉由流式細胞術評估在CD4 T細胞上之CD 25表現作為T細胞活化之標記。藉由在各供體中標準化至在測試抗體不存在下用抗CD3及抗CD28活化之細胞中之CD25幾何平均值來校對來自多名供體之數據。

所測試之抗體包括P238D突變之humCL19v1及前述之IgG1促效抗體，其包括PD1AB6 (WO 2017/058859 A1)及抗體1 (WO 2019/168745 A1)。此等抗體係自各別專利中所提供之序列重組生產。

抗CD3及抗CD28導致CD25表現顯著增加，其被所有測試之PD-1抗體顯著抑制（圖 4）。 實例7 ：IgG1 同型抗PD-1 抗體導致體外調節T 細胞之ADCC 殺滅，但P238D 突變之PD-1 抗體則否

使用體外NK細胞去顆粒作用檢定以研究抗PD-1抗體藉由ADCC除盡調節T細胞之可能性。Treg係使用來自Miltenyi（目錄號130-094-775）之人類CD4+ CD25+ CD127dim/-調節T細胞單離套組自健康供體之PBMC中藉由磁性單離來純化。NK細胞係使用來自Miltenyi（目錄號130-092-657）之人類NK單離套組類似地純化。

將20,000個經單離NK細胞接種在96孔U底盤中之每孔中，其中具有1 ug/ml的不同抗PD-1抗體或IgG1同型對照。所測試之抗體包括P238D突變之humCL19v1、humCL19v1之未突變IgG1版本、及前述之IgG1同型促效抗體，其包括PD1B1094 (WO 2018/226580 A2)及抗體1 (WO 2019/168745 A1)。此等抗體係自各別專利申請案中所提供之序列重組生產。

每孔添加100,000個Treg細胞，以給出1:5之效應:目標比。最後，將抗CD107a抗體(Biolegend #328638)連同孟寧素(monensin) (Biolegend #420701)及布雷非德菌素(Biolegend #420601)添加至各孔中，最終稀釋為1比100，以給出各孔之最終1x濃度。最終孔體積係200ul。將檢定在37C下在5% CO2中培養6小時。接著將檢定用包括CD3（死亡細胞標記）及CD56之抗體小組(antibody panel)染色，用1%甲醛固定，並藉由流式細胞術評估。將所產生之數據用FlowJo V10分析。去顆粒化NK細胞經識別為CD107+CD56+細胞。死亡Treg細胞經識別為對死亡細胞標記呈陽性之CD3+細胞。

IgG1同型抗PD-1抗體導致NK細胞去顆粒作用之顯著活化（圖 5）。P238D突變之humCL19v1沒有造成NK細胞去顆粒作用或Treg死亡。 實例8 ：humCL19v1 P238D 能夠在高水平PD-L1 存在下進一步抑制T 細胞活化，而其他PD-1 促效抗體則否

使用PD-1報導子細胞系以評估P238D突變之humCL19v1相較於前述之PD-1促效抗體在PD-L1高度表現之設置中的影響。

將表現T細胞刺激構築體（Promega目錄號J1250a）的PD-L1表現性CHOK1細胞以每孔40,000個細胞接種在96孔平底盤中並培養整夜以黏附至盤。隔天移除上清液，並將在NFAT反應元件之控制下產生螢光素酶的50,000個PD-1表現性Jurkat報導子細胞與PD-1抗體或同型對照一起添加。使用在每孔80 µl之總體積中從10ug/ml向下4x稀釋來評估PD-1抗體之劑量滴定(dose titration)。在37C下培養6小時之後，每孔添加80 µl Bio-Glo並培養15分鐘，接著在Clariostar盤讀取器上使用Firefly Luciferase設定讀取以定量螢光素酶生產。

所測試之抗體包括P238D突變之humCL19v1及前述之IgG1同型促效劑，其包括PD1AB6 (WO 2017/058859 A1)、PD1B1094 (WO 2018/226580 A2)、抗體1 (WO 2019/168745 A1)、及ANB030 (WO 2020/247628 A2)。此等抗體係自各別專利中所提供之序列重組生產。作為對照，亦評估PD-1阻斷抗體納武單抗(nivolumab)之生物相似藥(biosimilar)。

如所預期，納武單抗藉由阻斷PD-L1與PD-1之交互作用導致T細胞活化之顯著劑量反應性增加。出乎意料地，僅有P238D突變之humCL19v1抗體證實進一步抑制T細胞活化之能力（超出由PD-L1與PD-1交互作用已經提供之抑制）。所測試之其他PD-1抗體均未對T細胞活化具有任何影響（圖 6）。 實例9 ：humCL19v1 P238D 能夠抑制在RA PBMC 、纖維母細胞共培養物中之T 細胞活化

為了研究PD-1促效劑對來自類風濕性關節炎(RA)患者之T細胞的影響，將來自4名患有RA之供體的PBMC在與RA纖維母細胞樣滑膜細胞（FLS，來自Tebu-bio #408RAK-05a）共培養設置中活化。諸如纖維母細胞之基質細胞表現PD-L1及PDL-2，因此此檢定代表PD-1配體存在之生理情況(Dezutter-Dambuyant et al. 2016）。

在平底96孔盤中，將10,000個FLS細胞鋪開(plated out)於50 µl的培養基中並使其黏附2小時。接著將100,000個PBMC添加在50 µl的培養基中。將抗PD-1抗體（humCL19v1 P238D或來自WO 2019/168745 A1之抗體1）或同型對照添加在50 µl培養基中，最終濃度為1 µg/ml。最後，將抗CD3（殖株OKT3）及抗CD28（殖株CD28.2）添加在50 µl的培養基中，最終濃度各為0.5 ng/ml。在37C、5%CO ₂下培養3天之後，收集上清液並藉由流式微珠陣列(Biolegend Th17 Panel # 741032)來評估，並且藉由流式細胞術以標記CD3、CD4、CD25、及ICOS來評估細胞。促效劑humCL19v1 P238D導致在CD4 T細胞上之T細胞活化標記（包括CD25（圖 7A）及ICOS（圖 7B））之顯著降低，以及發炎性細胞介素生產（包括IFNg（圖 7C）、IL17F（圖 7D）、及TNFa（圖 7E））之顯著降低。參考促效抗體1對此等讀數中之任一者均不具有顯著影響。此等數據表明，humCL19v1 P238D在其中PD-1配體表現之設置中可為有效，而其他描述之PD-1促效劑在此等設置中則可能無效。 實例10. humCL19v1 P238D 增強PD-L1 與PD-1 之交互作用

在各種PD-1抗體存在下評估PD-L1與PD-1表現性細胞的結合。將PD-1表現性Jurkat T細胞與濃度為10 µg/ml之PD-1抗體或同型對照在冰上培養1小時。接著洗滌細胞並與遞增濃度的PDL1-Fc (Biolegend #762506)一起培養30分鐘，該PDL1-Fc已使用接合套組(Thermofisher #A20186)與AF647接合。接著再次洗滌細胞並藉由流式細胞術評估。與humCL19v1 P238D預培養過的細胞比與無抗體、同型對照、或其他描述之PD-1抗體預培養過的細胞展示出更亮的PDL1-Fc染色（圖 8）。與納武單抗預培養之細胞由於其配體阻斷抗原決定基，並沒有如預期與PDL1-Fc結合。此等數據表明humCL19v1與PD-1之結合增強其與PD-L1的交互作用。 實例11. 藉由PD-1 促效劑所下調之基因與自體免疫相關

使用與實例 1中所述者類似的方法，以定義由殖株19所致之PD-1促效作用的轉錄印記。將6孔平底盤之每孔中添加於1 ml檢定緩衝劑(RPMI 1% FCS)（含有10 µg/ml的測試抗體）中之150萬個PD-1表現性報導子Jurkat，接著添加於1 ml檢定緩衝劑中之150萬個FcR表現性刺激細胞（以產生5 µg/ml之最終抗體濃度）。對於靜止樣本(resting sample)，將於2 ml檢定緩衝劑中之150萬個Jurkat添加至空孔中。所有條件皆以6個技術重複(technical replicate)執行。所有樣本皆在37C下培養18小時。接著將來自各樣本中之80 µl的細胞轉移至用於螢光素酶評估之白色96孔盤中（如於實例 1中所述）（圖 9A），80 µl轉移至用於流式細胞術評估之96孔盤中，接著使用Mojosort小鼠CD45奈米珠(Biolegend #480028)藉由負向選擇來除盡剩餘的樣本刺激細胞。從剩餘的細胞中，將80 µl轉移至用於流式細胞術評估之96孔盤中以檢查Jurkat細胞純度（圖 9B）。將剩餘部分藉由離心沉澱，將上清液吸出，接著將細胞在-80下冷凍。將樣本使用股庫製備規程(stranded library preparation protocol)在GeneWiz進行RNA萃取及定序，其中定序深度目標為每個樣本至少20M讀數。

使用在nf-core內之rnaseq (v3.1) Nextflow流程(Nextflow pipeline)處理來自GeneWiz之RNA定序檔案。使用FastQC確認定序之品質且使用Salmon列舉針對人類基因體(GRCh38 v96)之轉錄。使用內部差異表現流程(differential expression pipeline)來進行所有後續分析，使用tximport以從估計之轉錄本豐度產生基因計數，使用DESeq2以在群組之間進行差異表現（不針對任何額外共變量調整），及使用EnrichR軟體對在群組之間表現顯著較高或較低之基因體進行基因體富集分析；經由Enrichr使用各種不同的基因體數據庫。顯著較高或較低之基因體係基於其等在DESeq2分析中之對數倍數變化來定義的群組，其中基因FDR的校正p值係小於0.05。相較於在同型對照存在下之活化，在PD-1促效劑存在下活化之細胞中有1227個基因顯著下調（圖 9C）。將此下調基因之集合在EBI GWAS目錄上定位，顯露出對與自體免疫疾病相關之基因的富集，特別是血清陽性類風濕性關節炎(sero-positive rheumatoid arthritis)（圖 9D）。此等數據表明PD-1路徑之抗體促效作用可使與自體免疫相關之發炎基因路徑下調。 實例12. 治療全身性紅斑性狼瘡之小鼠模型

在轉移模型(transfer model)中測試例示性抗體殖株19在治療SLE疾病模型中之功效，其中在H2-Ab1bm12接受者小鼠中藉由轉移來自人源化PD-1小鼠之MHC-II錯配之脾臟細胞來誘導疾病。全身性紅斑性狼瘡(SLE)係慢性自體免疫疾病，其特徵在於自體耐受性(self-tolerance)損壞並生產針對核抗原（諸如染色質及DNA）之自體抗體。免疫複合物在包括腎臟及皮膚之各種器官中之沉積導致不同的臨床表現。其可影響大約0.1%的人口，且在育齡女性及在某些種族（包括非裔美國人、亞洲人、拉丁語系人、及美國原住民(Izmirly et al., 2021)）中之頻率增加。現有療法包括消炎劑及皮質類固醇等免疫抑制劑，其等可幫助管理症狀，但尚無治癒疾病之方法，且仍需要更有效的治療方法。

在SLE之小鼠模型中測試殖株19對改善疾病之功效。先前已有描述SLE之轉移模型，其中疾病係藉由將來自供體bm12小鼠之未分級脾臟細胞(unfractionated splenocyte)轉移至C57BL/6接受者小鼠、或反之亦然(Klarquist & Janssen, 2015)。Bm12小鼠與C57BL/6小鼠在MHC II類抗原H-2A中有3個胺基酸不同。此MHC錯配導致同種異體反應，其中供體CD4 T細胞變成活化，分化成濾泡輔助細胞(follicular helper cellsm Tfh)並在生產自體抗體之情況下驅動生發中心(germinal center)形成。使用經調整之規程，其中供體脾臟細胞係衍生自在PD-1基因座處人源化之C57BL/6小鼠，以能夠評估抗人類PD-1促效抗體殖株19。此等小鼠先前在Billur Akkaya之博士論文(Akkaya, 2012)中已有描述及表徵。此提供一種模型，在該模型中儘管一些疾病繁殖(disease-propagating)之免疫細胞（諸如接受者之B細胞）不表現人類PD-1，但疾病起始(disease-initiating)之T細胞可用抗人類抗體靶向。

將在PD-1基因座處人源化之供體C57BL/6小鼠處死並將脾臟採集到RPMI培養基+ 2%FCS + P/S/N中。亦將bm12小鼠處死以提供用於無病對照(disease free control)之供體脾臟細胞。將脾臟藉由使用5 ml注射器之推桿加壓通過70 µM尼龍細胞過濾器來加工成單細胞懸浮液。接著將細胞沉澱並以每毫升2億個細胞之濃度再懸浮於PBS中。接著將每隻接受者小鼠腹膜內注射200 µl的此細胞懸浮液（每隻小鼠4,000萬個細胞）。將成年bm12小鼠（Jax庫存號：00116）用作接受者。雌性接受者接受來自雌性供體之細胞而雄性接受者接受來自雄性供體之細胞。將測試及對照抗體於無菌PBS中稀釋至1 mg/ml並IP注射。群組經分配於籠子之間以避免干擾籠蔽效應(cage effect)。將地塞米松在飲用水中投予至對照組（因此此等小鼠必須被分組到相同的籠中）。為了提供大約0.5 mg/kg/天，假設平均每日攝入量為0.2 ml/g。首先將地塞米松於100%乙醇中以10 mg/ml重構，接著在飲用水中稀釋至2.5 µg/ml (1/4000)。

在第一研究中，小鼠在細胞轉移之後的第1天及第22天腹膜內給藥200 µg測試抗體或mIgG1同型對照。對照組從第1天直到第35天為止，在飲用水中投予地塞米松。小鼠在第22天（進行血清自體抗體ELISA）及在第35天（當研究終止時）在給藥前藉由尾靜脈靜脈切開放血術取血。亦收集脾臟並藉由流式細胞術評估以定量免疫細胞擴增(immune cell expansion)，其包括供體Tfh細胞（圈選CD4+CXCR5+ICOS+細胞）之擴增。殖株19導致近乎疾病之完全預防，如藉由自體抗體水平（圖 10A 至10B）、Tfh頻率（圖 10C）、或脾臟腫大（圖 10D）所評估。在整個研究中，該效應值等於所投予之地塞米松。未經處理小鼠之間存在高度變異性，其中一些沒有植入供體細胞。在整個研究中，該效應值等於所投予之地塞米松。

在另一實驗中，殖株19係在不同時間點投予，在第0天投予再次完全防止供體TfH之擴增並顯著降低其他疾病發展之標記（圖 11A 至11B）。在第14天投予導致疾病標記物之部分降低。在第28天投予（在第30天研究終止之前）沒有導致任何標記（包括Tfh細胞頻率）之顯著降低。因為Tfh細胞表現高水平的人類PD-1，所以若殖株19經由ADCC或CDC作用為除盡性抗體(depleting antibody)，則預期其將在此48小時時程內被顯著除盡。 實例13.PD-1 促效劑在人源化小鼠中抑制延遲型超敏反應

使用在PD-1基因座處人源化之C57BL/6小鼠以在與自體免疫皮膚疾病相關之皮膚攻毒模型(skin challenge model)中評估PD-1促效殖株19對延遲型超敏反應的影響。在第0天將小鼠用於完全弗氏佐劑(complete freund adjuvant, CFA)中之鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)免疫。乳劑係將KLH (Sigma)於PBS中之混合物以1:1之比率添加至CFA (BD Biosciences)。KLH之最終濃度係4 mg/mL。將動物在1至2個部位中用100 µL的免疫乳劑皮下注射免疫。未攻毒之對照組僅接受PBS。同樣，在第0天免疫前1 h，將小鼠用mIgG1同型對照（殖珠Mopc21)或抗PD-1殖株19 mIgG1以10 mg/kg之單次劑量腹膜內處理。未攻毒之對照組僅接受PBS。從第0天至第5天，將在陽性處理對照組中之動物藉由用CsA以3 mg/kg之劑量每天一次管餵(oral gavage)來處理。為了製備CsA，將環孢靈(Sandimmune Neoral)溶液(Novartis)在0.5%甲基纖維素400cp (Sigma)中稀釋至0.3 mg/ml。在免疫之後五天，用20 µL的4 mg/mL抗原溶液在左耳之耳廓（在麻醉下）中攻毒小鼠。未攻毒之對照組在左耳之耳廓中接受20 µL的PBS。在耳朵攻毒之後一天，使用數位卡尺測量耳朵厚度。在測量耳朵厚度之後，動物被人道處死，死後，使用活組織檢體打孔器從所有群組之每個動物的左耳及右耳切下一個8 mm直徑的圓圈。將耳朵在精確的分析天平上稱重。耳水腫以左耳（攻毒）耳重與右耳（對照）耳重之間的差異評估。PD-1促效劑殖株19導致耳腫脹之顯著抑制（圖 12A）。

在另一個實驗中，在第0天免疫前1 h將小鼠用10、1、0.1、或0.01 mg/kg殖株19腹膜內處理。在此研究中，將CTLA-Ig融合蛋白（Biolegend，目錄號591908）用作陽性對照，在第0天免疫前1 h以10 mg/kg IP之劑量投予。殖株19在10 mg/kg或1 mg/kg之劑量下導致耳腫脹之顯著抑制，與CTLA4-Ig之效果可相比（圖 12B）。 實例14.PD-1 促效劑在小鼠模型中改善移植物抗宿主疾病之症狀

在一組實驗中，在體內判定humCL19v1 P238D對人類PBMC驅動之移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease, GvHD)的影響。簡言之，將大約8至10週齡之雌性NSG小鼠（JAX Labs，庫存編號05557）用2.4Gy全身射線輻照（在第-1天）。從leukopak（經由Tissue Solutions訂購之HemaCare產品）單離人類周邊血液單核細胞(PBMC)，並以25 × 10 ⁶個細胞/毫升PBS再懸浮。在幅照之後1天（在第0天）藉由尾部注射給小鼠靜脈內(IV)注射200 µl細胞懸浮液（5 × 10 ⁶個PBMC）。同樣地，在第0天，及在第7天、第14天、及第21天藉由腹膜內注射用10 mg/kg的humCL19v1 P238D或P238D突變之hIgG1同型對照處理小鼠。將小鼠定期稱重，且當其體重減輕15%時或在28天之後安樂死。在研究終止時收集周邊血液，藉由流式微珠陣列評估發炎性細胞介素。將脾臟稱重並使用hCD45、hCD4、hCD8、hCD20、hCD25、及FOXP3之標記對人類PBMC到肝臟及脾臟中之滲濾進行定量。亦藉由胞內流式細胞術評估在脾臟及肝臟中由CD8及CD4 T細胞生產之IFNg。

依循如上述之程序，humCL19v1 P238D相較於同型對照顯著降低脾臟重量（圖 13A）、脾臟（圖 13B）及肝臟（圖 13C）中之人類免疫細胞擴增、及血清發炎性細胞介素水平（圖 13D）。此外，除了降低整體細胞介素水平，humCL19v1 P238D亦在每個細胞基礎上降低CD4及CD8細胞介素生產，如藉由在肝臟及脾臟中之人類免疫細胞之胞內流式細胞術所評估（圖 13E ）。

雖然本文中已顯示並描述本揭露之較佳實施例，但所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見的是此類實施例僅作為實例之方式提供。所屬技術領域中具有通常知識者在不偏離本揭露之情況下將會有許多變型、改變、及取代。應理解的是，本揭露之實施例之各種替代方案可在實施本揭露時採用。以下申請專利範圍意欲定義本揭露之範疇，且由此涵蓋在此等申請專利範圍之範疇內的方法及結構以及其等效物。

無

本揭露之新穎特徵係在隨附申請專利範圍中具體闡述。藉由參照其中利用本揭露之原理闡述說明性實施例的以下實施方式及隨附圖式，將獲得對本揭露之特徵及優點的更好理解，其中：［圖 1A］包括顯示表現FcR之aAPC（人造抗原呈現細胞(artificial antigen presenting cell)）及呈現PD-1及TCR（T細胞受體）之相對細胞膜的示意圖（左圖）、及展示在FcR表現性aAPC存在下用例示性抗體殖株19 mIgG1處理導致T細胞抑制的圖（右圖），如由螢光素酶信號之減少所指示，而mIgG1同型對照之處理則未顯著影響T細胞活化。在此實驗中，將NFAT-螢光素酶報導子Jurkat細胞與表現小鼠FcγR2B之刺激細胞與增加濃度的抗PD-1殖株19 mIgG1或同型對照共培養，且測量發光作為T細胞活化之讀出。［圖 1B］包括不表現FcR之aAPC（人造抗原呈現細胞）及呈現PD-1及TCR（T細胞受體；左圖）之相對細胞膜的示意圖、及顯示在不表現FcR之aAPC存在下用例示性抗體殖株19 mIgG1處理對T細胞活化沒有效應的圖（右圖），如由螢光素酶信號之穩定數量所示，類似於在用mIgG1同型對照處理後之效應。在此實驗中，使用不表現任何Fc受體之刺激細胞執行與圖 1A中所示之實驗相同的檢定。［圖 2A］顯示展示例示性抗體對T細胞活化之效應的圖，如藉由Jurkat報導子檢定中之NFAT信號所判定。該圖顯示，將細胞用所有PD-1抗體及humCL19v1（參見表2）之P238D突變版本處理顯著抑制T細胞活化，但同型對照則否；在humCL19v1抗體之野生型IgG1版本與humCL19v抗體之P238D突變版本之間未偵測到顯著差異。在此實驗中，將PD-1表現性NFAT-螢光素酶Jurkat報導子細胞與人類FcγR2B表現性刺激細胞在10 µg/ml之單一濃度的各種抗PD-1抗體存在下共培養6小時，接著藉由發光定量測量NFAT活性。［圖 2B］顯示展示例示性抗體對T細胞活化之效應的圖，如藉由另一個T細胞報導子檢定中之NFAT信號所判定，在檢定中使用表現抗CD3「T細胞刺激劑」之人類HEK293T刺激細胞以刺激Jurkat T細胞之活化。該圖顯示，將細胞用humCL19v1之P238D突變版本處理顯著抑制T細胞活化，但其P238D同型對照則否。［圖 3A］顯示展示例示性抗體對T細胞活化之效應的圖，如藉由破傷風類毒素(tetanus toxoid, TT)活化檢定中之IFNγ釋放所判定。在PD-L1/2阻斷抗體存在下之破傷風類毒素活化檢定後，相較於IgG1同型對照處理，在用PD-1抗體及P238D突變版本處理後，周邊血液單核細胞的IFNγ釋放受到顯著更多的抑制。在此實驗中，將來自6名健康供體之人類PBMC在1 µg/ml之單次劑量的各種PD-1抗體存在下用破傷風類毒素刺激。在96小時之後，藉由上清液之ELISA評估IFNg生產，且將各供體數據標準化至在測試抗體不存在下所刺激之細胞中之IFNg水平。 * p＜0.05相對於同型對照，使用單因子ANOVA。［圖 3B］顯示展示例示性抗體對T細胞活化之效應的圖，如藉由病毒肽活化檢定中之IFNγ生產所判定。在布雷非德菌素A (brefeldin A)存在下之由CEF HLA I型肽刺激後，相較於IgG1同型對照處理，在用P238D突變之humCL19v1處理後，周邊血液單核細胞的IFNγ生產受到顯著更多的抑制。［圖 4］顯示展示在藉由周邊血液單核細胞之抗CD3及抗CD28刺激誘導CD25後，例示性抗體對CD25表現之效應的圖。不同於同型對照，P238D突變之humCL19v1抗體如同IgG1抗體，有效抑制初代T細胞活化(CD25)表現。在此實驗中，將來自3名健康供體之人類PBMC在1 µg/ml之單次劑量的各種PD-1抗體存在下用可溶性抗CD3及抗CD28抗體刺激。在72小時之後，藉由流式細胞術評估在CD4 T細胞上之CD25表現，且將各供體數據標準化至在測試抗體不存在下所刺激之細胞中之CD25表現水平。 * p＜0.05相對於同型對照，使用單因子ANOVA。［圖 5］顯示在PD-1抗體存在下，藉由與調節T細胞以1:5比率的純化NK細胞對調節T細胞共培養誘導的自然殺手細胞之體外去顆粒作用（抗體依賴性細胞毒性或ADCC）。不同於IgG1同型對照，所有IgG1同型抗PD-1抗體（但非P238D突變之PD-1抗體(humCL19v1 P238D)）導致調節T細胞之顯著ADCC殺滅，因而導致細胞之去顆粒作用。在此實驗中，將20,000個健康供體NK細胞與調節T細胞與1ug/ml的指示抗體一起培養。顯示來自兩個單獨的研究之數據，其中每個研究具有一個Treg供體及3個不同的NK細胞供體。各個不同的圖標代表不同的NK細胞供體，其中將NK細胞去顆粒作用標準化至該供體之無抗體設置。*p＜0.05相對於同型對照對比，使用單因子ANOVA。［圖 6］顯示僅humCLV19v1 P238D PD-1抗體能夠在高PD-L1存在下抑制T細胞活化，而所有其他抗PD-1促效抗體則否，如藉由Jurkat報導子檢定中之NFAT信號所判定。當將含有T細胞刺激構築體之PD-L1表現性細胞與PD-1表現性Jurkat報導子細胞一起培養，以測試P238D突變之humCL19v1相較於其他PD-1抗體的影響時，僅突變之P238D PD-1抗體顯著抑制T細胞活化。在此實驗中，將PD-1表現性Jurkat報導子細胞與PD-L1表現性刺激細胞在各種抗PD-1抗體存在下共培養，且藉由螢光素酶生產評估T細胞活化。［圖 7A］至［圖 7B］係展示例示性PD-1促效抗體對在RA PBMC、纖維母細胞共培養物中之T細胞活化之效應的圖，如分別藉由CD25表現（圖 7A）、ICOS表現（圖 7B）、IFNγ（圖 7C，圖中之「IFNg」）、IL-17F（圖 7D）、及TNFα（圖 7E，圖中之「TNFa」）所測量。在此實驗中，將來自患有RA之患者的PBMC與纖維母細胞樣滑膜細胞共培養並在不同的PD-1抗體或同型對照存在下用抗CD3及抗CD28刺激。在72小時評估細胞及上清液。藉由流式細胞術評估在CD4 T細胞上之CD25及ICOS表現。藉由流式微珠陣列(cytometric bead array)評估在培養物上清液中之IFNg、IL-17F、及TNFa之水平。各個符號代表不同的PBMC供體，其係標準化至該供體之無抗體設置。*p＜0.05相對於同型對照對比，使用單因子ANOVA。［圖 8］係展示例示性PD-1促效抗體對PDL1-Fc與PD-1表現性Jurkat細胞（與各種PD-1抗體預培養）之結合之效應的圖。僅humCL19v1 P238D顯示會增加PDL1-Fc與PD-1表現性Jurkat細胞之結合。在此實驗中，將PD-1表現性Jurkat細胞以10 µg/ml在冰上預培養一小時，接著用增加濃度的AF647接合之PDL1-Fc染色。［圖 9A］至［圖 9D］證實由PD-1促效劑下調之基因係與自體免疫相關。圖 9A係顯示在PD-L1不存在下但在例示性PD-1促效抗體（殖株19 mIgG1）或同型對照存在下，Jurkat T細胞之活化的圖，如藉由螢光素酶活性所測量。將PD-1表現性Jurkat報導子細胞與FcR表現性刺激細胞在5 µg/ml殖株19 mIgG1或同型對照存在下共培養，且從各孔中取出一部分的細胞以評估螢光素酶生產作為T細胞活化之讀出。圖 9B顯示活化Jurkat細胞在磁性選擇之前及之後的代表性流式細胞術圖。使用磁珠藉由負向選擇將Jurkat細胞與刺激細胞分離，且藉由流式細胞術評估經純化Jurkat之純度。圖 9C係顯示在PD-1促效劑存在下活化之Jurkat相對於同型對照之差異表現基因的火山圖，其係藉由將經純化Jurkat細胞用GeneWiz進行批量RNA定序。圖 9D顯示藉由PD-1促效作用顯著下調之基因印記。將基因定位(mapped)在EBI GWAS目錄上，以識別與不同性狀相關之基因的富集。［圖 10A］至［圖 10D］係顯示例示性PD-1促效抗體殖株19在SLE之小鼠模型中之效應的圖，如藉由總抗組蛋白IgG水平（圖 10A）、在細胞轉移之後第35天之血清中之抗dsDNA IgG水平（圖 10B）、第35天之脾臟中之Tfh細胞頻率（CXCR5+ICOS+，佔總CD4之百分比）（圖 10C）、及第35天研究終止時之脾臟重量（圖 10D）所測量。抗dsDNA IgG水平係藉由ELISA評估並使用匯集血清之標準曲線以任意單位定量。［圖 11A］至［圖 11B］顯示例示性PD-1促效抗體殖株19在SLE之小鼠模型中防止Tfh細胞之擴增而不是除盡Tfh細胞。圖 11A顯示第30天之脾臟中之Tfh細胞頻率，且圖 11B顯示在免疫細胞轉移之後在第0天、第14天、或第28天用殖珠19給藥之後，第30天之脾臟重量。［圖 12A］至［圖 12B］顯示例示性PD-1促效抗體殖株19抑制小鼠中之延遲型超敏反應。圖 12A顯示殖株19對鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)誘導之延遲型超敏(DTH)之效應。在第0天，在用10 mg/kg殖株19或同型對照抗體處理之後一小時，用KLH抗原免疫小鼠，接著在第5天在一隻耳朵中進行皮內攻毒(challenged)。在第6天測量不同處理組中之攻毒與未攻毒之耳朵之間的活體組織切片重量之差異，係顯示於圖中。圖 12B顯示另一個實驗之結果，其中將小鼠類似地處理，但使用不同劑量的殖株19。各點代表個別的小鼠。*以上群組代表p＜0.05相對於同型對照，使用Kruskal-Wallis、Dunn'多重比較測試。［ 圖13A］至［圖 13E］顯示例示性PD-1促效抗體humCL19v1 P238D改善小鼠模型中移植物抗宿主疾病之症狀。向經輻照之小鼠注射人類周邊血液單核細胞(PBMC)，接著在第0天、及在PBMC注射之後第7天、第14天、及第21天接受用10 mg/kg的humCL19v1 P238D或P238D突變之hIgG1同型之處理。相較於同型對照，humCL19v1 P238D顯示顯著降低脾臟重量（圖 13A）、脾臟（圖 13B）及肝臟（圖 13C）中之人類免疫細胞擴增、及血清發炎性細胞介素水平（圖 13D）。圖 13E顯示humCL19v1 P238D亦在每個細胞基礎上降低CD4及CD8細胞介素生產，如藉由在肝臟及脾臟中之人類免疫細胞之胞內流式細胞術所評估。

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Claims

一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與特異性結合至PD-1之抗體接觸及促效該免疫細胞中之PD-1信號傳導，其中該抗體包含：包含胺基酸取代之Fc區，且其中該胺基酸取代導致該對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該胺基酸取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對該免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。
一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與特異性結合至PD-1並增強該免疫細胞之表面上之該PD-1與PD-L1的交互作用之抗體接觸。
如請求項2之方法，其中該抗體包含Fc區，且其中該Fc區包含胺基酸取代。
如請求項3之方法，其中該胺基酸取代導致該對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該胺基酸取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對該免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。
如請求項1或4之方法，其中針對該PD-1表現性調節T細胞之該ADCC係如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定為降低。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體不會導致針對該PD-1表現性調節T細胞之顯著ADCC，如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該抗體不會活化自然殺手(NK)細胞。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該抗體包含：包含重鏈可變區之重鏈及包含輕鏈可變區之輕鏈。
如請求項8之方法，其中該重鏈可變區包含互補決定區(CDR)，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項3至9中任一項之方法，其中該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。
一種抑制表現程式性死亡1 (PD-1)之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與抗體接觸，該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中： (i) 該重鏈包含：包含CDR之重鏈可變區，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾； (ii) 該輕鏈包含：包含CDR之輕鏈可變區，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；及 (iii) 該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。
如請求項8至11中任一項之方法，其中該輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項8至12中任一項之方法，其中該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1 (CDRH1)、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項8至13中任一項之方法，其中該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1 (CDRL1)、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項8至14中任一項之方法，其中該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列。
如請求項8至15中任一項之方法，其中該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列。
如請求項8至16中任一項之方法，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7至11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項8至17中任一項之方法，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12至16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項8至18中任一項之方法，其中該重鏈包含與SEQ ID NO: 18中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項8至19中任一項之方法，其中該輕鏈包含與SEQ ID NO: 19中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項3至20中任一項之方法，其中該Fc區係衍生自人類IgG1。
如請求項3至21中任一項之方法，其中該Fc區包含與SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項8至22中任一項之方法，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體(diabody)。
如請求項1至22中任一項之方法，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區形成單鏈可變片段(ScFv)，其可操作地連接至該Fc區。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該抗體係選自由下列所組成之群組：人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及多特異性抗體。
如請求項1至25中任一項之方法，其中該抗體係單株的。
如請求項1至26中任一項之方法，其中該抗體將該免疫細胞之活化降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、或50%。
如請求項1至26中任一項之方法，其中該抗體將該免疫細胞之活化降低約10%至50%、10%至40%、10%至30%、10%至20%、10%至15%、20%至50%、20%至40%、或20%至30%。
如請求項2至28中任一項之方法，其中該免疫細胞包含T細胞、B細胞、或巨噬細胞。
如請求項2至28中任一項之方法，其中該免疫細胞包含抗原特異性T細胞。
如請求項3至30中任一項之方法，其中該Fc區選擇性結合至FcγR2B。
如請求項31之方法，其中該抗體以小於5 µM、4 µM、3 µM、或2 µM之K _D結合至人類FcγR2B，如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項31或32之方法，其中該抗體以超過5 µM或10 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項31或32之方法，其中該抗體以至少15 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項31至34中任一項之方法，其中該抗體以至少50 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項31至34中任一項之方法，其中該抗體以至少80 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項31至36中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少2:1、3:1、4:1、5:1、或6:1。
如請求項31至36中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少6:1。
如請求項31至36中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係約6:1。
如請求項31至39中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少10:1、15:1、20:1、40:1、或50:1。
如請求項31至39中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少40:1。
如請求項31至39中任一項之方法，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係約40:1。
如請求項37至42中任一項之方法，其中該比率係藉由表面電漿共振在37℃下判定。
一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)並促效PD-1信號傳導，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，其中該Fc區包含胺基酸取代，該胺基酸取代導致針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。
一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，且其中該抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用。
如請求項45之抗體，其中該Fc區包含胺基酸取代，該胺基酸取代導致該對象中針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相較於缺乏該胺基酸取代之親本分子降低，且其中該抗體相較於該親本分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。
如請求項44至46中任一項之抗體，其中該重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項44至47中任一項之抗體，其中該輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項44至48中任一項之抗體，其中該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。
一種經單離抗體，其特異性結合至程式性死亡1 (PD-1)，其中該抗體包含重鏈、輕鏈、及Fc區，其中該重鏈包含重鏈可變區，其中該輕鏈包含輕鏈可變區，且其中： (i) 該重鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 1至3中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾； (ii) 該輕鏈可變區包含CDR，該CDR包含如SEQ ID NO: 4至6中之一或多者中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾；及 (iii) 該Fc區係衍生自IgG1且在根據EU索引編號之位置238處包含天冬胺酸(D)。
如請求項50之抗體，其中該抗體增強在免疫細胞之表面上表現之PD-1與PD-L1的交互作用。
如請求項45、46、或51之抗體，其中PD-1與PD-L1之間的該交互作用係如藉由實例10中所述之檢定所判定為增強。
如請求項50至52中任一項之抗體，其中相較於包含該IgG1之Fc區之其他方面相同的分子，該抗體誘導降低的針對PD-1表現性調節T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，且其中該抗體相較於該其他方面相同的分子對免疫細胞中之PD-1信號傳導具有相同或更高的促效效應。
如請求項44、46、或53之抗體，其中針對該PD-1表現性調節T細胞之該ADCC係如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定為降低。
如請求項44、46、53、或54之抗體，其中該抗體不會導致針對該PD-1表現性調節T細胞之顯著ADCC，如藉由實例7中所述之自然殺手細胞活化檢定所判定。
如請求項44、46、或53至55中任一項之抗體，其中該抗體不會活化自然殺手(NK)細胞。
如請求項44至55中任一項之抗體，其中該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1 (CDRH1)、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項44至57中任一項之抗體，其中該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1 (CDRL1)、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列，且具有0至3個胺基酸修飾。
如請求項44至58中任一項之抗體，其中該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2、及CDRH3，且其中CDRH1、CDRH2、及CDRH3分別包含如SEQ ID NO: 1至3中所示之序列。
如請求項44至59中任一項之抗體，其中該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2、及CDRL3，且其中CDRL1、CDRL2、及CDRL3分別包含如SEQ ID NO: 4至6中所示之序列。
如請求項44至60中任一項之抗體，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7至11中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項44至61中任一項之抗體，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12至16中任一者所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項44至62中任一項之抗體，其中該重鏈包含與SEQ ID NO: 18中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項44至63中任一項之抗體，其中該輕鏈包含與SEQ ID NO: 19中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項44至64中任一項之抗體，其中該Fc區係衍生自人類IgG1。
如請求項44至62中任一項之抗體，其中該Fc區包含與SEQ ID NO: 17中所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或99%、或100%同一性的序列。
如請求項44至66中任一項之抗體，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區形成選自由下列所組成之群組的結構：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2、及雙價抗體。
如請求項44至66中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含可操作地連接至該Fc區之該重鏈可變區，且其中該輕鏈包含該輕鏈可變區。
如請求項44至66中任一項之抗體，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區形成單鏈可變片段(ScFv)，其可操作地連接至該Fc區。
如請求項44至69中任一項之抗體，其中該抗體係人源化抗體。
如請求項44至69中任一項之抗體，其中該抗體係人類抗體。
如請求項44至69中任一項之抗體，其中該抗體係選自由下列所組成之群組：人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及多特異性抗體。
如請求項44至72中任一項之抗體，其中該抗體係單株的。
如請求項44至73中任一項之抗體，其中該抗體以小於200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、或40 nM之K _D結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至73中任一項之抗體，其中該抗體以小於60 nM之K _D結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至73中任一項之抗體，其中該抗體以小於40 nM之K _D結合人類PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至76中任一項之抗體，其中該抗體以小於5000 nM、4000 nM、2000 nM、1000 nM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、或200 nM之K _D結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至76中任一項之抗體，其中該抗體以小於600 nM之K _D結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至76中任一項之抗體，其中該抗體以小於300 nM之K _D結合食蟹獼猴PD-1，如藉由表面電漿共振(SPR)在37℃下所判定。
如請求項44至79中任一項所述之抗體，其中該抗體促效在免疫細胞之表面上表現之人類PD-1。
如請求項80之抗體，其中該免疫細胞係T細胞。
如請求項44至81中任一項之抗體，其中該抗體與在免疫細胞之表面上表現之人類PD-1的結合使該細胞之增殖相對於未被該抗體結合之可相比的免疫細胞減少。
如請求項82之抗體，其中該細胞係T細胞。
如請求項82或83之抗體，其中細胞活化之降低係藉由實例4中所述之NFAT-報導子檢定測量。
如請求項82或83之抗體，其中細胞活化之降低係藉由實例5中所述之破傷風類毒素活化檢定或病毒肽活化檢定測量。
如請求項82或83之抗體，其中細胞增殖之該減少係藉由實例6中所述之抗CD3/28活化檢定測量。
如請求項82或83之抗體，其中細胞增殖之該減少係在該免疫細胞靠近PD-L1表現性細胞時測量。
如請求項87之抗體，其中細胞增殖之該減少係藉由實例8中所述之檢定測量。
如請求項82或83之抗體，其中細胞增殖之該減少係在體外或體內測量。
如請求項82至89中任一項之抗體，其中細胞增殖之該減少係至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、或50%。
如請求項82至89中任一項之抗體，其中細胞增殖之該減少係約10%至50%、10%至40%、10%至30%、10%至20%、10%至15%、20%至50%、20%至40%、或20%至30%。
如請求項44至91中任一項之抗體，其中該Fc區選擇性結合至FcγR2B。
如請求項92之抗體，其中該抗體以小於5 µM、4 µM、3 µM、或2 µM之K _D結合至人類FcγR2B，如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項92或93之抗體，其中該抗體以至少2 µM、1 µM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、100 nM、80 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、或5 nM之K _D結合至人類FcγR2B。
如請求項92之抗體，其中該抗體以200 nM至5 µM、400 nM至4 µM、500 nM至3.5 µM、800 nM至3 µM、1 µM至5 µM、1 µM至4.5 µM、1 µM至4 µM、1 µM至3.5 µM、1 µM至3 µM、1 µM至2.5 µM、或1 µM至2 µM之K _D結合至人類FcγR2B。
如請求項92至95中任一項之抗體，其中該抗體以超過5 µM或10 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項92至95中任一項之抗體，其中該抗體以至少15 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131R同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項92至97中任一項之抗體，其中該抗體以至少50 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項92至97中任一項之抗體，其中該抗體以至少80 µM之K _D結合至人類FcγR2A（131H同種異型），如藉由表面電漿共振在37℃下所判定。
如請求項92至99中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少2:1、3:1、4:1、5:1、或6:1。
如請求項92至99中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係至少6:1。
如請求項92至99中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131R同種異型）之結合親和力的比率係約6:1。
如請求項92至102中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少10:1、15:1、20:1、40:1、或50:1。
如請求項92至102中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係至少40:1。
如請求項92至102中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγR2B之結合親和力對該抗體與人類FcγR2A（131H同種異型）之結合親和力的比率係約40:1。
如請求項100至105中任一項之抗體，其中該比率係藉由表面電漿共振在37℃下判定。
一種經單離核酸，其包含一或多種編碼能夠形成如請求項44至106中任一項之抗體之多肽的核苷酸序列。
一種載體，其包含一或多種編碼能夠形成如請求項44至106中任一項之抗體之多肽的核苷酸序列。
一種宿主細胞，其包含一或多種編碼重鏈及輕鏈之胺基酸序列的核酸分子，當該核酸分子表現時能夠形成如請求項44至106中任一項之抗體。
一種方法，其包含將如請求項109之宿主細胞在生產該抗體之條件下培養。
一種方法，其包含： (a) 提供宿主細胞，該宿主細胞包含一或多種編碼重鏈及輕鏈之胺基酸序列的核酸分子，當該核酸分子表現時能夠形成如請求項44至106中任一項之抗體； (b) 培養表現所編碼之胺基酸序列之該宿主細胞；及 (c) 單離該抗體。
一種免疫接合物，其包含與藥劑接合之如請求項44至106中任一項之抗體。
一種醫藥組成物，其包含治療有效量的如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物、及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
一種用於治療疾病或病況之醫藥組成物，其包含治療有效量的如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物、及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
一種套組，其包含在容器中之如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物。
如請求項115之套組，其進一步包含含有如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物之使用說明的資訊材料。
一種治療有需要之對象之疾病或病況的方法，其包含向該對象投予治療有效量的如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物、或向該對象投予如請求項113之醫藥組成物。
如請求項117之方法，其中該疾病或病況包含與PD-1相關之疾病或病況。
如請求項117或118之方法，其中該疾病或病況包含急性瀰漫性腦脊髓炎(ADEM)、艾迪森氏病(Addison's disease)、過敏、圓禿、肌萎縮性脊髓側索硬化症、ANCA血管炎、僵直性脊椎炎、抗磷脂質症候群、氣喘、異位性皮膚炎、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫胰臟炎、自體免疫多內分泌症候群、貝賽特氏病(Behcet’s disease)、大疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid)、腦性瘧疾、慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、乳糜瀉、克隆氏症(Crohn's disease)、庫欣氏症候群(Cushing's Syndrome)、疱疹樣皮膚炎、皮肌炎、第1型糖尿病、嗜酸性肉芽腫性多血管炎、膽囊疾病、移植物抗宿主疾病、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、化膿性汗腺炎、IgG4相關之疾病、發炎性腸道疾病(IBD)、發炎性纖維化(inflammatory fibrosis)、腸躁症候群、幼年型關節炎、川崎病(Kawasaki disease)、白血病、狼瘡性腎炎、萊姆關節炎(lyme arthritis)、淋巴瘤、淋巴增生病症、腦膜腦炎、多發性硬化症、重症肌無力、骨髓瘤、無放射影像確認之中軸性脊椎關節炎(non-radiographic axial spondyloarthritis, nr-AxSpA)、視神經脊髓炎、骨關節炎、骨盆腔發炎性疾病、天疱瘡、腹膜炎、藏毛疾病、多發性肌炎、原發性膽汁性膽管炎、原發性硬化性膽管炎、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、高安氏動脈炎(Takayasu’s arteritis)、顳動脈炎、移植排斥、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑、及伏格特-小柳-原田氏症(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)。
如請求項117至119中任一項之方法，其中該對象係人類對象。
一種下調對象之免疫反應的方法，其包含向該對象投予如請求項44至106中任一項之抗體、向該對象投予如請求項112之免疫接合物、或向該對象投予如請求項113之醫藥組成物。
一種抑制表現PD-1之免疫細胞的方法，其包含使該免疫細胞與如請求項44至106中任一項之抗體或如請求項112之免疫接合物接觸。
如請求項122之方法，其中該免疫細胞包含T細胞、B細胞、或巨噬細胞。
如請求項122之方法，其中該免疫細胞包含抗原特異性T細胞。
如請求項122至124中任一項之方法，其中該對象係人類對象。