TW202317137A - ２５－羥基－膽甾－５－烯－３－硫酸膽鹼鹽、彼之製法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明說明25HC3S膽鹼鹽及晶形25HC3S膽鹼鹽。本發明進一步揭示25HC3S膽鹼鹽(諸如晶形25HC3S膽鹼鹽)之醫藥調配物及以其治療或預防下列疾病之方法：諸如高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症(例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬和動脈粥樣硬化)。本發明亦提供製備25HC3S，包括晶形25HC3S膽鹼鹽之方法。
Description
本發明係有關於25-羥基-膽甾-5-烯-3-硫酸膽鹼鹽、彼之製法及其用途。
膽固醇代謝物5-膽甾-3β-25-二醇-3-硫酸鹽(「25HC3S」)先前已顯示降低脂質的生物合成及增加膽固醇的分泌和降解，且可有用於治療及預防高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症(例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬和動脈粥樣硬化)。
膽固醇於體內用於製造及修復細胞膜，及合成類固醇激素和維生素D，且在肝臟中轉變成膽汁酸。膽固醇有外源及內源性來源兩種。美國人平均每天消耗約450 mg之膽固醇及在肝臟和其他組織中生產額外500 mg至1,000 mg。另一來源為每天分泌至腸中的500 mg至1,000 mg之膽汁膽固醇及約50%被重新吸收(腸肝循環)。
高血清脂質水平(高膽固醇血症和高三酸甘油酯血症)係與膽固醇堆積在動脈壁中相關聯，且可導致NAFLD和動脈粥樣硬化。表徵動脈粥樣硬化之斑塊抑制血流及促進血塊形成，且最終可經由心臟病發作及/或中風而造成死亡或嚴重失能。很多用於治療高脂血症的治療劑已被開發，且已被醫師廣泛地開立處方。遺憾地，僅約35%之患者對當前可用的療法有反應。
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)為美國最常見的肝臟疾病。此病症係與肥胖、成人發病型II型糖尿病、坐式生活型態及高脂飲食相關聯。早期階段的NAFLD(脂肪肝)在採取適當的治療步驟時有可能可逆轉。然而，放任不管，其可進展成治療上更困難許多的肝細胞發炎(非酒精性脂肪肝炎或NASH)。不治療的NASH可導致不可逆轉的肝組織結疤(脂肪壞死(steatonecrosis))，有可能造成肝硬化、肝衰竭及肝癌。
已揭示25HC3S之特定的醫藥上可接受的鹽，諸如鈉鹽(例如美國專利10,144,759及Ogawa等人之Steroids, 74, 81-87(2009))。25HC3S的不同鹽可能帶來不同的實際效益及缺點，例如關於彼等處理成所欲醫藥調配物之順從性、彼等在解決特定的病理適應症之臨床功效及類似者。
晶形固體傾向於比非晶形固體更有利於處理、儲存及穩定性。然而，能量學可能不利於輕易形成適合的晶形固體，且同質多晶形性可能使得產生特定的活性醫藥成分的穩定晶形固體不切實際。
在此，發明人揭示25HC3S膽鹼鹽，包括晶形25HC3S膽鹼鹽。已驚訝地發現25HC3S膽鹼鹽提供比25HC3S的其他鹽更好的晶體品質。亦已驚訝地發現25HC3S膽鹼鹽比其他鹽(諸如25HC3S鈉鹽)低的吸濕性。亦提供製備25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)之方法。
在本揭示之一些態樣中，提供25HC3S膽鹼鹽。
在本揭示之一些態樣中，提供晶形25HC3S膽鹼鹽。
在本揭示之其他態樣中，提供實質上純的晶形25HC3S膽鹼鹽。
在本揭示之其他態樣中，提供用於製備25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)之方法。
在本揭示之額外態樣中，提供以本揭示之方法製備之25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)。
在本揭示之又額外態樣中，提供包含25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)及醫藥上可接受的賦形劑之醫藥組成物。
在本揭示之其他態樣中，提供治療或預防非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症中一或多者之方法，其包含對需要的患者投予有效量的25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)。
在本揭示之另外其他態樣中，提供25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)及視需要地一或多種醫藥上可接受的賦形劑之用途，其係用於(i)治療需要的患者，或(ii)預防需要的患者之非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症中一或多者，或用於預防上述病症。
在本揭示之額外態樣中，提供25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)及視需要地一或多種醫藥上可接受的賦形劑用於製造藥劑之用途，該藥劑係用於(i)治療需要的患者，或(ii)預防需要的患者之非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症中一或多者，或用於預防上述病症。
詳細說明
晶形25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸(25HC3S)膽鹼鹽
如本文所述，化合物25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽(25HC3S)係指式I所示之[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8, 9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鹽化合物：
術語「25HC3S膽鹼鹽」意指25HC3S的膽鹼鹽。術語「晶形25HC3S膽鹼鹽」意指25HC3S的晶形膽鹼鹽，亦即25HC3S的膽鹼鹽係呈晶形。膽鹼為四級銨化合物。其時常以氫氧化膽鹼(choline hydroxide)取得。25HC3S膽鹼鹽具有以下結構：
膽鹼為必要的營養素，其天然存在於一些食物中且可作為膳食補充劑取得。膽鹼為代謝作用的許多步驟中所需之甲基的來源。身體需要膽鹼以合成磷脂醯膽鹼及神經鞘磷脂(該兩種磷脂係與細胞膜相關聯)及生產神經傳遞質乙醯膽鹼。膽鹼缺乏係與非所欲臨床適應症相關聯，包括本文所述之病症表現。
晶形25HC3S膽鹼鹽係以x射線粉末繞射輕易地分析或表徵(characterize)。x射線粉末繞射圖案為具有在x軸上的°2θ(繞射角)及在y軸上的強度之x-y圖。x軸亦可呈d-間距(d-spacing)的形式，其係經由憑藉2dsinθ=nλ之布拉格定律而與繞射角有關，其中d為d-間距及λ為入射x射線波的波長。圖案含有可用於表徵晶形25HC3S膽鹼鹽之峰。除非另有其他指定，否則峰係以其在x軸上的位置，而不以其y軸強度述及。由於樣品定向(orientation)，發生在一種儀器上出現於一個樣品中的峰可能不出現在不同的儀器上所採集之另一樣品中，這是由於樣品相對於儀器的定向。
來自x射線粉末繞射的數據可以多種方式用於表徵晶形。例如，自繞射儀輸出的整個x射線粉末繞射圖案可用於表徵晶形25HC3S膽鹼鹽。然而，此等數據的較小子集亦可能且通常適合於表徵表徵晶形25HC3S膽鹼鹽。例如，來自此圖案之一或多個峰的集合可用於表徵晶形25HC3S膽鹼鹽。在本申請案中，所有報告之峰值係以Cu-Kα輻射之°2θ計，例如實施例24和實施例25中所提出。實際上，甚至常常可以單一x射線粉末繞射峰用於表徵此晶形。當本文的晶形25HC3S膽鹼鹽係以x射線粉末繞射圖案的「一或多個峰」表徵及列出此等峰時，通常意指所列出之峰的任何組合可用於表徵晶形25HC3S膽鹼鹽。再者，其他峰出現於x射線粉末繞射圖案中的事實通常不否定或以其他方式限制該表徵。
除了峰強度的可變性以外，在x軸上的峰位置亦可能有可變性。然而，當出於表徵的目的而報告峰位置時，通常可考慮此可變性。在沿著x軸的峰位置上的此可變性可衍生自數種來源(例如樣品製備、定向和大小、粒度、水分含量、溶劑含量、儀器和實驗參數、數據分析軟體)。例如，在不同條件下製備之同一晶形材料的樣品可產出略微不同的繞射圖，且不同的x射線儀器可使用不同的參數操作及該等可導致來自同一晶形固體而略微不同的繞射圖案。
由於此等可變性來源，常見的是在以°2θ計的峰值前使用單詞「約」陳述x射線繞射峰。出於本文報告數據的目的，該值通常是±0.2°2θ。這通常意指在維護良好的儀器上，吾人能預期峰量測值的可變性在同一儀器上是±0.2°2θ。除非另有其他指定，否則在本文所引述之x射線粉末繞射峰通常以此±0.2°2θ可變性報告，且無論何時於本文揭示時，通常意欲以此可變性報告，無論單詞「約」是否存在，然而在一些情況下，可變性係取決於儀器條件而可能更高。此外，在本發明之額外實施態樣中，在以°2θ引用之峰值或引用之峰值組的可變性是±0.1°2θ或甚至是±0.05°2θ，而不是±0.2°2θ。
來自晶形25HC3S膽鹼鹽的x射線粉末繞射數據可用於標定對應的單位晶胞。如本文所使用之「標定」通常係指確定以繞射圖案中的峰位置給出之結晶學單位晶胞的大小及形狀之方法。該術語係自分配至各個峰之密勒指數標籤(Miller index label)而得其名。例如，若圖案中的所有峰皆以單一單位晶胞標定，則此可為樣品含有單晶相的強力證據。如果有標定方案，則可直接計算單位晶胞體積且可有用於測定其溶劑化狀態。標定亦可為晶形的說明，且提供該相在特定的熱力學狀態點之所有取得的峰位置之簡潔的總結。
25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)可如實施例28中提出之方式製備。晶形25HC3S膽鹼鹽的x射線粉末繞射圖案可見於圖1中及圖2中之峰揀選(peak-picked)型式。表1顯示來自圖2之揀選峰。
晶形25HC3S膽鹼鹽可以各種分析技術表徵，包括以x射線粉末繞射。晶形25HC3S膽鹼鹽或其部分的x射線粉末繞射圖案可用於鑑定晶形25HC3S膽鹼鹽。晶形25HC3S膽鹼鹽含有單獨或一起可助於鑑定晶形25HC3S膽鹼鹽存在的各種x射線粉末繞射峰。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以一或多個在約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以一或多個在約3.9°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ及約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ及約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ及約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ及約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ及約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ及約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ及約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
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在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ及約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ及約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ及約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。在該等及其他例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案進一步表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有一或多個在16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案表徵。
在一些例子中，晶形25HC3S膽鹼鹽可以具有實質上與圖1所示者相同圖案的x射線粉末繞射圖案表徵。
晶形25HC3S膽鹼鹽的DSC溫度記錄圖表明在約198℃及約220℃之吸熱峰。圖5的TGA溫度記錄圖表明在高達198℃之重量損失可忽略。用於測量任何表徵DSC吸熱峰及任何表徵DSC溫度記錄圖之示例性方法於實施例21和23中闡述。在DSC測量值的上下文中，亦有可變性及術語「約」意指±1℃，且無論DSC測量值是否以「約」開頭或除非另有其他指定，否則應理解此種可變性。
不受理論的束縛，咸信晶形25HC3S膽鹼鹽為無水物，其意指在單位晶胞中沒有結晶水。這不排除其他水存在於包含晶形25HC3S膽鹼鹽之固體中的可能性。另外，晶形25HC3S膽鹼鹽在高達約95%的相對濕度下沒有明顯的吸濕性，在高達此相對濕度下僅增加約0.5%之重量，如根據實施例26之動態蒸汽吸附實驗所證明且其結果顯示在圖7中。再者，晶形25HC3S膽鹼鹽的x射線粉末繞射圖案在DVS後沒有明顯的改變，如圖3所示。在從5%持續至95%的相對濕度時僅觀察到0.5%之重量增加，且在恢復至5%的相對濕度時觀察到0.5%之重量損失，表明沒有遲滯性。此低吸濕性表明在此等應力下良好的穩定性，如本文別處進一步討論，這可使其具有適合於醫藥處理的穩定性。實際上，本揭示因此進一步包括穩定的晶形25HC3S膽鹼鹽。此等穩定性包括例如足以調配用於患者遞送之穩定的晶形25HC3S膽鹼鹽。除了在5.3 ppm之峰以外，
1H-NMR光譜係與如圖6所示之結構一致。
膽鹼鹽具有超越25HC3S之鈉鹽及一些其他鹽類的額外優勢，因為膽鹼相對離子具有額外的有益性質。例如，膽鹼為必要的營養素且缺乏膽鹼已被認為是脂肪及膽固醇堆積於肝臟中的原因。再者，25HC3S膽鹼鹽形成比那些先前技術更好的品質及繞射之晶體。最後，晶形25HC3S膽鹼鹽比例如晶形25HC3S鈉鹽具有較低的吸濕性且因此在物理上更為穩定。晶形25HC3S鈉鹽在暴露於潮濕條件時穩定形成水合物。特別地已製得晶形25HC3S鈉鹽之單水合物、二水合物和可變型水合物。已發現I型水合物具有吸濕性且可在高的水活性下(例如大於0.73)形成液晶。另一水合物，II型，在介於約21%與約30%之間的相對濕度下為穩定的。圖8顯示含有I型及II型兩者的晶形25HC3S鈉鹽之製造批次的DVS等溫線且顯示顯著的水攝取，直到約95%的相對濕度。相比之下，在持續高達約95%的相對濕度之條件下，僅吸收約0.5%之水重量，表明晶形25HC3S膽鹼鹽以無水物為穩定的。
進一步揭示實質上純的晶形25HC3S膽鹼鹽。如本文所揭示之「實質上純的」通常係指除了潛在的痕量級之其他形式的25HC3S膽鹼鹽以外，本文沒有任何明顯量存在的形式。痕量級的實例包括相對於存在的25HC3S膽鹼鹽總量(以重量為基礎)而總計不超過約約10%、5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.25%、0.1%或更少。
在本文進一步說明製備25HC3S膽鹼鹽之方法。在一些例子中，該方法可先製備25HC3S之鈉鹽。此製備的實例於本文提出。可能為晶形的25HC3S之鈉鹽可轉化成例如三乙銨鹽，如實施例27中所述。接著可使用三乙銨鹽產生25HC3S膽鹼鹽，如實施例28中所提出。
25HC3S的三乙銨鹽之製備可例如藉由將氯化三乙銨與三乙胺的混合物通過管柱及以溶劑(諸如醇)處理，直到中性pH而完成。晶形25HC3S鈉鹽可個別地溶解在溶劑(諸如醇)中。接著可將溶液通過事先暴露於三乙胺的相同管柱及與三乙銨溶液合併。接著分離所得固體(諸如在真空下或藉由乾燥)可提供晶形25HC3S三乙銨鹽，可將其例如以研缽及研杵均質化。適合於此方法的醇包括甲醇。
25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)之製備可以25HC3S鈉鹽開始，轉化成25HC3S的第二鹽(諸如三乙銨鹽)及接著將25HC3S的此第二鹽轉化成25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)。晶形25HC3S膽鹼鹽之製備可藉由製備在適合的溶劑(諸如乙腈)中之25HC3S的三乙銨鹽懸浮液及以膽鹼源(諸如水性氫氧化膽鹼)處理以形成25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)。可純化25HC3S膽鹼鹽，諸如以適合的溶劑沖洗。亦可執行額外的處理，諸如在真空下或以其他方式乾燥。本揭示進一步包括以本文所述之方法製得的晶形25HC3S膽鹼鹽。
成功地標定晶形25HC3S膽鹼鹽的x射線粉末繞射圖案，表明該圖案代表單晶相，其結果於圖4中提出。標定結果揭露晶形25HC3S膽鹼鹽具有斜方晶胞，3371.5 Å
3之晶胞體積，與無水形式一致。數個晶胞參數於以下表2中提出。
本揭示亦關於含有如本文所揭示之25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)之醫藥組成物。此等醫藥組成物包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑及25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)。此等醫藥組成物可經口投予或經配置而以任何有效的常規劑型，包括例如立即、緩慢和定時釋放型口服製劑，經由腸胃外、局部、鼻、眼科(ophthalmically)、眼睛(optically)、舌下、直腸、陰道及類似方法遞送。
如本文別處的討論及實施例中的論證，本揭示之25HC3S膽鹼鹽具有出乎意外的低吸濕性，包括與25HC3S的其他鹽形式之比較。25HC3S膽鹼鹽因此可有利地製造，且可用於製備醫藥調配物及特別地用於製備經口投予之劑型(例如固體劑型，諸如錠劑、膠囊(各者包括立即釋放型、持續釋放型或定時釋放型調配物)、丸劑、散劑或粒劑。
又再者，本揭示之25HC3S膽鹼鹽亦對患有針對25HC3S之病症的患者有利地提供補充的膽鹼。如本文別處的討論，膽鹼缺乏可促成該等病症，且可能有利的是在治療過程中提供膽鹼與25HC3S。因此，25HC3S膽鹼鹽出乎意外地及有益地結合有利的鹽形式性質，促成例如製備特別充分適合於治療特定病症的口服劑型，連同促成在使用該口服劑型進行治療方法的過程中有益地提供膽鹼補充的內在能力。
本揭示進一步包括以有效量的本揭示之25HC3S膽鹼鹽(包括晶形25HC3S膽鹼鹽)及/或包含晶形25HC3S膽鹼鹽之醫藥組成物治療及/或預防下列的疾病(例如在人類中)之方法及用途：諸如高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症(例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬和動脈粥樣硬化)中一或多者。
製備25-羥基-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽(25HC3S)之方法
在本文說明用於製備25-羥基-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽，諸如25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽(25HC3S)之各種方法。亦有未於本文說明的製造25HC3S之其他方法。儘管在本文的許多揭示涉及3β位置上的硫酸鹽，但是本揭示內容通常亦適用於3α位置上的硫酸鹽。用於製備本文所述之25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽之目標方法的各步驟中所使用之組分可按需要為經純化之組成物或粗製組成物。術語「經純化之」係以其常規意義使用，其係指其中已進行至少一些分離或純化過程之組成物，諸如反應混合物的過濾或水性後處理(workup)之過程。在特定的情況下，純化包括液相層析法、再結晶、蒸餾(例如共沸蒸餾)和其他類型的化合物純化中至少一者。例如，如本文所述之化合物可以層析方式純化，諸如高效能液相層析法(HPLC)、超臨界流體層析法(SFC)、薄層層析法、快速管柱層析法和離子交換層析法。可使用任何適合的固定相，包括正相和逆相以及離子樹脂。流動相可選自極性溶劑和非極性溶劑。在一些例子中，流動相包括極性溶劑。在一些例子中，極性溶劑係選自氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、二氯乙烷、丙酮、二㗁烷、乙酸乙酯、二甲亞碸、苯胺、二乙胺、硝基甲烷、乙腈、吡啶、異丙醇、乙醇、甲醇、乙二醇、乙酸和水。在一些例子中，流動相包括非極性溶劑。在一些例子中，非極性溶劑係選自二乙醚、甲苯、苯、戊烷、己烷、環己烷、石油醚和四氯化碳。參見例如L. R. Snyder和J. J. Kirkland編輯之第2版Introduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley and Sons, 1979；及E. Stahl編輯之Thin Layer Chromatography, Springer-Verlag, New York, 1969。
在一些例子中，反應混合物係以粗製混合物用於本文所述之方法的後續步驟中，其中反應混合物未進行純化或其他後處理。在特定的情況下，粗製混合物包括具有足夠純度的關注化合物，諸如其中反應混合物包括相對於粗製反應混合物(當溶劑存在時，將其排除)的70%或更高純度的關注化合物，諸如75%或更高，諸如80%或更高，諸如85%或更高，諸如90%或更高，諸如95%或更高，諸如97%或更高，諸如99%或更高，諸如99.5%或更高，諸如99.9%或更高，諸如99.99%或更高，且包括99.999%或更高，如以層析法(例如HPLC或SFC)、核磁共振光譜法(例如
1H NMR或
13C NMR)或其組合所測定。在一些例子中，關注之化合物係以相對於粗製反應混合物(當溶劑存在時，將其排除)的30重量%或更高的量存在於反應混合物中，諸如40重量%或更高，諸如50重量%或更高，諸如60重量%或更高，諸如70重量%或更高，諸如75重量%或更高，諸如80重量%或更高，諸如85重量%或更高，諸如90重量%或更高，諸如95重量%或更高，諸如97重量%或更高，諸如99重量%或更高，諸如99.5重量%或更高，諸如99.9重量%或更高，諸如99.99重量%或更高，且包括相對於粗製反應混合物的99.999重量%或更高，且該量的範圍可以是5重量%至99.999重量%，諸如30重量%至99.99重量%、40重量%至99.9重量%、50重量%至99重量%、70重量%至95重量%、75重量%至90重量%、80重量%至99重量%、或80重量%至95重量%。在一些例子中，關注之化合物係以相對於粗製反應混合物的30 mol%或更高存在於粗製反應混合物(當溶劑存在時，將其排除)中，諸如40 mol%或更高，諸如50 mol%或更高，諸如60 mol%或更高，諸如70 mol%或更高，諸如75 mol%或更高，諸如80 mol%或更高，諸如85 mol%或更高，諸如90 mol%或更高，諸如95 mol%或更高，諸如97 mol%或更高，諸如99 mol%或更高，諸如99.5 mol%或更高，諸如99.9 mol%或更高，諸如99.99 mol%或更高，且包括99.999 mol%或更高，且其範圍可以是30 mol%至99.999 mol%，諸如50 mol%至99 mol%、70 mol%至95 mol%、75 mol%至90 mol%、80 mol%至99 mol%、或80 mol%至95 mol%。
用於製備根據本揭示之25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸金屬鹽([(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸金屬鹽)之方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇與硫酸化劑接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽；及將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種金屬鹽接觸以生產5-膽甾-3β,25-二醇3-硫酸金屬鹽，該方法可以諸如流程Ia達成。
25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇可藉由與硫酸化劑接觸而硫酸化(流程IA1)。在一些例子中，硫酸化劑係選自三氧化硫複合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸酯化合物。在一些例子中，硫酸化劑係選自三氧化硫二甲基甲醯胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在一些例子中，硫酸化劑包括來自硫酸及乙酸酐和吡啶。在一些例子中，硫酸化劑包括三氧化硫三乙胺和吡啶。在一些例子中，硫酸化劑係選自1)氯磺酸和吡啶，及2)氯磺酸和2,6-二甲基吡啶(lutidine)。在一些例子中，硫酸化劑為氯磺酸乙酯。
25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇可在-10℃至50℃範圍之溫度下硫酸化，諸如-5℃至45℃，諸如-4℃至40℃，諸如-3℃至35℃，諸如-2℃至30℃，諸如-1℃至25℃，且包括0℃至20℃。反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的硫酸化劑的使用量是可改變的及可以是0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至5當量、0.5當量至10當量、0.5當量至8當量、0.5當量至5當量、0.9當量至10當量、0.9當量至8當量、0.9當量至5當量、1.3當量至10當量、1.3當量至8當量、1.3當量至5當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至5當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至5當量、或1當量至2當量、1當量至1.5當量、或1.1至1.2當量。
在一些例子中，該方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在至少一種溶劑中硫酸化，其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物展現低溶解度。在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在至少一種溶劑中硫酸化，其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物展現100 mmol/L或更低的溶解度，諸如90 mmol/L或更低，諸如80 mmol/L或更低，諸如70 mmol/L或更低，諸如60 mmol/L或更低，諸如50 mmol/L或更低，諸如40 mmol/L或更低，諸如30 mmol/L或更低，諸如20 mmol/L或更低，諸如10 mmol/L或更低，且包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在至少一種溶劑中硫酸化，其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物展現5 mmol/L或更低的溶解度。在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在至少一種溶劑中硫酸化，其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物在形成後沉澱。在一些例子中，該至少一種溶劑係選自氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲苯、四氫呋喃和甲基四氫呋喃。
在一些例子中，該方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇以足以降低或消除25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇之雙硫酸化作用的方式硫酸化。在一些情況下，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇硫酸化，且形成之雙硫酸鹽產物(亦即5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽，結構IA)的量為藉由將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇與硫酸化劑接觸所形成之反應產物的10重量%或更少，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括其中將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇硫酸化且形成之雙硫酸鹽產物的量是0.0001重量%或更少，且該量的範圍可以是10重量%至0.001重量%，諸如10重量%至0.1重量%、10重量%至1重量%、10重量%至2重量%、8重量%至0.001重量%、8重量%至0.1重量%、8重量%至1重量%、8重量%至2重量%、6重量%至0.001重量%、6重量%至0.1重量%、6重量%至1重量%、6重量%至2重量%、4重量%至0.001重量%、4重量%至0.1重量%、4重量%至1重量%、4重量%至2重量%、3重量%至0.001重量%、3重量%至0.1重量%、3重量%至1重量%、2重量%至0.001重量%、2重量%至0.1重量%、或2重量%至1重量%。
在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比是10：1或更大，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比是10
9：1或更大，且該比的範圍可以是10：1之重量比至10
9：1之重量比；諸如10：1之重量比至10
6：1之重量比、10：1之重量比至10
3：1之重量比、10：1之重量比至100：1之重量比、100：1之重量比至10
9：1之重量比、100：1之重量比至10
6：1之重量比、100：1之重量比至10
3：1之重量比、250：1之重量比至10
9：1之重量比、250：1之重量比至10
6：1之重量比、250：1之重量比至10
3：1之重量比、500：1之重量比至10
9：1之重量比、500：1之重量比至10
6：1之重量比、500：1之重量比至10
3：1之重量比、10
3：1之重量比至10
9：1之重量比、10
3：1之重量比至10
6：1之重量比、或250：1之重量比至10
3：1之重量比。
在一些例子中，當25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇硫酸化時，所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽保持溶解在至少一種溶劑中。在一些例子中，5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽在至少一種溶劑中具有高溶解度。在一些情況下，5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽在至少一種溶劑中展現500 mmol/L或更高的溶解度，諸如600 mmol/L或更高，諸如700 mmol/L或更高，諸如800 mmol/L或更高，諸如900 mmol/L或更高，且包括在至少一種溶劑中具有1 mol/L或更高的溶解度。
在特定的例子中，該方法進一步包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物與雙硫酸鹽產物(亦即5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽)分離。在一些例子中，利用真空過濾將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物與雙硫酸鹽產物分離。在一些例子中，利用25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物之再結晶將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物與雙硫酸鹽產物分離。在一些例子中，利用層析法(例如矽膠管柱)將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物與雙硫酸鹽產物分離。
在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在具有5.0至8.0之pH範圍的反應混合物中硫酸化，諸如5.1至7.9之pH，諸如5.2至7.8之pH，諸如5.3至7.7之pH，諸如5.4至7.6之pH，諸如5.5至7.5之pH，諸如5.6至7.4之pH，諸如5.7至7.3之pH，諸如5.8至7.2之pH，諸如5.9至7.1之pH，且包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在具有6.0至7.0之pH的反應混合物中硫酸化。
在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的存在下硫酸化。在特定的例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係以粒子存在(例如在事先反應或經純化之反應批次中所生產之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的晶種)。在一些例子中，與當25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽不存在時的溶解度相比，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇在25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(例如成為粒子)的存在下硫酸化足以降低由硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇反應所生產之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的溶解度。在特定的例子中，與當所添加之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽不存在時的溶解度相比，在反應混合物中所生產之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的溶解度降低5%或更多，諸如10%或更多，諸如25%或更多，諸如50%或更多，諸如75%或更多，諸如90%或更多，且包括所生產之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的溶解度降低99%或更多。添加至反應混合物中的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的粒子大小可改變及可具有0.01 mm或更大的尺寸(例如長度、寬度或直徑)，諸如0.025 mm或更大，諸如0.05 mm或更大，諸如0.075 mm或更大，諸如0.1 mm或更大，諸如0.25 mm或更大，諸如0.5 mm或更大，諸如0.75 mm或更大，諸如1 mm或更大，諸如2 mm或更大，諸如3 mm或更大，諸如4 mm或更大，且包括5 mm或更大。在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子在硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸後立即添加至反應混合物中。在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子在硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸後1分鐘或更久添加至反應混合物中，諸如5分鐘或更久，諸如10分鐘或更久，諸如15分鐘或更久，諸如20分鐘或更久，諸如30分鐘或更久，諸如40分鐘或更久，諸如50分鐘或更久，且包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子在硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸後60分鐘或更久添加至反應混合物中。
在特定的例子中，在與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸前，將硫酸化劑表徵。在一些例子中，硫酸化劑之表徵包括測定在與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸前之硫酸化劑的降解程度。在特定的例子中，硫酸化劑的降解程度之測定包括測定在與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸前之硫酸化劑中的雜質量。
在一些情況下，硫酸化劑的降解係由質子核磁共振光譜法(
1H-NMR)測定。硫酸化劑之質子NMR光譜法可在至少一種氘代溶劑中進行。在特定的例子中，該至少一種氘代溶劑為氘代丙酮((CD
3)
2CO)。在特定的例子中，該至少一種氘代溶劑不為氘代苯(C
6D
6)。在特定的例子中，該至少一種氘代溶劑不為氘代乙腈(CD
3CN)。在特定的例子中，該至少一種氘代溶劑不為氘代氯仿(CD
3Cl)。
在一些情況下，用於測定降解程度之方法包括將
1H-NMR光譜中在9.2 ppm至9.3 ppm之化學位移的一或多個峰積分及基於所積分之峰計算硫酸化劑的雜質水平。在特定的情況下，用於測定降解程度之方法包括將
1H-NMR光譜中在約9.25 ppm之化學位移的一或多個峰積分及基於所積分之峰計算硫酸化劑的雜質水平。在一些例子中，當硫酸化劑的雜質水平低於預定閾值時，諸如其中當藉由將質子NMR光譜中在9.2 ppm至9.3 ppm之化學位移的一或多個峰積分所測定之雜質水平是25%或更低，諸如24%或更低，諸如23%或更低，諸如22%或更低，諸如21%或更低，諸如20%或更低，諸如19%或更低，諸如18%或更低，諸如17%或更低，諸如16%或更低，諸如15%或更低，諸如14%或更低，諸如13%或更低，諸如12%或更低，諸如11%或更低，諸如10%或更低，諸如9%或更低，諸如8%或更低，諸如7%或更低，諸如6%或更低，諸如5%或更低，諸如4%或更低，諸如3%或更低，諸如2%或更低，且包括其中當藉由將質子NMR光譜中在9.2 ppm至9.3 ppm之化學位移的一或多個峰積分所測定之雜質水平是1%或更低時，將硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸。在一些例子中，當雜質水平高於預定閾值時，諸如其中當藉由將質子NMR光譜中在9.2 ppm至9.3 ppm之化學位移的一或多個峰積分所測定之雜質水平是25%或更高時，諸如26%或更高，諸如27%或更高，諸如28%或更高，諸如29%或更高，諸如30%或更高，諸如31%或更高，諸如32%或更高，諸如33%或更高，諸如34%或更高，且包括其中當藉由將質子NMR光譜中在9.2 ppm至9.3 ppm之化學位移的一或多個峰積分所測定之雜質水平是35%或更高時，不將硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸。
在特定的例子中，所產生之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物包括一或多種副產物。在一些例子中，副產物為5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽。在一些例子中，5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽副產物係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的10重量%或更少的量存在於硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇所生產之組成物中，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括其中5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽副產物係以0.001重量%或更少的量存在於硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇所生產之組成物中，且該量的範圍可以是0.1重量%至50重量%，諸如0.5重量%至20重量%、或1重量%至12重量%。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽副產物之重量比是10：1或更大，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比是10
9：1或更大。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比範圍是10：1至10
9：1，諸如100：1至10
8：1，諸如1000：1至10
7：1，且包括10000：1至10
6：1。
本揭示之態樣亦包括具有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽及5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之組成物，該5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的10重量%或更少的量存在於組成物中，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括0.001重量%或更少，且該量的範圍可以是10重量%至0.001重量%，諸如10重量%至0.1重量%、10重量%至1重量%、10重量%至2重量%、8重量%至0.001重量%、8重量%至0.1重量%、8重量%至1重量%、8重量%至2重量%、6重量%至0.001重量%、6重量%至0.1重量%、6重量%至1重量%、6重量%至2重量%、4重量%至0.001重量%、4重量%至0.1重量%、4重量%至1重量%、4重量%至2重量%、3重量%至0.001重量%、3重量%至0.1重量%、3重量%至1重量%、2重量%至0.001重量%、2重量%至0.1重量%、或2重量%至1重量%。
在一些例子中，組成物包括10：1或更大的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中在組成物中的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比是10
9：1或更大。在一些例子中，組成物包括10：1至10
9：1範圍之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之重量比，諸如100：1至10
8：1，諸如1000：1至10
7：1，且包括10000：1至10
6：1。
在一些例子中，副產物為硫酸化鏈甾醇
(sulfated desmosterol)(結構IB)。
在一些例子中，硫酸化鏈甾醇([(3S,8S,9S, 10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己-4-烯基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鹽)係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的10重量%或更少的量存在於硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇所生產之組成物中，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括其中硫酸化鏈甾醇係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的0.001重量%或更少的量存在於硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇所生產之組成物中，且該量的範圍可以是0.1重量%至10重量%，諸如0.2重量%至5重量%、或0.3重量%至3重量%。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之硫酸化鏈甾醇之重量比是10：1或更大，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之硫酸化鏈甾醇之重量比是10
9：1或更大。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之硫酸化鏈甾醇之重量比的範圍是10：1至10
9：1，諸如100：1至10
8：1，諸如1000：1至10
7：1，且包括10000：1至10
6：1。
本揭示之態樣亦包括具有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽及硫酸化鏈甾醇之組成物，該硫酸化鏈甾醇係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的10重量%或更少的量存在於組成物中，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的0.001% w/w或更少，且該量的範圍可以是10重量%至0.001重量%，諸如10重量%至0.1重量%、10重量%至1重量%、10重量%至2重量%、8重量%至0.001重量%、8重量%至0.1重量%、8重量%至1重量%、8重量%至2重量%、6重量%至0.001重量%、6重量%至0.1重量%、6重量%至1重量%、6重量%至2重量%、4重量%至0.001重量%、4重量%至0.1重量%、4重量%至1重量%、4重量%至2重量%、3重量%至0.001重量%、3重量%至0.1重量%、3重量%至1重量%、2重量%至0.001重量%、2重量%至0.1重量%、或2重量%至1重量%。
在一些例子中，組成物包括10：1或更大的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於硫酸化鏈甾醇之重量比，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中在組成物中的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於硫酸化鏈甾醇之重量比是10
9：1或更大。在一些例子中，組成物包括10：1至10
9：1範圍之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽對硫酸化鏈甾醇之重量比，諸如100：1至10
8：1，諸如1000：1至10
7：1，且包括10000：1至10
6：1。
在一些例子中，硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的副產物為熱降解產物並存在於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽組成物中。在一些例子中，當25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽組成物之組分係以液相層析法(例如HPLC)分離時，以相對滯留時間鑑定副產物。在特定的例子中，當25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽組成物之組分係利用HPLC分離(在約45℃下以C8固定相操作及以包含緩衝液(例如磷酸鈉之水性緩衝液)的第一流動相和包含一或多種有機溶劑(參見例如下表3和4)的第二流動相分離組成物之組分)，副產物為硫酸化鏈甾醇，為具有約18.3分鐘的滯留時間之化合物。在一些例子中，第一流動相為水性緩衝液。在特定的例子中，第一流動相包括磷酸鈉。在一些例子中，第二流動相係選自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中一或多者。在一些例子中，第一流動相之流速是約1.0 mL/分鐘。在一些例子中，第二流動相之流速是約1.0 mL/分鐘或更大。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽在相同的HPLC條件下具有約7.7分鐘的滯留時間。在一些例子中，當25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽組成物之組分係利用HPLC分離(在約45℃下以C8固定相操作及以包含緩衝液(例如磷酸鈉之水性緩衝液)的第一流動相和包含一或多種有機溶劑(參見例如下表3和4)的第二流動相分離組成物之組分)，副產物為具有約37.7分鐘的滯留時間之化合物。雖然不想受到理論的束縛，但是咸信具有約37.7分鐘的滯留時間之化合物為鏈甾醇(desmosterol)。在一些例子中，第一流動相為水性緩衝液。在特定的例子中，第一流動相包括磷酸鈉。在一些例子中，第二流動相係選自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中一或多者。在一些例子中，第一流動相之流速是約1.0 mL/分鐘。在一些例子中，第二流動相之流速是約1.0 mL/分鐘或更大。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽在相同的HPLC條件下具有約7.7分鐘的滯留時間，使得硫酸化鏈甾醇具有約2.4(=18.3/7.7)的相對滯留時間，及咸信為鏈甾醇之化合物具有約4.9(=37.7/7.7)的相對滯留時間。
本揭示之態樣亦包括具有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽及硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的一或多種副產物之組成物。在一些例子中，一或多種副產物係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的10重量%或更少的量存在於組成物中，諸如9重量%或更少，諸如8重量%或更少，諸如7重量%或更少，諸如6重量%或更少，諸如5重量%或更少，諸如4重量%或更少，諸如3重量%或更少，諸如2重量%或更少，諸如1重量%或更少，諸如0.5重量%或更少，諸如0.1重量%或更少，諸如0.01重量%或更少，諸如0.001重量%或更少，且包括0.001重量%或更少，且該量的範圍可以是0.1重量%至5重量%，諸如0.2重量%至10重量%、或0.3重量%至15重量%。在一些例子中，組成物包括25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽及一或多種副產物，該副產物相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的量範圍是0.0001重量%至10重量%，諸如0.005重量%至9.5重量%，諸如0.001%至9.0重量%，諸如0.05重量%至8.5重量%，諸如0.1重量%至8.0重量%，諸如0.5重量%至7.5重量%，諸如1重量%至7重量%，諸如1.5重量%至6.5重量%，且包括2重量%至6重量%。
在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之一或多種副產物之重量比是10：1或更大，諸如25：1或更大，諸如50：1或更大，諸如100：1或更大，諸如250：1或更大，諸如500：1或更大，諸如1000：1或更大，諸如2500：1或更大，諸如5000：1或更大，諸如10,000：1或更大，諸如25,000：1或更大，諸如50,000：1或更大，諸如100,000：1或更大，諸如10
6：1或更大，諸如10
7：1或更大，諸如10
8：1或更大，且包括其中25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之一或多種副產物之重量比是10
9：1或更大。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽相對於所形成之一或多種副產物之重量比的範圍是10：1至10
9：1，諸如100：1至10
8：1，諸如1000：1至10
7：1，且包括10000：1至10
6：1。
在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽為25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽(流程IA2)。
在特定的例子中，在硫酸化劑與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸前，先將硫酸化劑與酸酐接觸。在一些例子中，酸酐係選自乙酸酐、三氟乙酸酐和三氟甲酸酐。相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的酸酐量可改變及可以是0.001當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至5當量、0.5當量至10當量、0.5當量至8當量、0.5當量至5當量、0.9當量至10當量、0.9當量至8當量、0.9當量至5當量、1.3當量至10當量、1.3當量至8當量、1.3當量至5當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至5當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至5當量、0.1當量至1.5當量、0.5當量至1.1當量、或0.1當量至1當量。
在一些例子中，該方法包括在生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽後淬滅(亦即去活化)未反應之硫酸化劑。在一些例子中，淬滅硫酸化劑包括添加水至反應混合物中。相對於與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇接觸之硫酸化劑的量，添加至反應混合物中的水量可改變及可以是1當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，諸如6當量或更多，諸如7當量或更多，諸如8當量或更多，諸如9當量或更多，諸如10當量或更多，諸如15當量或更多，諸如20當量或更多，且包括25當量或更多。
在特定的例子中，淬滅未反應之硫酸化劑的反應性包括添加水至反應混合物中，隨後添加至少一種鹼。在一些例子中，該至少一種鹼為三烷基胺，諸如三甲胺或三乙胺。在一些例子中，該至少一種鹼為2,6-二甲基吡啶。在特定的例子中，該至少一種鹼為吡啶。吡啶可在添加水後1分鐘或更久添加至反應混合物中，諸如5分鐘或更久，諸如10分鐘或更久，諸如15分鐘或更久，諸如30分鐘或更久，諸如45分鐘或更久，諸如60分鐘或更久，諸如90分鐘或更久，諸如120分鐘或更久，諸如150分鐘或更久，諸如180分鐘或更久，諸如210分鐘或更久，且包括在添加水至反應混合物後240分鐘或更久。在特定的例子中，吡啶係在添加水後60分鐘添加至反應混合物中。相對於硫酸化劑的量，添加至反應混合物中的吡啶量可改變及可以是0.001當量或更多，諸如0.005當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.05當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如1當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，諸如6當量或更多，且包括10當量或更多。
在一些例子中，在反應混合物中的未反應之硫酸化劑係在緩慢攪動下淬滅。在特定的例子中，在緩慢攪動下淬滅未反應之硫酸化劑包括以足以保持未反應之硫酸化劑的黏聚物(agglomerate)於反應混合物中的方式攪拌反應混合物。在一些例子中，反應混合物的緩慢攪動足以使得未反應之硫酸化劑的黏聚物大小在淬滅期間減小10%或更少，諸如9%或更少，諸如8%或更少，諸如7%或更少，諸如6%或更少，諸如5%或更少，諸如4%或更少，諸如3%或更少，諸如2%或更少，諸如1%或更少，且包括其中緩慢地攪動反應混合物，使得未反應之硫酸化劑的黏聚物大小在淬滅期間減小0.1%或更少。在特定的例子中，反應混合物的緩慢攪動足以使得未反應之硫酸化劑的黏聚物在淬滅期間留在反應燒瓶的底部。在特定的例子中，反應混合物的緩慢攪動足以使得未反應之硫酸化劑的黏聚物很少至沒有存在於攪動之反應混合物的攪拌渦旋中。
在一些例子中，該方法包括在25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種金屬鹽接觸前純化該25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽。在一些例子中，經純化之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽具有97%或更高的純度，諸如98%或更高的純度，諸如99%或更高的純度，諸如99.5%或更高的純度，諸如99.7%或更高的純度，諸如99.9%或更高的純度，包括99.99%或更高的純度。在特定的例子中，經純化之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽具有一或多種硫酸化的副產物(例如來自硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的副產物)，其中該一或多種副產物係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的5% w/w或更少的量存在，諸如4% w/w或更少，諸如3% w/w或更少，諸如2% w/w或更少，諸如1% w/w或更少，諸如0.9% w/w或更少的量，諸如0.8% w/w或更少，諸如0.7% w/w或更少，諸如0.6% w/w或更少，諸如0.5% w/w或更少，諸如0.4% w/w或更少，諸如0.3% w/w或更少，諸如0.2% w/w或更少，諸如0.1% w/w或更少，諸如0.05% w/w或更少，諸如0.01% w/w或更少，且包括相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的0.001% w/w或更少的量存在。在一些例子中，雙硫酸化之產物(亦即5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽)係以相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的1% w/w或更少的量存在於經純化之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽組成物中，諸如0.9% w/w或更少的量，諸如0.8% w/w或更少，諸如0.7% w/w或更少，諸如0.6% w/w或更少，諸如0.5% w/w或更少，諸如0.4% w/w或更少，諸如0.3% w/w或更少，諸如0.2% w/w或更少，諸如0.1% w/w或更少，諸如0.05% w/w或更少，諸如0.01% w/w或更少，且包括相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的0.001% w/w或更少的量存在。
在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係以液相層析法純化。在一些例子中，純化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括使用矽膠固定相之液相層析法(例如矽膠填料管柱，≥5質量當量)。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係使用矽膠固定相及包括吡啶之流動相純化。在特定的例子中，流動相包括二氯甲烷、甲醇和吡啶。在特定的例子中，流動相包括二氯甲烷-甲醇(85:15)的混合物和吡啶(1%)。
在一些例子中，可將由固定相收集一或多個餾份合併。在一些例子中，可將合併的餾份濃縮。在特定的例子中，可將合併的餾份以蒸餾濃縮。在特定的例子中，可將合併的餾份在真空下濃縮。在特定的例子中，可將合併的餾份在真空下以蒸餾濃縮。
在一些例子中，將合併的餾份與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的一或多種粒子(例如來自事先純化之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽樣品的粒子)接觸。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子與合併的餾份接觸足以沉澱在合併的餾份中之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽。在一些例子中，25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子與合併的餾份接觸包括在蒸餾合併的餾份期間添加粒子。在一些例子中，在蒸餾合併的餾份前，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子添加至合併的餾份中。在一些例子中，在蒸餾合併的餾份的同時，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子添加至合併的餾份中，諸如在開始蒸餾後1分鐘或更久，諸如5分鐘或更久，諸如10分鐘或更久，諸如15分鐘或更久，諸如20分鐘或更久，諸如30分鐘或更久，諸如40分鐘或更久，諸如50分鐘或更久，且包括在開始蒸餾合併的餾份後60分鐘或更久添加25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子至合併的餾份中。在特定的例子中，將合併的餾份在恆壓下蒸餾，諸如其中壓力變化是10%或更少，諸如9%或更少，諸如8%或更少，諸如7%或更少，諸如6%或更少，諸如5%或更少，諸如4%或更少，諸如3%或更少，諸如2%或更少，諸如1%或更少，且包括0.1%或更少。在一些例子中，在蒸餾期間的壓力變化是10 inHg (英吋汞柱)或更少，諸如9 inHg或更少，諸如8 inHg或更少，諸如7 inHg或更少，諸如6 inHg或更少，諸如5 inHg或更少，諸如4 inHg或更少，諸如3 inHg或更少，諸如2 inHg或更少，諸如1 inHg或更少，諸如0.5 inHg或更少，諸如0.1 inHg或更少，諸如0.05 inHg或更少，且包括0.01 inHg或更少。在一些例子中，將合併的餾份在減壓下蒸餾，其中將壓力保持在介於15 inHg至30 inHg之間，諸如17.5 inHg至27.5 inHg，諸如20 inHg至25 inHg，諸如21 inHg至24 inHg，且包括保持在22 inHg至23 inHg之壓力下。
在一些例子中，將合併的餾份在真空下濃縮及將濃縮之合併的餾份與含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子之組成物接觸。在特定的例子中，將濃縮之合併的餾份與含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子之組成物及至少一種溶劑接觸。在特定的例子中，該至少一種溶劑係選自四氫呋喃，諸如2-甲基四氫呋喃。可將濃縮之合併的餾份與含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽粒子之組成物接觸0.001分鐘或更久的持續時間，諸如0.005分鐘或更久，諸如0.01分鐘或更久，諸如0.05分鐘或更久，諸如0.1分鐘或更久，諸如0.5分鐘或更久，諸如1分鐘或更久，諸如2分鐘或更久，諸如3分鐘或更久，諸如4分鐘或更久，諸如5分鐘或更久，諸如10分鐘或更久，諸如15分鐘或更久，諸如30分鐘或更久，諸如45分鐘或更久，且包括60分鐘或更久。在特定的例子中，將合併的餾份逐滴添加至含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽於2-甲基四氫呋喃中的組成物中。
在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與金屬鹽接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸金屬鹽(流程IB1)。
在一些例子中，生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸金屬鹽之方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種鈉鹽接觸。在一些例子中，該至少一種鈉鹽係選自乙酸鈉、碘化鈉、氯化鈉、氫氧化鈉和甲醇鈉。可將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與金屬鹽在-10℃至75℃範圍之溫度下接觸，諸如-5℃至70℃，諸如-4℃至65℃，諸如-3℃至60℃，諸如-2℃至55℃，諸如-1℃至50℃，諸如0℃至45℃，諸如5℃至40℃，且包括10℃至35℃。
反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的金屬鹽的使用量是可改變的，及可以是0.0001當量或更多，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、或2當量至3當量、1當量至100當量、1當量至5當量、1當量至2當量。
在一些例子中，該方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽與碘化鈉接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鈉鹽(流程IB2)。
在一些例子中，製備25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽之方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇與三氧化硫-吡啶複合物接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽；及將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽與鈉鹽接觸以生產5-膽甾-3β,25-二醇-3-硫酸鈉鹽(流程Ib)。
在一些例子中，製備25-羥基-3β-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽之方法包括將(3β)-膽甾-5-烯-3-醇與硫酸化劑接觸以生產第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽；將第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與有機鹼接觸以生產第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽；將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽在至少一種界面活性劑的存在下氧化以生產25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽；使25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽脫氧以產生25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽；及將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種金屬鹽接觸以生產5-膽甾-3β,25-二醇3-硫酸金屬鹽(流程IIa)。
在一些例子中，將膽固醇以硫酸化劑硫酸化(流程IIA1)。在一些例子中，硫酸化劑係選自三氧化硫複合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸酯化合物。在一些例子中，硫酸化劑為三氧化硫-吡啶複合物。在一些例子中，硫酸化劑係選自三氧化硫二甲基甲醯胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在一些例子中，硫酸化劑為硫酸及乙酸酐和吡啶。在一些例子中，硫酸化劑係選自氯磺酸和吡啶。在一些例子中，硫酸化劑係選自氯磺酸和2,6-二甲基吡啶。在一些例子中，硫酸化劑係選自氯磺酸乙酯。
膽固醇可在0℃至100℃範圍之溫度下硫酸化，諸如5℃至95℃，諸如10℃至90℃，諸如15℃至85℃，諸如20℃至80℃，諸如25℃至75℃，且包括30℃至70℃。反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，且包括0.7小時至18小時。相對於膽固醇的硫酸化劑的使用量是可改變的，及可以是0.0001當量或更多，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、2當量至3當量、1當量至30當量、1當量至5當量、或1當量至2當量。
在一些例子中，第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽為(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽(流程IIA2)。
在一些例子中，將第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(結構IIA)與有機鹼接觸以生產第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(結構IIB)(流程IIB1)。
在一些例子中，與第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸的有機鹼係選自氫氧化物鹼。在一些例子中，氫氧化物鹼係選自氫氧化四乙銨、氫氧化四丁銨、氫氧化四丙銨和氫氧化四甲銨。在一些例子中，第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係選自四乙銨陽離子鹽、四丁銨陽離子鹽、四丙銨陽離子鹽和四甲銨陽離子鹽。在一些例子中，將有機鹼與第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽在-10℃至75℃範圍之溫度下接觸，諸如
-5℃至70℃，諸如-4℃至65℃，諸如-3℃至60℃，諸如-2℃至55℃，諸如-1℃至50℃，且包括0℃至15℃。反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。相對於第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的有機鹼的使用量是可改變的，及可以是0.0001當量或更多，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、2當量至3當量、1當量至10當量、1當量至5當量、或1當量至2當量。
在特定的例子中，該方法包括將第一(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與氫氧化四丁銨接觸以產生(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸四丁銨陽離子鹽(結構IIB1)(流程IIB2)。
在一些例子中，將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽氧化以生產25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽(結構IIC)(流程IIC1)。
在一些例子中，氧化第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與含有氧化劑及至少一種界面活性劑之組成物接觸。
在一些例子中，該至少一種界面活性劑係選自非離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、陽離子界面活性劑和兩性離子界面活性劑。除了其他非離子界面活性劑之外，非離子界面活性劑可選自聚氧乙二醇醚(例如聚氧乙二醇辛酚醚)、聚氧乙二醇山梨醇酐烷酯、山梨醇酐烷酯、聚乙二醇與聚丙二醇之嵌段共聚物。陰離子界面活性劑可選自具有陰離子官能頭基之界面活性劑，諸如含磺酸根頭基、含磷酸根頭基、含硫酸根頭基或含羧酸根頭基之界面活性劑。例如，除了其他陰離子界面活性劑之外，陰離子界面活性劑可選自烷基硫酸鹽(諸如月桂基硫酸銨)、磺琥珀酸鈉二辛酯、全氟辛烷磺酸鹽、全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽、直鏈烷基苯磺酸鹽、烷基-芳基醚磷酸鹽、月桂醚硫酸鈉、木質素磺酸鹽或硬脂酸鈉。陽離子界面活性劑可選自具有陽離子官能頭基(諸如吡啶鎓頭基或四級銨頭基)之界面活性劑。例如，陽離子界面活性劑可選自硫酸氫十六烷基三甲銨、硫酸氫四丁銨、溴化十六烷基三甲銨、溴化四丁銨、碘化四丁銨、溴化四丁鏻、溴化四辛銨、碘化四辛銨、氯化苯甲基三乙銨、溴化苯甲基三乙銨、氯化苯甲基十六烷基二甲銨或溴化苯甲基十六烷基二甲銨。兩性離子界面活性劑包括陽離子中心及陰離子中心二者，諸如磺基甜菜鹼(例如3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲銨基]-1-丙烷磺酸鹽)或甜菜鹼(例如椰油醯胺基丙基甜菜鹼)。在特定的例子中，該至少一種界面活性劑為Extran實驗室皂、La Parisienne皂或DL-α-生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸鹽(例如TPGS-750-M-2)。
相對於第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的界面活性劑的使用量是可改變的，其中在一些情況下，使用0.0001當量或更多的界面活性劑，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多的界面活性劑，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、2當量至3當量、0.1當量至5當量、0.15當量至1當量、或0.2當量至0.3當量。
在一些例子中，氧化第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與氧化劑及至少一種酮在至少一種界面活性劑的存在下接觸。
在一些情況下，該至少一種酮係選自四氫噻喃-4-酮1,1-二氧化物和鹵化酮。在一些例子中，鹵化酮係選自1,1,1-三氟-2-丁酮、4,4-二氟環己酮、2-2-2-4’-四氟苯乙酮和1,1,1-三氟丙酮。在特定的例子中，該至少一種酮為1,1,1-三氟-2-丁酮。相對於目標反應中之氧化劑的酮的使用量是可改變的，及可以是1當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，諸如6當量或更多，諸如7當量或更多，諸如8當量或更多，諸如9當量或更多，諸如10當量或更多，諸如15當量或更多，諸如20當量或更多，諸如25當量或更多，諸如30當量或更多，諸如35當量或更多，且包括50當量或更多的酮，且該量的範圍可以是1當量至50當量，諸如1當量至35當量、1當量至25當量、1當量至15當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至5當量、2當量至50當量、2當量至35當量、2當量至25當量、2當量至15當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至5當量、4當量至50當量、4當量至35當量、4當量至25當量、4當量至15當量、4當量至10當量、4當量至8當量、1當量至50當量、2當量至25當量、或5當量至10當量。
在特定的例子中，該酮在使用前係進一步純化。例如，酮可在使用前以蒸餾純化。在一些情況下，測試酮之反應性(例如以
1H-NMR測試雜質)，以便於確定是否可能需要純化。
在特定的例子中，氧化第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與氧化劑及至少一種酮在至少一種界面活性劑及水的存在下接觸。水的存在量是可改變的，該量的範圍是反應混合物的0.0000001% w/v或更多，諸如0.000001% w/v或更多，諸如0.00001% w/v或更多，諸如0.0001% w/v或更多，諸如0.001% w/v，諸如0.01% w/v或更多，諸如0.1% w/v，諸如0.05% w/v或更多，諸如0.1% w/v或更多，諸如0.5% w/v或更多，諸如1% w/v或更多，諸如5% w/v或更多，諸如10% w/v或更多，諸如15% w/v或更多，且包括反應混合物的25% w/v或更多，且該量的範圍可以是0.0000001% w/v至25% w/v，諸如0.0000001% w/v至15% w/v、0.0000001% w/v至10% w/v、0.0000001% w/v至5% w/v、0.0000001% w/v至1% w/v、0.001% w/v至25% w/v、0.001% w/v至15% w/v、0.001% w/v至10% w/v、0.001% w/v至5% w/v、0.001% w/v至1% w/v、0.1% w/v至25% w/v、0.1% w/v至15% w/v、0.1% w/v至10% w/v、0.1% w/v至5% w/v、0.1% w/v至1% w/v、1% w/v至25% w/v、1% w/v至15% w/v、1% w/v至10% w/v、1% w/v至5% w/v、0.1% w/v至50% w/v、0.1% w/v至10% w/v、或0.5% w/v至1% w/v。
第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽可在-25℃至50℃範圍之溫度下氧化，諸如-20℃至45℃，諸如-15℃至40℃，諸如-10℃至35℃，諸如-5℃至30℃，諸如-1℃至25℃，且包括0℃至15℃。在特定的例子中，第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係在0℃至5℃之溫度下氧化。在反應混合物包括水量的情況下，反應可在
-10℃至50℃之溫度下進行，諸如-5℃至45℃，諸如0℃至40℃，諸如0℃至35℃，諸如0℃至30℃，諸如0℃至25℃，諸如0℃至20℃，諸如0℃至15℃，且包括0℃至10℃。
第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽可在5至7.5範圍之pH下氧化，諸如5.5至7.0之pH，且包括5.5至6.5之pH。在一些例子中，在反應混合物含有水的情況下(例如在雙相溶劑系統中)，pH範圍是5.0至6.0，諸如5.0至5.9之pH，諸如5.0至5.8之pH，諸如5.0至5.7之pH，諸如5.0至5.6，且包括5.0至5.5之pH。
反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。
在一些情況下，將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與具有過氧單硫酸氫鉀(potassium peroxymonosulfate)及至少一種酮之組成物在至少一種界面活性劑的存在下於現場接觸。在一些例子中，該方法包括將過氧單硫酸氫鉀與至少一種酮在至少一種界面活性劑的存在下接觸以形成單獨的氧化性反應混合物，及將該氧化性反應混合物添加至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中。在該等例子中，在氧化性反應混合物與第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸前，可將過氧單硫酸氫鉀與至少一種酮在至少一種界面活性劑的存在下接觸0.1分鐘或更久的持續時間，諸如1分鐘或更久，諸如2分鐘或更久，諸如3分鐘或更久，諸如5分鐘或更久，且包括10分鐘或更久，且該時間的範圍可以是2分鐘至180分鐘，諸如3分鐘至120分鐘或4分鐘至60分鐘。在特定的情況下，可將過氧單硫酸氫鉀與至少一種酮在至少一種界面活性劑的存在下接觸以形成單獨的氧化性反應混合物，及立即將該氧化性反應混合物與第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸。該氧化性反應混合物可在-10℃至50℃範圍之溫度下形成，諸如-5℃至45℃，諸如-4℃至40℃，諸如-3℃至35℃，諸如-2℃至30℃，諸如-1℃至25℃，且包括0℃至15℃。在氧化性反應混合物不立即與第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸的情況下，可將氧化性反應混合物保持在-10℃至50℃範圍之溫度下，諸如-5℃至45℃，諸如-4℃至40℃，諸如-3℃至35℃，諸如-2℃至30℃，諸如-1℃至25℃，且包括0℃至15℃。
在一些例子中，該方法進一步包括將氧化性反應混合物添加至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中。在一些情況下，該方法包括將氧化性反應混合物逐滴添加至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中。在一些情況下，該氧化性反應混合物以計量之量添加至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中。該計量之量可連續添加或以預定的時間間隔添加(例如每30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、或一些其他的間隔)。在一些情況下，可將氧化性反應混合物以控制添加的方式添加至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中，諸如以機械或電腦控制之泵，例如注射泵。在一些例子中，該方法包括產生氧化性反應混合物及將含有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之組成物添加至該氧化性反應混合物中。在一些情況下，該方法包括將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽逐滴添加至氧化性反應混合物中。在一些情況下，將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽以經計量之量添加至氧化性反應混合物中。該計量之量可連續添加或以預定的時間間隔添加(例如每30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、或一些其他的間隔)。在一些情況下，可將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽以控制添加的方式添加至氧化性反應混合物中，諸如以機械或電腦控制之泵，例如注射泵。
在特定的例子中，氧化第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種氧化性物種接觸。在一些情況下，該至少一種氧化性物種係選自二氧環丙烷(dioxirane)。在一些情況下，二氧環丙烷係現場產生於具有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之組成物中。在一些情況下，二氧環丙烷係分開產生(例如在分開的反應容器中，例如燒瓶)及添加至含有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之組成物中。
在特定的例子中，將第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽在至少一種鹼的存在下氧化。在特定的例子中，該至少一種鹼係選自弱鹼。在一些例子中，該至少一種鹼係選自碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、苯氧化鉀、檸檬酸鈉緩衝液、磷酸鈉緩衝液、甲酸鉀和乙酸鉀。在特定的例子中，該至少一種鹼為碳酸氫鉀。在一些例子中，該至少一種鹼係隨著時間推移地添加至反應混合物中，諸如以計量之量添加，其中鹼係以預定的時間間隔(例如每30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、或一些其他間隔)添加。在一些例子中，該至少一種鹼可為含有水之組成物，其中存在於組成物中的鹼可以是組成物的0.0000001% w/v或更多，諸如0.000001% w/v或更多，諸如0.00001% w/v或更多，諸如0.0001% w/v或更多，諸如0.001% w/v或更多，諸如0.01% w/v或更多，諸如0.05% w/v或更多，諸如0.1% w/v或更多，諸如0.5% w/v或更多，諸如1% w/v或更多，諸如5% w/v或更多，諸如10% w/v或更多，諸如15% w/v或更多，且包括25% w/v或更多，且其範圍可以是0.0000001% w/v至25% w/v，諸如0.0000001% w/v至15% w/v、0.0000001% w/v至10% w/v、0.0000001% w/v至5% w/v、0.0000001% w/v至1% w/v、0.001% w/v至25% w/v、0.001% w/v至15% w/v、0.001% w/v至10% w/v、0.001% w/v至5% w/v、0.001% w/v至1% w/v、0.1% w/v至25% w/v、0.1% w/v至15% w/v、0.1% w/v至10% w/v、0.1% w/v至5% w/v、0.1% w/v至1% w/v、1% w/v至25% w/v、1% w/v至15% w/v、1% w/v至10% w/v、1% w/v至5% w/v、0.1% w/v至20% w/v、0.2% w/v至15% w/v、或0.3% w/v至10% w/v。在特定的例子中，該至少一種鹼可為水性碳酸氫鉀組成物。
在特定的例子中，第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽係藉由與oxone在硫酸氫十六烷基三甲銨(CTAHS)的存在下接觸，隨後添加三氟丁酮及硫酸氫鉀而氧化，以形成25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽(流程IIC2)。
在特定的情況下，該方法包括在具有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之現場形成氧化性物種，諸如藉由將過氧單硫酸氫鉀與三氟丁酮在硫酸氫十六烷基三甲銨(CTAHS)的存在下在具有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之反應混合物中接觸。在特定的例子中，在具有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之現場形成氧化性物種包括在具有第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之現場形成二氧環丙烷。
在特定的例子中，該方法包括在分開的反應中形成二氧環丙烷及添加二氧環丙烷至第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽中。在該等例子中，可先將過氧單硫酸氫鉀與三氟丁酮在硫酸氫十六烷基三甲銨(CTAHS)的存在下接觸0.1分鐘或更久的持續時間，之後才將該反應性組成物與第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸，該持續時間可為諸如1分鐘或更久，諸如2分鐘或更久，諸如3分鐘或更久，諸如5分鐘或更久，且包括10分鐘或更久，且該時間的範圍可以是0.01分鐘至120分鐘，諸如0.1分鐘至90分鐘或0.5分鐘至60分鐘。在特定的情況下，可將過氧單硫酸氫鉀與三氟丁酮在硫酸氫十六烷基三甲銨(CTAHS)的存在下接觸以形成氧化性反應組成物，立即將該氧化性反應組成物與第二(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽接觸。
可將25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽脫氧以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(結構IID)(流程IID1)。
在一些例子中，自25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽產生25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽包括藉由將25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽與鋅接觸之脫氧作用。在特定的情況下，將25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽與鋅在至少一種鹵化物及至少一種酸的存在下接觸。在一些例子中，該至少一種鹵化物係選自碘和金屬鹵化物。在一些例子中，該金屬鹵化物係選自碘化鈉和碘化鋰。在一些例子中，該至少一種酸係選自弱酸。在一些例子中，該至少一種酸係選自乙酸、氫氯酸、檸檬酸、對甲苯磺酸、甲酸和甲烷磺酸。
用於脫氧25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽之試劑的量是可改變的，其中在一些情況下，使用相對於25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽的0.0001當量或更多的試劑，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、2當量至3當量、1當量至20當量、1當量至10當量、或4當量至6當量。
25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽可在-10℃至75℃範圍之溫度下脫氧，諸如-5℃至70℃，諸如-4℃至65℃，諸如-3℃至60℃，諸如-2℃至55℃，諸如-1℃至50℃，且包括0℃至25℃。反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。
在特定的情況下，該方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-(5,6-環氧基)-3-硫酸有機陽離子鹽與鋅在碘及乙酸的存在下接觸以產生25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(流程IID2)。
在一些例子中，將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽(結構IID)與金屬鹽接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸金屬鹽(結構IIE)(流程IIE1)。
在一些例子中，生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸金屬鹽之方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與至少一種鈉鹽接觸。在一些例子中，該至少一種鈉鹽係選自乙酸鈉、碘化鈉、氯化鈉、氫氧化鈉和甲醇鈉。可將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽與金屬鹽在-10℃至75℃範圍之溫度下接觸，諸如-5℃至70℃，諸如-4℃至65℃，諸如-3℃至60℃，諸如-2℃至55℃，諸如-1℃至50℃，諸如0℃至45℃，諸如5℃至40℃，且包括10℃至35℃。
反應可進行0.1小時至72小時範圍之持續時間，諸如0.2小時至48小時，諸如0.3小時至24小時，諸如0.4小時至21小時，諸如0.5小時至20小時，諸如0.6小時至19小時，諸如0.7小時至18小時，諸如0.8小時至17小時，諸如0.9小時至16小時，且包括1小時至15小時。相對於25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的金屬鹽的使用量是可改變的，及可以是0.0001當量或更多，諸如0.001當量或更多，諸如0.01當量或更多，諸如0.1當量或更多，諸如0.2當量或更多，諸如0.3當量或更多，諸如0.4當量或更多，諸如0.5當量或更多，諸如0.6當量或更多，諸如0.7當量或更多，諸如0.8當量或更多，諸如0.9當量或更多，諸如1當量或更多，諸如1.1當量或更多，諸如1.2當量或更多，諸如1.3當量或更多，諸如1.4當量或更多，諸如1.5當量或更多，諸如1.6當量或更多，諸如1.7當量或更多，諸如1.8當量或更多，諸如1.9當量或更多，諸如2當量或更多，諸如3當量或更多，諸如4當量或更多，諸如5當量或更多，且包括10當量或更多，且該量的範圍可以是0.001當量至10當量，諸如0.1當量至10當量、0.1當量至8當量、0.1當量至6當量、0.1當量至4當量、0.1當量至3當量、1當量至10當量、1當量至8當量、1當量至6當量、1當量至4當量、1當量至3當量、1.5當量至10當量、1.5當量至8當量、1.5當量至6當量、1.5當量至4當量、1.5當量至3當量、2當量至10當量、2當量至8當量、2當量至6當量、2當量至4當量、2當量至3當量、1當量至20當量、1當量至10當量、或1當量至7當量。
在一些例子中，該方法包括將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓鹽與碘化鈉接觸以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鈉鹽(流程IIE2)。
在一些實施態樣中，25HC3S膽鹼鹽具有相對低的溶解度，其可能有用於例如控制釋放型調配物，諸如注射或口服的控制釋放型調配物。如實施例中所示，晶形25HC3S膽鹼鹽至少因為其在鹽水中的低溶解度而可用於控制釋放型調配物。晶形25HC3S膽鹼鹽亦至少因為其在模擬空腹狀態之胃液(FaSSGF)中的低溶解度而可用於控制釋放型調配物。
在一些實施態樣中，晶形25HC3S膽鹼鹽可能具有經口的生物可利用性。例如，在模擬空腹狀態之腸液(FaSSIF)中具有高溶解度之25HC3S的鹽可能具有經口的生物可利用性。如實施例中所示，晶形25HC3S膽鹼鹽在FaSSIF中具有相對高的溶解度。在模擬進食狀態之腸液(FeSSIF)中具有高溶解度之25HC3S的鹽亦可能具有經口的生物可利用性。晶形25HC3S膽鹼鹽在FeSSIF中具有相對高的溶解度。
在一些實施態樣中，25HC3S的鹽為非吸濕性的，其有助於在周圍條件下處置原料藥(drug substance)及避免要求特殊的預防措施，例如要求在低濕度條件下處置、或在乾燥環境中處置、或保存在緊密的容器中。在周圍條件下秤重該等原料藥鹽的製造步驟沒有問題，因為不用擔心由於水分攝取而使天平上的秤重改變。而且，該等鹽的容器可在周圍條件下多次打開及關閉，無需擔心由於粉末吸水而改變組成物。該等鹽的非吸濕本性亦容許以濕式造粒製備經口錠劑及膠囊產品，且使多晶形物或其他固體形式轉換(諸如形成水合物)的可能性最小化。例如，如實施例中所示，晶形25HC3S膽鹼鹽在95%的相對濕度下獲得少於0.5%之水。另外，如DVS等溫線中所示，當晶形25HC3S膽鹼鹽隨著增加至95%的相對濕度而獲得少量水時，彼等可隨著降低至5%的相對濕度而可逆地失去所有該等水。
在一些實施態樣中，25HC3S膽鹼鹽具有高結晶性，例如自加工的觀點來看可能是有利的。晶形25HC3S膽鹼鹽具有高結晶性。XRPD圖案係以單一單位晶胞成功地標定及通過試驗性質的結晶學單位晶胞參數提供健全的晶形說明。來自標定結果的化學式單位體積係與無水形式及預期的鹽化學計量完全一致。
在一些實施態樣中，25HC3S膽鹼鹽具有相對高的DSC(微差掃瞄熱量法)吸熱轉移(表示熱降解或固態轉變)。雖然不想受到理論的束縛，但是此性質可容許原料藥經乾熱式滅菌(例如160°經2小時)，有助於製備滅菌劑型。例如，如實施例中所示，膽鹼之第一個顯著的吸熱轉移係在198℃附近，表明其可藉由乾熱式處理而滅菌。
在一些實施態樣中，25HC3S膽鹼鹽具有良好的溫度穩定性。如實施例中所示，晶形25HC3S膽鹼鹽膽鹼鹽具有良好的溫度穩定性。
在一些實施態樣中，25HC3S膽鹼鹽之膽鹼相對離子可於活體內具有有益的效應。例如，膽鹼鹽可為有益的，因為膽鹼缺乏亦與脂肪堆積和發炎有關的此等病症有牽連，建議補充膽鹼作為治療及/或管理此等病症可能是想要的(參見例如Zeisel等人之Nutr Rev. 2009 Nov; 67(11): 615-623；Corbin等人之Curr Opin Gastroenterol. 2012 Mar; 28(2): 159-165)。
條文
條文1. 一種25HC3S膽鹼鹽。
條文2. 一種晶形25HC3S膽鹼鹽。
條文3. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文4. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文5. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文6. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文7. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文8. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文9. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文10. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文11. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文12. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文13. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文14. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文15. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文16. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文17. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文18. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文19. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文20. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文21. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文22. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文23. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文24. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文25. 條文3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文26. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文27. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文28. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文29. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文30. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文31. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文32. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文33. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文34. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文35. 條文15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文36. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文37. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文38. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文39. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文40. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文41. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文42. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文43. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文44. 條文26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文45. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文46. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文47. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文48. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文49. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文50. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文51. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文52. 條文36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文53. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文54. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文55. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文56. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文57. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文58. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文59. 條文45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文60. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文61. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文62. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文63. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文64. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文65. 條文53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文66. 條文60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文67. 條文60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文68. 條文60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文69. 條文60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文70. 條文60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文71. 條文66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文72. 條文66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文73. 條文66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文74. 條文66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文75. 條文71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文76. 條文71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文77. 條文71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文78. 條文75之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文79. 條文75之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文80. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文81. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文82. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文83. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文84. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文85. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文86. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文87. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文88. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文89. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約15.8°2θ、約16.3°2θ, 及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文90. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
條文91. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文92. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有實質上與圖1所示者相同的x射線粉末繞射圖案。
條文93. 條文2至92之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有斜方單位晶胞。
條文94. 條文2至93之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有長度約7.9Å、約9.5Å及約45.1Å之單位晶胞。
條文95. 條文2至94之晶形25HC3S膽鹼鹽，其中在介於約5%至約95%的相對濕度之間以晶形膽鹼鹽攝取之水是少於0.5重量%。
條文96. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ及約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文97. 條文96之晶形25HC3S膽鹼鹽，其另外包含在約19.1°2θ之峰。
條文98. 條文2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
條文99. 一種實質上純的晶形25HC3S膽鹼鹽。
條文100. 條文2至98之實質上純的晶形膽鹼鹽。
條文101. 一種製備25HC3S膽鹼鹽之鹽的方法，其包含製備25HC3S溶液及以膽鹼化合物處理溶液的步驟。
條文102. 條文101之方法，其中溶液為有機溶液。
條文103. 條文102之方法，其中有機溶液包含乙腈。
條文104. 條文101至103之方法，其中膽鹼化合物為氫氧化膽鹼。
條文105. 條文101至104之方法，其中25HC3S溶液之製備係藉由將25HC3S之鹽溶解在醇溶劑中。
條文106. 條文105之方法，其中25HC3S之鹽為25HC3S之三乙銨鹽。
條文107. 條文106之方法，其中25HC3S之三乙銨鹽係以包含將25HC3S鈉溶解在適合的溶劑中、及以包含三乙銨鹽酸鹽之溶液處理、及分離25HC3S三乙銨鹽固體之方法製得。
條文108. 條文107之方法，其中適合的溶劑包含甲醇。
條文109. 條文107至108之方法，其中包含三乙銨鹽酸鹽之溶液另外包含三乙胺。
條文110. 一種由條文101至109之方法製得的晶形25HC3S膽鹼鹽。
條文111. 一種醫藥組成物，其包含條文1至100及110中任一者之25HC3S膽鹼鹽及至少一種醫藥上可接受的賦形劑。
條文112. 一種治療或預防非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症中一或多者之方法，其包含對需要的患者投予有效量的條文1至100及110至111中任一者之25HC3S膽鹼鹽化合物。
條文113. 條文111之醫藥組成物，其經配置而用於經口投予。
條文114. 條文112之方法，其中投予以供治療。
條文115. 條文1至100、110、111或113中任一者之25HC3S膽鹼鹽，其係用作為藥劑。
條文116. 條文1至100、110、111或113中任一者之25HC3S膽鹼鹽，其係用於如條文112或114所定義之方法。
條文117. 一種如條文1至100、110、111或113中任一者之25HC3S膽鹼鹽之用途，其係用於製造用於如條文112或114中任一者所定義之方法的藥劑。
條文118. 條文2至100、110或115至116中任一者之晶形25HC3S膽鹼鹽。
實驗
提出以下的實施例以便於提供那些熟習本技術的普通技能者如何製作及使用本發明之完整揭示及說明，且不意欲以其限制由發明人視為彼等發明之範圍，亦不意欲以其代表下列實驗為所執行的全部或僅有的實驗。已盡力確保關於所使用之數字(例如量、溫度等)的準確性，但是應該考慮一些實驗誤差及偏差。
製備25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽之通用合成程序
25HC3S可以各種方法製備。本文揭示25HC3S之示例性製備方法。應注意本文所使用之方法不一定用於本文所述之25HC3S膽鹼鹽或晶形25HC3S膽鹼鹽的合成期間。然而，該等方法可確實用於此等製備方法中。
所有的溫度皆以攝氏度(℃)計且未經校正。試劑級化學品及無水溶劑係自商業來源購得，且除非另有他提及，否則不進一步純化即可使用。產物名稱係使用包括在Biovia電子實驗室筆記本中的命名軟體確定。矽膠層析法係在使用預填充的可棄式SiO
2固定相管柱的Teledyne Isco儀器上以15至200 mL/min之溶析劑流速執行。分析性HPLC層析圖係使用具有DAD檢測器(190 nm至300 nm)之Agilent 1100系列儀器執行。質譜係在130℃下以Waters Micromass ZQ檢測器記錄。質譜儀配備有以正離子模式操作之電噴霧離子源(ESI)，且設定在介於m/z 150至750之間以0.3 s之掃描時間掃描。產物及中間物係以HPLC/MS分析：在Gemini-NX(5 μM，2.0×30 mm)上於2.5 min內使用在H
2O(0.03%(NH
4)
2CO
3/0.375% NH
4OH)中的5%至100%之MeCN的高pH緩衝液梯度，以1.8 mL/min運行3.5 min (B05)，及在EVO C18(5 μM，3.0×50 mm)上於2.5 min內使用在H
2O(0.1% HCOOH)中的5%至100%之MeCN的低pH緩衝液梯度，以2.2 mL/min運行3.5 min(A05)。
1H NMR光譜係以Bruker UltraShield 500 MHz/54 mm儀器(BZH 43/500/70B，D221/54-3209)紀錄。化學位移係參考溶劑峰，在
1H NMR中，CDCl
3出現在7.26 ppm，DMSO-d
6出現在2.50 ppm，及CD
3OD出現在3.31 ppm。
實施例1. [(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鈉之合成
將吡啶三氧化硫複合物(12.45 g，78 mmol)裝入無水3-頸燒瓶中及將固體懸浮於甲苯(1.5 L)和乙酸酐(7.2 mL，74.5 mmol)中。將混合物在20℃下攪拌40 min及添加吡啶(60 mL，745 mmol)。將混合物在20℃下攪拌20 min。一次添加呈固體的(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7, 8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(30 g，74.5 mmol)。將混合物在20℃下攪拌23 h。以劇烈攪拌經5 min逐滴添加乙酸鈉水溶液(10 wt%，123 mL，149 mmol)。將所得混合物在20℃下攪拌1 h。自反應器泵出溶劑，將任何固體收集至燒結玻璃濾器上。添加ACN(700 mL)及將漿液劇烈攪拌3 h。將漿液自反應器泵出至相同的燒結玻璃濾器上，且將反應器中的剩餘固體再懸浮於ACN (700 mL)中及攪拌1 h，然後自反應器泵出至燒結玻璃濾器。將燒結玻璃濾器中的固體以二乙醚(750 mL)沖洗出及接著懸浮於DMF(800 mL)中。將混合物在20℃下攪拌1 h。將懸浮液過濾及收集濾液。將二乙醚(3.2 L)以攪拌添加至濾液中。以真空過濾收集所得固體及將濾餅以二乙醚(1 L)沖洗。將固體在減壓下乾燥以得到固體的標題化合物(15 g，40%)。
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 5.56 - 5.32 (m, 1H), 4.17 (tt,
J= 11.5, 4.8 Hz, 1H), 2.55 (dd,
J= 4.9, 2.2 Hz, 1H), 2.47 - 2.29 (m, 1H), 2.14 - 2.06 (m, 2H), 2.01 (ddd,
J= 12.4, 7.7, 5.1 Hz, 1H), 1.97 - 1.85 (m, 2H), 1.73 - 1.22 (m, 15H), 1.20 (s, 6H), 1.19 - 1.08 (m, 4H), 1.07 (s, 3H), 1.04 - 0.95 (m, 1H), 1.00 (d,
J= 6.5 Hz, 3H), 0.76 (s, 3H)；
m/z：ES-[M]
-481.3；LCMS (B05)；t
R= 1.18 m。
實施例2. [(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鈉之合成
將三氧化硫吡啶複合物(4.74 g，29.8 mmol)裝入無水3-頸燒瓶中。將固體懸浮於甲苯(500 mL)中及一次添加乙酸酐(2.61 mL，27.67 mmol)。將所得混合物在23℃下攪拌1 h。添加吡啶(20 mL，248.4 mmol)及將混合物在23℃下攪拌5 min。一次添加呈固體的(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(10 g，24.83 mmol)。將混合物在23℃下攪拌23 h。將反應以MeOH(2.01 mL，49.7 mmol)稀釋及在23℃下攪拌1 h。將懸浮液過濾及將固體以甲苯(2×200 mL)清洗。收集固體及在高真空下乾燥以提供固體。將固體部分溶解在ACN(600 mL)中及添加碘化鈉(14.9 g，99.3 mmol)。將混合物在23℃下攪拌10 min，然後以冰浴冷卻至0℃及攪拌1.5 h。將懸浮液過濾及將固體以冷ACN(2×275 mL)和丙酮(2×200 mL)清洗。收集固體及在高真空下乾燥以得到固體的標題化合物(7.24 g，57%)。
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 5.56 - 5.32 (m, 1H), 4.17 (tt,
J= 11.5, 4.8 Hz, 1H), 2.55 (dd,
J= 4.9, 2.2 Hz, 1H), 2.47 - 2.29 (m, 1H), 2.14 - 2.06 (m, 2H), 2.01 (ddd,
J= 12.4, 7.7, 5.1 Hz, 1H), 1.97 - 1.85 (m, 2H), 1.73 - 1.22 (m, 15H), 1.20 (s, 6H), 1.19 - 1.08 (m, 4H), 1.07 (s, 3H), 1.04 - 0.95 (m, 1H), 1.00 (d,
J= 6.5 Hz, 3H), 0.76 (s, 3H)；
m/z：ES-[M]
-481.3；LCMS (B05)；t
R= 1.18 m。
實施例3. [(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鈉之合成
將15 L夾套反應器加熱至60℃及以氮氣吹洗1.5 h。將夾套溫度設定至30℃及裝入2-MeTHF(7 L)。裝入(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(495 g，1.23 mol)，及以2-MeTHF(6 L)沖洗通道(manway)/玻璃器皿。將溶液冷卻至25℃，添加額外的2-MeTHF(1 L)及添加三氧化硫吡啶複合物(234.8 g，1.47 mol)。將混合物在28℃下攪拌24 h。添加2-MeTHF (2 L)，將混合物再攪拌16 h，冷卻至20℃及過濾。將固體以2-MeTHF(3.5 L)沖洗。將固體溶解在MeOH(6 L)中的NaOH (118 g，2.95 mmol)之溶液中。將混合物在25℃下攪拌1 h及接著在矽藻土塞上過濾。將濾液濃縮至3.5 L及以二乙醚(8 L)稀釋。將懸浮液驟冷至15℃及過濾以得到固體的標題化合物(146.8 g，24%)。將濾液濃縮至1 L及再與二乙醚(4 L)混合。以真空過濾收集固體以得到固體的標題化合物(68.5 g，11%)。將矽藻土以MeOH(2 L)萃取，將其濃縮至500 mL及以二乙醚(3 L)稀釋，且以真空過濾收集固體以得到固體的標題化合物(53.3 g，8.6%)。自濾液分離出第四收成物(11.88 g，2%)。總產量：280.5 g，45%。
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 5.56 - 5.32 (m, 1H), 4.17 (tt,
J= 11.5, 4.8 Hz, 1H), 2.55 (dd,
J= 4.9, 2.2 Hz, 1H), 2.47 - 2.29 (m, 1H), 2.14 - 2.06 (m, 2H), 2.01 (ddd,
J= 12.4, 7.7, 5.1 Hz, 1H), 1.97 - 1.85 (m, 2H), 1.73 - 1.22 (m, 15H), 1.20 (s, 6H), 1.19 - 1.08 (m, 4H), 1.07 (s, 3H), 1.04 - 0.95 (m, 1H), 1.00 (d,
J= 6.5 Hz, 3H), 0.76 (s, 3H)；
m/z：ES-[M]
-481.3；LCMS (B05)；t
R= 1.18 m。
實施例4. [(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸銨之合成
將三氧化硫二甲基甲醯胺複合物(42 mg，0.273 mmol)添加至0℃下在無水DCM(20 mL)中的(3S,10R,13R,17R)-17-(5-羥基-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(100 mg，0.25 mmol)之攪拌溶液中。將混合物在0℃下攪拌5 h及接著將反應溫熱至20℃。將混合物在減壓下濃縮以得到粗製固體，將其在以DCM與MeOH(0至20%)的混合物溶析之矽膠(12 g匣)上以管柱層析法純化以得到不純的化合物。
m/z：ES-[M-H]
-481。
實施例5. [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸吡啶-1-鎓鹽之合成
在經烘箱乾燥之圓底燒瓶中，將三氧化硫吡啶複合物(4.53 g，28.5 mmol)懸浮於甲苯(240 mL)中。添加乙酸酐(2.44 mL)，隨後添加吡啶(20.8 mL)。將反應在23℃下攪拌1 h及一次添加呈固體的膽固醇(10 g，25.9 mmol)。將懸浮液在23℃下攪拌18 h及在燒結玻璃濾器上過濾，且將固體以甲苯(100 mL)沖洗，隨後以己烷(100 mL)沖洗。將固體懸浮於氯仿(400 mL)中及在相同的燒結玻璃濾器上過濾。將燒結玻璃濾器以氯仿(200 mL)沖洗及收集濾液。將濾液以己烷稀釋至1.8 L及冷藏1 h。將懸浮液過濾；將固體以二乙醚(100 mL)沖洗及在高真空下乾燥以得到固體的標題化合物(10.06 g，71%)。
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.89 (dd,
J= 6.6, 1.4 Hz, 2H), 8.79 - 8.61 (m, 1H), 8.27 - 8.05 (m, 2H), 5.38 (d,
J= 5.3 Hz, 1H), 4.13 (tt,
J= 11.5, 4.7 Hz, 1H), 2.53 (ddd,
J= 13.3, 5.0, 2.3 Hz, 1H), 2.43 - 2.28 (m, 1H), 2.12 - 2.02 (m, 2H), 2.01 - 1.94 (m, 1H), 1.94 - 1.80 (m, 2H), 1.70 - 0.83 (m, 20H), 1.03 (s, 3H), 0.95 (d,
J= 6.6 Hz, 3H), 0.88 (dd,
J= 6.6, 1.9 Hz, 6H), 0.72 (s, 3H)；
m/z：ES-[M]
-465.3；LCMS (B05)；t
R= 1.40 m。
實施例6. [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸吡啶-1-鎓鹽之合成
膽固醇硫酸吡啶鎓鹽之製備係藉由將三氧化硫吡啶複合物(4.53 g，28.5 mmol)添加至30℃下在2-MeTHF(250 mL)中的膽固醇(10 g，25.9 mmol)之溶液中及將混合物攪拌16 h。接著將懸浮液過濾及將固體以2-MeTHF (50 mL)沖洗以得到標題化合物。
實施例7. [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸鈉之合成
將氯磺酸(0.03 mL，0.45 mmol)添加至通過分子篩之丙酮(2.5 mL)中的2,6-二甲基吡啶(0.08 mL，0.69 mmol)之溶液中。將溶液在20℃下攪拌2 min，然後冷卻至0℃。逐滴添加經分子篩事先乾燥之丙酮(5 mL)中的膽固醇(100 mg，0.26 mmol)之溶液。將混合物在0℃下攪拌2 h，然後經16 h溫熱至20℃。將混合物過濾及收集固體。接著將固體懸浮於丙酮(10 mL)中及添加水性碳酸氫鈉，直到起泡平息。將懸浮液過濾及將固體以MeOH(10 mL)和DCM(10 mL)濕磨。在減壓下移除溶劑以供應固體。將固體以ACN(30 mL)濕磨、過濾及將濾液凍乾以得到固體的標題化合物(7.3 mg，5.8%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 5.31 - 5.19 (m, 1H), 4.10 (s, 1H), 3.87 - 3.78 (m, 1H), 2.42 - 2.31 (m, 1H), 2.13 (dd,
J= 14.5, 7.6 Hz, 1H), 2.02 - 1.69 (m, 5H), 1.62 - 0.95 (m, 20H), 0.94 (s, 3H), 0.89 (d,
J= 6.5 Hz, 4H), 0.84 (dd,
J= 6.6, 2.5 Hz, 7H), 0.65 (s, 3H)。
實施例8. [(3S,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16, 17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸銨之合成
將三氧化硫吡啶複合物(300 mg，1.88 mmol)添加至吡啶(5.00 mL)中的二氫膽固醇(cholestanol)(300 mg，0.772 mmol)之溶液中及將懸浮液在20℃下攪拌16 h。將殘餘物具有在DCM中的MeOH(5%之NH
4OH)之矽膠層析法(24 g匣)純化，以DCM與MeOH(0至30%)的混合物溶析，以得到固體的標題化合物(314 mg，84%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d
6) δ 7.08 (s, 4H), 3.97 - 3.86 (m, 1H), 1.91 (dd,
J= 12.5, 3.5 Hz, 1H), 1.86 - 1.71 (m, 2H), 1.69 - 1.55 (m, 3H), 1.55 - 1.41 (m, 3H), 1.38 - 1.25 (m, 5H), 1.25 - 0.90 (m, 15H), 0.88 (d,
J= 6.6 Hz, 4H), 0.84 (dd,
J= 6.6, 2.4 Hz, 7H), 0.74 (s, 3H), 0.62 (s, 3H)；
m/z：ES [M-NH
4]
-467.3；HPLC(BEH Ambicarb/ACN 5至100%) t
R=7.48 min。
實施例9. [(3R,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸銨之合成
將三氧化硫吡啶複合物(206 mg，1.29 mmol)添加至吡啶(5.00 mL)中的(3R,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14, 15,16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(200 mg，0.517 mmol)之溶液中。將懸浮液在20℃下攪拌16 h，接著在減壓下濃縮。將殘餘物以矽膠層析法(24.0 g匣)純化，以DCM與在MeOH (0至30%)中的5%之NH
4OH的混合物溶析，以得到固體的標題化合物(160 mg，64%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7.07 (s, 4H), 5.18 - 5.14 (m, 1H), 4.32 - 4.27 (m, 1H), 2.40 - 2.29 (m, 1H), 2.16 (dt,
J= 14.9, 2.4 Hz, 1H), 2.01 - 1.72 (m, 4H), 1.60 - 0.96 (m, 22H), 0.94 (s, 3H), 0.90 (d,
J= 6.5 Hz, 3H), 0.84 (dd,
J= 6.6, 2.4 Hz, 6H), 0.65 (s, 3H)；
m/z：ES [M-NH
4]
-465.6；HPLC (BEH AmForm/ACN 5-100%) t
R= 2.76 min。
實施例10. [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15, 16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-基]硫酸吡啶鎓鹽之合成
將乙酸酐(0.0704 mL，0.745 mmol)添加至無水甲苯(15.0 mL)中的三氧化硫吡啶複合物(125 mg，0.782 mmol)之懸浮液中。將懸浮液在20℃下攪拌40 min及添加吡啶(0.600 mL)。將懸浮液在20℃下攪拌20 min。一次添加呈固體的(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羥基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15, 16,17-十二氫-1H-環戊[a]菲-3-醇(300 mg，0.745 mmol)。將懸浮液在20℃下攪拌20 h。將混合物在燒結玻璃濾器上過濾以得到固體的標題化合物(329 mg，92%純度，72%產率)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d
6) δ 8.99 - 8.88 (m, 2H), 8.65 - 8.53 (m, 1H), 8.13 - 7.97 (m, 2H), 5.30 - 5.20 (m, 1H), 3.93 - 3.71 (m, 1H), 2.41 - 2.32 (m, 1H), 2.18 - 2.08 (m, 1H), 2.02 - 1.71 (m, 5H), 1.59 - 0.95 (m, 20H), 1.05 (s, 6H), 0.94 (s, 3H), 0.90 (d,
J= 6.4 Hz, 3H), 0.65 (s, 3H)；
m/zES
+[M+H]
+481.32；HPLC (DUR B) t
R= 1.36 min。
實施例11. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽(1，鈉鹽)之合成
實施例11A. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽之製備–途徑1
3β,25-二羥基膽甾-5-烯(4.6 g，0.011 mol)及三乙胺(1.7 mL，0.023 mol)懸浮於吡啶(57 ml)中及加熱至50℃。添加三氧化硫三甲胺複合物(3.2 g，0.023 mol)及將混合物攪動24小時。另外加入三氧化硫三甲胺複合物(0.77 g，0.006 mol)及將混合物額外攪動4小時。將反應混合物以50℃之夾套蒸餾至減少-20%之初始體積。將殘餘物以矽膠層析法(11 0 g)純化，以乙酸乙酯/甲醇/三乙胺(90/9/1 v/v)混合物溶析；將餾份以使用磷鉬酸染色劑之TLC(4:1之二氯甲烷：甲醇)分析。將含有3-及25-硫酸鹽區域異構物(regioisomer)之餾份合併及蒸發(浴溫＜35℃)。將殘餘物(4.2 g，0.0072 mol)在乙腈(25 g)中形成漿液，以1 N氫氧化鈉(7.2 ml，自30%之氫氧化鈉溶液稀釋)處理1小時及接著過濾。將固體以乙腈(25 g)沖洗及乾燥至恆重(2.77 g)。將含有3-及25-硫酸鈉鹽混合物(2.77 g)的固體在50℃下以乙醇(27.7 g，10S)濕磨1小時及接著在5℃下過濾。將分離之固體乾燥至恆重(1.2 g)。將固體(1.2 g)在30℃下懸浮在6:1之乙腈/水(10 S)中30分鐘及接著過濾。過濾需要約40分鐘。將固體乾燥至恆重(0.86 g)及分析。
實施例11B. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽之製備–途徑2 –過量硫酸化劑
使用過量的三氧化硫三甲胺複合物驅動反應朝向形成二硫酸鹽。3β,25-二羥基膽甾-5-烯之3-羥基之趨向硫酸化的反應性比25-羥基多約6倍。提供過量的硫酸化劑及容許反應進行至高轉換率以提供具有更高的區域異構物純度之單硫酸鹽。在此合成期間觀察到此結果。將吡啶(75 ml)中的3β,25-二羥基膽甾-5-烯(4.1 g)之溶液真空蒸餾以減少體積至50 ml。執行此蒸餾以移除異丙醇(來自二醇的再結晶)及任何存在的水分。將三乙胺(2當量)及接著將總共1.75當量之三氧化硫三甲胺複合物在50℃下經18小時期間分次(1.0、0.5和0.25當量)添加至反應中，及容許反應運作總共43小時。將反應混合物以真空蒸餾濃縮及使殘餘物被吸收至SiO
2(10 g)上。將裝載之SiO
2放置在SiO
2管柱上及以2至50%之甲醇/乙酸乙酯/1%之三乙胺溶析。將來自管柱之適當的餾份合併及蒸發以產出二硫酸鹽(3.1 g，39.7%)及單硫酸鹽(2.6 g，44.7%)。獲得22:1之3-硫酸鹽與25-硫酸鹽的混合物之單硫酸鹽。將固體懸浮於乙腈(25 g)中，以1 N氫氧化鈉(4.44 ml)處理及接著過濾。形成濃稠凝膠，其難以操作及不將其過濾。產物為乙腈/水中的懸浮液。將溶劑在40℃下以旋轉蒸發移除及將殘餘物在40℃之真空烘箱中乾燥。將固體以丙酮濕磨以產出白色固體：1.27 g，24.9%。此產物僅顯示3β-硫酸化產物，但受到RRT 8.18(未知，2.0%)、RRT 15.17(二醇，2.2%)及RRT 16.70(未知，1.8%)之峰污染。
實施例12. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽(1，鈉鹽)之製備規模合成
將3β,25-二羥基膽甾-5-烯(
34)(30 g，74.5 mmol)及無水吡啶(500 mL，Sigma-Aldrich，目錄#270970-1L，批號#SHBC6287V)裝入具有頂置式攪拌器的2 L三頸圓底燒瓶中。一次添加三氧化硫-三甲胺複合物(12.2 g，89.4 mmol，Sigma-Aldrich，目錄#135879-100G，批號#MKBH5585V)。將懸浮液在室溫攪拌隔夜。將反應混合物濃縮，及將殘餘物以管柱層析法純化以得到25.9 g (59%)為三乙胺鹽的白色固體(HPLC：98.6%純度)。將1 N NaOH(110 mL，110.1 mmol，NaOH，Fisher，目錄#S318-3，批號#034906)添加至ACN(1 L)中的三乙胺鹽(
34.1)(64 g，110.1 mmol)之懸浮液中及將混合物在室溫攪拌1 h。將固體過濾，以ACN(1 L)清洗及在真空下(P
2O
5)乾燥隔夜，產量：51.5 g，93%(HPLC：98.6%純度)。
在攪拌隔夜後，反應為凝膠狀混合物。TLC顯示為主要點的預期產物(TLC：在DCM中的20%之MeOH，R
f=0.4)，具有為次要點的起始材料(R
f＞0.9)及3
β-25-羥基膽固醇二硫酸鹽(R
f＜0.1)二者。填充矽膠(1 kg，Sorbent Technologies，目錄#40930-2.5 kg)以形成尺寸10 cm×42 cm的管柱。以DCM(2.8 L)中的1%之三乙胺(Et
3N，Fisher，目錄#04885-4，批號#062833)完成管柱平衡。將粗製殘餘物溶解在DCM(200 mL)及Et
3N(20 mL)中，將其直接裝載於管柱中。在此階段使用三乙胺以避免產物分解及二硫酸鹽分解(其形成之後非常難自產物移除的烯烴)。初始溶析劑為DCM(1%之Et
3N)(2 L)，隨後為DCM(1%之Et
3N)中的1%之MeOH(1 L)、DCM(1%之Et
3N)中的2%之MeOH(3 L)、DCM (1%之Et
3N)中的5%之MeOH(1 L)。產物於CH
2Cl
2(1%之Et
3N)中的2%之MeOH中開始溶析出。將收集之餾份在低於36℃下經由旋轉蒸發濃縮(若溫度高於45℃，則觀察到產物在MeOH的存在下分解)。對所選擇之餾份以TLC及NMR兩者檢查。HPLC(Zorbax SB-18，4.6×150 mm，5 µm，202 nm，流速0.8 mL/min)：溶劑A：MeOH/ 5%之ACN/7.4 mM NH
4Oac；溶劑B：H
2O/5%之ACN/7.4 mM NH
4Oac。梯度75%之A及25%之B至100%之A。產物：98.6%純度；1.4%起始材料(
34)。HPLC：Durashell C18 (Agela Technologies，4.6×50 mm，3 mm，100Å)；溶劑A：MeOH/5%之ACN/7.4 mM NH
4Oac；溶劑B：H
2O/5%之ACN/7.4 mM NH
4OAc。產物：98.6%純度；1.4%起始材料(
34)。
實施例13. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽(1，鈉鹽)之大規模合成
以公斤規模製備之總結
將3β,25-二羥基膽甾-5-烯(
34)(2.6 kg)及吡啶(39.2 kg)合併及將混合物在兩個50 L反應器中以攪動加熱至40℃。將三氧化硫-三甲胺(1.1 kg)添加至混合物中及在40℃下攪拌6至12小時，直到反應完成。將混合物在真空蒸餾下濃縮至最小的攪拌體積及接著以二氯甲烷和三乙胺稀釋。
將二氯甲烷中的粗製反應混合物裝載至以矽膠填充之2.33 ft
3不鏽鋼管柱(C-105)上及以二氯甲烷(含有1%之甲醇及1%之三乙胺)溶析。將含有非所欲產物之餾份收集至廢料桶中。收集含有所欲產物之餾份及將其濃縮至反應器中。
將乙腈、水及氫氧化鈉添加至含有所欲產物的反應器中及將混合物攪動，直到認為反應完成。將所得漿液冷卻至10至15℃及過濾以分離化合物(
1)。將分離之化合物(
1)的濾餅以乙腈清洗及接著在40℃之真空下乾燥，直到達成恆重。
將固體過濾，以乙腈(1 L)清洗及在真空下(P
2O
5)經乾燥隔夜，產量：51.5 g，93%(HPLC：98.6%純度)。
討論
在6 h後以HPLC分析反應混合物顯示44.1%剩餘的起始材料。反應被視為完成及在真空下蒸餾至最小的攪拌體積(步驟5.3)。將二氯甲烷和三乙胺添加至所得濃稠殘餘物中，及將溶液轉移至乾淨的5加侖大玻璃瓶(glass carboy)中。在保持溶液隔夜後，在大玻璃瓶中沉澱出濃稠固體。使用桌上型過濾器濾除固體。將約1/3的澄清濾液裝入C-105管柱的頂部。事先將C-105管柱中的矽膠事先以乙酸乙酯和甲醇沖洗，及接著以二氯甲烷中的1%之三乙胺溶析劑平衡。
一旦粗製溶液裝載至管柱的頂部，以保持~10 psi之壓力裝入溶析劑。溶析液剛離開管柱即以每10至15分鐘取樣。吡啶及3β,25-二羥基膽甾-5-烯存在於前兩個樣品中，但是在第三個樣品中除了吡啶及3β,25-二羥基膽甾-5-烯以外，亦檢測出3β-三乙胺鹽及25-硫酸鹽區域異構物。因為發生最少的分離，所以使用極性溶析劑(1%之MeOH、1%之NEt
3和98%之DCM)自管柱溶析出所有的剩餘材料。將濾液濃縮及與來自大玻璃瓶之剩餘的三分之二的粗製溶液合併。在蒸餾後，將粗製溶液轉移到乾淨的大玻璃瓶中。分析離開管柱的溶析液，其含有1.7%之甲醇(
1H NMR面積%)。將管柱以溶析劑(在二氯甲烷中的1%之三乙胺)平衡及分析甲醇(0.25%之甲醇，
1H NMR面積%)。在此期間開始在大玻璃瓶中形成固體。將漿液過濾及將濾液收集至乾淨的大玻璃瓶中。
將約三分之一的粗製溶液裝載至第二個C-105管柱上。將溶析劑以保持＜5 psi裝入管柱中。以薄層層析法(TLC)分析離開管柱的溶析液顯示發生分離。一旦以TLC不再檢測出3β,25-二羥基膽甾-5-烯，則以
1H NMR分析溶析液以確保3β-三乙胺鹽與25-硫酸鹽區域異構物分離。自含有溶析液的桶中移出樣品，及3β-三乙胺鹽的純度是85%，存在有15%之25-硫酸鹽區域異構體(
1H NMR)。HPLC重量百分比檢定顯示在桶中收集到127 g之3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物(85%之3β-三乙胺鹽)。將經純化之材料放在一旁及將剩餘三分之二的粗製溶液以層析法純化。將C-105管柱中的矽膠以甲醇沖洗及接著以二氯甲烷中的1%之三乙胺平衡(在再生後，以
1H NMR面積%分析，0.2%之甲醇於溶析液中)。
將自大玻璃瓶沉澱之固體以
1H NMR分析及經鑑定為自二氯甲烷與三乙胺(來自SO
3NMe
3試劑)及二氯甲烷與三乙胺之反應所生產之四級銨鹽。將二氯甲烷-三乙胺複合物以過濾分離，同時二氯甲烷-三乙胺複合物於層析法中形成。鹽的形成發生在周圍條件下，及在特定的情況下於加壓環境中迅速形成。建立其中3β-三乙胺鹽之三乙銨部分可與四級銨鹽交換以得到四級銨複合物及三乙胺鹽酸鹽之平衡。平衡有利於四級銨複合物的形成，因為有更多的二氯甲烷-三乙胺複合物存在。將三乙胺鹽酸鹽分離出及表徵。
在大玻璃瓶中的剩餘三分之二的粗製混合物中，使三分之一在第四管柱上經歷層析法。壓力在整個純化期間保持在0至1 psi。成功的分離3β-三乙胺鹽與25-硫酸鹽區域異構物：在桶中的3β-三乙胺鹽純度以HPLC是99.79%。自管柱分離出約0.050 kg之化合物
34.1(HPLC重量百分比檢定)。將矽膠以甲醇清潔及以二氯甲烷中的1%之三乙胺再生。在再生後存在的甲醇量是0.44% (
1H NMR面積%)。此管柱未發生分離。來自第四管柱的材料未進行進一步的純化。使來自第三管柱的溶析液(~50 g之3β-三乙胺鹽)經歷陽離子交換開始先將溶劑交換成乙腈。在添加乙腈、水及30%之氫氧化鈉後，將漿液攪動及接著保持隔夜。在後攪拌後，固體出現於反應器中。將混合物冷卻及使用新的8.5”桌上型過濾器過濾。將濾餅以新鮮乙腈清洗及乾燥。將樣品以
1H NMR分析，光譜中存在有與四級銨鹽一致的峰。HPLC測得25-硫酸鹽區域異構物的存在。
將來自第二管柱之溶析液在真空下濃縮及乾燥至恆重。以
1H NMR分析黃色粉末(540 g)顯示二氯甲烷-三乙胺四級銨鹽對單硫酸鹽化合物之比(3:1)。將所有的粗製材料(540 g)裝入3 L夾套反應器中。裝入乙腈(1400 g)及將漿液加熱至50±5℃經30分鐘。將漿液冷卻至26℃及接著過濾。分析濕濾餅，及3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構體對四級銨鹽之比是~1:1。將經純化之固體及新鮮乙腈(1400 g)裝回反應器中。在45 min後裝入水(200 g)，攪動15分鐘及接著過濾。將粒狀粉末在40℃之真空烘箱中乾燥隔夜。將濾液濃縮至乾燥，將殘餘物與經乾燥之材料合併及將兩者裝入3 L反應器中。將乙腈(1500 g)、1 N氫氧化鈉(600 g)及30%之氫氧化鈉(40 g)依序裝入反應器中。將漿液攪動48小時及接著在周圍溫度下過濾。將濾餅乾燥至恆重(173 g)及以HPLC分析。
實施例13A. 純化以分離25-硫酸鹽區域異構物與化合物(
1)
探究幾種用於自化合物(
1)清除25-硫酸鹽區域異構物之溶劑。在不純的化合物(
1)溶解在極性溶劑中及接著裝入反溶劑(anti-solvent)後，沒有固體回收(表列1和2，表3)。在材料溶解在甲醇中及接著添加乙腈後，形成很少量固體(表列3，表3)。使用2-丙醇(表列4，表3)及甲醇與水的混合物導致形式改變，其造成材料變成濃稠的糊狀物，使其無法轉移或過濾。在40至50℃下以乙醇濕磨不純的化合物(
1)足以清除大部分的25-硫酸鹽區域異構物(表列6，表3)。將化合物(
1)(1 g)與乙醇(10 mL)的混合物加熱至回流，冷卻及過濾。分離出的材料(55%回收率)具有99.6%純度，其中25-硫酸鹽及3β,25-二羥基膽甾-5-烯分別減少至0.1%及0.3%。
實施例13B. 3β-三乙胺鹽之純化
基於與三甲胺及三乙胺之反應性，純化3β-三乙胺鹽消除二氯甲烷。純化係使用包括90%之乙酸乙酯、9%之甲醇及1%之三乙胺的等度(isocratic)溶劑系統達成。
實施例13C.SO
3NMe
3當量之最適化
測定完全消耗3β,25-二羥基膽甾-5-烯或達到最少的雙硫酸鹽副產物及未反應之起始材料的點所需添加之SO
3NMe
3複合物的量。將含有三乙胺(0.5S)之吡啶(18.6S)中的3β,25-二羥基膽甾-5-烯(0.5 g，1.0S)之溶液加熱至50℃。每30 min自反應取出樣品，隨後添加SO
3NMe
3複合物。在裝入最後的SO
3NMe
3複合物後，容許小瓶在50℃下攪拌總共24 h(表4)。約1.75當量之SO
3NMe
3複合物足以消耗86.6%之起始材料3β,25-二羥基膽甾-5-烯(樣品7，表4)。在添加2.5當量之SO
3NMe
3複合物後，3β,25-二羥基膽甾-5-烯完全消耗。隨著反應進行，雙硫酸鹽的形成勝過3β,25-二羥基膽甾-5-烯之單硫酸化。在24 h後，3β-三乙胺鹽完全轉化成雙硫酸鹽。
實施例14. 3β-25-羥基膽甾-5-烯硫酸鹽(1，鈉鹽)之100克規模合成
將吡啶(15.6S)中的3β,25-二羥基膽甾-5-烯(100 g，1.0S)及三乙胺(0.5S)之漿液加熱至50℃。一次加入SO
3NMe
3複合物(1.75當量，0.6S)。將混合物攪動5小時及接著以HPLC分析反應完成(樣品1- 3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物(67.1%)；3β,25-二羥基膽甾-5-烯(12.2%)；雙硫酸鹽(20.8%))。將夾套設定至70℃及將反應濃縮至＜20%之初始體積。將樣品移出及以HPLC分析穩定性(樣品2- 3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物(60.5%)；3β,25-二羥基膽甾-5-烯(10.0%)；雙硫酸鹽(29.5%))。在蒸餾期間，單硫酸鹽的量自67.1%降低至60.5%，而雙硫酸氫鹽的量增加~9%。3β,25-二羥基膽甾-5-烯的量在蒸餾期間沒有降低太多。
在後攪拌48 h後，固體出現於反應器中，且添加甲醇(0.5S)不溶解固體。使粗製材料(300 g)經歷以90%之乙酸乙酯、9%之甲醇及1%之三乙胺溶析之矽膠層析法純化。將矽膠(2.4 kg)在溶析劑中漿液化及填充以形成5.25”×28”管柱。將粗製混合物轉移至管柱及進行三天純化。收集1 L餾份之溶析液。以TLC檢測出餾份1至7不含有材料；餾份8至11含有吡啶及3β,25-二羥基膽甾-5-烯；以TLC檢測出餾份12至20不含有材料；餾份21至22含有未確定之化合物，及餾份23至59含有3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物。
以重量百分比分析測定，在管柱後分離出約82 g之3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物(56.5%產率)。在層析法後，將含有3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物的混合物之溶析液濃縮成漿液及轉移至2公升反應器。將溶劑轉換成乙腈，將漿液冷卻至10℃及經10鐘裝入1 N氫氧化鈉(1.8S，1當量，以82 g之3β-三乙胺鹽/25-硫酸鹽區域異構物為基礎)。將漿液攪動1小時及接著過濾。非常快速過濾，要求＜5分鐘。將固體在40℃之真空下乾燥至恆重(70 g，99%產率，以陽離子交換)。將樣品以HPLC分析(樣品1，表5)，其表明有5.1%之25-硫酸鹽區域異構物存在。將白色粉末(70 g)轉移至2公升反應器及在50℃下以乙醇(700 g)形成漿液經1小時。在攪拌30分鐘後觀察漿液混合物增稠的形式變化。將漿液冷卻至10℃，攪拌1小時及接著在10℃下過濾。將反應器以乙醇(170 g)沖洗，冷卻至10℃及接著轉移至過濾器作為濾餅清洗劑。將固體乾燥至恆重(64.6 g，92.3%回收率)及以HPLC分析(樣品2，表5)。在濕磨後，化合物(
1)純度提高至97.4%，但是25-硫酸鹽區域異構物是1.6%。將不純的化合物(
1)(64.6 g，1.0S)在55℃下以乙醇(581 g，9S)形成漿液經1.5小時。將漿液冷卻至10℃及接著過濾。將反應器及濾餅在10℃下以乙醇(84 g)沖洗及將所得固體在40℃之真空下乾燥至恆重(60.4 g，有5.9%之乙醇存在，87.9%回收率)。
在以乙醇濕磨後，將化合物(
1)之樣品以HPLC分析(樣品3，表5)。清除25-硫酸鹽區域異構物，但是未知物1的量增加至0.9%。將經純化之材料(56.8 g)在30℃下於1公升反應器中以乙腈(5S)及水(0.9S)形成漿液經30分鐘。漿液在此期間形成強勁的峰，但是使用FMI泵容易地轉移糊狀物至過濾裝置。將反應器及濾餅以新鮮乙腈(30 g)沖洗及將材料乾燥至恆重(54.5 g，90.2%回收率)。以
1H NMR分析顯示沒有乙醇存在，但是有1.2重量%之水存在。最終材料的純度提高至＞99%(樣品4，表5)。在RRT 1.68和1.85之未知雜質的量分別為0.6%及0.2%。考慮到殘留的水，以100 g示範運行之化合物(
1)的最終分離產率是43.2%。
實施例15. 3β,25-二羥基膽甾-5-烯之水的共沸移除
將3β,25-二羥基膽甾-5-烯(5 g，1.0S)及吡啶(15.6S，0.016%之水，表列1，表6)之漿液加熱至50℃。取出反應樣品用於水含量分析(0.29%，表列2，表6)。將反應體積減少50%及取樣用於水含量分析(0.042%，表列3，表6)。將在餾出物中收集的吡啶量(39 g)在反應器中以新鮮吡啶置換及再取樣用於水含量分析(0.027%，表列4，表6)。一旦內部溫度到達50℃，則將三乙胺(0.5S)及SO
3NMe
3(0.6S)裝入反應器中。稀白色漿液在15分鐘內變澄清溶液及將反應在50℃下攪動。在2小時和3小時取出樣品用於IPC分析(表列1和2，表7)。在2 h後僅剩餘7.1%之3β,25-二羥基膽甾-5-烯。在添加SO
3NMe
3前之共沸移除水改進起始材料的消耗。
表6–水含量分析
表7–以HPLC分析之反應完成概況
實施例16. 粗製化合物(
1)之乙醇濕磨
| 樣品 | 評論 | % 水 |
| 1 | 吡啶溶劑 | 0.016 |
| 2 | 在蒸餾吡啶前的反應溶液 | 0.285 |
| 3 | 在蒸餾吡啶後的反應溶液 | 0.042 |
| 4 | 在添加吡啶後的反應溶液 | 0.027 |
| 樣品 | 25- 硫酸鹽 區域異構物 (%) | 3β- 三乙胺鹽 /25- 硫酸鹽區域異構物 (%) | 3β,25- 二羥基 膽甾 -5- 烯 (%) |
| 1 | 30.8 | 62.2 | 7.1 |
| 2 | 38.9 | 55.6 | 5.6 |
將粗製化合物(
1)懸浮於乙醇中、加熱至55℃及攪拌1小時。將漿液混合物冷卻、過濾及以乙醇清洗。將所得濾餅在50℃下乾燥隔夜。將濾餅裝回反應器中及懸浮於乙腈和水中。將混合物加熱至30℃及攪拌1小時。接著將混合物冷卻至15℃、過濾及以乙腈和水(90:10)清洗。將所得濾餅在50℃下不超過24小時乾燥，直到達成恆重。將經純化之化合物(
1)中的雜質含量以HPLC測定。(RRT 0.67 ＜0.05%；RRT 0.77 ＜0.05%；RRT 0.79 ＜0.05%；RRT 0.95 ＜0.05%；RRT 1.13 ＜0.05%；RRT 1.22 ＜0.05%；RRT 1.31 ＜0.05%；RRT 1.95 = 0.09%；RRT 2.09 ＜0.05%；RRT 2.67 ＜0.05%；RRT 2.75 = 0.05%；RRT 3.04 ＜0.05%；RRT 3.23 = 0.09%；RRT 3.64 = 0.3%；RRT 5.00 ＜0.05%；總雜質= 1.1%。
實施例17.硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽的副產物之鑑定
將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇之組成物在23℃下以甲苯中的三氧化硫-吡啶複合物硫酸化經1 h以生產25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽。在製備25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽產物時，將反應混合物中所形成之化合物以高效能液相層析法分析。表8和9提供HPLC層析法條件。表10列出當以三氧化硫吡啶複合物硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇時，所鑑定出之於反應混合物中所形成之化合物的滯留時間。
表8–層析法條件
表9–層析法條件–梯度
表10–滯留時間
實施例18. 測定三氧化硫吡啶硫酸化劑純度
| 管柱 | Aglient Zorbax Eclipse XDB-C8 ， 3.5 µm (4.6 × 150) mm |
| 流動相A | 具有0.2%之SDS的2.5 mM磷酸鈉，pH 2.1 |
| 流動相B | 10：85：5之MPA：ACN：MeOH |
| 檢測 | 雜質及計算的純度：205 nm；檢定：220 nm |
| 管柱溫度 | 45℃ |
| 注入體積 | 25.0 µL |
| 流速 | 1.0 mL/min |
| 採集時間 | 50.0分鐘(包括5.0 min.再平衡) |
| 時間 ( 分鐘 ) | %A | %B |
| 0.0 | 62 | 38 |
| 35 | 0 | 100 |
| 45 | 0 | 100 |
| 45.1 | 62 | 38 |
| 50.0 | 62 | 38 |
| 化合物 | 滯留時間 (min) |
| 吡啶 | 3.2 |
| 25-硫酸化之膽固醇 | 6.6 |
| 25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸鹽 | 7.7 |
| 未知的副產物#1 | 18.3 |
| 25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇 | 26.5 |
| 未知的副產物#2 | 37.7 |
質子核磁共振光譜法(
1H-NMR)係對氘代溶劑中的三氧化硫吡啶樣品進行。三氧化硫吡啶為無色固體，其可由於水分的存在而降解，這影響硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇的總產率及再現性。將來自三個批組(A至C)的三氧化硫吡啶樣品溶解在氘代丙酮((CD
3)
2CO)中及使用500 MHz Bruker光譜儀記錄質子NMR光譜。批組A之NMR光譜在9.25 ppm展現比其他批組之NMR光譜更小的峰組。基於在各光譜的9.25 ppm之積分峰，計算出批組A之硫酸化劑的雜質水平是21%，計算出批組B之硫酸化劑的雜質水平是33%，及計算出批組C之硫酸化劑的雜質水平是36%。
實施例19. 用於硫酸化25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇之製程參數
進行硫酸化反應研究，使雙硫酸化產物5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之形成減至最少及受到控制。
實施例19A. 以25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇粒子於反應混合物中進行硫酸化
在硫酸化反應期間，觀察到25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽在反應期間沉澱為似凝膠(gel-like)固體。一些此膠態材料可由於其粒徑而溶解在反應混合物中。為了使此溶解度效應最小化，測試添加25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之晶種至反應中以修飾產物晶體形狀。當反應以裝入三氧化硫-吡啶複合物進行時，在硫酸化反應期間所生產之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽的似凝膠固體轉變成具有較大粒徑的非晶形漿液。這容許控制所產生之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽在反應混合物中的溶解度。這亦導致在反應混合物中的雙硫酸化產物5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之形成減至最少。
將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-醇以2-甲基四氫呋喃(30V)溶解；及加熱至約35至40℃。將溶液冷卻至約20±5℃及添加25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽之晶種。將硫酸化劑三氧化硫-吡啶複合物分成四部分以彼此隔開2小時添加。將水(2當量)添加至漿液中及保持1小時。在此時點，將攪動減小至最小的渦旋深度。添加在2-甲基四氫呋喃中的吡啶(2當量)及將漿液保持12小時或更久。以過濾收集粗製25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物及將其以2-甲基四氫呋喃-吡啶(5%)清洗。經估計有約2至5%之雙硫酸化產物5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽存在於粗製產物中。
實施例19B. 淬滅未反應之三氧化硫-吡啶硫酸化劑
淬滅過量的未反應之三氧化硫吡啶硫酸化劑係使用兩當量水及吡啶以保持鹼性條件及避免25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物水解評估。在表11的項目1至3中，同時添加水及吡啶及保持1小時；接著將產物以真空過濾分離。在表11的項目4中，將保持時間延長以模擬時間擴展。為了控制試劑水解與雙硫酸化作用之間的競爭反應，以添加水及保持一小時來評估試劑水解。此方法使過量水解達到最大。接著添加吡啶使產物水解降至最低(項目5，表11)。如表11之總結，添加水經1小時，隨後與吡啶混合隔夜，得到最高產率的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物及最低量的雙硫酸化產物和鏈甾醇雜質。
在淬滅過量的未反應之硫酸化劑期間，確定攪動速度可在雙硫酸化產物5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽之形成與試劑淬滅之間的競爭中扮演一角色。在高攪動速度下，未淬滅之三氧化硫-吡啶複合物黏聚物破裂，容許與25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物進一步反應。在緩慢的攪動速度下，經黏聚之複合物續留於反應器底部，使此副反應降至最低。在該等反應條件下觀察到2至5%範圍的雙硫酸化產物5-膽甾-3β-25-二醇-二硫酸鹽形成。經分離之粗製25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物具有足以進一步純化的穩定性。
實施例19C. 25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物之液相層析法及再結晶
將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物使用填料管柱純化，該管柱係利用矽膠(≥質量當量)固定相及二氯甲烷-甲醇混合物(85：15)和吡啶(1%)流動相。層析管柱係以矽膠(5質量當量)/DCM-吡啶(1%)以1:2之直徑-矽膠比製備。小心地製備管柱以避免擾亂矽膠頂層。將粗製25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物溶解在二氯甲烷-甲醇(1:1)-吡啶(1%)(2.4V)中，將溶液裝入管柱中及以二氯甲烷-甲醇(15%)-吡啶(1%)(2V)沖洗。將管柱以二氯甲烷-甲醇(15%)-吡啶(1%)(~75V)溶析。取出約10V之樣品及以薄層層析法(移動相：7:3之二氯甲烷-甲醇、一滴吡啶及CAM染色劑)監測。將含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物之餾份合併及將含有雙硫酸化產物之餾份排除。
將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物以兩種不同的製程自收集的餾份分離及純化：
分離及再結晶製程(IP)-A。將具有來自填料管柱的產物之餾份在恆定的體積技術下濃縮。將25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物溶液添加至2-甲基四氫呋喃-庚烷(1:2)之初始恆定的體積(28V)混合物中，添加25-羥基-(3β)-膽固-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物粒種，同時同步蒸餾及添加。將壓力維持在介於20至25 in. Hg之間。在該等條件下立即沉澱出產物及其在蒸餾期間仍為漿液。將漿液溫度調節至20至25℃及保持最少1小時。以過濾收集產物及將其以2-甲基四氫呋喃-庚烷(1:2)沖洗，隨後以庚烷沖洗。將收集之材料在30至35℃之真空下經24小時乾燥。
分離製程(IP)-B。將具有來自填料管柱的產物之餾份在真空下濃縮至~7V。若溶液維持或變渾濁或觀察到固體，則添加二氯甲烷，直至獲得澄清溶液。將此濃縮之25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物溶液經約1小時至1.5小時逐滴添加至含有25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽晶種的2-甲基四氫呋喃-庚烷(1:3)混合物中。將產物在20至25℃下於容器中以二氯甲烷-甲醇(1:1)(0.5V)沖洗1小時。在漿液老化後，以過濾收集產物及將其以2-甲基四氫呋喃-庚烷(1:3)沖洗，隨後以庚烷沖洗。將固體在30至35℃之真空下經24小時乾燥。
各個分離及再結晶製程所獲得的25-羥基-(3β)-膽甾-5-烯-3-硫酸有機陽離子鹽產物純度總結於表12中。
實施例20. XRPD標定
標定及結構精修為演算研究。在圖4內，在容許的峰位置(以條形圖標記)與觀察到的峰之間的一致性表明一致的單位單胞測定。成功的圖案標定表明樣品主要由單晶相所組成，除非另有其他聲明。與指定之消光符號一致的空間群、單位晶胞參數及導出的量值製表於以下圖4及表2中。為了確認試驗性標定方案，必須確定結晶學單位晶胞內的分子堆疊模體(packing motif)。沒有嘗試執行分子堆疊。
實施例21. 微差掃瞄熱量法(DSC)
DSC係使用Mettler-Toledo DSC3+微差掃描熱量儀執行。τ滯後調整(tau lag adjustment)係以銦、錫和鋅執行。溫度及焓係以辛烷、水楊酸苯酯、銦、錫和鋅調整。接著以辛烷、水楊酸苯酯、銦、錫和鋅驗證該調整。將樣品放入密封式DSC鋁盤中及準確地記錄重量。接著將盤插入DSC槽中。將秤重後之作為樣品盤的鋁盤放置在槽的參考端上。在樣品分析前，將盤蓋刺穿。以30℃至350℃或30℃至250℃(兩者皆10℃/min)分析樣品。
實施例22. 質子NMR光譜法
除了在5.3 ppm之峰以外，
1H-NMR光譜係與圖6中所示之結構一致。沒有殘留溶劑的跡象。在約3.8 ppm之氯與亞甲基的重疊似乎為1 mol/mol之膽鹼。溶液NMR光譜係以Agilent DD2-400光譜儀擷取數據。樣品之製備係藉由將約2至10 mg之樣品溶解在含有TMS之DMSO-
d
6 中。數據擷取參數展示於以下表13中。
實施例23. 熱重分析(TGA)
TG分析係使用Mettler-Toledo TGA/DSC3分析儀執行。溫度及焓調整係使用銦、錫和鋅執行及接著以銦驗證。平衡係以草酸鈣驗證。將樣品放入開放式鋁盤中。將盤密封，將蓋刺穿，接著插入TG爐中。將秤重後之為樣品盤的鋁盤放置在槽的參考平台上。將爐在氮氣下加熱。各樣品以10℃/min自周圍溫度加熱至350℃。儘管溫度記錄圖係以參考溫度(x軸)繪製，但是結果係根據樣品溫度報告。
實施例24. 透射XRPD
XRPD圖案係以使用Cu輻射之入射束的PANalytical X'Pert PRO MPD或PANalytical Empyrean繞射儀收集，該入射束係使用Optix細長型聚焦源產生。使用橢圓漸變多層鏡聚焦通過試樣及到達檢測器上的Cu Kα X 射線。在分析前，先分析矽試樣(NIST SRM 640f)以驗證所觀察到的Si 111峰位置與經NIST-認證之位置一致。將樣品試樣夾在3微米厚的薄膜之間及進行透射幾何學分析。使用光束停止器(beam-stop)、短的抗散射延伸及抗散射刀口使空氣產生的背景值最小化。使用入射束及繞射光束之索勒縫隙(Soller slit)使來自軸向發散的寬化及不對稱性最小化。繞射圖案係使用位於試樣240 mm之掃描位置敏感性檢測器(X'Celerator)及Data Collector軟體v. 5.5收集。所有影像之儀器標記均為X'Pert PRO MPD，無關於所使用之儀器。
實施例25. 反射幾何學(以數量有限的樣品)
在可行的程度而言，XRPD圖案係以使用Cu K
α輻射之入射束的PANalytical X'Pert PRO MPD繞射儀收集，該入射束係使用細長型聚焦源及鎳濾光片產生。繞射儀係使用對稱的Bragg-Brentano幾何學配置。在分析前，先分析矽試樣(NIST SRM 640f)以驗證所觀察到的Si 111峰位置與經NIST-認證之位置一致。將樣品試樣製備成中心在矽零背景基板上的圓形薄層。使用抗散射狹縫(SS)使空氣產生的背景值最小化。使用入射束及繞射光束之索勒縫隙使來自軸向發散的寬化最小化。繞射圖案係使用位於樣品240 mm之掃描位置敏感性檢測器(X'Celerator)及Data Collector軟體v. 5.5收集。
實施例26. 動態蒸氣吸附(DVS)
動態蒸氣吸附數據係在表面測量系統DVS Intrinsic儀器上收集。樣品在分析前未經乾燥。吸附及解吸數據係在氮氣吹洗下以10%之RH增量在5%至95%之RH範圍內收集。分析之平衡準則為在5分鐘內有0.001 dm/dt之重量變化，在30分鐘之最小步進時間及180分鐘之最大平衡時間以及3分鐘數據記錄間隔之條件下。數據未對樣品之初始水分含量進行校正。
實施例27. 製備25HC3S三乙銨
將含有~145 g之「濕式」Dowex 50WX8的管柱(50至100網目，H+形式)以蒸餾水清洗，直到溶析液無色。將H
2O/甲醇(1/1)中的體積600 mL之1.5 M三乙銨鹽酸鹽以12.6 mL三乙胺(處理(目前pH ＞8.5)及接著通過管柱。接著將樹脂以甲醇沖洗，直到溶析液為中性(~ 200 mL)。
將41.2 g之25HC3S鈉溶解在820 mL之甲醇中，及在超音波處理後，將混濁溶液通過矽藻土過濾。接著將濾液通過上述管柱及收集~200 mL之餾份。以額外600 mL之MeOH達成完全溶析。在高真空下乾燥隔夜，得到39 g之25HC3S三乙銨的白色厚實固體(81%回收率)。以研缽/研杵均質化，得到白色細小粉末之標的物。
質子NMR分析(CDCl
3，d6-DMSO)表明定量轉化成三乙銨鹽。
實施例28. 製備晶形25HC3S膽鹼鹽
將70 mL乙腈中的實施例27之25HC3S三乙銨(4.0 g，6.9 mmol，1 eq.)的懸浮液以1 eq.氫氧化膽鹼(在H
2O中的6.9 mL之1 M溶液)處理及在室溫下攪拌2至3小時。收集固體及以乙腈沖洗，接著在高真空下乾燥以得到3.08 g之25HC3S膽鹼鹽的白色固體(76%)。
質子NMR分析(d6-DMSO)表明沒有殘餘的三乙胺。
實施例A. 25HC3S膽鹼鹽在室溫下的溶解度
1. 摘要
25HC3S膽鹼鹽在水性及有機溶劑中的溶解度係在室溫下一天後測定。水性溶劑為水、5%之右旋糖、0.9%之氯化鈉、模擬空腹狀態之腸液(FaSSIF)、模擬進食狀態之腸液(FeSSIF)和模擬空腹狀態之胃液(FaSSGF)。有機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈。
2. 引言及目的
此研究之目的為測定25HC3S膽鹼鹽在室溫下於4種有機溶劑及6種水性溶液中的溶解度。
3. 材料
材料包括下列。
3.1. 0.9%之氯化鈉：Hospira
3.2. 5%之右旋糖：Hospira
3.3. 水：DURECT USP純化水
3.4. 甲醇：EMD
3.5. 乙醇：Pharmco
3.6. 乙腈：Honeywell
3.7. 異丙醇：Honeywell
3.8. FaSSIF、FeSSIF、FaSSGF粉末：Biorelevant
3.9. FeSSIF緩衝液濃縮物：Biorelevant
3.10. FaSSIF緩衝液濃縮物：Biorelevant
3.11. FaSSGF緩衝液濃縮物：Biorelevant
3.12. 在此研究中所使用之25HC3S膽鹼鹽列於表A1中。
表A1 在溶解度研究中的25HC3S膽鹼鹽
4. 研究實驗程序
4.1 製備模擬之腸液及胃液
| 化合物 | 分子量 (g/mol) |
| 25HC3S膽鹼鹽 | 585.88 |
該等流體係按照Biorelevant(
Biorelevant.com)列出之用法說明製備。各緩衝液濃縮物係以水稀釋及充分混合。將FaSSIF、FeSSIF、FaSSGF粉末添加至各緩衝液中及混合以完全溶解粉末。緩衝液係儲存於室溫下及在製備48小時內使用。
4.2. 溶解度樣品製備
將25HC3S膽鹼鹽秤取至具有Teflon塗佈之螺旋蓋的8 mL或4 mL玻璃小瓶中。將各溶劑的等分試樣添加至各樣品中及渦旋混合約一分鐘，直到仍留下過量固體。將樣品在室溫下放置在每分鐘搖動210次的搖動器上。
在一天後，汲取樣品及檢查是否有過量固體存在。將各樣品的約1.5 mL之等分試樣以12000 rpm離心12至15分鐘。一些樣品需要2x離心。將於MeOH、EtOH、IPA和ACN中的各離心樣品之頂部澄清溶液的等分試樣以稀釋劑(95:5之水：MeOH)稀釋及以HPLC分析。將於水性介質中的25HC3S膽鹼鹽樣品以HPLC分析而無需稀釋。
注意：一些樣品在1天後沒有過量固體存在，藥物在該等樣品中的溶解度以≥濃度值之形式報告。
4.3 分析測試程序
25HC3S膽鹼鹽的所有溶解度樣品溶液皆使用HPLC測定。線性標準曲線係使用游離酸的濃度介於11 µg/mL至1.5 mg/mL之間的標準物強制曲線至原點而構建。溶解度係以mg/mL之游離酸25HC3S報告。HPLC方法之檢測極限(LOD)經計算為0.0007 mg/mL。
5. 結果及討論
表A1列出關於溶解度研究中所使用之25HC3S膽鹼鹽的相關訊息。計算溶解度及以25HC3S游離酸報告。所有的溶解度係在室溫下一天後測量。
表A3顯示25HC3S膽鹼鹽的溶解度結果。將水性介質中的樣品溶液之最終pH列於表A4中。
實施例B. 25HC3S膽鹼鹽的物理及化學固態穩定性
1. 摘要
25HC3S膽鹼鹽的穩定性係在2至8℃及80℃下3週及5週後測定。
2. 引言及目的
此研究之目的為測定25HC3S膽鹼鹽在2至8℃及80℃下的固態物理及化學穩定性。
3. 設備及材料
材料列於下文。
3.1. 分析天平，Mettler MT5
3.2. 超音波振動器，Branson 8510
3.3. 離心機，Eppendorf 5417C
3.4. 冷凍機(2至8℃儲存)
3.5. 培育箱(80℃儲存)
3.6. 培育箱(60℃儲存)
3.7. HPLC，Agilent 1100
3.8. 甲醇：EMD
3.9. 稀釋劑(95%之甲醇/5%之水)
3.10. 20 mL玻璃小瓶，具有氟聚合物樹脂/聚矽氧隔墊內襯之螺旋蓋
3.11. 在此研究中所使用之25HC3S膽鹼鹽列於表B1中。
表B1. 在穩定性研究中的25HC3S膽鹼鹽
研究實驗程序
4.1 用於穩定性設置及測試程序之穩定性樣品製備
| 化合物編號 / 名稱 | 分子量 (g/mol) |
| 25HC3S膽鹼鹽 | 585.88 |
將約25 mg之25HC3S膽鹼鹽添加至20 mL玻璃小瓶中及記錄各粉末重量。準備四個小瓶及根據表B2儲存在2至8℃或80℃下。最初計劃在3週及6週時間點取出樣品以用於測試。
表B2.用於25HC3S膽鹼鹽的穩定性樣品之分配
4.2 分析測試
4.2.1 外觀
| 溫度 | 小瓶數 |
| 80℃ | 2 |
| 2至8℃ | 2 |
關於外觀，以目視檢查各未開封之小瓶的顏色、凝塊及流動性。
4.2.2 檢定及降解產物之測定
標準溶液之製備
基於此研究中所使用之分子量及預期之UV反應因子，預期之分析樣品濃度係在25HC3S鈉參考標準物的範圍內(0.75 mg/mL至1.25 mg/mL之25HC3S鈉鹽)。
25HC3S膽鹼鹽(自由流動的粉末)之製備
樣品之製備係藉由將20 mL之100%甲醇移液至各小瓶中及以超音波處理和渦旋充分混合，以完全溶解用於HPLC分析的樣品。
4.3 HPLC分析
執行HPLC分析。
5. 結果及討論
表B1列出關於穩定性研究中所使用之25HC3S膽鹼鹽的相關訊息。表B4顯示25HC3S膽鹼鹽的穩定性結果及表B5呈現具有相關評論之25HC3S膽鹼鹽的穩定性。
表B5. 晶形25HC3S膽鹼鹽的物理及化學固態穩定性
實施例C. 測量25HC3S膽鹼鹽之粉末流動性質
背景
| 化合物 | 評論 |
| 25HC3S膽鹼鹽 | 在80℃下經5週後具有物理及化學穩定性 |
醫藥工業在劑型(尤其為錠劑及膠囊)製造期間重度地依賴於粉末的使用。在醫藥文獻中有許多嘗試使粉末流動的各種量度與製造性質互相關聯的參考。有各種表徵粉末流動之方法。另外，儘管很明顯沒有單一且簡單的試驗方法可適當地表徵醫藥粉末之流動性質，但是特定的試驗方法在醫藥開發期間可能很有價值。兩種經報導常用於測試粉末流動之方法為靜止角(angle of repose)及壓縮指數或豪斯納比(Hausner ratio)。
靜止角
靜止角係如下測量。將粉末自漏斗倒在平坦的表面上，直到形成粉末錐體。靜止角係根據以下公式計算：
靜止角=反正切(h/r)
其中：
H：錐體高度(mm)
r：錐體半徑(mm)
來自USP＜1174＞
Powder Flow之表C1說明與靜止角互相關聯的粉末流動性質。
表C1. 根據USP＜1174＞
Powder Flow之粉末流動性質及對應的靜止角
| 流動性質 | 靜止角 ( 度 ) |
| 極佳 | 25至30 |
| 良好 | 31至35 |
| 尚可-不需要援助 | 36至40 |
| 合格-可能受影響 | 41至45 |
| 差-必須攪動、振動 | 46至55 |
| 非常差 | 56至65 |
| 非常非常差 | ＞66 |
靜止角越低，材料越可流動。具有靜止角介於25°至30°之間的粉末顯示極佳的順暢流過給料斗、進料架、模檯及模孔。對於自41°至大於66°的靜止角，任何人可能經歷困難的粉末流動，如在給料斗內的卡料(rat-holing)或架橋。
產品架橋或「拱起(arching)」及卡料均為導致無流動狀態的問題。架橋為其中正在卸料或進料的材料在筒倉錐體(silo cone)/給料斗中的進料推動螺旋或卸料點上形成橋或拱形的情況。卡料為其中材料在給料斗中的進料推動螺旋或出口上方形成孔或狹窄通道的狀況，而剩餘材料靠在給料斗壁上靜止不動。該兩種狀況皆導致產品不依要求方式流動。
實驗
靜止角藉由將約2克之25HC3S膽鹼鹽通過7 mm內徑之塑膠管倒入21.14 mm直徑之O形橡膠環的中心，導致形成直徑固定的粉末錐體來測定。錐體的高度係以卡尺估計。
結果
表C2顯示25HC3S膽鹼鹽之靜止角測量值及根據USP＜1174＞
Powder Flow之其分類的總結。
表C2. 25HC3S膽鹼鹽之靜止角及根據USP＜1174＞
Powder Flow之流動性質分類
壓縮指數和豪斯納比
| 化合物編號 / 名稱 | 靜止角 ( 度 ) | 靜止角 ( 度 ) | 根據 USP＜1174＞ Powder Flow 之流動性質 |
| 四捨五入的整數 | |||
| 25HC3S膽鹼鹽 | 34.9 | 35 | 良好 |
壓縮指數和密切相關的豪斯納比為預測粉末流動特性之簡單、快速及普用的方法。已提出壓縮指數作為堆積密度、大小和形狀、表面積、水分含量及材料內聚性之間接量度，因為所有該等皆可影響觀察到的壓縮指數。壓縮指數和豪斯納比係藉由測量粉末的堆積體積及振實體積(tapped volume)來測定。
儘管在測定壓縮指數和豪斯納比之方法中有一些變數，但是基本程序係測量粉末的未沉降之視體積V
O及在輕敲材料直到沒有發生進一步的體積變化後測量最終振實體積V
f。壓縮指數和豪斯納比係如下計算：
壓縮指數=100×[(V
O- V
f)/V
O]
豪斯納比= (V
O/V
f)
豪斯納比和壓縮指數兩者係憑經驗建立。豪斯納比和壓縮指數不是材料的絕對性質；其值可取決測定方法而不同。
來自USP ＜1174＞
Powder Flow之表C3說明基於壓縮指數和豪斯納比值之粉末的流動特性。
表C3. 根據USP＜1174＞
Powder Flow之粉末流動性質及對應的壓縮指數和豪斯納比
實驗
| 壓縮指數 (%) | 流動特性 | 豪斯納比 |
| ≤10 | 極佳 | 1.00至1.11 |
| 11至15 | 良好 | 1.12至1.18 |
| 16至20 | 尚可 | 1.19至1.25 |
| 21至25 | 合格 | 1.26至1.34 |
| 26至31 | 差 | 1.35至1.45 |
| 32至37 | 非常差 | 1.46至1.59 |
| ＞38 | 非常非常差 | ＞1.60 |
將粉末小心地倒入5 mL玻璃量筒中(以容納粉末)，直到其接近或為5.0 mL。將此初始體積記錄為V
o。在量筒的堅硬的表面上輕敲200次及記錄體積。將量筒再輕敲100次及記錄最終體積V
f。通常在輕敲200次後的體積與輕敲300次後的體積相同或在0.1 mL以內。
結果
表C4顯示25HC3S膽鹼鹽之豪斯納比和壓縮指數測量值及根據USP＜1174＞
Powder Flow之彼等流動性質分類的總結。
表C4. 25HC3S膽鹼鹽之豪斯納比和壓縮指數及根據USP＜1174＞
Powder Flow之流動性質分類
| 化合物 | 豪斯納比 | 壓縮指數 | 根據 USP＜1174＞ 之 流動性等級 |
| ( 流動特性 ) | |||
| 25HC3S膽鹼鹽 | 1.72 | 42 | 非常非常差 |
[圖1]為晶形25HC3S膽鹼鹽的x射線粉末繞射(XRPD)繞射圖。
[圖2]為晶形25HC3S膽鹼鹽之揀選峰的XRPD繞射圖。
[圖3]為晶形25HC3S膽鹼鹽在動態蒸氣吸附(DVS)實驗前及後的XRPD繞射圖重疊。
[圖4]為晶形25HC3S膽鹼鹽之標定(indexing)結果。
[圖5]為晶形25HC3S膽鹼鹽之微差掃瞄熱量法(DSC)溫度記錄圖及熱重分析(TGA)溫度記錄圖。
[圖6]為呈溶液之25HC3S膽鹼鹽的
1H-NMR光譜。
[圖7]為晶形25HC3S膽鹼鹽之DVS等溫線。
[圖8]為晶形25HC3S鈉鹽之DVS等溫線。
Claims (118)
- 一種25HC3S膽鹼鹽。
- 一種晶形25HC3S膽鹼鹽。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約7.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項3之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約9.5°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項15之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約10.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項26之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約11.0°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項36之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約12.2°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項45之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約13.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項53之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約14.7°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項60之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項66之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約15.8°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項71之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項75之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項75之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有另外包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含下列在約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰中一或多者的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有實質上與圖1所示者相同的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項2至92之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有斜方單位晶胞。
- 如請求項2至93之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有長度約7.9Å、約9.5Å及約45.1Å之單位晶胞。
- 如請求項2至94之晶形25HC3S膽鹼鹽，其中在介於約5%至約95%的相對濕度之間該晶形膽鹼鹽攝取之水是少於0.5重量%。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ及約16.3°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 如請求項96之晶形25HC3S膽鹼鹽，其另外包含在約19.1°2θ之峰。
- 如請求項2之晶形25HC3S膽鹼鹽，其具有包含在約3.9°2θ、約7.8°2θ、約9.5°2θ、約10.1°2θ、約11.0°2θ、約12.2°2θ、約13.7°2θ、約14.7°2θ、約15.1°2θ、約15.8°2θ、約16.3°2θ及約19.1°2θ之峰的x射線粉末繞射圖案。
- 一種實質上純的晶形25HC3S膽鹼鹽。
- 如請求項2至98之實質上純的晶形膽鹼鹽。
- 一種製備25HC3S膽鹼鹽的鹽之方法，其包含製備25HC3S溶液及以膽鹼化合物處理該溶液的步驟。
- 如請求項101之方法，其中該溶液為有機溶液。
- 如請求項102之方法，其中該有機溶液包含乙腈。
- 如請求項101至103之方法，其中該膽鹼化合物為氫氧化膽鹼。
- 如請求項101至104之方法，其中該25HC3S溶液之製備係藉由將25HC3S之鹽溶解在醇溶劑中。
- 如請求項105之方法，其中該25HC3S之鹽為25HC3S之三乙銨鹽。
- 如請求項106之方法，其中該25HC3S之三乙銨鹽係以包含將25HC3S鈉溶解在適合的溶劑中、及以包含三乙銨鹽酸鹽之溶液處理、及分離25HC3S三乙銨鹽固體之方法製得。
- 如請求項107之方法，其中該適合的溶劑包含甲醇。
- 如請求項107至108之方法，其中該包含三乙銨鹽酸鹽之溶液另外包含三乙胺。
- 一種由如請求項101至109之方法製得的晶形25HC3S膽鹼鹽。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1至100及110中任一項之25HC3S膽鹼鹽及至少一種醫藥上可接受的賦形劑。
- 一種治療或預防非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、及與脂肪堆積和發炎有關的病症中一或多者之方法，其包含對需要的患者投予有效量的如請求項1至100及110至111中任一項之25HC3S膽鹼鹽化合物。
- 如請求項111之醫藥組成物，其經配置而用於經口投予。
- 如請求項112之方法，其中投予以供治療。
- 如請求項1至100、110、111或113中任一項之25HC3S膽鹼鹽，其係用作為藥劑。
- 如請求項1至100、110、111或113中任一項之25HC3S膽鹼鹽，其係用於如請求項112或114所定義之方法。
- 一種如請求項1至100、110、111或113中任一項之25HC3S膽鹼鹽之用途，其係用於製造用於如請求項112或114中任一項所定義之方法的藥劑。
- 如請求項2至100、110或115至116中任一項之晶形25HC3S膽鹼鹽。
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