TW202311527A - 從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途 - Google Patents

從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202311527A
TW202311527A TW111132151A TW111132151A TW202311527A TW 202311527 A TW202311527 A TW 202311527A TW 111132151 A TW111132151 A TW 111132151A TW 111132151 A TW111132151 A TW 111132151A TW 202311527 A TW202311527 A TW 202311527A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
stem cells
mesenchymal stem
hernia sac
tissue
hernia
Prior art date
Application number
TW111132151A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI836572B (zh
Inventor
林鼎淯
Original Assignee
約書亞健康事業股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 約書亞健康事業股份有限公司 filed Critical 約書亞健康事業股份有限公司
Publication of TW202311527A publication Critical patent/TW202311527A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI836572B publication Critical patent/TWI836572B/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本發明提供一種從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途。由本發明方法分離純化出的間質幹細胞產率高、具有高細胞分裂能力、無需使用酵素作為必要試劑，並具有應用於組織修復的再生醫學或組織工程的高潛力。

Description

從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途
本發明是有關於一種從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途。
迄今，間質幹細胞已經臨床測試證實是一種有價值幹細胞，其具備有免疫調節、幫助修復組織等功能，此外亦有專家公開指出具備上述若干功能之間質幹細胞，其細胞數量與功能發揮程度有關，細胞數量越多，功能發揮程度越高；細胞數量越少，則反之。間質幹細胞來源包括有胚胎幹細胞(embryonic stem cell)與成體幹細胞(adult stem cell)，其中成體幹細胞存在於包括有骨髓、臍帶、胎盤、血管壁及皮下脂肪(subcutaneous fat)等，熟習此技術者，皆以相似之培養技術進行擴增培養，可製成生物製劑產品，但先前技術中除取得成體幹細胞之步驟過於繁瑣影響品質無法一致性，亦無法有效篩選獲得大量之初代培養(P0)成體幹細胞。
由於間質幹細胞具備有免疫調節、幫助修復組織等優點，為達到上述已被證實的有效功能，所需的細胞數量將是關鍵因素之一，熟習此技術者通常需要將取得之幹細胞於體外培養數代，以期達到增加細胞數量之目的。目前坊間市售標榜以胎盤間質幹細胞為主的產品，實有購買者擔心該產品是使用含動物血清培養液及混雜整體胎盤組織生產出來的，因購買者擔心若該產品之成份與來源過於混雜，則易降低購買產品的意願。
由於現有細胞取得來源複雜，產品品質保證難以落實，包括必須能夠在長時間擴增培養下，依然產生跟原本細胞一模一樣，另外傳統的間質幹細胞分離純化方法常使用酵素(例如膠原蛋白酶(collagenase))作為必要試劑。然而，傳統的間質幹細胞分離純化方法使用膠原蛋白酶(collagenase)所得到的間質幹細胞往往具有產率低及間質幹細胞性質不良(例如細胞分裂能力不足)的缺點。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎的間質幹細胞之純化分離方法以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法，包含以下步驟：(a)取得一疝氣囊樣品，並將該疝氣囊樣品切成一組織切片；(b)清洗該組織切片並靜置一第一預定時間而形成一上清液及一經清洗的組織切片，接而移除該上清液；(c)於一第一培養基中對該經清洗的組織切片進行一均質處理，接而進行一再懸浮處理而形成一包含該間質幹細胞的混合物，然後對該包含該間質幹細胞的混合物進行過濾而得到一過濾物，接而將該過濾物接種至一培養瓶中進行培養一第二預定時間；以及(d)分離附著在該培養瓶上的該間質幹細胞，然後添加一第二培養基並進行連續培養一第三預定時間，藉此純化該間質幹細胞；其中步驟(b)無需使用酵素處理。
在本發明的一實施例中，該組織切片具有一為1~2 mm 3的體積。
在本發明的一實施例中，該第一預定時間為4~6分鐘。
在本發明的一實施例中，步驟(b)重複進行不超過兩次。
在本發明的一實施例中，該第一培養基及該第二培養基皆為
Figure 02_image001
-最低必需培養基(alpha-minimal essential medium)。
在本發明的一實施例中，該第一培養基或該第二培養基進一步添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及1%包含青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)的溶液。
在本發明的一實施例中，該第二預定時間為24~48小時。
在本發明的一實施例中，在步驟(d)中，附著在該培養瓶上的該間質幹細胞是藉由胰蛋白酶(trypsin)來分離。
在本發明的一實施例中，該第三預定時間為7~10天。
在本發明的一實施例中，該疝氣囊是來自於腹股溝。
本發明之另一目的為提供一種源自於疝氣囊的間質幹細胞用於製備一組織修復之醫藥品的用途，其中該源自於疝氣囊的間質幹細胞是藉由一如前所述的方法而被分離純化。
在本發明的一實施例中，該組織修復是肌肉組織修復。
綜上所述，本發明從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞的功效在於：間質幹細胞產率高、性質健康(具有高細胞分裂能力)、無需使用酵素作為必要試劑，並具有應用於組織修復(例如肌肉組織修復)，可施用於病患本身疝氣修補缺損結構的再生醫學或組織工程的高潛力。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在
Figure 02_image005
20%的範圍內，較佳為在
Figure 02_image005
10%的範圍內，最佳為在
Figure 02_image005
5%的範圍內。
除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
根據本發明所提供之醫藥品係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫藥品可以非經口服(例如：經皮)之投藥方式施用至有需要之個體上。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、病灶內注射(intralesional injection)、舌下投藥(sublingual administration)以及穿皮投藥(transdermal administration)。
依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，及其組合。
以適於穿皮投藥之劑型為例，根據本發明所提供之醫藥品可呈供直接外用之貼布、乳液、乳霜、凝膠(例如：水凝膠)、膏狀物(例如：分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如：懸浮液)等形式，但不以此為限。
根據本發明所提供之醫藥品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀而異。於根據本發明所提供之醫藥品中，可視實際應用需求，調整間質幹細胞於醫藥品中的含量比例。此外，該醫藥品可視需要另含一或多種其他活性成分(例如：組織修復藥物)，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該醫藥品之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分(即，源自於腹股溝疝氣囊的間質幹細胞)之效益沒有不利的影響即可。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。 實施例 1. 從腹股溝疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法
成人腹股溝疝氣(inguinal hernia)的手術(參見圖1A、B均代表手術中的疝氣囊)包括通過腹股溝切口進行開放式手術。從4個隨機選擇的腹股溝疝氣手術中獲得的新鮮疝氣囊(hernia sac)被採集並立即送往實驗室。表1摘述這4名患者的詳細訊息。在48小時內獲取間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)。首先從疝氣囊中分離腹膜組織(即為疝氣囊樣品)並藉由手術刀(scalpel)將大約2 g的腹股溝疝氣囊樣品切成小塊組織切片(具有一為1~2 mm 3的體積)。用10 mL磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)清洗組織切片並靜置大約4~6分鐘而形成上清液及經清洗的組織切片，接而移除上清液。此步驟被重複進行不超過兩次。使用Miltenyi gentleMACS均質機(Miltenyi gentleMACS Dissociator)獲得其中的間質細胞，該均質機已用於將組織半自動分離成單一細胞懸浮液(single-cell suspension)或徹底均質物(thorough homogenate)。將分離的懸浮液透過40-
Figure 02_image007
m過濾器(BD Falcon)過濾，並在
Figure 02_image001
-最低必需培養基(alpha-minimal essential medium)(Thermofisher)(進一步添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone))中在37°C、5% CO 2及潮濕環境下培養。或者，在上述重複進行兩次的步驟之後，於2 mL的
Figure 02_image001
-最低必需培養基(進一步添加10%胎牛血清(FBS)及1%包含青黴素及鏈黴素的溶液)中對經清洗的組織切片進行一再懸浮處理而形成一包含間質幹細胞的混合物，接而將包含該間質幹細胞的混合物接種至一個25 cm 2培養瓶中進行培養24~48小時。之後，分離附著在培養瓶上的間質幹細胞，然後添加3 mL的培養基並進行連續培養7~10天，藉此純化出間質幹細胞。特別地，細胞似乎在3-4天後從組織切片中長出。當細胞在培養瓶長成大約60%匯聚(confluency)時，藉由胰蛋白酶(trypsin)來分離附著在培養瓶上的間質幹細胞，然後通過40-
Figure 02_image007
m過濾器。本實驗已獲得臺中童綜合醫療社團法人童綜合醫院人體試驗委員會(institutional review board of Tung's Taichung Metro Harbor Hospital)的審查及批准。所有患者及參與者在參與前都提供書面知情同意書(IRB #109060)。 表1
患者1 患者2 患者3 患者4
年齡 54 36 71 42
性別 男 男 男 男
身高 165 166 156 174
體重 70 77 56.2 87
吸菸 無 無 無 無
疝氣大小 32 × 14.5 × 2.5 cm 6 × 4 × 8 cm 2 × 3 × 5 cm 3 × 3 × 5 cm
病史 B型肝炎、高血壓 無 前列腺癌 肺動靜脈瘤(Lung arteriovenous aneurysm)、陰囊精索靜脈曲張(scrotal spermatic varicocele)
手術史 無 無 機器人輔助腹腔鏡根治性前列腺切除術(Robot-assisted laparoscopic radical prostatectomy) 栓塞術(Embolization)
上述為本發明從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法流程，又稱為直接培養法(direct culture)，無需使用酵素分離組織，以下簡稱A方法。而習知方法作為比較組：B方法及C方法，該二方法皆需要藉由酵素，以分離組織以得到單一細胞。B方法是一般論文使用的方式，其操作流程如下，首先從疝氣囊中分離腹膜組織(即為疝氣囊樣品)並藉由手術刀將大約2 g的腹股溝疝氣囊樣品切成小塊組織切片(具有一為2~4 mm 3的體積)。加入5 mL膠原蛋白酶(collagenase)(1 mg/mL)溶液並在37
Figure 02_image009
下培育2小時。用100
Figure 02_image007
m過濾器過濾去除組織切片。以200 xg離心10分鐘並去除上清液，然後對細胞沉澱物添加5 mL的
Figure 02_image001
-最低必需培養基(進一步添加10%胎牛血清(FBS)及1%包含青黴素及鏈黴素的溶液)並轉移到25 cm 2培養瓶中進行培養。本發明(A方法)與習知方法(B方法)的主要差異在於：A方法的組織切片無需使用酵素，例如：膠原蛋白酶處理；B方法的組織切片需要使用膠原蛋白酶處理。因為膠原蛋白酶的來源是細菌生產，所以除了純度問題之外，更可能有細菌內毒素的殘留。另外生產此酵素的菌株，一般都是病原菌。所以能夠盡量不要使用是最好。但是習知方法很少有可以不必用到的，本發明(A方法)的疝氣囊間質幹細胞來源之質與量都強，所以可以不使用膠原蛋白酶。本發明A方法使用均質機打碎成均質物即可獲得間質幹細胞，藉此取代習知酶分解的方法，表示源自於疝氣囊的間質幹細胞採用本發明(A方法)即可得到分化力強、高產量、高分裂能力的結果。
C方法的操作流程如下。首先從疝氣囊中分離腹膜組織(即為疝氣囊樣品)並藉由手術刀將大約2 g的腹股溝疝氣囊樣品切成小塊組織切片(具有一為2~4 mm 3的體積)。加入5 mL膠原蛋白酶(collagenase)(1 mg/mL)溶液並使用gentleMACS均質機20分鐘以得到單一細胞溶液。用40
Figure 02_image007
m過濾器過濾去除組織切片。以200 xg離心10分鐘並去除上清液，然後對細胞沉澱物添加5 mL的
Figure 02_image001
-最低必需培養基(進一步添加10%胎牛血清(FBS)及1%包含青黴素及鏈黴素的溶液)並轉移到25 cm 2培養瓶中進行培養。特別地，B方法及C方法的初始細胞培養瓶中不含組織切片，但含有大量血球細胞。本發明(A方法)與習知方法(C方法)的主要差異在於：A方法的組織切片無需使用酵素，例如：膠原蛋白酶處理；C方法的組織切片需要使用膠原蛋白酶處理。另外，B方法與C方法的主要差異在於：B方法無需使用均質機，C方法需要使用均質機。
圖2顯示三種不同方法培養疝氣間質幹細胞的累積細胞數，結果發現本發明方法(即A方法)可培養出最多的間質幹細胞數，其次是B方法及C方法。特別地，A方法所培養出的間質幹細胞數大約是B方法的1.46倍，C方法的1.73倍，表示使用本發明方法所培養出的間質幹細胞具有高細胞分裂能力，且間質幹細胞產率高。
本發明A方法所分離純化出的間質幹細胞可用於組織修復。該組織修復是手術中將取下原擬丟棄的疝氣囊，在同一手術中使用本發明方法(無膠原蛋白酶)可同時用於患者的組織修復，包括其疝氣修復手術，或是其他部位，包括但不限於攝護腺、膀胱、胃賁門、身體疤痕組織等。因為本案疝氣囊間質幹細胞無須經酵素處理，可以直接打回人體需修復的組織處；而習知有酵素(細菌生化產品)的方法(B方法或C方法)會有產品感染疑慮，較不適合直接打回人體。 實施例 2. 經培養的源自於疝氣囊 (hernia sac) 的細胞的塑膠附著特性及形態
根據國際細胞治療協會(International Society for Cellular Therapy)，使用以下定義多能間質幹細胞的最低標準來確定間質幹細胞的存在：(1)附著於塑膠培養皿；(2)特異性表面抗原(Ag)表現；以及(3)多能分化潛力。
本實施例首先評估從腹股溝疝氣手術後獲得的疝氣囊中取出的細胞形態及其附著塑膠培養皿的能力。將間質幹細胞置於塑膠培養皿中，以觀察其形態及使用組織培養瓶在標準培養條件下維持塑膠附著的能力。在這種情況下，造血細胞(hematopoietic cell)、成熟脂肪細胞等不會附著在塑膠培養皿上。
圖3顯示經培養的源自於疝氣囊的細胞的塑膠附著特性及形態。來自4名患者的所有細胞均呈現梭形形態(spindle-shaped morphology)並表現出對塑膠的附著(參見圖3)，部分表明存在間質幹細胞。 實施例 3. 測定用於間質幹細胞鑑定的可靠陽性標記
本實施例選擇的陽性標記是基於現有的文獻(M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller, et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 8 (4) (2006), pp. 315-317)及人類間質幹細胞的抗體可用性。CD105、CD73及CD90標記用於評估人類間質幹細胞表現
Figure 02_image011
95%，而CD45、CD34、CD11b、CD19及人類白血球抗原-DR (human leukocyte antigen-DR, HLA-DR)標記用於評估人類間質幹細胞缺乏表現(
Figure 02_image013
2%)。使用的所有陽性CD標記(CD105、CD73及CD90)在測試時的表現均
Figure 02_image011
95%。
本實施例測定細胞表面免疫表型譜(cell surface immunophenotypic profile)以及以下陽性CD 標記：CD73 (100%)、CD90 (100%)及CD105 (99.2%)。還評估以下陰性CD標記以進一步驗證間質幹細胞的存在：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR (參見圖4)。因此，測試的所有陰性CD標記(CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR)的表現
Figure 02_image013
2% (參見圖4)，因為CD105、CD73及CD90標記在人類間質幹細胞表現
Figure 02_image011
95%，CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR標記在人類間質幹細胞表現
Figure 02_image013
2%，強烈表明存在間質幹細胞。 實施例 4. 細胞的分化能力
當間質幹細胞生長到90%匯聚時，將培養基轉移到三種分化培養基中以測定三系(trilineage)能力。分化培養基分別是StemMACS Osteodiff培養基、StemMACS Chondrodiff培養基或StemMACS Adipodiff培養基(Miltenyi Biotec)，其中將培養基轉移到StemMACS Osteodiff培養基以進行Von Kossa染色以驗證成骨作用(osteogenesis)；將培養基轉移到StemMACS Chondrodiff培養基以進行艾爾遜藍(Alcian blue)染色以驗證成為軟骨原細胞(chondroblast)的能力；將培養基轉移到StemMACS Adipodiff培養基以進行油紅O (Oil Red O)染色以確定脂肪生成(adipogenesis)。3週後，細胞進行Von Kossa染色以驗證成骨作用，艾爾遜藍染色以驗證成為軟骨原細胞的能力，以及油紅O染色以確定脂肪生成。
透過體外細胞培養物染色確定前驅細胞在體外分化為成骨細胞(osteoblast)、脂肪細胞(adipocyte)及軟骨原細胞。Von Kossa染色證實分化為成骨細胞，油紅O染色證實分化為脂肪細胞，艾爾遜藍染色證實分化為軟骨原細胞。圖5顯示Von Kossa、艾爾遜藍及油紅O染色後間質幹細胞的陽性分化能力及鑑定。未誘導的細胞沒有顯示出分化跡象。 實施例 5. 源自於疝氣囊的細胞相較於源自於皮下脂肪組織的細胞具有較多間質幹細胞
因為B方法是一般論文使用的方式，且可以定量比較不同組織經處理後的細胞數目，由於疝氣囊組織較富含有血管，取得的基質血管組分(stromal vascular fraction, SVF)細胞，相較於皮下脂肪組織相同處理的SVF細胞，具有顯著較多的細胞群落單位(colony forming unit, CFU)(參見圖6)，此CFU就是相當於間質幹細胞的細胞群落。因此，本實施例的結果可以看出，相較於脂肪組織，以相同方法從疝氣囊組織中可以獲得較多且健康(具有較多的細胞分裂次數)的間質幹細胞。 實施例 6. 源自於疝氣囊的間質幹細胞相較於源自於皮下脂肪組織的間質幹細胞具有較多的細胞分裂次數
圖7顯示源自於疝氣囊的間質幹細胞相較於源自於皮下脂肪組織的間質幹細胞具有較多的細胞分裂次數，累計細胞數更多。因此，依據本發明方法所純化分離出的源自於疝氣囊的間質幹細胞具有高細胞分裂能力。
綜上所述，本發明從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞確實具有以下功效：間質幹細胞產率高、性質健康(具有高細胞分裂能力)、無需使用酵素作為必要試劑，並具有應用於組織修復(例如肌肉組織的修復)，因為諸多文獻已知間質幹細胞有助於肌肉修復，可施用於病患本身疝氣修補缺損結構的再生醫學或組織工程的高潛力。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1顯示疝氣囊(hernia sac)於腹股溝疝氣(inguinal hernia)手術中。 圖2顯示三種不同方法培養疝氣(hernia)間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)的累積細胞數。 圖3顯示經培養的源自於疝氣囊的細胞的塑膠培養皿附著特性及形態。 圖4顯示用於識別疝氣囊中是否存在間質幹細胞的陽性及陰性標記，其中MSC表示間質幹細胞，SAC表示疝氣囊(hernia sac)。 圖5顯示Von Kossa、艾爾遜藍(Alcian blue)及油紅O (Oil Red O)染色後間質幹細胞的陽性分化能力及鑑定。 圖6顯示源自於疝氣囊的細胞相較於源自於皮下脂肪組織的細胞具有較多間質幹細胞，其中CFU表示細胞群落單位(colony forming unit)，*表示p
Figure 02_image003
0.05。 圖7顯示源自於疝氣囊的間質幹細胞相較於源自於皮下脂肪組織的間質幹細胞具有較多的細胞分裂次數，累計細胞數更多。

Claims (12)

  1. 一種從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法，包含以下步驟： (a) 取得一疝氣囊樣品，並將該疝氣囊樣品切成一組織切片； (b) 清洗該組織切片並靜置一第一預定時間而形成一上清液及一經清洗的組織切片，接而移除該上清液； (c) 於一第一培養基中對該經清洗的組織切片進行一均質處理，接而進行一再懸浮處理而形成一包含該間質幹細胞的混合物，然後對該包含該間質幹細胞的混合物進行過濾而得到一過濾物，接而將該過濾物接種至一培養瓶中進行培養一第二預定時間；以及 (d) 分離附著在該培養瓶上的該間質幹細胞，然後添加一第二培養基並進行連續培養一第三預定時間，藉此純化該間質幹細胞； 其中，步驟(b)無需使用酵素處理。
  2. 如請求項1所述的方法，其中該組織切片具有一為1~2 mm 3的體積。
  3. 如請求項1所述的方法，其中該第一預定時間為4~6分鐘。
  4. 如請求項1所述的方法，其中步驟(b)重複進行不超過兩次。
  5. 如請求項1所述的方法，其中該第一培養基及該第二培養基皆為
    Figure 03_image001
    -最低必需培養基(alpha-minimal essential medium)。
  6. 如請求項5所述的方法，其中該第一培養基或該第二培養基進一步添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及1%包含青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)的溶液。
  7. 如請求項1所述的方法，其中該第二預定時間為24~48小時。
  8. 如請求項1所述的方法，其中在步驟(d)中，附著在該培養瓶上的該間質幹細胞是藉由胰蛋白酶(trypsin)來分離。
  9. 如請求項1所述的方法，其中該第三預定時間為7~10天。
  10. 如請求項1所述的方法，其中該疝氣囊是來自於腹股溝。
  11. 一種源自於疝氣囊的間質幹細胞用於製備一組織修復之醫藥品的用途，其中該源自於疝氣囊的間質幹細胞是藉由一如請求項1至10中任一項所述的方法而被分離純化。
  12. 如請求項11所述的用途，其中該組織修復是肌肉組織修復。
TW111132151A 2021-08-31 2022-08-25 從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途 TWI836572B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163238800P 2021-08-31 2021-08-31
US63/238,800 2021-08-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202311527A true TW202311527A (zh) 2023-03-16
TWI836572B TWI836572B (zh) 2024-03-21

Family

ID=85386012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111132151A TWI836572B (zh) 2021-08-31 2022-08-25 從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230075134A1 (zh)
JP (1) JP7441447B2 (zh)
TW (1) TWI836572B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US9631176B2 (en) * 2003-11-04 2017-04-25 Biomaster, Inc. Method for preparing stem cells from fat tissue
DK2194121T3 (en) * 2007-09-11 2016-12-12 Univ Sapporo Medical CELL GROWTH PROCESS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR tissue repair and regeneration
AU2018316603B2 (en) * 2017-08-15 2024-06-13 Children's Medical Center Corporation Purified mesenchymal stem cell exosomes and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP7441447B2 (ja) 2024-03-01
TWI836572B (zh) 2024-03-21
US20230075134A1 (en) 2023-03-09
JP2023035950A (ja) 2023-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002229533B2 (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
US9770470B2 (en) Closed system separation of adherent bone marrow stem cells for regenerative medicine applications
AU2002229533A1 (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
CN106754674A (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
US9211306B2 (en) Cellular therapeutic agent for incontinence or urine comprising stem cells originated from decidua or adipose
CN105267243B (zh) 一种消除皮肤妊娠纹的干细胞提取物
JP5388297B2 (ja) アディポクラスター
EP1807509A1 (en) Multipotent stem cells isolated from umbilical cord blood and the cellular therapeutic agent comprisin the same for treating ischemic disease
WO2017012226A1 (zh) 间质干细胞、其克隆源性扩增的方法、其分离方法及其应用
KR101834800B1 (ko) 심장 조직-유래 세포
TWI836572B (zh) 從疝氣囊分離純化間質幹細胞的方法及源自於疝氣囊的間質幹細胞用於組織修復的用途
WO2022218443A1 (zh) 间充质干细胞来源的外泌体治疗脑卒中的方法和组合物
JP5960777B2 (ja) 関節疾患を治療するための組成物及び方法
KR101423659B1 (ko) 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금 치료제
CN110885785B (zh) 一种分离培养间充质干细胞的方法
CN106701673A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的专用培养基