TW202305126A

TW202305126A - 針對假單胞菌屬之包含crispr-cas系統的噬菌體組合物及其使用方法

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Publication number: TW202305126A
Application number: TW111116736A
Authority: TW
Inventors: 大衛Ｇ奧斯特勞; 保羅Ｍ葛羅佛羅; 克特賽爾; 漢娜惠特杜森; 拉娜麥克米蘭; 羅伯特麥基; 泰勒彭克; 肖恩斯蒂爾; 克里斯多夫拉德納; 哈利斯加布里埃爾奧
Original assignee: 美商羅卡斯生物科學公司; 美商詹森藥物公司
Priority date: 2021-05-05
Filing date: 2022-05-03
Publication date: 2023-02-01
Also published as: CN117729853A

Abstract

本文揭示靶向假單胞菌屬( Pseudomonas)物種之包含CRISPR-Cas系統之噬菌體組合物及其使用方法。

Description

針對假單胞菌屬之包含CRISPR-CAS系統的噬菌體組合物及其使用方法

在某些實施例中，本文揭示包含CRISPR-Cas系統之噬菌體組合物及其使用方法。

在某些態樣中，本文揭示一種噬菌體，該噬菌體與普納病毒(Pbunavirus)具有至少80%序列一致性，其中普納病毒選自PB1、p1106、p1587、p1835、p2037、p2363及p2421，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在某些態樣中，本文揭示一種噬菌體，該噬菌體與沙穆納病毒(Samunavirus)具有至少80%序列一致性，其中沙穆納病毒選自p1772、p2131、p2132及p2973，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在某些態樣中，本文揭示一種噬菌體，該噬菌體與匹克茲病毒(Phikzvirus)具有至少80%序列一致性，其中匹克茲病毒選自p1194及p4430，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在某些態樣中，本文揭示一種噬菌體，該噬菌體與布魯伊諾格病毒(Bruynoghevirus)具有至少80%序列一致性，其中布魯伊諾格病毒選自p1695及p3278，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在某些態樣中，本文揭示一種噬菌體，該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽；其中該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。

在一些實施例中，噬菌體與PB1 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與PB1e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1106 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1106e003具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1587 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1587e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1835 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1835e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2037 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2037e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2363 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2363e003具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2421 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2421e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1772 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1772e005具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2131 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2131e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2132 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2132e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2973 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2973e002具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1194 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p4430 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p1695 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p2167 WT具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體與p3278 WT具有至少80%序列一致性。在某些態樣中，本文揭示與PB1e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p1106e003具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p1587e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p1835e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2037e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2363e003具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2421e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p1772e005具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2131e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2132e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示與p2973e002具有至少95%序列一致性之噬菌體。

在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少三種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少四種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少五種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p1695wt、p4430wt、p2973e002、PB1e002、p2132e002、p2421e002、p1587e002、p2363e003、p2037e002、p1194wt、p2167wt、p3278wt、p2363wt、p2421wt、p1772wt、p2131wt、p2132wt、p2973wt、p1106wt、p1587wt、p1835wt、p2037wt及PB1wt。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：p1106e003、p1695wt、p1772e005、p1106wt、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2131e002、p1695wt、p2131e002、p2131wt及p4430wt。在某些態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含p1106e003、p1772e005、p1835e002、p2131e002、p1695wt及p4430wt。

在某些態樣中，本文揭示噬菌體在製造供治療假單胞菌感染用之藥劑中的用途，該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。在一些實施例中，本文揭示本文所述之噬菌體或本文所述之醫藥組合物在製造供治療假單胞菌感染用之藥劑中的用途。在一些實施例中，感染為囊腫性纖維化或非囊腫性纖維化支氣管擴張症。在一些實施例中，假單胞菌為耐藥性假單胞菌。

序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2021年10月27日，名為53240-743_601_SL.txt，且大小為71,774個位元組。

在某些實施例中，本文揭示包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含：(a) CRISPR陣列(亦稱為「crArray」)；(b) Cascade多肽；及(c) Cas3多肽。在某些實施例中，本文亦揭示包含本文所揭示之噬菌體的醫藥組合物。在某些實施例中，本文進一步揭示殺滅假單胞菌屬物種之方法，該方法包含向假單胞菌屬物種中引入包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含：(a) CRISPR陣列；(b) Cascade多肽；及(c) Cas3多肽。在某些實施例中，本文進一步揭示治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向個體投與編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含：(a) CRISPR陣列；(b) Cascade多肽；及(c) Cas3多肽。 特定術語

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。本揭示的說明書中使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，且並不意欲限制本揭露。

除非上下文另外指示，否則尤其意欲本文所述之本揭示的各種特徵能夠以任何組合使用。此外，本揭示亦涵蓋在一些實施例中，排除或省略本文所闡述之任何特徵或特徵之組合。為了說明，若本說明書陳述組合物包含組分A、B及C，則尤其意欲單獨或以任何組合形式省略及否認A、B或C中任一者或其組合。

熟習此項技術者應理解因在文獻及此項技術中之持續工作中缺乏統一此等術語之一致性所致術語之互換性表示各種CRISPR-Cas系統及其組分。

除非上下文另外明確指示，否則如在實施方式及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」意欲亦包括複數形式。亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋相關聯之所列項目中之一或多者的任何及所有可能組合，以及在替代方案(「或」)中解釋時組合之缺乏。

如本文所用，當提及諸如劑量或時段及其類似者之可量測值時，術語「約」係指指定量之±20%、±10%、±5%、±1%、+0.5%或甚至±0.1%的差異。如本文所用，諸如「X與Y之間」及「約X與Y之間」之片語應解釋為包括X及Y。如本文所用，諸如「約X與Y之間」之片語意謂「約X與約Y之間」，且諸如「約X至Y」之片語意謂「約X至約Y」。

如本文所用，術語「包含(comprise/comprises/comprising)」、「包括(includes/including)」、「具有(have/having)」指定規定的特徵、步驟、操作、元素及/或組分之存在，但不排除一或多個其他特徵、步驟、操作、元素、組分及/或其群組之存在或添加。

如本文所用，過渡片語「基本上由......組成」意謂請求項之範疇解釋為涵蓋請求項中所列舉的指定材料或步驟及不顯著影響所主張之揭示內容的基本及新穎特徵之彼等材料或步驟。因此，當用於本發明之請求項時，術語「基本上由......組成」並不意欲解釋為等效於「包含」。

如本文所用，術語「由......組成(consists of/consisting of)」不包括未另外直接規定的任何特徵、步驟、操作、元素及/或組分。「由......組成」之使用僅限制彼條項中所闡述之特徵、步驟、操作、要素及/或組分，且確實不包括來自整體技術方案之其他特徵、步驟、操作、要素及/或組分。

如本文所用，術語「互補的(complementary)」或「互補(complementarity)」係指在允許的鹽及溫度條件下多核苷酸藉由鹼基配對天然結合。舉例而言，序列「A-G-T」結合至互補序列「T-C-A」。兩個單股分子之間的互補為「部分的」，其中僅一些核苷酸結合或當總互補存在於單股分子之間時其為完全的。核酸股之間的互補程度對核酸股之間的雜交之效率及強度具有顯著影響。

如本文所用，「補體(complement)」意謂與比較物核苷酸序列100%互補或一致或其意謂低於100%互補(例如約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及其類似百分比互補)。補體或可補充的亦可按照突變之「補體」或「補充(complementing)」突變來使用。

如本文所用，術語「CRISPR噬菌體」、「CRISPR增強之噬菌體」及「crPhage」係指包含噬菌體DNA之噬菌體粒子，該噬菌體DNA包含編碼CRISPR-Cas系統之至少一種組分的至少一種異源多核苷酸(例如，CRISPR陣列、crRNA；例如，包含靶向crRNA之插入的P1噬菌體)。在一些實施例中，多核苷酸編碼CRISPR-Cas系統之至少一種轉錄活化因子。在一些實施例中，多核苷酸編碼CRISPR-Cas系統之抗CRISPR多肽之至少一種組分。

如本文所用，在兩個核酸分子、核苷酸序列或蛋白序列之情形下，片語「基本上一致(substantially identical)」或「基本一致(substantial identity)」係指當比較及比對最大對應關係時，如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目視檢查所量測，具有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及/或100%核苷酸或胺基酸殘基一致性的兩個或更多個序列或子序列。在一些實施例中，基本一致係指具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、96%、97%、98%或99%一致性之兩個或更多個序列或子序列。序列比較時，典型地，一個序列充當待與測試序列比較之參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。隨後，序列比較演算法基於指定程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。

藉由諸如Smith及Waterman之局部同源性演算法、Needleman及Wunsch之同源性比對演算法、Pearson及Lipman之搜尋相似性方法之工具且視情況藉由此等演算法之電腦化實施方式(諸如可以GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA)之部分形式獲得的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)來執行用於比對比較窗之序列的最佳比對。測試序列及參考序列之比對片段的「一致性分率」為兩個比對序列所共有之一致組分的數目除以參考序列片段(亦即全部參考序列或參考序列之較小規定部分)中之組分的總數目。序列一致性百分比表示為一致性分率乘以100。一或多個多核苷酸序列之比較係與全長多核苷酸序列或其一部分或與更長多核苷酸序列比較。在一些情況下，「一致性百分比」係使用用於經轉譯核苷酸序列之BLASTX 2.0版及用於多核苷酸序列之BLASTN 2.0版確定。

如本文所用，「目標核苷酸序列」係指與CRISPR陣列中之間隔序列完全互補或基本上互補(例如至少70%互補(例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多))的目標基因部分(亦即基因體中之目標區域或「前間隔子序列」，其與前間隔子相鄰模體(PAM)序列相鄰)。

如本文所用，術語「前間隔子相鄰模體」或「PAM」係指存在於與匹配間隔序列之核苷酸序列相鄰之目標DNA分子上的DNA序列。此模體發現於緊靠間隔序列所結合之區(由於間隔序列與該區互補)的目標基因中，且鑑別鹼基與間隔核苷酸序列配對開始之時間點。所需之確切PAM序列因各不同CRISPR-Cas系統而異。PAM之非限制性實例包括CCA、CCT、CCG、TTC、AAG、AGG、ATG、GAG及/或CC。在一些情況下，在I型系統中，PAM定位成緊鄰匹配間隔子之序列的5'，且因此在鹼基與間隔核苷酸序列配對之序列的3'，且由Cascade直接識別。在一些情況下，對於嗜鹼芽孢桿菌( B. halodurans) I-C型系統，PAM為YYC，其中Y可為T或C。在一些情況下，對於綠膿桿菌I-C型系統，PAM為TTC。一旦識別出同源前間隔子及PAM，便募集Cas3，其接著溶解且降解目標DNA。對於II型系統，PAM需要Cas9/sgRNA以形成R環，以經由其導引RNA與基因體之沃森-克里克配對查詢特異性DNA序列。PAM特異性為Cas9蛋白(例如Cas9之C末端的前間隔子相鄰模體識別域)之DNA結合特異性之功能。

如本文所用，術語「基因」係指能夠用以產生mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、抗微RNA、調節RNA及類似者之核酸分子。基因可能夠或可不能用以產生功能蛋白或基因產物。基因包括編碼區及非編碼區(例如內含子、調節元件、啟動子、增強子、終止序列及/或5'及3'非轉譯區)。基因「經分離」意謂大體上或基本上不含通常發現與呈其天然狀態之核酸相關的組分之核酸此等組分包括其他細胞材料、來自重組產物之培養基及/或用於以化學方式合成核酸之各種化學品。

術語「治療(treat/treating/treatment)」意謂減輕個體之病狀的嚴重度或至少部分改善或改進，且達成至少一種臨床症狀之一些緩解、緩和或減弱，及/或延緩疾病或病狀之進展，及/或延緩疾病或病痛之發作。關於感染、疾病或病狀，該等術語係指減弱感染、疾病或病狀之症狀或其他臨床表現。在一些實施例中，治療使得感染、疾病或病狀之症狀或其他臨床表現減少至少約5%，例如約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更高。

術語「預防(prevent/preventing/prevention)」(及其文法變化形式)係指預防及/或延緩個體中感染、疾病、病狀及/或臨床症狀之發作及/或相對於在疾病、病症及/或臨床症狀發作之前不進行本文所揭示的方法將出現的減輕感染、疾病、病狀及/或臨床症狀之發作嚴重度。因此，在一些實施例中，為預防感染將食物、表面、醫藥工具及裝置用本文所揭示之組合物藉由本文所揭示之方法處理。

本文所用之關於「感染」、「疾病」或「病狀」之術語係指由個體中存在目標細菌所致之個體之任何不良、負面或有害生理狀況。該等術語可互換使用。

如本文所用之術語「個體(individual)」或「個體(subject)」包括患有或易患涉及細菌之感染、疾病或病狀的任何動物。因此，在一些實施例中，個體為哺乳動物、禽類、爬行動物、兩棲動物、魚類、甲殼動物或軟體動物。哺乳動物個體包括但不限於人類、非人類靈長類動物(例如大猩猩、猴子、狒狒及黑猩猩等)、犬、貓、山羊、馬、豬、牛、綿羊及其類似者，以及實驗室動物(例如大鼠、天竺鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠及其類似者)。禽類個體包括但不限於雞、鴨、火雞、鵝、鵪鶉、雉雞及飼養作為寵物之鳥類(例如長尾鸚鵡、鸚鵡、金剛鸚鵡、鳳頭鸚鵡、金絲雀及其類似者)。魚類個體包括但不限於水產養殖中所用之物種(例如鮪魚、鮭魚、吳郭魚、鯰魚、鯉魚、鱒魚、鱈魚、海鱸、河鱸、笛鯛及其類似者)。甲殼動物個體包括但不限於水產養殖中所用之物種(例如蝦、對蝦、龍蝦、小龍蝦、蟹及其類似者)。軟體動物個體包括但不限於水產養殖中所用之物種(例如鮑魚、貽貝、牡蠣、蛤蜊、扇貝及其類似者)。在一些實施例中，適合之個體包括男性及女性以及任何年齡之個體，包括胚胎(例如在子宮內或卵內)、嬰兒、幼年、青年、成年及老年個體。在一些實施例中，個體為人類。

如本文所用，術語「經分離」在核酸序列之上下文中為在除其天然環境以外存在的核酸序列。

如本文所用，「表現卡匣」意謂包含所關注之核苷酸序列的重組核酸分子(例如本文所揭示之重組核酸分子及CRISPR陣列)，其中將核苷酸序列與至少對照序列(例如啟動子)以可操作方式締合。

如本文所用，「嵌合」係指其中至少兩個組分衍生自不同來源(例如不同生物體、不同編碼區)之核酸分子或多肽。

如本文所用，「可選標記」意謂當表現時賦予表現標記物之宿主細胞不同表型且因此使得此等經轉型細胞與不具有標記物之彼等細胞區分開的核苷酸序列。

如本文所用，「載體」係指用於將核酸(或多個核酸)轉移、遞送或引入至細胞中之組合物。

如本文所用，「醫藥學上可接受」意謂非生物學或以其他方式非所需的材料，亦即向個體投與材料而不引起任何非所需生物效應，諸如毒性。

如本文所用，術語「生物膜」意謂包埋於多醣之基質中的微生物之積聚。生物膜在實體生物或非生物表面上形成且在醫學上至關重要，占體內微生物感染之超過80%。

如本文所用，術語「活體內」用於描述發生於個體體內的事件。

如本文所用，術語「活體外」用以描述在用於容納實驗室試劑以使實驗室試劑與獲得材料之生物來源分離的容器中發生的事件。活體外分析可涵蓋基於細胞之分析，其中採用活細胞或死細胞。活體外分析亦涵蓋無細胞分析，其中不採用完整細胞。 CRISPR/CAS 系統

CRISPR-Cas系統為發現於細菌及古菌中之天然應變性免疫系統。CRISPR系統為涉及對抗入侵噬菌體及質體之防禦的核酸酶系統，其提供獲得性免疫性之形成。根據 cas基因體及其譜系學關係存在CRISPR-Cas系統之相異性。存在至少六種不同類型(I至VI)，其中I型代表細菌及古菌兩者中之所有經鑑別系統之超過50%。在一些實施例中，本文使用I型、II型、II型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系統。

I型系統分成七種亞型，包括：I-A型、I-B型、I-C型、I-D型、I-E型、I-F型及I-U型。I型CRISPR-Cas系統包括稱為Cascade之多亞單元複合物(用於與抗病毒防禦相關之複合物)、Cas3 (具有核酸酶、解螺旋酶及負責降解目標DNA之外切核酸酶活性的蛋白質)及編碼crRNA之CRISPR陣列(使Cascade複合物穩定且將Cascade及Cas3引導至DNA靶標)。Cascade與crRNA形成複合物，且蛋白-RNA對藉由crRNA序列之5'端與預定義前間隔子之間的互補鹼基配對識別其基因體目標。此複合物經由在crRNA內編碼之區及在病原體基因體內之前間隔子相鄰模體(PAM)導引至病原體DNA的同源基因座。鹼基配對出現在crRNA與目標DNA序列之間引起構形變化。在I-E型系統中，PAM係藉由Cascade內之CasA蛋白識別，該CasA蛋白隨後解旋側接DNA以評估目標與crRNA之間隔子部分之間的鹼基配對程度。充分識別使得Cascade募集且活化Cas3。Cas3隨後切割非目標股且開始沿3'至5'方向降解該股。

在I-C型系統中，蛋白質Cas5、Cas8c及Cas7形成Cascade效應複合物。Cas5加工前crRNA (其可採取多間隔子陣列，或兩個重複序列之間的單個間隔子形式)以產生由剩餘重複序列及線性間隔子形成之髮夾結構構成的個別crRNA。效應複合物隨後結合至經加工crRNA且掃描DNA以鑑別PAM位點。在I-C型系統中，PAM由Cas8c蛋白質識別，接著用於解開DNA雙螺旋。若在PAM之3'的序列與結合至效應複合物之crRNA間隔子匹配，則複合物中發生構形變化且將Cas3募集至該位點。Cas3接著切割非目標股且開始降解DNA。在一些情況下，Cas5包括Cas5、Cas5c、Cas5d及與SEQ ID NO: 76至少90%一致之序列。在一些情況下，Cas7包括Cas7、Cas7c及與SEQ ID NO: 78至少90%一致之序列。在一些情況下，Cas8包括Cas8、Cas8c及與SEQ ID NO: 77至少90%一致之序列。

在一些實施例中，CRISPR-Cas系統對於假單胞菌屬物種為內源性的。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統對於假單胞菌屬物種為外源性的。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-A型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-B型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-C型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為衍生自綠膿桿菌之I-C型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-D型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-E型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-F型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I-U型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為II型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為III型CRISPR-Cas系統。

在一些實施例中，本文所揭示之CRISPR陣列的加工包括但不限於以下過程：1)編碼前crRNA之核酸的轉錄；2)藉由Cascade及/或Cascade之特定成員(諸如Cas6)識別前crRNA，及(3)藉由Cascade或Cascade之成員(諸如Cas6)將前crRNA加工為成熟crRNA。在一些實施例中，I型CRISPR系統之作用模式包括但不限於以下過程：4)成熟crRNA與Cascade複合；5)複合成熟crRNA/Cascade複合物之目標識別；及6)導致DNA降解的靶標處之核酸酶活性。

在一些實施例中，本文提供CRISPR-Cas系統組分及包含CRISPR-Cas系統組分之噬菌體。舉例而言，本文提供與SEQ ID NO: 83-87中之任一者具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 83具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 84具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 85具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 86具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 87具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 83具有至少約90%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 84具有至少約90%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 85具有至少約90%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 86具有至少約90%一致性。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 87具有至少約90%一致性。在此等實施例中之任一者中，核酸序列可包含與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者至少90%一致的序列。在非限制性實例中，核酸序列包含以下中之一或多者：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 20。

本文進一步提供CRISPR-Cas系統組分，其包含與SEQ ID NO: 24具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 24具有至少約90%一致性。在此等實施例中之任一者中，核酸序列可包含與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者至少90%一致的序列。在非限制性實例中，核酸序列包含以下中之一或多者：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 20。

本文提供與SEQ ID NO: 25具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的CRISPR-Cas系統組分。在一些情況下，核酸序列與SEQ ID NO: 25具有至少約90%一致性。在此等實施例中之任一者中，核酸序列可包含與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者至少90%一致的序列。在非限制性實例中，核酸序列包含以下中之一或多者：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 20。 CRISPR 噬菌體

噬菌體(Bacteriophage)或「噬菌體(phage)」表示一組細菌病毒且經工程改造或來源於環境來源。單獨噬菌體宿主範圍通常為狹窄的，意謂噬菌體對細菌屬之一種菌株或少數菌株具有高度特異性，且此特異性使得其在其抗菌作用中獨特。噬菌體為依賴於宿主之細胞機制進行複製之細菌病毒。噬菌體根據其生活方式通常分類為毒性或溫和噬菌體。毒性噬菌體(亦稱為溶解性噬菌體)可僅經歷溶解複製。溶解性噬菌體感染宿主細胞，經歷諸多複製回合且觸發細胞溶解以釋放新製成噬菌體粒子。在一些實施例中，本文所揭示之溶解性噬菌體保留其複製能力。在一些實施例中，本文所揭示之溶解性噬菌體保留其觸發細胞溶解之能力。在一些實施例中，本文所揭示之溶解性噬菌體保留其複製能力及觸發細胞溶解之能力兩者。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體包含CRISPR陣列。在一些實施例中，CRISPR陣列不影響噬菌體複製及/或觸發細胞溶解之能力。溫和或溶原性噬菌體可經歷溶原性，其中噬菌體停止複製且穩定地駐留在宿主細胞內，整合至細菌基因體中或維持為染色體外質體。溫和噬菌體亦可經歷與其溶解性噬菌體對應物類似的溶解複製。溫帶噬菌體在感染後溶解複製或經歷溶原性取決於多種因素，包括生長條件及細胞之生理狀態。具有整合至其基因體中之溶原性噬菌體的細菌細胞係稱為溶原性細菌或溶原菌。暴露於不利條件可能觸發溶原性噬菌體之再活化、溶原性狀態之終止及噬菌體之溶解複製的恢復。此過程稱為誘導。促進溶原狀態終止之不利條件包括乾化、暴露於UV或電離放射及暴露於突變誘發化學品。此導致噬菌體基因之表現、整合過程之逆轉及溶解倍增。在一些實施例中，本文所揭示之溫和噬菌體會賦予溶解。術語「溶原性基因」係指基因產物促進溫和噬菌體之溶原性的任何基因。溶原性基因可直接促進，如在促進噬菌體整合至宿主基因體中之整合酶蛋白的情況下。溶原性基因亦可間接促進溶原性，如在防止溶解複製所需之基因的轉錄，且因此有利於維持溶原性之CI轉錄調節因子的情況下。

噬菌體使用三種一般方法封裝及遞送合成DNA。在第一方法下，將合成DNA以靶向方式重組至噬菌體基因體中，其通常涉及可選標記。在第二方法下，將噬菌體內之限制位點用於引入活體外合成DNA。在第三方法下，將一般編碼封裝位點及複製之溶解起點的噬菌體之質體封裝為噬菌體粒子之總成之部分。已使所得質體創造「噬菌粒」。

出於進化原因噬菌體受限於既定菌株。在一些情況下，將噬菌體之基因物質注入至不相容菌株中適得其反。因此噬菌體已進化至特異性感染菌株之有限橫截面。然而，已發現一些噬菌體將其基因物質注入至大範圍之細菌中。典型實例為P1噬菌體，已顯示其將DNA注射至一系列革蘭氏陰性細菌中。

噬菌體衣殼之容量有限，意謂其基因體大小必須保持在窄範圍內以便被適當包裝。由於編碼Cas操縱子+CRISPR陣列之DNA相當大(總計約6000 bp)，因此必須自噬菌體基因體中移除其他DNA，以便為Cas系統騰出空間。本文中工程化之例示性噬菌體包含插入至噬菌體中之Cas操縱子及CRISPR陣列，使得噬菌體保持活力。

在一些實施例中，本文揭示噬菌體，該等噬菌體包含編碼第一間隔序列之第一核酸序列或自其轉錄之crRNA，其中第一間隔序列與來自假單胞菌屬物種中之目標基因的目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，噬菌體包含編碼第一間隔序列之第一核酸序列或自其轉錄之crRNA，其中第一間隔序列與來自綠膿桿菌中之目標基因的目標核苷酸序列互補，其限制條件為噬菌體賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體為溫和噬菌體。在一些實施例中，噬菌體係藉由溶原性基因之移除、替換或失活而賦予溶解。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起維持溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起建立溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起建立溶原循環及維持溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因為抑制因子基因。在一些實施例中，溶原性基因為 cI抑制因子基因。在一些實施例中，噬菌體藉由移除溶原性基因之調節元件而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體藉由移除溶原性基因之啟動子而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體藉由移除溶原性基因之功能元件而賦予溶解。在一些實施例中，溶原性基因為活化因子基因。在一些實施例中，溶原性基因為 cII基因。在一些實施例中，溶原性基因為 lexA基因。在一些實施例中，溶原性基因為 int(整合酶)基因。在一些實施例中，使兩個或更多個溶原性基因移除、替代或不活化以引起噬菌體溶原性循環之遏止及/或溶解循環之誘發。在一些實施例中，噬菌體經由包含針對溶原性基因之第二間隔子的第二CRISPR陣列而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體藉由插入一或多個溶解基因而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體藉由插入一或多個有助於誘導溶解循環之基因而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體藉由改變一或多個有助於誘導溶解循環之基因之表現而賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體自溶原性噬菌體在表型上變成溶解性噬菌體。在一些實施例中，表型變化係經由自靶向CRISPR-Cas系統以使噬菌體溶解，因為噬菌體無法具有溶原性。在一些實施例中，自靶向CRISPR-Cas包含來自原噬菌體基因體之自靶向crRNA且殺滅溶原。在一些實施例中，噬菌體藉由環境改變而賦予溶解。在一些實施例中，環境改變包括但不限於改變溫度、pH或營養物；暴露於抗生素、過氧化氫、外來DNA或DNA損傷劑；存在有機碳及存在重金屬(例如呈鉻(VI)形式)。在一些實施例中，防止賦予溶解之噬菌體恢復至溶原狀態。在一些實施例中，藉助於引入額外CRIPSR陣列來防止賦予溶解之噬菌體恢復至溶原狀態。在一些實施例中，除了由噬菌體之溶解活性及/或CRISPR陣列之活性所引起之細胞死亡以外，該噬菌體不賦予假單胞菌屬物種任何新特性。

在一些實施例中，本文進一步揭示溫和噬菌體，該等溫和噬菌體包含編碼第一間隔序列之第一核酸序列或自其轉錄之crRNA，其中第一間隔序列與來自假單胞菌屬物種中之目標基因的目標核苷酸序列互補，其限制條件為噬菌體賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體感染多個菌株。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含目標基因之啟動子序列之全部或一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含位於目標基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含假單胞菌屬物種存活所需之必需基因的至少一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含高度保守非編碼或基因間序列。在一些實施例中，目標序列為位於必需基因 rpmF與保守假設蛋白之間的基因間序列。在一些實施例中，必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。在一些實施例中，必需基因為 dnaA、 ftsA、 gyrB、 dnaN、 glnS或 rpoB。在一些實施例中，目標序列為PA4325 (假設蛋白)、PA1310 (phnW，丙酮酸轉胺酶)或PA2970 (rpmF，50S核糖體蛋白L32)與PA2971 (保守假設蛋白)之間的邊界。在一些實施例中，目標核苷酸序列在非必需基因中。在一些實施例中，目標核苷酸序列為非編碼序列。在一些實施例中，非編碼序列為基因間序列。在一些實施例中，間隔序列與假單胞菌屬物種中之高度保守序列之目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與存在於假單胞菌屬物種中之序列的目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與包含必需基因之啟動子序列之全部或一部分的目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，第一核酸序列包含第一CRISPR陣列，其包含至少一個重複序列。在一些實施例中，至少一個重複序列在第一間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該第一間隔序列。

在一些實施例中，噬菌體DNA來自溶原性或溫和噬菌體。在一些實施例中，噬菌體包括但不限於p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4209、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。

在一些實施例中，所關注之噬菌體獲自環境來源或商業研究供應商。在一些實施例中，針對對抗細菌庫及其相關菌株之溶解活性篩選所獲得之噬菌體。在一些實施例中，針對噬菌體在所篩選細菌中產生原發性抗性之能力篩選對抗細菌庫及其相關菌株之噬菌體。

在一些實施例中，將核酸插入噬菌體基因體中。在一些實施例中，核酸包含crArray、Cas系統或其組合。在一些實施例中，在所關注之操縱子末端在轉錄終止子位點將核酸插入噬菌體基因體中。在一些實施例中，將核酸插入噬菌體基因體中作為一或多個經移除非必需基因之替代。在一些實施例中，將核酸插入噬菌體基因體中作為一或多個經移除溶原性基因之替代。在一些實施例中，用核酸替代非必需及/或溶原性基因增強噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，用核酸替代非必需及/或溶原性基因使得溶原性噬菌體溶解。

在一些實施例中，在第一位置將核酸引入噬菌體基因體中同時在分開的位置自噬菌體基因體分開移除一或多個非必需及/或溶原性基因及/或使其不活化。在一些實施例中，一或多個非必需及/或溶原性基因之移除使得溶原性噬菌體成為溶解性噬菌體。類似地，在一些實施例中，將一或多個溶解基因引入噬菌體中以便使得非溶解、溶原性噬菌體成為溶解性噬菌體。

在一些實施例中，藉由化學、生物化學及/或任何適合之方法達成一或多個非必需及/或溶原性基因之替代、移除、不活化或其任何組合。在一些實施例中，藉由任何適合之化學、生物化學及/或物理方法藉由同源重組達成一或多個溶解基因之插入。

在一些實施例中，待自噬菌體移除及/或替代之非必需基因為對於噬菌體之存活而言非必需之基因。在一些實施例中，待自噬菌體移除及/或替代之非必需基因為對於誘導及/或維持溶解循環而言非必需之基因。

在某些實施例中，本文揭示包含完全外源CRISPR-Cas系統之噬菌體。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統為I型CRISPR-Cas系統、II型CRISPR-Cas系統、III型CRISPR-Cas系統、IV型CRISPR-Cas系統、V型CRISPR-Cas系統或VI型CRISPR-Cas系統。在某些實施例中，本文揭示包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含：(a) CRISPR陣列；(b) Cascade多肽；及(c) Cas3多肽。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統與SEQ ID NO: 24具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統與SEQ ID NO: 25具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p1106 (FIRDI寄存編號BCRC970100)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p1587 (FIRDI寄存編號BCRC970101)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p1772 (FIRDI寄存編號BCRC970096)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p1835 (FIRDI寄存編號BCRC970079)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2037 (FIRDI寄存編號BCRC970103)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2131 (FIRDI寄存編號BCRC970097)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2132 (FIRDI寄存編號BCRC970098)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2363 (FIRDI寄存編號BCRC970094)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2421 (FIRDI寄存編號BCRC970095)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為p2973 (FIRDI寄存編號BCRC970099)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體為PB1 (FIRDI寄存編號BCRC970104)，其中噬菌體包含I型CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，噬菌體包含表 1A中所列之噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的CRISPR系統。

在一些實施例中，噬菌體為p1106e003 (FIRDI寄存編號BCRC970078)或與p1106e003至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p1587e002 (FIRDI寄存編號BCRC970088)或與p1587e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p1772e005 (FIRDI寄存編號BCRC970080)或與p1772e005至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p1835e002 (FIRDI寄存編號BCRC970102)或與p1835e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2037e002 (FIRDI寄存編號BCRC970090)或與p2037e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2131e002 (FIRDI寄存編號BCRC970081)或與p2131e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2132e002 (FIRDI寄存編號BCRC970086)或與p2132e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2363e003 (FIRDI寄存編號BCRC970089)或與p2363e003至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2421e002 (FIRDI寄存編號BCRC970087)或與p2421e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為p2973e002 (FIRDI寄存編號BCRC970084)或與p2973e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體為PB1e002 (FIRDI寄存編號BCRC970085)或與PB1e002至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，噬菌體包含表 1A中所列之噬菌體。在一些實施例中，提供包含一或多種工程化噬菌體及野生型噬菌體之噬菌體混合液系統。在一些實施例中，野生型噬菌體為表5A、表5B或表6A之噬菌體。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型普納病毒。野生型普納病毒之非限制性實例包括p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421及pb1。在一些實施例中，普納病毒與p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型沙穆納病毒。非限制性例示性野生型沙穆納病毒包括p1772、p2121、p2132及p2973。在一些實施例中，沙穆納病毒與p1772、p2121、p2131或p2973具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型Nankoku病毒。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型匹克茲病毒。野生型匹克茲病毒之非限制性實例包括p1194p.b008及p4430。在一些實施例中，匹克茲病毒與p1194或p4430具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型PhiKMV病毒。野生型PhiKMV病毒之非限制性實例為p2167。在一些實施例中，野生型噬菌體為野生型布魯伊諾格病毒。野生型布魯伊諾格病毒之非限制性實例包括p1695及p3278。在一些實施例中，布魯伊諾格病毒與p1695或p3278具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，野生型噬菌體為p1194。在一些實施例中，野生型噬菌體為p4430。在一些實施例中，野生型噬菌體為p1695。在一些實施例中，野生型噬菌體為匹克茲病毒、PhiKMV 病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。

在一些實施例中，噬菌體混合液系統包含CK000512 (p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695)。

在一些實施例中，複數種噬菌體一起使用。在一些實施例中，一起使用之複數種噬菌體靶向樣品或個體內之相同或不同細菌。在一些實施例中，混合液包含一起使用之複數種噬菌體。在一些實施例中，混合液包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含2種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含3種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含3種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含4種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含5種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含6種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含選自表6A之混合液。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含CRISPR陣列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含CRISPR陣列。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含編碼Cascade多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含編碼Cascade多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含編碼Cas3多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含編碼Cas3多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005及p2131e002。在一些實施例中，混合液進一步包含p1194。在一些實施例中，混合液進一步包含p1695。在一些實施例中，混合液進一步包含p4430。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p1194及p1695。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之匹克茲病毒噬菌體。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之PhiKMV病毒噬菌體。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之Brunyoghe病毒噬菌體。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之沙穆納病毒噬菌體。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之普納病毒噬菌體。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之Nankoku病毒噬菌體。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。

在一些實施例中，本文提供包含I型CRISPR-Cas系統之Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒或Zicotria病毒噬菌體。在一些實施例中，CRISPR-Cas系統包含一或多個與假單胞菌屬中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列包含至少一個與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性的重複序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列，例如選自SEQ ID NO: 1-11。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%一致性之CRISPR系統。在一些實施例中，噬菌體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之CRISPR系統。 CRISPR 陣列

在一些實施例中，CRISPR陣列(crArray)包含間隔序列及至少一個重複序列。在一些實施例中，CRISPR陣列編碼經加工之成熟crRNA。在一些實施例中，將成熟crRNA引入至噬菌體或假單胞菌屬物種中。在一些實施例中，內源性或外源性Cas6將CRISPR陣列加工為成熟crRNA。在一些實施例中，將外源性Cas6引入噬菌體中。在一些實施例中，噬菌體包含外源性Cas6。在一些實施例中，將外源性Cas6引入假單胞菌屬物種中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含間隔序列。在一些實施例中，CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。在一些實施例中，至少一個重複序列在至少一個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該至少一個間隔序列。在一些實施例中，CRISPR陣列具有任何長度且包含任何數目個與重複核苷酸序列交替之間隔核苷酸序列，該等間隔核苷酸序列為藉由靶向一或多個必需基因達成所需程度之假單胞菌屬物種殺滅所必需。在一些實施例中，CRISPR陣列包含1至約100個間隔核苷酸序列、基本上由其組成或由其組成，該等間隔核苷酸序列各自在其5'端及其3'端上連接至重複核苷酸序列。在一些實施例中，CRISPR陣列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個間隔核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含與SEQ ID NO: 83至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，CRISPR陣列包含與SEQ ID NO: 84至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，CRISPR陣列包含與SEQ ID NO: 85至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，CRISPR陣列包含與SEQ ID NO: 86至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，CRISPR陣列包含與SEQ ID NO: 87至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，本文描述一種包含I型CRISPR Cas系統之噬菌體，其中該噬菌體與普納病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，其中普納病毒選自PB1、p1106、p1587、p1835、p2037、p2363及p2421。在一些實施例中，本文描述一種包含I型CRISPR Cas系統之噬菌體，其中該噬菌體與沙穆納病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，其中沙穆納病毒選自p1772、p2131、p2132及p2973。在一些實施例中，本文描述一種包含I型CRISPR Cas系統之噬菌體，其中該噬菌體與匹克茲病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，其中匹克茲病毒選自p1194及p4430。在一些實施例中，本文描述一種包含I型CRISPR Cas系統之噬菌體，其中該噬菌體與布魯伊諾格病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，其中布魯伊諾格病毒選自p1695及p3278。在一些實施例中，本文描述一種包含I型CRISPR Cas系統之噬菌體，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。 間隔序列

在一些實施例中，間隔序列與存在於假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與綠膿桿菌中之目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，目標核苷酸序列為編碼區。在一些實施例中，編碼區為必需基因。在一些實施例中，編碼區為非必需基因。在一些實施例中，目標核苷酸序列為非編碼序列。在一些實施例中，非編碼序列為基因間序列。在一些實施例中，間隔序列與假單胞菌屬物種中之高度保守序列之目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與存在於假單胞菌屬物種中之序列的目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與包含必需基因之啟動子序列之全部或一部分的目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，間隔序列與目標核苷酸序列相比包含一個、兩個、三個、四個或五個錯配。在一些實施例中，錯配為連續的。在一些實施例中，錯配為非連續的。在一些實施例中，間隔序列與目標核苷酸序列具有70%互補性。在一些實施例中，間隔序列與目標核苷酸序列具有80%互補性。在一些實施例中，間隔序列與目標核苷酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補性。在一些實施例中，間隔序列與目標核苷酸序列具有100%互補性。在一些實施例中，間隔序列在長度為至少約8個核苷酸至約150個核苷酸之目標核苷酸序列的區域內完全互補或基本互補。在一些實施例中，間隔序列在長度為至少約20個核苷酸至約100個核苷酸之目標核苷酸序列的區內完全互補或基本互補。在一些實施例中，間隔序列之5'區與目標核苷酸序列100%互補，而間隔子之3'區與目標核苷酸序列基本上互補，且因此間隔序列與目標核苷酸序列之總體互補性為小於100%。例如，在一些實施例中，20個核苷酸之間隔序列之3'區(種子區)中之前7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個核苷酸與目標核苷酸序列100%互補，而間隔序列之5'區中之其餘核苷酸與目標核苷酸序列基本上互補(例如至少約70%互補)。在一些實施例中，間隔序列之3'端的前7至12個核苷酸與目標核苷酸序列100%互補，而間隔序列之5'區中之其餘核苷酸與目標核苷酸序列基本上互補(例如至少約50%互補(例如50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多))。在一些實施例中，間隔序列之3'端中之前7至10個核苷酸與目標核苷酸序列75%-99%互補，而間隔序列之5'區中之其餘核苷酸與目標核苷酸序列至少約50%至約99%互補。在一些實施例中，間隔序列之3'端中之前7至10個核苷酸與目標核苷酸序列100%互補，而間隔序列之5'區中之其餘核苷酸與目標核苷酸序列基本上互補(例如至少約70%互補)。在一些實施例中，間隔序列之(種子區內之)前10個核苷酸與目標核苷酸序列100%互補，而間隔序列之5'區中之其餘核苷酸與目標核苷酸序列基本上互補(例如至少約70%互補)。在一些實施例中，間隔序列之5'區(例如5'端處之前8個核苷酸、5'端處之前10個核苷酸、5'端處之前15個核苷酸、5'端處之前20個核苷酸)與目標核苷酸序列具有約75%或更多互補性(75%至約100%互補性)，而間隔序列之其餘部分與目標核苷酸序列具有約50%或更多互補性。在一些實施例中，間隔序列之5'端處之前8個核苷酸與目標核苷酸序列具有100%互補性，或具有一或兩個突變且因此分別與目標核苷酸序列具有約88%互補性或約75%互補性，而間隔核苷酸序列之其餘部分與目標核苷酸序列具有至少約50%或更多互補性。

在一些實施例中，間隔序列之長度為約15個核苷酸至約150個核苷酸。在一些實施例中，間隔核苷酸序列之長度為約15個核苷酸至約100個核苷酸(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個核苷酸或更多)。在一些實施例中，間隔核苷酸序列之長度為約8至約150個核苷酸、約8至約100個核苷酸、約8至約50個核苷酸、約8至約40個核苷酸、約8至約30個核苷酸、約8至約25個核苷酸、約8至約20個核苷酸、約10至約150個核苷酸、約10至約100個核苷酸、約10至約80個核苷酸、約10至約50個核苷酸、約10至約40個核苷酸、約10至約30個核苷酸、約10至約25個核苷酸、約10至約20個核苷酸、約15至約150個核苷酸、約15至約100個核苷酸、約15至約50個核苷酸、約15至約40個核苷酸、約15至約30個核苷酸、約20至約150個核苷酸、約20至約100個核苷酸、約20至約80個核苷酸、約20至約50個核苷酸、約20至約40個核苷酸、約20至約30個核苷酸、約20至約25個核苷酸，長度為至少約8個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約32個、至少約35個、至少約40個、至少約44個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個、至少約150個核苷酸或更多及其中之任何值或範圍。在一些實施例中，綠膿桿菌I-C型Cas系統之間隔子長度為約30至39個核苷酸、約31至約38個核苷酸、約32至約37個核苷酸、約33至約36個核苷酸、約34至約35個核苷酸或約35個核苷酸。在一些實施例中，綠膿桿菌I-C型Cas系統之間隔子長度為約34個核苷酸。在一些實施例中，綠膿桿菌I-C型Cas系統之間隔子長度為至少約10、至少約15、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約26、至少約27、至少約29、至少約29、至少約30、至少約31、至少約32、至少約33、至少約34、至少約35、至少約36、至少約37、至少約38、至少約39、至少約20、至少約41、至少約42、至少約43、至少約44、至少約45或超過約45個核苷酸。

在一些實施例中，間隔序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些情況下，間隔序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約95%同源性。在一些情況下，間隔序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約97%同源性。在一些情況下，間隔序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約99%同源性。在一些情況下，間隔序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有100%同源性。在一些情況下，間隔序列包含具有SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者之至少或約3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或超過34個核苷酸的至少一部分。

術語「序列一致性」意謂兩個多核苷酸序列在比較窗口內一致(亦即，在逐個核苷酸之基礎上)。術語「序列一致性百分比」藉由比較兩個最佳比對序列相較於比較窗來計算，確定兩個序列中存在之一致核酸鹼基(例如A、T、C、G、U或I)的位置數，得到匹配位置數，使匹配位置數除以比較窗中之總位置數(亦即窗大小)，且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。

術語兩個蛋白質之間的「同源性」或「相似性」係藉由比較一個蛋白質序列之胺基酸序列及其保守胺基酸替代物與第二蛋白質序列而確定。相似性可藉由此項技術中熟知之程序，例如BLAST程式(美國國家生物學資訊中心(National Center for Biological Information)之基本局部比對檢索工具)來確定。

在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個間隔序列的一致性相同。在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個間隔序列的一致性不同。在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個間隔序列的一致性不同，但與一或多個目標核苷酸序列互補。在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個間隔序列的一致性不同且與一或多個目標核苷酸序列互補，該一或多個目標核苷酸序列為重疊序列。在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個間隔序列的一致性不同且與一或多個目標核苷酸序列互補，該一或多個目標核苷酸序列不為重疊序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列之長度為約10至約40個連續核苷酸，定位成緊鄰生物體之基因體中之PAM序列(定位成緊鄰目標區之3'的PAM序列)。在一些實施例中，目標核苷酸序列定位成鄰近於PAM (前間隔子相鄰模體)或側接PAM。在一些實施例中，CRISPR陣列之兩個或更多個序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些情況下，CRISPR陣列之兩個或更多個序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約95%同源性。在一些情況下，CRISPR陣列之兩個或更多個序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約97%同源性。在一些情況下，CRISPR陣列之兩個或更多個序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少或約99%同源性。在一些情況下，CRISPR陣列之兩個或更多個序列與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有100%同源性。在一些情況下，CRISPR陣列之兩個或更多個序列包含具有SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者之至少或約3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或超過34個核苷酸的至少一部分。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 12-15中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 16-19中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 20-23中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該第一間隔序列、該第二間隔序列及該第三間隔序列包含0-8個核苷酸修飾。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12-15中之任一者具有至少或約97%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16-19中之任一者具有至少或約97%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20-23中之任一者具有至少或約97%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12-15中之任一者具有至少或約99%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16-19中之任一者具有至少或約99%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20-23中之任一者具有至少或約99%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12-15中之任一者具有至少或約100%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16-19中之任一者具有至少或約100%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20-23中之任一者具有至少或約100%同源性。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 12具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 16具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 20具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該第一間隔序列、該第二間隔序列及該第三間隔序列包含0-8個核苷酸修飾。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12具有至少或約97%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16具有至少或約97%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20具有至少或約97%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12具有至少或約99%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16具有至少或約99%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20具有至少或約99%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 12具有至少或約100%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 16具有至少或約100%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 20具有至少或約100%同源性。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 13具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 17具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 21具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該第一間隔序列、該第二間隔序列及該第三間隔序列包含0-8個核苷酸修飾。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 13具有至少或約97%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 17具有至少或約97%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 21具有至少或約97%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 13具有至少或約99%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 17具有至少或約99%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 21具有至少或約99%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 13具有至少或約100%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 17具有至少或約100%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 21具有至少或約100%同源性。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 14具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 18具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 22具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該第一間隔序列、該第二間隔序列及該第三間隔序列包含0-8個核苷酸修飾。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 14具有至少或約97%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 18具有至少或約97%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 22具有至少或約97%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 14具有至少或約99%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 18具有至少或約99%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 22具有至少或約99%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 14具有至少或約100%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 18具有至少或約100%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 22具有至少或約100%同源性。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，CRISPR陣列包含第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 15具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 19具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 23具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該第一間隔序列、該第二間隔序列及該第三間隔序列包含0-8個核苷酸修飾。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 15具有至少或約97%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 19具有至少或約97%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 23具有至少或約97%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 15具有至少或約99%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 19具有至少或約99%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 23具有至少或約99%同源性。在一些情況下，第一間隔序列與SEQ ID NO: 15具有至少或約100%同源性；第二間隔序列與SEQ ID NO: 19具有至少或約100%同源性；且第三間隔序列與SEQ ID NO: 23具有至少或約100%同源性。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Zicotria病毒中。

在一些實施例中，間隔子在一或多個噬菌體，例如工程化噬菌體內以複數個、簇狀組合。噬菌體或噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 12-15中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 16-19中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 20-23中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 12具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 23具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 13具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 22具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 14具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 21具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 15具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 20具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 16具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 19具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體混合液可包含一或多個陣列，該一或多個陣列具有第一間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 17具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；第二或第三間隔序列，該間隔序列與SEQ ID NO: 18具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，複數種噬菌體一起使用。在一些實施例中，一起使用之複數種噬菌體靶向樣品或個體內之相同或不同細菌。在一些實施例中，混合液包含一起使用之複數種噬菌體。在一些實施例中，混合液包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含2種選自表1A之噬菌體。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化匹克茲病毒。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化PhiKMV病毒。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Brunyoghe病毒。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化沙穆納病毒。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化普納病毒。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Nankoku病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Abidjan病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Baikal病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Beetre病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Casadaban病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Citex病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Cysto病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Detre病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化El病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Holloway病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Kochitakasu病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Lituna病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Luzseptima病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Nipuna病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Pakpuna病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Pamex病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Paundecim病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Phitre病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Primolici病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Septimatre病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Stubbur病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Tertilici病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Yua病毒。在一些實施例中，混合液包含野生型或工程化Zicotria病毒。

在一些實施例中，混合液包含選自表6A之混合液。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含CRISPR陣列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含CRISPR陣列。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含編碼Cascade多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含編碼Cascade多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中之至少一種噬菌體包含編碼Cas3多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液中存在之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27種噬菌體包含編碼Cas3多肽之核酸序列。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005及p2131e002。在一些實施例中，混合液進一步包含p1194。在一些實施例中，混合液進一步包含p1695。在一些實施例中，混合液進一步包含p4430。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p1194及p1695。在一些實施例中，混合液包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。

PAM序列發現於緊鄰間隔序列所結合之區域(由於間隔序列與該區域互補)的目標基因中，且識別鹼基與間隔核苷酸序列配對開始的點。所需確切PAM序列在每個不同CRISPR-Cas系統之間變化且經由已建立之生物資訊及實驗程序鑑別。PAM之非限制性實例包括CCA、CCT、CCG、TTC、AAG、AGG、ATG、GAG及/或CC。對於I型系統，PAM定位成緊鄰匹配間隔子之序列的5'，且因此在鹼基與間隔核苷酸序列配對之序列的3'，且由Cascade直接識別。一旦識別前間隔子，Cascade一般募集分裂且降解目標DNA之核酸內切酶Cas3。對於II型系統，PAM需要Cas9/sgRNA以形成R環，以經由其導引RNA與基因體之沃森-克里克配對查詢特異性DNA序列。PAM特異性為Cas9蛋白(例如Cas9之C末端的前間隔子相鄰模體識別域)之DNA結合特異性之功能。

在一些實施例中，待殺滅之細菌中的目標核苷酸序列為所關注之任何必需目標核苷酸序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列為非必需序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含編碼必需基因之啟動子或其補體之核苷酸序列的全部或一部分、基本上由其組成或由其組成。在一些實施例中，間隔核苷酸序列與必需基因之啟動子或其部分互補。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含位於必需基因之編碼或非編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼上的核苷酸序列之全部或一部分。

在一些實施例中，必需基因為對於生物體之存活至關重要的任何基因。然而，為必需高度取決於生物體所生存之情形。舉例而言，僅在澱粉為能量之唯一來源時分解澱粉所需的基因為必需。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含目標基因之啟動子序列之全部或一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含位於目標基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含假單胞菌屬物種存活所需之必需基因的至少一部分。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含高度保守非編碼或基因間序列。在一些實施例中，目標序列為位於必需基因rpmF與保守假設蛋白之間的基因間序列。在一些實施例中，必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。在一些實施例中，必需基因為 dnaA、 ftsA、 gyrB、 dnaN、 glnS或 rpoB。在一些實施例中，目標序列為PA4325 (假設蛋白)、PA1310 (phnW，丙酮酸轉胺酶)或PA2970 (rpmF，50S核糖體蛋白L32)與PA2971 (保守假設蛋白)之間的邊界。在一些實施例中，非必需基因為生物體之對於存活不重要的任何基因。然而，為非必需高度取決於生物體所生存之情形。

在一些實施例中，所關注之目標核苷酸序列之非限制性實例包括編碼轉錄調節因子、轉譯調節因子、聚合酶基因、新陳代謝酶、轉運體、RNA酶、蛋白酶、DNA複製酶、DNA修飾或降解酶、調節RNA、轉移RNA或核糖體RNA之目標核苷酸序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列來自涉及細胞分裂、細胞結構、代謝、運動性、致病性、毒性或抗生素抗性的基因。在一些實施例中，目標核苷酸序列來自其功能尚未表徵之假設基因。因此，舉例而言此等基因為來自任何細菌之任何基因。

在一些實施例中，藉由定位代表性基因體之搜尋集、搜尋具有相關參數之基因體及確定用於CRISPR工程化噬菌體之間隔子之品質來鑑別完全構築體噬菌體的適當間隔序列。

首先，定位及獲取所關注生物體/物種/目標之代表性基因體的適合搜尋集。在一些實施例中，代表性基因體集發現於多種資料庫中，包括但不限於NCBI GenBank或PATRIC資料庫。NCBI GenBank為可用的最大資料庫之一，且含有迄今為止定序之幾乎每一生物體之參考及提交基因體的混合物。特定言之，對於致病性原核生物，PATRIC (Pathosystems Resource Integration Center)資料庫提供額外的綜合基因體資源，且聚焦於與藥品相關的臨床相關菌株及基因體。以上資料庫均允許經由FTP (檔案傳送協定)伺服器大量下載基因體，實現快速及程式化資料集獲取。

隨後，用相關參數搜尋基因體以定位適合之間隔序列。在一些實施例中，基因體係沿正向及反向互補序列方向自開始至結束讀取，以定位含有PAM (前間隔子相鄰模體)位點之連續DNA伸長部。間隔序列將為在PAM位點之3'或5'附近的N-長度DNA序列(取決於CRISPR系統類型)，其中N特定於所關注Cas系統且一般提前已知。在一些實施例中，表徵PAM序列及間隔序列係在Cas系統之發現及初始研究期間進行。在一些實施例中，每一觀測之PAM相鄰間隔子均保存至檔案及/或資料庫以供下游使用。所需確切PAM序列在每個不同CRISPR-Cas系統之間變化且經由已建立之生物資訊及實驗程序鑑別。

接著，確定用於CRISPR工程化噬菌體之間隔子的品質。在一些實施例中，評估各觀測之間隔子以確定其存在於多少經評估基因體中。在一些實施例中，評估觀測之間隔子以查看其可在各給定基因體中出現多少次。在一些實施例中，每個基因體在超過一個位置出現之間隔子係有利的，因為若發生突變，則Cas系統可能無法識別目標位點，且各額外「備份」位點增加將存在適合之非突變目標位置的可能性。在一些實施例中，評估觀測之間隔子以確定其是否出現在基因體之功能註釋區域中。若此類資訊可用，則可進一步評估功能註釋以確定基因體之彼等區域是否對生物體之存活及功能「必不可少」。藉由聚焦於在所有或幾乎所有評估之所關注基因體(＞= 99)中出現之間隔子，間隔子選擇可廣泛地適用於許多靶向基因體。若存在保守間隔子的大型選擇池，則可優先考慮出現在具有已知功能之基因體區域中的間隔子，其中若彼等基因體區域對存活「必不可少」且每個基因體出現超過1次，則更優先考慮。

在一些實施例中，驗證完整構築體噬菌體之間隔序列。在一些實施例中，第一步包含鑑別在所關注生物體、物種或目標中複製的質體。在一些實施例中，質體具有可選標記。在一些實施例中，可選標記為抗生素抗性基因。在一些實施例中，表現卡匣包括用於可選標記之核苷酸序列。在一些實施例中，可選標記為腺嘌呤脫胺酶( ada)、殺稻瘟菌素S去胺酶( Bsr, BSD)、博萊黴素結合蛋白( Ble)、新黴素磷酸轉移酶( neo)、組胺醇脫氫酶( hisD)、麩胺合成酶( GS)、二氫葉酸還原酶( dhfr)、胞嘧啶脫胺酶( codA)、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶( Pac)或潮黴素B磷酸轉移酶( Hph)、安比西林、氯黴素、康黴素、四環素、多黏菌素B、紅黴素、卡本西林、鏈黴素、大觀黴素、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶( Pac)或吉歐黴素( Sh bla)。在一些實施例中，可選標記為涉及胸苷酸合酶、胸苷激酶、二氫葉酸還原酶或麩胺合成酶之基因。在一些實施例中，可選標記為編碼螢光蛋白之基因。

在一些實施例中，第二步包含將編碼Cas系統之基因插入質體中，使得該等基因將表現於所關注生物體、物種或目標中。在一些實施例中，啟動子提供於Cas系統上游。在一些實施例中，啟動子藉由所關注生物體、物種或目標識別以驅動Cas系統之表現。例示性啟動子包括但不限於L-阿拉伯糖誘導性( araBAD 、 P _BAD )啟動子、任何 lac啟動子、L-鼠李糖誘導性(rhaPBAD)啟動子、T7 RNA聚合酶啟動子、 trc啟動子、 tac啟動子、λ噬菌體啟動子(p _Lp _L-9G-50)、無水四環素誘導性( tetA)啟動子、 trp 、 Ipp 、 phoA 、 recA 、 proU 、 cst-1 、 cadA 、 nar 、 Ipp-lac 、 cspA 、 11-lac操縱子、T3- lac操縱子、T4基因 32、T5- lac操縱子、 nprM-lac操縱子、Vhb、蛋白A、棒狀桿菌-大腸桿菌樣啟動子、 thr 、 horn、白喉毒素啟動子、 sigA 、 sigB 、 nusG 、 SoxS 、 katb 、 a- 澱粉酶 (Pamy) 、 Ptms 、 P43(由兩個重疊RNA聚合酶σ因子識別位點σA、σB構成)、 Ptms 、 P43 、 rplK-rplA、鐵氧化還原蛋白啟動子及/或木糖啟動子。在一些實施例中，啟動子為BBa_J23102、BBa_J23104或BBa_J23109。在一些實施例中，啟動子源自生物體、物種或目標細菌，諸如內源性CRISPR啟動子、內源性Cas操縱子啟動子、p16、plpp或ptat。在一些實施例中，啟動子為噬菌體啟動子，諸如gp105或gp245之啟動子。在一些實施例中，在啟動子與Cas系統之間提供核糖體結合位點(RBS)。在一些實施例中，RBS由所關注之生物體、物種或目標識別。

在一些實施例中，第三步包含將基因靶向間隔子提供至質體中。在一些實施例中，使用生物資訊學鑑別基因體靶向間隔子。在一些實施例中，基因體靶向間隔子提供於重複序列-間隔子-重複序列上游。在一些實施例中，提供啟動子。在一些實施例中，啟動子藉由所關注生物體、物種或目標識別以驅動crRNA之表現。在一些實施例中，第三步之選殖包含使用未經所選殖間隔子靶向的生物體或物種。

在一些實施例中，第四步包含向表現Cas系統之質體中提供非目標間隔子。在一些實施例中，非目標間隔子包含隨機序列。在一些實施例中，非目標間隔子包含不包含所關注生物體、物種或目標之基因體中之靶向位點的序列。在一些實施例中，非目標間隔序列使用生物資訊學確定以在所關注生物體、物種或目標之基因體中不包含靶向位點。在一些實施例中，非目標間隔序列提供於重複序列-間隔子-重複序列上游。在一些實施例中，提供啟動子。在一些實施例中，啟動子藉由所關注生物體、物種或目標識別以驅動crRNA之表現。

在一些實施例中，第五步包含確定所生成之各間隔子的功效。在一些實施例中，確定殺滅功效。在一些實施例中，確定各間隔子靶向細菌基因體之功效。在一些實施例中，相比於包含非靶向間隔子之質體，包含間隔子之質體的轉移速率降低約0.5倍、約1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或至多約100倍。 重複核苷酸序列

在一些實施例中，CRISPR陣列之重複核苷酸序列包含CRISPR-Cas系統之任何已知重複核苷酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，重複核苷酸序列具有包含來自CRISPR-Cas系統之天然重複序列之二級結構(例如內部髮夾)的合成序列。在一些實施例中，重複核苷酸序列基於CRISPR-Cas系統之已知重複核苷酸序列而彼此不同。在一些實施例中，重複核苷酸序列各自由CRISPR-Cas系統之天然重複序列之不同二級結構(例如內部髮夾)構成。在一些實施例中，重複核苷酸序列為可用CRISPR-Cas系統操作之不同重複核苷酸序列之組合。

在一些實施例中，間隔序列在其5'端連接至重複序列之3'端。在一些實施例中，間隔序列在其3'端連接至重複核苷酸序列的5'端之約1至約8個、約1至約10個或約1至約15個核苷酸。在一些實施例中，重複序列之約1至約8個、約1至約10個或約1至約15個核苷酸為重複序列之3'端的一部分。在一些實施例中，間隔核苷酸序列在其3'端連接至重複序列之5'端。在一些實施例中，間隔子在其3'端連接至重複序列之5'端之約1至約8個、約1至約10個或約1至約15個核苷酸。在一些實施例中，重複序列之約1至約8個、約1至約10個或約1至約15個核苷酸為重複序列之5'端的一部分。

在一些實施例中，間隔核苷酸序列在其5'端連接至第一重複序列且在其3'端連接至第二重複序列，以形成重複序列-間隔子-重複序列。在一些實施例中，間隔序列在其5'端連接至第一重複序列之3'端且在其3'端連接至第二重複序列之5'，其中間隔序列及第二重複序列經重複以形成重複-(間隔子-重複)n序列，使得n為1至100之任何整數。在一些實施例中，重複-(間隔子-重複)n序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個間隔核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成。

在一些實施例中，重複序列與來自野生型CRISPR基因座之重複序列一致或基本上一致。在一些實施例中，重複序列為表3中發現之重複序列。在一些實施例中，重複序列本文所述之序列。在一些實施例中，重複序列包含野生型重複序列之一部分(例如野生型重複序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個連續核苷酸)。在一些實施例中，重複序列包含至少一個核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸或其中之任何範圍)，基本上由其組成，或由其組成。在一些實施例中，重複序列包含不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個核苷酸，基本上由其組成，或由其組成。在一些實施例中，重複序列包含約20至40、21至40、22至40 23至40、24至40、25至40、26至40、27至40、28至40、29至40、30至30、31至40、32至40、33至40、34至40、35至40、36至40、37至40、38至40、39至40、20至39、20至38、20至37、20至36、20至35、20至34、20至33、20至32、20至31、20至30、20至29、20至28、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22或20至21個核苷酸。在一些實施例中，重複序列包含約20至35、21至35、22至35 23至35、24至35、25至35、26至35、27至35、28至35、29至35、30至30、31至35、32至35、33至35、34至35、25至40、25至39、25至38、25至37、25至36、25至35、25至34、25至33、25至32、25至31、25至30、25至29、25至28、25至26個核苷酸。在一些實施例中，系統為綠膿桿菌I-C型Cas系統。在一些實施例中，綠膿桿菌I-C型Cas系統之重複長度為約25至38個核苷酸。

在一些實施例中，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些情況下，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少或約95%同源性。在一些情況下，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少或約97%同源性。在一些情況下，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少或約99%同源性。在一些情況下，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有100%同源性。在一些情況下，重複序列包含具有SEQ ID NO: 26-30中之任一者之至少或約3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或超過32個核苷酸的至少一部分。在一些實施例中，重複序列係工程化至匹克茲病毒中。在一些實施例中，匹克茲病毒為p1194或p4430。在一些實施例中，重複序列係工程化至PhiKMV病毒中。在一些實施例中，PhiKMV病毒為p2167。在一些實施例中，重複序列係工程化至Brunyoghe病毒中。在一些實施例中，Brunyoghe病毒為p1695或p3278。在一些實施例中，重複序列係工程化至沙穆納病毒中。在一些實施例中，沙穆納病毒為p1772、p2131、p2132或p2973。在一些實施例中，重複序列係工程化至普納病毒中。在一些實施例中，普納病毒為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421或pb1。在一些實施例中，重複序列係工程化至Nankoku病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Abidjan病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Baikal病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Beetre病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Casadaban病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Citex病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Cysto病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Detre病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至El病毒中。在一些實施例中，CRISPR陣列係工程化至Holloway病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Kochitakasu病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Lituna病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Luzseptima病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Nipuna病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Pakpuna病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Pamex病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Paundecim病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Phitre病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Primolici病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Septimatre病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Stubbur病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Tertilici病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Yua病毒中。在一些實施例中，重複序列係工程化至Zicotria病毒中。在一些實施例中，重複序列為工程化至噬菌體中之CRISPR陣列的一部分。 I 型 CRISPR-Cas 系統

在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-A型系統、I-B型系統、I-C型系統、I-D型系統、I-E型系統或I-F型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-A型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-B型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-C型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-D型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-E型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統為I-F型系統。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統包含Cascade多肽。I型Cascade多肽加工CRISPR陣列以產生經加工RNA，該經加工RNA隨後用於使複合物結合至與經加工RNA中之間隔子互補的目標序列。在一些實施例中，I型Cascade複合物為I-A型Cascade多肽、I-B型Cascade多肽、I-C型Cascade多肽、I-D型Cascade多肽、I-E型Cascade多肽、I-F型Cascade多肽或I-U型Cascade多肽。

在一些實施例中，I型Cascade複合物包含：(a)編碼Cas7 (Csa2)多肽之核苷酸序列、編碼Cas8a1 (Csx13)多肽或Cas8a2 (Csx9)多肽之核苷酸序列、編碼Cas5多肽之核苷酸序列、編碼Csa5多肽之核苷酸序列、編碼Cas6a多肽之核苷酸序列、編碼Cas3'多肽之核苷酸序列及編碼不具有核酸酶活性之Cas3"多肽之核苷酸序列(I-A型)；(b)編碼Cas6b多肽之核苷酸序列、編碼Cas8b (Csh1)多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (Csh2)多肽之核苷酸序列及編碼Cas5多肽之核苷酸序列(I-B型)；(c)編碼Cas5d多肽之核苷酸序列、編碼Cas8c (Csd1)多肽之核苷酸序列及編碼Cas7 (Csd2)多肽之核苷酸序列(I-C型)；(d)編碼Casl Od (Csc3)多肽之核苷酸序列、編碼Csc2多肽之核苷酸序列、編碼Csc1多肽之核苷酸序列及編碼Cas6d多肽之核苷酸序列(I-D型)；(e)編碼Cse1 (CasA)多肽之核苷酸序列、編碼Cse2 (CasB)多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (CasC)多肽之核苷酸序列、編碼Cas5 (CasD)多肽之核苷酸序列及編碼Cas6e (CasE)多肽之核苷酸序列(I-E型)；及/或(f)編碼Cys1多肽之核苷酸序列、編碼Cys2多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (Cys3)多肽之核苷酸序列及編碼Cas6f多肽之核苷酸序列(I-F型)。

在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統對於目標細菌為外源性的。在一些實施例中，外源性I型CRISPR-Cas系統包含(a)編碼Cas7 (Csa2)多肽之核苷酸序列、編碼Cas8a1 (Csx13)多肽或Cas8a2 (Csx9)多肽之核苷酸序列、編碼Cas5多肽之核苷酸序列、編碼Csa5多肽之核苷酸序列、編碼Cas6a多肽之核苷酸序列、編碼Cas3'多肽之核苷酸序列及編碼不具有核酸酶活性之Cas3"多肽之核苷酸序列(I-A型)；(b)編碼Cas6b多肽之核苷酸序列、編碼Cas8b (Csh1)多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (Csh2)多肽之核苷酸序列及編碼Cas5多肽之核苷酸序列(I-B型)；(c)編碼Cas5d多肽之核苷酸序列、編碼Cas8c (Csd1)多肽之核苷酸序列及編碼Cas7 (Csd2)多肽之核苷酸序列(I-C型)；(d)編碼Casl Od (Csc3)多肽之核苷酸序列、編碼Csc2多肽之核苷酸序列、編碼Csc1多肽之核苷酸序列及編碼Cas6d多肽之核苷酸序列(I-D型)；(e)編碼Cse1 (CasA)多肽之核苷酸序列、編碼Cse2 (CasB)多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (CasC)多肽之核苷酸序列、編碼Cas5 (CasD)多肽之核苷酸序列及編碼Cas6e (CasE)多肽之核苷酸序列(I-E型)；及/或(f)編碼Cys1多肽之核苷酸序列、編碼Cys2多肽之核苷酸序列、編碼Cas7 (Cys3)多肽之核苷酸序列及編碼Cas6f多肽之核苷酸序列(I-F型)。

在一些實施例中，對於目標細菌為外源性的I型CRISPR-Cas系統包含編碼Cas5d多肽之核苷酸序列、編碼Cas8c (Csd1)多肽之核苷酸序列及編碼Cas7 (Csd2)多肽之核苷酸序列(I-C型)。 噬菌體

在一些實施例中，噬菌體為絕對溶解性噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為具有保留之溶原性基因之溫和噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為一些溶原性基因經移除、替代或不活化之溫和噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為溶原性基因經移除、替代或不活化之溫和噬菌體，從而使噬菌體溶解。

在一些實施例中，噬菌體靶向假單胞菌屬。在一些實施例中，噬菌體靶向綠膿桿菌。在一些實施例中，相對於其他細菌物種，噬菌體特異性靶向假單胞菌屬。在一些實施例中，噬菌體在不存在CRISPR-Cas系統之情況下靶向假單胞菌屬。在一些實施例中，噬菌體結合至脂多醣。在一些實施例中，噬菌體結合至IV型菌毛。在一些實施例中，噬菌體結合至外膜孔蛋白OprM。在一些實施例中，目標係指感染細菌之噬菌體。在一些實施例中，目標係指殺滅細菌之噬菌體。在一些實施例中，特異性目標係指感染第一細菌物種但不感染第二細菌物種之噬菌體。在一些實施例中，特異性目標係指殺滅第一細菌物種但不殺滅第二細菌物種之噬菌體。

在一些實施例中，本文中之噬菌體為感染假單胞菌屬之噬菌體或自感染假單胞菌屬之噬菌體工程化。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體包括表 5A中所列出之野生型普納病毒噬菌體亞型，其中噬菌體感染標有正號(+)之目標假單胞菌屬(例如噬菌體p1106感染b002548)。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體包括表 5A中所列出之工程化普納病毒噬菌體亞型，其中噬菌體感染標有正號(+)之目標假單胞菌屬(例如噬菌體p1106e003感染b002548)。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體包括野生型沙穆納病毒噬菌體亞型、工程化沙穆納病毒噬菌體亞型、野生型匹克茲病毒、野生型PhiKMV病毒或野生型布魯伊諾格病毒，例如如表 5B中所列，其中噬菌體感染標有正號(+)之目標假單胞菌屬。如表 5A中所列，野生型普納病毒噬菌體亞型可為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421及/或pb1，而工程化普納病毒噬菌體亞型可為p1106e003、p1587e002、p1835e002、p2037e002、p2363e003及/或p2421e002。如表 5B中所列，野生型沙穆納病毒噬菌體亞型可為p1772、p2131、p2132及/或p2973，工程化沙穆納病毒噬菌體亞型可為pb1e002、p1772e005、p2131e002、p2132e002及/或p2973e002，野生型匹克茲病毒噬菌體亞型可為p1194及/或p4430，野生型PhiKMV病毒噬菌體亞型可為p2167，且野生型布魯伊諾格病毒噬菌體亞型可為p1695及p3278。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Nankoku病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Abidjan病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Baikal病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Beetre病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Casadaban病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Citex病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Cysto病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Detre病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為El病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Holloway病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Kochitakasu病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Lituna病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Luzseptima病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Nipuna病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Pakpuna病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Pamex病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Paundecim病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Phitre病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Primolici病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Septimatre病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Stubbur病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Tertilici病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Yua病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體為Zicotria病毒。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體殺滅假單胞菌屬。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染金黃色葡萄球菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅金黃色葡萄球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染金黃色葡萄球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅金黃色葡萄球菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染肺炎克雷伯氏菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅肺炎克雷伯氏菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染肺炎克雷伯氏菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅肺炎克雷伯氏菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染糞腸球菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅糞腸球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染糞腸球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅糞腸球菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染陰溝腸桿菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅陰溝腸桿菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染陰溝腸桿菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅陰溝腸桿菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染鮑氏不動桿菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅鮑氏不動桿菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染鮑氏不動桿菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅鮑氏不動桿菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不感染表皮葡萄球菌。在一些實施例中，感染假單胞菌屬之噬菌體不殺滅表皮葡萄球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不感染表皮葡萄球菌。在一些實施例中，殺滅假單胞菌屬之噬菌體不殺滅表皮葡萄球菌。在一些實施例中，噬菌體之組合感染假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合感染表5A中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合感染表5B中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合感染表6B中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。在一些實施例中，噬菌體之組合殺滅假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合殺滅表5A中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合殺滅表5B中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。作為非限制性實例，該組合殺滅表6B中之至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的假單胞菌屬。

在一些實施例中，噬菌體存在於包含其他噬菌體之混合液中，其中噬菌體中之每一者不破壞混合液中之其他噬菌體的功能。

在一些實施例中，噬菌體為匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。在一些實施例中，噬菌體為匹克茲病毒。在一些實施例中，噬菌體為PhiKMV病毒。在一些實施例中，噬菌體為Brunyoghe病毒。在一些實施例中，噬菌體為沙穆納病毒。在一些實施例中，噬菌體為普納病毒。在一些實施例中，噬菌體包含CRISPR-Cas3系統。在一些實施例中，噬菌體包括但不限於p1106 (ATCC寄存編號BCRC970100)、p1194(FIRDI寄存編號BCRC970097)、p1587(ATCC寄存編號BCRC970101)、p1695(FIRDI寄存編號BCRC970082)、p1772(FIRDI寄存編號BCRC970096)、p1835(FIRDI寄存編號BCRC970079)、p2037(FIRDI寄存編號BCRC970103)、p2131(FIRDI寄存編號BCRC970097)、p2132(FIRDI寄存編號BCRC970098)、p2167(FIRDI寄存編號BCRC970092)、p2363(FIRDI寄存編號BCRC970094)、p2421(FIRDI寄存編號BCRC970095)、p2973(FIRDI寄存編號BCRC970099)、p3278(FIRDI寄存編號BCRC970093)、p4430(FIRDI寄存編號BCRC970083)或PB1(FIRDI寄存編號BCRC9701049)，其靶向假單胞菌屬。

在一些實施例中，噬菌體為p1106或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1106噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p1106e003 (FIRDI寄存編號BCRC970078)。在一些實施例中，噬菌體與p1106e003具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p1194或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1194具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1194噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體為p1587或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1587具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1587噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p1587e002 (FIRDI寄存編號BCRC970088)。在一些實施例中，噬菌體與01587e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p1695或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1695具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1695噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體為p1772或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1772具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1772噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p1772e005 (FIRDI寄存編號BCRC970080)。在一些實施例中，噬菌體與p1772e005具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p1835或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p1835具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1835噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p1835e002 (FIRDI寄存編號BCRC970088)。在一些實施例中，噬菌體與p1835e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2037或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2037具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2037噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2037e002 (FIRDI寄存編號BCRC970090)。在一些實施例中，噬菌體與p2037e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2131或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2131具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2131噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2131 (FIRDI寄存編號BCRC970081)。在一些實施例中，噬菌體與p2131具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2132或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2132具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2132噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2132e002 (FIRDI寄存編號BCRC970086)。在一些實施例中，噬菌體與p2132e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2167或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2167具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2167噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體為p2163或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2163具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2163噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2163e003 (FIRDI寄存編號BCRC970089)。在一些實施例中，噬菌體與p2163e003具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2421或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2421具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2421噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2141e002 (FIRDI寄存編號BCRC970087)。在一些實施例中，噬菌體與p2141e0002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p2973或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p2973具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p2973噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為p2973e002 (FIRDI寄存編號BCRC970084)。在一些實施例中，噬菌體與p2973e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體為p3278或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p3278具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p3278噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體為p4430或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與p4430具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之p1106噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為PB1或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。在一些實施例中，噬菌體與PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，噬菌體為包含CRISPR-Cas系統之PB1噬菌體。在一些實施例中，噬菌體為PB1e002 (FIRDI寄存編號BCRC970104)。在一些實施例中，噬菌體與PB1e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，噬菌體包含表 1A中所列之噬菌體或其保留靶向假單胞菌屬能力之突變體。

本文亦揭示包含兩種或更多種噬菌體之混合液。在一些實施例中，兩種或更多種噬菌體係選自由以下組成之譜系：匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。在一些實施例中，混合液包含至少六種噬菌體，其中噬菌體包含匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒及普納病毒。在一些實施例中，混合液包含至少一種普納病毒、至少一種沙穆納病毒、至少一種匹克茲病毒及至少一種布魯伊諾格病毒。在一些實施例中，混合液之至少一種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，混合液之至少兩種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，混合液之至少三種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，混合液之至少四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，混合液之至少一種噬菌體不包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，混合液之至少兩種噬菌體不包含CRISPR-Cas系統。

在一些實施例中，混合液包含至少兩種噬菌體，其中噬菌體包含p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。在一些實施例中，混合液包含第一噬菌體，該噬菌體與p1106e003具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，該噬菌體與p1835e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，該噬菌體與p1772e005具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，該噬菌體與p2131e002具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，該噬菌體與p1194具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，該噬菌體與p4430具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，該噬菌體與p1695具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，該噬菌體與p4430具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，該噬菌體與p1695具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1106、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1106、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1106、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1106、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1106、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1587具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1106、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1106、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1106、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1106、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1106、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1695具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1106、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1106、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1106、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1106、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1106、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1772具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1106、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1106、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1106、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1106、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1106、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p1835具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1106、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1106、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1106、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1106、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1106、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2037具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p1106、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p1106、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p1106、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p1106、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p1106、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2131具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p1106、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p1106、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p1106、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p1106、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p1106、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2132具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p1106、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p1106、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p1106、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p1106、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p1106、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2167具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p1106、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p1106、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p1106、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p1106、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p1106、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2363具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p1106、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p1106、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p1106、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p1106、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p1106、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2421具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p1106、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p1106、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p1106、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p1106、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p1106、p2973、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p2973具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p1106、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p1106、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p1106、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p1106、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p1106、p3278、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p3278具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p1106、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p1106、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p1106、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p1106、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p1106、p4430或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與p4430具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p1106或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p1106或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p1106或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p1106或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p1106或PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，第一噬菌體與PB1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，混合液包含第二噬菌體，其中第二噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第三噬菌體，其中第三噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第四噬菌體，其中第四噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第五噬菌體，其中第五噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，混合液包含第六噬菌體，其中第六噬菌體與p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或p1106具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，至少一種、兩種、三種或四種噬菌體包含CRISPR-Cas系統。在一些實施例中，至少一種或兩種噬菌體不包含CRISPR Cas系統。

在一些實施例中，所關注之噬菌體獲自環境來源或商業研究供應商。在一些實施例中，針對對抗細菌庫及其相關菌株之溶解活性篩選所獲得之噬菌體。在一些實施例中，針對噬菌體在所篩選細菌中產生原發性抗性之能力篩選對抗細菌庫及其相關菌株之噬菌體。 假單胞菌屬物種

在一些實施例中，細菌為假單胞菌屬。在一些實施例中，細菌為綠膿桿菌。

在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起、促進感染、疾病或病狀及/或引起其併發症，且本文所述之組合物及方法用於治療該感染、疾病或病狀。在一些實施例中，感染、疾病或病狀為急性或慢性的。在一些實施例中，感染、疾病或病狀為局部或全身性的。在一些實施例中，感染、疾病或病狀為特發性的。在一些實施例中，感染、疾病或病狀係經由包括但不限於以下之方式獲得：呼吸道吸入；攝入；皮膚及傷口感染；血流感染；中耳感染；胃腸道感染；腹膜感染；泌尿道感染；泌尿生殖道感染；口腔軟組織感染；腹內感染；表皮或黏膜吸收；眼部感染(包括隱形眼鏡污染)；心內膜炎；囊腫性纖維化中之感染；諸如關節假體、牙齒植入體、導管及心臟植入體之留置醫療裝置之感染；性接觸；及/或醫院獲得性及呼吸器相關細菌性肺炎。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起泌尿道感染。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重發炎疾病。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重自體免疫疾病。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重發炎性腸病(IBD)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重牛皮癬。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重牛皮癬性關節炎(PA)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重類風濕性關節炎(RA)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重全身性紅斑性狼瘡症(SLE)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重多發性硬化症(MS)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重重症肌無力。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重血管炎。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重癌症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重癌症進展。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重癌轉移。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重對癌症療法之抗性。在一些實施例中，用於解決癌症之療法包括但不限於化學療法、免疫療法、激素療法、靶向藥物療法及/或放射線療法。在一些實施例中，癌症在包括但不限於以下之器官中產生：肛門、膀胱、血液及血液組分、骨骼、骨髓、腦、乳房、子宮頸、結腸及直腸、食道、腎臟、喉、淋巴系統、肌肉(亦即軟組織)、口腔及咽、卵巢、胰臟、前列腺、皮膚、小腸、胃、睾丸、甲狀腺、子宮及/或外陰。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重中樞神經系統(CNS)病症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重注意力不足/過動症(ADHD)。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重自閉症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重躁鬱症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重嚴重抑鬱症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重癲癇症。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重神經退化性病症，包括但不限於阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)及/或帕金森氏病(Parkinson's disease)。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，例如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療上文所述之任何疾病或病狀或與疾病或病狀相關之症狀。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液與用於治療或減輕與疾病相關之一或多種病狀之一或多種其他藥物組合用於治療上文所述之疾病或病狀，或與上文所述之疾病相關之症狀。

囊腫性纖維化及囊腫性纖維化相關支氣管擴張症與綠膿桿菌感染相關。參見例如P. Farrell等人, Radiology, 第252卷, 第2期, 第534-543頁 (2009)。在一些實施例中，向患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者投與一或多種噬菌體。在一些實施例中，向患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者投與兩種或更多種噬菌體之組合。在一些實施例中，向患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者投與噬菌體使得患者之細菌負荷降低。在一些實施例中，細菌負荷降低使得患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者得到臨床改善。

非囊腫性纖維化支氣管擴張症與綠膿桿菌感染相關。參見例如R. Wilson等人, Respiratory Medicine, 第117卷, 第179-189頁 (2016)。在一些實施例中，向患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症之患者投與一或多種噬菌體。在一些實施例中，向患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症之患者投與兩種或更多種噬菌體之組合。在一些實施例中，向患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症之患者投與噬菌體使得患者之細菌負荷降低。在一些實施例中，細菌負荷降低使得患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症之患者得到臨床改善。

在一些實施例中，向患有綠膿桿菌感染或由綠膿桿菌直接或間接引起之疾病的個體投與本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療綠膿桿菌之血流感染。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液適用於治療綠膿桿菌之呼吸道吸入、攝入、皮膚及傷口感染。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療與綠膿桿菌感染相關之中耳感染；胃腸道感染；腹膜感染；尿道感染；泌尿生殖道感染；口腔軟組織感染；腹內感染；表皮或黏膜吸收；眼部感染(包括隱形眼鏡污染)；泌尿道感染；心內膜炎；囊腫性纖維化中之感染；諸如關節假體、牙齒植入體、導管及心臟植入體之留置醫療裝置之感染；性接觸；及/或醫院獲得性及呼吸器相關細菌性肺炎。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重發炎疾病，且本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療發炎疾病。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重自體免疫疾病，且本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療自體免疫疾病。在一些實施例中，假單胞菌屬物種引起及/或加重發炎性腸病(IBD)，且本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療IBD。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療疾病，降低細菌負荷。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療疾病，減輕發炎。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療疾病，減輕與細菌感染相關之一或多種症狀，或細菌感染之一或多種後遺症。

在一些實施例中，治療以靜脈內或肌內藥物形式投與。在一些實施例中，經由經口途徑投與治療。在一些實施例中，經由霧化器投與治療。在一些實施例中，經由患者可操作之霧化器投與治療。在一些實施例中，經由定量霧化器投與治療。在一些實施例中，治療與一或多種其他藥物或治療劑組合投與。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療癌症。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療肺炎。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療囊腫性纖維化支氣管擴張症。在一些實施例中，向患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者投與噬菌體使得患者之細菌負荷降低。在一些實施例中，細菌負荷降低使得患有囊腫性纖維化支氣管擴張症之患者得到臨床改善。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。在一些實施例中，治療以靜脈內或肌內藥物形式投與。在一些實施例中，經由經口途徑投與治療。在一些實施例中，經由霧化器投與治療。在一些實施例中，經由患者可操作之霧化器投與治療。在一些實施例中，經由定量霧化器投與治療。在一些實施例中，治療與一或多種其他藥物或治療劑組合投與。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療非囊腫性纖維化支氣管擴張症。在一些實施例中，向患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症或纖維化相關支氣管擴張症之患者投與噬菌體使得患者之細菌負荷降低。在一些實施例中，細菌負荷降低使得患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症纖維化相關支氣管擴張症之患者得到臨床改善。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。在一些實施例中，治療以靜脈內或肌內藥物形式投與。在一些實施例中，經由經口途徑投與治療。在一些實施例中，經由霧化器投與治療。在一些實施例中，經由患者可操作之霧化器投與治療。在一些實施例中，經由定量霧化器投與治療。在一些實施例中，治療與一或多種其他藥物或治療劑組合投與。

在一些實施例中，治療包含組合物，例如包含一或多種噬菌體，例如噬菌體混合液之醫藥組合物，其中組合物中之噬菌體，例如噬菌體混合液來自由以下組成之譜系：匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。在一些實施例中，組合物包含噬菌體混合液511。在一些實施例中，組合物包含噬菌體混合液PACK512。在一些實施例中，本文提供醫藥組合物，其中醫藥組合物包含至少六種噬菌體，其中噬菌體來自由以下組成之群：p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。 插入位點

在一些實施例中，將核酸序列插入噬菌體中保留噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，將核酸序列插入噬菌體基因體中。在一些實施例中，在所關注之操縱子末端之轉錄終止子位點處將核酸序列插入噬菌體基因體中。在一些實施例中，將核酸序列插入噬菌體基因體中作為一或多個經移除非必需基因之替代。在一些實施例中，將核酸序列插入噬菌體基因體中作為一或多個經移除溶原性基因之替代。在一些實施例中，用核酸序列替代非必需及/或溶原性基因不影響噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，用核酸序列替代非必需及/或溶原性基因保留噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，用核酸序列替代非必需及/或溶原性基因增強噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，用核酸序列替代非必需及/或溶原性基因使得溶原性噬菌體溶解。

在一些實施例中，在第一位置將核酸序列引入噬菌體基因體中，同時在分開的位置自噬菌體基因體分開移除一或多個非必需及/或溶原性基因及/或使其不活化。在一些實施例中，在第一位置將核酸序列引入噬菌體中，同時在多個分開的位置自噬菌體基因體分開移除一或多個非必需及/或溶原性基因及/或使其不活化。在一些實施例中，一或多個非必需及/或溶原性基因之移除及/或不活化不影響噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，一或多個非必需及/或溶原性基因之移除及/或不活化保持噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，一或多個非必需及/或溶原性基因之移除使得溶原性噬菌體成為溶解性噬菌體。

在一些實施例中，噬菌體為藉由前述方式中任一者已賦予溶解之溫和噬菌體。在一些實施例中，溫和噬菌體係藉由一或多個溶原性基因之移除、替代或失活賦予溶解。在一些實施例中，噬菌體之溶解活性歸因於至少一個溶原性基因之移除、替代或失活。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起維持溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起建立溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因在噬菌體中起建立溶原循環及維持溶原循環之作用。在一些實施例中，溶原性基因為抑制因子基因。在一些實施例中，溶原性基因為 cI抑制因子基因。在一些實施例中，溶原性基因為活化因子基因。在一些實施例中，溶原性基因為 cII基因。在一些實施例中，溶原性基因為 lexA基因。在一些實施例中，溶原性基因為 int(整合酶)基因。在一些實施例中，使兩個或更多個溶原性基因移除、替代或不活化以引起噬菌體溶原性循環之遏止及/或溶解循環之誘發。在一些實施例中，溫和噬菌體藉由插入一或多個溶解基因而賦予溶解。在一些實施例中，溫和噬菌體藉由插入一或多個有助於誘導溶解循環之基因而賦予溶解。在一些實施例中，溫和噬菌體藉由改變一或多個有助於誘導溶解循環之基因之表現而賦予溶解。在一些實施例中，溫和噬菌體自溶原性噬菌體在表型上變成溶解性噬菌體。在一些實施例中，溫和噬菌體藉由環境改變而賦予溶解。在一些實施例中，環境改變包括但不限於改變溫度、pH或營養物；暴露於抗生素、過氧化氫、外來DNA或DNA損傷劑；存在有機碳及存在重金屬(例如呈鉻(VI)形式)。在一些實施例中，防止賦予溶解之溫和噬菌體恢復至溶原狀態。在一些實施例中，藉助於首個引入之CRISPR陣列之自靶向活性防止賦予溶解之溫和噬菌體恢復至溶原狀態。在一些實施例中，藉助於引入額外CRIPSR陣列來防止賦予溶解之溫和噬菌體恢復至溶原狀態。在一些實施例中，除了由噬菌體之溶解活性及/或第一或第二CRISPR陣列之活性所引起之細胞死亡以外，該噬菌體不賦予假單胞菌屬物種任何新特性。

在一些實施例中，藉由化學、生物化學及/或任何適合之方法達成一或多個非必需及/或溶原性基因之替代、移除、不活化或其任何組合。在一些實施例中，藉由任何適合之化學、生物化學及/或物理方法藉由同源重組達成一或多個溶解基因之插入。 非必需基因

在一些實施例中，待自噬菌體移除及/或替代之非必需基因為對於噬菌體之存活而言非必需之基因。在一些實施例中，待自噬菌體移除及/或替代之非必需基因為對於誘導及/或維持溶解循環而言非必需之基因。 轉錄活化因子

在一些實施例中，核酸序列進一步包含轉錄活化因子。在一些實施例中，經編碼之轉錄活化因子調節假單胞菌屬物種內之所關注基因的表現。在一些實施例中，轉錄活化因子活化假單胞菌屬物種內之所關注基因的表現，無論基因為外源性或內源性的。在一些實施例中，轉錄活化因子藉由破壞目標細菌內之一或多種抑制性元件之活性來活化目標細菌內之所關注基因的表現。在一些實施例中，抑制性元件包含轉錄抑制因子。在一些實施例中，抑制性元件包含整體轉錄抑制因子。在一些實施例中，抑制性元件為組蛋白樣類核結構(H-NS)蛋白或其同系物或功能片段。在一些實施例中，抑制性元件為白胺酸反應調節蛋白(LRP)。在一些實施例中，抑制性元件為CodY蛋白。

在一些細菌中，CRISPR-Cas系統不充分表現且在大部分環境條件下視為靜止。在此等細菌中，CRISPR-Cas系統之調節為轉錄調節劑之活性的結果，該等轉錄調節劑為例如廣泛涉及宿主基因體之轉錄調節的組蛋白樣類核結構(H-NS)蛋白。H-NS藉由沿AT富集位點多聚合使得DNA彎曲來對宿主轉錄調節加以控制。在一些細菌中，CRISPR-Cas3操縱子之調節係藉由H-NS調節。

類似地，在一些細菌中，CRISPR-Cas系統之抑制藉由抑制性元件(例如白胺酸反應調節蛋白(LRP))控制。LRP已牽涉結合至轉錄開始位點之上游及下游區。值得注意地，LRP在調節CRISPR-Cas系統之表現方面的活性在細菌與細菌範圍內變化。不同於具有廣泛物種間抑制活性之H-NS，LRP已展示有差異地調節宿主CRISPR-Cas系統之表現。因而，在一些情況下，LRP反映調節不同細菌中CRISPR-Cas系統表現之宿主特異性方式。

在一些情況下CRISPR-Cas系統之抑制亦藉由抑制性元件CodY控制。CodY為經由DNA結合起作用之GTP感應轉錄抑制因子。GTP之胞內濃度充當環境營養狀態之指標。在正常培養條件下，GTP為充足的且與CodY結合以抑制轉錄活性。然而，GTP濃度減少，CodY變得在結合DNA方面活性較小，進而使得先前經抑制基因之轉錄得以進行。因而，CodY充當嚴格的整體轉錄抑制因子。

在一些實施例中，轉錄活化因子為LeuO多肽、其任何同系物或功能片段、 leuO編碼序列或上調LeuO之試劑。在一些實施例中，轉錄活化因子包含LeuO之任何直系同源物或功能等效物。在一些細菌中，LeuO藉由充當對細菌之環境營養狀態起反應之整體轉錄調節因子而起作用對抗H-NS。在正常條件下，LeuO不充分表現。然而，在胺基酸不足及/或達至細菌生命週期中之生長停滯期情況下，LeuO上調。LeuO之表現增加導致其在疊加啟動子區拮抗H-NS以影響基因表現。LeuO之過度表現上調CRISPR-Cas系統之表現。

在一些實施例中，LeuO之表現導致破壞抑制性元件。在一些實施例中，由LeuO之表現所致之抑制性元件的破壞去除CRISPR-Cas系統之轉錄抑制。在一些實施例中，LeuO之表現去除由H-NS之活性所致的CRISPR-Cas系統之轉錄抑制。在一些實施例中，由LeuO之表現所致之抑制性元件的破壞引起CRISPR-Cas系統之表現增加。在一些實施例中，由抑制性元件之破壞所致的CRISPR-Cas系統之表現增加引起包含CRISPR陣列之核酸序列之CRISPR-Cas加工的增加，該抑制性元件之破壞由LeuO之表現引起。在一些實施例中，由抑制性元件之破壞所致的CRISPR-Cas系統之表現增加引起包含CRISPR陣列之核酸序列之CRISPR-Cas加工的增加，從而增加CRISPR陣列對抗細菌之致死性水準，該抑制性元件之破壞由LeuO之表現引起。在一些實施例中，轉錄活化因子引起噬菌體及/或CRISPR-Cas系統之活性增加。 調節元件

在一些實施例中，核酸序列與多種啟動子、終止子及其他調節元件可操作地相關聯以在各種生物體或細胞中表現。在一些實施例中，核酸序列進一步包含前導序列。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列。在一些實施例中，至少一個啟動子及/或終止子可操作地連接於CRISPR陣列。使用適用於本發明任何啟動子，且其包括例如對於所關注之生物體起作用之啟動子以及組成性、誘導性、發育調節性、組織特異性/較佳啟動子及類似啟動子，如本文所揭示。如本文所用之調節元件為內源性或異源性的。在一些實施例中，將衍生自受試生物體之內源性調節元件插入其不天然存在之基因背景中(例如基因體中與自然界中所發現不同的位置)，進而產生重組或非天然核酸。

在一些實施例中，核酸序列之表現為組成性、誘導性、時間調節、發育調節或化學調節的。在一些實施例中，藉由將核酸序列可操作地連接至在所關注生物體中起作用之啟動子而使得核酸序列之表現為組成性、誘導性、時間調節、發育調節或化學調節的。在一些實施例中，藉由將核酸序列可操作地連接至在所關注生物體中起作用之誘導性啟動子而使得抑制為可逆的。本文所揭示之啟動子之選擇取決於用於表現之數量、時間及空間要求且亦取決於待轉型之宿主細胞而變化。

用於本文所揭示之方法、噬菌體及組合物之例示性啟動子包括在細菌中起作用之啟動子。舉例而言，L-阿拉伯糖(L-arabinose)誘導性( araBAD 、 P _BAD )啟動子、任何 lac啟動子、L-鼠李糖(L-rhamnose)誘導性(rhaPBAD)啟動子、T7 RNA聚合酶啟動子、 trc啟動子、 tac啟動子、λ噬菌體啟動子(p _Lp _L-9G-50)、無水四環素誘導性( tetA)啟動子、 trp 、 Ipp 、 phoA 、 recA 、 proU 、 cst-1 、 cadA 、 nar 、 Ipp-lac 、 cspA 、 11-lac操縱子、T3- lac操縱子、T4基因 32、T5- lac操縱子、 nprM-lac操縱子、Vhb、蛋白A、棒狀桿菌-大腸桿菌樣啟動子、 thr 、 horn、白喉毒素(diphtheria toxin)啟動子、 sigA 、 sigB 、 nusG 、 SoxS 、 katb 、 a- 澱粉酶 (Pamy) 、 Ptms 、 P43(由兩個重疊RNA聚合酶σ因子識別位點σA、σB構成)、 Ptms 、 P43 、 rplK-rplA、鐵氧化還原蛋白啟動子及/或木糖啟動子。在一些實施例中，啟動子為BBa_J23102啟動子。在一些實施例中，啟動子在大範圍之細菌，諸如BBa_J23104、BBa_J23109中起作用。在一些實施例中，啟動子源自目標細菌，諸如內源性CRISPR啟動子、內源性 Cas操縱子啟動子、p16、plpp或ptat。在一些實施例中，啟動子為噬菌體啟動子，諸如gp105或gp245之啟動子。

在一些實施例中，啟動子與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少或約70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些情況下，啟動子與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少或約95%同源性。在一些情況下，啟動子與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少或約97%同源性。在一些情況下，啟動子與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少或約99%同源性。在一些情況下，啟動子與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有100%同源性。在一些情況下，啟動子包含具有SEQ ID NO: 1-11中之任一者之至少或約3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或超過50個核苷酸的至少一部分。在一些情況下，啟動子包含具有SEQ ID NO: 1-11中之任一者之至少或約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115 120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或超過215個核苷酸的至少一部分。

在一些實施例中，使用誘導性啟動子。在一些實施例中，化學調節性啟動子用於經由應用外源性化學調節因子來調變生物體中之基因的表現。化學調節性啟動子之使用使得能夠僅在例如用誘導化學物質處理生物體時合成由核酸序列編碼之RNA及/或多肽。在使用化學誘導性啟動子之一些實施例中，化學品之應用誘導基因表現。在使用化學抑制性啟動子之一些實施例中，化學品之應用抑制基因表現。在一些實施例中，啟動子為光誘導性啟動子，其中特定波長光之應用誘導基因表現。在一些實施例中，啟動子為光抑制性啟動子，其中特定波長光之應用抑制基因表現。 表現卡匣

在一些實施例中，核酸序列為表現卡匣或在表現卡匣中。在一些實施例中，表現卡匣經設計以表現本文所揭示之核酸序列。在一些實施例中，核酸序列為編碼CRISPR-Cas系統之組分的表現卡匣。在一些實施例中，核酸序列為編碼I型CRISPR-Cas系統之組分的表現卡匣。在一些實施例中，核酸序列為編碼可操作CRISPR-Cas系統之表現卡匣。在一些實施例中，核酸序列為編碼I型CRISPR-Cas系統之可操作組分，包括Cascade及Cas3的表現卡匣。在一些實施例中，核酸序列為編碼I型CRISPR-Cas系統之可操作組分，包括crRNA、Cascade及Cas3的表現卡匣。

在一些實施例中，包含所關注之核酸序列的表現卡匣為嵌合的，意謂其組分中之至少一者相對於其他組分中之至少一者為異源的。在一些實施例中，表現卡匣為天然存在的但已以適用於異源表現之重組形式獲得。

在一些實施例中，表現卡匣包括在所選宿主細胞中起作用之轉錄及/或轉譯終止區(亦即終止區)。在一些實施例中，終止區負責終止超出所關注之異源核酸序列的轉錄及正確的mRNA聚腺苷酸化。在一些實施例中，終止區對於轉錄起始區為天然的，對於可操作地連接之所關注核酸序列為天然的，對於宿主細胞為天然的或衍生自另一來源(亦即對於啟動子、對於所關注核酸序列、對於宿主或其任何組合為外來或異源的)。在一些實施例中，終止子可操作地連接至本文所揭示之核酸序列。

在一些實施例中，表現卡匣包括用於可選標記之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列編碼可選擇或可篩選標記，取決於標記是否賦予藉由化學方式，諸如藉由使用選擇劑(例如抗生素)選擇之特性，或取決於標記是否僅為經由觀測或測試，諸如藉由篩選(例如螢光)識別之特性。載體

除表現卡匣以外，本文所揭示之核酸序列(例如包含CRISPR陣列之核酸序列)亦與載體結合使用。載體包含核酸分子，該核酸分子包含待轉移、遞送或引入之核苷酸序列。載體之一般類別之非限制性實例包括但不限於病毒載體、質體載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、黏質體載體、福斯質體載體、噬菌體、人工染色體、農桿菌二元載體，其呈雙股或單股線性或圓形形式，其可為或可不為自傳遞或可移動的。載體藉由整合至細胞基因體中或在染色體外存在(例如具有複製起點之自主複製質體)而轉型原核或真核宿主。另外，包括穿梭載體，其意謂能夠天然或藉由設計在兩種不同宿主生物體中複製的DNA載體。在一些實施例中，穿梭載體在放線菌及細菌及/或真核生物中複製。在一些實施例中，載體中之核酸處於適當啟動子或用於宿主細胞中之轉錄的其他調節元件之控制下且與其可操作地連接。在一些實施例中，載體為雙功能性表現載體，其在多種宿主中有作用。 密碼子最佳化

在一些實施例中，核酸序列經密碼子最佳化以在任何所關注物種中表現。密碼子最佳化涉及使用物種特異性密碼子使用表針對密碼子使用偏好修飾核苷酸序列。密碼子使用表係基於用於所關注之物種的大部分高度表現基因之序列分析產生。當在核中表現核苷酸序列時，基於用於所關注之物種的高度表現核基因之序列分析產生密碼子使用表。藉由比較物種特異性密碼子使用表與存在於天然多核苷酸序列中之密碼子來確定核苷酸序列之修飾。核苷酸序列之密碼子最佳化產生一種核苷酸序列，其與原生核苷酸序列具有低於100%一致性(例如50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及類似比率)但其仍編碼與由原始核苷酸序列編碼之多肽具有相同功能的多肽。在一些實施例中，本發明之核酸序列經密碼子最佳化以在所關注之生物體/物種中表現。轉型

在一些實施例中，本文所揭示之核酸序列及/或表現卡匣短暫表現及/或穩定併入至宿主生物體之基因體中。在一些實施例中，藉由熟習此項技術者已知之任何方法將本文中所揭示之核酸序列及/或表現卡匣引入細胞中。轉型之示例性方法包括經由勝任細胞之電致孔轉型、勝任細胞之被動吸收、勝任細胞之化學轉型以及使得核酸引入細胞中的任何其他電子、化學、物理(機械)及/或生物機制，包括其任何組合。在一些實施例中，細胞之轉型包含核轉型。在一些實施例中，細胞之轉型包含質體轉型及綴合。

在一些實施例中，當引入超過一個核酸序列時，將核苷酸序列組裝作為單一核酸構築體之部分或作為各別核酸構築體，且位於相同或不同核酸構築體上。在一些實施例中，在單一轉型事件中或在各別轉型事件中將核苷酸序列引入所關注之細胞中。 抗微生物劑及肽

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體進一步經基因修飾以表現抗菌肽、抗菌肽之功能片段或溶解基因。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體表現本文所揭示之至少一種抗微生物劑或肽。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體包含編碼酶生物(enzybiotic)之核酸序列，其中核酸序列之蛋白產物靶向抗噬菌體細菌。在一些實施例中，噬菌體包含編碼酶之核酸，該等酶協助分解或降解生物膜基質。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體包含編碼Dispersin D胺基肽酶、澱粉酶、醣酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、肽麩醯胺酸酶、過氧化酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解、核糖核酸酶、轉麩醯胺酸酶、木聚糖酶或溶解酶之核酸。在一些實施例中，酶選自由以下組成之群：纖維素酶，例如纖維素酶之醣基羥化酶家族，例如亦稱為纖維素酶A之酶的醣基羥化酶5家族；聚葡糖胺(PGA)解聚酶；及結腸酸解聚酶，諸如1,4-L-岩藻糖苷水解酶、可拉酸、解聚褐藻酸酶、DNA酶I或其組合。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體分泌本文所揭示之酶。

在一些實施例中，抗微生物劑或肽由本文所揭示之噬菌體表現及/或分泌。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體分泌及表現抗生素，諸如安比西林(ampicillin)、青黴素(penicillin)、青黴素衍生物、頭孢菌素(cephalosporin)、單醯胺菌素(monobactam)、碳青黴烯(carbapenem)、氧氟沙星(ofloxacin)、環丙沙星(ciproflaxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)或本文所揭示之任何抗生素。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體包含編碼抗菌肽之核酸序列，表現抗菌肽或分泌輔助或增強假單胞菌屬物種殺滅的肽。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體包含編碼肽之核酸序列、編碼抗菌肽之核酸序列，表現抗菌肽或分泌輔助或增強第一及/或第二I型CRISPR-Cas系統之活性的肽。 使用方法

在某些實施例中，本文揭示殺滅假單胞菌屬物種之方法，其包含向假單胞菌屬物種中引入本文所揭示之噬菌體中之任一者。

在某些實施例中，本文進一步揭示修飾細菌細胞混合群體之方法，該混合群體具有包含必需基因中之目標核苷酸序列的第一細菌物種及不包含必需基因中之目標核苷酸序列的第二細菌物種，該方法包含向混合群體中引入本文所揭示之任何噬菌體之細菌細胞。

在某些實施例中，本文亦揭示治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向個體投與本文所揭示之任何噬菌體。

在一些實施例中，假單胞菌屬僅藉由噬菌體之溶解活性殺滅。在一些實施例中，假單胞菌屬僅藉由CRISPR-Cas系統之活性殺滅。在一些實施例中，假單胞菌屬物種藉由用CRISPR-Cas系統加工CRISPR陣列而被殺滅，以產生能夠引導基於CRISPR-Cas之核酸內切酶活性及/或在細菌之目標基因中之目標核苷酸序列處溶解的經加工crRNA。

在一些實施例中，假單胞菌屬物種藉由噬菌體之溶解活性與I型CRISPR-Cas系統之活性的組合殺滅。在一些實施例中，假單胞菌屬物種藉由I型CRISPR-Cas系統之活性殺滅，與噬菌體之溶解活性無關。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統之活性補充或增強噬菌體之溶解活性。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統之活性及噬菌體之溶解活性係加性的。

在一些實施例中，噬菌體之溶解活性與I型CRISPR-Cas系統之活性係協同的。在一些實施例中，協同活性被定義為導致比噬菌體之溶解活性及I型CRISPR-Cas系統之加性組合更高水準之噬菌體殺滅的活性。在一些實施例中，噬菌體之溶解活性係藉由噬菌體之濃度調變。在一些實施例中，I型CRISPR-Cas系統之活性係藉由噬菌體之濃度調變。

在一些實施例中，藉由增加向細菌投與之噬菌體的濃度調變細菌之協同殺滅以使得藉由噬菌體之溶解活性比藉由第一CRISPR-Cas系統之活性更有利於殺滅。在一些實施例中，藉由降低向細菌投與之噬菌體的濃度調變細菌之協同殺滅以使得藉由噬菌體之溶解活性比藉由CRISPR-Cas系統之活性更不利於殺滅。在一些實施例中，在低濃度下，溶解複製引起目標細菌之擴增及殺滅。在一些實施例中，在較高濃度下，噬菌體之擴增並非所需的。在一些實施例中，藉由改變間隔子之數目、長度、組成、一致性或其任何組合從而增加CRISPR陣列之致死性來調變細菌之協同殺滅，以使得藉由CRISPR-Cas系統之活性比藉由噬菌體之溶解活性更有利於殺滅。在一些實施例中，藉由改變間隔子之數目、長度、組成、一致性或其任何組合從而降低CRISPR陣列之致死性來調變細菌之協同殺滅，以使得藉由CRISPR-Cas系統之活性比藉由噬菌體之溶解活性更不利於殺滅。

在一個態樣中，本文提供一種治療個體之假單胞菌屬感染的方法，該方法包含向個體投與包含噬菌體之組合物，其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列，該系統藉由靶向及降解假單胞菌屬細菌基因體而引起細胞死亡。在一些實施例中，靶向假單胞菌屬細菌之CRISPR-Cas系統包含CRISPR陣列，該陣列包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補的間隔序列；Cascade多肽；及Cas3多肽。在一些實施例中，一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。在一些實施例中，至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。在一些實施例中，重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含編碼序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。在一些實施例中，啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。在一些實施例中，目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。

在一個實施例中，必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA或 metK。在一些實施例中，Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系統、I-B型CRISPR-Cas系統、I-C型CRISPR-Cas系統、I-D型CRISPR-Cas系統、I-E型CRISPR-Cas系統或I-F型CRISPR-Cas系統之Cascade複合物。在一些實施例中，Cascade複合物包含：(i) Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽及Cas6a多肽，其中Cas3多肽包含Cas3'多肽及不具有核酸酶活性之Cas3''多肽(I-A型CRISPR-Cas系統)；(ii) Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽及Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系統)；(iii) Cas5d多肽、Cas8c多肽及Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系統)；(iv) Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系統)；(v) Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽及Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系統)；(vi) Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽及Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。在一些實施例中，核酸序列進一步包含啟動子序列。

在一個實施例中，本文提供一種治療罹患假單胞菌屬感染之所選個體群的方法。在一個實施例中，個體難以用一或多種通常實踐之療法，例如包含一或多種抗生素化合物之療法治療。

在一個實施例中，將所選個體群鑑別為感染假單胞菌屬之MDR菌株的個體。在一個實施例中，將所選個體群鑑別為免疫功能不全的個體。在一些實施例中，感染為院內感染。在一些實施例中，感染持續性或復發性感染。在一些實施例中，個體有症狀。在一些實施例中，個體罹患慢性假單胞菌屬誘導之感染及疾病。在一個實施例中，組合物以單次劑量形式向個體投與一次。

在一些實施例中，本文提供一種治療罹患假單胞菌屬感染之個體的方法，其藉由投與組合物，例如包含一或多種噬菌體，例如噬菌體混合液之醫藥組合物，其中組合物中之噬菌體，例如噬菌體混合液來自由以下組成之譜系：匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。在一些實施例中，組合物包含噬菌體混合液511。在一些實施例中，組合物包含噬菌體混合液PACK512。在一些實施例中，本文提供醫藥組合物，其中醫藥組合物包含至少六種噬菌體，其中噬菌體來自由以下組成之群：p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。在一些實施例中，本文所揭示之組合物，諸如本文所述之一或多種噬菌體、工程化噬菌體或噬菌體混合液用於治療癌症。在一些實施例中，噬菌體選自表1A、表5A及/或表5B。

在一些實施例中，治療以靜脈內或肌內藥物形式投與。在一些實施例中，經由經口途徑投與治療。在一些實施例中，經由霧化器投與治療。在一些實施例中，經由患者可操作之霧化器投與治療。在一些實施例中，經由定量霧化器投與治療。

在一些實施例中，治療與一或多種其他藥物或治療劑，例如抗生素，諸如雷帕黴素組合投與。在一些實施例中，與包含一或多種噬菌體之組合物一起共投與之例示性治療劑亦可為抗生素，諸如安比西林、青黴素、青黴素衍生物、頭孢菌素、單醯胺菌素、碳青黴烯、氧氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、諾氟沙星、洛美沙星、曲伐沙星、莫西沙星、司帕沙星、吉米沙星、帕珠沙星或本文所揭示之任何抗生素。在一些實施例中，額外治療劑包含用於改良呼吸道功能之藥物。在一些實施例中，額外治療劑包含用於降低呼吸道反應性之藥物。在一些實施例中，額外治療劑包含用於減少呼吸道發炎之藥物。在一些實施例中，額外治療劑包含支氣管擴張劑。在一些實施例中，額外治療劑包含用於提高氧可用性之藥物。在一些實施例中，額外治療劑包含用於減少呼吸道黏液生成之藥物。在一些實施例中，額外治療劑包含DNA酶。在一些實施例中，額外治療劑為鹽水。在一些實施例中，額外治療劑為包含咳嗽練習之治療方法，例如用於治療囊腫性纖維化。

在一個實施例中，向個體投與組合物超過一次，例如多次劑量。在一個實施例中，向個體投與2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個劑量之組合物。在一個實施例中，一天一次、2天一次、3天一次、4天一次、5天一次、6天一次或一週一次地向個體投與組合物。在一個實施例中，10天一次地向個體投與組合物。在一個實施例中，12天一次地向個體投與組合物。在一個實施例中，2週一次地向個體投與組合物。在一個實施例中，3週一次地向個體投與組合物。在一個實施例中，1個月一次地向個體投與組合物。

在一個實施例中，經一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月或更長時間之時段向個體投與多次劑量之第一組合物。

在一個態樣中，本文提供一種治療個體之假單胞菌屬感染的方法，該方法包含向個體投與包含噬菌體之第一組合物，其中噬菌體包含編碼靶向假單胞菌屬細菌之I型CRISPR-Cas系統的核酸序列；及向個體投與第二治療劑。在一些實施例中，第二治療劑為抗生素或抗菌組合物。在一個實施例中，第一組合物及第二治療劑在同一天投與。在一個實施例中，第一組合物及第二治療劑在不同天投與。 投與途徑及劑量

本文所揭示之組合物之投與劑量及持續時間將視多種因素而定，包括個體之年齡、個體之體重及噬菌體之耐受性。在一些實施例中，通過動脈內、靜脈內、尿道內、肌內、經口、皮下、藉由吸入或其任何組合向個體投與本文所揭示之噬菌體。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體藉由經口投與向個體投與。在一些實施例中，本文揭示之噬菌體藉由局部、皮膚、經皮、經黏膜、植入、舌下、頰內、經直腸、經陰道、經眼、經耳或經鼻投與向患者投與。在一些實施例中，本文揭示之噬菌體藉由前述投與途徑之任何組合向個體投與。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體藉由吸入向個體投與。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體藉由使用霧化器吸入向個體投與。

在一些實施例中，本文所述之組合物及方法係用於治療肺部感染或疾病。在一些實施例中，肺部感染或疾病為囊腫性纖維化。在一些實施例中，向患有囊腫性纖維化或囊腫性纖維化相關支氣管擴張症之患者投與包含噬菌體之組合物係經由霧化器。在一些實施例中，經由患者可操作之霧化器投與治療。在一些實施例中，經由定量霧化器投與治療。在一些實施例中，治療與一或多種其他藥物或治療劑，例如抗生素或支氣管擴張劑組合投與。在一些實施例中，治療為如本文所述之噬菌體、噬菌體組合物及/或噬菌體混合液。舉例而言，包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695之組合物。組合物可在用於經肺遞送之可霧化調配物中。

在一些實施例中，向個體投與10 ³與10 ²⁰PFU之間的噬菌體劑量。在一些實施例中，向個體投與10 ³與10 ¹⁰PFU之間的噬菌體劑量。在一些實施例中，向個體投與10 ⁶與10 ²⁰PFU之間的噬菌體劑量。在一些實施例中，向個體投與10 ⁶與10 ¹⁰PFU之間的噬菌體劑量。舉例而言，在一些實施例中，向個體投與包含10 ³與10 ¹¹PFU之間的量之噬菌體之組合物。在一些實施例中，向個體投與包含約10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹、10 ¹⁰、10 ¹¹、10 ¹²、10 ¹³、10 ¹⁴、10 ¹⁵、10 ¹⁶、10 ¹⁷、10 ¹⁸、10 ¹⁹、10 ²⁰、10 ²¹、10 ²²、10 ²³、10 ²⁴PFU或更大量的噬菌體之組合物。在一些實施例中，向個體投與包含小於10 ¹PFU之量的噬菌體之組合物。在一些實施例中，向個體投與包含10 ¹與10 ⁸、10 ⁴與10 ⁹、10 ⁵與10 ¹⁰或10 ⁷與10 ¹¹PFU之間的量之噬菌體之組合物。在一些實施例中，向個體投與包含兩種或更多種噬菌體之組合物，其中各噬菌體以約10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹、10 ¹⁰、10 ¹¹、10 ¹²、10 ¹³、10 ¹⁴、10 ¹⁵、10 ¹⁶、10 ¹⁷、10 ¹⁸、10 ¹⁹、10 ²⁰、10 ²¹、10 ²²、10 ²³、10 ²⁴PFU或更大的量投與。在一些實施例中，向個體投與包含兩種或更多種噬菌體之組合物，其中各噬菌體以小於10 ¹PFU之量投與。在一些實施例中，向個體投與包含兩種或更多種噬菌體之組合物，其中各噬菌體以10 ¹與10 ⁸、10 ⁴與10 ⁹、10 ⁵與10 ¹⁰或10 ⁷與10 ¹¹PFU之間的量投與。

在一些實施例中，每日1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次向有需要之個體投與噬菌體或混合物。在一些實施例中，每週至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或21次向有需要之個體投與噬菌體或混合物。在一些實施例中，每月至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次向有需要之個體投與噬菌體或混合物。在一些實施例中，每2、4、6、8、10、12、14、18、20、22或24小時向有需要之個體投與噬菌體或混合物。

在一些實施例中，在出現疾病或病狀之前、期間或之後投與本文所揭示之組合物(噬菌體)。在一些實施例中，投與含有噬菌體之組合物的次數改變。在一些實施例中，將醫藥組合物用作預防性，且向具有病狀或疾病傾向之個體連續投與以預防疾病或病狀出現。在一些實施例中，在症狀發作期間或在症狀發作之後儘快向個體投與醫藥組合物。在一些實施例中，在症狀發作之最初48小時內、在症狀發作之最初24小時內、在症狀發作之最初6小時內或在症狀發作之最初3小時內引發組合物之投與。在一些實施例中，組合物之初始投與係經由任何實際途徑，諸如藉由本文所述之任何途徑使用本文所述之任何調配物。在一些實施例中，在偵測到或疑似疾病或病狀發作之後儘快投與組合物，且持續治療疾病所必需之時間長度，諸如(例如)約1個月至約3個月。在一些實施例中，將針對每個個體改變治療長度。 細菌感染

在某些實施例中，本文揭示治療細菌感染之方法。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體治療或預防人類或動物個體之由如本文所揭示細菌介導或引起的疾病或病狀。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體治療或預防人類或動物個體之由如本文所揭示細菌引起或加劇的疾病或病狀。此類細菌通常與個體之組織接觸，該組織包括：腸、口腔、肺、腋窩、眼、陰道、肛門、耳、鼻或咽喉組織。在一些實施例中，細菌感染藉由調變細菌之活性及/或藉由直接殺滅細菌來治療。

在一些實施例中，目標細菌為假單胞菌屬。在一些實施例中，細菌為綠膿桿菌。

在一些實施例中，存在於細菌群體中之一或多種目標細菌為病原性。在一些實施例中，病原性細菌為致腎盂腎炎性。在一些實施例中，病原細菌為肺病原體。在一些實施例中，病原細菌為血流病原體。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於治療個體之肺系統中的感染、疾病或病狀。在一些實施例中，噬菌體用於調變及/或殺滅個體之肺微生物組內之目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於選擇性調變及/或殺滅來自個體之肺微生物組內之複數種細菌的一或多種目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於選擇性調變及/或殺滅來自個體之肺微生物組內之複數種細菌的一或多種目標病原細菌。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於治療個體之泌尿道中的感染、疾病或病狀。在一些實施例中，噬菌體用於調變及/或殺滅個體泌尿道菌群內之目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於選擇性調變及/或殺滅來自個體之泌尿道菌群內的複數種細菌之一或多種目標致腎盂腎炎性細菌。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於治療個體之皮膚上的感染、疾病或病狀。在一些實施例中，噬菌體用於調變及/或殺滅個體之皮膚上的目標細菌。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於治療個體之黏膜上的感染、疾病或病狀。在一些實施例中，噬菌體用於調變及/或殺滅個體之黏膜上的目標細菌。

在一些實施例中，病原性細菌為抗生素抗性。

在一些實施例中，存在於細菌群體中之一或多種目標細菌形成生物膜。在一些實施例中，生物膜包含病原性細菌。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於治療生物膜。

在一些實施例中，噬菌體治療痤瘡及其他相關皮膚感染。

在一些實施例中，假單胞菌屬物種為多重耐藥性(MDR)菌株。MDR菌株為對至少一種抗生素具有抗性之菌株。在一些實施例中，菌株對諸如頭孢菌素、氟喹諾酮、碳青黴烯、可利斯汀、胺基醣苷、萬古黴素、鏈黴素及甲氧西林之抗生素類別具有抗性。在一些實施例中，菌株對抗生素具有抗性，該抗生素諸如頭孢吡普(Ceftobiprole)、頭孢洛林(Ceftaroline)、克林達黴素(Clindamycin)、達巴黴素(Dalbavancin)、達托黴素(Daptomycin)、利奈唑胺(Linezolid)、莫匹羅星(Mupirocin)、奧利萬星(Oritavancin)、特地唑胺(Tedizolid)、特拉萬星(Telavancin)、泰格環黴素(Tigecycline)、萬古黴素、胺基醣苷、碳青黴烯、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢吡肟(Cefepime)、氟喹諾酮、哌拉西林(Piperacillin)、替卡西林(Ticarcillin)、利奈唑胺(Linezolid)、鏈陽菌素(Streptogramin)或其任何組合。在一些實施例中，MDR菌株為綠膿桿菌。

在一些實施例中，細菌為假單胞菌屬物種。在一些實施例中，細菌為綠膿桿菌。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物用於獸醫學及醫學應用以及研究應用中。

在一些實施例中，細菌感染存在於患有囊腫性纖維化之個體中。在一些實施例中，細菌感染存在於患有非囊腫性纖維化支氣管擴張症之個體中。在一些實施例中，細菌感染存在於患有肺炎之個體中。在一些實施例中，細菌感染促成肺炎。作為非限制性實例，肺炎為醫院獲得性肺炎、呼吸器相關肺炎、社區獲得性肺炎或健保獲得性肺炎。在一些實施例中，細菌感染為血液系統感染(BSI)。

在一些實施例中，本文所述之方法包含投與額外治療劑。在一些實施例中，其他治療劑為抗生素。在一些實施例中，抗生素包含托普黴素。 微生物組

「微生物組(microbiome)」、「微生物群(microbiota)」及「微生物環境(microbial habitat)」在下文中可互換使用且係指生活個體之身體表面、腔室及體液上或中之微生物體的生態群落。微生物組環境之非限制性實例包括：腸、結腸、皮膚、皮膚表面、皮膚孔隙、陰道腔室、臍部區、結膜區、腸道區、胃、鼻腔及通路、胃腸道、泌尿生殖道、唾液、黏液及糞便。在一些實施例中，微生物組包含微生物材料，包括但不限於細菌、古菌、原生生物、真菌及病毒。在一些實施例中，微生物材料包含革蘭氏陰性細菌。在一些實施例中，微生物材料包含革蘭氏陽性細菌。在一些實施例中，微生物材料包含變形菌門( Proteobacteria)、放線菌門( Actinobacteria)、擬桿菌門( Bacteroidetes)或厚壁菌門( Firmicutes)。

在一些實施例中，如本文所揭示之噬菌體用於調變或殺滅個體之微生物組內之目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於CRISPR-Cas系統、溶解活性或其組合來調變及/或殺滅微生物組內之目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於調變及/或殺滅個體之微生物組內之目標細菌。在一些實施例中，噬菌體用於選擇性調變及/或殺滅來自個體之微生物組內的複數種細菌之一或多種目標細菌。

在一些實施例中，噬菌體用於調變或殺滅個體之肺微生物組內之目標單個或複數個細菌。肺微生物組之修飾(例如菌群失調)增加健康狀況之風險，諸如糖尿病、精神障礙、潰瘍性結腸炎、結腸直腸癌、自體免疫病症、肥胖症、糖尿病、中樞神經系統疾病及發炎性腸病。

在一些實施例中，向個體投與本文所揭示之噬菌體以促成健康微生物組。在一些實施例中，向個體投與本文所揭示之噬菌體以恢復個體之微生物組至促成健康狀態的微生物組組成。在一些實施例中，包含本文所揭示之噬菌體之組合物包含益菌助生質或第三試劑。在一些實施例中，藉由本文所揭示之噬菌體治療微生物組相關疾病或病症。 環境療法

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體進一步用於食物及農業消毒(包括肉類、水果及蔬菜消毒)、醫院消毒、家庭消毒、交通工具及設備消毒、工業消毒等。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於自傳遞至人類或動物之醫藥、獸醫、動物管理或任何其他環境細菌移除具有抗生素抗性或其他非所需的病原體。

在健康照護機構中噬菌體之環境應用為用於諸如內窺鏡之設備及諸如ICU之環境，其為因難以或不可能殺菌之病原體所致的院內感染之潛在來源。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於處理由變得對常用消毒劑具抗性之細菌屬佔據的設備或環境。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體組合物用於對非生物物體消毒。在一些實施例中，用具有噬菌體效價在水溶液噴塗、塗敷或傾倒至本文所揭示之環境上。在一些實施例中，本文中所描述之溶液包含10 ¹至10 ²⁰斑塊形成單位(PFU)/ml之間。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體藉由噴霧化劑施用，該等噴霧化劑包括乾燥分散劑以促進噬菌體分散至環境中。在一些實施例中，將物體沉浸於含有本文所揭示之噬菌體的溶液中。消毒

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用作多個領域中之消毒劑。儘管可使用術語「噬菌體)phage/bacteriophage)」，但應注意適當時此術語應廣泛地解釋為包括單一噬菌體、多重噬菌體，諸如噬菌體混合物及噬菌體與諸如殺菌劑、清潔劑、界面活性劑、水等之試劑的混合物。

在一些實施例中，噬菌體用於對包括手術室、患者室、等待室、實驗室或其他各種醫院設備之醫院設施消毒。在一些實施例中，此設備包括心電圖描記器、呼吸器、心血管輔助裝置、主動脈內氣囊泵、輸液裝置、其他患者護理裝置、電視、監視器、遙控器、電話、床等。在一些情形中，經由氣溶膠罐施用噬菌體。在一些實施例中，藉由用轉移媒劑擦拭物體上之噬菌體來施用噬菌體。

在一些實施例中，本文所述之噬菌體與患者護理裝置結合使用。在一些實施例中，噬菌體與習知呼吸器或呼吸道療法設備結合使用以清洗患者之間的內表面及外表面。呼吸機之實例包括在手術中支持呼吸之裝置、支持喪失能力患者之呼吸的裝置及類似設備。在一些實施例中，習知療法包括自動或電動裝置或人工袋型裝置，諸如通常發現於急診室及救護車中的。在一些實施例中，呼吸道療法包括引入諸如慢性阻塞性肺病或哮喘通常使用之支氣管擴張劑之藥品的吸入劑或諸如持續氣道正壓裝置之維持呼吸道通暢之裝置。

在一些實施例中，本文所述之噬菌體用於淨化表面及治療在存在高度傳染性細菌性疾病(諸如腦膜炎或腸溶性感染)之區域中的經移植之人。

在一些實施例中，用本文所揭示之組合物處理水供應器。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於處理污染水；存在於水槽、井、儲存器、容納槽、輸水道、管道及類似水分散裝置中之水。在一些實施例中，將噬菌體應用於水、油、冷卻流體及其他液體積聚於集合池中之工業容納槽。在一些實施例中，將本文所揭示之噬菌體週期性引入工業容納槽以減少細菌生長。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於對生活區域消毒，諸如房屋、房間、公寓、宿舍或任何生活區域。在一些實施例中，噬菌體用於對公共區域消毒，諸如劇場、音樂廳、博物館、火車站台、機場、寵物區域(諸如寵物床或墊料盒子)。在此能力下，將噬菌體自包括泵噴霧器、氣溶膠容器、噴射瓶、預濕潤小毛巾等之習知裝置施配，直接施用至(例如噴塗至)待消毒之區域或經由轉移媒劑(諸如毛巾、海綿等)轉移至區域。在一些實施例中，將本文所揭示之噬菌體應用於房屋之各個室內，包括廚房、臥室、盥洗室、車庫、地下室等。在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體呈與習知清洗劑相同之方式。在一些實施例中，噬菌體與習知清洗劑結合(之前、之後或同時)施用，其限制條件為習知清洗劑經調配從而保留適當噬菌體生物活性。

在一些實施例中，在紙產品之處理期間或處理完成後將本文所揭示之噬菌體添加至紙產品之組分。添加本文所揭示之噬菌體的紙產品包括但不限於紙巾、廁紙、濕潤擦拭紙。 食品安全

在一些實施例中，本文所述之噬菌體用於任何食品或營養增補劑用於預防污染。食品或醫藥產品之實例為牛乳、酸乳、凝乳、乳酪、醱酵乳、基於牛乳之醱酵產品、冰淇淋、基於醱酵穀物之產品、基於牛乳之粉劑、嬰兒配方乳品或錠劑、液體懸浮液、乾式口服補充劑、濕式口服補充劑或乾式管飼。

噬菌體消毒之廣泛概念適用於其他農業應用及生物體。生產，包括水果及蔬菜、乳製品及其他農產品。舉例而言，經常在處理混雜有病原性細菌之植物時達到新切割產物。此已引起食物源性病之爆發可追蹤產生。在一些實施例中，將噬菌體製劑應用至農業生產經由應用對與食物源性病有關之細菌物種具有特異性之單一噬菌體或噬菌體混合物大體上減少或消除食物源性病之可能性。在一些實施例中，在生產及處理之各個階段施用噬菌體以在彼時間點減少細菌污染或在後續時間點防止污染。

在一些實施例中，將特異性噬菌體應用於餐館、食品雜貨儲存、生產中之生產配送中心。在一些實施例中，將本文所揭示之噬菌體週期性或連續施用於沙拉吧之水果及蔬菜內容物。在一些實施例中，將噬菌體應用至沙拉吧或對食品外部消毒為噴灑或噴塗方法或沖洗法。

在一些實施例中，本文所述之噬菌體用於基質或含有封裝之支撐介質，該封裝含有肉、生產、切割水果及蔬菜以及其他食品。在一些實施例中，用噬菌體製劑浸漬適合於封裝之聚合物。

在一些實施例中，本文所述之噬菌體用於農舍及家畜飼料。在一些實施例中，在飼養家畜之農場上，在家畜之飲用水、食物或兩者中向家畜提供噬菌體。在一些實施例中，將本文所述之噬菌體噴塗至屍體上且用於對屠宰區域殺菌。

使用特異性噬菌體作為生產上之生物控制試劑提供許多優勢。舉例而言，噬菌體為將不以常用化學消毒劑進行之方式擾亂天然微生物群之生態平衡但將特異性溶解靶向食物源性病原體的天然、無毒性產品。因為噬菌體不同於化學消毒劑為與其宿主細菌一起釋放之天然產物，當需要時快速鑑別具有對抗最近出現的抗性細菌之活性的新型噬菌體，而若干年來新型有效消毒劑之鑑別為相當長的過程。 醫藥組合物

在某些實施例中，本文揭示醫藥組合物，其包含(a)如本文所揭示之核酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在某些實施例中，本文亦揭示醫藥組合物，其包含(a)如本文所揭示之噬菌體；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在某些實施例中，本文進一步揭示醫藥組合物，其包含(a)如本文所揭示之組合物；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑包含界面活性劑。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為緩衝劑。

在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物及投與其以治療細菌、古細菌感染或對區域殺菌之方法。在一些實施例中，醫藥組合物包含上文在醫藥學上可接受之載劑中所論述之任何試劑。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物或方法治療假單胞菌屬細菌感染。在一些實施例中，細菌感染為綠膿桿菌血流感染。在一些實施例中，細菌感染為綠膿桿菌呼吸道感染。在一些實施例中，本文所揭示之方法的醫藥組合物治療囊腫性纖維化相關支氣管擴張症。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物或方法治療非囊腫性纖維化相關支氣管擴張症。在一些實施例中，本文所揭示之方法的醫藥組合物治療惡性外耳炎、內眼炎、心內膜炎、腦膜炎、肺炎或敗血症。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物包含藥劑、醫藥劑、載劑、佐劑、分散劑、稀釋劑及其類似物。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體經調配用於根據適合之方法投與於醫藥載劑中。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物之製造，特別將噬菌體與可接受之載劑摻合。在一些實施例中，載劑為固體(包括粉末)或液體或兩者，且較佳調配為單位劑量組合物。在一些實施例中，將一或多種噬菌體併入藉由藥劑學之任何適合方法製備的本文所揭示之組合物中。

在一些實施例中，治療個體之活體內的方法包含向個體投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中的本文所揭示之噬菌體，其中該醫藥組合物以治療有效量投與。在一些實施例中，藉由此項技術中已知之任何方式將噬菌體投與至有需要之人類個體或動物。

在一些實施例中，適合於投與本文所揭示之噬菌體至物體或個體之表面的方法及組合物包括水溶液。在一些實施例中，將此等水溶液噴塗至物體或個體之表面上。在一些實施例中，將水溶液用於沖洗及清潔個體之物理傷口形成包括細菌之外來碎片。

在一些實施例中，適合於經鼻投與或以其他方式投與至個體之肺的方法及組合物包括任何適合之方式，例如藉由可吸入粒子之氣溶膠懸浮液投與，該等可吸入粒子包含個體所吸入的噬菌體組合物。在一些實施例中，可吸入粒子為液體或固體。如本文所用，「氣溶膠」包括任何氣載懸浮階段，其能夠被吸入至細支氣管或鼻腔通道中。在一些實施例中，液體粒子之氣溶膠藉由任何適合之方式製得，諸如用壓力驅動氣溶膠霧化器、超音波霧化器或網孔霧化器。在一些實施例中，包含組合物之固體粒子之氣溶膠用任何固體微粒藥劑氣溶膠生成器藉由醫藥領域中已知之技術產生。

霧化器為液體氣溶膠發生器，其將散裝液體(通常為基於水之組合物)轉化成可吸入下呼吸道中的直徑為小於5微米質量中值空氣動力學直徑(MMAD)之小液滴霧或雲。散裝液體含有治療劑粒子或治療劑及任何所需賦形劑之溶液。當吸入氣溶膠雲時，液滴將治療劑帶入鼻子、上呼吸道或深肺中。

氣動(噴射)霧化器使用加壓氣體供應作為液體霧化之驅動力。壓縮氣體經由噴嘴或噴射器遞送以產生低壓場，該低壓場夾帶周圍的散裝液體且將其剪切成薄膜或細絲。膜或細絲不穩定且分解成小液滴，該等液滴由壓縮氣流攜帶入吸氣中。插入液滴羽流中之擋板將較大液滴篩出且使其返回至散裝液體儲集器。實例包括PARI LC® Plus®或Sprint®霧化器、Devilbiss PulmoAide®霧化器及Boehringer Ingelheim Respimat®吸入器。

機電霧化器使用電產生之機械力來霧化液體。機電驅動力係藉由以超音波頻率振動散裝液體或迫使散裝液體穿過薄膜中之小孔而施加。該等力產生薄液膜或細絲流，其分解成小液滴以形成可夾帶於呼吸流中之緩慢移動的氣溶膠流。

機電霧化器之一種形式為超音波霧化器，其中散裝液體耦合至以超音波範圍內之頻率振盪的振動器。耦合係藉由使液體與振動器(例如保持杯中之盤或環)直接接觸，或藉由將大液滴置於固體振動投影儀上而達成。振動產生圓形立膜，該膜在其邊緣分解成液滴以霧化液體。實例包括DuroMist®霧化器、Drive Medical之Beetle Neb®霧化器、Octive Tech之Densylogic®霧化器及John Bunn Nano-Sonic®霧化器。機電霧化器之另一種形式為網孔霧化器，其中散裝液體被驅動穿過直徑範圍為2至8微米之小孔的網或膜，以產生細絲，該等細絲立即分解成小液滴。在一些設計中，藉由使用螺線管活塞驅動器(AERx®)施加壓力或藉由將液體包夾在壓電振動板與網之間而迫使液體穿過網，產生振盪泵抽作用(EFlow®、AerovectRx、TouchSpray™)。在第二種設計類型中，網經由液體之立柱來回振動，以將其泵抽穿過孔。實例包括AeroNeb®、AeroNeb Go®、Pro®；PARI EFlow®；Omron 22UE®；及Aradigm AERx®。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體用於經口投與。在一些實施例中，噬菌體係以固體劑型投與，諸如膠囊、錠劑及粉劑；或以液體劑型投與，諸如酏劑、糖漿及懸浮液。在一些實施例中，適合於經頰(舌下)投與之組合物及方法包括口含錠，該等口含錠包含於通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍之調味基質中的噬菌體；及片劑，該等片劑包含於諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠之惰性基質中的噬菌體。

在一些實施例中，本發明之方法及組合物適合於非經腸投與，包含噬菌體之無菌水性及非水性注射溶液。在一些實施例中，此等製劑與預期接受者之血液等張。在一些實施例中，此等製劑包含使得組合物與預期接受者之血液等張的抗氧化劑、緩衝劑、殺菌素及溶質。在一些實施例中，水性及非水性無菌懸浮液包括懸浮劑及增稠劑。在一些實施例中，本文所揭示之組合物呈現於單位\劑量或多劑量容器(例如密封安瓿及小瓶)中，且儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，僅需在即將使用之前添加無菌液體載劑(例如生理鹽水或注射用水)。

在一些實施例中，適合於經直腸投與之方法及組合物呈現為單位劑量栓劑。在一些實施例中，此等藉由將噬菌體與一或多種習知固體載劑(例如可可脂)摻和且隨後塑形所得混合物來製備。在一些實施例中，適於局部施用至皮膚之方法及組合物呈軟膏、乳膏、乳劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油之形式。在一些實施例中，所使用之載劑包括石油膏、羊毛脂、聚乙二醇、醇、經皮增強劑及其兩者或更多者之組合。

在一些實施例中，適合於經皮投與之方法及組合物呈現為離散貼片，該等離散貼片經調適可與接受者之表皮長時間保持緊密接觸。

在一些實施例中，本文所揭示之噬菌體以治療有效量向該個體投與。在一些實施例中，將本文所揭示之至少一種噬菌體組合物調配為醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多種本文所揭示之噬菌體。在一些情況下，醫藥調配物包含本文所述之噬菌體及以下中之至少一者：賦形劑、稀釋劑或載劑。

在一些實施例中，醫藥調配物包含賦形劑。賦形劑描述於Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association (1986)中且包括但不限於溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、界面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體黏合劑及潤滑劑。

適合之賦形劑之非限制性實例包括但不限於緩衝劑、防腐劑、穩定劑、黏合劑、緻密劑、潤滑劑、螯合劑、分散增強劑、崩解劑、調味劑、甜味劑著色劑。

在一些實施例中，賦形劑為緩衝劑。適合之緩衝劑之非限制性實例包括但不限於檸檬酸鈉、碳酸鎂、碳酸氫鎂、碳酸鈣及碳酸氫鈣。在一些實施例中，醫藥調配物包含如下所列之任何一或多種緩衝劑：碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鎂、乳酸鎂、葡糖酸鎂、氫氧化鋁、檸檬酸鈉、酒石酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉、多磷酸鈉、多磷酸鉀、焦磷酸鈉、焦磷酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈉、磷酸三鉀、偏磷酸鉀、氧化鎂、氫氧化鎂、碳酸鎂、矽酸鎂、乙酸鈣、甘油磷酸鈣、氯化鈣、氫氧化鈣及其他鈣鹽。

在一些實施例中，賦形劑為防腐劑。適合之防腐劑之非限制性實例包括但不限於：抗氧化劑，諸如α-生育酚及抗壞血酸鹽；及抗微生物劑，諸如對羥苯甲酸酯、氯丁醇及苯酚。在一些實施例中，抗氧化劑包括但不限於乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、檸檬酸、抗壞血酸、丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluene；BHT)、丁基化羥基苯甲醚(butylated hydroxy anisole；BHA)、亞硫酸鈉、對胺基苯甲酸、麩胱甘肽、沒食子酸丙酯、半胱胺酸、甲硫胺酸、乙醇及N-乙醯基半胱胺酸。在一些實施例中，防腐劑包括維利微素A、TL-3、正釩酸鈉、氟化鈉、N-α-甲苯磺醯基-苯丙胺酸-氯甲基酮、N-α-甲苯磺醯基-離胺酸-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺醯氟、二異丙基氟磷酸酯、蛋白酶抑制劑、還原劑、烷基化劑、抗微生物劑、氧化酶抑制劑或其他抑制劑。

在一些實施例中，醫藥調配物包含黏合劑作為賦形劑。適合黏合劑之非限制性實例包括澱粉、預膠凝澱粉、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、聚丙烯醯胺、聚乙烯㗁唑啶酮(polyvinyloxoazolidone)、聚乙烯醇、C ₁₂-C ₁₈脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、醣、寡醣及其組合。

在一些實施例中，用於醫藥調配物之黏合劑係選自：澱粉，諸如馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、小麥澱粉；糖，諸如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麥芽糊精；天然及合成膠；明膠；纖維素衍生物，諸如微晶纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素；聚乙烯吡咯啶酮(聚維酮)；聚乙二醇(PEG)；蠟；碳酸鈣；磷酸鈣；醇，諸如山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇及水或其組合。

在一些實施例中，醫藥調配物包含潤滑劑作為賦形劑。適合之潤滑劑之非限制性實例包括硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、氫化植物油、氫化蓖麻油(sterotex)、聚氧乙烯單硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸鈉、月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂及輕質礦物油。在一些實施例中，醫藥調配物中之潤滑劑係選自硬脂酸鹽(諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋁)；脂肪酸酯(諸如硬脂醯反丁烯二酸鈉)；脂肪酸(諸如硬脂酸)；脂肪醇；二十二烷酸甘油酯；礦物油；石蠟；氫化植物油；白胺酸；聚乙二醇(PEG)；金屬月桂基硫酸鹽(諸如月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂)；氯化鈉；苯甲酸鈉；乙酸鈉及滑石或其組合。

在一些實施例中，賦形劑包含調味劑。在一些實施例中，調味劑包括天然油；來自植物、葉子、花及果實之提取物；及其組合。

在一些實施例中，賦形劑包含甜味劑。適合之甜味劑之非限制性實例包括葡萄糖(玉米糖漿)、右旋糖、轉化糖、果糖及其混合物(當不用作載劑時)；糖精及其各種鹽，諸如鈉鹽；二肽甜味劑，諸如阿斯巴甜；二氫查酮化合物(dihydrochalcone compounds)、甘草素；甜菊(甜菊苷)；蔗糖之氯衍生物，諸如蔗糖素；及糖醇，諸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇及其類似物。

在一些情況下，醫藥調配物包含著色劑。適合之著色劑之非限制性實例包括食品、藥品及化妝品著色料(FD&C)、藥品及化妝品著色料(D&C)及外用藥品及化妝品著色料(Ext. D&C)。

在一些實施例中，本文所揭示之醫藥調配物包含螯合劑。在一些實施例中，螯合劑包括乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(EDTA)；EDTA之二鈉、三鈉、四鈉、二鉀、三鉀、二鋰及二銨鹽；EDTA之鋇、鈣、鈷、銅、鏑、銪、鐵、銦、鑭、鎂、錳、鎳、釤、鍶或鋅螯合劑。

在一些情況下，醫藥調配物包含稀釋劑。稀釋劑之非限制性實例包括水、甘油、甲醇、乙醇及其他類似生物相容稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑為酸水溶液，諸如乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸、氫氯酸、磷酸、硝酸、硫酸或類似酸。

在一些實施例中，醫藥調配物包含界面活性劑。在一些實施例中，界面活性劑係選自但不限於聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、月桂基硫酸鈉、硬脂醯反丁烯二酸鈉、聚氧化乙烯烷基醚、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇(PEG)、聚氧化乙烯蓖麻油衍生物、多庫酯鈉、四級銨化合物、胺基酸(諸如L-白胺酸)、脂肪酸之糖酯、脂肪酸之甘油酯或其組合。

在一些情況下，醫藥調配物包含另外的醫藥劑。在一些實施例中，另外的醫藥劑為抗生素試劑。在一些實施例中，抗生素試劑屬於由以下組成之群：胺基糖苷、安沙黴素、碳頭孢烯、碳青黴烯、頭孢菌素(包括第一、第二、第三、第四及第五代頭孢菌素)、林可醯胺、巨環內酯、單醯胺菌素、硝基呋喃、喹諾酮、青黴素、磺醯胺、多肽或四環素。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為胺基醣苷，諸如阿米卡星(Amikacin)、慶大黴素(Gentamicin)、卡那黴素(Kanamycin)、新黴素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、托普黴素(Tobramycin)或巴龍黴素(Paromomycin)。在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為安沙黴素，諸如格爾德黴素或除莠黴素。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為碳頭孢烯，諸如氯碳頭孢(Loracarbef)。在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為碳青黴烯，諸如厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亞胺培南(Imipenem)/西司他汀(Cilastatin)或美羅培南(Meropenem)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為頭孢菌素(第一代)，諸如頭孢羥胺苄(Cefadroxil)、頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢胺苄(Cefalexin)、頭孢噻吩(Cefalotin)或頭孢噻啶(Cefalothin)；或替代地頭孢菌素(第二代)，諸如頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢孟多(Cefamandole)、頭孢西丁(Cefoxitin)、頭孢羅齊(Cefprozil)或頭孢呋辛(Cefuroxime)。在一些實施例中，抗生素試劑為頭孢菌素(第三代)，諸如頭孢克肟(Cefixime)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢托侖(Cefditoren)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢泊肟(Cefpodoxime)、頭孢布坦(Ceftibuten)、頭孢唑肟(Ceftizoxime)及頭孢曲松(Ceftriaxone)或頭孢菌素(第四代)，諸如頭孢吡肟或頭孢吡普。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為林可醯胺，諸如克林達黴素(Clindamycin)及阿奇黴素(Azithromycin)；或巨環內酯，諸如阿奇黴素、克拉黴素(Clarithromycin)、地紅黴素(Dirithromycin)、紅黴素(Erythromycin)、羅紅黴素(Roxithromycin)、醋竹桃黴素(Troleandomycin)、泰利黴素(Telithromycin)及大觀黴素(Spectinomycin)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為單醯胺菌素，諸如安曲南(Aztreonam)；或硝基呋喃，諸如呋喃唑酮(Furazolidone)或呋喃妥因(Nitrofurantoin)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為青黴素，諸如阿莫西林(Amoxicillin)、安比西林(Ampicillin)、阿洛西林(Azlocillin)、卡本西林(Carbenicillin)、氯唑西林(Cloxacillin)、雙氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林(Mezlocillin)、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、青黴素G或V、哌拉西林(Piperacillin)、替莫西林(Temocillin)及替卡西林(Ticarcillin)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為磺胺，諸如磺胺米隆(Mafenide)、磺醯胺基柯衣定(Sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋醯胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀(Silver sulfadiazine)、磺胺甲二唑、磺胺甲基異㗁唑、胺苯磺胺、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、磺胺異㗁唑、甲氧苄啶(Trimethoprim)或甲氧苄啶-磺胺甲基異㗁唑(增效磺胺甲基異㗁唑(Co-trimoxazole)) (TMP-SMX)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為喹啉酮，諸如環丙沙星、依諾沙星(Enoxacin)、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸(Nalidixic acid)、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星(Grepafloxacin)、司帕沙星及替馬沙星(Temafloxacin)。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為多肽，諸如桿菌肽(Bacitracin)、可利斯汀或多黏菌素B。

在一些實施例中，本文所述之抗生素試劑為四環素，諸如地美環素(Demeclocycline)、多西環素(Doxycycline)、米諾四環素(Minocycline)或土黴素(Oxytetracycline)。 所列舉實施例 ：1. 一種噬菌體，其包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列，該系統包含： (a) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列； (b) Cascade多肽；及 (c) Cas3多肽。 2. 如實施例1之噬菌體，其中該一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。 3. 如實施例1至2中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。 4. 如實施例3之噬菌體，其中該至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。 5. 如實施例3至4中任一項之噬菌體，其中該重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。 6. 如實施例1至5中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。 7. 如實施例1至6中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含編碼序列。 8. 如實施例1至6中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。 9. 如實施例1至6中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。 10. 如實施例9之噬菌體，其中該啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。 11. 如實施例1之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。 12. 如實施例11之噬菌體，其中該必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。 13. 如實施例1至12中任一項之噬菌體，其中該Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系統、I-B型CRISPR-Cas系統、I-C型CRISPR-Cas系統、I-D型CRISPR-Cas系統、I-E型CRISPR-Cas系統或I-F型CRISPR-Cas系統之Cascade複合物。 14. 如實施例13之噬菌體，其中該Cascade複合物包含： (i) Cas5d多肽、Cas8c多肽及Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系統)； (ii) Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽及Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系統)； (iii) Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽及Cas6a多肽，其中Cas3多肽包含Cas3'多肽及不具有核酸酶活性之Cas3''多肽(I-A型CRISPR-Cas系統)； (iv) Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系統)； (v) Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽及Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系統)；或 (vi) Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽及Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系統)。 15. 如實施例13之噬菌體，其中該Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7 (視情況SEQ ID NO: 82)多肽(I-C型CRISPR-Cas系統)。 16. 如實施例1至15中任一項之噬菌體，其中該核酸序列進一步包含啟動子序列。 17. 如實施例1至16中任一項之噬菌體，其中該噬菌體為絕對溶解性噬菌體。 18. 如實施例1至16中任一項之噬菌體，其中該噬菌體為賦予溶解之溫和噬菌體。 19. 如實施例18之噬菌體，其中該溫和噬菌體係藉由溶原性基因之移除、替代或失活而賦予溶解。 20. 如實施例17至19中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種僅藉由噬菌體之溶解活性殺滅。 21. 如實施例1至19中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種僅藉由CRISPR-Cas系統之活性殺滅。 22. 如實施例17至19中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種藉由噬菌體之溶解活性與CRISPR-Cas系統之活性的組合殺滅。 23. 如實施例22之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種藉由該CRISPR-Cas系統之活性殺滅，與該噬菌體之溶解活性無關。 24. 如實施例22之噬菌體，其中該CRISPR-Cas系統之活性補充或增強該噬菌體之溶解活性。 25. 如實施例22之噬菌體，其中該噬菌體之溶解活性及該CRISPR-Cas系統之活性係協同的。 26. 如實施例17至25中任一項之噬菌體，其中該噬菌體之溶解活性、該CRISPR-Cas系統之活性或兩者係藉由該噬菌體之濃度調變。 27. 如實施例1至26中任一項之噬菌體，其中該噬菌體感染該假單胞菌屬物種之多個菌株。 28. 如實施例1至27中任一項之噬菌體，其中該噬菌體包含匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒或普納病毒。 29. 如實施例28之噬菌體，其中該噬菌體與選自以下之噬菌體具有至少80%序列一致性：p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。 30. 如實施例29之噬菌體，其中該噬菌體包含p1106e003、p1106wt、p1194wt、p1587e002、p1587wt、p1695wt、p1772e005、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2037e002、p2037wt、p2131e002、p2131wt、p2132e002、p2132wt、p2167wt、p2363e003、p2363wt、p2421e002、p2421wt、p2973e002、p2973wt、p3278wt、p4430wt、PB1e002或PB1wt，或其兩種或更多種噬菌體。 31. 如實施例1至30中任一項之噬菌體，其中該核酸序列係插入非必需噬菌體基因中。 32. 一種醫藥組合物，其包含： (a)如實施例1至31中任一項之噬菌體；及 (b)醫藥學上可接受之賦形劑。 33. 如實施例32之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少兩種噬菌體。 34. 如實施例33之醫藥組合物，其中該噬菌體來自由以下組成之譜系：匹克茲病毒、PhiKMV病毒、Brunyoghe病毒、沙穆納病毒、Nankoku病毒、Abidjan病毒、Baikal病毒、Beetre病毒、Casadaban病毒、Citex病毒、Cysto病毒、Detre病毒、El病毒、Holloway病毒、Kochitakasu病毒、Lituna病毒、Luzseptima病毒、Nipuna病毒、Pakpuna病毒、Pamex病毒、Paundecim病毒、Phitre病毒、Primolici病毒、Septimatre病毒、Stubbur病毒、Tertilici病毒、Yua病毒、Zicotria病毒及普納病毒。 35. 如實施例33之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少六種噬菌體，其中該噬菌體包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。 36. 如實施例32至35中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物呈以下形式：錠劑、膠囊、液體、糖漿、口服調配物、靜脈內調配物、鼻內調配物、經眼調配物、經耳調配物、皮下調配物、局部調配物、經皮調配物、經黏膜調配物、可吸入呼吸道調配物、栓劑、凍乾調配物、可霧化調配物及其任何組合。 37. 一種殺滅假單胞菌屬物種之方法，其包含向目標細菌中引入編碼來自噬菌體之I型CRISPR-Cas系統的核酸序列，該核酸序列包含： (a) 包含一或多個與該假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列； (b) Cascade多肽；及 (c) Cas3多肽。 38. 如實施例37之方法，其中該一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。 39. 如實施例37至38中任一項之方法，其中該CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。 40. 如實施例39之方法，其中該至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。 41. 如實施例39至40中任一項之方法，其中該重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。 42. 如實施例37至41中任一項之方法，其中該CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。 43. 如實施例37至42中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含編碼序列。 44. 如實施例37至42中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。 45. 如實施例37至42中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。 46. 如實施例45之方法，其中該啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。 47. 如實施例37至43中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。 48. 如實施例47之方法，其中該必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。 49. 如實施例37至48中任一項之方法，其中該Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系統、I-B型CRISPR-Cas系統、I-C型CRISPR-Cas系統、I-D型CRISPR-Cas系統、I-E型CRISPR-Cas系統或I-F型CRISPR-Cas系統之Cascade複合物。 50. 如實施例49之方法，其中該Cascade複合物包含： (i) Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽及Cas6a多肽，其中Cas3多肽包含Cas3'多肽及不具有核酸酶活性之Cas3''多肽(I-A型CRISPR-Cas系統)； (ii) Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽及Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系統)； (iii) Cas5d多肽、Cas8c多肽及Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系統)； (iv) Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系統)； (v) Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽及Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系統)；或 (vi) Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽及Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系統)。 51. 如實施例49之方法，其中該Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。 52. 如實施例37至51中任一項之方法，其中該核酸序列進一步包含啟動子序列。 53. 如實施例37至52中任一項之方法，其中該噬菌體為絕對溶解性噬菌體。 54. 如實施例37至52中任一項之方法，其中該噬菌體為賦予溶解之溫和噬菌體。 55. 如實施例54之方法，其中該溫和噬菌體係藉由溶原性基因之移除、替代或失活而賦予溶解。 56. 如實施例37至55中任一項之方法，其中該假單胞菌屬物種僅藉由CRISPR-Cas系統之活性殺滅。 57. 如實施例53至55中任一項之方法，其中該假單胞菌屬物種藉由噬菌體之溶解活性與CRISPR-Cas系統之活性的組合殺滅。 58. 如實施例57之方法，其中該假單胞菌屬物種藉由該CRISPR-Cas系統之活性殺滅，與該噬菌體之溶解活性無關。 59. 如實施例57之方法，其中該CRISPR-Cas系統之活性補充或增強該噬菌體之溶解活性。 60. 如實施例57之方法，其中該噬菌體之溶解活性及該CRISPR-Cas系統之活性係協同的。 61. 如實施例53至60中任一項之方法，其中該噬菌體之溶解活性、該CRISPR-Cas系統之活性或兩者係藉由該噬菌體之濃度調變。 62. 如實施例37至61中任一項之方法，其中該噬菌體感染該假單胞菌屬物種之多個菌株。 63. 如實施例37至62中任一項之方法，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。 64. 如實施例63之方法，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106e003、p1106wt、p1194wt、p1587e002、p1587wt、p1695wt、p1772e005、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2037e002、p2037wt、p2131e002、p2131wt、p2132e002、p2132wt、p2167wt、p2363e003、p2363wt、p2421e002、p2421wt、p2973e002、p2973wt、p3278wt、p4430wt、PB1e002或PB1wt，或其兩種或更多種噬菌體。 65. 如實施例37至64中任一項之方法，其中插入該核酸序列以替代或鄰近於非必需噬菌體基因。 66. 如實施例37至65中任一項之方法，其中細菌細胞混合群體包含該假單胞菌屬物種。 67. 如實施例37至66中任一項之方法，其進一步包含投與至少一種額外噬菌體。 68. 如實施例67之方法，其包含投與至少六種噬菌體，其中該噬菌體包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。 69. 一種治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向該個體投與包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含： (a) CRISPR陣列； (b) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的Cascade多肽；及 (c) Cas3多肽。 70. 如實施例69之方法，其中該一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。 71. 如實施例69至70中任一項之方法，其中該CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。 72. 如實施例71之方法，其中該至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。 73. 如實施例71至72中任一項之方法，其中該重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。 74. 如實施例69至73中任一項之方法，其中該CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。 75. 如實施例69至74中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含編碼序列。 76. 如實施例69至74中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。 77. 如實施例69至74中任一項之方法，其中該目標核酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。 78. 如實施例77之方法，其中該啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。 79. 如實施例69至74中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。 80. 如實施例79之方法，其中該必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。 81. 如實施例69至80中任一項之方法，其中該Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系統、I-B型CRISPR-Cas系統、I-C型CRISPR-Cas系統、I-D型CRISPR-Cas系統、I-E型CRISPR-Cas系統或I-F型CRISPR-Cas系統之Cascade複合物。 82. 如實施例81之方法，其中該Cascade複合物包含： (i) Cas5d多肽、Cas8c多肽及Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系統)； (ii) Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽及Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系統)； (iii) Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽及Cas6a多肽，其中Cas3多肽包含Cas3'多肽及不具有核酸酶活性之Cas3''多肽(I-A型CRISPR-Cas系統)； (iv) Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系統)； (v) Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽及Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系統)；或 (vi) Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽及Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系統)。 83. 如實施例82之方法，其中該Cascade複合物包含Cas5d多肽(視情況SEQ ID NO: 80)、Cas8c多肽(視情況SEQ ID NO: 81)及Cas7多肽(視情況SEQ ID NO: 82) (I-C型CRISPR-Cas系統)。 84. 如實施例69至83中任一項之方法，其中該核酸序列進一步包含啟動子序列。 85. 如實施例69至84中任一項之方法，其中該噬菌體為絕對溶解性噬菌體。 86. 如實施例69至84中任一項之方法，其中該噬菌體為賦予溶解之溫和噬菌體。 87. 如實施例86之方法，其中該溫和噬菌體係藉由溶原性基因之移除、替代或失活而賦予溶解。 88. 如實施例69至87中任一項之方法，其中該假單胞菌屬物種僅藉由CRISPR-Cas系統之活性殺滅。 89. 如實施例85至87中任一項之方法，其中該假單胞菌屬物種藉由噬菌體之溶解活性與CRISPR-Cas系統之活性的組合殺滅。 90. 如實施例89之方法，其中該假單胞菌屬物種藉由該CRISPR-Cas系統之活性殺滅，與該噬菌體之溶解活性無關。 91. 如實施例89之方法，其中該CRISPR-Cas系統之活性補充或增強該噬菌體之溶解活性。 92. 如實施例89之方法，其中該噬菌體之溶解活性及該CRISPR-Cas系統之活性係協同的。 93. 如實施例85至92中任一項之方法，其中該噬菌體之溶解活性、該CRISPR-Cas系統之活性或兩者係藉由該噬菌體之濃度調變。 94. 如請求項69至93中任一項之方法，其中該噬菌體感染多個菌株。 95. 如實施例69至87中任一項之方法，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。 96. 如實施例95之方法，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106e003、p1106wt、p1194wt、p1587e002、p1587wt、p1695wt、p1772e005、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2037e002、p2037wt、p2131e002、p2131wt、p2132e002、p2132wt、p2167wt、p2363e003、p2363wt、p2421e002、p2421wt、p2973e002、p2973wt、p3278wt、p4430wt、PB1e002或PB1wt，或其兩種或更多種噬菌體。 97. 如實施例69至96中任一項之方法，其中插入該核酸序列以替代或鄰近於非必需噬菌體基因。 98. 如實施例69至97中任一項之方法，其進一步包含投與至少一種額外噬菌體。 99. 如實施例98之方法，其包含投與至少六種噬菌體，其中該噬菌體包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。 100. 如實施例69至99中任一項之方法，其中該疾病或病狀為細菌感染、囊腫性纖維化、非囊腫性纖維化支氣管擴張症或肺炎。 101. 如實施例100之方法，其中該細菌感染與囊腫性纖維化或非囊腫性纖維化支氣管擴張症相關，或其中該細菌感染為血流感染。 102. 如實施例69至101中任一項之方法，其中引起該疾病或病狀之該假單胞菌屬物種為耐藥性假單胞菌屬物種。 103. 如實施例102之方法，其中該耐藥性假單胞菌屬物種對至少一種抗生素具抗性。 104. 如實施例69至103中任一項之方法，其中引起該疾病或病狀之該假單胞菌屬物種為多重耐藥性假單胞菌屬物種。 105. 如實施例104之方法，其中該多重耐藥性假單胞菌屬物種對至少一種抗生素具抗性。 106. 如實施例103或105中任一項之方法，其中該抗生素包含頭孢菌素(cephalosporin)、氟喹諾酮(fluoroquinolone)、碳青黴烯(carbapenem)、可利斯汀(colistin)、胺基醣苷(aminoglycoside)、萬古黴素(vancomycin)、鏈黴素(streptomycin)或甲氧西林(methicillin)。 107. 如實施例69至106中任一項之方法，其中該假單胞菌屬物種為綠膿桿菌。 108. 如實施例69至107中任一項之方法，其中該投與為動脈內、靜脈內、尿道內、肌內、經口、皮下、吸入、局部、皮膚、經皮、經黏膜、植入、舌下、頰內、經直腸、經陰道、經眼、經耳或經鼻投與或其任何組合。 109. 如實施例69至108中任一項之方法，其進一步包含投與額外治療劑。 110. 如實施例109之方法，其中該額外治療劑包含托普黴素。 111. 如實施例69至110中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。 112. 一種噬菌體，其包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列，該系統包含： (a) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列； (b) 包含Cas5、Cas8c及Cas7之Cascade多肽；及 (c) Cas3多肽。 113. 如實施例112之噬菌體，其中該一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。 114. 如實施例112至113中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。 115. 如實施例114之噬菌體，其中該至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。 116. 如實施例112至115中任一項之噬菌體，其中該重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。 117. 如實施例112至116中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。 118. 如實施例112至117中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含編碼序列。 119. 如實施例112至117中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。 120. 如實施例112至117中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。 121. 如實施例120之噬菌體，其中該啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。 122. 如實施例112至121中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含位於必需基因之經轉錄區之編碼股上的核苷酸序列之全部或一部分。 123. 如實施例122之噬菌體，其中該必需基因為 Tsf 、 acpP 、 gapA 、 infA 、 secY 、 csrA 、 trmD 、 ftsA 、 fusA 、 glyQ 、 eno 、 nusG 、 dnaA 、 dnaS 、 pheS 、 rplB 、 gltX 、 hisS 、 rplC 、 aspS 、 gyrB 、 glnS 、 dnaE 、 rpoA 、 rpoB 、 pheT 、 infB 、 rpsC 、 rplF 、 alaS 、 leuS 、 serS 、 rplD 、 gyrA 、 glmS 、 fus 、 adk 、 rpsK 、 rplR 、 ctrA 、 parC 、 tRNA-Ser 、 tRNA-Asn或 metK。 124. 如實施例112至123中任一項之噬菌體，其中該核酸序列進一步包含啟動子序列。 125. 如實施例112至124中任一項之噬菌體，其中該噬菌體為絕對溶解性噬菌體。 126. 如實施例112至124中任一項之噬菌體，其中該噬菌體為賦予溶解之溫和噬菌體。 127. 如實施例126之噬菌體，其中該溫和噬菌體係藉由溶原性基因之移除、替代或失活而賦予溶解。 128. 如實施例125至127中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種僅藉由噬菌體之溶解活性殺滅。 129. 如實施例125至127中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種僅藉由CRISPR-Cas系統之活性殺滅。 130. 如實施例125至127中任一項之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種藉由噬菌體之溶解活性與CRISPR-Cas系統之活性的組合殺滅。 131. 如實施例130之噬菌體，其中該假單胞菌屬物種藉由該CRISPR-Cas系統之活性殺滅，與該噬菌體之溶解活性無關。 132. 如實施例130之噬菌體，其中該CRISPR-Cas系統之活性補充或增強該噬菌體之溶解活性。 133. 如實施例130之噬菌體，其中該噬菌體之溶解活性及該CRISPR-Cas系統之活性係協同的。 134. 如實施例125至133中任一項之噬菌體，其中該噬菌體之溶解活性、該CRISPR-Cas系統之活性或兩者係藉由該噬菌體之濃度調變。 135. 如請求項112至134中任一項之噬菌體，其中該噬菌體感染多個菌株。 136. 如實施例112至135中任一項之噬菌體，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。 137. 如實施例136之噬菌體，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106e003、p1106wt、p1194wt、p1587e002、p1587wt、p1695wt、p1772e005、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2037e002、p2037wt、p2131e002、p2131wt、p2132e002、p2132wt、p2167wt、p2363e003、p2363wt、p2421e002、p2421wt、p2973e002、p2973wt、p3278wt、p4430wt、PB1e002或PB1wt，或其兩種或更多種噬菌體。 138. 如實施例112至137中任一項之噬菌體，其中該核酸序列係插入非必需噬菌體基因中。 139. 一種醫藥組合物，其包含： (a)如實施例112至138中任一項之噬菌體；及 (b)醫藥學上可接受之賦形劑。 140. 如實施例139之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少兩種噬菌體。 141. 如實施例140之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少六種噬菌體，其中該噬菌體包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。 142. 如實施例139至141中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物呈以下形式：錠劑、膠囊、液體、糖漿、口服調配物、靜脈內調配物、鼻內調配物、經眼調配物、經耳調配物、皮下調配物、局部調配物、經皮調配物、經黏膜調配物、可吸入呼吸道調配物、栓劑、凍乾調配物、可霧化調配物及其任何組合。 143. 一種對有需要之表面進行消毒的方法，該方法包含向該表面投與包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體，該系統包含： (a) CRISPR陣列； (b) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的級聯多肽；及 (c) Cas3多肽。 144. 如實施例143之方法，其中該表面為醫院表面、車輛表面、設備表面或工業表面。 145. 一種預防食品或營養補充劑之污染的方法，該方法包含使食品或營養補充劑與包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列的噬菌體接觸，該系統包含： (a) CRISPR陣列； (b) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的級聯多肽；及 (c) Cas3多肽。 146. 如實施例145之方法，其中該食品或營養補充劑包含牛乳、酸乳、凝乳、乳酪、醱酵乳、基於牛乳之醱酵產品、冰淇淋、基於醱酵穀物之產品、基於牛乳之粉劑、嬰兒配方乳品或錠劑、液體懸浮液、乾式口服補充劑、濕式口服補充劑或乾式管飼。 147. 一種噬菌體，其包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸序列，該系統包含： (a) 包含與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列，其中該間隔序列包含SEQ ID NO: 12、16及20； (b) 級聯多肽；及 (c) Cas3多肽。 148. 一種噬菌體，其與選自以下之噬菌體具有至少80%序列一致性：p1106、p1194、p1587、p1695、p1772、p1835、p2037、p2131、p2132、p2167、p2363、p2421、p2973、p3278、p4430或PB1，或其兩種或更多種噬菌體。 149. 如實施例148之噬菌體，其中該噬菌體與以下各者具有至少80%一致性：p1106e003、p1106wt、p1194wt、p1587e002、p1587wt、p1695wt、p1772e005、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2037e002、p2037wt、p2131e002、p2131wt、p2132e002、p2132wt、p2167wt、p2363e003、p2363wt、p2421e002、p2421wt、p2973e002、p2973wt、p3278wt、p4430wt、PB1e002或PB1wt，或其兩種或更多種噬菌體。 150. 如實施例148之噬菌體，其進一步包含 (a) CRISPR陣列； (b) 包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的Cascade多肽；及 (c) Cas3多肽。 151. 如實施例150之噬菌體，其中該一或多個間隔序列包含SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之至少一者，或與SEQ ID NO: 12-23、31-74或88-120中之任一者具有至少90%序列一致性。 152. 如實施例150至151中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列進一步包含至少一個重複序列。 153. 如實施例151之噬菌體，其中該至少一個重複序列在一或多個間隔序列之5'端或3'端可操作地連接至該一或多個間隔序列。 154. 如實施例151至153中任一項之噬菌體，其中該重複序列與SEQ ID NO: 26-30中之任一者具有至少約90%序列一致性。 155. 如實施例151至154中任一項之噬菌體，其中該CRISPR陣列與如圖1A-1E中所述之序列或SEQ ID NO: 83-87具有至少約90%序列一致性。 156. 如實施例151至155中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含編碼序列。 157. 如實施例151至156中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含非編碼或基因間序列。 158. 如實施例151至157中任一項之噬菌體，其中該目標核苷酸序列包含啟動子序列之全部或一部分。 159. 如實施例158之噬菌體，其中該啟動子序列與SEQ ID NO: 1-11中之任一者具有至少約90%序列一致性。 160. 一種包含至少四種噬菌體之組合物，其包含 (a) 與p1106e003具有至少80%序列一致性之第一噬菌體； (b) 與p1835e002具有至少80%序列一致性之第二噬菌體； (c) 與p1772e005具有至少80%序列一致性之第三噬菌體；及 (d) 與p2131e002具有至少80%序列一致性之第四噬菌體。 161. 如實施例160之組合物，其進一步包含與p1194具有至少80%序列一致性之第五噬菌體。 162. 如實施例160之組合物，其進一步包含與p1695具有至少80%序列一致性之第五噬菌體。 163. 如實施例160之組合物，其進一步包含與p4430具有至少80%序列一致性之第五噬菌體。 164. 如實施例161或163之組合物，其進一步包含與p1695具有至少80%序列一致性之第六噬菌體。其他 實施例1. 一種噬菌體，該噬菌體與普納病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性，其中普納病毒選自PB1、p1106、p1587、p1835、p2037、p2363及p2421，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。 2. 一種噬菌體，該噬菌體與沙穆納病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性，其中沙穆納病毒選自p1772、p2131、p2132及p2973，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。 3. 一種噬菌體，該噬菌體與匹克茲病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性，其中匹克茲病毒選自p1194及p4430，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。 4. 一種噬菌體，該噬菌體與布魯伊諾格病毒具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性，其中布魯伊諾格病毒選自p1695及p3278，且其中噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。 5. 一種噬菌體，該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽；其中該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。 6. 如實施例5之噬菌體，其與PB1 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 7. 如實施例5之噬菌體，其與PB1e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 8. 如實施例5之噬菌體，其與p1106 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 9. 如實施例5之噬菌體，其與p1106e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 10. 如實施例5之噬菌體，其與p1587 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 11. 如實施例5之噬菌體，其與p1587e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 12. 如實施例5之噬菌體，其與p1835 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 13. 如實施例5之噬菌體，其與p1835e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 14. 如實施例5之噬菌體，其與p2037 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 15. 如實施例5之噬菌體，其與p2037e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 16. 如實施例5之噬菌體，其與p2363 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 17. 如實施例5之噬菌體，其與p2363e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 18. 如實施例5之噬菌體，其與p2421 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 19. 如實施例5之噬菌體，其與p2421e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 20. 如實施例5之噬菌體，其與p1772 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 21. 如實施例5之噬菌體，其與p1772e005具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 22. 如實施例5之噬菌體，其與p2131 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 23. 如實施例5之噬菌體，其與p2131e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 24. 如實施例5之噬菌體，其與p2132 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 25. 如實施例5之噬菌體，其與p2132e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 26. 如實施例5之噬菌體，其與p2973 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 27. 如實施例5之噬菌體，其與p2973e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 28. 如實施例5之噬菌體，其與p1194 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 29. 如實施例5之噬菌體，其與p4430 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 30. 如實施例5之噬菌體，其與p1695 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 31. 如實施例5之噬菌體，其與p2167 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 32. 如實施例5之噬菌體，其與p3278 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 33. 一種噬菌體，該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽；其中該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。 34. 如實施例5之噬菌體，其與PB1 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 35. 如實施例5之噬菌體，其與PB1e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 36. 如實施例5之噬菌體，其與p1106 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 37. 如實施例5之噬菌體，其與p1106e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 38. 如實施例5之噬菌體，其與p1587 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 39. 如實施例5之噬菌體，其與p1587e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 40. 如實施例5之噬菌體，其與p1835 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 41. 如實施例5之噬菌體，其與p1835e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 42. 如實施例5之噬菌體，其與p2037 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 43. 如實施例5之噬菌體，其與p2037e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 44. 如實施例5之噬菌體，其與p2363 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 45. 如實施例5之噬菌體，其與p2363e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 46. 如實施例5之噬菌體，其與p2421 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 47. 如實施例5之噬菌體，其與p2421e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 48. 如實施例5之噬菌體，其與p1772 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 49. 如實施例5之噬菌體，其與p1772e005具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 50. 如實施例5之噬菌體，其與p2131 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 51. 如實施例5之噬菌體，其與p2131e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 52. 如實施例5之噬菌體，其與p2132 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 53. 如實施例5之噬菌體，其與p2132e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 54. 如實施例5之噬菌體，其與p2973 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 55. 如實施例5之噬菌體，其與p2973e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 56. 如實施例5之噬菌體，其與p1194 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 57. 如實施例5之噬菌體，其與p4430 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 58. 如實施例5之噬菌體，其與p1695 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 59. 如實施例5之噬菌體，其與p2167 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 60. 如實施例5之噬菌體，其與p3278 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 61. 一種噬菌體，該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽；其中該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。 62. 如實施例5之噬菌體，其與PB1 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 63. 如實施例5之噬菌體，其與PB1e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 64. 如實施例5之噬菌體，其與p1106 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 65. 如實施例5之噬菌體，其與p1106e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 66. 如實施例5之噬菌體，其與p1587 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 67. 如實施例5之噬菌體，其與p1587e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 68. 如實施例5之噬菌體，其與p1835 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 69. 如實施例5之噬菌體，其與p1835e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 70. 如實施例5之噬菌體，其與p2037 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 71. 如實施例5之噬菌體，其與p2037e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 72. 如實施例5之噬菌體，其與p2363 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 73. 如實施例5之噬菌體，其與p2363e003具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 74. 如實施例5之噬菌體，其與p2421 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 75. 如實施例5之噬菌體，其與p2421e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 76. 如實施例5之噬菌體，其與p1772 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 77. 如實施例5之噬菌體，其與p1772e005具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 78. 如實施例5之噬菌體，其與p2131 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 79. 如實施例5之噬菌體，其與p2131e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 80. 如實施例5之噬菌體，其與p2132 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 81. 如實施例5之噬菌體，其與p2132e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 82. 如實施例5之噬菌體，其與p2973 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 83. 如實施例5之噬菌體，其與p2973e002具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 84. 如實施例5之噬菌體，其與p1194 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 85. 如實施例5之噬菌體，其與p4430 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 86. 如實施例5之噬菌體，其與p1695 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 87. 如實施例5之噬菌體，其與p2167 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。 88. 如實施例5之噬菌體，其與p3278 WT具有至少80%、81%、82%、83%、84%或85%序列一致性。實例實例 1 ： 本應用中所用之工程化噬菌體

噬菌體經工程化以含有crArray及Cas構築體。表 1A描繪在以下應用中所用之噬菌體的組分。表 1B描繪用於驅動crArray及Cas啟動子兩者之表現的啟動子之序列。表 1C描繪用於靶向特定位點之crArray中之間隔序列的序列。另外，圖 1A-1E描繪以下實例中所用之crArray1-crArray5的序列及比對。合併之crArray1及假單胞菌屬I C型CRISPR插入物的全序列顯示於圖 1F-1K及表 1D中。合併之crArray3及假單胞菌屬I C型CRISPR插入物的全序列顯示於圖 1L-1Q及表 1D中。表 1A ： 噬菌體之組分

噬菌體名稱	寄存編號	crArray 啟動子	crArray 標識	Cas 啟動子	Cas 標識
p1106e003	BCRC970078	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p1106wt	BCRC970100	N/A	N/A	N/A	N/A
p1194wt	BCRC970097	N/A	N/A	N/A	N/A
p1587e002	BCRC970088	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p1587wt	BCRC970101	N/A	N/A	N/A	N/A
p1695wt	BCRC970082	N/A	N/A	N/A	N/A
p1772e005	BCRC970080	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p1772wt	BCRC970096	N/A	N/A	N/A	N/A
p1772e004	N/A	N/A	N/A	BBa_J23109	PaIC
p1772e006	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	N/A	N/A
p1772e008	N/A	ACR	crArray 2 (圖1B，SEQ ID NO: 84)	BBa_J23109	PaIC
p1772e016	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p1772e017	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23106	PaIC
p1772e018	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	P16	PaIC
p1772e019	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	Gp105	PaIC
p1772e020	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	Gp245	PaIC
p1772e021	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	PAMP	PaIC
p1772e022	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	Plpp	PaIC
p1772e023	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	pTat	PaIC
p1835e002	BCRC970102	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p1835wt	BCRC970079	N/A	N/A	N/A	N/A
p2037e002	BCRC970090	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2037wt	BCRC970103	N/A	N/A	N/A	N/A
p2131e002	BCRC970081	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2131wt	BCRC970097	N/A	N/A	N/A	N/A
p2132e002	BCRC970086	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2132wt	BCRC970098	N/A	N/A	N/A	N/A
p2167wt	BCRC970092	N/A	N/A	N/A	N/A
p2363e003	BCRC970089	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2363wt	BCRC970094	N/A	N/A	N/A	N/A
p2421e002	BCRC970087	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2421wt	BCRC970095	N/A	N/A	N/A	N/A
p2973e002	BCRC970084	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p2973wt	BCRC970099	N/A	N/A	N/A	N/A
p3278wt	BCRC970093	N/A	N/A	N/A	N/A
p4430wt	BCRC970083	N/A	N/A	N/A	N/A
PB1e002	BCRC970085	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
PB1wt	BCRC970104	N/A	N/A	N/A	N/A
p4209	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
p4209e001	N/A	N/A	N/A	N/A	PaIC
p4209e002	N/A	ACR	crArray 1 (圖1A，SEQ ID NO: 83)	BBa_J23109	PaIC
pArray3	N/A	ACR	crArray 3 (圖1C，SEQ ID NO: 85)	BBa_J23109	PaIC
PArray4	N/A	ACR	crArray 4 (圖1D，SEQ ID NO: 86)	BBa_J23109	PaIC

表 1B ：啟動子序列

SEQ ID NO	啟動子	來源	序列
1	ACR	噬菌體基因體	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCC
2	BBa_J23109	BioBrick	TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGC
3	內源性(啟動子 + RBS)	綠膿桿菌基因體	GATTTTTTTCGGGTGAGGTTGCGGGCTGTTCGGTAGGTTTATAAACACTGCTATCCAAAGCTATGGACACGCTCGGCTACGAGAACAGTTGGCGTGATGGCCTCTAGCAATTAGATTGTTATGCGACATCCGCAGACTTGGCAGGGAGCGCACCT
4	BBa_J23106	BioBrick	TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAGTGCTAGC
5	P16 (啟動子 + RBS)	綠膿桿菌基因體	ATCCGAGGGATACGGGCCTTGTCAGCACGGTGTTGCTAATGAGAGCCTTTGCCCGGGCAATAGTACGGGCAGTGTGTAGCGGATTGAAAGACGCTGAATCACTGACAGGCATGAAGACTATCGATAGAGTCTGATAGTGTCGCCGCCGCACAGCGGATAGAGTCCACAGTCATTGAAGTGTTAATCCGCGATCAAGCTC
6	gp105 (啟動子 + RBS)	噬菌體基因體	GACCTAGCTTTTATAGCGGGTTTCGTGGTTTATAGCCCATTGAAAAAAATCTCACATCTATATCACAGGTGTGCACTCGTTCCCGAAAGGTTCTGAGTCTACTTGATCAAGTATTGAAATACCATCGTAAAGGAAAAAGACATGTCTATTCGTGATAGCGAAAACAACAACGGCCAACAGCAGCAGACCGCGCAAACTGCCGCCCCCGCCCCGCAA
7	gp245 (啟動子 + RBS)	噬菌體基因體	TTCAATTTAAGTAGTAACGAGGTCAGCCCGGAATCTTTGGGTATTCTTAAGGTATTTCTGACTCAGTGTGGTTGGGACAGCTTCACTGTACATTGCACTGGATTTGTTAATTTCTTATACCGGGGCACCATGGGCAGCAAATCGTGTTACGAATTCCGTCTAACCAATAAGCGAGCTAAATA
8	Pamp	質體	CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT
9	Plpp (啟動子 + RBS)	綠膿桿菌基因體	CTTCAAGAATTCGTATTGACCCCATAGACAGCTTCGTCGACGCCCGTCCCGGCCCCCTTGGGCTTGCCGGACGGCTTATGTCATGATGGCGCCACCCTCGCAGGTTCAAGGCCGGCTTTCTTCCTCTATGAACAAATCCCTTGCGCTGACTACGTAATCAC
10	Ptat (啟動子 + RBS)	綠膿桿菌基因體	CTTCAAGAATTCGGGGTATTCCTGATCCTGCGCCGCTAGCGCCGCGCACGGCCACTAGGCCCGCGCCGATAGCCAGTCGCGCTCCCGGCTGGCACACTACTCCCATTTCCGCCGGAAACGCGCGCAACGTACCGGCAACGAACGTGGAAAGACCATGAAAGACTGGCTGGATGAGATTCACTGGAACGCCGTGACCTACGTATGCAC
11	rrnB P1	大腸桿菌	GAAAATTATTTTAAATTTCCTCTAGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGACACCA

表 1C ： 靶向假單胞菌屬之間隔序列

陣列標識	間隔靶標	SEQ ID NO	序列
間隔子 1
crArray 1	假設蛋白/基因間區域	12	AGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTG
crArray 2	非靶向對照	13	GCTCGACTGGTCGGTAACCACTTGTGTGTGGTGA
crArray 3	ftsA	14	GGTGCTGACCGAGGACGAGAAGGAACTGGGCGTG
crArray 4	glnS	15	GATGACACCAACCCGGCCAAGGAAGACCAGGAGT
間隔子 2
crArray 1	phnW (丙酮酸轉胺酶)	16	GAGACCGAAGAGAACGTGCCGACCACCGCCGCTG
crArray 2	非靶向對照	17	CAGTGCATGGCAGCGAACGCCGAGAGCCGACACC
crArray 3	dnaA	18	TCCGCGATGAGCTGCCGTCCCAACAATTCAACAC
crArray 4	dnaN	19	AACGCGAAGCCCTGTTGAAACCGCTGCAACTGGT
間隔子 3
crArray 1	rpmF/基因間區域/假設蛋白	20	TGCTGAACAGCCATGATTGATTAACTCCTAAACG
crArray 2	非靶向對照	21	CGTAAACCTAATGGGCCTGATCTACAGTAATCTA
crArray 3	gyrB	22	ACCACCGAGACGCCCACACCGTGCAAGCCGCCGG
crArray 4	rpoB	23	CTATCGCGAATTCCTGCAGGCTGGCGCAACCAAG
額外間隔序列
	GyraseB	31	CGCCAGATGCCCGAGCTGATCGAGCGTGGCTACA
	非編碼序列	32	GAACCAACGCATGGCAGGATCAAAACCTGCTGCC
	磷酸核糖轉移酶	33	GCCGCCGGAGGTCTCGTTGCGGTAACGGGTCGCA
	tsf	34	CGGGTTGCCGCCTTTCAGGTTGACCACGACACCG
	acpP	35	CAGAGCCATCACCAGCTCGACGGTGTCAAGGGAG
	gapA	36	ACCAGCCGCGACAAAGCCGCTGCCCACCTGCAGG
	infA	37	CGTGTGGAGTTGGAAAATGGGCACGTCGTCACCG
	secY	38	AGCGGCTGCCCCGGAGCGATCGCTTGCGCGACGT
	csrA	39	CCTTTGACACCCAGTACCGTCACGGTGACGTCGT
	trmD	40	TTCATCGACGTGCTCTTCGATGAAGCGCTCGTCG
crArray 3	ftsA	41	GGTGCTGACCGAGGACGAGAAGGAACTGGGCGTG
	fusA	42	AACATCATCGACACCCCCGGCCACGTCGACTTCA
	glyQ	43	TGGTGGAACACGTCGCCATAGGTGACCTTGCCGA
	eno	44	CAGCCGGCCCAGTCGGACTCGTCCATGCCGTCCT
	nusG	45	GGCTTGGGCTTGTCGCCGCTATCGGCCACGCGAC
crArray 3	dnaA	46	TCCGCGATGAGCTGCCGTCCCAACAATTCAACAC
	pheS	47	CACCTGGTGGAACATCGGCGAGTGGGTCAGGTCG
	rplB	48	AGCTCGATACCATGAACAGTGCTACCCACCGGGA
	gltX	49	TCGCGCTCGTCCGGCATCGACCAGCCCATCCGCC
	hisS	50	CACGCCCATGGCGAAACCGACACCCGGGGTCGGC
	rplC	51	CAGCGCTTGATGGTGCCCGCGAAGCCCTTACCCT
	aspS	52	GCCGCTACCTGGACGACAACGGCTTCCTCGACGT
	gyrB	53	CGCCAGATGCCCGAGCTGATCGAGCGTGGCTACA
crArray 3	gyrB	54	ACCACCGAGACGCCCACACCGTGCAAGCCGCCGG
crArray 4	glnS	55	GATGACACCAACCCGGCCAAGGAAGACCAGGAGT
	dnaE	56	CTGGTACAGGATGATGCCGTAGGTGGGCTTGAGC
	rpoA	57	GGGATCCAGAGTGCCGTTGGTTTCCAGGTCCAGG
	pheT	58	CCCGTCGGCTACCACCGTTAGTTCCAGGGCTTGC
	infB	59	CTTGATCGGCTTGCCGTTCTCGTCGAGCATGGCG
	rpsC	60	GTAGGTGGCATAGTCGATATCGGCGCGCAGGGTG
	rplF	61	GTAATCAACCGGATGGGAGAAGCCGAGGGACAGG
	alaS	62	TGGGCGATGGGCGATACCGGACCCTGCGGTCCCT
	leuS	63	GACGCCATCGGCGCCGACCTCGAGGCCAAGGGCC
	serS	64	CAGCGCTTCGTAGGAGGTGGCCGGATCGACGATC
	rplD	65	AGACCCAGGGTGTCCAGCTTGGCAACCAGGCCCT
	gyrA	66	CTGGTATTCGGAGAGCAGCTTCTCGTGCTCCAGG
	glmS	67	CGGGCCGGCCTGGGTCAGCAGGGTCAGGTCGGAT
	adk	68	GGCGGGTTGTGCTCGGTGTGGTACACGCGGCCGG
	rpsK	69	AGAGCGCGAACGGCGGACTCGCGGCCCGGGCCCG
	rplR	70	TTGGCTGCATCGATGTTGCCGGTGGCACCTTCGC
	parC	71	GAAGCTGGCCCCCGGCGGCGGCGTCAGCCGGCCG
	tRNA-Ser	72	GAACCCCCGACACCCTTTTGAGGTGTACTCCCTT
	tRNA-Asn	73	CGCGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAAATGACTGTT
	metK	74	CGGGTTGTGCTGGGTGGACAGCACCACCGCATCG
	假單胞菌屬	88	AGAAGGGTCAXGGXCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	89	AGAAGGXTCAGGGXCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	90	AGAAGGXTCAXGGCCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	91	AGAAGGXTCAXGGXCATGCGGTTTTTCCTCTGTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	92	AGAAGGXTCAXGGXCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	93	AGAAGGGTCAGGGXCATGCGGTTTTTCCTCTGTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	94	AGAAGGGTCAGGGTCATGCGGTTTTTCCTCTGTG
	假單胞菌屬	95	AGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	96	AGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTATG
	假單胞菌屬	97	AGAAGGXTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	98	AGAAGGATCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTG
	假單胞菌屬	99	AGAAGGXTCAXGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	100	AGAAGGATCAAGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTG
	假單胞菌屬	101	AGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTXTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	102	AGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTATG
	假單胞菌屬	103	GAGACCGAAGAGXAXGTGCCGACCACXGCCGCTG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	104	GAGACCGAAGAGAAXGTGCCGACCACCGCCGCTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	105	GAGACCGAAGAGAATGTGCCGACCACCGCCGCTG
	假單胞菌屬	106	GAGACCGAAGAGAACGTGCCGACCACXGCCGCTG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	107	GAGACCGAAGAGAACGTGCCGACCACTGCCGCTG
	假單胞菌屬	108	GAGACCGAAGAGXACGTGCCGACCACCGCCGC，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	109	GAGACCGAAGAGGACGTGCCGACCACCGCCGC
	假單胞菌屬	110	TGCTGAACAGCCATXAXXXATTAACTCCTAAACG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	111	TGCTGAACAGCCATXATTGATTAACTCCTAAACG，其中X為A、T、C或G
	假單胞菌屬	112	TGCTGAACAGCCATAATTGATTAACTCCTAAACG
	假單胞菌屬	113	TGCTGAACAGCCATXATTXATTAACTCCTAAACG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	114	TGCTGAACAGCCATAATTAATTAACTCCTAAACG
	假單胞菌屬	115	TGCTGAACAGCCATXAXTGATTAACTCCTAAACG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	116	TGCTGAACAGCCATAACTGATTAACTCCTAAACG
	假單胞菌屬	117	TGCTGAACAGCCATXATXXATTAACTCCTAAACG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	118	TGCTGAACAGCCATAATCAATTAACTCCTAAACG
	假單胞菌屬	119	TGCTGAACAGCCATXAXTXATTAACTCCTAAACG，其中各X獨立地選自A、T、C或G
	假單胞菌屬	120	TGCTGAACAGCCATAACTCATTAACTCCTAAACG

表 1D ： PaIC 插入序列

陣列	SEQ ID NO	序列
crArray 1 ( 圖 1A)	83	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACAGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGAGACCGAAGAGAACGTGCCGACCACCGCCGCTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACTGCTGAACAGCCATGATTGATTAACTCCTAAACGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAG
crArray 2 ( 圖 1B)	84	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGCTCGACTGGTCGGTAACCACTTGTGTGTGGTGAGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCAGTGCATGGCAGCGAACGCCGAGAGCCGACACCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCGTAAACCTAATGGGCCTGATCTACAGTAATCTAGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGGCCGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAG
crArray 3 ( 圖 1C)	85	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGGTGCTGACCGAGGACGAGAAGGAACTGGGCGTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACTCCGCGATGAGCTGCCGTCCCAACAATTCAACACGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACACCACCGAGACGCCCACACCGTGCAAGCCGCCGGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAG
crArray 4 ( 圖 1D)	86	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGATGACACCAACCCGGCCAAGGAAGACCAGGAGTGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACAACGCGAAGCCCTGTTGAAACCGCTGCAACTGGTGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCTATCGCGAATTCCTGCAGGCTGGCGCAACCAAGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAG
crArray 5 ( 圖 1E)	87	GAAAATTATTTTAAATTTCCTCTAGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGACACCAGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACATTTATCACAAAAGGATTGTTCGATGTCCAACAAGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGCACTCCCGTTCTGGATAAT
crArray3-PAIC	24	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGGTGCTGACCGAGGACGAGAAGGAACTGGGCGTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACTCCGCGATGAGCTGCCGTCCCAACAATTCAACACGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACACCACCGAGACGCCCACACCGTGCAAGCCGCCGGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGGCCGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAGTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGCATTAAAGAGGAGAAAATGGACGCGGAGGCTAGCGATACTCACTTTTTTGCTCACTCCACCTTAAAGGCAGATCGCAGCGATTGGCAGCCTCTGGTCGAGCATCTACAGGCTGTTGCCCGTTTGGCAGGAGAGAAGGCTGCCTTCTTCGGCGGCGGTGAATTAGCTGCTCTTGCTGGTCTGTTGCATGACTTGGGTAAATACACTGACGAGTTTCAGCGGCGTATTGCGGGTGATGCCATCCGTGTCGATCACTCTACTCGCGGGGCCATACTGGCGGTAGAACGCTATGGCGCGCTAGGTCAATTGCTAGCCTACGGCATCGCTGGCCACCATGCCGGGTTGGCCAATGGCCGCGAGGCTGGTGAGCGAACTGCCTTGGTCGACCGCCTGAAAGGGGTTGGGCTGCCACGGTTATTGGAGGGGTGGTGCGTGGAAATCGTGCTACCCGAGCGCCTTCAACCACCGCCACTAAAAGCGCGCCTGGAAAGAGGTTTCTTTCAGTTGGCCTTTCTTGGCCGGATGCTCTTTTCCTGCTTGGTTGATGCGGATTATCTAGATACCGAAGCCTTCTACCACCGCGTCGAAGGACGGCGCTCCCTTCGCGAGCAAGCGCGGCCGACCTTGGCCGAGTTACGCGCAGCCCTTGATCGGCATCTGACTGAGTTCAAGGGAGATACGCCGGTCAACCGCGTTCGCGGGGAGATATTGGCCGGCGTGCGCGGCAAGGCGAGCGAACTTCCCGGGCTGTTTTCTCTCACAGTGCCCACAGGAGGCGGCAAGACCCTGGCCTCTCTGGCTTTCGCCCTGGATCACGCTCTAGCTCATGGGCTGCGCCGGGTGATCTACGTGATTCCCTTCACTAGCATCGTCGAGCAGAACGCTGCGGTATTCCGTCGTGCACTCGGGGCCTTAGGCGAAGAGGCGGTGCTGGAGCATCACAGCGCCTTCGTTGATGACCGCCGGCAGAGCCTGGAGGCCAAGAAGAAACTGAACCTAGCGATGGAGAACTGGGACGCGCCTATCGTGGTGACCACTGCAGTGCAGTTCTTCGAAAGCCTGTTTGCCGACCGTCCAGCCCAGTGCCGCAAGCTACACAACATCGCCGGCAGCGTGGTGATTCTTGACGAGGCACAGACCCTACCGCTCAAGCTGTTGCGGCCCTGCGTTGCCGCCCTTGATGAACTGGCGCTCAACTACCGTTGTAGCCCAGTTCTCTGTACTGCCACGCAGCCAGCGCTTCAATCGCCGGATTTCATCGGTGGGCTGCAGGACGTACGTGAGCTGGCGCCCGAGCCGCAGCGGCTGTTCCGGGAGTTGGTGCGGGTACGAATACGGACATTGGGCCCGCTCGAAGATGCGGCCTTGACTGAGCAGATCGCCAGGCGTGAACAAGTGCTGTGCATCGTCAACAATCGACGCCAGGCCCGTGCGCTCTATGAGTCGCTTGCCGAGTTGCCCGGTGCCCGCCATCTCACCACCCTGATGTGCGCCAAGCACCGTAGCAGCGTGCTGGCCGAGGTGCGCCAGATGCTCAAAAAGGGGGAGCCCTGTCGCCTGGTGGCCACCTCGCTGATCGAGGCCGGTGTGGATGTGGATTTTCCCGTGGTACTGCGTGCCGAGGCTGGATTGGATTCCATCGCCCAGGCCGCGGGACGCTGCAATCGCGAAGGCAAGCGGCCGCTGGCCGAAAGCGAGGTGCTGGTGTTCGCCGCGGCCAATTCTGACTGGGCGCCACCCGAGGAACTCAAGCAGTTCGCCCAGGCCGCCCGCGAAGTGATGCGCCTGCACCCGGATGATTGCCTGTCCATGGCGGCCATCGAGCGGTATTTTCGCATACTGTACTGGCAGAAGGGCGCGGAGGAGTTGGATGCGGGTAACCTGCTCGGCCTGATTGAGAGAGGCCGGCTCGATGGCCTGCCCTACGAGACTTTGGCCACCAAGTTCCGCATGATCGACAGCCTTCAACTGCCGGTGATCATCCCATTTGATGACGAGGCCAGAGCAGCCCTGCGCGAGCTGGAGTTCGCCGACGGCTGCGCCGCCATCGCCCGTCGCCTGCAGCCATATCTGGTGCAGATGCCACGCAAGGGTTATCAGGCATTGCGGGAAGCCGGTGCGATCCAGGCGGCGGCAGGTACGCGTTATGGTGAGCAGTTTATGGCGTTGGTCAACCCTGATCTGTATCACCACCAATTCGGGTTGCACTGGGATAATCCGGCCTTTGTCAGCAGCGAGCGGCTATGTTGGTAGTCGGGACGCGCAACAGCGGCCTGGCCTGGATGATGTGAAAGGGAGGGCCGATGGCCTACGGAATTCGCTTAATGGTCTGGGGCGAGCGTGCCTGCTTCACCCGCCCGGAAATGAAGGTGGAACGCGTCTCTTACGATGCGATCACGCCGTCCGCCGCGCGCGGCATTCTCGAGGCTATCCACTGGAAGCCGGCGATTCGCTGGGTGGTGGATCGCATTCAAGTGCTTAAGCCGATCCGCTTCGAATCCATCCGGCGCAACGAGGTCGGCGGCAAGCTGTCCGCTGTCAGCGTCGGTAAGGCAATGAAGGCCGGGCGTACTAATGGTCTGGTGAATCTGGTCGAGGAGGATCGCCAGCAGCGCGCGACTACTCTGCTGCGCGATGTCTCCTATGTCATCGAGGCGCATTTCGAGATGACTGACAGGGCTGGCGCCGACGATACGGTGGGCAAGCATCTGGATATCTTCAACCGTCGCGCACGGAAGGGGCAGTGCTTCCATACACCCTGCCTAGGCGTGCGCGAGTTTCCGGCCAGTTTTCGGTTGCTGGAAGAGGGCAGTGCCGAGCCTGAAGTCGATGCCTTTCTGCGCGGCGAGCGTGATCTGGGCTGGATGCTGCATGACATTGACTTCGCCGATGGCATGACCCCGCACTTCTTCCGTGCCCTGATGCGCGATGGGCTGATCGAGGTGCCGGCCTTCAGGGCGGCAGAGGACAAGGCATGATCCTTTCGGCCCTCAATGACTATTATCAGCGACTGCTGGAGCGGGGTGAAGCGAATATCTCACCCTTCGGCTACAGCCAAGAAAAGATCAGTTACGCCCTGCTGCTGTCCGCACAAGGAGAGTTGCTGGACGTGCAGGACATTCGCTTGCTCTCTGGCAAGAAGCCTCAACCCAGGCTTATGAGTGTGCCGCAGCCGGAGAAGCGCACCTCGGGCATCAAGTCCAACGTACTGTGGGACAAGACCAGCTATGTGCTGGGTGTTAGTGCCAAGGGCGGAGAGCGTACTCAGCAGGAGCACGAGTCCTTCAAGACGCTGCACCGGCAGATCTTGGTTGGGGAAGGCGACCCCGGTCTGCAGGCCTTGCTCCAGTTCCTCGACTGTTGGCAGCCGGAGCAGTTCAAGCCCCCGCTGTTCAGCGAAGCAATGCTCGACAGCAACTTAGTGTTCCGCCTAGACGGCCAACAACGCTATCTGCACGAGACTCCGGCGGCCCTGGCGTTGCGTACCCGGCTGTTGGCCGACGGCGACAGCCGCGAGGGGCTGTGCCTAGTCTGCGGCCAACGTCAGCCGTTGGCGCGCCTGCATCCAGCGGTCAAGGGCGTCAATGGTGCCCAGAGTTCGGGGGCTTCCATCGTCTCCTTCAACCTCGACGCTTTTTCCTCCTACGGCAAGAGCCAGGGGGAAAATGCTCCGGTCTCCGAACAGGCCGCCTTTGCCTACACCACGGTGCTCAACCATTTGTTGCGTCGCGACGAGCACAACCGCCAGCGCCTGCAGATTGGCGACGCGAGTGTGGTGTTCTGGGCGCAGGCGGATACTCCTGCTCAGGTGGCCGCCGCCGAGTCGACCTTCTGGAACCTGCTGGAGCCACCCGCAGATGATGGTCAGGAAGCGGAAAAGCTGCGCGGCGTGCTGGATGCTGTGGCCACGGGGCGGCCCTTGCATGAGCTCGACTCGCTAATGGAGGAAGGTACCCGCATTTTTGTGTTAGGGCTGGCGCCCAATACCTCGCGACTGTCCATTCGGTTCTGGGCAGTCGATAGCCTTGCGGTATTCACCCAGCATCTGGCCGAGCATTTCCGGGATATGCACCTTGAGCCTCTGCCCTGGAAGACGGAGCCGGCCATCTGGCGCTTGCTCTATGCTACCGCGCCCAGTCGTGACGGCAGAGCCAAGACCGAAGACGTACTCCCACAACTGGCCGGTGAAATGACCCGCGCCATCCTGACCGGCAGCCGCTATCCGCGCAGTTTGCTAGCCAACCTGATCATGCGCATGCGTGCCGACGGCGACGTCTCTGGCATACGCGTCGCGCTGTGCAAGGCCGTGCTCGCTCGCGAGGCACGCCTGAGCGGCAAAATTCACCAAGAGGAGCTACCTATGAGTCTCGACAAGGACGCCAGCAACCCCGGCTATCGCTTGGGGAGGCTGTTCGCCGTGTTGGAAGGCGCCCAGCGCGCAGCCCTGGGCGACAGGGTCAATGCCACTATCCGTGACCGCTACTACGGTGCCGCGTCCAGCACGCCAGCCACGGTTTTCCCGATACTGCTGCGCAACACACAAAACCACTTGGCCAAGCTGCGCAAGGAGAAGCCCGGACTAGCAGTGAACCTAGAGCGCGATATAGGCGAAATCATTGACGGTATGCAGAGCCAATTCCCGCGTTGCCTGCGCCTGGAGGACCAGGGACGCTTTGCTATTGGTTACTACCAACAGGCCCAGGCCCGTTTCAACCGTGGCCCCGATTCCGTCGAGTAAGGAGCAGAAGAATGACCGCCATCTCCAACCGCTACGAGTTCGTTTACCTCTTTGATGTCAGCAATGGCAATCCCAATGGCGACCCGGATGCTGGCAACATGCCGCGTCTCGATCCGGAAACCAACCAGGGGTTGGTCACTGACGTTTGCCTCAAGCGCAAGATCCGCAACTACGTCAGCCTGGAGCAGGAAAGTGCCCCCGGCTATGCCATCTATATGCAGGAAAAATCCGTGCTGAATAACCAGCACAAACAGGCCTACGAGGCGCTCGGTATCGAGTCAGAGGCAAAGAAACTGCCCAAGGACGAAGCCAAGGCGCGCGAACTGACCTCTTGGATGTGCAAGAACTTCTTCGATGTGCGTGCTTTCGGGGCGGTGATGACCACCGAGATTAATGCCGGCCAGGTGCGTGGACCGATCCAACTGGCATTCGCCACGTCTATCGACCCGGTATTGCCTATGGAGGTATCCATCACCCGCATGGCGGTGACTAACGAAAAGGATTTGGAGAAGGAACGCACCATGGGACGCAAGCACATCGTGCCTTACGGCTTGTACCGCGCCCATGGTTTCATCTCTGCCAAGTTGGCCGAGCGAACCGGCTTTTCCGACGACGACTTGGAACTGCTATGGCGCGCTTTGGCCAATATGTTCGAACACGACCGCTCGGCGGCACGTGGCGAGATGGCAGCGCGCAAGTTGATCGTCTTCAAGCATGAGCATGCCATGGGCAATGCACCCGCCCATGTGCTGTTCGGCAGCGTTAAGGTCGAGCGAGTCGAGGGGGACGCAGTTACACCAGCACGCGGTTTCCAGGATTACCGTGTCAGCATCGATGCGGAAGCTCTGCCTCAGGGCGTGAGCGTGCGCGAGTACCTCTAG
crArray1	25	ACAAGCGGCACATTGTGCCTATTGCGAATTAGGCACAATGTGCCTAATCTAACGTCATGCCAGCCACAACGGCGAGGCGCCAAGAAGGATAGAAGCCGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACAGAAGGGTCAGGGCCATGCGGTTTTTCCTCTGTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACGAGACCGAAGAGAACGTGCCGACCACCGCCGCTGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACTGCTGAACAGCCATGATTGATTAACTCCTAAACGGTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAACCATGCAAGCTTGGCGTAGGCCGCTTCGTCCCTATCAAAGCTTGGAGTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGCATTAAAGAGGAGAAAATGGACGCGGAGGCTAGCGATACTCACTTTTTTGCTCACTCCACCTTAAAGGCAGATCGCAGCGATTGGCAGCCTCTGGTCGAGCATCTACAGGCTGTTGCCCGTTTGGCAGGAGAGAAGGCTGCCTTCTTCGGCGGCGGTGAATTAGCTGCTCTTGCTGGTCTGTTGCATGACTTGGGTAAATACACTGACGAGTTTCAGCGGCGTATTGCGGGTGATGCCATCCGTGTCGATCACTCTACTCGCGGGGCCATACTGGCGGTAGAACGCTATGGCGCGCTAGGTCAATTGCTAGCCTACGGCATCGCTGGCCACCATGCCGGGTTGGCCAATGGCCGCGAGGCTGGTGAGCGAACTGCCTTGGTCGACCGCCTGAAAGGGGTTGGGCTGCCACGGTTATTGGAGGGGTGGTGCGTGGAAATCGTGCTACCCGAGCGCCTTCAACCACCGCCACTAAAAGCGCGCCTGGAAAGAGGTTTCTTTCAGTTGGCCTTTCTTGGCCGGATGCTCTTTTCCTGCTTGGTTGATGCGGATTATCTAGATACCGAAGCCTTCTACCACCGCGTCGAAGGACGGCGCTCCCTTCGCGAGCAAGCGCGGCCGACCTTGGCCGAGTTACGCGCAGCCCTTGATCGGCATCTGACTGAGTTCAAGGGAGATACGCCGGTCAACCGCGTTCGCGGGGAGATATTGGCCGGCGTGCGCGGCAAGGCGAGCGAACTTCCCGGGCTGTTTTCTCTCACAGTGCCCACAGGAGGCGGCAAGACCCTGGCCTCTCTGGCTTTCGCCCTGGATCACGCTCTAGCTCATGGGCTGCGCCGGGTGATCTACGTGATTCCCTTCACTAGCATCGTCGAGCAGAACGCTGCGGTATTCCGTCGTGCACTCGGGGCCTTAGGCGAAGAGGCGGTGCTGGAGCATCACAGCGCCTTCGTTGATGACCGCCGGCAGAGCCTGGAGGCCAAGAAGAAACTGAACCTAGCGATGGAGAACTGGGACGCGCCTATCGTGGTGACCACTGCAGTGCAGTTCTTCGAAAGCCTGTTTGCCGACCGTCCAGCCCAGTGCCGCAAGCTACACAACATCGCCGGCAGCGTGGTGATTCTTGACGAGGCACAGACCCTACCGCTCAAGCTGTTGCGGCCCTGCGTTGCCGCCCTTGATGAACTGGCGCTCAACTACCGTTGTAGCCCAGTTCTCTGTACTGCCACGCAGCCAGCGCTTCAATCGCCGGATTTCATCGGTGGGCTGCAGGACGTACGTGAGCTGGCGCCCGAGCCGCAGCGGCTGTTCCGGGAGTTGGTGCGGGTACGAATACGGACATTGGGCCCGCTCGAAGATGCGGCCTTGACTGAGCAGATCGCCAGGCGTGAACAAGTGCTGTGCATCGTCAACAATCGACGCCAGGCCCGTGCGCTCTATGAGTCGCTTGCCGAGTTGCCCGGTGCCCGCCATCTCACCACCCTGATGTGCGCCAAGCACCGTAGCAGCGTGCTGGCCGAGGTGCGCCAGATGCTCAAAAAGGGGGAGCCCTGTCGCCTGGTGGCCACCTCGCTGATCGAGGCCGGTGTGGATGTGGATTTTCCCGTGGTACTGCGTGCCGAGGCTGGATTGGATTCCATCGCCCAGGCCGCGGGACGCTGCAATCGCGAAGGCAAGCGGCCGCTGGCCGAAAGCGAGGTGCTGGTGTTCGCCGCGGCCAATTCTGACTGGGCGCCACCCGAGGAACTCAAGCAGTTCGCCCAGGCCGCCCGCGAAGTGATGCGCCTGCACCCGGATGATTGCCTGTCCATGGCGGCCATCGAGCGGTATTTTCGCATACTGTACTGGCAGAAGGGCGCGGAGGAGTTGGATGCGGGTAACCTGCTCGGCCTGATTGAGAGAGGCCGGCTCGATGGCCTGCCCTACGAGACTTTGGCCACCAAGTTCCGCATGATCGACAGCCTTCAACTGCCGGTGATCATCCCATTTGATGACGAGGCCAGAGCAGCCCTGCGCGAGCTGGAGTTCGCCGACGGCTGCGCCGCCATCGCCCGTCGCCTGCAGCCATATCTGGTGCAGATGCCACGCAAGGGTTATCAGGCATTGCGGGAAGCCGGTGCGATCCAGGCGGCGGCAGGTACGCGTTATGGTGAGCAGTTTATGGCGTTGGTCAACCCTGATCTGTATCACCACCAATTCGGGTTGCACTGGGATAATCCGGCCTTTGTCAGCAGCGAGCGGCTATGTTGGTAGTCGGGACGCGCAACAGCGGCCTGGCCTGGATGATGTGAAAGGGAGGGCCGATGGCCTACGGAATTCGCTTAATGGTCTGGGGCGAGCGTGCCTGCTTCACCCGCCCGGAAATGAAGGTGGAACGCGTCTCTTACGATGCGATCACGCCGTCCGCCGCGCGCGGCATTCTCGAGGCTATCCACTGGAAGCCGGCGATTCGCTGGGTGGTGGATCGCATTCAAGTGCTTAAGCCGATCCGCTTCGAATCCATCCGGCGCAACGAGGTCGGCGGCAAGCTGTCCGCTGTCAGCGTCGGTAAGGCAATGAAGGCCGGGCGTACTAATGGTCTGGTGAATCTGGTCGAGGAGGATCGCCAGCAGCGCGCGACTACTCTGCTGCGCGATGTCTCCTATGTCATCGAGGCGCATTTCGAGATGACTGACAGGGCTGGCGCCGACGATACGGTGGGCAAGCATCTGGATATCTTCAACCGTCGCGCACGGAAGGGGCAGTGCTTCCATACACCCTGCCTAGGCGTGCGCGAGTTTCCGGCCAGTTTTCGGTTGCTGGAAGAGGGCAGTGCCGAGCCTGAAGTCGATGCCTTTCTGCGCGGCGAGCGTGATCTGGGCTGGATGCTGCATGACATTGACTTCGCCGATGGCATGACCCCGCACTTCTTCCGTGCCCTGATGCGCGATGGGCTGATCGAGGTGCCGGCCTTCAGGGCGGCAGAGGACAAGGCATGATCCTTTCGGCCCTCAATGACTATTATCAGCGACTGCTGGAGCGGGGTGAAGCGAATATCTCACCCTTCGGCTACAGCCAAGAAAAGATCAGTTACGCCCTGCTGCTGTCCGCACAAGGAGAGTTGCTGGACGTGCAGGACATTCGCTTGCTCTCTGGCAAGAAGCCTCAACCCAGGCTTATGAGTGTGCCGCAGCCGGAGAAGCGCACCTCGGGCATCAAGTCCAACGTACTGTGGGACAAGACCAGCTATGTGCTGGGTGTTAGTGCCAAGGGCGGAGAGCGTACTCAGCAGGAGCACGAGTCCTTCAAGACGCTGCACCGGCAGATCTTGGTTGGGGAAGGCGACCCCGGTCTGCAGGCCTTGCTCCAGTTCCTCGACTGTTGGCAGCCGGAGCAGTTCAAGCCCCCGCTGTTCAGCGAAGCAATGCTCGACAGCAACTTAGTGTTCCGCCTAGACGGCCAACAACGCTATCTGCACGAGACTCCGGCGGCCCTGGCGTTGCGTACCCGGCTGTTGGCCGACGGCGACAGCCGCGAGGGGCTGTGCCTAGTCTGCGGCCAACGTCAGCCGTTGGCGCGCCTGCATCCAGCGGTCAAGGGCGTCAATGGTGCCCAGAGTTCGGGGGCTTCCATCGTCTCCTTCAACCTCGACGCTTTTTCCTCCTACGGCAAGAGCCAGGGGGAAAATGCTCCGGTCTCCGAACAGGCCGCCTTTGCCTACACCACGGTGCTCAACCATTTGTTGCGTCGCGACGAGCACAACCGCCAGCGCCTGCAGATTGGCGACGCGAGTGTGGTGTTCTGGGCGCAGGCGGATACTCCTGCTCAGGTGGCCGCCGCCGAGTCGACCTTCTGGAACCTGCTGGAGCCACCCGCAGATGATGGTCAGGAAGCGGAAAAGCTGCGCGGCGTGCTGGATGCTGTGGCCACGGGGCGGCCCTTGCATGAGCTCGACTCGCTAATGGAGGAAGGTACCCGCATTTTTGTGTTAGGGCTGGCGCCCAATACCTCGCGACTGTCCATTCGGTTCTGGGCAGTCGATAGCCTTGCGGTATTCACCCAGCATCTGGCCGAGCATTTCCGGGATATGCACCTTGAGCCTCTGCCCTGGAAGACGGAGCCGGCCATCTGGCGCTTGCTCTATGCTACCGCGCCCAGTCGTGACGGCAGAGCCAAGACCGAAGACGTACTCCCACAACTGGCCGGTGAAATGACCCGCGCCATCCTGACCGGCAGCCGCTATCCGCGCAGTTTGCTAGCCAACCTGATCATGCGCATGCGTGCCGACGGCGACGTCTCTGGCATACGCGTCGCGCTGTGCAAGGCCGTGCTCGCTCGCGAGGCACGCCTGAGCGGCAAAATTCACCAAGAGGAGCTACCTATGAGTCTCGACAAGGACGCCAGCAACCCCGGCTATCGCTTGGGGAGGCTGTTCGCCGTGTTGGAAGGCGCCCAGCGCGCAGCCCTGGGCGACAGGGTCAATGCCACTATCCGTGACCGCTACTACGGTGCCGCGTCCAGCACGCCAGCCACGGTTTTCCCGATACTGCTGCGCAACACACAAAACCACTTGGCCAAGCTGCGCAAGGAGAAGCCCGGACTAGCAGTGAACCTAGAGCGCGATATAGGCGAAATCATTGACGGTATGCAGAGCCAATTCCCGCGTTGCCTGCGCCTGGAGGACCAGGGACGCTTTGCTATTGGTTACTACCAACAGGCCCAGGCCCGTTTCAACCGTGGCCCCGATTCCGTCGAGTAAGGAGCAGAAGAATGACCGCCATCTCCAACCGCTACGAGTTCGTTTACCTCTTTGATGTCAGCAATGGCAATCCCAATGGCGACCCGGATGCTGGCAACATGCCGCGTCTCGATCCGGAAACCAACCAGGGGTTGGTCACTGACGTTTGCCTCAAGCGCAAGATCCGCAACTACGTCAGCCTGGAGCAGGAAAGTGCCCCCGGCTATGCCATCTATATGCAGGAAAAATCCGTGCTGAATAACCAGCACAAACAGGCCTACGAGGCGCTCGGTATCGAGTCAGAGGCAAAGAAACTGCCCAAGGACGAAGCCAAGGCGCGCGAACTGACCTCTTGGATGTGCAAGAACTTCTTCGATGTGCGTGCTTTCGGGGCGGTGATGACCACCGAGATTAATGCCGGCCAGGTGCGTGGACCGATCCAACTGGCATTCGCCACGTCTATCGACCCGGTATTGCCTATGGAGGTATCCATCACCCGCATGGCGGTGACTAACGAAAAGGATTTGGAGAAGGAACGCACCATGGGACGCAAGCACATCGTGCCTTACGGCTTGTACCGCGCCCATGGTTTCATCTCTGCCAAGTTGGCCGAGCGAACCGGCTTTTCCGACGACGACTTGGAACTGCTATGGCGCGCTTTGGCCAATATGTTCGAACACGACCGCTCGGCGGCACGTGGCGAGATGGCAGCGCGCAAGTTGATCGTCTTCAAGCATGAGCATGCCATGGGCAATGCACCCGCCCATGTGCTGTTCGGCAGCGTTAAGGTCGAGCGAGTCGAGGGGGACGCAGTTACACCAGCACGCGGTTTCCAGGATTACCGTGTCAGCATCGATGCGGAAGCTCTGCCTCAGGGCGTGAGCGTGCGCGAGTACCTCTAG

實例 2 ： 外源性 Cas 操縱子及 crRNA 間隔子殺滅細菌。

具有功能性I-C型Cas操縱子之綠膿桿菌菌株用僅Cas質體或含crRNA之質體轉型。在內源性I-C型Cas系統存在下，crRNA之表現使得細菌自靶向且降解其自身的DNA。藉由計數在瓊脂盤上生長之菌落之數目以及特異性針對質體之抗生素選擇來確定轉型體之數目。唯一可形成菌落之細菌為獲得質體且經受住自靶向之彼等細菌。此等資料展示外源性Cas表現相比於內源性系統改良自靶向，且在不存在內源性系統時起作用，如圖 2A中所見。上部兩個圖展示將僅Cas質體、含有單個靶向間隔子之質體或含有3個間隔子之靶向陣列之質體轉型為含有內源性I-C型Cas系統之菌株的結果。在此實驗設置中，個別間隔子或陣列與內源性Cas系統一同起作用且足以殺滅大部分轉型體。下圖展示將外源性I-C型Cas操縱子添加至crRNA質體進一步增強轉型後的殺滅能力，存在之細菌的水準低於偵測水準。

將質體轉型為不含功能性I-C型Cas操縱子之綠膿桿菌菌株。經轉型質體表現單獨的間隔子陣列或間隔子陣列及I-C型Cas操縱子。圖 2B展示每毫升轉型為綠膿桿菌菌株b1121之Cas操縱子無效突變體所獲得的細菌轉型體之數目。陣列1靶向細菌，而陣列2為非靶向對照。不同質體藉由莫耳濃度標準化為空載體對照質體。當細胞經Cas及靶向陣列1兩者轉型時，偵測之轉型體之數目降低。當與用空載體接收之轉型體之數目相比時，僅經靶向陣列1轉染或經Cas及非靶向陣列2轉染之細胞不展示轉型體數目的降低。

將含有個別間隔子或獨特陣列之質體轉型為具有內源性I-C型Cas系統之綠膿桿菌菌株b1121，或相同菌株之Cas操縱子無效突變體。在b1121轉染之細胞中觀測到細胞死亡，但在Cas操縱子無效突變體中未觀測到。如圖 2C中所描繪之此等資料指示靶向rpoB及ftsA之個別間隔子以及陣列3及陣列4能夠與內源性I-C型Cas系統一起工作以殺滅細胞。實例 3 ：經 CRISPR-Cas 完整構築體工程化之噬菌體的穩定性

圖 3A描繪野生型噬菌體p1772及其工程化變異體之基因體的示意圖。基因體軸下方之條指示經移除及替換之基因體區域。噬菌體基因體下方之示意圖說明用於替換經缺失區域中之WT噬菌體基因的DNA。CRISPR陣列crArray 1、crArray 3及crArray 4靶向細菌且預期在活性I-C型Cas系統存在下殺滅細菌。crArray 2由非靶向間隔子製成，但在結構上與三個靶向陣列相同，且充當展示I型Cas特異性自靶向活性的對照。

攜帶CRISPR-Cas3構築體之噬菌體經連續繼代以評估噬菌體基因體中所含之重複序列的穩定性。p1772e005在綠膿桿菌菌株b1126 (I-F型菌株)上連續擴增。擴增一至八以一步擴增形式進行，其中將50 μL細菌隔夜培養物添加至15 mL法爾康管(falcon tube)中之5 mL LB中，接著立即添加1 µL先前的溶解物。使混合物在37℃下在振盪培育箱中生長10-16小時。培育後，將噬菌體-細菌混合物在5,000 rcf下離心10 min，且將上清液經由0.45 µm針筒過濾器過濾且儲存於4℃下。對於擴增九，將擴增八之連續十倍稀釋液點樣至菌株b1121或b1126之軟瓊脂覆層上。用移液管自各盤上挑取單個斑塊至200 µL PBS中，以獲得擴增九。將十微升擴增九添加至50 µL b1121或b1126隔夜及5 mL LB，接著生長約16小時，隨後離心及過濾。對於桑格定序，使用側接工程化位點之引子藉由PCR自溶解物擴增噬菌體DNA。桑格及NGS定序確認CRISPR-Cas3構築體在負載至噬菌體基因體上時之穩定性及完整性(展示於圖 3B中)。實例 4. CRISPR 構築體之噬菌體形態

將1.5 mL粗溶解物在4℃及24,000 × g下離心1小時。平緩地丟棄一部分上清液(大約1.4 mL)，且將1 mL乙酸銨(0.1 M，pH 7.5)添加至剩餘溶解物中，接著將其離心。此步驟進行兩次。洗滌之噬菌體樣品藉由陰性染色穿透式電子顯微術觀測。使輝光放電的弗姆瓦(formvar)/碳塗佈之400目銅網格(Ted Pella, Inc., Redding, CA)漂浮在25 µL樣品懸浮液液滴上五分鐘，快速轉移至兩滴去離子水中，接著用一滴2%醋酸鈾醯水溶液染色30秒。網格用濾紙吸乾且風乾。使用在80 kV下操作之JEOL JEM-1230穿透式電子顯微鏡觀測樣品，且使用帶有Gatan Microscopy Suite 3.0軟體之Gatan Orius SC1000 CCD相機獲取影像。結果例示於圖 4中。在修飾之後，噬菌體形態不存在明顯可觀測的改變。實例 5. 經 CRISPR-Cas 完整構築體工程化之噬菌體的擴增

將p1772wt (野生型)及工程化變異體p1772e004 (僅Cas系統)及p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)與b1126之指數生長培養物以1之感染倍率(MOI)混合。在感染後0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h 10 min及24 h時，收集樣品用於斑塊形成單位(PFU)計數( 圖 5A -5B)以及RNA分離及定量。對於PFU計數，在各時間點收集之樣品經由0.45 µm過濾器過濾以自宿主細菌分離噬菌體。如針對載片3所描述製備軟瓊脂覆層。將噬菌體樣品之10倍連續稀釋液點樣至覆層上且在37℃下培育。第二天，對斑塊進行計數且用於計算初始樣品中之PFU/mL。基於此等資料，未觀測到噬菌體生長型式的顯著差異且各噬菌體達到相似的最大效價。

p1772wt、p1772e004及p1772e005稀釋至1e6之粒子計數，且各個別噬菌體用於以0.01之MOI感染一組34種不同細菌。在20小時時程內每小時擷取600 nm波長下之光學密度(OD)讀數。所得OD讀數用於在三種噬菌體中之一者存在下生成細菌生長曲線。積分用於計算各生長曲線之曲線下面積(AUC)，其中噬菌體添加後的較小AUC表明細菌負荷降低。藉由監測培養物隨時間推移之OD600 (濁度)來確定宿主範圍，以獲得細菌生長曲線，其中引入之噬菌體的起始量指示於圖底部(輸入噬菌體效價，以斑塊形成單位/毫升計)。在存在及不存在噬菌體之情況下比較給定菌株之AUC。圖 5C例示AUC比，其中將在存在噬菌體之情況下菌株生長之AUC計算值除以在不存在噬菌體之情況下菌株生長之AUC。各列表示獨特菌株。熱圖中較暗的值指示細菌負荷之降低幅度更大。若(在存在噬菌體之情況下的AUC)/(在不存在噬菌體之情況下的AUC)為小於0.65，則認為噬菌體感染給定菌株。AUC比之熱圖表明，在此分析中，工程化噬菌體變異體具有與野生型親本相當的宿主範圍。p1772wt、p1772e004及p1772e005之宿主範圍彼此類似且在分析之誤差內。藉由成斑對AUC命中之宿主範圍確認顯示WT與CRISPR-Cas3之間無差異。

表 2展示來自兩個獨特的含有完整構築體之工程化噬菌體pArray3 (靶向crArray3+Cas系統)及pArray4 (靶向crArray4+Cas系統)之代表性生長實驗的資料。在此分析中，藉由用單一細菌菌落接種LB生長培養基且如「輸入PFU/mL」欄中所指示添加噬菌體來進行擴增。將擴增物培育隔夜。培育後，藉由過濾移除細菌且藉由軟瓊脂覆層方法定量溶解物中之噬菌體效價。溶解物之效價指示於「輸出PFU/mL」欄中。此等資料表明工程化噬菌體有效地複製。此等資料亦證明滴定分析之相對精確度。表 2 ： pArray3 及 pArray4 之生長

噬菌體名稱	複本	輸入PFU/ml	輸出PFU/ml	增加倍數
pArray3	1	3.00e+6	2.25e+9	750
pArray3	2	1.90e+6	4.00e+9	2105
pArray4	1	1.00e+5	8.00e+9	80000
pArray4	2	5.00e+5	2.50e+9	5000

實例 6. 工程化噬菌體中之 CRISPR-Cas 系統表現

此實例展示Cas系統及crArray成功地自噬菌體基因體表現。圖 6A描繪工程化至p1772及本文所述之其他噬菌體中之間隔子陣列(crArray)及Cas操縱子的排列。箭頭表示用於基因表現之定量反轉錄PCR (qRT-PCR)分析之引子對的結合位置。

不含Cas操縱子之p1772wt (野生型)用作對照。對於RNA分離，將在各時間點收集之樣品直接添加至RNAprotect。將樣品在室溫下培育5分鐘，持續10分鐘且以5000 × g離心，且丟棄上清液。將集結粒儲存在-80℃下。接著使用Qiagen RNeasy Mini套組分離RNA。使用BioRad iScript cDNA合成套組合成cDNA。使用BioRad SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix進行qRT-PCR。所有資料均為兩個生物複本之平均值。倍數變化為2 ^-ΔΔCt，使用綠膿桿菌基因 rpsH作為管家基因且將在相同時間點的各資料點與僅細胞對照進行比較。

圖 6B-6D展示在藉由噬菌體p1772之不同變異體感染綠膿桿菌菌株之後，指定RNA之相對表現量。此等圖表中之資料呈現為相比於不存在噬菌體之媒劑對照的表現之倍數變化。各時間點均標準化為該時間點之未感染對照。藉由使用細菌管家基因 rpsH標準化樣品來解釋細菌濃度之變化。此等資料表明在感染綠膿桿菌時，噬菌體產生crArray、 Cas3及 Cas8c轉錄本。圖B-D中所用之細菌宿主含有內源性Cas操縱子，因此p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)與p1772wt之間的差異表示噬菌體介導之表現相比於內源性表現的增加。

圖 6E展示來自不同工程化噬菌體基因體之 cas3mRNA的相對表現。此等資料表明在感染後1 h，來自p1772e005之 cas3表現比來自兩種其他工程化噬菌體，亦即p2131e002 (靶向crArray1+Cas系統)及p2132e002 (靶向crArray1+Cas系統)之表現更多。然而，在感染後24 h，噬菌體表現接近相同量之 cas3。此等資料係藉由比較 cas3RNA表現與噬菌體gDNA之量且在感染後1 h標準化為p1772e005來計算。此等分析中所用之菌株為Cas空，因此內源性 cas3表現無貢獻。實例 7. 經 CRISPR-Cas 完整 構築體工程化時之噬菌體溶解活性

藉由在含有10 mM MgCl ₂及10 mM CaCl ₂之LB中混合100 µL p1772指示菌株b1121之飽和隔夜培養物與6 mL 0.375%瓊脂來製備頂部瓊脂覆層。在頂部瓊脂固化之後，將p1772wt (野生型)及p1772e004 (僅Cas系統)及p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)之連續10倍稀釋系列的2 µL液滴點樣至頂部瓊脂表面上。將盤在37℃下培育約18 h，接著使用Keyence BZ-X800顯微鏡以4×及10×放大率成像。圖 7說明p1772噬菌體之改良斑塊形態。觀測到野生型噬菌體之形態產生模糊斑塊，而工程化變異體p1772e005產生大小相似的斑塊，該斑塊具有模糊暈圈但中心清晰。此資料表明p1772e005比p1772wt更完全地殺滅細菌。實例 8 ：含有 crArray 及 Cas 操縱子之噬菌體比僅含 crArray 之 噬菌體更有效地殺死細菌

將p1772野生型及工程化噬菌體與對數生長之細菌混合且立即塗鋪於LB瓊脂上之2 μl點中。經由稀釋系列改變噬菌體與細菌之比，以使得細菌的量在每次稀釋時保持恆定，但噬菌體的量為1至4稀釋。在最高稀釋度下，感染倍率(MOI)為100，意謂每個細菌存在大約100個噬菌體。在圖 8A中，p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)及p1772e006 (僅靶向crArray1)均在隔夜培育之後始終殺死大部分存在於I-C型菌株中之細菌，如由彼等點中幾乎無細菌菌落生長所指示，而野生型噬菌體不控制對照細菌集落形成。因此，野生型及p1772e004 (僅Cas系統)無法控制細菌複製，即使在100之MOI下亦如此。圖 8B展示由於細菌中之內源性Cas系統，p1772e006在此菌株中比野生型更有效地殺滅細菌，然而，其似乎不如亦含有外源性Cas系統之噬菌體(p1772e005)有效。此係因為隨著培育時間延長，相比於p1772e005，暴露於p1772e006之點中形成菌落的細菌更多。

圖 8C為來自圖8A-8B中進行之相同類型分析之單一MOI的定量。相比於圖8A-8B，圖C中之菌株不具有內源性Cas系統，但具有mCherry基因之基因體整合複本。對盤進行成像且定量各點之螢光。顯示1.5 MOI的結果，但高於0.4之MOI均具有與1.5 MOI一致的結果。由於缺乏內源性Cas系統，因此僅crArray噬菌體(p1772e006)的行為與野生型噬菌體類似。含有非靶向crArray之完全工程化噬菌體(p1772e008)相對於野生型亦未得到改良。然而，含有靶向crArray之完全工程化噬菌體(p1772e005)在比任何其他噬菌體變異體顯著更大的程度上抑制細胞生長。此資料顯示完全工程化變異體不需要內源性Cas系統即可有效。

具有活性內源性I-C型Cas系統之綠膿桿菌菌株(b1121)生長至對數中期，且在液體培養物中以指定感染倍率(MOI)感染噬菌體。在所有情況下，噬菌體均成功地殺滅細菌，如圖 9A-9C中所描繪，由恢復之菌落形成單位(CFU)/mL相比於未感染對照減少指示。p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)及p1772e006 (僅靶向crArray1)均比野生型噬菌體更有效地殺滅細菌。相對於p1772wt (野生型)或自靶向變異體，p1772e004 (僅Cas系統)不具有經改良活性，表明需要自靶向crRNA及I型CRISPR-Cas組分兩者以改良噬菌體功效。值得注意的是，p1772e006及p1772e005在相等程度上被殺滅，表明工程化噬菌體變異體能夠藉由在相容及活性Cas系統存在下自噬菌體表現靶向細菌之Cas系統來殺滅。此等圖中之點線表示分析之偵測極限(LOD)。未獲得菌落之樣品顯示於LOD處。實例 9 ： 靶向間隔子之多種不同綠膿桿菌改良了噬菌體功效

將p1772野生型及工程化噬菌體變異體與對數生長之表現mCherry之細菌混合且立即塗鋪至LB瓊脂上。噬菌體與細菌之比率藉由進行噬菌體之稀釋系列而改變，使得在各點中細菌之量保持恆定但噬菌體之量改變。最高感染倍率(MOI)為100，意謂每個細菌存在大約100個噬菌體。隔夜培育後，藉由用亮場及mCherry螢光對盤成像來記錄細菌生長。基於此等影像對樣品進行定量。

五種不同噬菌體變異體用於確定用外源性I-C型Cas系統遞送非靶向crRNA之溶解噬菌體(p1772e008)、無外源性CRISPR-Cas系統之單獨的自靶向crRNA (p1772e006)、用外源性I-C型Cas系統遞送之兩種不同自靶向crArray (pArray3及pArray4)及親本野生型噬菌體(p1772wt)的效應。在此等分析中，不具有任何內源性Cas系統之綠膿桿菌菌株及指定噬菌體以指定比率組合且立即塗鋪於LB盤上。此等分析中所用之宿主菌株為Cas-空且具有染色體整合的mCherry基因，以促進經由量測相對螢光來觀測及定量細菌。結果描繪於圖 10A-10B中。較深色點表示較高細菌生長。各影像右側之數值表示感染倍率(MOI)。在最高MOI下，每1個細菌存在大約100個噬菌體。此等盤影像展示在較高MOI下，噬菌體pArray3及pArray4 (均為編碼活性I-C型Cas系統之p1772噬菌體，且各自具有各由三個不同自靶向間隔子構成之獨特crArray)比p1772wt、具有Cas操縱子及非靶向間隔子之噬菌體(p1772e008)或含有crArray但不含外源性Cas系統之p1772 (p1772e006)更有效地殺滅綠膿桿菌。如所預期，僅crRNA噬菌體(p1772e006)不改良噬菌體功效，因為該細菌不具有內源性Cas系統。

圖 10C為圖 10A中之框的更高解析度視圖，且突出顯示完全工程化噬菌體(pArray3)與僅具有crArray且無Cas操縱子之噬菌體(p1772e006)之間的差異。在底列(MOI 0.00610)，pArray3形成之斑塊比p1772e006更清晰(亦即，pArray3樣品中之光點更亮)。在頂列(MOI 0.0244)，pArray3比p1772e006更好地抑制細菌生長(暗點)。

圖 10D-10E展示圖10A及圖10B中所示之相同盤之對應螢光影像的第四列向下(MOI 約1.5)的定量，圖10A及圖10B定量存在之螢光細菌的相對量。與亮場影像一致，在約1.5之MOI下，相比於用野生型噬菌體或非靶向(p1772e008)及僅crArray (p1772e006)工程化噬菌體處理之樣品，用pArray3及pArray4處理之樣品具有顯著更少螢光信號(指示活細菌細胞的損失)。實例 10 ： 以不同啟動子驅動 cas 操縱子表現之 crArray/Cas 插入物的功效。

將p1772野生型及工程化噬菌體變異體與對數生長之表現mCherry之細菌混合且立即塗鋪至LB瓊脂上。噬菌體與細菌之比率藉由進行噬菌體之稀釋系列而改變，使得在各點中細菌之量保持恆定但噬菌體之量改變。最高感染倍率(MOI)為100，意謂每個細菌存在大約100個噬菌體。隔夜培育後，藉由用亮場及mCherry螢光對盤成像來記錄細菌生長。基於此等影像對樣品進行定量。圖 11A展示藉由p1772野生型及含有由不同啟動子表現之Cas系統及crArray之多個工程化噬菌體變異體的細菌殺滅。所有工程化噬菌體變異體均具有與p1772e005相同的結構(參見圖 3A)且不同之處僅為驅動Cas操縱子表現之啟動子的標識。p1772e016使用驅動綠膿桿菌中之內源性I-C型Cas系統的啟動子。p1772e005、p1772e017、p1772e021均使用大腸桿菌啟動子或大腸桿菌細菌啟動子之衍生物。p1772e018、p1772e022及p1772e023均使用綠膿桿菌細菌啟動子。p1772e019及p1772e020使用綠膿桿菌噬菌體啟動子。在塗鋪各點之前，兩個盤來自相同分析且對照(p1772wt及p1772e005)來自相同噬菌體-細菌混合物。所用細菌宿主菌株為自染色體表現mCherry之Cas-空綠膿桿菌菌株。個別影像使用4×物鏡及亮場照明獲取，接著拼接在一起以獲得此處所示之影像。圖 11B展示圖 11A中所示之相同盤之對應螢光影像之第四列向下(MOI約1.5)的定量。在使用之不同啟動子中觀測到總體功效的差異，由相比於p1772wt顯著較少的螢光信號(指示活細菌細胞的損失)所指示。實例 11 ： 多個不同噬菌體具有改良之對數減少功效

將野生型及工程化噬菌體變異體與對數生長之表現mCherry之細菌混合且立即塗鋪至LB瓊脂上。所示之結果來自1.5之感染倍率(MOI)，意謂每個單一細菌存在大約1.5個噬菌體。隔夜培育後，藉由對盤進行mCherry螢光成像來記錄細菌生長。基於此等影像對樣品進行如圖 12A-12B中所描繪之定量。測試兩種獨特野生型噬菌體(p2131及p2973)及其含有Cas系統及crArray 1之工程化對應物(p2132e002及p2973e002)。在約1.5之MOI下，工程化噬菌體具有比野生型噬菌體少得多的活細菌。此等結果展示噬菌體遞送之Cas系統在多個獨特噬菌體中起作用。實例 12 ： 間隔子陣列 /Cas 插入物在替代性噬菌體及假單胞菌屬菌株中之功效

用p4209wt (野生型)及p4209e002 (靶向crArray1+Cas系統)針對一組假單胞菌屬菌株進行分析。簡言之，將早期對數期細菌培養物與噬菌體混合以獲得圖中列出之最終效價。立即(t=0 h)及在37℃下培育3及24 h之後塗鋪樣品。對盤進行成像，且將野生型與完整構築體變異體之間的差異製成表格。將p4209野生型及工程化噬菌體變異體與對數生長之細菌混合且立即塗鋪至LB瓊脂上，或在塗鋪之前在液體中培育指定時間量。噬菌體與細菌之比率藉由進行噬菌體之稀釋系列而改變，使得在各點中細菌之量保持恆定但噬菌體之量改變。隨著細菌複製且死於噬菌體，噬菌體與細菌之相對比率在實驗過程中變化。在隔夜培育之後，藉由對盤成像來記錄細菌生長。各組影像頂部之標籤表示該影像中顯示之菌株的Cas類型。圖 13A展示此分析之結果。在所有時間點之菌株b2550中，相比於1×10 ⁹PFU/mL之效價下之p4209wt，p4209e002在相同效價下完全抑制細菌生長。在t=0 h之菌株b2631中，在1×10 ⁵PFU/mL之效價下針對p4209e002未觀測到生長，而在相同效價下針對p4209wt之生長明顯更大。在t=3 h之相同菌株中，在任何效價下針對p4209e002均未觀測到生長，而在所有效價下針對p4209wt存在可見生長。在t=0 h之菌株b2816中，在1×10 ⁹PFU/mL之效價下針對p4209e002觀測到的生長略少於相同效價下之p4209wt。在t=3 h之相同菌株中，在1×10 ⁹PFU/mL之效價下針對p4209e002觀測到極少生長，而在相同效價下針對p4209wt存在顯著生長。在t=0 h之菌株b2825中，在1×10 ⁷PFU/mL之效價下針對p4209e002未觀測到生長，而在相同效價下針對p4209wt觀測到顯著生長。在t=3 h之相同菌株中，在1×10 ⁹PFU/mL及1×10 ⁷PFU/mL之效價下針對p4209e002觀測到一些生長，而在相同效價下針對p4209wt存在明顯更多生長。總之，此等資料展示獨特噬菌體p4209e002對若干無關綠膿桿菌菌株具有改良之Cas及crRNA間隔子活性。

p4209wt、p4209e001 (僅Cas系統)及p4209e002 (靶向crArray1+Cas系統)在多個菌株上成斑以檢查成斑效率。綠膿桿菌菌株b1121同等支持所有變異體且作為效價參考提供。在綠膿桿菌菌株b2631上，野生型變異體以顯著降低之水準成斑，僅Cas變異體根本不成斑，且完全工程化變異體在相比於b1121無效率損失之情況下成斑。在綠膿桿菌菌株b2816上，野生型或僅Cas變異體均未顯示任何活性證據，而完全工程化變異體產生清除區。在綠膿桿菌菌株b2825上，野生型及僅Cas變異體之成斑效率顯著降低，而完全工程化變異體維持與b1121相當的效率。b2631及b2825均展示具有不利影響之工程化事件(Cas系統的插入)之實例-亦即成斑效率降低(b2631)或斑塊清晰度降低(b2825)。在兩種情況下，添加靶向crArray (其使得Cas系統具有活性)均不僅挽救了降低的活性，而且提高了活性，超過野生型親本中所見之活性。盤影像底部之標籤表示該影像中顯示之菌株及其含有之內源性Cas系統的類型。此等結果進一步支持Cas系統及靶向crArray改良噬菌體複製及殺滅各種菌株之能力。實例 13. 活體內功效研究

圖 15A概述用於使用p1772wt (野生型)及p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)進行活體內功效模型化的材料及方法。來自Envigo之雌性ICR小鼠經由在第-4及-1天兩次腹膜內注射環磷醯胺(分別為150 mg/kg及100 mg/kg)而致使嗜中性球減少。在誘導嗜中性球減少症之後，藉由單次肌內注射使小鼠感染綠膿桿菌b1121。先前模型開發確定約5e6 CFU為此特定菌株之理想接種物。在感染後(p.i)3 h，小鼠藉由在受感染大腿中單次肌內注射而用媒劑(1× TBS+10 mM鹽)、p1772wt或p1772e005治療。左下方的表詳述在各實驗中遞送至各受感染大腿之總PFU。。在接種後的指定時間點將小鼠安樂死且收集大腿肌肉。使用珠粒攪拌器系統均質化大腿。均質物經連續稀釋及塗鋪以進行CFU定量。均質物亦經由0.45 μm過濾器過濾。濾液經連續稀釋及塗鋪以在b1121覆層盤上進行PFU定量。所有CFU及PFU量測均標準化為g組織。

各實驗均顯示細菌菌落形成單位(CFU)及噬菌體斑塊形成單位(PFU)。圖 15B-15C展示小鼠中之噬菌體功效，其中噬菌體經肌內投與。在指定時間點收集大腿肌肉組織。兩個複本均展示完全工程化噬菌體在比野生型噬菌體更大的程度上減少定殖。圖 15D展示小鼠中之噬菌體功效，其中噬菌體經靜脈內投與。在指定時間點收集大腿肌肉組織。完全工程化噬菌體在比野生型噬菌體更大的程度上破壞細菌。總之，來自圖15B-15D之此等資料表明藉由不同途徑遞送之噬菌體進入大腿且殺滅細菌。在每個時間點，用完全工程化噬菌體治療之小鼠之大腿組織的CFU/g低於用野生型噬菌體治療之小鼠的CFU/g。圖 15E為展示在小鼠感染模型中建立噬菌體治療之劑量-反應之模型之實驗設計的示意圖。此實驗與圖 15A中所示之實驗類似地進行，但另外包括抗生素治療組以表示當前標準照護。噬菌體劑量亦在不同組之間滴定。

圖 15F展示用不同劑量之噬菌體或抗生素對小鼠進行治療的結果。總體而言，此等資料表明工程化p1772e005在小鼠感染模型中比p1772wt更有效。此外，工程化噬菌體之表現優於給與之抗生素治療。在圖B-D及F中，資料展示為平均值±SEM。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。使用單因素變異數分析與多重比較或雙因素變異數分析與杜凱氏檢驗(Tukey's test)來確定統計顯著性。實例 14. 活體內功效研究

將b1121之培養物生長隔夜，反稀釋至LB + 10 mM MgCl ₂+ 10 mM CaCl ₂中且生長至0.45之OD600。培養物經分離且用LB/鹽(僅細胞對照)、p1772e005 (MOI = 0.1)、PB1e002 (MOI = 0.1)或p1772e005 + PB1e002之混合液(MOI = 0.1/噬菌體)處理。所有樣品在37℃下在微量滴定盤中振盪培育24 h且每10分鐘量測630 nm處之OD。資料呈現為12個複本之平均值。誤差條表示標準差。資料展示兩種完整構築體噬菌體之混合液在比任一噬菌體自身更大的程度上抑制培養物反彈。圖 16展示p1772e005與PB1e002之間的協同性。實例 15 ： 不同重複序列之活性

綠膿桿菌培養物之培養物經包含不同重複序列之載體轉型。載體為空載體pUCP19 (空載體)或含有pUCP19載體，該載體包含假單胞菌屬I C型Cas系統及靶向由表 3中所列出之重複序列側接之gyrB基因的間隔子。自各測試條件獲取等分試樣，稀釋且點樣至計數之細菌CFU。表 3 ：重複序列

SEQ ID NO	重複序列	序列
26	重複序列1	GTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGATTGAAAC
27	重複序列2	GTCGCGCCCCGCACGGGCGCGTGGAGTGAAAG
28	重複序列3	GTCGCGCCCCGCACGGGTGCGTGGATTGAAAC
29	重複序列4	GTCGCGCCCCGCATGGGCGCGTGGATTGAACA
30	重複序列5	GTCGCGCCCTACGCGGGCGCGTGGAGTGAAAG

此分析之結果描繪於圖 17中。特異性序列產生不同數目個轉型體。重複序列1及重複序列3均導致轉型體之數目低於空載體或經重複序列2、4或5轉型之細菌。此表明重複序列之序列影響假單胞菌屬培養物中之噬菌體靶向的功效。實例 16 ： 設計及驗證靶向目標細菌之間隔序列 間隔子設計

使用以下方案設計間隔序列。首先，獲取所關注生物體/物種/靶標之代表性基因體的適合搜尋集。適合資料庫之實例包括NCBI genbank及PATRIC (Pathosystems Resource Integration Center)資料庫。基因體經由FTP (檔案傳送協定)伺服器大量下載，實現快速及程式化資料集獲取。

用相關參數搜尋基因體以定位適合之間隔序列。基因體可沿正向及反向互補序列方向自開始至結束讀取，以定位含有PAM (前間隔子相鄰模體)位點之連續DNA伸長部。間隔序列將為在PAM位點之3'附近的N-長度DNA序列，其中N特定於所關注Cas系統且一般提前已知。表徵PAM序列及間隔序列一般在Cas系統之發現及初始研究期間進行。每一觀測之PAM相鄰間隔子均可保存至檔案及/或資料庫以供下游使用。

隨後，使用以下方法確定用於CRISPR工程化噬菌體之間隔子的品質。首先，可評估各觀測之間隔子以確定其存在於多少經評估基因體中。可另外評估觀測之間隔子以查看其可在各給定基因體中出現多少次。每個基因體在超過一個位置出現之間隔子可為有利的，因為若發生突變，則Cas系統可能無法識別目標位點，且各額外「備份」位點增加將存在適合之非突變目標位置的可能性。可評估觀測之間隔子以確定其是否出現在基因體之功能註釋區域中。若此類資訊可用，則可進一步評估功能註釋以確定基因體之彼等區域是否對生物體之存活及功能「必不可少」。聚焦於在所有或幾乎所有評估之所關注基因體(＞= 99)中出現之間隔子確保廣泛適用性以證明間隔子選擇的合理性。若存在保守間隔子的大型選擇池，則可優先考慮出現在具有已知功能之基因體區域中的間隔子，其中若彼等基因體區域對存活「必不可少」且每個基因體出現超過1次，則更優先考慮。 間隔子驗證

鑑別之間隔序列可接著藉由完成以下程序來驗證。首先，鑑別在所關注生物體中複製且具有可選標記(例如抗生素抗性基因)之質體。編碼Cas系統之基因插入至質體中，使得其將在所關注生物體中表現。在Cas系統上游，包括經所關注生物體識別以驅動Cas系統之表現的啟動子。在啟動子與Cas系統之間，包括經所關注生物體識別之核糖體結合位點(RBS)。

隨後，將已在生物資訊學上鑑別之基因體靶向間隔子插入至表現Cas系統之質體中。在重複序列-間隔子-重複序列上游，包括經所關注生物體識別以驅動crRNA之表現的啟動子。此類啟動子之實例列於表 1B中。此選殖必須在未由所選殖間隔子靶向之生物體或菌株中進行。

接著，將非靶向間隔子插入至表現Cas系統之質體中。此間隔子之序列可隨機生成且隨後在生物資訊學上確認為在所關注生物體之基因體中不具有靶向位點。在重複序列-間隔子-重複序列上游，包括經所關注生物體識別以驅動crRNA之表現的啟動子。

接下來，確定各測試間隔子之殺滅功效。將表 4中所列之質體標準化為相同莫耳濃度。藉由轉型、結合或任何其他將質體引入至細胞中之方法將各質體轉移至所關注生物體。將經轉型細胞塗鋪至適當的選擇性培養基(例如含抗生素之瓊脂)上。在細胞生長成集落之後，對由各不同質體轉移產生之集落進行計數。與含有非靶向間隔子之對照質體相比，轉移速率顯著更低的含有靶向間隔子之質體被視為成功靶向細菌基因體。表 4 ： 所用質體及對照

質體	功能
空主鏈載體	質體轉移效率之對照
含有Cas系統之載體	Cas系統毒性之對照
含有Cas系統及非靶向間隔子之載體	脫靶效應之對照
含有Cas系統及靶向間隔子之載體	測試樣品

實例 17 ： 經純化綠膿桿菌噬菌體宿主範圍分析

獲得經純化綠膿桿菌噬菌體之資料，據報導係組合液體及成斑宿主範圍分析之最佳結果。最終結果為給定噬菌體加菌株組合在液體及成斑宿主範圍內之二元命中的中值。液體宿主範圍包括向364孔盤之孔中添加5μL冷凍、OD控制的培養材料、5μL已知效價噬菌體材料及40μL生長培養基，以及適當培養物、噬菌體及僅培養基對照。將盤在37℃下培育20小時，同時振盪，且每小時藉由液體處理器獲取OD600讀數。藉由確定添加噬菌體之樣品與其各別對照之覆蓋面積(AUC)之間的比率來計算結果。AUC比低於0.65之樣品被視為正(+)命中，而AUC比大於或等於0.65為負(-)命中。對於成斑宿主範圍分析，培養所關注菌株且針對原噬菌體進行篩選。將所關注噬菌體在微量滴定盤上連續稀釋50倍，自未稀釋至在1× PBS中稀釋為50-3。倒入用作效價宿主之菌株的瓊脂覆層且使其靜置隔夜。第二天，對所關注菌株之溶解物進行點樣。在15-20 min後，使用Hamilton-STAR-C062對盤進行成像，且手動計數或穿過內部開發的影像分析管道進行轉換、背景減除及計數。具有正(+)數個斑塊形成單位之樣品被視為命中。涉及綠膿桿菌、野生型普納病毒噬菌體亞型及工程化普納病毒噬菌體亞型之此分析的結果在表 5A中列出。涉及綠膿桿菌、野生型沙穆納病毒噬菌體亞型、工程化沙穆納病毒噬菌體亞型、野生型匹克茲病毒、野生型PhiKMV病毒及野生型布魯伊諾格病毒之此分析的結果在表 5B中列出。如表 5A中所列，野生型普納病毒噬菌體亞型為p1106、p1587、p1835、p2037、p2363、p2421及pb1，而工程化普納病毒噬菌體亞型為p1106e003、p1587e002、p1835e002、p2037e002、p2363e003及p2421e002。如表 5B中所列，野生型沙穆納病毒噬菌體亞型為p1772、p2131、p2132及p2973，工程化沙穆納病毒噬菌體亞型為pb1e002、p1772e005、p2131e002、p2132e002及p2973e002，野生型匹克茲病毒噬菌體亞型為p1194及p4430，野生型PhiKMV病毒噬菌體亞型為p2167，且野生型布魯伊諾格病毒噬菌體亞型為p1695及p3278。表 5A ： 綠膿桿菌噬菌體宿主範圍

靶標

野生型 普納病毒

工程化 普納病毒

p1106

p1587

p1835

p2037

p2363

p2421

pb1

p1106e003

p1587e002

p1835e002

p2037e002

p2363e003

p2421e002

pb1e002

b002548

+

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b002550

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b002553

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b002554

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b002557

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b002563

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+

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b002567

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b002571

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b002575

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+

-

b002580

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+

b002583

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+

-

+

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b002586

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b002588

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b002590

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+

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-

b002593

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b002599

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+

-

+

-

b002600

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+

-

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b002601

+

b002609

+

b002614

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+

-

+

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b002617

-

+

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b002624

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+

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b002630

+

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+

-

b002631

+

b002637

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+

-

+

-

b002638

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b002658

+

-

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-

+

-

b002660

+

-

+

-

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-

b002775

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+

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b002776

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b002780

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b002781

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b002782

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b002785

+

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b002790

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b002797

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b002807

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b002809

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b002811

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b002816

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b002819

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b002820

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+

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b002825

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b002827

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b002831

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b002832

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b002835

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b002836

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b002839

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b002840

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b002844

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b002847

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b002857

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b002861

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b002866

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b002873

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b002875

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b002876

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b002877

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b002885

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b002887

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b002890

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b002893

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b002898

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b002906

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b003049

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b003052

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b003053

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b003056

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b003064

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b003065

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b003068

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b003075

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b003076

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b003080

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b003082

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b003137

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b003144

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b003149

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b003152

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b003153

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b003159

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b003168

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b003172

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b003177

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+

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b003190

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b003194

-

表 5B ： 綠膿桿菌噬菌體宿主範圍

靶標

野生型 沙穆納病毒

工程化 沙穆納病毒

野生型 匹克茲 病毒

野生型PhiKMV 病毒

野生型布魯伊諾格病毒

p1772

p2131

p2132

p2973

p1772e005

p2131e002

p2132e002

p2973e002

p1194p.b008

p4430

p2167

p1695

p3278

b002548

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b002550

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+

-

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b002553

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b002554

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b002557

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b002563

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b002567

+

b002571

-

+

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b002575

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+

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-

b002580

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b002583

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b002586

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b002588

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+

-

+

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b002590

-

+

b002593

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+

b002599

-

b002600

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b002601

-

+

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b002609

-

+

-

+

-

+

b002614

+

-

+

-

b002617

-

+

-

+

-

+

-

b002624

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+

-

b002630

-

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-

+

b002631

+

b002637

-

b002638

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+

-

+

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b002658

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+

-

b002660

-

+

b002775

-

+

-

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+

-

b002776

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+

-

+

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-

b002780

-

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b002781

-

+

-

+

-

b002782

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-

+

b002785

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+

-

b002790

-

+

-

+

-

+

-

b002797

-

+

-

b002807

-

b002809

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+

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b002811

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+

-

+

b002816

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+

-

+

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b002819

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+

-

+

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b002820

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b002825

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-

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-

b002827

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+

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+

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b002831

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+

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b002832

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+

-

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b002835

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+

-

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b002836

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b002839

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b002840

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+

-

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b002844

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+

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b002847

+

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b002856

-

+

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b002857

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b002861

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b002866

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b002873

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b002875

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b002876

-

+

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b002877

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b002885

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b002887

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b002890

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b002893

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b002898

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b002906

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b003049

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b003052

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b003053

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b003056

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b003064

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b003065

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b003068

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b003075

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b003076

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b003080

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+

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b003082

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b003137

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b003144

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b003149

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b003152

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b003153

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b003159

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+

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b003168

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+

b003172

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+

-

b003177

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+

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b003190

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+

b003194

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+

-

+

-

實例 18 ： 綠膿桿菌噬菌體宿主範圍分析

獲得綠膿桿菌噬菌體之資料，據報導係組合液體及成斑宿主範圍分析之最佳結果。最終結果為給定噬菌體加菌株組合在液體及成斑宿主範圍內之二元命中的中值。液體宿主範圍包括向364孔盤之孔中添加5μL冷凍、OD控制的培養材料、5μL已知效價噬菌體材料及40μL生長培養基，以及適當培養物、噬菌體及僅培養基對照。將盤在37℃下培育20小時，同時振盪，且每小時藉由液體處理器獲取OD600讀數。藉由確定添加噬菌體之樣品與其各別對照之覆蓋面積(AUC)之間的比率來計算結果。AUC比低於0.65之樣品被視為正(+)命中，而AUC比大於或等於0.65為負(-)命中。對於成斑宿主範圍分析，培養所關注菌株且針對原噬菌體進行篩選。將所關注噬菌體在微量滴定盤上連續稀釋50倍，自未稀釋至在1× PBS中稀釋為50-3。倒入用作效價宿主之菌株的瓊脂覆層且使其靜置隔夜。第二天，對所關注菌株之溶解物進行點樣。在15-20 min後，使用Hamilton-STAR-C062對盤進行成像，且手動計數或穿過內部開發的影像分析管道進行轉換、背景減除及計數。具有正(+)數個斑塊形成單位之樣品被視為命中。噬菌體混合液ck000125、ck000239、ck000240、ck000241、ck000511及ck000512 (亦稱為PACK512、混合液512、ck00512、CK512)之詳細組成在表 6A中列出。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000125包含p1106e003、p1835e002、p1772e005及p2131e002。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000239包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002及p1194。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000240包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002及p4430。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000241包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002及p1695。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000511包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p1194及p1695。如表 6B中所列，噬菌體混合液ck000512包含p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p4430及p1695。表 6A ： 宿主範圍噬菌體混合液組成

		混合液
	個別噬菌體	4 噬菌體	5 噬菌體混合液	6 噬菌體混合液
	CK000125	CK000239	CK000240	CK000241	CK000511	CK000512 (PACK512)
工程化噬菌體	PB1	p1106e003	x	x	x	x	x	x
p1835e002	x	x	x	x	x	x
SM1	p1772e005	x	x	x	x	x	x
p2131e002	x	x	x	x	x	x
野生型噬菌體	匹克茲	p1194		x			x
p4430			x			x
Bruynoghe	p1695				x	x	x

涉及綠膿桿菌及噬菌體混合液ck000125、ck000239、ck000240、ck000241、ck000511及ck000512之此分析的結果在表 6A中列出。總體而言，相比於表 5A及表 5B中所列之個別噬菌體分析，噬菌體混合液分析中之宿主範圍增加，如藉由表 6B中所列之正(+)命中的增加所示。如表 6B中所列，混合液ck000512綠膿桿菌宿主範圍資料始終增加。

如表6C中所示，在284種不同假單胞菌屬細菌分離株中測試混合物CK000125及CK00512之宿主範圍。111個分離株來自囊腫性纖維化(CF)且85個分離株來自非囊腫性纖維化支氣管擴張症(NCFB)。在284個假單胞菌屬分離株中，95個為多重耐藥性的，其中彼等分離株中之49個來自CF且9個來自NCFB。兩種混合物之宿主範圍均大於85%，其中混合物CK00512對於所有MDF分離株具有100%之宿主範圍。表 6B ： 綠膿桿菌混合液噬菌體宿主範圍

靶標	混合液
	ck000125	ck000239	ck000240	ck000241	ck000511	ck000512 (PACK512)
b002548	+	+	+	+	+	+
b002550	+	+	+	+	+	+
b002553	-	-	-	-	-	-
b002554	-	-	-	-	-	-
b002557	-	-	-	-	-	-
b002563	+	+	+	+	+	+
b002567	+	+	+	+	+	+
b002571	+	+	+	+	+	+
b002575	+	+	+	+	+	+
b002580	+	+	+	+	+	+
b002583	+	+	+	+	+	+
b002586	+	+	+	+	+	+
b002588	+	+	+	+	+	+
b002590	-	+	+	+	+	+
b002593	+	+	+	+	+	+
b002599	+	+	+	+	+	+
b002600	+	+	+	+	+	+
b002601	+	+	+	+	+	+
b002609	+	+	+	+	+	+
b002614	+	+	+	+	+	+
b002617	+	+	+	+	+	+
b002624	+	+	+	+	+	+
b002630	+	+	+	+	+	+
b002631	+	+	+	+	+	+
b002637	+	+	+	+	+	+
b002638	+	+	+	+	+	+
b002658	+	+	+	+	+	+
b002660	+	+	+	+	+	+
b002775	+	+	+	+	+	+
b002776	+	+	+	+	+	+
b002780	+	+	+	+	+	+
b002781	+	+	+	+	+	+
b002782	+	+	+	+	+	+
b002785	+	+	+	+	+	+
b002790	+	+	+	+	+	+
b002797	+	+	+	+	+	+
b002807	+	+	+	+	+	+
b002809	+	+	+	+	+	+
b002811	+	+	+	+	+	+
b002816	+	+	+	+	+	+
b002819	+	+	+	+	+	+
b002820	+	+	+	+	+	+
b002825	+	+	+	+	+	+
b002827	+	+	+	+	+	+
b002831	-	+	+	-	+	+
b002832	+	+	+	+	+	+
b002835	+	+	+	+	+	+
b002836	+	+	+	+	+	+
b002839	+	+	+	+	+	+
b002840	+	+	+	+	+	+
b002844	+	+	+	+	+	+
b002847	+	+	+	+	+	+
b002856	+	+	+	+	+	+
b002857	+	+	+	+	+	+
b002861	+	+	+	+	+	+
b002866	+	+	+	+	+	+
b002873	+	+	+	+	+	+
b002875	+	+	+	+	+	+
b002876	+	+	+	+	+	+
b002877	+	+	+	+	+	+
b002885	+	+	+	+	+	+
b002887	+	+	+	+	+	+
b002890	+	+	+	+	+	+
b002893	+	+	-	+	+	+
b002898	+	+	+	+	+	+
b002906	+	+	+	+	+	+
b003049	-	-	+	-	-	+
b003052	+	+	+	+	+	+
b003053	-	+	+	+	+	+
b003056	+	+	+	+	+	+
b003064	+	+	+	+	+	+
b003065	+	+	+	+	+	+
b003068	+	+	+	+	+	+
b003075	+	+	+	+	+	+
b003076	-	+	+	+	+	+
b003080	+	+	+	+	+	+
b003082	+	+	+	+	+	+
b003137	-	+	+	+	+	+
b003144	+	+	+	+	+	+
b003149	+	+	+	+	+	+
b003152	+	+	+	+	+	+
b003153	+	+	+	+	+	+
b003159	+	+	-	+	+	+
b003168	+	+	+	+	+	+
b003172	+	+	+	+	+	+
b003177	+	+	+	+	+	+
b003190	+	+	+	+	+	+
b003194	-	+	+	+	+	+

表 6C ： 混合液宿主範圍

		CK000125	CK000512
宿主範圍% MDR (n=95 ；n=284 之子集)	CF n=49	95.9	100
NCFB n=9	100	100
PIHP n=37	91.9	100
總HR n=95	94.7	100
總宿主範圍%(n=284)	CF n=111	87.4	92.8
NCFB n=85	92.9	94.1
PIHP n=88	95.5	100
總HR n=284	91.5	95.4

實例 19 ： 脫靶成斑綠膿桿菌混合液噬菌體分析

如表 7中所示，綠膿桿菌混合液噬菌體不展現脫靶成斑。除b1233/PAO1以外，綠膿桿菌混合液噬菌體亦在b2631或b1121上成斑，因為並非所有噬菌體感染此菌株。綠膿桿菌混合液CK000511及CK000512 (PACK512)；組成性噬菌體p1835e002、p1106e003、p1772e005、p2131e002、p1194、p1695及p4430；以及陽性對照噬菌體在脫靶ESKAPE物種上成斑。自任何測試之噬菌體均未觀測到脫靶成斑，如由(-)所指出。如表 7中所詳述，獲得之資料顯示噬菌體僅命中(+)綠膿桿菌。表 7 ：脫靶成斑噬菌體分析

		菌株
	金黃色葡萄球菌	肺炎克雷伯氏菌	綠膿桿菌	糞腸球菌	陰溝腸桿菌	鮑氏不動桿菌	表皮葡萄球菌
	b3321 ATCC 12600	b3432 ATCC 13883	b2631/b1121 b1233 (PAO1)	b3434 ATCC 19434	b3433 ATCC 13047	b1212 ATCC 19606	b3431 ATCC 19606
噬菌體	混合液511	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
混合液512 (PACK512)	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
p1835e002	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
p1106e003	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
p1772e005	-	-	+(b2631)	-	-	-	-
p2131e002	-	-	+(b2631)	-	-	-	-
p1194	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
p1695	-	-	+(b1121) +(b1233)	-	-	-	-
	p4430	-	-	+(b2631) +(b1233)	-	-	-	-
	陽性對照噬菌體	+ p5570	+ p5179	+(b1233) p5724	+ p5722	+ p5723	N/A	+ 噬菌體K

實例 20 ： 綠膿桿菌混合液對綠膿桿菌呼吸道 / 囊腫性纖維化分離株有效

CRISPR- 噬菌體與野生型噬菌體之比較 製備 攻擊接種物

細菌分離株、托普黴素MIC及攻擊接種物描述於表8中。綠膿桿菌分離株b1121用於此研究。自冷凍培養小瓶之表面刮下一環量之細菌儲備液，且在若干TSA盤上劃線以進行分離。在37℃下生長16h之後，將接種物自盤中移出，且懸浮至PBS，pH 7.2 (Gibco 20012027)中且調節至1.0±0.3之OD650 _nm。在同一研究中用獨立製備之接種物攻擊兩個動物群組。表 8 ：菌株

分離株	來源	TOB MIC (µg/mL)	攻擊接種物 (log ₁₀CFU/0.05 mL)
b1121	呼吸道	0.5	8.14/8.20
b2631	CF分離株	0.5	7.21/7.27
b3144	CF分離株	2.0	8.04/7.96

CF，囊腫性纖維化；CFU，菌落形成單位；MIC，最低抑制濃度；TOB，托普黴素。 治療急性下呼吸道感染模型 (LRTI) 中之小鼠

托普黴素(75 mg/kg/天，HED 6 mg/kg/天)作為比較物進行測試。硫酸托普黴素(Xgen，批號AZ1240B)係在dH ₂O中製備，且以0.2 mL皮下投與。治療在感染後1小時開始且以12小時時間間隔每天兩次(BID)繼續，總共4個劑量。托普黴素每天新鮮製備且在給藥之間儲存於4℃下。將個別噬菌體在PBS，pH 7.4中稀釋至4.25E+09 PFU/mL，使得各個別噬菌體之最終濃度為10.7 Log10 PFU/劑量。噬菌體在攻擊後2 h在麻醉下鼻內遞送。在攻擊後8、24及32 h投與額外劑量。動物在治療時被隨機分配且分成兩個治療組。在兩個群組中，動物均用p1772WT或p1772FC治療。在兩組中包括托普黴素及PBS作為對照。 鼠類肺炎模型

無特定病原體之7-8週齡雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine)用3%異氟醚麻醉且用3升/分鐘之氧氣維持，隨後將0.050 mL綠膿桿菌懸浮液b1121接種至兩個鼻孔中。將小鼠以仰臥位放入籠中且使其自麻醉中恢復。在攻擊後24及48 h，用CO ₂窒息對動物實施安樂死，以無菌方式取出肺且放入均質化管中。瀕死的動物被人道地安樂死且算作死亡。由MFD (最大可行劑量；最高菌株以10 ^10-11PFU/mL為目標)確定高劑量組。屍體剖檢用於大體觀測且標準組織面板用於組織病理學；第二肺葉可用於PD (PCR)。 組織中之 CFU 測定

將肺收集至含有1.4 mm陶瓷珠(VWR 10158-610)及1 mL PBS，pH 7.4 (Gibco 10010023)之軟組織均質化管中。將組織均質化20秒，隨後休息10秒，且再均質化20秒。將勻漿1:100連續稀釋至0.9%無菌鹽水(BBL，221819)中，且塗鋪於胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)盤上，以使用螺旋盤方法進行CFU計數。在37℃下培育20-22 h之後測定CFU。細菌計數表示為Log ₁₀CFU/公克組織且將來自兩個研究之資料組合以進行分析。

圖 18E展示CRISPR噬菌體p1772FC (p1772e005)相比於野生型噬菌體之功效。 噬菌體混合液與個別噬菌體之比較

綠膿桿菌分離株b1121、b2631或b3144用於此等研究。製備綠膿桿菌懸浮液分離株以用於攻擊。綠膿桿菌b3144在PBS，pH 7.2中1:3稀釋，且綠膿桿菌b2631在PBS中1:10稀釋。分離株b1121在標準化為OD650nm=1.0之後不稀釋。

如圖 18A中所述地製備及給與托普黴素治療劑。以12小時時間間隔BID向動物給藥，總共3個劑量。治療對照包括托普黴素、托普黴素加PACK512及PBS。將混合液512，亦稱為PACK512 (描述於表6A中)稀釋至基於噬菌體效價及EU/mL之最大可用濃度，且在攻擊後2 h在鼻內麻醉下遞送。在攻擊後8、24 h投與額外劑量。動物在治療時被隨機分配且分成兩個治療組。在群組一中，動物用混合液及個別噬菌體治療。在群組二中，動物用PACK512治療。兩個群組中均包括托普黴素、托普黴素加PACK512及PBS，且將來自兩個研究之資料組合以用於分析。

無特定病原體之7-8週齡雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine)用3%異氟醚麻醉且用3升/分鐘之氧氣維持，隨後將0.050 mL綠膿桿菌懸浮液接種至兩個鼻孔中。將小鼠以仰臥位放入籠中且使其自麻醉中恢復。在恢復期間，將籠子放在105℉之加熱墊上，直至動物完全清醒且可走動。

在用綠膿桿菌懸浮液攻擊後24及48 h，如上文所述地收集肺，除了在連續稀釋之後，將勻漿塗鋪於假單胞菌屬抑制瓊脂(PIA)盤上以使用螺旋盤方法進行CFU計數。在37℃下培育16-22 h之後確定各動物之CFU。細菌計數係表示為Log10 CFU/公克組織，且資料係使用t檢驗、曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)、變異數分析(ANOVA)或對數秩檢驗來分析。所有統計分析均使用GraphPad Prism 8.0版進行。P值＜0.05被視為統計顯著。

用混合液及混合液與托普黴素之組合治療使得綠膿桿菌水準低於所有3種測試菌株之偵測水準，如圖 18B-18D中所描繪。另外，相比於用單獨的托普黴素治療，用混合液治療使得偵測之CFU顯著降低。

在上文所述之類似分析中，亦測試噬菌體混合液ck00125。圖 19A說明用於在急性LRTI模型中測試ck00125 (CK125)之活體內功效的分析設計。圖 19B-19D說明早在攻擊後24小時及在所有三種測試之綠膿桿菌菌株中，單獨CK125之細菌負荷的統計學顯著降低。與托普黴素組合時，細菌水準低於偵測水準。因此，與使用ck00512 (PACK512)混合液所觀測到的類似，使用該混合液可見幾乎完全移除細菌。實例 21 ： 比較混合液與個別噬菌體之功效

材料及方法 ：製備 攻擊接種物

綠膿桿菌分離株b1121、b2631或b3144用於此等研究。如上所述地製備用於攻擊的分離株，且進行以下修改。綠膿桿菌b3144在PBS，pH 7.2中1:3稀釋，且綠膿桿菌b2631在PBS中1:10稀釋。分離株b1121在標準化為OD650nm=1.0之後不稀釋。治療

托普黴素如上文所述地製備及給藥，除了以12小時時間間隔BID向動物給藥，總共3個劑量。將個別噬菌體及混合液512 (PACK512)稀釋至基於噬菌體效價及EU/mL之最大可用濃度(表2)。個別噬菌體及混合液中之噬菌體濃度相同。噬菌體在攻擊後2 h在麻醉下鼻內遞送。在攻擊後8、24 h投與額外劑量。動物在治療時被隨機分配且分成兩個治療組。在群組一中，動物用混合液及個別噬菌體治療。在群組二中，動物用PACK512治療。兩個群組中均包括托普黴素、托普黴素加PACK512及PBS，且將來自兩個研究之資料組合以用於分析。 鼠類肺炎模型

致力於理解混合液PACK512 (亦稱為ck00512)相對於個別工程化噬菌體之相對益處，在具有或不具有托普黴素之噬菌體p1106FC、p1772FC、P1835FC、p2131FC、p1685WT、p4430WT及混合液512 (PACK512)之間進行比較。實驗設置展示於圖 18F中。綠膿桿菌b2631、b3144及p1121之結果分別展示於圖 18G、 18H及 18I中，表明在急性LRTI模型中，在具有及不具有托普黴素治療之情況下，PACK 512均展現相對於個別噬菌體之優良功效。 組織中之 CFU 測定

如上文所述地收集肺，除了在連續稀釋之後，將勻漿塗鋪於假單胞菌屬抑制瓊脂(PIA)盤上以使用螺旋盤方法進行CFU計數。在37℃下培育16-22 h之後確定各動物之CFU。細菌計數表示為Log ₁₀CFU/公克組織。 統計分析

使用 t檢驗、曼-惠特尼檢驗、變異數分析(ANOVA)或對數秩檢驗分析資料係適當的。所有統計分析均使用GraphPad Prism 8.0版進行。P值＜0.05被視為統計顯著。實例 21 ： 混合液對綠膿桿菌生物膜之效應在此實例中，測試噬菌體混合液對假單胞菌屬生物膜之效應。分析設置表示於圖 20A中。如圖 20B中所示，混合液CK125展現針對預成型生物膜之抗生物膜活性，如藉由在用混合液進行24及48小時生物膜處理時，低MOI下之高細菌抑制水準所指示，且在多個假單胞菌屬菌株中有效。PACK512混合液亦展現針對來自所有三種關鍵菌株(b1121、b2631、b3144)之預成型( 圖 22)及新成型生物膜(MBIC)及浮游細菌(MIC)的抑制活性。實例 22 ： 混合液在黏液素存在下之殺菌活性

黏液素為來自健康以及患病人類個體之黏液中豐富的醣蛋白。囊腫性纖維化之特徵在於氣管及肺上皮細胞過度產生黏液，該黏液主要形成治療劑進入細胞之障壁。在此實驗中，將源自健康人類之氣管上皮組織培養1個月，且在使培養物經受細菌感染30分鐘且接著追加噬菌體混合液之前量測黏液素。在培育19.5小時之後，收集樣品且測定細菌及噬菌體負荷。如圖 22及 23中所示，噬菌體混合液ck125及PACK512 (分別)成功地降低感染來自呼吸道分離株之綠膿桿菌b1121(左側)及來自CF患者分離株之b2631(右側)的細胞培養物中之細菌負荷。如藉由艾爾遜藍分析(Alcian Blue assay)偵測的細菌添加時之黏液素水準為1.3±0.09 mg/mL (n=3『T=0收集』跨孔及n=2樣品稀釋液/跨孔之GEOMEAN)。實例 23. 活體內噬菌體持久性

為了試圖理解活體內噬菌體持久性之時程，隨時間推移在LRTI小鼠模型中測定噬菌體含量。觀測到儘管有細菌清除，但各噬菌體之含量均較高。例示性結果展示於圖 24中，藉由治療後32 h之斑塊分析及個別噬菌體複本數之qPCR測定定量地證明噬菌體的存在。此表明噬菌體不易於自系統中清除。

每劑量之噬菌體基因體複本(GC)水準係藉由qPCR測定，乘以給與之劑量數且除以各治療組內之肺重量的GEOMEAN。

每劑量之PFU係基於NME噬菌體儲備液之PFU/mL效價及調配混合液中之預期PFU/劑量估計，接著除以各治療組內之肺重量的GEOMEAN。

序列表

基因	SEQ ID	序列 (5'-3')
Cas3	75	ATGGACGCGGAGGCTAGCGATACTCACTTTTTTGCTCACTCCACCTTAAAGGCAGATCGCAGCGATTGGCAGCCTCTGGTCGAGCATCTACAGGCTGTTGCCCGTTTGGCAGGAGAGAAGGCTGCCTTCTTCGGCGGCGGTGAATTAGCTGCTCTTGCTGGTCTGTTGCATGACTTGGGTAAATACACTGACGAGTTTCAGCGGCGTATTGCGGGTGATGCCATCCGTGTCGATCACTCTACTCGCGGGGCCATACTGGCGGTAGAACGCTATGGCGCGCTAGGTCAATTGCTAGCCTACGGCATCGCTGGCCACCATGCCGGGTTGGCCAATGGCCGCGAGGCTGGTGAGCGAACTGCCTTGGTCGACCGCCTGAAAGGGGTTGGGCTGCCACGGTTATTGGAGGGGTGGTGCGTGGAAATCGTGCTACCCGAGCGCCTTCAACCACCGCCACTAAAAGCGCGCCTGGAAAGAGGTTTCTTTCAGTTGGCCTTTCTTGGCCGGATGCTCTTTTCCTGCTTGGTTGATGCGGATTATCTAGATACCGAAGCCTTCTACCACCGCGTCGAAGGACGGCGCTCCCTTCGCGAGCAAGCGCGGCCGACCTTGGCCGAGTTACGCGCAGCCCTTGATCGGCATCTGACTGAGTTCAAGGGAGATACGCCGGTCAACCGCGTTCGCGGGGAGATATTGGCCGGCGTGCGCGGCAAGGCGAGCGAACTTCCCGGGCTGTTTTCTCTCACAGTGCCCACAGGAGGCGGCAAGACCCTGGCCTCTCTGGCTTTCGCCCTGGATCACGCTCTAGCTCATGGGCTGCGCCGGGTGATCTACGTGATTCCCTTCACTAGCATCGTCGAGCAGAACGCTGCGGTATTCCGTCGTGCACTCGGGGCCTTAGGCGAAGAGGCGGTGCTGGAGCATCACAGCGCCTTCGTTGATGACCGCCGGCAGAGCCTGGAGGCCAAGAAGAAACTGAACCTAGCGATGGAGAACTGGGACGCGCCTATCGTGGTGACCACTGCAGTGCAGTTCTTCGAAAGCCTGTTTGCCGACCGTCCAGCCCAGTGCCGCAAGCTACACAACATCGCCGGCAGCGTGGTGATTCTTGACGAGGCACAGACCCTACCGCTCAAGCTGTTGCGGCCCTGCGTTGCCGCCCTTGATGAACTGGCGCTCAACTACCGTTGTAGCCCAGTTCTCTGTACTGCCACGCAGCCAGCGCTTCAATCGCCGGATTTCATCGGTGGGCTGCAGGACGTACGTGAGCTGGCGCCCGAGCCGCAGCGGCTGTTCCGGGAGTTGGTGCGGGTACGAATACGGACATTGGGCCCGCTCGAAGATGCGGCCTTGACTGAGCAGATCGCCAGGCGTGAACAAGTGCTGTGCATCGTCAACAATCGACGCCAGGCCCGTGCGCTCTATGAGTCGCTTGCCGAGTTGCCCGGTGCCCGCCATCTCACCACCCTGATGTGCGCCAAGCACCGTAGCAGCGTGCTGGCCGAGGTGCGCCAGATGCTCAAAAAGGGGGAGCCCTGTCGCCTGGTGGCCACCTCGCTGATCGAGGCCGGTGTGGATGTGGATTTTCCCGTGGTACTGCGTGCCGAGGCTGGATTGGATTCCATCGCCCAGGCCGCGGGACGCTGCAATCGCGAAGGCAAGCGGCCGCTGGCCGAAAGCGAGGTGCTGGTGTTCGCCGCGGCCAATTCTGACTGGGCGCCACCCGAGGAACTCAAGCAGTTCGCCCAGGCCGCCCGCGAAGTGATGCGCCTGCACCCGGATGATTGCCTGTCCATGGCGGCCATCGAGCGGTATTTTCGCATACTGTACTGGCAGAAGGGCGCGGAGGAGTTGGATGCGGGTAACCTGCTCGGCCTGATTGAGAGAGGCCGGCTCGATGGCCTGCCCTACGAGACTTTGGCCACCAAGTTCCGCATGATCGACAGCCTTCAACTGCCGGTGATCATCCCATTTGATGACGAGGCCAGAGCAGCCCTGCGCGAGCTGGAGTTCGCCGACGGCTGCGCCGCCATCGCCCGTCGCCTGCAGCCATATCTGGTGCAGATGCCACGCAAGGGTTATCAGGCATTGCGGGAAGCCGGTGCGATCCAGGCGGCGGCAGGTACGCGTTATGGTGAGCAGTTTATGGCGTTGGTCAACCCTGATCTGTATCACCACCAATTCGGGTTGCACTGGGATAATCCGGCCTTTGTCAGCAGCGAGCGGCTATGTTGGTAG
Cas5c	76	ATGGCCTACGGAATTCGCTTAATGGTCTGGGGCGAGCGTGCCTGCTTCACCCGCCCGGAAATGAAGGTGGAACGCGTCTCTTACGATGCGATCACGCCGTCCGCCGCGCGCGGCATTCTCGAGGCTATCCACTGGAAGCCGGCGATTCGCTGGGTGGTGGATCGCATTCAAGTGCTTAAGCCGATCCGCTTCGAATCCATCCGGCGCAACGAGGTCGGCGGCAAGCTGTCCGCTGTCAGCGTCGGTAAGGCAATGAAGGCCGGGCGTACTAATGGTCTGGTGAATCTGGTCGAGGAGGATCGCCAGCAGCGCGCGACTACTCTGCTGCGCGATGTCTCCTATGTCATCGAGGCGCATTTCGAGATGACTGACAGGGCTGGCGCCGACGATACGGTGGGCAAGCATCTGGATATCTTCAACCGTCGCGCACGGAAGGGGCAGTGCTTCCATACACCCTGCCTAGGCGTGCGCGAGTTTCCGGCCAGTTTTCGGTTGCTGGAAGAGGGCAGTGCCGAGCCTGAAGTCGATGCCTTTCTGCGCGGCGAGCGTGATCTGGGCTGGATGCTGCATGACATTGACTTCGCCGATGGCATGACCCCGCACTTCTTCCGTGCCCTGATGCGCGATGGGCTGATCGAGGTGCCGGCCTTCAGGGCGGCAGAGGACAAGGCATGA
Cas8c	77	ATGATCCTTTCGGCCCTCAATGACTATTATCAGCGACTGCTGGAGCGGGGTGAAGCGAATATCTCACCCTTCGGCTACAGCCAAGAAAAGATCAGTTACGCCCTGCTGCTGTCCGCACAAGGAGAGTTGCTGGACGTGCAGGACATTCGCTTGCTCTCTGGCAAGAAGCCTCAACCCAGGCTTATGAGTGTGCCGCAGCCGGAGAAGCGCACCTCGGGCATCAAGTCCAACGTACTGTGGGACAAGACCAGCTATGTGCTGGGTGTTAGTGCCAAGGGCGGAGAGCGTACTCAGCAGGAGCACGAGTCCTTCAAGACGCTGCACCGGCAGATCTTGGTTGGGGAAGGCGACCCCGGTCTGCAGGCCTTGCTCCAGTTCCTCGACTGTTGGCAGCCGGAGCAGTTCAAGCCCCCGCTGTTCAGCGAAGCAATGCTCGACAGCAACTTAGTGTTCCGCCTAGACGGCCAACAACGCTATCTGCACGAGACTCCGGCGGCCCTGGCGTTGCGTACCCGGCTGTTGGCCGACGGCGACAGCCGCGAGGGGCTGTGCCTAGTCTGCGGCCAACGTCAGCCGTTGGCGCGCCTGCATCCAGCGGTCAAGGGCGTCAATGGTGCCCAGAGTTCGGGGGCTTCCATCGTCTCCTTCAACCTCGACGCTTTTTCCTCCTACGGCAAGAGCCAGGGGGAAAATGCTCCGGTCTCCGAACAGGCCGCCTTTGCCTACACCACGGTGCTCAACCATTTGTTGCGTCGCGACGAGCACAACCGCCAGCGCCTGCAGATTGGCGACGCGAGTGTGGTGTTCTGGGCGCAGGCGGATACTCCTGCTCAGGTGGCCGCCGCCGAGTCGACCTTCTGGAACCTGCTGGAGCCACCCGCAGATGATGGTCAGGAAGCGGAAAAGCTGCGCGGCGTGCTGGATGCTGTGGCCACGGGGCGGCCCTTGCATGAGCTCGACTCGCTAATGGAGGAAGGTACCCGCATTTTTGTGTTAGGGCTGGCGCCCAATACCTCGCGACTGTCCATTCGGTTCTGGGCAGTCGATAGCCTTGCGGTATTCACCCAGCATCTGGCCGAGCATTTCCGGGATATGCACCTTGAGCCTCTGCCCTGGAAGACGGAGCCGGCCATCTGGCGCTTGCTCTATGCTACCGCGCCCAGTCGTGACGGCAGAGCCAAGACCGAAGACGTACTCCCACAACTGGCCGGTGAAATGACCCGCGCCATCCTGACCGGCAGCCGCTATCCGCGCAGTTTGCTAGCCAACCTGATCATGCGCATGCGTGCCGACGGCGACGTCTCTGGCATACGCGTCGCGCTGTGCAAGGCCGTGCTCGCTCGCGAGGCACGCCTGAGCGGCAAAATTCACCAAGAGGAGCTACCTATGAGTCTCGACAAGGACGCCAGCAACCCCGGCTATCGCTTGGGGAGGCTGTTCGCCGTGTTGGAAGGCGCCCAGCGCGCAGCCCTGGGCGACAGGGTCAATGCCACTATCCGTGACCGCTACTACGGTGCCGCGTCCAGCACGCCAGCCACGGTTTTCCCGATACTGCTGCGCAACACACAAAACCACTTGGCCAAGCTGCGCAAGGAGAAGCCCGGACTAGCAGTGAACCTAGAGCGCGATATAGGCGAAATCATTGACGGTATGCAGAGCCAATTCCCGCGTTGCCTGCGCCTGGAGGACCAGGGACGCTTTGCTATTGGTTACTACCAACAGGCCCAGGCCCGTTTCAACCGTGGCCCCGATTCCGTCGAGTAA
Cas7c	78	ATGACCGCCATCTCCAACCGCTACGAGTTCGTTTACCTCTTTGATGTCAGCAATGGCAATCCCAATGGCGACCCGGATGCTGGCAACATGCCGCGTCTCGATCCGGAAACCAACCAGGGGTTGGTCACTGACGTTTGCCTCAAGCGCAAGATCCGCAACTACGTCAGCCTGGAGCAGGAAAGTGCCCCCGGCTATGCCATCTATATGCAGGAAAAATCCGTGCTGAATAACCAGCACAAACAGGCCTACGAGGCGCTCGGTATCGAGTCAGAGGCAAAGAAACTGCCCAAGGACGAAGCCAAGGCGCGCGAACTGACCTCTTGGATGTGCAAGAACTTCTTCGATGTGCGTGCTTTCGGGGCGGTGATGACCACCGAGATTAATGCCGGCCAGGTGCGTGGACCGATCCAACTGGCATTCGCCACGTCTATCGACCCGGTATTGCCTATGGAGGTATCCATCACCCGCATGGCGGTGACTAACGAAAAGGATTTGGAGAAGGAACGCACCATGGGACGCAAGCACATCGTGCCTTACGGCTTGTACCGCGCCCATGGTTTCATCTCTGCCAAGTTGGCCGAGCGAACCGGCTTTTCCGACGACGACTTGGAACTGCTATGGCGCGCTTTGGCCAATATGTTCGAACACGACCGCTCGGCGGCACGTGGCGAGATGGCAGCGCGCAAGTTGATCGTCTTCAAGCATGAGCATGCCATGGGCAATGCACCCGCCCATGTGCTGTTCGGCAGCGTTAAGGTCGAGCGAGTCGAGGGGGACGCAGTTACACCAGCACGCGGTTTCCAGGATTACCGTGTCAGCATCGATGCGGAAGCTCTGCCTCAGGGCGTGAGCGTGCGCGAGTACCTCTAG

蛋白質	SEQ ID	序列
Cas3	79	MDAEASDTHFFAHSTLKADRSDWQPLVEHLQAVARLAGEKAAFFGGGELAALAGLLHDLGKYTDEFQRRIAGDAIRVDHSTRGAILAVERYGALGQLLAYGIAGHHAGLANGREAGERTALVDRLKGVGLPRLLEGWCVEIVLPERLQPPPLKARLERGFFQLAFLGRMLFSCLVDADYLDTEAFYHRVEGRRSLREQARPTLAELRAALDRHLTEFKGDTPVNRVRGEILAGVRGKASELPGLFSLTVPTGGGKTLASLAFALDHALAHGLRRVIYVIPFTSIVEQNAAVFRRALGALGEEAVLEHHSAFVDDRRQSLEAKKKLNLAMENWDAPIVVTTAVQFFESLFADRPAQCRKLHNIAGSVVILDEAQTLPLKLLRPCVAALDELALNYRCSPVLCTATQPALQSPDFIGGLQDVRELAPEPQRLFRELVRVRIRTLGPLEDAALTEQIARREQVLCIVNNRRQARALYESLAELPGARHLTTLMCAKHRSSVLAEVRQMLKKGEPCRLVATSLIEAGVDVDFPVVLRAEAGLDSIAQAAGRCNREGKRPLAESEVLVFAAANSDWAPPEELKQFAQAAREVMRLHPDDCLSMAAIERYFRILYWQKGAEELDAGNLLGLIERGRLDGLPYETLATKFRMIDSLQLPVIIPFDDEARAALRELEFADGCAAIARRLQPYLVQMPRKGYQALREAGAIQAAAGTRYGEQFMALVNPDLYHHQFGLHWDNPAFVSSERLCW*
Cas5c	80	MAYGIRLMVWGERACFTRPEMKVERVSYDAITPSAARGILEAIHWKPAIRWVVDRIQVLKPIRFESIRRNEVGGKLSAVSVGKAMKAGRTNGLVNLVEEDRQQRATTLLRDVSYVIEAHFEMTDRAGADDTVGKHLDIFNRRARKGQCFHTPCLGVREFPASFRLLEEGSAEPEVDAFLRGERDLGWMLHDIDFADGMTPHFFRALMRDGLIEVPAFRAAEDKA*
Cas8c	81	MILSALNDYYQRLLERGEANISPFGYSQEKISYALLLSAQGELLDVQDIRLLSGKKPQPRLMSVPQPEKRTSGIKSNVLWDKTSYVLGVSAKGGERTQQEHESFKTLHRQILVGEGDPGLQALLQFLDCWQPEQFKPPLFSEAMLDSNLVFRLDGQQRYLHETPAALALRTRLLADGDSREGLCLVCGQRQPLARLHPAVKGVNGAQSSGASIVSFNLDAFSSYGKSQGENAPVSEQAAFAYTTVLNHLLRRDEHNRQRLQIGDASVVFWAQADTPAQVAAAESTFWNLLEPPADDGQEAEKLRGVLDAVATGRPLHELDSLMEEGTRIFVLGLAPNTSRLSIRFWAVDSLAVFTQHLAEHFRDMHLEPLPWKTEPAIWRLLYATAPSRDGRAKTEDVLPQLAGEMTRAILTGSRYPRSLLANLIMRMRADGDVSGIRVALCKAVLAREARLSGKIHQEELPMSLDKDASNPGYRLGRLFAVLEGAQRAALGDRVNATIRDRYYGAASSTPATVFPILLRNTQNHLAKLRKEKPGLAVNLERDIGEIIDGMQSQFPRCLRLEDQGRFAIGYYQQAQARFNRGPDSVE*
Cas7c	82	MTAISNRYEFVYLFDVSNGNPNGDPDAGNMPRLDPETNQGLVTDVCLKRKIRNYVSLEQESAPGYAIYMQEKSVLNNQHKQAYEALGIESEAKKLPKDEAKARELTSWMCKNFFDVRAFGAVMTTEINAGQVRGPIQLAFATSIDPVLPMEVSITRMAVTNEKDLEKERTMGRKHIVPYGLYRAHGFISAKLAERTGFSDDDLELLWRALANMFEHDRSAARGEMAARKLIVFKHEHAMGNAPAHVLFGSVKVERVEGDAVTPARGFQDYRVSIDAEALPQGVSVREYL*

儘管已在本文中顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見的是此類實施例僅以舉例方式提供。在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到諸多變化、改變及取代。應理解，本文所述之本發明之實施例的各種替代方案可用於實踐本發明。以下申請專利範圍意欲界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。

本發明之新穎特徵細緻闡述於隨附申請專利範圍中。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其隨附圖式的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優勢的更好理解，在隨附圖式中：

圖 1A描繪crArray1 (SEQ ID NO: 83)之序列及佈置。圖 1B描繪crArray2 (SEQ ID NO: 84)之序列及佈置。圖 1C描繪crArray3 (SEQ ID NO: 85)之序列及佈置。圖 1D描繪crArray4 (SEQ ID NO: 86)之序列及佈置。圖 1E描繪crArray 5 (SEQ ID NO: 87)之序列及佈置。圖 1F-1K描繪crArray1及PaIC插入物(SEQ ID NO: 25)之佈置。圖 1L-1Q描繪crArray3及PaIC插入物(SEQ ID NO: 24)之佈置。

圖 2A(上圖)描繪使用內源性CRISPR-Cas3系統用含有crRNA之質體對兩個綠膿桿菌菌株進行轉型之效應，如藉由以菌落形成單位(CFU)計之轉型體數目所量測。下圖展示用含有含3個間隔子之crRNA及外源性I-C型Cas操縱子的質體對綠膿桿菌進行轉型之效應，該轉型使得轉型體少於偵測極限。圖 2B描繪每毫升轉型為綠膿桿菌菌株b1121之Cas操縱子無效突變體所獲得的細菌轉型體之數目。陣列1靶向細菌基因體，而陣列2為非靶向對照。不同質體藉由莫耳濃度標準化為空載體對照質體。圖 2C描繪將靶向rpoB或ftsA或3個間隔子之陣列陣列3或陣列4之個別間隔子轉型為具有(b1121)或不具有(b1121 cas KO)內源性I-C型Cas操縱子之綠膿桿菌菌株的效應。

圖 3A描繪野生型噬菌體p1772及其工程化變異體之基因體的示意圖。基因體軸下方之條指示經移除及替換之基因體區域。噬菌體基因體下方之示意圖說明用於替換經缺失區域中之WT噬菌體基因的DNA。陣列1、陣列3及陣列4靶向細菌基因體且將在I型Cas操縱子存在下殺滅細菌。陣列2中之間隔子為非靶向的，但陣列在結構上與三個靶向陣列相同。圖 3B在p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)已在37℃下繼代5或10次之後比較其序列。在核苷酸水準下在插入物中未觀測到差異，表明表現CRISPR-Cas3之工程化噬菌體的穩定性。

圖 4例示經CRISPR-Cas3工程化之噬菌體不展現結構變化。當藉由TEM成像時，在p1772wt (野生型)、p1772e004 (僅Cas系統)與p1772e005 (靶向crArray+Cas系統)之間無整體形態差異。

圖 5A- 圖 5C例示完整構築體噬菌體在不同Cas類型之變異體中與野生型親本噬菌體類似地擴增且保留類似宿主範圍。圖 5A描繪含有I-F型Cas系統之綠膿桿菌菌株中之p1772wt (野生型)、p1772e004 (Cas系統)及p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)的活體外擴增效價。圖 5B描繪含有I-C型Cas系統之綠膿桿菌菌株中之p1772wt及p1772e005的活體外擴增效價。圖 5C描繪p1772wt、p1772e004及p1772e005在44個綠膿桿菌菌株上之宿主範圍。若(在存在噬菌體之情況下的AUC)/(在不存在噬菌體之情況下的AUC)為小於0.65，則認為噬菌體感染給定菌株。

圖 6A- 圖 6E例示外源性CRISPR-Cas3系統有效地自噬菌體基因體表現。圖 6A描繪插入至p1772之工程化變異體中之間隔子陣列及Cas操縱子的示意圖。圖 6B-6D描繪感染p1772wt (野生型)或p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)之綠膿桿菌菌株b1121中之crArray、Cas3及Cas8在1600分鐘內的表現。圖 6E描繪在感染p1772e005、p2131e002 (靶向crArray1+Cas系統)及p2132e002 (靶向crArray1+Cas系統)之後1及24小時，Cas3之表現。

圖 7描繪由將p1772wt (野生型)或p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)塗鋪至綠膿桿菌上產生的斑塊。

圖 8A例示基於盤之殺滅分析的結果。將p1772wt (野生型)、p1772e004 (僅Cas系統)、p1772e006 (僅靶向crArray1)及p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)與綠膿桿菌以100至0.0000954之感染倍率(MOI)混合。圖 8B描繪在較大放大率下的與圖8A相同設置之盤的一部分。圖 8C展示以1.5之MOI感染p1772wt、p1772e008 (非靶向crArray2+Cas系統)、p1772e006及p1772e005之綠膿桿菌之相對螢光單位的定量。

圖 9A描繪當以1之MOI接種時，綠膿桿菌菌株b1121中之p1772wt (野生型)、p1772e004 (僅Cas系統)、p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)及p1772e006 (僅靶向crArray1)在24小時內的生長。圖 9B描繪當以10之MOI接種時，綠膿桿菌菌株b1121中之p1772wt、p1772e004、p1772e005及p1772e006在24小時內的生長。圖 9C描繪當以100之MOI接種時，綠膿桿菌菌株b1121中之p1772wt、p1772e004、p1772e005及p1772e006在24小時內的生長。

圖 10A描繪瓊脂盤上以100至0.0001之MOI混合的綠膿桿菌培養物與p1772wt (野生型)、p1772e008 (非靶向crArray2+Cas系統)、p1772e006 (僅靶向crArray 1)及pArray3 (靶向crArray3+Cas系統)的生長。圖 10B描繪瓊脂盤上以100至0.0001之MOI混合的綠膿桿菌培養物與p1772wt、p1772e008、p1772e006及pArray4 (靶向crArray4+Cas系統)的生長。圖 10C為圖10A之插圖，且描繪在0.0244 (頂列)及0.00610 (底列)之MOI下，p1772e006相比於pArray3之放大率。圖 10D為來自圖 10A中以約1.5之MOI感染噬菌體之後的細菌之螢光信號的定量。圖 10E為來自圖 10B中以約1.5之MOI感染噬菌體之後的細菌之螢光信號的定量。

圖 11描繪與具有不同啟動子之p1772變異體混合之綠膿桿菌培養物在瓊脂盤上的生長。圖 11A展示與在100至0.00001之MOI下，p1772wt (野生型)及含有相同crArray 1及Cas系統之變異體混合之綠膿桿菌培養物於瓊脂盤上的生長，其中Cas系統由不同啟動子驅動。圖 11B展示來自圖11A的MOI 1.5下之細胞的螢光定量。

圖 12A描繪在1.5之MOI下，與p2132wt (野生型)及p2132e002 (靶向crArray1+Cas系統)混合之綠膿桿菌培養物於瓊脂盤上之生長的螢光定量。圖 12B描繪在1.5之MOI下，與p2973wt (野生型)及p2973e002 (靶向crArray1+Cas系統)混合之綠膿桿菌培養物於瓊脂盤上之生長的螢光定量。

圖 13描繪與不同噬菌體變異體混合之綠膿桿菌培養物之不同菌株於瓊脂盤上的生長。將p4209wt (野生型)及p4209e002 (靶向crArray1+Cas系統)與綠膿桿菌之b2550 (I-E型Cas)、b2631 (I-F型Cas)、b2816 (I-E/I-F型Cas)及b2825(無活性I型Cas)菌株混合，且在培育0小時、3小時或24小時之後塗鋪。

圖 14描繪crArray/Cas插入物在多個綠膿桿菌菌株中之功效。p4209wt (野生型)、p4209e001 (僅Cas系統)及p4209e002 (靶向crArray1+Cas系統)在綠膿桿菌之b2550 (I-E型Cas)、b2631 (I-F型Cas)、b2816 (I-E/I-F型Cas)及b2825(無活性I型Cas)菌株上成斑。

圖 15A- 圖 15D例示比較p1772wt (野生型)與p1772e005 (靶向crArray1+Cas系統)的活體內功效結果。圖 15A為描繪圖15B-15D之實驗設置的示意圖。圖 15B描繪噬菌體在注射至小鼠大腿肌肉中時之功效。左圖描繪在感染後6小時恢復之菌落形成單位(CFU)之數目。右圖描繪在感染後6小時恢復之斑塊形成單位(PFU)之數目。圖 15C描繪噬菌體在注射至小鼠大腿肌肉中時之功效且描繪在感染後8及24小時恢復之CFU (頂部)及PFU (底部)之數目。圖 15D描繪噬菌體在靜脈內投與時之功效且描繪在感染後9、12、15及24小時恢復之CFU (頂部)及PFU (底部)之數目。圖 15E描繪圖15F之實驗設置。圖 15F描繪用p1772wt及p1772e005治療之劑量反應且描繪感染後8及24小時恢復之CFU (頂部)及PFU (底部)的量。資料展示為平均值±SEM。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001。單因素變異數分析與多重比較或雙因素變異數分析與杜凱氏檢驗。

圖 16例示CRISPR-Cas3工程化參考噬菌體PB1e002 (crArray1+Cas系統)與p1772e005 (crArray1+Cas系統)協同作用。

圖 17描繪在用含有不同間隔序列之插入物轉染假單胞菌屬之後產生之轉型體的數目。

圖 18A描繪用於測試單獨或在混合液中之CRISPR工程化噬菌體之效率的分析。圖 18B描繪感染綠膿桿菌b2631之小鼠用混合液治療之效應。圖 18C描繪感染綠膿桿菌b1121之小鼠用混合液治療之效應。圖 18D描繪感染綠膿桿菌b3144之小鼠用混合液治療之效應。圖 18E描繪相比於野生型噬菌體，用CRISPR工程化噬菌體治療之效應。圖 18F描繪用於測試混合液相比於用個別噬菌體治療之功效之分析的圖形表示。圖 18G描繪感染綠膿桿菌b2631之小鼠用個別噬菌體或噬菌體混合液(如圖中所示)治療之效應。圖 18H描繪感染綠膿桿菌b3144之小鼠用混合液或個別噬菌體治療之效應。圖 18I描繪感染綠膿桿菌之小鼠用混合液或個別噬菌體治療之效應。

圖 19A描繪用於測試混合液功效之分析。圖 19B描繪感染綠膿桿菌b2631之小鼠用噬菌體混合液CK125治療之效應。圖 19C描繪感染綠膿桿菌b1121之小鼠用混合液治療之效應。圖 19D描繪感染綠膿桿菌b3144之小鼠用混合液治療之效應。TOB=托普黴素。

圖 20A展示使用最小生物膜根除濃度(MBEC)分析測試噬菌體混合液CK125針對來自關鍵綠膿桿菌菌株b1121及b2631之預成型生物膜之抗生物膜活性之實驗設置的圖形表示。圖 20B左側，24 h處之抑制%，中間，48 h處之抑制%。右側，展示描繪噬菌體混合液或環丙沙星之MBEC IC50之比較資料的表。

圖 21(上圖)展示使用最小生物膜根除濃度(MBEC)方法測試噬菌體混合液PACK512針對來自綠膿桿菌菌株b1121、b2631及b2631之呼吸道/臨床分離株之生物膜之抗生物膜活性的實驗設置及結果。圖 22(下圖)左側，24 h處之抑制%，右側，48 h處之抑制%。

圖 22A展示用於測試在人類黏液素存在下之混合液之殺菌活性的分析設置。圖 22B展示來自分析之結果，不同治療中之細菌負荷，左側，來自呼吸道分離株之綠膿桿菌菌株b1121抑制的結果；右側，來自CF分離株之綠膿桿菌菌株b2631抑制的結果。

圖 23A展示測試混合液在黏液素存在下之殺細菌功效且與托普黴素比較的分析設置。圖 23B展示與無治療對照相比，在混合液存在下，或在托普黴素治療存在下之細菌負載。

圖 24展示在綠膿桿菌下呼吸道感染模型中在細菌清除之後的測試噬菌體含量資料。

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          <![CDATA[<110> 美商羅卡斯生物科學公司(LOCUS BIOSCIENCES, INC.)]]>
                美商詹森藥物公司(JANSSEN PHARMACEUTICALS, INC.)
          <![CDATA[<120> 用於假單孢菌屬之包含CRISPR-CAS系統的噬菌體組合物及其使用方法]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：噬菌體基因體序列]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagcc                                97
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 35]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc                                  35
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 155]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          gatttttttc gggtgaggtt gcgggctgtt cggtaggttt ataaacactg ctatccaaag       60
          ctatggacac gctcggctac gagaacagtt ggcgtgatgg cctctagcaa ttagattgtt      120
          atgcgacatc cgcagacttg gcagggagcg cacct                                 155
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 35]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          tttacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc                                  35
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 199]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          atccgaggga tacgggcctt gtcagcacgg tgttgctaat gagagccttt gcccgggcaa       60
          tagtacgggc agtgtgtagc ggattgaaag acgctgaatc actgacaggc atgaagacta      120
          tcgatagagt ctgatagtgt cgccgccgca cagcggatag agtccacagt cattgaagtg      180
          ttaatccgcg atcaagctc                                                   199
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 216]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：噬菌體基因體序列]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          gacctagctt ttatagcggg tttcgtggtt tatagcccat tgaaaaaaat ctcacatcta       60
          tatcacaggt gtgcactcgt tcccgaaagg ttctgagtct acttgatcaa gtattgaaat      120
          accatcgtaa aggaaaaaga catgtctatt cgtgatagcg aaaacaacaa cggccaacag      180
          cagcagaccg cgcaaactgc cgcccccgcc ccgcaa                                216
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 182]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：噬菌體基因體序列]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          ttcaatttaa gtagtaacga ggtcagcccg gaatctttgg gtattcttaa ggtatttctg       60
          actcagtgtg gttgggacag cttcactgta cattgcactg gatttgttaa tttcttatac      120
          cggggcacca tgggcagcaa atcgtgttac gaattccgtc taaccaataa gcgagctaaa      180
          ta                                                                     182
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 105]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga       60
          caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagt                      105
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 161]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          cttcaagaat tcgtattgac cccatagaca gcttcgtcga cgcccgtccc ggcccccttg       60
          ggcttgccgg acggcttatg tcatgatggc gccaccctcg caggttcaag gccggctttc      120
          ttcctctatg aacaaatccc ttgcgctgac tacgtaatca c                          161
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 207]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          cttcaagaat tcggggtatt cctgatcctg cgccgctagc gccgcgcacg gccactaggc       60
          ccgcgccgat agccagtcgc gctcccggct ggcacactac tcccatttcc gccggaaacg      120
          cgcgcaacgt accggcaacg aacgtggaaa gaccatgaaa gactggctgg atgagattca      180
          ctggaacgcc gtgacctacg tatgcac                                          207
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 59]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 大腸桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacacca        59
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          agaagggtca gggccatgcg gtttttcctc tgtg                                   34
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          gctcgactgg tcggtaacca cttgtgtgtg gtga                                   34
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          ggtgctgacc gaggacgaga aggaactggg cgtg                                   34
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          gatgacacca acccggccaa ggaagaccag gagt                                   34
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          gagaccgaag agaacgtgcc gaccaccgcc gctg                                   34
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>]]> 未知之描述：合成寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 17]]>
          cagtgcatgg cagcgaacgc cgagagccga cacc                                   34
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          tccgcgatga gctgccgtcc caacaattca acac                                   34
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          aacgcgaagc cctgttgaaa ccgctgcaac tggt                                   34
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          tgctgaacag ccatgattga ttaactccta aacg                                   34
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          cgtaaaccta atgggcctga tctacagtaa tcta                                   34
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          accaccgaga cgcccacacc gtgcaagccg ccgg                                   34
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          ctatcgcgaa ttcctgcagg ctggcgcaac caag                                   34
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 6024]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaacg gtgctgaccg aggacgagaa ggaactgggc gtggtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaactccgc gatgagctgc cgtcccaaca attcaacacg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa caccaccgag acgcccacac cgtgcaagcc gccgggtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtaggccgc ttcgtcccta      360
          tcaaagcttg gagtttacag ctagctcagt cctagggact gtgctagcat taaagaggag      420
          aaaatggacg cggaggctag cgatactcac ttttttgctc actccacctt aaaggcagat      480
          cgcagcgatt ggcagcctct ggtcgagcat ctacaggctg ttgcccgttt ggcaggagag      540
          aaggctgcct tcttcggcgg cggtgaatta gctgctcttg ctggtctgtt gcatgacttg      600
          ggtaaataca ctgacgagtt tcagcggcgt attgcgggtg atgccatccg tgtcgatcac      660
          tctactcgcg gggccatact ggcggtagaa cgctatggcg cgctaggtca attgctagcc      720
          tacggcatcg ctggccacca tgccgggttg gccaatggcc gcgaggctgg tgagcgaact      780
          gccttggtcg accgcctgaa aggggttggg ctgccacggt tattggaggg gtggtgcgtg      840
          gaaatcgtgc tacccgagcg ccttcaacca ccgccactaa aagcgcgcct ggaaagaggt      900
          ttctttcagt tggcctttct tggccggatg ctcttttcct gcttggttga tgcggattat      960
          ctagataccg aagccttcta ccaccgcgtc gaaggacggc gctcccttcg cgagcaagcg     1020
          cggccgacct tggccgagtt acgcgcagcc cttgatcggc atctgactga gttcaaggga     1080
          gatacgccgg tcaaccgcgt tcgcggggag atattggccg gcgtgcgcgg caaggcgagc     1140
          gaacttcccg ggctgttttc tctcacagtg cccacaggag gcggcaagac cctggcctct     1200
          ctggctttcg ccctggatca cgctctagct catgggctgc gccgggtgat ctacgtgatt     1260
          cccttcacta gcatcgtcga gcagaacgct gcggtattcc gtcgtgcact cggggcctta     1320
          ggcgaagagg cggtgctgga gcatcacagc gccttcgttg atgaccgccg gcagagcctg     1380
          gaggccaaga agaaactgaa cctagcgatg gagaactggg acgcgcctat cgtggtgacc     1440
          actgcagtgc agttcttcga aagcctgttt gccgaccgtc cagcccagtg ccgcaagcta     1500
          cacaacatcg ccggcagcgt ggtgattctt gacgaggcac agaccctacc gctcaagctg     1560
          ttgcggccct gcgttgccgc ccttgatgaa ctggcgctca actaccgttg tagcccagtt     1620
          ctctgtactg ccacgcagcc agcgcttcaa tcgccggatt tcatcggtgg gctgcaggac     1680
          gtacgtgagc tggcgcccga gccgcagcgg ctgttccggg agttggtgcg ggtacgaata     1740
          cggacattgg gcccgctcga agatgcggcc ttgactgagc agatcgccag gcgtgaacaa     1800
          gtgctgtgca tcgtcaacaa tcgacgccag gcccgtgcgc tctatgagtc gcttgccgag     1860
          ttgcccggtg cccgccatct caccaccctg atgtgcgcca agcaccgtag cagcgtgctg     1920
          gccgaggtgc gccagatgct caaaaagggg gagccctgtc gcctggtggc cacctcgctg     1980
          atcgaggccg gtgtggatgt ggattttccc gtggtactgc gtgccgaggc tggattggat     2040
          tccatcgccc aggccgcggg acgctgcaat cgcgaaggca agcggccgct ggccgaaagc     2100
          gaggtgctgg tgttcgccgc ggccaattct gactgggcgc cacccgagga actcaagcag     2160
          ttcgcccagg ccgcccgcga agtgatgcgc ctgcacccgg atgattgcct gtccatggcg     2220
          gccatcgagc ggtattttcg catactgtac tggcagaagg gcgcggagga gttggatgcg     2280
          ggtaacctgc tcggcctgat tgagagaggc cggctcgatg gcctgcccta cgagactttg     2340
          gccaccaagt tccgcatgat cgacagcctt caactgccgg tgatcatccc atttgatgac     2400
          gaggccagag cagccctgcg cgagctggag ttcgccgacg gctgcgccgc catcgcccgt     2460
          cgcctgcagc catatctggt gcagatgcca cgcaagggtt atcaggcatt gcgggaagcc     2520
          ggtgcgatcc aggcggcggc aggtacgcgt tatggtgagc agtttatggc gttggtcaac     2580
          cctgatctgt atcaccacca attcgggttg cactgggata atccggcctt tgtcagcagc     2640
          gagcggctat gttggtagtc gggacgcgca acagcggcct ggcctggatg atgtgaaagg     2700
          gagggccgat ggcctacgga attcgcttaa tggtctgggg cgagcgtgcc tgcttcaccc     2760
          gcccggaaat gaaggtggaa cgcgtctctt acgatgcgat cacgccgtcc gccgcgcgcg     2820
          gcattctcga ggctatccac tggaagccgg cgattcgctg ggtggtggat cgcattcaag     2880
          tgcttaagcc gatccgcttc gaatccatcc ggcgcaacga ggtcggcggc aagctgtccg     2940
          ctgtcagcgt cggtaaggca atgaaggccg ggcgtactaa tggtctggtg aatctggtcg     3000
          aggaggatcg ccagcagcgc gcgactactc tgctgcgcga tgtctcctat gtcatcgagg     3060
          cgcatttcga gatgactgac agggctggcg ccgacgatac ggtgggcaag catctggata     3120
          tcttcaaccg tcgcgcacgg aaggggcagt gcttccatac accctgccta ggcgtgcgcg     3180
          agtttccggc cagttttcgg ttgctggaag agggcagtgc cgagcctgaa gtcgatgcct     3240
          ttctgcgcgg cgagcgtgat ctgggctgga tgctgcatga cattgacttc gccgatggca     3300
          tgaccccgca cttcttccgt gccctgatgc gcgatgggct gatcgaggtg ccggccttca     3360
          gggcggcaga ggacaaggca tgatcctttc ggccctcaat gactattatc agcgactgct     3420
          ggagcggggt gaagcgaata tctcaccctt cggctacagc caagaaaaga tcagttacgc     3480
          cctgctgctg tccgcacaag gagagttgct ggacgtgcag gacattcgct tgctctctgg     3540
          caagaagcct caacccaggc ttatgagtgt gccgcagccg gagaagcgca cctcgggcat     3600
          caagtccaac gtactgtggg acaagaccag ctatgtgctg ggtgttagtg ccaagggcgg     3660
          agagcgtact cagcaggagc acgagtcctt caagacgctg caccggcaga tcttggttgg     3720
          ggaaggcgac cccggtctgc aggccttgct ccagttcctc gactgttggc agccggagca     3780
          gttcaagccc ccgctgttca gcgaagcaat gctcgacagc aacttagtgt tccgcctaga     3840
          cggccaacaa cgctatctgc acgagactcc ggcggccctg gcgttgcgta cccggctgtt     3900
          ggccgacggc gacagccgcg aggggctgtg cctagtctgc ggccaacgtc agccgttggc     3960
          gcgcctgcat ccagcggtca agggcgtcaa tggtgcccag agttcggggg cttccatcgt     4020
          ctccttcaac ctcgacgctt tttcctccta cggcaagagc cagggggaaa atgctccggt     4080
          ctccgaacag gccgcctttg cctacaccac ggtgctcaac catttgttgc gtcgcgacga     4140
          gcacaaccgc cagcgcctgc agattggcga cgcgagtgtg gtgttctggg cgcaggcgga     4200
          tactcctgct caggtggccg ccgccgagtc gaccttctgg aacctgctgg agccacccgc     4260
          agatgatggt caggaagcgg aaaagctgcg cggcgtgctg gatgctgtgg ccacggggcg     4320
          gcccttgcat gagctcgact cgctaatgga ggaaggtacc cgcatttttg tgttagggct     4380
          ggcgcccaat acctcgcgac tgtccattcg gttctgggca gtcgatagcc ttgcggtatt     4440
          cacccagcat ctggccgagc atttccggga tatgcacctt gagcctctgc cctggaagac     4500
          ggagccggcc atctggcgct tgctctatgc taccgcgccc agtcgtgacg gcagagccaa     4560
          gaccgaagac gtactcccac aactggccgg tgaaatgacc cgcgccatcc tgaccggcag     4620
          ccgctatccg cgcagtttgc tagccaacct gatcatgcgc atgcgtgccg acggcgacgt     4680
          ctctggcata cgcgtcgcgc tgtgcaaggc cgtgctcgct cgcgaggcac gcctgagcgg     4740
          caaaattcac caagaggagc tacctatgag tctcgacaag gacgccagca accccggcta     4800
          tcgcttgggg aggctgttcg ccgtgttgga aggcgcccag cgcgcagccc tgggcgacag     4860
          ggtcaatgcc actatccgtg accgctacta cggtgccgcg tccagcacgc cagccacggt     4920
          tttcccgata ctgctgcgca acacacaaaa ccacttggcc aagctgcgca aggagaagcc     4980
          cggactagca gtgaacctag agcgcgatat aggcgaaatc attgacggta tgcagagcca     5040
          attcccgcgt tgcctgcgcc tggaggacca gggacgcttt gctattggtt actaccaaca     5100
          ggcccaggcc cgtttcaacc gtggccccga ttccgtcgag taaggagcag aagaatgacc     5160
          gccatctcca accgctacga gttcgtttac ctctttgatg tcagcaatgg caatcccaat     5220
          ggcgacccgg atgctggcaa catgccgcgt ctcgatccgg aaaccaacca ggggttggtc     5280
          actgacgttt gcctcaagcg caagatccgc aactacgtca gcctggagca ggaaagtgcc     5340
          cccggctatg ccatctatat gcaggaaaaa tccgtgctga ataaccagca caaacaggcc     5400
          tacgaggcgc tcggtatcga gtcagaggca aagaaactgc ccaaggacga agccaaggcg     5460
          cgcgaactga cctcttggat gtgcaagaac ttcttcgatg tgcgtgcttt cggggcggtg     5520
          atgaccaccg agattaatgc cggccaggtg cgtggaccga tccaactggc attcgccacg     5580
          tctatcgacc cggtattgcc tatggaggta tccatcaccc gcatggcggt gactaacgaa     5640
          aaggatttgg agaaggaacg caccatggga cgcaagcaca tcgtgcctta cggcttgtac     5700
          cgcgcccatg gtttcatctc tgccaagttg gccgagcgaa ccggcttttc cgacgacgac     5760
          ttggaactgc tatggcgcgc tttggccaat atgttcgaac acgaccgctc ggcggcacgt     5820
          ggcgagatgg cagcgcgcaa gttgatcgtc ttcaagcatg agcatgccat gggcaatgca     5880
          cccgcccatg tgctgttcgg cagcgttaag gtcgagcgag tcgaggggga cgcagttaca     5940
          ccagcacgcg gtttccagga ttaccgtgtc agcatcgatg cggaagctct gcctcagggc     6000
          gtgagcgtgc gcgagtacct ctag                                            6024
          <![CDATA[<210> 25]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaaca gaagggtcag ggccatgcgg tttttcctct gtggtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaacgagac cgaagagaac gtgccgacca ccgccgctgg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa ctgctgaaca gccatgattg attaactcct aaacggtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtaggccgc ttcgtcccta      360
          tcaaagcttg gagtttacag ctagctcagt cctagggact gtgctagcat taaagaggag      420
          aaaatggacg cggaggctag cgatactcac ttttttgctc actccacctt aaaggcagat      480
          cgcagcgatt ggcagcctct ggtcgagcat ctacaggctg ttgcccgttt ggcaggagag      540
          aaggctgcct tcttcggcgg cggtgaatta gctgctcttg ctggtctgtt gcatgacttg      600
          ggtaaataca ctgacgagtt tcagcggcgt attgcgggtg atgccatccg tgtcgatcac      660
          tctactcgcg gggccatact ggcggtagaa cgctatggcg cgctaggtca attgctagcc      720
          tacggcatcg ctggccacca tgccgggttg gccaatggcc gcgaggctgg tgagcgaact      780
          gccttggtcg accgcctgaa aggggttggg ctgccacggt tattggaggg gtggtgcgtg      840
          gaaatcgtgc tacccgagcg ccttcaacca ccgccactaa aagcgcgcct ggaaagaggt      900
          ttctttcagt tggcctttct tggccggatg ctcttttcct gcttggttga tgcggattat      960
          ctagataccg aagccttcta ccaccgcgtc gaaggacggc gctcccttcg cgagcaagcg     1020
          cggccgacct tggccgagtt acgcgcagcc cttgatcggc atctgactga gttcaaggga     1080
          gatacgccgg tcaaccgcgt tcgcggggag atattggccg gcgtgcgcgg caaggcgagc     1140
          gaacttcccg ggctgttttc tctcacagtg cccacaggag gcggcaagac cctggcctct     1200
          ctggctttcg ccctggatca cgctctagct catgggctgc gccgggtgat ctacgtgatt     1260
          cccttcacta gcatcgtcga gcagaacgct gcggtattcc gtcgtgcact cggggcctta     1320
          ggcgaagagg cggtgctgga gcatcacagc gccttcgttg atgaccgccg gcagagcctg     1380
          gaggccaaga agaaactgaa cctagcgatg gagaactggg acgcgcctat cgtggtgacc     1440
          actgcagtgc agttcttcga aagcctgttt gccgaccgtc cagcccagtg ccgcaagcta     1500
          cacaacatcg ccggcagcgt ggtgattctt gacgaggcac agaccctacc gctcaagctg     1560
          ttgcggccct gcgttgccgc ccttgatgaa ctggcgctca actaccgttg tagcccagtt     1620
          ctctgtactg ccacgcagcc agcgcttcaa tcgccggatt tcatcggtgg gctgcaggac     1680
          gtacgtgagc tggcgcccga gccgcagcgg ctgttccggg agttggtgcg ggtacgaata     1740
          cggacattgg gcccgctcga agatgcggcc ttgactgagc agatcgccag gcgtgaacaa     1800
          gtgctgtgca tcgtcaacaa tcgacgccag gcccgtgcgc tctatgagtc gcttgccgag     1860
          ttgcccggtg cccgccatct caccaccctg atgtgcgcca agcaccgtag cagcgtgctg     1920
          gccgaggtgc gccagatgct caaaaagggg gagccctgtc gcctggtggc cacctcgctg     1980
          atcgaggccg gtgtggatgt ggattttccc gtggtactgc gtgccgaggc tggattggat     2040
          tccatcgccc aggccgcggg acgctgcaat cgcgaaggca agcggccgct ggccgaaagc     2100
          gaggtgctgg tgttcgccgc ggccaattct gactgggcgc cacccgagga actcaagcag     2160
          ttcgcccagg ccgcccgcga agtgatgcgc ctgcacccgg atgattgcct gtccatggcg     2220
          gccatcgagc ggtattttcg catactgtac tggcagaagg gcgcggagga gttggatgcg     2280
          ggtaacctgc tcggcctgat tgagagaggc cggctcgatg gcctgcccta cgagactttg     2340
          gccaccaagt tccgcatgat cgacagcctt caactgccgg tgatcatccc atttgatgac     2400
          gaggccagag cagccctgcg cgagctggag ttcgccgacg gctgcgccgc catcgcccgt     2460
          cgcctgcagc catatctggt gcagatgcca cgcaagggtt atcaggcatt gcgggaagcc     2520
          ggtgcgatcc aggcggcggc aggtacgcgt tatggtgagc agtttatggc gttggtcaac     2580
          cctgatctgt atcaccacca attcgggttg cactgggata atccggcctt tgtcagcagc     2640
          gagcggctat gttggtagtc gggacgcgca acagcggcct ggcctggatg atgtgaaagg     2700
          gagggccgat ggcctacgga attcgcttaa tggtctgggg cgagcgtgcc tgcttcaccc     2760
          gcccggaaat gaaggtggaa cgcgtctctt acgatgcgat cacgccgtcc gccgcgcgcg     2820
          gcattctcga ggctatccac tggaagccgg cgattcgctg ggtggtggat cgcattcaag     2880
          tgcttaagcc gatccgcttc gaatccatcc ggcgcaacga ggtcggcggc aagctgtccg     2940
          ctgtcagcgt cggtaaggca atgaaggccg ggcgtactaa tggtctggtg aatctggtcg     3000
          aggaggatcg ccagcagcgc gcgactactc tgctgcgcga tgtctcctat gtcatcgagg     3060
          cgcatttcga gatgactgac agggctggcg ccgacgatac ggtgggcaag catctggata     3120
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          agtttccggc cagttttcgg ttgctggaag agggcagtgc cgagcctgaa gtcgatgcct     3240
          ttctgcgcgg cgagcgtgat ctgggctgga tgctgcatga cattgacttc gccgatggca     3300
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          gggcggcaga ggacaaggca tgatcctttc ggccctcaat gactattatc agcgactgct     3420
          ggagcggggt gaagcgaata tctcaccctt cggctacagc caagaaaaga tcagttacgc     3480
          cctgctgctg tccgcacaag gagagttgct ggacgtgcag gacattcgct tgctctctgg     3540
          caagaagcct caacccaggc ttatgagtgt gccgcagccg gagaagcgca cctcgggcat     3600
          caagtccaac gtactgtggg acaagaccag ctatgtgctg ggtgttagtg ccaagggcgg     3660
          agagcgtact cagcaggagc acgagtcctt caagacgctg caccggcaga tcttggttgg     3720
          ggaaggcgac cccggtctgc aggccttgct ccagttcctc gactgttggc agccggagca     3780
          gttcaagccc ccgctgttca gcgaagcaat gctcgacagc aacttagtgt tccgcctaga     3840
          cggccaacaa cgctatctgc acgagactcc ggcggccctg gcgttgcgta cccggctgtt     3900
          ggccgacggc gacagccgcg aggggctgtg cctagtctgc ggccaacgtc agccgttggc     3960
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          gtaatcaacc ggatgggaga agccgaggga cagg                                   34
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          <![CDATA[<211> 34]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          tgggcgatgg gcgataccgg accctgcggt ccct                                   34
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          cagcgcttcg taggaggtgg ccggatcgac gatc                                   34
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          <![CDATA[<400> 72]]>
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          atggacgcgg aggctagcga tactcacttt tttgctcact ccaccttaaa ggcagatcgc       60
          agcgattggc agcctctggt cgagcatcta caggctgttg cccgtttggc aggagagaag      120
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          aaatacactg acgagtttca gcggcgtatt gcgggtgatg ccatccgtgt cgatcactct      240
          actcgcgggg ccatactggc ggtagaacgc tatggcgcgc taggtcaatt gctagcctac      300
          ggcatcgctg gccaccatgc cgggttggcc aatggccgcg aggctggtga gcgaactgcc      360
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          atcgtgctac ccgagcgcct tcaaccaccg ccactaaaag cgcgcctgga aagaggtttc      480
          tttcagttgg cctttcttgg ccggatgctc ttttcctgct tggttgatgc ggattatcta      540
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          ccgaccttgg ccgagttacg cgcagccctt gatcggcatc tgactgagtt caagggagat      660
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          cttcccgggc tgttttctct cacagtgccc acaggaggcg gcaagaccct ggcctctctg      780
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          ttcactagca tcgtcgagca gaacgctgcg gtattccgtc gtgcactcgg ggccttaggc      900
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          gccaagaaga aactgaacct agcgatggag aactgggacg cgcctatcgt ggtgaccact     1020
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          aacatcgccg gcagcgtggt gattcttgac gaggcacaga ccctaccgct caagctgttg     1140
          cggccctgcg ttgccgccct tgatgaactg gcgctcaact accgttgtag cccagttctc     1200
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          cgtgagctgg cgcccgagcc gcagcggctg ttccgggagt tggtgcgggt acgaatacgg     1320
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          atcgcccagg ccgcgggacg ctgcaatcgc gaaggcaagc ggccgctggc cgaaagcgag     1680
          gtgctggtgt tcgccgcggc caattctgac tgggcgccac ccgaggaact caagcagttc     1740
          gcccaggccg cccgcgaagt gatgcgcctg cacccggatg attgcctgtc catggcggcc     1800
          atcgagcggt attttcgcat actgtactgg cagaagggcg cggaggagtt ggatgcgggt     1860
          aacctgctcg gcctgattga gagaggccgg ctcgatggcc tgccctacga gactttggcc     1920
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          ctgcagccat atctggtgca gatgccacgc aagggttatc aggcattgcg ggaagccggt     2100
          gcgatccagg cggcggcagg tacgcgttat ggtgagcagt ttatggcgtt ggtcaaccct     2160
          gatctgtatc accaccaatt cgggttgcac tgggataatc cggcctttgt cagcagcgag     2220
          cggctatgtt ggtag                                                      2235
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          <![CDATA[<211> 675]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 76]]>
          atggcctacg gaattcgctt aatggtctgg ggcgagcgtg cctgcttcac ccgcccggaa       60
          atgaaggtgg aacgcgtctc ttacgatgcg atcacgccgt ccgccgcgcg cggcattctc      120
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          ccgatccgct tcgaatccat ccggcgcaac gaggtcggcg gcaagctgtc cgctgtcagc      240
          gtcggtaagg caatgaaggc cgggcgtact aatggtctgg tgaatctggt cgaggaggat      300
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          gccagttttc ggttgctgga agagggcagt gccgagcctg aagtcgatgc ctttctgcgc      540
          ggcgagcgtg atctgggctg gatgctgcat gacattgact tcgccgatgg catgaccccg      600
          cacttcttcc gtgccctgat gcgcgatggg ctgatcgagg tgccggcctt cagggcggca      660
          gaggacaagg catga                                                       675
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          <![CDATA[<400> 77]]>
          atgatccttt cggccctcaa tgactattat cagcgactgc tggagcgggg tgaagcgaat       60
          atctcaccct tcggctacag ccaagaaaag atcagttacg ccctgctgct gtccgcacaa      120
          ggagagttgc tggacgtgca ggacattcgc ttgctctctg gcaagaagcc tcaacccagg      180
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          ttttcctcct acggcaagag ccagggggaa aatgctccgg tctccgaaca ggccgccttt      720
          gcctacacca cggtgctcaa ccatttgttg cgtcgcgacg agcacaaccg ccagcgcctg      780
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          ctgtccattc ggttctgggc agtcgatagc cttgcggtat tcacccagca tctggccgag     1080
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          ttgctctatg ctaccgcgcc cagtcgtgac ggcagagcca agaccgaaga cgtactccca     1200
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          gcggtgatga ccaccgagat taatgccggc caggtgcgtg gaccgatcca actggcattc      420
          gccacgtcta tcgacccggt attgcctatg gaggtatcca tcacccgcat ggcggtgact      480
          aacgaaaagg atttggagaa ggaacgcacc atgggacgca agcacatcgt gccttacggc      540
          ttgtaccgcg cccatggttt catctctgcc aagttggccg agcgaaccgg cttttccgac      600
          gacgacttgg aactgctatg gcgcgctttg gccaatatgt tcgaacacga ccgctcggcg      660
          gcacgtggcg agatggcagc gcgcaagttg atcgtcttca agcatgagca tgccatgggc      720
          aatgcacccg cccatgtgct gttcggcagc gttaaggtcg agcgagtcga gggggacgca      780
          gttacaccag cacgcggttt ccaggattac cgtgtcagca tcgatgcgga agctctgcct      840
          cagggcgtga gcgtgcgcga gtacctctag                                       870
          <![CDATA[<210> 79]]>
          <![CDATA[<211> 744]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 79]]>
          Met Asp Ala Glu Ala Ser Asp Thr His Phe Phe Ala His Ser Thr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ala Asp Arg Ser Asp Trp Gln Pro Leu Val Glu His Leu Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Arg Leu Ala Gly Glu Lys Ala Ala Phe Phe Gly Gly Gly Glu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Tyr Thr Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Gln Arg Arg Ile Ala Gly Asp Ala Ile Arg Val Asp His Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Arg Gly Ala Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Gly Ala Leu Gly Gln 
                          85                  90                  95      
          Leu Leu Ala Tyr Gly Ile Ala Gly His His Ala Gly Leu Ala Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Glu Ala Gly Glu Arg Thr Ala Leu Val Asp Arg Leu Lys Gly Val 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Pro Arg Leu Leu Glu Gly Trp Cys Val Glu Ile Val Leu Pro 
              130                 135                 140                 
          Glu Arg Leu Gln Pro Pro Pro Leu Lys Ala Arg Leu Glu Arg Gly Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Gln Leu Ala Phe Leu Gly Arg Met Leu Phe Ser Cys Leu Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Ala Asp Tyr Leu Asp Thr Glu Ala Phe Tyr His Arg Val Glu Gly Arg 
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Leu Arg Glu Gln Ala Arg Pro Thr Leu Ala Glu Leu Arg Ala 
                  195                 200                 205             
          Ala Leu Asp Arg His Leu Thr Glu Phe Lys Gly Asp Thr Pro Val Asn 
              210                 215                 220                 
          Arg Val Arg Gly Glu Ile Leu Ala Gly Val Arg Gly Lys Ala Ser Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Val Pro Thr Gly Gly Gly Lys Thr 
                          245                 250                 255     
          Leu Ala Ser Leu Ala Phe Ala Leu Asp His Ala Leu Ala His Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Arg Val Ile Tyr Val Ile Pro Phe Thr Ser Ile Val Glu Gln Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Val Phe Arg Arg Ala Leu Gly Ala Leu Gly Glu Glu Ala Val 
              290                 295                 300                 
          Leu Glu His His Ser Ala Phe Val Asp Asp Arg Arg Gln Ser Leu Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Lys Lys Lys Leu Asn Leu Ala Met Glu Asn Trp Asp Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Val Thr Thr Ala Val Gln Phe Phe Glu Ser Leu Phe Ala Asp Arg 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Gln Cys Arg Lys Leu His Asn Ile Ala Gly Ser Val Val Ile 
                  355                 360                 365             
          Leu Asp Glu Ala Gln Thr Leu Pro Leu Lys Leu Leu Arg Pro Cys Val 
              370                 375                 380                 
          Ala Ala Leu Asp Glu Leu Ala Leu Asn Tyr Arg Cys Ser Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Thr Ala Thr Gln Pro Ala Leu Gln Ser Pro Asp Phe Ile Gly Gly 
                          405                 410                 415     
          Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Ala Pro Glu Pro Gln Arg Leu Phe Arg 
                      420                 425                 430         
          Glu Leu Val Arg Val Arg Ile Arg Thr Leu Gly Pro Leu Glu Asp Ala 
                  435                 440                 445             
          Ala Leu Thr Glu Gln Ile Ala Arg Arg Glu Gln Val Leu Cys Ile Val 
              450                 455                 460                 
          Asn Asn Arg Arg Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Ser Leu Ala Glu Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Gly Ala Arg His Leu Thr Thr Leu Met Cys Ala Lys His Arg Ser 
                          485                 490                 495     
          Ser Val Leu Ala Glu Val Arg Gln Met Leu Lys Lys Gly Glu Pro Cys 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Val Ala Thr Ser Leu Ile Glu Ala Gly Val Asp Val Asp Phe 
                  515                 520                 525             
          Pro Val Val Leu Arg Ala Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ile Ala Gln Ala 
              530                 535                 540                 
          Ala Gly Arg Cys Asn Arg Glu Gly Lys Arg Pro Leu Ala Glu Ser Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Val Leu Val Phe Ala Ala Ala Asn Ser Asp Trp Ala Pro Pro Glu Glu 
                          565                 570                 575     
          Leu Lys Gln Phe Ala Gln Ala Ala Arg Glu Val Met Arg Leu His Pro 
                      580                 585                 590         
          Asp Asp Cys Leu Ser Met Ala Ala Ile Glu Arg Tyr Phe Arg Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Tyr Trp Gln Lys Gly Ala Glu Glu Leu Asp Ala Gly Asn Leu Leu Gly 
              610                 615                 620                 
          Leu Ile Glu Arg Gly Arg Leu Asp Gly Leu Pro Tyr Glu Thr Leu Ala 
          625                 630                 635                 640 
          Thr Lys Phe Arg Met Ile Asp Ser Leu Gln Leu Pro Val Ile Ile Pro 
                          645                 650                 655     
          Phe Asp Asp Glu Ala Arg Ala Ala Leu Arg Glu Leu Glu Phe Ala Asp 
                      660                 665                 670         
          Gly Cys Ala Ala Ile Ala Arg Arg Leu Gln Pro Tyr Leu Val Gln Met 
                  675                 680                 685             
          Pro Arg Lys Gly Tyr Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Ala Ile Gln Ala 
              690                 695                 700                 
          Ala Ala Gly Thr Arg Tyr Gly Glu Gln Phe Met Ala Leu Val Asn Pro 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Leu Tyr His His Gln Phe Gly Leu His Trp Asp Asn Pro Ala Phe 
                          725                 730                 735     
          Val Ser Ser Glu Arg Leu Cys Trp 
                      740                 
          <![CDATA[<210> 80]]>
          <![CDATA[<211> 224]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 80]]>
          Met Ala Tyr Gly Ile Arg Leu Met Val Trp Gly Glu Arg Ala Cys Phe 
          1               5                   10                  15      
          Thr Arg Pro Glu Met Lys Val Glu Arg Val Ser Tyr Asp Ala Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Ala Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Ile His Trp Lys Pro Ala 
                  35                  40                  45              
          Ile Arg Trp Val Val Asp Arg Ile Gln Val Leu Lys Pro Ile Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Ile Arg Arg Asn Glu Val Gly Gly Lys Leu Ser Ala Val Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Val Gly Lys Ala Met Lys Ala Gly Arg Thr Asn Gly Leu Val Asn Leu 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Glu Asp Arg Gln Gln Arg Ala Thr Thr Leu Leu Arg Asp Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Tyr Val Ile Glu Ala His Phe Glu Met Thr Asp Arg Ala Gly Ala 
                  115                 120                 125             
          Asp Asp Thr Val Gly Lys His Leu Asp Ile Phe Asn Arg Arg Ala Arg 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Gln Cys Phe His Thr Pro Cys Leu Gly Val Arg Glu Phe Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Phe Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ser Ala Glu Pro Glu Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Ala Phe Leu Arg Gly Glu Arg Asp Leu Gly Trp Met Leu His Asp Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Phe Ala Asp Gly Met Thr Pro His Phe Phe Arg Ala Leu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Leu Ile Glu Val Pro Ala Phe Arg Ala Ala Glu Asp Lys Ala 
              210                 215                 220                 
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          <![CDATA[<400> 81]]>
          Met Ile Leu Ser Ala Leu Asn Asp Tyr Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Arg 
          1               5                   10                  15      
          Gly Glu Ala Asn Ile Ser Pro Phe Gly Tyr Ser Gln Glu Lys Ile Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Leu Leu Leu Ser Ala Gln Gly Glu Leu Leu Asp Val Gln Asp 
                  35                  40                  45              
          Ile Arg Leu Leu Ser Gly Lys Lys Pro Gln Pro Arg Leu Met Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Gln Pro Glu Lys Arg Thr Ser Gly Ile Lys Ser Asn Val Leu Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Lys Thr Ser Tyr Val Leu Gly Val Ser Ala Lys Gly Gly Glu Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Gln Gln Glu His Glu Ser Phe Lys Thr Leu His Arg Gln Ile Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Glu Gly Asp Pro Gly Leu Gln Ala Leu Leu Gln Phe Leu Asp 
                  115                 120                 125             
          Cys Trp Gln Pro Glu Gln Phe Lys Pro Pro Leu Phe Ser Glu Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Leu Asp Ser Asn Leu Val Phe Arg Leu Asp Gly Gln Gln Arg Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          His Glu Thr Pro Ala Ala Leu Ala Leu Arg Thr Arg Leu Leu Ala Asp 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Ser Arg Glu Gly Leu Cys Leu Val Cys Gly Gln Arg Gln Pro 
                      180                 185                 190         
          Leu Ala Arg Leu His Pro Ala Val Lys Gly Val Asn Gly Ala Gln Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Ala Ser Ile Val Ser Phe Asn Leu Asp Ala Phe Ser Ser Tyr 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys Ser Gln Gly Glu Asn Ala Pro Val Ser Glu Gln Ala Ala Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Tyr Thr Thr Val Leu Asn His Leu Leu Arg Arg Asp Glu His Asn 
                          245                 250                 255     
          Arg Gln Arg Leu Gln Ile Gly Asp Ala Ser Val Val Phe Trp Ala Gln 
                      260                 265                 270         
          Ala Asp Thr Pro Ala Gln Val Ala Ala Ala Glu Ser Thr Phe Trp Asn 
                  275                 280                 285             
          Leu Leu Glu Pro Pro Ala Asp Asp Gly Gln Glu Ala Glu Lys Leu Arg 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Leu Asp Ala Val Ala Thr Gly Arg Pro Leu His Glu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Met Glu Glu Gly Thr Arg Ile Phe Val Leu Gly Leu Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Asn Thr Ser Arg Leu Ser Ile Arg Phe Trp Ala Val Asp Ser Leu Ala 
                      340                 345                 350         
          Val Phe Thr Gln His Leu Ala Glu His Phe Arg Asp Met His Leu Glu 
                  355                 360                 365             
          Pro Leu Pro Trp Lys Thr Glu Pro Ala Ile Trp Arg Leu Leu Tyr Ala 
              370                 375                 380                 
          Thr Ala Pro Ser Arg Asp Gly Arg Ala Lys Thr Glu Asp Val Leu Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Ala Gly Glu Met Thr Arg Ala Ile Leu Thr Gly Ser Arg Tyr 
                          405                 410                 415     
          Pro Arg Ser Leu Leu Ala Asn Leu Ile Met Arg Met Arg Ala Asp Gly 
                      420                 425                 430         
          Asp Val Ser Gly Ile Arg Val Ala Leu Cys Lys Ala Val Leu Ala Arg 
                  435                 440                 445             
          Glu Ala Arg Leu Ser Gly Lys Ile His Gln Glu Glu Leu Pro Met Ser 
              450                 455                 460                 
          Leu Asp Lys Asp Ala Ser Asn Pro Gly Tyr Arg Leu Gly Arg Leu Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Val Leu Glu Gly Ala Gln Arg Ala Ala Leu Gly Asp Arg Val Asn 
                          485                 490                 495     
          Ala Thr Ile Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Ala Ala Ser Ser Thr Pro Ala 
                      500                 505                 510         
          Thr Val Phe Pro Ile Leu Leu Arg Asn Thr Gln Asn His Leu Ala Lys 
                  515                 520                 525             
          Leu Arg Lys Glu Lys Pro Gly Leu Ala Val Asn Leu Glu Arg Asp Ile 
              530                 535                 540                 
          Gly Glu Ile Ile Asp Gly Met Gln Ser Gln Phe Pro Arg Cys Leu Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Leu Glu Asp Gln Gly Arg Phe Ala Ile Gly Tyr Tyr Gln Gln Ala Gln 
                          565                 570                 575     
          Ala Arg Phe Asn Arg Gly Pro Asp Ser Val Glu 
                      580                 585         
          <![CDATA[<210> 82]]>
          <![CDATA[<211> 289]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 82]]>
          Met Thr Ala Ile Ser Asn Arg Tyr Glu Phe Val Tyr Leu Phe Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asn Gly Asn Pro Asn Gly Asp Pro Asp Ala Gly Asn Met Pro Arg 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Pro Glu Thr Asn Gln Gly Leu Val Thr Asp Val Cys Leu Lys 
                  35                  40                  45              
          Arg Lys Ile Arg Asn Tyr Val Ser Leu Glu Gln Glu Ser Ala Pro Gly 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ala Ile Tyr Met Gln Glu Lys Ser Val Leu Asn Asn Gln His Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Tyr Glu Ala Leu Gly Ile Glu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Pro 
                          85                  90                  95      
          Lys Asp Glu Ala Lys Ala Arg Glu Leu Thr Ser Trp Met Cys Lys Asn 
                      100                 105                 110         
          Phe Phe Asp Val Arg Ala Phe Gly Ala Val Met Thr Thr Glu Ile Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Gln Val Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ala Phe Ala Thr Ser Ile 
              130                 135                 140                 
          Asp Pro Val Leu Pro Met Glu Val Ser Ile Thr Arg Met Ala Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Lys Asp Leu Glu Lys Glu Arg Thr Met Gly Arg Lys His Ile 
                          165                 170                 175     
          Val Pro Tyr Gly Leu Tyr Arg Ala His Gly Phe Ile Ser Ala Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Ala Glu Arg Thr Gly Phe Ser Asp Asp Asp Leu Glu Leu Leu Trp Arg 
                  195                 200                 205             
          Ala Leu Ala Asn Met Phe Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Arg Gly Glu 
              210                 215                 220                 
          Met Ala Ala Arg Lys Leu Ile Val Phe Lys His Glu His Ala Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Ala Pro Ala His Val Leu Phe Gly Ser Val Lys Val Glu Arg Val 
                          245                 250                 255     
          Glu Gly Asp Ala Val Thr Pro Ala Arg Gly Phe Gln Asp Tyr Arg Val 
                      260                 265                 270         
          Ser Ile Asp Ala Glu Ala Leu Pro Gln Gly Val Ser Val Arg Glu Tyr 
                  275                 280                 285             
          Leu 
          <![CDATA[<210> 83]]>
          <![CDATA[<211> 369]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 83]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaaca gaagggtcag ggccatgcgg tttttcctct gtggtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaacgagac cgaagagaac gtgccgacca ccgccgctgg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa ctgctgaaca gccatgattg attaactcct aaacggtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtagcttcg tccctatcaa      360
          agcttggag                                                              369
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 373]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 84]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaacg ctcgactggt cggtaaccac ttgtgtgtgg tgagtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaaccagtg catggcagcg aacgccgaga gccgacaccg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa ccgtaaacct aatgggcctg atctacagta atctagtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtaggccgc ttcgtcccta      360
          tcaaagcttg gag                                                         373
          <![CDATA[<210> 85]]>
          <![CDATA[<211> 369]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 85]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaacg gtgctgaccg aggacgagaa ggaactgggc gtggtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaactccgc gatgagctgc cgtcccaaca attcaacacg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa caccaccgag acgcccacac cgtgcaagcc gccgggtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtagcttcg tccctatcaa      360
          agcttggag                                                              369
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 369]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc       60
          cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagccgtc gcgccccgca cgggcgcgtg      120
          gattgaaacg atgacaccaa cccggccaag gaagaccagg agtgtcgcgc cccgcacggg      180
          cgcgtggatt gaaacaacgc gaagccctgt tgaaaccgct gcaactggtg tcgcgccccg      240
          cacgggcgcg tggattgaaa cctatcgcga attcctgcag gctggcgcaa ccaaggtcgc      300
          gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaaccat gcaagcttgg cgtagcttcg tccctatcaa      360
          agcttggag                                                              369
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 177]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 87]]>
          gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag       60
          tcgcgccccg cacgggcgcg tggattgaaa catttatcac aaaaggattg ttcgatgtcc      120
          aacaagtcgc gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaacgca ctcccgttct ggataat         177
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡]]>核苷酸
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (11)..(11)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t或g]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t或g]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (32)..(32)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t或g]]>
          <![CDATA[<400> 88]]>
          agaagggtca nggncatgcg gtttttcctc tntg                                   34
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t或g]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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Claims

一種噬菌體，該噬菌體與普納病毒(Pbunavirus)具有至少80%序列一致性，其中該普納病毒選自PB1、p1106、p1587、p1835、p2037、p2363及p2421，且其中該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。
一種噬菌體，該噬菌體與沙穆納病毒(Samunavirus)具有至少80%序列一致性，其中該沙穆納病毒選自p1772、p2131、p2132及p2973，且其中該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。
一種噬菌體，該噬菌體與匹克茲病毒(Phikzvirus)具有至少80%序列一致性，其中該匹克茲病毒選自p1194及p4430，且其中該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。
一種噬菌體，該噬菌體與布魯伊諾格病毒(Bruynoghevirus)具有至少80%序列一致性，其中該布魯伊諾格病毒選自p1695及p3278，且其中該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽。
一種噬菌體，該噬菌體包含編碼I型CRISPR-Cas系統之核酸，該系統包含：包含一或多個與假單胞菌屬物種中之目標核苷酸序列互補之間隔序列的CRISPR陣列；Cascade多肽；及Cas3多肽；其中該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。
如請求項5之噬菌體，其與PB1 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與PB1e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1106 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1106e003具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1587 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1587e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1835 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1835e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2037 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2037e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2363 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2363e003具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2421 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2421e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1772 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1772e005具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2131 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2131e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2132 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2132e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2973 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2973e002具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1194 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p4430 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p1695 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p2167 WT具有至少80%序列一致性。
如請求項5之噬菌體，其與p3278 WT具有至少80%序列一致性。
一種噬菌體，其與PB1e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p1106e003具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p1587e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p1835e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2037e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2363e003具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2421e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p1772e005具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2131e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2132e002具有至少95%序列一致性。
一種噬菌體，其與p2973e002具有至少95%序列一致性。
一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。
一種醫藥組合物，其包含至少三種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。
一種醫藥組合物，其包含至少四種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。
一種醫藥組合物，其包含至少五種選自由以下組成之群的噬菌體：與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。
一種醫藥組合物，其包含與p1106e003具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1772e005具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1835e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p2131e002具有至少80%序列一致性之噬菌體、與p1695wt具有至少80%序列一致性之噬菌體及與p4430wt具有至少80%序列一致性之噬菌體。
一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：p1106e003、p1835e002、p1772e005、p2131e002、p1695wt、p4430wt、p2973e002、PB1e002、p2132e002、p2421e002、p1587e002、p2363e003、p2037e002、p1194wt、p2167wt、p3278wt、p2363wt、p2421wt、p1772wt、p2131wt、p2132wt、p2973wt、p1106wt、p1587wt、p1835wt、p2037wt及PB1wt。
一種醫藥組合物，其包含至少兩種選自由以下組成之群的噬菌體：p1106e003、p1695wt、p1772e005、p1106wt、p1772wt、p1835e002、p1835wt、p2131e002、p1695wt、p2131e002、p2131wt及p4430wt。
一種醫藥組合物，其包含p1106e003、p1772e005、p1835e002、p2131e002、p1695wt及p4430wt。
一種噬菌體在製造供治療假單胞菌感染用之藥劑中之用途，該噬菌體與以下各者具有至少80%序列一致性：PB1WT、PB1e002、p1106 WT、p1106e003、p1587 WT、p1587e002、p1835 WT、p1835e002、p2037 WT、p2037e002、p2363 WT、p2363e003、p2421 WT、p2421e002、p1772 WT、p1772e005、p2131 WT、p2131e002、p2132 WT、p2132e002、p2973 WT、p2973e002、p1194 WT、p4430 WT、p1695 WT、p2167 WT或p3278 WT。
一種如請求項1至43中任一項之噬菌體或如請求項44至51中任一項之醫藥組合物在製造供治療假單胞菌感染用之藥劑中之用途。
如請求項52或53之用途，其中該感染為囊腫性纖維化或非囊腫性纖維化支氣管擴張症。
如請求項52或53之用途，其中該假單胞菌為耐藥性假單胞菌。