CN117651764A - 包含crispr-cas系统的用于埃希氏菌的噬菌体组合物及其使用方法 - Google Patents

包含crispr-cas系统的用于埃希氏菌的噬菌体组合物及其使用方法 Download PDF

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CN117651764A CN202180089410.6A CN202180089410A CN117651764A CN 117651764 A CN117651764 A CN 117651764A CN 202180089410 A CN202180089410 A CN 202180089410A CN 117651764 A CN117651764 A CN 117651764A
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保罗·加罗福洛
大卫·G·奥斯特劳特
库尔特·塞利
汉纳·休伊特·图森
拉娜·麦克米兰
德鲁·德洛伦佐
罗伯特·麦基
卡梅伦·普里波尔
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Rocos Biosciences
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Abstract

这里公开了包含CRISPR‑Cas系统的用于埃希氏菌的噬菌体组合物及其使用方法。

Description

包含CRISPR-CAS系统的用于埃希氏菌的噬菌体组合物及其使 用方法
交叉引用
本申请要求2020年11月5日提交的美国临时申请第63/110,107号和2021年5月5日提交的美国临时申请第63/184,647号的权益，二者均通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，其以ASCII格式电子提交，并由此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2021年11月3日，命名为53240-744_601_SL.txt，且大小为43,562字节。
发明内容
在一些方面，本文提供了核酸、CRISPR阵列和包含它们的细菌噬菌体(bacteriophage)。进一步提供了用包含核酸、CRISPR阵列和/或细菌噬菌体的组合物杀灭埃希氏菌的方法。
在某些方面，提供了一种核酸序列，其与SEQ ID NO:39具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQID NO:13。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:39或与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的序列。
在某些方面，本文提供了一种CRISPR阵列，其包含本文的核酸序列。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个具有至少约80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的序列。
在某些方面，本文提供了一种CRISPR阵列，其包含与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的序列。
在某些方面，本文提供了一种细菌噬菌体，其包含本文的核酸或CRISPR阵列。在一些实施方案中，所述核酸和/或CRISPR阵列替换细菌噬菌体DNA。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体(phage)。在一些实施方案中，所述核酸和/或CRISPR阵列是所述细菌噬菌体中存在的CRISPR系统的一部分。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf1系统。
在某些方面，本文提供了重组噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p004ke009包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p00c0e030包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p00exe014包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p004ke009包含至少90％序列同一性。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p00c0e030包含至少90％序列同一性。在一些实施方案中，提供了一种重组噬菌体，其与p00exe014包含至少90％序列同一性。
在某些方面，本文提供了一种包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：(a)CRISPR阵列，其包含第一间隔子序列，所述第一间隔子序列包含选自SEQ ID NO:12或20-37的序列；和(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含第二间隔子序列。在一些实施方案中，所述第一间隔子序列包含SEQ IDNO:12，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:25，或所述第一间隔子序列包含SEQ IDNO:12，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:24，或所述第一间隔子序列包含SEQ IDNO:25，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含第三间隔子序列。在一些实施方案中，所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12，所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:25，并且所述第三间隔子序列包含SEQ ID NO:24。
在某些方面，本文提供了一种包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：(a)CRISPR阵列，其包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与第一埃希氏菌属物种中的第一靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述第一埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；其任选地进一步包含第三间隔子序列，所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补；和(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列，其中所述第二间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列，并且如果存在，所述第三间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含重复序列，所述重复序列包含与SEQ IDNO:13-18中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含启动子序列，所述启动子序列包含与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个具有至少约90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
在某些方面，本文提供了一种细菌噬菌体，其被修饰以用编码CRISPR系统的核酸序列替换细菌噬菌体DNA，所述CRISPR系统包含：包含与靶细菌中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的CRISPR阵列，和编码CRISPR核酸酶的序列，其中所述靶细菌包括埃希氏菌属物种。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体DNA对于所述细菌噬菌体的活力或功能性不是必需的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含间隔子序列，所述间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含重复序列，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列包含启动子序列，所述启动子序列与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个包含至少约90％同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
在某些方面，本文提供了一种组合物，其包含本文的细菌噬菌体和野生型噬菌体。在一些实施方案中，所述野生型噬菌体包含p00ke。在一些实施方案中，所述野生型噬菌体包含p5516。在一些实施方案中，所述野生型噬菌体包含p00jc。
在某些方面，本文提供了一种包含两种或更多种细菌噬菌体的组合物。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p00c0e030、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p00jc具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p00ke具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与p5516具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p00ke具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
在某些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体或根据权利要求45-54中任一项所述的组合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
在某些方面，本文提供了细菌杀灭方法和治疗方法。在一些实施方案中，提供了一种杀灭细菌的方法，其包括将来自本文的细菌噬菌体或组合物的遗传物质引入到所述细菌中。在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用本文的细菌噬菌体或组合物。在一些实施方案中，提供了一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p00jc具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。在一些实施方案中，提供了一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p00ke具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。在一些实施方案中，提供了一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p5516具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p00jc具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p00ke具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p5516具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。在一些实施方案中，提供了一种杀灭多种细菌的方法，所述方法包括将所述多种细菌与第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体组合，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集，其中所述多种细菌包括表6的两种或更多种细菌。在一些实施方案中，提供了一种治疗包含多种细菌的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集，其中所述多种细菌包括表6的两种或更多种细菌。在一些实施方案中，所述多种细菌包括表6的至少50、100、150、200、250、300或350种细菌。在一些实施方案中，所述第一和/或第二细菌噬菌体包含本文的细菌噬菌体。在一些实施方案中，(i)所述第一细菌噬菌体包含与p00jc具有至少80％同一性的噬菌体，(ii)所述第一细菌噬菌体包含与p00ke具有至少80％同一性的噬菌体，(iii)所述第一细菌噬菌体包含与p5516具有至少80％同一性的噬菌体，(iv)所述第一细菌噬菌体包含与p004Ke009具有至少80％同一性的噬菌体，(v)所述第一细菌噬菌体包含与p00c0e030具有至少80％同一性的噬菌体，或(vi)所述第一细菌噬菌体包含与p00exe014具有至少80％同一性的噬菌体。在一些实施方案中，(i)所述第一噬菌体与p004ke009具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p00c0e030、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(ii)所述第一噬菌体与p00c0e030具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(iii)所述第一噬菌体与p00exe014具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(iv)所述第一噬菌体与p00jc具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(v)所述第一噬菌体与p00ke具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p5516具有至少80％序列同一性，或(vi)所述第一噬菌体与p5516具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p00ke具有至少80％序列同一性。
在某些方面，本文公开了一种细菌噬菌体，其包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列与图1A-1C中的任一个所示的序列包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含：(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)I-C型Cascade复合物。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR-Cas系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体包含T4样病毒属(Tequatrovirus)、Rb69病毒属(Mosigyvirus)、phAPEC8病毒属(Phapecoctavirus)、独特肌病毒科(Unique Myoviridae)或威克瑞病毒属(Vectrevirus)。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是p004ke007或p004Ke005。在一些实施方案中，所述核酸序列被插入到非必需细菌噬菌体基因中。在一些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含：(a)本文公开的细菌噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体来自以下谱系：T4样病毒属、Rb69病毒属、phAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少六种细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含p004k、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke和p5516。在一些实施方案中，所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
在某些方面，本文公开了一种杀灭埃希氏菌属物种的方法，其包括将包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列的细菌噬菌体引入到所述埃希氏菌属物种中，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列，其包含与所述埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列与图1A-1C中的任一个所示的序列包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述启动子序列与SEQID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含：(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌I-C型Cascade复合物。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR-Cas系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体与p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少80％同一性。在一些实施方案中，所述核酸序列被插入非必需细菌噬菌体基因的位置中或与其相邻。在一些实施方案中，细菌细胞的混合群体包含所述埃希氏菌属物种。
在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列；包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列与图1A-1C中的任一个所示的序列包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含：(i)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR-Cas系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体与p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少80％同一性。在一些实施方案中，所述核酸序列被插入非必需细菌噬菌体基因的位置或与其相邻。在一些实施方案中，所述疾病是细菌感染。在一些实施方案中，引起所述疾病的所述埃希氏菌属物种是耐药性埃希氏菌属物种。在一些实施方案中，所述耐药性埃希氏菌属物种对至少一种抗生素具有耐药性。在一些实施方案中，引起所述疾病的所述埃希氏菌属物种是多药耐药性埃希氏菌属物种。在一些实施方案中，所述多药耐药性埃希氏菌属物种对至少一种抗生素具有耐药性。在一些实施方案中，所述抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素或甲氧西林。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，所述施用是动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮下、吸入、局部、皮肤、透皮、经粘膜、植入、舌下、颊、直肠、阴道、眼、耳或鼻施用或其任何组合。在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列与图1A-1C中的任一个所示的序列包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR-Cas系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体与p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少80％同一性。在一些实施方案中，所述核酸序列被插入到非必需细菌噬菌体基因中。
在一些实施方案中，所述成熟crRNA被效应子复合物中的单个Cas蛋白结合。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas复合物是II型系统。在一些实施方案中，包含间隔子序列的所述II型效应子复合物包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的序列；和Cas9多肽。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR-Cas系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统是III型系统，其中所述成熟crRNA被Cas10和其它Cas蛋白结合。
在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统是V型系统。在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统被Cas12蛋白结合。
在一些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含：(a)本文公开的细菌噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种细菌噬菌体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少六种细菌噬菌体，其中每种细菌噬菌体与p004k、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke和p5516包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
在某些方面，本文公开了一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列；包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述表面是医院表面、车辆表面、设备表面或工业表面。
在某些方面，本文公开了一种防止食物产品或营养补充剂中的污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列；包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述食物产品或营养补充剂包括乳、酸乳、凝乳、乳酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方或片剂、液体混悬液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管饲。
在某些方面，本文公开了一种细菌噬菌体，其包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列，所述I型CRISPR-Cas系统包含：CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列，其中所述间隔子序列包含SEQ ID NO:12或20-37；Cascade多肽；和Cas3多肽。
在某些方面，本文公开了一种细菌噬菌体，其与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体包含至少80％序列同一性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体与p004ke007或p004Ke005包含至少80％同一性。在一些实施方案中，所述细菌噬菌体进一步包含CRISPR阵列；包含与假单胞菌属物种中的靶核苷酸序列互补的一个或多个间隔子序列的Cascade多肽；和Cas3多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个间隔子序列包含SEQ IDNO:12或20-37中的至少一个，或与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少90％序列同一性。在一些实施方案中，所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列与图1A-1C中的任一个所示的序列包含至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％序列同一性。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本公开的新颖特征。通过参考阐述利用本公开原理的说明性实施方案的以下详细描述和附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A描绘了含有SC2间隔子(SEQ ID NO:42，具有接头SEQ ID NO:55)的crArray的序列和排列。
图1B描绘了噬菌体p004Ke009、p00c0e030和p00exe014的阵列序列(标记的PAIC阵列2，SEQ ID NO:43)。
图1C描绘了pJC_Cfp1阵列序列(阵列：SEQ ID NO:44，所示序列：SEQ ID NO:56)。
图2是野生型噬菌体p004k及其经工程改造的变体p004ke007的基因组的示意图。基因组轴下方的条指示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图示出了用于替换缺失区域中的WT噬菌体基因的DNA。
图3A-图3D示出了crArray/Cas系统插入在大肠埃希氏菌中的功效。图3A描绘了与三个大肠埃希氏菌菌株(b3402、b3418或b4098)混合的p004kwt(野生型)和p004ke007(SC2+Cas系统)在琼脂平板上的生长。图3B-图3D分别是b3402、b3418和b4098中的细胞生长的光密度的量化。
图4描绘了与两个大肠埃希氏菌菌株(b2185或b3911)混合的p00EX.015和p00EXe014.008(3间隔子全构建体)在琼脂平板上的生长。
图5示出了用于测试所选构建体的示例性CRISPR-Cas系统。
图6示出了在靶向细菌中测试crRNA阵列的基于质粒的实验设置。
图7示出了证明间隔子具有高覆盖率和功效的数据。
图8示出了来自单独PAIC间隔子杀灭测试的数据。
图9A示出了仅crRNA没有引起CFU形成的统计学减少。
图9B-图9C示出了指示所选间隔子不激活内源EcIF或EcIE系统的数据。图9B示出了所鉴定的间隔子的ECIF相互影响(crosstalk)。图9C示出了PAIC间隔子的ECIE活性。
图10示出了用于预测减轻突变逃逸的靶向位点的数量的突变模型。
图11示出了基于质粒的PAIC阵列杀灭数据。
图12A-图12C示出了CK618和抗生素在88分离株小组上的宿主范围。图12A，所有88个菌株上的宿主范围。图12B，21个MDR菌株上的宿主范围。图12C，具有除头孢烯外的任何β-内酰胺耐药性的31个菌株上的宿主范围。单一治疗是用CK618或抗生素治疗。抗生素+CK618是抗生素和CK618的组合。
图13A-1图3C示出了CK618和抗生素在304分离株小组上的宿主范围。图13A，所有304个菌株上的宿主范围。图13B，93个MDR菌株上的宿主范围。图13C，具有除头孢烯外的任何β-内酰胺耐药性的91个菌株上的宿主范围。单一治疗是用CK618或抗生素治疗。抗生素+CK618是抗生素和CK618的组合。
图14A示出了使用CK570噬菌体混合物体内测试经工程改造的噬菌体功效的示意性设计。
图14B示出了使用CK618噬菌体混合物体内测试经工程改造的噬菌体功效的示意性设计。
图15A-图15C示出了证明在小鼠UTI模型中施用CK570后的肾脏(图15A)、膀胱(图15B)和尿液(图15C)中的细菌负荷减少的数据。
图16A-图16E示出了证明在施用CK570后的肾脏(图16A)、膀胱(图16B)、尿液(图16C)、血液(图16D)和脾脏(图16E)中的噬菌体的可检测水平的数据。
图17A-图17B示出了证明在小鼠UTI模型中施用CK618后的肾脏(图17A)和膀胱(图17B)中的细菌负荷减少的数据。
图18A-图18C示出了证明静脉内CK618在肾脏(图18A)、膀胱(图18B)和血浆(图18C)中的生物分布的数据，所述静脉内CK618以单剂量或五个每日两次剂量施用，伴随有或未伴随有初始尿道内剂量的CK618。
图19示出了AUC(曲线下面积)比率和OD(光密度)达到时间的图示。
具体实施方式
在某些实施方案中，本文公开了包含编码CRISPR系统的核酸序列的细菌噬菌体。在一些实施方案中，CRISPR系统包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列，和编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。一个示例性CRISPR系统是I型CRISPR-Cas系统，其包括：(a)CRISPR阵列(也被称为“crArray”)；(b)Cascade多肽；和(c)Cas3多肽。另一实例是CRISPR-Cpf1系统。进一步的示例性CRISPR系统包括II型和V型CRISPR-Cas系统。
本文公开的另外的细菌噬菌体实施方案包括一种细菌噬菌体，其被修饰以用编码CRISPR系统的核酸序列替换细菌噬菌体DNA，所述CRISPR系统包含：包含与靶细菌中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的CRISPR阵列，和编码CRISPR核酸酶的序列。
在某些实施方案中，本文还公开了包含本文公开的细菌噬菌体的药物组合物。
在某些实施方案中，本文进一步公开了杀灭埃希氏菌属物种的方法，其包括将本文所述的细菌噬菌体引入到埃希氏菌属物种中。在某些实施方案中，本文进一步公开了治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用本文所述的细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体是野生型噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体是经工程改造的噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含表1的一种或多种细菌噬菌体，或与表1的一种或多种细菌噬菌体包含至少80％序列同一性。细菌噬菌体可以包括混合物(例如CK618)中的两种或更多种不同的细菌噬菌体。
本公开进一步提供了核酸序列，例如用于整合到细菌噬菌体中。在一些实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO:38-44中的任一个具有至少80％同一性。一些此类核酸序列包含间隔子和/或重复序列，其中间隔子序列(如果存在的话)与靶细菌序列互补。
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员所通常理解相同的含义。本文公开内容的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本公开。
除非上下文另有指示，否则特别旨在本文描述的本公开的各个特征能够以任何组合使用。此外，本公开还考虑到，在一些实施方案中，排除或省略了本文阐述的任何特征或特征组合。举例来说，如果说明书声明一种组合物包含组分A、B和C，则特别旨在A、B或C中的任一个或其组合被单独地或以任何组合省略和弃用。
本领域的技术人员将理解各个CRISPR-Cas系统及其组件的术语的可互换性，这是由于文献中缺乏一致性，并且本领域正在努力统一这些术语。
如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地另有指示。此外，如本文所使用，“和/或”是指并且涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能组合，并且在以选择性连词(“或”)解释时不包括组合。
如本文所使用，术语“约”在指如剂量或时间段等可测量的值时，是指特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、+0.5％或甚至±0.1％的变化。如本文所使用，如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”等短语应被解释为包括X和Y。如本文所使用，如“在约X和Y之间”等短语意指“在约X和约Y之间”，而如“约X至Y”的短语意指“约X至约Y”。
如本文所使用，术语“包括”、“包含”和“具有”指定了所述特征、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是不排除一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、组件和/或其群组的存在或添加。
如本文所使用，过渡短语“基本上由……组成”意指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中列举的特定材料或步骤，以及不会实质上影响所要求保护的公开内容的基本和新颖特征的那些材料或步骤。因此，当在本公开的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”不旨在被解释为等同于“包括”。
如本文所使用，术语“由……组成”排除了没有直接陈述的任何特征、步骤、操作、元件和/或组件。“由……组成”的使用仅限制了所述从句中阐述的特征、步骤、操作、元件和/或组件，并总整体上将其它特征、步骤、操作、元件和/或组件排除在权利要求之外。
在一些实施方案中，如本文所使用，“……的部分”或“……的一部分”或类似语言包括至少10个连续的核碱基或氨基酸，视情况而定。
如本文所使用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子之间的互补性是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著影响。
如本文所使用，“互补序列(Complement)”意指与比较核苷酸序列的100％互补性或同一性，或意指小于100％互补性(例如，约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等互补性)。互补序列或可互补的也可以用于突变的“互补序列”或与突变“互补”的方面。
如本文所使用，术语“CRISPR噬菌体”、“CRISPR增强噬菌体”和“crPhage”是指包含细菌噬菌体DNA的细菌噬菌体颗粒，所述细菌噬菌体DNA包含编码CRISPR-Cas系统的至少一个组件(例如，CRISPR阵列，crRNA；例如，包含靶向crRNA的插入序列的P1细菌噬菌体)的至少一个异源多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR-Cas系统的至少一个转录激活因子。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR-Cas系统的抗CRISPR多肽的至少一个组件。
如本文所使用，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列的情况下，短语“基本上同一”或“基本同一性”是指当针对最大对应性进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用以下序列比较算法中的一种或通过目视检查测量。在一些实施方案中，基本同一性是指两个或更多个序列或子序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、96％、96％、97％、98％或99％同一性。对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对通过工具进行，如Smith和Waterman的局部同源算法、Needleman和Wunsch的同源比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且任选地通过这些算法的计算机化实施方式进行，如可作为Wisconsin(Accelrys Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州)的一部分获得GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共有的相同组件的数量除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小限定部分)中的组件的总数。序列同一性百分比被表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列与全长多核苷酸序列或其一部分或更长的多核苷酸序列进行比较。在一些情况下，对于翻译的核苷酸序列使用BLASTX版本2.0，并且对于多核苷酸序列使用BLASTN版本2.0来确定“同一性百分比”。
如本文所使用，“靶核苷酸序列”是指靶基因的部分(即基因组或“原型间隔子序列”中的靶区域，其与原型间隔子相邻基序(PAM)序列相邻)，其与CRISPR阵列中的间隔子序列完全互补或基本上互补(例如，至少70％互补(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大比率))。
如本文所使用，术语“原型间隔子相邻基序”或“PAM”是指存在于靶DNA分子上与匹配间隔子序列的核苷酸序列相邻的DNA序列。此基序存在于靶基因中，紧邻与间隔子序列结合的区域，所述结合是因为所述间隔子序列与所述区域互补；并鉴定与间隔子核苷酸序列碱基配对的起始点。所需的确切PAM序列在每个不同的CRISPR-Cas系统之间有所不同。PAM的非限制性实例包括CCA、CCT、CCG、TTC、AAG、AGG、ATG、GAG和/或CC。在一些情况下，在I型系统中，PAM直接位于与间隔子匹配的序列的5’，因此位于与间隔子核苷酸序列碱基配对的序列的3’，并被Cascade直接识别。在一些情况下，对于耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)I-C型系统，PAM是YYC，其中Y可以是T或C。在一些情况下，对于铜绿假单胞菌I-C型系统，PAM是TTC。一旦识别出同源的原型间隔子序列和PAM，便募集Cas3，其然后裂解和降解靶DNA。对于II型系统，Cas9/sgRNA需要PAM来形成R环，以通过其向导RNA与基因组的沃森-克里克配对来询问特异性DNA序列。PAM特异性是Cas9蛋白的DNA结合特异性的功能(例如，Cas9的C-末端处的原型间隔子相邻基序识别结构域)。
如本文所使用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、抗微小RNA、调节RNA等的核酸分子。基因可以能够或不能够用于产生功能性蛋白或基因产物。基因包含编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区)二者。基因是“分离的”，其是指基本上或本质上不含通常与天然状态的核酸相关联地存在的组分的核酸。这样的组件包括其它细胞材料、来自重组生产的培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学物质。
术语“治疗”是指对象病状的严重程度降低或至少部分改善或好转，并且至少一种临床症状得到某种程度的缓解、减轻或减少，和/或疾病或病状的进展延迟，和/或疾病或病的发作延迟。关于感染、疾病或病状，所述术语是指所述感染、疾病或病状的症状或其它表现的减少。在一些实施方案中，治疗使所述感染、疾病或病状的症状或其它表现减少至少约5％，例如约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
术语“预防”(及其语法变体)是指预防和/或延迟对象中的感染、疾病、病状和/或临床症状的发作，和/或相对于在所述疾病、病症和/或临床症状发作之前在没有实施本文公开的方法时将发生的情况，所述感染、疾病、病状和/或临床症状发作的严重程度的降低。因此，在一些实施方案中，为了预防感染，用本文公开的组合物和方法处理食物、表面、医疗工具和装置。
本文使用的关于“感染”、“疾病”或“病状”的术语是指对象中的任何不利的、负面的或有害的生理状况。在一些实施方案中，“感染”、“疾病”或“病状”的源头是对象中和/或对象上的靶细菌群体的存在。在一些实施方案中，细菌群体包括一个或多个靶细菌物种。在一些实施方案中，细菌种群中的所述一个或多个细菌物种包括一种或多种细菌的一个或多个菌株。在一些实施方案中，靶细菌群体引起急性或慢性的“感染”、“疾病”或“病状”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起局部或全身的“感染”、“疾病”或“病状”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起特发性的“感染”、“疾病”或“病状”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起通过各种方式获得的“感染”、“疾病”或“病状”，所述方式包括但不限于呼吸吸入、摄入、皮肤和伤口感染、血流感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、尿路感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、腹内感染、表皮或粘膜吸收、眼感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化中的感染、留置医疗装置(如关节假体、牙植入物、导管和心脏植入物)的感染、性接触和/或医院获得性和呼吸机相关细菌性肺炎。
如本文所使用，术语“个体”或“对象”包括患有或易患涉及细菌的感染、疾病或病状的任何动物。因此，在一些实施方案中，对象是哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、甲壳动物或软体动物。哺乳动物对象包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如，大猩猩、猴子、狒狒和黑猩猩等)、狗、猫、山羊、马、猪、牛、绵羊等以及实验室动物(例如，大鼠、豚鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠等)。鸟类对象包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、雉鸡和作为宠物饲养的鸟类(例如，长尾小鹦鹉、鹦鹉、金刚鹦鹉、美冠鹦鹉、金丝雀等)。鱼类对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如，金枪鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳟鱼、鳕鱼、鲈鱼、河鲈鱼、鲷鱼等)。甲壳动物对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如，虾、对虾、龙虾、小龙虾、螃蟹等)。软体动物对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如，鲍鱼、贻贝、牡蛎、蛤蜊、扇贝等)。在一些实施方案中，合适的对象包括雄性和雌性以及任何年龄的对象，包括胚胎(例如，子宫内或卵内)、婴儿、少年、青少年、成人和老年对象。在一些实施方案中，对象是人类。
如此处所使用，核酸序列情况下的术语“分离的”是离开其天然环境存在的核酸序列。
如本文所使用，“表达盒”意指包含感兴趣的核苷酸序列的重组核酸分子(例如，本文公开的重组核酸分子和CRISPR阵列)，其中所述核苷酸序列与至少控制序列(例如，启动子)可操作地相关联。
如本文所使用，“嵌合的”是指核酸分子或多肽，其中至少两个组件源自不同的来源(例如，不同的生物体，不同的编码区)。
如本文所使用，“可选择标志物”意指一种核苷酸序列，当被表达时，其赋予表达所述标志物的宿主细胞一种独特的表型，从而允许这种转化细胞与没有所述标志物的那些细胞相区分。
如本文所使用，“载体”是指用于将一个核酸(或多个核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。
如本文所使用，“药学上可接受的”意指非生物学上或其它方面不期望的材料，即所述材料被施用于对象而不会引起如毒性等任何不期望的生物学效应。
如本文所使用，术语“生物膜”意指包埋在多糖基质中的微生物体的累积。生物膜在实体生物或非生物表面上形成，具有重要的医学意义，占体内微生物感染的高于80％。
如本文所使用，术语“体内”用于描述在对象体内发生的事件。
如本文所使用，术语“体外”用于描述在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得其与获得所述材料的生物来源分离。体外测定可以涵盖其中采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定也可以涵盖不采用完整细胞的无细胞测定。
CRISPR/CAS系统
CRISPR-Cas系统是在细菌和古菌中发现的天然适应性免疫系统。CRISPR系统是参与针对入侵细菌噬菌体和质粒的防御的核酸酶系统，其提供了某一形式的获得性免疫。基于cas基因的集合及其系统发育关系，CRISPR-Cas系统存在多样性。至少有六个不同的类型(I至VI)，其中I型占细菌和古菌二者中的所有已鉴定系统的超过50％。在一些实施方案中，本文使用了I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统。
I型系统分为七个亚型，包括：I-A型、I-B型、I-C型、I-D型、I-E型、I-F型和I-U型。I型CRISPR-Cas系统包括被称为Cascade的多亚基复合物(与抗病毒防御相关的复合物)、Cas3(一种具有核酸酶、解旋酶和核酸外切酶活性的蛋白质，其负责降解靶DNA)和编码crRNA的CRISPR阵列(稳定Cascade复合物并将Cascade和Cas3引导到DNA靶标)。Cascade与crRNA形成复合物，并且该蛋白质-RNA对通过crRNA序列的5’端和预定义的原型间隔子之间的互补碱基配对识别其基因组靶标。这种复合物通过crRNA内编码的区域和病原体基因组内的原型间隔子相邻基序(PAM)被引导到病原体DNA的同源基因座。crRNA和靶DNA序列之间发生碱基配对，导致构象变化。在I-E型系统中，PAM被Cascade内的CasA蛋白识别，其然后解开侧翼DNA以评估靶标和crRNA的间隔子部分之间的碱基配对程度。足够的识别导致Cascade招募和激活Cas3。Cas3然后切割非靶链，并开始在3’至5’方向上降解所述链。
在I-C型系统中，蛋白Cas5、Cas8c和Cas7形成Cascade效应子复合物。Cas5加工前crRNA(其可以采取多间隔子阵列或两个重复之间的单个间隔子的形式)以产生由发夹结构构成的单独crRNA，所述发夹结构由其余的重复序列和线性间隔子形成。效应子复合物然后与经加工的crRNA结合，并扫描DNA以识别PAM位点。在I-C型系统中，PAM被Cas8c蛋白识别，然后发挥作用解开DNA双链体。如果PAM的序列3’与结合到效应子复合物的crRNA间隔子匹配，则复合物发生构象变化，并且Cas3被募集到所述位点。Cas3然后切割非靶链，并开始降解DNA。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统对于埃希氏菌属物种来说内源的。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统对于埃希氏菌属物种来说是外源的。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-A型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-B型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-C型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-D型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-E型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-F型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I-U型CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是II型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是III型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是IV型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是VI型CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，本文公开的CRISPR阵列的加工包括但不限于以下过程：1)编码前crRNA的核酸的转录；2)由Cascade和/或Cascade的特定构件(如，Cas6)识别前crRNA，和3)由Cascade或Cascade的构件(如，Cas6)将前crRNA加工成成熟crRNA。在一些实施方案中，I型CRISPR系统的作用模式包括但不限于以下过程：4)成熟crRNA与Cascade复合；5)经复合的成熟crRNA/Cascade复合物的靶标识别；和6)导致DNA降解的靶标处的核酸酶活性。
CRISPR噬菌体
在某些实施方案中，本文公开了包含CRISPR-Cas系统的细菌噬菌体组合物及其使用方法。
细菌噬菌体或“噬菌体”代表一组细菌病毒，并且经工程改造或来源于环境来源。单独细菌噬菌体宿主范围通常很窄，这意味着噬菌体对某一细菌物种的一个菌株或较少数菌株具有高度特异性，并且这种特异性使它们具有独特的抗细菌作用。细菌噬菌体是依靠宿主的细胞机制进行复制的细菌病毒。细菌噬菌体通常根据其生活方式被分类为烈性噬菌体或温和噬菌体。烈性细菌噬菌体也被称为裂解性细菌噬菌体，其只能进行裂解性复制。裂解性细菌噬菌体感染宿主细胞，进行多轮复制，并触发细胞裂解以释放新产生的细菌噬菌体颗粒。在一些实施方案中，本文公开的裂解性细菌噬菌体保留它们的复制能力。在一些实施方案中，本文公开的裂解性细菌噬菌体保留它们触发细胞裂解的能力。在一些实施方案中，本文公开的裂解性细菌噬菌体保留它们的复制能力和触发细胞裂解的能力二者。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体包含CRISPR阵列。在一些实施方案中，CRISPR阵列不影响细菌噬菌体复制和/或触发细胞裂解的能力。温和细菌噬菌体或溶原性细菌噬菌体可以经历溶原性，其中噬菌体停止复制并稳定地存在于宿主细胞中，整合到细菌基因组中或被维持为染色体外质粒。温和噬菌体也可以经历裂解性复制，类似于它们的裂解性细菌噬菌体对应物。温和噬菌体在感染时是裂解性复制还是经历溶原性取决于包括生长条件和细胞的生理状态在内的多种因素。具有整合到其基因组中的溶原性噬菌体的细菌细胞被称为溶原性细菌或溶原体。暴露于不利条件可能触发溶原性噬菌体的再激活、溶原性状态的终止和噬菌体裂解性复制的恢复。这个过程叫做诱导。有利于溶原性状态的终止的不利条件包括干燥、暴露于UV或电离辐射以及暴露于诱变化学物质。这导致噬菌体基因的表达、整合过程的逆转和裂解性增殖。在一些实施方案中，本文公开的温和细菌噬菌体被赋予裂解性。术语“溶原基因”是指其基因产物促进温和噬菌体的溶原性的任何基因。溶原基因可以直接促进溶原性，如在有助于细菌噬菌体向宿主基因组中整合的整合酶蛋白的情况下。溶原基因也可以间接促进溶原性，如在阻止裂解性复制所需的基因的转录从而有利于维持溶原性的CI转录调节因子的情况下。
细菌噬菌体使用三种一般方法包装和递送合成DNA。在第一种方法中，合成DNA以靶向方式重组到细菌噬菌体基因组中，这通常涉及可选择标志物。在第二种方法中，使用噬菌体内的限制性位点来在体外引入合成DNA。在第三种方法中，通常编码噬菌体包装位点和裂解性复制起点的质粒被包装为细菌噬菌体颗粒的组装部分。所得的质粒被称为“噬菌粒”。
由于进化的原因，噬菌体限于给定的细菌菌株。在一些情况下，将他们的遗传物质注入到不相容的菌株会事与愿违。因此，噬菌体已经进化成专门感染有限典型类型的细菌菌株。然而，已经发现一些噬菌体将它们的遗传物质注入到多种细菌中。经典的实例是P1噬菌体，它已被证明能在多种革兰氏阴性细菌中注入DNA。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码第一间隔子序列的第一核酸序列或由其转录的crRNA的细菌噬菌体，其中第一间隔子序列与来自埃希氏菌属物种中的靶基因的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含编码第一间隔子序列的第一核酸序列或由其转录的crRNA，其中第一间隔子序列与来自埃希氏菌属物种中的靶基因的靶核苷酸序列互补，条件是细菌噬菌体被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在维持溶原周期方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在建立溶原周期方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在建立溶原周期和维持溶原周期两方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因是阻遏子基因。在一些实施方案中，溶原基因是cI阻遏子基因。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过去除溶原基因的调节元件而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过去除溶原基因的启动子而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过去除溶原基因的功能元件而被赋予裂解性。在一些实施方案中，溶原基因是激活因子基因。在一些实施方案中，溶原基因是cII基因。在一些实施方案中，溶原基因是int(整合酶)基因。在一些实施方案中，两个或更多个溶原基因被去除、替换或灭活，以引起细菌噬菌体溶原周期的停滞和/或裂解周期的诱导。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过包含被引导到溶原基因的第二间隔子的第二CRISPR阵列而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过插入一个或多个裂解基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过插入有助于诱导裂解周期的一个或多个基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过改变有助于诱导裂解周期的一个或多个基因的表达而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体在表型上从溶原性细菌噬菌体变为裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，表型变化通过自靶向CRISPR-Cas系统以使细菌噬菌体具有裂解性，因为它不能溶原。在一些实施方案中，自靶向CRISPR-Cas包含来自原噬菌体基因组的自靶向crRNA并杀灭溶原体。在一些实施方案中，细菌噬菌体通过环境改变而被赋予裂解性。在一些实施方案中，环境改变包括但不限于温度、pH或营养物的改变；暴露于抗生素、过氧化氢、外来DNA或DNA破坏剂；有机碳的存在；以及重金属(例如，呈铬(VI)的形式)的存在。在一些实施方案中，防止被赋予裂解性的细菌噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，通过引入另外的CRIPSR阵列来防止被赋予裂解性的细菌噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，除了由细菌噬菌体的裂解活性和/或CRISPR阵列的活性引起的细胞死亡之外，细菌噬菌体不赋予埃希氏菌属物种任何新的性质。在一些实施方案中，本文进一步公开了温和细菌噬菌体，其包含编码第一间隔子序列的第一核酸序列或由其转录的crRNA，其中第一间隔子序列与来自埃希氏菌属物种中的靶基因的靶核苷酸序列互补，条件是细菌噬菌体被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体感染多个细菌菌株。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶基因的启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于靶基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含埃希氏菌属物种存活所需的必需基因的至少一部分。在一些实施方案中，基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，靶核苷酸序列在非必需基因中。非必需基因的非限制性实例包括ppSa(例如，SC2)、raiA(例如，SC6)和基因间保守重复(例如，SC6)。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非编码序列。在一些实施方案中，非编码序列是基因间序列。在一些实施方案中，间隔子序列与埃希氏菌属物种中的高度保守序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔子序列与埃希氏菌属物种中存在的序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔子序列与包含必需基因的启动子序列的全部或部分的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，第一核酸序列包含第一CRISPR阵列，所述第一CRISPR阵列包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与第一间隔子序列可操作地连接。
在一些实施方案中，细菌噬菌体或噬菌粒DNA来自溶原性或温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体或噬菌粒包含但不限于P1噬菌体、M13噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、φC2噬菌体、φCD27噬菌体、φNM1噬菌体、Bc431 v3噬菌体、φ10噬菌体、φ25噬菌体、φ151噬菌体、A511样噬菌体、B054、0176样噬菌体或弯曲杆菌噬菌体(如，NCTC 12676和NCTC 12677)。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含但不限于p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516。
在一些实施方案中，一起使用多种细菌噬菌体。在一些实施方案中，一起使用的所述多种细菌噬菌体靶向样品或对象内的相同或不同细菌。
在一些实施方案中，感兴趣的细菌噬菌体获自环境来源或商业研究供应商。在一些实施方案中，对于针对细菌及其相关菌株的文库的裂解活性，对所获得的细菌噬菌体进行筛选。在一些实施方案中，对于细菌及其相关菌株的文库，针对其在所筛选的细菌中生成原发耐药性的能力对细菌噬菌体进行筛选。
在一些实施方案中，核酸被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸包含crArray、Cas系统或其组合。在一些实施方案中，核酸在感兴趣的操纵子的末端处的转录终止子位点处被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸作为一个或多个被去除的非必需基因的替换被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸作为一个或多个被去除的溶原基因的替换被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，用核酸替换非必需和/或溶原基因增强了细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸替换非必需和/或溶原基因使溶原性细菌噬菌体具有裂解性。
在一些实施方案中，核酸在第一位置处被引入到细菌噬菌体基因组中，而一个或多个非必需和/或溶原基因在不同的位置处从细菌噬菌体基因组中被分别去除和/或灭活。在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的去除使溶原性细菌噬菌体成为裂解性细菌噬菌体。类似地，在一些实施方案中，一个或多个裂解基因被引入到细菌噬菌体中，以使非裂解性、溶原性细菌噬菌体成为裂解性细菌噬菌体。
在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的替换、去除、灭活或其任何组合通过化学、生物化学和/或任何合适的方法实现。在一些实施方案中，一个或多个裂解基因的插入通过任何合适的化学、生物化学和/或物理方法通过同源重组来实现。
在一些实施方案中，待从细菌噬菌体中去除和/或替换的非必需基因是对细菌噬菌体的存活非必需的基因。在一些实施方案中，待从细菌噬菌体中去除和/或替换的非必需基因是对裂解周期的诱导和/或维持非必需的基因。
在某些实施方案中，本文公开了包含完整外源CRISPR系统的细菌噬菌体。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在某些实施方案中，本文公开了包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述I型CRISPR-Cas系统包含：(a)CRISPR阵列；(b)Cascade多肽；和(c)Cas3多肽。示例性I型组件序列被提供为SEQ ID NO:47-54。在某些实施方案中，本文公开了包含编码V型CRISPR-Cpf1(Cas12a)系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述V型CRISPR-Cpf1系统包含与Cpf1核酸酶多肽相关的CRISPR阵列。示例性Cpf1序列被提供为SEQ ID NO:46。在一些实施方案中，CRISPR系统包含与SEQ ID NO:46-54中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR系统包含SEQ ID NO:46-54中的任一个。例如，CRISPR系统包含与SEQID NO:46具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:47具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:48具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:49具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:50具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ IDNO:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:52具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；与SEQ ID NO:53具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或与SEQ ID NO:54具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或其任何组合。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p004ke007。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p004Ke005。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p004K。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00c0。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00ex。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00jc。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00ke。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p5516。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p004ke009。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00c0e030。在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00exe014。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含表1中列出的噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，一起使用多种细菌噬菌体。在一些实施方案中，一起使用的所述多种细菌噬菌体靶向样品或对象内的相同或不同细菌。在一些实施方案中，一起使用包含多种细菌噬菌体的混合物。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的2种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的3种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的3种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的4种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的5种噬菌体。在一些实施方案中，混合物包含选自表1的6种噬菌体。在一些实施方案中，混合物中的至少一种细菌噬菌体包含CRISPR阵列(例如，包含表2-4的一个或多个组件)。在一些实施方案中，混合物中存在的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细菌噬菌体包含CRISPR阵列。在一些实施方案中，混合物中的至少一种细菌噬菌体包含编码Cascade多肽的核酸序列。在一些实施方案中，混合物中存在的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细菌噬菌体包含编码Cascade多肽的核酸序列。在一些实施方案中，混合物中的至少一种细菌噬菌体包含编码Cas3多肽的核酸序列。在一些实施方案中，混合物中存在的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细菌噬菌体包含编码Cas3多肽的核酸序列。在一些实施方案中，混合物包含p004ke009、p00c0e030、p00exe014，其中每种细菌噬菌体包含I型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物进一步包含p5516。在一些实施方案中，混合物进一步包含p00jc。在一些实施方案中，混合物进一步包含p00ke。
CRISPR阵列
在一些实施方案中，CRISPR阵列(crArray)包含间隔子序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列编码经加工的成熟crRNA。在一些实施方案中，成熟crRNA被引入到噬菌体或埃希氏菌属物种中。在一些实施方案中，内源或外源Cas6将CRISPR阵列加工成成熟crRNA。在一些实施方案中，外源Cas6被引入到噬菌体中。在一些实施方案中，噬菌体包含外源Cas6。在一些实施方案中，外源Cas6被引入到埃希氏菌属物种中。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含间隔子序列。在一些实施方案中，所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与间隔子序列可操作地连接。在一些实施方案中，CRISPR阵列具有任何长度，并且包含与重复核苷酸序列交替的任何数量的间隔子核苷酸序列，所述重复核苷酸序列是通过靶向一个或多个必需基因来实现对埃希氏菌属物种的期望杀灭水平所必需的。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含1至约100个间隔子核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成，每个间隔子核苷酸序列在其5’端和其3’端上与重复核苷酸序列连接。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个间隔子核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:38具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:42。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与SEQ ID NO:44具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含SEQ ID NO:44。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表3的间隔子(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表3的间隔子。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表4的重复(例如，来自表3的1、2或3个间隔子)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表4的重复。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含与来自表1的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，CRISPR阵列包含来自表1的启动子。
间隔子序列
在一些实施方案中，间隔子序列与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是编码区。在一些实施方案中，编码区是必需基因。在一些实施方案中，编码区是非必需基因。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非编码序列。在一些实施方案中，非编码序列是基因间序列。在一些实施方案中，间隔子序列与埃希氏菌属物种中的高度保守序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔子序列与埃希氏菌属物种中存在的序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔子序列与包含必需基因的启动子序列的全部或部分的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，与靶核苷酸序列相比，间隔子序列包含一个、两个、三个、四个或五个错配。在一些实施方案中，错配是连续的。在一些实施方案中，错配是非连续的。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核苷酸序列具有70％互补性。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核苷酸序列具有80％互补性。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核苷酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核苷酸序列具有100％互补性。在一些实施方案中，间隔子序列在长度为至少约8个核苷酸至约150个核苷酸的靶核苷酸序列区域上具有完全互补性或基本互补性。在一些实施方案中，间隔子序列在长度为至少约20个核苷酸至约100个核苷酸的靶核苷酸序列区域上具有完全互补性或基本互补性。在一些实施方案中，间隔子序列的5’区域与靶核苷酸序列100％互补，而间隔子的3’区域与靶核苷酸序列基本上互补，并且因此间隔子序列与靶核苷酸序列的总互补性小于100％。例如，在一些实施方案中，20个核苷酸的间隔子序列的3’区域(种子区)中的前7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列的3’端的前7至12个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约50％互补(例如，50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大比率)。在一些实施方案中，间隔子序列的3’端中的前7至10个核苷酸与靶核苷酸序列75％-99％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶核苷酸序列至少约50％至约99％互补。在一些实施方案中，间隔子序列的3’端中的前7至10个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列的前10个核苷酸(种子区内)与靶核苷酸序列100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列的5’区域(例如，5’端处的前8个核苷酸、5’端处的前10个核苷酸、5’端处的前15个核苷酸、5’端处的前20个核苷酸)与靶核苷酸序列具有约75％或更大互补性(75％至约100％互补性)，而间隔子序列的其余部分与靶核苷酸序列具有约50％或更大互补性。在一些实施方案中，间隔子序列的5’端处的前8个核苷酸与靶核苷酸序列具有100％互补性或具有一个或两个突变，并且因此与靶核苷酸序列分别具有约88％互补性或约75％互补性，而间隔子核苷酸序列的其余部分与靶核苷酸序列具有至少约50％或更大互补性。
在一些实施方案中，间隔子序列的长度为约15个核苷酸至约150个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子核苷酸序列的长度为约15个核苷酸至约100个核苷酸(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个核苷酸或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，间隔子核苷酸序列的长度为约8至约150个核苷酸、约8至约100个核苷酸、约8至约50个核苷酸、约8至约40个核苷酸、约8至约30个核苷酸、约8至约25个核苷酸、约8至约20个核苷酸、约10至约150个核苷酸、约10至约100个核苷酸、约10至约80个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约15至约150、约15至约100、约15至约50、约15至约40、约15至约30、约20至约150个核苷酸、约20至约100个核苷酸、约20至约80个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约20至约40、约20至约30、约20至约25、至少约8、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约32、至少约35、至少约40、至少约44、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150个核苷酸、或更多个核苷酸、以及其中的任何值或范围。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌I-C型Cas系统具有约30至39个核苷酸、约31至约38个核苷酸、约32至约37个核苷酸、约33至约36个核苷酸、约34至约35个核苷酸或约35个核苷酸的间隔子长度。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌I-C型Cas系统具有约34个核苷酸的间隔子长度。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌I-C型Cas系统具有至少约10、至少约15、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约29、至少约29、至少约30、至少约31、至少约32、至少约33、至少约34、至少约、至少约35、至少约36、至少约37、至少约38、至少约39、至少约20、至少约41、至少约42、至少约43、至少约44、至少约45或超过约45个核苷酸的间隔子长度。
在一些实施方案中，间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少或约95％同源性。在一些情况下，间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少或约97％同源性。在一些情况下，间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37包含至少或约99％同源性。在一些情况下，间隔子序列与SEQID NO:12或20-37包含100％同源性。在一些情况下，间隔子序列包含具有SEQ ID NO:12或20-37中的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或超过34个核苷酸的至少一部分。
术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列在比较窗口内是相同的(即基于逐个核苷酸)。术语“序列同一性百分比”通过以下计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置的数量以得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口内的位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得出序列同一性百分比。
两个蛋白质之间的术语“同源性”或“相似性”通过比较一个蛋白质序列与另一个蛋白质序列的氨基酸序列及其保守氨基酸取代基来确定。相似性可以通过本领域熟知的程序来确定，例如BLAST程序(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具)。
在一些实施方案中，CRISPR阵列的两个或更多个间隔子序列的同一性是相同的。在一些实施方案中，CRISPR阵列的两个或更多个间隔子序列的同一性是不同的。在一些实施方案中，CRISPR阵列的两个或更多个间隔子序列的同一性是不同的，但是与一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，CRISPR阵列的两个或更多个间隔子序列的同一性是不同的，并且与作为重叠序列的一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，CRISPR阵列的两个或更多个间隔子序列的同一性是不同的，并且与不是重叠序列的一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列长度为约10至约40个连续核苷酸，紧邻生物体的基因组中的PAM序列定位(PAM序列紧邻靶区域的3’定位)。在一些实施方案中，靶核苷酸序列邻近或侧接PAM(原型间隔子相邻基序)。
PAM序列存在于靶基因中，紧邻与间隔子序列结合的区域，所述结合是因为所述间隔子序列与所述区域互补；并鉴定与间隔子核苷酸序列碱基配对的起始点。所需的确切PAM序列在每个不同的CRISPR-Cas系统之间有所不同，并通过已建立的生物信息学和实验程序进行鉴定。PAM的非限制性实例包括CCA、CCT、CCG、TTC、AAG、AGG、ATG、GAG和/或CC。对于I型系统，PAM直接位于与间隔子匹配的序列的5’，因此位于与间隔子核苷酸序列碱基配对的序列的3’，并被Cascade直接识别。一旦识别出原型间隔子序列，Cascade通常招募核酸内切酶Cas3，其切割并降解靶DNA。对于II型系统，Cas9/sgRNA需要PAM来形成R环，以通过其向导RNA与基因组的沃森-克里克配对来询问特异性DNA序列。PAM特异性是Cas9蛋白的DNA结合特异性的功能(例如，Cas9的C-末端处的原型间隔子相邻基序识别结构域)。
在一些实施方案中，待杀灭的细菌中的靶核苷酸序列是任何感兴趣的必需靶核苷酸序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非必需序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含编码必需基因的启动子或其互补序列的核苷酸序列的全部或部分，或基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，间隔子核苷酸序列与必需基因的启动子或其部分互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的编码或非编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。
在一些实施方案中，必需基因是生物体的对其存活至关重要的任何基因。然而，“必需”高度取决于有机体生活的环境。例如，只有在淀粉是唯一的能量来源的情况下，消化淀粉所需的基因才是必需的。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶基因的启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于靶基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含埃希氏菌属物种存活所需的必需基因的至少一部分。在一些实施方案中，必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含非必需基因或其一部分。在一些实施方案中，非必需基因是生物体的对存活非至关重要的任何基因。然而，“非必需”高度取决于生物体生活的环境。非必需基因的非限制性实例包括ppSa(例如，SC2)、raiA(例如，SC6)和基因间保守重复(例如，SC6)。
在一些实施方案中，感兴趣的靶核苷酸序列的非限制性实例包括编码转录调节因子、翻译调节因子、聚合酶基因、代谢酶、转运蛋白、RNA酶、蛋白酶、DNA复制酶、DNA修饰或降解酶、调节RNA、转移RNA或核糖体RNA的靶核苷酸序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列来自参与细胞分裂、细胞结构、代谢、运动性、致病性、毒性或抗生素耐药性的基因。在一些实施方案中，靶核苷酸序列来自功能尚未表征的假设基因。因此，例如，这些基因是来自任何细菌的任何基因。
可以通过定位代表性基因组搜索集，用相关参数搜索基因组，并确定用于CRISPR工程改造噬菌体的间隔子的质量，来鉴定全构建体噬菌体的合适间隔子序列。
首先，针对感兴趣的生物体/物种/靶标定位并获取合适的代表性基因组搜索集。代表性基因组的集可以在各种数据库中找到，包括但不限于NCBI基因库或PATRIC数据库。NCBI基因库是可用的最大数据库之一，其含有迄今为止几乎所有已测序生物体的参考和提交基因组的混合物。具体地，对于致病原核生物，PATRIC(病理系统资源整合中心)数据库提供了另外的综合基因组资源，并提供了对与药物产品相关的临床相关菌株和基因组的关注。上述两个数据库都允许通过FTP(文件传输协议)服务器批量下载基因组，从而实现快速和程序化数据集获取。
接下来，用相关参数搜索基因组以定位合适的间隔子序列。可以以正向和反向互补方向从头至尾读取基因组，以定位含有PAM(原型间隔子相邻基序)位点的连续DNA片段。间隔子序列将是与PAM位点3’或5’相邻的N长度的DNA序列(取决于CRISPR系统类型)，其中N特定于感兴趣的Cas系统，并且通常是预先已知的。表征PAM序列和间隔子序列可以在Cas系统的发现和初始研究期间进行。每个观察到的PAM相邻间隔子可以保存到文件和/或数据库中，以供下游使用。所需的确切PAM序列在每个不同的CRISPR-Cas系统之间有所不同，并通过已建立的生物信息学和实验程序进行鉴定。
接下来，确定CRISPR工程改造噬菌体中使用的间隔子的质量。可以评估每个观察到的间隔子，以确定它们存在于多少个评估的基因组中。可以对观察到的间隔子进行评估，以了解它们在每个给定的基因组中可能出现的次数。在每个基因组超过一个位置出现的间隔子可能是有利的，因为如果发生突变，Cas系统可能无法识别靶位点，并且每个另外的“备份”位点增加了将存在合适的非突变靶位置的可能性。可以评估观察到的间隔子，以确定它们是否出现在基因组的功能注释区域。如果可获得这些信息，可以进一步评估功能注释，以确定基因组的这些区域对于生物体的存活和功能是否是“必需的”。通过关注出现在所有或几乎所有评估的感兴趣基因组(>＝99％)中的间隔子，间隔子选择可以广泛适用于许多靶向基因组。如果存在较大的保守间隔子选择池，则可以优先选择出现在具有已知功能的基因组区域中的间隔子，如果这些基因组区域对于存活是“必需的”并且在每个基因组中出现超过1次，则给予更高的优先级。
在一些实施方案中，验证全构建体噬菌体的间隔子序列。在一些实施方案中，第一步包括鉴定在感兴趣的生物体、物种或靶标中复制的质粒。在一些实施方案中，质粒具有可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物是抗生素耐药性基因。在一些实施方案中，表达盒包括可选择标志物的核苷酸序列。在一些实施方案中，可选择标志物是腺嘌呤脱氨酶(ada)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(Bsr，BSD)、博来霉素结合蛋白(Ble)、新霉素磷酸转移酶(neo)、组氨醇脱氢酶(hisD)、谷氨酰胺合酶(GS)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、胞嘧啶脱氨酶(codA)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Pac)或潮霉素B磷酸转移酶(Hph)、氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素、多粘菌素B、红霉素、羧苄青霉素、链霉素、壮观霉素、嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Pac)或吉欧霉素(Sh bla)。在一些实施方案中，可选择标志物是涉及胸苷酸合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合酶的基因。在一些实施方案中，可选择标志物是编码荧光蛋白的基因。
在一些实施方案中，第二步包括将编码Cas系统的基因插入到质粒中，使得它们将在感兴趣的生物体、物种或靶标中表达。在一些实施方案中，在Cas系统的上游提供启动子。在一些实施方案中，启动子被感兴趣的生物体、物种或靶标识别，以驱动Cas系统的表达。示例性启动子包括但不限于L-阿拉伯糖诱导型(araBAD，PBAD)启动子、任何lac启动子、L-鼠李糖诱导型(rhaPBAD)启动子、T7 RNA聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(pLpL-9G-50)、脱水四环素诱导型(tetA)启动子、trp、Ipp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、Ipp-lac、cspA、11-lac操纵子、T3-lac操纵子、T4基因32、T5-lac操纵子、nprM-lac操纵子、Vhb、蛋白A、棒状杆菌-大肠埃希氏菌样启动子、thr、horn、白喉毒素启动子、sig A、sigB、nusG、SoxS、katb、α-淀粉酶(Pamy)、Ptms、P43(包含两个重叠的RNA聚合酶σ因子识别位点，σΑ、σΒ)、Ptms、P43、rplK-rplA、铁氧还蛋白启动子和/或木糖启动子。在一些实施方案中，启动子是BBa_J23102、BBa_J23104或BBa_J23109。在一些实施方案中，启动子源自生物体、物种或靶细菌，如内源CRISPR启动子、内源Cas操纵子启动子、p16、plpp或ptat。在一些实施方案中，启动子是噬菌体启动子，如gp105或gp245的启动子。在一些实施方案中，在启动子和Cas系统之间提供核糖体结合位点(RBS)。在一些实施方案中，RBS被感兴趣的生物体、物种或靶标识别。
在一些实施方案中，第三步包括将基因组靶向间隔子提供到质粒中。在一些实施方案中，基因组靶向间隔子使用生物信息学鉴定。在一些实施方案中，基因组靶向间隔子被提供在重复-间隔子-重复的上游。在一些实施方案中，提供启动子。在一些实施方案中，启动子被感兴趣的生物体、物种或靶标识别，以驱动crRNA的表达。在一些实施方案中，第三步的克隆包括使用不被所克隆的间隔子靶向的生物体或物种。
在一些实施方案中，第四步包括将非靶间隔子提供到表达Cas系统的质粒中。在一些实施方案中，非靶间隔子包含随机的序列。在一些实施方案中，非靶间隔子包含不包含感兴趣的生物体、物种或靶标的基因组中的靶向位点的序列。在一些实施方案中，使用生物信息学确定非靶间隔子序列以不包含感兴趣的生物体、物种或靶标的基因组中的靶向位点。在一些实施方案中，非靶间隔子序列被提供在重复-间隔子-重复的上游。在一些实施方案中，提供启动子。在一些实施方案中，启动子被感兴趣的生物体、物种或靶标识别，以驱动crRNA的表达。
在一些实施方案中，第五步包括确定所生成的每个间隔子的功效。在一些实施方案中，确定杀灭功效。在一些实施方案中，确定每个间隔子靶向细菌基因组的功效。在一些实施方案中，与包含非靶向间隔子的质粒相比，包含间隔子的质粒的转移速率降低约0.5倍、约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或至多约100倍。
重复核苷酸序列
在一些实施方案中，CRISPR阵列的重复核苷酸序列包含CRISPR-Cas系统的任何已知重复核苷酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，重复核苷酸序列是包含来自CRISPR-Cas系统的天然重复的二级结构(例如，内部发夹)的合成序列。在一些实施方案中，重复核苷酸序列基于CRISPR-Cas系统的已知重复核苷酸序列而彼此不同。在一些实施方案中，重复核苷酸序列各自由来自CRISPR-Cas系统的天然重复的不同二级结构(例如，内部发夹)构成。在一些实施方案中，重复核苷酸序列是可与CRISPR-Cas系统一起操作的不同重复核苷酸序列的组合。
在一些实施方案中，间隔子序列在其5’端处与重复序列的3’端连接。在一些实施方案中，间隔子序列在其5’端处与重复序列的3’端的约1至约8、约1至约10或约1至约15个核苷酸连接。在一些实施方案中，重复序列的约1至约8、约1至约10、约1至约15个核苷酸是重复序列的3’端的一部分。在一些实施方案中，间隔子核苷酸序列在其3’端处与重复序列的5’端连接。在一些实施方案中，间隔子在其3’端处与重复序列的5’端的约1至约8、约1至约10或约1至约15个核苷酸连接。在一些实施方案中，重复序列的约1至约8、约1至约10、约1至约15个核苷酸是重复序列的5’端的一部分。
在一些实施方案中，间隔子核苷酸序列在其5’端处与第一重复序列连接，并在其3’端处与第二重复序列连接，以形成重复-间隔子-重复序列。在一些实施方案中，间隔子序列在其5’端处与第一重复序列的3’端连接，并在其3’端处与第二重复序列的5’连接，其中间隔子序列和第二重复序列重复以形成重复-(间隔子-重复)n序列，使得n是1至100的任何整数。在一些实施方案中，重复-(间隔子-重复)n序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个间隔子核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，重复序列与来自野生型CRISPR基因座的重复序列相同或基本上相同。在一些实施方案中，重复序列是表3中存在的重复序列。在一些实施方案中，重复序列是本文描述的序列。在一些实施方案中，重复序列包含野生型重复序列的一部分(例如，野生型重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，重复序列包含至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或其中的任何范围)，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，重复序列包含不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，重复序列包含约20至40、21至40、22至40、23至40、24至40、25至40、26至40、27至40、28至40、29至40、30至30、31至40、32至40、33至40、34至40、35至40、36至40、37至40、38至40、39至40、20至39、20至38、20至37、20至36、20至35、20至34、20至33、20至32、20至31、20至30、20至29、20至28、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22或20至21个核苷酸。在一些实施方案中，重复序列包含约20至35、21至35、22至35、23至35、24至35、25至35、26至35、27至35、28至35、29至35、30至30、31至35、32至35、33至35、34至35、25至40、25至39、25至38、25至37、25至36、25至35、25至34、25至33、25至32、25至31、25至30、25至29、25至28、25至26个核苷酸。在一些实施方案中，所述系统是铜绿假单胞菌I-C型Cas系统。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌I-C型Cas系统具有约25至38个核苷酸的重复长度。
在一些实施方案中，重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少或约95％同源性。在一些情况下，重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少或约97％同源性。在一些情况下，重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少或约99％同源性。在一些情况下，重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含100％同源性。在一些情况下，重复序列包含具有SEQ ID NO:13-18中的任一个的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或超过32个核苷酸的至少一部分。
I型CRISPR-Cas系统
在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-A型系统、I-B型系统、I-C型系统、I-D型系统、I-E型系统或I-F型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-A型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-B型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-C型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-D型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-E型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统是I-F型系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统包含Cascade多肽。I型Cascade多肽加工CRISPR阵列以产生经加工的RNA，其然后用于将复合物结合到与经加工的RNA中的间隔子互补的靶序列。在一些实施方案中，I型Cascade复合物是I-A型Cascade多肽、I-B型Cascade多肽、I-C型Cascade多肽、I-D型Cascade多肽、I-E型Cascade多肽、I-F型Cascade多肽或I-U型Cascade多肽。
在一些实施方案中，I型Cascade复合物包含：(a)编码Cas7(Csa2)多肽的核苷酸序列、编码Cas8a1(Csx13)多肽或Cas8a2(Csx9)多肽的核苷酸序列、编码Cas5多肽的核苷酸序列、编码Csa5多肽的核苷酸序列、编码Cas6a多肽的核苷酸序列、编码Cas3’多肽的核苷酸序列和编码不具有核酸酶活性的Cas3”多肽的核苷酸序列(I-A型)；(b)编码Cas6b多肽的核苷酸序列、编码Cas8b(Csh1)多肽的核苷酸序列、编码Cas7(Csh2)多肽的核苷酸序列和编码Cas5多肽的核苷酸序列(I-B型)；(c)编码Cas5d多肽的核苷酸序列、编码Cas8c(Csd1)多肽的核苷酸序列和编码Cas7(Csd2)多肽的核苷酸序列(I-C型)；(d)编码Casl Od(Csc3)多肽的核苷酸序列、编码Csc2多肽的核苷酸序列、编码Csc1多肽的核苷酸序列和编码Cas6d多肽的核苷酸序列(I-D型)；(e)编码Cse1(CasA)多肽的核苷酸序列、编码Cse2(CasB)多肽的核苷酸序列、编码Cas7(CasC)多肽的核苷酸序列、编码Cas5(CasD)多肽的核苷酸序列和编码Cas6e(CasE)多肽的核苷酸序列(I-E型)；和/或(f)编码Cys1多肽的核苷酸序列、编码Cys2多肽的核苷酸序列、编码Cas7(Cys3)多肽的核苷酸序列和编码Cas6f多肽的核苷酸序列(I-F型)。
在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统对于埃希氏菌属物种来说是外源的。
V型CRISPR系统
在一些实施方案中，本文公开的方法中采用的CRISPR-Cas系统是V型CRISPR系统，其使用Cpf1核酸酶(例如，来自普雷沃氏菌(Prevotella)和弗朗西斯氏菌1(Francisella1)的CRISPR)。这种长度为1200-1500个氨基酸的单体蛋白属于V型CRISPR系统。Cpf1CRISPR阵列由九个间隔子序列组成，它们被36个核苷酸长的重复序列分开。Cpf1识别DNA靶标中的5’-TTTV-3’PAM，这导致crRNA的间隔子源性区段与互补的靶DNA碱基配对。由于Cpf1同时具有RNA酶和DNA酶活性，所以它不采用tracrRNA进行crRNA生物合成；相反，前crRNA形成假结，其被Cpf1自身识别和切割。Cpf1在切割位点处诱导交错末端(关于crRNA长度的5’突出的5或8个核苷酸)。AM识别是Cpf1介导的基因编辑的第一步。当PAM位于相关原型间隔子的周围时，它将引发crRNA与靶DNA链的后续杂交并形成R环结构。Cpf1家族蛋白的PAM序列主要富含T，并仅在胸苷数量上有所不同。另外，还揭示了Cpf1的核酸酶组件识别靶链上的5’-TTN-3’PAM。PI、REC1和WED结构域一起参与PAM识别。
埃希氏菌属
在一些实施方案中，细菌包括一个或多个埃希氏菌物种。在一些实施方案中，细菌包括一个或多个埃希氏菌属菌株。在一些实施方案中，靶细菌是大肠埃希氏菌。
在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起感染或疾病。在一些实施方案中，感染或疾病是急性或慢性的。在一些实施方案中，感染或疾病是局部的或全身的。在一些实施方案中，感染或疾病是特发性的。在一些实施方案中，感染或疾病通过各种方式获得，所述方式包括但不限于呼吸吸入、摄入、皮肤和伤口感染、血流感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、尿路感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、腹内感染、表皮或粘膜吸收、眼感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化中的感染、留置医疗装置(如关节假体、牙植入物、导管和心脏植入物)的感染、性接触和/或医院获得性和呼吸机相关细菌性肺炎。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起尿路感染。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重炎性疾病。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重自身免疫性疾病。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重银屑病。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重银屑病性关节炎(PA)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重多发性硬化(MS)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重格雷夫斯病。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重桥本甲状腺炎。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重重症肌无力。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重血管炎。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重癌症。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重癌症进展。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重癌症转移。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重对癌症疗法的耐药性。在一些实施方案中，用于治疗癌症的疗法包括但不限于化学疗法、免疫疗法、激素疗法、靶向药物疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，癌症在器官中发展，所述器官包括但不限于肛门、膀胱、血液和血液组分、骨、骨髓、大脑、乳腺、子宫颈、结肠和直肠、食管、肾脏、喉、淋巴系统、肌肉(即软组织)、口腔和咽部、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、甲状腺、子宫和/或外阴。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重中枢神经系统(CNS)的病症。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重注意力缺陷/多动障碍(ADHD)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重自闭症。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重双相情感障碍。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重重度抑郁症。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重癫痫。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌引起和/或加重神经退行性病症，包括但不限于阿尔茨海默病、亨廷顿病和/或帕金森病。
在一些实施方案中，向患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者施用一种或多种细菌噬菌体。在一些实施方案中，向患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者施用两种或更多种细菌噬菌体的组合。在一些实施方案中，向患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者施用细菌噬菌体导致患者体内的细菌负荷的减少。在一些实施方案中，细菌负荷的减少导致患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者的临床改善。
在一些实施方案中，向患有非囊性纤维化支气管扩张的患者施用一种或多种细菌噬菌体。在一些实施方案中，向患有非囊性纤维化支气管扩张的患者施用两种或更多种细菌噬菌体的组合。在一些实施方案中，向患有非囊性纤维化支气管扩张的患者施用细菌噬菌体导致患者体内的细菌负荷的减少。在一些实施方案中，细菌负荷的减少导致患有非囊性纤维化支气管扩张的患者的临床改善。
细菌噬菌体
在一些实施方案中，细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体是保留溶原基因的温和细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体是温和细菌噬菌体，其中一些溶原基因被去除、替换或灭活。在一些实施方案中，细菌噬菌体是温和细菌噬菌体，其溶原基因被去除、替换或灭活，从而使细菌噬菌体具有裂解性。
在一些实施方案中，细菌噬菌体靶向埃希氏菌属某些种。在一些实施方案中，细菌噬菌体靶向大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体相较于其它细菌物种特异性靶向埃希氏菌属某些种。在一些实施方案中，细菌噬菌体在不存在CRISPR-Cas系统的情况下靶向埃希氏菌属某些种。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。在一些实施方案中，细菌噬菌体是T4样病毒属。在一些实施方案中，细菌噬菌体是Rb69病毒属。在一些实施方案中，细菌噬菌体是PhAPEC8病毒属。在一些实施方案中，细菌噬菌体是独特肌病毒科。在一些实施方案中，细菌噬菌体是威克瑞病毒属。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含CRISPR-Cas3系统。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是靶向埃希氏菌属某些种的p004Ke009、p00c0e030、p00exe014、p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含但不限于p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516。在一些实施方案中，“细菌噬菌体”包括一种或多种细菌噬菌体，其中第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体不同或相同。例如，细菌噬菌体包含p004Ke009、p00c0e030和p00exe014。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p004K，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p004K细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p004ke005包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p004ke007包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p004ke009包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00c0，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00c0包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p00c0细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00c0e030包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00ex，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00ex包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p00ex细菌噬菌体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00exe014包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00jc，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00jc包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p00jc细菌噬菌体。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p00ke，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p00ke包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p00ke细菌噬菌体。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是p5516，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。在一些实施方案中，细菌噬菌体与p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，细菌噬菌体是包含CRISPR系统的p5516细菌噬菌体。
在一些实施方案中，细菌噬菌体包含表1中列出的噬菌体，或保留靶向埃希氏菌属某些种的能力的其突变体。
本文还公开了包含两种或更多种细菌噬菌体的混合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种细菌噬菌体选自以下谱系：T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。在一些实施方案中，混合物包含至少六种细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科和威克瑞病毒属。在一些实施方案中，混合物的至少一种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物的至少两种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物的至少三种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物的至少四种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物的至少一种细菌噬菌体不包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物的至少两种细菌噬菌体不包含CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，混合物包含至少两种细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516。在一些实施方案中，混合物包含第一细菌噬菌体，所述第一细菌噬菌体与p004ke009包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，所述第二细菌噬菌体与p00c0e030包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，所述第三细菌噬菌体与p00exe014包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，所述第四细菌噬菌体与p00exe014包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，所述第五细菌噬菌体与p00jc包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，所述第五细菌噬菌体与p00jc包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性，其中所述细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，所述第五细菌噬菌体与p00ke包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，所述第五细菌噬菌体与p00ke包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性，其中所述细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，所述第六细菌噬菌体与p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p00c0包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p004K、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p004K、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p004K、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p004K、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p004K、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p00ex包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0、p004K、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p00c0、p004K、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p00c0、p004K、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p00c0、p004K、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p00c0、p004K、p00jc、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p00jc包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p004K、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p004K、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p004K、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p004K、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p004K、p00ke或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p00ke包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p004K或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p004K或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p004K或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p004K或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p004K或p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，第一细菌噬菌体与p5516包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，混合物包含第二细菌噬菌体，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第三细菌噬菌体，其中所述第三细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第四细菌噬菌体，其中所述第四细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第五细菌噬菌体，其中所述第五细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，混合物包含第六细菌噬菌体，其中所述第六细菌噬菌体与p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p004K包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或五种细菌噬菌体包含CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，至少一种、两种或三种细菌噬菌体不包含CRISPR Cas系统。
在一些实施方案中，感兴趣的细菌噬菌体获自环境来源或商业研究供应商。在一些实施方案中，对于细菌及其相关菌株的文库，针对裂解活性对所获得的细菌噬菌体进行筛选。在一些实施方案中，对于细菌及其相关菌株的文库，针对其在所筛选的细菌中生成原发耐药性的能力对细菌噬菌体进行筛选。
插入位点
在一些实施方案中，将核酸序列插入到细菌噬菌体中保留了细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，核酸序列被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸序列在感兴趣的操纵子的末端处的转录终止子位点处被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸序列作为一个或多个被去除的非必需基因的替换被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸序列作为一个或多个被去除的溶原基因的替换被插入到细菌噬菌体基因组中。在一些实施方案中，用核酸序列替换非必需和/或溶原基因不影响细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替换非必需和/或溶原基因保留细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替换非必需和/或溶原基因增强了细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替换非必需和/或溶原基因使溶原性细菌噬菌体具有裂解性。
在一些实施方案中，核酸序列在第一位置处被引入到细菌噬菌体基因组中，而一个或多个非必需和/或溶原基因在不同的位置处从细菌噬菌体基因组中被分别去除和/或灭活。在一些实施方案中，核酸序列在第一位置处被引入到细菌噬菌体基因组中，而一个或多个非必需和/或溶原基因在多个不同的位置处从细菌噬菌体基因组中被分别去除和/或灭活。在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的去除和/或灭活不影响细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的去除和/或灭活保留细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的去除使溶原性细菌噬菌体成为裂解性细菌噬菌体。
在一些实施方案中，细菌噬菌体是温和细菌噬菌体，其已经通过前述方式中的任一种而被赋予裂解性。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活一个或多个溶原基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，细菌噬菌体的裂解活性归因于至少一个溶原基因的去除、替换或灭活。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在维持溶原周期方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在建立溶原周期方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因在细菌噬菌体中在建立溶原周期和维持溶原周期两方面起作用。在一些实施方案中，溶原基因是阻遏子基因。在一些实施方案中，溶原基因是cI阻遏子基因。在一些实施方案中，溶原基因是激活因子基因。在一些实施方案中，溶原基因是cII基因。在一些实施方案中，溶原基因是lexA基因。在一些实施方案中，溶原基因是int(整合酶)基因。在一些实施方案中，两个或更多个溶原基因被去除、替换或灭活，以引起细菌噬菌体溶原周期的停滞和/或裂解周期的诱导。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体通过插入一个或多个裂解基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体通过插入有助于诱导裂解周期的一个或多个基因而被赋予裂解性。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体通过改变有助于诱导裂解周期的一个或多个基因的表达而被赋予裂解性。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体在表型上从溶原性细菌噬菌体变为裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，温和细菌噬菌体通过环境改变而被赋予裂解性。在一些实施方案中，环境改变包括但不限于温度、pH或营养物的改变；暴露于抗生素、过氧化氢、外来DNA或DNA破坏剂；有机碳的存在；以及重金属(例如，呈铬(VI)的形式)的存在。在一些实施方案中，防止被赋予裂解性的温和细菌噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，通过首先引入的CRISPR阵列的自靶向活性来防止被赋予裂解性的温和细菌噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，通过引入另外的CRISPR阵列来防止被赋予裂解性的温和细菌噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，除了由细菌噬菌体的裂解活性和/或第一或第二CRISPR阵列的活性引起的细胞死亡之外，细菌噬菌体不赋予靶细菌任何新的性质。
在一些实施方案中，一个或多个非必需和/或溶原基因的替换、去除、灭活或其任何组合通过化学、生物化学和/或任何合适的方法实现。在一些实施方案中，一个或多个裂解基因的插入通过任何合适的化学、生物化学和/或物理方法通过同源重组来实现。
非必需基因
在一些实施方案中，待从细菌噬菌体中去除和/或替换的非必需基因是对细菌噬菌体的存活非必需的基因。在一些实施方案中，待从细菌噬菌体中去除和/或替换的非必需基因是对裂解周期的诱导和/或维持非必需的基因。
转录激活因子
在一些实施方案中，核酸序列进一步包含转录激活因子。在一些实施方案中，所编码的转录激活因子调节埃希氏菌属物种内的感兴趣的基因的表达。在一些实施方案中，转录激活因子激活埃希氏菌属物种内的感兴趣的基因的表达，无论是外源的还是内源的。在一些实施方案中，转录激活因子通过破坏埃希氏菌属物种内的一个或多个抑制元件的活性来激活埃希氏菌属物种内的感兴趣的表达基因。在一些实施方案中，抑制元件包含转录阻遏子。在一些实施方案中，抑制元件包含全局转录阻遏子。在一些实施方案中，抑制元件是组蛋白样类核结构(H-NS)蛋白或其同源物或功能片段。在一些实施方案中，抑制元件是亮氨酸反应性调节蛋白(LRP)。在一些实施方案中，抑制元件是CodY蛋白。
在一些细菌中，CRISPR-Cas系统表达很差，并且在大多数环境条件下被认为是沉默的。在这些细菌中，CRISPR-Cas系统的调节是转录调节因子，例如广泛参与宿主基因组的转录调节的组蛋白样类核结构(H-NS)蛋白的活性的结果。H-NS通过沿富含AT位点的多聚化从而导致DNA弯曲来控制宿主转录调节。在如大肠埃希氏菌等一些细菌中，CRISPR-Cas3操纵子的调节由H-NS调节。
类似地，在一些细菌中，CRISPR-Cas系统的阻遏由抑制元件，例如亮氨酸反应性调节蛋白(LRP)控制。LRP与转录起始位点的上游和下游区域的结合有关。值得注意的是，LRP调节CRISPR-Cas系统的表达的活性因细菌而异。与具有广泛的物种间阻遏活性的H-NS不同，LRP已被证明以不同方式调节宿主CRISPR-Cas系统的表达。因此，在一些情况下，LRP反映了在不同细菌中调节CRISPR-Cas系统表达的宿主特异性方式。
在一些情况下，CRISPR-Cas系统的阻遏也受抑制元件CodY控制。CodY是一种GTP感应转录阻遏子，其通过DNA结合发挥作用。GTP的细胞内浓度作为环境营养状况的指标。在正常培养条件下，GTP是丰富的，并与CodY结合以阻遏转录活性。然而，随着GTP浓度的降低，CodY在结合DNA方面变得不那么活跃，从而允许先前被阻遏的基因发生转录。因此，CodY可作为严格的全局转录阻遏子。
在一些实施方案中，转录激活因子是LeuO多肽、其同源物或功能片段、leuO编码序列或上调LeuO的试剂。在一些实施方案中，转录激活因子包含LeuO的任何直向同源物或功能等同物。在一些细菌中，LeuO通过充当对细菌的环境营养状态做出反应的全局转录调节因子而与H-NS起相反作用。在正常条件下，LeuO的表达很差。然而，在氨基酸饥饿和/或达到细菌生命周期的稳定期时，LeuO被上调。LeuO表达的增加导致它在重叠的启动子区域处拮抗H-NS，从而影响基因表达。LeuO的过表达上调CRISPR-Cas系统的表达。
在一些实施方案中，LeuO的表达导致抑制元件的破坏。在一些实施方案中，由于LeuO的表达而引起的抑制元件的破坏解除了CRISPR-Cas系统的转录阻遏。在一些实施方案中，由于H-NS的活性，LeuO的表达解除了CRISPR-Cas系统的转录阻遏。在一些实施方案中，由于LeuO的表达而引起的抑制元件的破坏导致CRISPR-Cas系统的表达的增加。在一些实施方案中，由于LeuO的表达导致的抑制元件的破坏而引起的CRISPR-Cas系统的表达的增加导致包含CRISPR阵列的核酸序列的CRISPR-Cas加工的增加。在一些实施方案中，由于LeuO的表达对抑制元件的破坏而引起的CRISPR-Cas系统的表达的增加导致包含CRISPR阵列的核酸序列的CRISPR-Cas加工的增加，从而增加CRISPR阵列对细菌的致死水平。在一些实施方案中，转录激活因子引起细菌噬菌体和/或CRISPR-Cas系统的活性增加。
调节元件
在一些实施方案中，核酸序列与多个启动子、终止子和用于多种生物体或细胞中的表达的其它调节元件可操作地相关联。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含前导序列。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，至少一个启动子和/或终止子可操作地连接CRISPR阵列。使用了对本公开有用的任何启动子，并且所述启动子包括例如对感兴趣的生物体起作用的启动子以及组成型、诱导型、发育调节型、组织特异性/优选启动子等，如本文所公开。本文所使用的调节元件是内源的或异源的。在一些实施方案中，源自生物体对象的内源调节元件被插入到其并非天然存在的遗传背景中(例如，基因组中与天然存在所不同的位置)，从而产生重组或非天然核酸。
在一些实施方案中，核酸序列的表达是组成型的、诱导型的、时间调节型的、发育调节型的或化学调节型的。在一些实施方案中，通过将核酸序列可操作地连接到在感兴趣的生物体中起作用的启动子，使核酸序列的表达变为组成型的、诱导型的、时间调节型的、发育调节型的或化学调节型的。在一些实施方案中，通过将核酸序列可操作地连接到在感兴趣的生物体中起作用的诱导型启动子上，使得阻遏变为可逆的。本文公开的启动子的选择会有所不同，这取决于表达的定量、时间和空间要求，还取决于待转化的宿主细胞。
用于本文公开的方法、细菌噬菌体和组合物的示例性启动子包括在细菌中起作用的启动子。例如，L-阿拉伯糖诱导型(araBAD，PBAD)启动子、任何lac启动子、L-鼠李糖诱导型(rhaPBAD)启动子、T7RNA聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(pLpL-9G-50)、脱水四环素诱导型(tetA)启动子、trp、Ipp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、Ipp-lac、cspA、11-lac操纵子、T3-lac操纵子、T4基因32、T5-lac操纵子、nprM-lac操纵子、Vhb、蛋白A、棒状杆菌-大肠埃希氏菌样启动子、thr、horn、白喉毒素启动子、sig A、sig B、nusG、SoxS、katb、α-淀粉酶(Pamy)、Ptms、P43(包含两个重叠的RNA聚合酶σ因子识别位点，σΑ、σΒ)、Ptms、P43、rplK-rplA、铁氧还蛋白启动子和/或木糖启动子。在一些实施方案中，启动子是BBa_J23102启动子。在一些实施方案中，启动子在大范围细菌中起作用，例如BBa_J23104、BBa_J23109等。在一些实施方案中，启动子源自靶细菌，例如内源CRISPR启动子、内源Cas操纵子启动子、p16、plpp或ptat。在一些实施方案中，启动子是噬菌体启动子，例如gp105或gp245的启动子。
在一些实施方案中，启动子与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，启动子与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少或约95％同源性。在一些情况下，启动子与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少或约97％同源性。在一些情况下，启动子与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少或约99％同源性。在一些情况下，启动子与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含100％同源性。在一些情况下，启动子包含具有SEQ ID NO:1-11或19中的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或超过50个核苷酸的至少一部分。在一些情况下，启动子包含具有SEQ IDNO:1-11或19中的至少或约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或超过215个核苷酸的至少一部分。
在一些实施方案中，使用诱导型启动子。在一些实施方案中，通过应用外源化学调节子，使用化学调节型启动子来调节生物体中的基因的表达。化学调节型启动子的使用使得RNA和/或由核酸序列编码的多肽仅在例如用诱导化学物质处理生物体时才能合成。在使用化学诱导型启动子的一些实施方案中，化学物质的应用诱导基因表达。在使用化学阻遏型启动子的一些实施方案中，化学物质的应用阻遏基因表达。在一些实施方案中，启动子是光诱导型启动子，其中特定波长的光的应用诱导基因表达。在一些实施方案中，启动子是光阻遏型启动子，其中特定波长的光的应用阻遏基因表达。
表达盒
在一些实施方案中，核酸序列是表达盒或存在于表达盒中。在一些实施方案中，表达盒被设计成表达本文公开的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列是编码CRISPR-Cas系统的组件的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码I型CRISPR-Cas系统的组件的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码可操作的CRISPR-Cas系统的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码I型CRISPR-Cas系统的可操作组件(包括Cascade和Cas3)的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码I型CRISPR-Cas系统的可操作组件(包括crRNA、Cascade和Cas3)的表达盒。
在一些实施方案中，包含感兴趣的核酸序列的表达盒是嵌合的，意味着其组件中的至少一个相对于其其它组件中的至少一个是异源的。在一些实施方案中，表达盒是天然存在的，但已经以可用于异源表达的重组形式获得。
在一些实施方案中，表达盒包含在所选宿主细胞中起作用的转录和/或翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，终止区负责终止超出感兴趣的异源核酸序列的转录，并负责正确的mRNA聚腺苷酸化。在一些实施方案中，终止区对于转录起始区来说是天然的，对于可操作地连接的感兴趣的核酸序列来说是天然的，对于宿主细胞来说是天然的，或源自另一来源(即对于启动子、感兴趣的核酸序列、宿主或其任何组合来说是外源的或异源的)。在一些实施方案中，终止子与本文公开的核酸序列可操作地连接。
在一些实施方案中，表达盒包含可选择标志物的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码可选择或可筛选标志物，这取决于所述标志物是否赋予通过化学方式，例如通过使用选择剂(例如，抗生素)选择的性状，或者取决于所述标志物是否仅仅是通过观察或测试，如通过筛选(例如，荧光)鉴定的性状。
载体
除了表达盒，本文公开的核酸序列(例如，包含CRISPR阵列的核酸序列)与载体结合使用。载体包含核酸分子，所述核酸分子包含待转移、递送或引入的核苷酸序列。一般类别的载体的非限制性实例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、福斯质粒载体、细菌噬菌体、人工染色体，或土壤杆菌二元载体，其呈双链或单链线性或环状形式，可以是或不是自转移或移动的。载体通过整合到细胞基因组或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。此外，还包括穿梭载体，所述穿梭载体是指能够天然地或通过设计在两种不同的宿主生物体中进行复制的DNA载具。在一些实施方案中，穿梭载体在放线菌和细菌和/或真核生物中复制。在一些实施方案中，载体中的核酸受合适的启动子或用于在宿主细胞中转录的其它调节元件的控制，并与其可操作地连接。在一些实施方案中，载体是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。
密码子优化
在一些实施方案中，核酸序列被密码子优化以在任何感兴趣的物种中表达。密码子优化涉及使用物种特异性密码子使用表针对密码子使用偏好对核苷酸序列进行修饰。密码子使用表是基于对感兴趣物种的最高度表达基因的序列分析而生成的。当核苷酸序列将在核中表达时，密码子使用表是基于对感兴趣物种的高度表达核基因的序列分析而生成的。核苷酸序列的修饰通过将物种特异性密码子使用表与天然多核苷酸序列中存在的密码子进行比较来确定。核苷酸序列的密码子优化导致与天然核苷酸序列具有小于100％同一性(例如，50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)的核苷酸序列，但其仍可编码与原始核苷酸序列所编码的多肽具有相同功能的多肽。在一些实施方案中，本公开的核酸序列被密码子优化以在感兴趣的生物体/物种中表达。
转化
在一些实施方案中，本文公开的核酸序列和/或表达盒被瞬时表达和/或稳定并入到宿主生物体的基因组中。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法将本文公开的核酸序列和/或表达盒引入到细胞中。示例性转化方法包括通过感受态细胞的电穿孔的转化、感受态细胞的被动摄取、感受态细胞的化学转化以及导致核酸引入到细胞中的任何其它电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。在一些实施方案中，细胞的转化包括核转化。在一些实施方案中，细胞的转化包括质粒转化和缀合。
在一些实施方案中，当引入超过一个的核酸序列时，核苷酸序列被组装为单个核酸构建体的一部分，或为独立的核酸构建体，并位于相同或不同的核酸构建体上。在一些实施方案中，核苷酸序列在单个转化事件中或在多个独立转化事件中被引入到感兴趣的细胞中。
抗微生物剂和肽
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体被进一步遗传修饰以表达抗细菌肽、抗细菌肽的功能片段或裂解基因。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体表达至少一种本文公开的抗微生物剂或肽。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体包含编码抗生酶(enzybiotic)的核酸序列，其中所述核酸序列的蛋白质产物靶向噬菌体抗性细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体包含编码有助于分解或降解生物膜基质的酶的核酸。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体包含编码分散蛋白D(Dispersin D)氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或裂解酶的核酸。在一些实施方案中，所述酶选自纤维素酶，如纤维素酶的糖基羟化酶家族，如酶的糖基羟化酶5家族，也被称为纤维素酶A；聚葡糖胺(PGA)解聚酶；和结肠酸解聚酶，如1,4-L-岩藻二糖水解酶、可拉酸、解聚藻酸酶、DNA酶I或其组合。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体分泌本文公开的酶。
在一些实施方案中，抗微生物剂或肽由本文公开的细菌噬菌体表达和/或分泌。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体分泌和表达抗生素，如氨苄青霉素、青霉素、青霉素衍生物、头孢菌素、单环β-内酰胺(monobactam)、碳青霉烯、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、诺氟沙星、洛美沙星、曲伐沙星、莫西沙星、司帕沙星、吉米沙星、帕珠沙星或本文公开的任何抗生素。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体包含编码抗细菌肽的核酸序列，表达抗细菌肽，或分泌辅助或增强大肠埃希氏菌杀灭的肽。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体包含编码肽的核酸序列、编码抗细菌肽的核酸序列，表达抗细菌肽或分泌辅助或增强第一和/或第二I型CRISPR-Cas系统的活性的肽。
使用方法
在某些实施方案中，本文公开了杀灭大肠埃希氏菌的方法，其包括将本文公开的细菌噬菌体中的任一种引入到大肠埃希氏菌中。
在某些实施方案中，本文进一步公开了修饰细菌细胞的混合群体的方法，所述混合群体具有包含必需基因中的靶核苷酸序列的第一细菌物种和不包含必需基因中的靶核苷酸序列的第二细菌物种，所述方法包括将本文公开的细菌噬菌体中的任一种引入细菌细胞的混合群体。
在某些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用本文公开的细菌噬菌体中的任一种。
在一些实施方案中，大肠埃希氏菌仅通过细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌仅通过CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌通过以下方式杀灭：CRISPR-Cas系统对CRISPR阵列加工以产生经加工的crRNA，所述经加工的crRNA能够引导基于CRISPR-Cas的核酸内切酶活性和/或细菌的靶基因中的靶核苷酸序列处的切割。
在一些实施方案中，大肠埃希氏菌通过细菌噬菌体的裂解活性与I型CRISPR-Cas系统的活性的组合杀灭。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌通过I型CRISPR-Cas系统的活性杀灭，不依赖于细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统的活性补充或增强了细菌噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统的活性和细菌噬菌体的裂解活性是相加的。
在一些实施方案中，细菌噬菌体的裂解活性和I型CRISPR-Cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，协同活性被定义为导致比细菌噬菌体的裂解活性和I型CRISPR-Cas系统的相加组合更高噬菌体杀灭水平的活性。在一些实施方案中，细菌噬菌体的裂解活性由细菌噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统的活性由细菌噬菌体的浓度调节。
在一些实施方案中，通过增加施用于细菌的细菌噬菌体的浓度，将细菌的协同杀灭调节为相较于第一CRISPR-Cas系统的活性，有利于通过细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，通过降低施用于细菌的细菌噬菌体的浓度，将细菌的协同杀灭调节为相较于CRISPR-Cas系统的活性，不利于通过细菌噬菌体的裂解活性杀灭。在一些实施方案中，在低浓度下，裂解性复制允许扩增和杀灭靶细菌。在一些实施方案中，在高浓度下，不需要扩增噬菌体。在一些实施方案中，通过改变间隔子的数量、长度、组成、同一性或其任何组合从而增加CRISPR阵列的致死性，将细菌的协同杀灭调节为相较于细菌噬菌体的裂解活性，有利于通过CRISPR-Cas系统的活性杀灭。在一些实施方案中，通过改变间隔子的数量、长度、组成、同一性或其任何组合从而降低CRISPR阵列的致死性，将细菌的协同杀灭调节为相较于细菌噬菌体的裂解活性，不利于通过CRISPR-Cas系统的活性杀灭。
施用途径和剂量
本文公开的组合物的施用剂量和持续时间将取决于多种因素，包括对象的年龄、对象的体重和噬菌体的耐受性。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮下、通过吸入或以其任何组合施用于患者。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体通过口服施用而施用于患者。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体通过局部、皮肤、透皮、经粘膜、植入、舌下、颊、直肠、阴道、眼、耳或鼻施用而施用于患者。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体通过前述施用途径的任何组合施用于患者。
在一些实施方案中，给予介于103和1020PFU之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予介于103和1010PFU之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予介于106和1020PFU之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予介于106和1010PFU之间的噬菌体剂量。例如，在一些实施方案中，细菌噬菌体以介于103和1011PFU之间的量存在于组合物中。在一些实施方案中，细菌噬菌体以约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024PFU或更多的量存在于组合物中。在一些实施方案中，细菌噬菌体以小于101PFU的量存在于组合物中。在一些实施方案中，细菌噬菌体以介于101和108、104和109、105和1010或107和1011PFU之间的量存在于组合物中。在一些实施方案中，向对象施用包含两种或更多种细菌噬菌体的组合物，其中每种细菌噬菌体以约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024PFU或更多的量施用于对象。在一些实施方案中，向对象施用包含两种或更多种细菌噬菌体的组合物，其中每种细菌噬菌体以小于101PFU的量施用。在一些实施方案中，向对象施用包含两种或更多种细菌噬菌体的组合物，其中每种细菌噬菌体以介于101和108、104和109、105和1010或107和1011PFU之间的量施用。
在一些实施方案中，将细菌噬菌体或混合物每天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次施用于有需要的对象。在一些实施方案中，将细菌噬菌体或混合物每周至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次施用于有需要的对象。在一些实施方案中，将细菌噬菌体或混合物每月至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次施用于有需要的对象。在一些实施方案中，将细菌噬菌体或混合物每隔2、4、6、8、10、12、14、18、20、22或24小时施用于有需要的对象。
在一些实施方案中，本文公开的组合物(细菌噬菌体)在疾病或病状发生之前、期间或之后施用。在一些实施方案中，施用含有细菌噬菌体的组合物的时间有所不同。在一些实施方案中，药物组合物用作预防剂并连续施用于具有病状或疾病倾向的对象，以便预防疾病或病状的发生。在一些实施方案中，在症状发作期间或发作后尽快向对象施用药物组合物。在一些实施方案中，在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内或在症状发作的3小时内开始组合物的施用。在一些实施方案中，组合物的初始施用通过任何可行的途径，例如使用本文所述的任何制剂通过本文所述的任何途径。在一些实施方案中，在检测到或怀疑疾病或病状发作后，在可行范围内尽可能快地施用组合物，施用时间为治疗所述疾病所必需的时间长度，如例如约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗的长度将因每个对象而有所不同。
细菌感染
在某些实施方案中，本文公开了治疗细菌感染的方法。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体治疗或预防人类或动物对象中的由如本文公开的细菌介导或引起的疾病或病状。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体治疗或预防人类或动物对象中的由如本文公开的细菌引起或加重的疾病或病状。这样的细菌通常与对象的组织接触，所述组织包括：肠、口腔、肺、腋窝、眼、阴道、肛门、耳、鼻或喉组织。在一些实施方案中，通过调节细菌的活性和/或通过直接杀灭细菌来治疗细菌感染。
在一些实施方案中，细菌是埃希氏菌属某些种。在一些实施方案中，细菌是大肠埃希氏菌
在一些实施方案中，细菌群体中存在的一种或多种埃希氏菌属物种是致病性的。在一些实施方案中，致病菌是尿道致病性的。在一些实施方案中，致病菌是尿道致病性大肠埃希氏菌(UPEC)。在一些实施方案中，致病菌是致泻性的。在一些实施方案中，致病菌是致泻性大肠埃希氏菌(DEC)。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性的。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性大肠埃希氏菌(STEC)。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性的。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性大肠埃希氏菌(STEC)。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性大肠埃希氏菌(STEC)。在一些实施方案中，致病菌是各种O-抗原:H-抗原血清型大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，致病菌是肠致病性的。在一些实施方案中，致病菌是肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于治疗对象的胃肠道中的感染、疾病或病状。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节和/或杀灭对象的微生物组或肠道菌群内的靶细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌的一种或多种靶细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌的一种或多种靶肠致病性细菌。在一些实施方案中，靶肠致病性细菌是肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌的一种或多种靶致泻性细菌。在一些实施方案中，靶致泻性细菌是致泻性大肠埃希氏菌(DEC)。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌的一种或多种靶志贺毒素产生性细菌。在一些实施方案中，靶志贺毒素产生性细菌是志贺毒素产生性大肠埃希氏菌(STEC)。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于治疗对象的尿路中的感染、疾病或病状。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节和/或杀灭对象的尿路菌群内的靶细菌。尿路菌群包括但不限于表皮葡萄球菌、粪肠球菌和一些α-溶血性链球菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的尿路菌群内的多种细菌的一种或多种靶尿道致病性细菌。在一些实施方案中，靶细菌是尿路致病性大肠埃希氏菌(UPEC)。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于治疗对象的皮肤上的感染、疾病或病状。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节和/或杀灭对象的皮肤上的靶细菌。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于治疗对象的粘膜上的感染、疾病或病状。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节和/或杀灭对象的粘膜上的靶细菌。
在一些实施方案中，致病菌是抗生素耐药性的。在一些实施方案中，致病菌是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)产生性的。在一个实施方案中，致病菌是碳青霉烯耐药性大肠埃希氏菌。
在一些实施方案中，细菌群体中存在的所述一种或多种靶细菌形成生物膜。在一些实施方案中，生物膜包含致病菌。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于治疗生物膜。
在一些实施方案中，细菌包括埃希氏菌属某些种。在一些实施方案中，细菌是大肠埃希氏菌。
在一些实施方案中，细菌噬菌体治疗痤疮和其它相关的皮肤感染。
在一些实施方案中，埃希氏菌属物种是多药耐药性(MDR)细菌菌株。MDR菌株是对至少一种抗生素具有耐药性的细菌菌株。在一些实施方案中，细菌菌株对如头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素和甲氧西林等抗生素具有耐药性。在一些实施方案中，细菌菌株是大肠埃希氏菌。
在一些实施方案中，细菌是大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物用于兽医和医学应用以及研究应用。
微生物组
“微生物组”、“微生物群”和“微生物栖息地”在下文中可互换使用，并且是指生活在对象的体表、体腔和体液之上或之中的微生物生态群落。微生物组栖息地的非限制性实例包括：肠道、结肠、皮肤、皮肤表面、皮肤毛孔、阴道腔、脐区、结膜区、肠区、胃、鼻腔及通道、胃肠道、泌尿生殖道、唾液、粘液和粪便。在一些实施方案中，微生物组包括微生物材料，包括但不限于细菌、古菌、原生生物、真菌和病毒。在一些实施方案中，微生物材料包括革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，微生物材料包括革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，微生物材料包括变形菌、放线菌、拟杆菌或厚壁菌。
在一些实施方案中，如本文公开的细菌噬菌体用于调节或杀灭对象的微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于通过CRISPR-Cas系统、裂解活性或其组合来调节和/或杀灭微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节和/或杀灭对象的微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于选择性地调节和/或杀灭来自对象的微生物组内的多种细菌的一种或多种靶细菌。在一些实施方案中，靶细菌是大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌是多药耐药性(MDR)菌株。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)菌株。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌是碳青霉烯耐药性菌株。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌是非多药耐药性(非MDR)菌株。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌是非碳青霉烯耐药性菌株。在一些实施方案中，致病菌是尿道致病性的。在一些实施方案中，致病菌是尿道致病性大肠埃希氏菌(UPEC)。在一些实施方案中，致病菌是致泻性的。在一些实施方案中，致病菌是致泻性大肠埃希氏菌(DEC)。在一些实施方案中，致病菌志贺毒素产生性的。在一些实施方案中，致病菌是志贺毒素产生性大肠埃希氏菌(STEC)。在一些实施方案中，致病菌是各种O-抗原:H-抗原血清型大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，致病菌是肠致病性的。在一些实施方案中，致病菌是肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)。
在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节或杀灭对象的胃肠道的微生物组或肠道菌群内的单种或多种靶细菌。微生物组或肠道菌群的改变(例如，生态失调)增加了健康状况的风险，如糖尿病、精神病症、溃疡性结肠炎、结肠直肠癌、自身免疫性病症、肥胖症、糖尿病、中枢神经系统疾病和炎性肠病。与胃肠道疾病和病状相关并被细菌噬菌体调节或杀灭的示例性细菌包括大肠埃希氏菌的菌株、亚菌株和肠型。
在一些实施方案中，细菌噬菌体用于调节或杀灭对象的胃肠道的微生物组或肠道菌群内的单种或多种靶细菌。微生物组或肠道菌群的改变(例如，生态失调)增加了健康状况的风险，如糖尿病、精神病症、溃疡性结肠炎、结肠直肠癌、自身免疫性病症、肥胖症、糖尿病、中枢神经系统疾病和炎性肠病。与胃肠道疾病和病状相关并被细菌噬菌体调节或杀灭的细菌的示例性列表包括肠杆菌科、巴斯德氏菌科、梭杆菌科、奈瑟氏球菌科、韦荣氏球菌科、孪生球菌科(gemellaceae)、拟杆菌目、梭菌目、丹毒丝菌科(erysipelotrichaceae)、双歧杆菌科拟杆菌属、粪杆菌属、罗斯氏菌属、布劳特氏菌属、瘤胃球菌属、粪球菌属、链球菌属、多尔氏菌属、布劳特氏菌属、瘤胃球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、链球菌属、大肠埃希氏菌、具核梭杆菌、副流感嗜血杆菌(巴斯德氏菌科)、小韦荣氏球菌、啮蚀艾肯菌(奈瑟氏球菌科)、麻疹孪生球菌、普通拟杆菌、粪便拟杆菌、两岐双岐杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、齿双歧杆菌、汉逊布劳特氏菌、活泼瘤胃球菌、系结梭菌、普氏粪杆菌、扭链瘤胃球菌、鲍氏梭菌(clostridium bolteae)、直肠真杆菌、肠罗氏菌、陪伴粪球菌、放线菌属、乳球菌属、罗斯氏菌属、链球菌属、布劳特氏菌属、小杆菌属、脱硫弧菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、粪球菌属、梭菌属、双歧杆菌属、克雷伯氏菌属、颗粒链菌属、真杆菌属、厌氧棒杆菌属(anaerostipes)、副拟杆菌属、粪芽孢菌属、戈登氏杆菌属、柯林斯氏菌属、拟杆菌属、粪杆菌属、厌氧棍状菌属(anaerotruncus)、另枝菌属、嗜血杆菌属、厌氧球菌属、韦永氏球菌属、阿雷沃氏菌属(arevotella)、阿克曼菌属、嗜胆菌属、萨特氏菌属、埃格特菌属、霍尔德曼氏菌属、孪生球菌属、嗜胨菌属、罗氏菌属、肠球菌属、片球菌属、柠檬酸杆菌属、臭气杆菌属、肠杆菌属、梭杆菌属和变形杆菌属。
在一些实施方案中，将本文公开的细菌噬菌体施用于对象以促进健康的微生物组。在一些实施方案中，将本文公开的细菌噬菌体施用于对象以将对象的微生物组恢复至促进健康的微生物组组成。在一些实施方案中，包含本文公开的细菌噬菌体的组合物包含益生元或第三试剂。在一些实施方案中，微生物组相关疾病或病症通过本文公开的细菌噬菌体治疗。
环境疗法
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体进一步用于食物和农业卫生(包括肉类、水果和蔬菜卫生)、医院卫生、家庭卫生、车辆及设备卫生、工业卫生等。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于从医学、兽医学、畜牧业或细菌传递给人类或动物的任何其它环境去除抗生素耐药性或其它不期望的病原体。
医疗保健机构中的噬菌体的环境应用用于如内窥镜等设备和如ICU等环境，由于难以或无法进行消毒的病原体，这些设备和环境是潜在的医院感染来源。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于处理对常用消毒剂具有耐药性的细菌属所栖息的设备或环境。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体组合物用于对无生命物体进行消毒。在一些实施方案中，用具有噬菌体滴度的水性溶液喷洒、涂抹或倾倒于本文公开的环境上。在一些实施方案中，本文所述的溶液包含101-1020噬斑形成单位(PFU)/ml。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体通过包含干燥分散剂的气雾化试剂来应用，以有助于将细菌噬菌体分布到环境中。在一些实施方案中，将物体浸入含有本文公开的细菌噬菌体的溶液中。
卫生
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体在各种领域中用作卫生剂。尽管可以使用术语“噬菌体”或“细菌噬菌体”，但是应注意，在适当的情况下，此术语应被广义地解释为包括单种细菌噬菌体、多种细菌噬菌体(如细菌噬菌体混合物)以及细菌噬菌体与如消毒剂、去污剂、表面活性剂、水等试剂的混合物。
在一些实施方案中，细菌噬菌体用于对医院设施，包括手术室、病房、候诊室、实验室或其它各种医院设备进行卫生处理。在一些实施方案中，此设备包括心电图仪、呼吸器、心血管辅助装置、主动脉内球囊泵、输注装置、其它患者护理装置、电视、监视器、遥控器、电话、床等。在一些情况下，通过气雾剂罐应用细菌噬菌体。在一些实施方案中，通过用转移载具将噬菌体擦在物体上应用细菌噬菌体。
在一些实施方案中，本文所述的细菌噬菌体与患者护理装置结合使用。在一些实施方案中，细菌噬菌体与常规呼吸机或呼吸治疗装置结合使用，以逐个患者清洁内表面和外表面。呼吸机的实例包括用以支持手术期间的换气的装置、用以支持失能患者的换气的装置以及类似的装备。在一些实施方案中，常规疗法包括自动或机动装置，或手动袋式装置，如急诊室和救护车中常见的装置。在一些实施方案中，呼吸疗法包括用以引入药物的吸入器，如通常用于慢性阻塞性肺病或哮喘的支气管扩张器；或用以维持气道通畅的装置，如持续气道正压通气装置。
在一些实施方案中，本文所述细菌噬菌体用于清理表面和治疗存在如脑膜炎或肠道感染等高传染性细菌性疾病的区域中的定居人群。
在一些实施方案中，用本文公开的组合物处理供水。在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于处理被污染的水、存在于水箱、井、储水器、储罐、导水管、导管和类似的水分配装置中的水。在一些实施方案中，将细菌噬菌体应用于工业储罐，其中水、油、冷却液和其它流体聚集在收集池中。在一些实施方案中，将本文公开的细菌噬菌体周期性地引入工业储罐中，以减少细菌生长。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于对生活区域，如房屋、独立公寓、私人公寓、宿舍或任何生活区域进行卫生处理。在一些实施方案中，细菌噬菌体用于对公共区域，如剧院、音乐厅、博物馆、火车站、机场、如宠物床或猫砂箱等宠物区进行卫生处理。在这种情况下，细菌噬菌体从常规装置中分配，所述常规装置包括泵式喷雾器、气雾剂容器、喷射瓶、预湿湿巾等，其直接应用于(例如，喷到)待进行卫生处理的区域，或通过如毛巾、海绵等转移载具转移到所述区域。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体应用于房屋的各个房间，包括厨房、卧室、浴室、车库、地下室等。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体与常规清洁剂的方式相同。在一些实施方案中，噬菌体与常规清洁剂结合(在其之前、在其之后或与其同时)应用，条件是常规清洁剂被配制成保持足够的细菌噬菌体生物活性。
在一些实施方案中，在纸制品的加工期间或在加工完成后，将本文公开的细菌噬菌体添加到纸制品的组分中。添加了本文公开的细菌噬菌体的纸制品包括但不限于纸巾、卫生纸、湿纸巾。
食物安全
在一些实施方案中，本文所述的细菌噬菌体用于任何食物产品或营养补充剂中，以防止污染。食物或药物产品的实例是乳、酸乳、凝乳、乳酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方或片剂、液体混悬液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管饲。
细菌噬菌体卫生的广义概念适用于其它农业应用和生物体。农产品，包括水果和蔬菜、乳制品和其它农业产品。例如，新切的农产品在到达加工厂时经常被致病菌污染。这导致了可追溯到农产品的食源性病疾的爆发。在一些实施方案中，通过应用对与食源性病疾相关的细菌物种具有特异性的单一噬菌体或噬菌体混合物，将细菌噬菌体制剂应用于农产品显著降低或消除了食源性病疾的可能性。在一些实施方案中，在生产和加工的不同阶段应用细菌噬菌体，以减少所述点的细菌污染或防止后续点的污染。
在一些实施方案中，将特异性细菌噬菌体应用于餐馆、杂货店、农产品配送中心的农产品。在一些实施方案中，将本文公开的细菌噬菌体周期性地或连续地应用于沙拉吧的水果和蔬菜内容物。在一些实施方案中，将细菌噬菌体应用于沙拉吧或对食物物品的外部进行卫生处理是喷雾或喷洒过程或清洗过程。
在一些实施方案中，本文所述的细菌噬菌体用于含有包装的基质或支持介质中，所述包装含有肉、农产品、切开的水果和蔬菜以及其它食品。在一些实施方案中，适合用于包装的聚合物用细菌噬菌体制剂浸渍。
在一些实施方案中，本文所述的细菌噬菌体用于农舍和家畜饲料中。在一些实施方案中，在饲养家畜的农场中，在其饮用水、食物或两者中向家畜提供细菌噬菌体。在一些实施方案中，将本文所述的细菌噬菌体喷洒到屠体上，并用于对屠宰区进行消毒。
特异性细菌噬菌体作为生物控制剂在农产品上的使用具有许多优点。例如，细菌噬菌体是天然的无毒产品，其不会像普通化学杀菌剂那样破坏天然微生物群落的生态平衡，但会特异性地溶解靶向的食源性病原体。因为细菌噬菌体与化学杀菌剂不同，其是与其宿主细菌一起进化的天然产物，所以在需要时可快速鉴定出对最近出现的耐药性细菌有活性的新噬菌体，而新的有效杀菌剂的鉴定则是一个漫长得多的过程，需要数年时间。
药物组合物
在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含(a)如本文公开的核酸序列；和(b)药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本文还公开了药物组合物，其包含(a)如本文公开的细菌噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本文进一步公开了药物组合物，其包含(a)如本文公开的组合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物和施用其以治疗细菌、古菌感染或对某一区域进行消毒的方法。在一些实施方案中，药物组合物在药学上可接受的载剂中包含以上讨论的试剂中的任一个。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗尿路感染(UTI)和/或炎性疾病(例如，炎性肠病(IBD))。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗克罗恩病。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包括药用剂、药物剂、载剂、佐剂、分散剂、稀释剂等。
在一些实施方案中，将本文公开的细菌噬菌体配制成用于根据合适的方法在药物载剂中施用。在一些实施方案中，根据本公开的药物组合物的制造，细菌噬菌体尤其与可接受的载剂混合。在一些实施方案中，载剂是固体(包括粉末)或液体，或两者兼而有之，并且优选地被配制成单位剂量组合物。在一些实施方案中，一种或多种细菌噬菌体被并入本文公开的组合物中，所述组合物通过任何合适的药学方法制备。
在一些实施方案中，一种治疗对象的体内疾病的方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物在药学上可接受的载剂中包含本文公开的细菌噬菌体，其中所述药物组合物以治疗有效量施用。在一些实施方案中，通过本领域已知的任何方式将细菌噬菌体施用于有需要的人类对象或动物。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体用于口服施用。在一些实施方案中，细菌噬菌体以如胶囊、片剂和粉末等固体剂型施用，或以如酏剂、糖浆和混悬液等液体剂型施用。在一些实施方案中，适合用于颊(舌下)施用的组合物和方法包括锭剂，其在调味基质中包含细菌噬菌体，所述基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；和糖锭，其在如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶等惰性基质中包含细菌噬菌体。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物适合用于肠胃外施用，包括细菌噬菌体的无菌水性和非水性注射溶液。在一些实施方案中，这些制剂与预期接受者的血液等渗。在一些实施方案中，这些制剂包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，它们使组合物与预期接受者的血液等渗。在一些实施方案中，水性和非水性无菌混悬液包含助悬剂和增稠剂。在一些实施方案中，本文公开的组合物存在于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿和小瓶)中，并且储存在冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需要在临使用前加入无菌液体载剂，例如注射用盐水或水。
在一些实施方案中，适合用于直肠施用的方法和组合物以单位剂量栓剂的形式存在。在一些实施方案中，通过将细菌噬菌体与一种或多种常规固体载剂(例如，可可脂)混合，然后将所得混合物成型来制备这些。在一些实施方案中，适合用于皮肤局部施用的方法和组合物为软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。在一些实施方案中，所使用的载剂包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及其中两种或更多种的组合。
在一些实施方案中，适合用于透皮施用的方法和组合物以分立的贴片形式存在，其适于与接受者的表皮保持长时间的紧密接触。
在一些实施方案中，适合用于鼻施用或以其它方式施用于对象的肺的方法和组合物包括任何合适的方式，例如通过对象吸入的包含细菌噬菌体组合物的可呼吸颗粒的气雾剂混悬液施用。在一些实施方案中，可呼吸颗粒是液体或固体。如本文所使用，“气雾剂”包括任何气载混悬相，其能够被吸入到细支气管或鼻道中。在一些实施方案中，液体颗粒气雾剂通过任何合适的方式产生，如用压力驱动的气雾剂雾化器或超声雾化器。在一些实施方案中，通过制药领域已知的技术，用任何固体颗粒药物气雾剂生成器生产包含组合物的固体颗粒气雾剂。
在一些实施方案中，适合用于将本文公开的细菌噬菌体施用于物体或对象的表面的方法和组合物包括水性溶液。在一些实施方案中，这种水性溶液被喷洒到物体或对象的表面上。在一些实施方案中，水性溶液用于冲洗和清洁对象的物理伤口，以使其免受包括细菌在内的外来碎屑的影响。
在一些实施方案中，本文公开的细菌噬菌体以治疗有效量施用于对象。在一些实施方案中，至少一种本文公开的细菌噬菌体组合物被配制成药物制剂。在一些实施方案中，药物制剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种本文公开的细菌噬菌体。在一些情况下，药物制剂包含本文所述的细菌噬菌体以及赋形剂、稀释剂或载剂中的至少一种。
在一些实施方案中，药物制剂包含赋形剂。赋形剂描述于Handbook ofPharmaceutical Excipients,美国药学协会(1986)中，并且包括但不限于溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂和润滑剂。
合适的赋形剂的非限制性实例包括但不限于缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括但不限于柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，药物制剂包含所列出的任何一种或多种缓冲剂：碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其它钙盐。
在一些实施方案中，赋形剂是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括但不限于抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐；和抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、蛋氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，防腐剂包括井冈霉素A、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸酯、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷基化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其它抑制剂。
在一些实施方案中，药物制剂包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。
在一些实施方案中，用于药物制剂的粘合剂选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然和合成胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，如山梨醇、木糖醇、甘露醇和水或其组合。
在一些实施方案中，药物制剂包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，药物制剂中的润滑剂选自金属硬脂酸盐(如，硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如，硬脂酰基富马酸钠)、脂肪酸(如，硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属月桂基硫酸盐(如，月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石或其组合。
在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。在一些实施方案中，调味剂包括天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。
在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载剂时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(甜菊糖甙)；蔗糖的氯代衍生物，如三氯蔗糖；和糖醇，如山梨醇、甘露醇、木糖醇(sylitol)等。
在一些情况下，药物制剂包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食物、药物和化妆品着色剂(FD&C)、药物和化妆品着色剂(D&C)以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D&C)。
在一些实施方案中，本文公开的药物制剂包含螯合剂。在一些实施方案中，螯合剂包括乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠盐、三钠盐、四钠盐、二钾盐、三钾盐、二锂盐和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物。
在一些情况下，药物制剂包含稀释剂。稀释剂的非限制性实例包括水、甘油、甲醇、乙醇和其它类似的生物相容性稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂是水性酸，如乙酸、柠檬酸、马来酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸或类似物。
在一些实施方案中，药物制剂包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂选自但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、月桂基硫酸钠、硬脂酰基富马酸钠、聚氧乙烯烷基醚、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、多库酯钠、季铵化合物、如L-亮氨酸等氨基酸、脂肪酸糖酯、脂肪酸甘油酯或其组合。
在一些情况下，药物制剂包含另外的药物剂。在一些实施方案中，另外的药物剂是抗生素剂。在一些实施方案中，抗生素剂是氨基糖苷、安沙霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌素(包括第一代、第二代、第三代、第四代和第五代头孢菌素)、林可胺、大环内酯、单环β-内酰胺、硝基呋喃、喹诺酮、青霉素、磺酰胺、多肽或四环素。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是氨基糖苷，如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素或巴龙霉素。在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是安沙霉素，如格尔德霉素或除莠霉素。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是碳头孢烯，如氯碳头孢。在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是碳青霉烯，如厄他培南、多立培南、亚胺培南/西司他丁或美罗培南。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是头孢菌素(第一代)，如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄或头孢噻吩(Cefalotin/Cefalothin)，或者可替代地是头孢菌素(第二代)，如头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯或头孢呋辛。在一些实施方案中，抗生素剂是头孢菌素(第三代)，如头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢布烯、头孢唑肟和头孢曲松；或者是头孢菌素(第四代)，如头孢吡肟或头孢吡普。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是林可胺，如克林霉素和阿奇霉素；或大环内酯，如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素和壮观霉素。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是单环β-内酰胺，如氨曲南；或硝基呋喃，如呋喃唑酮或呋喃妥因。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是青霉素，如阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G或V、哌拉西林、替莫西林和替卡西林。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是磺酰胺，如磺胺米隆、磺酰胺柯衣定(Sulfonamidochrysoidine)、磺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶或甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明)(TMP-SMX)。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是喹诺酮，如环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星和替马沙星。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是多肽，如杆菌肽、粘菌素或多粘菌素B。
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是四环素，如地美环素、多西环素、米诺环素或土霉素。
进一步的实施方案
1.一种包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
2.根据实施方案1所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列，其中任选地，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
5.根据实施方案4所述的细菌噬菌体，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
6.根据实施方案1-34中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ ID NO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
8.根据实施方案1-6中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
9.根据实施方案1-6中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含(例如，至少10个连续的核碱基)启动子序列的全部或部分。
10.根据实施方案9所述的细菌噬菌体，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因或非必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分。
12.根据实施方案11所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分，并且所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
14.根据实施方案1-12中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
15.根据实施方案14所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽和Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
16.根据实施方案14所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
17.根据实施方案14-16中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌I-C型Cascade复合物。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的细菌噬菌体，其进一步包含有包含启动子序列的核酸序列。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
22.根据实施方案21所述的细菌噬菌体，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。
24.根据实施方案20-22中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR系统的活性杀灭。
25.根据实施方案20-22中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR系统的活性的组合杀灭。
26.根据实施方案25所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。
27.根据实施方案25所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。
28.根据实施方案25所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR系统的活性是协同的。
29.根据实施方案20-26中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体包含至少80％序列同一性。
32.根据实施方案31所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是p004Ke007、p004Ke009、p00c0e030或p00exe014。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述核酸序列被插入到非必需细菌噬菌体基因中。
34.一种药物组合物，其包含：
(a)根据实施方案1-33中任一项所述的细菌噬菌体；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
35.根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少两种细菌噬菌体。
36.根据实施方案34或实施方案35所述的药物组合物，其中所述细菌噬菌体来自以下谱系：T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。
37.根据实施方案35或实施方案36所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少六种细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含p004k、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke和p5516；或p00exe014、p004Ke009、p00jc、p00ke、p00c0e030和p5516。
38.根据实施方案34-37中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
39.一种杀灭埃希氏菌属物种的方法，其包括将来自包含CRISPR系统的细菌噬菌体的遗传物质引入到所述埃希氏菌属物种中，所述CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与所述埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
41.根据实施方案39或实施方案40所述的方法，其中所述间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
42.根据实施方案39-41中任一项所述的方法，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列，其中任选地，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
44.根据实施方案39-43中任一项所述的方法，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ IDNO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
45.根据实施方案39-44中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
46.根据实施方案39-44中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
47.根据实施方案39-46中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含(例如，至少10个连续的核碱基)启动子序列的全部或部分。
48.根据实施方案47所述的方法，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
49.根据实施方案39-48中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因或非必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分。
50.根据实施方案49所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分，并且所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。
51.根据实施方案39-50中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
52.根据实施方案39-50中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
54.根据实施方案52所述的方法，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌I-C型Cascade复合物。
56.根据实施方案39-55中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统进一步包含有包含启动子序列的核酸序列。
57.根据实施方案39-56中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
58.根据实施方案39-57中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
60.根据实施方案39-59中任一项所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR系统的活性杀灭。
61.根据实施方案57-60中任一项所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR系统的活性的组合杀灭。
62.根据实施方案61所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。
63.根据实施方案61所述的方法，其中所述CRISPR系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。
64.根据实施方案61所述的方法，其中所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR系统的活性是协同的。
65.根据实施方案60-64中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
66.根据实施方案39-65中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
67.根据实施方案39-66中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体与p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke、p5516、p004Ke007、p004Ke009、p00c0e030或p00exe014包含至少80％同一性。
68.根据实施方案39-67中任一项所述的方法，其中所述核酸序列被插入非必需细菌噬菌体基因的位置或与其相邻。
69.根据实施方案39-68中任一项所述的方法，其中细菌细胞的混合群体包含所述埃希氏菌属物种。
70.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
72.根据实施方案70或实施方案71所述的方法，其中所述间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
73.根据实施方案70或实施方案71所述的方法，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列，其中任选地，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
74.根据实施方案73所述的方法，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
75.根据实施方案70-74中任一项所述的方法，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ IDNO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
76.根据实施方案70-75中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
77.根据实施方案70-75中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
78.根据实施方案70-77中任一项所述的方法，其中所述靶核酸序列包含(例如，至少10个连续的核碱基)启动子序列的全部或部分。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
80.根据实施方案70-79中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因或非必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分，并且所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。
82.根据实施方案70-81中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
83.根据实施方案70-81中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
86.根据实施方案70-85中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统进一步包含有包含启动子序列的核酸序列。
87.根据实施方案70-86中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
88.根据实施方案70-86中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
90.根据实施方案87-89中任一项所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR系统的活性杀灭。
91.根据实施方案87-89中任一项所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR系统的活性的组合杀灭。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。
93.根据实施方案91所述的方法，其中所述CRISPR系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。
94.根据实施方案91所述的方法，其中所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR系统的活性是协同的。
95.根据实施方案87-94中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
96.根据实施方案70-95中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
97.根据实施方案70-96中任一项所述的方法，其中所述细菌噬菌体与p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke、p5516、p004Ke007、p004Ke009、p00c0e030或p00exe014包含至少80％同一性。
98.根据实施方案70-97中任一项所述的方法，其中所述核酸序列被插入非必需细菌噬菌体基因的位置或与其相邻。
99.根据实施方案70-98中任一项所述的方法，其中所述疾病是细菌感染。
100.根据实施方案70-99中任一项所述的方法，其中引起所述疾病的所述埃希氏菌属物种是耐药性埃希氏菌属物种。
101.根据实施方案100所述的方法，其中所述耐药性埃希氏菌属物种对至少一种抗生素具有耐药性。
102.根据实施方案70-101中任一项所述的方法，其中引起所述疾病的所述埃希氏菌属物种是多药耐药性埃希氏菌属物种。
103.根据实施方案102所述的方法，其中所述多药耐药性埃希氏菌属物种对至少一种抗生素具有耐药性。
104.根据实施方案101或103中任一项所述的方法，其中所述抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素或甲氧西林。
105.根据实施方案70-104中任一项所述的方法，其中所述埃希氏菌属物种是大肠埃希氏菌。
106.根据实施方案70-105中任一项所述的方法，其中所述施用是动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮下、吸入、局部、皮肤、透皮、经粘膜、植入、舌下、颊、直肠、阴道、眼、耳或鼻施用或其任何组合。
107.根据实施方案70-106中任一项所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
108.根据实施方案70-107中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少一种另外的细菌噬菌体。
109.一种细菌噬菌体，其包含编码I型CRISPR-Cas系统的核酸序列，所述I型CRISPR-Cas系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；
(b)包含Cas5、Cas8c和Cas7的Cascade多肽；和
(c)Cas3多肽。
110.根据实施方案109所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
111.根据实施方案109或实施方案110所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
112.根据实施方案109-111中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列，其中任选地，所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
113.根据实施方案112所述的细菌噬菌体，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
114.根据实施方案109-113中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ ID NO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
115.根据实施方案109-114中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
116.根据实施方案109-114中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
117.根据实施方案109-116中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含(例如，至少10个连续的核碱基)启动子序列的全部或部分。
118.根据实施方案117所述的细菌噬菌体，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
119.根据实施方案109-118中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因或非必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分。
120.根据实施方案119所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分，并且所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。
121.根据实施方案109-120中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR-Cas系统进一步包含启动子序列。
122.根据实施方案109-121中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
123.根据实施方案109-121中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
124.根据实施方案123所述的细菌噬菌体，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
125.根据实施方案121-124中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。
126.根据实施方案121-124中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种仅通过所述CRISPR系统的活性杀灭。
127.根据实施方案121-126中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR系统的活性的组合杀灭。
128.根据实施方案127所述的细菌噬菌体，其中所述埃希氏菌属物种通过所述CRISPR系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。
129.根据实施方案127所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。
130.根据实施方案127所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR系统的活性是协同的。
131.根据实施方案125-130中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
132.根据实施方案109-131中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
133.根据实施方案109-132中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与p004ke007、p004Ke005、p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516包含至少80％同一性。
134.根据实施方案109-133中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述核酸序列被插入到非必需细菌噬菌体基因中。
135.一种药物组合物，其包含：
(a)根据实施方案109-134中任一项所述的细菌噬菌体；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
136.根据实施方案135所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少两种细菌噬菌体。
137.根据实施方案136所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少六种细菌噬菌体，其中每种细菌噬菌体与p004k、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke和p5516；或p00exe014、p004Ke009、p00jc、p00ke、p00c0e030和p5516包含至少80％序列同一性。
138.根据实施方案135-137中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
139.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含I型CRISPR系统的细菌噬菌体，所述I型CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
140.根据实施方案139所述的方法，其中所述表面是医院表面、车辆表面、设备表面或工业表面。
141.根据实施方案139或实施方案140所述的方法，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
142.根据实施方案139-141中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
143.根据实施方案142所述的方法，其中所述Cascade复合物包含：(i)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
144.根据实施方案143所述的方法，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
145.一种防止食物产品或营养补充剂中的污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含编码I型CRISPR系统的核酸序列的细菌噬菌体，所述I型CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
146.根据实施方案145所述的方法，其中所述食物产品或营养补充剂包括乳、酸乳、凝乳、乳酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方或片剂、液体混悬液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管饲。
147.根据实施方案145或实施方案146所述的方法，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
148.根据实施方案145-147中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
149.根据实施方案148所述的方法，其中所述Cascade复合物包含：(i)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
150.根据实施方案149所述的方法，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
151.一种细菌噬菌体，其包含编码I型CRISPR系统的核酸序列，所述I型CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列，其中所述间隔子序列包含SEQ ID NO:12或20-37中的至少一个；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
152.根据实施方案151所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
153.根据实施方案151或实施方案152所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列包含选自SEQ ID NO:12或20-37的两个或三个序列。154.根据实施方案151-153中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
155.根据实施方案151-153中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
156.根据实施方案155所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
157.根据实施方案156所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。158.一种细菌噬菌体，其与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体包含至少80％序列同一性。
159.根据实施方案158所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与p004Ke007、p004Ke009、p00c0e030或p00exe014包含至少80％同一性。
160.根据实施方案158或实施方案159所述的细菌噬菌体，其进一步包含
(a)CRISPR阵列，其包含与埃希氏菌属物种中的靶核苷酸序列互补的一个或多个间隔子序列；
(b)编码Cascade多肽的核酸；和
(c)编码Cas3多肽的核酸。
161.根据实施方案160所述的细菌噬菌体，其中所述一个或多个间隔子序列包含SEQ ID NO:12或20-37中的至少一个，或与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
162.根据实施方案158所述的细菌噬菌体，其中所述一个或多个间隔子序列包含两个或三个间隔子序列，其中每个间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
163.根据实施方案160-162中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述一个或多个间隔子序列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与所述埃希氏菌属物种中的所述靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；任选地，其中所述间隔子序列包含第三间隔子序列，其中所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补。
164.根据实施方案158-163中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。
165.根据实施方案164所述的细菌噬菌体，其中所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
166.根据实施方案164或实施方案165所述的细菌噬菌体，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
167.根据实施方案158-166中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ ID NO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
168.根据实施方案158-167中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
169.根据实施方案158-167中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
170.根据实施方案156-168中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述包含启动子序列。
171.根据实施方案170所述的细菌噬菌体，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
172.一种细菌噬菌体，其被修饰以用编码CRISPR系统的核酸序列替换细菌噬菌体DNA，所述CRISPR系统包含：包含与靶细菌中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的CRISPR阵列，和编码CRISPR核酸酶的序列。
173.根据实施方案172所述的细菌噬菌体，其中所述靶细菌包括埃希氏菌属物种。
174.根据实施方案172或实施方案173所述的细菌噬菌体，其中所述经修饰的细菌噬菌体是活的。
175.根据实施方案172-174中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述经修饰的细菌噬菌体是裂解性的。
176.根据实施方案172-175中任一项所述的细菌噬菌体，其中编码所述CRISPR系统的所述核酸序列是单个核酸序列。
177.根据实施方案172-175中任一项所述的细菌噬菌体，其中编码所述CRISPR系统的所述核酸序列包含编码所述CRISPR系统的两个或更多个核酸序列。
178.根据实施方案172-177中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统、CRISPR阵列和/或编码所述CRISPR核酸酶的序列位于与包含启动子和编码蛋白质的基因的细菌噬菌体编码序列相邻(例如，相距0个核碱基)或与其相距至少一个核碱基。
179.根据实施方案172-178中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统、CRISPR阵列和/或编码所述CRISPR核酸酶的序列位于与所述细菌噬菌体的必需基因相邻(例如，相距0个核碱基)或与其相距至少一个核碱基。
180.根据实施方案172-179中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。
181.根据实施方案172-180中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约4000个核碱基至约8000个核碱基。
182.根据实施方案172-181中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约5000个核碱基至约8000个核碱基。
183.根据实施方案172-182中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体。
184.根据实施方案172-183中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是经修饰的p00ke噬菌体。
185.根据实施方案172-183中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是经修饰的p00c0噬菌体。
186.根据实施方案172-183中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是经修饰的p00ex噬菌体。
187.根据实施方案172-186中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA对于活力不是必需的，不影响细菌噬菌体复制，不影响细菌噬菌体裂解，不影响所述细菌噬菌体的天然生活方式，或不影响所述细菌噬菌体的功能性，或其中两种或更多种的任何组合。
188.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cas系统。
189.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cpf1系统。
190.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
191.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
192.根据实施方案191所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽和Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
193.根据实施方案192所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。194.根据实施方案192所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌I-C型Cascade复合物。
195.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含I型CRISPR-Cas组件。
196.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含V型CRISPR-Cas组件。
197.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含II型CRISPR-Cas组件。
198.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR核酸酶包含Cas3、或Cas3’和不具有核酸酶活性的Cas3”。
199.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR核酸酶包含Cpf1。
200.根据实施方案172-187中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR核酸酶包含Cas9。
201.根据实施方案172-200中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述间隔子序列与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。202.根据实施方案172-201中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列进一步包含至少一个重复序列。
203.根据实施方案202所述的细菌噬菌体，其中所述至少一个重复序列在其5’端或其3’端处与所述间隔子序列可操作地连接。
204.根据实施方案202或实施方案203所述的细菌噬菌体，其中所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
205.根据实施方案172-204中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列与选自SEQ ID NO:38-45的序列包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
206.根据实施方案172-205中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。
207.根据实施方案172-205中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码或基因间序列。
208.根据实施方案172-207中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含(例如，至少10个连续的核碱基)启动子序列的全部或部分。
209.根据实施方案208所述的细菌噬菌体，其中所述启动子序列与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
210.根据实施方案172-209中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因或非必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分。
211.根据实施方案210所述的细菌噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的(例如，至少10个连续的核碱基)核苷酸序列的全部或部分，并且所述必需基因是Tsf、acpP、gapA、infA、secY、csrA、trmD、ftsA、fusA、glyQ、eno、nusG、dnaA、dnaS、pheS、rplB、gltX、hisS、rplC、aspS、gyrB、glnS、dnaE、rpoA、rpoB、pheT、infB、rpsC、rplF、alaS、leuS、serS、rplD、gyrA、glmS、fus、adk、rpsK、rplR、ctrA、parC、tRNA-Ser、tRNA-Asn或metK。
212.根据实施方案172-211中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含有包含启动子序列的核酸序列。
213.根据实施方案172-212中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
214.根据实施方案172-213中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
215.根据实施方案172-213中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
216.根据实施方案215所述的细菌噬菌体，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
217.根据实施方案172-216中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶细菌仅通过所述细菌噬菌体的裂解活性杀灭。
218.根据实施方案172-216中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶细菌仅通过所述CRISPR系统的活性杀灭。
219.根据实施方案172-216中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述靶细菌通过所述细菌噬菌体的裂解活性与所述CRISPR系统的活性的组合杀灭。
220.根据实施方案214或实施方案215所述的细菌噬菌体，其中所述靶细菌通过所述CRISPR系统的活性杀灭，不依赖于所述细菌噬菌体的裂解活性。
221.根据实施方案214或实施方案215所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统的活性补充或增强了所述细菌噬菌体的裂解活性。
222.根据实施方案214或实施方案215所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性和所述CRISPR系统的活性是协同的。
223.根据实施方案214或实施方案215所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体的裂解活性、所述CRISPR系统的活性或两者都由所述细菌噬菌体的浓度调节。
224.根据实施方案172-223中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。
225.根据实施方案172-224中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke、p5516、p00exe014、p004Ke009或p00c0e030的噬菌体包含至少80％序列同一性。
226.根据实施方案172-225中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是由选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体修饰的。
227.一种核酸序列，其与SEQ ID NO:38-45中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
228.一种核酸序列，其与SEQ ID NO:39具有至少80％同一性。
229.根据实施方案228所述的核酸，其与SEQ ID NO:39具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
230.根据实施方案228所述的核酸，其包含SEQ ID NO:39。
231.根据实施方案227-230中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:12。
232.根据实施方案227-231中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:25。
233.根据实施方案227-232中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:24。
234.根据实施方案227-233中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:13。
235.一种CRISPR阵列，其包含根据实施方案227-234中任一项所述的核酸序列。
236.根据实施方案235所述的CRISPR阵列，其进一步包含启动子。237.根据实施方案236所述的CRISPR阵列，其中所述启动子是来自埃希氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属或其它细菌物种的启动子。
238.根据实施方案236或实施方案237所述的CRISPR阵列，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:1-11或19中的任一个具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
239.根据实施方案236或实施方案237所述的CRISPR阵列，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
240.根据实施方案236-239中任一项所述的CRISPR阵列，其中所述启动子是rrnBP1启动子。
241.根据实施方案227-240中任一项所述的CRISPR阵列，其包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
242.一种细菌噬菌体，其包含根据实施方案227-234中任一项所述的核酸，或根据实施方案235-241中任一项所述的CRISPR阵列。
243.根据实施方案242所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列位于与包含启动子和编码蛋白质的基因的细菌噬菌体编码序列相邻(例如，相距0个核碱基)或与其相距至少一个核碱基。244.根据实施方案242或实施方案243所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列位于与包含启动子和编码蛋白质的基因的细菌噬菌体编码序列相邻(例如，相距0个核碱基)或与其相距至少一个核碱基。
245.根据实施方案242-244中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列替换细菌噬菌体DNA。
246.根据实施方案245所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体。
247.根据实施方案245或实施方案246所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA是经修饰的p00ke噬菌体。
248.根据实施方案245或实施方案247所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA是经修饰的p00c0噬菌体。
249.根据实施方案245或实施方案247所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA是经修饰的p00ex或噬菌体。
250.根据实施方案242-249中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA对于活力不是必需的，不影响细菌噬菌体复制，不影响细菌噬菌体裂解，不影响所述细菌噬菌体的天然生活方式，或不影响所述细菌噬菌体的功能性，或其中两种或更多种的任何组合。
251.根据实施方案242-250中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是活的。
252.根据实施方案242-251中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体感染多个细菌菌株。
253.根据实施方案242-252中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是裂解性的。
254.根据实施方案242-252中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是专性裂解性细菌噬菌体。
255.根据实施方案242-254中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是被赋予裂解性的温和细菌噬菌体。
256.根据实施方案255所述的细菌噬菌体，其中所述温和细菌噬菌体通过去除、替换或灭活溶原基因而被赋予裂解性。
257.根据实施方案242-256中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体包含T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。
258.根据实施方案242-257中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列是所述细菌噬菌体中存在的CRISPR系统的一部分。
259.根据实施方案258所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。
260.根据实施方案258所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约4000个核碱基至约8000个核碱基。
261.根据实施方案258所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约5000个核碱基至约8000个核碱基。
262.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cas系统。
263.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cpf1系统。
264.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
265.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统，所述I型CRISPR-Cas系统进一步包含编码Cascade多肽的核酸序列，任选地，其中所述Cascade多肽形成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统或I-F型CRISPR-Cas系统的Cascade复合物。
266.根据实施方案265所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含：
(i)Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)；(ii)Cas7多肽、Cas8a1多肽或Cas8a2多肽、Cas5多肽、Csa5多肽和Cas6a多肽、Cas3’多肽和不具有核酸酶活性的Cas3”多肽(I-A型CRISPR-Cas系统)；(iii)Cas6b多肽、Cas8b多肽、Cas7多肽和Cas5多肽(I-B型CRISPR-Cas系统)；(iv)Cas10d多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、Cas6d多肽(I-D型CRISPR-Cas系统)；(v)Cse1多肽、Cse2多肽、Cas7多肽、Cas5多肽和Cas6e多肽(I-E型CRISPR-Cas系统)；或(vi)Csy1多肽、Csy2多肽、Csy3多肽和Csy4多肽(I-F型CRISPR-Cas系统)。
267.根据实施方案266所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包含Cas5d多肽、Cas8c多肽和Cas7多肽(I-C型CRISPR-Cas系统)。
268.根据实施方案266或实施方案267所述的细菌噬菌体，其中所述Cascade复合物包括铜绿假单胞菌I-C型Cascade复合物。
269.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含I型CRISPR-Cas组件。
270.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含V型CRISPR-Cas组件。
271.根据实施方案258-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含II型CRISPR-Cas组件。
272.根据实施方案158-261中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含编码核酸酶的核酸。
273.根据实施方案272所述的细菌噬菌体，其中所述核酸酶包含Cas3、或Cas3’和不具有核酸酶活性的Cas3”。
274.根据实施方案272所述的细菌噬菌体，其中所述核酸酶包含Cpf1。275.根据实施方案272所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR核酸酶包含Cas9。
276.根据实施方案242-275中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
277.根据实施方案242-276中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体是由选自p004K、p00c0、p00ex、p00jc、p00ke或p5516的噬菌体修饰的。
278.根据实施方案242-277中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与p004Ke009包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
279.根据实施方案242-277中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与p00c0e030包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
280.根据实施方案242-277中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体与p00exe014包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
281.一种组合物，其包含根据实施方案1-226或242-280中任一项所述的细菌噬菌体和野生型噬菌体。
282.根据实施方案281所述的组合物，其中所述野生型噬菌体靶向表6的所述细菌中的任一种。
283.根据实施方案281或实施方案282所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p00ke。
284.根据实施方案281-283中任一项所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p5516。
285.根据实施方案281-284中任一项所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p00jc。
286.一种组合物，其包含根据实施方案1-226或242-280中任一项所述的细菌噬菌体和第二细菌噬菌体。
287.根据实施方案286所述的组合物，其中所述第二细菌噬菌体来自以下谱系：T4样病毒属、Rb69病毒属、PhAPEC8病毒属、独特肌病毒科或威克瑞病毒属。
288.根据实施方案286或实施方案287所述的组合物，其中所述第二细菌噬菌体被修饰以用编码CRISPR系统的核酸序列替换细菌噬菌体DNA，所述CRISPR系统包含：包含与靶细菌中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的CRISPR阵列，和编码CRISPR核酸酶的序列。
289.根据实施方案286-288中任一项所述的组合物，其中表6的所述细菌中的至少一种被所述第二细菌噬菌体靶向。
290.根据实施方案289所述的组合物，其中表6的所述细菌中的至少10、20、30、40、50、100、150、200、250或300种被所述第二细菌噬菌体靶向。
291.根据实施方案286-290中任一项所述的组合物，其中所述第二细菌噬菌体与p004ke009包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
292.根据实施方案286-290中任一项所述的组合物，其中所述第二细菌噬菌体与p00c0e030包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
293.根据实施方案286-290中任一项所述的组合物，其中所述第二细菌噬菌体与p00exe014包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
294.一种重组噬菌体，其与p004ke009包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
295.一种重组噬菌体，其与p00c0e030包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
296.一种重组噬菌体，其与p00exe014包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
297.一种噬菌体，其与p00jc包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
298.一种噬菌体，其与p00ke包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
299.一种噬菌体，其与p5516包含至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
300.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p00c0e030、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。301.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。302.一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。303.一种组合物，其包含与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。
304.一种组合物，其包含与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。
305.一种组合物，其包含与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体。
306.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
307.根据实施方案306所述的组合物，其包含与p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
308.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
309.根据实施方案308所述的组合物，其包含与p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
310.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
311.根据实施方案310所述的组合物，其包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
312.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p00exe014、p00c0e030、p00jc或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
313.根据实施方案312所述的组合物，其包含与p00exe014、p00c0e030、p00jc或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00jc或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00jc或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
314.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
315.根据实施方案314所述的组合物，其包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p00exe014、p00c0e030、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
316.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p5516、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
317.根据实施方案316所述的组合物，其包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
318.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p5516、p00ke或p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
319.根据实施方案318所述的组合物，其包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p5516、p00ke或p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
320.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p5516、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
321.根据实施方案320所述的组合物，其包含与p004ke009、p5516、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p5516、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p5516、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
322.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00ke、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
323.根据实施方案322所述的组合物，其包含与p004ke009、p00ke、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00ke、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00ke、p00exe014或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
324.一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00ke、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
325.根据实施方案324所述的组合物，其包含与p004ke009、p00ke、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00ke、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00ke、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
326.一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
327.根据实施方案326所述的组合物，其包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
328.一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
329.根据实施方案328所述的组合物，其包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00jc、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
330.一种组合物，其包含与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
331.根据实施方案330所述的组合物，其包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
332.一种组合物，其包含与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
333.根据实施方案332所述的组合物，其包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
334.一种组合物，其包含与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一噬菌体，与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第三噬菌体。
335.根据实施方案334所述的组合物，其包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第四噬菌体；任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第五噬菌体；并且任选地包含与p004ke009、p00exe014、p00c0e030或p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第六噬菌体。
336.根据实施方案307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333或335中任一项所述的组合物，其中所述第四噬菌体不同于所述第三噬菌体。
337.根据实施方案307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335或336中任一项所述的组合物，其中存在所述第五噬菌体，并且所述第五噬菌体不同于所述第三和第四噬菌体。
338.根据实施方案307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333或335-337中任一项所述的组合物，其中存在所述第六噬菌体，并且所述第六噬菌体不同于所述第三、第四和第五噬菌体。
339.一种药物组合物，其包含：
(a)根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体或根据实施方案281-293或300-338中任一项所述的组合物；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
340.根据实施方案339所述的药物组合物，其中所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。341.一种杀灭细菌的方法，其包括将来自根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体的遗传物质引入到所述细菌中。
342.一种杀灭细菌的方法，其包括将来自根据实施方案281-293或300-338中任一项所述的组合物的细菌噬菌体的遗传物质引入到所述细菌中。
343.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体。
344.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用根据实施方案281-293或300-338中任一项所述的组合物。
345.根据实施方案343或实施方案344所述的方法，其中所述疾病是细菌感染。
346.根据实施方案343-345中任一项所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌。
347.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体。
348.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用根据实施方案281-293或300-338中任一项所述的组合物。
349.根据实施方案347或实施方案348所述的方法，其中所述表面包含埃希氏菌。
350.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体。
351.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入根据实施方案281-293或300-338中任一项所述的组合物。
352.根据实施方案350或实施方案351所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌。
353.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含细菌噬菌体的组合物接触，所述细菌噬菌体与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
354.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含细菌噬菌体的组合物接触，所述细菌噬菌体与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
355.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含细菌噬菌体的组合物接触，所述细菌噬菌体与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
356.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含p00jc的组合物接触。
357.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含p00ke的组合物接触。
358.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含p5516的组合物接触。
359.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
360.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
361.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
362.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含p00jc的组合物。
363.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含p00ke的组合物。
364.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含p5516的组合物。
365.根据实施方案359-364中任一项所述的方法，其中所述疾病是细菌感染。
366.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
367.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
368.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
369.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含p00jc的组合物。
370.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含p00ke的组合物。
371.一种对有需要的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用包含p5516的组合物。
372.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
373.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
374.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含细菌噬菌体的组合物，所述细菌噬菌体与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
375.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含p00jc的组合物。376.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含p00ke的组合物。377.一种防止食物产品或营养补充剂中的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入包含p5516的组合物。378.根据实施方案366-377中任一项所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌。
379.一种杀灭多种细菌的方法，所述方法包括将所述多种细菌与第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体组合，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集。
380.一种治疗包含多种细菌的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集。
381.根据实施方案380所述的方法，其中所述疾病是细菌感染。
382.一种对包含多种细菌的表面进行卫生处理的方法，所述方法包括向所述表面施用第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集。
383.一种防止食物产品或营养补充剂中的来自多种细菌的细菌污染的方法，所述方法包括向所述食物产品或所述营养补充剂中加入第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集。
384.根据实施方案379-383中任一项所述的方法，其中靶向所述多种细菌的所述第一子集包括感染所述多种细菌的所述第一子集，并且靶向所述多种细菌的所述第二子集包括感染所述多种细菌的所述第二子集。
385.根据实施方案379-384中任一项所述的方法，其中所述第一子集不同于所述第二子集。
386.根据实施方案379-385中任一项所述的方法，其中所述多种细菌包括表6的两种或更多种细菌。
387.根据实施方案379-386中任一项所述的方法，其中所述多种细菌包括表6的至少50、100、150、200、250、300或350种细菌。
388.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体。
389.根据实施方案379-388中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含根据实施方案1-226、242-280或294-299中任一项所述的细菌噬菌体。
390.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
391.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
392.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
393.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p004Ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
394.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
395.根据实施方案379-387中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
396.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p00jc具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
397.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p00ke具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
398.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p5516具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
399.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p004Ke009具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
400.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p00c0e030具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
401.根据实施方案379-388或390-395中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含与p00exe014具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的噬菌体。
实施例
实施例1：本申请中使用的经工程改造的噬菌体
细菌噬菌体被工程改造以包含crArray和Cas构建体。表1描绘了在以下应用中使用的噬菌体的组件。表2描绘了用于驱动crArray和Cas启动子二者的表达的启动子的序列。表3描绘了用于靶向特异性位点的crArray中的间隔子序列的序列。表4描绘了重复序列。此外，图1A描绘了以下实施例中使用的初步crArray5(SC2)的序列和比对。图1B提供了最终混合物噬菌体的全阵列序列和比对。
本文提供了Cpf1系统和序列。示例性pJC_Cpf1阵列序列和比对详述于图1C中。Cpf1序列元件也在表1-4和表23中列出。
表1：噬菌体的组件
*选择噬菌体于2021年10月21日保藏在ATCC。
表2：启动子序列
表3：间隔子和阵列序列
表4：重复序列
实施例2：靶向大肠埃希氏菌中的crArray
图2示出了野生型噬菌体p004k及其经工程改造的变体p004ke007的基因组的示意图。基因组轴下方的条表示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图示出了用于替换缺失区域中的WT噬菌体基因的DNA。
将大肠埃希氏菌噬菌体p004k-wt(野生型)和p004ke007(靶向SC2+Cas系统)与所指示的细菌菌株在细菌处于对数生长期时混合，并在接种后3小时铺到LB琼脂上。通过对噬菌体进行系列稀释来改变噬菌体与细菌的比率，使得每个点中的细菌的量保持恒定，但噬菌体的量有所变化。随着细菌复制并屈服于噬菌体，噬菌体和细菌的相对比率在实验过程中发生变化，这就是没有列出MOI的原因。每组图像顶部的标记表示所示出的菌株。
在此测定中，将噬菌体与对数生长中期的所指示细菌培养物以1:1混合，以获得在图像左侧列出的最终噬菌体滴度。将细菌-噬菌体混合物孵育3小时，然后将2ul培养物点在LB平板上，如图3A中所描绘。在噬菌体的作用下存活下来的细菌会复制形成可见的菌落，因此细菌越少意味着噬菌体杀灭能力越好。在此测定中，经工程改造的噬菌体在所有稀释度下似乎都比野生型能更好地杀灭细菌，但对于每个大肠埃希氏菌菌株来说，1×107稀释度在视觉上是最显著的。图3B-图3D示出了图3A中的图像的量化。通过比较每个点的相对光密度(基本上就是每个点有多暗，其中越暗的点表示细胞生长越多)来确定量化。总之，这些数据表明，含有Cas系统和靶向细菌基因组的crArray的经工程改造的噬菌体在多个菌株中比野生型噬菌体亲本具有更高的杀灭能力。这些数据表明，表达外源Cas系统的噬菌体改善了噬菌体对抗不同人类病原体的能力。
实施例3：设计和验证用于靶向靶细菌的间隔子序列
间隔子设计
使用以下方案设计间隔子序列。首先，获得感兴趣的生物体/物种/靶标的代表性基因组的合适搜索集。合适的数据库的实例包括NCBI基因库和PATRIC(病理系统资源整合中心)数据库。基因组通过FTP(文件传输协议)服务器批量下载，从而实现快速和程序化的数据集获取。
用相关参数搜索基因组以定位合适的间隔子序列。可以以正向和反向互补方向从头至尾读取基因组，以定位含有PAM(原型间隔子相邻基序)位点的连续DNA片段。间隔子序列将是与PAM位点3’相邻的N长度的DNA序列，其中N特定于感兴趣的Cas系统，并且通常是预先已知的。表征PAM序列和间隔子序列通常在Cas系统的发现和初步研究期间进行。每个观察到的PAM相邻间隔子可以保存到文件和/或数据库中，以供下游使用。
接下来，使用以下过程确定CRISPR工程改造噬菌体中使用的间隔子的质量。首先，可以评估每个观察到的间隔子，以确定它们存在于多少个评估的基因组中。可以另外对观察到的间隔子进行评估，以了解它们在每个给定的基因组中可能出现的次数。在每个基因组超过一个位置出现的间隔子可能是有利的，因为如果发生突变，Cas系统可能无法识别靶位点，并且每个另外的“备份”位点增加了将存在合适的非突变靶位置的可能性。可以评估观察到的间隔子，以确定它们是否出现在基因组的功能注释区域。如果可获得这些信息，可以进一步评估功能注释，以确定基因组的这些区域对于生物体的存活和功能是否是“必需的”。关注出现在所有或几乎所有评估的感兴趣基因组(>＝99)中的间隔子确保了广泛的适用性以证明间隔子选择。如果存在较大的保守间隔子选择池，则可以优先选择出现在具有已知功能的基因组区域中的间隔子，如果这些基因组区域对于存活是“必需的”并且在每个基因组中出现超过1次，则给予更高的优先级。
间隔子验证
然后，可以通过完成以下程序来验证所鉴定的间隔子序列。首先，鉴定在感兴趣的生物体中复制并具有可选择标志物(例如，抗生素耐药性基因)的质粒。将编码Cas系统的基因插入到质粒中，使得它们将在感兴趣的生物体中表达。在Cas系统的上游包含启动子，所述启动子被感兴趣的生物体识别，以驱动Cas系统的表达。在启动子和Cas系统之间包含被感兴趣的生物体识别的核糖体结合位点(RBS)。
使用双质粒系统(在图6中示出)。一个质粒含有通过组成型启动子(与经工程改造的噬菌体中相同的启动子和RBS)表达的CRISPR-Cas系统和用于选择的卡那霉素耐药性标志物。将此质粒转化到大肠埃希氏菌中。
第二质粒含有通过组成型启动子(与经工程改造的噬菌体中相同的启动子)表达的单独crRNA和用于选择的氨苄青霉素耐药性标志物。由携带CRISPR-Cas质粒的大肠埃希氏菌菌株制备电感受态细胞。然后，将含有crRNA的质粒转化到此菌株中。
接下来，确定每个测试间隔子的杀灭功效。表5中列出的质粒被归一化到相同的摩尔浓度。通过转化、缀合或将质粒引入到细胞中的任何其它方法，将每个质粒转移到感兴趣的生物体。将转化的细胞铺到合适的选择性培养基(例如，含抗生素的琼脂)上。在细胞生长成菌落后，对每种不同质粒转移产生的菌落进行计数。转移速率明显低于含有非靶向间隔子的对照质粒的含有靶向间隔子的质粒被认为可成功靶向细菌基因组。
表5：使用的质粒和对照
质粒 功能
空骨架载体 质粒转移效率的对照
含有Cas系统的载体 Cas系统毒性的对照
含有Cas系统和非靶向间隔子的载体 脱靶效应的对照
含有Cas系统和靶向间隔子的载体 测试样品
实施例4：大肠埃希氏菌工程改造工作流程的概述
图5示出了示例性CRISPR-Cas系统，铜绿假单胞菌1C型Cas系统。PAIC基因操纵子将近5700bp，包含4个独立的蛋白质。crRNA阵列是单独表达的。
利用基于质粒的测定来测试crRNA的功效(在图6中示出)。使用双质粒系统。一个质粒含有通过组成型启动子(与经工程改造的噬菌体中相同的启动子和RBS)表达的CRISPR-Cas系统和用于选择的卡那霉素耐药性标志物。将此质粒转化到大肠埃希氏菌中。
第二质粒含有通过组成型启动子(与经工程改造的噬菌体中相同的启动子)表达的单独crRNA和用于选择的氨苄青霉素耐药性标志物。由携带CRISPR-Cas质粒的大肠埃希氏菌菌株制备电感受态细胞。然后，将含有crRNA的质粒转化到此菌株中。
比较活性crRNA或“随机序列(scramble)”对照(与正常crRNA长度相同的随机化核苷酸序列)转化后形成的菌落形成单位(CFU)的数量。形成的菌落越少，归因于crRNA质粒和CRISPR-Cas质粒的组合的减少作用越大。
例如，如果对照crRNA质粒转化导致1E7 CFU，而活性crRNA质粒转化导致1E4 CFU，这将表示归因于CRISPR-Cas诱导的细菌杀灭的3个对数的减少
如图7中所示，所指定的间隔子具有高覆盖率和功效。crRNA的初始列表是基于它们的靶序列在公开可获得的一组～10,000个大肠埃希氏菌基因组中的保守程度来选择的。基于前述基于质粒的测定来确定功效栏。突出显示的间隔子靶标是针对阵列测试选择的间隔子靶标。选择基于多个参数，包括但不限于覆盖百分比、功效和靶标等。
实施例5.测试crRNA阵列的功效
使用上述方法测试间隔子阵列。图8示出了示例性的代表性PaIC间隔子效率，表明了4种选择的crRNA的基于质粒的转化结果。与随机序列对照相比，所有四种都表现出大肠埃希氏菌菌落减少了大约2个对数。没有菌落的重复被归因于检测限(LOD)的1/2。数据以平均值±S.D.作图。CFU的减少不能用一般的质粒毒性或另一种机制(即反义阻遏)来解释，因为在大肠埃希氏菌的无Cas菌株(没有PAIC CRISPR-Cas质粒)中没有观察到显著的CFU减少(图9A)。此外，当将选择的crRNA质粒转化到具有天然CRISPR-Cas系统的大肠埃希氏菌菌株中时，CFU形成没有可测量的减少。针对大肠埃希氏菌IF型(EcIF)系统设计的crRNA导致CFU的多个对数的减少，这指示crRNA设计的高度特异性，并且不存在所鉴定的PaIC间隔子的相互影响(图9B)。针对大肠埃希氏菌IE型(EcIE)设计的crRNA不激活内源Cas系统，这是因为不存在激活天然EcIE系统所需的LeuO转录调节子(图9C)。在此测定中，K12大肠埃希氏菌菌株DH5-α菌株用于EcIE测试，并且大肠埃希氏菌NC101菌株用于EcIF测试。
实施例6.可以充分避免突变逃逸的待靶向位点的数量的预测模型
开发了突变频率的基本模型，以理解防止逃逸所需的独立CRISPR-Cas靶标的数量。图10中示出的数据表明，用CRISPR-Cas靶向3个独立的位点足以减轻突变逃逸的风险。此模型假设了几个最坏情况的参数，例如：(a)每个基因组1e-6的正常突变率；(b)1014CFU的高生物负荷(总GI微生物组或～100m2肺表面积的完全覆盖)；(c)体内的高生长率(20分钟倍增时间)；(d)任何突变完全消除CRISPR-Cas活性。在这些高度严格的假设下，3个间隔子足以完全抑制一个月连续感染时或以1014CFU进行～2,000个细菌代时耐药性的出现。
实施例7.PaIC阵列1和2的分析
基于前面部分描述的测定，进一步分析了至少两个阵列，即PaIC阵列1和PaIC阵列2。表9表征了所述阵列。
表9.PaIC阵列1和PaIC阵列2
如表9中所指示，两个阵列对约10,000个临床EC菌株具有高总体覆盖率。使用之前描述的基于质粒的杀灭方法的阵列杀灭数据的比较，两个PaIC阵列都表现出较高的细菌杀灭能力(图11)。在下表10中提供了阵列序列。
表10.PaIC阵列1和PaIC阵列2的核苷酸序列。序列包含启动子、CRISPR重复和三个crRNA间隔子序列。
实施例8：经纯化的和混合物大肠埃希氏菌噬菌体宿主范围测定
获得了经纯化的和混合物大肠埃希氏菌噬菌体的数据，在来自组合液体和成斑宿主范围测定的最佳结果中报告。总结的数据是给定噬菌体加菌株组合的液体和成斑宿主范围的二元命中的中位数。
确定液体宿主范围涉及向364孔板的孔中加入5uL冷冻的、OD控制的培养物材料、5uL已知滴度的噬菌体材料和40uL生长培养基，以及适当的培养物、噬菌体和仅培养基对照。在振荡的同时将平板在37℃下孵育20小时，并且通过液体处理器每小时量取OD600读数。通过确定加入了噬菌体的样品和其相应对照的曲线下面积(AUC)之间的比率来计算结果。AUC比率低于0.65的样品被认为是阳性(+)命中，而大于或等于0.65的AUC比率是阴性(-)命中。
针对成斑宿主范围测定，培养感兴趣的细菌菌株并针对原噬菌体进行筛选。通过微量滴定板将感兴趣的细菌噬菌体在1X PBS中连续稀释50倍，从未稀释至50-3。倾倒用作滴度宿主的菌株的琼脂覆盖层，并静置过夜。第二天，对感兴趣的细菌菌株的裂解物进行点样。15-20min后，使用Hamilton-STAR-C062对平板进行成像，或者手动计数，或者通过内部开发的图像分析管道进行转换、背景扣除和计数。具有阳性(+)数量个噬斑形成单位的样品被认为是命中。
涉及大肠埃希氏菌、野生型T4样病毒属噬菌体(p004k和p00ex)、野生型Rb69病毒属噬菌体(p00c0)、野生型PhAPEC8病毒属噬菌体(p00jc)、野生型独特肌病毒科噬菌体(p00ke)、野生型威克瑞病毒属噬菌体(p5516)和混合物CK507的此测定的结果在表11中列出。混合物CK507包含p004ke009、p00c0e030、p00ex014、p00jc、p00ke和p5516。总体而言，与经纯化的噬菌体相比，混合物CK507的宿主范围数据有所增加。
表11：野生型噬菌体和混合物CK507的大肠埃希氏菌噬菌体宿主范围
实施例9：第二大肠埃希氏菌噬菌体测定中的全构建体
在将大肠埃希氏菌细菌(菌株b2185和b3911)和噬菌体混合并立即点样到平板上之后，完成了以3e10 PFU/ml(MOI为～100)开始和具有相同细菌浓度的噬菌体的系列1:5稀释的标准平板杀灭测定。将p00Ex野生型和经工程改造的噬菌体与对数生长的细菌混合，并立即铺在LB琼脂上的2ul点中。通过系列稀释改变噬菌体与细菌的比率，使得细菌的量在每次稀释时保持恒定，但是噬菌体的量是1比5的稀释度。在最高稀释度下，感染复数(MOI)为100，意味着每个细菌有大约100个噬菌体。在图4中，p00EXe014(FC)杀灭b2185和b3911菌株始终优于p00EX野生型(WT)对应物。两个大肠埃希氏菌菌株的数据验证了全构建体噬菌体如预期起作用，从而验证了标准平板杀灭测定。
实施例10.经纯化的噬菌体混合物CK618
描述了包含六种细菌噬菌体(p004k、p00jc、p00c0、p00ke、p5516和p00ex)的经纯化的噬菌体混合物。针对与临床试验材料(包括内毒素水平)的一致性评估效力和纯度。
表12.混合物的组分
噬菌体 属 并入的构建体
p00exe014 T4样病毒属 全构建体
p004Ke009 T4样病毒属 全构建体
p00jc PhAPEC8病毒属 野生型
p00ke 未分类的肌病毒属 野生型
p00c0e030 Rb69病毒属 全构建体
p5516 威克瑞病毒属 野生型
表13示出了混合物CK618中的大肠埃希氏菌噬菌体宿主范围
实施例11.混合物CK618的高滴度液体和成斑宿主范围
本研究的目的是通过两种不同的方法来确定CK618及其组分单独噬菌体的总宿主范围。
材料和方法
开发了临床相关的300分离株临床小组(CP)。大肠埃希氏菌(E.coli)分离株来源于国际健康管理协会(IHMA)，并获得关于每个菌株的各个特征的元数据。如果菌株对三类或更多类抗生素具有耐药性，则其被定义为MDR，如表14中所总结。
表14.宿主范围小组元数据
1由于四舍五入，并非所有百分比的总和都是100％。
2MDR＝多药耐药性。如果菌株对三类或更多类抗生素具有耐药性，则其被定义为MDR。
通过在37℃振荡培养箱中在约4至6小时内将细菌菌株培养至对数期，产生用于两种宿主范围测定的细菌平板。然后，将这些培养物在LB中用甘油稀释至20％甘油中的600nm处的目标最终光密度(OD600)为0.02，并随后将各小组冷冻。进一步测试后，小组上的菌株的平均滴度为2.89×106菌落形成单位(CFU)/mL。将各小组储存在-80℃冰箱中，直到用于宿主范围测试。
来自CK618的单独噬菌体以最大有效滴度进行测试。另外，CK618中的每种噬菌体(表15)组合到具有三种不同噬菌体浓度的混合物中。
表15.CK618的总结
对于最高滴度的混合物，将等体积的每种噬菌体组合以产生总混合物滴度为1.0×1011PFU/mL的混合物。对于两种较低滴度的混合物，在组合前将噬菌体滴度归一化以产生每种噬菌体的滴度为3.0×109PFU/mL(总混合物滴度为1.8×1010PFU/mL)或1.0×107PFU/mL(总混合物滴度为6.0×107PFU/mL)的混合物。噬菌体是通过过程开发(PD)过程产生的。除了规模较小之外，PD过程使用了用于临床试验材料制造的相同的一般制造过程。针对与临床试验材料的一致性(包括内毒素水平)评估效力和纯度。然后，通过对上述300分离株CP和另外4个感兴趣的菌株进行基于液体的测定和基于成斑的测定，对混合物进行宿主范围测试。
基于液体的宿主范围
在Hamilton VANTAGE液体处理机器人上的液体宿主范围方案开始前至少45分钟，从冰箱中取出冷冻细菌小组。所述仪器准备了所有必需的消耗品，包括作为生长培养基的用10mM CaCl2和10mM MgCl2改良的LB(在下文中被称为LB+盐)、细菌小组(96孔微量滴定板中的至多4个不同的小组)和微量离心管中的噬菌体裂解物。将仅含LB+盐的空白样品包含在96孔微量滴定板和微量离心管中，以测试运行的潜在污染并作为对照。96孔微量滴定板的每个孔通过液体处理机器人装载40μL LB+盐，然后装载5μL噬菌体，然后装载5μL来自细菌小组的细菌。此制备物在测试样品中产生的最终噬菌体浓度是输入噬菌体的浓度的1/10。一旦制备了所有的组合，将平板放入到37℃的振荡培养箱中。将平板孵育20小时，并且每小时读取每个平板中的每个孔的OD600。
前述方案生成了存在和不存在噬菌体混合物的情况下的每个细菌菌株的生长曲线。计算曲线下面积(AUC)，并计算(存在噬菌体的情况下的AUC)/(不存在噬菌体的情况下的AUC)的比率(图19，左图)。如果AUC比率<0.65，则认为所述菌株被噬菌体混合物靶向。用所靶向的菌株的数量除以所测试的菌株的数量，得到宿主范围百分比或HR％。对被分类为多药耐药性(MDR)的菌株子集进行相同的分析。此外，被噬菌体混合物靶向的一些菌株最终产生耐药性并开始生长，因此增加了所述孔中的OD600读数。其它菌株保持被抑制，直到测定时间过程结束(20小时)。通过检查给定菌株+噬菌体样品达到OD600为0.4的时间量(以小时计)来量化菌株生长(图19错误！未找到参考源，右图)。如果样品从未达到0.4的OD600，则认为所述样品被抑制。用保持被抑制到低于0.4的OD600的菌株的数量除以所测试的菌株的数量，得到抑制度量％OD<0.4。
基于成斑的宿主范围
将冷冻的细菌小组从冰箱中取出解冻，并向深孔块的每个孔中加入1mL LB以在37℃振荡培养箱中孵育过夜。一旦培养物生长过夜，使用它们来产生双层琼脂覆盖法所需的覆盖层。为了产生这些覆盖层，使用矩形LB琼脂平板，其中100μL细菌和0.56％低盐顶层琼脂(低盐顶层琼脂与LB以3:1混合)的覆盖层混合物倾倒于平板上。将覆盖层倾倒到琼脂平板上，并在点样前静置固化至少20分钟。
使用Hamilton VANTAGE液体处理机器人进行噬菌体成斑。将每种噬菌体(以最大有效滴度，表15)或噬菌体混合物(如“材料和方法”部分中所述)在LB中以1:10连续稀释。双层琼脂覆盖层固化后，通过机器人将噬菌体点到覆盖层上。一旦点样完成且各点已干燥，将平板从液体处理机器人上取下并置于37℃培养箱中过夜。
过夜孵育后，使用液体处理机器人Hamilton STAR上的集成相机IDS uEye对平板进行成像。通过对单独噬斑形成单位的数量进行计数，使用内部算法来鉴定敏感的细菌菌株。使用最少三个噬斑形成单位来指定命中。对给出异常值结果(算法中的三种方法之间的对数差>2)的平板和通过所述算法未检测到噬斑的平板进行手动计数。
结果
使用两种方法测试噬菌体混合物的宿主范围，所述两种方法生成了液体中的噬菌体暴露和细菌覆盖层上的成斑后的AUC。这两个度量的组合表明，在最大可行滴度下，CK618靶向CP中92.4％的菌株。在代表38.8％ CP的MDR菌株子集上，CK618的宿主范围百分比增加到94.1％。
用于确定混合物的性能的另一个度量是OD达到时间(Time to OD)。此度量可用于确定混合物在初始下降后抑制细菌菌株生长的有效程度。所述评分考虑了在初始的OD下降后未反弹至OD≥0.4的菌株的百分比。因此，较高的OD达到时间百分比代表被混合物抑制的那些菌株。CK618的OD达到时间评分在全小组上的最大可行滴度下为67.8％，而MDR菌株为62.4％(表16)。
表16.不同测量方法的CK507、CK618和单独噬菌体的宿主范围
实施例12.与抗生素的体外协同作用
本研究的目的是评定CK618与抗生素的相互作用。
材料和方法
针对两个分离株小组，与抗生素组合以及与其相比来测试噬菌体混合物CK618。第一测定使用了一组来自北美洲、欧洲、拉丁美洲和亚洲的88个同期尿路感染(UTI)分离株。这些分离株中的二十一个(24％)被分类为多药耐药性(MDR)，其对3种或更多种抗生素具有耐药性。针对此组测试了七种不同的抗生素，代表五种护理标准(SOC)抗生素(头孢曲松、头孢氨苄、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑[TMP/SMX；也被称为复方新诺明]、磷霉素和呋喃妥因)和通常用作比较剂的两种非SOC抗生素(头孢地尼和环丙沙星)。第二测定使用了由300菌株临床分离株小组(表14)以及另外4个感兴趣的菌株构成的小组。这些分离株中的九十三个(31％)被分类为MDR。将针对88分离株小组测试的相同SOC抗生素中的四种针对此小组进行测试。非SOC抗生素不包括在内，因为它们在临床环境中的使用有限，并且呋喃妥因不包括在内，因为对这种药物的耐药概率较低。
对于两个分离株小组，在标准AST微量稀释测定中，在可杀灭敏感分离株但允许中等或耐药性分离株生长的浓度下，通过使用临床和实验室标准协会(CLSI)或欧洲抗微生物剂药敏测试委员会(EUCAST)断点来确定所测试的抗生素浓度(表17)。
表17.抗生素和噬菌体处理条件
CLSI＝临床和实验室标准协会；EUCAST＝欧洲抗微生物剂药敏测试委员会；PFU＝噬斑形成单位；SMX＝磺胺甲噁唑；TMP＝甲氧苄啶
相较于CK570中的三种噬菌体，所提出的2期CRISPR增强的噬菌体(CRISPR-噬菌体，在下文中被称为“crPhage”)混合物(CK618)的组成已从CK570更新为包含六种细菌噬菌体。制备噬菌体混合物CK618，使得所有噬菌体在最终的混合物中具有相同的滴度。然后，将混合物与细菌混合，以获得以下最终滴度：对于混合物，1×106噬斑形成单位(PFU)/mL/噬菌体；对于细菌，1×105菌落形成单位(CFU)/mL，从而导致样品中的每种噬菌体的感染复数(MOI)为10。简言之，将5μl每种样品(仅CK618、CK618和抗生素、仅抗生素或仅培养基)加入5μl光密度(OD)归一化的细菌分离株和40μl LB培养基中。在37℃下振荡孵育反应物，并在20小时内每小时进行OD测量。
宿主范围百分比是对抗生素或CK618的处理有反应的分离株的百分比。在88分离株小组的情况下，对整个小组以及被分类为多药耐药性(MDR)(n＝21)和β-内酰胺耐药性(n＝31)的子集的结果进行分析。在304分离株小组的情况下，对整个小组以及被分类为MDR(n＝93)和β-内酰胺耐药性(n＝91)的分离株子集的结果进行分析。
结果
CK618在所有菌株上优于大多数SOC抗生素，包括第一代和第三代头孢菌素、环丙沙星和TMP/SMX(图12A-图12C、图13A-图13C、表18、表19)。在所有情况下，组合疗法比仅抗生素治疗更有效。在MDR和β-内酰胺耐药性菌株子集中，头孢菌素、环丙沙星或TMP/SMX的组合疗法与仅噬菌体混合物的表现类似，或较其稍好。磷霉素和呋喃妥因对所有菌株都有很强的活性，并因LBP-EC01的加入而略有改善。对于MDR和β-内酰胺耐药性菌株，头孢菌素、环丙沙星和TMP/SMX的总体宿主范围减少，而LBP-EC01、呋喃妥因和磷霉素的表现类似，这与所测试的分离株的抗生素耐药性状态无关(图12A-图12C、图13A-图13C、表18、表19)。
表18.88分离株小组上的仅CK618、仅抗生素以及二者的组合的宿主范围
MDR＝多药耐药性
表19.304分离株小组上的仅CK618、仅抗生素以及二者的组合的宿主范围
这些数据表明，CK618优于所有所测试的抗生素，重新采用的药物磷霉素除外，磷霉素已经有几个经证明的抗生素耐药机制的病例，并且目前有效只是因为它直到MDR/XDR分离株出现时才被广泛使用。此外，CK618与抗生素相互补地起作用。无论分离株MDR状态或抗生素同一性如何，在所有情况下，与CK618或仅抗生素的治疗相比，CK618加抗生素的并行治疗表现出更高的宿主范围。在Bactrim(TMP/SMX或复方新诺明)的情况下，来自304分离株小组的MDR菌株的百分比从仅Bactrim治疗时的17.2％增加到Bactrim+CK618治疗时的75.3％(表19)，从而为并行治疗的益处提供了有力的论据。
实施例13.用于测试混合物功效的尿路感染模型
在用大肠埃希氏菌(E.coli)菌株ATCC 700928感染的C3H/OuJ小鼠中发展尿路感染(UTI)模型，其导致大肠埃希氏菌对膀胱和肾脏的稳定感染。在本研究中测试了CK618替代物混合物CK570，以确定所述混合物可以降低膀胱、肾脏和尿液中的大肠埃希氏菌负荷的程度。
材料
CRISPR噬菌体(“crPhage”)混合物包含6种噬菌体(p004k、p00jc、p00c0、p00ke、p5516和p00ex)。CK570中使用的p00jc的全构建体版本使用Cpf1/Cas12a作为CRISPR系统而不是使用其它全构建体噬菌体中使用的PAIC Cas操纵子，并通过过程开发(PD)过程产生。除了规模较小之外，PD过程使用了用于临床试验材料制造的相同的一般制造过程。针对与临床试验材料的一致性(包括内毒素水平)评估效力和纯度二者。
表22.替代物混合物CD570的组分
噬菌体 属 工程改造状态
p00ex T4样病毒属 全构建体
p004k T4样病毒属 全构建体
p00jc PhAPEC8病毒属 全构建体1
p00ke 未分类的肌病毒属 野生型
p00c0 Rb69病毒属 全构建体
p5516 威克瑞病毒属 野生型
1CK570中使用的p00jc的全构建体版本使用Cpf1/Cas12a作为CRISPR系统而不是使用其它全构建体噬菌体中使用的PAIC Cas操纵子。
CK570在1X tris缓冲盐水(TBS)中配制，其复合效力为7.6×1010噬斑形成单位(PFU)/mL且估计内毒素含量为16.6EU/mL。用CK570治疗的小鼠通过尿道内(IU)施用接受3.8×109PFU/剂量或通过IV施用接受7.6×109PFU/剂量。相对于感染菌株的混合物效力为是2.0×1010PFU/mL(如通过连续稀释和在ATCC 700928细菌覆盖层上铺板来确定)。本研究中使用的媒剂是1X TBS。环丙沙星是阳性对照，其由合成药房制备成2.5mg/mL原药(stock)水溶液形式的可注射剂。
在本研究中使用了大约8周大、体重21至24克的C3H/OuJ雌性小鼠。每笼饲养1至5个小鼠，并随意提供食物(5P76 Prolab isopro辐照实验室餐食)和水。
实验设计
在第0天，第1组至第5组中的动物接受单次IU剂量的50μL大肠埃希氏菌(如下所述)。感染后(p.i.)四十八(48)、60、72、84和96小时，所有动物接受IU施用(第1组和第2组)或IV施用(第3组至第5组)的媒剂(1X TBS)、CK570或环丙沙星(表20)
表20.实验设计
简言之，在第0天，时间0，通过IU施用，用109菌落形成单位(CFU)的大肠埃希氏菌(ATCC 700928)感染小鼠(图14A)。用含1-4％异氟烷的氧气麻醉小鼠2-3分钟，直到达到通过捏脚趾反射确认的深度麻醉平面。然后，将每个小鼠放在板上，腹部朝上，将鼻子插入到供应异氟烷的鼻锥中。轻轻按摩下腹部以排出膀胱中的任何尿液。使用连接到1mL注射器的24G新生儿导管(BD Insyte-N Autoguard BC 24GA 0.56IN[0.7×14mm]cat#381411)，将50μL接种物缓慢滴注到膀胱中。对于IV施用，将小鼠手动限制在限制器装置中，并通过侧尾静脉施用研究治疗。使用100μL的剂量体积来进行IV注射。对于IU施用，使用相同的方法来进行大肠埃希氏菌的初始施用。使用50μL的剂量体积来进行IU施用。
然后，对两组小鼠实施安乐死，并在p.i.49小时和54小时(分别为治疗后1小时和6小时)通过从匀质组织的连续稀释和培养来评定大肠埃希氏菌负荷。第三组小鼠每12小时接受4次额外剂量的媒剂、环丙沙星或CK570，直至p.i.96小时。在p.i.102小时(最终治疗后6小时)，对剩余的小鼠实施安乐死，并对大肠埃希氏菌负荷进行计数。在用吸入的异氟烷(1-5％)麻醉后，打开腹部以暴露膀胱，并且将尿液用胰岛素注射器无菌收集并置于无菌的、不含DNA酶/RNA酶的管中。
收集尿液后，取出膀胱并放入预先称重的匀质管中，所述管含有1.4mm陶瓷珠(Fisher Scientific cat#15-340-153)和200μL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS；Teknova cat#P0200)；并重新称重，精确到千分位。以类似于膀胱的方式将肾脏和脾脏收集到1mL体积的无菌PBS中。通过将针插入到心脏中并收集到4mL肝素钠血液收集管(Fisher Scientificcat#02-689-5)中并轻轻旋转以确保与抗凝血剂的充分混合来收集血液。将组织匀质，并且将所有样品立即连续稀释并铺板以进行CFU计数。CFU/mL的计算被归一化为膀胱和肾脏的克组织。所有CFU数据都经过对数转换。
结果
直接将混合物递送到感染部位的CK570的IU施用导致所有时间点的肾脏、p.i.54小时和p.i.102小时的膀胱以及p.i.49小时和p.i.102小时的尿液中的细菌负荷的显著减少(图15A-图15C)。细菌负荷的减少范围为～2个对数至～4个对数，并且在一些情况下达到检测限(LOD)。这些数据还表明，无论是单剂量给药，还是5个每日两次(BID)剂量给药，均可获得显著功效。
重要的是，CK570的静脉内(IV)施用(全身施用途径)也实现了细菌负荷的显著减少。在所有时间点的肾脏、p.i.54小时和p.i.102小时的膀胱和p.i.102小时的尿液中观察到所计数的CFU水平的显著降低(图16A-图16C)。细菌负荷的减少范围为～2个对数至～3个对数。在所有评定的时间点，环丙沙星治疗将每个组织中的细菌负荷显著减少至LOD。值得注意的是，环丙沙星不是人类无并发症UTI的护理标准抗生素，并且本实验中的环丙沙星的使用仅旨在作为阳性对照，以确认模型如预期执行。除了CFU的计数，还通过过滤组织匀质物、过滤血浆和尿液的系列稀释和在ATCC 700928的覆盖层上的成斑来对CK570噬菌体进行计数。噬菌体的IU施用导致肾脏、膀胱和尿液中的可检测水平的CK570，尤其是在早期时间点。IV施用在早期时间点还导致血液和脾脏中的可检测水平的LBPEC01，但到p.i.102小时，信号下降到检测限或接近检测限。尽管在p.i.102小时时可检测到的噬菌体的水平最低，但仍有显著的混合物功效，如由两种施用途径均显著减少细菌负荷所证明。总之，CK570的IU或IV施用导致将混合物充分递送到关键器官以实现功效。
因此，IU和IV施用都是实现细菌负荷减少的有效施用途径，从而证明CK570的全身递送是可行的临床施用途径。此外，功效在单剂量的CK570后实现，并且在四个额外剂量后得以保持。总之，这些数据指示，CK570是高效的并且能够显著减少UTI模型中的大肠埃希氏菌细菌负荷。
在另一研究中，设计的示意图在图14B中示出，使用CK618获得了类似的结果。实验布局在表21中呈现。
表21.实验设计
结果
据观察，在膀胱中，相对于媒剂治疗或仅IV剂量，p.i.48小时的IU剂量和IV剂量的CK618的施用都导致54小时处的显著的～3个对数的CFU减少(图17B)。相比之下，在102小时的时间点，接受5次IV剂量的CK618的两个治疗组表现出相对于媒剂治疗组的统计学显著的2-3个对数的CFU减少，其中在接受和未接受初始IU剂量的CK618的组之间没有显著差异。因此，初始IU剂量改善了单次IV剂量的CK618的功效，但相对于BID施用的五次IV剂量并未提高功效。混合物噬菌体的计数表明，在p.i.48小时仅用单次IV剂量的CK618治疗的动物的肾脏中，在54小时处可检测到噬菌体非常少，而在5次IV剂量后，在102小时的时间点，在肾脏中可明显地检测到噬菌体(图18A)。相比之下，在IV给药前在p.i.48小时接受IU剂量的动物在两个时间点在肾脏中都有明显可检测到的噬菌体。在膀胱和血浆中(图18B-图18C)，相对于仅IV给药，IU负荷剂量在任一时间点都没有引起生物分布的显著变化。与功效数据相一致，这些结果表明，IU负荷剂量相对于单次IV剂量可以改善噬菌体对尿路的生物分布，但相对于5次BID IV剂量未实现改善。
表23.Cpf1序列
表24.示例性CRISPR系统组件
尽管本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说，显然这些实施方案仅仅是作为实例提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应理解，在实践本公开时，可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 洛可斯生物科学公司
<120> 包含CRISPR-CAS系统的用于埃希氏菌的噬菌体组合物及其使用方法
<130> 53240-744.601
<140>
<141>
<150> 63/184,647
<151> 2021-05-05
<150> 63/110,107
<151> 2020-11-05
<160> 56
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 97
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：
噬菌体基因组序列
<400> 1
acaagcggca cattgtgcct attgcgaatt aggcacaatg tgcctaatct aacgtcatgc 60
cagccacaac ggcgaggcgc caagaaggat agaagcc 97
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 2
tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35
<210> 3
<211> 155
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 3
gatttttttc gggtgaggtt gcgggctgtt cggtaggttt ataaacactg ctatccaaag 60
ctatggacac gctcggctac gagaacagtt ggcgtgatgg cctctagcaa ttagattgtt 120
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<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 4
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<210> 5
<211> 199
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 5
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：
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<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：
噬菌体基因组序列
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ta 182
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
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<400> 9
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<211> 207
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 10
cttcaagaat tcggggtatt cctgatcctg cgccgctagc gccgcgcacg gccactaggc 60
ccgcgccgat agccagtcgc gctcccggct ggcacactac tcccatttcc gccggaaacg 120
cgcgcaacgt accggcaacg aacgtggaaa gaccatgaaa gactggctgg atgagattca 180
ctggaacgcc gtgacctacg tatgcac 207
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌
<400> 11
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacacca 59
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 12
atttatcaca aaaggattgt tcgatgtcca acaa 34
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 13
gtcgcgcccc gcacgggcgc gtggattgaa ac 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 14
gtcgcgcccc gcacgggcgc gtggagtgaa ag 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 15
gtcgcgcccc gcacgggtgc gtggattgaa ac 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 16
gtcgcgcccc gcatgggcgc gtggattgaa ca 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 17
gtcgcgccct acgcgggcgc gtggagtgaa ag 32
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 18
gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagat 36
<210> 19
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 19
tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagcattaa agaggagaaa atg 53
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 20
cggcagatgg tcattgacct cggcataggt caga 34
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 21
ataatcgatc atttgacgac tcctgtctta gcgt 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 22
tgacatttca gcttttgtaa gcgccatagg ttca 34
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 23
gcctttgtgc tgcagtttat tgagctgccg ttcc 34
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 24
atgccggatg cggcgtgaac gccttatccg gcct 34
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 25
aaccgtctgt actgaagcgc aaccgttctc acgg 34
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 26
gtaagattaa aaaactgatc gagctggttg aaga 34
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 27
ttatgactcc tccagtatca aagtcctgaa aggg 34
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 28
gtaaccgcgg tctgcactct gcattcactg ttcg 34
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 29
cctatccttc tggtcgacta cacatgggcc acgt 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 30
tgatctgtct gcggacatta acgaacacct gatc 34
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 31
tgtcatgcaa gtccctcggg tcgagaagat cacc 34
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 32
caatatcatg gtcgtgtcca ggcactggca gatg 34
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 33
tatgaaaaac cgactaccga acgtaagcgc gcta 34
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 34
tgaacaacga aatcatcctg gtaacctgtg gttc 34
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 35
cattggtagc catgtttctt tcctg 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 36
atactggagg agtcataaga attcg 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 37
cggcgaccag tgccgtagta ttgat 25
<210> 38
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 38
gtcgcgcccc gcacgggcgc gtggattgaa acatttatca caaaaggatt gttcgatgtc 60
caacaagtcg cgccccgcac gggcgcgtgg attgaaac 98
<210> 39
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 39
gtcgcgcccc gcacgggcgc gtggattgaa acatttatca caaaaggatt gttcgatgtc 60
caacaagtcg cgccccgcac gggcgcgtgg attgaaacaa ccgtctgtac tgaagcgcaa 120
ccgttctcac gggtcgcgcc ccgcacgggc gcgtggattg aaacatgccg gatgcggcgt 180
gaacgcctta tccggcctgt cgcgccccgc acgggcgcgt ggattgaaac 230
<210> 40
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 40
atttatcaca aaaggattgt tcgatgtcca acaagtcgcg ccccgcacgg gcgcgtggat 60
tgaaacaacc gtctgtactg aagcgcaacc gttctcacgg gtcgcgcccc gcacgggcgc 120
gtggattgaa acatgccgga tgcggcgtga acgccttatc cggcct 166
<210> 41
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 41
gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagatcatt ggtagccatg tttctttcct 60
ggtctaagaa ctttaaataa tttctactgt tgtagatata ctggaggagt cataagaatt 120
cggtctaaga actttaaata atttctactg ttgtagatcg gcgaccagtg ccgtagtatt 180
gatgtctaag aactttaaat aatttctact gttgtagat 219
<210> 42
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 42
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag 60
tcgcgccccg cacgggcgcg tggattgaaa catttatcac aaaaggattg ttcgatgtcc 120
aacaagtcgc gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaac 157
<210> 43
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 43
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag 60
tcgcgccccg cacgggcgcg tggattgaaa catttatcac aaaaggattg ttcgatgtcc 120
aacaagtcgc gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaacaac cgtctgtact gaagcgcaac 180
cgttctcacg ggtcgcgccc cgcacgggcg cgtggattga aacatgccgg atgcggcgtg 240
aacgccttat ccggcctgtc gcgccccgca cgggcgcgtg gattgaaac 289
<210> 44
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 44
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag 60
tctaagaact ttaaataatt tctactgttg tagatcattg gtagccatgt ttctttcctg 120
gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagatatac tggaggagtc ataagaattc 180
ggtctaagaa ctttaaataa tttctactgt tgtagatcgg cgaccagtgc cgtagtattg 240
atgtctaaga actttaaata atttctactg ttgtagat 278
<210> 45
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 45
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag 60
tcgcgccccg cacgggcgcg tggattgaaa catttatcac aaaaggattg ttcgatgtcc 120
aacaagtcgc gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaacaac cgtctgtact gaagcgcaac 180
cgttctcacg ggtcgcgccc cgcacgggcg cgtggattga aactgaacaa cgaaatcatc 240
ctggtaacct gtggttcgtc gcgccccgca cgggcgcgtg gattgaaac 289
<210> 46
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 46
agtatctatc aggaattcgt aaacaaatat tccctgtcga aaacgctgcg ctttgaatta 60
attccacaag gcaaaacgct ggaaaacatc aaagcgcgtg gccttatcct ggatgacgaa 120
aagcgtgcaa aagactacaa gaaagctaaa caaatcatcg acaaatatca tcagtttttt 180
attgaagaaa ttcttagctc cgtgtgtatc agtgaagacc ttcttcagaa ctatagcgat 240
gtttacttca agctgaagaa atcggacgat gataatctgc agaaagattt taagagtgcc 300
aaggatacta tcaagaaaca gattagtgag tacattaagg attccgagaa gttcaaaaac 360
ctgttcaacc agaacctgat cgatgccaag aaagggcagg aatccgatct gatcctgtgg 420
cttaaacaat ccaaagataa cggcatcgaa ctgtttaagg caaatagcga catcacagat 480
atcgatgaag cactggaaat tatcaaatcg ttcaaagggt ggacaaccta cttcaaagga 540
tttcatgaaa atcgtaaaaa cgtgtacagc tcaaacgaca tcccaacctc tatcatttac 600
cgcatcgttg acgataattt acccaaattt ttggagaaca aagcgaaata tgaatctctg 660
aaggataagg cgccggaagc gatcaattat gaacagatca aaaaggactt ggcggaggag 720
ttgacttttg atattgacta taaaacgtcg gaagtgaacc agcgcgtctt tagcctggac 780
gaagttttcg agattgcaaa ctttaataac tacttaaatc aatccgggat tactaagttt 840
aatacgatta ttggcgggaa attcgttaac ggtgaaaaca ccaaacgtaa aggtatcaac 900
gaatacatta atctgtatag ccagcaaatc aacgataaaa cactcaaaaa atataagatg 960
tccgtgctgt tcaaacagat tttaagtgat acggaaagta agtcatttgt gattgacaaa 1020
ctggaagatg actccgatgt agtgacgact atgcagtcat tttatgaaca gattgcggct 1080
ttcaaaaccg tcgaagagaa gtcgatcaaa gagacgctca gcctcttatt tgatgatctc 1140
aaagcccaga agctggatct ttcgaaaatc tactttaaaa acgataagtc tttaaccgac 1200
ctgtcccaac aggtgtttga tgactactcc gtgattggta ctgccgtgct ggaatatatt 1260
acccagcaaa ttgctccgaa aaacttagat aacccaagta agaaagaaca ggaactgatt 1320
gcgaaaaaaa cggaaaaagc gaaatatctg agcctggaaa ccattaaact ggccctggaa 1380
gaatttaaca aacatcgtga tatcgacaaa caatgccgtt tcgaagaaat cctggccaat 1440
tttgccgcca ttccgatgat tttcgatgaa atcgcacaga ataaggacaa tctggcgcag 1500
atctcaatta aataccagaa tcagggtaag aaagatctcc tgcaggctag cgccgaagat 1560
gatgtgaaag cgatcaaaga cctgctggac caaactaata atctgctgca taaactgaag 1620
atctttcaca ttagccagtc agaagacaag gcgaacattc tcgataaaga tgaacacttc 1680
tacctggttt tcgaagaatg ctacttcgaa ttagcaaaca ttgtccccct ctataataaa 1740
attcgcaatt atattactca gaaaccctat agcgatgaaa aattcaaact gaatttcgaa 1800
aactccaccc tggcgaacgg ttgggataag aataaagagc cagataatac cgccattctg 1860
tttatcaaag acgataaata ttatttaggc gtcatgaaca agaaaaacaa caaaatcttt 1920
gacgacaaag ccatcaagga aaataagggt gaaggttaca agaaaatcgt ttataaactg 1980
ctgcctgggg cgaacaaaat gctgccgaaa gtgtttttta gcgccaagag cattaaattt 2040
tataatccga gtgaagacat cctgcgcatc cgtaatcatt cgacgcatac caaaaatggc 2100
agcccgcaaa aaggctatga aaagtttgag ttcaatattg aagattgtcg taagtttatc 2160
gacttttaca aacaatcgat cagcaaacat cccgaatgga aagactttgg cttccgtttc 2220
tccgacaccc aacgttataa ctcgatcgat gagttctatc gcgaggtcga aaatcagggt 2280
tataaactga cattcgaaaa catcagcgag tcatacattg actccgttgt aaatcagggc 2340
aaactgtacc tcttccagat ttataataaa gatttcagcg cgtactcaaa gggccgcccc 2400
aatctccata ccttatattg gaaggcattg tttgatgagc gtaatctcca ggatgtagtg 2460
tacaaactca atggcgaggc ggaactgttt tatcgtaaac agagcattcc aaagaaaatt 2520
acccacccgg cgaaggaagc gattgccaac aaaaacaagg acaatccgaa aaaggaaagc 2580
gtgttcgagt acgacctgat taaagacaaa cgctttacgg aagataagtt tttctttcac 2640
tgcccgatca cgattaactt taaatcgtcc ggcgcaaaca aatttaacga cgaaattaac 2700
ttgctgctga aagagaaagc gaacgatgtg cacattctgt cgatcgatcg tggtgaacgc 2760
catctggcgt attacacgct ggtggatggc aagggtaaca ttatcaagca ggataccttc 2820
aatatcatcg gtaatgatcg catgaaaacg aattatcacg acaaactggc tgctatcgag 2880
aaagatcgtg atagcgctcg caaagactgg aaaaaaatca acaacatcaa ggaaatgaaa 2940
gaaggttatc tttctcaggt agtacacgaa atcgccaaat tagtcattga atataatgct 3000
attgtagtgt ttgaagatct gaactttggt ttcaaacgcg gtcgcttcaa ggtcgaaaaa 3060
caggtttacc agaaattaga gaaaatgttg attgagaaac tgaactatct ggtcttcaag 3120
gacaatgagt ttgataagac aggtggcgtt ctgcgtgcgt atcagctgac cgccccgttc 3180
gaaaccttca agaaaatggg taaacagacg ggtattatct attacgtgcc ggcaggcttc 3240
accagcaaga tttgcccggt cacgggcttc gtcaaccaac tgtacccaaa gtatgaaagt 3300
gtatccaaga gccaggagtt ctttagcaag tttgataaaa tctgctacaa cctggataag 3360
ggctatttcg agttcagctt cgactacaaa aacttcggcg acaaagccgc gaaaggcaag 3420
tggacgattg cctccttcgg cagccgcctg attaactttc gcaactcgga caaaaatcat 3480
aattgggata cccgcgaagt gtatcctacg aaagagctgg agaaactgct caaagactac 3540
tcgatcgaat atggtcacgg tgagtgtatt aaagccgcaa tttgcggtga aagcgataaa 3600
aagtttttcg ccaaactcac cagcgtatta aatactatcc ttcagatgcg caattccaag 3660
acaggtaccg aactcgatta tctgatctcg ccggtggcgg atgtgaacgg gaacttcttt 3720
gacagccgcc aggcgccgaa aaatatgcca caagacgcag atgcaaatgg agcttatcac 3780
attggtctga aaggacttat gctcctgggc cgtattaaaa ataaccagga gggtaagaaa 3840
cttaatctgg ttattaaaaa cgaagaatat tttgagttcg ttcagaaccg taacaactaa 3900
<210> 47
<211> 2235
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 47
atggacgcgg aggctagcga tactcacttt tttgctcact ccaccttaaa ggcagatcgc 60
agcgattggc agcctctggt cgagcatcta caggctgttg cccgtttggc aggagagaag 120
gctgccttct tcggcggcgg tgaattagct gctcttgctg gtctgttgca tgacttgggt 180
aaatacactg acgagtttca gcggcgtatt gcgggtgatg ccatccgtgt cgatcactct 240
actcgcgggg ccatactggc ggtagaacgc tatggcgcgc taggtcaatt gctagcctac 300
ggcatcgctg gccaccatgc cgggttggcc aatggccgcg aggctggtga gcgaactgcc 360
ttggtcgacc gcctgaaagg ggttgggctg ccacggttat tggaggggtg gtgcgtggaa 420
atcgtgctac ccgagcgcct tcaaccaccg ccactaaaag cgcgcctgga aagaggtttc 480
tttcagttgg cctttcttgg ccggatgctc ttttcctgct tggttgatgc ggattatcta 540
gataccgaag ccttctacca ccgcgtcgaa ggacggcgct cccttcgcga gcaagcgcgg 600
ccgaccttgg ccgagttacg cgcagccctt gatcggcatc tgactgagtt caagggagat 660
acgccggtca accgcgttcg cggggagata ttggccggcg tgcgcggcaa ggcgagcgaa 720
cttcccgggc tgttttctct cacagtgccc acaggaggcg gcaagaccct ggcctctctg 780
gctttcgccc tggatcacgc tctagctcat gggctgcgcc gggtgatcta cgtgattccc 840
ttcactagca tcgtcgagca gaacgctgcg gtattccgtc gtgcactcgg ggccttaggc 900
gaagaggcgg tgctggagca tcacagcgcc ttcgttgatg accgccggca gagcctggag 960
gccaagaaga aactgaacct agcgatggag aactgggacg cgcctatcgt ggtgaccact 1020
gcagtgcagt tcttcgaaag cctgtttgcc gaccgtccag cccagtgccg caagctacac 1080
aacatcgccg gcagcgtggt gattcttgac gaggcacaga ccctaccgct caagctgttg 1140
cggccctgcg ttgccgccct tgatgaactg gcgctcaact accgttgtag cccagttctc 1200
tgtactgcca cgcagccagc gcttcaatcg ccggatttca tcggtgggct gcaggacgta 1260
cgtgagctgg cgcccgagcc gcagcggctg ttccgggagt tggtgcgggt acgaatacgg 1320
acattgggcc cgctcgaaga tgcggccttg actgagcaga tcgccaggcg tgaacaagtg 1380
ctgtgcatcg tcaacaatcg acgccaggcc cgtgcgctct atgagtcgct tgccgagttg 1440
cccggtgccc gccatctcac caccctgatg tgcgccaagc accgtagcag cgtgctggcc 1500
gaggtgcgcc agatgctcaa aaagggggag ccctgtcgcc tggtggccac ctcgctgatc 1560
gaggccggtg tggatgtgga ttttcccgtg gtactgcgtg ccgaggctgg attggattcc 1620
atcgcccagg ccgcgggacg ctgcaatcgc gaaggcaagc ggccgctggc cgaaagcgag 1680
gtgctggtgt tcgccgcggc caattctgac tgggcgccac ccgaggaact caagcagttc 1740
gcccaggccg cccgcgaagt gatgcgcctg cacccggatg attgcctgtc catggcggcc 1800
atcgagcggt attttcgcat actgtactgg cagaagggcg cggaggagtt ggatgcgggt 1860
aacctgctcg gcctgattga gagaggccgg ctcgatggcc tgccctacga gactttggcc 1920
accaagttcc gcatgatcga cagccttcaa ctgccggtga tcatcccatt tgatgacgag 1980
gccagagcag ccctgcgcga gctggagttc gccgacggct gcgccgccat cgcccgtcgc 2040
ctgcagccat atctggtgca gatgccacgc aagggttatc aggcattgcg ggaagccggt 2100
gcgatccagg cggcggcagg tacgcgttat ggtgagcagt ttatggcgtt ggtcaaccct 2160
gatctgtatc accaccaatt cgggttgcac tgggataatc cggcctttgt cagcagcgag 2220
cggctatgtt ggtag 2235
<210> 48
<211> 675
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 48
atggcctacg gaattcgctt aatggtctgg ggcgagcgtg cctgcttcac ccgcccggaa 60
atgaaggtgg aacgcgtctc ttacgatgcg atcacgccgt ccgccgcgcg cggcattctc 120
gaggctatcc actggaagcc ggcgattcgc tgggtggtgg atcgcattca agtgcttaag 180
ccgatccgct tcgaatccat ccggcgcaac gaggtcggcg gcaagctgtc cgctgtcagc 240
gtcggtaagg caatgaaggc cgggcgtact aatggtctgg tgaatctggt cgaggaggat 300
cgccagcagc gcgcgactac tctgctgcgc gatgtctcct atgtcatcga ggcgcatttc 360
gagatgactg acagggctgg cgccgacgat acggtgggca agcatctgga tatcttcaac 420
cgtcgcgcac ggaaggggca gtgcttccat acaccctgcc taggcgtgcg cgagtttccg 480
gccagttttc ggttgctgga agagggcagt gccgagcctg aagtcgatgc ctttctgcgc 540
ggcgagcgtg atctgggctg gatgctgcat gacattgact tcgccgatgg catgaccccg 600
cacttcttcc gtgccctgat gcgcgatggg ctgatcgagg tgccggcctt cagggcggca 660
gaggacaagg catga 675
<210> 49
<211> 1764
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 49
atgatccttt cggccctcaa tgactattat cagcgactgc tggagcgggg tgaagcgaat 60
atctcaccct tcggctacag ccaagaaaag atcagttacg ccctgctgct gtccgcacaa 120
ggagagttgc tggacgtgca ggacattcgc ttgctctctg gcaagaagcc tcaacccagg 180
cttatgagtg tgccgcagcc ggagaagcgc acctcgggca tcaagtccaa cgtactgtgg 240
gacaagacca gctatgtgct gggtgttagt gccaagggcg gagagcgtac tcagcaggag 300
cacgagtcct tcaagacgct gcaccggcag atcttggttg gggaaggcga ccccggtctg 360
caggccttgc tccagttcct cgactgttgg cagccggagc agttcaagcc cccgctgttc 420
agcgaagcaa tgctcgacag caacttagtg ttccgcctag acggccaaca acgctatctg 480
cacgagactc cggcggccct ggcgttgcgt acccggctgt tggccgacgg cgacagccgc 540
gaggggctgt gcctagtctg cggccaacgt cagccgttgg cgcgcctgca tccagcggtc 600
aagggcgtca atggtgccca gagttcgggg gcttccatcg tctccttcaa cctcgacgct 660
ttttcctcct acggcaagag ccagggggaa aatgctccgg tctccgaaca ggccgccttt 720
gcctacacca cggtgctcaa ccatttgttg cgtcgcgacg agcacaaccg ccagcgcctg 780
cagattggcg acgcgagtgt ggtgttctgg gcgcaggcgg atactcctgc tcaggtggcc 840
gccgccgagt cgaccttctg gaacctgctg gagccacccg cagatgatgg tcaggaagcg 900
gaaaagctgc gcggcgtgct ggatgctgtg gccacggggc ggcccttgca tgagctcgac 960
tcgctaatgg aggaaggtac ccgcattttt gtgttagggc tggcgcccaa tacctcgcga 1020
ctgtccattc ggttctgggc agtcgatagc cttgcggtat tcacccagca tctggccgag 1080
catttccggg atatgcacct tgagcctctg ccctggaaga cggagccggc catctggcgc 1140
ttgctctatg ctaccgcgcc cagtcgtgac ggcagagcca agaccgaaga cgtactccca 1200
caactggccg gtgaaatgac ccgcgccatc ctgaccggca gccgctatcc gcgcagtttg 1260
ctagccaacc tgatcatgcg catgcgtgcc gacggcgacg tctctggcat acgcgtcgcg 1320
ctgtgcaagg ccgtgctcgc tcgcgaggca cgcctgagcg gcaaaattca ccaagaggag 1380
ctacctatga gtctcgacaa ggacgccagc aaccccggct atcgcttggg gaggctgttc 1440
gccgtgttgg aaggcgccca gcgcgcagcc ctgggcgaca gggtcaatgc cactatccgt 1500
gaccgctact acggtgccgc gtccagcacg ccagccacgg ttttcccgat actgctgcgc 1560
aacacacaaa accacttggc caagctgcgc aaggagaagc ccggactagc agtgaaccta 1620
gagcgcgata taggcgaaat cattgacggt atgcagagcc aattcccgcg ttgcctgcgc 1680
ctggaggacc agggacgctt tgctattggt tactaccaac aggcccaggc ccgtttcaac 1740
cgtggccccg attccgtcga gtaa 1764
<210> 50
<211> 870
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 50
atgaccgcca tctccaaccg ctacgagttc gtttacctct ttgatgtcag caatggcaat 60
cccaatggcg acccggatgc tggcaacatg ccgcgtctcg atccggaaac caaccagggg 120
ttggtcactg acgtttgcct caagcgcaag atccgcaact acgtcagcct ggagcaggaa 180
agtgcccccg gctatgccat ctatatgcag gaaaaatccg tgctgaataa ccagcacaaa 240
caggcctacg aggcgctcgg tatcgagtca gaggcaaaga aactgcccaa ggacgaagcc 300
aaggcgcgcg aactgacctc ttggatgtgc aagaacttct tcgatgtgcg tgctttcggg 360
gcggtgatga ccaccgagat taatgccggc caggtgcgtg gaccgatcca actggcattc 420
gccacgtcta tcgacccggt attgcctatg gaggtatcca tcacccgcat ggcggtgact 480
aacgaaaagg atttggagaa ggaacgcacc atgggacgca agcacatcgt gccttacggc 540
ttgtaccgcg cccatggttt catctctgcc aagttggccg agcgaaccgg cttttccgac 600
gacgacttgg aactgctatg gcgcgctttg gccaatatgt tcgaacacga ccgctcggcg 660
gcacgtggcg agatggcagc gcgcaagttg atcgtcttca agcatgagca tgccatgggc 720
aatgcacccg cccatgtgct gttcggcagc gttaaggtcg agcgagtcga gggggacgca 780
gttacaccag cacgcggttt ccaggattac cgtgtcagca tcgatgcgga agctctgcct 840
cagggcgtga gcgtgcgcga gtacctctag 870
<210> 51
<211> 744
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 51
Met Asp Ala Glu Ala Ser Asp Thr His Phe Phe Ala His Ser Thr Leu
1 5 10 15
Lys Ala Asp Arg Ser Asp Trp Gln Pro Leu Val Glu His Leu Gln Ala
20 25 30
Val Ala Arg Leu Ala Gly Glu Lys Ala Ala Phe Phe Gly Gly Gly Glu
35 40 45
Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Tyr Thr Asp
50 55 60
Glu Phe Gln Arg Arg Ile Ala Gly Asp Ala Ile Arg Val Asp His Ser
65 70 75 80
Thr Arg Gly Ala Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Gly Ala Leu Gly Gln
85 90 95
Leu Leu Ala Tyr Gly Ile Ala Gly His His Ala Gly Leu Ala Asn Gly
100 105 110
Arg Glu Ala Gly Glu Arg Thr Ala Leu Val Asp Arg Leu Lys Gly Val
115 120 125
Gly Leu Pro Arg Leu Leu Glu Gly Trp Cys Val Glu Ile Val Leu Pro
130 135 140
Glu Arg Leu Gln Pro Pro Pro Leu Lys Ala Arg Leu Glu Arg Gly Phe
145 150 155 160
Phe Gln Leu Ala Phe Leu Gly Arg Met Leu Phe Ser Cys Leu Val Asp
165 170 175
Ala Asp Tyr Leu Asp Thr Glu Ala Phe Tyr His Arg Val Glu Gly Arg
180 185 190
Arg Ser Leu Arg Glu Gln Ala Arg Pro Thr Leu Ala Glu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Leu Asp Arg His Leu Thr Glu Phe Lys Gly Asp Thr Pro Val Asn
210 215 220
Arg Val Arg Gly Glu Ile Leu Ala Gly Val Arg Gly Lys Ala Ser Glu
225 230 235 240
Leu Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Val Pro Thr Gly Gly Gly Lys Thr
245 250 255
Leu Ala Ser Leu Ala Phe Ala Leu Asp His Ala Leu Ala His Gly Leu
260 265 270
Arg Arg Val Ile Tyr Val Ile Pro Phe Thr Ser Ile Val Glu Gln Asn
275 280 285
Ala Ala Val Phe Arg Arg Ala Leu Gly Ala Leu Gly Glu Glu Ala Val
290 295 300
Leu Glu His His Ser Ala Phe Val Asp Asp Arg Arg Gln Ser Leu Glu
305 310 315 320
Ala Lys Lys Lys Leu Asn Leu Ala Met Glu Asn Trp Asp Ala Pro Ile
325 330 335
Val Val Thr Thr Ala Val Gln Phe Phe Glu Ser Leu Phe Ala Asp Arg
340 345 350
Pro Ala Gln Cys Arg Lys Leu His Asn Ile Ala Gly Ser Val Val Ile
355 360 365
Leu Asp Glu Ala Gln Thr Leu Pro Leu Lys Leu Leu Arg Pro Cys Val
370 375 380
Ala Ala Leu Asp Glu Leu Ala Leu Asn Tyr Arg Cys Ser Pro Val Leu
385 390 395 400
Cys Thr Ala Thr Gln Pro Ala Leu Gln Ser Pro Asp Phe Ile Gly Gly
405 410 415
Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Ala Pro Glu Pro Gln Arg Leu Phe Arg
420 425 430
Glu Leu Val Arg Val Arg Ile Arg Thr Leu Gly Pro Leu Glu Asp Ala
435 440 445
Ala Leu Thr Glu Gln Ile Ala Arg Arg Glu Gln Val Leu Cys Ile Val
450 455 460
Asn Asn Arg Arg Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Ser Leu Ala Glu Leu
465 470 475 480
Pro Gly Ala Arg His Leu Thr Thr Leu Met Cys Ala Lys His Arg Ser
485 490 495
Ser Val Leu Ala Glu Val Arg Gln Met Leu Lys Lys Gly Glu Pro Cys
500 505 510
Arg Leu Val Ala Thr Ser Leu Ile Glu Ala Gly Val Asp Val Asp Phe
515 520 525
Pro Val Val Leu Arg Ala Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ile Ala Gln Ala
530 535 540
Ala Gly Arg Cys Asn Arg Glu Gly Lys Arg Pro Leu Ala Glu Ser Glu
545 550 555 560
Val Leu Val Phe Ala Ala Ala Asn Ser Asp Trp Ala Pro Pro Glu Glu
565 570 575
Leu Lys Gln Phe Ala Gln Ala Ala Arg Glu Val Met Arg Leu His Pro
580 585 590
Asp Asp Cys Leu Ser Met Ala Ala Ile Glu Arg Tyr Phe Arg Ile Leu
595 600 605
Tyr Trp Gln Lys Gly Ala Glu Glu Leu Asp Ala Gly Asn Leu Leu Gly
610 615 620
Leu Ile Glu Arg Gly Arg Leu Asp Gly Leu Pro Tyr Glu Thr Leu Ala
625 630 635 640
Thr Lys Phe Arg Met Ile Asp Ser Leu Gln Leu Pro Val Ile Ile Pro
645 650 655
Phe Asp Asp Glu Ala Arg Ala Ala Leu Arg Glu Leu Glu Phe Ala Asp
660 665 670
Gly Cys Ala Ala Ile Ala Arg Arg Leu Gln Pro Tyr Leu Val Gln Met
675 680 685
Pro Arg Lys Gly Tyr Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Ala Ile Gln Ala
690 695 700
Ala Ala Gly Thr Arg Tyr Gly Glu Gln Phe Met Ala Leu Val Asn Pro
705 710 715 720
Asp Leu Tyr His His Gln Phe Gly Leu His Trp Asp Asn Pro Ala Phe
725 730 735
Val Ser Ser Glu Arg Leu Cys Trp
740
<210> 52
<211> 224
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 52
Met Ala Tyr Gly Ile Arg Leu Met Val Trp Gly Glu Arg Ala Cys Phe
1 5 10 15
Thr Arg Pro Glu Met Lys Val Glu Arg Val Ser Tyr Asp Ala Ile Thr
20 25 30
Pro Ser Ala Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Ile His Trp Lys Pro Ala
35 40 45
Ile Arg Trp Val Val Asp Arg Ile Gln Val Leu Lys Pro Ile Arg Phe
50 55 60
Glu Ser Ile Arg Arg Asn Glu Val Gly Gly Lys Leu Ser Ala Val Ser
65 70 75 80
Val Gly Lys Ala Met Lys Ala Gly Arg Thr Asn Gly Leu Val Asn Leu
85 90 95
Val Glu Glu Asp Arg Gln Gln Arg Ala Thr Thr Leu Leu Arg Asp Val
100 105 110
Ser Tyr Val Ile Glu Ala His Phe Glu Met Thr Asp Arg Ala Gly Ala
115 120 125
Asp Asp Thr Val Gly Lys His Leu Asp Ile Phe Asn Arg Arg Ala Arg
130 135 140
Lys Gly Gln Cys Phe His Thr Pro Cys Leu Gly Val Arg Glu Phe Pro
145 150 155 160
Ala Ser Phe Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ser Ala Glu Pro Glu Val Asp
165 170 175
Ala Phe Leu Arg Gly Glu Arg Asp Leu Gly Trp Met Leu His Asp Ile
180 185 190
Asp Phe Ala Asp Gly Met Thr Pro His Phe Phe Arg Ala Leu Met Arg
195 200 205
Asp Gly Leu Ile Glu Val Pro Ala Phe Arg Ala Ala Glu Asp Lys Ala
210 215 220
<210> 53
<211> 587
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 53
Met Ile Leu Ser Ala Leu Asn Asp Tyr Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Gly Glu Ala Asn Ile Ser Pro Phe Gly Tyr Ser Gln Glu Lys Ile Ser
20 25 30
Tyr Ala Leu Leu Leu Ser Ala Gln Gly Glu Leu Leu Asp Val Gln Asp
35 40 45
Ile Arg Leu Leu Ser Gly Lys Lys Pro Gln Pro Arg Leu Met Ser Val
50 55 60
Pro Gln Pro Glu Lys Arg Thr Ser Gly Ile Lys Ser Asn Val Leu Trp
65 70 75 80
Asp Lys Thr Ser Tyr Val Leu Gly Val Ser Ala Lys Gly Gly Glu Arg
85 90 95
Thr Gln Gln Glu His Glu Ser Phe Lys Thr Leu His Arg Gln Ile Leu
100 105 110
Val Gly Glu Gly Asp Pro Gly Leu Gln Ala Leu Leu Gln Phe Leu Asp
115 120 125
Cys Trp Gln Pro Glu Gln Phe Lys Pro Pro Leu Phe Ser Glu Ala Met
130 135 140
Leu Asp Ser Asn Leu Val Phe Arg Leu Asp Gly Gln Gln Arg Tyr Leu
145 150 155 160
His Glu Thr Pro Ala Ala Leu Ala Leu Arg Thr Arg Leu Leu Ala Asp
165 170 175
Gly Asp Ser Arg Glu Gly Leu Cys Leu Val Cys Gly Gln Arg Gln Pro
180 185 190
Leu Ala Arg Leu His Pro Ala Val Lys Gly Val Asn Gly Ala Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Ala Ser Ile Val Ser Phe Asn Leu Asp Ala Phe Ser Ser Tyr
210 215 220
Gly Lys Ser Gln Gly Glu Asn Ala Pro Val Ser Glu Gln Ala Ala Phe
225 230 235 240
Ala Tyr Thr Thr Val Leu Asn His Leu Leu Arg Arg Asp Glu His Asn
245 250 255
Arg Gln Arg Leu Gln Ile Gly Asp Ala Ser Val Val Phe Trp Ala Gln
260 265 270
Ala Asp Thr Pro Ala Gln Val Ala Ala Ala Glu Ser Thr Phe Trp Asn
275 280 285
Leu Leu Glu Pro Pro Ala Asp Asp Gly Gln Glu Ala Glu Lys Leu Arg
290 295 300
Gly Val Leu Asp Ala Val Ala Thr Gly Arg Pro Leu His Glu Leu Asp
305 310 315 320
Ser Leu Met Glu Glu Gly Thr Arg Ile Phe Val Leu Gly Leu Ala Pro
325 330 335
Asn Thr Ser Arg Leu Ser Ile Arg Phe Trp Ala Val Asp Ser Leu Ala
340 345 350
Val Phe Thr Gln His Leu Ala Glu His Phe Arg Asp Met His Leu Glu
355 360 365
Pro Leu Pro Trp Lys Thr Glu Pro Ala Ile Trp Arg Leu Leu Tyr Ala
370 375 380
Thr Ala Pro Ser Arg Asp Gly Arg Ala Lys Thr Glu Asp Val Leu Pro
385 390 395 400
Gln Leu Ala Gly Glu Met Thr Arg Ala Ile Leu Thr Gly Ser Arg Tyr
405 410 415
Pro Arg Ser Leu Leu Ala Asn Leu Ile Met Arg Met Arg Ala Asp Gly
420 425 430
Asp Val Ser Gly Ile Arg Val Ala Leu Cys Lys Ala Val Leu Ala Arg
435 440 445
Glu Ala Arg Leu Ser Gly Lys Ile His Gln Glu Glu Leu Pro Met Ser
450 455 460
Leu Asp Lys Asp Ala Ser Asn Pro Gly Tyr Arg Leu Gly Arg Leu Phe
465 470 475 480
Ala Val Leu Glu Gly Ala Gln Arg Ala Ala Leu Gly Asp Arg Val Asn
485 490 495
Ala Thr Ile Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Ala Ala Ser Ser Thr Pro Ala
500 505 510
Thr Val Phe Pro Ile Leu Leu Arg Asn Thr Gln Asn His Leu Ala Lys
515 520 525
Leu Arg Lys Glu Lys Pro Gly Leu Ala Val Asn Leu Glu Arg Asp Ile
530 535 540
Gly Glu Ile Ile Asp Gly Met Gln Ser Gln Phe Pro Arg Cys Leu Arg
545 550 555 560
Leu Glu Asp Gln Gly Arg Phe Ala Ile Gly Tyr Tyr Gln Gln Ala Gln
565 570 575
Ala Arg Phe Asn Arg Gly Pro Asp Ser Val Glu
580 585
<210> 54
<211> 289
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 54
Met Thr Ala Ile Ser Asn Arg Tyr Glu Phe Val Tyr Leu Phe Asp Val
1 5 10 15
Ser Asn Gly Asn Pro Asn Gly Asp Pro Asp Ala Gly Asn Met Pro Arg
20 25 30
Leu Asp Pro Glu Thr Asn Gln Gly Leu Val Thr Asp Val Cys Leu Lys
35 40 45
Arg Lys Ile Arg Asn Tyr Val Ser Leu Glu Gln Glu Ser Ala Pro Gly
50 55 60
Tyr Ala Ile Tyr Met Gln Glu Lys Ser Val Leu Asn Asn Gln His Lys
65 70 75 80
Gln Ala Tyr Glu Ala Leu Gly Ile Glu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Pro
85 90 95
Lys Asp Glu Ala Lys Ala Arg Glu Leu Thr Ser Trp Met Cys Lys Asn
100 105 110
Phe Phe Asp Val Arg Ala Phe Gly Ala Val Met Thr Thr Glu Ile Asn
115 120 125
Ala Gly Gln Val Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ala Phe Ala Thr Ser Ile
130 135 140
Asp Pro Val Leu Pro Met Glu Val Ser Ile Thr Arg Met Ala Val Thr
145 150 155 160
Asn Glu Lys Asp Leu Glu Lys Glu Arg Thr Met Gly Arg Lys His Ile
165 170 175
Val Pro Tyr Gly Leu Tyr Arg Ala His Gly Phe Ile Ser Ala Lys Leu
180 185 190
Ala Glu Arg Thr Gly Phe Ser Asp Asp Asp Leu Glu Leu Leu Trp Arg
195 200 205
Ala Leu Ala Asn Met Phe Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Arg Gly Glu
210 215 220
Met Ala Ala Arg Lys Leu Ile Val Phe Lys His Glu His Ala Met Gly
225 230 235 240
Asn Ala Pro Ala His Val Leu Phe Gly Ser Val Lys Val Glu Arg Val
245 250 255
Glu Gly Asp Ala Val Thr Pro Ala Arg Gly Phe Gln Asp Tyr Arg Val
260 265 270
Ser Ile Asp Ala Glu Ala Leu Pro Gln Gly Val Ser Val Arg Glu Tyr
275 280 285
Leu
<210> 55
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 55
gaaaattatt ttaaatttcc tctagtcagg ccggaataac tccctataat gcgacaccag 60
tcgcgccccg cacgggcgcg tggattgaaa catttatcac aaaaggattg ttcgatgtcc 120
aacaagtcgc gccccgcacg ggcgcgtgga ttgaaacgca ctcccgttct ggataat 177
<210> 56
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 56
acccggggaa aattatttta aatttcctct agtcaggccg gaataactcc ctataatgcg 60
acaccagtct aagaacttta aataatttct actgttgtag atcattggta gccatgtttc 120
tttcctggtc taagaacttt aaataatttc tactgttgta gatatactgg aggagtcata 180
agaattcggt ctaagaactt taaataattt ctactgttgt agatcggcga ccagtgccgt 240
agtattgatg tctaagaact ttaaataatt tctactgttg tagattcctc gctcactgac 300
tcgcttcgag ctcggtacct gacagct 327

Claims (71)

1.一种核酸序列，其与SEQ ID NO:39具有至少80％同一性。
2.根据权利要求1所述的核酸，其包含SEQ ID NO:25。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸，其包含SEQ ID NO:24。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:12。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸，其包含SEQ ID NO:13。
6.根据权利要求1所述的核酸，其包含SEQ ID NO:39或与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的序列。
7.一种CRISPR阵列，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的CRISPR阵列，其进一步包含启动子。
9.根据权利要求8所述的CRISPR阵列，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个具有至少约80％同一性的序列。
10.根据权利要求9所述的CRISPR阵列，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％同一性的序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的CRISPR阵列，其包含与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的序列。
12.一种CRISPR阵列，其包含与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的序列。
13.一种细菌噬菌体，其包含根据权利要求2-6中任一项所述的核酸或根据权利要求7-11中任一项所述的CRISPR阵列。
14.一种细菌噬菌体，其包含根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求12所述的CRISPR阵列。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列替换细菌噬菌体DNA。
16.根据权利要求15所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述核酸和/或CRISPR阵列是所述细菌噬菌体中存在的CRISPR系统的一部分。
18.根据权利要求17所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf1系统。
20.一种重组噬菌体，其与p004ke009包含至少80％序列同一性。
21.一种重组噬菌体，其与p00c0e030包含至少80％序列同一性。
22.一种重组噬菌体，其与p00exe014包含至少80％序列同一性。
23.一种重组噬菌体，其与p004ke009包含至少90％序列同一性。
24.一种重组噬菌体，其与p00c0e030包含至少90％序列同一性。
25.一种重组噬菌体，其与p00exe014包含至少90％序列同一性。
26.一种包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，其包含第一间隔子序列，所述第一间隔子序列包含选自SEQ ID NO:12或20-37的序列；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的细菌噬菌体，其中所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24。
28.根据权利要求26所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含第二间隔子序列。
29.根据权利要求28所述的细菌噬菌体，其中所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:25，或所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:24，或所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:25，并且所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:24。
30.根据权利要求28所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含第三间隔子序列。
31.根据权利要求30所述的细菌噬菌体，其中所述第一间隔子序列包含SEQ ID NO:12，所述第二间隔子序列包含SEQ ID NO:25，并且所述第三间隔子序列包含SEQ ID NO:24。
32.一种包含CRISPR系统的细菌噬菌体，所述CRISPR系统包含：
(a)CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含第一间隔子序列和第二间隔子序列，其中所述第一间隔子序列与第一埃希氏菌属物种中的第一靶核苷酸序列互补，并且所述第二间隔子序列与所述第一埃希氏菌属物种和/或第二埃希氏菌属物种中的第二靶核苷酸序列互补；所述CRISPR阵列任选地进一步包含第三间隔子序列，所述第三间隔子序列与所述埃希氏菌属物种、第二埃希氏菌属物种和/或第三埃希氏菌属物种中的第三靶核苷酸序列互补；和
(b)编码CRISPR相关核酸酶的核酸序列。
33.根据权利要求32所述的细菌噬菌体，其中所述第一间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列，其中所述第二间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列，并且如果存在，所述第三间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含重复序列，所述重复序列包含与SEQ ID NO:13-18中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。
35.根据权利要求26-34中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含启动子序列，所述启动子序列包含与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个具有至少约90％同一性的序列。
36.根据权利要求26-35中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
37.一种细菌噬菌体，其被修饰以用编码CRISPR系统的核酸序列替换细菌噬菌体DNA，所述CRISPR系统包含：包含与靶细菌中的靶核苷酸序列互补的间隔子序列的CRISPR阵列，和编码CRISPR核酸酶的序列，其中所述靶细菌包括埃希氏菌属物种。
38.根据权利要求37所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包含总共约3000个核碱基至约8000个核碱基。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA对于所述细菌噬菌体的活力或功能性不是必需的。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体DNA来自p004ke、p00c0或p00ex噬菌体。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含间隔子序列，所述间隔子序列包含与SEQ ID NO:12或20-37中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含重复序列，所述重复序列与SEQ ID NO:13-18中的任一个包含至少约90％同一性。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR阵列包含启动子序列，所述启动子序列与SEQ ID NO:11、1-10或19中的任一个包含至少约90％同一性。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的细菌噬菌体，其中所述CRISPR系统包括I型CRISPR-Cas系统、CRISPR-Cpf1系统、II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。
45.一种组合物，其包含根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体和野生型噬菌体。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p00ke。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p5516。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述野生型噬菌体包含p00jc。
49.一种组合物，其包含与p004ke009具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p00c0e030、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
50.一种组合物，其包含与p00c0e030具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
51.一种组合物，其包含与p00exe014具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
52.一种组合物，其包含与p00jc具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
53.一种组合物，其包含与p00ke具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p5516具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
54.一种组合物，其包含与p5516具有至少80％序列同一性的第一噬菌体，和与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p00ke具有至少80％序列同一性的第二噬菌体。
55.一种药物组合物，其包含：
(a)根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体或根据权利要求45-54中任一项所述的组合物；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述药物组合物是片剂、胶囊、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼部制剂、耳部制剂、皮下制剂、局部制剂、透皮制剂、经粘膜制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂、冻干制剂、可雾化制剂及其任何组合的形式。
57.一种杀灭细菌的方法，其包括将来自根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体或根据权利要求45-56中任一项所述的组合物的遗传物质引入到所述细菌中。
58.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体或根据权利要求45-56中任一项所述的组合物。
59.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p00jc具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。
60.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p00ke具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。
61.一种杀灭细菌的方法，其包括将所述细菌与包含与p5516具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物接触。
62.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p00jc具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。
63.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p00ke具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。
64.一种治疗有需要的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含与p5516具有至少80％同一性的细菌噬菌体的组合物。
65.一种杀灭多种细菌的方法，所述方法包括将所述多种细菌与第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体组合，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集，其中所述多种细菌包括表6的两种或更多种细菌。
66.一种治疗包含多种细菌的个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用第一细菌噬菌体和第二细菌噬菌体，其中所述第一细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第一子集，并且所述第二细菌噬菌体靶向所述多种细菌的第二子集，其中所述多种细菌包括表6的两种或更多种细菌。
67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述多种细菌包括表6的至少50、100、150、200、250、300或350种细菌。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述第一细菌噬菌体包含根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述第二细菌噬菌体包含根据权利要求1-44中任一项所述的细菌噬菌体。
70.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中：(i)所述第一细菌噬菌体包含与p00jc具有至少80％同一性的噬菌体，(ii)所述第一细菌噬菌体包含与p00ke具有至少80％同一性的噬菌体，(iii)所述第一细菌噬菌体包含与p5516具有至少80％同一性的噬菌体，(iv)所述第一细菌噬菌体包含与p004Ke009具有至少80％同一性的噬菌体，(v)所述第一细菌噬菌体包含与p00c0e030具有至少80％同一性的噬菌体，或(vi)所述第一细菌噬菌体包含与p00exe014具有至少80％同一性的噬菌体。
71.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中(i)所述第一噬菌体与p004ke009具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p00c0e030、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(ii)所述第一噬菌体与p00c0e030具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00exe014、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(iii)所述第一噬菌体与p00exe014具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00jc、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(iv)所述第一噬菌体与p00jc具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00ke或p5516具有至少80％序列同一性，(v)所述第一噬菌体与p00ke具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p5516具有至少80％序列同一性，或(vi)所述第一噬菌体与p5516具有至少80％序列同一性，并且所述第二噬菌体与p004ke009、p00c0e030、p00exe014、p00jc或p00ke具有至少80％序列同一性。
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