TW202300513A - 抗病毒感染之胜肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種抗病毒感染之免疫原性組合物，特別是一種具有能夠與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex, MHC)分子結合並誘導抗冠狀病毒的廣效免疫性之胜肽的免疫原性組合物。

Description

抗病毒感染之胜肽疫苗
相關申請之交互引用：本案主張於2021年5月18日提出之美國臨時申請第63/190,116號之優先權與權益，其揭露之內容係以引用方式全文併入本文。
本發明涉及一種抗病毒感染之免疫原性組合物，尤其是一種具有能夠與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex, MHC)分子結合並誘導抗冠狀病毒的廣效免疫性之胜肽的免疫原性組合物。
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)為導致2019年冠狀病毒病(coronavirus disease 2019, COVID-19)的病毒，該病自2019年年底以來一直是全球大流行的疾病。SARS-CoV-2最早於2019年12月發現於中國武漢，截至2022年4月3日為止，向世衛組織報告的COVID-19確診病例已達489,779,062件，包括6,152,095例死亡病例(https://covid19.who.int)。該數字仍在快速增長中。
SARS-CoV-2透過在人群中傳播而持續演化。迄今為止，全球已發現6種主要的SARS-CoV-2病毒亞型。這些突變分別發生在SARS-CoV-2的棘蛋白P681H的位置(B.1.1.207變異株)、N501Y/69-70del/P681H的位置(B.1.1.7，Alpha變異株)、N501Y/K417N/E484K的位置(B.1.351，Bata變異株)、N501Y/E484K/K417T的位置(P.1，Gamma變異株)，以及Delta變異株(B.1.617.2) 棘蛋白上的10個突變，與Omicron變異株(B.1.1.529)棘蛋白上的30個突變。SARS-COV-2病毒仍在持續突變中，更糟糕的是目前已經產生了兩種不同亞型的COVID-19病毒的雜交，如XD、XE，以及XF 等。由於SARS-CoV-2具有高突變率，因此迫切需要開發一種廣效COVID-19疫苗來阻止COVID-19的全球流行疫情。
本發明涉及基於冠狀病毒棘蛋白所設計之胜肽。這些胜肽可用於診斷、預防，或治療人類冠狀病毒感染。本案發明人設計了多種在不同冠狀病毒之間保守且能夠與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合的胜肽。於一疫苗組合物中包含一個或多個這樣的胜肽可具有抗一個或多個冠狀病毒的保護能力，及/或治療現有冠狀病毒感染的能力。每種胜肽還可用於診斷是否存在冠狀病毒感染，例如透過檢測一樣品中是否存在能夠與該胜肽結合的分子(例如，T細胞受體或抗體)。舉例而言，該冠狀病毒可為一種與一人類區域性流行病或全球性流行病有關的冠狀病毒。例如，該冠狀病毒可為一人畜共通來源的冠狀病毒。例如，該冠狀病毒可為一乙型冠狀病毒(Betacoronavirus)屬的成員。例如，該冠狀病毒可為一Sarbecoronavirus亞屬的成員。例如，該冠狀病毒可為SARS 冠狀病毒或SARS 2冠狀病毒。
因此，本發明提供一種胜肽，包含一胺基酸序列，其係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26以及與SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26具有至少80%同源性之變異序列，且其中該變異序列與一MHC分子結合及/或誘導T細胞與該變異序列胜肽發生交叉反應。
本發明還提供： - 一種編碼本發明之胜肽的核酸； - 一種免疫原性組合物，包含本發明之胜肽或本發明之核酸； - 一種特異性識別本發明之胜肽的抗體； - 一種能夠與本發明之胜肽結合的T細胞受體； - 一種重組宿主細胞，包含一組成分，其係選自由下列所組成之群組：本發明之胜肽、本發明之核酸、本發明之抗體或其片段，以及本發明之T細胞受體或其片段； - 一種產生活化的T淋巴細胞之體外或離體方法，包括使T細胞與裝載抗原的人類第I類或第II類MHC分子在體外或離體接觸一段足夠以抗原特異性方式活化該T細胞的時間，該MHC分子係於一合適的抗原呈現細胞或一模擬一抗原呈現細胞的人造構築物上表現，其中該抗原為本發明之胜肽； - 一種透過上述方法產生之活化的T淋巴細胞，其中該活化的T淋巴細胞選擇性地識別呈現本發明之胜肽的細胞； - 一種藥物組合物，包含至少一種活性成分，其係選自由下列所組成之群組：本發明之胜肽、本發明之核酸、本發明之抗體或其片段、本發明之T細胞受體或其片段、本發明之重組宿主細胞，以及本發明之活化的T淋巴細胞； - 一種於一有需要的受試者中預防或治療一病原體感染之方法，包括向該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物或藥物組合物； - 一種本發明之免疫原性組合物或藥物組合物在製備用於預防或治療一有需要的受試者中的一病原體感染的藥物中之用途； - 一種產生抗冠狀病毒抗體之方法，包括將本發明之免疫原性組合物施用於一動物或人類受試者； - 一種本發明之免疫原性組合物在製備用於產生抗冠狀病毒抗體的藥物中之用途； - 一種複合物，包含與一MHC分子結合的本發明之胜肽； - 一種確定一個體中現在或先前是否存在冠狀病毒感染之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與自該個體獲得之一樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一分子之間是否存在結合； - 一種鑑定冠狀病毒特異性T細胞之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與自一個體獲得之一樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一T細胞受體之間是否存在結合；以及 - 一種鑑定一冠狀病毒特異性T細胞受體之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與一T細胞受體接觸，並確定該胜肽或複合物與該T細胞受體之間是否存在結合。
透過結合以下附圖對較佳具體實施例之描述，這些及其他方面將變得顯而易見。
本發明涉及一種胜肽，包含一胺基酸序列，其係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26以及與SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26具有至少80%同源性之變異序列，且其中該變異序列與一主要組織相容性複合物(MHC)分子結合及/或誘導T細胞與該變異序列胜肽發生交叉反應。SEQ ID NOs: 1至26列於表1中。
表1
SEQ ID NO 序列
1 KLNSGDSKV
2 KMNSGDSKV
3 KINSGDSKV
4 KQNSGDSKV
5 KVNSGDSKV
6 KLNSGDSFV
7 KLNSGDSKL
8 KLNSGDSKI
9 KLNSGDSKA
10 KLNSGDSPV
11 KLNSGISKV
12 KLNSGLSKV
13 KLNSGVSKV
14 KLMSGDSKV
15 KLWSGDSKV
16 KLFSGDSKV
17 KLYSGDSKV
18 FLNSGDSKV
19 YLNSGDSKV
20 KLNSGDWKV
21 KLNSGDFKV
22 KLNSGDYKV
23 KLNSGDSYV
24 KLNSGDSKVV
25 KLNSGDSKVL
26 FKLNSGDSKV
為了設計SEQ ID NOs: 1至26，選擇人類SARS-CoV-2棘蛋白的保守區域，並根據人類白血球抗原(human leukocyte antigen, HLA)分子結構產生9至10個胺基酸殘基長度的短抗原胜肽。然後對這些胜肽進行HLA結合分析以確認它們與HLA分子的結合活性，其中選擇對HLA具有強結合活性的胜肽。因此，本發明之胜肽能夠結合MHC分子，特別是第I類MHC分子。
於某些具體實施例中，本發明之胜肽具有結合第I類或第II類MHC分子的能力，且當該胜肽結合MHC時，該胜肽能夠被CD4 +及/或CD8 +T細胞識別。
於某些具體實施例中，該變異序列與SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26具有至少80%同源性。於某些具體實施例中，該變異序列與SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少95%同源性。每種可能性代表本發明之單獨具體實施例。
如本文所用，術語“冠狀病毒(coronavirus, CoV)”係指在哺乳動物及鳥類中引起疾病的冠狀病毒科(Coronaviridae)的一群相關的RNA病毒。目前為止已鑑定出七種人類冠狀病毒(HCoVs)，分別為HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)，以及新型冠狀病毒(2019-nCoV，又名SARS-CoV-2)。與高致病性 的SARS-CoV、MERS-CoV，以及2019-nCoV不同，這四種所謂的常見HCoVs通常會引起輕微的上呼吸道疾病，並造成15%至30%的成人普通感冒病例，儘管 嬰兒、老年人或免疫功能低下的患者有時會發生嚴重且危及生命的下呼吸道感染(Encyclopedia of Virology. 2021年：428-440)。
如本文所用，術語“嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)”係指造成2019年冠狀病毒病(COVID-19)的冠狀病毒株。SARS-CoV-2 為一種正股單鏈RNA病毒，基因組大小為29,903個鹼基。每個SARS-CoV-2病毒顆粒的直徑為50-200奈米，具有四種結構蛋白，分別為棘(spike, S)、外膜(envelope, E)、膜(membrane, M)，以及核鞘(nucleocapsid, N)蛋白。N蛋白包含RNA基因組，S、E以及M蛋白共同形成病毒外膜。棘蛋白是負責讓病毒附著在宿主細胞膜上並與之融合的蛋白質。具體而言，棘蛋白的S1次單元催化附著作用，亦即S2次單元與宿主細胞膜的融合。
如本文所用，術語“主要組織相容性複合物(MHC)”係指編碼在細胞表面上發現的幫助免疫系統識別外來物質的蛋白質的一群基因。MHC 蛋白存在於所有高等脊椎動物中。在人類中，該複合物亦稱為人類白血球抗原(HLA)系統。MHC主要以與膜結合的形式存在，負責調節免疫系統。MHC透過在細胞表面呈現一外源或自體蛋白質的胜肽片段並允許細胞毒性T細胞的T細胞受體(T Cell Receptor, TCR)識別並與該胜肽片段結合，以活化細胞毒性T細胞。MHC主要可分為兩種類型。第I類MHC存在於幾乎所有細胞的表面，而第II類MHC僅存在於抗原呈現細胞(antigen presenting cell, APC)，例如自然殺手(natural killer, NK)細胞、巨噬細胞，以及樹突細胞。當裝載一特定胜肽片段時，第I類MHC可選擇性地活化表現TCR的細胞毒性T細胞，因此，去除膜結合結構域的重組第I類MHC可用於治療癌症或傳染病。與第II類MHC不同的是，當凹槽中未裝載胜肽時，大多數的第I類MHC並不穩定。因此，以裝載目標合成胜肽的形式或融合至α鏈的形式製備重組第I類MHC。另外，當使用微生物進行表現時，可能會有無法正確進行再折疊的風險，因此一般使用動物細胞進行表現。於本領域中，HLA以及MHC可互換使用，其含義相同，在人類中使用HLA代替MHC。於本說明書中，術語“HLA”與“MHC”可以相同含義互換使用。
如本文所用，用於描述本發明之胜肽的命名法遵循常規做法，其中胺基(N端)及/或5’位於左側，羧基(C端)及/或3’位於右側。
如本文所用，術語“胜肽”係指胺基酸的分子鏈，包括L-型及D-型。如果需要，可以在體內或體外對胺基酸進行修飾，例如透過甘露糖基化、糖基化、醯胺化(特別是C端醯胺)、羧化，或磷酸化，規定這些修飾必須保持原始分子的生物活性。此外，胜肽可為一嵌合蛋白的部分。
胜肽的功能性衍生物也含括於本發明中。功能性衍生物目的在於包括在整個序列中具有一個或多個不同胺基酸的胜肽，其具有缺失、取代、倒位或添加。已經描述可預期基本上不會改變生物學及免疫學活性的胺基酸取代。相關胺基酸之間的胺基酸置換或在演化中經常發生的置換包括Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn，以及Ile/Val等。
根據本發明所述之胜肽可透過合成或重組DNA技術產生。產生合成胜肽之方法在本領域中是已知的。
用於胜肽合成的有機化學方法被認為包括透過縮合反應偶聯所需的胺基酸，無論是在均相中還是藉助所謂的固相。縮合反應可照以下方法進行：於一縮合劑存在的環境下，將一具有一游離羧基以及受保護的其他反應基團的化合物(胺基酸、胜肽)與一具有游離氨基以及受保護的其他反應基團的化合物(胺基酸、胜肽)進行縮合。將一具有一活化的羧基以及游離或受保護的其他反應基團的化合物(胺基酸、胜肽)與一具有一游離氨基以及游離或受保護的其他反應基團的化合物(胺基酸、胜肽)進行縮合。可透過將該羧基轉化為一醯鹵、疊氮化物、酸酐、咪唑啉，或一活化酯，例如，N-羥基-琥珀醯亞胺、N-羥基-苯並三唑，或對硝基苯基以進行羧基的活化。
上述縮合反應最常用的方法為：碳二亞胺法、疊氮化物法、混合酸酐法，以及使用活化酯的方法，例如The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology，第1-3卷(Gross, E.與Meienhofer, J.編輯) 1979、1980、1981年(Academic Press, Inc.)中所述。
透過給定胺基酸序列的“變異株”，發明人係指例如一個或兩個胺基酸殘基的側鏈被改變(例如，透過以另一種天然存在的胺基酸殘基的側鏈或一些其他側鏈來代替它們)，使得該胜肽仍然能夠與由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26所組成之給定胺基酸序列所組成之胜肽以基本相同的方式結合一MHC分子。例如，可對一胜肽進行修飾，以使其至少保持(若未促進)與合適的MHC分子(例如，HLA-A*02)的結合槽相互作用並結合的能力。
本領域技術人員將能夠評估由一特定胜肽的變異序列所誘導的T細胞是否能夠與該胜肽本身發生交叉反應。
本發明還涉及編碼本發明之胜肽的核酸。 因此，該核酸編碼包含或由SEQ ID NO: 1至26中任一序列或其變異序列組成之胜肽。
如本文所用，術語“編碼一胜肽的核酸”係指一編碼該胜肽的核苷酸序列。該編碼一特定胜肽、寡胜肽，或多胜肽的核酸可為天然存在的核酸或者其可為合成構建的核酸。該核酸(例如，多核苷酸)可為，例如，去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)、互補DNA (complementary DNA, cDNA)、胜肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)、核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)，或其組合，其可為單股及/或雙股，或天然或穩定形式的多核苷酸，例如，具有硫代磷酸酯骨架的多核苷酸，而且只要該核酸可編碼胜肽，其可包含或不包含內含子。
本發明還涉及一種免疫原性組合物，包含本發明之胜肽或本發明之核酸。因此，該免疫原性組合物包含一胜肽，該胜肽包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成。或者，該免疫原性組合物包含編碼一胜肽的核酸，該胜肽包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物進一步包含一藥學上可接受之載劑及/或佐劑。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物包含至少一種本發明之胜肽。於某些具體實施例中，該免疫原性組合物包含兩個或更多個本發明之胜肽。該包含本發明之胜肽的免疫原性組合物亦稱為一胜肽疫苗。
如本文所用，術語“胜肽疫苗”係指由至少一種胜肽所組成之製劑，該至少一種胜肽提高對一特定病原體之免疫力。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物包含編碼至少一種本發明之胜肽的核酸。於某些具體實施例中，該免疫原性組合物包含編碼兩個或更多個本發明之胜肽的核酸。於某些具體實施例中，該核酸為DNA。 於某些具體實施例中，該核酸為RNA。於某些具體實施例中，該核酸為mRNA。
如本文所用，術語“免疫原性組合物”係指能夠產生一免疫反應之組合物。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物在施用後表現出對T細胞的活化作用。於某些具體實施例中，該免疫原性組合物在施用後表現出對CD4 +T細胞的活化作用。於某些具體實施例中，該免疫原性組合物在施用後表現出對CD8 +T細胞的活化作用。於某些具體實施例中，該免疫原性組合物在施用後表現出對CD4 +與CD8 +T細胞的聯合活化作用。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物在施用後產生抗本發明之胜肽內包含的抗原決定位的特異性抗體(任何類別的免疫球蛋白)。每種可能性代表一個單獨的具體實施例。
如本文所用，術語“佐劑”係指一藥物組合物中非活性劑之任何組成分。
於某些具體實施例中，該佐劑係選自包含以下之群組：一油乳劑、一細胞激素、一免疫刺激複合物(immunostimulating complex, ISCOM)、一皂苷型助劑、Montanide ISA 51VG、脂質體、氫氧化鋁(明礬)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、鑰孔貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、脂多醣(Lipopolysaccharides, LPS) 或衍生物，例如，單磷醯脂質A (Monophosphoryl lipid, MPL)、CpG DNA、微生物DNA/RNA、奈米顆粒(例如，金顆粒)、細菌菌影、TNF
Figure 02_image005
的配體或促效劑抗體， 基於類鐸受體(Toll-like receptor, TLR)的佐劑(例如，參閱Heit等人，Eur. J. Immunol.，2007年，37:2063-2074)，或其組合。
如本文所用，“藥學上可接受之載劑”或“藥學上可接受之賦形劑”包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑與抗真菌劑、等滲劑與吸收增強劑或延遲劑，以及生理相容的其他賦形劑或添加劑。於特定具體實施例中，該載劑適用於鼻內、靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、腸胃外、口服、經黏膜或經皮給藥。根據給藥途徑，可將該活性化合物包覆於一材料中以保護該化合物免受酸及可能使該化合物不活化的其他自然條件的作用。將此類介質與試劑用於藥物活性物質在本領域中是已知的。
於某些具體實施例中，胜肽抗原與用於胜肽包封及遞送的聚合物結合，例如聚(丙交酯-共-己內酯)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙交酯-共-己內酯)(Poly(lactide-co-caprolactone)-block-poly(ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-caprolactone), PLCL-PEG-PLCL)、聚(ε-己內酯)-聚(乙二醇)-聚(ε-己內酯)(Poly(ε-caprolactone)-poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone), PCL-PEG-PCL)，或本領域已知的其他聚合物，例如，但不限於，羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose, CMC)、殼聚醣，以及1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)。
於某些具體實施例中，未添加任何佐劑。 於某些具體實施例中，添加一種佐劑。 於某些具體實施例中，添加佐劑組合物。
本發明還涉及一種特異性識別本發明之胜肽的抗體。 因此，該抗體特異性識別包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽。
如本文所用，術語“抗體”係指包含至少一個結合結構域的一個或一群多胜肽，該結合結構域由具有三維結合空間的多胜肽鏈折疊所形成，該空間具有與一抗原的抗原決定位的特徵互補的內表面形狀及電荷分佈。抗體通常具有一四聚體形式，包括兩對相同的多胜肽鏈，每對具有一條“輕”鏈與一條“重”鏈。每個輕/重鏈對的可變區形成一個抗體結合位點。抗體可為寡株的、多株的、單株的、嵌合的、駱駝化的、CDR移植的、多特異性的、雙特異性的、催化的、人源化的、完全人類的、抗遺傳型的，以及可以可溶性或結合形式標記的抗體及片段，包括單獨或與其他胺基酸序列組合的抗原決定位結合片段、變異株或衍生物。抗體可來自任何物種。術語抗體還包括結合片段，包括，但不限於，Fv、Fab、Fab'、F(ab') 2、單鏈抗體(single stranded antibody, svFC)、二聚體可變區(Diabody)，以及二硫鍵連接的可變區(disulphide-linked variable region, dsFv)。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，亦即，含有一抗原結合位點的分子。抗體片段可融合或不融合至另一免疫球蛋白結構域，包括，但不限於，一Fc區或其片段。本領域技術人員將進一步理解，可產生其他融合產物，包括，但不限於，scFv-Fc融合體、可變區(例如，V L與V H)-Fc融合體以及scFv-scFv-Fc融合體。
免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA，以及IgY)、類別(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2)或亞類。
術語“一個抗體”或“多個抗體”在本文中以廣義使用，包括多株抗體及單株抗體。除了完整或“完全”的免疫球蛋白分子之外，術語“抗體”還包括這些免疫球蛋白分子的片段(例如 CDRs、Fv、Fab，以及Fc片段)或聚合物，以及免疫球蛋白分子的人源化形式，只要它們表現出任何所需特性，亦即，特異性識別根據本發明之胜肽或其變異序列。只要有可能，本發明之抗體可從商業來源購買。本發明之抗體也可使用習知的方法產生。本發明之抗體可用作治療劑或診斷劑。
本發明還涉及能夠與本發明之胜肽結合的T細胞受體。因此，該T細胞受體能夠結合包含或由SEQ ID NO: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽。
於某些具體實施例中，該胜肽與一MHC分子結合。
如本文所用，術語“T細胞受體”(TCR)係指包含一
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多胜肽鏈(α鏈)以及一β多胜肽鏈(β鏈)的異二聚體分子，其中該異二聚體受體能夠結合由一HLA分子所呈現的一胜肽抗原。該術語還包括所謂的
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/
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TCRs。
本發明還涉及一種重組宿主細胞，包含一組成分，其係選自由下列所組成之群組：本發明之胜肽、本發明之核酸、本發明之抗體或其片段，以及本發明之T細胞受體或其片段。因此，該重組宿主細胞包含一種組成分，其係選自由下列所組成之群組：一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽，編碼一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽的核酸、一特異性識別一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽的抗體或片段，以及一能夠與一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽結合的T細胞受體。
於某些具體實施例中，該重組宿主細胞係選自一抗原呈現細胞，例如一樹突細胞、一T細胞，或一自然殺手(natural killer, NK)細胞。
本發明還涉及一種產生活化的T淋巴細胞之體外或離體方法，包括使T細胞與裝載抗原的人類第I類或第II類MHC分子在體外或離體接觸一段足夠以抗原特異性方式活化該T細胞的時間，該MHC分子係於一合適的抗原呈現細胞或一模擬一抗原呈現細胞的人造構築物上表現，其中該抗原為本發明之胜肽。
本發明還涉及透過上述體外或離體方法產生之活化T淋巴細胞，其中該活化T淋巴細胞選擇性識別呈現本發明之胜肽的細胞。因此，該活化的T淋巴細胞選擇性地識別一呈現包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽的細胞。
本發明還涉及一種藥物組合物，包含至少一種活性成分，其係選自由下列所組成之群組：本發明之胜肽、本發明之核酸、本發明之抗體或其片段、本發明之T細胞受體或其片段、本發明之重組宿主細胞，以及本發明之活化的T淋巴細胞。因此，該藥物組合物包含至少一種活性成分，其係選自由下列所組成之群組：一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽、編碼一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽的核酸、一特異性識別一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽的抗體或片段，以及一能夠與一包含或由SEQ ID NOs: 1至26中任一序列或其變異序列所組成之胜肽結合的T細胞受體。
於某些具體實施例中，該藥物組合物進一步包含一藥學上可接受之載劑及/或藥學上可接受之賦形劑及/或穩定劑。
如本文所用，術語“藥物組合物”係指適合在一醫療環境中施用於人類之組合物。較佳地，該藥物組合物為無菌的且根據優良製造(good manufacturing practice, GMP)規範生產。
於製備本發明之藥物組合物時，可能需要修飾該胜肽抗原，或將該胜肽與其他試劑組合或綴合，以改變藥物動力學及生物分佈。本領域普通技術人員已知許多改變藥物動力學及生物分佈之方法。此類方法的實例包括 在由其他蛋白質、脂質(例如，脂質體)、碳水化合物或合成聚合物所組成之囊泡中保護該蛋白質、蛋白質複合物，以及多核苷酸。例如，可將本發明之疫苗試劑摻入脂質體中以增強藥物動力學及生物分佈特性。多種方法可用於製備脂質體，例如美國專利第4,235,871、4,501,728，以及4,837,028號中所述。為了與脂質體遞送載劑一起使用，胜肽通常被包裹在脂質體或脂質囊泡內，或結合到囊泡的外部。
本發明還涉及於一有需要的受試者中預防或治療一病原體感染之方法，包括向該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物或藥物組合物。
於某些具體實施例中，該病原體感染係由一冠狀病毒所誘導的。 於某些具體實施例中，該冠狀病毒為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)。
於某些具體實施例中，本發明提供一種治療或預防一病原體感染之方法，包括向一有需要的受試者施用一富集的T細胞群，其中該富集的T細胞群係透過在體外向一T細胞群施用該免疫原性組合物所獲得的。
如本文所用，一物質之一“有效量”或一“足夠量”為足以實現有益或期望之結果(包括臨床結果)的量，因此，一“有效量”取決於其所應用之情況。於施用一免疫原性組合物的情況下，該有效量為一免疫原性有效量，其包含足夠引發一免疫反應的本發明之免疫原性組合物的量。於施用一藥物組合物的情況下，該有效量為一藥物有效量，其包含足夠維持或產生所需的生理結果的本發明之藥物組合物。可施用一或多個劑量的一有效量。
如本文所用，術語“免疫原性有效量”係指在必要的劑量及時間段內組合有效地引發一特定T淋巴細胞調節的免疫反應及/或體液反應的量。這種反應可透過用於T細胞活化的常規分析來確定，包括，但不限於，檢測抗體產生、增殖、特異性細胞激素活化及/或細胞溶解活性的分析，例如，使用抗體濃度/效價分析(例如，透過ELISA)。
如本文所用，術語“藥學有效量”係指能夠或足以維持或產生一所需生理結果的量，包括，但不限於，治療、減少、消除、基本上防止，或預防，或其組合，一疾病、病症，或其組合。一藥學有效量可包括依序或同時施用的一個或多個劑量。本領域技術人員將知道調整本發明之劑量以適應各種類型的製劑，包括，但不限於，緩釋製劑。如本文所用，術語“預防性”係指一組合物能夠基本上防止或預防一疾病、病症，或其組合的任何方面。如本文所用，術語“治療性”係指能夠治療、減少、停止惡化、減緩惡化、有益地改變、消除，或其組合，一疾病、病症，或其組合的任何方面。
如本文所用，關於免疫原性組合物之術語“劑量”係指在任何時間由一受試者服用(施用或接受)該免疫原性組合物的一測量部分。
如本文所用，術語“免疫”係指增加一哺乳動物受試者對抗原的反應並因此提高其抵抗或克服感染的能力之過程。
如本文所用，術語“疫苗接種”係指將疫苗引入一哺乳動物受試者的身體中。
如本文所用，術語“受試者”係指一動物，更具體而言係指非人類哺乳動物以及人類有機體。非人類動物受試者還可包括動物的生產前形式，例如胚胎或胎兒。非人類動物的非限制性實例包括：馬、牛、駱駝、山羊、綿羊、狗、貓、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、天竺鼠、豬。於某些具體實施例中，該受試者為一人類。 人類受試者還可包括胎兒。
如本文所用，術語“受試者”係指需要治療的任何受試者，特別是哺乳動物受試者，例如一人類。
於某些具體實施例中，一有需要的受試者受一病原體感染。於某些具體實施例中，一有需要的受試者易受一病原體感染。於某些具體實施例中，一有需要的受試者可能容易受一病原體感染。
如本文所用，術語“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”包括減輕其至少一種症狀、降低其嚴重性，或抑制其惡化。治療不一定代表疾病、失調，或病症完全被治癒。為了成為有效的治療，本文有用之組合物僅需降低一疾病、病症或病狀的嚴重性，降低與之相關的症狀的嚴重性，或改善一患者或受試者的生活品質。
於某些具體實施例中，本發明之胜肽疫苗減少將疾病轉染或傳播至其他受試者。
於某些具體實施例中，在有或無共刺激分子、試劑或佐劑的情況下施用一有效量的本發明之胜肽疫苗。根據本發明之方法，可在足以預防及/或改善病原體感染的條件下，將該胜肽疫苗施用於一需要這種治療的受試者一段時間。
於某些具體實施例中，該免疫原性組合物可透過多種給藥方式施用於受試者，包括皮內、肌肉內、皮下、靜脈內、心房內、關節內、腹膜內、腸胃外、口服、直腸、鼻內、肺內，以及透皮遞送，或局部給藥至眼睛、耳朵、皮膚，或黏膜。或者，該抗原可選擇地在一生物學上合適的液體或固體載劑中，透過直接暴露於源自一受試者(自體)或另一受試者(異體)的細胞、組織或器官以離體方式施用。
胜肽疫苗可透過注射該胜肽疫苗本身或與一適當的輔助劑或佐劑組合施用於受試者。或者，該胜肽疫苗可透過，例如，噴霧溶液透過黏膜經皮施用。該胜肽的單位劑量通常在約0.001 mg至100 mg的範圍內，更通常在約1 µg至約1,000 µg之間，其可單次或重複地施用於一患者。
可與胜肽或蛋白質抗原及/或表現共刺激分子的載體一起配製或綴合以在本發明中使用以增加其免疫原性的助劑或佐劑的實例包括細胞激素(例如GM-CSF)、細菌細胞成分，例如BCG細菌細胞成分、免疫刺激複合物 (ISCOM)，萃取自名為QuillA的樹皮、QS-21、一皂苷類助劑、Montanide ISA 51VG、脂質體、氫氧化鋁(明礬)、牛血清白蛋白(BSA)、破傷風類毒素(tetanus toxoid, TT)、鑰孔貝血藍素(KLH)，以及基於類鐸受體(TLR)的佐劑(例如，參閱Heit等人，Eur. J. Immunol. (2007年) 37:2063-2074)。
本發明還涉及一種產生抗冠狀病毒抗體之方法，包括將本發明之免疫原性組合物施用於一動物或一人類受試者。
於某些具體實施例中，該抗冠狀病毒抗體的特徵在於對一冠狀病毒具有結合親和力。於某些具體實施例中，該抗冠狀病毒抗體為抗
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冠狀病毒胜肽的抗體。於某些具體實施例中，該冠狀病毒為229E或NL63。於某些具體實施例中，該抗冠狀病毒抗體為抗
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冠狀病毒胜肽的抗體。於某些具體實施例中，該冠狀病毒為OC43、HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV，以及SARS-CoV-2。
於某些具體實施例中，該動物為馬、牛、駱駝、山羊、綿羊、狗、貓、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、天竺鼠或豬。該動物還可包括動物的生產前形式，例如胚胎或胎兒。
本發明還涉及包含與一MHC分子結合的本發明之胜肽的複合物。因此，該複合物包含一胜肽，該胜肽包含或由SEQ ID NOs: 1至26中的任一序列或其變異序列所組成，其與一MHC分子結合。
於某些具體實施例中，該MHC分子為一第I類MHC分子。於某些具體實施例中，該MHC分子為一第II類MHC分子。較佳為，該MHC分子為一第I類MHC分子。該第I類MHC分子可為任何HLA超型(supertype)。例如，該第I類MHC分子可為A2超型。
於某些具體實施例中，該複合物包含兩個或更多個本發明之胜肽以及兩個或更多個MHC分子。例如，該複合物可包含三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個本發明之胜肽。該複合物可包含三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個MHC分子。該複合物可，例如，分別包含三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個本發明之胜肽以及三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個MHC分子。該複合物可包含與MHC分子相同數量的本發明之胜肽。該複合物可包含與MHC分子不同數量的本發明之胜肽。例如，該複合物可包含四個MHC分子。該複合物可包含或由一個MHC四聚體所組成。例如，該複合物可包含十二個MHC分子。該複合物可以包含或由一個MHC十二聚體所組成。
當複合物包含兩個或更多個本發明之胜肽時，該兩個或更多個胜肽中的每一個可為相同的。或者，該兩個或更多個胜肽中的每一個可為不同的。當該複合物包含三個或更多個本發明之胜肽時，該三個或更多個胜肽中的每一個可為相同的。當該複合物包含三個或更多個本發明之胜肽時，該三個或更多個胜肽中的每一個可為不同的。當該複合物包含三個或更多個本發明之胜肽時，該三個或更多個胜肽中的一些可為相同的，而該三個或更多個胜肽中的另一些可為不同的。
當該複合物包含兩個或更多個MHC分子時，該兩個或更多個MHC分子中的每一個可為相同的。或者，該兩個或更多個MHC分子中的每一種可為不同的。當該複合物包含三個或更多個本發明之胜肽時，該三個或更多個MHC分子中的每一個可為相同的。當該複合物包含三個或更多個本發明之胜肽時，該三個或更多個MHC分子中的每一個可為不同的。當該複合物包含三個或更多個MHC分子時，該三個或更多個MHC分子中的一些可為相同的，而該三個更多MHC分子中的另一些可為不同的。
於某些具體實施例中，該複合物包含兩個或更多個本發明之胜肽以及兩個或更多個MHC分子，而且每個胜肽可與該兩個或更多個MHC分子之一結合。亦即，該複合物中所包含的每個胜肽可與該複合物中所包含的一MHC分子結合。較佳為，該複合物中所包含的每個胜肽與該複合物中所包含的不同MHC分子結合。亦即，該複合物中所包含的每個MHC分子較佳與該複合物中所包含的不超過一個胜肽結合。然而，該複合物可包含一個或多個不與一MHC分子結合的本發明之胜肽。該複合物可包含一個或多個不與本發明之胜肽結合的MHC分子。
該複合物中所包含的一個或多個MHC分子可相互連接。例如，該複合物中的一個或多個MHC分子中的每一個可連接至一骨架分子或一奈米顆粒上。於某些具體實施例中，該兩個或更多個MHC分子中的每一個都連接至一葡聚醣骨架上。亦即，該複合物可包含或由一MHC右旋體所組成。將一個或多個MHC分子連接至一葡聚醣骨架的機制為本領域已知的。任何數量的MHC分子都可連接至該葡聚醣骨架上。例如，一個或多個、兩個或多個、三個或多個本發明之胜肽以及三個或多個MHC分子可連接至該葡聚醣骨架上。
於某些具體實施例中，該複合物進一步包含一螢光團，可選擇地其中該螢光團連接至該葡聚醣骨架。螢光團在本領域中為已知的且包括異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)，以及別藻藍蛋白(allophycocyanin, APC)。該複合物可包含任何數量的螢光團。例如，該複合物可包含兩個或更多個、三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個本發明之胜肽，以及三個或更多個，例如四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個螢光團。當該複合物包含多個螢光團時，該複合物中所包含的螢光團可為相同的或不同的。當該複合物包含一骨架，例如一葡聚醣骨架時，該螢光團較佳連接至該葡聚醣骨架。用於將一螢光團連接至一葡聚醣骨架的機制在本領域中為已知的。
本發明還涉及一種確定一個體中現在或先前是否存在冠狀病毒感染之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與自該個體獲得之一樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一分子之間是否存在結合。
例如，該樣品可為一血液樣品、一血清樣品、一血漿樣品、一尿液樣品、一唾液樣品，或透過擦拭存在於該個體中的黏膜表面所獲得之樣品。較佳地，該樣品為一血液樣品、一血清樣品，或一血漿樣品。
於某些具體實施例中，該分子為一抗體或一T細胞受體。例如，該分子可為一抗體或抗體片段。該抗體或抗體片段可位於一B細胞的表面上或包含在一B細胞內。該抗體或抗體片段可在該樣品中游離。 例如，該分子可為一T細胞受體。該T細胞受體可為一CD4 +T細胞受體。該T細胞受體可為一CD8 +T細胞受體。該T細胞受體可在一T細胞的表面上或包含在該T細胞內。該T細胞可為一CD4 +T細胞。該T細胞可為一CD8 +T細胞。
用於檢測一胜肽或含胜肽複合物與一分子之間的結合之方法為本領域中已知的，包括，例如，酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、酵素結合免疫吸附斑點分析法(enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot)，以及流式細胞儀。
於某些具體實施例中，該結合存在時表示現在或先前存在冠狀病毒感染，及/或該結合不存在時表示現在或先前不存在冠狀病毒感染。
於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)。於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞。較佳地，於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內存在 (i) 冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)，以及 (ii) 對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞。
於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體可能不存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)。於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B 細胞、CD8 +T 細胞，及/或 CD4 +T 細胞。較佳地，於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體不存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)，且該個體體內存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞 。
本發明還涉及一種鑑定冠狀病毒特異性T細胞之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與自一個體獲得之樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一T細胞受體之間是否存在結合。
例如，該樣品可為一血液樣品、一血清樣品、一血漿樣品、一尿液樣品、一唾液樣品，或透過擦拭存在於該個體中的黏膜表面所獲得之樣品。較佳地，該樣品為一血液樣品。
該T細胞受體可為一CD4 +T細胞受體。該T細胞受體可為一CD8 +T細胞受體。較佳地，該T細胞受體為一CD8 +T細胞受體。
該T細胞受體可位於一T細胞的表面上或包含在一T細胞中。該T細胞可為一CD4 +T細胞。該T細胞可為一CD8 +T細胞。較佳地，該T細胞為一CD8 +T細胞。
用於檢測一胜肽或含胜肽複合物與一T細胞受體之間的結合之方法為本領域中已知的，包括，例如，酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、酵素結合免疫吸附斑點分析法(ELISpot)，以及流式細胞儀。
該結合的存在可能表示存在一個或多個對冠狀病毒具有特異性的T細胞。不存在該結合可能表示不存在對冠狀病毒具有特異性的T細胞。
於某些具體實施例中，該個體現在正感染冠狀病毒。於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)。於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞。較佳地，於現在存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內存在 (i) 冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)，以及 (ii) 對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、 蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞。
於某些具體實施例中，該個體先前，但並非現在，感染了冠狀病毒。於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體可能不存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)。於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體體內可能存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B 細胞、CD8 +T 細胞，及/或 CD4 +T 細胞。較佳地，於先前存在冠狀病毒感染的情況下，該個體不存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)，且該個體體內存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞 。因此，該個體體內可能不存在冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)，但該個體體內可能存在對冠狀病毒顆粒或其組成分(例如，胜肽、蛋白質)具有特異性的抗體、B細胞、CD8 +T細胞，及/或CD4 +T細胞。
本發明還涉及一種鑑定一冠狀病毒特異性T細胞受體之方法，包括使本發明之胜肽或複合物與一T細胞受體接觸，並確定該胜肽或複合物與該T細胞受體之間是否存在結合。
於某些具體實施例中，存在結合表示該T細胞受體為一冠狀病毒特異性T細胞受體，及/或不存在結合表示該T細胞受體不為一冠狀病毒特異性T細胞受體。
該T細胞受體可為一CD4 +T細胞受體。該T細胞受體可為一CD8 +T細胞受體。較佳地，該T細胞受體為一CD8 +T細胞受體。
該T細胞受體可位於一T細胞的表面上或包含在一T細胞中。該T細胞可為一CD4 +T細胞。該T細胞可為一CD8 +T細胞。較佳地，該T細胞為一CD8 +T細胞。
用於檢測一胜肽或含胜肽複合物與一T細胞受體之間的結合之方法為本領域中已知的，包括，例如，酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、酵素結合免疫吸附斑點分析法(ELISpot)，以及流式細胞儀。
如本文所述之技術及科學術語的含義可被本領域普通技術人員清楚地理解。
如本文所用，術語“約”、“大約”或“大概”當與一數值組合時係指該參考值的正負10%。例如，約1000奈米(nm)的長度係指1000 nm ±100 nm的長度。
應當注意的是，如本文與所附申請專利範圍中使用的，單數形式“一”、“一個”以及“該”包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及“一多核苷酸”時，包括多個此類多核苷酸，提及“該多胜肽”時，包括所提及之一個或多個多胜肽以及本領域技術人員已知的等價物等等。還應注意的是，可撰寫該申請專利範圍以排除任何選擇性的元素。因此，本陳述目的在於作為在引用申請專利範圍要件或使用“否定”限制時使用“單獨”、“僅”等排他性術語的先行基礎。
於某些情況下，使用約定類似於“A、B，以及C中的至少一個等”時，通常這種結構目的在以本領域技術人員會理解該約定的意義上(例如，“具有A、B，以及C中的至少一個的系統”將包括但不限於具有只有A、只有B、只有C、A與B一起、A與C一起、B與C一起，及/或A、B，以及C一起等的系統)。本領域技術人員將進一步理解，實際上呈現兩個或多個替代術語的任何分離詞及/或短語，無論是在描述、申請專利範圍或附圖中，都應被理解為考慮包括其中一個術語、任一術語，或兩個術語的可能性。例如，短語“A 或 B”將被理解為包括“A”或“B”或“A與B”的可能性。
透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了示範而非限制。本領域技術人員根據本發明之公開內容應當理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可對所公開之具體實施例進行多種改變，仍然可獲得相似或類似的結果。
實施例
實施例 1 抗原胜肽與第 I 類 MHC 的結合能力分析
材料與方法
MHC- 胜肽結合分析。MHC-胜肽結合分析用於確定本發明之每種抗原胜肽結合HLA-A201的能力，HLA-A201為人類最常見的人類第I類MHC等位基因(Wills, M.R.等人，J. Virol.，1996年，70:7569-7579；Weekes, M.P.等人，J. Virol.，1999年，73:2099-2108；Reiser, J.B.等人，Acta Cryst. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun.，2009年，65:1157-1161)。根據製造商的說明書進行第I類MHC重折疊分析(easYmer，immunAware Aps公司，哥本哈根，丹麥)。簡言之，將本發明之每種抗原胜肽(SEQ ID NOs：1-26)與
Figure 02_image001
2-微球蛋白輕鏈次單元以及生物素標記的重組HLA-A201於18°C下作用48小時以形成胜肽-HLA複合物。然後，以鏈黴親和素包覆的珠子捕捉該生物素標記的胜肽-HLA複合物，並在流式細胞儀上透過PE綴合的抗人類β2-微球蛋白檢測。巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV) pp65蛋白衍生胜肽 ( 495NLVPMVATV 503；SEQ ID NO: 27；以下稱為CMVpp65 495-503)為一已知的HLA-A201強結合胜肽，對HLA-A201具有45 nM的結合親和力(IC 50) (Hassan C.等人，J. Biol. Chem.，2015年，290:2593-2603)，以CMVpp65 495-503作為陽性對照。在陰性對照中則不使用任何胜肽。
結果
本發明之胜肽具有與人類第 I 類 MHC 結合的能力。如圖1所示，在濃度為3 nM以及8.9 nM下，本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)以及胜肽12 (SEQ ID NO: 12)對HLA-A201的結合親和力均高於CMVpp65 495-503(SEQ ID NO: 27；陽性對照)。具體而言，8.9 nM的胜肽1 (SEQ ID NO: 1)以及胜肽12 (SEQ ID NO: 12)對HLA-A201的結合親和力分別為CMVpp65 495-503(SEQ ID NO: 27；陽性對照)的1.8倍以及2.1倍。
此外，如圖2所示，本發明之所有抗原胜肽(SEQ ID NOs: 1-26) 在8.9 nM的濃度下顯現出對HLA-A201的強結合親和力。
實施例1的結果表示，本發明之胜肽(SEQ ID NOs: 1-26)對HLA-A201具有強結合親和力，HLA-A201為人類中最常見的人類第I類MHC等位基因。因此，當將本發明的胜肽之一施用於人類受試者群體時，其在大多數受試者中結合第I類MHC以觸發隨後的免疫反應。
實施例 2 第 I 類 MHC 四聚體分析
MHC四聚體試劑可快速簡單地檢測抗原特異性T細胞。MHC四聚體的技術是基於MHC-胜肽複合物在單細胞層級上識別抗原特異性T細胞的能力。這項技術使研究人員能夠精確測量在傳染病、癌症以及自體免疫性疾病中所涉及的T細胞反應。抗原特異性T細胞免疫反應的存在被認為是開發疫苗以及治療方法時，抗腫瘤或抗病毒反應的最重要且最相關的結果。由於存在抗原特異性T細胞免疫反應對於開發疫苗的重要性及相關性，於本實施例中使用MHC四聚體測定來檢測抗原特異性T細胞。
材料與方法
第 I 類 MHC 四聚體分析。根據製造商的說明書進行第I類MHC四聚體分析(easYmer
Figure 02_image009
，immunAware Aps公司，哥本哈根，丹麥)。 簡言之，將3 µL的75 µM本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)或胜肽12 (SEQ ID NO: 12)與45 µL的ddH 2O、12 µL的折疊緩衝液(6倍)，以及12 µL的easYmer
Figure 02_image009
混合，並於18°C下作用48小時以獲得約500 nM的折疊單體。然後，將50 µL獲得的折疊單體與相當於2.1 µL的0.2 mg/mL鏈黴親和素螢光團混合，並於4°C下黑暗中作用至少1小時以使單體四聚化。將四聚體在FACS緩衝液(含 1% v/v BSA以及0.1% v/v NaN 3的PBS)中稀釋至30 nM，用於對人類T細胞進行染色。
接下來，將存在於FACS緩衝液中的大約1-2 x 10 5個人類周邊血單核細胞(PBMCs, HLA-A201 +) (STEMCELL Technologies公司，溫哥華，英屬哥倫比亞省，加拿大)接種至96孔微孔盤上。以700 xg離心細胞3分鐘，去除上清液。將細胞以40 µL稀釋的四聚體重新懸浮，並在室溫(room temperature, RT)下避光作用20分鐘。將細胞在冷的FACS緩衝液中清洗一次並以700 xg離心3分鐘。去除上清液後，以抗CD8抗體對細胞進行共染色，於4°C下避光作用30分鐘。以冷的FACS緩衝液清洗細胞兩次，重新懸浮於FACS緩衝液中，並以流式細胞儀(BD LSRFortessa TMX20，富蘭克林湖，紐澤西州，美國)進行分析。
統計分析。使用微軟Excel軟體進行統計分析。以學生氏t檢驗計算顯著性。 * p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001。
結果
本發明之胜肽誘導抗原特異性 T 細胞免疫反應。如圖3所示，可透過人類PBMC (HLA-A201 +)中的第I類MHC四聚體染色來檢測本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)以及胜肽12 (SEQ ID NO: 12)的抗原特異性細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells, CTLs)。結果顯示本發明之抗原胜肽至少誘導抗原特異性CTLs (亦即，CD8 +T細胞)免疫反應。胜肽-四聚體複合物可檢測相應的特異性CTLs，這些反應的CTLs可識別攜帶胜肽的外源生物體或內源細胞。透過識別胜肽的CTLs，可消除該外源生物體或受感染的內源細胞。
此外，結果顯示與胜肽1 (SEQ ID NO: 1)或胜肽12 (SEQ ID NO: 12)結合的第I 類HLA四聚體與人類PBMCs中約2.2至3.3%的CD8 +T細胞結合。由於成人中預估存在約4 x 10 10個CD8 +T細胞(Alanio, C.等人，Blood，2010年，115(18):3718-3725)，因此本發明之胜肽能夠參與成人體內大約0.9至1.3 x 10 9個CD8 +T細胞，以識別病毒感染的細胞並誘導其細胞凋亡。
實施例 3 細胞內細胞激素分析
為了進一步驗證抗原胜肽誘導T細胞反應的能力，使用細胞內細胞激素染色來檢測對本發明之胜肽有反應的CD4 +T輔助細胞所產生的細胞激素。
材料與方法
細胞內細胞激素染色與多參數流式細胞儀分析。將大約1-2 x 10 5個人類PBMCs (HLA-A201 +) (STEMCELL Technologies公司，溫哥華，英屬哥倫比亞省，加拿大)接種至含有X-VIVO TM15培養基的96孔微孔盤上。將本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)或胜肽12 (SEQ ID NO: 12)從250 nM連續稀釋5倍至0.4 nM，以各稀釋濃度的胜肽處理PBMCs。培養基每5天更新一次，在胜肽處理後的第12天，收集細胞並根據製造商的說明書以抗CD4-PerCP-Cy5.5偶聯抗體、抗IFN-
Figure 02_image003
-FITC鉻偶聯抗體，以及抗IL4-PE鉻偶聯抗體進行細胞染色。之後，以冷的FACS緩衝液清洗細胞兩次，重新懸浮於FACS緩衝液中，並以流式細胞儀(BD LSRFortessa TMX20，富蘭克林湖，紐澤西州，美國)進行分析。
結果
本發明之胜肽刺激免疫細胞分泌細胞激素，增強細胞及體液免疫。如圖4A所示，本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)在250 nM濃度下刺激T輔助細胞(CD4 +細胞)分泌更多的IFN-
Figure 02_image003
，並在50 nM濃度下刺激CD4 +細胞分泌更多的IL-4。如圖4B所示，本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)在10 nM以及250 nM濃度下刺激CD4 +細胞分泌更多的IFN-
Figure 02_image003
，並在10 nM濃度下刺激CD4 +細胞分泌更多的IL-4。
結果顯示，本發明之胜肽能夠刺激T輔助細胞分泌細胞激素IFN-
Figure 02_image003
與IL-4，這兩種細胞激素分別代表細胞免疫與體液免疫。此外，本發明之胜肽透過刺激T輔助細胞分泌IFN-
Figure 02_image003
以增強CTL免疫反應，這與實施例2的結果一致。
實施例 4 以肌肉注射胜肽 1 引起之免疫原性的分析
材料與方法
小鼠免疫。為了確定本發明之抗原胜肽的免疫原性，以本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)作為小鼠模型之實例。由Envigo公司(印第安納波利斯，印第安納州，美國)提供的10隻雌性BALB/c小鼠(7-9 週齡)，以肌肉注射45 µg胜肽1 (SEQ ID NO: 1)共3次，每次間隔2週 (於第0、14，以及28天進行注射)。於每次免疫前一天(第-1、13，以及27天)收集血清。於第41天進行最後一次採血。分離的血清儲存於-80°C待血清學分析使用。第一次注射前一天(第-1天，給藥前組)收集的血清樣品以及第三次注射後2週(第41天，給藥後組)收集的血清樣品用於進行抗棘蛋白IgG ELISA分析。
總 IgG ELISA 分析。根據製造商的說明書，使用IgG(總)小鼠未包覆 ELISA套組(型號88-50400，Thermo Fisher Scientific公司，麻州，美國)進行總IgG ELISA分析。簡言之，以在包覆緩衝液中的100 µL/孔的捕獲抗體包覆Nunc TMMaxiSorp TM9018 ELISA盤，並於4°C下作用過夜。以400 µL/孔清洗緩衝液清洗ELISA盤兩次。以250 µL阻隔緩衝液阻隔ELISA盤上的孔，並於室溫下作用2小時後，清洗ELISA盤兩次。以分析緩衝液A對標準品進行連續2倍稀釋以製作標準曲線。然後，在空白孔中加入100 µL/孔的分析緩衝液A，在樣品孔中加入90 µL/孔的分析緩衝液A。以分析緩衝液A對血清樣品稀釋至少10,000倍，然後將10 µL/孔的預稀釋血清樣品添加到適當的孔中。向所有孔中加入50 µL/孔的稀釋檢測抗體。然後，蓋上ELISA盤並於室溫下作用2小時，並在作用後清洗四次。將100 µL/孔的基質溶液添加至每個孔中，並將ELISA盤於室溫下作用15分鐘。之後，向每個孔中加入100 µL終止溶液，並以微量盤分析儀在波長450 nm下測量ELISA盤的吸光值(OD 450 nm)。
抗棘蛋白 IgG ELISA 分析。根據製造商的說明書，使用人類SARS-CoV-2棘蛋白(三聚體) IgG ELISA套組(型號BMS2325，Thermo Fisher Scientific，麻州，美國)進行抗棘蛋白IgG ELISA分析。簡言之，以清洗緩衝液清洗以人類SARS-CoV-2棘蛋白(三聚體)包覆的96 孔盤，然後將90 µL檢測緩衝液與10 µL以檢測緩衝液稀釋的樣品添加至該96 孔盤的孔中。以上蓋覆蓋該96 孔盤並於37°C下作用30分鐘。作用後，以清洗緩衝液清洗該96 孔盤，並將100 µL以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)綴合的抗小鼠檢測抗體(A90-131P，Bethyl公司，德州，美國)加至該96 孔盤的孔中。以上蓋覆蓋該96 孔盤並於37°C下再作用30分鐘。作用後，以清洗緩衝液清洗該96 孔盤，並將100 µL基質溶液(四甲基聯苯胺，Tetramethylbenzidine, TMB)添加至該96 孔盤的孔中。將該96 孔盤於室溫下作用15分鐘。作用後，將100 µL終止溶液添加至該96 孔盤的孔中。然後，以微量盤分析儀在波長450 nm下測量該96 孔盤的吸光值(OD 450 nm)。
統計分析。以Prism 5 (GraphPad Software公司，聖地牙哥，加州，美國)進行統計分析。 t檢驗用於計算顯著性。 * p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001。
結果
以肌肉注射施用本發明之胜肽誘導抗 SARS-CoV-2 棘蛋白的免疫原性。如圖5A所示，以肌肉注射對小鼠施用本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)，誘導了總IgG抗體，其中在第二次給藥後功效達到平原期。結果顯示本發明之胜肽具有免疫原性。
如圖5B所示，以肌肉注射施用本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)至小鼠體內，誘導了抗棘蛋白IgG抗體。結果進一步顯示本發明之胜肽誘導小鼠產生抗人類SARS-CoV-2棘蛋白的特異性抗體。
實施例 5 以肌肉注射胜肽 12 引起之免疫原性的分析
材料與方法
小鼠免疫。為了確定本發明之抗原胜肽的免疫原性，以本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)作為小鼠模型之實例。由樂斯科生物科技公司(台灣) 提供的4隻雌性BALB/c小鼠(7-9 週齡)，以肌肉注射400 µg胜肽12 (SEQ ID NO: 12)共3次，每次間隔2週 (於第0、14，以及28天進行注射)。於第一次注射前一天(第-1天，給藥前組)以及第三次注射後2週(第41天，給藥後組)收集血清。分離的血清儲存於-80°C待血清學分析使用。
總 IgG ELISA 分析。如實施例4中所述進行總IgG ELISA分析。
抗棘蛋白 IgG ELISA 分析。如實施例4中所述進行抗棘蛋白IgG ELISA分析。
統計分析。如實施例4所述進行統計分析。
結果
以肌肉注射施用本發明之胜肽誘導抗 SARS-CoV-2 棘蛋白的免疫原性。如圖6A所示，以肌肉注射對小鼠施用本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)，誘導了總IgG抗體。結果表示本發明之胜肽具有免疫原性。本實施例的結果也對應於實施例3之結果，其中本發明之胜肽刺激T輔助細胞分泌IL-4，而IL-4活化B細胞產生抗體。
如圖6B所示，以肌肉注射施用本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)至小鼠體內，誘導了抗棘蛋白IgG抗體。結果進一步顯示，本發明之胜肽誘導小鼠產生抗人類SARS-CoV-2棘蛋白的特異性抗體。
實施例 6 以口服施用胜肽 1 引起之免疫原性的分析
材料與方法
小鼠免疫。為了確定本發明之抗原胜肽的免疫原性，以本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)作為小鼠模型之實例。由樂斯科生物科技公司(台灣) 提供的5隻雌性BALB/c小鼠(7-9 週齡)，以口服施用200 µL的1 µg/µL胜肽1 (SEQ ID NO: 1；每劑200 µg)與1% (v/v)的77 mg/mLPLCL-PEG-PLCL(Sigma-Aldrich公司，聖路易斯市，密蘇里州，美國)共3次，每次相隔2週(於第0、14，以及28天口服給藥)。於第一次給藥前一天(第-1天，給藥前組)以及第三次給藥後2週(第41天，給藥後組)收集血清。分離的血清儲存於-80°C待血清學分析使用。
總 IgG ELISA 分析。如實施例4中所述進行總IgG ELISA分析。
抗棘蛋白 IgG ELISA 分析。如實施例4中所述進行抗棘的蛋白IgG ELISA分析。
統計分析。如實施例4所述進行統計分析。
結果
以口服施用本發明之胜肽誘導抗 SARS-CoV-2 棘蛋白的免疫原性。如圖7A所示，以口服方式對小鼠施用本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)，誘導了總IgG抗體。結果顯示本發明之胜肽具有免疫原性。
如圖7B所示，以口服方式對小鼠施用本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)，誘導了抗棘蛋白IgG抗體。結果進一步顯示，本發明之胜肽誘導小鼠產生抗人類SARS-CoV-2棘蛋白的特異性抗體。
本發明之胜肽乃是專門設計用於與人類MHC分子結合，因此這些胜肽對HLA-A201具有高親和力(如圖2所示)。然而，本發明之胜肽對小鼠MHC分子也具有較低的親和力。例如，預估本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)對小鼠第H2-Kd類、第H2-Ld類，以及第H-2-Dd類MHC分子分別具有2.2、78.1以及82.5 µM的半數最大抑制濃度(IC 50) (https://www.iedb.org)。由於雖然對小鼠的MHC分子的親和力較低，但本發明之胜肽仍然能夠在小鼠中誘導免疫反應(如圖5A至7B所示)。這些結果顯示，本發明之胜肽不僅能夠引起不同亞型MHC分子的免疫反應，而且能夠在人類受試者中引起更高的免疫反應。
總之，本發明之胜肽對MHC分子，尤其是對第I類MHC分子表現出強結合親和力，誘導CD4 +與CD8 +T細胞反應，參與CTL反應，且透過肌肉注射及口服途徑刺激產生抗人類SARS-CoV-2棘蛋白的特異性抗體。由於本發明之胜肽是基於人類SARS-CoV-2棘蛋白的保守區域設計的，並誘導細胞免疫反應及體液免疫反應，因此這些胜肽是開發抗冠狀病毒(特別是SARS-CoV-2)的廣效疫苗的重要候選者。
當然，在不脫離本發明之範圍的情況下，可對本發明之上述實施例進行許多改變及修改。因此，為了促進科學及有用領域的進步，公開本發明且目的僅在於由所附申請專利範圍所述之範圍來限制。
附圖說明本發明之一個或多個具體實施例，並與書面說明一起用於解釋本發明之原理。在可能的情況下，貫穿附圖使用相同的附圖標記來指代具體實施例的相同或相似元件。
圖 1所示為濃度為1 nM、3 nM，以及8.9 nM的本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)、胜肽12 (SEQ ID NO: 12)，以及CMVpp65 495-503(SEQ ID NO: 27；陽性對照)的第I類HLA結合能力。不同濃度的胜肽與
Figure 02_image001
2-微球蛋白輕鏈次單元以及生物素標記的重組HLA-A201一起培養，以形成胜肽-HLA複合物。然後透過鏈黴親和素(streptavidin)包覆的珠子捕捉該胜肽-HLA複合物，並使用抗人類
Figure 02_image001
2-微球蛋白抗體在流式細胞儀上進行偵測。每個數據點代表對應於所形成的胜肽-HLA複合物數量的平均螢光強度，誤差線代表標準偏差 (n=2)。
圖 2所示為濃度為8.9 nM的本發明之胜肽1-26 (SEQ ID NOs: 1-26)的第I類HLA結合能力。如圖1中所述進行MHC-胜肽結合分析。每個條形代表對應於所形成的胜肽-HLA複合物數量的平均螢光強度，誤差線代表標準偏差 (n=2)。
圖 3所示為本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)與胜肽12 (SEQ ID NO: 12)的第I類MHC四聚體分析結果。以與胜肽1 (SEQ ID NO: 1)或胜肽12 (SEQ ID NO: 12) 結合的第I類MHC四聚體處理人類周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 20分鐘，再以抗CD8抗體共染色，然後以流式細胞儀分析。結果以平均值表示，誤差線代表標準誤差(n=3)。* p＜ 0.05。
圖 4A所示為在以胜肽處理的第12天，CD4 +T細胞對本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)的反應所釋放之細胞激素(IFN-
Figure 02_image003
和IL-4)的分析。以濃度為 0.4、2、10、50、250 nM的胜肽1 (SEQ ID NO: 1)處理人類PBMCs 12 天，然後進行細胞內細胞激素染色以及多參數流式細胞儀分析。每個數據點代表對應於細胞激素量的平均螢光強度，誤差線代表標準誤差(n=3)。
圖 4B所示為在以胜肽處理的第12天，CD4 +T細胞對本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)的反應所釋放之細胞激素(IFN-
Figure 02_image003
和IL-4)的分析。以濃度為 0.4、2、10、50、250 nM的胜肽12 (SEQ ID NO: 12)處理人類PBMCs 12 天，然後進行細胞內細胞激素染色以及多參數流式細胞儀分析。每個數據點代表對應於細胞激素量的平均螢光強度，誤差線代表標準誤差(n=3)。
圖 5A所示為每次免疫後2週BALB/c小鼠體內的總IgG含量。BALB/c小鼠(每組n＝10)每次肌肉注射45 µg的本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)，共注射三次，每次相隔2週(第0、14，以及28天)。在第一次注射前一天以及每次注射後2週(第-1、13、27，以及41天)收集抗血清，並進行總IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的總IgG量。每個盒鬚圖描繪自第25個百分位至第75個百分位的測量值。誤差線對應於第10個百分位以及第90個百分位，每個箱型中的水平線代表平均值。*** p＜ 0.001。
圖 5B所示為第三次免疫後2週BALB/c小鼠體內的抗棘蛋白IgG的效價。如圖5A所述方式免疫小鼠(每組n = 10)，並在第一次注射前一天(第-1天，給藥前)以及第三次注射後2週(第41天，給藥後)收集抗血清，並進行抗棘蛋白IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的抗棘蛋白IgG效價。每個盒鬚圖描繪自第25個百分位至第75個百分位的測量值。誤差線對應於第10個百分位以及第90個百分位，每個箱型中的水平線代表平均值。*** p＜ 0.001。
圖 6A所示為第三次免疫後2週BALB/c小鼠體內的總IgG含量。BALB/c小鼠(每組n = 3~4)每次肌肉注射400 µg本發明之胜肽12 (SEQ ID NO: 12)，共注射三次，每次相隔2週(第0、14，以及28天)。在第一次注射前一天(第-1天，給藥前)以及第三次注射後2週(第41天，給藥後)收集抗血清，並進行總IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的總IgG含量，水平線代表每組的平均值。*** p＜ 0.001。
圖 6B所示為第三次免疫後2週BALB/c小鼠體內的抗棘蛋白IgG的效價。如圖6A所述方式收集抗血清(每組 n = 4)並進行抗棘蛋白IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的抗棘蛋白IgG效價，水平線代表每組的平均值。* p＜ 0.05，*** p＜ 0.001。
圖 7A所示為在第三次免疫後2週BALB/c小鼠體內的總IgG含量。BALB/c小鼠(每組n = 5)每次口服給藥200 µg本發明之胜肽1 (SEQ ID NO: 1)以及1% (v/v)的PLCL-PEG-PLCL，共給藥三次，每次相隔2週(第0、14，以及28天)。在第一次給藥前一天(第-1天，給藥前)以及第三次注射後2週(第41天，給藥後)收集抗血清，並進行總IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的總IgG含量，水平線代表每組的平均值。*** p＜ 0.001。
圖 7B所示為第三次免疫後2週BALB/c小鼠體內的抗棘蛋白IgG的效價。如圖7A所述方法收集抗血清(每組n = 5)並進行抗棘蛋白IgG的ELISA分析。每個點代表每個單獨血清樣品的抗棘蛋白IgG效價，水平線代表每組的平均值。** p＜ 0.01。

Claims (33)

  1. 一種胜肽，包含一胺基酸序列，其係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26以及與SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 26具有至少80%同源性之變異序列，且其中該變異序列與一主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex, MHC)分子結合及/或誘導T細胞與該變異序列胜肽發生交叉反應。
  2. 如請求項1所述之胜肽，其中該胜肽具有與一第I類或第II類MHC分子結合的能力，且其中該胜肽在與該MHC結合時能夠被CD4 +及/或CD8 +T細胞識別。
  3. 一種編碼如請求項1所述之胜肽的核酸。
  4. 一種免疫原性組合物，包含如請求項1所述之胜肽或如請求項3所述之核酸。
  5. 如請求項4所述之免疫原性組合物，進一步包含一藥學上可接受之載劑及/或一佐劑。
  6. 一種特異性識別如請求項1所述之胜肽的抗體。
  7. 一種能夠與如請求項1所述之胜肽結合的T細胞受體。
  8. 如請求項7所述之T細胞受體，其中該胜肽與一MHC分子結合。
  9. 一種重組宿主細胞，包含一組成分，其係選自由下列所組成之群組：如請求項1所述之胜肽、如請求項3所述之核酸、如請求項6所述之抗體或其片段，以及如請求項7所述之T細胞受體或其片段。
  10. 如請求項9所述之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係選自一樹突細胞、一T細胞，或一自然殺手(natural killer, NK)細胞。
  11. 一種產生活化的T淋巴細胞之體外或離體方法，包括使T細胞與裝載抗原的人類第I類或第II類MHC分子在體外或離體接觸一段足夠以抗原特異性方式活化該T細胞的時間，該MHC分子係於一合適的抗原呈現細胞或一模擬一抗原呈現細胞的人造構築物上表現，其中該抗原為如請求項1所述之胜肽。
  12. 一種透過如請求項11所述之方法產生之活化的T淋巴細胞，其中該活化的T淋巴細胞選擇性地識別呈現如請求項1所述之胜肽的細胞。
  13. 一種藥物組合物，包含至少一種活性成分，其係選自由下列所組成之群組：如請求項1所述之胜肽、如請求項3所述之核酸、如請求項6所述之抗體或其片段、如請求項7所述之T細胞受體或其片段、如請求項9所述之重組宿主細胞，以及如請求項12所述之活化的T淋巴細胞。
  14. 如請求項13所述之藥物組合物，進一步包含一藥學上可接受之載劑，及/或一藥學上可接受之賦形劑及/或穩定劑。
  15. 一種如請求項4所述之免疫原性組合物或如請求項13所述之藥物組合物在製備用於預防或治療一有需要的受試者中的一病原體感染的藥物中之用途。
  16. 如請求項15所述之用途，其中該病原體感染係由一冠狀病毒所引起的。
  17. 如請求項16所述之用途，其中該冠狀病毒為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。
  18. 一種如請求項4所述之免疫原性組合物在製備用於產生抗冠狀病毒抗體的藥物中之用途。
  19. 如請求項18所述之用途，其中該抗冠狀病毒抗體的特徵在於對一冠狀病毒具有結合親和力。
  20. 如請求項19所述之用途，其中該冠狀病毒為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)。
  21. 一種複合物，包含與一MHC分子結合之如請求項1所述之胜肽。
  22. 如請求項21所述之複合物，其中該複合物包含兩個或更多個如請求項1所述之胜肽以及兩個或更多個MHC分子。
  23. 如請求項22所述之複合物，其中該兩個或更多個胜肽中的每一種與該兩個或更多個MHC分子之一結合。
  24. 如請求項22所述之複合物，其中該兩個或更多個MHC分子中的每一種皆連接至一葡聚醣骨架。
  25. 如請求項24所述之複合物，其中該複合物進一步包含一螢光團，可選擇地其中該螢光團連接至該葡聚醣骨架上。
  26. 一種確定一個體中現在或先前是否存在冠狀病毒感染之方法，包括使如請求項1所述之胜肽或如請求項21所述之複合物與自該個體獲得之一樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一分子之間是否存在結合。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該分子為一抗體或一T細胞受體。
  28. 如請求項26所述之方法，其中該結合存在時表示現在或先前存在冠狀病毒感染，及/或該結合不存在時表示現在或先前不存在冠狀病毒感染。
  29. 一種鑑定冠狀病毒特異性T細胞之方法，包括使如請求項1所述之胜肽或如請求項21所述之複合物與自一個體獲得之一樣品接觸，並確定該胜肽或複合物與該樣品中包含的一T細胞受體之間是否存在結合。
  30. 如請求項29所述之方法，其中該個體現在感染了冠狀病毒。
  31. 如請求項29所述之方法，其中該個體先前，但並非現在，感染了冠狀病毒。
  32. 一種鑑定一冠狀病毒特異性T細胞受體之方法，包括使如請求項1所述之胜肽或如請求項21所述之複合物與一T細胞受體接觸，並確定該胜肽或複合物與該T細胞受體之間是否存在結合。
  33. 如請求項32所述之方法，其中存在結合表示該T細胞受體為一冠狀病毒特異性T細胞受體，及/或不存在結合表示該T細胞受體不為一冠狀病毒特異性T細胞受體。
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