TW202300506A - 抗新型冠狀病毒之免疫組合物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)之免疫組合物，特別是一種包含重組SARS-CoV-2 棘蛋白及佐劑之免疫組合物。

Description

抗新型冠狀病毒之免疫組合物

本案主張於2020年6月18日提出之美國臨時申請第63/040,696號以及於2021年3月1日提出之PCT國際申請第PCT/US21/20277號之優先權與權益，其揭露之內容係以引用方式全文併入本文。

本發明涉及一種抗嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2，又稱新型冠狀病毒)之免疫組合物，特別是一種包含重組SARS-CoV-2棘蛋白及佐劑之免疫組合物。

世界衛生組織(World Health Organization, WHO)於2019年12月31日接獲警示，在中國湖北省武漢市發現數起肺炎病例。該病毒病原體與已知的任何其他病毒都不相符，該病毒後來被正式命名為“嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2，又稱新型冠狀病毒)”。由SARS-CoV-2引起的疾病的正式名稱為2019年冠狀病毒病(COVID-19)。COVID-19的常見症狀包含發燒、乾咳、疲勞、疲倦、肌肉或身體疼痛、喉嚨痛、腹瀉、結膜炎、頭痛、味覺或嗅覺喪失、皮膚起疹，以及呼吸急促。雖然大多數的病例症狀輕微，但有些患者會發展為急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，這是由細胞激素風暴、多重器官衰竭、感染性休克，以及血栓所引起的。首例確診的新型冠狀病毒感染死亡案例發生在2020年1月9日，而截至2021年6月13日為止，WHO已接獲通報175,306,598例COVID-19確診病例，其中3,792,777例死亡。而這些數字仍在快速增長。

需要施打COVID-19疫苗才能在不限制日常活動的情況下降低感染SARS-CoV-2的風險。尤其是迫切需要一種能夠快速誘導針對SARS-CoV-2的免疫反應的COVID-19疫苗。

於一方面，本發明提供一種抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫原性組合物，包含一抗原性重組蛋白以及一佐劑，該佐劑係選自由含鋁佐劑、未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(cytosine-phosphate-guanosine, CpG)模體及其組合所組成之群組，其中該抗原性重組蛋白基本上由SARS-CoV-2棘蛋白的第14個至第1208個殘基所組成，且第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，第682個至第685個殘基被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”，以及在C端具有一T4纖維蛋白(fibritin)三聚化結構域。

於另一方面，本發明提供一種在一有此需要的受試者中引發抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫反應之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

於另一方面，本發明提供一種保護一有此需要的受試者免於感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

於另一方面，本發明提供一種預防一有此需要的受試者感染COVID-19疾病之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

於另一方面，本發明提供一種本發明之免疫原性組合物在製備用於在一有此需要的受試者中引發針對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫反應的藥物之用途。

於另一方面，本發明提供一種本發明之免疫原性組合物在製備用於保護一有此需要的受試者免於感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的藥物之用途。

於另一方面，本發明提供一種本發明之免疫原性組合物在製備用於預防一有此需要的受試者感染COVID-19疾病的藥物之用途。

透過結合以下附圖對較佳具體實施例之描述，這些及其他方面將變得顯而易見。

本發明涉及一種抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫原性組合物。該免疫原性組合物包含一抗原性重組蛋白以及一佐劑，該佐劑包含一含鋁佐劑及/或一未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(CpG)模體。該抗原性重組蛋白包含SARS-CoV-2棘蛋白的第14個至第1208個殘基，其中第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，第682個至第685個殘基被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”，以及在其C端具有一T4纖維蛋白三聚化結構域。

於某些具體實施例中，該C端具有的T4纖維蛋白三聚化結構域包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 2具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該SARS-CoV-2棘蛋白的第14個至第1208個殘基，其中第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，且第682個至第685個殘基被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”，包含如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 1具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該抗原性重組蛋白包含如SEQ ID NO: 5或6所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 5或6具有90%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該含鋁佐劑包含氫氧化鋁、羥基氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁、羥基磷酸硫酸鋁、無定形羥基磷酸硫酸鋁、硫酸鋁鉀、單硬脂酸鋁或其組合。

於某些具體實施例中，一0.5 ml劑量的該免疫原性組合物包含約250至約500 μg的Al ³⁺，或約375 μg的Al ³⁺。

於某些具體實施例中，該未甲基化的CpG模體包含一如SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或其組合所示之合成寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)。

於某些具體實施例中，一0.5 ml劑量的該免疫原性組合物包含約750至約3000 μg的寡核苷酸，或其中該免疫原性組合物包含約750 μg、約1500 μg，或約3000 μg的寡核苷酸。

本發明還涉及一種在一有此需要的受試者中引發抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫反應之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

本發明還涉及一種保護一有此需要的受試者免於感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

本發明還涉及一種預防一有此需要的受試者感染COVID-19疾病之方法，包含對該受試者施用一有效量的本發明之免疫原性組合物。

本發明還涉及一種本發明之免疫原性組合物在製備用於在一有此需要的受試者中引發針對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫反應的藥物之用途。

於某些具體實施例中，該免疫反應包含產生抗SARS-CoV-2的中和抗體以及偏向Th1的免疫反應。

本發明還涉及一種本發明之免疫原性組合物在製備用於保護一有此需要的受試者免於感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的藥物之用途。

本發明還涉及一種本發明之免疫原性組合物在製備用於預防一有此需要的受試者感染COVID-19疾病的藥物之用途。

於某些具體實施例中，該免疫原性組合物係透過肌肉注射施用。

本領域普通技術人員可清楚地理解本文描述之技術及科學術語之含義。

如本文所用，除非另有說明，否則單數形式“一”、“一個”以及“該”等包含複數形式。例如，“一種”賦形劑包含一種或多種賦形劑。

如本文所用之詞彙“包含”是開放式的，表示此類實施例可包含額外的元素。反之，詞彙“由…組成”是封閉式的，表示此類實施例不包含額外的元素(痕量雜質除外)。詞彙“基本上由…組成”是部分封閉式的，表示此類實施例還可包含非實質改變此類實施例的基本特徵之元素。

如本文可互換使用，術語“多核苷酸”以及“寡核苷酸”包含單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA)、雙鏈DNA (double-stranded DNA, dsDNA)、單鏈RNA (single-stranded RNA, ssRNA)，以及雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)、修飾的寡核苷酸以及寡核苷或其組合。寡核苷酸可為線性或環狀構造，或者該寡核苷酸可包含線性及環狀片段。寡核苷酸通常為透過磷酸二酯鍵連接的核苷聚合物，雖然在寡核苷酸中亦可使用替代的鍵，例如硫代磷酸酯。核苷係由與糖鍵合的嘌呤(腺嘌呤(adenine, A)或鳥嘌呤(guanine, G)或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(thymine, T)、胞嘧啶(cytosine, C)或尿嘧啶(uracil, U)或其衍生物)鹼基所組成。DNA中的四個核苷單位(或鹼基)稱為去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷，以及去氧胞苷。核苷酸為一核苷的磷酸酯。

如本文所用，術語“嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2，又稱為新型冠狀病毒)”係指導致2019年冠狀病毒病(COVID-19)的冠狀病毒株。SARS-CoV-2為一種正股單鏈RNA病毒，基因組大小為29,903個鹼基。每個SARS-CoV-2病毒顆粒的直徑為50-200 nm，具有四種結構蛋白，分別為棘(spike, S)、外膜(envelope, E)、膜(membrane, M)，以及核鞘(nucleocapsid, N)蛋白。N蛋白包含RNA基因組，S、E以及M蛋白共同形成病毒外膜。棘蛋白是負責讓病毒附著在宿主細胞膜上並與之融合的蛋白質。具體而言，棘蛋白的S1次單元催化附著作用，亦即S2次單元與宿主細胞膜的融合。

如本文所用，術語“抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫原性組合物”係指用於刺激或引發針對SARS-CoV-2的免疫反應之組合物。免疫反應包含，但不限於，產生抗SARS-CoV-2的中和抗體以及偏向Th1的免疫反應。

如本文所用，術語“含鋁佐劑”係指包含鋁的佐劑。於某些具體實施例中，該含鋁佐劑包含，但不限於，氫氧化鋁、羥基氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁、羥基磷酸硫酸鋁、無定形羥基磷酸硫酸鋁、硫酸鋁鉀、單硬脂酸鋁或其組合。於某些具體實施例中，該含鋁佐劑為美國食品暨藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)核准施用於人類的含鋁佐劑。於某些具體實施例中，該含鋁佐劑為經FDA核准施用於人類的氫氧化鋁佐劑。於某些具體實施例中，該含鋁佐劑為經FDA核准施用於人類的磷酸鋁佐劑。

如本文所用，術語“未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(CpG)模體”係指含有CpG的寡核苷酸，其中C未甲基化，且有助於在體外、體內及/或離體測量下可測得之免疫反應。於某些具體實施例中，該含CpG的寡核苷酸包含依照以下公式的回文六聚體：5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’。於某些較佳的具體實施例中，該未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(CpG)模體具有如SEQ ID NO:8 (5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3')所示之寡核苷酸，其中CGs中的Cs未甲基化。於某些具體實施例中，該含CpG的寡核苷酸含有TCG，其中C未甲基化，且其長度為8至100個核苷酸，較佳為8至50個核苷酸，或較佳為8至25個核苷酸。於某些較佳具體實施例中，該未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(CpG)模體具有如SEQ ID NO: 9 (5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3')所示之寡核苷酸，其中TCGs中的Cs未甲基化。該未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(CpG)模體的實例還包含，但不限於，5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 10)、5'-TCCATGGACGTTCCTGAGCGTT-3' (SEQ ID NO: 11)、5'-TCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-3' (SEQ ID NO: 12)，以及5'-TCGTCGACGA TCGGCGCGCGCCG-3' (SEQ ID NO: 13)。除非另有說明，本文所述之含CpG的寡核苷酸以其藥學上可接受的鹽類形式存在。於一較佳具體實施例中，該含CpG的寡核苷酸為鈉鹽形式。

物質的一“有效量”或一“足夠量”為足以產生有益的或期望的結果，包含臨床結果的量，因此，一“有效量”取決於其應用的上下文。在施用一免疫原性組合物的情況下，一有效量包含足夠的佐劑以及SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白以引發免疫反應。可施用一或多個劑量來達到一有效量。

術語“個體”以及“受試者”係指哺乳動物。“哺乳動物”包含，但不限於，人類、非人類靈長類動物(如，猴子)、農場動物、運動動物、囓齒動物(如，小鼠及大鼠)，以及寵物(如，狗及貓)。

如本文所用，關於一免疫原性組合物的術語“劑量”係指一受試者在任何時間服用(給予或接受)的該免疫原性組合物的一確定量部分。

如本文所用，術語“分離的”以及“純化的”係指從與其天然相關的至少一種組成分中移出(例如，從其原始環境中移除)的材料。當用於指一重組蛋白質時，術語“分離的”係指已從產生該蛋白質的宿主細胞的培養基中移出的蛋白質。

對一反應或參數的“刺激”包含當與除了目標參數之外的其他相同條件相比，或替代地，與另一條件相比時引發及/或增強該反應或參數(例如，相較於不存在TLR激動劑的條件下，存在TLR激動劑時TLR的訊息傳遞增加)。例如，對一免疫反應的“刺激”表示該反應的增加。取決於測量的參數，增加可為自5倍至500倍或更多，或者自5、10、50 或100倍至500、1,000、5,000或10,000倍。

如本文所用，術語“免疫”係指增加一哺乳動物受試者對抗原的反應並因此提高其抵抗或克服感染的能力之過程。

如本文所用，術語“接種疫苗”係指將疫苗引入一哺乳動物受試者的體內。

“佐劑”係指當添加至一包含一抗原的組合物中時，在暴露於受體內時非特異性地增強或加強該受體對該抗原的免疫反應之物質。

透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了示範而非限制。本領域技術人員根據本發明之公開內容應當理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可對所公開之具體實施例進行多種改變，仍然可獲得相似或類似的結果。

實施例

實施例 1 抗 SARS-CoV-2 的免疫原性組合物之製備

將具有編碼以下蛋白序列(SEQ ID NO: 14)的多核苷酸的質體轉染至ExpiCHO-S 細胞(Thermo Fisher Scientific公司，沃爾瑟姆市，麻州，美國)中：編碼SARS-CoV-2棘蛋白(Wuhan-Hu-1株；GenBank編號：MN908947)的第1個至第1208個殘基，其中第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，且弗林蛋白酶(furin)切割位點(第682個至第685個殘基)被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”，以及在該蛋白的C端具有一T4纖維蛋白三聚化結構域(SEQ ID NO: 2)、一HRV3C蛋白酶切割位點 (SEQ ID NO: 3)、一8x His標籤，以及一Twin-Strep標籤(SEQ ID NO: 4)。

6天後收穫細胞培養物，並使用Strep-Tactin樹脂(IBA Lifesciences公司，哥廷根鎮，德國)從上清液中純化蛋白質。將HRV3C蛋白酶(1%，重量百分比)添加至該蛋白質中，並於4°C下進行反應過夜。使用Superose 6 16/70管(GE Healthcare Biosciences公司，芝加哥，伊利諾州，美國)進一步純化被切割的蛋白質，所得為純化的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(或簡稱S-2P重組蛋白)。然後將純化的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(SEQ ID NO: 5或6)與未甲基化的CpG模體(CpG 1018，SEQ ID NO: 8)及/或含鋁佐劑，如氫氧化鋁(Al(OH) ₃)或磷酸鋁(AlPO ₄)作為抗SARS-CoV-2的免疫原性組合物。

實施例 2 免疫原性組合物在小鼠中抗 SARS-CoV-2 的免疫原性

本實施例提供臨床前研究之描述，以評估從實施例1獲得之免疫原性組合物在小鼠中抗SARS-CoV-2的免疫原性。

A. 初步試驗 1 – 以磷酸鋁配製的 SARS-CoV-2 S-2P 重組蛋白

材料與方法

小鼠免疫。6-8週齡的BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣) (N = 5/組)在第0週與第3週接種SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白。將在磷酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline, PBS)中稀釋的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(終濃度為1 μg/mL或10 μg/mL)與磷酸鋁(終濃度為0.5 mg 鋁/mL)混合。小鼠以肌肉注射接種 100 μL上述混合物(每條後腿各接種50 μL)。最後一次免疫兩週後，收集血清用於測量抗體反應。

假病毒的生產。使用QuikChange XL套組(Stratagene公司，聖地牙哥市，加州，美國)合成編碼Wuhan-Hu-1病毒株棘蛋白(SEQ ID NO: 7)的 cDNA，然後插入CMV/R質體。 以定序確認CMV/R-SARS-CoV-2棘蛋白質體。HEK293T細胞獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，並於37 °C、5% CO ₂的條件下，在補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、2 mM麩醯胺酸，以及1%青黴素/鏈黴素的DMEM培養基中培養。為了生產SARS-CoV-2假病毒，使用Fugene 6轉染試劑(Promega公司，麥迪遜市，威斯康辛州，美國)將CMV/R-SARS-CoV-2棘蛋白質體與包裝質體pCMVDR8.2以及轉導質體pHR CMV-Luc共轉染至HEK293T細胞。轉染後72小時，收集、過濾並在-80°C下冷凍上清液。

假病毒的感染性以及中和試驗。於37 °C、5% CO ₂的條件下，將Huh7.5細胞(RRID: CVCL_7927)培養於補充有10% FBS、2 mM麩醯胺酸，以及1%青黴素/鏈黴素的DMEM培養基中。以Huh7.5細胞評估假病毒的感染性，該細胞在96孔黑色/白色細胞培養盤(isoplates) (PerkinElmer公司，沃爾瑟姆市，麻州，美國)中培養過夜。將假病毒以兩倍連續稀釋後加入靜置的Huh7.5細胞中，進行三重複試驗。培養2小時後，加入新鮮培養基。培養72小時後裂解細胞，並加入螢光素酶受質(Promega公司)。在SpectramaxL微量盤冷光儀(Molecular Devices公司，聖荷西市，加州，美國)上，以波長570 nm處的相對螢光素酶單位(relative luciferase units, RLU)測量螢光素酶活性。針對中和實驗，將連續稀釋的小鼠血清(1:40、四倍、八倍稀釋)與各種假病毒株混合，這些假病毒株先前已被定量至目標濃度50,000 RLU。取每個稀釋濃度三重複試驗的RLU讀值之平均值製成Sigmoids曲線；未被感染的細胞視為100%中和，將僅以病毒轉導的細胞視為0%中和，計算50%中和力價(IC ₅₀)。

結果

中和試驗的結果如圖1所示。以磷酸鋁配製的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(0.1 μg/小鼠以及1 μg/小鼠)比單獨(不含磷酸鋁)的重組蛋白(0.1 μg/小鼠以及1 μg/小鼠)引起更大的中和作用。這些數據顯示，磷酸鋁可顯著提高 SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白作為冠狀病毒病(COVID-19)疫苗抗原的免疫原性。

B. 初步試驗 2 – 以 CpG 與氫氧化鋁的組合配製的 SARS-CoV-2 S-2P 重組蛋白

材料與方法

小鼠免疫。 6-8週齡BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣)(N = 6/組)在第0週及第3週接種SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白。將在PBS中稀釋的 SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(終濃度為10 μg或50 μg/mL)與CpG 1018 (SEQ ID NO: 8) (終濃度為0.1 mg/mL)、氫氧化鋁(終濃度為0.5 mg鋁/mL)，或 CpG 1018 (終濃度為0.1 mg/mL)以及氫氧化鋁(終濃度為0.5 mg鋁/mL)的組合混合。小鼠以肌肉注射接種100 μL上述混合物(每條後腿各接種50 μL)。最後一次免疫兩週後，收集血清用於測量抗體反應。

假病毒的產生、假病毒的感染性，以及中和試驗。方法如A部分所述。

結果

中和試驗結果如圖2所示。由CpG以及氫氧化鋁組合配製的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白在低劑量(1 µg/小鼠)以及較高劑量(5 µg/小鼠)下皆引發最高的中和活性。此外，僅以氫氧化鋁配製的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白(1 µg/小鼠)比僅以CpG配製的重組蛋白(1 µg/小鼠以及5 µg/小鼠)引發更大的中和作用。僅以CpG配製的重組蛋白以劑量依賴性方式引發中和活性。這些數據顯示，CpG及/或氫氧化鋁顯著提高SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白作為冠狀病毒病 (COVID-19)疫苗抗原的免疫原性。

C. 含佐劑的穩定融合前 SARS-CoV-2 棘蛋白抗原之開發

材料與方法

假病毒的生產與定量。為了生產SARS-CoV-2假病毒，使用TransIT-LT1轉染試劑(Mirus Bio公司)，將表現全長野生型Wuhan-Hu-1株SARS-CoV-2棘蛋白(SEQ ID NO: 7)的質體與包裝質體pCMV

8.91及報導質體pLAS2w.FLuc.Ppuro (RNA技術平台，中央研究院，台灣)共轉染至HEK293T細胞中。透過將Wuhan-Hu-1參考病毒株上的第23403個核苷酸從A變更為G，以定點誘變產生D614G變異株。透過省略p2019-nCoV棘蛋白(野生型)產生模擬假病毒。轉染後72小時，收集、過濾並於-80 °C下冷凍上清液。以細胞對慢病毒極限稀釋的反應進行細胞活性分析來估算SARS-CoV-2假型慢病毒的轉導單位 (transduction unit, TU)。簡言之，在進行慢病毒轉導的前1天，將穩定表現人類 ACE2基因的HEK-293 T細胞接種在96孔盤上。為了定量假病毒，將不同量的假病毒加入含有聚凝胺的培養基中。將96孔盤於37°C下以1100 xg進行離心感染30分鐘。於37°C下培養細胞16小時後，移除含有病毒及聚凝胺的培養基，並以含有2.5 µg/ml嘌呤黴素的新鮮完整DMEM培養基代替。以嘌呤黴素處理48小時後，移除培養基並根據製造商的說明使用10%阿爾瑪藍(Alarma Blue)試劑檢測細胞活性。將未被感染的細胞(未經嘌呤黴素處理)的存活率設為100%。以存活細胞對稀釋的病毒劑量做圖來確定病毒力價(轉導單位)。

基於假病毒的中和試驗。將HEK293-hAce2細胞(2 x 10 ⁴個細胞/孔)接種於96孔白色細胞培養盤中並培養過夜。於56°C下加熱血清30分鐘以滅活補體，並以補充有2% FBS的MEM培養基稀釋血清，起始稀釋倍數為20，然後進行兩倍連續稀釋(共8次稀釋步驟，最終稀釋濃度為1:5120)。稀釋的血清與等體積的假病毒(1000 TU)混合，並於37°C下培養1小時，然後添加到帶有細胞的培養盤中。培養1小時後，將培養基更換為50 µL新鮮培養基。隔天將培養基更換為100 µL新鮮培養基。在感染後72小時裂解細胞並測量相對螢光素酶單位(RLU)。以Tecan i-control (Infinite 500)檢測螢光素酶活性。將未被感染的細胞視為100%中和，將僅以病毒轉導的細胞視為0%中和，計算達到50%以及90%抑制效果時的稀釋的倍數(即為ID ₅₀與ID ₉₀)。確認ID ₅₀與ID ₉₀的幾何平均力價(GMT)，因為當ID ₅₀力價一直在檢測上限而達到飽和時，可以ID ₉₀力價進行判斷。

野生型 SARS-CoV-2 病毒的中和作用。SARS-CoV-2病毒的中和試驗如先前所報導的方法進行(Huang等人，J. Clin. Microbiol. 58(8): e01068-e1120, 2020年)。Vero E6細胞(2.5 x 10 ⁴個細胞/孔)接種於96孔盤中並培養過夜。於 56°C下加熱血清30分鐘以滅活補體，並以無血清的MEM培養基稀釋血清，起始稀釋倍數為20，然後進行兩倍連續稀釋，共進行11次稀釋步驟，最終稀釋濃度為1:40,960。稀釋後的血清與等體積的100 TCID ₅₀/50 µL的SARS-CoV-2病毒 (hCoV-19/Taiwan/CGMH-CGU-01/2020病毒株，GenBank登錄號為MT192759)混合，並於37°C下培養2小時。然後將該血清病毒混合物加入到含有Vero E6細胞的96孔盤中，並在含有2% FBS的MEM培養基中於37°C下培養5天。培養後，對每個孔加入4%甲醛以固定細胞10分鐘，並以0.1%結晶紫染色以進行可視化。以Reed-Muench公式計算其NT ₅₀力價。

小鼠免疫。 雌性BALB/c與C57BL/6小鼠獲自中央研究院國家實驗動物中心(台灣)以及樂斯科生物科技股份有限公司(台灣)。針對抗原製劑，SARS-CoV-2 S-2P蛋白與等體積的CpG 1018 (SEQ ID NO: 8)、氫氧化鋁、PBS，或CpG 1018加氫氧化鋁混合。如先前所述(Pallesen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114(35): E7348–E7357, 2017年)，對6-9週齡的小鼠進行兩次免疫接種，每次接種間隔3週(每隻小鼠的左右股四頭肌各肌肉注射50 µL)。使用包覆S-2P重組蛋白抗原的96孔盤，以直接ELISA檢測總體血清抗棘蛋白的IgG抗體力價，並使用包覆含有受體結合結構域(receptor binding domain, RBD)區域的棘蛋白的大腸桿菌表現片段的96孔盤，以直接ELISA檢測總體血清抗RBD的IgG抗體力價。

細胞激素分析。第二次注射後兩週，對小鼠實施安樂死，並且如先前所述之方法(Lu等人，Immunology, 130(2): 254–261, 2010年)分離脾細胞並以S-2P重組蛋白(2 µg/孔)刺激。為了檢測IFN-

、IL-2、IL-4，以及IL-5，收集96孔微孔盤內的培養上清液，使用小鼠IFN-

Quantikine ELISA套組、小鼠IL-2 Quantikine ELISA套組、小鼠IL-4 Quantikine ELISA套組，以及小鼠IL-5 Quantikine ELISA套組(R&D System公司)透過ELISA分析這些細胞激素的含量。以Multiskan GO分析儀(Thermo Fisher Scientific公司)讀取OD450值。

以 Sprague Dawley (SD) 大鼠進行肌肉注射 ( intramuscular injection , IM) 單次及二次的劑量範圍之研究。Crl:CD Sprague Dawley (SD)大鼠獲自樂斯科生物科技股份有限公司(台灣)。動物實驗在啟弘生物科技股份有限公司(台灣)的生物安全性測試設施中進行。以單獨含有1500 µg CpG 1018佐劑或含有750 µg CpG 1018與375 µg氫氧化鋁的組合佐劑的5 µg、25 µg或50 µg的S-2P重組蛋白對6-8週齡的SD大鼠進行免疫。在實驗第1天(針對單劑量與雙劑量研究)以及第15天(針對雙劑量研究)對每隻大鼠進行肌肉注射(0.25 mL/部位，左右股四頭肌共2個部位)測試品或載劑對照品。觀察期分別為14天(針對單劑量研究)以及28天(針對雙劑量研究)。評估的參數包含在存活期間的臨床徵狀、局部刺激檢查、垂死/死亡率、體溫、體重，以及食物的攝取。採集血液樣本用於血液學檢驗，包含凝血測試以及血清化學。對所有動物實施安樂死並進行屍體解剖，以對注射部位以及肺部進行大體病變檢查、器官重量，以及組織病理學評估。

統計分析。針對中和試驗，條形高度表示幾何平均力價，誤差線表示95%信賴區間。針對細胞激素與大鼠數據，條形高度或符號表示平均值，而誤差線表示標準差(SD)。虛線表示檢測的下限及上限。使用Prism 6.01 (GraphPad公司)的分析套裝軟體進行統計分析。在含有不同佐劑的相同S-2P重組蛋白劑量或具有不同抗原劑量的相同佐劑系統下比較數據。使用Kruskal-Wallis與校正的Dunn氏多重比較檢驗計算2個以上實驗組之間的非參數檢驗。Mann-Whitney U檢驗則用於比較兩個實驗組。使用Spearman氏等級相關係數計算抗體效價以及中和效價之間的相關性。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001。

結果

以含有 CpG 1018 與氫氧化鋁佐劑的 S-2P 重組蛋白誘導有效的中和抗體。以ExpiCHO系統作為S-2P重組蛋白抗原的表現系統以建立用於臨床研究以及商業生產的穩定選殖株。在冷凍電子顯微鏡下，CHO細胞產生的S-2P重組蛋白的結構顯示出典型的棘三聚體，類似於在293細胞中表現的SARS-CoV-2棘蛋白(Wrapp等人，Science, 367(6483): 1260–1263, 2020年)，這代表CHO細胞可用於生產S-2P重組蛋白。接著，檢查誘導偏向Th1反應的CpG 1018在臨床應用上的潛力。並將氫氧化鋁與CpG 1018一起進行測試，因為氫氧化鋁已被發現在與CpG組合使用時會增強CpG佐劑的效力，同時保留CpG誘導偏向Th1反應的特性(Thomas等人，Hum. Vaccin., 5(2): 79–84, 2009年)。以第一次注射後3週或第二次注射後2週抽取的血清進行假病毒中和試驗。在第一次注射後3週，當小鼠以含有CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的1 µg以及5 µg的S-2P重組蛋白進行免疫接種時，已經觀察到中和活性。在第二次注射後2週，以含有CpG 1018、氫氧化鋁以及CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的1 µg S-2P重組蛋白進行免疫接種，結果達到50%抑制效果時的稀釋濃度(ID ₅₀)的幾何平均力價(GMT)分別為245、3109，以及5120 (圖3)。以5 μg S-2P重組蛋白進行免疫的BALB/c (圖3)以及C57BL/6小鼠中觀察到類似的趨勢。

然後檢查來自這些小鼠的血清中抗棘蛋白的IgG抗體的含量。相較於只以CpG 1018為佐劑的組別，以CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的組別具有顯著較高的抗棘蛋白的IgG抗體力價(圖4)。為了確認抗體對棘蛋白中關鍵的受體結合結構域(RBD)的活性，檢查免疫血清中的抗RBD的IgG抗體，結果與抗棘蛋白的IgG抗體力價相似，以CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的S-2P重組蛋白誘導的IgG抗體力價最高。如Spearman氏等級相關係數為0.6486所示，抗棘蛋白的IgG抗體力價以及抗RBD的IgG抗體力價之間存在中等相關性。進一步以中和試驗測試免疫血清對野生型SARS-CoV-2病毒株的中和能力。濃度為1 µg的S-2P重組蛋白能夠誘發小鼠產生抑制SARS-CoV-2病毒株的中和抗體，雖然其對SARS-CoV-2病毒株的抑制效力低​於對假病毒的抑制效力(圖3、圖5)。以CpG 1018、氫氧化鋁以及CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的1 μg S-2P重組蛋白所誘導產生的抗體的ID ₅₀的幾何平均力價(GMT)分別約為60、250，以及1500 (圖5)。另外還產生帶有目前顯性突變D614G棘蛋白的假病毒，以含有CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的S-2P重組蛋白免疫的小鼠所產生的中和抗體皆能有效對抗帶有野生型D614以及突變D614G的棘蛋白的假病毒(圖6)。發現野生型病毒以及假病毒的中和力價以及總體抗棘蛋白的IgG抗體力價具有高度相關，其Spearman氏等級相關係數大於0.8。

CpG 1018 誘導 Th1 免疫反應。為了確認CpG 1018是否可在疫苗佐劑系統中誘導Th1反應，將小鼠以S-2P重組蛋白以及氫氧化鋁、CpG 1018或這兩者的組合為佐劑進行免疫，並取出其脾細胞以測量參與Th1及Th2反應的細胞激素。一如預期，以氫氧化鋁為佐劑的S-2P重組蛋白誘導的IFN-

及IL-2數量有限，而IFN-

及IL-2為Th1反應的代表性細胞激素。相較之下，在高劑量抗原加上CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的組別中，檢測到IFN-

及IL-2的增加最為顯著。針對Th2反應，雖然在S-2P重組蛋白加上氫氧化鋁為佐劑的組別中觀察到IL-4、IL-5以及IL-6 的含量增加，但添加CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的組別中則觀察到IL-5及IL-6的含量被抑制。在S-2P重組蛋白加上CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的組別中，IFN-

/IL-4、IFN-

/IL-5，以及IFN-

/IL-6的比率分別增加約36、130，以及2倍，此一結果強烈表示偏向Th1的免疫反應(圖7)。這些結果顯示，CpG 1018對於將細胞調節的免疫反應導向Th1反應的方向上效果優於氫氧化鋁，同時並保持高抗體含量。

S-2P 重組蛋白不會對大鼠產生全身性不良反應。為了說明候選疫苗的安全性及潛在毒性，對SD大鼠施用以1500 µg CpG 1018或750 µg CpG 1018與375 µg氫氧化鋁的組合為佐劑的5 µg、25 µg或50 µg的S-2P重組蛋白，以進行單劑量及雙劑量研究。在雌性及雄性大鼠中皆未觀察到因為施用單劑量的S-2P重組蛋白(不論有或無佐劑)所造成的死亡、臨床症狀異常，以及體重變化、體溫、攝取食物等方面的差異。在單劑量及雙劑量的研究中皆發現兩種性別的大鼠在施打疫苗後4小時或24小時內體溫升高；然而，這些體溫的變化是和緩的，而且包括對照組(PBS)在內的所有處理組別中，兩種性別的大鼠在施打疫苗後48小時內體溫都恢復正常。大多數雄性及雌性大鼠在施打單劑量及雙劑量後，體內的器官皆未觀察到明顯的損傷，除了一隻雄性大鼠之外，但該雄性大鼠的器官損傷被認為與疫苗無關。總之，SD大鼠以CpG 1018或CpG 1018與氫氧化鋁的組合為佐劑的S-2P重組蛋白肌肉注射一次或兩次並未引起任何全身性不良反應。

結果顯示，對小鼠注射兩次由CpG 1018與氫氧化鋁佐劑以及融合前棘蛋白(S-2P重組蛋白)所組成的次單位疫苗可有效誘導小鼠產生中和抗體以抗表現野生型以及D614G變異棘蛋白的假病毒以及野生型SARS-CoV-2病毒。S-2P重組蛋白與CpG 1018及氫氧化鋁的組合在小鼠中引發了具有高中和抗體含量的Th1主導的免疫反應，且在大鼠中未顯現出主要的不良反應。因此，於本實施例中，本案發明人證明S-2P重組蛋白與CpG 1018及氫氧化鋁的佐劑組合誘導了有效的偏向Th1的免疫反應，以防止野生型病毒感染，同時保持高抗體含量，該些抗體顯示出對病毒變異株的交叉中和反應。因此，本發明之抗SARS-CoV-2的免疫原性組合物可作為減輕全球COVID-19大流行負擔的理想候選疫苗。

實施例 3 抗 SARS-CoV-2 的免疫原性組合物對倉鼠提供 SARS-CoV-2 病毒攻毒的保護效果

材料與方法

基於假病毒的中和試驗以及 IgG ELISA。構築表現Wuhan-Hu-1病毒株的SARS-CoV-2棘蛋白的慢病毒，並如實施例2所述進行中和試驗。簡言之，將HEK293-hACE2細胞接種在96孔白色細胞培養盤中並培養過夜。將接種疫苗以及未接種疫苗的倉鼠的血清進行熱滅活，並在補充有2% FBS的MEM培養基中稀釋，起始稀釋倍數為20，然後進行2倍連續稀釋，共進行8次稀釋步驟，最終稀釋至1:5120。稀釋的血清與等體積的假病毒(1,000 TU)混合，並於37°C下作用1小時，然後添加至上述含有細胞的培養盤中。在感染後72小時裂解細胞並測量相對螢光素酶單位(RLU)。未被感染的細胞視為100%中和，將僅以病毒轉導的細胞視為0%中和，以計算達到50%以及90%抑制效果時的稀釋的倍數(即為ID ₅₀與ID ₉₀)。使用塗覆S-2P重組蛋白抗原的96孔盤，以直接ELISA檢測總體血清抗棘蛋白的IgG抗體力價。

倉鼠的免疫及攻毒試驗。研究開始前自國家實驗動物中心(台北，台灣)獲得6-9週齡的雌性金色敘利亞倉鼠。來自不同窩的倉鼠被隨機分為四組(每組N=10)：分別以載劑對照(PBS)、以150 µg CpG 1018與75 μg氫氧化鋁為佐劑的1或5 µg的S-2P重組蛋白，或單獨使用佐劑對倉鼠進行肌肉注射兩次，每次間隔3週。在第二次免疫後2週，經由頜下靜脈對倉鼠採血以確認中和抗體的存在。倉鼠在第二次免疫後4週以1 x 10 ⁴PFU的SARS-CoV-2 TCDC#4 病毒株(hCoV-19/Taiwan/4/2020，GISAID登錄號：EPI_ISL_411927)進行鼻內攻毒，每隻倉鼠攻毒100 μL。將倉鼠分為兩群，在攻毒後第3天及第6天分別實施安樂死以進行屍體剖檢及組織取樣。感染後每天記錄每隻倉鼠的體重及存活率。在攻毒後的第3天及第6天，以二氧化碳對倉鼠實施安樂死。收集右肺用於進行病毒載量測定(RNA力價以及TCID ₅₀分析)。左肺則固定於4%多聚甲醛中進行組織病理學檢查。

以細胞培養感染分析 (TCID ₅₀) 定量肺組織中的病毒力價。使用均質機將倉鼠的中、下以及腔後肺葉在600 μl含有2% FBS以及1%青黴素/鏈黴素的DMEM培養基中均質。組織均質液以15,000 rpm離心5分鐘，收集上清液用於活病毒定量。簡言之，將每個樣本的10倍連續稀釋液加至Vero E6細胞單層上並培養4天，每個樣本進行四重複試驗。然後以10%甲醛固定細胞並以0.5%結晶紫染色20分鐘。以自來水洗滌細胞培養盤並進行感染評分。以Reed與Muench法(Reed and Muench, American Journal of Epidemiology, 27(3): 493-497, 1938年)計算50%組織培養感染劑量(TCID ₅₀)/mL。

以即時 RT-PCR 對 SARS-CoV-2 病毒 RNA 進行定量。使用以SARS-CoV-2基因組的外膜(E)基因的第26,141個至第26,253個核苷酸區域為目標的特異性引子，以TaqMan即時RT-PCR方法(Corman等人，Eurosurveillance. 25(3): 2000045, 2020年)測量SARS-CoV-2病毒的RNA含量。除了正向引子E-Sarbeco-F1 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3' (SEQ ID NO: 15)以及反向引子 E-Sarbeco-R2 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' (SEQ ID NO: 16)之外，並使用探針E-Sarbeco-P1 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3' (SEQ ID NO: 17)。根據製造商的說明書，使用RNeasy Mini套組(QIAGEN公司，德國)從每個肺樣本中收集總共30 µL RNA溶液。將5 µL RNA樣本加入至25 µL含有Superscript III一步法RT-PCR系統與Platinum Taq聚合酶(Thermo Fisher Scientific公司，美國)的混合物中。最終反應混合物包含400 nM的正向及反向引子、200 nM探針、1.6 mM去氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP)、4 mM硫酸鎂、50 nM ROX參考染劑，以及1 μL的酶混合物。使用一步法PCR的循環條件進行PCR：55°C 10分鐘以合成第一股cDNA，然後在94°C下作用3分鐘，接著進行45個擴增循環：94°C 15 秒以及58°C 30秒。以Applied Biosystems 7500即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司，美國)收集並計算數據。合成的113 bp寡核苷酸片段作為qPCR標準以評估病毒基因組的複製數。寡核苷酸由基龍米克斯生物科技股份有限公司(台北，台灣)合成。

結果

倉鼠作為 SARS-CoV-2 病毒攻毒模型。為了開發S2-P重組蛋白疫苗的SARS-CoV-2病毒倉鼠攻毒模型，先進行初步研究以確定攻毒實驗的最佳病毒劑量。未接種疫苗的倉鼠接種10 ³、10 ⁴或10 ⁵PFU的SARS-CoV-2病毒，並在感染後第3天或第6天實施安樂死以進行組織取樣。在感染10 ³至10 ⁵PFU的SARS-CoV-2病毒後，倉鼠的體重減輕具有劑量依賴性。感染10 ³PFU病毒的倉鼠體重增加，而感染10 ⁴及10 ⁵PFU病毒的倉鼠在感染後6天(dpi)體重減輕的情況逐漸變嚴重。然而，感染10 ³至10 ⁵PFU的SARS-CoV-2病毒的倉鼠在感染後3天及6天時測量到的病毒基因組RNA含量以及病毒力價並無顯著差異。所有劑量的病毒都導致肺部病變增加，即使在感染10 ³PFU病毒而體重未減輕的倉鼠中也是如此。肺部病理評分及肺部病毒載量亦未具有病毒接種劑量依賴性的效果。因此，以10 ⁴PFU的病毒進行病毒攻毒研究，因為該濃度對於接種而言在臨床症狀及病毒力價之間提供了足夠的平衡。

對倉鼠施用以 CpG 1018 及氫氧化鋁為佐劑的 S-2P 重組蛋白可誘導高含量的中和抗體。間隔21天接受兩次免疫接種的倉鼠被分成四組，分別接種：載劑對照(僅PBS)、佐劑組、低劑量(LD)或高劑量(HD)的S-2P重組蛋白以及CpG 1018與氫氧化鋁(S-2P+CpG 1018+氫氧化鋁)。這四組倉鼠在接種疫苗後未觀察到體重變化上的差異。在第二次免疫後十四天，在低劑量(LD)及高劑量(HD)組的倉鼠中皆發現高含量的中和抗體力價，其90%抑制稀釋度(ID ₉₀)的幾何平均力價(GMT)分別為2,226及1,783 (圖8A)。低劑量(LD)及高劑量(HD)組的抗棘蛋白的IgG抗體含量很高，甚至好幾個單獨的樣本達到了檢測上限，這兩組抗棘蛋白的IgG抗體的幾何平均力價(GMT)分別為1,492,959以及1,198,315 (圖8B)。總之，即使在低劑量下，S-2P+CpG 1018+氫氧化鋁也能在倉鼠中誘導有效程度的免疫原性。

添加佐劑的 S-2P 重組蛋白可保護倉鼠在 SARS-CoV-2 病毒攻毒後免於受臨床症狀及病毒載量的影響。倉鼠在第二次免疫後4週接受10 ⁴PFU的SARS-CoV-2病毒攻毒，並在感染後3或6天(dpi)追蹤體重。在感染後3或6天犧牲動物以進行病毒載量及組織病理學分析。低劑量(LD)及高劑量(HD)疫苗接種組在病毒攻毒後3或6天未出現體重減輕，反而在感染後6天平均體重分別增加了5 g及3.8 g。該二劑量組都在感染後6天具有最顯著的保護作用，而載體對照組以及佐劑組的體重皆明顯減輕。以病毒RNA以及TCID ₅₀分析測量肺部病毒載量，結果顯示低劑量(LD)及高劑量(HD)疫苗接種組的倉鼠在感染後3天的病毒RNA以及病毒力價皆顯著降低，並在感染後6天降至檢測下限以下(圖9A-9B)。請注意，由於倉鼠的自然免疫反應，對照組及佐劑組的倉鼠的病毒載量，尤其是透過TCID ₅₀測量的病毒力價在感染後6天皆顯著下降(圖9A-9B)。分析肺部切片並將病理評分製成圖表(圖10)。對照組及實驗組在感染後3天沒有差異；然而，在感染後6天，相較於高劑量(HD)抗原/佐劑免疫組，載劑對照組及佐劑組具有顯著增加的肺部病變，包含廣泛的免疫細胞浸潤以及瀰漫性肺泡損傷(圖10)。這些結果顯示，S-2P+CpG 1018+氫氧化鋁可誘導出強大的免疫反應，能夠抑制肺部病毒載量並防止受感染的倉鼠體重減輕及產生肺部病變。

相較於對照組的倉鼠肺部在感染後6天因病毒所造成的瀰漫性肺泡損傷(載劑對照組及佐劑組的平均分數為4.09，評分為中度至重度)，S-2P+CpG 1018+氫氧化鋁免疫組中的所有倉鼠都受到保護，肺部病變顯著減少[低劑量(LD)及高劑量(HD)疫苗接種組的平均分數為1.72，一般評分為極輕度至輕度]。這項研究的意義不僅在於證明疫苗在活體動物內的功效，還有其安全性。病毒攻毒研究可以評估候選疫苗對增加疾病的風險。免疫組的組織病理學評分與未進行攻毒的動物的評分沒有區別，表示並不存在因為疫苗所增加的病變。本實施例中的研究結果提供了更多支持該候選疫苗臨床開發進展的數據。

實施例 4 以 CpG 為佐劑的 S-2P 重組蛋白次單位疫苗 “MVC-COV1901” 在人類中體內的安全性及免疫原性

本實施例提供在健康人類受試者中進行的第I期臨床試驗研究，以評估SARS-CoV-2次單位疫苗(亦即，本發明之免疫原性組合物)的安全性及免疫原性。該SARS-CoV-2次單位疫苗在本文中稱為“S-2P+CpG 1018+氫氧化鋁”或“MVC-COV1901”，該疫苗的詳細描述請參閱實施例1。

疫苗。MVC-COV1901被配製為含有三種不同劑量的SARS-CoV-2重組棘(S)蛋白，並以CpG 1018與氫氧化鋁作為佐劑。每劑MVC-COV1901疫苗含有5、15或25 μg的S-2P重組蛋白，並以750 μg CpG 1018以及375 μg (Al ³⁺含量相當於375 μg)的氫氧化鋁為佐劑，作為單劑0.5 mL肌肉注射(IM)給藥。

受試者。本研究目標為招募45名受試者。以20至49歲的健康成年人為符合資格的受試者。資格是根據病史、體格檢查、實驗室檢查，以及調查人員的臨床判斷所確定的。排除標準包含已知可能暴露於SARS CoV-1或SARS CoV-2病毒的病史、接種過任何其他COVID-19疫苗、免疫功能受損、自體免疫性疾病病史、未受控制的HIV、HBV或HCV感染、自身抗體測試異常、發熱或在首次施用後2天內出現急性疾病，以及在首次給藥後14天內出現急性呼吸道疾病。

研究設計。本研究為一項第I期先期性、開放式(受試者及研究者都知道測試的藥物為何)、單中心的臨床研究，目的在於評估該SARS-CoV-2疫苗MVC-COV1901的安全性及免疫原性。本研究為一項劑量遞增的研究，涉及三組不同的20至49歲受試者。每個子階段包含15名受試者。群組1a、1b以及1c分別施用三種不同劑量(5、15以及25 μg)的S-2P重組蛋白。疫苗接種計劃包含接種兩劑，以肌肉注射方式在實驗第1天及第29天，即相隔28天，將疫苗注射於非慣用手臂的三角肌中。

群組1a：招募四位前哨受試者接受含有5 μg S-2P重組蛋白的疫苗，以評估該疫苗的初步安全性。若該4名前哨受試者在第一次接種後7天內沒有發生 ≥ 3級不良事件(adverse events, AEs)或嚴重不良事件(serious adverse events, SAEs)，則將繼續對第1a期中其餘受試者進行接種。

群組1b：招募另外4名前哨受試者接受含有15 μg S-2P重組蛋白的疫苗。若該4名前哨受試者在第一次接種後7天內沒有發生 ≥ 3級不良事件(AEs)或嚴重不良事件(SAEs) ，則將繼續對第1b期中其餘受試者進行接種。

群組1c：招募另外4名前哨受試者接受含有25 μg S-2P重組蛋白的疫苗。若該4名前哨受試者在第一次接種後7天內沒有發生 ≥ 3級不良事件(AEs)或嚴重不良事件(SAEs) ，則將繼續對第1c期中其餘受試者進行接種。

在疫苗接種前後進行生命跡象及心電圖(electrocardiogram, ECG)檢查。受試者在每次接種疫苗後至少觀察30分鐘以確認有無任何即時的不良事件(AE)，並被要求在每次接種後7天內將預設的局部(疼痛、紅斑、腫脹/硬結)及全身(發燒、肌痛、不適/疲勞、噁心/嘔吐、腹瀉)不良事件(AEs)記錄在受試者的每日記錄卡中。在每次接種後28天內記錄非預設的不良事件(AEs)；在整個研究期間(大約7個月)記錄所有其他不良事件(AEs)、嚴重不良事件(SAEs)以及特別關注的不良事件(adverse events of special interest, AESIs)。收集血清樣本用於血液學、生物化學以及免疫學評估。

免疫原性終點是在第一次接種後14天(第15天)與28天(第29天)，以及第二次接種後第14天(第43天)與第28天(第57天)，以及在第二次接種後90天與180天評估中和抗體力價以及結合抗體力價。另外還測試了35名康復的COVID-19患者的恢復期血清樣本(Mitek COVID-19 Panel 1.1以及COVID-19 Panel 1.4，獲自Access Biologicals有限公司，維斯塔市，加州，美國)。在第二次接種後28天以IFN-γ ELISpot以及IL-4 ELISpot評估細胞免疫反應。

SARS-CoV-2 棘蛋白特異性免疫球蛋白 G (IgG)：使用包覆S-2P重組蛋白抗原的訂製的96孔盤，透過直接酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)檢測總體血清抗棘蛋白的IgG抗體力價。

SARS-CoV-2 假病毒中和試驗：對待測樣本進行連續稀釋(初始稀釋倍數為1:20，接著進行兩倍稀釋，最終稀釋倍數為1:2560)。將稀釋的血清與等體積的假病毒(1000 TU)混合並培養，然後加入含有HEK293-hACE2細胞(1 x 10 ⁴個細胞/孔)的細胞培養盤。透過裂解細胞及測量相對螢光素酶單位(RLU)計算進入細胞的假病毒的數量。將未被感染的細胞視為100%中和，將僅以病毒轉導的細胞視為0%中和，計算達到50%抑制效果時的稀釋的倍數(ID ₅₀)，並確定ID ₅₀的幾何平均力價(GMT)。

野生型 SARS-CoV-2 中和試驗。將SARS-CoV-2病毒(hCoV-19/Taiwan/CGMH-CGU-01/2020，GenBank登錄號MT192759)進行滴定得到其 TCID ₅₀，並將Vero E6細胞(2.5 x 10 ⁴個細胞/孔)接種在96孔盤中並培養。血清進行兩倍稀釋，最終稀釋倍數為1:8192，稀釋後的血清與等體積的含有100 TCID ₅₀的病毒溶液混合。培養血清-病毒混合物，然後加入至含有Vero E6細胞的培養盤中，然後進一步培養。中和效價定義為能夠抑制50%細胞病變效應的最高稀釋倍數(CPE NT ₅₀)，係使用Reed-Muench方法計算。以英國國家生物製品檢定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC；波特斯巴，英國)的參考血清樣本20/130作為比較物，使用相同的驗證測試進行分析。

細胞免疫反應。以ELISpot分析確定抗原特異性IFN-γ或IL-4分泌斑點形成單位(spot forming units, SFU)的數量。冷凍保存的周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)迅速解凍並靜置過夜。以每孔1 x 10 ⁵個細胞進行IFN-γ ELISpot分析(人類IFN-γ ELISpot套組，Mabtech公司，斯德哥爾摩，瑞典)，或以每孔2 x 10 ⁵個細胞進行IL-4 ELISpot分析(人類IFN-γ ELISpot套組，Mabtech公司，斯德哥爾摩，瑞典)。以胜肽庫(PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S1，Miltenyi Biotec公司)刺激細胞，該胜肽庫主要由覆蓋SARS-CoV-2棘蛋白N端的S1結構域序列的15聚體序列所組成，該些聚體序列之間具有11個胺基酸重疊，並於37°C下培養該受刺激的細胞24-48小時。以CD3-2單株抗體(mAb)刺激的細胞作為陽性對照。依照使用手冊檢測IFN-γ或IL-4的釋放，並使用CTL自動ELISpot讀取儀對斑點進行計數。計算在胜肽庫中刺激三重複算出的斑點形成單位(spot-forming units, SFU)的平均值，並透過減去陰性對照重複(對照培養基)的平均值進行標準化。結果表示為每百萬個周邊血單核細胞(PBMC)內有多少斑點形成單位(SFU)。

統計分析。對至少接種1劑疫苗的總接種群(total vaccinated group, TVG)族群進行安全性分析。免疫原性終點包含抗原特異性免疫球蛋白以及野生型病毒與假病毒中和抗體力價的幾何平均力價(GMT)與血清轉化率(seroconversion rate, SCR)。血清轉化率(SCR)定義為從基礎線或檢測下限(lower limit of detection, LoD)的一半(如果測不到基處線的話)為基準，樣品中抗體力價增加 ≥ 該基準的4倍的受試者的百分比。以兩側95% CI呈現幾何平均力價(GMT)與血清轉化率(SCR)。以IFN-γ ELISpot及IL-4 ELISpot確定的平均值表示抗原特異性細胞免疫反應。

結果

安全性。在本研究截止紀錄數據時沒有發生嚴重不良事件(SAEs)或特別關注的不良事件(AESIs)。未修改或中斷本研究。圖11總結發生的預設的不良事件(AEs)。最常出現的局部不良事件(AEs)是疼痛/壓痛(80.0%)，而不適/疲勞(28.9%)是所有處理組中最常見的全身性不良事件(AEs)。除了施打25 μg劑量組中出現一例不適/疲勞之外，所有局部及全身性不良事件(AEs)都是輕微的。沒有受試者發燒。第一次及第二次接種後引起的預設的不良事件(AEs)相似。對安全實驗室數值(safety laboratory values)的評估、心電圖解釋，以及其他非預設的不良事件未顯現出特別需要關注的地方。

體液免疫反應。體液免疫原性結果總結於圖12A至12C。如圖12A所示，第二次接種後與棘蛋白結合的IgG抗體力價迅速增加，所有受試者在第43天與第57天出現血清轉化。抗體的幾何平均力價(GMT)在第43天達到高峰，5 μg、15 μg以及25 μg 劑量組的高峰值分別為7178.2 (95% CI: 4240.3 - 12151.7)、7746.1 (95% CI: 5530.2 - 10849.8)、11220.6 (95% CI: 8325.7)。於第43天，5 μg、15 μg以及25 μg劑量組的抗體幾何平均力價(GMT)範圍為恢復期血清樣本的抗體幾何平均力價(GMT)的3.3至5.1倍(2179.6, [95% CI: 1240.9 - 3828.4])。

如圖12B所示，在接種疫苗之前，在測試血清濃度的下限(1:20稀釋)的標準下，沒有受試者具有可檢出的假病毒中和力價(ID ₅₀)。到了第43天，5 μg、15 μg以及25 μg劑量組的假病毒中和力價(ID ₅₀)達到高峰，其幾何平均力價(GMT)分別為538.5 (95% CI: 261.9 - 1107.0)、993.1 (95% CI: 655.0 - 1505.7)，以及1905.8 (95% CI: 1601.7 - 2267.8)。所有受試者(100%)在第二次接種後都發生血清轉化。第43天，5 μg、15 μg以及25 μg劑量組的抗體幾何平均力價(GMT)範圍為恢復期血清樣本的抗體幾何平均力價(GMT)的1.25至4.4倍(430.5, [95% CI: 274.9 - 674.0])。

野生型SARS-CoV-2病毒的中和抗體力價的結果總結於圖12C中。在接種疫苗之前，在該分析中測試的血清濃度下限(1:8 稀釋)的標準下，沒有受試者具有可檢出的野生型病毒中和效價(NT ₅₀)。在第二次接種後，在15 μg及25 μg 劑量組的所有受試者的血清樣本中確認具有中和反應。在第43天，5 μg、15 μg以及25 μg劑量組的抗體幾何平均力價(GMT)分別為33.3 (95% CI：18.5 - 59.9)、76.3 (95% CI：53.7 - 108.3)，以及167.4 (95% CI：122.1 - 229.6)。在第57天，15 μg及25 μg劑量組的抗體幾何平均力價(GMT)相似：分別為52.2 (95% CI：37.9 - 71.8)以及81.9 (95% CI：55.8 - 120.2)。在第43天，5 μg、15 μg以及25 μg劑量組的抗體幾何平均力價(GMT)範圍為恢復期血清樣本的抗體幾何平均力價(GMT)的0.8、1.8以及3.9倍(42.7，[95%CI：26.4 - 69.0]；力價範圍從未檢出至631.0)。15 μg及25 μg劑量組的所有受試者在第43天及第57天發生血清轉化；有些受試者的中和效價甚至類似於NIBSC的參考血清20/130 (281.8)。

細胞免疫反應。細胞免疫反應的結果總結於圖13中。所有受試者在接種疫苗之前具有的分泌IFN-γ的T細胞最少。到了第57天，在接種5 μg、15 μg以及25 μg疫苗的受試者中，每百萬個細胞中分別觀察到平均161.3、85.5以及94.9個分泌IFN-γ的T細胞。在接種疫苗之前，所有受試者具有的分泌IL-4的T細胞最少。到了第57天，在接種5 μg、15 μg以及25 μg疫苗的受試者中，每百萬個細胞中分別觀察到平均24.1、16.0以及31.3個分泌IL-4的T細胞。由MVC-COV1901誘導的細胞免疫反應顯示，產生IFN-γ的細胞數量顯著增加，表示存在偏向Th1的免疫反應。

總之，預設的不良事件大多是輕微且相似的。沒有受試者發燒。在接種第二劑後，評估的三個劑量中15 μg及25 μg劑量皆引發高中和抗體反應，所有受試者都發生血清轉換以及偏向Th1的T細胞免疫反應。因此，15 μg S-2P重組蛋白以及CpG 1018與氫氧化鋁的組合被認為足以引發明顯的體液免疫反應。該結果還顯示，MVC-COV1901疫苗具有良好的耐受性並引發強大的免疫反應，適合進一步開發。

實施例 5 以 CpG 為佐劑的 S-2P 重組蛋白次單位疫苗 “MVC-COV1901” 對 SARS-CoV-2 高關注變異株 ( Variants of Concern, VoCs) 的中和能力之評估

自COVID-19大流行開始以來，每隔一段時間就會檢測到變異株。其中一些被稱為高關注變異株(VoCs)，這些高關注變異株(VoCs)被發現在關鍵受體結合結構域(receptor-binding domain, RBD)中具有突變，受體結合結構域(RBD)為抗體進行識別及中和的主要目標。這些高關注變異株(VoCs)中最具代表性的是B.1.1.7 (Alpha變異株)、B.1.351 (Bata變異株)，以及P1 (Gamma 變異株)，這三個變異株在棘蛋白的受體結合結構域(RBD)中都帶有N501Y突變。發現具有這些突變的高關注變異株(VoCs)會降低單株抗體及疫苗誘導的抗體的中和能力，這可能會使目前的治療方法以及疫苗無效(Garcia-Beltran等人，Cell, 184(9):2372-2383.e9, 2021年)。本實施例提供之研究涉及使用來自兩個來源的血清以調查MVC-COV1901疫苗抗SARS-CoV-2高關注變異株(VoCs)的中和能力：來自動物毒理學研究的大鼠血清，以及來自第I期臨床試驗的人類血清。

A. MVC-COV1901 疫苗在大鼠中引發抗 SARS-CoV-2高關注變異株(VoCs) 的中和能力。

材料與方法

動物研究。Crl:CD Sprague Dawley (SD)大鼠獲自樂斯科生物科技股份有限公司(台北，台灣)，並在啟弘生物科技股份有限公司(新北市，台灣)的生物安全性測試設施中進行研究。SD大鼠的免疫如實施例2的C部分中所述進行。簡言之，以1,500 µg CpG 1018與750 µg氫氧化鋁為佐劑的5、25或50 µg S-2P重組蛋白，每隔兩週對大鼠進行3次免疫。在第二次免疫後兩週(第29天)或第三次免疫後兩週(第43天)收集血清，並以表現SARS-CoV-2武漢野生型(WT)或B.1.351變異株(Beta變異株)的棘蛋白的假病毒進行中和試驗。

假病毒中和試驗。構築表現SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1野生型病毒株(WT)的棘蛋白的慢病毒，並如實施例 2 C部分所述進行中和試驗。以相同方式構築表現B.1.351變異株(Beta 變異株；GenBank登錄號MZ314998.1)的棘蛋白的慢病毒，但將野生型棘蛋白序列替換為變異株的序列。

統計分析。以Prism 6.01 (GraphPad Software公司，聖地牙哥市，加州，美國)進行統計分析。使用Tukey多重比較檢驗的雙因子變異數分析(Two-way ANOVA)以及校正的Dunn氏多重比較檢驗的Kruskal-Wallis法計算顯著性，如各自的圖式簡單說明中所述。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。

結果

MVC-COV1901 在大鼠中誘導的抗體有效地中和變異株，效果與中和野生型病毒相當。如圖14所示，在第29天及第43天，抗體對於抗B.1.351 (Beta變異株)病毒仍維持有效，雖然力價稍低於抗野生型病毒。值得注意的是，第三次免疫後兩週(第43天)採樣的血清的ID ₅₀及ID ₉₀的幾何平均力價(GMT)高於第二次免疫後兩週(第29天)採樣的血清，表示第三次免疫對這種高關注變異株(VoCs)的中和活性有提高的趨勢。這種效果在低劑量(5 µg)組尤其明顯。到了第43天，所有的劑量組別對於抗B.1.351變異株的ID ₅₀(圖14，左圖)及ID ₉₀(圖14，右圖)達到相似的程度。

總之，大鼠研究顯示，透過接種三劑疫苗的方法，本案發明人能夠在三種劑量組別中誘導相似程度的中和效價。有鑑於接種三劑的方案能產生對抗該變異株的高免疫原性，這些結果可外推至人類，因為額外劑量的免疫接種可能是提高對高關注變異株(VoCs)免疫力的一種策略。

B. MVC-COV1901 疫苗在人體內引發抗 SARS-CoV-2高關注變異株(VoCs) 的中和能力。

材料與方法

臨床試驗。45名20至49歲的人類受試者參加一項先期性、開放式、單中心劑量遞增的第I期臨床研究。該研究為20至49歲的受試者提供三個獨立的子階段：第1a期、第1b期以及第1c期。每個子階段有15名受試者。該臨床試驗針對該三個獨立的子階段分別採用三種不同劑量：第1a期為低劑量(LD；5 µg)、第1b期為中劑量(MD；15 µg)，以及第1c期為高劑量(HD；25 µg)的S-2P重組蛋白，各期並以750 µg CpG 1018與375 µg氫氧化鋁(含有約375 µg的Al ³⁺)作為佐劑。疫苗接種計劃包含接種兩劑，以肌肉注射方式在實驗第1天及第29天，即相隔28天，分別將0.5 mL疫苗注射於非慣用手臂的三角肌中。於第57天(第二次接種後4週)，採集血清樣本用於假病毒中和試驗。該臨床試驗的細節請參閱實施例4。

假病毒中和試驗。構築表現SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1野生型病毒株(WT)的棘蛋白的慢病毒，並如實施例 2 C部分所述進行中和試驗。以相同方式構築表現D614G、B.1.1.7 (Alpha 變異株；GenBank登錄號MZ314997.1)、B.1.351 (Beta變異株；GenBank登錄號MZ314998.1)、P1 (Gamma變異株；GenBank登錄號LR963075)，以及B.1.429 (Epsilon變異株；GenBank登錄號MW591579)的棘蛋白的慢病毒，但將野生型棘蛋白序列替換為各變異株的序列。

統計分析。統計分析方法如上一節所述進行。

結果

來自接種 MVC-COV1901 的人類抗血清可有效中和 D614G 、 B.1.1.7 (Alpha) 、 P1 (Gamma) 變異株，但對 B.1.351 (Beta) 及 B.1.429 (Epsilon) 變異株的中和作用較為減弱。圖15A-C所示為來自人類血清的假病毒中和試驗的數據，其中包含野生型、D614G、B.1.1.7 (Alpha)、B.1.351 (Beta)、P1 (Gamma)，以及B.1.429 (Epsilon)變異株。雖然相較於抗野生型病毒而言，所有劑量組(LD、MD以及HD組)抗D614G及B.1.1.7 (Alpha變異株)的中和抗體力價稍為下降(圖15A-C)，但降低的程度不具統計學意義。然而，當比較野生型病毒以及B.1.351 (Beta變異株)時，所有劑量組(LD、MD以及HD組)抗B.1.351 (Beta變異株)的中和抗體力價皆顯著降低。相較之下，所有劑量組(LD、MD以及HD組)抗P1 (Gamma變異株)的中和抗體力價皆高於抗野生型病毒的中和抗體力價。雖然當比較野生型病毒株與B.1.429 (Epsilon變異株)時，低劑量(LD)及中劑量(MD)組抗B.1.429 (Epsilon變異株)的中和抗體力價顯著降低(圖15A-B)，但高劑量(HD)組抗B.1.429 (Epsilon變異株)的中和抗體力價與抗野生型病毒株的中和抗體力價沒有顯著差異(圖15C)。當繪製每個劑量組別抗該些變異株的中和抗體力價時，可觀察到劑量依賴性效應(圖15A-C)。透過使用更高劑量的抗原，可增加抗B.1.351 (Beta變異株)、P1 (Gamma變異株)以及B.1.429 (Epsilon變異株)的中和抗體力價。

總之，第I期臨床試驗中接種疫苗的人類受試者對B.1.351 (Beta變異株)、P1 (Gamma變異株)以及B.1.429 (Epsilon變異株)顯示出降低但仍明顯的中和能力(ID ₅₀)，尤其是較高劑量的組別。結果顯示，接種兩劑MVC-COV1901能夠以劑量依賴性方式引發抗SARS-CoV-2變異株的中和抗體。

當然，在不脫離本發明之範圍的情況下，可對本發明之上述實施例進行許多改變及修改。因此，為了促進科學及有用領域的進步，公開本發明且目的僅在於由所附申請專利範圍所述之範圍來限制。

附圖說明本發明之一個或多個具體實施例，並與書面說明一起用於解釋本發明之原理。在可能的情況下，貫穿附圖使用相同的附圖標記來指代具體實施例的相同或相似元件。

圖1所示為使用以含有或不含有磷酸鋁佐劑的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白免疫的小鼠的血清進行中和試驗之結果。

圖2所示為使用以不同配方的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白免疫的小鼠的血清進行中和試驗之結果。

圖3所示為在第二次注射後2週時，由CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白所誘導的中和抗體。BALB/c小鼠(每組N = 6隻)以2個劑量的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白進行免疫接種，每劑量間隔3週，該SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白係以中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞所表現並以CpG 1018、氫氧化鋁或兩者之組合為佐劑，在第二次注射後2週收穫抗血清。以表現SARS-CoV-2棘蛋白的假病毒對抗血清進行中和試驗，以確定中和抗體的ID ₅₀(左圖)以及ID ₉₀(右圖)的力價。** p＜ 0.01, *** p＜ 0.001。

圖4所示為以含有佐劑的S-2P重組蛋白免疫的小鼠的總體抗棘蛋白的IgG抗體的力價。以酵素連結免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量採樣自圖3之說明所述之BALB/c小鼠(每組N = 6)的血清中抗棘蛋白的IgG抗體的總量，該BALB/c小鼠以0、1或5 µg S-2P重組蛋白以及CpG 1018、氫氧化鋁或兩者之組合進行免疫。*** p＜ 0.001。

圖5所示為以CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白誘導的抗體對野生型SARS-CoV-2病毒的中和作用。抗血清的收集如圖4之說明所述(每組N = 6)，並以野生型SARS-CoV-2進行中和試驗以確定中和抗體的力價。** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001。

圖6所示為以CpG 1018與氫氧化鋁為佐劑的SARS-CoV-2 S-2P重組蛋白免疫的小鼠所產生之抗體，對帶有D614D (野生型)或D614G (變異株)形式的棘蛋白的假病毒之抑制作用。收集如圖5之說明所述之BALB/c小鼠的抗血清，該BALB/c小鼠係以1或5 µg的S-2P重組蛋白以及10 µg的CpG 1018與50 µg的氫氧化鋁免疫(由於檢測能力的限制，每組N = 5)。以帶有D614D或D614G的棘蛋白的假病毒進行中和試驗。

圖7所示為IFN-

/IL-4、IFN-

/IL-5，以及IFN-

/IL-6的比率。使用由細胞激素分析所得之IFN-

、IL-4、IL-5，以及IL-6的數值(每組N = 6)計算比率。比值大於1表示偏向Th1反應，而比值小於1表示偏向Th2反應。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01。

圖8A-8B所示為倉鼠在第二次免疫後2週以假病毒測定之中和抗體力價。間隔3週對倉鼠(每組N = 10)免疫兩次，倉鼠以載劑對照(PBS)、1 μg (低劑量組，LD)或5 μg (高劑量組，HD)的S-2P重組蛋白並以150 μg CpG 1018與75 μg氫氧化鋁為佐劑，或單獨使用佐劑進行免疫。在第二次注射後2週收集抗血清，並使用表現SARS-CoV-2棘蛋白的假病毒進行中和試驗以確定中和抗體的ID ₉₀力價(圖8A)，以及以ELISA分析總體抗棘蛋白的IgG抗體的力價(圖8B)。結果以幾何平均值表示，誤差線代表95%信賴區間，並使用Kruskal-Wallis與校正的Dunn氏多重比較檢驗計算統計顯著性。虛線表示檢測的下限與上限(在ID ₉₀中分別為40與5120，在IgG ELISA中分別為100與1,638,400)。*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。

圖9A-9B所示為倉鼠感染SARS-CoV-2病毒後3或6天(days post infection, dpi)的病毒載量。在感染後3或6天對倉鼠實施安樂死，收集肺組織樣本，以進行病毒基因組RNA的定量PCR來確定病毒載量(圖9A)，以及透過TCID ₅₀測定確定病毒力價(圖9B)。結果以幾何平均值表示，誤差線代表95%信賴區間，並使用Kruskal-Wallis與校正的Dunn氏多重比較檢驗計算統計顯著性。虛線表示檢測的下限(100)。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01。

圖10所示為倉鼠感染SARS-CoV-2病毒後3或6天(dpi)的肺部病理評分。在感染後3或6天對倉鼠實施安樂死，收集肺組織樣本進行切片及染色。如實施例方法中所述對組織病理學切片進行評分，並將結果製成表格。結果以肺部病理評分之平均值呈現，誤差線代表標準誤差，且透過單因子變異數分析(one-way ANOVA)與Tukey氏多重比較測試計算統計顯著性。**** p＜ 0.0001。

圖11所示為第I期臨床試驗中獲報的不良事件之總結。受試者被要求在每次接種疫苗後至多7天內將引起的局部及全身不良事件記錄在受試者的每日紀錄卡中。將引起的不良事件(adverse events, AEs)製成表格並分級為輕度、中度，或重度。

圖12A-12C所示為第I期臨床試驗中體液免疫反應之總結。以5、15，或25 μg的MVC-COV1901疫苗接種的受試者的血清透過ELISA測量抗棘蛋白的IgG抗體(圖12A)，並透過假病毒中和試驗(圖12B)或活病毒中和試驗(圖12C)測量中和抗體力價。來自35名康復的COVID-19患者的人類恢復期血清(human convalescent sera, HCS)透過相同的分析進行比較，並且在活病毒中和試驗中使用NIBSC 20/130國際血清標準品作為標準(圖12C中的星號)。橫槓表示幾何平均力價，誤差線表示95%信賴區間。

圖13所示為第I期臨床試驗中細胞免疫反應之總結。以S1胜肽庫的胜肽刺激細胞，並於37°C下培養24-48小時。以CD3-2單株抗體(monoclonal antibody, mAb)刺激的細胞作為陽性對照。使用ELISpot分析檢測IFN-γ (左圖)或 IL-4 (右圖)。計算在胜肽庫中刺激三重複算出的斑點形成單位(spot-forming units, SFU)的平均值，並透過減去陰性對照重複(對照培養基)的平均值進行標準化。結果表示為每百萬周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)含有的SFU。橫槓表示平均值，誤差線表示標準偏差。

圖14所示為以接種含有佐劑的S-2P重組蛋白的大鼠的抗血清對帶有野生型或B.1.351 (Beta)變異株的棘蛋白的SARS-CoV-2假病毒進行的中和作用。以指定量的含有佐劑的S-2P重組蛋白對大鼠免疫3次，每次間隔2週。取自五隻雄性大鼠的抗血清匯集為一個樣本，而取自五隻雌性大鼠的抗血清則匯集為另一樣本。因此每個劑量組別產生兩個匯集樣本(N=2)。在第二次免疫後兩週(第29天)或第三次免疫後兩週(第43天)收集抗血清，如上所述方式匯集樣本，並以表現SARS-CoV-2武漢野生型或B.1.351變異株的棘蛋白的假病毒進行中和試驗以確定中和抗體的ID ₅₀與ID ₉₀力價。結果以條形表示幾何平均力價，而各符號代表每個樣本的數值。

圖15A-15C所示為接種不同劑量的MVC-COV1901疫苗的臨床試驗受試者的抗血清對帶有野生型或變異株的棘蛋白的SARS-CoV-2假病毒的中和作用。在第二次免疫後4週(第一次免疫後56天)收集來自MVC-COV1901受試者的第I期臨床試驗的血清樣本。以假病毒中和試驗測量所有劑量組別，包含低劑量(LD；圖15A)、中劑量(MD；圖15B)、高劑量(HD；圖15C)的ID ₅₀中和力價。圖中每個點代表一個體血清樣本的中和效價。進行Kruskal-Wallis與校正的Dunn氏多重比較檢驗，且與野生型比較的變異株之統計顯著性顯示於相應欄位之上方。** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。

Claims (13)

1. 一種抗新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. SARS-CoV-2)的免疫原性組合物，包含一抗原性重組蛋白以及一佐劑，該佐劑選自由一含鋁佐劑、一未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤核苷(cytosine-phosphate-guanosine, CpG)模體及其組合所組成之群組，其中該抗原性重組蛋白基本上由SARS-CoV-2棘蛋白的第14個至第1208個殘基，其中第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，第682個至第685個殘基被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”，以及在其C端具有一T4纖維蛋白三聚化結構域所組成。
2. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中該T4纖維蛋白三聚化結構域包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 2具有90%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。
3. 如請求項1或2所述之免疫原性組合物，其中該SARS-CoV-2棘蛋白的第14個至第1208個殘基，其中第986個與第987個殘基被置換為脯胺酸，第682個至第685個殘基被置換為“甘胺酸-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸(GSAS)”包含如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 1具有90%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。
4. 如請求項1或2所述之免疫原性組合物，其中該抗原性重組蛋白包含如SEQ ID NO: 5或6所示之胺基酸序列或至少與SEQ ID NO: 5或6具有90%、95%、96%、97%、98%或99%相似度的胺基酸序列。
5. 如請求項1或2所述之免疫原性組合物，其中該含鋁佐劑包含氫氧化鋁、羥基氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁、羥基磷酸硫酸鋁、無定形羥基磷酸硫酸鋁、硫酸鋁鉀、單硬脂酸鋁或其組合。
6. 如請求項5所述之免疫原性組合物，其中一0.5 ml劑量的該免疫原性組合物包含約250至約500 μg的Al ³⁺，或約375 μg的Al ³⁺。
7. 如請求項1或2所述之免疫原性組合物，其中該未甲基化的CpG模體包含一如SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或其組合所示之合成寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)。
8. 如請求項7所述之免疫原性組合物，其中一0.5 ml劑量的該免疫原性組合物包含約750至約3000 μg的寡核苷酸，或其中該免疫原性組合物包含約750 μg、約1500 μg，或約3000 μg的寡核苷酸。
9. 一種如請求項1所述之免疫原性組合物在製備用於在一有此需要的受試者中引發針對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫反應的藥物之用途。
10. 如請求項9所述之用途，其中該免疫反應包含產生抗SARS-CoV-2的中和抗體以及偏向Th1的免疫反應。
11. 一種如請求項1所述之免疫原性組合物在製備用於保護一有此需要的受試者免於感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的藥物之用途。
12. 一種如請求項1所述之免疫原性組合物在製備用於預防一有此需要的受試者感染COVID-19疾病的藥物之用途。
13. 如請求項9至12中任一項所述之用途，其中該免疫原性組合物係透過肌肉注射施用。

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