TW202245739A - 富含類薑黃素之油性萃出物於治療急性肺損傷的用途 - Google Patents

Abstract

在此揭示一種富含類薑黃素之油性萃出物用於治療急性肺損傷 （ALI），例急性呼吸窘迫症候群 （ARDS）的新穎用途。 依據本揭示內容較佳實施方式，富含類薑黃素之油性萃出物包含溶於油中的類薑黃素，且該類薑黃素由25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素（bisdemethoxycurcumin）、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素（demethoxycurcumin）及40-50%（重量％）之薑黃素（curcumin）所組成。

Description

富含類薑黃素之油性萃出物於治療急性肺損傷的用途

本揭示內容是關於一種疾病治療的領域，且特別是關於一種富含類薑黃素之油性萃出物於治療急性肺損傷 （ALI），例如急性呼吸窘迫症候群 （ARDS）的新穎用途。

急性肺損傷 （ALI）及其重症（如，急性呼吸窘迫症候群 （ARDS））的總死亡率約為43% ，其仍然是重症照護中的主要死因。所述疾病的病理特徵包括與強烈發炎反應相關的瀰漫性肺泡毛細管損傷和肺通透性增加。基於臨床症狀的這些變化，其特徵為急性發病、嚴重低血氧和蛋白性肺水腫。 儘管進行了許多大型多中心臨床試驗以探索各種治療策略的潛力，例如，利用醣皮質素（glucocorticoid）、酮康唑（ketoconazole）、利索茶鹼（lysophylline）、前列地爾（alprostadil）、吸入一氧化氮或補充表面活性劑。然而，治療性藥物的介入未能改善ALI / ARDS的臨床結果。 至目前為止，能夠顯著改善ADRS患者存活率的是施用低潮氣量的微創通氣策略。

薑黃（ Curcuma longa）為薑科（ Zingiberaceae）的一員，具地下根莖。 薑黃作為民間醫學藥方使用已數千年，能夠治療多種疾病，例如炎症 、傳染性疾病，以及胃、肝、血液疾病。薑黃素等類薑黃素是源自薑黃的天然多酚化合物，其生物活性包括作為潛在抗癌、糖尿病和抗發炎的營養保健品已被廣泛研究。

本揭示內容之目的在於提供一種以本方法所製得的薑黃之富含類薑黃素萃取物的新穎用途，其中相較於以習知方法所製得的萃出物而言，本發明富含類薑黃素萃出物中的二去甲氧基薑黃素（bisdemethoxycurcumin）為習知技術所製得之萃出物中的至少五倍。 再者，本發明富含類薑黃素之油性萃出物 能夠抑制年輕、高齡和法尼醇受體（farnesoid X receptor,  FXR） 缺陷個體中與ALI相關蛋白質的表現，因此，本發明富含類薑黃素之油性萃出物能夠作為治療ALI（如，ARDS）的藥劑或膳食補充品。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容是關於一種以本揭示內容製得的富含類薑黃素之油性萃出物的新穎用途，其中發現富含類薑黃素之油性萃出物能夠抑制與ALI相關蛋白的表現，因此，能夠作為治療ALI（如，急性呼吸窘迫症候群（ARDS）的醫藥品或膳食補充品。

依據本揭示內容之實施方式， 富含類薑黃素之油性萃出物包含 溶於油中的類薑黃素，且類薑黃素由25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素（bisdemethoxycurcumin）、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素（demethoxycurcumin）及40-50%（重量％）之薑黃素（curcumin）所組成。

所述富含類薑黃素之油性萃出物是由一方法所製得，其包含以一油萃取乾燥薑黃粉末的步驟，以製得富含類薑黃素之油性萃出物，其中類薑黃素由25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素（bisdemethoxycurcumin）、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素（demethoxycurcumin）及40-50%（重量％）之薑黃素（curcumin）所組成。

依據本揭示內容的實施方式，所述萃取是由以下步驟所完成： （i） 以油與乾燥薑黃粉末混合；以及 （ii） 在超音波震盪下隔水加熱該步驟（i）之油混合物。

依據本揭示內容之實施方式，在步驟（i）中適合用以與乾燥薑黃粉末混合的油是一可食用蔬菜油。舉例而言，所述可食用蔬菜油包含但不限於， 椰子油、玉米油、芥花油、 棉籽油、橄欖油、棕櫚油、花生油、 菜籽油、葵花油、 芝麻油、 大豆油和堅果油。在一較佳的實施方式中，所述乾燥薑黃粉末是以橄欖油萃取。

依據本揭示內容之實施方式，步驟（ii）中的隔水加熱是依序以50℃加熱30分鐘、60℃加熱30分鐘和80℃加熱30分鐘，完成油混合物之加熱；其中在每個加熱的過程中，以約25-35 kHz 之頻率進行超音波震盪。

依據本揭示內容之實施方式，所述乾燥薑黃粉末以下列步驟所製成： （a）將新鮮的薑黃之根莖（rhizome）切片；（b）將步驟（a）之切片以55℃乾燥；以及（c）以一球磨機將該步驟（b）之乾燥切片磨成粉末。

因此，所製得的富含類薑黃素之油性萃出物包含溶於油中的類薑黃素，其中類薑黃素由25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素及40-50%（重量％）之薑黃素所組成。

適合用以施用以本方法所製得富含類薑黃素之油性萃出物的個體是哺乳類；較佳為人類。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，請求項所使用的單數詞「一」涵蓋複數型，除非在此另有指明。再者，在請求項中所使用的「至少一」和「一或多」具相同的意義，包含一、二、三或以上。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

在本揭示內容中，「萃出物（extract）」一詞包含粗萃物（crude extract）及精製萃出物（refined extract）。具體來說，粗萃物是由簡單萃取所得的產物，其係讓所選的植物部分和至少一種萃取劑（即，油）接觸。在可任選的情形中，後續可對所得的粗萃出物進行一或多種分離及／或純化處理，以得到精製萃出物。植物萃出物可以是液體形式（例如，溶液、濃縮液、蒸餾液）。

「重量百分比」（weight percentage；wt %）一詞在本揭示內容是指在包含一成分的混合物中，該成分（例如，本發明富含類薑黃素萃出物之二去甲氧基薑黃素、去甲氧基薑黃素或薑黃素）的重量百分比。重量百分比（wt %）是將該成分的重量除以該混合物的總重量所得到，並以百分比及/或小數來表示。

在本揭示內容中，「治療」（treat）一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理ALI相關的症狀、次要疾病或病徵。「治療」（treat）一詞於此說明書中亦指應用或投予本揭示內容之藥學組合物至一個體，其患有ALI相關的症狀、次要疾病或病徵，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個ALI相關的症狀、次要疾病或病徵的發生。「治療」亦可以是投予至患有早期該些病徵、疾病和/或症狀之個體，以降低ALI相關之症狀、次要疾病或病徵的發生。當一或多與ALI相關的症狀或臨床標記降低時，則該治療為「有效的」（effective）。或者是，當一症狀、次要疾病或病徵的進程減緩或中止時，則該治療為「有效的」（effective）。

「有效量」（effective amount） 在此處係指一成分的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指成分的治療利益效果超越其毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病徵，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病徵的發生，或是可緩減與疾病或病徵相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件（如，個體體重、年齡或性別）、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療（如果有的話）的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克（毫克/公斤）。或者是，可將有效量表示成活性成分（例如，本發明富含類薑黃素之油性萃出物的二去甲氧基薑黃素、 去甲氧基薑黃素或薑黃素）的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥劑（例如，本揭示內容之藥學組合物）的人體等效劑量（human equivalent dose, HED）。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局（US Food and Drug Administration, FDA）所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」（Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers）來估算人體使用之最高安全劑量。

「個體」（subject）及「病患」（patient）在本揭示內容為可互換的詞彙，且係指包含人類等可接受本發明富含類薑黃素之油性萃出物及/或方法治療的動物。除非另有所指，否則「個體」（subject）或「病患」（patient）一詞同時意指男性及女性。據此，「個體」（subject）或「病患」（patient）一詞包含任何在接受本發明富含類薑黃素之油性萃出物或治療方法後，可產生治療效益的哺乳動物。例示性之「個體」（subject）或「病患」（patient）包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥及家禽。在一例示性之實施方式中，個體是一人類。

II. 發明詳細說明

本揭示內容是關於一種富含類薑黃素之油性萃出物的新穎用途，發現其能夠抑制與ALI 相關蛋白的表現；因此，本發明富含類薑黃素之油性萃出物能夠作為治療ALI（如，急性呼吸窘迫症候群（ARDS））的醫藥品或膳食補充品。

依據本揭示內容之實施方式，所述富含類薑黃素之油性萃出物包含溶於油中的類薑黃素，且類薑黃素是由25-30% （重量％）之二去甲氧基薑黃素、25-30% （重量％）之去甲氧基薑黃素和40-50% （重量％）之薑黃素所組成。在較佳實施方式，所述富含類薑黃素之油性萃出物包含溶於油中的類薑黃素，其中類薑黃素由約 26.7% （重量％）之二去甲氧基薑黃素， 約 28.8% （重量％） 之去甲氧基薑黃素，以及約 44.5% （重量％） 之薑黃素所組成。

依據本揭示內容之實施方式，所述富含類薑黃素之油性萃出物是由 本揭示內容實施例所述之步驟所製得。具體而言，將新鮮薑黃的根莖切片，厚度約 0.2公分，並以55℃烘乾，接著將其磨製成粉末， 例如，以球磨機磨成粉末。此外或可任選地是，磨至好的粉末可利用過濾器或篩網（約 400目） 進行過濾，以得到直徑小於38 μm 的薑黃粉末。

為了製得所述萃出物，所製得的乾燥薑黃粉末是與可食用蔬菜 油混合並一重量 （克）相對於體積（公升）比10:1至1:10所製得，例如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、9:2、9:3、9:4、9:5、9:6、9:7、9:8、9:10、8:3、8:5、8:6、8:7、8:9、8:10、7:2、7:3、7:4、7:5、7:6、7:8、7:9、7:10、6:4、6:5、6:7、6:8、6:9、6:10、5:2、5:3、5:4、5:6、5:7、5:8、5:9、5:10、4:1、4:3、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9、4:10、3:1、3:7、3:8、3:10、2:9、2:7、1:7、1:8、1:9和1:10；較佳為，重量 （克）相對於體積（公升）比約 10:1。適合用於本方法的可食用蔬菜油包含，但不限於， 椰子油、玉米油、芥花油、棉籽油、橄欖油、棕櫚油、花生油、菜籽油、葵花油、芝麻油、大豆油和堅果油。在一較佳的實施方式中，以橄欖油萃取所述乾燥薑黃粉末。

接著，所述油混合物以隔水加熱方式進行萃取，首先以50℃加熱 30分鐘，接著以60℃加熱30分鐘，最後以80℃加熱30分鐘，加熱的過程皆以超音波進行震盪，頻率約25-35 kHz，例如約28 kHz。 需要注意的是「隔水加熱」是指間接加熱乾燥薑黃粉末之油混合物及油（如，橄欖油）。具體而言，將混合物至於第一容器內，並將第一容器至於預先注入足量水的第二容器，接著直接加熱第二容器直到第二容器內的溫度達到預設溫度（如，50、60或 80℃），接著維持在前述期間（如，30分鐘）。最重要的是，整個隔水加熱期間第二容器需持續有水（即， 容器內的水量從未降至零）。  再者， 在隔水加熱的期間，施用超音波震盪頻率約 25-35 kHz，例如， 25、 26、 27、 28、 30、 31、 32、 33、 34 和35 kHz ，至第一容器。 在本揭示內容中，製得的油性萃出物命名為「ATG-235溶液」。

上述以本發明發法所製得的ATG-235溶液富含類薑黃素，其中ATG-235溶液中的類薑黃素由 25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素及40-50%（重量％）之薑黃素所組成。在一較佳的實施方式中，所述ATG-235溶液是由約 26.7% （重量％）之二去甲氧基薑黃素， 約 28.8% （重量％） 之去甲氧基薑黃素，以及約 44.5% （重量％） 之薑黃素所組成；而以已知製法所製得的薑黃萃出物中類薑黃素是由5.7% （重量％）之二去甲氧基薑黃素、24.1% （重量％）之去甲氧基薑黃素，以及70.8% （重量％）之薑黃素所組成。需要注意的是以本發明方法所製得的ATG-235溶液富含二去甲氧基薑黃素，且薑黃素比例低， 相較於已知方法所製得的萃出物，其中本發明萃出物的二去甲氧基薑黃素高於先前技術萃出物中的五倍，且薑黃素的量僅為先前技術萃出物中的一半。

依據實施目的之不同，可以一或多種適當的藥學上可接受之載體或賦形劑來配製本發明富含類薑黃素萃出物或ATG-235溶液，並將本揭示內容的藥學組合物配製成適合口服及腸胃外施用的形式。在藥物劑型中，本發明的ATG-235溶液可單獨或與其他已知用以治療ALI的藥學活性劑合併投予至個體體內。適用以各投予路徑之不同劑型為習知技藝人士所熟知。

在某些實施方式中，本發明ATG-235溶液是以液體劑型作腸胃外施用，例如，注射施用，其係包含但不限於皮下、彈丸注射（bolus injection）、肌肉、腹腔及靜脈注射。ATG-235溶液可以油性或水性載體進行配方，且可包含配製劑和/或調味劑。所述液體劑型可置於無菌的安瓶或小瓶中。在某些實施方式中，本發明ATG-235溶液是以液體劑型作口服施用。液體劑型可填充於軟式明膠膠囊中。舉例來說，液體可以包含一溶液、懸浮液、乳化液、微乳化液、沈澱物或任何期望的液體介質，其係帶有本發明ATG-235溶液的活性成分。液體可加以設計來改善本發明ATG-235溶液的活性成分，以形成一包含藥物的乳化液或經釋放後的分散質。

依據本揭示內容之實施方式，本發明富含類薑黃素之油性萃出物或ATG-235溶液是以口服或腸胃外方式，對患有ALI個體投予一劑或多劑（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多劑）。

適合施用本發明方法所製得富含類薑黃素之油性萃出物的個體是哺乳類，較佳是人類。

在一實施方式中，所述個體是小鼠。為產生治療功效，對小鼠投予每劑每公斤體重約1-100毫克之本發明富含類薑黃素之油性萃出物；較佳地，約為每劑每公斤體重約10-90毫克之本發明ATG-235 溶液；更佳地，投予每劑每公斤體重約50-70毫克之本發明ATG-235 溶液，即足以對罹患ALI個體產生治療功效。

所屬技術領域中具有通常知識者可依據本實施例揭示的動物模式劑量來計算本發明富含類薑黃素之油性萃出物的人體等效劑量（human equivalent dose, HED）。因此，本發明ATG-235溶液適合人類個體施用的有效量的每劑劑量範圍為0.08-8毫克/公斤體重；較佳為每劑量0.8-8毫克/公斤體重。

依據特定較佳的實施方式， 每日施用本發明富含類薑黃素之油性萃出物並至少施用7天至所述個體；舉例而言，每日施用至所述個體，且至少施用7、8、9、10、11、12、13、14或14天以上。在一具體的實施方式中，本揭示內容富含類薑黃素之油性萃出物是每日施用至所述個體並施用14天。

可以理解的是，本技術領域相關人士或臨床人員可以依據患者的生理條件或疾病的嚴重程度調整劑量或投藥方案。

依據所需目的之不同，本發明富含類薑黃素之油性萃出物可單獨投予至個體，或是與其他對ALI具有治療效益的治療合併投予至個體。本發明富含類薑黃素之油性萃出物可在投予該其他治療之前、同時或之後，投予至個體。

可利用本發明富含類薑黃素之油性萃出物及/或方法治療的個體是一哺乳動物；舉例來說，人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛及兔子。較佳地，該個體為一人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料與方法

脂多醣 （ LPS ）誘導急性肺損傷 （ ALI ） 動物模型

將C57BL/6J 年輕和高齡小鼠 （4和 18月齡），和Nr1h4剔除年輕小鼠 （FXR KO，B6。129 x 1 （FVB）- Nr1h4tm1Gonz/J Stock No: 007214，4月齡） 飼養於12小時光照/黑暗週期、平均恆溫（25 ± 1.0°C）、相對溼度為60-70%的環境中，可隨意取用食物及水。所有的動物試驗皆經動物保護及使用委員會批准。在適應一週後，將小鼠隨機分為12組，包含： （1） 年輕正常對照組 （4月齡）； （2） 年輕 LPS 處理組 （4月齡）； （3） 年輕 LPS + ATG-235 處理組； （4） 年輕 LPS + 茶鹼 （Th） 處理組； （5） 高齡組 （18月齡）； （6） 高齡LPS 處理組； （7） 高齡LPS + ATG-235 處理組； （8） 高齡LPS + 茶鹼 （Th） 處理組； （9） FXR KO 小鼠 （4月齡） ；（10） FXR KO 小鼠 （4月齡） + LPS 組； （11） FXR KO 小鼠 （4月齡） + LPS + ATG-235 處理組；和 （12） FXR KO 小鼠 （4月齡） + LPS + 茶鹼 （Th） 處理組。需要注意的是茶鹼作為本實驗的陽性對照組。為了誘導ALI，小鼠以腹腔注射 （ip） PBS或LPS （3毫克/公斤） 連續注射7天，接著小鼠以口服投予橄欖油、實施例1之ATG-235溶液 （2 毫升/公斤），或茶鹼 （10 毫克/公斤） ，連續投予14天。 於注射最後一劑LPS的15天後，犠牲所有動物進行後續分析。

組織學、免疫組織化學及免疫螢光分析

於小鼠犧牲後，立即收集腦組織。所述腦組織以4%三聚甲醛固定進行石蠟包埋處理後，將包埋組織切為5微米厚度的組織切片。  免疫染色前，以二甲苯及梯度系列酒精對組織檢體進行脫蠟。利用過氧化氫酶來阻斷內源性過氧化酶的活性。以蒸餾水洗滌組織檢體，並置於包含5%正常山羊血清之Tris緩衝液（包含0.5% TWEEN ^®20、pH 7.4 （TBS-T））30分鐘。之後，將組織檢體與抗IL-1β、抗p65 NF-κB、抗p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、抗骨髓過氧化酶 （myeloperoxidase，MPO）、抗NLR家族比林結構域蛋白3（ family pyrin domain containing 3）（NLRP3）、抗凋亡蛋白酶1（Caspase 1）、過氧化體增生活化受體-γ共活化因子-1α （peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR）-γ coactivator-1α，PGC1α）、抗粒線體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）、抗髓鞘調節因子-1（myelin regulatory factor-1 ，MRF-1）、抗SIRT1和 MITOTRACKER ^TM或活性氧物質 （ROS）染劑於室溫培養2小時。組織樣本進一步加入二級抗體（ALEXAFLUOR ^®488、ALEXAFLUOR ^®633、抗小鼠或抗兔子抗體），並於室溫培養1小時。所有的抗體皆是以2%之非免疫山羊血清（於含有TWEEN ^®的磷酸鹽緩衝液（PBST））進行稀釋。將組織檢體與3,30-二氨基聯苯胺（3,30-diaminobenzidine, DAB）培養5-10分鐘，並以蘇木精或4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色細胞核。

測定支氣管肺泡灌洗液（ BALF ）中細胞性和非細胞性成分

以1 毫升PBS經氣管灌洗小鼠肺部，得到支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）。將BAL細胞離心（500 x g、4℃、10 分鐘）沉澱，並再次懸浮，使用標準血細胞計數器（Goyaev chamber）計算總白血球數。以裝有油浸透鏡的光學顯微鏡檢查BALF的細胞組成。計數每200個細胞中單核球/巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜酸性球和淋巴球的數量，且觀察至少5個視野。每一細胞族群的相對細胞數量以總細胞數的百分比呈現。以ELISA測定BALF中非細胞性成分，例如，TNF-α、IL-1β和IL-6。

統計分析

將數據表示為平均值±標準差（平均值 ± S.E.M.）。使用Mann-Whitney秩和檢定及Wilcoxon秩和檢定來比對不同組別之數據。 P＜ 0.05即視為具有統計顯著性。

實施例 1 製備本發明富含類薑黃素之油性萃出物或 ATG-235 溶液

將新鮮薑黃的根分別切成0.2公分薄片。利用烘箱以55℃乾燥所述切片，接著以球磨機磨製成粉末。薑黃粉末以400目過濾後，製備出經乾燥且過濾之薑黃粉末，其直徑分別＜ 38 微米（μm）。

薑黃粉末以400目過濾後，製備出經乾燥且過濾之薑黃粉末，其直徑分別 ＜38 微米（μm）。取20公克經乾燥且過濾之粉末和2公升橄欖油於燒瓶中混合，接著以隔水加熱的方式進行萃取。萃取步驟為三階段製程，包括（1） 50℃，30分鐘 （2） 60℃，30分鐘 （3） 80℃，30分鐘，製成本揭示內容之油性萃出物。需要注意的是在「隔水加熱」的步驟中，是將燒瓶放置預先承裝足夠水量的容器中，接著直接對容器進行加熱，而非對燒瓶直接加熱，直到容器內的溫度達到指定溫度，並維持一定的預設期間。最重要的是，整個隔水加熱的過程中容器需保持有水的狀態（即，容器內的水位不可降至零）。再者，隔水加熱萃取的整個過程中，對燒瓶施以28KHz的超音波震盪（以一超音波振盪器（強度：4.1千瓦）所產生）。製得的油性萃出物命名為「ATG-235」溶液，接著以液相層析儀（LC/MS）分析。 為了與以已知常規方法製得的類薑黃素進行比較，其中先前技術製得的經乾燥和過濾之類薑黃素粉末（20 克），是以甲醇萃取，接著以 LC/MS分析。結果摘要於表1。

利用本發明方法和利用常規方法製得的薑黃粉末之油性萃出物中所呈現的類薑黃素量摘要於表1。意外發現本發明薑黃粉末之油性萃出物中所含的二去甲氧基薑黃素量，是習知方法製得的油性萃出物中二去甲氧基薑黃素量的二至五倍；其中相較於習知方法薑黃素的量約60-70％，本發明的薑黃素減少至44.5%。因此，相較於習知方法所製得的萃取物，本發明之實施例中所製得的油萃取物富含類薑黃素。

表 1  薑黃粉末油萃出物或甲醇萃出物中類薑黃素的百分比

化合物	百分比 （類薑黃素（毫克） /萃出物（克））
實施例1之油性萃出物	習知方法製得的甲醇萃出物
二去甲氧基薑黃素	26.88%	5-15%
去甲氧基薑黃素	28.83%	20-27%
薑黃素	44.49%	60-70%

實施例 2  ATG-235 溶液能夠減緩年輕小鼠中 LPS 誘導的 ALI

年輕小鼠（4月齡）腹腔注射LPS（3 毫克/公斤）誘導ALI症狀產生，接著以口服施用ATG-235溶液（2 毫升/公斤）或茶鹼 （Th）（10 毫克/公斤）進行治療。以組織學分析評估小鼠肺部結構，以顯微鏡下觀察細胞浸潤的情況，以及以免疫墨點法分析與ALI相關細胞激素的產生及蛋白質的表現量。 結果示於第1圖至第5圖。

2.1 肺部結構變形

肺部HE染色組織學特徵結果顯示LPS 誘導出血和紅斑狀況、肺泡間質增厚、肺間質性水腫，該些症狀皆為ALI相關症狀。令人意外的是ㄒATG-235和茶鹼處理的小鼠中，肺部結構變形顯著受到抑制（第1圖，（A）和 （B））。用以評估肺部結構的組織病理分數如表1所示。此外，相較於對照組正常的小鼠，施用 ATG-235溶液或茶鹼至經LPS處理的小鼠造成小鼠肺部濕潤和乾燥的重量比顯著降低，其可作為減輕LPS誘導肺浸潤的指標（第1圖，（C））。

表1  評估肺部結構之組織病理分數

參數	分數（每個視野）
0	1	2
A	肺泡空間中的嗜中性白血球	無	1-5	2
B	間質空間中的嗜中性白血球	無	1-5	＞5
C	透明膜	無	1	＞5
D	填充在空隙中的蛋白質碎屑	無	1	＞1
E	肺泡間隔增厚	＜ 2X	2X – 4X	＞4X
F	肺泡充血	無	1-5	＞5

2.2  ALI 相關細胞浸潤和蛋白質表現

經LPS 處理亦能夠造成細胞浸潤 （即，嗜中性白血球和巨噬細胞等）、細胞激素產生（即，TNF-α、IL-1β和IL-6），以及增強發炎蛋白質的表現 （即，MAPK、NF-κB和IL-1β），該些狀況可透過ATG-235溶液或茶鹼處理後減緩（第2圖和第3圖）。

2.3 粒線體 功能

已知粒線體功能異常會導致肺損傷。因此，在此研究ATG-235溶液對於患有ALI年輕小鼠之粒線體功能的影響，結果示於第4圖和第5圖。

結果顯示，相較於對照組小鼠，經LPS處理的小鼠骨髓過氧化酶 （MPO）、NLRP3和凋亡蛋白酶1的量分別降低；並且施用實施例之ATG-235溶液至經LPS處理的小鼠，各蛋白質量能夠成功上升回復至正常對照組的量（第4圖）。

再者，經LPS 處理會誘導肺組織中自由基產生並降低調控粒線體生合成的酵素量，包含過氧化體增生活化受體-γ共活化因子-1α （peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR）-γ coactivator-1α，PGC1α）、線粒體轉錄因子A （mitochondrial transcription factor A，TFAM）、核內呼吸因子1 （nuclear respiratory factor 1，NRF-1）及NAD-依賴性去乙醯化酶Sirtuin-1 （NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，sirtuin-1，SIRT1） 。令人意外的是應用實施例1之ATG-235溶液能夠成功恢復粒線體功能。再者，ATG-235溶液較茶鹼 更有潛力（第5圖）。

綜上所述，在此實施例中的數據顯示，本發明ATG-235溶液能夠改善患有ALI年輕小鼠中的粒線體功能。

實施例 3  ATG-235 溶液能夠減緩高齡小鼠中 LPS 誘導的 ALI

在此實施例中，施用LPS至小鼠誘導ALI，接著以實施例2中所示之步驟以ATG-235溶液或茶鹼處理，除了使用高齡小鼠 （18月齡）外，沒有使用年輕小鼠 （4月齡）。結果示於第6-10圖。

3.1 肺部結構變形

與實施例2年輕小鼠的實驗結果相似，經LPS處理的高齡小鼠的肺臟組織病理學特徵亦顯示出血和紅斑狀況、肺泡間質增厚、肺間質性水腫，該些症狀皆為ALI相關症狀。ATG-235或茶鹼處理的小鼠中肺部結構變形顯著受到抑制（第6圖，（A）和 （B））。此外，相較於對照組正常的小鼠，施用 ATG-235溶液或茶鹼至經LPS處理的小鼠造成小鼠肺部濕潤和乾燥的重量比顯著降低，其可作為減輕LPS-誘導肺浸潤的指標（第6圖，（C））。最重要的是本發明ATG-235溶液似乎比茶鹼更具潛力，其中茶鹼作為陽性對照組。

3.2  ALI 相關細胞浸潤和蛋白質表現

高齡小鼠中LPS 誘導的細胞浸潤 （即，嗜中性白血球和巨噬細胞等）、細胞激素產生（即，TNF-α、IL-1β和IL-6），以及增強發炎蛋白質的表現 （即，MAPK、NF-κB和IL-1β），該些狀況可透過ATG-235溶液或茶鹼處理後減緩（第7圖和第8圖）。 再者，本發明ATG-235比茶鹼更具潛力。

3.3 粒線體 功能

在此研究ATG-235溶液對於患有ALI高齡小鼠粒線體功能的影響，結果示於第9圖和第10圖。結果顯示，相較於對照組小鼠，經LPS處理的小鼠骨髓過氧化酶 （MPO）、NLRP3和凋亡蛋白酶1的量分別降低；並且應用實施例之ATG-235溶液至經LPS處理的小鼠，各別的蛋白質量能夠成功上升並回復，且與正常對照組未處理高齡小鼠的量相似（第9圖）。

再者，LPS處理使得調控粒線體生合成的酵素量降低，包含PGC1α、TFAM 、NRF-1和 SIRT1，然而，應用ATG-235溶液能夠成功使每個酵素成功回復至與控制組小鼠（即，未經LPS處理小鼠）相似的量，此可作為粒線體功能改善的指標。更進一步而言， ATG-235溶液比茶鹼更具有潛力（第10圖）。

綜上所述，此實施例中的數據顯示本發明ATG-235溶液能夠改善患有ALI高齡小鼠中的粒線體功能。

實施例 4  ATG-235 溶液能夠減緩法尼醇受體（ farnesoid X receptor, FXR ）缺陷小鼠中 LPS 誘導的 ALI

在此實施例中，施用LPS至小鼠誘導ALI，接著以實施例2中所示之步驟，使用ATG-235溶液或茶鹼處理，在此實施例中是以FXR缺陷小鼠（4月齡）取代年輕小鼠（ 4月齡）。FXR是一種人類NR1H4基因編碼的核受體，並且在肝臟和小腸中表現量高。結果示於第11圖至第15圖。

4.1 肺部結構變形

與實施例2和3的實驗結果相似，經LPS處理的FXR缺陷小鼠的肺臟組織病理學特徵亦顯示出血和紅斑狀況、肺泡間質增厚、肺間質性水腫，該些症狀皆為ALI相關症狀。ATG-235或茶鹼處理的小鼠中肺部結構變形顯著受到抑制（第11圖，（A）和 （B））。此外，相較於對照組正常的小鼠，施用 ATG-235溶液或茶鹼至經LPS處理的小鼠造成小鼠肺部濕潤和乾燥的重量比顯著降低，其可作為減輕LPS-誘導肺浸潤的指標（第11圖，（C））。最重要的是本發明ATG-235溶液比茶鹼更具潛力。

4.2 ALI 相關細胞浸潤和蛋白質表現

FXR 缺陷小鼠中LPS 誘導的細胞浸潤 （即，嗜中性白血球和巨噬細胞等）、細胞激素產生（即，TNF-α、IL-1β和IL-6），以及增強發炎蛋白質的表現 （即，MAPK、NF-κB和IL-1β），該些狀況可透過ATG-235溶液或茶鹼處理後減緩（第12圖和第13圖）。 再者，本發明ATG-235比茶鹼更具潛力。

4.3 粒線體 功能

在此研究ATG-235溶液對於患有ALI之FXR缺陷小鼠粒線體功能的影響，結果示於第14圖和第15圖。結果顯示，相較於對照組小鼠，經LPS處理的小鼠骨髓過氧化酶 （MPO）、NLRP3和凋亡蛋白酶1的量分別降低；並且應用實施例之ATG-235溶液至經LPS處理的小鼠，各別的蛋白質量能夠成功上升回復，並與正常對照組未處理高齡小鼠的量相似（第14圖）。

再者，LPS處理使得調控粒線體生合成的酵素量降低，包含PGC1α、TFAM、NRF-1和 SIRT1，然而，應用ATG-235溶液能夠成功使每個酵素成功回復至與控制組小鼠（即，未經LPS處理小鼠）相似的量，此可作為粒線體功能改善的指標。更進一步而言， ATG-235溶液比茶鹼夠具有潛力（第15圖）。

綜上所述，此實施例中的數據顯示本發明ATG-235溶液能夠改善患有FXR缺陷小鼠中的粒線體功能。

總而言之，本揭示內容提供一種新穎富含類薑黃素之油性萃出物 （即， ATG-235溶液）用以治療患有 ALI 個體（如，ARDS）的用途，所述萃出物中溶於油的類黃薑素由25-30% （重量％） 之二去甲氧基薑黃素、25-30% （重量％） 之去甲氧基薑黃素和40-50% （重量％） 之薑黃素所組成。因此，本發明富含類薑黃素之油性萃出物能夠作為預防和/或治療ALI的治療劑，藉使增強ALI個體的壽命和生活品質。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為依據本揭示內容實施例2所繪示的結果 ，其闡述ATG-235溶液或茶鹼 （Th）對急性肺損傷 （ALI）之年輕小鼠的影響，其中分別為 （A） 是HE染色照片，（B）和 （C） 為年輕小鼠組織病理分數和肺水腫的直條圖； 每組n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於 LPS組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於 LPS + 茶鹼組； 第2圖為依據本揭示內容實施例2所示結果的直條圖，其繪示ATG-235 溶液對於年輕小鼠中（A） BALF總細胞數、（B）嗜中性白血球數量 、（C）巨噬細胞數量， （D） TNFα （E） IL-1β和（F） IL-6量的影響，每組n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於 LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS +茶鹼組； 第3圖為依據本揭示內容實施例2所示結果的直條圖，其繪示ATG-235 溶液或茶鹼對於 （A） IL-1β、（B） 磷酸化65 （p65） NF-κB和 （C） 磷酸化 38 （p38） MAPK量的影響，每組n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於 LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS +茶鹼組； 第4圖為依據本揭示內容實施例2所示結果的直條圖，其繪示ATG-235 溶液或茶鹼對於年輕小鼠中（A） MPO、（B） NLRP3和 （C） 凋亡蛋白酶1量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於  LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組對於LPS + 茶鹼組； 第5圖為依據本揭示內容實施例2所示結果的直條圖，其繪示ATG-235 溶液或茶鹼對於年輕小鼠中（A） ROS、（B） 粒線體、（C） PGC1α、（D） TFAM、（E） NRF-1和 （F） SIRT1 量的影響每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第6圖為依據本揭示內容實施例3所示結果，其繪示ATG-235溶液或茶鹼 （Th） 對於高齡小鼠ALI的影響，其中 （A）是HE-染色照片、 （B）和 （C）分別是高齡小鼠組織病理分數和肺水腫的直條圖，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組 相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05，LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第7圖為依據本揭示內容實施例3所示結果，其繪示 ATG-235溶液或茶鹼對於高齡小鼠中（A） BALF總細胞數、（B）嗜中性白血球數量 、（C） 巨噬細胞數量、 （D） TNFα、（E） IL-1β和 （F） IL-6量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第8圖為依據本揭示內容實施例3所示結果，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於高齡小鼠中（A） IL-1β、（B） 磷酸化 65 （p65） NF-κB和 （C） 磷酸化 38 （p38） MAPK量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^# p＜0.05，LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第9圖為依據本揭示內容實施例3所示結果的直條圖，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於高齡小鼠中（A） MPO、（B） NLRP3和 （C） 凋亡蛋白酶1量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第10圖為依據本揭示內容實施例3所示結果的直條圖，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於高齡小鼠中 （A） ROS、（B） 粒線體、（C） PGC1α、（D） TFAM、（E） NRF-1和 （F） SIRT1量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第11圖為依據本揭示內容實施例4所示結果，其繪示ATG-235溶液或茶鹼 （Th）對於FXR缺陷小鼠之 ALI 的影響，其中（A） 是HE-染色照片，（B）和（C）分別是高齡小鼠組織病理分數和肺水腫的直條圖，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05，LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第12圖為依據本揭示內容實施例4所示結果的直條圖，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於FXR 缺陷小鼠中（A） BALF總細胞數、（B）嗜中性白血球數量、（C） 巨噬細胞數量、（D） TNFα、（E） IL-1β和 （F） IL-6量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05，LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第13圖為依據本揭示內容實施例4所示結果的直條圖，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於FXR 缺陷小鼠中 （A） IL-1β、（B） 磷酸化 65 （p65） NF-κB和 （C） 磷酸化 38 （p38） MAPK的影響 ，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組； 第14圖為依據本揭示內容實施例4所示結果的直條圖，其繪示ATG-235溶液或茶鹼對於FXR 缺陷小鼠中（A） MPO、（B） NLRP3和 （C） 凋亡蛋白酶1量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組；和 第15圖為依據本揭示內容實施例4所示結果的直條圖，其繪示 ATG-235溶液或茶鹼 對於FXR缺陷小鼠中（A） ROS、（B） 粒線體、（C） PGC1α、（D） TFAM、（E） NRF-1和 （F） SIRT1量的影響，每組 n = 5，結果以平均值± S.E.M表示，以非配對學生 t試驗評估平均值之間差異的統計顯著性； * p＜ 0.05，正常對照組相對於LPS 組； ^# p＜ 0.05， LPS 組相對於LPS + ATG-235 組； ^¥ P＜0.05， LPS 組相對於LPS + 茶鹼組。

Claims (6)

1. 一種利用一富含類薑黃素之油性萃出物製造用於治療急性肺損傷（ALI）之醫藥品的用途，其中該富含類薑黃素之油性萃出物包含溶於該油中的類薑黃素，且該類薑黃素由25-30%（重量％）之二去甲氧基薑黃素（bisdemethoxycurcumin）、25-30%（重量％）之去甲氧基薑黃素（demethoxycurcumin）及40-50%（重量％）之薑黃素（curcumin）所組成。
2. 如請求項1所述之用途，其中該ALI是急性呼吸窘迫症候群 （ARDS）。
3. 如請求項2所述之用途，其中該 ARDS是輸血相關肺損傷、呼吸器誘導肺損傷、細菌誘導肺損傷或病毒誘導肺損傷。
4. 如請求項1所述之用途，其中該富含類薑黃素之油性萃出物是由一方法所製成，其中該方法包含： (i)               以一油與該乾燥薑黃粉末混合；以及 (ii)             在超音波震盪下隔水加熱該步驟（i）之油混合物；其中該油是一可食用蔬菜油，選自於以下所組成之群組：椰子油、玉米油、芥花油、棉籽油、橄欖油、棕櫚油、花生油、菜籽油、葵花油、芝麻油、大豆油和堅果油。
5. 如請求項4所述之用途，其中在該步驟 （ii）中， 該隔水加熱是依序以50℃、60℃和80℃分別加熱30分鐘，完成該油混合物之加熱；以及 該超音波震盪的頻率為約25-35kHz。
6. 如請求項4所述之用途，其中該乾燥薑黃粉末是由以下步驟所製成： （a）將一新鮮的薑黃之根莖切片； （b）將該步驟（a）之該切片以55℃乾燥；以及 （c）以一球磨機將該步驟（b）之乾燥切片磨成粉末。

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