TW202236961A - 冷凍保存劑的用途與粒線體冷凍保存方法 - Google Patents
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Abstract
一種冷凍保存劑，包含海藻糖、HEPES以及人類血清白蛋白，且此冷凍保存劑不包含氯化鉀、氯化鈉、乙二醇四乙酸以及乙二胺四乙酸。前述冷凍保存劑可用於粒線體的冷凍保存。
Description
本發明係關於一種冷凍保存劑與冷凍保存方法，特別是一種冷凍保存劑與使用其的粒線體冷凍保存方法。
粒線體(Mitochondria)是細胞內進行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所。由於三磷酸腺苷為細胞活動的能量來源，所以粒線體又有「細胞能量工廠」之稱。除了為細胞提供能量外，粒線體還參與細胞分化、細胞資訊傳遞和細胞凋亡等過程，並擁有調控細胞生長周期的能力。由於粒線體是人體中相當重要的胞器，一旦粒線體的功能出現問題，將導致如腦肌病與神經退化性疾病帕金森氏症等疾病的發生。
針對這些粒線體相關疾病，目前新興的治療方法包含粒線體移植。透過預先冷凍保存健康的粒線體，在日後發生粒線體相關疾病時，即可移植健康的粒線體至細胞中以取代有問題的粒線體，藉此改善粒線體相關疾病的症狀。
由於粒線體為雙層膜結構，較細胞來得脆弱，因此雖然已知有多種細胞的冷凍保存劑，但這些冷凍保存劑並不適合拿來凍存粒線體。為此，業界正積極開發粒線體專用的冷凍保存劑。然而，在進行粒線體冷凍保存的過程中，粒線體常常會出現腫脹甚至破損的狀況，導致粒線體在解凍後無法發揮正常功能。因此，如何防止粒線體在冷凍保存過程中受損，已成為一個重要的課題。
本發明係提供一種冷凍保存劑與使用其的粒線體冷凍保存方法，藉由使用此冷凍保存劑對粒線體進行冷凍保存，防止粒線體在冷凍保存過程中受損。
本發明一實施例揭露一種冷凍保存劑，包含海藻糖(Trehalose)、HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及人類血清白蛋白(Human albumin protein)，且此冷凍保存劑不包含氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)、乙二醇四乙酸(EGTA)以及乙二胺四乙酸(EDTA)。
本發明另一實施例揭露一種冷凍保存劑，由海藻糖(Trehalose)、HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及人類血清白蛋白(Human albumin protein)所組成。
本發明一實施例揭露一種粒線體冷凍保存方法，包含以下步驟。將冷凍保存劑與複數個粒線體置入容器中。接著，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器置入液態氮中進行降溫。接著，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器自液態氮中取出並置入冷凍設備中進行冷凍保存。
根據上述本發明所揭露的冷凍保存劑與使用其的粒線體冷凍保存方法，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的結構完整性以及較佳的能量合成能力。如此一來，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的功能，進而在後續使用上可取得較佳的效果。
以上之關於本揭露內容之說明及以下之實施方式之說明係用以示範與解釋本發明之精神與原理，並且提供本發明之專利申請範圍更進一步之解釋。
以下在實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵以及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露之內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易地理解本發明相關之目的及優點。以下之實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。
本發明一實施例的冷凍保存劑包含體積莫耳濃度150至300 mM的海藻糖(Trehalose)、體積莫耳濃度10至20 mM的HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及重量百分濃度0.1至1%的人類血清白蛋白(Human albumin protein)；此冷凍保存劑中不包含氯化鉀(KCl)、乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。換句話說，本發明一實施例的冷凍保存劑中包含海藻糖、HEPES及人類血清白蛋白；海藻糖在冷凍保存劑中的體積莫耳濃度為150至300 mM；HEPES在冷凍保存劑中的體積莫耳濃度為10至20 mM；人類血清白蛋白在冷凍保存劑中的重量百分濃度為0.1至1%；此冷凍保存劑中不包含氯化鉀(KCl)、乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。冷凍保存劑可用於粒線體的冷凍保存，例如可用於冷凍保存人類細胞的粒線體。在一實施例中，此冷凍保存劑中不包含氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
進行冷凍保存的過程中，冷凍保存劑中的海藻糖保護粒線體膜，維持粒線體膜的完整性，以及維持粒線體膜的正常功能。冷凍保存劑中的HEPES具有緩衝冷凍保存劑的酸鹼度的功效，且HEPES亦具有使冷凍保存劑為粒線體的等張溶液的功效。冷凍保存劑中的人類血清白蛋白亦具有使冷凍保存劑的滲透壓與粒線體的滲透壓保持恆定的功效。
於習用冷凍保存劑中，氯化鉀具有用於調整冷凍保存劑為粒線體的pH緩衝溶液和等張溶液的功效。於習用冷凍保存劑中，乙二醇四乙酸(EGTA)與乙二胺四乙酸(EDTA)具有捕捉細胞破損時釋出的鈣離子的功效，藉此避免大量鈣離子進入粒線體內導致粒線體膜通透性改變，造成粒線體腫脹甚至破損。
然而，相較於習用冷凍保存劑，本發明一實施例的冷凍保存劑中並不包含氯化鉀、乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。在未含有氯化鉀、乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的情況下，使用本發明一實施例的冷凍保存劑進行冷凍保存的粒線體，仍可維持較佳的結構完整性以及較佳的能量合成能力。如此一來，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的功能，進而在後續使用上可取得較佳的效果。
於本發明另一實施例揭露一種冷凍保存劑，由體積莫耳濃度150至300 mM的海藻糖(Trehalose)、體積莫耳濃度10至20 mM的HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及重量百分濃度0.1至1%的人類血清白蛋白(Human albumin protein)所組成。換句話說，換句話說，本發明另一實施例的冷凍保存劑由海藻糖、HEPES及人類血清白蛋白所組成；海藻糖在冷凍保存劑中的體積莫耳濃度為150至300 mM；HEPES在冷凍保存劑中的體積莫耳濃度為10至20 mM；人類血清白蛋白在冷凍保存劑中的重量百分濃度為0.1至1%。本實施例中各組成成分的功效以及冷凍保存劑用於冷凍保存粒線體的效果如前一實施例中所述，在此便不再贅述。
於本發明前述二實施例中，海藻糖的體積莫耳濃度為150至300 mM，較佳為200至300 mM，更佳為250至300 mM。HEPES的體積莫耳濃度為10至20 mM，較佳為10至16 mM，更佳為10至13 mM。人類血清白蛋白的重量百分濃度為0.1至1%，較佳為0.1至0.7%，更佳為0.1至0.3%。
於本發明其他實施例中，海藻糖與HEPES的體積莫耳濃度之比值(海藻糖/HEPES)為13至17，較佳為14至16，更加為15。
於本發明前述實施例中的冷凍保存劑係呈液態而可被直接使用，但不以此為限。於本發明再其他實施例中，冷凍保存劑係呈固態，欲使用固態的冷凍保存劑時須先以純水或其他細胞可接受的溶劑將固態的冷凍保存劑調配成液態的冷凍保存劑。固態的冷凍保存劑中，乾燥的海藻糖、乾燥的HEPES與乾燥的人類血清蛋白的重量比為92.42~112.96∶2.14~2.62∶0.9~1.1，較佳的重量比為102.69∶2.38∶1。
接下來說明本發明一實施例的粒線體冷凍保存方法，請參照圖1。圖1為本發明一實施例之粒線體冷凍保存方法流程圖。本發明一實施例的粒線體冷凍保存方法例如為用於冷凍保存人類細胞的粒線體。本發明一實施例的粒線體冷凍保存方法包含以下步驟。
首先，對容器進行預冷(S101)。
詳細來說，將容器放入液態氮中20至40秒進行預冷。容器例如為試管或離心管。
接著，將冷凍保存劑與粒線體置入容器中(S102)。
詳細來說，先將已預冷的容器在室溫下回溫5至15秒，再將前述本發明之冷凍保存劑與粒線體直接置入容器的底部。將冷凍保存劑與粒線體置入容器中後，可輕敲容器使冷凍保存劑與粒線體集中至容器底部，避免粒線體殘留在容器內壁面。殘留在容器內壁面而未浸於冷凍保存劑中的粒線體，在冷凍保存過程中因未受到冷凍保存劑保護而容易腫脹或破損。
接著，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器置入液態氮中進行降溫(S103)。
詳細來說，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器置入液態氮中5至15秒進行降溫，使容器中的冷凍保存劑與粒線體呈凍結狀態。
接著，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器自液態氮中取出並置入冷凍設備中進行冷凍保存(S104)。
詳細來說，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器自液態氮中取出並置入冷凍設備中，於攝氏-70至-90度的溫度進行冷凍保存。
欲解凍冷凍保存的粒線體時，將裝有凍結狀態的冷凍保存劑與粒線體的容器自冷凍設備中取出後，置入攝氏25至35度的水中輕輕搖晃45至65秒進行解凍。待容器中的冷凍保存劑與粒線體完全解凍後，將裝有冷凍保存劑與粒線體的容器插入碎冰中，使粒線體保持在攝氏4至10度以備後續使用。後續使用例如為將粒線體用於粒線體移植以治療粒線體相關疾病。
使用本發明一實施例的粒線體冷凍保存方法，經冷凍保存的粒線體在解凍後仍可維持較佳的結構完整性以及較佳的能量合成能力。如此一來，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的功能，進而在後續使用上可取得較佳的效果。
以下藉由實驗說明本發明所揭露之冷凍保存劑與使用其的粒線體冷凍保存方法可使經冷凍保存的粒線體維持較佳的結構完整性以及較佳的能量合成能力。
於本發明的粒線體冷凍保存實驗中，使用的粒線體取自人類的幹細胞。幹細胞的準備方式為於flask中，以含有重量百分濃度10％的胎牛血清(FBS)的培養基培養168個小時後，供後續使用，其中幹細胞可以是胚胎幹細胞、誘導型幹細胞、羊膜間葉幹細胞、胎盤間葉幹細胞、絨毛膜間葉幹細胞、臍帶間葉幹細胞、脂肪間葉幹細胞、骨髓間葉幹細胞或其它來源的成體幹細胞。
實驗用粒線體的準備步驟如下所述。首先，自培養幹細胞的培養皿中取出大約10
8個至10
9個幹細胞。接著，將取出的幹細胞與粒線體蛋白分離緩衝液(Mitochondria Isolation Buffer)裝入試管中，並利用解離器(Dissociator)均質化試管中的幹細胞與緩衝液。接著，將打破的幹細胞放入Percoll層析液中，並以適當的離心力進行數十分鐘的超高速離心，以分離出粒線體。接著，以緩衝液浸潤清洗分離出的粒線體，以便供後續實驗使用。
粒線體進行冷凍保存的方法如下所述。首先，將離心管放入液態氮中預冷30秒。接著，將離心管自液態氮中取出並於室溫下回溫10秒。接著，將先前自幹細胞中分離出的粒線體300微克(μg)以及冷凍保存劑60微升(μl)直接置入離心管底部的容置空間中。接著，輕敲離心管以確保粒線體與冷凍保存劑均集中在離心管底部。接著，將裝有粒線體與冷凍保存劑的離心管放入液態氮中並靜置10秒鐘，使粒線體與冷凍保存劑進入冷凍狀態。最後，將裝有冷凍狀態的粒線體與冷凍保存劑的離心管放入內部溫度為攝氏-80度的冰箱中進行冷凍保存。
前述粒線體進行冷凍保存的方法中使用的冷凍保存劑分別為本發明之實施例、比較例1與比較例2的冷凍保存劑。本發明之實施例、比較例1與比較例2的冷凍保存劑的組成如表一所示。
表一
| 實施例 | 比較例1 | 比較例2 | |
| 海藻糖 | 300 mM | 300 mM | 300 mM |
| HEPES | 10 mM | 10 mM | - |
| 人類血清白蛋白 | 0.1 wt% | 0.1 wt% | 0.1 wt% |
| 氯化鉀 | - | 10 mM | - |
| EGTA | - | 1 mM | - |
| EDTA | - | 1 mM | - |
解凍經冷凍保存的粒線體以供後續使用的解凍方法如下所述。首先，自冰箱中取出裝有冷凍狀態的粒線體與冷凍保存劑的離心管，並立即以攝氏30度的溫水對裝有冷凍狀態的粒線體與冷凍保存劑的離心管進行溫水浴，在溫水浴的過程中輕輕搖晃離心管55秒。接著，待離心管中的粒線體與冷凍保存劑完全解凍後，將離心管插入碎冰中以待後續使用。
接下來，使用電子顯微鏡觀察使用本發明實施例、比較例1與比較例2的冷凍保存劑進行冷凍保存3個月的粒線體，在解凍後的結構完整性。已解凍的粒線體自離心管中被取出後，先以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)進行清洗，再被製成電子顯微鏡觀察用的試片，以便進行觀察。
電子顯微鏡觀察結果如圖2至圖4所示。圖2為粒線體使用本發明實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。圖3為粒線體使用本發明比較例1之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。圖4為粒線體使用本發明比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。觀察圖2至圖4中的粒線體可發現，圖2中未破損的粒線體數量最多，未破損的粒線體的平均直徑最小，且粒線體內膜的嵴(Mitochondrial cristae)可清楚的被觀察到。相較之下，圖3中未破損的粒線體數量較少，且未破損的粒線體的平均直徑較大；圖4中未破損的粒線體數量最少，且未破損的粒線體的平均直徑最大。因此，由圖2至圖4可知，本發明實施例的冷凍保存劑雖然不含有氯化鉀、EGTA或EDTA，但使用實施例進行冷凍保存的粒線體在解凍後仍保持良好的結構完整性，並未因缺乏氯化鉀、EGTA或EDTA而具有較高的平均直徑以及較差的結構完整性。
接下來，使用海馬生物能量測定儀檢測使用本發明實施例、比較例1與比較例2的冷凍保存劑進行冷凍保存1個月與3個月的粒線體，在解凍後的能量合成能力。已解凍的粒線體自離心管中被取出後，先以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)進行清洗，再以海馬生物能量測定儀進行檢測。
海馬生物能量測定儀的測量原理與流程如下。首先，將以PBS清洗後的粒線體20微克與分析用培養基置入分析用孔盤中。接著，偵測孔中的基礎耗氧量。接著，加入二磷酸腺苷(ADP)至孔中以作為粒線體後續合成三磷酸線苷(ATP)的原料，此時測得的耗氧量即為粒線體合成三磷酸線苷的耗氧量。接著，加入三磷酸線苷合成酶抑制劑至孔中以抑制粒線體產生三磷酸線苷(ATP)，以得到三磷酸線苷合成耗氧量。三磷酸線苷合成酶抑制劑例如為寡黴素(Oligomycin)。接著，加入適當濃度的抗耦合劑至孔中，在不破壞粒線體內膜的電子傳遞鏈的情況下，讓粒線體以極限狀況空轉以評估粒線體內膜的電子傳遞鏈的耗氧能力。抗耦合劑例如為Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)。最後，加入電子傳遞鏈抑制劑至孔中以完全關閉粒線體的耗氧量，藉此確認量測的背景值。電子傳遞鏈抑制劑例如為魚藤酮(Rotenone)、抗黴素A(Antimycin A)或兩者之組合。
海馬生物能量測定儀的測量結果如表二、圖5及圖6所示。圖5為粒線體分別使用本發明實施例、比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存1個月再解凍後之氧氣消耗量示意圖。圖6為粒線體分別使用本發明實施例、比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後之氧氣消耗量示意圖。
表二
| 實施例 | 比較例1 | 比較例2 | ||||
| 1個月 | 3個月 | 1個月 | 3個月 | 1個月 | 3個月 | |
| 基礎耗氧量(pmol/min) | 319.1 (59.6) | 253.34 (21.84) | 225.1 (32.1) | 200.80 (35.20) | 202.1 (44.4) | 192.55 (10.64) |
| 非ATP合成耗氧量(pmol/min) | 524.7 (92.0) | 437.40 (18.52) | 391.0 (41.7) | 340.11 (38.83) | 369.0 (57.9) | 350.56 (21.32) |
| 合成ATP耗氧量(pmol/min) | 137.8 (8.9) | 112.19 (4.17) | 88.9 (27.9) | 97.40 (8.30) | 94.7 (4.5) | 96.87 (14.83) |
| 電子傳遞鏈 耗氧能力(pmol/min) | 334.3 (70.7) | 243.70 (4.10) | 227.7 (18.4) | 207.11 (31.07) | 223.6 (40.5) | 178.46 (4.58) |
| 量測背景值(pmol/min) | 50.3 (15.6) | 30.74 (9.77) | 30.2 (21.1) | 26.18 (3.15) | 46.0 (17.2) | 30.54 (11.97) |
| 括號內為測量值的標準差 |
如表二與圖5所示，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存1個月的粒線體相較於使用比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存1個月的粒線體，在解凍後整體的耗氧量較高，且具有明顯較高的合成ATP耗氧量以及電子傳遞鏈耗氧能力。由此可知，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存1個月的粒線體在解凍後，具有較佳的健康狀態與較佳的工作能力。如表二與圖6所示，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月的粒線體相較於使用比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月的粒線體，在解凍後整體的耗氧量較高，且具有較高的合成ATP耗氧量以及電子傳遞鏈耗氧能力。由此可知，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月的粒線體在解凍後，具有較佳的健康狀態與較佳的工作能力。
由表二、圖5及圖6可知，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存的粒線體，在解凍後具有較佳的能量合成能力。如此一來，使用實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存的粒線體，在解凍後具有應用於粒線體移植治療的潛力。
根據上述本發明所揭露的冷凍保存劑與使用其的粒線體冷凍保存方法，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的結構完整性以及較佳的能量合成能力。如此一來，經冷凍保存的粒線體可維持較佳的功能，進而在後續使用上可取得較佳的效果。
雖然本發明以前述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內，所為之更動與潤飾，均屬本發明之專利保護範圍。關於本發明所界定之保護範圍請參考所附之申請專利範圍。
無
圖1為本發明一實施例之粒線體冷凍保存方法流程圖。
圖2為粒線體使用本發明實施例之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。
圖3為粒線體使用本發明比較例1之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。
圖4為粒線體使用本發明比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後的電子顯微鏡照片。
圖5為粒線體分別使用本發明實施例、比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存1個月再解凍後之氧氣消耗量示意圖。
圖6為粒線體分別使用本發明實施例、比較例1與比較例2之冷凍保存劑進行冷凍保存3個月再解凍後之氧氣消耗量示意圖。
Claims (10)
- 一種冷凍保存劑用於冷凍保存粒線體的用途，其中該冷凍保存劑包含：海藻糖(Trehalose)；HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)；以及人類血清白蛋白(Human albumin protein)；其中，該冷凍保存劑不包含氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)、乙二醇四乙酸(EGTA)以及乙二胺四乙酸(EDTA)。
- 一種冷凍保存劑用於冷凍保存粒線體的用途，其中該冷凍保存劑由海藻糖(Trehalose)、HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及人類血清白蛋白(Human albumin protein)所組成。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中海藻糖的體積莫耳濃度為150至300 mM，HEPES的體積莫耳濃度為10至20 mM，以及人類血清白蛋白的重量百分濃度為0.1至1%。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中海藻糖、HEPES與人類血清蛋白的重量比為92.42~112.96∶2.14~2.62∶0.9~1.1。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中海藻糖的體積莫耳濃度為300 mM。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中HEPES的體積莫耳濃度為10 mM。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中人類血清白蛋白的重量百分濃度為0.1%。
- 如請求項1或請求項2所述之用途，其中該冷凍保存劑用於冷凍保存人類細胞的粒線體。
- 一種粒線體冷凍保存方法，包含：將請求項1至7中任一項所述的冷凍保存劑與複數個粒線體置入一容器中；將裝有該冷凍保存劑與該些粒線體的該容器進行降溫；以及將降溫後之裝有該冷凍保存劑與該些粒線體的該容器進行冷凍保存。
- 如請求項9所述之粒線體冷凍保存方法，更包含於將請求項1至7中任一項所述的冷凍保存劑與該些粒線體置入該容器中的步驟前，對該容器進行預冷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW111121550A TWI836467B (zh) | 2018-12-24 | 冷凍保存劑及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW111121550A TWI836467B (zh) | 2018-12-24 | 冷凍保存劑及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202236961A true TW202236961A (zh) | 2022-10-01 |
| TWI836467B TWI836467B (zh) | 2024-03-21 |
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