TW202227629A

TW202227629A - 新穎之酯酶及其用途

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Publication number: TW202227629A
Application number: TW110139876A
Authority: TW
Inventors: 文森特圖爾尼爾
Original assignee: 法商卡爾畢歐斯公司
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-07-16
Also published as: US20230399629A1; CA3195335A1; CN116529373A; JP2023546505A; WO2022090289A1; EP4237549A1; KR20230093467A; AU2021370362A1

Abstract

本發明係關於新穎之酯酶，更特別是關於具有與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比改良之活性及/或改良之熱穩定性之酯酶變異體及其於降解含聚酯材料(諸如塑膠產品)之用途。本發明之酯酶特別適合降解聚對苯二甲酸乙二酯及含有聚對苯二甲酸乙二酯之材料。

Description

新穎之酯酶及其用途

本發明係關於新穎之酯酶，更特別是關於具有與親本酯酶相比改良之活性及/或改良之熱穩定性之酯酶。本發明亦關於一種該等新穎之酯酶於降解含聚酯材料(諸如塑膠產品)之用途。本發明之酯酶特別適合降解聚對苯二甲酸乙二酯及含有聚對苯二甲酸乙二酯之材料。

酯酶能夠催化多種聚合物(包括聚酯)之水解。在此種情境下，酯酶已在多種工業應用中顯示有前景的效應，包括作為清潔劑用於餐具洗滌及洗衣應用，作為降解酵素用於加工生物質及食物，作為生物觸媒用於環境污染物之解毒或用於在紡織工業中處理聚酯織物。酯酶作為降解酵素用於水解聚對苯二甲酸乙二酯(PET)之用途尤其受到關注。實際上，PET用於大量技術領域，諸如用於製造服裝、地毯，或以熱固性樹脂之形式用於製造包裝或汽車塑膠等，使得掩埋場中的PET積聚成為日益增加之生態問題。

聚酯且特別是PET之酵素降解被認為是減少塑膠廢料積聚之受關注的解決方案。實際上，酵素可加速含聚酯材料且更特別是塑膠產品之水解，甚至上至單體層級。此外，水解產物(亦即單體及寡聚物)可經回收為用於合成新穎聚合物之材料。

在此種情況下，幾種酯酶已經識別為聚酯之候選降解酵素，且已開發此等酯酶之一些變異體。在酯酶中，角質酶(亦稱爲角質水解酶(EC 3.1.1.74))尤其受到關注。角質酶已從各種真菌(P.E. Kolattukudy，「Lipases」，B. Borg- strόm及H.L.Brockman編，Elsevier 1984，471-504)、細菌及植物花粉識別出。最近，總體基因體學方法已導致識別出另外酯酶。

然而，仍需要具有與已經知曉的酯酶相比改良之活性及/或改良之熱穩定性之酯酶，以提供更有效且因此更具競爭力之聚酯降解製程。

本發明提供與具有如SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列之親本或野生型酯酶相比展現增加之活性及/或增加之熱穩定性之新穎之酯酶。此野生型酯酶對應於Uniprot資料庫(www.uniprot.org)中D1A9G5寄存編號下參考的酯酶之胺基酸序列之胺基酸30至289且描述作具有聚酯降解活性。本發明之酯酶尤其可用於降解塑膠產品(更特別是含PET塑膠產品)之製程。

就此而言，本發明之一目標係提供一種酯酶，其(i)具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列之至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，及(ii)具有在對應於選自F209、T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258之殘基之位置處之至少一處胺基酸取代，及/或選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C之至少一處胺基酸取代，其中該等位置參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編號，(iii)具有聚酯降解活性且較佳(iv)展現與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。

較佳地，酯酶包含在選自T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251，較佳選自Q94、G135、T168、F209及S251之位置處之至少一處胺基酸取代，更佳在位置F209處，甚至更佳選自F209I/W之至少一處取代，及/或選自S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自T183E、N204C/K/R之至少一處胺基酸取代。

本發明之另一個目標係提供一種編碼本發明之酯酶之核酸。本發明亦關於一種包含該核酸之表現盒或表現載體，及關於包含該核酸、表現盒或載體之宿主細胞。

本發明亦提供一種包含本發明之酯酶、本發明之宿主細胞或其提取物之組合物。

本發明之另一個目標係提供一種製備本發明之酯酶之方法，該方法包括： (a) 在適合表現編碼酯酶之核酸之條件下培養根據本發明之宿主細胞；且視需要 (b) 從細胞培養物回收該酯酶。

本發明之另一個目標係提供一種降解聚酯之方法，該方法包括 (a) 使聚酯與根據本發明之酯酶或根據本發明之宿主細胞或根據本發明之組合物接觸；且視需要 (b) 回收單體及/或寡聚物。

特別地，本發明提供一種降解PET之方法，該方法包括使PET與至少一種本發明酯酶接觸，且視需要回收PET之單體及/或寡聚物。

本發明亦關於一種本發明之酯酶於降解PET或含PET塑膠產品之用途。

本發明亦關於一種含聚酯材料，該含聚酯材料中包含本發明之酯酶或宿主細胞或組合物。

本發明亦關於一種包含根據本發明之酯酶或宿主細胞或包含本發明之酯酶之組合物之清潔劑組合物。

定義

將藉由參考以下定義最佳地理解本發明。

本文中，術語「肽」、「多肽」、「 蛋白質」、「酵素」係指經肽鍵連接之胺基酸鏈，無論形成該鏈之胺基酸之數目如何。胺基酸在本文中由其單字母或三字母代碼根據以下命名法表示：A：丙胺酸(Ala)；C：半胱胺酸(Cys)；D：天冬胺酸(Asp)；E：麩胺酸(Glu)；F：苯丙胺酸(Phe)；G：甘胺酸(Gly)；H：組胺酸(His)；I：異白胺酸(Ile)；K：離胺醇(Lys)；L：白胺酸(Leu)；M：甲硫胺酸(Met)；N：天冬醯胺酸(Asn)；P：脯胺酸(Pro)；Q：麩醯胺酸(Gln)；R：精胺酸(Arg)；S：絲胺酸(Ser)；T：蘇胺酸(Thr)；V：纈胺酸(Val)；W：色胺酸(Trp)及Y：酪胺酸(Tyr)。

術語「酯酶」係指屬於根據酵素命名法歸類為EC 3.1.1之一類水解酶之酵素，該酵素催化酯水解為酸及醇。術語「 角質酶」或「 角質水解酶」係指根據酵素命名法歸類為EC 3.1.1.74之酯酶，該酯酶能夠催化從角質及水產生角質單體之化學反應。

術語「 野生型蛋白質」或「 親本蛋白質」係指本身天然出現的多肽之非突變形式。在本例中，親本酯酶係指具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列之酯酶。

術語「 突變體」及「 變異體」係指衍生自SEQ ID NO 1且包含在一或多個(例如幾個)位置處之至少一種修飾或變化(亦即取代、插入及/或缺失)且具有聚酯降解活性之多肽。該等變異體可藉由此項技術中熟知的各種技術來獲得。特別地，用於改變編碼野生型蛋白質之DNA序列之技術之實例包括但不限於定點誘變、隨機誘變及合成寡核苷酸建構。因此，術語「修飾」及「變化」如本文關於特定位置所用時意指該特定位置中之胺基酸與野生型蛋白質中之該特定位置中之胺基酸相比已經修飾。

「取代」意指胺基酸殘基經另一胺基酸殘基置換。較佳地，術語「取代」係指胺基酸殘基經選自天然存在之標準20個胺基酸殘基、罕見的天然存在之胺基酸殘基(例如羥脯胺酸、羥離胺酸、別羥離胺酸(allohydroxylysine)、6-N-甲基離胺酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺酸、別-異白胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、焦麩胺酸鹽、胺基丁酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸)及通常合成製備的非天然存在之胺基酸殘基(例如環己基-丙胺酸)之另一胺基酸殘基置換。較佳地，術語「取代」係指胺基酸殘基經選自天然存在之標準20個胺基酸殘基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S及T)之另一胺基酸殘基置換。符號「+」指示取代之組合。在本文件中，以下術語用於指定取代：L82A表示在本序列之位置82處之胺基酸殘基(白胺酸，L)經丙胺酸(A)取代。A121V/I/M表示在親本序列之位置121處之胺基酸殘基(丙胺酸，A)經以下胺基酸中之一者取代：纈胺酸(V)、異白胺酸(I)或甲硫胺酸(M)。取代可爲保守性或非保守性取代。保守性取代之實例係在鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸及組胺酸)、酸性胺基酸(麩胺酸及天冬胺酸)、極性胺基酸(麩醯胺酸、天冬醯胺酸及蘇胺酸)、疏水性胺基酸(甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸、半胱胺酸及纈胺酸)、芳族胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸)及小胺基酸(甘胺酸、丙胺酸及絲胺酸)之群內。

除非另作指明，否則揭示於本申請案中之位置藉由參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編號。

如本文所用，術語「 序列一致性」或「 一致性」係指兩個多肽序列之間的匹配(相同胺基酸殘基)之數目(或以百分比%表示的分數)。序列一致性係藉由在比對時比較該等序列以便最大化重疊及一致性同時最小化序列間隙來確定。特別地，可使用多種數學全局或局部比對演算法中之任何一種來確定序列一致性，取決於兩個序列之長度而定。相似長度之序列較佳使用全局比對演算法(例如Needleman及Wunsch演算法；Needleman及Wunsch，1970)比對，該演算法最佳地於整個長度之上比對序列，而實質上不同長度之序列較佳使用局部比對演算法(例如Smith及Waterman演算法(Smith及Waterman，1981)或Altschul演算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005))比對。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以在此項技術中的技能範圍內的各種方式來達成，例如，使用可在網際網路網站(諸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上可得的公開可得電腦軟體。熟習此項技術者可確定用於測定比對之適宜參數，包括達成於所比較的序列之全長上最大比對所需的任何演算法。出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係指使用逐對序列比對程式EMBOSS Needle產生的值，該比對程式使用Needleman-Wunsch演算法建立兩個序列之最佳全局比對，其中所有研究參數均設定為預設值，亦即評分矩陣 = BLOSUM62，間隙空位 = 11，間隙延伸 = 1。

「 聚合物」係指化學化合物或其結構由經共價化學鍵連接的多個單體(重複單元)組成之化合物之混合物。在本發明之上下文中，術語聚合物包括由單一類型之重複單元(亦即均聚物)或不同重複單元之混合物(亦即共聚物或異聚物)組成之天然或合成聚合物。根據本發明，「 寡聚物」係指含有2至約20個單體之分子。

在本發明之上下文中，「 含聚酯材料」或「 含聚酯產品」係指包含至少一種呈結晶、半結晶或完全非晶形式之聚酯之產品，諸如塑膠產品。在一個特定實施例中，含聚酯材料係指由至少一種塑膠材料製成的任何物品，諸如塑膠片、管、桿、型材、型料、膜、大塊體(massive block)等，其含有至少一種聚酯及視需要之其他物質或添加劑，諸如塑化劑、礦物或有機填充劑。在另一個特定實施例中，含聚酯材料係指適用於製造塑膠產品之呈熔融或固體狀態之塑膠化合物或塑膠調配物。在另一個特定實施例中，含聚酯材料係指包含至少一種聚酯之紡織品、織物或纖維。在另一個特定實施例中，含聚酯材料係指包含至少一種聚酯之塑膠廢料或纖維廢料。

在本描述中，術語「聚酯」涵蓋但不限於聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸三亞甲基酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚對苯二甲酸乙二醇異山梨糖醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)及此等聚合物之摻合物/混合物。 新穎之酯酶

本發明提供與親本酯酶相比具有改良之活性及/或改良之熱穩定性之新穎之酯酶。更特別地，本發明人已設計特別適合用於工業製程中之新穎之酵素。本發明之酯酶特別適合於降解聚酯，更特別是PET，包括含PET材料且特別是含PET塑膠產品。在一個特定實施例中，酯酶既展現增加之活性又展現增加之熱穩定性。

因此，本發明之一個目標係提供與具有如SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列之酯酶(亦稱為親本酯酶)相比展現增加之活性之酯酶。

特別地，本發明人已識別出SEQ ID NO 1所示的特定胺基酸殘基，意欲將其與酯酶之X射線結晶結構(亦即，折疊3D結構)中之聚合物受質接觸，該等殘基可經有利修飾以促進受質與酯酶之接觸且有利地導致聚合物之吸附增加及/或由此導致酯酶對該聚合物之活性增加。

在本發明之上下文中，術語「增加之活性」或「增加之降解活性」指示在給定條件(例如溫度、pH、濃度)下，與在相同條件下SEQ ID NO 1所示的酯酶降解及/或吸附於相同聚酯上之能力相比，酯酶降解聚酯之能力增加及/或吸附於聚酯上之能力增加。特別地，本發明之酯酶具有增加之PET降解活性。此種增加可比SEQ ID NO 1所示的酯酶之PET降解活性大至少10%，較佳至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%或更大。特別地，降解活性係導致聚酯之單體及/或寡聚物之解聚合活性，其可進一步進行取回且視需要再使用。

酯酶之「降解活性」可由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來評估。例如，降解活性可藉由測定特定聚合物的解聚合活性率、測定降解分散在瓊脂板中之固體聚合物化合物之速率、或測定反應器中之聚合物的解聚合活性率來評估。特別地，可藉由測定酯酶之「比降解活性」來評估降解活性。酯酶針對PET之「比降解活性」對應於反應之初始期(亦即前24小時)期間µmol經水解之PET/min或mg所產生的當量TA/小時及/mg酯酶且從反應之水解曲線之線性部分確定，該曲線係藉由在前24小時期間在不同時間進行的幾次採樣設定。作為另一個實例，「降解活性」可藉由在限定的時間期後測定在使聚合物或含聚合物塑膠產品與降解酵素接觸之情況下在溫度、pH及緩衝液之適宜條件下釋放的寡聚物及/或單體之速率及/或產率來評估。

可由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來評估酵素吸附於受質上之能力。例如，可從含有酵素之溶液來測定酵素吸附於受質上之能力且其中該酵素先前已在適宜條件下與受質一起培養。

本發明人亦已識別出SEQ ID NO 1所示的靶胺基酸殘基，且可經有利修飾以改良相應酯酶在高溫下，且有利地在高於50℃，較佳高於60℃，更佳高於65℃之溫度下之穩定性(亦即改良之熱穩定性)。

因此，本發明之一個目標係提供與具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列之酯酶(亦即親本酯酶)之熱穩定性相比展現增加之熱穩定性之新穎之酯酶。

在本發明之上下文中，且除非另有指明，否則給定溫度對應於該溫度+/- 1℃。

在本發明之上下文中，術語「增加之熱穩定性」指示與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，酯酶在高溫下，且特別是在介於50℃與90℃之間的溫度下抵抗其化學及/或物理結構之變化之能力增加。在一個特定實施例中，在介於50℃與90℃之間、介於50℃與80℃之間、介於50℃與75℃之間、介於50℃與70℃之間、介於50℃與65℃之間、介於55℃與90℃之間、介於55℃與80℃之間、介於55℃與75℃之間、介於55℃與70℃之間、介於55℃與65℃之間、介於60℃與90℃之間、介於60℃與80℃之間、介於60℃與75℃之間、介於60℃與70℃之間、介於60℃與65℃之間、介於65℃與90℃之間、介於65℃與 80℃之間、介於65℃與75℃之間、介於65℃與70℃之溫度下，與親本酯酶之熱穩定性相比，酯酶之熱穩定性改良。在一個特定實施例中，至少在65℃下，與親本酯酶之熱穩定性相比，酯酶之熱穩定性改良。

特別地，可透過評估酯酶之熔融溫度(Tm)來評估熱穩定性。在本發明之上下文中，「熔融溫度」係指所考慮的酵素群體中之一半未折疊或錯折疊所處之溫度。通常，與SEQ ID NO 1所示的酯酶之Tm相比，本發明之酯酶顯示約1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更大之增加之Tm。特別地，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，在介於50℃與90℃之間的溫度下，本發明之酯酶可具有增加之半衰期。特別地，在介於50℃與90℃之間、介於50℃與80℃之間、介於50℃與75℃之間、介於50℃與70℃之間、介於50℃與65℃之間、介於55℃與90℃之間、介於55℃與80℃之間、介於55℃與75℃之間、介於55℃與70℃之間、介於55℃與65℃之間、介於60℃與90℃之間、介於60℃與80℃之間、介於60℃與75℃之間、介於60℃與70℃之間、介於60℃與65℃之間、介於65℃與90℃之間、介於65℃與80℃之間、介於65℃與75℃之間、介於65℃與70℃之間的溫度下，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，本發明之酯酶可具有增加之半衰期。在一個特定實施例中，至少在65℃下，與親本酯酶之熱穩定性相比，酯酶之熱穩定性改良。

酯酶之熔融溫度(Tm)可由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來測定。例如，DSF可用於定量酯酶之熱變性溫度之變化且由此確定其Tm。或者，可藉由使用圓偏光二色性分析蛋白質折疊來評估Tm。較佳地，如實驗部分中所暴露，使用DSF或圓偏光二色性來測定Tm。在本發明之上下文中，進行Tm的比較，其中在相同條件(例如pH、聚酯之性質及量等)下測定Tm。

或者，可藉由在不同溫度下培養後測定酯酶之酯酶活性及/或聚酯解聚合活性且與親本酯酶之酯酶活性及/或聚酯解聚合活性比較來評估熱穩定性。亦可評估在不同溫度下進行多輪聚酯的解聚合檢定之能力。快速且有價值之測試可在於藉由暈圈直徑測定評估酯酶在不同溫度下培養後降解分散在瓊脂板中之固體聚酯化合物之能力。

因此，本發明之一個目標係提供一種酯酶，其(i)具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，及(ii)具有在選自T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F209、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251、P258、A23、T52、A55、F62、S65、S68、W71、L92、D96、R100、A121、A125、A127、E138、I152、L157、S177、P180、A182、T183、N204、N205、Q212、F213、S214、D216、T217、F221、P243、A246、I247及G248之位置處之至少一處胺基酸取代，其中該等位置係藉由參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編碼，及(iii)展現聚酯降解活性及(iv)與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。

本發明之目標係提供一種酯酶，其(i)具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，及(ii)具有在對應於選自F209、T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258之殘基之位置處之至少一處胺基酸取代，及/或選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C之至少一處胺基酸取代，其中該等位置參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編號，(iii)具有聚酯降解活性且較佳(iv)展現與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。

特別地，本發明之目標係提供一種酯酶，其(i)具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，及(ii)具有在選自由T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F209、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258組成之群之位置處之至少一處取代，其中該等位置係藉由參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編號，(iii)具有聚酯降解活性及較佳(iv)與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。特別地，取代係選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C及P258S，更佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C及P258S。

在一個特定實施例中，該酯酶包含在選自T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251之位置處之至少一處胺基酸取代，較佳選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S251C，更佳選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之至少一處取代。

在一個較佳實施例中，該酯酶包含在選自Q94、G135、T168、F209及S251之位置處之至少一處胺基酸取代，較佳選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S251C，更佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之至少一處取代。

在一個實施例中，該酯酶包含在位置F209處之至少一處取代，較佳選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M，更佳選自F209I/W，甚至更佳取代F209I之至少一處取代。

在一個實施例中，該酯酶包含在位置S251處之至少一處取代，較佳至少取代S251C。

在一個實施例中，該酯酶進一步包含在選自A23、T52、A55、F62、S65、S68、W71、L92、D96、R100、A121、A125、A127、E138、I152、L157、S177、P180、A182、T183、N204、N205、Q212、F213、S214、D216、T217、P243、A246、I247及G248，較佳選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S/Q、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W/T、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K/G、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C之位置處之至少一處取代。

在一個較佳實施例中，酯酶進一步包含在選自T183、N204及S214，較佳選自T183E/D、N204C/K/R及S214P/D，甚至更佳選自T183E、N204C/K/R及S214P之位置處之至少一處取代。

在一個特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，與SEQ ID NO 1相比，其具有在選自T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F209、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258之位置處之一至二十五處胺基酸取代，較佳選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C及P258S，更佳係選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C及P258S之一至二十五處胺基酸取代。

較佳地，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，與SEQ ID NO 1相比，其具有在選自由T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251組成之群之位置處之一至七處取代，較佳係選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S251C，更佳選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之一至七處取代。更佳地，該酯酶具有在選自由Q94、G135、T168、F209及S251C組成之群之位置處之一至五處取代，較佳係選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S251C，更佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之一至五處取代。

在一個特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比，具有在選自T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F209、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258之位置處之單一胺基酸取代，較佳係選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C及P258S，更佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C及P258S之單一取代。

較佳地，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比，具有在選自由T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251組成之群之位置處之單一胺基酸取代，較佳係選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S251C，更佳選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之單一取代。更佳地，該酯酶與SEQ ID NO 1相比具有在選自由Q94、G135、T168及F209組成之群之位置處之單一取代，較佳係選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M，更佳選自Q94G/P、G135A、T168Q及F209I/W之單一取代。

本發明之一個目標亦係提供一種酯酶，其(i)具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，(ii)具有選自由A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C組成之群之至少一處取代，及(iii)具有聚酯降解活性及較佳(iv)與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。

特別地，該酯酶具有選自由A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204C/K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C組成之群之至少一處取代。

在一個實施例中，該酯酶包含選自N204K/R之至少一處胺基酸取代及至少如親本酯酶中之胺基酸殘基S251。

在一個實施例中，該酯酶包含選自S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自S177H/Q/N、T183E、N204C、Q212D/M及S214P/D之至少一處胺基酸取代。較佳地，該酯酶包含選自T183E、N204C/K/R及S214P/D，更佳選自T183E、N204C及S214P/D之至少一處胺基酸取代。

在另一個實施例中，該酯酶進一步包含在選自T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F209、F210、M218、K220、Q238、L240、P242、S251及P258之位置處之至少一處胺基酸取代，較佳係選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C及P258S，更佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C及P258S，甚至更佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W及S251C之至少一處胺基酸取代。在一個特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比具有選自由A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204C/K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C組成之群之一至三十一處胺基酸取代。特別地，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比具有選自由S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自S177H/Q/N、T183E、N204K/R、Q212D/M及S214P/D組成之群之一至五處胺基酸取代，更佳具有選自T183E、N204K/R及S214P/D之一至三處取代。

在一個特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有選自由A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C組成之群，較佳選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204C/K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C之單一胺基酸取代。特別地，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比具有選自由S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D組成之群，較佳選自S177H/Q/N、T183E、N204K/R、Q212D/M及S214P/D，更佳選自T183E、N204K/R及S214P/D之單一胺基酸取代。

本發明之目標亦提供一種酯酶，其包含在選自T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251，較佳選自Q94、G135、T168、F209及S251之位置處之至少一處胺基酸取代，及/或選自S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自T183E、N204C/K/R及S214P/D之至少一處胺基酸取代。

特別地，該酯酶包含選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204C/K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C之至少一處胺基酸取代。特別地，該酯酶包含選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W、S251C、S177N、T183E、N204C、Q212D/M及S214P之至少一處胺基酸取代。

在一個較佳實施例中，該酯酶包含選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204C/K/R及S214P/D，較佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W、S251C、T183E、N204C及S214P，更佳選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、S251C、T183E、N204C及S214P之至少一處胺基酸取代。

在一個實施例中，該酯酶包含選自N204K/R之至少一處胺基酸取代及至少如在親本酯酶中之胺基酸殘基S251。

在一個特定實施例中，該酯酶具有與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性且具有至少在位置N204 + S251之組合處之取代，較佳係選自N204C/K/R + S251C之取代組合，更佳係組合N204C + S251C。在一個特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有取代N204C/K/R + S251C之組合，較佳係選自N204C + S251C。在一個實施例中，該酯酶具有由SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列與選自N204C/K/R + S251C，較佳N204C + S251C之取代之組合組成之胺基酸序列。

在另一個實施例中，該酯酶包含選自N204C/K/R + S251C之取代之組合，較佳係取代N204C + S251C之組合、及在選自T63、S67、Q94、G135、T168、S177、T183、F209、Q212及S214之位置處，較佳在選自Q94、G135、T168、T183、F209及S214之位置處之至少一處另外胺基酸取代，較佳係至少兩處另外取代，更佳係至少三處另外取代。較佳地，該酯酶包含取代N204C/K/R + S251C之組合，較佳係取代N204C + S251C之組合，及選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、S177H/Q/N、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、Q212D/M及S214P/D，較佳選自Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S214P/D之至少一處另外胺基酸取代，較佳至少兩處，更佳至少三處另外取代。更佳地，該取代之組合係N204C + S251C及該等另外胺基酸取代係選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、S177N、T183E、F209I/W、Q212D/M及S214P，較佳係選自Q94G/P、G135A、T168Q、T183E、F209I/W及S214P，更佳係選自Q94G、G135A、T168Q、T183E、F209I/W及S214P。

在一個較佳實施例中，該酯酶包含在位置F209 + S251 + N204處之取代之組合，較佳係選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + S251C + N204C/K/R之取代之組合，更佳係取代F209I/W + S251C + N204C之組合。

特別地，該酯酶包含在位置F209 + S251 + N204處之取代之組合及在選自T63、S67、Q94、G135、T168、S177、T183、Q212及S214之位置處，較佳在選自Q94、G135、T168、T183及S214之位置處之至少一處另外取代，較佳係至少兩處另外取代。較佳地，該酯酶包含選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M+ S251C + N204C/K/R之取代之組合及選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、S177H/Q/N、T183E、Q212D/M及S214P/D，較佳選自Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、T183E及S214P/D之至少一處另外胺基酸取代，較佳係至少兩處另外取代。更佳地，選自F209I/W + S251C + N204C之取代之組合且另外胺基酸取代係選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、S177N、T183E、Q212D/M及S214P，較佳係選自Q94G/P、G135A、T168Q、T183E及S214P，更佳選自Q94G、G135A、T168Q、T183E及S214P。

在一個實施例中，該酯酶包含至少在位置F209 + N204 + S251 + Q94之組合處之取代，較佳係選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P，更佳係選自F209I/W + N204C + S251C + Q94G，甚至更佳係F209I + N204C + S251C + Q94G。

在另一個特定實施例中，該酯酶包含選自N204C/K/R + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q212D/M、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q + T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E及F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E + T168Q，較佳選自N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C + Q94G、F209I/W + N204C + S251C + Q212M、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E + T168Q，更佳選自N204C + S251C、F209I + N204C + S251C + Q94G、F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E之至少一種取代組合。有利地，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，該酯酶既展現增加之熱穩定性又展現增加之聚酯降解活性。在一個特定實施例中，在65℃下，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，該酯酶既展現增加之熱穩定性又展現增加之聚酯降解活性。

在一個實施例中，該酯酶進一步包含在選自L14、A64、R75、E87、T88、A179、A206、N215、A219、F239、R245、D249、I250、R100、L157、I178、N205及F221之位置處之至少一處取代。較佳地，該酯酶進一步包含選自L14D/E、A64D/S、R75C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、E87A/E/F、T88E/S、A179C、A206D、N215C/D/E、A219E、F239E、R245C/E、D249E/H/S、I250T、R100Q、L157T、I178V、N205G及F221Y之至少一處取代。

在一個實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比具有選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C之一至五十六處胺基酸取代。較佳地，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D之一至十處胺基酸取代，更佳具有選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204C/K/R及S214P/D，甚至更佳選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、S251C、T183E、N204C及S214P之一至八處取代。

在一個實施例中，該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO 1相比具有選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C之單一胺基酸取代。較佳地，該單一取代係選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204K/R、Q212D/M及S214P/D，更佳係選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204K/R及S214P/D，甚至更佳係選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、T183E及S214P。

在一個特定實施例中，該酯酶之胺基酸序列由SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列組成，其與SEQ ID NO 1相比具有選自N204C + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q212D/M、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q + T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E及F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E + T168Q，較佳選自N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C + Q94G、F209I/W + N204C + S251C + Q212M、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E + T168Q，更佳選自N204C + S251C、F209I + N204C + S251C + Q94G、F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E之單一取代組合。有利地，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，該酯酶既展現增加之熱穩定性又展現增加之聚酯降解活性。在一個特定實施例中，至少在65℃下，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，該酯酶既展現增加之熱穩定性又展現增加之聚酯降解活性。

在一個實施例中，該酯酶包含選自如在親本酯酶中之C241、C257、E174、S130、D176、H208、G61、F62、M131、A70、T136、H129、G132、W155、I171、I178、R91、T217及S65之至少一個胺基酸殘基，亦即本發明之酯酶未在一個、兩個、三個等或所有此等位置處進行修飾。

在一個實施例中，該酯酶包含如在親本酯酶中至少形成該酯酶之催化位點之胺基酸S130、D176及H208及/或形成二硫鍵之胺基酸C241及C257。較佳地，該酯酶包含如在親本酯酶中之選自C241 + C257、S130 + D176 + H208及C241 + C257 + S130 + D176 + H208之至少一種組合。在一個實施例中，該酯酶包含如在親本酯酶中之組合C241 + C257 + S130 + D176 + H208 + E174 + M131。

在一個實施例中，該酯酶包含如在親本酯酶中之選自A70、T136、H129、G132、W155、I171、I178、R91、T217及S65之至少一個胺基酸。較佳地，該酯酶包含如在親本酯酶中之選自I171及I178之至少一個胺基酸，更佳係至少如在親本酯酶中之組合I171 + I178。在一個實施例中，該酯酶包含如在親本酯酶中之組合I171 + I178 + A70 + T136 + H129 + G132 + W155 + R91 + T217 + S65。

較佳地，該酯酶包含如在親本酯酶中之組合C241 + C257 + S130 + D176 + H208 + I171 + I178。 變異體之聚酯降解活性

本發明之一個目標係提供具有酯酶活性之新穎之酵素。在一個特定實施例中，本發明之酵素展現角質酶活性。

在一個特定實施例中，本發明之酯酶具有聚酯降解活性，較佳係聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性、及/或聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)降解活性及/或聚己內酯(PCL)降解活性及/或聚丁二酸丁二酯(PBS)活性，更佳係聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性、及/或聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)降解活性。甚至更佳地，本發明之酯酶具有聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性。

有利地，本發明之酯酶展現至少在20℃至90℃，較佳30℃至90℃，更佳40℃至90℃，更佳50℃至90℃，甚至更佳60℃及90℃之溫度範圍內的聚酯降解活性。特別地，本發明之酯酶展現在35℃及90℃、35℃及85℃、35℃及80℃、35℃及75℃、35℃及70℃、35℃及65℃、35℃及60℃、35℃及55℃、35℃及50℃之溫度範圍內的聚酯降解活性。在一個特定實施例中，酯酶至少展現在60℃下的聚酯降解活性。在一個特定實施例中，酯酶展現至少在65℃下的聚酯降解活性。在一個特定實施例中，酯酶展現至少在70℃下的聚酯降解活性。在一個特定實施例中，聚酯降解活性仍可在介於55℃與70℃之間的溫度下測定。如上所述，該等溫度必須視為+/- 1℃。

在一個特定實施例中，與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，在給定溫度下，且更特別地，在介於40℃與90℃之間，更佳介於50℃與90℃之間的溫度下，本發明之酯酶具有增加之聚酯降解活性。

在一個特定實施例中，該酯酶在65℃下具有比SEQ ID NO 1所示的酯酶之聚酯降解活性高至少5%，較佳至少10%、20%、50%、100%或更多之聚酯降解活性。

在一個特定實施例中，本發明之酯酶展現至少在5至9之pH範圍內，較佳在6至9之pH範圍內，更佳在6.5至9之pH範圍內，甚至更佳在6.5至8之pH範圍之可測定之酯酶活性。 核酸、表現盒、載體、宿主細胞

本發明之另一個目標係提供一種編碼如上所定義的酯酶之核酸。

如本文所用，術語「核酸」、「核酸序列」、「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核苷酸序列」係指去氧核糖核苷酸及/或核糖核苷酸之序列。核酸可爲DNA (cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。其可係呈單股形式或呈雙螺旋(duplex)形式或其混合物。其可係重組、人造及/或合成起源且其可包含經修飾之核苷酸，包含例如經修飾之鍵、經修飾之嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾之糖。本發明之核酸可呈分離或純化形式，且藉由此項技術中本身已知的技術，例如cDNA文庫之選殖及表現、擴增、酵素合成或重組技術來製備、分離及/或操縱。核酸亦可藉由熟知的化學合成技術在活體外合成，如例如Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444中所述。

本發明亦涵蓋在嚴格條件下與編碼如以上所定義的酯酶之核酸雜交之核酸。較佳地，此種嚴格條件包括在約42℃下在2X SSC/0.1% SDS中培養雜交過濾器約2.5小時，接著在65℃下在1X SSC/0.1% SDS中洗滌過濾器15分鐘四次。所使用的方案描述於Sambrook等人(Molecular Cloning: a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y. (1988))及Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))之此類參考文獻中。

本發明亦涵蓋編碼本發明之酯酶之核酸，其中該等核酸之序列或該核酸之一部分至少已使用最佳化密碼子用法進行工程化。

或者，根據本發明之核酸可從根據本發明之酯酶之序列推導出且密碼子用法可根據其中核酸將進行轉錄之宿主細胞經調適。此等步驟可根據熟習此項技術者所熟知的方法進行且其中一些方法描述於參考手冊Sambrook等人(Sambrook等人，2001)中。

本發明之核酸可進一步包含另外核苷酸序列，諸如調節區域，亦即可用於導致或調節所選宿主細胞或系統中多肽之表現之啟動子、增強子、緘默子、終止子、信號肽及類似者。

本發明進一步關於包含根據本發明之以可操作方式連接至一或多個控制序列之核酸之表現盒，該一或多個控制序列導引該核酸在適宜宿主細胞中之表現。

術語「表現」如本文所用係指涉及多肽之產生之任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。

術語「表現盒」指示包含編碼區域(亦即本發明之核酸)及調節區域(亦即包含以可操作方式連接的一或多個控制序列)之核酸構築體。

通常，表現盒包含根據本發明之以可操作方式連接至控制序列(諸如轉錄啟動子及/或轉錄終止子)之核酸，或由其組成。控制序列可包括經宿主細胞或活體外表現系統識別以用於編碼本發明之酯酶之核酸之表現之啟動子。啟動子含有介導酵素之表現之轉錄控制序列。啟動子可係在宿主細胞中顯示轉錄活性之任何聚核苷酸，包括突變體、截短及混合啟動子，且可從編碼與宿主細胞同源或異源之細胞外或細胞內多肽之基因獲得。控制序列亦可為轉錄終止子，其經宿主細胞識別以終止轉錄。終止子以可操作方式連接至編碼酯酶之核酸的3'端。在宿主細胞中具有功能性之任何終止子可用於本發明中。通常，表現盒包含根據本發明之以可操作方式連接至轉錄啟動子及轉錄終止子之核酸，或由其組成。

本發明亦關於包含如以上所定義的核酸或表現盒之載體。

如本文所用，術語「載體」或「表現載體」係指包含本發明之表現盒之DNA或RNA分子，用作將重組遺傳物質轉移至宿主細胞中之媒介物。載體之主要類型為質體、噬菌體、病毒、黏接質體及人造染色體。載體本身一般為由插入物(異源核酸序列、轉殖基因)及充當載體之「主鏈」之更大序列組成之DNA序列。將遺傳資訊轉移至宿主之載體之目的通常係分離、倍增(multiply)或表現靶細胞中之插入物。稱為表現載體(表現構築體)之載體尤其適用於靶細胞中異源序列之表現，且一般具有驅動編碼多肽之異源序列之表現之啟動子序列。一般而言，存在於表現載體中之調節元件包括轉錄啟動子、核糖體結合位點、終止子及視需要存在之操縱子。較佳地，表現載體亦含有宿主細胞中自主複製之複製起點、可選擇之標記、有限數目之有用限制酵素位點及高複本數潛力。表現載體之實例為選殖載體、經修飾之選殖載體、經專門設計之質體及病毒。提供不同宿主中適宜程度之多肽表現之表現載體係此項技術中熟知的。載體之選擇將通常取決於載體與其中意欲引入載體之宿主細胞之相容性。較佳地，表現載體為線性或圓形雙股DNA分子。

本發明之另一個目標係提供包含如上所述的核酸、表現盒或載體之宿主細胞。本發明因此關於一種根據本發明之核酸、表現盒或載體於轉化、轉染或轉導宿主細胞之用途。載體之選擇將通常取決於載體與其中必須引入載體之宿主細胞之相容性。

根據本發明，宿主細胞可以瞬時或穩定方式進行轉化、轉染或轉導。將本發明之表現盒或載體引入至宿主細胞中使得該盒或載體維持為染色體整合體或自複製染色體外載體。術語「宿主細胞」亦涵蓋由於複製期間發生的突變而與親本宿主細胞不同的親本宿主細胞之任何子代。宿主細胞可為可用於產生本發明之變異體(例如原核生物或真核生物)之任何細胞。原核宿主細胞可為任何革蘭氏陽性(Gram-positive)或革蘭氏陰性(Gram-negative)細菌。宿主細胞亦可為真核細胞，諸如酵母、真菌、哺乳動物、昆蟲或植物細胞。在一個特定實施例中，宿主細胞係選自大腸桿菌( Escherichia coli)、芽孢桿菌( Bacillus)、鏈黴菌( Streptomyces)、木黴菌( Trichoderma)、麯黴菌( Aspergillus)、酵母菌( Saccharomyces)、畢赤酵母菌( Pichia)、弧菌( Vibrio)或椰氏酵母菌( Yarrowia)之群。

可藉由熟練技術者已知的任何方法，諸如電穿孔、結合、轉導、勝任細胞轉化、原生質體轉化、原生質體融合、生物彈射擊(biolistic)「基因槍」轉化、PEG介導之轉化、脂質輔助轉化或轉染、化學介導之轉染、乙酸锂介導之轉化、脂質體介導之轉化，將根據本發明之核酸、表現盒或表現載體引入至宿主細胞中。

視需要，可將本發明之核酸、盒或載體之超過一個複本插入至宿主細胞中以增加變異體的產生。

在一個特定實施例中，宿主細胞為重組微生物。本發明確實允許微生物的工程化而具有改良之降解含聚酯材料之能力。例如，本發明之序列可用於補充已經知曉能夠降解聚酯的真菌或細菌之野生型菌株，以便改良及/或增加菌株能力。 酯酶之產生

本發明之另一個目標係提供一種產生本發明之酯酶之方法，該方法包括表現編碼酯酶之核酸且視需要回收該酯酶。

特別地，本發明係關於產生本發明之酯酶之活體外方法，該方法包括(a)使本發明之核酸、盒或載體與活體外表現系統接觸；及(b)回收所產生的酯酶。活體外表現系統為熟習此項技術者所熟知且可購買獲得。

較佳地，該產生方法包括 (a)在適合於表現核酸之條件下培養包含編碼本發明之酯酶之核酸之宿主細胞；且視需要 (b)從細胞培養物回收該酯酶。

有利地，宿主細胞為重組芽孢桿菌、重組大腸桿菌、重組麯黴菌、重組木黴菌、重組鏈黴菌、重組酵母菌、重組畢赤酵母菌、重組弧菌或重組椰氏酵母菌。

使用此項技術中已知的方法，將宿主細胞在適合於多肽的產生之營養培養基中培養。例如，細胞可藉由在適宜培養基中且在允許酵素進行表現及/或分離之條件下進行的實驗室或工業發酵罐中之搖瓶(shake flask)培養、或小規模或大規模發酵(包括連續、分批、饋料-分批或固態發酵)來培養。培養在來自商業供應商或根據公開的組成(例如在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)之目錄中)製備的適宜營養培養基中進行。

若酯酶分泌至營養培養基中，則酯酶可直接從培養物上清液回收。相反地，酯酶可從細胞溶解產物或在透化後回收。酯酶可使用此項技術中已知的任何方法來回收。例如，酯酶可從營養培養基藉由習知程序(包括但不限於收集、離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱)來回收。視需要，酯酶可藉由此項技術中已知的多種程序(包括但不限於層析(例如離子交換、親和力、疏水性、聚焦層析及尺寸排阻)、電泳程序(例如製備型等電聚焦)、差別溶解度(例如硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取)以獲得實質上純之多肽來部分或完全純化。

酯酶可以純化形式按原樣單獨地或與另外酵素組合使用，以催化涉及聚酯及/或含聚酯材料(諸如含聚酯塑膠產品)之降解及/或再循環之酵素反應。酯酶可呈可溶性形式或呈固相。特別地，其可結合至細胞膜或脂質囊泡，或結合至合成支撐物，諸如玻璃、塑膠、聚合物、過濾器、膜，例如呈珠粒、管柱、板及類似者之形式。 組合物

本發明之另一個目標係提供一種包含本發明之酯酶或宿主細胞或其含有酯酶之提取物之組合物。在本發明上下文中，術語「組合物」涵蓋任何類型之包含本發明之酯酶或宿主細胞或其含有酯酶之提取物之組合物。

本發明之組合物可包含基於組合物之總重量計0.1重量%至99.9重量%，較佳0.1重量%至50重量%，更佳0.1重量%至30重量%，甚至更佳0.1重量%至5重量%之酯酶。或者，組合物可包含5至10重量%之本發明之酯酶。

組合物可呈液體或乾燥形式，例如呈粉末之形式。在一些實施例中，組合物為凍乾產物。

組合物可進一步包含賦形劑及/或試劑等。適宜賦形劑涵蓋常用於生物化學中之緩衝液、用於調整pH之試劑、防腐劑(preservative) (諸如苯甲酸鈉、山梨酸鈉或抗壞血酸鈉、防腐劑(conservative))、保護或穩定劑(諸如澱粉)、糊精、阿拉伯膠(arabic gum)、鹽、糖(例如山梨糖醇、海藻糖或乳糖)、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、丙二醇、懸浮劑(諸如EDTA)、還原劑、胺基酸、載劑(諸如溶劑或水溶液)及類似者。本發明之組合物可藉由將酯酶與一種或幾種賦形劑混合來獲得。

在一個特定實施例中，組合物包含基於組合物之總重量計0.1重量%至99.9重量%，較佳50重量%至99.9重量%，更佳70重量%至99.9重量%，甚至更佳95重量%至99.9重量%之賦形劑。或者，組合物可包含90重量%至95重量%之賦形劑。

在一個特定實施例中，組合物可進一步包含展現酵素活性之另外多肽。熟習此項技術者將容易調適本發明之酯酶之量，取決於例如包含在組合物中之聚酯降解及/或另外酵素/多肽之性質而定。

在一個特定實施例中，將本發明之酯酶與一種或幾種賦形劑(尤其是能夠穩定或保護多肽以防降解之賦形劑)一起溶解於水性介質中。例如，可將本發明之酯酶最終與另外組分(諸如甘油、山梨糖醇、糊精、澱粉、甘油(諸如丙二酸)、鹽等)一起溶解於水中。所得混合物然後可經乾燥以便獲得粉末。熟習此項技術者熟知用於乾燥此種混合物之方法且包括但不限於凍乾、冷凍乾燥、噴霧乾燥、超臨界乾燥、下向式蒸發(down-draught evaporation)、薄層蒸發、離心蒸發、輸送機乾燥、流化床乾燥、鼓式乾燥或其任何組合。

在一個特定實施例中，組合物呈粉末形式且包含酯酶及穩定/溶解量之甘油、山梨糖醇或糊精，諸如麦芽糊精及/或環糊精、澱粉、二醇(諸如丙二酸)及/或鹽。

在一個特定實施例中，本發明之組合物包含表現本發明之酯酶之至少一種重組細胞或其提取物。「細胞之提取物」指示獲自細胞之任何級分，諸如細胞上清液、細胞碎屑(cell debris)、細胞壁、DNA提取物、酵素或酵素製劑或藉由化學、物理及/或酵素處理從細胞衍生得的任何製劑，其實質上不含活細胞。較佳提取物係酵素活性提取物。本發明之組合物可包含本發明之一個或幾個重組細胞或其提取物、及視需要之一個或幾種另外細胞。

在一個實施例中，該組合物由表現且分泌本發明之酯酶之重組微生物之培養基組成或包含其。在一個特定實施例中，組合物包含此種凍乾培養基。 酯酶之使用

本發明之另一個目標係提供使用本發明之酯酶以在有氧或無氧條件下降解及/或再循環聚酯或含聚酯材料之方法。本發明之酯酶特別適用於降解PET及含PET之材料。

因此，本發明之一個目標係使用本發明之酯酶、或相應重組細胞或其提取物、或組合物來酵素降解聚酯。

在一個特定實施例中，由酯酶所靶向之聚酯係選自聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸三亞甲基酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚對苯二甲酸乙二醇異山梨糖醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)及此等材料之摻合物/混合物，較佳係聚對苯二甲酸乙二酯。

在一個較佳實施例中，聚酯為PET，且回收至少單體(例如單乙二醇或對苯二甲酸)、及/或寡聚物(例如對苯二甲酸甲基-2-羥乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥乙基)酯4-甲酯(HEMT)及對苯二甲酸二甲酯(DMT))。

本發明之一個目標亦係使用本發明之酯酶、或相應重組細胞或其提取物、或組合物來酵素降解含聚酯材料之至少一種聚酯。

本發明之另一個目標係提供一種用於降解含聚酯材料之至少一種聚酯之方法，其中將該含聚酯材料與本發明之酯酶或宿主細胞或其提取物或組合物接觸，由此降解含聚酯材料之至少一種聚酯。

有利地，聚酯解聚合直至單體及/或寡聚物。

特別地，本發明提供一種用於降解含PET材料之PET之方法，其中將該含PET材料與本發明之酯酶或宿主細胞或組合物接觸，由此降解PET。

在一個實施例中，將至少一種聚酯降解成可再聚合之單體及/或寡聚物，其可有利地取回以便再使用。取回的單體/寡聚物可用於再循環(例如再聚合聚酯)或甲烷化。在一個特定實施例中，至少一種聚酯為PET，且取回單乙二醇、對苯二甲酸、對苯二甲酸甲基-2-羥乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥乙基)酯4-甲酯(HEMT)及/或對苯二甲酸二甲酯(DMT)。

在一個實施例中，含聚酯材料之聚酯經完全降解。

降解含聚酯材料所需的時間可根據含聚酯材料本身(亦即含聚酯材料之性質及來源、其組成、形狀等)、所使用的酯酶之類型及量以及各種製程參數(亦即溫度、pH、另外試劑等)而變化。熟習此項技術者可輕易地將該等製程參數適應於含聚酯材料及設想的降解時間。

有利地，降解製程係在包含在20℃與90℃之間，較佳在40℃與90℃之間，更佳在50℃與70℃之間的溫度下實施。在一個特定實施例中，降解製程係在60℃下實施。在另一個特定實施例中，降解製程係在65℃下實施。在另一個特定實施例中，降解製程係在70℃下實施。更一般而言，將溫度維持在低於不活化溫度，該不活化溫度對應於酯酶經不活化(亦即酯酶與其在其最佳溫度下之活性相比已喪失超過80%活性之溫度)及/或重組微生物不會再合成酯酶之溫度。特別地，將溫度維持在低於靶向聚酯之玻璃化轉變溫度(Tg)。

有利地，該製程係在連續流製程中在可使用酯酶幾次及/或再循環之溫度下實施。

有利地，降解製程係在包括在5至9之間，較佳在6至9之pH範圍內，更佳在6.5至9之pH範圍內，甚至更佳在6.5至8之pH範圍內之pH下實施。

在一個特定實施例中，含聚酯材料可在與酯酶接觸之前進行預處理，以便物理地改變其結構，以便增加聚酯與酯酶之間的接觸表面。

本發明之另一個目標係提供一種用於從含聚酯材料產生單體及/或寡聚物之方法，該方法包括將含聚酯材料暴露於本發明之酯酶或相應重組細胞或其提取物、或組合物，及視需要回收單體及/或寡聚物。

可依序或連續回收由於解聚合產生之單體及/或寡聚物。可回收單一類型之單體及/或寡聚物或幾種不同類型之單體及/或寡聚物，取決於起始含聚酯材料而定。

本發明之方法尤其適用於自PET、及/或含PET塑膠產品產生選自單乙二醇及對苯二甲酸之單體、及/或選自對苯二甲酸甲基-2-羥乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥乙基)酯4-甲基酯(HEMT)及對苯二甲酸二甲酯(DMT)之寡聚物。

所回收的單體及/或寡聚物可使用所有適宜純化方法進一步經純化且以可再聚合之形式經調節。

所回收的可再聚合之單體及/或寡聚物可再使用例如以合成聚酯。有利地，具有相同性質之聚酯經再聚合。然而，可將所回收的單體及/或寡聚物與其他單體及/或寡聚物混合，以便例如合成新穎之共聚物。或者，所回收的單體可用作化學中間體以便產生新穎之所關注化合物。

本發明亦關於一種含聚酯材料之表面水解或表面官能化之方法，該方法包括將含聚酯材料暴露於本發明之酯酶、或相應重組細胞或其提取物、或組合物。本發明之方法特別適用於增加聚酯材料之親水性或水吸收性。此種增加之親水性可在紡織品產生、電子裝置及生物醫學應用上特別受關注。

本發明之另一個目標係提供一種含聚酯材料，其中本發明之酯酶及/或表現且分泌該酯酶之重組微生物包含在內。作為一個實例，用於製備此種包含本發明之酯酶的含聚酯材料之方法揭示於專利申請案WO2013/093355、WO2016/198650、WO2016/198652、WO2019/043145及WO2019/043134中。

因此，本發明之一個目標係提供一種含聚酯材料，其含有本發明之酯酶及/或重組細胞及/或組合物或其提取物及至少PET。根據一個實施例，本發明提供包含PET及本發明之具有PET降解活性之酯酶之塑膠產品。

因此，本發明之另一個態樣係提供含有本發明之酯酶及/或重組細胞、及/或組合物或其提取物及至少PBAT之含聚酯材料。根據一個實施例，本發明提供包含PBAT及本發明之具有PBAT降解活性之酯酶之塑膠產品。

因此，本發明之另一個態樣係提供含有本發明之酯酶及/或重組細胞、及/或組合物或其提取物及至少PBS之含聚酯材料。根據一個實施例，本發明提供包含PBS及本發明之具有PBS降解活性之酯酶之塑膠產品。

因此，本發明之另一個態樣係提供含有本發明之酯酶及/或重組細胞、及/或組合物或其提取物及至少PCL之含聚酯材料。根據一個實施例，本發明提供包含PCL及本發明之具有PCL降解活性之酯酶之塑膠產品。

經典地，本發明之酯酶可用於清潔劑、食品、動物飼料(animal feed)、造紙、紡織及醫藥應用中。更特別地，本發明之酯酶用作清潔劑組合物之組分。清潔劑組合物包括但不限於手洗或機洗衣物清潔劑組合物，諸如適用於預處理經染色之織物及沖洗經添加之織物軟化劑組合物之洗衣添加劑組合物、用於一般家庭硬質表面清潔操作之清潔劑組合物、用於餐具手洗或機洗操作之清潔劑組合物。在一個特定實施例中，本發明之酯酶可用作清潔劑添加劑。因此，本發明提供包含本發明之酯酶之清潔劑組合物。特別地，本發明之酯酶可用作清潔劑添加劑以便減少紡織品清潔期間的起球及灰化效應。

本發明亦關於用於在動物飼料中使用本發明之酯酶之方法、以及包含本發明之酯酶之飼料組合物及飼料添加劑。術語「飼料」及「飼料組合物」係指適合或意圖由動物攝取之任何化合物、製劑、混合物或組合物。在另一個特定實施例中，將本發明之酯酶用於水解蛋白質，且產生包含肽之水解產物。此種水解產物可用作飼料組合物或飼料添加劑。

本發明之另一個目標係提供一種在造紙工業中使用本發明之酯酶之方法。更特別地，本發明之酯酶可用於從紙漿及造紙機之水管線移除黏著物(sticky)。實例實例 1 — 酯酶之建構、表現及純化 - 建構

已使用質體建構來產生根據本發明之酯酶。此種質體包括選殖編碼SEQ ID NO 1所示的酯酶之基因，針對介於pET-26b(+)表現載體(Merck Millipore，Molsheim，France)之 NdeI及 XhoI限制位點之間的大腸桿菌表現進行最佳化。已在SEQ ID NO 1及 NdeI限制位點之間添加編碼PelB前導序列之核苷酸序列。將經表現之融合蛋白引導至細菌周質，其中該PelB前導序列係藉由信號肽酶移除而產生與SEQ ID NO 1相同但新增C端胺基酸延伸之功能性蛋白質。已根據供應商的建議，使用兩種定點誘變套組，以產生酯酶變異體：QuikChange II定點誘變套組及QuikChange Lightning多定點，來自Agilent (Santa Clara，California, USA)。 - 酯酶之表現及純化

已成功採用菌株Stellar™ (Clontech，California, USA)及大腸桿菌BL21 (DE3) (New England Biolabs，Evry, France)以在50 mL LB-Miller培養基或ZYM自動可誘導培養基(Studier等人，2005- Prot. Exp. Pur. 41，207-234)中進行選殖及重組表現。LB-Miller培養基中之誘導已在16℃下用0.5 mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG，Euromedex，Souffelweyersheim, France)進行。已在Avanti J-26 XP離心機(Beckman Coulter，Brea, USA)中藉由離心(8000 rpm，20分鐘，在10℃下)來停止培養。已將細胞懸浮於20 mL Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 300 mM，pH 8)中。然後，將細胞懸浮液用30%幅度(2秒ON及1秒OFF循環)藉由FB 705超音波儀(Fisherbrand，Illkirch，France)進行超音波處理2分鐘。然後，已實現離心步驟：30分鐘，以10000 g，10℃，在Eppendorf離心機中。已收集可溶級分且提交至親和層析。此純化步驟已用Talon®金屬親和樹脂(Clontech, CA, USA)完成。已利用補充咪唑之Talon緩衝液之步驟進行蛋白質溶離。已針對Talon緩衝液透析經純化之蛋白質，然後使用Bio-Rad蛋白質檢定根據製造商說明書(Lifescience Bio-Rad，France)定量且儲存在+4℃。實例 2 — 評估酯酶之降解活性

已確定酯酶之降解活性且與SEQ ID NO 1所示的酯酶之活性進行比較。

已使用多種方法來評估比活性： (1)基於PET水解之比活性 (2)基於固體形式下聚酯之降解之活性 (3)基於100 mL以上之反應器中之PET水解之活性 2.1. 基於PET水解之比活性

稱取100 mg粉末形式下之非晶型PET (根據WO 2017/198786製備以達成低於20%之結晶度)且引入100 mL玻璃瓶中。將以1.38 µM在Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 0.3M，pH 8)中製備的1 mL之包含SEQ ID NO 1所示的酯酶(作為參考對照)或本發明之酯酶之酯酶製劑引入玻璃瓶中。最後，加入9 mL 0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8。

解聚合藉由在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃及150 rpm下在Max Q 4450培養箱(Thermo Fisher Scientific，Inc. Waltham，MA, USA)中培養各玻璃瓶開始。

藉由在前24小時期間在不同時間進行的採樣且藉由超高效液相層析(UHPLC)分析來確定解聚合反應之初始速率，單位為mg所產生的當量TA/小時。若需要，將樣品在0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8中稀釋。然後，將150 µL甲醇及6.5 µL HCl 6N加入至150 µL樣品或稀釋液。於混合及0.45 µm注射器過濾器上過濾後，將樣品加載於UHPLC上以監測對苯二甲酸(TA)、MHET及BHET之釋放。所使用的層析系統係Ultimate 3000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific，Inc. Waltham，MA，USA)，包括泵模組、自動取樣器、在25℃下恆溫之管柱烘箱及在240 nm下之UV偵測器。所使用的管柱係Discovery® HS C18 HPLC管柱(150 x 4.6 mm，5 µm，配備前置管柱，Supelco，Bellefonte，USA)。使用含在1 mM H ₂SO ₄中之MeOH梯度(30%至90%)以1 mL/min分離TA、MHET及BHET。注射係20 µL樣品。在除樣品相同的條件下根據從市售TA及BHET及室內合成的MHET製備的標準曲線測定TA、MHET及BHET。在反應之水解曲線之線性部分中確定PET水解之比活性(mg當量TA/小時/mg酵素)，此曲線係藉由在前72小時期間在不同時間進行的採樣設定。當量TA對應於所測得的TA及所測得的MHET及BHET中所含TA之總和。當量TA之該測定亦可用於計算在給定時間下PET解聚合檢定之產率。 2.2. 基於呈固體形式之聚酯之降解之活性

將20 µL酵素製劑沉積於含有PET之瓊脂板中創建之孔中。瓊脂板之製備藉由將500 mg PET溶解於六氟-2-丙醇(HFIP)中且將該介質倒入250 mL水溶液中來實現。在52℃下在140毫巴下HFIP蒸發後，將溶液與含有3%瓊脂之0.2M磷酸鉀緩衝液pH 8混合v/v。將約30 mL混合物用於製備各板且儲存在4℃。

測定在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小時後由於因野生型酯酶及變異體的聚酯降解而形成的暈圈之直徑或表面積且進行比較。 2.3. 基於反應器中PET水解之活性

將在80 mL 100 mM磷酸鉀緩衝液pH 8中製備的0.69 µmol至2.07 µmol之經純化之酯酶與20 g非晶型PET (根據WO 2017/198786製備以達成低於20%之結晶度)在500 mL Minibio生物反應器(Applikon Biotechnology，Delft，The Netherlands)中混合。藉由水浴浸漬來進行在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下之溫度調節且使用單一船用式葉輪(marine impeller)以維持恆定攪拌在250 rpm。藉由6N NaOH來調節PET解聚合檢定之pH且藉由my-Control生物控制器系統(Applikon Biotechnology，Delft，The Netherlands)確保在pH 8下。在檢定期間記錄鹼消耗且其可用於PET解聚合檢定之表徵。

PET解聚合檢定之最終產率藉由確定殘餘PET重量或藉由測定所產生的當量TA或透過鹼消耗來確定。殘餘PET之重量確定在反應結束時藉由過濾反應體積透過12至15 µm級11無灰濾紙(Dutscher SAS，Brumath，France)且在對其稱重之前乾燥此種滯留物來評估。使用描述於2.1中之UHPLC方法來實現所產生的當量TA之測定，且基於給定時間下之莫耳濃度(TA + MHET + BHET)相對初始樣品中所含TA之總量之比來計算水解百分比。PET解聚合產生酸單體，其將與鹼中和以能夠維持反應器中之pH。使用相應莫耳鹼消耗來計算所產生的當量TA之測定，且基於給定時間下當量TA之莫耳濃度相對初始樣品中所含TA之總量之比來計算水解百分比。

在65℃下於24小時後本發明之酯酶(變異體)之PET解聚合產率顯示於下表1中。表1指示與用作參考之SEQ ID NO 1所示的酯酶之PET解聚合產率(其PET解聚合產率視為等於1)相比，本發明之變異體之PET解聚合產率改良。

如實例2.1中所述測定PET解聚合產率。表1：與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，在65℃下於24小時後，本發明之酯酶之PET解聚合產率改良。

變異體	與 SEQ ID NO 1 相比， PET 解聚合產率之改良
V1：N204C + S251C	20.4倍
V2：F209I + N204C + S251C + Q94G	18.2倍
V3：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E	47.3倍
V4：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E	16.2倍

變異體V1至V4具有如SEQ ID NO 1所示的確切胺基酸序列，不同之處在於分別列於表1中之取代之組合。

表1顯示，所有變異體在65℃下之PET解聚合產率均至少16.2倍高於SEQ ID NO 1所示的酯酶之PET解聚合產率。

本發明之酯酶(變異體)之比降解活性顯示於下表2中。SEQ ID NO 1所示的酯酶之比降解活性用作參考且視為100%比降解活性。如實例2.1中所述在65℃下測定比降解活性。表2：本發明之變異體之比降解活性

變異體	比降解活性
V1：N204C + S251C	416%
V2：F209I + N204C + S251C + Q94G	575%
V3：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E	1486%
V4：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E	599%

變異體V1至V4具有如SEQ ID NO 1所示的確切胺基酸序列，不同之處在於分別列於表2中之取代之組合。實例 3 — 評估本發明之酯酶之熱穩定性

已測定本發明之酯酶之熱穩定性且與SEQ ID NO 1所示的酯酶之熱穩定性進行比較。

已使用不同方法以評估熱穩定性： (1) 溶液中蛋白質之圓偏光二色性； (2) 在給定溫度、時間及緩衝液條件下於蛋白質培養後之殘餘酯酶活性； (3) 在給定溫度、時間及緩衝液條件下於蛋白質培養後之殘餘聚酯解聚合活性； (4) 在給定溫度、時間及緩衝液條件下於蛋白質培養後降解分散於瓊脂板中之固體聚酯化合物(諸如PET或PBAT或類似物)之能力； (5) 在給定溫度、緩衝液、蛋白質濃度及聚酯濃度條件下進行多輪聚酯解聚合檢定之能力； (6) 差示掃描量熱法(DSF)；以下給出關於此類方法之方案之詳細內容。 3.1 圓偏光二色性

已利用Jasco 815裝置(Easton，USA)進行圓偏光二色性(CD)以比較SEQ ID NO 1所示的酯酶之熔融溫度( T _m )與本發明之酯酶之Tm。技術上，在Talon緩衝液中以0.5 mg/mL製備400 µL蛋白質樣品且用於CD。實現自280至190 nm之第一掃描以確定對應於蛋白質之正確折疊之兩個CD最大強度。然後進行自25℃至110℃之第二掃描，長度波長對應於此種最大強度且提供特定曲線(S形3參數y=a/(1+e^((x-x0)/b)))，藉由Sigmaplot 11.0版軟體分析該等曲線，當x=x0時，確定 Tm。所獲得的 T _m 反映給定蛋白質之熱穩定性。 T _m 越高，變異體在高溫下越穩定。 3.2 殘餘酯酶活性

將1 mL之40 mg/L (含在Talon緩衝液中)之SEQ ID NO 1所示的酯酶或本發明之酯酶之溶液在不同溫度(40、50、60、65、70、75、80及90℃)下培養至多10天。定期地，採集樣品，在0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8.0中稀釋1至500倍且實現對硝基苯酚丁酸酯(pNP-B)檢定。將20 µL樣品與175 µL 0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8.0及5µL pNP-B溶液在2-甲基-2丁醇(40 mM)中混合。在30℃於攪拌下進行15分鐘酵素反應，且藉由微板分光光度計(Versamax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)獲得在405 nm處之吸光度。使用所釋放的對硝基苯酚之標準曲線在水解曲線之線性部分中確定pNP-B水解之活性(初始速度以µmol pNPB/min表示)。 3.3 殘餘聚酯解聚合活性

10 mL之40 mg/L (含在Talon緩衝液中)之SEQ ID NO 1所示的酯酶之溶液及本發明之酯酶之溶液分別在不同溫度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃及90℃)下培養至多30天。定期地，取1 mL樣品，且轉移至裝納在250至500 µm下微米化之100 mg非晶型PET (根據WO 2017/198786製備以達成低於20%之結晶度)及49 mL 0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8.0之瓶中且在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下培養。150 µL緩衝液經定期取樣。需要時，將樣品在0.1M磷酸鉀緩衝液pH 8中稀釋。然後，將150 µL甲醇及6.5 µL HCl 6 N加入至150 µL樣品或稀釋液。於混合及0.45 µm注射器過濾器上過濾後，將樣品加載於UHPLC上以監測對苯二甲酸(TA)、MHET及BHET之釋放。所使用的層析系統係Ultimate 3000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific，Inc. Waltham，MA，USA)，包括泵模組、自動取樣器、在25℃下恆溫之管柱烘箱及在240 nm下之UV偵測器。所使用的管柱係Discovery® HS C18 HPLC管柱(150 x 4.6 mm，5 µm，配備前置管柱，Supelco，Bellefonte，USA)。使用含在1 mM H ₂SO ₄中之MeOH梯度(30%至90%)以1 mL/min分離TA、MHET及BHET。注射係20 µL樣品。在除樣品相同條件下根據從市售TA及BHET及室內合成的MHET製備的標準曲線測定TA、MHET及BHET。在水解曲線之線性部分中測定PET水解之活性(µmol經水解之PET/min或mg所產生的當量TA/小時)，該曲線係藉由在前24小時內在不同時間進行的採樣設定。當量TA對應於所測得的TA及所測得的MHET及BHET中所含TA之總和。 3.4 呈固體形式之聚酯之降解

1 mL之40 mg/L (含在Talon緩衝液中)之SEQ ID NO 1所示的酯酶之溶液及本發明之酯酶之溶液分別在不同溫度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃及90℃)下培養至多30天。定期地，將20 µL酵素製劑沉積於含有PET之瓊脂板中創建之孔中。含有PET之瓊脂板之製備藉由將500mg PET溶解於六氟-2-丙醇(HFIP)中且將該介質倒入250 mL水溶液中來實現。在52℃下在140毫巴下HFIP蒸發後，將溶液與含有3%瓊脂之0.2M磷酸鉀緩衝液pH 8混合v/v。將約30 mL混合物用於製備各omnitray且儲存在4℃。

在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小時後測定且比較由於因本發明之野生型酯酶及變異體之聚酯降解而形成的暈圈之直徑或表面積。在給定溫度下酵素之半衰期對應於減少暈圈直徑2倍因子所需的時間。 3.5 多輪聚酯的解聚合

在酵素反應器中評估酯酶進行連續多輪聚酯解聚合檢定之能力。Minibio 500生物反應器(Applikon Biotechnology B.V.，Delft，The Netherlands)開始於3 g非晶型PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)及100 mL之含有3 mg酯酶之10 mM磷酸鉀緩衝液pH 8。使用船用式葉輪將攪拌設定為250 rpm。藉由浸漬於外部水浴中使生物反應器熱穩定在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。藉由加入3M KOH調節pH為8。藉助BioXpert軟體V2.95監測不同參數(pH、溫度、攪拌、鹼的添加)。每20小時加入1.8 g非晶型PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)。定期採樣500 µL反應介質。

如實例2.3中所述，藉由HPLC來測定TA、MHET及BHET之量。使用經熱穩定在65℃下之Aminex HPX-87K管柱(Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules，California，United States)測定EG之量。溶離劑為5 mM K ₂HPO ₄0.6 mL.min ^-1。注射係20 µL。使用折射計來監測乙二醇。

基於在給定時間下之莫耳濃度(TA +MHET + BHET)相對包含在初始樣品中之TA之總量之比，或基於在給定時間下之莫耳濃度(EG +MHET + 2 x BHET)相對包含在初始樣品中之EG之總量之比，來計算水解百分比。降解速率以mg總的所釋放TA/小時或以mg總EG/小時計算得。

酵素之半衰期經評估為達成降解速率50%損失所需的培養時間。 3.6 差示掃描量熱法(DSF)

DSF用於藉由確定野生型蛋白質(SEQ ID NO 1)及其變異體之熔融溫度(Tm) (一半的蛋白質群體未折疊時的溫度)評估野生型蛋白質(SEQ ID NO 1)及其變異體之熱穩定性。以14 µM之濃度製備蛋白質樣品且儲存在由20 mM Tris HCl pH 8.0、300 mM NaCl組成之緩衝液A中。首先將含在DMSO中之SYPRO橙色染料5000x儲備溶液在水中稀釋至250x。將蛋白質樣品加載至白色透明96孔PCR板(Bio-Rad目錄號HSP9601)上，其中各孔含有25 µl之最終體積。各孔中蛋白質及SYPRO橙色染料之最終濃度分別為5 µM (0.14 mg/ml)及10X。每孔的加載體積如下：15 µL緩衝液A、9 µL 14 µM蛋白質溶液及1 µL 250x Sypro橙色稀釋溶液。然後用光學品質密封膠帶密封PCR板且在室溫下以2000 rpm旋轉1分鐘。然後使用CFX96即時PCR系統設置進行DSF實驗以使用450/490激發及560/580發射濾波器。將樣品以0.3℃/秒之速率從25加熱至100℃。每0.03秒採集單次螢光測定。使用Bio-Rad CFX Manager軟體從熔融曲線之一階導數之峰值確定熔融溫度。

然後將SEQ ID NO 1所示的酯酶及本發明之酯酶基於其Tm值進行比較。由於實驗之間來自不同產生之相同蛋白質之高再現性，0.8℃之ΔTm視作顯著性以比較變異體。Tm值對應於至少3次測量的平均值。

如實例3.6中所述，SEQ ID NO 1所示的酯酶之Tm經評估爲63.1℃ +/-0.4℃。

本發明之酯酶變異體之熱穩定性顯示於下表3中，以Tm值表示且根據實例3.6評估。與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，Tm之增量以括號指示。表3：本發明之酯酶之Tm

變異體	Tm
V1：N204C + S251C	73.6℃ (+10.5℃)
V2：F209I + N204C + S251C + Q94G	72.8℃ (+9.7℃)
V3：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E	77.5℃ (+14.4℃)
V4：F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E	65.2℃ (+2.1℃)

變異體V1至V4具有如SEQ ID NO 1所示的確切胺基酸序列，不同之處在於分別列於表3中之取代之組合。

<![CDATA[<110>  法商卡爾畢歐斯公司(CARBIOS)]]>
          <![CDATA[<120>  新穎之酯酶及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  B3374PC00]]>
          <![CDATA[<140> TW 110139876]]>
          <![CDATA[<141> 2021-10-27]]>
          <![CDATA[<150> EP 20306285.6]]>
          <![CDATA[<151> 2020-10-27]]>
          <![CDATA[<160>  1     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  260]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  彎曲嗜熱單孢菌]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Ala Asn Pro Tyr Gln Arg Gly Pro Asp Pro Thr Glu Ser Leu Leu Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Arg Gly Pro Phe Ala Val Ser Glu Gln Ser Val Ser Arg Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Ser Gly Phe Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Thr Thr Thr 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Gly Thr Phe Gly Ala Ile Ala Ile Ser Pro Gly Phe Thr Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Trp Ser Ser Leu Ala Trp Leu Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Val Ile Gly Ile Glu Thr Asn Thr Arg Leu Asp Gln Pro Asp 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Gly Arg Gln Leu Leu Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Thr Gln Arg 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Val Arg Asn Arg Val Asp Ala Ser Arg Leu Ala Val Ala Gly 
                  115                 120                 125             
          His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Glu Ala Ala Lys Ser Arg Thr 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Lys Ala Ala Ile Pro Ile Ala Pro Trp Asn Leu Asp Lys Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Pro Glu Val Arg Thr Pro Thr Leu Ile Ile Gly Gly Glu Leu Asp 
                          165                 170                 175     
          Ser Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ser Ile Pro Phe Tyr Asn Ser Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Asn Ala Arg Glu Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Asn Ala Ser His 
                  195                 200                 205             
          Phe Phe Pro Gln Phe Ser Asn Asp Thr Met Ala Lys Phe Met Ile Ser 
              210                 215                 220                 
          Trp Met Lys Arg Phe Ile Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asp Gln Phe Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Pro Pro Pro Arg Ala Ile Gly Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Asp Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Pro His Thr 
                      260

Claims

一種酯酶，其(i)與SEQ ID NO 1所示的全長胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，及(ii)具有在對應於選自S251、F209、T11、E12、T48、T63、S67、Q94、Y108、G135、P151、N156、D158、T168、F188、E197、E202、S207、F210、M218、K220、Q238、L240、P242及P258之殘基之位置處之至少一處胺基酸取代，及/或選自A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C之至少一處胺基酸取代，其中該等位置藉由參考SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列進行編號，(iii)具有聚酯降解活性且(iv)展現與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比增加之熱穩定性及/或增加之降解活性。
如請求項1之酯酶，其中該酯酶包含在選自T63、S67、Q94、G135、T168、F209及S251，較佳選自Q94、G135、T168、F209及S251之位置處之至少一處胺基酸取代、及/或選自S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自T183E、N204C/K/R及S214P/D之至少一處胺基酸取代。
如請求項1或2之酯酶，其中該酯酶包含至少在位置F209處之取代，較佳選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M，更佳選自F209I/W。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自T11N、E12F/H/Y/R、T48A、T63M、S67T、Q94G/P、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q、F188I、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W、F210T/A、M218I、K220E、Q238D、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N、P180E、A182R、T183E、N204C/K/R、N205K、Q212D/M、F213D/M、S214P/D、D216P、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E、I247Y/T及G248C之至少一處胺基酸取代。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D，較佳選自T63M、S67T、Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W、S251C、S177N、T183E、N204C、Q212D/M及S214P之至少一處胺基酸取代。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204C/K/R及S214P/D，較佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、F209I/W、S251C、T183E、N204C及S214P，更佳選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、S251C、T183E、N204C及S214P之至少一處胺基酸取代。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含至少在位置N204 + S251之組合之取代，較佳取代N204C + S251C之組合。
如請求項7之酯酶，其中該酯酶進一步包含在選自T63、S67、Q94、G135、T168、S177、T183、F209、Q212及S214，較佳選自Q94、G135、T168、T183、F209及S214之位置處之至少一處另外胺基酸取代。
如請求項7或8之酯酶，其中該酯酶進一步包含選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、S177H/Q/N、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、Q212D/M及S214P/D，較佳選自Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S214P/D，更佳選自Q94G、G135A、T168Q、T183E、F209I/W及S214P之至少一處取代。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含取代N204C + S251C之組合以及在選自T63、S67、Q94、G135、T168、S177、T183、F209、Q212及S214之位置處，較佳在選自Q94、G135、T168、T183、F209及S214之位置處之至少一處另外胺基酸取代，較佳至少兩處另外取代，更佳至少三處另外取代。
如請求項10之酯酶，其中該酯酶包含取代N204C + S251C之組合以及至少一處另外胺基酸取代，較佳至少兩處，更佳至少三處另外取代，該另外取代選自T63M/V、S67T、Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、S177H/Q/N、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、Q212D/M及S214P/D，較佳選自Q94G/P/N/T/Y、G135A、T168Q/V、T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M及S214P/D，更佳選自Q94G/P、G135A、T168Q、T183E、F209I/W及S214P，甚至更佳選自Q94G、G135A、T168Q、T183E、F209I/W及S214P。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含至少在位置F209 + N204 + S251 + Q94之組合處之取代，較佳選自F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P，更佳選自F209I/W + N204C + S251C + Q94G，甚至更佳F209I + N204C + S251C + Q94G之取代之組合。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含至少選自N204C/K/R + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q212D/M、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q + T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E及F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C/K/R + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E + T168Q，較佳選自N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C + Q94G、F209I/W + N204C + S251C + Q212M、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E + T168Q，更佳選自N204C + S251C、F209I + N204C + S251C + Q94G、F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E之取代之組合。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶進一步包含在選自L14、A64、R75、E87、T88、A179、A206、N215、A219、F239、R245、D249、I250、R100、L157、I178、N205及F221之位置處之至少一處胺基酸取代，較佳係選自L14D/E、A64D/S、R75C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、E87A/E/F、T88E/S、A179C、A206D、N215C/D/E、A219E、F239E、R245C/E、D249E/H/S、I250T、R100Q、L157T、I178V、N205G及F221Y之至少一處胺基酸取代。
如請求項1之酯酶，其中該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C之一至五十六處胺基酸取代，較佳具有選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204C/K/R、Q212D/M及S214P/D之一至十處胺基酸取代，更佳具有選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204C/K/R及S214P/D，甚至更佳選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、S251C、T183E、N204C及S214P之一至八處取代。
如請求項1之酯酶，其中該酯酶具有SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有選自T11N/D/E/I/M/Q/S、E12F/H/Y/R//D/E/G/L/N/P/Q/V、T48A、T63M/V、S67T、Q94G/P/N/Q/T/Y、Y108Q、G135A、P151A、N156H、D158Q、T168Q/V、F188I/Y、E197P、E202M、S207D/L、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、F210T/A、M218I、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、S251C、P258S、A23P、T52P/E、A55L、F62M、S65N/Q、S68H、W71R/D/E/M、L92W/F、D96S、R100S、A121R/W、A125G、A127G、E138R、I152Q、L157E/G/N/Q/W、S177H/Q/N/E、P180E/D、A182R、T183E/D、N204C/K/R、N205K、Q212D/M/E/H/Y、F213D/M、S214P/D、D216P/N、T217A、P243V/Y、A246Y/C/E/D、I247Y/T及G248C，較佳選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、S177H/Q/N/E、T183E、N204K/R、Q212D/M及S214P/D，更佳選自Q94G/P/N/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M、S251C、T183E、N204K/R，甚至更佳選自Q94G、G135A、T168Q、F209I、T183E及S214P之單一胺基酸取代。
如請求項13之酯酶，其中該酯酶之該胺基酸序列在於SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其具有選自N204C + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q212D/M、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + G135A + T168Q + T183E、F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E及F209I/W/A/G/H/L/N/R/S/T/M + N204C + S251C + Q94G/P + S214P/D + T183E + T168Q，較佳選自N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C、F209I/W + N204C + S251C + Q94G、F209I/W + N204C + S251C + Q212M、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E、F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I/W + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E + T168Q，更佳選自N204C + S251C、F209I + N204C + S251C + Q94G、F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + T183E及F209I + N204C + S251C + Q94G + S214P + G135A + T168Q + T183E之取代之組合。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含選自如親本酯酶中之C241、C257、E174、S130、D176、H208、G61、F62、M131、A70、T136、H129、G132、W155、I171、I178、R91、T217及S65之至少一個胺基酸殘基，較佳地，該酯酶包含選自如親本酯酶中之C241 + C257、S130 + D176 + H208及C241 + C257 + S130 + D176 + H208，更佳如親本酯酶中之C241 + C257 + S130 + D176 + H208 + E174 + M131之至少一種組合。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中該酯酶包含選自如親本酯酶中之A70、T136、H129、G132、W155、I171、I178、R91、T217及S65之至少一個胺基酸殘基，較佳選自如親本酯酶中之I171及I178之至少一個胺基酸，更佳至少組合I171 + I178，甚至更佳I171 + I178 + A70 + T136 + H129 + G132 + W155 + R91 + T217 + S65。
如前述請求項中任一項之酯酶，其中與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，該酯酶展現增加之熱穩定性以及增加之降解活性。
如請求項20之酯酶，其中與SEQ ID NO 1所示的酯酶相比，在65℃下，該酯酶展現增加之熱穩定性以及增加之聚酯降解活性。
一種編碼如請求項1至21中任一項中所定義的酯酶之核酸。
一種包含如請求項22之核酸之表現盒或載體。
一種包含如請求項22之核酸或如請求項23之表現盒或載體之宿主細胞。
一種組合物，其包含如請求項1至21中任一項中所定義的酯酶、或如請求項24之宿主細胞、或含有該酯酶之其提取物。
一種降解聚酯之方法，該方法包括 (a) 使該聚酯與如請求項1至21中任一項之酯酶或如請求項24之宿主細胞或如請求項25之組合物接觸；且視需要 (b) 回收單體及/或寡聚物。
如請求項26之方法，其中該聚酯係選自聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸三亞甲基酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚對苯二甲酸乙二醇異山梨糖醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)及此等材料之摻合物/混合物，較佳係聚對苯二甲酸乙二酯。
如請求項26或27之方法，其中步驟(a)係在包含介於20℃與90℃之間，較佳介於40℃與90℃之間，更佳介於50℃與70℃之間的溫度下實施。
如請求項26至28之方法，其中步驟(a)係在包含介於5至9之間之pH下，較佳6至9之pH範圍內，更佳在6.5至9之pH範圍內實施。
一種含聚酯材料，其含有如請求項1至21中任一項之酯酶或如請求項24之宿主細胞或如請求項25之組合物。
一種清潔劑組合物，其包含如請求項1至21中任一項之酯酶或如請求項24之宿主細胞或如請求項25之組合物。