TW202216983A - 用於病毒轉導之半自動化中空纖維系統 - Google Patents

用於病毒轉導之半自動化中空纖維系統 Download PDF

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Abstract

一種用於引入一載體之系統包括一過濾器模組，該過濾器模組界定一毛細管内空間及一毛細管外空間，該毛細管外空間與該毛細管内空間藉由一多孔膜間隔開。該系統亦包括一對毛細管内口，該對毛細管内口流體地耦接至該毛細管内空間之相對端且各自接收一轉導媒介、細胞及一載體。該系統亦包括一對毛細管外口，該對毛細管外口耦接至該毛細管外空間之相對端且與一毛細管外媒介源及一廢物容器流體連通。

Description

用於病毒轉導之半自動化中空纖維系統
本揭示案係關於用於使用中空纖維過濾器模組進行病毒轉導的半自動化方法及系統。
細胞療法利用自然轉導過程，使用為了安全性及功能性而被修飾之病毒顆粒作為遞送媒介物(載體)將治療基因引入患者細胞中。病毒載體轉導為目前細胞療法製造中用於引入治療遺傳材料的最常用之方法。
當前之製造轉導過程在使用病毒載體時係勞動密集且效率低下的，導致製造細胞療法之成本高昂且延長了生產此等療法所需之時間。因此，在製造轉導過程中，在當前技術水平中存在顯著限制。
本揭示案之一個態樣提供一種用於將一載體引入細胞中之系統。該系統包括一過濾器模組，該過濾器模組界定一毛細管内空間及一毛細管外空間，該毛細管外空間與該毛細管内空間藉由一多孔膜間隔開。該系統亦包括一對毛細管内口，該對毛細管内口流體地耦接至該毛細管内空間之相對端且各自接收一轉導媒介、細胞及一載體。該系統亦包括一對毛細管外口，該對毛細管外口耦接至該毛細管外空間之相對端且與一毛細管外媒介源及一廢物容器流體連通。
本揭示案之該態樣可包括以下可選特征中之一或多者。在一些示例中，該系統包括與該等毛細管内口中之至少一者流體連通的一收獲容器。在一些實施方案中，該系統包括一毛細管内泵，該毛細管内泵可操作以將該轉導媒介、該等細胞及該載體中之每一者的一流提供至該等毛細管内口中之至少一者。視情況地，該毛細管内泵可操作以在一第一狀態下在一第一時間段期間將該等細胞及該載體提供至該等毛細管内口且在一第二狀態下在一第二時間段期間將該轉導媒介提供至該等毛細管内口。
在一些示例中，該系統包括廢物容器，該廢物容器經由該等毛細管外口中之至少一者與該毛細管外空間連通。在一些實施方案中，該系統包括一毛細管外泵，該毛細管外泵可操作以將該毛細管外媒介之一流提供至該等毛細管外口中之每一者。在一些組態中，系統包括一毛細管外泵，該毛細管外泵可操作以將自該等毛細管外口流出的一廢物流體之一流提供至該廢物容器。
在一些實施方案中，該多孔膜為圓柱形的。在一些示例中，該多孔膜包括孔，該等孔允許具有小於約50 kDa之一大小的顆粒自該毛細管内空間穿過該等孔。在一些組態中，該毛細管内空間界定一轉導區。
本揭示案之另一態樣提供一種用於將一病毒或一非病毒載體引入細胞中的系統。該系統包括一中空纖維，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端的一毛細管内空間。該系統亦包括一外殼，該外殼圍封該一或多個中空纖維以在該中空纖維與該外殼之間自該第一端至該第二端界定一毛細管外空間，該外殼包括與該第一端相鄰的與該毛細管内空間流體連通之一第一口及與該第二端相鄰的與該毛細管内空間流體連通之一第二口。該系統亦包括一轉導媒介源，該轉導媒介源經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通。該系統進一步包括一細胞源，該細胞源包括細胞且經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通。該系統亦包括一病毒源，該病毒源包括一病毒或非病毒載體且經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通。
本揭示案之該態樣可包括以下可選特征中之一或多者。在一些示例中，該系統包括經由該第一口及該第二口中之至少一者與該毛細管内空間流體連通的一收獲容器。在一些實施方案中，該系統包括一毛細管内泵，該毛細管内泵包括與該轉導媒介源、該細胞源及該病毒源中之每一者流體連通的一入口。在一些示例中，該毛細管内泵包括經由該第一口與該毛細管内空間流體連通的一第一出口及經由該第二口與該毛細管内空間流體連通的一第二出口。
在一些組態中，該外殼包括與該細胞外空間連通之一第三口，且該系統進一步包括經由該第三口與該毛細管外空間連通之一廢物容器。在一些示例中，該系統包括經由該第三口與該毛細管外空間流體連通的一毛細管外媒介源。在一些組態中，該第三口與該毛細管内空間之該第一端相鄰設置，且該系統進一步包括一第四口，該第四口與該毛細管外空間流體連通且與該毛細管内空間之該第二端相鄰設置。在一些示例中，該廢物容器及該毛細管外媒介源中之每一者經由該第三口及該第四口中之每一者與該毛細管外空間連通。
在一些組態中，該中空纖維包括複數個中空纖維。在一些實施方案中，該中空纖維包括孔，該等孔允許具有小於約50 kDa之一大小的顆粒自該毛細管内空間穿過該等孔。
本揭示案之另一態樣提供了一種使用一中空纖維將一病毒或非病毒載體引入細胞中之方法，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端之一毛細管内空間及自該第一端至該第二端圍繞該毛細管内空間的一毛細管外空間。該方法包括將一病毒或非病毒載體裝載至該中空纖維之該毛細管內空間中且將細胞裝載至該中空纖維之該毛細管內空間中。
本揭示案之該態樣可包括以下可選特征中之一或多者。在一些示例中，將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該病毒或非病毒載體。在一些實施方案中，將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該病毒或非病毒載體。在一些組態中，將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該等細胞。
在一些示例中，將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該等細胞。視情況地，該方法可進一步包括在該中空纖維之該毛細管內空間轉導該等細胞且自該中空纖維之該毛細管內空間收獲所轉導細胞。在一些示例中，自該毛細管內空間收獲該等轉導細胞包括將一沖洗流體裝載至該中空纖維之該毛細管外空間中。在一些實施方案中，自該毛細管内空間收獲該等轉導細胞包括自該第一端或該第二端中之一者將一冲洗流體裝載至該毛細管内空間中。
在一些示例中，該方法包括自該毛細管外空間收集一廢物。在一些實施方案中，同時裝載該等細胞及病毒或非病毒載體。在一些組態中，分開裝載該等細胞及病毒或非病毒載體。在一些實施方案中，在該病毒或非病毒載體之前裝載該等細胞。在一些組態中，在該等細胞之前裝載該病毒或非病毒載體。
在一些示例中，以1x103至1x1010 細胞/ml之一濃度裝載該等細胞。在一些實施方案中，裝載該等細胞包括以隨著該中空纖維之内表面積之一大小而變的一速率裝載細胞。在一些組態中，該病毒或非病毒載體作為病毒顆粒裝載。在一些示例中，該病毒或非病毒載體作為核酸載體裝載。
在一些示例中，該方法包括以約5-100 µl/min/cm2之間的每平方厘米的該中空纖維之一内表面積的一流速來裝載該等細胞及該病毒或非病毒載體。在一些示例中，每平方厘米的該中空纖維之一内表面積的一裝載流速為約5-20 µl/min/cm2之間。在一些實施方案中，該載體得自一慢病毒、一逆轉錄病毒、一腺病毒、一腺相關病毒或一混合病毒。在一些示例中，該載體為一逆轉錄病毒。在一些實施方案中，該載體為一慢病毒。在一些示例中，該載體包括奈米顆粒、脂質體、脂顆粒、碳、非反應性金屬、明膠及/或多胺奈米球。
在一些實施方案中，細胞及病毒載體以約0.25至約4.0之一感染複數(MOI)裝載至該毛細管内空間中。在一些示例中，該等細胞及病毒載體係以約2.5之一MOI裝載至該毛細管内空間中。在一些組態中，該等細胞為B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞、祖細胞或一細胞系。
本揭示案之另一態樣提供一種藉由根據前面段落所述之方法產生的細胞群。本揭示案之另一態樣提供一種藥物組合物，該藥物組合物包括藉由根據前面段落所述之方法產生的細胞。
本揭示案之另一態樣提供一種製造一細胞治療產品之方法，該細胞治療產品包括一或多個轉導細胞。該方法包括：(i)提供一種用於轉導細胞之系統，該系統包括一中空纖維，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端的一毛細管内空間； (ii)將一群細胞及一病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中，導致該毛細管内空間中之一或多個細胞轉導；(iii)自該毛細管内空間收獲包括一或多個轉導細胞之一群細胞。
本揭示案之該態樣可包括以下可選特征中之一或多者。在一些實施方案中，該群細胞係選自αβ T細胞、 γδ T細胞、NK細胞、HSC、巨噬細胞、樹狀細胞及iPSC。在一些組態中，該病毒或非病毒載體包括一重組受體。在一些組態中，該重組受體為一嵌合抗原受體(CAR)。
在一些示例中，該等轉導細胞包括在細胞之表面上的一重組受體。在一些實施方案中，該嵌合抗原受体包括一細胞外配體結合域，該細胞外配體結合域靶向選自以下一或多者之一腫瘤抗體：CD44、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD89、CD123、CS-1、ROR1、間皮素、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、CEA、MAGE A3 TCR、EGFR、HER2/ERBB2/neu、EPCAM、EphA2、CEA及BCMA。
在一些組態中，該方法包括分離該等轉導細胞之一步驟。在一些組態中，該方法進一步包括在一生物反應器中擴增該等收獲之細胞的一步驟。在一些實施方案中，該方法進一步包括將該等收獲之細胞冷凍保存於一合適之冷凍保存媒介中的一步驟。在一些實施方案中，該系統包括與該第一端相鄰的與該毛細管內空間流體連通之一第一口及與該第二端相鄰的與該毛細管內空間流體連通之一第二口。
在一些示例中，將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該病毒或非病毒載體。在一些實施方案中，將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該病毒或非病毒載體。在一些組態中，將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該等細胞。在一些實施方案中，將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該等細胞。
在以下部分中詳細描述了本揭示案之各種態樣。部分之使用並不意謂著限製本揭示案。每個部分可適用於本揭示案之任何態樣。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」表示「及/或」。如本文所用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括單數及復數所指對象，除非上下文另有明確規定。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年6月10日提出申請之美國臨時申請案63/037,377之優先權。該先前申請案之揭示内容被視為本申請案之揭示内容的部分且藉此以全文引用之方式併入。 技術現狀
轉導係病毒感染靶細胞或宿主細胞之細胞的過程。病毒自然經歷轉導過程，且已進化到非常有效地將遺傳物質引入靶細胞。為了進行轉導，病毒顆粒必須與其靶細胞實體接觸，以首先結合、進入且最終將遺傳物質引入靶細胞中。結合經由特定之蛋白質-蛋白質相互作用發生，病毒及靶細胞上均需要正確之蛋白質。
細胞療法利用自然轉導過程，使用為了安全性及功能性而被修飾之病毒顆粒作為遞送媒介物(載體)將治療基因引入患者細胞中。病毒載體轉導為目前細胞療法製造中用於將治療遺傳物質引入細胞中的最常用之方法。
病毒轉導之當前業界方法包括靜態轉導系統、使用化學增强劑，及離心感染。下面將進一步描述此等當前業界方法中之每一者。
靜態條件下之病毒轉導係目前進行病毒轉導的最普遍之方式。在標準靜態轉導方法下，大多數轉導係在標準培養瓶或培養袋中在靜態培養條件下進行的。以此方式，病毒載體懸浮在可能为單個細胞直徑之約100-1000倍深的媒介中。使用標準靜態方法轉導面臨各種問題，導致細胞轉導效率低下。例如，使用靜態方法會導致存在保持懸浮而無法到達靶細胞之小載體顆粒。發生该情況至少部分係因為大細胞迅速沈澱到培養容器之底部。使用靜態培養方法進行轉導之最終結果为只有一小部分載體顆粒能夠僅经由擴散而到達細胞。因此，轉導效率低，且需要大量之病毒載體才能达成可觀之細胞轉導。此係因為病毒載體與靶細胞之結合係由受體/配體表達及實體接觸決定。因此，轉導率與給定細胞之局部病毒濃度成比例。需要大量病毒載體才能達到令人滿意之轉導率可能會導致成本很高，且亦導致整個細胞療法製造過程之效率低下。
細胞轉導之另一種標準方法涉及使用化學增強劑，转而增加載體與細胞之結合率。然而，使用依賴化學增強劑之方法亦很昂貴，且化學增強劑之去除在製造過程中產生了額外之阻礙。
細胞轉導之另一種標準方法為使用離心感染。離心感染係指細胞之離心接種。離心感染減小細胞佔據之體積。該技術已展現出各種負面態樣，包括例如對細胞之損害、難以擴大規模，且對於小載體通常效果較差。
用於增強病毒特別係逆轉錄病毒之轉導效率的另一種方法為藉由使用結合至逆轉錄病毒之細胞黏附性物質，諸如纖連蛋白或纖連蛋白片段CH-296 [RETRONECTIN ®(重組人纖連蛋白片段)或重組人纖連蛋白]。該方法需要將含有逆轉錄病毒載體之溶液加入到塗有重組人纖連蛋白之容器中，然後孵育一定時間，使得僅病毒載體結合到重組人纖連蛋白上，去除含有病毒感染抑制物質之上清液，然後加入靶細胞。用重組人纖連蛋白塗覆容器表面係繁瑣的且使得該方法成本相當高。此外，當需要將基因轉移至大量細胞中時，該方法難以擴大規模。 使用中空纖維系統進行細胞轉導
本揭示案係關於使用中空纖維系統轉導細胞之高效方法，諸如允許自動或半自動、高效細胞轉導的切向流體流動方法，該方法可應用於慢病毒、逆轉錄病毒及其他病毒及非病毒載體。本文描述之方法提供了一種繞過當前最先進方法之限制的中空纖維轉導方法。
圖1A示出包括一或多個中空纖維之中空纖維系統100，該一或多個纖維整合於定製設計的基於泵/閥之架構内。在本揭示案之一些實施例中，中空纖維系統100包括毛細血管內媒介容器104、細胞容器108、病毒容器112、毛細血管外媒介容器116、廢物容器120、收獲容器124、毛細管內泵128、毛細管外泵132及包括一或多個中空纖維136之過濾器模組134。如下文更詳細地描述，過濾器模組134提供了用於將各種材料引入至中空纖維系統100及逆轉錄病毒材料中之便利構件。
毛細管內媒介容器104容納毛細管內媒介或轉導媒介106，且經由轉導媒介導管140連接至毛細管內泵128。細胞容器108容納細胞110且經由細胞導管144連接至毛細管內泵128。細胞可包括B細胞、T細胞、NK (自然殺傷)細胞、單核細胞、其他淋巴細胞或前驅細胞。
病毒容器112容納病毒或載體顆粒114，且經由病毒導管148連接至毛細管內泵128。載體114可包括病毒顆粒。在其他示例中，病毒可包括核酸載體。在一些示例中，病毒源自慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒或混合病毒。在一些實施例中，病毒可包括逆轉錄病毒或慢病毒。在一些示例中，使用非病毒載體代替病毒。此處，非病毒載體可包括脂質體、脂質顆粒、碳、非反應性金屬、明膠、聚胺奈米球及/或無機奈米顆粒。非病毒載體之額外示例包括例如原生質球、紅細胞影、膠體金屬、無機奈米顆粒、DEAE葡聚醣質粒等，或其組合。在一些實施例中，無機奈米顆粒為磷酸鈣奈米顆粒。
雖然本揭示案展示了分別藉由導管140、144、148單獨地連接至毛細管内泵128之所有三個容器104、108、112，但容器104、108、112中之兩者或更多者可共用共同導管。例如，所有三個容器104、108、112可經由單個導管連接至毛細管內泵128。在另一個實施例中，細胞容器108及病毒容器112可經由獨立於轉導媒介導管140之共同導管連接至毛細血管內泵128。
毛細管內泵128接收毛細管內媒介106、細胞110及載體顆粒114中之一或多者，且以所要速率將其供應至過濾器模組134。在所示示例中，毛細管內泵128包括與過濾器模組134流體連通之第一出口152A及第二出口152B。第一出口152A經由第一毛細管內導管156A流體地耦接至過濾器模組134，且第二出口152B經由第二毛細管內導管156B流體地耦接至過濾器模組134。如圖所示，過濾器模組134經由設置於過濾器模組134之第一端處的第一毛細管内口160A連接至第一毛細管内導管156A且經由設置於過濾器模組134的相對之第二端處的第二毛細管内口160B連接至第二毛細管内導管156B。毛細管内口160A及160B可包括可操作以選擇性地調整流體/媒介至過濾器模組134中之通路的閥。
繼續參看圖1A，毛細管外媒介容器116容納毛細管外或收獲媒介118，且廢物容器120經組態以接收來自過濾器模組134之流體廢物122。毛細管外泵132經組態以在過濾器模組134與毛細管外媒介容器116及廢物容器120中之每一者之間提供流體流。此處，毛細管外泵132經由毛細管外媒介導管176與毛細管外媒介容器116連接且經由廢物導管180與廢物容器120連接。毛細管外泵132包括各自經由各別毛細管外口164A、164B連接至過濾器模組134的兩個或更多個泵口172A、172B，該等毛細管外口可包括經組態以調整毛細管外媒介118及廢物122流入及流出過濾器模組134的閥。第一毛細管外口164A經由第一毛細管外導管168A將過濾器模組134連接至毛細管外泵132之第一毛細管外泵口172A。第二毛細管外口164B經由第二毛細管外導管168B將過濾器模組134連接至毛細管外泵132之第二毛細管外泵口172B。
毛細管内泵128及毛細管外泵132中之每一者可包括可操作以在各種容器104、108、112、116、120與過濾器模組134之間提供流體流的任何類型之泵。雖然所示示例展示了體現為單個泵之每一泵128、132，但系統100之其他實施例可包括各自可操作以向或自容器104、108、112、116、120中之一或多者提供流體的複數個毛細管内泵128及/或複數個毛細管外泵132。泵128、132可實施為手動泵，諸如注射器，或實施為動力泵，諸如計量泵。視情況地，可藉由在導管140、144、148、176、180或容器104、108、112、116、120中實施之一或多個閥來調節自容器104、108、112、116、120中之每一者至泵128、132中之每一者的流。在其他示例中，每一導管140、144、148、176、180可離散地連接至獨立泵128、132，藉此藉由各別泵128、132之操作來直接調節來自每一容器104、108、112、116、120之流。
圖1B示出中空纖維136之簡化示例的水平截面。該水平截面為沿著如圖1A所示之綫1B-1B截取的中空纖維136之截面。中空纖維136可圍封在外殼137內且形成過濾器模組134之示例。如圖所示，中空纖維136内之空間界定毛細管内空間138，且中空纖維136外之空間界定毛細管外空間139。例如，毛細管外空間139為中空纖維136與外殼137之間的空間。雖然所示示例展示了單個中空纖維136界定毛細管内空間138，但應當理解，可能存在平行地佈置且共同地界定毛細管内空間138之複數個中空纖維136，諸如在圖1D中所示之示例中。過濾器模組134之一個示例為購自Repligen之MicroKros中空纖維，或類似者。繼續參看圖1A，第一毛細管内口160A及第二毛細管内口160B在中空纖維136之相對端處流體地耦接至毛細管内空間138，而第一毛細管外口164A及第二毛細管外口164B在外殼137之相對端處流體地耦接至毛細管外空間139。
圖1C示出本揭示案之中空纖維136的垂直截面。該垂直截面為沿著圖1A中所示之綫1C-1C截取的中空纖維136之截面。該垂直截面亦示出設置於外殼137内之中空纖維136。中空纖維136包括具有複數個孔之膜，該等孔界定了毛細管内空間138與毛細管外空間139之間的過濾器通道。如上所述且如圖1D中所示，複數個中空纖維136可實施在過濾器模組134中，其中所有中空纖維136均容納於外殼137內。此處，每一中空纖維136界定毛細管内空間138之離散部分。
在一個實施例中，中空纖維136為圓柱形的且具有500 µm之直徑。在一些實施例中，中空纖維之形狀為圓柱形。在一些示例中，中空纖維之直徑大於約80 μm、100 μm、150 μm、200 μm。在一些實施例中，中空纖維直徑為約250 μm、300 μm、350 μm、400 μm、450 μm、500 μm、550 μm、600 μm、650 μm、700 μm、750 μm、800 μm、850μm、900 μm、950 µm 或約1,000 µm。
在一些實施例中，中空纖維136包括具有複數種孔徑之膜。在一個實施例中，膜之孔徑為750 kD。在一些示例中，中空纖維136之膜的孔徑可在約50 kDa與100 kDa之間。在一些示例中，中空纖維136之膜的孔徑大於約50 kDa。在一些實施例中，中空纖維136之膜的孔徑為約100 kDa至約200 kDa。在一些示例中，中空纖維136之膜的孔徑為約300 kDa、400 kDa、500 kDa、30 nm、40 nm、50 nm、100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、 600 nm、700 nm、800 nm、900 nm 或 1µm。
在一些實施例中，中空纖維膜包括聚碸(PS)、改性聚醚碸(mPES)、混合纖維素酯(ME)、聚醚碸(PES)或其混合物。在一些示例中，中空纖維膜包括陶瓷、金屬或其混合物。視情況地，中空纖維膜不包括重組人纖連蛋白、纖連蛋白及/或聚凝胺(亦即，不含重組人纖連蛋白、纖連蛋白及/或聚凝胺)。在一些實施例中，可藉由用化合物塗覆中空纖維136之膜來增加載體114向細胞110中之引入。在一些實施例中，中空纖維136塗覆有重組人纖連蛋白。在一些實施方案中，中空纖維136塗覆有纖連蛋白。在一些組態中，中空纖維136之膜塗覆有聚凝胺。在一些示例中，中空纖維塗覆有重組人纖連蛋白、纖連蛋白及/或聚凝胺之混合物。 使用中空纖維系統之病毒轉導過程
如下文更詳細地解釋，根據本揭示案使用中空纖維系統100將病毒或非病毒載體引入細胞中大体上包括以下三個步驟：1)將細胞及病毒或非病毒載體引入毛細管内空間138中，2)將病毒或非病毒載體引入毛細管内空間138内之細胞中，及3)自毛細管内空間138收獲細胞及病毒或非病毒載體。在每一步驟均可調整流體流動方向。
在一些示例中，將包括轉導免疫細胞之所收獲細胞轉移至合適之生物反應器或培養容器中用於擴增。轉導細胞隨後在合適之培養媒介中擴增3至20天，隨後洗滌且懸浮於最終製劑緩衝液中，且冷凍保存在合適製劑中以備將來治療使用。
在一些示例中，一旦收獲轉導細胞，則藉由使用本領域中之合適手段，例如，使用結合在轉導細胞之細胞上表達之嵌合抗體受體(CAR)的抗體將轉導細胞與載體及非轉導細胞親和性隔離或使用流式細胞分析技術，來將轉導細胞與非轉導細胞及載體分離。可使用的本領域中之其他合適手段包括但不限於大小排除分離或用於將細胞與載體分離的某其他方法，諸如使用柱、膜等。一旦在收獲步驟之後對細胞進行隔離、分離或移除，則細胞可擴增且隨後被冷凍保存或在收獲步驟之後被冷凍保存，且被冷凍保存之細胞隨後可用於將來之治療使用。 在細胞及病毒或非病毒載體裝載期間之流體流動方向
圖2A至圖2C示出在細胞及載體裝載過程期間中空纖維系統100之組態及流體流動方向。導管140、144、148、156A、156B、168A、168B、176及180；毛細管内空間138；中空纖維136；及毛細管外空間139内之箭頭的方向指示裝載過程期間之流體流動方向。如圖2A中所示，在細胞及載體裝載過程期間，毛細管内泵128自細胞容器108接收細胞110之流及自病毒容器112接收載體114之流，但不自毛細管内媒介容器104接收毛細管内媒介106。因此，雖然容器104、108、112中之每一者可流體地耦接至毛細管内泵128，但可經由一或多個閥來選擇性地控制(例如，接通及切斷)來自該等容器中之每一者的流。
繼續參看圖2A，毛細管内泵128經由第一毛細管内導管156A及第二毛細管内導管156B中之每一者將細胞110及載體114提供至毛細管内空間138。如前所述，毛細管内導管156A、156B可經由設置於中空纖維過濾器模組134之相對端處的毛細管内口160A、160B連接至毛細管内空間138。因此，經由毛細管内導管156A、156B自中空纖維136之相對端將細胞110及載體114引入中空纖維136之毛細管内空間138，以在毛細管内空間138内產生細胞110及載體114之逆流。當細胞110及載體114自毛細管内空間138之相對端流入時，細胞110及載體114之逆流會碰撞及/或在毛細管内空間138内之公共區域處匯合以界定轉導區。因此，在下文參看圖3A至圖3C描述之轉導步驟期間，細胞110可基於該逆流而在毛細管内空間138之局部區域内進行轉導。
在裝載步驟期間，可將細胞110及載體114同時提供至毛細管内空間138。在其他示例中，可在提供載體114之前將細胞110提供至毛細血管內空間138。相反，在一些示例中，可在細胞110之前將載體114提供至毛細管内空間138。在另一個示例中，可經由兩個口160A、160B將細胞110及載體114間歇地且交替地提供至毛細管内空間138，使得在毛細管内空間138内提供細胞110及載體114之分層。視情況地，可經由口160A、160B中之一者來裝載細胞110及載體114，而口160A、160B中之另一者處於關閉狀態。
在一些實施例中，細胞以1x10 3至1x10 10細胞/ml範圍內之濃度裝載至中空纖維中。在一些實施例中，細胞以約1x10 6至1x10 9細胞/ml之濃度裝載至中空纖維中。在一些實施例中，細胞以約1x106、1 x 10 7細胞/ml、2 x 10 7細胞/ml、3 x 10 7細胞/ml、4 x 10 7細胞/ml、5 x 10 7細胞/ml、6 x 10 7細胞/ml、7 x 10 7細胞/ml、8 x 10 7細胞/ml、9 x 10 7細胞/ml或1 x 10 8細胞/ml之濃度裝載至中空纖維中。
在一些實施例中，病毒顆粒以1×10 6IU病毒/ml至1×10 9IU病毒/ml範圍內之濃度進行裝載。在一些實施例中，病毒以約1 x 10 7IU 病毒/ml、2 x 10 7IU 病毒/ml、3 x 10 7IU病毒/ml、4 x 10 7IU病毒/ml、5 x 10 7IU病毒/ml、6 x 10 7IU病毒/ml、7 x 10 7IU病毒/ml、8 x 10 7IU病毒/ml、9 x 10 7IU病毒/ml、1 x 10 8IU病毒/ml或1 x 10 9IU病毒/ml之濃度進行裝載。
在一些實施例中，裝載病毒或非病毒載體之流速隨著中空纖維136之膜的内表面積之大小而變。在一些示例中，每平方厘米的中空纖維136之膜之内表面積的流速係在0.25 ml/min/cm 2至100 ml/min/cm 2之範圍内。在一些實施例中，將細胞裝載至中空纖維中之恆定流速係在0.25 ml/min/cm 2至100 ml/min/cm 2之間。例如，在一些實施方案中，該恆定流速為約0.25 ml/min/cm 2、0.5 ml/min、1 ml/min/cm 2、5 ml/min/cm 2、10 ml/min/cm 2、15 ml/min/cm 2、20 ml/min/cm 2、25 ml/min/cm 2、30 ml/min/cm 2、35 ml/min/cm 2、40 ml/min/cm 2、45 ml/min/cm 2、50 ml/min/cm 2、55 ml/min/cm 2、60 ml/min/cm 2、65 ml/min/cm 2、70 ml/min/cm 2、75 ml/min/cm 2、80 ml/min/cm 2、85 ml/min/cm 2、90 ml/min/cm 2、95 ml/min/cm 2或100 ml/min/cm 2。
在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0之感染複數(MOI)裝載至中空纖維毛細血管內空間中。因此，在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約0.25之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約0.5之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約1.0之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約1.5之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約2.0之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約2.5之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約3.0之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約3.5之MOI進行裝載。在一些實施例中，細胞及病毒顆粒以約4.0之MOI進行裝載。
在細胞110及載體114裝載於毛細管内空間138内之情況下，中空纖維136將細胞110及載體114保持於中空纖維136之毛細管内空間138内且進行濃縮。結果，細胞110及載體114濃縮於毛細管內空間138中(例如，在中空纖維136之膜的內表面上。來自細胞110及載體114之廢物或流體122穿過中空纖維136之孔自毛細管内空間138傳遞至毛細管外空間139。如圖2B中所示，廢物122在相反方向上經毛細管外空間139流至設置於過濾器模組134之相對端處的毛細管外口164A、164B。此處，廢物122朝向毛細管外口164A、164B之相對流導致廢物122之外出流相對於細胞110及載體114之進入流的交叉流。廢物122自毛細管外口164A、164B經由毛細管外導管168A、168B行進至毛細管外泵132之毛細管外泵口172A、172B，且隨後藉由泵132經由廢物導管180排放至廢物容器120。 病毒或非病毒載體引入期間之流體流動方向
一旦細胞110及載體114裝載至毛細管内空間138中，則中空纖維系統100經組態以將毛細管内媒介106引入至毛細管内空間以促進轉導。毛細管内流體裝載步驟促進毛細管内空間138中(例如，在中空纖維136之膜的内表面上)之細胞110與載體114相互作用，藉此導致載體114結合至細胞110且載體顆粒114隨之進入細胞110中。圖3A至圖3C示出在轉導過程期間中空纖維系統100之組態及流體流動方向。箭頭方向指示在轉導過程期間各別材料122、140之流體流動方向。如圖3A中所示，在轉導過程期間，細胞容器108及病毒容器112並未與毛細管内泵128流體連通，而毛細管内媒介容器104與毛細管内泵128流體連通。因此，毛細管內泵128接收毛細管內媒介106之流，但不接收細胞110或載體114。
繼續參看圖3A，毛細管内泵128經由第一毛細管内導管156A及第二毛細管内口156B中之每一者將毛細管内媒介提供至毛細管内空間138以開始載體引入。因此，像細胞110及載體114一樣，毛細管内媒介106可自中空纖維136之相對端裝載於毛細管内空間138中。在一個實施例中，轉導時間為約90分鐘。
可使用連續且恆定之流體流以低流速將毛細管内媒介106提供至毛細管内空間138以防止病毒擴散遠離細胞。在一些實施例中，將病毒或非病毒載體引入細胞中之恆定流速係在10 µl/min至5 ml/min之間。在一些實施例中，將載體轉導至細胞中之恆定流速係在10 µl/min至5 ml/min之間。例如，在一些實施例中，該恆定流速為約10 µl/min、25 µl/min、50 µl/min、100 µl/min、250 µl/min、500 µl/min、750 µl/min、1 ml/min、2 ml/min、3 ml/min、4 ml/min或5 ml/min。
在一些實施例中，細胞及病毒或非病毒載體經受流體流達約5分鐘至約幾天。在一些實施例中，細胞及病毒經受流體流達5分鐘至約18小時。在一些實施例中，細胞及病毒經受流體流達約60分鐘至約120分鐘。在一些實施例中，細胞及病毒經受流體流達約90分鐘。在一些實施例中，在轉導之後，細胞在中空纖維系統中進一步培養幾週。
在轉導過程期間，流體經由口160A、160B進入過濾器模組134之毛細管内空間，且自毛細管内空間138穿過中空纖維136之口且流出至毛細管外空間139。來自轉導過程之廢物或流體122穿過中空纖維136之孔自毛細管内空間138傳遞至毛細管外空間139。如圖3B中所示，廢物122在相反方向上經毛細管外空間139流至設置於過濾器模組134之相對端處的毛細管外口164A、164B。此處，廢物122朝向毛細管外口164A、164B之相對流導致廢物122之外出流相對於毛細管内媒介140之進入流的交叉流。自毛細管外口164A、164B，毛細管外泵132經由毛細管外導管168A、168B接收廢物122且隨後經由廢物導管180將廢物122排放至廢物容器120。 收獲細胞及病毒或非病毒載體期間之流體流動方向
在圖3A至圖3C中所示之轉導過程之後，系統100經組態以自毛細管内空間138收獲轉導細胞126。圖4A至圖4C示出了在細胞收獲過程期間中空纖維系統100之組態及流體流動方向。箭頭方向指示在細胞收獲過程期間之流體流動方向。如圖4A中所示，在收獲過程期間，毛細管外泵132經由毛細管外口164A、164B中之每一者將來自毛細管外媒介容器116的毛細管外媒介118之流提供至毛細管外空間139。如圖4B及圖4C中所示，毛細管外媒介118自毛細管外空間139傳遞至毛細管内空間138以使轉導細胞126自毛細管内空間138移位。例如，毛細管外媒介118經由毛細管外口164A、164B中之每一者引入至過濾器模組134之毛細管外空間以最大化轉導細胞126自中空纖維136之膜的內表面至毛細管內空間138中的移位。
繼續參看圖4A，毛細管內泵128亦可將毛細管內媒介106 (或其他沖洗流體)之流自毛細管內媒介容器104提供至毛細管內空間138，以自毛細管內空間沖洗所釋放之轉導細胞126。然而，不同於在轉導過程期間(圖3A至圖3C)，在該過程中毛細管內媒介106係經由兩個毛細管內口160A、160B自中空纖維136之兩端提供，在收獲過程期間，毛細管內媒介106僅經由一個毛細管內口160A提供以開始通過毛細管內空間138之單向流。通過毛細管內空間之重複單向流體流允許經由另一個毛細管內口160B將轉導細胞126自毛細管內空間138收獲至收獲容器124。
在一些示例中，轉導細胞126係在完全培養基中自毛細管內空間138收獲，且隨後直接轉移至合適之生物反應器或培養容器。然後將轉導細胞在產品相關培養緩衝液中擴增一段擴增期(例如，3天至20天)。一旦擴增，在冷凍用於治療用途之前，將細胞洗滌且懸浮在最終製劑緩衝液中。在其他示例中，轉導細胞126可在最終製劑緩衝液中自毛細血管內空間138收獲。此處，將轉導細胞126引入用於靶細胞大小選擇及去除多餘病毒的基於膜、柱或其他之過程。然後將選定之靶細胞冷凍以備將來治療之用。 使用半自動化中空纖維系統進行逆轉錄病毒及慢病毒轉導 實施例 1. 使用半自動化中空纖維 系統對 T 細胞進行無重組人纖連蛋白之逆轉錄病毒轉導
本實施例說明了一項研究，該研究演示了使用半自動化中空纖維系統對T細胞進行無重組人纖連蛋白之逆轉錄病毒轉導。此實施例比較了在六種不同條件下達成之轉導率：a)僅未轉導(UTD)靜態袋，b)無重組人纖連蛋白(RN)塗層之靜態袋，細胞與病毒共孵育90分鐘，c)孵育90分鐘的具有重組人纖連蛋白塗層之靜態袋，d)無重組人纖連蛋白塗層之靜態袋，細胞與病毒共孵育過夜，e)有重組人纖連蛋白塗層之靜態袋，細胞與病毒共孵育過夜(標準過程)，及f)不含重組人纖連蛋白之半自動化中空纖維系統，細胞與病毒共孵育90分鐘。所有六種條件之比較轉導率示出於圖5中。
在此實施例中，製備三倍稀釋之逆轉錄病毒以確定最佳感染範圍。將CD4/CD8分離之T細胞解凍且活化48小時。在靜態對照條件下，將700萬個預活化之T細胞以100萬個細胞/mL之濃度放入培養袋中。然後將此等預活化之細胞用病毒(MOI 2.5)轉導過夜或轉導90分鐘。製備重組人纖連蛋白對照物，且細胞袋用重組人纖連蛋白以10 µg/mL塗佈過夜。塗佈有重組人纖連蛋白之袋與逆轉錄病毒一起預孵育2小時。
在半自動化中空纖維系統100中，將細胞及病毒以MOI 2.5裝載至過濾器模組134中且轉導90分鐘。在中空纖維系統100中不使用重組人纖連蛋白。在90分鐘之轉導過程結束時，自過濾器模組134收獲細胞及病毒，隨後洗滌以去除病毒，然後將細胞鋪板在GREX-6M中。過夜轉導之靜態袋細胞在第二天亦經歷了類似過程。所有細胞在轉導後擴增5天，然後被收獲以用於流分析。
資料表明，當細胞轉導之時間間隔類似時，塗佈有重組人纖連蛋白之袋論證了與無重組人纖連蛋白塗層之袋相比較高之轉導率。例如，孵育90分鐘的具有重組人纖連蛋白塗層之靜態袋表明了與無重組人纖連蛋白塗層且孵育了類似時間間隔之靜態袋相比較高之轉導率，如圖5中所示。類似地，孵育過夜的具有重組人纖連蛋白塗層之靜態袋表明了與孵育過夜的無重組人纖連蛋白塗層之靜態袋相比較高之轉導率，如圖5中所示。孵育90分鐘的無重組人纖連蛋白塗層之半自動化中空纖維系統100演示了與孵育過夜的具有重組人纖連蛋白塗層的靜態袋(亦即，標準過程)之轉導率大致相同的轉導率，如可在圖5中清楚地看出。
另外，在轉導之後，自袋中收獲之細胞(亦即，靜態對照)與自中空纖維收獲之細胞的存活性無顯著差異，如圖6中所示。類似地，在袋中轉導之細胞與在中空纖維系統中轉導之細胞之間，細胞之擴增或繁殖無明顯差異。 實施例 2. 使用半自動化中空纖維系統對 NK 細胞進行無重組人纖連蛋白之逆轉錄病毒轉導
本實施例說明了一項概念驗證研究，該研究演示了使用中空纖維系統對NK細胞進行逆轉錄病毒轉導。本實施例比較了在兩種不同條件下達成之轉導率：a)孵育90分鐘的無重組人纖連蛋白塗層之靜態板，b)孵育90分鐘的無重組人纖連蛋白塗層之半自動化中空纖維系統100。該兩種條件之比較轉導率示出於圖7中。
在該實施例中，將逆轉錄病毒製備為最佳感染範圍。分離新鮮臍帶血NK細胞，且在轉導前活化6天。在靜態對照條件下，將100萬個細胞/mL濃度之500萬個預活化NK細胞用病毒(MOI 2)轉導90分鐘。在半自動化中空纖維系統中，將細胞及病毒以MOI 2裝載至中空纖維中且轉導90分鐘。在90分鐘之轉導過程結束時，自中空纖維系統100收獲細胞及病毒，隨後進行洗滌以去除病毒，然後將細胞鋪板在組織培養板中。轉導之靜態細胞亦經歷了類似過程。所有細胞在轉導後擴增9天，然後被收獲以用於流分析。
資料表明，與靜態板對照組相比，中空纖維系統表現出更高的進入NK細胞之轉導率，如圖7所示。 實施例 3. 使用半自動化中空纖維系統進行慢病毒轉導
本實施例說明了一項概念驗證研究，該研究演示了使用半自動化中空纖維系統進行慢病毒轉導。此實施例比較了在四種不同條件下達成之轉導率：a)未轉導之 袋(亦即，僅靜態袋)，b)孵育90分鐘之靜態袋，c)孵育過夜之靜態袋，及d)孵育 90分鐘之半自動化中空纖維。所有該四種條件之比較轉導率示出於圖8中。
在本實施例中，使用帶有ZsGreen報告基因之慢病毒載體。將CD4/CD8分離之T細胞解凍且活化48小時。製備一瓶細胞及病毒混合物[感染複數(MOI)為1]，然後分裝到單獨小瓶中以確保MOI相等。
在靜態對照條件下，將700萬個預活化之T細胞以100萬個細胞/mL之濃度放入細胞袋中。然後將此等預活化之細胞用病毒以MOI 1轉導過夜或轉導90分鐘。
在半自動化中空纖維系統中，細胞/病毒混合物被裝載至中空纖維中且轉導90分鐘。在90分鐘之轉導過程結束時，自中空纖維收獲細胞及病毒，隨後洗滌以去除病毒，然後將細胞鋪板在GREX-6M中。過夜轉導之細胞在第二天亦經歷了類似過程。所有細胞在轉導後擴增5天，然後被收獲以用於流分析。
與轉導90分鐘之靜態袋相比，過夜轉導之靜態袋顯示出更高之轉導率，如圖8中所示。與過夜孵育之靜態袋相比，僅孵育90分鐘之半自動化中空纖維系統100顯現出約1.4倍高之轉導，如可在圖8清楚看到。另外，在轉導之後，自袋收獲之細胞與自中空纖維收獲之細胞的存活性無明顯差異。類似地，在轉導之後，袋與中空纖維之間無明顯之膨脹差異。 用於細胞治療轉導之半自動化中空纖維系統
圖9示出用於細胞治療轉導之中空纖維系統200之另一示例的示意佈局。該佈局具有輸入材料206、210、214、218、輸出材料222、226及中空纖維236。
輸入材料包括轉導媒介206、細胞210、載體214及回收/收獲媒介218。用於輸入材料之每個容器204、208、212、216亦連接至氣泡感測器284及閥260A-260D，該閥控制輸入材料206、210、214至中空纖維236之流。氣泡感測器284A-D偵測輸入材料206、210、214、218中氣泡之存在且幫助確保中空纖維236接收無氣泡輸入材料206、210、214、218。
輸出材料包括收獲之細胞226及廢物222。每一輸出材料之容器220、224亦連接至一或多個口164A、164B，該一或多個口控制流體/媒介自中空纖維236至輸出材料容器220、224之流。
中空纖維236經由閥260E-260G、264A-264D及壓力感測器288連接至若干泵228A、228B、232。此等泵228A、228B、232控制在細胞及病毒裝載過程、轉導過程及收獲過程期間流體流向中空纖維236之毛細管內空間及毛細管外空間的速率，該等過程係用中空纖維236以上文相對於中空纖維236描述之類似方式來進行。
本文所揭示之系統及方法藉由使用中空纖維系統增加載體與靶細胞之間的接觸而顯著地提高病毒或非病毒載體引入至細胞中之效率。以此方式，大量細胞暴露於允許細胞有效轉導之足夠載體濃度。此會減少用於轉導細胞之時間，同時亦最小化載體浪費。因此，本揭示案提供不僅減少用於達成細胞高轉導之載體總量且亦顯著地減少轉導時間的系統及方法。因此，在一個態樣中，與習知轉導系統相比，本文所描述之系統及方法以降低之成本達成有效之細胞轉導。本文揭示之系統及方法的額外好處包括轉導細胞之量增加、在轉導過程期間消耗之病毒減少、過程時間減少及製造成本降低。此轉而使患者受益，至少因為該等方法允許更快之處理時間，且產生更有效之治療方法。
本文所描述之方法使用實現自中空纖維之一側至中空纖維之另一側的切向流體流的中空纖維系統。該中空纖維系統包括一或多根中空纖維。該中空纖維包括允許跨越膜之切向流體流的多孔圓柱形表面。切向流體流使載體與細胞接觸/接近，藉此促使病毒轉導效率提高。
中空纖維之多孔圓柱形表面允許流體及小分子流過，但同時不允許細胞及較大分子流過。因此，在本文所描述之一些實施例中，該中空纖維包括選擇性地允許某些分子流過及流出中空纖維但同時保留細胞及其他較大分子的孔徑。此外，如本文所描述之中空纖維可經調整為具有50kDa至1μm之間的孔隙率以進一步增強所需之流特性以達成將病毒或非病毒載體引入靶細胞或宿主細胞之高效率。中空纖維之孔隙率亦可基於將使用之病毒或非病毒載體之大小來調整。在一些實施例中，中空纖維之孔徑為病毒或非病毒顆粒之大小的四分之一。在一些實施例中，中空纖維之孔徑為病毒或非病毒顆粒之大小的三分之一。在一些實施例中，中空纖維之孔徑為病毒或非病毒顆粒之大小的一半。可進行調整以進一步最佳化病毒或非病毒載體引入至靶細胞或宿主細胞中之效率的中空纖維之另一參數為中空纖維自身之直徑。 轉導細胞之用途
使用本文所描述之方法與病毒或非病毒載體一起引入的細胞允許將該等細胞用於修飾細胞可具有之任何目的。修飾細胞保持高存活性(例如，大於70%、75%、80%、85%、或90%，或直至98%)且可用於各種應用，諸如用於細胞治療目的，諸如，例如，在過繼細胞治療應用中。
在一些實施例中，使用中空纖維系統之轉導細胞的存活性及繁殖與使用過夜靜態條件之轉導細胞的存活性及繁殖相同。 過繼細胞療法
除其他外，本文所描述之方法可用於對細胞進行基因工程改造以用於各種治療方法，包括例如用於過繼細胞治療應用。
過繼細胞療法(「ACT」)係指將自體或同種異體細胞輸注到患者體內以治療疾病。多種細胞類型可用於基於ACT之療法，諸如B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞、前驅細胞或細胞系。前驅細胞可直接自患者或非患者供體中分離。前驅細胞包括例如來自患者或非患者供體的成體幹細胞及多能細胞，諸如iPSC。在一些實施例中，ACT使用基因修飾之造血幹細胞(「HSC」)移植。
造血幹細胞(「HSC」)移植為一類ACT方法，涉及輸注自體或同種異體幹細胞，以在骨髓或免疫系統受損或有缺陷之患者中重建造血功能。其亦允許引入基因修飾HSC，例如，治療先天性遺傳疾病。在典型HSC移植中，HSC自骨髓、外周血或臍帶血中獲得。
在一些實施例中，自外周血獲得之細胞經過基因工程改造以用於ACT方法。外周血用於自體移植，因為與骨髓或臍帶血相比，幹細胞及前驅細胞含量高。此外，自外周血獲得之HSC在移植後顯示出更快之植入。由於外周血中之HSC濃度較低，通常會使用動員劑處理供體，諸如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，此會影響HSC至骨髓環境之黏附且将其釋放至外周血中。
在一些實施例中，本文描述之方法用於對基於T細胞免疫療法之ACT方法的T細胞進行基因修飾。T細胞免疫療法為另一類ACT方法，且涉及輸注自體或同種異體T淋巴細胞，該等T淋巴細胞在 體外被選擇及/或改造以靶向特定抗原，諸如例如腫瘤相關抗原。T淋巴細胞通常藉由白細胞去除術自供體之外周血中獲得。在一些T細胞免疫治療方法中，自供體獲得之T淋巴細胞，例如腫瘤浸潤淋巴細胞(「TIL」)，在培養物中擴增且針對抗原特異性進行選擇，而不改變其天然特異性。在其他T細胞免疫治療方法中，自供體獲得之T淋巴細胞經過 體外工程改造，通常係藉由用病毒表達載體轉導，以表達預定特異性之嵌合抗原受體（「CAR」）。CAR通常包括細胞外域，諸如來自scFv之結合域，該細胞外域賦予對所要抗原之特異性；跨膜域；及一或多個觸發T細胞效應器功能之細胞內域，諸如來自CD3ζ或FcRγ之細胞內域，且視情況地，所繪出之一或多個共刺激域，例如來自CD28及/或4-1BB。在其他T細胞免疫治療方法中，自供體獲得之T淋巴細胞經過 體外工程改造，通常藉由用病毒表達載體轉導，以表達T細胞受體(「TCR」)，該等T細胞受體賦予在HLA等位基因之特定背景下呈現的抗原所需之特異性。
在一些實施例中，本文所描述之方法用於基因修飾造血幹細胞(HSC)。在一些實施例中，HSC要經歷額外處理以擴增HSC群或藉由本文所描述之重組方法進行操縱以在移植至受體之前將異源基因或額外功能性引入同種異體HSC中。在某些實施例中，該額外處理導致HSC成熟。
自供體獲得之HSC (自體或同種異體)在移植至受體中之前可經歷額外處理。在一些實施例中，HSC經處理以擴增HSC群，例如藉由在合適媒介中培養一或多個HSC。
在一些實施例中，藉由重組方法來操縱HSC (自體或同種異體)以藉由本文所揭示之方法引入異源基因。此類基因操縱可用於糾正基因缺陷，及/或在移植之前將額外功能性引入HSC。在一些實施例中，將功能野生型基因引入HSC中以糾正基因缺陷，例如先天性造血障礙(例如，β-地中海貧血、範可尼貧血、血友病、鐮狀細胞貧血等)；原發性免疫缺陷(例如，腺苷脫氨酶缺陷、X連鎖嚴重聯合免疫缺陷、慢性肉芽腫病、Wiskott-Aldrich綜合症、Janus激酶3缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、白細胞黏附缺陷1型等)；及先天性代謝疾病(例如，黏多醣貯積症(MPS) I、II、III、VII型、戈謝病、X連鎖腎上腺腦白質營養不良等)。在某些實施例中，HSC藉由重組酶系統進行基因操縱，例如使用CRISPR/Cas9系統或Cre/Lox重組酶之基因組編輯。例如，重組酶系統可用於消融基因或糾正基因缺陷。在各種實施例中，改變HSC功能性之其他方法包括反義核酸、核酶及RNAi之引入等。
在一些實施例中，藉由將病毒或非病毒載體引入前驅細胞或細胞系中來修飾前驅細胞或細胞系。根據本文所述之方法及系統，可使用任何合適之前驅細胞或細胞系。作為非限制性示例，合適之前驅細胞包括例如直接自患者或自非患者供體分離之細胞。前驅細胞包括例如來自患者或非患者供體的成體幹細胞及多能細胞，諸如iPSC。各種細胞系亦可與本文所述之方法及系統一起使用，且包括例如人或非人來源之哺乳動物細胞系。
本揭示案之其他特徵、目的及優點在以下示例中係顯而易見的。然而，應當理解，该等示例雖然指示了本揭示案之實施例，但僅以說明而非限制之方式給出。本揭示案之範疇內的各種變化及修改對於熟習此項技術者而言將自示例中變得顯而易見。 定義
過繼細胞療法：如本文所用，術語「過繼細胞療法」、「過繼細胞轉移」或「ACT」係指將細胞轉移至有需要之患者體內。細胞可自有需要之患者身上衍生及繁殖，或者可自非患者供體獲得。在一些實施例中，細胞為免疫細胞，諸如淋巴細胞。多種細胞類型可用於ACT，諸如T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞、NK細胞、δ-γT細胞、調節性T細胞及外周血單核細胞。在一些實施例中，細胞經基因修飾以引入嵌合抗原受體(CAR)。
動物：如本文所用，術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物( 例如、嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物、及/或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為轉基因動物、基因工程動物及/或克隆動物。
大約或約：如本文所用，術語「大約」或「約」適用於一或多個相關值，係指規定之值以及與規定之參考值相似的值。在某些實施例中，術語「大約」或「約」係指在任一方向(大於或小於)與規定之參考值偏差範圍在25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值範圍，除非另有說明或自上下文中明顯看出(除非該數字將超過可能值之100%)。
嵌合抗原受體 (CAR) ：如本文所用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」工程化受體可將抗原特異性賦予使用本文所述方法轉導之細胞(例如免疫細胞，如NK細胞、iPSC衍生NK細胞 (iNK 細胞)、T細胞如初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞、γδ T細胞、T調節細胞或其組合)上。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在各種實施例中，本文所述之CAR可包括抗原特異性靶向域、細胞外域、跨膜域、可選之一或多個共刺激域及細胞內信號傳導域中的一或多者。
冷凍保存：如本文所用，術語「冷凍保存」通常係指將生物材料(例如，一群細胞或轉導細胞)冷凍到足夠低之溫度，使得停止可能會損壞材料之化學過程藉此保護材料。冷凍保存之細胞在冷凍狀態下可在較長時間內保持活力，諸如在冷凍保存狀態下可維持1、5、10年或更長時間。冷凍保存之細胞一旦解凍，就能夠繁殖用於 體外及 體內應用。
宿主細胞或靶細胞：如本文所用，術語「宿主細胞」或「靶細胞」包括未轉染、未感染及未轉導之細胞。在一些實施例中，術語「宿主細胞」或「靶細胞」包括用本揭示案之重組載體或多核苷酸轉染、感染或轉導。宿主細胞可包括包裝細胞、生產細胞及被病毒載體感染之細胞。在特定實施例中，用本揭示案之病毒載體感染的宿主細胞適合施用於需要治療之受試者。在一些實施例中，靶細胞為幹細胞或前驅細胞。在某些實施例中，靶細胞為體細胞，例如成體幹細胞、前驅細胞或分化細胞。在較佳實施例中，靶細胞為造血細胞，例如造血幹細胞或前驅細胞。在一些實施例中，靶細胞包括B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞或前驅細胞。在一些實施例中，靶細胞為哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞或真菌細胞。 哺乳動物細胞系
在一些實施例中，「宿主細胞」或「靶細胞」包括細胞系。多種細胞系在本領域中為衆所周知的且適合與本揭示案一起使用。合適之細胞系包括例如人或非人來源之哺乳動物細胞系。
根據本揭示案，任何對細胞培養及多肽表達敏感之哺乳動物細胞或細胞類型均可用作宿主細胞或靶細胞。根據本揭示案可使用之哺乳動物細胞的非限制性示例包括人胚胎腎293細胞(HEK293)、HeLa細胞；BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC No: 85110503)；人成視網膜細胞(PER.C6 (CruCell，Leiden，荷蘭))； SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)轉化之猴腎CV1系；人胚胎腎系(為懸浮培養生長而亞克隆之293 或293細胞，Graham等，J. Gen Virol.，36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4139 (1980))；小鼠支持細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587）；人宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W136，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)； TRI 細胞(Mather 等，Annals NY Acad. Sci.，383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4 細胞；及人類肝癌細胞系(Hep G2)。在一些實施例中，合適之哺乳動物細胞並非內體酸化缺陷細胞。
此外，根據本揭示案，可使用任何數量之商業及非商業可獲得的表達多肽或蛋白質之融合瘤細胞系。熟習此項技術者將理解，融合瘤細胞系可能具有不同之營養需求及/或可能需要不同之培養條件以實現最佳生長及多肽或蛋白質表達，且能夠根據需要修改條件。 非哺乳動物細胞系
根據本揭示案，任何對細胞培養及多肽表達敏感之非哺乳動物衍生細胞或細胞類型均可用作宿主細胞。根據本揭示案可使用之非哺乳動物宿主細胞及細胞系的非限制性示例包括源自以下各者之細胞及細胞系：針對酵母之 巴斯德畢赤酵母、 甲醇畢赤酵母、 安古斯塔畢赤酵母、粟酒裂殖酵母、 釀酒酵母及 解脂耶氏酵母；針對昆蟲之 昆蟲草地夜蛾、 粉紋夜蛾、 果蠅及 烟草天蛾；及針對細菌之 大腸桿菌、 鼠傷寒沙氏桿菌、 枯草桿菌、 地衣芽孢桿菌、 脆弱類桿菌、 產氣莢膜梭菌、 艱難梭菌；及來自兩棲動物之 非洲爪蟾。
功能等同物或衍生物：如本文所用，術語「功能等同物」或「功能衍生物」在氨基酸序列之功能衍生物的上下文中表示保留與原始序列之生物活性(功能或結構)實質上相似之生物活性的分子。功能衍生物或等同物可為天然衍生物或合成製備。示例性之功能衍生物包括有一或多個氨基酸被取代、缺失或添加之氨基酸序列，條件係保持蛋白質之生物活性。取代氨基酸理想地具有與被取代氨基酸相似之化學物理性質。所要之相似化學物理性質包括電荷、蓬鬆度、疏水性、親水性等之相似性。
體外：如本文所用，術語「 體外」係指在人工環境中發生之事件， 例如在試管或反應容器中、在細胞培養物 中等，而非在多細胞生物體內。
體內：如本文所用，術語「 體內」係指在多細胞生物體內發生之事件，例如人及非人動物。在基於細胞之系統的上下文中，該術語可用於指在活細胞內發生之事件(與例如 體外系統相反)。
非病毒載體：如本文所用，術語「非病毒載體」包括例如奈米顆粒、脂質體、脂質顆粒、碳、非反應性金屬、明膠及/或聚胺奈米球。
初細胞：術語「初細胞」係指自受試者直接分離且隨後繁殖之細胞。
多肽：如本文所用，術語「多肽」係指經由肽鍵連接在一起之連續氨基酸鏈。該術語用於指任何長度之氨基酸鏈，但熟習此項技術者將理解該術語不限於長鏈，且可指包含經由肽鍵連接在一起之兩個氨基酸的最小鏈。如熟習此項技術者已知的，可對多肽進行處理及/或修飾。
蛋白質：如本文所用，術語「蛋白質」係指作為離散單元起作用之一或多種多肽。若單個多肽為離散功能單元且不需要與其他多肽永久或暫時實體結合以形成離散功能單元，則術語「多肽」與「蛋白質」可互換使用。若離散功能單元包括多於一種彼此實體結合之多肽，則術語「蛋白質」係指實體偶聯且作為離散單元一起起作用的多個多肽。
受試者：如本文所用，術語「受試者」係指人或任何非人動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人包括出生前和出生後之形式。在許多實施例中，受試者為人類。受試者可為患者，係指被交給醫療提供者以診斷或治療疾病之人。術語「受試者」在本文中可與「個體」或「患者」互換使用。受試者可能患有或易患某種疾病或病症，但可能會或可能不會表現出疾病或病症之症狀。
實質上：如本文所用，術語「實質上」係指表現出相關特性或性質之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域之熟習此項技術者將理解，生物及化學現像極少(若有)完成及/或繼續完成或達到或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於捕獲許多生物及化學現像中固有的潛在不完整性。
患有：「患有」疾病、病症及/或病徵之個體已被診斷出或表現出該疾病、病徵及/或病徵之一或多種症狀。
治療有效量：如本文所用，治療劑之術語「治療有效量」係指當施用於患有或易患某疾病、病症及/或病徵之受試者時足以治療、診斷、預防及/或延遲疾病、病症及/或病徵之症狀發作的量。熟習此項技術者應當理解，治療有效量通常經由包含至少一個單位劑量之給藥方案給藥。
治療：如本文所用，術語「治療」、「治療」或「治療」係指用於部分或完全減輕、改善、緩解、抑制、預防、延遲特定疾病、病症及/或病徵之一或多種症狀或特徵的發作、降低該一或多種症狀或特徵之嚴重程度及/或降低該一或多種症狀或特徵的發生率。為了降低發生與疾病相關之病理的風險，可對未表現出疾病跡象及/或僅表現出疾病早期跡象之受試者進行治療。
載體：如本文所用，術語「載體」係指任何載體與任何外源基因之組合。載體可包括非病毒載體、病毒載體等，及其任何組合。例如，非病毒載體可包括但不限於脂質體、原生質球狀體、紅細胞影、膠體金屬、磷酸鈣、DEAE聚葡醣質粒等，或其組合。病毒載體可包括但不限於逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、假型載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、混合病毒等，及其任何組合。
轉導：如本文所用，術語「轉導」係指經由病毒載體將外源DNA引入另一個細胞的過程。各種病毒載體為本領域已知的且包括例如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、假型載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等，及其任何組合。
轉染：如本文所用，術語「轉染」係指藉由非病毒方法將核酸引入細胞的過程。在一些實施例中，本文所述之方法適用於相關細胞之轉染。
本文用端點對數值範圍之列舉包括包含在該範圍內的所有數字及分數(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4及5)。亦應當理解，假定其所有數字及其分數均被術語「約」修飾。
在以下部分中詳細描述了本揭示案之各種態樣。部分之使用並不意謂著限製本揭示案。每個部分可適用於本揭示案之任何態樣。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」表示「及/或」。如本文所用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括單數及復數所指對象，除非上下文另有明確規定。
元件符號 100:中空纖維系統 104:毛細管內媒介容器 106:毛細管內媒介 108:細胞容器 110:細胞 112:病毒容器 114:載體 116:毛細管外媒介容器 118:毛細管外媒介 120:廢物容器 122:廢物 124:收獲容器 126:轉導細胞 128:毛細管內泵 132:毛細管外泵 134:過濾器模組 136:中空纖維 137:外殼中空纖維 138:毛細管內空間 139:毛細管外空間 208:外殼 212:毛細血管內空間 216:毛細管外空間 140:毛細管內媒介導管 144:細胞導管 148:病毒導管 152A:第一毛細管內出口 152B:第二毛細管內出口 156A:第一毛細管內導管 156B:第二毛細管內導管 160A:第一毛細管內閥 160B:第二毛細管內閥 164A:第一毛細管外閥 164B:第二毛細管外閥 168A:第一毛細管外導管 168B:第二毛細管外導管 172A:第一毛細管外泵口 172B:第二毛細管外泵口 176:毛細管外媒介導管 180:廢物導管 200:中空纖維系統 204:毛細管內媒介容器 206:毛細管內媒介 208:細胞容器 210:細胞 212:病毒容器 214:載體 216:毛細管外媒介容器 218:毛細管外媒介 220:廢物容器 222:廢物 224:收獲容器 226:轉導細胞 228:毛細管內泵 232:毛細管外泵 234:過濾器模組 236:中空纖維 208:外殼 212:毛細血管內空間 216:毛細管外空間 240:毛細管內媒介導管 244:細胞導管 248:病毒導管 252A:第一毛細管內出口 252B:第二毛細管內出口 256A:第一毛細管內導管 256B:第二毛細管內導管 260A:第一毛細管內閥 260B:第二毛細管內閥 264A:第一毛細管外閥 264B:第二毛細管外閥 268A:第一毛細管外導管 268B:第二毛細管外導管 272A:第一毛細管外泵口 272B:第二毛細管外泵口 276:毛細管外媒介導管 280:廢物導管 284A:氣泡感測器 284B:氣泡感測器 284C:氣泡感測器 284D:氣泡感測器 288:壓力感測器
圖1A示出了根據本揭示案的包括中空纖維之中空纖維系統。 圖1B示出了沿著圖1A之綫1B-1B截取的該中空纖維之水平截面，其中中空纖維裝載有細胞及病毒或非病毒載體。 圖1C示出了沿著圖1A之綫1C-1C截取的該中空纖維之垂直截面，其中中空纖維裝載有細胞及病毒或非病毒載體。 圖1D為根據本揭示案的包括複數個中空纖維之中空纖維過濾器模組之示例的示意圖。 圖2A示出包括中空纖維之中空纖維系統，展示在細胞及病毒載體裝載期間之流體流動方向。 圖2B示出中空纖維之水平截面，展示在細胞及病毒或非病毒載體裝載期間之流體流動方向。 圖2C示出中空纖維之垂直截面，展示在細胞及病毒或非病毒載體裝載期間之流體流動方向。 圖3A示出包括中空纖維之中空纖維系統，展示在將病毒或非病毒載體引入靶細胞或宿主細胞期間之流體流動方向。 圖3B示出中空纖維之水平截面，展示在將病毒或非病毒載體引入靶細胞或宿主細胞期間之流體流動方向。 圖3C示出中空纖維之垂直截面，展示在將病毒或非病毒載體引入靶細胞或宿主細胞期間之流體流動方向。 圖4A示出包括中空纖維之中空纖維系統，展示在細胞收獲期間之流體流動方向。 圖4B示出具有細胞及病毒之中空纖維的水平截面，展示在細胞收獲期間之流體流動方向。 圖4C示出中空纖維之垂直截面，展示在細胞收獲期間之流體流動方向。 圖5示出在不同之轉導條件下的逆轉錄病毒轉導T細胞。 圖6示出在不同條件下T細胞在其轉導之後的存活率。 圖7示出在不同轉導條件下的逆轉錄病毒轉導NK細胞。 圖8示出在不同轉導條件下的慢病毒轉導T細胞。 圖9示出用於細胞治療轉導之半自動化中空纖維系統的技術佈局。
134:過濾器模組
136:中空纖維
137:外殼
138:毛細管內空間
139:毛細管外空間

Claims (62)

  1. 一種用於將一載體引入細胞中之系統，該系統包括： 一過濾器模組，該過濾器模組界定一毛細管内空間及一毛細管外空間，該毛細管外空間與該毛細管内空間藉由一多孔膜間隔開； 一對毛細管内口，該對毛細管内口流體地耦接至該毛細管内空間之相對端且各自接收一轉導媒介、細胞及一載體；及 一對毛細管外口，該對毛細管外口耦接至該毛細管外空間之相對端且與一毛細管外媒介源及一廢物容器流體連通。
  2. 如請求項1之系統，該系統進一步包括與該等毛細管内口中之至少一者流體連通的一收獲容器。
  3. 如請求項1之系統，該系統進一步包括一毛細管内泵，該毛細管内泵可操作以將該轉導媒介、該等細胞及該載體中之每一者的一流提供至該等毛細管内口中之至少一者。
  4. 如請求項3之系統，其中該毛細管内泵可操作以在一第一狀態下在一第一時間段期間將該等細胞及該載體提供至該等毛細管内口且在一第二狀態下在一第二時間段期間將該轉導媒介提供至該等毛細管内口。
  5. 如請求項1之系統，該系統進一步包括一廢物容器，該廢物容器經由該等毛細管外口中之至少一者與該毛細管外空間連通。
  6. 如請求項1之系統，該系統進一步包括一毛細管外泵，該毛細管外泵可操作以將該毛細管外媒介之一流提供至該等毛細管外口中之每一者。
  7. 如請求項1之系統，該系統進一步包括一毛細管外泵，該毛細管外泵可操作以將自該等毛細管外口流出的一廢物流體之一流提供至該廢物容器。
  8. 如請求項1之系統，其中該多孔膜為圓柱形。
  9. 如請求項1之系統，其中該多孔膜包括孔，該等孔允許具有小於約50 kDa之一大小的顆粒自該毛細管内空間穿過該等孔。
  10. 如請求項1之系統，其中該毛細管内空間界定一轉導區。
  11. 一種用於將一病毒或一非病毒載體引入細胞中之系統，該系統包括： 一中空纖維，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端的一毛細管内空間；及 一外殼，該外殼圍封該一或多個中空纖維以在該中空纖維與該外殼之間自該第一端至該第二端界定一毛細管外空間，該外殼包括與該第一端相鄰的與該毛細管内空間流體連通之一第一口及與該第二端相鄰的與該毛細管内空間流體連通之一第二口； 一轉導媒介源，該轉導媒介源經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通； 一細胞源，該細胞源包括細胞且經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通；及 一病毒源，該病毒源包括一病毒或非病毒載體且經由該第一口及該第二口中之每一者與該毛細管内空間流體連通。
  12. 如請求項11之系統，該系統進一步包括經由該第一口及該第二口中之至少一者與該毛細管内空間流體連通的一收獲容器。
  13. 如請求項11之系統，該系統進一步包括一毛細管内泵，該毛細管内泵包括與該轉導媒介源、該細胞源及該病毒源中之每一者流體連通的一入口。
  14. 如請求項13之系統，其中該毛細管内泵包括經由該第一口與該毛細管内空間流體連通的一第一出口及經由該第二口與該毛細管内空間流體連通的一第二出口。
  15. 如請求項11之系統，其中該外殼包括與該毛細管外空間連通之一第三口，且該系統進一步包括： 一廢物容器，該廢物容器經由該第三口與該毛細管外空間連通。
  16. 如請求項15之系統，該系統進一步包括經由該第三口與該毛細管外空間流體連通的一毛細管外媒介源。
  17. 如請求項16之系統，其中該第三口與該毛細管内空間之該第一端相鄰設置，且該系統進一步包括一第四口，該第四口與該毛細管外空間流體連通且與該毛細管内空間之該第二端相鄰設置。
  18. 如請求項17之系統，其中該廢物容器及該毛細管外媒介源中之每一者經由該第三口及該第四口中之每一者與該毛細管外空間連通。
  19. 如請求項11之系統，其中該中空纖維包括複數個中空纖維。
  20. 如請求項11之系統，其中該中空纖維包括孔，該等孔允許具有小於約50 kDa之一大小的顆粒自該毛細管内空間穿過該等孔。
  21. 一種使用一中空纖維將一病毒或非病毒載體引入細胞中之方法，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端之一毛細管内空間及自該第一端至該第二端圍繞該毛細管内空間的一毛細管外空間，該方法包括以下步驟： 將一病毒或非病毒載體裝載至該中空纖維之該毛細管内空間中；及 將細胞裝載至該中空纖維之該毛細管内空間中。
  22. 如請求項21之方法，其中將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該病毒或非病毒載體。
  23. 如請求項21之方法，其中將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該病毒或非病毒載體。
  24. 如請求項21之方法，其中將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該等細胞。
  25. 如請求項21之方法，其中將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該等細胞。
  26. 如請求項21之方法，該方法進一步包括以下步驟： 在該中空纖維之該毛細管内空間内轉導該等細胞；及 自該中空纖維之該毛細管内空間收獲該等轉導細胞。
  27. 如請求項26之方法，其中自該毛細管内空間收獲該等轉導細胞包括將一冲洗流體裝載至該中空纖維之該毛細管外空間中。
  28. 如請求項26之方法，其中自該毛細管内空間收獲該等轉導細胞包括自該第一端或該第二端中之一者將一冲洗流體裝載至該毛細管内空間中。
  29. 如請求項21之方法，該方法進一步包括自該毛細管外空間收集一廢物。
  30. 如請求項21之方法，其中同時裝載該等細胞及病毒或非病毒載體。
  31. 如請求項21之方法，其中分開裝載該等細胞及病毒或非病毒載體。
  32. 如請求項21之方法，其中在該病毒或非病毒載體之前裝載該等細胞。
  33. 如請求項21之方法，其中在該等細胞之前裝載該病毒或非病毒載體。
  34. 如請求項21之方法，其中該等細胞係以1x10 3至1x10 10細胞/ml之一濃度裝載。
  35. 如請求項21之方法，其中裝載該等細胞包括以隨著該中空纖維之内表面積之一大小而變的一速率裝載細胞。
  36. 如請求項21之方法，其中該病毒或非病毒載體作為病毒顆粒裝載。
  37. 如請求項21之方法，其中該病毒或非病毒載體作為核酸載體裝載。
  38. 如請求項21之方法，該方法進一步包括以約5-100 µl/min/cm 2之間的每平方厘米的該中空纖維之一内表面積的一流速來裝載該等細胞及該病毒或非病毒載體。
  39. 如請求項38之方法，其中每平方厘米的該中空纖維之一内表面積的一裝載流速為約5-20 µl/min/cm 2之間。
  40. 如請求項21之方法，其中該載體得自一慢病毒、一逆轉錄病毒、一腺病毒、一腺相關病毒或一混合病毒。
  41. 如請求項40之方法，其中該載體為一逆轉錄病毒。
  42. 如請求項40之方法，其中該載體為一慢病毒。
  43. 如請求項21之方法，其中該載體包括奈米顆粒、脂質體、脂顆粒、碳、非反應性金屬、明膠及/或多胺奈米球。
  44. 如請求項21之方法，其中該等細胞及病毒載體以約0.25至約4.0之一感染複數(MOI)裝載至該毛細管内空間中。
  45. 如請求項44之方法，其中該等細胞及病毒載體係以約2.5之一MOI裝載至該毛細管内空間中。
  46. 如請求項21之方法，其中該等細胞為B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞、前驅細胞或一細胞系。
  47. 一種藉由如請求項21之方法產生之細胞群。
  48. 一種藥物組合物，該藥物組合物包括藉由如請求項21之方法產生的細胞。
  49. 一種製造一細胞治療產品之方法，該細胞治療產品包括一或多個轉導細胞，該方法包括： (i) 提供一種用於轉導細胞之系統，該系統包括一中空纖維，該中空纖維界定自一第一端延伸至一第二端的一毛細管内空間； (ii) 將一群細胞及一病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中，導致該毛細管内空間中之一或多個細胞轉導；及 (iii) 自該毛細管内空間收獲包括一或多個轉導細胞之一群細胞。
  50. 如請求項49之方法，其中該群細胞係選自αβT細胞、γδ T細胞、NK細胞、HSC、巨噬細胞、樹狀細胞及iPSC。
  51. 如請求項49之方法，其中該病毒或非病毒載體包括一重組受體。
  52. 如請求項51之方法，其中該重組受體為一嵌合抗原受体(CAR)。
  53. 如請求項49之方法，其中該等轉導細胞包括在細胞之表面上的一重組受體。
  54. 如請求項52之方法，其中該嵌合抗原受体包括一細胞外配體結合域，該細胞外配體結合域靶向選自以下一或多者之一腫瘤抗體：CD44、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD89、CD123、CS-1、ROR1、間皮素、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、CEA、MAGE A3 TCR、EGFR、HER2/ERBB2/neu、EPCAM、EphA2、CEA及BCMA。
  55. 如請求項49之方法，其中該方法進一步包括分離該等轉導細胞之一步驟。
  56. 如請求項49之方法，其中該方法進一步包括在一生物反應器中擴增該等收獲之細胞的一步驟。
  57. 如請求項49之方法，其中該方法進一步包括將該等收獲之細胞冷凍保存於一合適之冷凍保存媒介中的一步驟。
  58. 如請求項49之方法，其中該系統包括與該第一端相鄰的與該毛細管內空間流體連通之一第一口及與該第二端相鄰的與該毛細管內空間流體連通之一第二口。
  59. 如請求項49之方法，其中將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該病毒或非病毒載體。
  60. 如請求項49之方法，其中將該病毒或非病毒載體裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該病毒或非病毒載體。
  61. 如請求項49之方法，其中將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之至少一者裝載該等細胞。
  62. 如請求項49之方法，其中將該等細胞裝載至該毛細管内空間中包括自該毛細管内空間之該第一端及該第二端中之每一者裝載該等細胞。
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