TW202216184A

TW202216184A - 具有神經再生性應用的組合物

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Publication number: TW202216184A
Application number: TW110124874A
Authority: TW
Inventors: 湯瑪斯布萊特; 大衛Ａ羅斯
Original assignee: 愛爾蘭商格里佛全球營運有限公司
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2022-05-01
Also published as: CL2022003591A1; EP4178554A1; KR20230038195A; CA3182958A1; IL299183A; CN115996743A; BR112022026567A2; MX2022016227A; WO2022008609A1; JP2023532557A; AU2021306631A1; AR122900A1; US20230263863A1

Abstract

本發明揭示含有運鐵蛋白或乳鐵蛋白之醫藥組合物，用於在罹患神經退行性事件之患者中促進或誘導新神經細胞之產生。神經退行性事件可由神經退行性疾病諸如阿茲海默氏症、帕金森氏症、亨汀頓氏舞蹈症、或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症導致。理想地，運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白具有較低鐵飽和度。

Description

具有神經再生性應用的組合物

本發明係關於治療性蛋白及其在再生醫學領域中之用途。具體而言，本文揭示運鐵蛋白及乳鐵蛋白之應用及其在促進神經前驅細胞或神經幹細胞之增殖、誘導、及/或分化中之用途。

神經退行性疾病諸如肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨汀頓氏舞蹈症、阿茲海默氏症、及帕金森氏症係以進行性神經元細胞死亡為特徵之疾病並且與高發病率、患者痛苦、低生活品質、及高死亡率相關。隨著人口結構愈來愈向老年人群轉變，社會中神經退行性疾病之患病率正在迅速攀升。隨著預期壽命不斷提高，預計神經退行性病狀將與癌症及心血管疾病競爭，成為將來世代之主要死亡原因。

無例外地，在撰寫本文時，尚無經批准之療法可以治癒或逆轉神經退行性疾病之影響。在某些情況下，經批准之藥物可以延緩疾病之進展。例如，利魯唑(riluzole；RILUTEK)及依達拉奉(edaravone；RADICAVA)係兩種已獲批准的治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之療法，可延緩疾病之進展，但是一旦疾病之症狀出現，該等分子就不能逆轉該等症狀。

鑒於缺乏治癒性療法，因此大多數商業上批准之治療方法係針對症狀的就不足為奇了，尤其例如針對帕金森氏症及運動病症的多巴胺能治療、針對失智症之行為及心理症狀的抗精神病藥物以及用於治療疼痛的鎮痛藥物。

神經保護係治療神經退行性疾病之另一種非恢復性方法。科學及專利文獻中有大量關於神經保護化合物及分子的報告，該等化合物及分子試圖限制神經退行性疾病造成之損害並減緩其衰虛進程。

一個此類實例係以Grifols Worldwide Operations Ltd之名義的美國專利公開案第2016008437號，該公開案揭示原運鐵蛋白及全鐵運鐵蛋白之混合物藉由在許多退行性疾病狀態中調節缺氧誘導因子(Hypoxia Inducible Factor；HIF)之活性而發揮神經保護作用。類似地，HealthPartners Research Foundation之國際專利申請公開案第WO2006/20727號提出使用去鐵胺作為缺氧誘導因子-1α之調節劑，以便引起針對缺血患者中之再灌注之有害影響的神經保護反應。

雖然儘管有上述作用，但是顯而易見地，缺乏能夠治癒或逆轉神經退行性疾病及病狀之虛衰性影響的臨床候選藥物。經批准之臨床療法僅限於控制疾病之症狀，並且對於除了經由神經保護作用及途徑來減緩病狀進展以外具有更大功效的治療方法的需求仍未得到滿足。能夠治癒或至少部分逆轉神經損害的創新仍然難以捉摸，因此係非常合乎需要的。

用語「包含(「comprises/comprising」)」及用語「具有/包括」在本文中與本發明有關使用時用於指定存在所陳述特徵、整數、步驟或組分但是不排除存在或添加一或多個其他特徵、整數、步驟、組分、或其群組。

熟習此項技術者應認識到本文揭示之特定實施例不應孤立地閱讀，並且本說明書意圖所揭示之實施例彼此組合地閱讀，而非個別地閱讀。因此，各實施例可充當修改或限制本文揭示之其他實施例之基礎。

濃度、量、及其他數值資料可在本文中以範圍形式來表示或提供。應瞭解此範圍形式僅僅為了方便及簡明而使用，並且因此應靈活地理解為不僅包括明確地列舉為範圍極限之數值，而且包括涵蓋於該範圍內之所有個別數值或子範圍，如同各數值及子範圍明確列舉一般。作為說明，「10至100」之數值範圍應理解為不僅包括明確列舉的10至100之值，而且包括所指示範圍內之個別值及子範圍。因此，在此數值範圍中包括個別值諸如10、11、12、13...97、98、99、100及子範圍諸如10至40、25至40及50至60 等。此相同原則適用於僅列舉一個數值之範圍，諸如「至少10」。此外，不論所描述範圍或特徵之廣度為何，此解釋皆適用。 [治療方法]

在第一態樣中，本發明提供在罹患神經退行性事件之患者中促進及/或誘導新神經細胞之產生的方法，該方法包括將治療有效量之選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。

熟習此項技術者理解在過多哺乳動物鐵結合蛋白之中，運鐵蛋白及乳鐵蛋白係具有61%序列一致性之運鐵蛋白家族之相關蛋白。除了許多重疊及互補功能以外，運鐵蛋白及乳鐵蛋白亦表現出許多相互排斥功能。本發明在其範圍內包括所有野生型哺乳動物運鐵蛋白，然而，包含SEQ ID NO：1列出之胺基酸序列之人類運鐵蛋白(UniProtKB Seq. No. Q06AH7)係尤其較佳的。類似地，本發明在其範圍內包括所有野生型哺乳動物乳鐵蛋白，然而，包含SEQ ID NO：2列出之胺基酸序列之人類乳鐵蛋白(UniProtKB Seq. No. P02788)係尤其較佳的。

野生型運鐵蛋白含有兩個同源葉片(N-葉片及C-葉片)，並且各葉片結合單一鐵原子。因此，各野生型運鐵蛋白分子每個分子可結合多達兩個鐵原子或離子。類似地，各野生型乳鐵蛋白分子以類似的方式每個分子可結合兩個鐵原子。

運鐵蛋白及乳鐵蛋白可自天然來源提取或替代地使用重組產生/製造過程來製造。合適天然來源可分別為人類血漿或人乳。

藉由「運鐵蛋白」，本說明書應理解為意指治療有效量之： ● 野生型(哺乳動物，較佳人類)運鐵蛋白、 ● 其功能突變體、 ● 其功能片段、或 ● 其組合。

運鐵蛋白、其功能突變體、或其功能片段之鐵飽和度可為約50%或更少。較佳地，鐵飽和度為約40%或更少。在一個實施例中，鐵飽和度為約30%或更少。例如，鐵飽和度可為約20%或更少，諸如約10%或更少。在一些實施例中，鐵飽和度為約5%或更少。在仍另一實施例中，鐵飽和度可為少於約1%。為避免任何疑問，本文中表示為小於X%之範圍包括0至X%，亦即運鐵蛋白絕對沒有經結合之鐵 - 0%鐵飽和度。

如本文使用，「原運鐵蛋白(apo-transferrin)」意謂具有少於1%之鐵飽和度之運鐵蛋白。類似地，「全鐵運鐵蛋白(holo-transferrin)」意謂具有99%或更大之鐵飽和度之運鐵蛋白。

熟習此項技術者認識到運鐵蛋白鐵飽和水平可在沒有過度負擔的情況下、藉由量化具有已知運鐵蛋白濃度之樣品中之總鐵水平來容易地測定。樣品中之總鐵水平可藉由熟習此項技術者知道之許多方法中任一者來量測。合適實例包括： ●比色檢定-藉由量測在562 nm下、在菲洛嗪與乙酸鹽緩衝液中之Fe ²⁺之間之反應中形成之紫色複合物的強度來將鐵定量。硫脲或其他化學品可添加至複合物污染物金屬諸如Cu ²⁺，該等金屬亦可與菲洛嗪結合並且產生虛假地較高鐵值。參見Ceriotti 等人, Improved direct specific determination of serum iron and total iron-binding capacity Clin Chem. 1980, 26(2), 327-31，其內容以引用方式併入本文。 ●感應耦合電漿原子發射光譜(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy；ICP-AES)係對樣品中之金屬之質量百分比進行量化的發射光譜技術。ICP-AES基於使用電漿(由正離子及自由電子組成之電離氣體)來激發樣品中之金屬原子/離子並且分析該特定金屬特有的電磁輻射之發射波長。雖然該技術係熟習此項技術者之公知常識內之標準分析技術，但是關於ICP-AES之進一步資訊可在Manley 等人, Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography–inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 2009, 14, 61–74中找到，其內容以引用方式併入本文。

出於本發明之治療性方法之目的來測定樣品之鐵含量之較佳方法係ICP-AES。然後基於運鐵蛋白蛋白濃度、樣品之總鐵含量、及野生型運鐵蛋白具有兩個鐵結合位點之事實來計算運鐵蛋白之鐵飽和度。野生型人類運鐵蛋白(分子量79,750)可結合兩個鐵原子以致於含有1 g運鐵蛋白之樣品藉由1.4 mg鐵而變得100%飽和。

在特定樣品之運鐵蛋白濃度未知的情況下，其可藉由各種較好表徵之免疫(ELISA，濁度測定法)及非免疫方法(吸光度，AU480化學分析)來容易地測定。

在撰寫本文時，運鐵蛋白尚未在全球任何主要司法管轄區被批准為藥物。因此，沒有關於運鐵蛋白之藥典專論。關於運鐵蛋白之物理性質諸如鐵飽和度的進一步資訊可自熟習此項技術者查閱之主要參考文獻獲得；參見L von Bonsdorff 等人， Transferrin, 第21章，第301-310頁， Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use， J. Bertolini 等人編, Wiley, 2013 [印刷物ISBN:9780470924310 |線上ISBN:9781118356807]，其內容以引用方式併入本文並且被視為熟習此項技術者之公知常識。

藉由「乳鐵蛋白」，本說明書應理解為意指治療有效量之： ● 野生型(哺乳動物，較佳人類)乳鐵蛋白、 ● 其功能突變體、 ● 其功能片段、或 ● 其組合。

乳鐵蛋白、其功能突變體、或其功能片段之鐵飽和度可為約50%或更少。較佳地，鐵飽和度為約40%或更少。在一個實施例中，鐵飽和度為約30%或更少。例如，鐵飽和度可為約20%或更少，諸如約10%或更少。在一些實施例中，鐵飽和度為約5%或更少。在仍另一實施例中，鐵飽和度可為少於約1%。

如本文使用，「原乳鐵蛋白(apo-lactoferrin)」意謂具有少於1%之鐵飽和度之乳鐵蛋白。類似地，「全鐵乳鐵蛋白(holo-lactoferrin)」意謂具有99%或更大之鐵飽和度之乳鐵蛋白。乳鐵蛋白之鐵含量、及飽和水平可與以上詳細地論述之運鐵蛋白類似地量測。

在使用術語運鐵蛋白及乳鐵蛋白中，本說明書在其範圍內包括運鐵蛋白及乳鐵蛋白之重組衍生物，該等衍生物與分別在SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中概述之人類蛋白之野生型胺基酸序列的不同之處係相對於野生型蛋白可不實質性改變重組蛋白之結構、或親水性質的一或多個取代、一或多個缺失、或一或多個插入。本發明之範圍內之運鐵蛋白及乳鐵蛋白之重組變異體可另外包含至少一個翻譯後修飾，諸如聚乙二醇化、醣化、多唾液酸化、或其組合。

在一個實施例中，本發明涵蓋在SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中具有相對於野生型蛋白之一或多個保守取代的運鐵蛋白及乳鐵蛋白之重組變異體。「保守取代」為其中一個胺基酸由具有類似性質之另一胺基酸取代以使得熟習肽化學技術者可預測多肽之二級結構及親水性質實質上不會改變的取代。總體上，以下胺基酸群組內之變化代表保守變化：(1) ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2) cys、ser、tyr、thr；(3) val、ile、leu、met、ala、phe; (4) lys、arg、his；及(5) phe、tyr、trp、his。

例如，本發明之治療方法範圍內之重組運鐵蛋白或乳鐵蛋白可與分別在SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中概述之野生型人類運鐵蛋白及人類乳鐵蛋白具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性

在另一實施例中，本發明包括運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白之特定突變體形式，該等形式保持其結構但是防止蛋白在一個或另一個鐵結合域處與鐵結合，例如N-葉片、C-葉片、或其組合。

本發明之範圍內之運鐵蛋白突變體包括但不限於： i) Y188F突變體N葉片(SEQ ID NO: 3)； ii) Y95F/Y188F突變體N葉片(SEQ ID NO: 4)；及 iii) Y426F/Y517F突變體C葉片(SEQ ID NO: 5)。

熟習此項技術者認識到重組蛋白可利用在蛋白表現、產生及純化技術中熟知之標準技術來獲得。所關注之重組蛋白之核酸序列可插入適合於在選定宿主細胞中表現的任何表現載體中，例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母、及細菌。

如本文使用，術語「表現載體」係指能夠將蛋白表現構建體引入宿主細胞中之實體。一些表現載體亦在宿主細胞內部複製，從而增加藉由蛋白表現構建體之蛋白表現。一種類型之載體為「質體」，其係指內部可接合其他DNA區段之圓形雙股DNA環。其他載體包括黏粒、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome；BAC)及酵母人工染色體(yeast artificial chromosome；YAC)、福斯質體、噬菌體及噬菌粒。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在其引入其中之宿主細胞中自主複製( 例如，具有在宿主細胞中起作用之複製起點的載體)。其他載體在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，藉此連同宿主基因組一起複製。此外，某些較佳載體能夠引導其可操作地連接之基因之表現。

合適細菌細胞包括大腸桿菌 (Escherichia coli) 、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium) 、假單胞菌 (Pseudomonas)屬某些種、鏈黴菌 (Streptomyces)屬某些種、及葡萄球菌 (Staphylococcus)屬某些種。合適酵母細胞包括酵母 (Saccharomyces)屬某些種、畢赤酵母 (Pichia)屬某些種、及克魯維酵母屬某些種。合適昆蟲細胞包括衍生自中國桑蠶 (Bombyx mori) 、甘藍夜蛾 (Mamestra brassicae) 、草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 、粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)及黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster)之昆蟲細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0、CRL7O3O、HsS78Bst、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、人類腺病毒轉型293細胞( 例如HEK293)、PER.C6、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞株、衍生自Swiss、Balb-c或NIH小鼠之鼠科3T3細胞、及CV-1細胞株細胞。

本發明亦涵蓋接合或融合至任何其他蛋白、蛋白片段、蛋白域、肽、小分子或其他化學實體之野生型及重組運鐵蛋白及乳鐵蛋白的用途。例如，合適融合或接合配偶體(conjugation partners)包括血清白蛋白(例如，牛、兔或人類)、匙孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子(包括Fc域免疫球蛋白)、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風類毒素、或來自其他病原性細菌之類毒素、或減毒毒素衍生物、細胞介素、趨化因子、升糖素樣肽-1、艾塞納肽-4(exendin-4)、XTEN、或其組合。

在本發明之一個實施例中，用於本發明之方法中之運鐵蛋白及乳鐵蛋白係具有經改良之活體內半衰期之融合蛋白，其中： ● 野生型(哺乳動物，較佳人類)運鐵蛋白或乳鐵蛋白蛋白融合至選自免疫球蛋白Fc域及白蛋白之融合蛋白；或 ● 本發明之方法範圍內之突變體運鐵蛋白或乳鐵蛋白融合至選自免疫球蛋白Fc域及白蛋白之融合蛋白。

在一個實施例中，較佳融合蛋白為免疫球蛋白Fc域。例如，免疫球蛋白Fc域可包含恆定重鏈免疫球蛋白域之至少一部分。恆定重鏈免疫球蛋白域較佳為包含CH2及CH3域及視情況鉸鏈區之至少一部分的Fc片段。免疫球蛋白Fc域可為IgG、IgM、IgD、IgA或IgE免疫球蛋白Fc域，或由此衍生之經修飾免疫球蛋白Fc域。較佳地，免疫球蛋白Fc域包含恆定IgG免疫球蛋白Fc域之至少一部分。IgG免疫球蛋白Fc域可選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc域、或其經修飾Fc域。

在一個實施例中，融合蛋白可包含融合至IgG1 Fc域之運鐵蛋白。在一個實施例中，融合蛋白可包含融合至IgG1 Fc域之運鐵蛋白突變體。 [神經退行性事件]

令人驚訝地，本發明人已經發現運鐵蛋白及乳鐵蛋白在鐵結合/遞送至細胞之外具有意想不到的治療作用，因為此等兩種蛋白質在刺激來自神經前驅細胞及/或神經幹細胞之神經細胞之發育方面非常有效。因而，本發明提供在罹患神經退行性事件之患者中刺激神經細胞發育之方法，該方法包括將治療有效量之選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。

如本文使用，術語「刺激神經細胞發育」用於意謂運鐵蛋白或乳鐵蛋白對於患者之神經前驅細胞及/或神經幹細胞具有直接或間接作用以便產生新神經細胞。不希望限制本發明之普遍性，認為投與運鐵蛋白或乳鐵蛋白導致以下中之至少一者增加： i) 患者內之神經前驅細胞及/或神經幹細胞之增殖，或 ii) 誘導神經前驅細胞及/或神經幹細胞分化成經分化之神經細胞，與未暴露於運鐵蛋白、或乳鐵蛋白之神經前驅細胞/神經幹細胞相比。

藉由「神經細胞」，本說明書包括神經系統之所有細胞包括但不限於神經膠質細胞、及神經元細胞。在一個實施例中，在本發明之方法中涉及之神經細胞係神經元細胞並且運鐵蛋白及乳鐵蛋白增強新神經元細胞之神經新生。

如本文使用，術語「神經退行性事件」係指引起神經細胞之結構及/或功能損失的事件並且包括神經細胞死亡。該事件可為導致立即神經細胞損害或死亡的孤立一次性事件/發生。或者，該事件可為逐步導致神經細胞損害程度增加或死亡的連續或慢性事件。在一個特定實施例中，神經退行性事件引起大腦及/或脊髓中之結構損失、功能損失、或神經元細胞(或神經元)死亡，導致大腦及/或脊髓損害及功能障礙。

在一個實施例中，神經退行性事件由神經退行性疾病導致。「神經退行性疾病」意謂以神經元之功能異常及/或死亡為特徵，導致大腦、脊髓、中樞神經系統、及/或末梢神經系統之神經功能損失的任何疾病。本發明之範圍內之神經退行性疾病可為慢性或急性。

本發明範圍內之神經退行性疾病之非限制性實例包括帕金森氏症、額顳葉失智症、阿茲海默氏症、輕度認知障礙、瀰漫性路易氏體疾病、路易氏體型失智症、脫髓鞘疾病如多發性硬化症及急性橫貫性脊髓炎，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨汀頓氏舞蹈症、克雅氏病、皮質基底節變性、周圍神經病變、進行性核上性麻痹、脊髓小腦變性、脊髓性共濟失調、弗里德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)、小腦皮質變性、神經原性肌萎縮症、前角細胞變性、嬰兒脊髓性肌萎縮症及青少年脊髓性肌萎縮症、亞急性硬化性全腦炎、Hallervorden-Spatz病、拳擊手型失智症、皮克氏病、tau蛋白病、突觸核蛋白病及其組合。

在一個實施例中，神經退行性疾病可選自由以下組成之群：帕金森氏症、阿茲海默氏症、多發性硬化、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、及亨汀頓氏舞蹈症。例如，神經退行性疾病可為帕金森氏症。

作為非限制性/非束縛性理論，已知神經退行性傷害或損傷導致神經幹細胞遷移至此傷害或損傷部位。參見 Arvidsson 等人 , 2002, Nat. Med., 8, 963-970 ；Kokaia及Lindvall, 2003, Curr. Opin. Neurobiol., 13, 127-132 ；及 Kernie 等人 , 2010, Neurobiol. Disease, 37, 267-274 。本發明人假定藉由增加患者內之運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合之濃度，此類分子可增強且/或促進身體的自身神經再生修復機制。運鐵蛋白及乳鐵蛋白可藉由熟習此項技術者已知之任何習知藥物遞送手段來直接或間接地投與神經退行性傷害或損傷部位。

熟習此項技術者應認識到段落[0037]至[0044]內揭示之特定實施例不應孤立地閱讀，並且本說明書意圖所揭示之此等實施例與其他實施例組合，而非個別地揭示。例如，段落[0037]至[0044]中揭示之實施例中之各者應詮釋為明確地與段落[0011]至[0036]中之實施例中之各者、或其中揭示之實施例中之2者或更多者之任何變換組合。 [組合療法]

本發明之方法亦涵蓋與運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白組合之輔助活性化合物及分子的用途。輔助活性化合物及分子可與運鐵蛋白、或乳鐵蛋白共配製為單位劑型，亦即意欲作為用於待治療之受試者之單一劑量的實體上分立單位。或者，輔助活性化合物及分子可以部件套組形式呈現，並且： ● 與運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白分開地，以分階段或依序給藥模式來投與；或 ● 同時自不同劑型來共同投與。

例如，本發明之方法涵蓋投與和運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白組合的其他基於血清或血漿之蛋白。本發明之範圍內之血清或血漿蛋白包括自合適血漿來源諸如人類血漿純化之蛋白、及使用重組製造技術製備之蛋白。例如，血清或血漿蛋白可選自由以下組成之群：白蛋白(例如ALBUTEIN)、α-1抗胰蛋白酶/α-1蛋白酶抑制劑(例如PROLASTIN)、抗凝血酶(例如THROMBATE III)、多株免疫球蛋白(IgG、IgA、及其組合)、多特異性免疫球蛋白(IgM)、C1酯酶抑制劑(例如BERINERT)、甲狀腺素轉運蛋白、及其組合。

本發明之範圍內之示例性多株免疫球蛋白包括商購多株IgG調配物諸如FLEBOGAMMA DIF 5%及10%、GAMUNEX– C 10%、BIVIGAM 10%、GAMMAGARD Liquid 10%等。

本發明之範圍內之示例性多特異性免疫球蛋白(IgM)包括含有多特異性IgM之商購免疫球蛋白調配物諸如PENTAGLOBIN或TRIMODULIN。

在一個實施例中，血清或血漿蛋白可選自由以下組成之群：白蛋白、抗凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、C1酯酶抑制劑、及其組合。例如，血清或血漿蛋白可選自由以下組成之群：抗凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、及其組合。在一個特定實施例中，除了選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，將治療有效量之α-1抗胰蛋白酶投與患者。在一個特定實施例中，除了選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，將治療有效量之抗凝血酶投與患者。

本發明之方法亦提供投與和運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白組合的已知神經原性/神經營養化合物及分子。例如，本發明之方法涵蓋與運鐵蛋白及/或乳鐵蛋白一起，投與神經原性/神經營養蛋白、肽、及小分子。

合適神經原性及/或神經營養化合物及分子可選自由以下組成之群：BDNF(大腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)；NGF超家族；SEQ ID NO: 6)、GNDF(膠質細胞株衍生神經營養因子；TGF-β超家族；SEQ ID NO: 7)、CNTF(睫狀神經營養因子-1(cilliary neurotrophic factor)；神經因子超家族；SEQ ID NO: 8)、PACAP(垂體腺苷酸環化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide)之胺基酸1-38；SEQ ID NO: 9)、Y-27632及其醫藥學上可接受之鹽[ 反-4-[(1 R)-1-胺基乙基]- N-4-吡啶基環己烷甲醯胺]、法舒地爾(Fasudil)及其醫藥學上可接受之鹽[六氫-1-(5-異喹啉基-磺醯基)-1 H-1,4-二氮呯]、及其組合。

熟習此項技術者認識到本發明亦在其範圍內涵蓋以上列出化合物及分子中之各者與運鐵蛋白及乳鐵蛋白中之各者的共價接合物。此外，應認識到本發明亦在其範圍內涵蓋以上列出蛋白及肽中之各者與運鐵蛋白及乳鐵蛋白中之各者的重組融合蛋白。

在一個實施例中，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可佔用於本發明之治療性方法中之總蛋白含量的至少20重量%。例如，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可佔用於本發明之組合療法中之總蛋白含量之大於或等於約30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、93重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、或99重量%。

熟習此項技術者應認識到段落[0046]至[0054]內揭示之特定實施例不應孤立地閱讀，並且本說明書意圖所揭示之此等實施例與其他實施例組合，而非個別地揭示。例如，段落[0046]至[0054]中揭示之實施例中之各者應詮釋為明確地與段落[0011]至[0044]中之實施例中之各者、或其中揭示之實施例中之2者或更多者之任何變換組合。 [本發明之醫藥組合物]

在另一態樣中，本發明亦提供包含運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合之醫藥組合物，用於在罹患神經退行性事件之患者中產生新神經細胞。

本發明之醫藥組合物可視情況進一步包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。至少一種醫藥學上可接受之載劑可選自佐劑及媒劑。至少一種醫藥學上可接受之載劑包含適合於所需特定劑型的任何及所有溶劑、稀釋劑、其他液體媒劑、分散助劑、懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑。

合適載劑描述於 Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第 21 版， 2005 ， D.B. Troy 、 Lippincott Williams 及 Wilkins 編 , Philadelphia ，及 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick 及 J. C. Boylan 編 , 1988-1999, Marcel Dekker, New York，其內容以引用方式併入本文。此類載劑或稀釋劑之較佳實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、乙二醇、葡萄糖溶液、緩衝溶液(諸如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、及山梨酸鉀)及5%人類血清白蛋白。視投與途徑而定，亦可使用脂質體及非水性媒劑諸如飽和植物脂肪酸、及不揮發性油(諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油)之甘油酯混合物。

本發明之醫藥組合物經調配以與其意欲投與途徑相容。對於全身使用，本發明之醫藥組合物可被配製成藉由選自由以下組成之群之習知途徑來投與：靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、大腦內、顱內、肺內、鼻內、脊椎內、鞘內、經皮、經黏膜、經口、陰道、及直腸。

在一個實施例中，非經腸投與為較佳投與途徑。醫藥組合物可封閉於安瓿、一次性注射器、密封袋、或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。在一實施例中，如靜脈內注射之投與為較佳投與途徑。調配物可藉由輸注或藉由快速濃注來連續投與。

本發明之醫藥組合物可以單位劑量單位形式呈現，亦即意欲作為用於待治療之受試者之單一劑量的實體上分立單位。

適合於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(當可溶於水中時)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，合適載劑包括生理鹽水、抑菌水、CREMOPHOR EL、或磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline；PBS)。在所有情況下，組合物必須為無菌的，並且應該為流動的，達到易於注射之程度。

本發明之組成物應在製造及儲存條件下為穩定的。此外，組合物應該被保存以防止微生物如細菌及真菌之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇、及其類似物)、及其合適混合物之溶劑或分散介質。

防止微生物作用可藉由各種抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞、及其類似劑來達成。在多種情況下，較佳應於組合物中包括等滲劑，例如糖(諸如甘露糖醇、山梨糖醇等)、多元醇或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠來達成。

本發明之醫藥組合物之無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性分子與如以上論述之成分之一者或組合一起併入合適溶劑中隨後過濾滅菌來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，提供活性成分之散劑加上來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分。

除非任何習知介質或試劑與本發明之活性分子不相容，否則其在組合物中之用途預期在本發明之範圍內。

在一個實施例中，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可佔本發明之醫藥組合物之總蛋白含量之至少20重量%。例如，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可佔本發明之醫藥組合物之總蛋白含量之大於或等於約30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、93重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、或99重量%。

熟習此項技術者應認識到段落[0056]至[0067]內揭示之特定實施例不應孤立地閱讀，並且本說明書意圖所揭示之此等實施例與其他實施例組合，而非個別地揭示。例如，段落[0056]至[0067]中揭示之實施例中之各者應詮釋為明確地與段落[0011]至[0054]中之實施例中之各者、或其中揭示之實施例中之2者或更多者之任何變換組合。 [給藥]

如以上論述，本發明人假定藉由增加神經退行性傷害或損傷部位附近之運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合之濃度，此類分子可增強且/或促進身體的自身神經再生修復機制。運鐵蛋白及乳鐵蛋白可藉由熟習此項技術者已知之任何習知藥物遞送手段來直接或間接地投與神經退行性傷害或損傷部位。例如，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可藉由選自由大腦內、顱內、脊椎內、及鞘內組成之群之習知途徑來局部投與或投與至由神經退行性事件引起之損傷附近。例如，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合可在外科手術期間局部投與。

替代地，運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可藉由選自由靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、肺內、鼻內、經皮、經黏膜、經口、陰道及直腸組成之群之投與途徑來間接地遞送至神經退行性傷害或損傷部位。

為避免任何疑問，藉此機會澄清本說明書在兩個獨立且不同之情形中談到運鐵蛋白鐵飽和水平： a) 在如段落[0016]概述之第一種情形中，本說明書談到待投與患者之醫藥組合物中之經純化外源運鐵蛋白之鐵飽和度。在此情況下，經純化外源運鐵蛋白之鐵飽和水平可使用感應耦合電漿原子發射光譜來測定(但是亦可使用其他方法，諸如比色方法)。 b) 在以下立即更詳細地論述之第二種情形中，本說明書談到在將含有外源運鐵蛋白之醫藥組合物投與患者之後，量測患者中，亦即患者之血漿或血清中之生理運鐵蛋白之鐵飽和度。

在正常生理條件下，實際上血漿中之所有鐵結合至運鐵蛋白並且生理運鐵蛋白之所得鐵飽和度為大約30%。在實例6(參見下文)中，本發明人證實具有少於30%之鐵飽和度之運鐵蛋白導致意外神經再生效應。作為非限制性假設，設想藉由向患者投與含有外源運鐵蛋白(具有低鐵飽和度)之醫藥組合物，患者之血漿內之運鐵蛋白之生理濃度增加，導致生理運鐵蛋白之鐵飽和度下降至30%以下。因此，允許生理運鐵蛋白利用神經再生效應。自然地，具有少於1%之鐵飽和度之外源運鐵蛋白可能比具有40%之鐵飽和度的外源運鐵蛋白更有效。

因此，在一個實施例中，將選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以足以將患者之運鐵蛋白(在患者之血清或血漿樣品中)之鐵飽和度減少至約30%以下之濃度來投與患者。較佳地，將選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以足以將患者之運鐵蛋白(在患者之血清或血漿樣品中)之鐵飽和度減少至約20%以下，例如約10%以下之濃度來投與患者。運鐵蛋白、乳鐵蛋白、或其組合可使用基於滴定之劑量方案來投與患者以達成此血清或血漿運鐵蛋白鐵飽和水平。

熟習此項技術者認識到量測患者之血清或血漿中之運鐵蛋白鐵飽和水平係通常使用如以上段落[0018]中論述之比色方法來執行的常規檢定。血漿或血清鐵含量在化學分析器上使用比色反應來量測，該反應使用呋喃三嗪二鈉鹽或菲洛嗪作為色原體以與鐵形成顏色複合物。經分析之樣品產生兩個值： ● 樣品鐵含量(亦即結合至樣品中之運鐵蛋白的鐵)，及不飽和鐵結合能力(unsaturated iron binding capacity；UIBC，亦即樣品中之運鐵蛋白上之未佔用鐵結合位點的數目)。 ● 總鐵結合能力(total iron binding capacity；TIBC)為樣品鐵含量及UIBC之總和。 ● 運鐵蛋白飽和度(%)以[(樣品鐵含量/TIBC) x 100]來測定。

量測患者之血清或血漿中之運鐵蛋白鐵飽和水平之比色檢定之操作係公知常識並且進一步資訊可在各種文獻綜述，諸如Pfeiffer 等人， Am J Clin Nutr2017，106(增刊),1606S–14S中找到，其內容以引用方式併入本文。

在本發明之方法之仍另一實施例中，選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白可以約5 mg/kg至約8400 mg/kg之濃度投與患者。例如，約10 mg/kg至約7000 mg/kg，諸如約20 mg/kg至約6000 mg/kg，例如約50 mg/kg至約5000 mg/kg。在一些實施例中，選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白可以約50 mg/kg至約1000 mg/kg之濃度投與患者。適當地，蛋白可以約50 mg/kg至約500 mg/kg，諸如約50 mg/kg至約250 mg/kg，例如約50 mg/kg至約150 mg/kg之濃度投與。

在一個實施例中，本發明之方法可包括作為多次給藥方案之一部分，將選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。例如，在多次給藥期期間，在投與期之第1天，初始劑量為約50 mg/kg至約5000 mg/kg，隨後每個劑量為約50 mg/kg至約1000 mg/kg。例如，在多次給藥期期間，在投與期之第1天，初始劑量為約50 mg/kg至約1000 mg/kg，隨後每個劑量為約50 mg/kg至約500 mg/kg。例如，在多次給藥期期間，在投與期之第1天，初始劑量為約50 mg/kg至約500 mg/kg，隨後每個劑量為約50 mg/kg至約250 mg/kg。例如，在多次給藥期期間，在投與期之第1天，初始劑量為約50 mg/kg至約250 mg/kg，隨後每個劑量為約50 mg/kg至約250 mg/kg。多次給藥期可包含約3至約30次投與直至總累積劑量。多次給藥期可為約1至約30週。多個部分劑量可以約1天至約30天之間隔投與。

熟習此項技術者應認識到段落[0069]至[0077]內揭示之特定實施例不應孤立地閱讀，並且本說明書意圖所揭示之此等實施例與其他實施例組合，而非個別地揭示。例如，段落[0069]至[0077]中揭示之實施例中之各者應詮釋為明確地與段落[0011]至[0067]中之實施例中之各者、或其中揭示之實施例中之2者或更多者之任何變換組合。

一般技藝人士應容易地顯而易知本文如下揭示之實例僅代表概括實例，並且能夠再現本發明之其他佈置及方法係可能的並且藉由本發明包涵。 [實例1：原運鐵蛋白(apo-transferrin；ApoTf)以劑量反應方式誘導SH-SY5Y細胞中之分化及軸突生長]

在細胞培養物中以及在活體內利用運鐵蛋白，以將鐵作為營養物遞送至細胞中。此舉通常經由全鐵運鐵蛋白(holo-transferrin；HoloTf)結合至其同源受體CD71運鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1；TfR1)並且藉由其內吞的作用來實現。通常咸信運鐵蛋白向細胞提供鐵作為促進及維持代謝活動之手段。本發明人意外地發現原運鐵蛋白，無鐵形式之運鐵蛋白，誘導很常見神經元研究模型SH-SY5Y細胞之分化。神經元分化之誘導藉由軸突形成之形態參數(通常用作神經元分化、神經元健康、及功能之標誌物的關鍵要素)根據以下程序來評定：Agholme，2010. J. of Alzheimer’s Disease. Vol. 20:1p069–108；及Dyberg 等人, 2017. PNASVol 114 (32), E6603-E6612。

未分化的SH-SY5Y細胞接種於96孔透明底部板中之含有0.1% FBS之培養基中。無血清基礎培養基如藉由SH-SY5Y細胞之供應商建議來利用(Sigma，目錄號94030304-1VL)。接種細胞之後二十四小時，將無血清基礎培養基中之x軸指示之最終濃度之ApoTf之3x儲備溶液添加至細胞。ApoTf自彙集人類血漿獲得並且純化並且以0.2mg/mL之最終濃度給予。允許細胞分化6天。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。

簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。

獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞、細胞主體、並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到各測試孔中之不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照細胞設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。

自圖1A，很明顯原運鐵蛋白能夠以劑量依賴性方式誘導軸突生長。原運鐵蛋白濃度遞增增加直至0.8mg/mL之最大值與SH-SY5Y細胞中之經改良之生長反應相關。此現象與運鐵蛋白之已知功能相反，運鐵蛋白主要以全鐵或載鐵形式之運鐵蛋白起作用。

圖1B示出原運鐵蛋白誘導細胞數目之濃度依賴性增加。增加細胞數目指示增加細胞增殖，直至0.8 mg/mL原運鐵蛋白之最大測試劑量。

圖1C提供用0.1mg/mL ApoTf治療之SH-SY5Y細胞(下圖)與未治療對照(上圖)之視覺比較。左圖示出使用Hoechst 33342之細胞核染色。右側影像示出細胞主體及軸突之微管蛋白染色。自圖1C，顯而易知ApoTf對於促進細胞增殖，及隨後/同時促進誘導軸突/微管蛋白生長具有深遠效應。

另外，如圖1D示出，發現原運鐵蛋白治療導致一種經較好表徵之傳統神經元標誌物β-III-微管蛋白增加。在此實驗中，SH-SY5Y細胞如以上描述來分化。在分析時，細胞用多聚甲醛固定，針對β-III-微管蛋白(R&D Systems, MAB1195)來染色，並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。影像分析藉由評估用β-III-微管蛋白染色之細胞之螢光強度來執行。來自單獨二級抗體之背景自所有值減去。對於指示條件，該等值以標準偏差來顯示為「β-III-微管蛋白染色強度」。 [SH-SY5Y細胞]

藉由「SH-SY5Y細胞」，本說明書意謂衍生自SK-N-SH神經母細胞瘤細胞株之次選殖細胞株。其充當神經退行性病症之模型，因為藉由添加特定化合物，該等細胞可轉化成各種類型之功能神經細胞。另外，SH-SY5Y細胞株廣泛地用於實驗神經學研究中，包括與神經退行性過程、神經中毒性、及神經保護相關之神經元分化、代謝、及功能的分析。

本文在以下概述經同行評審之引文，該等引文將SH-SY5Y細胞株稱為各種神經退行性病症之預測性模型。該清單不構成本發明人對於先前技術的承認，實情為其用來說明熟習此項技術者知道SH-SY5Y細胞株作為神經退行性病症之預測性模型的效用。

[神經新生] Dayem 等人Biologically synthesized silver nanoparticles induce neuronal differentiation of SH-SY5Y cells via modulation of reactive oxygen species, phosphatases, and kinase signaling pathways. Biotechnol. J.2014, 9, 934-943. Fagerstrom 等人Protein Kinase C-epsilon Implicated in Neurite Outgrowth in Differentiating Human Neuroblastoma Cells. Cell Growth & DifferentiationVol. 7, 775-785, June 1996.

[情緒穩定(抑鬱 )]Yuan 等人The Mood Stabilizer Valproic Acid Activates Mitogen-activated Protein Kinases and Promotes Neurite Growth. JBCVol. 276, No. 34, Issue of August 24, pp. 31674-31683, 2001. Tatro 等人. Modulation of Glucocorticoid Receptor Nuclear Translocation in Neurons by Immunophilins FKBP51 and FKBP52: Implications for Major Depressive Disorder. Brain Res. 2009 August 25; 1286: 1-12. Laifenfeld 等人. Norepinephrine alters the expression of genes involved in neuronal sprouting and differentiation: relevance for major depression and antidepressant mechanisms. Journal of Neurochemistry, 2002, 83, 1054-1064. Cavarec 等人. In Vitro Screening for Drug-Induced Depression and/or Suicidal Adverse Effects: A New Toxicogenomic Assay Based on CE-SSCP Analysis of HTR2C mRNA Editing in SH-SY5Y Cells. Neurotoxicity Research. Jan2013, Vol. 23 Issue 1, p49-62.

[Tau蛋白病(阿茲海默氏症、FTD及其他Tau蛋白異常之神經退行性疾病）) Jamsa 等人. The retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor differentiated SH-SY5Y cell line as a model for Alzheimer's disease-like tau phosphorylation. Biochemical and Biophysical Research Communications319 (2004) 993-1000. Seidel et. al. Induced Tauopathy in a Novel 3D-Culture Model Mediates Neurodegenerative Processes: A Real-Time Study on Biochips . PLOS One.(November 2012) Volume 7 Issue 11. e49150. Karch 等人Extracellular Tau Levels Are Influenced by Variability in Tau That Is Associated with Tauopathies . JBCVOL. 287, NO. 51, pp. 42751-42762, December 14, 2012.

[阿茲海默氏症] Pettifer 等人. Guanosine protects SH-SY5Ycells against b-amyloid-induced apoptosis. NeuroReport2004 15(5):833-836. Tanii 等人. Alzheimer's Disease Presenilin-1 Exon 9 Deletion And L250s Mutations Sensitize SH-SY5Y Neuroblastoma Cells To Hyperosmotic Stress-Induced Apoptosis. NeuroscienceVol. 95, No. 2, pp. 593-601, 2000. Li 等人. Beta-amyloid induces apoptosis in human-derived neurotypic SH-SY5Y cells. Brain Res. 1996 Nov 4;738(2):196-204.

[ALS及額顳葉型失智症] Lee 等人. Hexanucleotide Repeats in ALS/FTD Form Length-Dependent RNA Foci, Sequester RNA Binding Proteins, and Are Neurotoxic. Cell Reports5, 1178-1186, December 12, 2013. Farg 等人. C9ORF72, implicated in amytrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Human Molecular Genetics, 2014, Vol. 23, No. 13. Nonaka 等人Phosphorylated and ubiquitinated TDP-43 pathological inclusions in ALS and FTLD-U are recapitulated in SH-SY5Y cells. FEBS Letters 583 (2009) 394-400.

[帕金森氏症] Xing 等人Protective effects and mechanisms of Ndfipl on SH-SY5Y cell apoptosis in an in vitro Parkinson's disease model. Genetics and Molecular Research15 (2): gmr.15026963. Jung 等人. Rosiglitazone protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against MPP+ induced cytotoxicity via inhibition of mitochondrial dysfunction and ROS production. Journal of the Neurological Sciences253 (2007) 53-60. Choi 等人Signaling Pathway Analysis of MPP+-treated Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells. Biotechnology and Bioprocess Engineering19: 332-340 (2014).

[弗里德賴希共濟失調] Palomo 等人Silencing of frataxin gene expression triggers p53-.dependent apoptosis in human neuron-like cells. Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 14 2807-2822.

[亨汀頓氏舞蹈症] Banez-Coronel 等人A Pathogenic Mechanism in Huntington's Disease Involves Small CAG-Repeated RNAs with Neurotoxic Activity. Neuroscience Research Volume53, Issue 3, November 2005, Pages 241-249. Vidoni 等人. Resveratrol protects neuronal-like cells expressing mutant Huntingtin from dopamine toxicity by rescuing ATG4-mediated autophagosome formation. Neurochemistry International117 (2018) 174-187. Vidoni 等人. Dopamine exacerbates mutant Huntingtin toxicity via oxidative mediated inhibition of autophagy in SH-SY5Y neuroblastoma cells: Beneficial effects of anti-oxidant therapeutics. Neurochemistry International101 (2016) 132-143. Olsen 等人. Examination of mesenchymal stem cell-mediated RNAi transfer to Huntington's disease affected neuronal cells for reduction of huntingtin. Molecular and Cellular Neuroscience49 (2012) 271-281. [實例2：ApoTf對於原代人類神經前驅細胞中之β-III-微管蛋白及GFAP蛋白濃度的效應]

ApoTf之神經原性效應亦轉移至原代人類大腦皮質衍生神經前驅細胞，另一種既定成人神經新生模型( 參見Azari及Reynolds，「In Vitro Models for Neurogenesis」. Cold Spring Harb Perspect Biol2016, 8, a021279)。如圖2A及2B示出，相對於沒有原運鐵蛋白之細胞，原運鐵蛋白極大地增加來自原代人類大腦衍生神經前驅細胞之培養物的分化成神經元(β-III-微管蛋白陽性細胞%，圖2A)及星形細胞(GFAP陽性細胞%，圖2B)之細胞之百分比。

保持為神經球之神經前驅細胞獲自Lonza (PT-2599)。將細胞自神經球之冷凍小瓶中解凍並且在人類NeuroCult™ NS-A完全增殖培養基(Stemcell Technologies)中培養2週。將神經球分離成單一細胞並且塗鋪在檢定板之經層黏連蛋白塗佈之孔中。在不存在或存在ApoTf (0.8 mg/mL)的情況下，將神經前驅細胞接種於含有1/10濃度之建議增殖補充物的NeuroCult™ NS-A基礎培養基中72小時。在分析時，細胞用多聚甲醛固定，針對β-III-微管蛋白(R&D Systems, MAB1195)及GFAP (Invitrogen, PA3-16727)來染色，並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。藉由評估對於β-III-微管蛋白或GFAP呈陽性染色之細胞之相對數目來執行影像分析。指示條件之值以標準偏差來顯示為「% β-III-微管蛋白陽性」細胞(圖2A)或「% GFAP陽性」細胞(圖2B)。 [實例3：鐵螯合併非藉由ApoTf之唯一神經新生作用模式]

甲磺酸去鐵胺(deferoxamine mesylate；DFO)係用於鐵過載之臨床實踐中之小分子鐵螯合劑。如同ApoTf，DFO對於鐵具有高親和力結合常數；但是僅具有單一鐵結合位點。研究DFO對於軸突生長之效應。ApoTf以接近於其功能劑量曲線底部之濃度來測試並且與DFO誘導軸突生長之能力進行比較。以2.4 μM(0.2mg/mL)測試之ApoTf具有兩個鐵結合位點，並且因此與4.8 μM下之DFO之單一鐵結合位點相當。

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來接種並且治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。ApoTf自彙集人類血漿獲得並且純化並且以0.2mg/mL之最終濃度給予。甲磺酸去鐵胺(DFO)獲自Tocris (目錄號5764)，按照製造商之建議來重新懸浮並且儲存。針對神經原性性質來評定之DFO之濃度在x軸上指示。

自圖3A，可發現DFO在1-3 μM之間顯示最大軸突生長，並且超出該濃度，軸突形成極少，而ApoTf繼續增加分化甚至一直到9.9 μM(0.8 mg/mL；20 μM鐵結合位點)。此等資料表明雖然鐵螯合可在軸突生長中起作用，但是其並非主要作用機制；ApoTf之另一未識別功能方面亦必須在其神經原性能力中起作用。

本發明人進一步尋求測定是否藉由N末端鐵結合位點之突變來減少運鐵蛋白之鐵結合活性足以介導神經新生。

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。所有蛋白以0.2mg/mL之最終濃度給予。

血漿來源之人類血清白蛋白(pdHSA)及ApoTf自彙集人類血漿獲得並且純化；重組ApoTf(rec ApoTf；SEQ ID NO: 1)、及N-葉片突變體Tf(N-mut rec ApoTf；SEQ ID 4)藉由自293-6E細胞之細胞培養物表現來獲得。

簡言之，將野生型人類運鐵蛋白(SEQ ID NO:1)及N-葉片突變體人類運鐵蛋白(SEQID4)序列選殖至含有N末端6xHIS標籤及TEV裂解位點之哺乳動物表現質體中。將表現質體轉染至293-6E細胞株中，隨後自細胞培養物上清液收穫蛋白。蛋白在NI-NTA管柱上純化並且在洗滌之後溶離。TurboTEV蛋白酶用於自運鐵蛋白裂解N末端6xHIS標籤及額外胺基酸。TEV裂解之後，藉由第二Ni-NTA捕獲管柱將運鐵蛋白與裂解6xHIS標籤及未裂解蛋白分離。然後，Ni-NTA捕獲管柱之徑流溶離份經受低pH處理，以移除結合至此等蛋白之任何潛在殘餘鐵，緩衝交換至PBS pH 7.4，濃縮，並且無菌過濾供最終使用。

自圖3B，我們發現血漿來源之人類血清白蛋白(pdHSA)不影響神經新生。然而，ApoTf及重組ApoTf均誘導SH-SY5Y之神經新生。具有減少鐵結合能力之ApoTf突變體(N-mut rec ApoTf)在誘導SH-SY5Y細胞之分化方面與ApoTf及rec ApoTf幾乎相等。鐵結合似乎並非ApoTf之神經原性潛力之唯一作用機制。 [實例4：對於SH-SY5Y之神經原性效應對於原運鐵蛋白及原乳鐵蛋白係特異性的]

因為根據實例3，發現鐵螯合在ApoTf之神經原性能力中之作用不清楚，本發明人測定是否其他鐵結合蛋白亦可介導SH-SY5Y細胞之神經新生。

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。BSA獲自Sigma；rHSA獲自Albumedix；ApoTf及HoloTf自彙集人類血漿獲得並且純化；原鐵蛋白(馬)獲自Sigma；原乳鐵蛋白獲自Athens Research & Technology。所有蛋白以0.2mg/mL之最終濃度給予。

自圖4，我們發現牛血清清蛋白(bovine serum albumin；BSA)及低親和力鐵結合形式之人類血清白蛋白均不影響神經新生。對於低親和力鐵結合形式之人類血清白蛋白(human serum albumin；rHSA)之進一步資訊，參見Silva 等人，2009. Biochimica et Biophysica Acta，第1794卷，第1449–1458頁。全鐵運鐵蛋白(HoloTf)，亦即鐵飽和形式之運鐵蛋白亦不能誘導SH-SY5Y細胞之分化。

意外地，另一具有多個鐵結合位點之高親和力鐵結合蛋白，原鐵蛋白，亦即鐵貧乏形式之鐵蛋白，在誘導SH-SY5Y細胞之分化方面係無效的。此發現結果推進了鐵結合為ApoTf之神經原性潛力之唯一作用機制的假設。出乎意料地，原乳鐵蛋白亦誘導此等細胞之分化。原乳鐵蛋白係原運鐵蛋白之結構及功能同源物，但是在母乳中而不是在血漿中發現。

原乳鐵蛋白與原運鐵蛋白具有61%一致性，而原鐵蛋白及人類血清白蛋白(HSA)在結構上與原運鐵蛋白或原乳鐵蛋白無關。 [實例5：ApoTf誘導之SH-SY5Y細胞分化並非經由缺氧誘導因子1α(HIF-1α)]

已報導ApoTf及HoloTf均可誘導HIF-1α產生，導致相關神經保護效應(Grifols Worldwide Operations limited之US2016008437，其內容以引用方式併入本文)。雖然在神經元死亡之前，此為有益特性，但是一旦神經元細胞死亡，神經保護並非有益於患者。另一方面，在傷害之後，神經新生有益於患者，因為其可使新神經元細胞再生。

為了證實ApoTf在HIF途徑以外介導神經新生之假設，本發明人在SH-SY5Y細胞分化檢定中測試一種熟知、高度特異性脯胺醯基羥化酶(PHD2)抑制劑。已知小分子PHD2抑制劑IOX2( N-[[1,2-二氫-4-羥基-2-側氧基-1-(苯基甲基)-3-喹啉基]羰基]-甘胺酸)可經由其對於PHD2之作用來活化HIF途徑。參見Chowdhury 等人, 2013. ACS Chem. Biol. 第8卷，第1488頁。IOX2具有用於抑制PHD2之22nM之IC ₅₀並且可在低至1μM之濃度下誘導未分化SH-SY5Y中之HIF-1α之上調(Ross，US2016008437 上述)。

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來接種並且治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。ApoTf自彙集人類血漿獲得並且純化並且以0.2mg/mL之最終濃度給予。IOX2獲自Tocris (目錄號4451)，按照製造商之建議來重新懸浮並且儲存。

自圖5，很明顯在IOX2治療細胞中未觀察到軸突生長或分化。甚至4μM IOX2之非常高濃度下，未觀察到效應(比在US2016008437中報導的誘導SH-SY5Y中之HIF-1α之濃度高4倍，並且比Chowdhury測定為用於PHD2蛋白之IC ₅₀之濃度高180倍以上)。此等資料，以及對於HoloTf缺少神經新生(實例4)，指示HIF-1α在使SH-SY5Y細胞分化中不起作用。 [實例6：鐵飽和度在運鐵蛋白功效中之作用]

將如表1概述的具有各種純度及鐵飽和量之ApoTf針對其神經原性潛力來進行評定。運鐵蛋白樣品根據熟習此項技術者已知並且在L von Bonsdorff 等人， Transferrin，第21章，第301-310頁， Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use，J. Bertolini 等人編, Wiley, 2013 [印刷物ISBN:9780470924310 |線上ISBN:9781118356807]之第21.4節中詳述之程序/方法來製備，其內容以引用方式併入本文。

蛋白純度藉由SDS-PAGE來測定。鐵飽和水平使用ICP-AES根據Manley 等人， J Biol Inorg Chem (2009) 14:61–74概述之程序來測定，其內容以引用方式併入本文。 [表1]

樣品名稱	蛋白純度(%)	鐵飽和度(%)	來源
原運鐵蛋白A	99.11	0.27	Grifols – 室內製備
原運鐵蛋白B	98.57	0.59	Grifols – 室內製備
原運鐵蛋白C	96.72	0.24	Grifols – 室內製備
原運鐵蛋白D	94.35	未測定	Athens Research & Technology Inc., 目錄號16-16A32001-BPG
全鐵運鐵蛋白	99.0	100	Grifols – 室內製備

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。

圖 6A將以0.2mg/mL之最終濃度給予的純度及鐵含量在表1中概述的ApoTf A-D對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。圖6B將以0.2mg/mL之最終濃度給予的具有各種鐵飽和水平(在X軸上列出)之運鐵蛋白對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長繪圖。

在自彙集人類血漿純化運鐵蛋白之後，製備ApoTf(＜0.3%飽和度)及HoloTf(100%飽和度)，如von Bonsdorff，參見上文概述。藉由混合ApoTf及HoloTf以產生在圖6B中繪製之所指示飽和度百分比，產生各種鐵飽和含量。

自圖6A，我們發現所有ApoTf製劑(ApoTf A-D)，甚至具有僅94%蛋白純度之樣品，能夠誘導SH-SY5Y之神經原性分化。圖6B示出鐵飽和程度對於運鐵蛋白誘導SH-SY5Y細胞之分化之能力所具有的效應。在此實例中，將具有至少99%之蛋白純度的ApoTf或HoloTf以各種比率混合以便測定鐵飽和度/含量之效應。具有少於30%之鐵飽和含量的運鐵蛋白顯示神經原性潛力。 [實例7：原運鐵蛋白與神經營養蛋白及肽因子協同作用以便誘導分化]

若干神經營養蛋白因子經考量用於臨床用途中，以便在神經退行性病狀中以及在創傷性腦損傷之後刺激神經新生。參見 Houlton等人, 2019. Frontiers in Neurosci., Vol.13, Article 790；Weissmiller及Wu, 2012. Translational Neurodegeneration, Vol. 1:14; Apfel, 2001. Clin Chem Lab Med., Vol. 39(4), p351。

來自三個神經營養超家族之蛋白針對與ApoTf組合時之功能來進行測試。此等神經營養蛋白係：BDNF(大腦衍生神經營養因子；NGF超家族)，GNDF(膠質細胞株衍生神經營養因子；TGF-β超家族)，及CNTF(睫狀神經營養因子-1；神經因子超家族)。另外，另一已知神經營養肽PACAP(垂體腺苷酸環化酶活化多肽之胺基酸1-38)針對與ApoTf組合時之功能來進行評定。

在圖7A-7D中，ApoTf單獨或與指示神經營養因子組合以0.1mg/mL之最終濃度來給予。(A)BDNF獲自Peprotech(目錄號450-02)並且以25ng/mL給予。(B)GDNF獲自Peprotech(目錄號450-10)並且以1000ng/mL給予。(C)CNTF獲自Peprotech(目錄號450-13)並且以250ng/mL給予。(D)PACAP獲自Tocris(目錄號1186)並且以200nM給予。縮寫SF表示無血清培養基。

檢視圖7A-7D中之各者，顯而易知神經營養因子、及肽片段中之各者以不同程度來誘導SH-SY5Y細胞之分化。在一些情況下，諸如BDNF，在不存在ApoTf的情況下，在所測試濃度下，神經營養因子不誘導分化。在提供之所有實驗中，與經測試之單獨分子相比，與ApoTf組合之神經營養因子誘導更大分化。出乎意料地，ApoTf顯示與其他神經營養因子及肽的對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長的協同效應。 [實例8：原運鐵蛋白與神經原性小分子協同作用以便誘導分化]

在實例7中測試ApoTf與基於非蛋白的神經原性小分子化合物一起發揮作用之能力。評定與神經原性化合物Y-27632 [ 反-4-[(1 R)-1-胺基乙基]- N-4-吡啶基環己烷甲醯胺二鹽酸鹽]組合之ApoTf。Y-27632係Rock1及Rock2(Rho激酶)抑制劑。藉由小分子來抑制Rock1及2具有誘導神經元分化之已知能力，包括SH-SY5Y細胞。參見 Dyberg 等人, 2017. PNASVol 114 (32), E6603-E6612。

未分化的SH-SY5Y細胞如實例1所描述來治療。軸突生長藉由成像及影像分析來評定。在分析時，製備Tubulin Tracker (Molecular Probes, T34075)及Hoechst 33342 (Molecular Probes #H3570)細胞核染色劑之10x溶液。簡言之，將溶解於DMSO中之Tubulin Tracker用Pluronic F-127 1:1稀釋並且進一步稀釋至HBSS中以產生10x溶液。將Hoechst 33342以10μg/mL添加至HBSS-Tubulin Tracker溶液以產生10x細胞核染色劑。將10x染色溶液(10μL)直接添加至經治療之檢定孔並且在37℃下培養30分鐘。培養之後，將110μL之0.4%錐蟲藍直接添加至檢定孔並且在Molecular Devices Nano成像儀器上成像。對於各影像，每個孔獲得藍色(細胞核)及綠色(微管蛋白)螢光通道中之九個影像。獲得影像之後，MetaExpress軸突生長分析模組(Molecular Devices)用於鑑別細胞主體並且量化軸突。軸突分支之總數除以成像細胞之總數，以考慮到不同數目之細胞。生長倍數變化藉由將未治療之對照設定為1之值來測定，並且所有其他治療相對於未治療對照來示出。ApoTf單獨或與指示小分子組合以0.1mg/mL之最終濃度來給予。Y-27632獲自Tocris(目錄號1254)並且以50μM給予。

圖8示出Y-27632本身係強烈神經原性化合物，然而，在ApoTf存在下，神經原性效應係協同的，顯示超過單獨任一分子所表現出之效應的效應。ApoTf與許多已知蛋白、肽、及小分子神經原性實體協同起作用之能力係意想不到的及意外的發現。 [實例9：在帕金森氏症之小鼠模型中藉由原運鐵蛋白治療實現的經改良之步態及運動]

為了說明上述活體外結果將成功轉化為積極臨床效果，發明人在帕金森氏症小鼠模型中試驗了該療法。向小鼠投與1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)以便破壞黑質中之多巴胺能神經元並且在小鼠中誘導帕金森氏症。關於更多細節參見Sedelis 等人, Behavioural Brain Research125 (2001), 109–122；Przedborski及Vila, Clinical Neuroscience Research1 (2001), 407–418。

多巴胺能神經元之破壞有害地影響動物運動。小鼠之運動及步態可藉由視訊分析來量測。如圖9示出，相對於對照小鼠(n=15)，在暴露於MPTP之小鼠中，可觀察到運動及步態之實質性改變。與在實例1-8中之發現一致，MPTP誘導之小鼠中之帕金森氏症藉由投與ApoTf (n=15)來顯著改善。圖9證明瞭ApoTf之神經再生特性，因為ApoTf極大地改善了患病小鼠之運動功能障礙，有效地使小鼠相對於對照動物來正常化。

如由芬蘭國家動物實驗委員會授權之許可證中所規定並且根據美國國立衛生研究院(Bethesda, MD, USA)關於實驗室動物護理及使用的指導方針，在Charles River Laboratories (Finland)進行動物實驗。8至12週齡的C57Bl/6J小鼠被圈養在標準溫度(22 ± 1℃)及光控環境中(上午7點至晚上8點照明開啟)，可隨意獲取食物及水。

MPTP溶液藉由將MPTP鹽酸鹽以2.42 mg/mL溶解於無菌鹽水中來製備；對應於2.0 mg/mL之活性化合物。為了誘導帕金森氏症，MPTP藉由腹膜內注射每天兩次以20 mg/kg給予。MPTP注射液或用於對照小鼠之單獨鹽水連續兩天(第0天及第1天)以4小時間隔來給予。

ApoTf蛋白在無菌PBS，pH 7.4中以51.5 mg/mL之濃度投與。藉由腹膜內注射給予小鼠350 mg/kg之ApoTf或用於對照小鼠之單獨PBS。第1天至第7天每天一次給予ApoTf，並且在第1天最後一次MPTP劑量之後1小時，給予第一次ApoTf治療劑量。

在第7天，使用Motorater (TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany)測試系統，小鼠經受運動學步態分析。在上午7點至晚上8點之間的光照週期期間對動物進行測試。在運動及步態分析時段之前，小鼠在身體之31個點上進行了標記，以方便對捕獲之視訊進行資料分析。使用高速攝影機(300 fps)自三個不同方向，亦即自下方及兩側捕獲運動。

各小鼠之捕獲視訊首先轉化成軟體可讀格式。為了獲得原始資料，跟蹤身體之標記點並且將三個方向中之各者關聯。其後，不同步態模式及運動使用由Charles River Discovery Research Service Finland開發之專門定製軟體來提取。步態模式及運動分析評估了100個不同參數，包括但不限於步幅時間、步幅期間之擺動時間、速度、步寬、站姿及四肢協調。資料藉由使用主要成分分析(PCA)來分析。總體步態分析基於各小鼠之所有參數之PCA，並且所獲得之值示出對照小鼠及MPTP、或MPTP加上ApoTf小鼠之間的總體差異，該等差異經量測為「距離」。對照小鼠(對照)設定為0之值，並且對於僅MPTP小鼠(MPTP)、或隨後進行ApoTf治療之MPTP小鼠(MPTP→ApoTf)，示出「與對照之距離」。值顯示為平均值 +/- SEM (n = 15)。 [參考文獻] [序列]

在前述文本中涉及之序列在下文中以fasta格式概述。 SEQ ID NO: 1 人類運鐵蛋白 [UniProt Q06AH7] 蛋白序列

VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP SEQ ID NO: 2 人類乳鐵蛋白 [UniProt P02788] 蛋白序列

GRRRRSVQWCTVSQPEATKCFQWQRNMRRVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAENRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVGEQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDGGYVYTAGKCGLVPVLAENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGAFRCLAENAGDVAFVKDVTVLQNTDGNNNDAWAKDLKLADFALLCLDGKRKPVTEARSCHLAMAPNHAVVSRMDKVERLKQVLLHQQAKFGRNGSDCPDKFCLFQSETKNLLFNDNTECLARLHGKTTYEKYLGPQYVAGITNLKKCSTSPLLEACEFLRK SEQ ID NO: 3 Y188F 運鐵蛋白 N- 葉片突變體蛋白

VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGFSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP SEQ ID 4 Y95F/Y188F 運鐵蛋白 N- 葉片突變體蛋白

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MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDS KKRIGWRFIRIDTSCVCTLT IKRGR SEQ ID NO: 7 GDNF

MQSLPNSNGAAAGRDFKMKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAANMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI SEQ ID NO: 8 CNTF

MAFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM SEQ ID NO: 9 PACAP

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK

無。

本發明之額外特徵及優勢在隨附圖式中變得更清楚。

圖1A至1D示出回應於原運鐵蛋白，軸突生長之誘導、及SH-SY5Y細胞之增殖及β-III-微管蛋白濃度增加。

圖2A至2B證明原運鐵蛋白誘導原代人類神經前驅細胞變成β-III-微管蛋白蛋白陽性神經元及GFAP蛋白陽性星形細胞。

圖3A將相對於原運鐵蛋白，各種濃度之甲磺酸去鐵胺對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。

圖3B示出具有減少鐵結合能力之運鐵蛋白突變體對於促進SH-SY5Y細胞中之軸突生長的功效。

圖4將各種不同蛋白對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。

圖5將一種脯胺醯基羥化酶抑制劑IOX2對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。

圖6A及6B示出鐵飽和度對於運鐵蛋白在促進SH-SY5Y細胞中之軸突生長方面之功效的作用。

圖7A至7D將與其他神經營養蛋白/肽片段組合之原運鐵蛋白對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。

圖8將與小分子Y-27632組合之原運鐵蛋白對於SH-SY5Y細胞中之軸突生長之效應繪圖。

圖9證明原運鐵蛋白在小鼠中之MPTP誘導之帕金森氏病中之積極再生效應。

Claims

一種在罹患神經退行性事件之患者中促進及/或誘導新神經細胞的產生之方法，前述方法包括將治療有效量之選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。
如請求項1所述之方法，其中投與至前述患者之治療有效量之前述運鐵蛋白或前述乳鐵蛋白具有少於約20%之鐵飽和度。
如請求項1或2所述之方法，其中前述蛋白為人類運鐵蛋白。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述運鐵蛋白為血漿來源運鐵蛋白或重組運鐵蛋白。
如請求項4所述之方法，其中前述重組運鐵蛋白為選自由以下組成之群的突變體運鐵蛋白： i) 包含SEQ ID NO: 3列出之胺基酸序列的Y188F突變體； ii) 包含SEQ ID NO: 4列出之胺基酸序列的Y95F/Y188F突變體； iii) 包含SEQ ID NO: 5列出之胺基酸序列的Y426F/Y517F突變體；及 iv) 其組合。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述運鐵蛋白為融合蛋白之域，並且前述融合蛋白為免疫球蛋白Fc域。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述神經退行性事件由神經退行性疾病導致。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述神經退行性事件係選自由以下組成之群的神經退行性疾病：帕金森氏症、額顳葉失智症、阿茲海默氏症、輕度認知障礙、瀰漫性路易氏體疾病、路易氏體型失智症、脫髓鞘疾病諸如多發性硬化症及急性橫貫性脊髓炎，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨汀頓氏舞蹈症、克雅氏病、皮質基底節變性、周圍神經病變、進行性核上性麻痹、脊髓小腦變性、脊髓性共濟失調、弗里德賴希共濟失調、小腦皮質變性、神經原性肌萎縮症、前角細胞變性、嬰兒脊髓性肌萎縮症及青少年脊髓性肌萎縮症、亞急性硬化性全腦炎、Hallervorden-Spatz病、拳擊手型失智症、皮克氏病、tau蛋白病、突觸核蛋白病及其組合。
如前述請求項中任一項所述之方法，除了投與前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，前述方法進一步包括將治療有效量之血清或血漿蛋白投與至前述患者。
如請求項9所述之方法，其中前述血清或血漿蛋白及前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白作為單一劑型來投與。
如請求項9至10所述之方法，其中前述血清或血漿蛋白選自由以下組成之群：白蛋白、α-1抗胰蛋白酶/α-1蛋白酶抑制劑、抗凝血酶、多株免疫球蛋白、多特異性免疫球蛋白、C1酯酶抑制劑、甲狀腺素轉運蛋白、及其組合。
如前述請求項中任一項所述之方法，除了投與前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，前述方法進一步包括投與治療有效量之神經原性或神經營養化合物或分子。
如請求項12所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子選自由以下組成之群：NGF超家族之成員、TGF-β超家族之成員、神經因子超家族之成員、神經營養肽、Rho-激酶抑制劑、及其組合。
如請求項12至13所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO: 6列出之胺基酸序列的大腦衍生神經營養因子；包含SEQ ID NO: 7列出之胺基酸序列的膠質細胞株衍生神經營養因子；包含SEQ ID NO: 8列出之胺基酸序列的睫狀神經營養因子-1；包含SEQ ID NO: 9列出之胺基酸序列的PACAP；反-4-[(1R)-1-胺基乙基]-N-4-吡啶基環己烷甲醯胺及其醫藥學上可接受之鹽；六氫-1-(5-異喹啉基-磺醯基)-1H-1,4-二氮呯及其醫藥學上可接受之鹽；及其組合。
如請求項12至14所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子及前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白作為單一劑型來投與。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白經由選自由以下組成之群的投與途徑來投與至有需要之患者：靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、大腦內、顱內、肺內、鼻內、脊椎內、鞘內、經皮、經黏膜、經口、陰道及直腸。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白局部投與或投與至由前述神經退行性事件引起之損傷附近。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以足以將前述患者之運鐵蛋白之鐵飽和度減少至約30%以下的濃度來投與至前述患者。
如請求項18所述之方法，其中前述患者之運鐵蛋白之鐵飽和度在前述患者之血清或血漿之樣品中量測。
如請求項1至17所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以約5 mg/kg至約8400 mg/kg之濃度投與至前述患者。
如前述請求項中任一項所述之方法，其中作為多次給藥方案之一部分，將前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。
一種在罹患神經退行性事件之患者中刺激神經細胞發育之方法，前述方法包括將治療有效量之選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。
如請求項22所述之方法，其中投與至前述患者之治療有效量之前述運鐵蛋白或前述乳鐵蛋白具有少於約20%之鐵飽和度。
如請求項22至23所述之方法，其中前述蛋白為人類運鐵蛋白。
如請求項22至24所述之方法，其中前述運鐵蛋白為血漿來源運鐵蛋白或重組運鐵蛋白。
如請求項25所述之方法，其中前述重組運鐵蛋白為選自由以下組成之群的突變體運鐵蛋白： i) 包含SEQ ID NO: 3列出之胺基酸序列的Y188F突變體； ii) 包含SEQ ID NO: 4列出之胺基酸序列的Y95F/Y188F突變體； iii) 包含SEQ ID NO: 5列出之胺基酸序列的Y426F/Y517F突變體；及 iv) 其組合。
如請求項22至26所述之方法，其中前述運鐵蛋白為融合蛋白之域，並且前述融合蛋白為免疫球蛋白Fc域。
如請求項22至27所述之方法，其中前述神經退行性事件由神經退行性疾病導致。
如請求項22至27所述之方法，其中前述神經退行性事件由選自由以下組成之群的神經退行性疾病導致：帕金森氏症、額顳葉失智症、阿茲海默氏症、輕度認知障礙、瀰漫性路易氏體疾病、路易氏體型失智症、脫髓鞘疾病如多發性硬化症及急性橫貫性脊髓炎，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨汀頓氏舞蹈症、克雅氏病、皮質基底節變性、周圍神經病變、進行性核上性麻痹、脊髓小腦變性、脊髓性共濟失調、弗里德賴希共濟失調、小腦皮質變性、神經原性肌萎縮症、前角細胞變性、嬰兒脊髓性肌萎縮症及青少年脊髓性肌萎縮症、亞急性硬化性全腦炎、Hallervorden-Spatz病、拳擊手型失智症、皮克氏病、tau蛋白病、突觸核蛋白病及其組合。
如請求項22至29所述之方法，除了投與前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，前述方法進一步包括將治療有效量之血清或血漿蛋白投與至前述患者。
如請求項30所述之方法，其中前述血清或血漿蛋白選自由以下組成之群：白蛋白、α-1抗胰蛋白酶/α-1蛋白酶抑制劑、抗凝血酶、多株免疫球蛋白、多特異性免疫球蛋白、C1酯酶抑制劑、甲狀腺素轉運蛋白、及其組合。
如請求項30至31所述之方法，其中前述血清或血漿蛋白及前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白作為單一劑型來投與。
如請求項22至32所述之方法，除了投與前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以外，前述方法進一步包括投與治療有效量之神經原性或神經營養化合物或分子。
如請求項33所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子選自由以下組成之群：NGF超家族之成員、TGF-β超家族之成員、神經因子超家族之成員、神經營養肽、Rho-激酶抑制劑、及其組合。
如請求項33至34所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子及前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白作為單一劑型來投與。
如請求項33至35所述之方法，其中前述神經原性或神經營養化合物或分子選自由以下組成之群包含SEQ ID NO: 6列出之胺基酸序列的大腦衍生神經營養因子；包含SEQ ID NO: 7列出之胺基酸序列的膠質細胞株衍生神經營養因子；包含SEQ ID NO: 8列出之胺基酸序列的睫狀神經營養因子-1；包含SEQ ID NO: 9列出之胺基酸序列的PACAP；反-4-[(1 R)-1-胺基乙基]- N-4-吡啶基環己烷甲醯胺及其醫藥學上可接受之鹽；六氫-1-(5-異喹啉基-磺醯基)-1 H-1,4-二氮呯及其醫藥學上可接受之鹽；及其組合。
如請求項22至36所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白經由選自由以下組成之群的投與途徑來投與至有需要之患者：靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、大腦內、顱內、肺內、鼻內、脊椎內、鞘內、經皮、經黏膜、經口、陰道及直腸。
如請求項22至37所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白局部投與或投與至由前述神經退行性事件引起之損傷附近。
如請求項22至38所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以足以將前述患者之運鐵蛋白之鐵飽和度減少至約30%以下的濃度來投與至前述患者。
如請求項39所述之方法，其中前述患者之運鐵蛋白之鐵飽和度在前述患者之血清或血漿之樣品中量測。
如請求項22至38所述之方法，其中前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白以約5 mg/kg至約8400 mg/kg之濃度投與至前述患者。
如請求項22至41所述之方法，其中作為多次給藥方案之一部分，將前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白投與至有需要之患者。
一種穩定的醫藥組合物，其包含：治療有效量之選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白；及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑，其中治療有效量之前述選自運鐵蛋白、乳鐵蛋白、及其組合的蛋白具有少於約25%之鐵飽和度。
如請求項43所述之醫藥組合物，其中前述蛋白為人類運鐵蛋白。
如請求項43至44所述之醫藥組合物，其中前述運鐵蛋白為血漿來源運鐵蛋白或重組運鐵蛋白。
如請求項45所述之醫藥組合物，其中前述重組運鐵蛋白為選自由以下組成之群的突變體運鐵蛋白：包含SEQ ID NO: 3列出之胺基酸序列的Y188F突變體；包含SEQ ID NO: 4列出之胺基酸序列的Y95F/Y188F突變體；包含SEQ ID NO: 5列出之胺基酸序列的Y426F/Y517F突變體；及其組合。
如請求項43至46所述之醫藥組合物，其中前述運鐵蛋白為融合蛋白之域，並且前述融合蛋白為免疫球蛋白Fc域。