TW202214847A - 能將基質3-酮-去氧雪腐鐮刀菌烯醇轉化為3-epi-去氧雪腐鐮刀菌烯醇的改良多肽 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及將3-酮-DON轉化為3-epi-DON、降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,以及用於將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述方法使用一種或多種多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。還設想包含一種或多種多肽的飼料或食品添加劑或者飼料或食品以及藥物組合物以及其製備,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。涵蓋另外的多肽,其包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成。還設想宿主細胞或植物。
Description
本發明涉及將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,用於降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,以及用於使用一種或多種多肽將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。還設想包含一種或多種多肽的飼料或食品添加劑或者飼料或食品以及藥物組合物以及其製備,所述多肽包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。涵蓋另外的多肽,其包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成。還設想宿主細胞或植物。
黴菌毒素是由絲狀真菌產生的次級代謝產物。黴菌毒素的一個代表是去氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON),或嘔吐毒素,一種B型單端孢黴烯,其由多種鐮孢屬(Fusarium)真菌產生並且在全世界均可發現。這些真菌侵染栽培植物,尤其是諸如各種類型的穀物,其中真菌侵染通常發生在收穫之前,此時真菌的生長和/或黴菌毒素產生可能發生在儲存之前,或者甚至可能發生在收穫之後,在儲存之前或在不適當的儲存條件下。在跨越8年的國際研究中,從2004年1月至2011年12月分析了總共19,757個樣品;其中72%測試為至少一種黴菌毒素陽性,發現39%是共污染的,56%測試為DON(Schatzmayr和Streit (2013))。單端孢黴烯和因此的DON已在世界所有地區和在所有類型的測試穀物和飼料作物例如玉米、大豆粉、小麥、麥麩、DDGS(含可溶物的幹酒糟)以及在最終動物飼料混合物中發現,發生率高達100%。
用於減少食物和動物飼料產品的單端孢黴烯污染的主要策略是限制真菌的生長,例如通過保持“良好的農業實踐”。這尤其包括確保種子沒有害蟲和真菌侵染或農業廢物從田間迅速移除。此外,通過使用殺真菌劑可以減少田間的真菌生長。收穫後,收穫的材料應在低於15%的殘餘水分水準和低溫下儲存以防止真菌生長。同樣,在進一步加工之前,應當除去被真菌侵染污染的材料。儘管有這一長列的預防措施,甚至在具有最高農業標準的地區諸如北美和中歐,在2004年至2011年發現了高達68%的測試樣品被DON(單端孢黴烯的代表)污染(Schatzmayr和Streit (2013))。
已知單端孢黴烯的毒性(至少)部分是由於C-3原子上存在的羥基(-OH)基團。具有這種3-羥基基團的最豐富的單端孢黴烯之一是去氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)。
然而,DON和其它單端孢黴烯的羥基基團可以兩種異構體狀態存在,即S構型(DON)或R構型(3-epi-DON),如若干公開文件例如He等人(2015)、Payros等人(2016)和Pierron等人(2016)中所討論地。
Hassan等人(2017)聲稱,DON向3-epi-DON的差向異構化經由通過形成3-酮DON的兩步過程進行。3-酮DON包含3-氧代基團而不是如在異構體中存在的3-羥基基團。最後,Carere等人(2018)鑒定了一種酶,即來自D. mutans 17-2-E-8的DmDepB,其進行從3-酮-DON到3-epi-DON和DON的還原。WO2019/046954描述了與Hassan等人(2017)完全相同的酶和從豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)獲得的另一種DepB酶(RlDepB)。He等人(2020)描述了類似的酶,區別在於具有兩種與DepB的同源物,而不是僅一種(He等人(2020) “A quinone-dependent dehydrogenase and two NADPH-dependent aldo/keto reductases detoxify deoxynivalenol in wheat via epimerization in a Devosia strain.” Food Chemistry, 321:126703)。
然而,仍然需要提供在將3-酮-DON轉化為無毒異構體3-epi-DON或將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含S構型的3-羥基基團的單端孢黴烯方面具有更高效率的酶。
本發明的解決方案描述於下文,在實施例中示例,在附圖中說明並在請求項中反映。
本發明涉及一種將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。
本發明涉及一種將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽分別與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或3或與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或3或與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
本發明還涉及一種包含一種或多種多肽的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,所述多肽包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。
本發明還涉及包含一種或多種多肽的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或3的序列或與SEQ ID NO. 2或3分別具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或3的序列或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
本發明還涉及一種多肽,其包含SEQ ID NO. 1、2或3的序列或與SEQ ID NO. 1、2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1、2或3的序列或與SEQ ID NO. 1、2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠分別將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
此外,本發明涉及一種通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成,或隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或3或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或3或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
本發明還涉及一種如本文公開的一種或多種多肽用於將3-酮-DON轉化為3-epi-DON和/或DON的用途。
此外,本發明涉及一種如本文公開的一種或多種多肽在製備飼料添加劑或飼料組合物、藥物組合物中的用途。
本發明涉及一種如本文公開的一種或多種多肽在優選由甘蔗或甜菜製備生物氣(biogas)、生物乙醇或糖中的用途。
此外,本發明涉一種及用於包含3-酮-DON或DON的農耕組合物(agrarian composition)的添加劑,所述添加劑包含如本文公開的一種或多種多肽。
本發明還涵蓋一種將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述方法包括使如本文公開的一種或多種多肽與包含3-氧代基團的單端孢黴烯接觸。
此外,本發明涉及一種包含如本文公開的一種或多種多肽的宿主細胞。
本發明還涵蓋一種經遺傳修飾以表達如本文公開的一種或多種多肽的植物。
本發明還涉及一種如本文公開的植物的種子。
此外,本發明涉及一種包含如本文公開的一種或多種多肽的製備物(preparation)。
此外,本發明涉及一種如本文公開的一種或多種多肽,其用於預防和/或治療黴菌毒素中毒。此外,本發明涉及如本文公開的一種或多種多肽,其用作預防和/或治療黴菌毒素中毒的藥物和/或用於預防和/或治療黴菌毒素中毒的方法。
此外,本發明涉及一種包含如本文公開的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)的藥物組合物。
令人驚奇地發現,SEQ ID NO. 1-28中任一個的還原酶以比現有技術的酶更高的活性將3-酮-DON轉化為3-epi-DON。在這種轉化中,與現有技術的酶SEQ ID NO. 29(DmDepB)和SEQ ID NO. 30(RlDepB)相比,單端孢黴烯(例如DON)的3-氧代基團被更高效地轉化為3-羥基基團。實施例中示出了這種更好的活性。由於大多數單端孢黴烯共有其在3位包含3-氧代基團這一特徵(還如本文之後將討論地),該基團可以被轉化為3-羥基基團,類似於就DON所見的反應。因此,SEQ ID NO. 1-28中任一個的酶能够將任何包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含羥基基團的單端孢黴烯。
值得注意的是,本发明的酶也能够進行高度立體選擇性的轉化。這意味着與其它3-羥基異構體相比,3-氧代基團以更高的效率被轉化為特定異構體的3-羥基基團。具体地,如实施例中示出地,用於本发明的多肽可以以比转化为R构型的羟基基團(例如DON)更高的效率将3-氧代基团转化为S构型的羟基基團(例如3-epi-DON)。
進一步發現SEQ ID NO. 1-28中任一個的酶共有如本文序列表中示出的特定基序中的序列同一性。
本發明涉及一種將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。本發明涉及將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽分別與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或3或與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或3或與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
本發明的或用於本發明的多肽能夠將基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(本文縮寫為3-epi-DON)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(本文縮寫為DON)。本文所述的反應描述於以下從Hassan等人(2017) “The enzymatic epimerization of DON by
Devosia mutansproceeds through the formation of
3-keto-DON intermediate.” Scientific Reports 7, article number 6929獲得的反應方案中。
反應方案:3-酮DON轉化為兩種異構體3-epi-DON和DON,改編自Hassan等人(2017)。
如從上述反應方案可以看出,3-酮 DON可以被轉化為兩種異構體,即DON(R構型)和3-epi-DON(S構型)。
術語「多肽」當在本文使用時是指肽、蛋白質或多肽,其可互換使用並且其涵蓋給定長度的胺基酸鏈,其中胺基酸殘基通過共價肽鍵連接。本發明還涵蓋除了本領域技術人員已知的標準遺傳密碼的20種蛋白胺基酸之外的胺基酸,例如硒代半胱氨酸。這樣的多肽包括SEQ ID NO. 1-28中任一個。
術語多肽還指並且不排除多肽的修飾。修飾包括糖基化、乙醯化、醯化、磷酸化、ADP-核糖基化、醯胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂醯肌醇、交聯、環化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價交聯、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、配製(formulation)、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒醯化(selenoylation)、硫酸化、轉移RNA介導的向蛋白質添加胺基酸例如精氨醯化(arginylation)和泛素化;參見,例如,PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993);POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12;Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990); 626-646, Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62。
設想本文所述的一種或多種多肽包含與SEQ ID NO. 1具有至少75.0%、至少80.0%、至少83.0%、至少85.0%、至少87.0%、至少88.5%、至少89.0%、至少90.0%、至少91.0%、至少92.0%、至少93.0%、至少94.0%、至少95.0%、至少96.0%、至少97.0%、至少98.0%、至少99.0%或更高序列同一性的序列,或者由所述序列組成。
進一步設想本文所述的一種或多種多肽包含與SEQ ID NO. 2-28中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性的序列,或者由所述序列組成。
另外或備選地,本文所述的一種或多種多肽包含與SEQ ID NO. 2-7中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性的序列,或者由所述序列組成。
另外或備選地,本文所述的一種或多種多肽包含分別與SEQ ID NO. 2或3中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性的序列,或者由所述序列組成。
還考慮本文所述的一種或多種多肽包含SEQ ID NO. 1-28中任一個的序列,或者由所述序列組成。
如本文所述,所述一種或多種多肽可以與SEQ ID NO. 1-28中任一個具有一定的序列同一性。這表明這些多肽也可以是片段,並因此包含關於SEQ ID NO. 1-28中任一個的胺基酸缺失。
根據本發明,在兩個或更多個多肽序列如SEQ ID NO. 1-28的上下文中,術語「相同」或「同一性百分比」是指當在比較視窗或在指定區域上比較和比對最大對應性時,相同的或具有特定百分比的相同核苷酸(例如至少85.0%、88.5%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%或99.0%同一性)的兩個或更多個序列或子序列,如使用本領域已知的序列比較演算法或通過人工比對和目測測量地。具有例如80.0%至95.0%或更大序列同一性的序列被認為是基本上相同的。這種定義也適用於測試序列的互補序列。本領域技術人員將知道如何使用例如如本領域已知的演算法諸如基於CLUSTALW電腦程式(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994)), 4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)的那些確定序列之間的同一性百分比。
本領域技術人員也可以獲得BLAST和BLAST 2.6算法(Altschul Nucl. Acids Res.25. (1977), 3389-3402)。用於胺基酸序列的BLASTP程式使用6的字長(W)、10的預期閾值和兩條鏈的比較作為預設值。此外,可使用BLOSUM62評分矩陣(Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 89. (1989), 10915;Henikoff和Henikoff (1992) ‘Amino acid substitution matrices from protein blocks.‘ Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9)。
例如,BLAST2.6,其代表基本局部比對搜索工具(Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402;Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300;Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410),可用於搜索局部序列比對。
還考慮本文所述的一種或多種多肽可以是還原酶。例如,所述多肽可以是醛酮還原酶。
進一步設想本文所述的一種或多種多肽包含以下多肽序列中的一個或多個:
(i) YRKLGNSG(SEQ ID NO. 31);
(ii) LGTMTFG(SEQ ID NO. 32);
(iii) AGGNFX
1DTAX
2VYS,其中X
1是I或L,X
2是N或D(SEQ ID NO. 33);
(iv) ETLRFLDD(SEQ ID NO. 34);
(v) GKIX
3YYGFSN,其中X
3是A或G(SEQ ID NO. 35);
(vi) RDIEHEX
4VPA,其中X
4是I或V(SEQ ID NO. 36);
(vii) GLLPWSPLGGGWL(SEQ ID NO. 37);
(viii) GATRLGENP(SEQ ID NO. 38);
(ix) AQVALAW(SEQ ID NO. 39);和/或
(x) PAVX
5SVILGART,其中X
5是T或A(SEQ ID NO. 40)。
考慮本文所述的一種或多種多肽包含(i)-(x)中示出的肽序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。優選地,所述多肽包含(i)-(x)中示出的所有肽序列。
進一步設想與SEQ ID NO. 1的序列相比,包含與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列的所述一種或多種多肽包含一個或多個胺基酸置換。
進一步設想與SEQ ID NO. 2或3的序列相比,包含與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列的所述一種或多種多肽分別包含一個或多個胺基酸置換。
還考慮所述一個或多個胺基酸置換包含保守胺基酸置換,或者由所述保守胺基酸置換組成,優選高度保守的胺基酸置換。
如本文所用,「保守(的)」置換是指如下表1中作為“示例性置換”列出的置換。如本文所用的「高度保守(的)」置換是指如下表1中標題「優選置換」下示出的置換。
表1. 保守胺基酸置換。
原始 | 示例性置換-保守 | 優選置換-保守 |
Ala(A) (中性且小) | Val(V) (非極性且小) Leu(L) (非極性且相對較小) Ile(I) (非極性且相對較小) Gly(G) (中性且小) | Val(V) (非極性相對較小) Gly(G) (中性且小) |
Arg(R) (極性且相對較大) | Lys(K) (極性且相對較大) Gln(Q) (極性且相對較小) Asn(N) (極性且相對較小) | Lys(K) (極性且相對較大) |
Asn(N) (極性且相對較小) | Gln(Q) (極性且相對較小) His(H) (極性且相對較大) Asp(D) (極性且相對較小) Lys(K) (極性且相對較大) Arg(R) (極性且相對較大) | Gln(Q) (極性且相對較小) |
Asp(D) (帶負電荷的側鏈) | Glu(E) (極性且相對較小) Asn(N) (極性且相對較小) | Glu(E) (極性且相對較小) |
Cys(C) (特殊) | Ser(S) (中性且小) Ala(A) (中性且小) | Ser(S) (中性且小) |
Gln(Q) (極性且相對較小) | Asn(N) (極性且相對較小) Glu(E) (極性且相對較小) | Asn(N) (極性且相對較小) |
Glu(E) (極性且相對較小) | Asp(D) (極性且相對較小) Gln(Q) (極性且相對較小) | Asp(D) (極性且相對較小) |
Gly(G) (中性且小) | Ala(A) (中性且小) | Ala(A) (中性且小) |
His(H) (極性且相對較大) | Asn(N) (極性且相對較小) Gln(Q) (極性且相對較小) Lys(K) (極性且相對較大) Arg(R) (極性且相對較大) | Arg(R) (極性且相對較大) |
Ile(I) (非極性相對較小) | Leu(L) (非極性相對較小) Val(V) (非極性相對較小) Met(M) (非極性相對較小) Ala(A) (中性且小) Phe(F) (非極性且相對較大) | Leu(L) (非極性相對較小) |
Leu(L) (非極性且相對較小) | Norl Ile(I) (非極性相對較小) Val(V) (非極性相對較小) Met(M) (非極性相對較小) Ala(A) (中性且小) | Ile(I) (非極性相對較小) |
Lys(K) (極性且相對較大) | Arg(R) (極性且相對較大) Gln(Q) (極性且相對較小) Asn(N) (極性且相對較小) | Arg(R) (極性且相對較大) |
Met(M) (非極性且相對較小) | Leu(L) (非極性且相對較小) Phe(F) (非極性且相對較大) Ile(I) (非極性相對較小) | Leu(L) (非極性且相對較小) |
Phe(F) (非極性且相對較大) | Leu(L) (非極性且相對較小) Val(V) (非極性相對較小) Ile(I) (非極性相對較小) Ala(A) (中性且小) Tyr(Y) (非極性且相對較大) | Tyr(Y) (非極性且相對較大) |
Pro(P) (中性且小) | Ala(A) (中性且小) | Ala(A) (中性且小) |
Ser(S) (中性且小) | Thr(T) (中性且小) | Thr(T) (中性且小) |
Thr(T) (中性且小) | Ser(S) (中性且小) | Ser(S) (中性且小) |
Trp(W) (非極性且相對較大) | Tyr(Y) (非極性且相對較大) Phe(F) (非極性且相對較大) | Tyr(Y) (非極性且相對較大) |
Tyr(Y) (非極性且相對較大) | Trp(W) (非極性且相對較大) Phe(F) (非極性且相對較大) Thr(T) (中性且小) Ser(S) (中性且小) | Phe(F) (非極性且相對較大) |
Val(V) (非極性且小) | Ile(I) (非極性相對較小) Leu(L) (非極性且相對較小) Met(M) (非極性相對較小) Phe(F) (非極性且相對較大) Ala(A) (中性且小) | Leu(L) (非極性且相對較小) |
本發明還涵蓋本發明的一種或多種多肽或用於本發明的一種或多種多肽包含多於280、290、300、310、320、330個或多於340個胺基酸,或者由所述胺基酸組成。進一步設想所述多肽包含320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348個或更多個胺基酸,或者由所述胺基酸組成。所述多肽可以包含341、342或343個胺基酸,或者由所述胺基酸組成。
值得注意的是,SEQ ID NO. 1-28中任一個的多肽在將3-酮-DON轉化為3-epi-DON方面是高效的。這也可以通過以下事實看出:每分鐘僅需要少量多肽來產生1μmol 3-epi-DON(也參見圖3)。這種測量表明本文所述的多肽具有高活性。
因此進一步設想如本文所述的多肽能够以每1mg多肽每分鐘至少0.06μmol 3-epi-DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。
如本文所用的「活性」涉及「比活性」,即每種酶的產物形成速率。所述比活性是由1mg多肽(酶)在1分鐘內形成的以μmol計的產物的量(μmol/min/mg)。實施例中公開了一種可以如何測量比活性的方式。
還涵蓋所述多肽能够以每1mg多肽每分鐘至少0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、2.00或更多μmol 3-epi-DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。
另一方面,本文所述的多肽將3-酮-DON轉化為DON的活性低於轉化為3-epi-DON的活性。
因此設想如本文所述的多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至多0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少μmol DON的(比)活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物DON。進一步考慮所述多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至少0.015、0.02、0.03或更多μmol DON將基質基質3-酮-DON轉化為產物DON。
還可以由對於3-epi-DON形成和對於DON所見的活性計算多肽的活性比例。該比例通過將給定多肽對DON的活性除以完全相同的多肽對3-epi-DON的活性來計算。優選地,在完全相同的實驗中使用3-酮-DON作為基質基質測定這些活性。在實施例中描述了這樣做的示例性方法。
因此設想如本文所述的多肽能够以DON相對3-epi-DON(DON:3-epi-DON)的0.045至0.26的活性比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。還考慮所述多肽能夠以DON比3-epi-DON(DON:3-epi-DON)的0.05至0.25、0.05至0.23、0.06至0.24、0.07至0.23、0.08至0.22、0.09至0.21、0.10至0.20、0.11至0.19、0.12至0.18或0.13至0.17的活性比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。
對於DON形成的活性可用與對於3-epi-DON形成的活性的相同方法測量。在實施例中詳細解釋了一種測量某一多肽是否能夠或是否以0.045至0.26的DON:3-epi-DON比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON的方式。
例如,(比)活性可以通過以下計算:
(a) 使200nM多肽與以下接觸:
(aa) 濃度為30ppm的3-酮DON;
(ab) 緩衝液,其包含10.255mM磷酸、7.287mM檸檬酸、11.45mM硼酸和68.6mM氫氧化鈉,pH為7.0,其中用HCl調節pH;以提供溶液(根據Teorell & Stenhagen, 1938);
(b) 從步驟(a)的溶液中取出20μL樣品;和
(ba) 使所述樣品與20μL 100%甲醇接觸,
(bb) 將所述樣品儲存在4°C下直到溫育結束;
(c) 使步驟(a)的溶液與終濃度為1mM的NADPH接觸,以提供溫育樣品;
(d) 將所述溫育樣品在30℃下溫育120分鐘;
(da) 在溫育樣品的5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘之後,取出20μL樣品;和
(db) 在取出每個樣品之後,使每個樣品與20μL 100%甲醇接觸;和
(dc) 將每個樣品儲存在4℃下直到溫育結束;
(e) 使步驟(b)中0分鐘時取出的樣品和步驟(d)中5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時取出的樣品與超純H
2O中的40%甲醇接觸,以提供在所述樣品中0.3ppm 3-酮-DON或更少的濃度;
(f) 通過LC-MS/MS分析每個樣品;
(g) 測定每個樣品中3-epi-DON和DON的量;
(h) 計算每個樣品的反應線性階段存在的每1mg多肽每分鐘的3-epi-DON和/或DON形成速率。
LC-MS/MS分析步驟可以通過以下進行:
(fa) 在細微性為2.6µm的150mm×2.1mm聯苯柱上分離DON、3-酮-DON和3-epi-DON;
(fb) 其中流動相由甲醇和水的混合物(具有0.055μS/cm的最大電導率)與0.1% (v/v)乙酸組成;
(fc) 其中通過負離子化模式的電噴霧電離(ESI)產生離子,
(fd) 其中通過三重四級杆質譜儀進行LC-MS/MS定量。
進一步考慮步驟(d)的溫育在熱迴圈儀中進行。
還設想本發明的方法通過使用終濃度為30ppm的3-酮-DON作為基質基質進行。另外或備選地,所述方法可以通過使用濃度為200 nM的如本文公開的多肽進行。另外或備選地,所述方法可以在4.5至10.0的pH下、優選在5.0至7.0的pH下、更優選在6.5的pH下進行。另外或備選地,所述方法可以在14.9℃至55.7℃的溫度下、優選在25.0℃至50.0℃的溫度下、更優選在38℃至45℃的溫度下進行。
因此,本發明還涉及將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮 DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成,其中所述方法在4.5至10.0的pH下和/或在14.9℃至55.7℃的溫度下、優選在25.0℃至50.0℃的溫度下、更優選在38℃至45℃的溫度下進行。
進一步設想如本文公開的多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至少80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%或更多是3-epi-DON。
如從上述反應方案可以看出,3-酮DON可以被轉化為兩種異構體,即3-epi-DON和DON。因此這兩種異構體代表總產物。每種定義的總產物等於100%。由於本發明的多肽是高度立體選擇性的,因此一種異構體(此處為3-epi-DON)以比另一種異構體(此處為DON)更高的效率(或更高的量)獲得。本文例如在實施例中公開了可以如何測量由基質基質3-酮-DON獲得的DON和/或3-epi-DON的量。特別地,在獲得的總產物(等於100%)中至少80%是3-epi-DON。
進一步考慮如本文所述的多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至多97.0%、96.0%、95.0%、94.0%、93.0%、92.0%、91.0%、90.0%、89.0%、88.0%、87.0%、86.0%、85.0%、84.0%、83.0%、82.0%、81.0%、80.0%或更少是3-epi-DON。
進一步考慮如本文所述的多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的79.0%至96.0%、80.0%至95.0%、81.0%至94.0%是3-epi-DON。
另外或備選地,所述多肽可能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至少3.0%、4.5%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%、13.0%、14.0%、15.0%、16.0%、17.0%、18.0%、19.0%、20.0%、21.0%、22.0%或更多是DON。
同樣,可以是如本文公開的多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100%的總產物,其中所述總產物的至多21.5%、21.0%、20.0%、19.0%、18.0%、17.0%、16.0%、15.0%、14.0%、13.0%、12.0%、11.0%、10.0%、9.0%、8.0%、7.0%、6.0%、5.0%、4.0%或更少是DON。
例如,如本文公開的多肽可能能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100%的總產物,其中所述總產物的3.9%至21.5%、4.0%至21.0%或5.0%至19.0%是DON。
進一步設想如本文公開的多肽能夠以至少3.7:1的比例(3-epi-DON:DON)將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
為了計算該比例,將產物3-epi-DON的百分比除以使用如本文公開的特定多肽轉化基質基質3-酮-DON時獲得的產物DON的百分比。很明顯在沒有DON僅獲得3-epi-DON或反之的情況下,該比例是不可計算的。這是因為在數學上不可能用數字0做除法。然而,本發明還涉及對3-epi-DON具有100%立體選擇性的多肽。因此,在該除法是除以數位0的情況下,本發明仍然包括這樣的多肽。然而,如果除法為0,因為僅獲得DON,本發明不包括這樣的多肽。
因此還設想如本文公開的多肽可能夠以至少3.8:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或更高的比例(3-epi-DON:DON)將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。所述多肽可另外或備選地能夠以至多25.0:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或更小的比例(3-epi-DON:DON)將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。因此,所述多肽可能夠以24.5:1至3.7:1、24:1至4:1、20:1至4:1、18:1至4:1、19:1至5:1或18:1至6:1的比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
本發明還涉及包含如本文公開的一種或多種多肽的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,所述多肽包含SEQ ID NO. 1的序列或与SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或与SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列组成。
本文所述的飼料或食品添加劑或者飼料或食品可以是任何合適的飼料或食品添加劑或者飼料或食品。
本文所述的飼料或食品添加劑或者飼料或食品以及如本文所述的藥物組合物可包含載體。所述載體可以是任何合適的載體。所述飼料或食品添加劑或者飼料或食品可以包含1、2、3、4、5、6種或更多種載體。
所述載體可以是液體,優選H
2O,或固體,優選營養製品和/或藥物。例如,所述載體可以是固體或液體。示例性固體包括食品/飼料補充劑、膳食補充劑、營養製品和/或藥物。示例性飼料/食物補充劑尤其包括飼料/食物添加劑、維生素、礦物質、胺基酸、必需脂肪酸、纖維、微量元素、礦物質、抗氧化劑、植物提取物和草藥提取物。
所述載體也可以是酶的載體。酶的載體可以是無機和有機來源的。用於酶的固定的潛在無機材料是二氧化矽(溶膠-凝膠二氧化矽、鍛制二氧化矽、膠態二氧化矽納米顆粒和矽膠)和不同的氧化物,諸如氧化鈦、氧化鋁和氧化鋯。
此外,應用粘土材料,諸如膨潤土、多水高嶺土、高嶺土、蒙脫石、海泡石和鈣磷灰石。另外,碳基材料諸如活性炭和木炭已知是有效的酶固定劑。有機酶載體可以是生物聚合物,但也可以是合成聚合物。生物聚合物包括碳水化合物和蛋白質。典型的實例是麥芽糖糊精、海藻糖、菊粉、膠原、纖維素、角蛋白、角叉菜膠、甲殼質、脫乙醯殼多糖和藻酸鹽。作為合成聚合物的實例,可以提及聚苯胺、聚醯胺、聚苯乙烯、聚氨酯、聚丙烯、聚乙烯醇和離子交換樹脂。酶載體也可以是如Zdarta等人(2018)中所述的載體。
所述載體也可以是液體。示例性液體包括H2O、水溶液、鹽溶液(例如緩衝液)、凝膠、粘性製劑、脂肪或油。優選的水溶液含有H2O和其它物質,如緩衝物質和/或多元醇如聚環氧烷(PAO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-蘋果酸酐、葡聚糖、纖維素、脫乙醯殼多糖的水解產物、澱粉、糖原、山梨醇、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、普魯蘭多糖、菊粉、黃原膠、角叉菜膠、果膠、藻酸水解產物、生物聚合物、山梨醇、甘油、纖維二糖和單丙二醇((MPG)。
所述載體可以另外或備選地是可食用的組分,優選無毒的組分和/或提供質地的組分。
本發明的飼料/食品添加劑或者飼料/食品組合物以及如本文所述的藥物組合物可以進一步包含能夠將DON轉化為3-酮-DON和/或將包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯(諸如DON)轉化為如本文所述的包含3-氧代基團的單端孢黴烯(諸如3-酮DON)的酶。
製備這樣的飼料/食品添加劑或者飼料/食品組合物的方法是技術人員已知的,並且尤其描述於WO 99/35240。
如本文公開的飼料/食品添加劑或飼料/食品組合物或藥物組合物可以是用於降低DON的量的飼料/食品添加劑或飼料/食品或藥物組合物。在這種情況下,飼料/食品添加劑或飼料/食品或藥物組合物進一步包含能夠將DON轉化為3-酮-DON的酶。
如本文公開的組合物也可以是用於減少包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯的組合物。在這種情況下,這些組合物進一步包含能夠將包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯轉化為包含3-氧代基團的單端孢黴烯的酶。
本文所述的組合物(例如飼料/食品添加劑、飼料/食品組合物、藥物組合物)因此可以進一步包含一種或多種能夠將DON轉化為3-酮-DON和/或將包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯轉化為包含3-氧代基團的單端孢黴烯的酶。可用於組合物中的示例性的酶尤其描述於WO2016/154640或WO2019/046954。因此,將DON轉化為3-酮DON的酶可包含如WO2016/154640的SEQ ID NO. 1(本文的SEQ ID NO. 41)或WO2019/046954的SEQ ID NO. 7(本文的SEQ ID NO. 42)中公開的序列,或者由所述序列組成。因此,如本文所述的組合物(例如飼料/食品添加劑、飼料/食品組合物、藥物組合物)可進一步包含酶,所述酶包含SEQ ID NO. 41和/或42,或者由SEQ ID NO. 41和/或42組成。
如本文公開的組合物(例如飼料/食品添加劑、飼料/食品組合物、藥物組合物)可另外包含一種或多種能夠將DON轉化為3-酮-DON和/或將包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯轉化為如本文所述的包含3-氧代基團的單端孢黴烯的酶。
本發明還涉及多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 1、2或3的序列或分別與SEQ ID NO. 1、2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1、2或3的序列或分別與SEQ ID NO. 1、2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。如本文其它地方公開地,還設想本文所述的一種或多種多肽包含與SEQ ID NO. 1具有至少89%、至少90.0%、至少91.0%、至少92.0%、至少93.0%、至少94.0%、至少95.0%、至少96.0%、至少97.0%、至少98.0%、至少99.0%或100.0%序列同一性的序列,或者由所述序列組成。
本發明還涉及通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。
本發明還涉及通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或3或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或3或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
所述方法可進一步包括使所述組合物與至少一種醌輔因數和/或至少一種金屬離子和/或至少一種氧化還原輔因數接觸的步驟。醌輔因數可選自PQQ(吡咯喹啉醌(CAS No. 72909-34-3)、色氨酸色氨醯醌(TTQ,CAS No. 134645-25-3)、6-羥基多巴醌(topaquinone)(TPQ,CAS No. 64192-68-3)、賴氨酸酪氨醯醌(LTQ,CAS No. 178989-72-5)和半胱氨酸色氨醯醌(CTQ,CAS No. 400616-72-0)。金屬離子,使醌輔因數與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶(可優選為WO2016/154640中描述的醇脫氫酶SEQ ID NO. 1-3)能夠快速和完全結合,可選自Li
+、Na
+、K
+、Mg
2+、Ca
2+、Zn
2+、Zn
3+、Mn
2+、Mn
3+、Fe
2+、Fe
3+、Cu
2+、Cu
3+、Co
2+和Co
3,優選Ca
2+和Mg
2+。至少一種氧化還原輔因數可選自NAD+、NADP+、吩嗪硫酸甲酯基團(PMS,CAS No. 299-11-6)、PMS衍生物、六氰高鐵酸鉀(III)、六氰高鐵酸鈉(III)、細胞色素C、輔酶Q1、輔酶Q10、亞甲基藍和N,N,N’,N’-四甲基對苯二胺(TMPD)。
PMS衍生物的實例是:1-羥基吩嗪、2-(五異戊二烯基氧基)二氫吩嗪、5,10-二氫-9-二甲基烯丙基吩嗪-1-羧酸、5,10-二氫吩嗪-1-羧酸、甲基硫酸5-甲基吩嗪鎓、6-乙醯吩嗪-1-羧酸、benthophoenin、氯法齊明、二氫橋亞甲基吩嗪(dihydromethanophenazine)、esmeraldic acid、esmeraldin B、和泉吩嗪(izumiphenazine) A-C、詹納斯綠(Janus Green) B陽離子、橋亞甲基吩嗪(methanophenazine) pelagicin A、吩嗪、吩嗪-1,6-二羧酸、吩嗪-1-甲醯胺、吩嗪-1-羧酸、酚藏花紅(phenosafranine)、綠膿菌素(pyocyanin)、山芬黴素(Saphenamycin)或saphenic酸(saphenic acid)甲酯。
本發明還涉及如本文公開的一種或多種多肽用於將3-酮-DON轉化為3-epi-DON和/或轉化為DON的用途。
本發明還涉及如本文公開的一種或多種多肽在製備飼料添加劑或飼料組合物或藥物組合物中的用途。
此外,本發明涉及如本文公開的一種或多種多肽在優選由甘蔗或甜菜製造生物氣、生物乙醇或糖中的用途。在這些用途中,本發明的組合物或多肽可以加入到包含單端孢黴烯諸如DON的組合物中。
本發明還涉及用於包含3-酮-DON或DON的農耕組合物的添加劑,所述添加劑包含如本文公開的一種或多種多肽。
“農耕組合物”可以是包含植物或植物部分如種子或木材的任何組合物。這種農耕組合物可包含3-酮-DON和/或DON。根據本發明的添加劑可進一步包含一種或多種能夠將DON轉化為3-酮-DON和/或將包含3-R-羥基基團的單端孢黴烯轉化為如本文所述的包含3-氧代基團的單端孢黴烯的酶。所述農耕組合物也可以是包含單端孢黴烯的組合物,所述單端孢黴烯包含R-羥基基團,諸如DON。
本發明還涉及將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團、優選3-S-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述方法包括使如本文公開的一種或多種多肽與包含3-氧代基團的單端孢黴烯接觸。
技術人員知道R
1、R
2、R
3、R
4和R
5上可存在哪些取代。已知單端孢黴烯的毒性(至少)部分是由於C-3原子上存在的羥基(-OH)基團。因此,在某些單端孢黴烯中,C-3與羥基基團(R1 = -OH/-羥基基團)相連。
包含3-羥基(3-OH)基團(在上式中R
1位)的單端孢黴烯是本領域技術人員已知的。這種單端孢黴烯的非限制性實例包括DON(CAS No. 51481-10-8)、T-2毒素(CAS No. 21259-20-1)、HT-2毒素(CAS No. 26934-87-2)、瓜萎鐮菌醇(Nivalenol)(CAS No. 23282-20-4)、Fuseranon-X(CAS No. 23255-69-8)、藨鐮刀菌烯三醇(Scirpenetriol)(CAS No. 2270-41-9)、15-乙醯氧基藨鐮刀菌烯醇(15-Acetoxyscirpenol)(CAS No. 2623-22-5)、4,15-二乙醯氧基藨鐮刀菌烯醇(4,15-Diacetoxyscirpenol)(CAS No. 2270-40-8)、脫乙醯新茄醇(Deacetylneosolaniol)(CAS No. 74833-39-9)、新茄醇(Neosolaniol)(CAS No. 36519-25-2)、Sporotrichiol(CAS No. 101401-89-2)和接骨木鐮菌素(Sambucinol)(CAS No. 90044-33-0)。這些包含3-羥基(3-OH)基團的單端孢黴烯可被氧化為包含3-氧代(= O;在R
1位)的單端孢黴烯。本文描述了能夠進行這種轉化的酶。然後,所述多肽可以將這些含有3-氧代基團的單端孢黴烯優選轉化為包含3-羥基(3-OH)基團的單端孢黴烯的兩種異構體即R和S構型之一。
本發明涵蓋包含3-羥基基團的單端孢黴烯以S構型存在。
本發明還涉及包含如本文公開的一種或多種多肽的宿主細胞。
術語「宿主細胞」指含有待表達的核苷酸序列或表達載體並且其能夠產生根據本發明的酶或多肽的所有細胞。特別地,這是指原核和/或真核細胞,優選巴斯德畢赤酵母(
Pichia pastoris)、大腸桿菌(
Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(
Bacillus subtilis)、鏈黴菌(Streptomyces)、漢森酵母(Hansenula)、木黴(Trichoderma)、乳桿菌(Lactobacillus)、麯黴(Aspergillus),芽孢桿菌(Bacillus)、木黴或麯黴的植物細胞和/或孢子。本文所用的名字巴斯德畢赤酵母(
P. pastoris)與名字巴斯德駒形氏酵母(
Komagataella pastoris)同義,巴斯德畢赤酵母(
P. pastoris)是較老的名字,而巴斯德駒形氏酵母(
K. pastoris)是系統上較新的名字(Yamada等人(1995))。值得注意的是,物種巴斯德駒形氏酵母最近已經被重新分配為法夫駒形氏酵母(
K. phaffii)(Kurtzman (2009))。如本文使用的法夫駒形氏酵母可以例如涉及菌株法夫駒形氏酵母CBS 7435、法夫駒形氏酵母GS115或法夫駒形氏酵母JC308。
還涵蓋所述宿主細胞可進一步表達用於本文所述的多肽的輔因數。輔因數可以是任何合適的輔因數。例如,所述輔因數是NAD/H或NADP/H。也設想所述宿主細胞是重組細胞。
本發明還涉及經遺傳修飾以表達如本文公開的一種或多種多肽的質粒。示例性植物尤其包括玉米(玉蜀黍)、小麥、大麥、黑麥和燕麥。
本發明還涉及如本文所述的植物的種子。
本發明還涉及包含如本文公開的一種或多種多肽的製備物。
根據本發明的「製備物」可通過在如本文所述的組合物中使用本文所述的多肽獲得。在一個實施方案中,所述製備物因此可以包含本文所述的多肽或多肽的部分以及其它組分諸如載體、農耕提取物(agrarian extract)等。所述製備物還可以包含其他分子和/或蛋白質和/或物質,例如由於例如本文所述多肽的純化效率較低而來自用於本發明方法的緩衝液的留下物質(left over)。
本發明還涉及如本文公開的一種或多種多肽,其用於預防和/或治療黴菌毒素中毒。該用途可以包括向處於風險中或有此需要的受試者施用如本文公開的一種或多種多肽的步驟。
類似地,本發明還涉及預防或治療黴菌毒素中毒的方法,所述方法包括向處於風險中或有此需要的受試者施用如本文公開的一種或多種多肽。
優選地,施用治療有效量的如本文公開的一種或多種多肽。所述受試者可患有黴菌毒素中毒。所述受試者還可以是處於發生黴菌毒素中毒風險中的受試者。
本發明還涉及包含如本文公開的一種或多種多肽的藥物組合物。所述藥物組合物可以進一步包含藥學上可接受的載體。這種載體可以是如本文公開的任何載體。
本發明還涉及包含如下序列或由如下序列組成的多核苷酸:所述序列編碼SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%或88.5%序列同一性的序列,其中所述多核苷酸能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
本發明還涉及包含如下序列或由如下序列組成的多核苷酸:所述序列編碼SEQ ID NO. 2或3或分別與SEQ ID NO. 2或3具有至少88.5%序列同一性的序列,其中所述多核苷酸能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
所述核酸可以被導入或插入表達載體。術語「表達載體」指能夠在體內或體外表達基因的核酸分子構建體。特別地,它可以涵蓋這樣的DNA構建體:所述DNA構建體適用於將編碼多肽的核苷酸序列轉移到宿主細胞中以便整合在基因組中或遊離地定位在染色體外空間中,並且在細胞內表達該編碼多肽的核苷酸序列並且任選地將該多肽轉移出細胞。
注意如本文所用,單數形式「一個/一種」和「所述/該」包括複數指代,除非上下文另有明確指示。因此,例如,提及「多肽」包括一種或多種這樣的不同多肽,提及“方法”包括提及本領域普通技術人員已知的等同步驟和方法,其可以被修飾或替代本文所述的方法。
除非另有說明,在一系列要素之前的術語“至少”應理解為是指該系列中的每個要素。本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規實驗確定本文所述的本發明的具體實施方案的許多等同方案。這些等同方案也意在被本發明涵蓋。
術語「和/或」無論在本文何處使用都包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的全部或任何其它組合」的含義。
術語「小於」或反之「大於」不包括具體的數位。
例如,小於20是指小於所指示的數目。類似地,多於或大於是指多於或大於所指示的數目,例如大於80%是指多於或大於所指示的數目80%。
在整個說明書和隨後的請求項書中,除非上下文另有要求,詞語“包含(comprise)”及其變體諸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”應理解為暗示包括所述的整數或步驟或者整數或步驟的組,但不排除任何其它整數或步驟或者整數或步驟的組。當在本文使用時,術語“包含”可以用術語“含有”或“包括”代替,或者有時當在本文使用時用術語“具有”代替。當在本文使用時,“由…組成”排除未指定的任何要素、步驟或成分。
術語「包括」是指「包括但不限於」。「包括」和「包括但不限於」可互換使用。
當在本文使用時,術語「約」理解為是指在各自的值或範圍(諸如pH、濃度、百分比、摩爾濃度、胺基酸的數目、時間等)中可以存在變化,其可以是給定值的至多5%、至多10%。例如,如果製劑包含約5mg/ml的化合物,這被理解為是指製劑可以具有4.5-5.5mg/ml。
應當理解,本發明不限於本文所述的特定方法、方案、材料、試劑和物質等,因此可以變化。本文所用的術語僅用於描述特定實施方案的目的,而不是要限制本發明的範圍,本發明的範圍僅由請求項書限定。
本說明書全文中引用的所有出版物(包括所有專利、專利申請、科學出版物、說明書等),無論在上文還是下文,均以其全文通過引用併入本文。本文中沒有任何內容被解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於這種公開。在通過引用併入的材料與本說明書矛盾或不一致的程度上,本說明書將取代任何這樣的材料。
本文引用的所有文獻和專利文獻的內容均以其全文通過引用併入。
從以下實施例將更好地理解本發明及其優點,提供這些實施例僅用於說明性目的。這些實施例不意在以任何方式限制本發明的範圍。
本發明的特徵還在於以下專案。
1. 將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。
2. 將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
3. 將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 3或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 3或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
4. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽是還原酶。
5. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽包含以下多肽序列中的一個或多個:
(i) YRKLGNSG;
(ii) LGTMTFG;
(iii) AGGNFX
1DTAX
2VYS,其中X
1是I或L,X
2是N或D;
(iv) ETLRFLDD;
(v) GKIX
3YYGFSN,其中X
3是A或G;
(vi) RDIEHEX
4VPA,其中X
4= I或V;
(vii) GLLPWSPLGGGWL;
(viii) GATRLGENP;
(ix) AQVALAW;和/或
(x) PAVX
5SVILGART,其中X
5= T或A。
6. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽包含(i)-(x)中示出的肽序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。
7. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽與SEQ ID NO. 1具有至少75.0%、至少80.0%、至少83.0%、至少85.0%、至少87.0%、至少88.5%、至少89%、至少90.0%、至少91.0%、至少92.0%、至少93.0%、至少94.0%、至少95.0%、至少96.0%、至少97.0%、至少98.0%、至少99.0%或更高序列同一性。
8. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽與SEQ ID NO. 1具有至少89.0%、至少90.0%、至少91.0%、至少92.0%、至少93.0%、至少94.0%、至少95.0%、至少96.0%、至少97.0%、至少98.0%、至少99.0%或更高序列同一性。
9. 前述項中任一項的方法,其中與SEQ ID NO. 1的序列相比,包含與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列的所述一種或多種多肽包含一個或多個胺基酸置換。
10. 前述項中任一項的方法,其中與SEQ ID NO. 2的序列相比,包含與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列的所述一種或多種多肽包含一個或多個胺基酸置換。
11. 前述項中任一項的方法,其中與SEQ ID NO. 3的序列相比,包含與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列的所述一種或多種多肽包含一個或多個胺基酸置換。
12. 前述項中任一項的方法,其中所述一個或多個胺基酸置換包含保守胺基酸置換,或者由保守胺基酸置換組成。
13. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽包含341、342或343個胺基酸,或者由所述胺基酸組成。
14. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽進一步與SEQ ID NO. 2-28中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性。
15. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽進一步與SEQ ID NO. 2-7中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性。
16. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽進一步與SEQ ID NO. 2或3中任一個具有至少95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或更高序列同一性。
17. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1-28中任一個的序列,或者由所述序列組成。
18. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以DON比3-epi-DON(DON:3-epi-DON)的0.045至0.26的活性比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且轉化為產物DON。
19. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以DON比3-epi-DON(DON:3-epi-DON)的0.05至0.25、0.05至0.23、0.06至0.24、0.07至0.23、0.08至0.22、0.09至0.21、0.10至0.20、0.11至0.19、0.12至0.18、0.13至0.17的活性比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且轉化為產物DON。
20. 前述項中任一項的方法,其中對於DON的比活性用與對於3-epi-DON的活性相同的方法測量。
21. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至少0.06μmol 3-epi-DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。
22. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至少0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、2.00或更多μmol 3-epi-DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON。
23. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至多0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少μmol DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物DON。
24. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以每1mg多肽每分鐘至少0.015、0.02、0.03或更多μmol DON的活性將基質基質3-酮-DON轉化為產物DON。
25. 前述項中任一項的方法,其中所述(比)活性通過以下計算:
(a) 使200nM多肽與以下接觸:
(aa) 濃度為30ppm的3-酮DON;
(ab) 緩衝液,其包含10.255mM磷酸、7.287mM檸檬酸、11.45mM硼酸和68.6mM氫氧化鈉,pH為7.0,其中用HCl調節pH;以提供溶液;
(b) 從步驟(a)的溶液中取出20μL樣品;和
(ba) 使所述樣品與20μL 100%甲醇接觸,
(bb) 將所述樣品儲存在4°C下直到溫育結束;
(c) 使步驟(a)的溶液與終濃度為1mM的NADPH接觸,以提供溫育樣品;
(d) 將所述溫育樣品在30℃下溫育120分鐘;
(da) 在溫育樣品的5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘之後,取出20μL樣品;和
(db) 在取出每個樣品之後,使每個樣品與20μL 100%甲醇接觸;和
(dc) 將每個樣品儲存在4℃下直到溫育結束;
(e) 使步驟(b)中0分鐘時取出的樣品和步驟(d)中5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時取出的樣品與超純H
2O中的40%甲醇接觸,以提供在所述樣品中0.3ppm 3-酮-DON或更少的濃度;
(f) 通過LC-MS/MS分析每個樣品;
(g) 測定每個樣品中3-epi-DON和DON的量;
(h) 計算每個樣品的反應線性階段存在的每1mg多肽每分鐘的3-epi-DON和/或DON形成速率。
26. 前述項中任一項的方法,其中步驟(f)的LC-MS/MS分析通過以下進行:
(fa) 在細微性為2.6µm的150mm×2.1mm聯苯柱上分離DON、3-酮-DON和3-epi-DON;
(fb) 其中流動相由甲醇和水的混合物(具有0.055μS/cm的最大電導率)與0.1% (v/v)乙酸組成;
(fc) 其中通過負離子化模式的電噴霧電離(ESI)產生離子,
(fd) 其中通過三重四級杆質譜儀進行LC-MS/MS定量。
27. 前述項中任一項的方法,其中步驟(d)的所述溫育在熱迴圈儀中進行。
28. 前述項中任一項的方法,其中所述方法通過使用終濃度為30ppm的3-酮-DON作為基質基質進行。
29. 前述項中任一項的方法,其中所述方法通過使用濃度為200 nM的前述請求項中任一項的多肽進行。
30. 前述項中任一項的方法,其中所述方法在4.5至10.0的pH下、優選在5.0至7.0的pH下、更優選在6.5的pH下進行。
31. 前述項中任一項的方法,其中所述方法在14.9℃至55.7℃的溫度下、優選在25.0℃至50.0℃的溫度下、更優選在38℃至45℃的溫度下進行。
32. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至少80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%或更多是3-epi-DON。
33. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至多97.0%、96.0%、95.0%、94.0%、93.0%、92.0%、91.0%、90.0%、89.0%、88.0%、87.0%、86.0%、85.0%、84.0%、83.0%、82.0%、81.0%、80.0%或更少是3-epi-DON。
34. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的79.0%至96.0%、80.0%至95.0%、81.0%至94.0%是3-epi-DON。
35. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的至少4.5%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%、13.0%、14.0%、15.0%、16.0%、17.0%、18.0%、19.0%、20.0%、21.0%、22.0%或更多是DON。
36. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100%的總產物,其中所述總產物的至多21.5%、21.0%、20.0%、19.0%、18.0%、17.0%、16.0%、15.0%、14.0%、13.0%、12.0%、11.0%、10.0%、9.0%、8.0%、7.0%、6.0%、5.0%、4.0%或更少是DON。
37. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100%的總產物,其中所述總產物的3.9%至21.5%、4.0%至21.0%或5.0%至19.0%是DON。
38. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以至少3.7:1的比例(3-epi-DON:DON)將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
39. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以至少3.8:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或更高的比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
40. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以至多25.0:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或更小的比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
41. 前述項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以24.5:1至3.7:1、24:1至4:1、20:1至4:1、18:1至4:1、19:1至5:1或18:1至6:1的比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
42. 飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其包含一種或多種多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 1的序列或与SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或与SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列组成。
43. 飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其包含一種或多種多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 2的序列或与SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2的序列或与SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列组成。
44. 飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其包含一種或多種多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 3的序列或与SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 3的序列或与SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列组成。
45. 根據前述項中任一項的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其中所述食品或飼料添加劑進一步包含載體。
46. 根據前述項中任一項的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其中所述載體是液體,優選H
2O,或固體,優選營養製品和/或藥物。
47. 根據前述項中任一項的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其中所述載體是可食用組分,優選無毒組分和/或提供質地的組分。
48. 多肽,其包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
49. 多肽,其包含SEQ ID NO. 2的序列或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2的序列或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
50. 多肽,其包含SEQ ID NO. 3的序列或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 3的序列或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
51. 通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%(例如至少88.5%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,優選至少88.5%)序列同一性的序列組成。
52. 通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 2或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 2或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
53. 通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括:
a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和
b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 3或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 3或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列組成。
54. 如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)用於將3-酮-DON轉化為3-epi-DON和/或DON的用途。
55. 如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)在製備飼料添加劑或飼料組合物或藥物組合物中的用途。
56. 如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)在優選地由甘蔗或甜菜製備生物氣、生物乙醇或糖中的用途。
57. 用於包含3-酮-DON或DON的農耕組合物的添加劑,所述添加劑包含如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)。
58. 將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述方法包括使如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)與包含3-氧代基團的單端孢黴烯接觸。
59. 項58的方法,其中所述包含3-羥基基團的單端孢黴烯以S構型存在。
60. 宿主細胞,其包含如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)。
61. 項60的宿主細胞,其中所述宿主細胞是重組細胞。
62. 項60或61的宿主細胞,其另外表達用於所述多肽的輔因數,優選過表達NADH或NADPH。
63. 植物,其經遺傳修飾以表達如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)。
64. 如項63定義的植物的種子。
65. 包含如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)的製備物。
66. 如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成),其用於預防和/或治療黴菌毒素中毒。
67. 預防或治療黴菌毒素中毒的方法,所述方法包括向處於風險中或有此需要的受試者施用如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)。
68. 項67的方法或項66的使用的多肽,其中所述多肽以治療有效量施用。
69. 藥物組合物,其包含如前述項中任一項定義的一種或多種多肽(例如包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成)。
70. 項58的藥物組合物,其進一步包含藥學上可接受的載體。
71. 包含如下序列或由如下序列組成的多核苷酸:所述序列編碼SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,其中所述多核苷酸能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
72. 包含如下序列或由如下序列組成的多核苷酸:所述序列編碼SEQ ID NO. 2或與SEQ ID NO. 2具有至少88.5%序列同一性的序列,其中所述多核苷酸能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
73. 包含如下序列或由如下序列組成的多核苷酸:所述序列編碼SEQ ID NO. 3或與SEQ ID NO. 3具有至少88.5%序列同一性的序列,其中所述多核苷酸能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
74. 前述項中任一項的方法,其中由基質基質3-酮DON獲得的epi-DON和/或DON的量通過以下計算:
(a) 使200nM多肽與以下接觸:
(aa) 濃度為30ppm的3-酮DON;
(ab) 緩衝液,其包含10.255mM磷酸、7.287mM檸檬酸、11.45mM硼酸和68.6mM氫氧化鈉,pH為7.0,其中用HCl調節pH;以提供溶液;
(b) 從步驟(a)的溶液中取出20μL樣品;和
(ba) 使所述樣品與20μL 100%甲醇接觸,
(bb) 將所述樣品儲存在4°C下直到溫育結束;
(c) 使步驟(a)的溶液與終濃度為1mM的NADPH接觸,以提供溫育樣品;
(d) 將所述溫育樣品在30℃下溫育120分鐘,取出20μL樣品,並且使所述樣品與20μL 100%甲醇接觸;
(e) 使步驟(b)中0分鐘時取出的樣品和步驟(d)中120分鐘時取出的樣品與超純H
2O中的40%甲醇接觸,以提供在所述樣品中0.3ppm 3-酮-DON或更少的濃度;
(f) 通過LC-MS/MS分析每個樣品;
(g) 測定每個樣品中3-epi-DON和DON的量;
(h) 計算總產物的3-epi-DON和DON的量,其總和設定為100%;
(i) 計算相對於獲得的總產物(= 100%)的3-epi-DON的百分比和/或DON的百分比。
75. 前述項中任一項的方法,其中步驟(f)的LC-MS/MS分析通過以下進行:
(fa) 在細微性為2.6µm的150mm×2.1mm聯苯柱上分離DON、3-酮-DON和3-epi-DON;
(fb) 其中流動相由甲醇和水的混合物(具有0.055μS/cm的最大電導率)與0.1% (v/v)乙酸組成;
(fc) 其中通過負離子化模式的電噴霧電離(ESI)產生離子,
(fd) 其中通過三重四級杆質譜儀進行LC-MS/MS定量。
76. 前述項中任一項的方法,其中所述一種或多種多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%(例如至少89%或至少90%)序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%(例如至少89%或至少90%)序列同一性的序列組成。
77. 前述項中任一項的方法,其中所述方法為體外、體內或離體方法。
78. 前述項中任一項的方法,其中所述方法為製備方法,優選為飼料添加劑製備方法或飼料組合物製備方法或藥物組合物製備方法。
79. 前述項中任一項的用途,其中所述用途是製備過程中、優選飼料添加劑製備過程中或飼料組合物製備過程中或藥物組合物製備過程中的用途。
80. 前述項中任一項的用途,其中所述用途為體外、體內或離體用途。
本申請中使用了以下序列。
表2:描述了如本文所述的序列。
本發明的實施例
# | 同義詞 | 序列 |
1 | SEQ ID NO. 1 | MDYRKLGNSGAVVSHLCLGTMTFGKEADEATSHLLLDDYVAAGGNFIDTADVYSTGVSETIIGNWLKAKPGRELNLVIASKGRFPMGNGPNDLGLSRKHLGAALDASLKRLGVERIDLYQMHAFDALTPMDETLRFLDDSIRNGKIAYYGFSNFTGWQLTKAVYLAKLNGYQPPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPASLDAQIGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQAPSGATRLGENPKRGMEAFEARNAKDATWSIIGAVEDIAKAHNVSMAQVALAWVVAQPAVTSVILGARTREQLADNLKSVSLKLSAADLATLSEASKPAMSDYPYGAGGINQRHRKLEGGR 總胺基酸:343 |
2 | SEQ ID NO. 2 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIVGRWLKARPEAASQVVLATKGRFPMGAGPNDIGLSRKHLNRALEDSLRRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHVAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQERTWQIIDAVAEIAKDRGASAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
3 | SEQ ID NO. 3 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFVLMDQYVEAGGNFLDTADVYSAGLSEEIVGRWLKGKKLRDLVIATKGRFPMGQGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDAVRSGKIAYYGFSNFLGWHITKAVWMARAQGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQERTWAIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGAADLVLSEADMERLNAVSAPQMADYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
4 | SEQ ID NO. 4 | MDYRKLGNSGAVVSHLCLGTMTFGSEADEATSFKLLDDYVAAGGNFIDTADVYSAGVSEEIIGRWLKDKPGRAQNLVIATKGRFPMGQGPNDLGLSRKHLGAALDASLKRLGVEQIDLYQMHAFDVLTPLEETLRFLDDSIRNGKIAYYGFSNFTGWQLTKAVWLAKLNGYQPPVTLQPQYSLLVRDIEHEIVPASLDAGIGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPTGATRLGENPKRGMEAFEARNAKDSTWAVIGAVEDIAKARGVSMAQVALAWVAAQPAVASVILGARTQEQLADNLKSAALKLSAGDLQTLGDVSKPVMADYPYGTGGINQRNRNIEGGR 總胺基酸:343 |
5 | SEQ ID NO. 5 | MKYRKLGNSGAVVSAYCLGTMTFGAESDEATSFRLMDDYVAAGGNFLDTANVYSAGVSEEIVGRWLKTKPTGLRDLVITTKGRFPMGDGPNHLGLSRKNLREALDASLKRLGVEHIDLYQMHAFDALTPLEETLRFLDDSIRNGKIAYYGFSNFLGWQLTKAVWIARANGYQPPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPASLDAGIGLLPWSPLGGGWLSGKYRRDEMPTGATRLGENPKRGGEAYERRNAKSATWDIIGVVEDVAKTRGVSMAQVALAWVAQRPAVTSVILGARTTEQLKDNLGAIDLALSTEEIEKLNAASKPAVGDYPYGAGGINQRNRKIEGGR 總胺基酸:343 |
6 | SEQ ID NO. 6 | MQYRKLGNSGAVVSTQTLGTMTFGAEADEATSFQLMDDYVAAGGNFLDTADVYSAGTSEEIVGRWLKARPEAARQVLITTKARFPMGSGPNDLGLSRRHLNQALDASLGRLGVEHIDLYQMHAFDALTPLEETLRFLDDAIRNGKIGYYGFSNFIGWQLTKATWIAKAGGLAPPITLQPHYNLLVRDIEHEIVPAALDADIGLLPWSPLGGGWLTGKYKRDQLPTGATRLGENPNRGQESYGPRNEQERTWRIIAAVEAVAKALGVSMAQVALAWLADRPAVTSVILGARTREQLADNLAAADLRLDAEHAQQLTDASAPEVADYPYGKGGVNQRHRKIAGGR 總胺基酸:343 |
7 | SEQ ID NO. 7 | MEYRKLGNSGAIVTNYCLGTMTFGKESDEATSFRLMDDYVAAGGNFIDTANVYSDGLSEQIIGGWLKSKPGILRDLVITTKGRFPMGDGPNHLGLSRKNLSEALDASLKRLGVEHIDLYQLHAFDALTPIEETLRFLDDSIRNGKIAYYGFSNFLGWQMTKAVWIAKAGNFQPPVTLQPQYNLLARDIEHEVVPAALDAGIGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPSGATRLGENPKRGLEAFEKRNANPATWQVIGALEDIAKARGASMAQVALAWLVKRPAVTSVILGARTAEQLADNLGAADVTLSDDEMRTLTEMSAPQVADYPYGEGGNRQRNRRMEGGR 總胺基酸:343 |
8 | SEQ ID NO. 8 | MDYRKLGNSGAVVSSYCLGTMTFGAEADEATSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKAKPEAASNLVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDSIGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHVAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQERTWQIIDAVAEIAKDRGASAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
9 | SEQ ID NO. 9 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIVGRWLKARPEAASQVVLASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDSIGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHLAKLNHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQDRTWQIIDAVADIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKLKLSAEDTDKLSRASMPQMSDYPYGERGISQRFRKMEGGR 總胺基酸:350 |
10 | SEQ ID NO. 10 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKAKPEAASQVVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLRRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDSIGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHLAKLNHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQERTWQIIDAVAEIAKDRGASAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
11 | SEQ ID NO. 11 | MEYRKLGNSGTIVSSYCLGTMTFGAEADEATSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKARPEAASNVVLASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALEDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHLAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMEAFGPRNAQDRTWQIIDAVADIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKLKLSAEDTDKLSRISMPQMSDYPYGERGISQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
12 | SEQ ID NO. 12 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKAKPEAASNLVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHLAKLNHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQDRTWQIIDAVADIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
13 | SEQ ID NO. 13 | MDYRKLGNSGTVVTSYCLGTMTFGAEADEATSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKARPEAASNVVIATKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALEDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAIGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHLAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMEAFGPRNAQDRTWQIIDAVAEIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEDTDKLTRASMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
14 | SEQ ID NO. 14 | MEYRKLGNSGAIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKARPEAASNVVLATKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALEDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDSVGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHLAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMEAFGPRNAQDRTWQIIDAVAEIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEDTDKLTRASMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
15 | SEQ ID NO. 15 | MDYRKLGNSGAVVSSYCLGTMTFGAEADEATSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIVGRWLKARPEAASQVVLATKGRFPMGAGPNDIGLSRKHLNRALEDSLRRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDSIGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHLAKLNHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQERTWQIIDAVAEIAKDRGASAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKSKLSAEDTDKLTRISMPQMSDYPYGERGISQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
16 | SEQ ID NO. 16 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADETTSHLILDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKAKPEAASNLVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHVAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMEAFGPRNAQDRTWQIIDAVADIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
17 | SEQ ID NO. 17 | MDYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADEATSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGVSEEIIGRWLKAKPEAASNLVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHVAKANHWSAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESFGPRNAQDRTWQIIDAVAEIAKDRGVSAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSSKLKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRKMEGGR 總胺基酸:343 |
18 | SEQ ID NO. 18 | MEYRKLGNSGTIVTSYCLGTMTFGAEADEATSHLLLDDYVEAGGNFIDTANVYSLGLSEQIIGRWLKAKPEAASQVVIASKGRFPMGAGPNDLGLSRKHLNRALDDSLKRLGVEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVGAGKIAYYGFSNYLGWQLTKAVHVAKANHWSAPVTLQPQYNLLARDIEHEIVPACLDAGMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPTGATRLGENPNRGMEAFGPRNAQERTWQIIDAVAEIAKDRGASAAQVALAWVEARPAVTSVILGARTREQLADNLGSVKVKLSAEETDKLTRISMPQMSDYPYGERGVSQRFRRMEGGR 總胺基酸:343 |
19 | SEQ ID NO. 19 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGVSEEIIGRWLKAKRLRNLVIASKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSIRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKLNGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWSIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGAADLVLSEADMERLNAVSAPQMADYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
20 | SEQ ID NO. 20 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFVLMDQYVEAGGNFLDTADVYSAGLSEEIVGRWLKGKKLRDLVIATKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSIRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKLNGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWSIIGAVEDIAKAQNVSMAQVALAWTVARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSVDLVLSEADMERLNAASAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKLEGGR 總胺基酸:341 |
21 | SEQ ID NO. 21 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGVSEEIIGRWLKGKKLRDLVIATKGRFPMGQGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSIRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKLNGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWSIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSVDLVLSEADMERLNAASAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKLEGGR 總胺基酸:341 |
22 | SEQ ID NO. 22 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFVLMDQYVEAGGNFLDTADVYSAGLSEEIIGRWLKAKRLRNLVIASKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDAIRSGKIAYYGFSNFLGWHITKAVWMARAQGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWSIIGAVEDIAKAQNVSMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSVDLVLSEADMERLNAASAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKLEGGR 總胺基酸:341 |
23 | SEQ ID NO. 23 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSAGVSEEIVGRWLKAKKLRNLVIATKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDAIRSGKIAYYGFSNFLGWHITKAVWMAKANGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQERTWSIIGAVEDIAKAQDVSMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSADLVLSEADMERLNAASAPQMADYPYGTGGIGQRNRKLEGGR 總胺基酸:341 |
24 | SEQ ID NO. 24 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFVLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGLSEEIIGRWLKGKRLRDLVIASKGRFPMGQGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSVRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMARLQGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWAIIGAVEDIAKAQNVTMAQVALAWTVARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGAVDLVLSEADMERLNAVSAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
25 | SEQ ID NO. 25 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSAGLSEEIIGRWLKAKRLRDLVIATKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDAVRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKAQGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWAIIGAVEDIAKAQDVSMAQVALAWTVARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSADLVLSEADMERLNAVSAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKLEGGR 總胺基酸:341 |
26 | SEQ ID NO. 26 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGVSEEIVGRWLKGKKLRDLVIATKGRFPMGQGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDAVRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKLNGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQERTWAIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTVARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGSVDLVLSEADMERLNAASAPQMADYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
27 | SEQ ID NO. 27 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFLLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGLSEEIIGRWLKAKKLRDLVIASKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSIRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMARANGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQDRTWSIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTVARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGAADLVLSEADMERLNAVSAPQMADYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
28 | SEQ ID NO. 28 | MDYRKLGNSGAVVSNLCLGTMTFGDEADEATSFVLMDQYVEAGGNFLDTADVYSTGVSEEINGRWLKGKKLRDLVIATKGRFPMGNGPNHLGLSRKHLGEALDASLQRLGVEQIDLYQMHAWDALTPLEETLRFLDDSIRSGKIAYYGFSNFLGWHLTKAVWMAKLNGYAAPVTLQPQYNLLVRDIEHEVVPACEDAGMGLLPWSPLGGGWLSGKYKRDQMPEGATRLGENPKRGMEAYEGRNAQERTWAIIGAVEDIAKAQDVTMAQVALAWTAARPAVTSVILGARTAEQLKDNLGAVDLVLSEADMERLNAASAPQMSDYPYGTGGIGQRNRKIEGGR 總胺基酸:341 |
29 | SEQ ID NO. 29 由本文引用的Carere等人(2018)描述(來自D. mutans 17-2-E-8的DmDepB) | MEYRKLGNSGTVVTSYCLGTMTFGQETDEATSHLIMDDYIKAGGNFIDTANVYSAGVSEEIVGRWLKARPSEARQVVVATKGRFPMGAGPNDLGLSRTNLNRALNDSLRRLGVEQIDLYQMHAWDAVTPIEETLRFLDDAVSAGKIAYYGFSNYLGWQVTKAVHVARANHWTAPVTLQPQYNLLVRDIEHEIVPACQDAAMGLLPWSPLGGGWLAGKYQRDVMPSGATRLGENPNRGMESYGPRNAQERTWQIIDMVAEIAKERGVSAAQVALAWVVARPAVTAVILGARTREQLADNLGAVAVTLSTEEMERLNRVSAPAMADYPYGERGVSQRHRKMDGGR 總胺基酸:343 |
30 | SEQ ID NO. 30 WO2019/046954中描述(來自豆科根瘤菌的DepB酶(RlDepB)) | MDYRKLGPSGTVVTAYCLGTMTGAEADEAASHKLLDDYFAWGGNFIDTADVYSAGKSEEIIGRWLKARPTEARQAIVATKGRFPMGNGPNDIGLSRRHLSQALDDSLRRLGLEQIDLYQMHAWDALTPIEETLRFLDDAVSSGKIGYYGFSNYVGWHIAKASEIAKARGYTRPVTLQPQYNLLMRDIELEIVAACQDAGMGLLPWSPLGGGWLTGKYKRDEMPTGATRLGENPNRGGESYAPRNAQERTWAIIGTVEEIAKARGVSMAQVALAWTAARPAITSVILGARTPEQLADNLGAMKVELSGEEMARLNEVSAPQPLDYPYGKGGINQRHRKIEGGR 總胺基酸:342 |
31 | SEQ ID NO. 31 | YRKLGNSG |
32 | SEQ ID NO. 32 | LGTMTFG |
33 | SEQ ID NO. 33 | AGGNFX 1DTAX 2VYS X 1= I或L X 2= N或D |
34 | SEQ ID NO. 34 | ETLRFLDD |
35 | SEQ ID NO. 35 | GKIX 3YYGFSN X 3= A或G |
36 | SEQ ID NO. 36 | RDIEHEX 4VPA X 4= I或V |
37 | SEQ ID NO. 37 | GLLPWSPLGGGWL |
38 | SEQ ID NO. 38 | GATRLGENP |
39 | SEQ ID NO. 39 | AQVALAW |
40 | SEQ ID NO. 40 | PAVX 5SVILGART X 5= T或A |
41 | SEQ ID NO. 41 (WO2016/154640的SEQ ID NO. 1) | MRFEYLRQNVVGLALSTALIASLSGPAFAQHDANAAAEPSKAGQSAIENFQPVTADDLAGKNPANWPILRGNYQGWGYSPLDQINKDNVGDLQLVWSRTMEPGSNEGAAIAYNGVIFLGNTNDVIQAIDGKTGSLIWEYRRKLPSASKFINSLGAAKRSIALFGDKVYFVSWDNFVVALDAKTGKLAWETNRGQGVEEGVANSSGPIVVDGVVIAGSTCQFSGFGCYVTGTDAESGEELWRNTFIPRPGEEGDDTWGGAPYENRWMTGAWGQITYDPELDLVYYGSTGAGPASEVQRGTEGGTLAGTNTRFAVKPKTGEVVWKHQTLPRDNWDSECTFEMMVVSTSVNPDAKADGMMSVGANVPRGETRKVLTGVPCKTGVAWQFDAKTGDYFWSKATVEQNSIASIDDTGLVTVNEDMILKEPGKTYNYCPTFLGGRDWPSAGYLPKSNLYVIPLSNACYDVMARTTEATPADVYNTDATLVLAPGKTNMGRVDAIDLATGETKWSYETRAALYDPVLTTGGDLVFVGGIDRDFRALDAESGKEVWSTRLPGAVSGYTTSYSIDGRQYVAVVSGGSLGGPTFGPTTPDVDSASGANGIYVFALPEKK |
42 | SEQ ID NO. 42 (WO2019/046954的SEQ ID NO. 7) | MKKRTSILLASVAMLGMGSTAFAQVDINALPAVTDAILANPDAGDWPSYGRDITNYRFSPLDQVNKDNVGQLTLAWARALEPGNLQSAPLEFGGVLFTAAPGDVVQAMDAATGQLIWEYRRQLPDRATLNSLGENKRGIALYEDKIYVATWDNFIVALDAKTGQVAWESDRGGGADLISNTTGPIVANGVVVAGSTCQFSEFGCYVTGHDAATGEELWRNNFIPKKGEEGDDTWGDSTEDQRWMTGAWGQMTYDPELDLVYYGSTGAGPAAEFQRNTVGGTLFGSNTRFAVKPKTGEIVWRHQVLPRDNWDQECTYEMVPVDIDSAPAADMEGLLALGTAAPGKKRVLTGVPCKTGVMWQFDAQTGEFIYARDTVQQTLIESVDNTGLVTVNEAAIPTEVDVATPMCPTYLGGRDWSPTAFNPTSKVMFVPLTNMCADVTVLDQEPTGLDVYNTELTYKMPEGVTDAGRIDAINVETGKTLWSWTQQTPQYASITATAGGLIFTGGADRRFKAIDQETGELVWSVTLGSRATGHPISYEVDGRQYIAIPAGGPGYATDLITASGSTVDVVSGSNMLYVFALPEQKK |
實施例
1
:
pH
最佳值的確定
為了確定如本文所述的多肽的催化pH最佳值,製備了用於在不同pH值下轉化3-酮-DON的反應。為此,製備了16個不同pH值的反應,每個反應的終體積為200μL。以終濃度為200nM使用具有SEQ ID NO. 1的胺基酸序列的多肽。作為基質基質,以終濃度為30ppm使用3-酮-DON,以終濃度為1mM使用NADPH。作為緩衝液,使用Teorell Stenhagen(TS)緩衝液(Stenhagen & Teorell. 1938. Nature 141, 415),並將其pH設定為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。具體地,TS緩衝液包含:68,6mM NaOH,10,255mM磷酸,7,287mM檸檬酸,11,45mM硼酸和約17-63mM HCl以達到所需的pH。轉化反應物在30℃下溫育120分鐘,並通過加入NADPH開始。在整個溫育過程中,在0分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時抽取20μL樣品。在加入NADPH之前,抽取0分鐘時的樣品。將該20μL樣品立即與20μL 100%甲醇混合以停止轉化反應,然後保持在冰上直至溫育結束。
在通過LC-MS/MS分析之前,所有樣品用40%甲醇的水溶液稀釋至最大0.3ppm 3-酮-DON的終濃度。特別地,在該實驗設置中,30ppm 3-酮DON用作起始原料。當用甲醇停止反應時,已實現1:2的稀釋(20μl + 20μl),得到樣品中15ppm 3-酮DON的濃度。進一步1:50稀釋得到0.3ppm 3-酮DON的濃度。
對於LC-MS/MS分析,在細微性為2.6μm(100Å)的150mm×2.1mm Phenomenex Kinetex聯苯基柱上分離DON、3-酮-DON和3-epi DON。流動相由甲醇和超純水的混合物(電導率為最大0.055μS/cm)與0.1% (v/v)乙酸組成。使用負離子化模式的電噴霧電離(ESI)產生離子。使用QTrap和/或三重四極杆品質檢測器進行定量。值得注意的是,所謂的QTRAP品質檢測器是來自Sciex的三重四極杆品質檢測器,其具有更好的掃描功能以易於檢測和定量低量的分析物。如果需要,稀釋樣品以落入該方法的線性範圍,該範圍為所注入樣品中1ppb至500ppb的分析物濃度。定量限值(LOQ)是可靠檢測的限值,並且在樣品中檢測到的1ppb化合物以下的濃度不被認為是可靠的,得到LOQ為1ppb。在分析物的濃度在LOQ以下的情況下,所有進一步的計算(例如,為了測定分析物的(比)活性或比例)均以1ppb進行。基於從各個樣品時間點測定的3-epi-DON和/或DON的量計算動力學參數。
在各反應的線性範圍內計算了比活性。
為了測定反應的線性範圍,採用以下程式。由各個樣品時間點,將曲線繪製成圖表(x軸=時間,y軸= 3-epi-DON或DON的量)。然後在該圖表中識別曲線具有線性形狀的時間框。
然後將酶的以kDa計的分子量乘以實驗中使用的以μM計的酶濃度(這裡0.2=在1ml 0.2μM溶液中的mg酶)。然後將後一個值轉為實際反應體積(這裡為200μL)以獲得反應中以mg計的酶的量(酶的量
e[mg])。
將給定時間點
z(選擇以落入反應的線性範圍)的產物3-epi DON/DON的以ppm計的濃度(= mg/L)也轉為絕對值,即反應體積中的μg。然後將該值除以產物的分子量(對於3-epi DON和DON兩者,296.32g/摩爾)。以此方式,單位元元由[μg]轉為[μmol](產物
p的量[μmol])。
為了測定(比)活性,進行以下計算
a = p/z/e。(比)活性具有單位[μmol
產物/min/mg
酶 ]。
在不同的pH值下形成3-epi-DON的比活性在下表3中示出。
表3:具有SEQ ID NO. 1的胺基酸序列的多肽在不同pH值下的比活性,以每mg多肽每分鐘形成的3-epi-DON的μmol計。
pH | µmol/min/mg |
2.5 | 0.000 |
3.0 | 0.000 |
3.5 | 0.000 |
4.0 | 0.007 |
4.5 | 0.020 |
5.0 | 0.082 |
5.5 | 0.133 |
6.0 | 0.201 |
6.5 | 0.243 |
7.0 | 0.199 |
7.5 | 0.181 |
8.0 | 0.154 |
8.5 | 0.197 |
9.0 | 0.137 |
9.5 | 0.127 |
10.0 | 0.114 |
發現該多肽在pH 4.5至pH 10的pH範圍內有活性,在pH 6.5時3-epi-DON形成最佳。
通過將總產物形成(DON+3-epi-DON)設定為100%測定了立體選擇性。然後相對於產物總量(100%)測定了所得產物DON或3-epi-DON的部分。
實施例
2
:
溫度最佳值的確定
為了確定如本文所述的多肽的催化溫度最佳值,製備了用於在不同溫度下轉化3-酮-DON的反應。為此,製備了24個反應,每個反應的終體積為180μL。以終濃度為200nM使用具有SEQ ID NO. 1的胺基酸序列的多肽。作為基質基質,以終濃度為30ppm使用3-酮-DON,以終濃度為1mM使用NADPH。作為緩衝液,以pH 7.0使用TS緩衝液。如Teorell和Stenhagen (1938) „Ein Universalpuffer für den pH-Bereich 2.0 bis 12.0.“ Biochem Z.;299:416–419中所述製備緩衝液。轉化反應物在實驗室PCR-熱迴圈儀中在不同溫度下溫育120分鐘,並通過加入NADPH開始。在整個溫育過程中,在0分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時抽取20μL樣品。在加入NADPH之前,從反應物中抽取0分鐘時的樣品。將該20μL樣品立即與180μL 100%甲醇混合以停止轉化反應,然後保持在冰上直至溫育結束。
如實施例1所述通過LC-MS/MS進行分析。
在不同溫度下形成3-epi-DON的比活性在下表4中示出。
表4:在不同溫度下,具有SEQ ID NO. 1的胺基酸序列的多肽的比活性,以每mg多肽每分鐘形成的3-epi-DON的μmol計。
溫度 °C | µmol/min/mg |
14.9 | 0.106 |
15.0 | 0.094 |
16.0 | 0.089 |
17.8 | 0.109 |
20.1 | 0.116 |
22.7 | 0.114 |
25.5 | 0.116 |
28.3 | 0.127 |
31.0 | 0.118 |
33.3 | 0.100 |
35.0 | 0.098 |
36.0 | 0.088 |
34.9 | 0.105 |
35.2 | 0.102 |
36.3 | 0.085 |
38.0 | 0.092 |
40.3 | 0.076 |
42.9 | 0.059 |
45.7 | 0.040 |
48.4 | 0.031 |
51.0 | 0.017 |
53.2 | 0.015 |
54.8 | 0.018 |
55.7 | 0.019 |
大多數3-epi-DON是在14.9℃至55.7℃的溫度下由多肽形成的。
實施例
3
:
SEQ ID NO. 1-28
的比對和同一性
SEQ ID NOs 1-28的ClustalO比對。該序列比對的結果在圖1中示出。在圖2中描述了ClustalO序列同一性。如實施例1所述,對所有SEQ ID NOs 1-28以及SEQ ID NO. 29和SEQ ID NO. 30的現有技術的酶,測定了(比)活性以及立體選擇性(基於如實施例1所述測量的3-epi-DON(3ED)和DON的總量)。結果在圖3中示出。
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無
附圖示出:
圖 1SEQ ID NO. 1-28的ClustalO序列比對。
圖 2SEQ ID NO. 1-28的ClustalO序列同一性。
圖 3示出了SEQ ID NO. 1-28的不同酶以及現有技術的酶關於酶活性以及立體選擇性的數據。
無
Claims (17)
- 一種將3-酮-DON轉化為3-epi-DON的方法,所述方法包括使一種或多種多肽與3-酮DON接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。
- 如請求項1的方法,其中所述多肽包含以下多肽序列中的一個或多個: (i) YRKLGNSG; (ii) LGTMTFG; (iii) AGGNFX 1DTAX 2VYS,其中X 1是I或L,X 2是N或D; (iv) ETLRFLDD; (v) GKIX 3YYGFSN,其中X 3是A或G; (vi) RDIEHEX 4VPA,其中X 4是I或V; (vii) GLLPWSPLGGGWL; (viii) GATRLGENP; (ix) AQVALAW;和/或 (x) PAVX 5SVILGART,其中X 5是T或A。
- 如請求項1或2的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且轉化為產物DON,其中所述多肽對DON的活性與所述多肽對3-epi-DON的活性的比例(DON:3-epi-DON)為0.045至0.26。
- 如前述請求項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的79.0%至96.0%、80.0%至95.0%、81.0%至94.0%是3-epi-DON。
- 如前述請求項中任一項的方法,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且另外轉化為產物DON,總計為100.0%的總產物,其中所述總產物的3.9%至21.5%、4.0%至21.0%或5.0%至19.0%是DON。
- 如前述請求項中任一項的方法,其中所述多肽能夠以24.5:1至3.7:1、24:1至4:1、20:1至4:1、18:1至4:1、19:1至5:1或18:1至6:1的比例將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON和DON。
- 一種飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其包含一種或多種多肽,所述多肽包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。
- 如前述請求項中任一項的飼料或食品添加劑或者飼料或食品,其中所述食品或飼料添加劑進一步包含載體。
- 一種多肽,其包含SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1的序列或與SEQ ID NO. 1具有至少88.5%序列同一性的序列組成,其中所述多肽能夠將基質基質3-酮-DON轉化為產物3-epi-DON並且任選地轉化為產物DON。
- 一種通過將DON轉化為3-epi-DON來降低包含DON的組合物中DON含量或降低包含DON的組合物的毒性的方法,所述方法包括: a) 使所述組合物與能夠將DON轉化為3-酮DON的酶接觸;和 b) 隨後或同時地使所述組合物與一種或多種多肽接觸,所述多肽包含SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列,或者由SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1具有至少72.0%序列同一性的序列組成。
- 如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽用於將3-酮-DON轉化為3-epi-DON和/或轉化為DON的用途。
- 如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽在製備飼料添加劑或飼料組合物或藥物組合物中的用途。
- 如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽在優選由甘蔗或甜菜製備生物氣、生物乙醇或糖中的用途。
- 一種用於包含3-酮-DON或DON的農耕組合物的添加劑,所述添加劑包含如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽。
- 一種將包含3-氧代基團的單端孢黴烯轉化為包含3-羥基基團的單端孢黴烯的方法,所述方法包括使如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽與包含3-氧代基團的單端孢黴烯接觸。
- 一種宿主細胞,其包含如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽。
- 一種如前述請求項中任一項定義的一種或多種多肽,其用作預防和/或治療黴菌毒素中毒的藥物和/或用於預防和/或治療黴菌毒素中毒的方法。
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