TW202211928A - 粒線體治療骨關節炎之用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容關於一種治療亟需之個體骨關節炎的方法。所述方法主要包含投予一有效量之分離粒線體至該個體。根據本揭示內容某些實施方式，分離粒線體是以約每公斤1毫克至每公斤100毫克的有效量投予該個體。

Description

粒線體治療骨關節炎之用途

本揭示內容是關於疾病治療領域。特別是有關於一種藉由使用分離的粒線體治療骨關節炎的方法。

骨關節炎 (Osteoarthritis，OA)是最常見的關節炎形式，其影響全世界約15%的人口。當緩衝骨頭末端的保護性軟骨隨著時間逐漸退化，並造成骨頭內不可逆的變化及使關節結合在一起並使肌肉附著在骨頭上的結締組織惡化時，導致關節滑膜(joint lining)發炎，此時便是骨關節炎。即便是在早期，前述關節疾病將致使慢性軟骨退化，包含滑液(synovial)發炎、軟骨下骨重塑及形成骨贅(osteophyte)。

已有開發許多治療骨關節炎的藥物，例如用來降低發炎反應的非類固醇抗發炎藥 (non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，以及用來舒緩疼痛的乙醯胺酚(acetaminophen)及度洛西汀(duloxetine)。較嚴重骨關節炎的狀況時可以採用手術，藉由置換人工關節或骨頭來幫助有症狀病患維持正常生活。然而，前述治療方式沒有一個可以完全治癒骨關節炎。

目前研究指出，四頭肌的萎縮及衰弱及骨細胞釋放的促發炎細胞因子會影響骨關節炎的病理狀況及疼痛強度。一般認為骨關節炎的發展及進程與含有氧氣分子之自由基的活性含氧物(ROS)以及氧化壓力有顯著關係。作為ROS的主要生產地與其分子的主要標的，現認為粒線體在OA致病機轉中扮演關鍵角色。具體而言，ROS導致粒線體呼吸鏈抑制、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)減少以及粒線體DNA(mtDNA)突變。也有體外實驗報導氧化壓力會透過粒線體損傷而造成滑膜細胞(synoviocyte)細胞凋亡。前述全部情況都與發炎進程的嚴重程度有關，因為他們會增強功能性衰竭及細胞死亡，導致降低骨關節炎滑膜細胞的存活。然而，粒線體涉及骨關節炎疾病進程的程度及方式仍是未知。

鑑於上述，現有技術有必要提供一種新穎的治療骨關節炎(OA)的方法。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文具體實施及廣泛描述地，本揭示內容的一個態樣是關於一種對一亟需之個體治療骨關節炎的方法。所述方法包含對該個體投予有效量的分離粒線體。

根據本揭示內容之實施方式，可以有效量約1至100 mg/kg的分離粒線體投予所述個體；優選有效量為約10至50 mg/kg；更優選有效量為約15至45 mg/kg。

根據本揭示內容之實施方式，以每3日一次至每10日一次投予分離粒線體至該個體。在一優選實施方式中，分離粒線體是以每7日一次之頻率投予該個體。

根據本揭示內容之實施方式，所述分離粒線體可分離自生殖細胞、幹細胞、體細胞或其組合。

適用於本揭示內容的生殖細胞實例包含但不限於配子細胞、精母細胞及卵母細胞。適用於本揭示內容的非限制性幹細胞實例包含間質幹細胞、成體幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓幹細胞、神經幹細胞、角膜緣幹細胞(limbal stem cell)以及組織衍生的幹細胞。適合用於本揭示內容的例示性體細胞包含但不限於： 肌肉細胞、肝細胞、神經元、纖維母細胞、上皮 細胞、脂肪細胞、成骨細胞、白血球、淋巴球、血小板以及黏膜細胞。根據一具體實施例，分離粒線體是從肌肉細胞分離。

根據本揭示內容一特定實施方式，是透過周邊關節注射將所述分離粒線體投予該個體。在某些具體實施例，分離粒線體是透過關節內注射投予該個體。

本發明方法也可或額外更包含對該個體投予一抗發炎藥及/或一鎮痛藥。

根據本揭示內容之部分實施方式，抗發炎藥可以是乙醯柳酸(acetylsalicylic acid)、塞來昔布(celecoxib)、雙氯氛酸二氟尼柳(diclofenac diflunisal)、依托度酸鹽(etodolac)、伊布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮基布洛芬(ketoprofen)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolac)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奧沙普秦(oxaprozin)、匹洛西卡(piroxicam)、雙水楊酯(salsalate)、蘇林達克(sulindac)、妥美汀(tolmetin)、普賴鬆(prednisone)、可體松(cortisone)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)或其組合。

根據本揭示內容之特定實施方式，鎮痛藥可以是乙醯胺酚(paracetamol)、尼夫平(nefopam)、可待因(codeine)、阿米替林(amitriptyline)、加巴噴丁(gabapentin)、嗎啡(morphine)、羥考酮(oxycodone)、普瑞巴林(pregabalin)、他噴他竇(tapentadol)、丁基東莨菪鹼(hyoscine butylbromide)、曲馬多(tramadol)或其組合。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本文另有定義，本文所有的技術及科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者習知的術語的意思相同。

本揭示內容使用的「分離粒線體(isolated mitochondria)」一詞係指藉由各種已知方法從真核生物之特定細胞分離之粒線體，舉例來說，利用特定的緩衝液或是使用電位差及磁場從哺乳動物細胞分離完整的粒線體，同時還維持粒線體的生物活性。

本揭示內容交替使用「投予」、「施用」、「給予」、「給藥」(administering, administered或administration)等詞語，是指提供分離粒線體予一亟需之個體用於治癒、預防、改善以及治療骨關節炎之症狀，以及/或是用於緩解與骨關節炎相關的疼痛。

本揭示內容使用的「有效量(effective amount)」一詞是指分離粒線體，有效、為一定劑量且在必要的時間內的量，以提供對治療病症的療效或益處，或延遲或最小化一或多種與該病症相關的症狀，藉以達到與骨關節炎之治療相關的期望治療與期望結果。 本文揭示的分離粒線體之有效量是指分離粒線體的量，不論是單獨或是與其他治療劑合併，皆能對病狀產生治療效益。在本揭示內容某些具體實施例，分離粒線體的量是足以促使患有骨關節炎之個體滑液組織的細胞修復。

本文交替使用「個體」或「病患」之詞語，且意思是指能夠以本揭示內容之方法治療的哺乳動物(包含人類)。所述「哺乳動物」(mammal)是指哺乳綱(class)的所有成員，其包含人類、靈長類、馴養動物及家畜(例如兔、豬、羊、牛)以及動物園圈養動物、用於運動的動物或寵物；以及囓齒類(例如小鼠與大鼠)。再者，除非明確指出性別，否則「個體」或「受試者」或「患者」一詞均有包含男性(雄性)及女性(雌性)。

本揭示內容使用「周邊關節(peripheral joint)」一詞是用來指個體身體除了軸關節(例如髖關節及肩關節)之外的其他肢體關節。周邊關節包含肘、腕、膝及踝。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約(about)」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

除非上下文另有明確說明，本文所使用的單數形式「一 (a, an)」以及「該 (the)」均包含複數形式。

2. 具體實施方式

本揭示內容至少部分基於發現分離粒線體能夠下調抗氧化蛋白及發炎性細胞因子之表現，延遲細胞凋亡及細胞降解，並促使細胞修復，因此可用於治療骨關節炎。據此，本揭示內容旨在提供一種利用分離粒線體治療骨關節炎的方法。

本揭示內容一態樣是關於治療亟需之個體骨關節炎的方法。本方法包含對所述個體投予有效量之分離粒線體。

粒線體可以透過任何本發明技術領域的具有通常知識者熟知的方式從細胞或組織中分離出來。分離粒線體的方法分別描述於現有文獻，舉例來說，McCully等人，"Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection"，Am J Physiol Heart Circ Physiol, 296(1):H94-H105 (2009年)；Frezza等人，"Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts"，Nature protocols, 2, 287-295(2007年)；以及題為《分離粒線體的產品及方法》(Products and Methods to Isolate Mitochondria)之PCT公開本(公開號：WO 2015192020)。前述每一現有文獻都藉由引用併入本文內容。一般而言，透過收集組織及細胞樣本，接著均質化，並以重複離心分離粒線體。也可以或額外透過以套組形式的市售尼龍篩濾器過濾細胞均漿。在以具體實施例中，是利用粒線體分離套組從動物組織分離粒線體。非必要地，可以本領域具有通常知識者熟知的手段將分離粒線體保藏在體外環境。通常，從細胞分離的粒線體仍保有如其在細胞中原有的生物活性。

適合用於本發明方法之粒線體可以從自源性、同種異體及/或異種來源的細胞或組織分離之。自源性粒線體是從相同個體組織或細胞獲得的粒線體；同種異體粒線體是指從相同物種但不同個體的組織或細胞獲得的粒線體；異種粒線體則指從不同物種之個體獲得的粒線體。具體來說，粒線體可以從同個體、或一物種不同個體間、或是不同物種不同個體的體細胞、生殖細胞、及/或幹細胞分離取得。例示性生殖細胞包含配子細胞、精母細胞或卵母細胞。適合本揭示內容的例示性幹細胞包含間質幹細胞、成體幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓幹細胞、神經幹細胞、角膜緣幹細胞(limbal stem cell)以及組織衍生的幹細胞。適合本揭示內容的例示性體細胞包含但不限於：肌肉細胞、肝細胞、神經元、纖維母細胞、上皮 細胞、脂肪細胞、成骨細胞、白血球、淋巴球、血小板以及黏膜細胞(mucosal cell)。根據本揭示內容某些實施方式，可從單一大鼠的肌肉組織及肌肉細胞分離粒線體。根據本揭示內容部分實施方式，是從一大鼠的自體肌肉組織及/或細胞分離粒線體。根據本揭示內容的部分實施方式，是從一自體來源(例如人類)的肌肉組織及/或細胞分離粒線體。

根據本揭示內容的實施方式，可給予一具有關節炎疾病，特別是骨關節炎的個體足以改善與前述疾病相關症狀的分離粒線體。根據本揭示內容某些實施方式，是以該個體體重每公斤1毫克至每公斤100毫克之量的分離粒線體投予所述個體，舉例來說，前述量可以是每公斤約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100毫克。投予所述個體之分離粒線體的優選量為約每公斤10毫克至50 毫克，像是約每公斤10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或50毫克。投予所述個體之分離粒線體的更優選量為約每公斤15至45毫克，像是約每公斤15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45毫克。在本揭示內容的特定實施例中，可以將有效量約16 mg/kg之分離粒線體投予具有骨關節炎的個體。在本揭示內容另一實施例中，是將有效量約21 mg/kg的分離粒線體投予骨關節炎個體。在本揭示內容又另一實施例中，是將有效量為32 mg/kg的分離粒線體投予至該骨關節炎個體。本揭示內容另一實施例中，是將有效量為約43 mg/kg的分離粒線體投予至該骨關節炎個體。此外，所述分離粒線體還以每日四次至每三個月一次的頻率來投予。在一些實施方式中，本文所述分離粒線體是以每日四次、每日三次、每日兩次、每日一次、每兩日一次、每三日一次、每一周一次、每隔周一次、每月一次、每隔月一次或每三個月一次的頻率投予。在一些實施方式中，可以每三日一次至每十日一次的頻率將分離粒線體投予至該個體。優選是將分離粒線體以每七日一次的頻率投予至該個體。

可藉由可有效地將分離粒線體傳送合適或期望的作用部位的任何路徑投予本揭示內容的分離粒線體。在一些實施方式中，所述分離粒線體是透過非口服(不經腸胃道的)給藥至一合適或期望的位置。合適的例示性非口服給藥路徑包含但不限於：周邊關節、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、皮內、皮下以及腹腔內給藥。具體地，預期路徑是靜脈內給藥(例如：全身靜脈注)及/或局部投予至受影響的位置(即：直接投予至病灶關節，例如：周邊關節注射)。所屬技術領域中具有通常知識者理解的合適路徑，會根據治療的特定病症、病症的嚴重程度、病患個體的身體狀況(包括年齡、生理狀況、體型、性別和體重、治療的期間、合併治療的疾病種類(如果有的話)、活性成分的劑量和性質、遺傳因素以及健康從業人員的通常知識及專業知識中的其他類似因素而有所不同。該些因素對所屬技術領域中具有通常知識者而言是習知技術，且不需過度實驗就可以實施。通常最合適的給藥路徑會隨著各種因素而有所改變，像是藥劑在循環系統還境中的穩定性、以及/或是個體的生理條件(例如該個體是否能耐於關節內注射)。根據本揭示內容的部分實施方式，可透過周邊關節注射投予該分離粒線體。在一些優選實施方式中，是透過關節內注射將分離粒線體投予至膝蓋。

可將分離粒線體優選地製備成適合注射至目標位置(例如膝關節)的組合物。根據本揭示內容某些實施方式，可將分離粒線體懸浮至水性溶液中以形成一注射組合物。本方法可採用的水性溶液的實例包含但不限於：蒸餾水、葡萄糖溶液、木糖醇溶液、右旋甘露醇(D-mannitol)溶液、果糖溶液、鹽水、聚葡糖溶液、胺基酸溶液、林格氏液(Ringer's solution)、林格式乳酸鹽溶液、磷酸鹽緩衝液以及磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)。根據本揭示內容部分實施方式，分離粒線體是懸浮於一鹽水溶液中。在本揭示內容的一特定實驗例，從肌肉組織分離的粒線體是懸浮於一磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。

如本文所述的分離粒線體可以與一或多種有效成分或其他藥學藥劑(例如：治療及/或預防活性劑)合併投予，前述藥學藥劑可用以治療本文所述的骨關節炎、減少罹患骨關節炎的風險或延緩該骨關節炎之進程。可依次給予或同時給予所述分離粒線體與額外的藥學藥劑至所需之個體。根據本揭示內容的選擇性實施方式，本發明方法更包含對一個體投予包含一抗發炎藥及一鎮痛藥的藥學藥劑。適合用於治療骨關節炎的例示性抗發炎藥包含乙醯柳酸、塞來昔布、雙氯氛酸 二氟尼柳、依托度酸鹽、伊布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮咯酸氨丁三醇、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、匹洛西卡、雙水楊酯、蘇林達克、妥美汀、普賴鬆、可體松以及甲基培尼皮質醇。適合用於治療骨關節炎的例示性鎮痛藥包含但不限於乙醯胺酚、尼夫平、可待因、阿米替林、加巴噴丁、嗎啡、羥考酮、普瑞巴林、他噴他竇、丁基東莨菪鹼以及曲馬多。

根據本揭示內容，個體是指可以本揭示內容之方法治療並受益於本揭示內容之方法的動物。動物的實例包含但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、豬、山羊、牛、馬、犬、貓、鳥及禽類。在一例示性實施方式中，個體是大鼠。在另一例示性實施方式中，個體是人類。

藉由前述特徵，本揭示內容方法可有效地逆轉及降低受骨關節炎之苦之個體損傷組織的氧化壓力及發炎。此外，投予完整的粒線體也可刺激細胞修復並防止關節軟骨磨損，是以本方法可有效地治癒骨關節炎。

下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。無須進一步說明，據信所屬技術領域中具有通常知識者可根據本文的描述，最大限度地利用本發明。本文引用的所有公開文獻均透過引用其整體併入本文。

實驗例

材料與方法

動物以及飼養條件

於動物房中飼養雄性史一道二氏(Sprague Dawley，SD)大鼠(5周齡，重量約151–200 g)，每三隻一籠，維持12/12小時光/暗循環，溫度為22 ± 2 °C，食物及水可以任意採食。所有的行為實驗均在暗循環期間進行。

誘發骨關節炎(下稱OA)動物模型

如下隨機分配SD大鼠成三組(每組6隻，n=6)： 第1組：假處理組 (控制組(CTL))，該組別之老鼠右後肢膝蓋接受關節內注射100 μl的0.9%鹽水； 第2組：碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate，MIA)誘導之OA組 (下稱MIA)，其中，將100 μl的MIA透過膝韌帶注射至老鼠右後肢膝蓋直至關節內空間，接著以注射PBS；以及 第3組：粒線體治療組(下稱：MIA+mito)，以100 μl之MIA以關節內注射至老鼠右後肢膝蓋，接著注射分離粒線體(20毫克 × 2)。

分離粒線體

在本研究中，透過粒線體分離套組自每隻大鼠自源肌肉組織(具體是200毫克腿肌肉組織)分離粒線體。根據供應商提供的使用操作說明以Mito TRACKERTM測定粒線體活性。從肌肉樣本分離20 mg的粒線體，接著將其懸浮於1毫升的PBS。

行為評定

透過Gale等人 (請參見Spinal cord contusion in the rat: behavioral analysis of functional neurologic impairment", Experimental Neurology, vol. 88(1), 123–134, 1985)以及Nakae等人(參見："The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model", J Biomed Biotechnol 2011:939023, 2011年)發表的綜合行為得分(Combined Behavioral Score，CBS) 來評估運動行為。簡言之，CBS是用來測量大鼠的活動能力。在本研究中，在建立MIA誘導OA大鼠模型之後，接著注射粒線體，根據表1總結的運動分數類別記錄每隻大鼠的CBS。

表1：CBS運動分數

運動分數的一般描述	分數
0	正常走路	0
1	輕微走路缺陷	5
2	後肢可支撐體重	15
3	後肢移動頻繁，無重量支撐	25
4	輕微移動後肢，無法負重	40
5	後肢無移動，無負重	45

西方墨點轉漬法分析

從大鼠取下關節組織樣本並以PBS洗滌。萃取組織樣本的全蛋白，且利用蛋白測定套組測定萃取蛋白的濃度。以10%的SDS-PAGE電泳區分全蛋白並將其轉印到PVDF膜上。在TBST(tris緩衝鹽水(tris-buffered saline，TBS)以及0.1%之聚山梨醇酯(TWEEN® 20)之組合)溶液中，37°C下，以5%的脫脂牛奶培養1小時以阻斷轉印膜，接著以1倍的TBST洗滌，最後於4°C下將該轉印膜與初級抗體培養隔夜。前述轉印膜與過氧化酶共軛之二級抗體於37°C下培養1小時之後，隨即使用ECLTM偵測系統偵測。

測定氧化壓力程度

以400×g於4°C下離心分離組織的均質物30分鐘，接著3-硝基酪胺酸酵素免疫測定(ELISA)套組進行測定並以脂質過氧化(MDA)測定套組進行脂質過氧化測定，是以可測定受試組織的活性含氧物(ROS)數值。

測定細胞因子表現量

遵照製造商說明利用ELISA測定硝基酪胺酸，介白素6 (IL-6)、介白素1β (IL-1β)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及基質金屬肽酶(MMP13)的表現量。使用蛋白分析染劑測定蛋白質濃度。

統計分析

所有結果以平均值±標準差的方式呈現。針對多重比較是以單因子變異數分析(ANOVA)進行統計分析，p值＜0.05表示具有統計上顯著差異。

組織切片

從犧牲大鼠採樣取下濕關節組織，以連續酒精溶液脫水並將其浸入10%的中性福馬林溶液固定。接著，以石蠟包埋該組織。如果需要的話可將石蠟包埋的組織切成3 μm之厚度。

數位影像

所有玻璃載玻片均使用數位載玻片掃描儀，以40倍(×40) (0.26 μm/像素)的高精密度(高精密度自動對焦)進行數位化。以分析軟體(例如DSAssistant and EasyScanner)檢視經前述獲得的載玻片全影像。

實施例1：粒線體治療對於行為能力喪失之影響

本實驗中，將SD大鼠隨機分成三組，每一組個數(n)=6。在第0天，第1組的大鼠分別經關節內注射100 μl的0.9%鹽水，而第2組及第3組的大鼠則經關節內注射，分別以100 μl的碘乙酸鈉(MIA)處理(具體劑量為每公斤10毫克)，以誘發膝蓋骨關節炎(OA)。接著，透過每周膝關節注射一次(亦即第7天及第14天注射)，第1組及第2組的大鼠分別以1毫升的PBS溶液處理，而第3組的大鼠則以懸浮於1mL之PBS溶液的20毫克分離粒線體處理；每隻大鼠總粒線體注射量為40毫克。根據前述表1列出的準則，記錄每隻大鼠於第1天、第5天、第9天及第21天的行為分數。第21天之後，犧牲大鼠以進行後續實驗。

發現注射粒線體可以逐漸復原MIA誘導OA之大鼠的行為能力喪失(第1A圖)。再者，相較於控制組，以粒線體長期治療(即，高達21天的治療)可顯著地恢復每隻MIA誘導之OA大鼠的運動活力(第1B圖)。

實驗例2：粒線體治療可降低MIA誘導OA之大鼠的氧化壓力及發炎

2.1滑液組織

分別割離控制組與經MIA處理之組別的滑液組織，並透過西方墨點轉漬分析抗氧化蛋白(即：nrf2及sirt1)及發炎蛋白(即：iNOS及HO-1)的表現量。第2A至2D圖繪示每個蛋白定量的結果。

如第2A及2B圖呈現的，相較於未投予粒線體治療的控制組(亦即，經MIA誘導之OA並以PBS處理的大鼠)，投予粒線體顯著地增加nrf2及sirt1蛋白質表現。第2A及2B圖的數據則指明投予完整粒線體可增強膝關節的細胞再生。此外，第2C及2D圖的數據也指出以粒線體治療可減輕MIA誘導OA大鼠的氧化壓力及發炎。

2.2肌肉組織

分別割離控制組與經MIA處理之組別的肌肉組織，藉由丙二醛(malondialdehyde，MDA)分析測定其MDA的表現量以評估在肌肉組織內的氧化壓力。第3圖則繪示MDA表現量的定量結果，MDA作為肌肉裡的氧化壓力指標，此結果可見投予粒線體可顯著地降低MDA的表現量。第3圖數據表示受損組織的氧化壓力可藉由投予粒線體扭轉。

2.3 血清

取得實驗老鼠的血清，並分別檢測以粒線體處理組及控制組(無粒線體處理組)之大鼠的氧化壓力。以ELISA定量測定硝基酪胺酸(氧化壓力指標)及細胞因子(包含IL-1β、 IL-6、 TNF-α及MMP13)的表現量。相較於控制組，受過粒線體處裡的OA大鼠具有較低的硝基酪胺酸表現量(請見第4A圖)，以及分別較低的IL-1β、IL-6、TNF-α及MMP13等細胞因子表現量(第4B至4E圖)，這表示注射的粒線體可以有效地降低大鼠的發炎反應。

實驗例3：粒線體治療可刺激MIA誘導OA大鼠的組織/細胞再生

隨機選取每一組大鼠並犧牲。解剖所有選取大鼠的膝關節並固定，透過肉眼或也可以藉由放大裝置的協助來檢視解剖膝關節的外觀，接著以數位相機拍攝影像。如第5圖所示，OA大鼠的膝關節軟骨嚴重地磨損(第5圖的黃色箭頭)且變形(黑色箭頭)；然而經粒線體治療的大鼠，其關節軟骨僅有些微的磨損以及少數變形。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1A及1B圖分別根據本揭示內容實驗例1，繪示以特定治療方法投予經MIA誘導之骨關節炎(以下稱OA)大鼠之行為測試結果。CTL：控制組；MIA：經MIA誘導的OA組；MIA+mito：以粒線體治療經MIA誘導的OA大鼠。***，p＜0.05。

第2A至2D圖分別呈現根據本揭示內容之實驗例2，繪示以特定治療方法投予經MIA誘導之OA大鼠滑液組織的抗氧化能力。檢測來自滑膜組織的兩個抗氧化蛋白(即：核因子淡紅2相關因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，nrf2)及NAD-依賴性去乙醯化酶-1 (NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，sirt1)以及兩個發炎性蛋白(即：一氧化氮合成酶(iNOS)以及血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)) ，其表現量分別繪示於第2A圖：nrf2；第2B圖： sirt1；第2C圖：HO-1；以及第2D圖：iNOS。*，p＜0.05；**，p＜0.001；***，p＜0.005。

第3圖是根據本揭示內容之實驗例2繪示從三組實驗大鼠肌肉組織中獲得丙二醛(MDA)之表現量結果。*，p＜0.05；**，p＜0.001。

第4A至4E圖分別根據本揭示內容實驗例2繪示三組大鼠血清抗發炎因子的表現量結果。第4A圖繪示三組大鼠硝基酪胺酸(nitrotyrosine)之表現量；IL-1β、 IL-6、 TNF-α、及MMP13的表現量則分別繪示於第4B至4E圖。*，p＜0.05；**，p＜0.001；***，p＜0.005。

第5圖是從三隻大鼠解剖膝關節拍攝的照片。黃箭頭：軟骨磨損；黑色箭頭：軟骨變形。

Claims (16)

1. 一種治療一亟需之個體骨關節炎的方法，其包含對該個體投予一有效量之分離粒線體。
2. 如請求項1所述之方法，其中該分離粒線體係以1至100 mg/kg之該有效量投予該個體。
3. 如請求項2所述之方法，其中該分離粒線體係以10至50 mg/kg之該有效量投予該個體。
4. 如請求項3所述之方法，其中該分離粒線體係以15至45 mg/kg之該有效量投予該個體。
5. 如請求項1所述之方法，其中該分離粒線體係每3日一次至每10日一次投予該個體。
6. 如請求項5所述之方法，其中該分離粒線體係每7日一次投予該個體。
7. 如請求項1所述之方法，其中該分離粒線體係從生殖細胞、幹細胞、體細胞或其組合分離。
8. 如請求項7所述之方法，其中該生殖細胞為配子細胞、精母細胞或卵母細胞。
9. 如請求項7所述之方法，其中該幹細胞為間質幹細胞、成體幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓幹細胞、神經幹細胞、角膜緣幹細胞或組織衍生的幹細胞。
10. 如請求項7所述之方法，其中該體細胞為肌肉細胞、肝細胞、神經元、纖維母細胞、上皮 細胞、脂肪細胞、成骨細胞、白血球、淋巴球、血小板、 或黏膜細胞。
11. 如請求項10所述之方法，其中該分離粒線體係從肌肉細胞分離。
12. 如請求項1所述之方法，其中該分離粒線體係透過周邊關節注射投予該個體。
13. 如請求項12所述之方法，其中該分離粒線體係透過關節內注射投予該個體。
14. 如請求項1所述之方法，更包含對該個體投予一抗發炎藥、一鎮痛藥或其組合。
15. 如請求項14所述之方法，其中該抗發炎藥係選自由乙醯柳酸、塞來昔布、雙氯氛酸二氟尼柳、依托度酸鹽、伊布洛芬、吲哚美辛、 酮基布洛芬、酮咯酸氨丁三醇、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、匹洛西卡、雙水楊酯、蘇林達克、妥美汀、普賴鬆、可體松、甲基培尼皮質醇以及其組合所組成之群組。
16. 如請求項14所述之方法，其中該鎮痛藥係選自由乙醯胺酚、尼夫平、可待因、阿米替林、加巴噴丁、嗎啡、羥考酮、普瑞巴林、他噴他竇、丁基東莨菪鹼、曲馬多以及其組合所組成之群組。

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