TW202210509A - 預防或治療周邊動脈阻塞疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露係提供一種周邊動脈阻塞疾病(PAOD)的預防或治療方法，係包括對受試者給予有效量的CXC趨化因子配體5(CXCL5)拮抗劑。本揭露另提供一種用於預防或治療周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織之方法，其係透過抑制CXCL5而增強血管生成，以有助於加速傷口癒合。

Description

預防或治療周邊動脈阻塞疾病的方法

本揭露涉及用於改善周邊動脈阻塞疾病(PAOD)的方法，尤指用於預防或治療周邊缺血的方法。

周邊動脈阻塞疾病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)是一種常見的循環系統問題，涉及動脈阻塞，因而減少了流向四肢的血液。PAOD可能導致四肢血液流動不足，並導致間歇性不走症(intermittent claudication)等症狀，從而降低患者的活動能力。

PAOD患者(例如患有糖尿病的患者)會歷經一種向皮膚供應血液的血管異常。因此，此些患者可能在其皮膚的某些部位上進一步發生潰瘍或甚至有壞死區域(即組織死亡)。缺血性損傷係非常痛苦且使人衰弱，且癒合緩慢，並傾向於發生在手及手指上，例如，指關節或其他骨骼突出處，例如肘部、膝蓋、臀部、腳踝和腳趾。因此，考量身體風險，由PAOD引起而影響患者活動性質的問題是重要的。此也可能帶來情緒風險，因這些藉由限制患者行走能力之問題係嚴重地破壞患者的基本獨立性。

糖尿病患者常見有傷口癒合不良的情況，且預計有15%的糖尿病患者在其一生中會發展為足潰瘍。由於此些潰瘍不會癒合或癒合非常緩慢，因而本質上係傾向為慢性疾病。糖尿病足潰瘍係糖尿病患者的嚴重問題，因高達25%的糖尿病足潰瘍係因周圍血管病變而最終必須面臨截肢。

改善PAOD的策略之一在於促進血管生成或新血管形成。然而，糖尿病性血管病也伴隨全身性血管炎症。因此，在糖尿病性血管病中的治療效果不能與心血管疾病相關的動脈硬化中的治療效果相提並論，因目前為止尚無有效的方法來控制因糖尿病性血管病所引起的炎症。

因此，仍存在有待改善之預防或治療PAOD狀況(如肢體缺血)的需求。

基於上述內容，本揭露係提供一種透過抑制CXC趨化因子配體5(CXC chemokine ligand 5，CXCL5)來預防或治療藉由刺激血管生成而易於緩解的病症或疾病之方法。

於本揭露的一實施態樣中，係提供一種對有其需要之受試者預防或治療PAOD的方法。上述方法係包括對該受試者給予有效量的CXCL5拮抗劑。

於本揭露的一實施態樣中，該CXCL5拮抗劑係能透過防止CXCL5與其受體結合而抑制CXCL5活性。於另一實施態樣中，該CXCL5拮抗劑係針對CXCL5或CXCL5受體的抗體或適體(aptamer)。於另一實施態樣中，該CXCL5拮抗劑係可為抗CXCL5抗體或其片段、可溶型CXC趨化因子受體2(CXCR2)、 CXCR2阻斷劑、可溶型CXCR1、CXCR1阻斷劑、可溶型Duffy抗原趨化因子受體(DARC)或DARC阻斷劑。於另一實施態樣中，該CXCL5拮抗劑係選自CXCL5中和抗體、AZD5069(即，N-[2-[(2,3-二氟苯基)甲基硫烷基]-6-[(2R,3S)-3,4-二羥基丁烷-2-基]氧基嘧啶-4-基]氮雜環丁烷-1-磺酰胺)、瑞帕利辛(reparixin)、SB225002(即N-(2-羥基-4-硝基苯基)-N'-(2-溴苯基)-脲)、SB265610(即N-(2-溴苯基)-N'-(7-氰基-1H-苯並三唑-4-基)脲)及其組合。

於本揭露的一實施態樣中，透過該方法預防或治療的PAOD係可為肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、間歇性不走症、伯格氏症候群(Buerger’s syndrome)、雷諾氏症候群(Raynaud’s syndrome)或血管炎。於另一實施態樣中，該糖尿病性潰瘍係糖尿病性足潰瘍。於另一實施態樣中，該肢體缺血係慢性肢體缺血。

於本揭露的一實施態樣中，另提供一種對有其需要之受試者預防或治療周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織之方法。此方法係包括對該受試者給予包含用以誘導血管新生之有效量的CXC趨化因子配體5(CXCL5)拮抗劑及其藥學上可接受的載體之藥物組成物。

於本揭露的一實施態樣中，該周邊缺血性組織或周邊缺血是由以下各項中的至少一種引起的：糖尿病、慢性動脈阻塞、伯格氏病、雷諾氏病、血管痙攣、硬皮病及血管炎。於另一實施態樣中，該周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織係包括慢性傷口、指缺血性病變(digital ischemic lesion)、指潰瘍或指壞死病變。

於本揭露的一個實施態樣中，該CXCL5拮抗劑的給予係導致受試者之血管生成刺激。於另一實施態樣中，該給予係促進受試者的缺血組織癒合或加速傷口癒合。於又一實施態樣中，該給予係促進缺血組織或受損組織的再上皮化或基質沉積。在又一實施態樣中，該給予係減輕與周邊缺血性組織或與 周邊缺血相關的靜息疼痛。於另一實施態樣中，該給予係減少受試者新周邊缺血性組織的發展。

於本揭露的一實施態樣中，該CXCL5拮抗劑的有效量為約0.01mg/kg至約100mg/kg，例如約0.1mg/kg至約80mg/kg、約0.5mg/kg至約70mg/kg、約1mg/kg至約60mg/kg、約5mg/kg至約50mg/kg、約10mg/kg至約40mg/kg和約15mg/kg至約30mg/kg。

於本揭露的一實施態樣中，CXCL5拮抗劑係經口服、腹膜內、靜脈內、皮內、肌內、皮下或透皮方式給予。

於本揭露的一實施態樣中，在2至4天的時間內給予CXCL5拮抗劑1至2次。於另一實施態樣中，在3至5週的時間內給予CXCL5拮抗劑8至15次。

於本揭露中，透過CXCL5拮抗劑之使用，本揭露所提供之方法可改善內皮先驅細胞(endothelial progenitor cell，EPC)和人類主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cell，HAEC)的功能，從而增強血管生成。因此，本揭露的方法有效改善傷口的癒合能力及缺血，以及減輕與缺血相關的靜息疼痛，並防止新缺血性組織的發展。採用本揭露的CXCL5拮抗劑之方法有利於加速血管生成過程，故能有效治療PAOD並改善周圍缺血。

藉由閱讀於後詳細的敘述，一併參考此處所述的圖式，會更理解本揭露的實施方式。

圖1A至圖1D係顯示來自單核細胞之血漿(n=6；圖1A)和上清液(n=6；圖1B)中的CXCL5水平，正常和糖尿病患者的早期內皮先驅細胞(EPC)(n=6；圖1C)和晚期EPC(n=6；圖1D)。「N」代表從「n」個不 同個體培養的細胞，並對從每個個體培養的細胞進行三個獨立實驗的實驗。DM：糖尿病；* P<0.05；** P<0.01。

圖2A至圖2H係顯示不同量的CXCL5中和抗體對EPC的血管生成和遷移能力之影響。圖2A至圖2D係顯示來自透過CXCL5中和抗體治療誘導之糖尿病受試者的晚期EPC的管形成和遷移，及其相對於正常受試者的百分比(n=3)。圖2E至圖2H係顯示來自透過CXCL5中和抗體的治療誘導之正常受試者的高葡萄糖刺激的晚期EPC的管形成和遷移，及其相對於未刺激的EPC的百分比(n=3)。「N」代表從「n」個不同個體培養的細胞，並對從每個個體培養的細胞進行三個獨立實驗的實驗。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體。對照組：取自正常受試者且無高葡萄糖刺激的晚期EPC；HG：高葡萄糖(25mM)；* P<0.05；** P<0.01。

圖3A至圖3F係顯示自糖尿病患者的晚期EPC中(n=3；圖3A至3C)，以及自正常受試者之高葡萄糖刺激下的晚期EPC中(n=3；圖3D至圖3F)，不同量的CXCL5中和抗體對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)表現的影響。「N」代表從「n」個不同個體培養的細胞，並對從每個個體培養的細胞進行三個獨立實驗的實驗。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；對照組：取自正常受試者且無高葡萄糖刺激的晚期EPC；HG：高葡萄糖(25mM)；* P<0.05；** P<0.01。

圖4A至圖4G係說明在高葡萄糖刺激的人類主動脈內皮細胞(HAEC)中，不同量的CXCL5中和抗體對血管生成和遷移能力(n=3；圖4A至圖4D)以及VEGF和SDF-1表現(n=3；圖4E至圖4G)的影響。CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；對照組：無高葡萄糖刺激的HAEC；HG：高葡萄糖(25mM)；* P<0.05；** P<0.01。

圖5A和圖5B係顯示在每組小鼠(非DM組，n=6；DM，n=8；DM+IgG 10μg組，n=6；DM+IgG 100μg組，n=6；DM+CXCL5 10μg mAb組，n=6；DM+CXCL5 100μg mAb組，n=6)中藉由激光都卜勒成像系統監測的足血流量的圖。圖5A係顯示對缺血性(右)和非缺血性(左)後肢的代表性評估，其在後肢缺血手術之前、之後及之後4週進行。圖5B係顯示對血流之定量評估，其係表示為缺血肢體與非缺血肢體的血流比率。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；* P<0.05；** P<0.01。

圖6係顯示在後肢缺血手術前後，透過流式細胞儀進行測量每組小鼠(非DM組，n=6；DM，n=8；DM+IgG 10μg組，n=6；DM+IgG 100μg組，n=6；DM+CXCL5 10μg mAb組，n=6；DM+CXCL5 100μg mAb組，n=6)中循環EPC水平的圖。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；OP：後肢缺血手術；* P<0.05；** P<0.01。

圖7A至圖7C係顯示在後肢缺血手術後，透過西方墨點轉漬法測量，使用CXCL5 100μg mAb，n=3處理的DM小鼠的大腿肌肉中VEGF和SDF-1表現的圖。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；* P<0.05；** P<0.01。

圖8A至圖8E係說明CXCL5中和抗體對糖尿病小鼠(非DM組，n=24；DM，n=20；DM+IgG 10μg組，n=12；DM+IgG 100μg組，n=12；DM+CXCL5 10μg mAb組，n=12；DM+CXCL5 100μg mAb組，n=12)的傷口癒合作用的圖。圖8A和圖8B顯示一段時間內每組小鼠中傷口癒合的代表性照片，以及隨時間測量的第0天傷口面積(%)與初始面積之比的統計分析。圖8C至圖8E分別顯示使用光學顯微鏡觀察之H & E染色的、抗CD31免疫染色的和 皮下組織的Masson三色染色的切片。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；* P<0.05；** P<0.01。

圖9A和圖9B係說明CXCL5中和抗體對離體主動脈環作用的圖(非DM組，n=10；DM，n=12；DM+IgG 10μg組，n=6；DM+IgG 100μg組，n=6；DM+CXCL5 10μg mAb組，n=6；DM+CXCL5 100μg mAb組，n=6)。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；** P<0.01。

圖10A和圖10D係說明CXCL5中和抗體對體內基質膠塞新血管形成作用的圖(非DM組，n=10；DM，n=12；DM+IgG 10μg組，n=6；DM+IgG 100μg組，n=6；DM+CXCL5 10μg mAb組，n=6；DM+CXCL5 100μg mAb組，n=6)。圖10A和圖10B係顯示每組小鼠中的基質膠塞，並透過血紅蛋白含量測量基質膠塞中新血管形成的定量分析。圖10C和圖10D係分別顯示基質膠塞的H & E染色和抗CD31免疫染色部分。DM：糖尿病；CXCL5 mAb：CXCL5中和抗體；** P<0.01。

以下係藉由特定的具體實施例用於說明本揭露之實施方式。熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本揭露之優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同之實施方式加以實現或應用。本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點和應用，在不悖離本揭露所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。

應注意的是，如本文所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確地限於一個指示物，係包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。

如本文所使用，術語「包括」係指對本揭露內容係必不可少的組成、方法和其相應的組分，但對於未指定的元素之涵蓋是開放的，無論是否為必不可少的組成。

本揭露係涉及用於預防或治療對有其需要之受試者的周邊動脈阻塞疾病(PAOD)的方法。上述方法係包括對受試者給予有效量的CXCL5拮抗劑，其中，該CXCL5拮抗劑係能抑制CXCL5活性。

本揭露另針對一種對有其需要之受試者預防或治療周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織之方法，係包括對該受試者給予有效量的CXCL5拮抗劑，其中，該CXCL5拮抗劑係能刺激該受試者的血管生成。

於本揭露的一實施態樣中，CXCL5拮抗劑能夠防止CXCL5與其受體結合。在另一實施態樣中，CXCL5拮抗劑係用以抑制因CXCL5與其受體結合而產生的細胞內信號傳導之試劑。舉例來說，CXCL5拮抗劑可以針對CXCL5和CXCL5的受體中的至少一種，從而阻斷CXCL5信號傳導。如本文所使用，CXCL5的受體包括但不限於CXCR2、CXCR1和DARC[1-3]。

如本文所使用，術語「CXCR2」或「CXCR2受體」可互換使用，並且在本領域中具有其一般含義。CXCR2受體可來自任何來源，但是通常係哺乳動物(如人類或非人的靈長類)CXCR2受體。於本揭露的一實施態樣中，CXCR2受體係人類CXCR2受體。

如本文所使用，術語「DARC」，也稱為Duffy血型抗原，係指多種趨化因子的混雜受體，其作為通信信號。該DARC係結合CC和CXC類趨化因子、黑色素瘤生長刺激活性(MSGA-α/CXCL1)、白介素8(CXCL8)、在正常T細胞表現及分泌活化而調控(regulated upon activation normal T-expressed and secreted，RANTES/CCL5)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)、中性粒細胞活化蛋白2和3、生長相關基因alpha、CXCL5、和血管生成相關血小板因子1。

如本文所使用，術語「CXCL5」係在本領域中具有其一般含義。CXCL5係CXCR2受體的天然配體，且可來自任何來源，但通常係哺乳動物(如人類或非人靈長類)CXCL5。於本揭露的一實施態樣中，CXCL5係人類的CXCL5。

如本文所使用，術語「CXCL5拮抗劑」係包括在給予受試者後，所致受試者之與CXCL5相關的生物學活性的抑制或下調的任何實體，包括不同於因該CXCL5與其受體的結合而引起的任何下游生物學效應。CXCL5拮抗劑包括任何可抑制CXCL5活性或阻斷CXCL5受體活化、或任何CXCL5受體活化的下游生物學效應的試劑。此CXCL5拮抗劑係包括能與CXCL5相互作用的任何試劑，從而阻止或降低其正常的生物學活性。舉例來說，所述試劑可為有機小分子或針對CXCL5的抗體，例如CXCL5中和抗體，其可阻斷CXCL5與其受體間的相互作用，或可阻斷CXCL5的活性。該CXCL5拮抗劑也可係針對CXCL5受體的小分子或抗體，其可透過佔據受體之配體結合位點或其部分來起作用，從而使受體不能接近其配體CXCL5。

在本揭露的一實施態樣中，CXCL5拮抗劑係針對CXCL5或CXCL5受體的抗體或適體。在另一實施態樣中，CXCL5拮抗劑是抗CXCL5抗體或其片段、可溶型CXCR2、CXCR2阻斷劑、可溶型CXCR1、CXCR1阻斷劑、可溶型DARC或DARC阻斷劑。在又一實施態樣中，CXCL5拮抗劑選自CXCL5中和抗體、AZD5069、瑞帕利辛、SB225002、SB265610及其組合所組成群組。

如本文所使用，術語「適體」係指在分子識別方面，代表抗體替代物的一類分子。適體是寡核苷酸或寡肽序列，其具有以高親和力和特異性識別實際任何種類的靶分子的能力。

在本揭露的一實施態樣中，PAOD係包括肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、間歇性不走症、伯格氏症候群、雷諾氏症候群及血管炎。在另一實施態樣中，使用本揭露內容的方法治療的受試者係患有糖尿病、慢性動脈阻塞、血管痙攣、硬皮病或血管炎。在又一個實施態樣中，該周邊缺血性組織或周邊缺血是由以下各項中的至少一種引起的：糖尿病、慢性動脈阻塞、伯格氏病、雷諾氏病、血管痙攣和硬皮病。

肢體缺血包括慢性肢體缺血和急性肢體缺血(acute limb ischemia，ALI)。慢性肢體缺血發展為嚴重肢體缺血(critical limb ischemia，CLI)，導致遠端肢體處於截肢的危險中。急性肢體缺血表現為快速的血流損失，可能在數小時內損壞組織。CLI通常與糖尿病有關，其導致血管系統受損、組織過度受損和慢性缺血性靜息疼痛。此外，伯格氏病會損害流向手和腳的血液，最終導致手指和腳趾的損失。PAOD通常會導致肢體和四肢傷口癒合不良、潰瘍和組織壞死，此可能會因非創傷性截肢而導致患肢喪失。

踝肱壓力指數(ABPI)和腳趾肱壓力指數(TBPI)係用以指示患者的動脈系統狀態。典型結果係如下所示：

(1)ABPI>0.9至1.2：正常；

(2)ABPI=0.8至0.9：輕度PAOD(可能會出現流入疾病(inflow disease))；

(3)ABPI=0.5到0.79：中度缺血/間歇性不走症(諮詢血管外科醫生有益於加快傷口癒合)；

(4)ABPI=0.35至0.49：中度重度缺血(建議緊急諮詢血管外科)；

(5)ABPI=0.2至0.34：嚴重缺血(建議緊急諮詢血管外科)；

(6)ABPI<0.2：考慮到絕對壓力和臨床表現，可能是嚴重的局部缺血(建議緊急諮詢血管外科)；

(7)TBPI>0.7：正常；

(8)TBPI=0.64至0.7：臨界點；和

(9)TBPI<0.64：PAOD異常提示(建議緊急諮詢血管外科)。

在PAOD患者中，內皮先驅細胞(EPC)的數量減少，並由群落形成能力和遷移活性定義的EPC功能顯著降低，且與後肢缺血中的新血管形成減少有關。同樣地，I型或II型糖尿病患者的EPC數量減少。EPC數量及其功能的減少涉及一些血管併發症，例如內皮功能障礙，使患者在缺血性事件後易出現新血管形成受損。

如本文所使用，術語「周圍缺血組織」及其等效物係指因用於供應周邊組織脈管系統的任何收縮、損傷或阻塞而導致血液供應減少的組織。如本文所使用，術語「由周圍缺血而損傷的組織」及其等效物係指周邊缺血因一段時間對組織或細胞的形態、生理和/或分子損傷。

如本文所使用，術語「慢性傷口」通常係指在約三個月內未癒合的傷口，但可為在約一或兩個月內未癒合的傷口。慢性皮膚傷口係包括例如糖尿病性潰瘍、靜脈性潰瘍、外傷性潰瘍、壓力性潰瘍、血管性潰瘍、動脈性潰瘍、鐮狀細胞性潰瘍和混合性潰瘍。

本揭露內容之方法和CXCL5拮抗劑可用於治療多種疾病，這些疾病將從刺激血管形成、刺激血管新生、增加血流量和/或增加血管質化而增益。

如本文所使用，術語「血管生成」表示血管的生長或形成。血管生成包括從先前存在的血管中生長出新血管，以及指自發性血管形成的脈管形 成和透過自現有血管分裂而形成新血管之套疊(intussusception)。血管生成包括「新血管形成」、「血管再形成」、「新血管生成」和「血管再生」。

如本文所使用，術語「治療」係指獲得期望的藥理和/或生理作用，例如刺激血管生成。就完全或部分預防疾病或其症狀而言，該效果可以是預防性的，或者對於完全或部分治癒、減輕、緩解、補救、改善疾病或歸因於該疾病的不利影響而言，該效果可以是治療性的。

如本文所使用，術語「與PAOD相關的症狀」、「由缺血引起的症狀」和「因缺血所致的症狀」所指的症狀包括器官功能受損或喪失、抽筋、跛行、麻木、刺痛、無力、疼痛、傷口癒合不良、發炎、皮膚變色和壞疽。本文所使用的「治療」涵蓋任何疾病的治療，並包括：(a)防止可能易患該疾病但尚未被診斷出患有該疾病的受試者中發生疾病或病狀(例如，防止因血液流動不足導致的皮膚移植物或重新附著的肢體喪失)；(b)抑制疾病或其症狀，例如減慢或阻止其發展；(c)緩解疾病或其症狀(例如，增強缺血組織周圍新血管形成的發展，以改善流向組織的血液)。在本揭露內容中，對血管生成的刺激用於具有藉由增加血管和增加血流而適於治療的疾病或病症的對象。此對象可由健康護理專業人員基於任何合適診斷方法的結果來識別。

如本文所使用，術語「患者」和「受試者」可互換使用。術語「受試者」是指人或動物。受試者的實例包括但不限於人、猴、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、食火雞、鴕鳥、和魚。在本揭露的某些實施態樣中，受試者是哺乳動物，如靈長類動物，例如人。

如本文所使用，術語「有效量」係指在治療的受試者上賦予期望的治療效果(例如，期望的血管生成刺激水平)所需的活性劑(例如，CXCL5 拮抗劑)的量。如本領域技術人員所知，有效劑量將根據給藥途徑、賦形劑使用、與其他治療方法共同使用的可能性及待治療的病症而變化。

在本揭露的一個實施態樣中，CXCL5拮抗劑的有效量為約0.01mg/kg至約100mg/kg，例如約0.1mg/kg至約80mg/kg、約0.5mg/kg至約70mg/kg、約1mg/kg至約60mg/kg、約5mg/kg至約50mg/kg、約10mg/kg至約40mg/kg和約15mg/kg至約30mg/kg。在另一個實施態樣中，CXCL5拮抗劑的有效量的下限選自0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和25mg/kg，上限選自100mg/kg、90mg/kg、80mg/kg、70mg/kg、60mg/kg、50mg/kg和40mg/kg。

在本揭露的一個實施態樣中，在2至4天的時間內給予CXCL5拮抗劑1至2次。在另一實施態樣中，在3至5週的時間內給予CXCL5拮抗劑8至15次。例如，CXCL5拮抗劑每週給藥3次，或在4週內給藥10次。在另一實施態樣中，CXCL5拮抗劑間隔24小時施用。

如本文所使用，術語「給予」或「施用」係指透過導致活性劑至少部分定位在所需部位的方法或途徑而將活性劑(例如，CXCL5拮抗劑)置於受試者體內，從而產生期望的效果。本文所述的活性劑可透過本領域已知的任何適當途徑施用，包括但不限於口服或腸胃外途徑，包括腹膜內、靜脈內、皮內、肌內、皮下或透皮途徑。

在本揭露的一個實施態樣中，CXCL5拮抗劑可存在於藥物組成物中來給予至受試者。在某些實施態樣中，本揭露提供一種用於刺激血管生成的藥物組成物，其包含CXCL5拮抗劑和藥學上可接受的載體。本揭露中提供的藥物組成物可有效地預防或治療PAOD和/或周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織。

在本揭露的一個實施態樣中，藥學上可接受的載體可以是稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、助流劑、表面活性劑或其組合。

在本揭露的一個實施態樣中，藥物組成物是無菌的可注射組成物，其可以係在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的溶液或懸浮液。可採用之可接受的媒介物和溶劑係包括1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液和等張的氯化鈉溶液。另外，常規上使用不揮發性油作為溶劑或懸浮介質(如合成的甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸係如油酸及其甘油酯衍生物，其可用於製備注射劑、作為天然藥學上可接受的油(例如橄欖油和菌麻油)，例如其聚氧乙烯化形式。此些油溶液或懸浮液也可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的表面活性劑(例如Tweens和Spans或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑)，其係用於藥學上可接受的固體、液體或其他劑型的製備，以用於配製目的。

藥物組成物中的載體必須是「可接受的」，其係與組成物的活性劑相容(並能穩定活性劑)，且對待治療的受試者無害。可將一種或多種助溶劑使用作為藥物賦形劑，以輸送活性化合物。其他載體的實例係包括膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素和月桂基硫酸鈉。

已透過許多實例說明本揭露，以下實施例僅是示例性的，無意以任何方式限制本揭露的適用範圍。

實施例

實施例1：血漿和內皮先驅細胞(EPC)中之CXCL5水平的測量

為了EPC的細胞培養，在隔夜禁食後的早晨，從健康志願者或II型糖尿病(DM)患者的外周靜脈中獲取血液樣本。在本研究中，僅納入了未經胰島素治療的穩定II型DM患者，並排除在過去6個月內接受過大手術或目前正在接受其他疾病的藥物治療的其他重大系統性疾病的患者。所述之人體研究係經研究委員會機構的批准，且符合《赫爾辛基宣言》。

於採血後，藉由使用Histopaque-1077(1.077g/mL，Sigma-Aldrich)進行密度梯度離心分離總單核細胞。簡言之，將單核細胞鋪於內皮細胞生長基礎培養基-2(EBM-2；Lonza)中，並添加補充劑(皮質醇、人成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子、R3類胰島素生長因子-1、抗壞血酸、人表皮生長因子、硫酸紫菌素-兩性黴素和20%的胎牛血清)在塗覆有纖連蛋白的6孔板上。於培育4天後，更換培養基並除去非附著性細胞。附著的早期EPC出現細長的紡錘形狀。晚期(外生)EPC在開始培養單核細胞後的2至4週出現。晚期EPC在匯合時表現出典型的成熟內皮細胞的鵝卵石形態和單層生長模式。EPC係於37℃和95%空氣及5%CO₂的氛圍中，在添加有胎牛血清(最終濃度為5% v/v)的EBM-2中生長。

根據製造商的說明，以ELISA試劑盒(R & D系統)對早期EPC和晚期EPC測量取自單核細胞之血漿和上清液中的CXCL5的水平。如圖1A和圖1B中所示，DM患者血漿中的CXCL5水平高於健康受試者(圖1A)，但DM患者和健康受試者的單核細胞上清液中的CXCL5水平係無顯著差異(圖1B)。另外，如圖1C和圖1D中所示，可發現相較於健康受試者，DM患者的早期EPC(圖1C)和晚期EPC(圖1D)的上清液係含有更高的CXCL5水平。

實施例2：CXCL5中和抗體對EPC功能的影響

透過實施例1中描述的方法獲得EPC。此外，將自健康志願者的EPC置於高葡萄糖(25mM)中培養3天，以獲得高葡萄糖刺激的EPC。以CXCL5單源抗體(1ng/mL或10ng/mL；R & D Systems)或IgG對照組經預處理24小時，分別將健康志願者和DM患者的EPC(1×10⁴細胞)分別懸浮於無血清EBM-2中，以用於後續的遷移測定和管形成測定。

使用腔室分析法評估EPC的遷移。將預處理的細胞添加至帶有聚碳酸酯膜的24孔之多孔板的上腔室中。將補充有10%胎牛血清的EBM-2添加至下腔室。經培育18小時後，將細胞以4%多聚甲醛固定並使用蘇木精溶液染色。在六個隨機高倍(×100)顯微鏡視野中計數遷移的細胞數量。

對於管形成測定，將ECMatrix凝膠溶液(Invitrogen)與ECMatrix稀釋緩衝液(Invitrogen)混合，並置於96孔板中。然後，將1×10⁴預處理的EPC放入添加有10%胎牛血清的EGM-2的基質溶液中，並在95%空氣和5%CO₂的氣氛中於37℃培育16小時。在倒立光學顯微鏡(×40)下檢查細管的形成。進行四個代表場之成像，並使用Image-Pro Plus軟件比較細胞形成的完整管之總面積的平均值。

請參考圖2A至圖2D中，可觀察到透過CXCL5中和抗體改善自糖尿病患者之EPC的管形成和遷移的能力。另外，如圖2E至圖2H所示，CXCL5中和抗體改善自正常受試者的高葡萄糖刺激的EPC的管形成和遷移。因此，CXCL5之抑制可導致增強的血管生成和EPC的遷移。

進一步進行西方墨點轉漬法，以檢測EPC中的血管內皮生長因子(VEGF)和基質細胞衍生因子1(SDF-1)的表現。在還原條件下(Bio-Rad Laboratories)，使用8%至12%的梯度之凝膠對從EPC獲得的等量蛋白質進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然後轉移至硝酸纖維素膜(Millipore)。將膜與抗VEGF(Cell Signaling Technology)、SDF-1(Cell Signaling Technology)和肌動蛋白(Cell Signaling Technology)的抗體在4℃培育過夜。將膜與經山葵過氧化酶(HRP)偶聯的二抗(1：1000)在室溫下培育1小時。最後，該膜係以ECL試劑盒(PerkinElmer)觀察。

將上述之西方墨點轉漬法的結果和統計分析示於圖3A至圖3F中。可發現透過經CXCL5中和抗體處理，自糖尿病患者的EPC或來自正常受試者的高葡萄糖刺激的EPC中的VEGF和SDF-1表現增加。此些結果表示該CXCL5中和抗體係藉VEGF和SDF-1信號途徑改善EPC的血管生成和遷移能力。

實施例3：CXCL5中和抗體對人類主動脈內皮細胞(HAEC)的影響

將原發性HAEC(ScienCell，Carlsbad，加利福尼亞州，美國)於37℃及具5%CO₂氣氛的濕潤培養箱中，於塗覆有纖連蛋白的平板中進行培養，其中，該內皮細胞培養基係含有5%胎牛血清、1%內皮細胞生長補充劑和1%青黴素/鏈黴素溶液。根據實施例2中所述的方法，進行HAEC的血管生成和遷移能力以及HAEC中的VEGF和SDF-1表現的評估。

將上述結果顯示於圖4A至圖4G中。可觀察到CXCL5中和抗體係透過VEGF和SDF-1途徑進行信號傳導，在高葡萄糖刺激的HAEC中誘導出明顯的血管生成反應。

實施例4：動物實驗和小鼠後肢缺血模型的建立

為了建立糖尿病小鼠模型，從BioLASCO(台北，台灣)購買六周大的雄性FVB/NCrlBltw小鼠。使EVB/NCrlBltw小鼠適應2週，然後用於形成I型 糖尿病(DM)模型。為了產生FVB/NCrlBltw小鼠之高血糖，對FVB/NCrlBltw小鼠腹膜內(i.p.)注射鏈脲佐菌素(STZ)(40mg/kg；Sigma-Aldrich)5天。

上述動物飼養係根據國立陽明大學動物保護委員會的規定進行。所有與動物有關的工作均在國立陽明大學批准的動物護理和使用委員會機構(IACUC)規程下進行。

為進行CXCL5拮抗劑治療，糖尿病小鼠在後肢缺血手術後立即腹膜內注射抗CXCL5中和性單源抗體(10μg或100μg；R & D Systems)，每週3次，且持續4週。以大鼠IgG2B同型(10μg或100μg；R & D Systems)作為對照組。

單側後肢缺血係透過切除右股動脈進行誘發。簡言之，將單個組的動物先藉由腹膜內注射三溴乙醇(240mg/kg；Avertin；Sigma-Aldrich)進行麻醉，並結紮右股動脈的近端和遠端以及右隱動脈的遠端。在後肢缺血建立4週後，將動物犧牲。

實施例5：CXCL5中和抗體對STZ誘導的糖尿病小鼠中血管生成的作用

在本實施例中，係使用實施例4中所述之具有後肢缺血的動物。

在手術前、手術後和手術後4週，使用激光都卜勒灌注成像儀系統(Moor Instruments Limited)測量後肢血液灌注。為避免環境溫度和動物血壓變化的影響，將結果表示為缺血性肢體與非缺血性肢體的灌注比。

圖5A係顯示激光都卜勒灌注成像的結果。在以顏色編碼的圖像中，紅色表示正常灌注，藍色表示缺血後肢的血流量係明顯減少。圖5B係顯示對血流的定量評估，其表示為缺血肢體與非缺血肢體的血流比率。觀察到在非 DM動物和該些以CXCL5中和抗體處理的動物中有後肢血流恢復之發生，表明CXCL5拮抗劑在改善缺血組織方面是有效的。

此外，為檢測EPC樣細胞的流動，在手術前和手術後2天進行外周血樣品之採集，並將分離的單核細胞與螢光異硫氰酸鹽(FITC)抗小鼠Sca-1(eBioscience)和藻紅素抗小鼠Flk-1(VEGFR-2，eBioscience)抗體在4℃下放置30分鐘。使用FACScalibur流式細胞儀(BD Pharmingen)透過流式細胞術分析單核細胞中Sca-1⁺/Flk-1⁺細胞(即，類EPC細胞)的表現。為進行分析，藉由列舉Sca-1⁺/Flk-1⁺細胞並以FloJo(Treestar)進行評估，以定量10⁵個循環的類EPC細胞。

根據上述結果報告，循環的EPC是自骨髓中遷移的，其在血管修復和缺血區域的再灌注中起重要作用。如圖6所示，可發現CXCL5中和抗體的治療可以挽救因糖尿病小鼠缺血引起的循環EPC的減少，此暗示CXCL5拮抗劑可能參與遷移或激活EPC，從而有助於新血管形成。

在犧牲動物後，收集小鼠的大腿肌肉並用於西方墨點轉漬法以檢測VEGF和SDF-1的表現。結果示於圖7A至圖7C中，表明經由使用CXCL5中和抗體處理，糖尿病小鼠中的VEGF和SDF-1表現增加。由此可見，CXCL5中和抗體可藉由VEGF和SDF-1途徑誘導血管生成反應。

實施例6：CXCL5中和抗體對STZ誘導的糖尿病小鼠中傷口癒合的作用

在此實施例中，使用在實施例4中所述之建立糖尿病小鼠和藥物治療方案。為進行傷口癒合分析，將小鼠麻醉並剃毛，再以抗菌肥皂溶液和75%的酒精清潔背部皮膚。經CXCL5抗體治療3週後，以活檢穿孔器產生直徑3 mm的圓形全層切除傷口，而沒有傷害肌肉，並使用數位相機(Nikon)記錄傷口。

圖8A和圖8B分別顯示在一段時間內每組傷口皮膚的癒合模式的代表性照片，以及隨時間測量的傷口面積(%)與第0天的初始面積的比率。此些結果表明，傷口癒合能力的提高係歸因於CXCL5中和抗體的治療。

於受傷後五天進行動物犧牲，對受傷的皮膚取樣以進行組織學和免疫組織化學分析。將傷口樣品固定於4%多聚甲醛中24小時，接著於梯度酒精中進行脫水。然後，將樣品切成5μm的厚度並包埋在石蠟中。對某些切片進行脫石蠟處理，並與H & E和Masson的三色染色劑一起培育以進行組織學分析。將其他部分經去石蠟處理，並與多株兔抗鼠CD31抗體(Abcam)在4℃培育過夜，然後與二山羊抗兔抗體(Abcam)進行培育。

圖8C係顯示經H & E染色的切片。相對於未治療的糖尿病組或IgG治療組，在CXCL5中和抗體治療組中觀察到顯著增加的再上皮化。

圖8D係顯示抗CD31免疫染色切片。CD31也稱為血小板內皮細胞黏附分子1(PECAM-1)，係在內皮細胞、血小板和大多數白血球細胞亞群的膜上表現的細胞表面受體，已被很好地定義為血管生成的標誌物。如圖8D所示，相對於未處理的對照組或IgG處理的組，在CXCL5中和抗體處理組中，CD31陽性面積增加，表明CXCL5中和抗體可以改善血管生成血管的發育。

圖8E係顯示透過Masson三色染色的傷口膠原沉積。膠原蛋白合成在皮膚傷口癒合過程中發揮關鍵作用，因其為傷口癒合細胞和再生血管提供支架，從而促進傷口癒合。參考圖8E，在CXCL5中和抗體處理組的皮膚傷口肉芽組織中觀察到更多的新生膠原纖維，而在未處理的對照組中觀察到更少的膠原纖維。

以上結果係表明CXCL5中和抗體可促進生成血管的發展和傷口膠原纖維的沉積，從而促進皮膚傷口的癒合。

實施例7：CXCL5中和抗體對STZ誘導的糖尿病小鼠的離體主動脈出芽(sprouting)和基質膠塞體內新血管形成的作用

在此實施例中，使用在實施例4中所述之建立糖尿病小鼠和藥物治療方案。

對於主動脈環測定，在將CXCL5中和抗體處理4週並去除胸主動脈後，用三溴乙醇(240mg/kg；Avertin；Sigma-Aldrich)犧牲小鼠。將組織修剪，並用鹽水沖洗內腔中的血液。將主動脈環切成胸主動脈下降長度的0.5mm，並嵌入1mg/mL的I型大鼠尾膠原基質(Sigma-Aldrich，08115)，然後在37℃培育1小時。將主動脈環在含有2.5%牛血清(Gibco)、50U/mL青黴素、0.5mg/mL鏈黴素(Sigma-Aldrich)和30ng/mL VEGF(PEPROTECH)的EBM-2(Lonza)中培養於24孔，共7天。將主動脈環與螢光異硫氰酸鹽(FITC)抗凝集素B4(Sigma-Aldrich，L9006)在4℃培育隔夜。透過螢光顯微鏡(x100)擷取圖像。

為進行基質膠塞新血管形成測定，在CXCL5中和抗體治療2週後，對小鼠皮下注射生長因子還原的(GFR)基底膜基質(Corning Matrigel)，該基質膜係含有30ng/mL VEGF(Cayman)和50U肝素(Sigma-Aldrich)。於14天後收集該塞，並在500μL細胞裂解緩衝液中均質化，並在4℃下以6000g離心60分鐘。使用比色測定法(Sigma)在400nm波長處檢測到血紅蛋白。另外，取得之塞係用於組織學和免疫組織化學分析。其組織學和免疫組織化學分析的過程係與實施例6中描述的相同。

圖9A和圖9B顯示離體的血管出芽測定和凝集素BS-1陽性血管出芽數的定量分析。凝集素BS-1是內皮細胞的特異性標記。此些結果係表明CXCL5中和抗體可改善主動脈出芽，其代表新血管生成。

圖10A和圖10B顯示每組小鼠中的基質膠塞，並透過血紅蛋白含量測量基質膠塞中新血管形成的定量分析。可觀察到，CXCL5中和抗體改善糖尿病小鼠中的基質膠塞新血管形成。進一步地，圖10C和圖10D顯示基質膠塞的H & E染色和抗CD31免疫染色部分，表明CXCL5中和抗體增加了新生血管生成。

統計

上述實施例中顯示的結果為平均值±平均值的標準誤差(SEM)。使用未配對的Student t檢定或方差分析進行統計分析，然後進行Scheffe的多重事後比較檢定。使用SPSS軟體(SPSS第14版，伊利諾伊州，芝加哥市，美國)分析數據。p值<0.05被認為具有統計學意義。

從以上所述，實驗表明CXCL5的抑制可改善該傷口癒合受損的受試者之EPC功能，如管形成和遷移能力。同樣地，對CXCL5的抑制可挽救因高葡萄糖刺激而受損之EPC或HAEC功能。隨細胞功能之改善，諸如VEGF和SDF-1的血管生成因子的表現增加，從而增強受試者的血管生成。此外，對CXCL5的抑制可增加EPC的數量，促進血管生成，並誘導血管出芽和微管生成，以及膠原在皮膚組織中的沉積，從而改善局部缺血和傷口癒合。因此，本揭露使用的CXCL5拮抗劑的方法可有利於加速血管生成過程，從而有效治療PAOD，並改善周邊缺血組織或周邊缺血損傷的組織。

雖然已詳細說明本揭露之實施例，但對熟習此項技術者而言，在不實質上脫離本揭露的教示和特徵的情況下，對所示的實施例進行各種修改和 改變仍被認為落在本揭露之精神及範疇內。因此，此修改和改變包含在本揭露闡述的精神和範圍內。

參考文獻：

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2. Smith, E., et al., “Duffy antigen receptor for chemokines and CXCL5 are essential for the recruitment of neutrophils in a multicellular model of rheumatoid arthritis synovium.” Arthritis Rheum, 2008. 58(7): p. 1968-73.

3. Gardner, L., et al., “The human Duffy antigen binds selected inflammatory but not homeostatic chemokines.” Biochem Biophys Res Commun, 2004. 321(2): p. 306-12.

Claims (15)

1. 一種對有其需要之受試者預防或治療周邊動脈阻塞疾病的方法，包括對該受試者給予有效量的CXC趨化因子配體5拮抗劑，以抑制CXCL5活性。
2. 如請求項1所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑係針對CXCL5或CXCL5受體的抗體或適體。
3. 如請求項2所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑係抗CXCL5抗體或其片段、可溶型CXC趨化因子受體2、CXCR2阻斷劑、可溶型CXCR1、CXCR1阻斷劑、可溶型Duffy抗原趨化因子受體或DARC阻斷劑。
4. 如請求項1所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑係選自由CXCL5中和抗體、AZD5069、瑞帕利辛、SB225002、SB265610及其組合所組成群組之一者。
5. 如請求項1所述之方法，其中，該周邊動脈阻塞疾病係肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、間歇性不走症、伯格氏症候群、雷諾氏症候群或血管炎。
6. 如請求項1所述之方法，其中，該受試者係針對患有糖尿病、慢性動脈阻塞、血管痙攣、硬皮病或血管炎的人或動物。
7. 如請求項1所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑的有效量係約0.01mg/kg至約100mg/kg。
8. 如請求項7所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑的有效量係約0.1mg/kg至約80mg/kg。
9. 如請求項1所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑係經口服、腹膜內、靜脈內、皮內、肌內、皮下或透皮方式給藥。
10. 一種對有其需要之受試者預防或治療周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織之方法，包括對該受試者給予藥物組成物，其中，該藥物組成物包含有效量的CXC趨化因子配體5拮抗劑以誘導血管新生，及其藥學上可接受的載體。
11. 如請求項10所述之方法，其中，該CXC趨化因子配體5拮抗劑係抗CXCL5抗體或其片段、可溶型CXC趨化因子受體2、CXCR2阻斷劑、可溶型CXCR1、CXCR1阻斷劑、可溶型Duffy抗原趨化因子受體或DARC阻斷劑。
12. 如請求項10所述之方法，其中，該周邊缺血性組織或周邊缺血係由以下各項中的至少一種所引起：糖尿病、慢性動脈阻塞、伯格氏病、雷諾氏病、血管痙攣、硬皮病或血管炎。
13. 如請求項10所述之方法，其中，該周邊缺血性組織或由周邊缺血而損傷的組織係包括慢性傷口、指缺血性病變、指潰瘍或指壞死病變。
14. 如請求項10所述之方法，其中，該給予促進組織癒合、組織上皮的再形成及組織內基質沉積中的至少一種。
15. 如請求項10所述之方法，其中，該給予減輕該受試者之與周邊缺血性組織或周邊缺血相關的靜息疼痛、以及該受試者之新周邊缺血性組織的發展中的至少一種。

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