TW202210073A

TW202210073A - 一種包含安卓幸醇之組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途

Info

Publication number: TW202210073A
Application number: TW109131276A
Authority: TW
Inventors: 曾耀銘; 楊震; 葉淇臺; 吳駿翃; 龔建賢; 常青; 曾德毓
Original assignee: 毓維生物科技股份有限公司; 大陸商甘肅安卓幸製藥有限公司; 新加坡商新加坡綠色化學工程有限公司
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-03-16
Also published as: TWI778414B

Abstract

本發明提供一種包含安卓幸醇(Antrocinol；(3aS,4R,6aS,10aR)-4-(羥甲基)-7,7-二甲基十氫-1H-萘酚[1,8a-c]呋喃-1-酮)之組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效劑量之安卓幸醇。

Description

一種包含安卓幸醇之組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途

本發明係關於一種組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長生長之藥物的用途，尤其係指一種包含安卓幸醇(Antrocinol)之組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途。

肝癌係指發生於肝臟或從肝臟開始的惡性腫瘤，也係全世界最常見癌症的第五位以及致命癌症的第二位，其在亞洲國家的發生率比較高，肝癌的致病原因可能因B型肝炎、C型肝炎或是酒精性肝硬化而引起，抑或是因包括黃麴毒素或非酒精性脂肪肝疾病所造成。美國FDA在2005年核准拜耳公司研發的一種多種激酶抑制劑(MKI)索拉非尼(Sorafenib)，作為晚期HCC患者的第一線分子標靶藥物；這索拉非尼是美國FDA自1906年6月設立近百年來，核准的第一個抗肝癌藥物。經索拉非尼治療後，晚期肝癌(Hepatocellular Carcinoma；HCC)患者的生存期延長2.8個月。隨後拜耳公司研發的兩種MKI藥物Regorafenib及Lenvatinib也在FDA的批准下成為晚期HCC患者的二線和一線治療用藥，儘管這兩個MKI藥物獲得FDA的批准，HCC患者的總體生存率仍顯示出對索拉非尼的非劣性(non-inferiority response)，且由於客觀緩解率(object response rate；ORR)低於10%和耐藥性表型出現(resistant phenotypes)，以MKIs治療的方法總體結果令人失望。

牛樟芝(學名：Antrodia cinnamomea)具有抗發炎、抗氧化及抗血管增生等功能，目前已被廣泛用於防癌和保肝的保健食品上，過去研究指出，牛樟芝是許多癌細胞(例如：肝癌、肺癌及乳癌等)的有效拮抗劑，並且可以透過抑制JAK/STAT3訊息傳遞通路來影響非小肺癌細胞(non-small lung cancer)。

本發明合成了一種新的小分子化合物安卓幸醇(Antrocinol；(3aS,4R,6aS,10aR)-4-(羥甲基)-7,7-二甲基十氫-1H-萘酚[1,8a-c]呋喃-1-酮)，其係在在安卓幸(Antrocin)的第12號碳原子位置上加入羥基，本發明是第一個發現安卓幸醇在肝癌中的抗癌能力。

本說明書中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分，此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念，進一步，此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。於申請專利範圍中和”包含”一詞一起使用時，該用語「一」可意謂一個或超過一個。

本說明書中的用語「或」其意同「及/或」。

本發明係一種組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式(I)化合物(中文名稱：安卓幸醇；英文名稱：Antrocinol；化學式：(3aS,4R,6aS,10aR)-4-(羥甲基)-7,7-二甲基十氫-1H-萘酚[1,8a-c]呋喃-1-酮)或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。

式(I)化合物之結構式如下：

於一實施方式中，其中該式(I)化合物之該互變異構形式、該立體異構物、該消旋物、該代謝物、該多形體、該鹽類、或該溶劑合物係對於抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長的作用機制與該式(I)化合物已揭示的抗癌作用機制具相同效果者。

於一實施方式中，其中該組合物進一步包括一藥學上可接受之鹽類或載體。

於一實施方式中，該藥物係用於治療或預防肝癌細胞或肝癌幹細胞的轉移或復發之藥物。

於一實施方式中，該式(I)化合物之有效量為0.01μM至1000μM。

於一較佳實施方式中，該式(I)化合物之有效量為0.5μM至1000μM。

於一實施方式中，該有效量為於人體給予每公斤體重0.08mg/kg~0.8mg/kg(0.08mg/kgBW~0.8mg/kgBW)之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。

於一較佳實施方式中，該有效量為於人體給予0.24 mg/kgBW~0.64mg/kgBW之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。

於一更佳實施方式中，該有效量為於人體給予0.4mg/kgBW之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。

於一更佳實施方式中，其中該藥物係以口服、吸劑或針劑方式給予。

本發明之組合物可與石炭酸、百里酚、桉樹腦、苯扎氯銨、西吡氯銨、尼泊金甲酯、過氧化氫、度美芬、氟化物、生物酶、鈣、水，甜味劑(如山梨醇、蔗糖、三氯蔗糖、糖精鈉與木糖醇)等混合以製成液狀或膏狀之製劑，例如漱口水、牙膏或口腔局部塗抹製劑。

本發明之組合物可以混合保溼劑(如：丙二醇、丙烯乙二醇)、乳化劑(如：聚山梨醇酯、羊毛脂)等以噴劑形式使用，並可進一步在醫療器具上形成一層抗菌薄膜。

本發明之組合物能以固體，溶液，乳劑，分散體，微膠粒，脂質體，以及其他如含有本發明中的一種或多種成分作為活性成分的組合物產物，或與有機或無機載體或賦形劑混合以適用於腸內或腸胃外的施用。活性成分可以被混合，例如，藥學上可接受的通常無毒性的載具如片劑，丸劑，膠囊，栓劑，溶液，乳液，懸浮液以及其他任何合適的形式以供使用。可使用的載體包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯樹膠，明膠，甘露醇，澱粉糊，三矽酸鎂，滑石，玉米澱粉，角蛋白，膠體二氧化矽，馬鈴薯澱粉，尿素，中等鏈長的甘油三酯，葡聚醣，以及合適用於製備製劑，固體，半固體或液體形式的其他載體，另外，亦可以使用穩定劑，增稠劑和著色劑和香料作為輔助。

本發明之組合物可以口服的形式，例如作為片劑，錠劑，錠劑，水性或油性懸浮液，可分散粉末或顆粒，乳劑，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。口服使用的組合物可根據各種已知的醫藥組合物製備方法加以製備，而此組合物可含有一種或多種如蔗糖，乳糖或糖精等甜味劑，如薄荷，冬青油或櫻桃等調味劑，著色劑和防腐劑以提供製藥上的美觀和口感。混合有活性成分與藥學上可接受無毒賦形劑的片劑也可藉由已知方法加以製造。可使用的賦形劑如：(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑和崩解劑，如玉米澱粉，馬鈴薯澱粉或海藻酸；(3)粘合劑，如黃蓍膠，玉米澱粉，明膠或阿拉伯膠，和(4)潤滑劑，如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。片劑可為未包衣，或可以藉由已知技術進行包衣以延遲胃腸道中的崩解與吸收，從而提供較長時間的持續作用。例如延時材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯均可採用，亦可藉由如美國專利案號4256108；4160452；及4,265,874所描述的技術包衣，以生成控制藥效釋放的滲透性治療片劑。

在某些情況下，口服使用的組合物可為硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。它們也可為軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質混合，例如花生油，液體石蠟或橄欖油。

本發明之組合物實施方式亦可為無菌注射用懸浮液的形式。此懸浮液可根據已知的方法使用適合的分散或濕潤劑和懸浮劑來配製。無菌注射用製劑亦可為無菌可注射溶液或懸浮液溶於無毒的腸道外可接受稀釋劑或溶劑中，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液。無菌的不揮發油通常用作溶劑或懸浮介質。為了這個目的，任何溫和的固定油都可以使用，包括合成的單或二甘油酯，脂肪酸(包括油酸)，天然存在的植物油如芝麻油，椰子油，花生油，棉籽油等，或合成的脂肪酸載體如油酸乙酯或類似物。緩衝劑，防腐劑，抗氧化劑等可以根據需要進行結合。

本發明之組合物實施方式亦可混合保溼劑(如：urea；PCA-Na)及基劑，以軟膏的形式塗抹於皮膚上。

圖1為安卓幸醇(Antrocinol)的化學結構圖。

圖2為安卓幸醇抑制肝癌細胞增殖的結果；圖2A顯示安卓幸醇對HCC細胞之毒性；圖2B顯示在Huh7細胞中，安卓幸醇作為抗增殖劑的作用優於索拉非尼(Sorafenib)和癌瑞格(Stivarga)；圖2C顯示安卓幸醇具有時間及劑量依賴性的特性抑制Huh7細胞增殖；圖2D顯示安卓幸醇劑量依賴性的下調細胞增殖和細胞週期相關的生物標記；圖2E及圖2F顯示安卓幸醇抑制Huh7細胞的細胞數及細胞群的形成；所有實驗結果均三重複並以平均值±標準差表示。

圖3係為了進一步了解安卓幸醇在具敏感性的細胞中增強的訊息傳遞路徑，參照圖3A，本發明比較最具敏感性的細胞(Huh7)和較不敏感的細胞(SNU387)之間的基因表現，兩種細胞的基因表現圖譜均來自cBioportal website，並使用基因集富集分析GSEA 4.0.3軟體(Broad Institute)進行分析，其結果如圖3B所示，KRAS/MAPK訊息傳遞路徑在Huh7 細胞中都顯著上調，RAS會與MAPK訊息傳遞路徑上游的蛋白質激酶受體結合並活化；圖3C及圖3D則顯示安卓幸醇可以顯著抑制Huh7細胞內KRAS/MAPK訊息傳遞路徑。值得注意的是，安卓幸醇係以劑量依賴性的方式顯著降低KRAS、ERK1/2和AKT的蛋白質表現以及活化(圖3E)。這些發現表明，安卓幸醇通過抑制KRAS及MAPK抗癌細胞增殖，為HCC治療提供新的選擇。

圖4說明安卓幸醇會誘導肝癌細胞凋亡；圖4A及圖4B顯示，膜聯蛋白A5(Annexin V)分析結果證明安卓幸醇以劑量依賴性方式促進Huh7細胞的凋亡；圖4C顯示隨著安卓幸醇的劑量增加，細胞凋亡的生物標記Caspase-3、Caspase-7、Bak和Bax增加；而抗凋亡的生物標記Bcl2和Bcl-xL的表現減少；圖4D顯示Bsx/Bcl2比率反映出細胞凋亡的情況；實驗結果均三重複並以平均值±標準差表示，*表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001；NS表示不具顯著性差異。

圖5為安卓幸醇抑制肝癌細胞的癌細胞幹性；圖5A顯示安卓幸醇可減少Huh7細胞球形腫瘤(Tumor sphere)的大小；圖5B之球形腫瘤的量化數值顯示安卓幸醇以劑量依賴性的方式顯著抑制腫瘤的大小；圖5C顯示安卓幸醇的抑制作用與癌幹細胞的蛋白標記的減少有關；實驗結果均三重複並以平均值±標準差表示。

圖6為安卓幸醇在小鼠體內抑制肝癌的腫瘤生成。圖6A顯示腫瘤負荷(tumor burden)與時間的關係曲線，對於帶有球形腫瘤的Huh7的小鼠進行不同的處理，與對照組和索拉非尼(Sorafenib)組相比之下，安卓幸醇處理顯著抑制腫瘤生長而，安卓幸醇+索拉非尼(Sorafenib)組合處理組效果最顯著，在所有組別中的腫瘤負荷最低；圖6B顯示平均體重與時間的關係曲線，結果顯示，所有小鼠的體重似乎都正常，沒有突然減少或增加，這表明所有處理均未引起細胞毒性；圖6C為免疫組織染色，結果顯示，與對照組相比，安卓幸醇和組合處理的組別均觀察到ERK和AKT表現減少，而BAX表現增加；圖6D為球形腫瘤細胞的形成能力比較，在無血清的條件下，比較所有組別中培養的腫瘤細胞數，結果顯示組合處理組顯示出最低的球形腫瘤形成能力，其次為安卓幸醇，*表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001；NS表示不具顯著性差異。

以下實驗例僅用於解釋本發明，但本發明的保護範圍並不僅限以下實施例，為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下：

實驗例一、安卓幸醇之製備

本發明之新的小分子安卓幸醇(Antrocinol；(3aS,4R,6aS,10aR)-4-(羥甲基)-7,7-二甲基十氫-1H-萘酚[1,8a-c]呋喃-1-酮)係依據先前文獻(Chem.Commun.,2016,52：12426-12429)所揭示的非對稱合成系列既定立體構型化合物的其中一個中間產物「安卓幸醇」的合成方法進行合成，其係在安卓幸(Antrocin)的第12號碳原子位置上加入羥基。

該安卓幸醇具有一下列之化學結構式：

實驗例二、安卓幸醇之生物活性分析

1、冷凍細胞之活化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡，細胞活化後，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其他蛋白質)。

冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰容器中取出，立即放入37℃水浴槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在3分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管的外部，移入無菌的細胞操作台內，取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入含有培養基之培養容器內(稀釋比例為1：10~1：15)，混合均勻，然後放入CO₂培養箱培養隔日後更換培養基。

2、人類癌症細胞之培養

人類HCC細胞株品系SNU387、Mahlavu、Hep3B、Huh7和J5等皆獲自美國菌種中心(American Type Culture Collection；ATCC；Manassas，美國VA)。

細胞培養在有含有10%胎牛血清(FBS)和1%盤尼西林/鏈黴素(Life Technologies公司的Invitrogen品牌，Carlsbad，美國CA)的RPMI 1640培養基中，並培養在37℃且5%濕度的二氧化碳培養箱，當細胞生長到95%匯集時則進行繼代，或每72小時更換培養基。

為了執行藥物的細胞毒性測定，在不同的持續時間將細胞處理不同濃度的安卓幸醇。

3、安卓幸醇對細胞毒性實驗(cytotoxicity)

於96孔盤中每孔接種3.5×10³個SNU387、Mahlavu、Hep3B、Huh7和J5細胞株細胞，培養24小時後，以不同濃度的安卓幸醇處理細胞，於處理後24或48小時，處理過的細胞用PBS洗滌，再用10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid；TCA)固定1小時，並用蒸餾水洗滌，並且將活細胞在室溫下孵育1小時於含0.4% SRB(w/v)的1%乙酸，藉由1%乙酸洗滌三次來除去未結合的染料並風乾96孔盤，再以10mM Trizma鹼(Trizma base)溶解附著的染料，並於96孔盤光譜測定儀中以570nm的波長讀取吸光值。

4、安卓幸醇之西方墨點法(Western blot)分析

使用Bio-Rad Mini-Protean系統(Bio-Rad Laboratories股份有限公司，Hercules，美國CA)將10μg蛋白質樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳並轉漬到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride；PVDF)膜上，藉由含聚山梨醇酯二十(Tween 20)的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝食鹽水(Tris-buffered saline；TBST)所配置的5%脫脂牛奶孵育膜1小時來封閉非特異性結合，然後用針對全部β-catenin(1：1000，Cell Signaling Technology 公司)、CDK2(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、CDK4(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、GSK-3(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、TCF1/TCF7(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、LEF1(1： 1000，Cell Signaling Technology公司)、p-Stat3(1：1000，Santa Cruz公司)、Stat3(1：1000，Santa Cruz公司)、KLF4(1：1000，Santa Cruz公司)、cMyc(1：1000，Santa Cruz公司)、Nanog,CD133,KLF4(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、Slug(1：1000，Cell Signaling Technology公司)和CD44、SOX2、GAPDH(1：500，Santa Cruz公司)等的一級抗體在4℃下隔夜作用。

用一級抗體隔夜探測後，以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)共軛的二級抗體孵育膜1小時，然後用PBS洗滌三次；使用增強的化學發光(ECL)偵測系統(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，Waltham，美國MA)來偵測和顯影蛋白條帶訊息，並使用ImageJ軟體定量蛋白條帶。

實施例三、安卓幸醇之動物試驗測定之結果

1、實驗動物

本發明所使用之免疫缺陷小鼠係由樂斯科生物科技股份公司購得(約4-6週大之NOD/SCID雌性小鼠)，在標準實驗動物無特定病原體條件下飼養，經馴養一週後，開始進行試驗。

2、動物實驗

將Huh7細胞以0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)作用3~5分鐘，使細胞呈懸浮狀態，加入含血清的培養基中和胰蛋白酶的作用，並以1000rpm、20℃、離心5分鐘，接著去除上清液，輕輕打散沉澱的細胞，再將細胞回溶於適當體積之培養液中均勻混合，取少許細胞液，以血球計數器進行細胞計數，將細胞稀釋成每毫升含10⁷個細胞之濃度，取約0.15毫升分裝至1.5毫升小離心管中。

在標準實驗動物無特定病原體條件下飼養來自樂斯科生物科技股份有限公司的6到8週齡雌性NOD/SCID小鼠(n=20)。NOD/SCID小鼠(5隻/處理4組)在0.5ml PBS中的0.5×10⁶個Huh7肝癌細胞，當腫瘤達到平均大小

150mm³時在第7到10天間開始處理。處理組1包括每週三次腹腔內(i.p)注射在0.5ml PBS中的5mg/kg安卓幸醇長達4週；處理組2包括每週三次腹腔內(i.p)注射在0.5ml PBS中的10mg/kg索拉非尼(Sorafenib)長達4週；處理組3包括每週三次腹腔內(i.p)注射5mg/kg安卓幸醇合併10mg/kg索拉非尼(Sorafenib)長達4週；而對照組處理組4包括每週三次腹腔內(i.p)注射注射PBS。

每週測量一次腫瘤大小，利用游標量尺測量腫瘤之最長徑和最短徑，為確保量測之準確度，實驗期間由同一人進行腫瘤大小的量測，最後，將小鼠犧牲，取其腫瘤組織，拍照存檔，再以福馬林固定。

腫瘤體積計算公式：

最長徑為a、最短徑為b；腫瘤大小=(a×b²)/2。腫瘤大小的變化以倍數計算製成圖表顯示。

腫瘤大小改變倍數(fold change in tumor volume)=腫瘤大小(N)/腫瘤大小(N-1)。

N為周數。

每週測量腫瘤生長兩次，並且使用公式計算腫瘤體積(v)：v=(寬度)2×長度/2，於最後一次安卓幸醇處理後再持續3週追蹤動物(即腫瘤接種後7週)，腫瘤小的小鼠則允許再持續追蹤8到12週，然後在處理組和對照組具有極度巨大腫瘤之下人道犧牲。

每項實驗進行腫瘤生長的評估並且使用第13版的Sigma plot(Stystat Software公司，美國CA)以學生t檢定確定統計分析，p<0.05被認為是統計上顯著的，所有實驗動物程序被批准並進行均按照機構的實驗動物照護及使用委員會/小組(IACUC/P)批准方案LAC-2015-0386。

結果

本發明之新的小分子安卓幸醇(Antrocinol)的化學結構如圖1所示。

本發明首次發現安卓幸醇在肝癌(HCC)中的抗癌能力，為了研究安卓幸醇對肝癌細胞增殖的影響，本發明對SNU387、Mahlavu、Hep3B、Huh7和J5等幾種肝癌細胞株進行磺胺多巴酚B(SRB)細胞存活率分析，如圖2A所示，安卓幸醇在該等細胞株中對應的最大半數抑制劑量(IC₅₀)分別為SNU387(5μM)、Mahlavu(4.9μM)、Hep3B(4.6μM)和J5(4.4μM)；值得注意的是，Huh7細胞株是對安卓幸醇最敏感的細胞，其IC₅₀為3.8μM。

此外，如圖2B所示，本發明發現安卓幸醇作為肝癌細胞或肝癌幹細胞的抗增殖劑的作用出乎意料地比「安卓幸；Antrocin」(IC₅₀：9μM)，「癌瑞格；Stivarga」(IC₅₀：11μM)和「索拉非尼；Sorafenib」(IC₅₀：12.5μM)都來的好，且圖2C的結果也證明，安卓幸醇具有時間及劑量依賴性的特性抑制Huh7細胞增殖。

鑒於圖2B的結果證實了安卓幸醇顯著比臨床上使用之多重激酶抑制劑癌瑞格(Stivarga)和索拉非尼(Sorafenib)更有效地抑制HCC細胞的存活率(viability)和增殖能力(proliferation)。本發明進一步透過西方墨點法評估細胞週期的相關生物標記以證實安卓幸醇的抗增殖作用，參照圖2D，在Huh7細胞株中，安卓幸醇的抗增殖作用與CDK2、CDK4、Ki67和Cyclin D等生物標記的減少呈劑量正相關性；在功能性研究方面，如圖2E及圖2F顯示，安卓幸醇以劑量依賴性地減少細胞數及細胞聚落形成。

為了進一步了解安卓幸醇在具敏感性的細胞中增強的訊息傳遞路徑，參照圖3A，本發明比較最具敏感性的細胞(Huh7)和較不敏感的細胞(SNU387)之間的基因表現，兩種細胞的基因表現圖譜均來自cBioportal website，並使用基因集富集分析GSEA 4.0.3軟體(Broad Institute)進行分析，其結果顯示，KRAS/MAPK訊息傳遞路徑在Huh7細胞中都顯著上調(圖3B)，RAS會與MAPK訊息傳遞路徑上游的蛋白質激酶受體結合並活化。安卓幸醇可以顯著抑制Huh7細胞內KRAS/MAPK訊息傳遞路徑(圖3C及圖3D)。

最近的研究發現MAPK訊息傳遞路徑的下調能夠抑制HCC細胞的增殖和生長，因此本發明認為安卓幸醇可能是透過抑制MAPK訊息傳遞路徑，而產生抗增殖的能力。

為提供安卓幸醇對MAPK訊息傳遞路徑抑制作用的證據，我們對MAPK訊息傳遞路徑下游的ERK1/2和AKT進行評估，值得注意的是，安卓幸醇係以劑量依賴性的方式顯著降低ERK1/2和AKT的蛋白質表現以及活化(圖3E)。這些發現表明，安卓幸醇通過抑制MAPK抗癌細胞增殖，為HCC治療提供新的選擇。

MAPK訊息傳遞路徑是進化保守的激酶，用以調節基本生物學過程，包括細胞的存活與凋亡，為了探討安卓幸醇的處理在HCC細胞中是否能誘導細胞凋亡，於一實施方式中，本發明分別用不同劑量的安卓幸醇(0μM、5μM、10μM、20μM及40μM)處理Huh7細胞，並使用細胞凋亡分析評估細胞凋亡率並以西方墨點法分析細胞凋亡的相關蛋白質標記變化。

與對照組相比，參照圖4A及圖4B，經過安卓幸醇處理的組別有更多的凋亡細胞，將安卓幸醇劑量從5μM增加到40μM會顯著增加早期和晚期細胞凋亡；西方墨點法分析的結果顯示，安卓幸醇以劑量依賴的方式活化caspase-3和caspase-7促進Huh7細胞的凋亡，而隨著安卓幸醇劑量從5μM增加到40μM，抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xL表現皆顯著下降，與對照組相比，安卓幸醇的處理顯著增加促凋亡蛋白Bax和Bak的表現(圖4C)，增加安卓幸醇劑量後，Bax/Bcl2的比例明顯增加(圖4D)，這些發現顯示安卓幸醇可能通過抑制MAPK訊息傳遞路徑以誘導細胞凋亡。

肝癌幹細胞(liver cancer stem cell,LCSCs)是一群具有自我新生(self-renewal)和分化能力(differentiation)的細胞，其特徵在於EpCAM，CD44，CD133，CD90和CD13的高度表現，在HCC中，MAPK的活化促進癌症幹性的表現。

為了提供安卓幸醇通過下調MAPK抑制肝癌幹細胞的證據，我們用不同劑量的安卓幸醇處理Huh7細胞，並進行類癌幹細胞培養和評估LCSCs的蛋白質標記表現。

在一實施方式中，如圖5A及圖5B所示，我們發現所有劑量的安卓幸醇處理後(5μM、10μM、20μM及40μM)均顯著抑制了Huh7球形腫瘤的大小，此發現提供安卓幸醇降低LCSCs表型的第一個證據；在Huh7 細胞中，參照圖5C，與對照組相比，安卓幸醇以劑量依賴性的方式抑制Nanog、CD133、KLF4、CD44、OCT4、SOX2和cMyc等蛋白質的表現，針對HCC細胞，該數據表明安卓幸醇可能為靶向治療LCSCs提供新的選擇。

圖6A顯示對於帶有球形腫瘤的Huh7的小鼠進行不同的處理的結果，與對照組和索拉非尼(Sorafenib)組相比之下，安卓幸醇處理組顯著抑制腫瘤的生長，雖然索拉非尼(Sorafenib)的處理也顯示出一定程度的抑制作用，但抑制作用較安卓幸醇組差，而在安卓幸醇+索拉非尼(Sorafenib)的組合處理組可以觀察到最佳的延遲腫瘤生長效果，值得注意的是，本發明中使用的所有處理方案均未導致小鼠的體重明顯減輕(圖6B)，這表明在整個實驗過程中，所有處理對動物均無細胞毒性。

腫瘤樣品的免疫組織染色(immunohistochemical；IHC)與體外觀察結果一致，如圖6C所示，安卓幸醇的處理使AKT和ERK蛋白質表現降低，BAX升高，而安卓幸醇+索拉非尼(Sorafenib)的組合處理組對腫瘤樣品的影響更為明顯，更重要的是，與控制組和索拉非尼(Sorafenib)組相比，安卓幸醇處理和安卓幸醇+索拉非尼(Sorafenib)組合處理組的小鼠的球形腫瘤形成的數量顯著減少。

前述各實施方式所呈現的結果，安卓幸醇比癌瑞格(Stivarga)甚至索拉非尼(Sorafenib)更能有效地抑制Huh7細胞生長，且Huh7細胞中的ERK/AKT蛋白訊息傳遞路徑是安卓幸醇處理後基因表現變化最大的路徑，證實安卓幸醇可顯著抑制AKT、p-AKT、ERK1/2和p-ERK1/2的表現；球形腫瘤分析的結果顯示，安卓幸醇的處理顯著抑制Huh7細胞的球形腫瘤形成及顯著抑制Huh7細胞中的腫瘤幹細胞生物標記(包括 CD133、KLF4、CD44、OCT4、SOX2及c-MYC)的表現。

此外，單獨使用安卓幸醇能顯著抑制植入Huh7類癌幹細胞(cancer stem-like cells)小鼠的腫瘤生長，且組合使用安卓幸醇及索拉非尼(Sorafenib)顯示出抑制腫瘤的協同增效作用，證明安卓幸醇能夠增強索拉非尼(Sorafenib)的效果，在腫瘤樣本免疫組織染色分析的結果顯示，組合使用安卓幸醇及索拉非尼(Sorafenib)的組別中，其ERK和AKT的表現量降低且BAX的表現量增加；在球形腫瘤形成分析中，安卓幸醇及索拉非尼(Sorafenib)組合能最有效抑制球形腫瘤形成能力。

綜合以上結果，本發明是第一個提出安卓幸醇對肝細胞癌(HCC)抗癌能力的發明，並證明了安卓幸醇比索拉非尼(Sorafenib)更能有效抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞的生長，對於以索拉非尼(Sorafenib)治療效果不佳或具抗藥性(resistant)的肝癌患者而言，安卓幸醇可能成為新的替代藥物。

Claims

一種組合物用於製備抑制肝癌細胞或肝癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式(I)化合物：

或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。
如請求項1所述之用途，其中該組合物進一步包括一藥學上可接受之鹽類或載體。
如請求項1所述之用途，其中該藥物係用於治療或預防肝癌細胞的轉移或復發之藥物。
如請求項1所述之用途，其中該有效量為於人體給予0.08mg/kgBW~0.8mg/kgBW之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。
如請求項1所述之用途，其中該有效量為於人體給予0.24mg/kgBW~0.64mg/kgBW之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。
如請求項1所述之用途，其中該有效量為於人體給予0.4mg/kgBW之該式(I)化合物或其互變異構形式、其立體異構物、其消旋物、其代謝物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物。
如請求項1所述之用途，其中該藥物係以口服、吸劑或針劑方式給予。