TW202208843A - 鑑定抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法,其中該方法為當一含菌檢體透過基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜法(MALDI-TOF MS)分析得到的一質譜圖,其中該質譜圖中存在一質荷比位置為6580至6600範圍的波峰訊號時,則確認該檢體存在具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌。同時,本發明亦提供一種可用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的胜肽生物標記及其方法,其中該胜肽生物標記係包含以下胺基酸序列所構成的胜肽:GQQDKVIGKAKEVVE(SEQ NO ID:5)。
Description
本發明涉及一鑑定耐甲氧西林金黃色葡萄球(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法,尤其是透過一胜肽生物標記用來區分耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法。
根據2000年至2015年的統計結果顯示有76個國家的每年使用抗生素劑量,從原本使用211億劑的抗生素上升到348億劑抗生素,顯示出這15年間使用抗生素的比率大幅上升了65%。同時,在2015年中全球人類使用的抗生素劑量已達420億劑並且預估至2030年時每日使用抗生素的劑量將成長200%,而來到每日1280億劑。而統計臨床結果顯示出抗生素的濫用主要發生在使用錯誤劑量(19.9%)、使用錯誤頻率(18.9%)以及重複治療(18.1%),其中錯誤劑量與重複治療可能是對抗藥細菌使用無效抗生素。
細菌的抗藥性機制是由抗藥性基因所控制,抗藥基因有些是細菌先天具備的,有些則是經由質體或跳躍子傳遞給其他細菌而產生。由於在抗生素環境中,不具抗藥的細菌將會被淘汰,而生存下來的就是具有抗藥性的細菌。換言之,抗生素的濫用會造成抗藥性細菌越來越多,此現象特別在抗生素大量使用的地區中可以觀察到具有抗藥性細菌的比例明顯的增加,例如:抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistance Staphylococcus
aureus,MRSA)是一種對甲氧苯青黴素(Methicillin)及其他類似的抗生素產生抗藥性的特殊細菌,該細菌感染力極高,故被歸類為超級細菌之一。
金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)為孢桿菌屬和葡萄球菌科細菌,可以在人的呼吸道和皮膚上發現,一般情況不會產生病徵,但是該病菌偶爾會引起疾病,包括皮膚、傷口、尿道、肺部、血液感染和食物中毒。抗生素能有效治癒大部分金黃葡萄球菌感染,但是耐藥性金黃葡萄球菌是一種對甲氧西林抗生素產生耐藥性的細菌株,常常同時存在著對常用的抗生素,如:苯唑西林、青霉素、阿莫西林和頭孢菌素等產生耐藥性。因此,快速且精準地診斷抗藥性的金黃色葡萄球菌對於後續的抗生素使用是迫切需要且極為重要。
微生物感染的診斷與治療與癌症截然不同,各類臨床檢驗檢查結果的綜合研判以及臨床數據的整合的即時性是很重要的,常見的感染疾病,如:敗血症、腦膜炎、肺炎、尿道感染等皆是以急性症狀表現於臨床上,因此,需要在最短的時間內正確診斷出感染症的病原體以及確定其抗生素抗藥性表現。臨床上,當病人出現發燒及其他發炎反應等指標時,顯示出該病人具有感染的可能性時,常會進行微生物的培養並同時進行抗生素的經驗性療法,用以控制病人感染的狀況。進一步,透過微生物的鑑定與抗生素敏感性試驗的結果,除了可提供作為臨床上合理使用抗生素的依據促使正確使用抗生素而提高患者存活率或儘早出院,同時,亦減少抗生素的濫用而造成醫療費用浪費以及與環境遭受抗生素的污染與破壞。
臨床診斷感染的黃金標準主要依據實驗室的微生物培養與鑑定的結果。現行的流程為接收到檢體後,將處理後的檢體接種到適合的培養
基進行隔夜培養,之後仍需額外的24小時來進行傳統生化鑑定來判斷菌種的種類,同時進行抗生素藥物感受性測試,因此,完整的微生物培養鑑定報告需耗費3-5天。為了加速細菌鑑定的流程,目前國內外許多醫學中心均採用基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜法(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)來執行細菌鑑定以及搭配藥物感受性測試(試驗時間約24小時)才能得知細菌是否對特定抗生素具有抗藥性。
針對MRSA的鑑定方法包含了聚合酶鏈鎖反應以及基因定序法,透過已知的抗藥性基因來鑑定細菌是否具有抗藥性,然而與使用MALDI-TOF MS相較之下,基因定序法費用較高、操作人員訓練要求相對高以及操作時間也相對長,因此,在臨床微生物鑑定流程仍是以MALDI-TOF MS為主流。先前已有許多以MALDI-TOF MS作為MRSA鑑定的相關技術揭露,在過去相關技術揭露主要都是以已知的菌種(包含:抗藥性或藥敏性的金黃色葡萄球菌的質譜圖譜進行分析比較而找到用以識別MRSA的生物標記,目前許多商用軟體提供透過一質譜儀分析所得到的質譜圖譜可以直接鑑定菌種或是進一步預測是否為抗藥性菌株。然而,此一預測結果往往與實際上臨床病人所得到的臨床檢驗結果不盡相同。因此,尋找更準確且更符合臨床上診斷MRSA的生物標記用以診斷病人的感染以及後續的抗生素治療是迫切需要的。
非本文另外定義,否則本公開中採用的科學和技術術語應具有本
領域普通技術人員通常理解和使用的含義。另外,除非上下文另外要求,否則應理解單數術語應包括相同的複數形式,而複數術語應包括單數。具體地,如本文和權利要求書中所使用的單數形式“一個”和“一種”包括複數形式,除非上下文另外明確指出。
儘管闡述本發明的廣泛範圍的數值範圍和參數是近似值,但是在具體實施例中闡述的數值被盡可能精確地報導。但是,任何數值都內涵了某些誤差,這些誤差必定是由各個測試測量中的標準偏差引起的。同樣,如本文所用,術語“約”是指當由本領域普通技術人員考慮時在平均值的可接受的標準誤差內。除了在操作/工作示例中,或者除非另有明確說明,否則本文所公開的所有數值範圍、數量、值和百分比均應理解為在所有情況下均由術語“約”所描述。因此,除非有相反的指示,否則本公開和所附權利要求書中闡述的數值參數是可以根據期望變化的近似值。至少,每個數值參數至少應該根據報告的有效數字的數量並通過應用普通的捨入技術來解釋。
本發明提供一種用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法,包含:(a)提供一含菌檢體;(b)將該含菌檢體放置在一MALDI-TOF質譜儀靶板上,獲得一質譜圖;以及(c)當該質譜圖中存在一質荷比位置為6580至6600範圍的波峰訊號時,則確認該檢體存在具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌。
本發明方法之步驟(a)中,該含菌檢體可為一體液或由組織而取得生物檢體;其中該體液可選自血液、血清、唾液、消化液、淚液、汗液、尿液、及前述之組合;其中該組織可選自傷口組織、上皮組織或肌肉組織
等。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,在另一實施例中,該質荷比位置為6586至6600的範圍;在一較佳實施例中,該質荷比位置為6590至6600的範圍;在一更佳實施例中,該質荷比位置為6590至6593的範圍。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該質荷比位置為6580至6600的範圍為一含有SEQ NO ID:5胺基酸序列所組成之胜肽。
在一實施例中,本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該質荷比位置進一步包含一第二質荷比。
在另一實施例中,本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該質荷比位置進一步包含一第二質荷比和一第三質荷比。
在一較佳實施例中,本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該質荷比位置進一步包含一第二質荷比、一第三質荷比和一第四質荷比。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該第二質荷比範圍為3030至3050;在一較佳實施例中,該質荷比位置為3030至3040的範圍;在一更佳實施例中,該質荷比位置為3033至3034的範圍。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該第三質荷比範圍為3760至3770;在一較佳實施例中,該質荷比
位置為3762至3763的範圍。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該第四質荷比範圍為6540至6560;在一較佳實施例中,該質荷比位置為6050至6560的範圍;在一更佳實施例中,該質荷比位置為6543至6546的範圍。
本發明用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法中,其中該第二質荷比的訊號強度高於一甲氧西林敏感性之金黃色葡萄球菌所獲得之質譜圖的相同質荷比位置的訊號;其中該第三質荷比的訊號低於一甲氧西林敏感性之金黃色葡萄球菌所獲得之質譜圖的相同質荷比位置的訊號。
本發明亦提供一種可用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的胜肽生物標記及其方法,其中該胜肽生物標記係包含以下胺基酸序列所構成的胜肽:GQQDKVIGKAKEVVE(SEQ NO ID:5)。
本發明亦提供一種用於鑑定甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法,包含:(a)提供一含菌檢體;以及(b)檢測該檢體是否含有一含有SEQ NO ID:5所示之胺基酸序列所構成的胜肽,若該檢體含有該胜肽則確認該檢體存在具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌。
本發明方法之步驟(a)中,該含菌檢體可為一體液或由組織而取得生物檢體;其中該體液可選自血液、血清、唾液、消化液、淚液、汗液、尿液、及前述之組合;其中該組織可選自傷口組織、上皮組織或肌肉組織等。
本發明之用於偵測該胜肽生物標記的方法,其中本領域之一般通
常知識者透過本發明揭示的內容可視需要選用適宜的胺基酸序列檢測方法,以檢測待測檢體是否含有一由SEQ NO ID:5所示之胺基酸序列所構成的胜肽,其中該檢測的方法可採用基質輔助雷射脫附離子化飛行時間式質譜(MALDI-TOF MS)分析、液相層析電灑游離法質譜(LC-ESI-MS)分析、液相層析串聯質譜(LC-MS/MS)分析、氣相層析質譜(GS/MS)分析、高效液相層析(HPLC)法、超高效液相層析(UPLC)法、及前述之組合。本發明之一較佳實施例中,該檢測的方法係使用基質輔助雷射脫附離子化飛行時間式質譜(MALDI-TOF MS)進行檢測分析。
[圖1A]係微生物進行MALDI-TOF MS分析所得到的質譜圖譜的示意圖(非為本次實施內容),X軸為質荷比(mass-to-charge ratio,m/z),Y軸為訊號強度(任意單位,a.u.)。
[圖1B]係微生物進行藥物感受性測試檢驗的報告內容,作為判定該菌種對抗生素的綜合情況。
[圖2]係MRSA以及MSSA檢體進行MOTIF-TOF MS的質譜圖譜,其中圖2A為質荷比從2200至2690,圖2B為荷質比從2400至2480,P1和P2則為MRSA與MSSA圖譜中有顯著差異之處,其中P1的質荷比約為2412至2413的範圍,P2的質荷比約為2450。
[圖3]係MRSA以及MSSA檢體進行MOTIF-TOF MS的質譜圖譜,其中圖3A為質荷比從2700至3290,圖3B為質荷比從2850至2940,圖3C為質荷比從2970
至3070,P3、P4和P5則為MRSA與MSSA圖譜中有顯著差異之處,其中P3的質荷比約為2880、P4的質荷比約為3005、P5的質荷比約為3035至3050的範圍。
[圖4]係MRSA以及MSSA檢體進行MOTIF-TOF MS的質譜圖譜,其中圖4A為質荷比從3500至3990,圖4B為質荷比從3730至3830,P6則為MRSA與MSSA圖譜中有顯著差異之處,P6的質荷比約為3762至3763的範圍。
[圖5]係MRSA以及MSSA檢體進行MOTIF-TOF MS的質譜圖譜,其中圖5A為質荷比從6350至6840,圖5B為質荷比從6530至6640,P7、P8和P9則為MRSA與MSSA圖譜中有顯著差異之處,其中P7的質荷比約為6570、P8的質荷比約為6590至6593的範圍,以及P9的質荷比約為6540至6560的範圍。
[圖6]係質譜的虛擬凝膠(pseudo-gel)圖,其中X軸為質荷比,左側Y軸為MRSA或是MSSA的菌株編號,右側Y軸的彩色色階顯示出質譜儀偵測出的訊號強度,結果顯示出質荷比為6590-6600的訊號主要出現在MRSA圖中(下圖),而未在MSSA圖中(上圖)。
[圖7]係以SHAP分析的結果摘要圖,X軸為SHAP(SHapley Additive exPlanation)數值,主要作為判斷一特徵對於一模型輸出的影響;右側Y軸顯示為特徵值(feature value),左側Y軸質荷比數值作為每一特徵進行分析,SHAP數值主要用於評估每一特徵間的重要性。
[圖8]係使用4種質荷比作為特徵組合進行分辨具抗藥性的MRSA與不具抗藥性的MSSA分類的ROC曲線。
[圖9]係MRSA64和MSSA4樣本以C4色譜柱分餾後進行質譜偵測後的質譜
圖,分別為第5段分餾部分、第7段分餾部分、第8段分餾部分以及第9段分餾部分的質譜圖,其中X軸顯示為質荷比為0-12000的圖譜訊號。
[圖10]係MRSA64和MSSA4樣本以C4色譜柱分餾後進行質譜偵測後的質譜圖,分別為第5段分餾部分、第7段分餾部分、第8段分餾部分以及第9段分餾部分的質譜圖,其中X軸顯示為質荷比為6400-6800的範圍。
[圖11]係MRSA64中質荷比為6593.2中胜肽片段進行蛋白質鑑定分析結果。
[圖12]係MSSA6中質荷比為6550中的胜肽片段蛋白質鑑定分析結果。
本發明可以以許多不同的形式實現,並且不應被解釋為限於在此闡述的示例。所描述的示例不限於權利要求中所描述的本發明的範圍。
實例一、資料庫的建立和分析
臨床檢體來源:使用驗證資料為中國醫學大學附設醫院所蒐集的包含MRSA與MSSA回溯性微生物檢驗資料(IRB編號:CMUH109-REC3-098),包含Class0為MSSA以及Class1為MRSA的資料(總共包含一萬筆以上的資料),其中資料庫內的MALDI-TOF的檢測結果是依據MRSA或是MSSA的蛋白質圖譜與儀器資料庫的比對所得到,在每次臨床檢測時會留存每個菌株的蛋白質圖譜與該菌株的蛋白質的質量紀錄(如圖1A示意圖),配合後續抗生素敏感測試結果(如圖1B示意圖),即可作為區分MRSA或是MSSA的資料庫建立,進一步進行圖譜差異化的分析比較。
微生物鑑定質譜儀(Bruker MALDI Biotyper)操作:
1.檢體的製備
(1)菌體直接塗抹樣品的製備方法:
使用乾淨牙籤沾取欲鑑定新鮮微生物菌落(培養時間為24至48小時之間),直接薄薄塗抹一層檢體於乾淨的MALDI樣品盤上。風乾後,於MALDI樣品盤上之菌體加上1μL的70%甲酸(Fomic acid,FA),於室溫下風乾,於MALDI樣品盤上之菌體加上1μL的2-氰基-3-(4-羥苯基)丙烯酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA))基質溶液,於室溫下風乾,確實風乾後的樣品,則可送入MALDI-TOF質譜儀進行分析與菌種鑑定。
(2)菌體先以甲酸(fomic acid,FA)萃取的樣品製備方法:
取約單一菌落或5至10mg的菌量置入含有300μL的純水的1.5mL微量離心管,使得菌體充分散開、均質化於水中後,加入900μL無水酒精且充分混合均勻,在此步驟條件下,可於-18℃保存至多6個月,於室溫下可保存數天,適用於樣品寄送。接著以轉速15,000g進行離心2分鐘,除去上清液後,再次以轉速15000g進行第二次2分鐘的離心,再將剩餘的上清液盡量去除並風乾約數分鐘。接著,加入25μL 70%甲酸,此加入的70%甲酸可以根據菌量不同,調整其加入的量(加入的範圍可以在1-80μL之間)。接著利用微量吸管重複吸放或使用震盪使菌體充分散開、均質化。待充分混合後,加入與70% FA溶液相同體積的HCCA並以震盪使其混合均勻。混合均於後於最高速15000g離心2分鐘,取1μL上清液,置於MALDI樣品盤上,於室溫下風乾,風乾後的樣品,加入1μL的HCCA基質溶液,確實風乾後的樣品,便可送入MALDI-TOF質譜儀進行分析與菌種鑑定。
2.使用質譜儀透過MALDI-TOF MS分析,經過雷射脈衝施打於樣品上而得到MRSA或是MSSA菌株圖譜。在線性模式下(linear mod),質
譜偵測質量範圍為1000至10000質荷比,而在反射模式下(reflector mod)下,質譜偵測質量範圍為1000至4000質荷比。
2.以microflex LT儀器軟體進行分析
3.自MALDI Biotyper Realtime Classification(RTC)檢視鑑定結果
結果:圖1A為微生物進行MALDI-TOF MS分析所得到的質譜圖譜的示意圖(非為本次實施內容),圖譜顯示的波峰主要作為區分MRSA和MSSA分析,圖1B為微生物進行藥物感受性測試檢驗的報告內容,作為判定該菌種對抗生素的綜合情況,其中內容含有細菌名稱、藥物敏感性測試結果(Sensitive,S:敏感/有效;Resistant,有抗藥性/無效;the minimum inhibitory concentration,MIC:最低抑菌濃度)、格蘭氏染色分類以及細菌型態。
將MRSA和MSSA兩類的質譜圖進行分析,得到一平均的強度的質譜圖接著進型比對分析,其中圖中以箭頭指出波峰處代表MRSA和MSSA不同訊號的地方(Peak,P),分別標示出P1-P9。結果詳述如下:圖2A為質荷比從2200至2690,圖2B為荷質比從2400至2480,其中P1的質荷比約為2412至2413的範圍,P2的質荷比約為2450。圖3A為質荷比從2700至3290,圖3B為質荷比從2850至2940,圖3C為質荷比從2970至3070,其中P3的質荷比約為2880、P4的質荷比約為3005、P5的質荷比約為3035至3050的範圍。圖4A為質荷比從3500至3990,圖4B為質荷比從3730至3830,P6的質荷比約為3762至3763的範圍。圖5A為質荷比從6350至6840,圖5B為質荷比從6530至6640,其中P7的質荷比約為6570、P8的質荷比約為6590至6593的範圍以及P9的質荷比約為6540至6560的範圍。
實施例二、辨識MRSA和MSSA的重要質量生物標記以及其組合
從圖2-圖5中的所有的MRSA和MSSA所有樣本進行平均找出的不同的質荷比的生物特徵,為了找出用以辨識MRSA的重要生物標誌組合,因此,本發明進一步透過機器學習和深度學習演算法,進行重要的特徵學習和搜尋。
SHAP(SHapley Additive exPlanation)數值主要用於評估特徵間的重要性。由於胜肽片段會行跨一段電荷質量範圍,透過將每10Da做平均將能更有效觀察電荷質量區間差異。利用圖7的SHAP摘要圖顯示出質荷比為6590-6600區間(D6590)最為重要,其次為3030-3040(D3030)、4640-4650(D4640)、3760-3770(D3760)以及7420-7430(D7420)。而特徵值(Feature value)表示該質量區間的數值,以質荷比為6590-6600為例(D6590),當該區間平均質量越大(即特徵值越高),為抗藥性金黃葡萄球菌的可能性越高。而質荷比為7420-7430則是當該區域平均質量越小(即特徵值越低),則為抗藥性金黃葡萄球菌的可能性越高。因此,以生物的角度來解釋即為荷質比為6590、3030和4640的胜肽表現量上升,而荷質比3760和7420的胜肽表現則降低。
由圖5和圖7的結果皆可得出辨識MRSA最重要的質荷比為6591±5m/z,為了更確定預測出來的結果是否符合實際樣本中的表現情況,因此圖6為質譜的虛擬凝膠圖,其中X軸為質荷比,左側Y軸為MRSA或是MSSA的菌株編號,右側Y軸的彩色色階顯示出質譜儀偵測出的訊號強度,結果顯示出質荷比為6590-6600的訊號主要出現在MRSA圖中(圖6,下圖,以方框所表示的訊號),而未在MSSA圖中(圖6,上圖)。因此,
荷質比6591±5m/z的胜肽可作為辨識MRSA的重要生物標誌。
進一步,將4種特徵組合製作出接收者操作特徵(Receiver operating characteristic curve,ROC)曲線並且取得AUC(area under the curve)數值進行MRSA抗藥性分類預測,一般而言,若AUC為0.7-0.9之間則為準確性高的檢驗方法,AUC數值常被用來評估試驗的診斷價值,若數值越高則診斷價值就越高。圖8結果顯示了4種質荷比的生物特徵組合,其中包括:質荷比為3033±3m/z、3762±3m/z、6551±5m/z和6591±5m/z以機器學習模型LGBMClassifier進行分析所得到ROC曲線下的AUC平均為0.9,其中Class 1為MRSA族群、Class 0為MSSA族群、巨集平均(macro-average)ROC曲線是先對每一類統計指標值然後推算所有類求算術平均;而微平均(micro-average)ROC曲線則是對數據集中每一個實例不分類進行統計建立全局混淆矩陣,然後計算其平均;然而,在這兩指標在只有兩類別時是完全一樣的。另外,若以商業軟體(ClinProTools)對單一質譜圖譜中進行MRSA細菌抗藥性分類預測,當分別輸入MRSA/MSSA兩組進行組間比較挑選出一訊號(peak)後進行組間檢定,其中針對單一peak進行檢定,透過ROC分析得到最好的AUC會比4種特徵組合的數值來的低。
實施例三、鑑定用以辨識MRSA和MSSA的重要生物標誌的胜肽序列
進一步利用蛋白質分析鑑定出可分區分MRSA和MSSA的胜肽片段。首先,欲分析的MRSA(樣品編號為MRSA64)和MSSA(樣品編號為MSSA4)的樣本先通過液相層析管柱進行分選(C4 column fractionation)得到的各個分餾部分以MALDI-TOF MS分析而得到質譜圖譜,將質譜圖譜中欲分析的質荷比的波峰分離後進行蛋白質水解,最後將水解號的蛋白質片
段以液相層析串聯質譜儀(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)進行胜肽片段的序列的鑑定,每個MS/MS質譜圖均由DataAnalysis 4.4軟件(Bruker)處理,以生成離子質量清單。每一肽段的鑑定是通過在Mascot Mascot 2.6伺服器中輸入質量清單來完成,進一步根據其蛋白質數據庫進行搜索與確認,因此,胺基酸序列的分析以及資料庫的比對找出該分析的蛋白質身分。
本發明中圖9和圖10為MRSA64和MSSA4樣本以C4色譜柱進行液相層析進行分餾(C4 column fractionation)和MALDI-TOF MS分析,其中圖譜分別顯示出經過分餾後第5、7、8以及9區段的質譜圖,而圖9為質荷比為1000-12000的質譜圖譜訊號,圖10為質荷比為6440-6750的質譜圖譜訊號。從圖10結果中比較MRSA64和MSSA4的質譜圖譜可觀察到在第5段分餾部分中MSSA4在荷質比為6550有訊號,然而在MRSSA中則無;相反地,在第7段分餾部分中MRSA64中增加了荷質比為6593.2的訊號,而MSSA4則無。
圖11為MRSA64樣本中的質荷比為6593.2中胜肽片段蛋白質鑑定分析結果,圖12為MSSA4樣本中的質荷比為6550中的胜肽片段蛋白質鑑定分析結果。其中圖11A和12A分別為MRSA64和MSSA4的胜肽片段透過胰蛋白質與Glu-C水解酶水解後的胜肽片段清單進行比對排列(peptide mapping)。
將MRSA64圖譜荷質比為6593.2和MSSA4圖譜荷質比為6550的胜肽片段的胺基酸序列分別列於表一和表二。
在MRSA64中第7段分餾部分所偵測到的波峰訊號為6593.2,而透過蛋白質鑑定得知此蛋白質為Q5HFD7(Y1680_STAAC)UPF0337 protein SACOL168(SACOL1680)或Q2FGA1(Y1582_STAA3)UPF0337 protein SAUSA300_1582(SAUSA300_1582),其中該蛋白質的平均中性質量(average neutral mass)為6722.53m/z,當降解第一個胺基酸Met時,因此在質譜偵測質量為6591.48m/z,即為6722.5m/z-131m/z〔149Da-18Da(結合時脫水)=131Da〕。另外,在MSSA4中第5段分餾部分所偵測到的波峰訊號為6551,而透過蛋白質鑑定得知此蛋白質為Q7A593(Y1452_STAAN)UPF0337 protein SA1452,其中該蛋白質的平均中性質量(average neutral mass)為6682.46m/z,當降解第一個胺基酸Met,因此在質譜偵測質量為6551.48m/z,即為6682.46m/z-131m/z〔149Da-18Da(結合時脫水)=131Da〕。
圖11B和圖12B得知MRSA和MSSA的序列差異在於MRSA為GQQDKVIGKAKEVVE(SEQ NO ID:5),MSSA為GQQDKATGKAKEVVE(SEQ NO ID:6),因此,胜肽序列GQQDKVIGKA KEVVE(SEQ NO ID:5)可作為作為鑑別MRAS和MSSA的胜肽生物標記。
表三列出本發明中用以區分MRSA和MSSA中重要的質荷比的胜肽標誌,可用來預測是否樣本含有MRSA,可作為臨床上準確且快速的判斷
標準。
<110> 中國醫藥大學附設醫院
<120> 鑑定抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法
<150> US 63/071,392
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 60
<212> 蛋白質
<213> 金黃色葡萄球菌
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<212> 蛋白質
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 2
<210> 3
<211> 60
<212> 蛋白質
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 3
<210> 4
<211> 59
<212> 蛋白質
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 4
<210> 5
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<212> 蛋白質
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
<210> 6
<211> 15
<212> 蛋白質
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 6
Claims (14)
- 一種用於鑑定具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法,包含:(a)提供一含菌檢體;(b)將該含菌檢體放置在一MALDI-TOF質譜儀靶板上,獲得一質譜圖;以及(c)當該質譜圖中存在一質荷比位置為6580至6600範圍的波峰訊號時,則確認該檢體存在具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌。
- 如請求項1的方法,其中該含菌檢體係一體液或一組織。
- 如請求項2的方法,其中該體液可選自血液、血清、唾液、消化液、淚液、汗液、尿液、及前述之組合。
- 如請求項1的方法,其中該質荷比位置為一含有SEQ NO ID:5胺基酸序列所組成之胜肽。
- 如請求項1的方法,其中該質荷比位置進一步包含一第二質荷比,其中該第二質荷比位置範圍為3030至3050。
- 如請求項5的方法,其中該質荷比位置進一步包含一第三質荷比,其中該第三質荷比位置範圍為3760-3770。
- 如請求項6的方法,其中該質荷比位置進一步包含一第四質荷比,其中該第四質荷比位質範圍為6540-6560。
- 如請求項5的方法,其中該第二質荷比的訊號強度高於一具甲氧西林敏感性之金黃色葡萄球菌所獲得之質譜圖的相同質荷比位置的訊號。
- 如請求項6的方法,其中該第三質荷比的訊號強度低於一具甲氧西林敏感性之金黃色葡萄球菌之質譜圖的相同質荷比位置的訊號。
- 一種可用於鑑定甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的一胜肽生物標記,其中該胜肽生物標記為一含有以下胺基序列所構成之胜肽:GQQDKVIGKAKEVVE(SEQ NO ID:5)。
- 一種用於鑑定甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌的方法,包含:(a)提供一含菌檢體;以及(b)檢測該檢體是否含有一含有SEQ NO ID:5所示之胺基酸序列所構成的胜肽,若該檢體含有該胜肽則確認該檢體存在具甲氧西林抗藥性之金黃色葡萄球菌。
- 如請求項10的方法,其中該含菌檢體係一體液或一組織。
- 如請求項11的方法,其中該體液可選自血液、血清、唾液、消化液、淚液、汗液、尿液、及前述之組合。
- 如請求項10的方法,其中該胜肽係利用選自以下群組之方法進行檢測:基質輔助雷射脫附離子化飛行時間式質譜(MALDI-TOF MS)分析、液相層析電灑游離法質譜(LC-ESI-MS)分析、液相層析串聯質譜(LC-MS/MS)分析、氣相層析質譜(GS/MS)分析、高效液相層析(HPLC)法、超高效液相層析(UPLC)法、及前述之組合。
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