TW202136285A

TW202136285A - 含有多醣-蛋白質結合物之a型鏈球菌免疫原性組合物

Info

Publication number: TW202136285A
Application number: TW110105419A
Authority: TW
Inventors: 杰弗里Ｃ費爾曼; 內拉吉卡普爾; 彼得Ｔ戴維; 安吉Ａ塞德拉
Original assignee: 美商Ｖａｘｃｙｔｅ公司
Priority date: 2020-02-18
Filing date: 2021-02-17
Publication date: 2021-10-01
Also published as: CA3168201A1; IL295702A; KR20220143107A; AU2021224585A1; CN115175697A; MX2022010129A; US20230293658A1; BR112022016268A2; JP2023514332A; WO2021167996A1; EP4106807A1

Abstract

本發明提供包含A型鏈球菌(Group A Streptococcus，GAS)多肽抗原及至少一種多肽-多醣結合物之免疫原性組合物。本發明進一步提供使用該等組合物在個體中誘導針對GAS感染之免疫反應之方法。

Description

含有多醣-蛋白質結合物之A型鏈球菌免疫原性組合物

本申請案係關於微生物學及疫苗研發之領域。

A型鏈球菌(Group A Streptococcus，GAS)係每年在全世界引起700百萬例咽炎(「鏈球菌性咽喉炎」)之主要人類病原體，且嚴重侵襲性感染、敗血症、壞死性筋膜炎、中耳炎及中毒性休克症候群之病例日益增加。咽炎於學齡兒童中高度流行且係全世界抗生素處方之主要來源，此在整個人類微生物菌群中引起抗性之選擇壓力。GAS亦造成感染後免疫介導之風濕性心臟病(RHD)，該疾病係發展中國家中之主要死亡病因。當前大約30百萬人受RHD影響，其中每年超過300,000人死亡(60% ＜ 70歲)且損失11.5百萬失能調整後生命年。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含第一A型鏈球菌(GAS)多肽抗原；第二GAS多肽抗原；及至少一種多肽-多醣結合物，其中結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸(nnAA)，且其中結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

在一些實施例中，GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原。在一些實施例中，GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原之肽片段。在一些實施例中，第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35及Sfb1。在一些實施例中，第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。

在一些實施例中，C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。

在一些實施例中，非GAS載體多肽係鐵蛋白。在一些實施例中，第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽係選自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene)黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、SEQ ID NO: 25及蛋白質D。在一些實施例中，第三GAS多肽抗原係SLO。

在一些實施例中，至少一種nnAA取代結合多肽中之離胺酸、白胺酸或異白胺酸。在一些實施例中，至少一種nnAA取代結合多肽中之離胺酸、白胺酸、精胺酸或異白胺酸。在一些實施例中，nnAA包含點擊化學反應性基團。在一些實施例中，nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。在一些實施例中，nnAA係pAMF。

在一些實施例中，結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD多肽在SEQ ID NO: 9之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD多肽在SEQ ID NO: 33之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，ADI多肽在SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，ADI多肽在SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。在一些實施例中，鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合多醣包含聚鼠李糖核心。在一些實施例中，結合多醣具有約5 kDa至約7 kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣係四聚體、六聚體、八聚體或十聚體多醣。在一些實施例中，結合多醣具有約10 kDa至40 kDa之平均分子量。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。在一些實施例中，ADI多肽包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，ADI多肽包含與列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。在一些實施例中，鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。在一些實施例中，鐵蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

在一些實施例中，該組合物包含約10%至約50%之第一GAS抗原、約10%至約50%之第二GAS抗原及約10%至約50%之多肽-多醣結合物。在一些實施例中，該組合物進一步包含一或多種選自明礬、皂素、單磷醯基脂質A (MPL)或其組合之佐劑。在一些實施例中，該組合物包含Alhydogel。

在一些實施例中，本發明提供在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向個體投與本文所闡述之免疫原性組合物。

在一些實施例中，個體為18歲或更年長。在一些實施例中，個體小於18歲。在一些實施例中，個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之血清型。在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之血清型。在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之血清型。在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之血清型。在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之血清型。在一些實施例中，GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之血清型。

在一些實施例中，免疫原性組合物在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在個體中誘導針對人類組織之抗體反應。在一些實施例中，免疫原性組合物在個體中誘導針對志賀桿菌(Shigella )細菌之保護性免疫反應，其中志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。

在一些實施例中，本發明提供在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向個體投與本文所闡述之免疫原性組合物。在一些實施例中，本發明提供本文所闡述之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。在一些實施例中，本發明提供本文所闡述之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。在一些實施例中，個體為18歲或更年長。在一些實施例中，個體小於18歲。在一些實施例中，個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張以下申請案之益處：2020年2月18日提出申請之美國臨時申請案第62/977,886號；2020年4月22日提出申請之美國臨時申請案第63/13,924號；2020年10月9日提出申請之美國臨時申請案第63/090,069號；及2020年12月9日提出申請之美國臨時申請案第63/123,293號，該等申請案之揭示內容之全部內容以引用方式併入本文中。政府權益之聲明

本發明在美國政府支持下以CARB-X納稅穿透實體(CARB-X Pass Through Entity)下之由衛生與公共服務部防備與響應助理部長辦公室(Health and Human Services Office of the Assistant Secretary for Preparedness and Response，HHS/ASPR)授予之許可號93.360 (子受方4500003905)來獲得。政府擁有本發明之某些權利。概述

儘管全球高度需要，但並無針對GAS之安全且有效之商業疫苗。該病原體之特徵為接種疫苗帶來特殊挑戰，包括其不變之透明質酸(遍佈於結締組織中之一種免疫學惰性碳水化合物)莢膜。另外，免疫顯性表面錨定性GAS M蛋白高度多型(＞200個emm 類型)，且其二聚體捲曲螺旋結構之區域可在風濕性心臟病(RHD)中激起針對心臟組織之自體免疫反應。世界衛生組織(World Health Organization)、國際疫苗研究院(International Vaccine Institute)、維康信託基金會(Wellcome Trust)、蓋茨基金會(Gates Foundation)及其他機構最近召開關於GAS疫苗研發之諮詢會以解決該等重大科學挑戰且滿足此至關重要之全球性衛生需求。 A 型鏈球菌

A型鏈球菌(GAS)細菌係革蘭氏陽性(Gram positive)、β-溶血性鏈球菌。其在人類中引起多種疾病。該等疾病包括鏈球菌性咽喉炎(極性咽炎)、中耳炎及皮膚與軟組織感染(例如膿疱病及蜂窩組織炎)。該等疾病亦可包括稀有病例之侵襲性(嚴重)病況，例如壞死性筋膜炎(食肉病)及中毒性休克症候群(TSS)。若干毒性因子有助於GAS之發病，例如M蛋白、溶血素及細胞外酶。

GAS疫苗學已主要著眼於細胞壁錨定性M蛋白。在歷史研究中，向人類志願者投與粗製全M蛋白製劑，隨後使用活GAS細菌在咽中進行攻擊。儘管該等製劑降低了GAS定殖，但在一些免疫化個體中報導了增加之急性風濕熱(ARF)發生率。迄今為止，以下兩種N-末端M蛋白疫苗製劑已達到人類臨床試驗：六價製劑(Dale JB. 1999. Vaccine, 17:193-200；Kotloff等人，2004. JAMA 292:709-715；Hall等人，2004. Infect. Immun. 72:2507-2512)及26價製劑(Hu等人，2002. Infect. Immun. 70:2171-2177；McNeil等人，2005. Clin. Infect. Dis. 41:1114-1122)。該等製劑在成人志願者中充分耐受。最近以來，研發了類似多價疫苗，包括代表30種GAS血清型之N-末端肽(Dale等人，2011. Vaccine 29:8175-8178.)。針對此實驗疫苗所產生之血清展現針對所有30種疫苗血清型以及24種(測試40種)非疫苗血清型之殺細菌活性。儘管該等製劑已展示能夠抵抗所選非疫苗血清型，但其並不抵抗所有全球性傳播之血清型(Abdissa等人，2006. Clin. Infect. Dis. 42:1362-1367；Ikebe等人，Working Group for β-Haemolytic Streptococci in Japan. 2007. 2001-2005. Epidemiol. Infect. 135:1227-1229；Nir-Paz等人，2010. Epidemiol. Infect. 138:53-60；Steer等人，2009. Lancet Infect. Dis. 9:611-616；O’Loughlin等人，2007. Clin. Infect. Dis. 45:853-862)。所包括之30種血清型係基於盛行於北美洲及歐洲者(Dale JB等人，2011. Vaccine29: 8175-8178.)，其通常不同於在流行區分離之各種血清型。最近已報導使用GAS蛋白及蛋白質-GAC結合物作為疫苗(Di Benedetto, R.等人，2020. J. Mol. Sci.第22期: 8558)，但該等物質使用可破壞載體蛋白及PS主鏈上之B/T細胞表位之非特異性結合方法。另外，亦使用含有潛在交叉反應性GlcNAc免疫顯性表位之天然GAC來製備該等結合物。

因此，業內需要針對GAS之改良疫苗。 組合疫苗

在一些實施例中，本發明提供包含兩種或更多種GAS多肽抗原及多肽-多醣結合物之免疫原性組合物。為清楚起見，在本文所闡述之組合物中，每一多肽係不同的。舉例而言，在包含第一多肽抗原、第二多肽抗原及第三多肽抗原或多肽-多醣結合物之組合物中，第一多肽、第二多肽及第三多肽具有不同序列。GAS 抗原

在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物包含兩種或更多種GAS多肽抗原。在一些實施例中，GAS多肽抗原係選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、鏈球菌免疫球蛋白結合蛋白35 (Sib35)及纖連蛋白結合蛋白F1 (Sfb1)。在一些實施例中，GAS多肽抗原係選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、鏈球菌免疫球蛋白結合蛋白35 (Sib35)、纖連蛋白結合蛋白F1 (Sfb1)以及黏附及分裂多肽(SpyAD)。該等GAS抗原中之每一者之UniProt參考鑑別符提供於下文之表1中。表 1 ： 實例性 GAS 抗原之 UniProt 參考

抗原	UniProt Ref
C5a	P15926
SLO	P0C0I3
Sib35	Q1XG74
Sfb1	Q48VN7

在一些實施例中，GAS多肽抗原包含全長多肽抗原序列。在一些實施例中，GAS多肽抗原包含全長多肽抗原序列之片段。舉例而言，在一些實施例中，免疫原性組合物包含C5a GAS多肽抗原，其中C5a多肽係全長C5a多肽之片段。在一些實施例中，C5a片段包含全長蛋白之胺基酸90-1035 (例如包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30)。在一些實施例中，免疫原性組合物包含SLO GAS多肽抗原，其中SLO多肽係全長SLO多肽之片段。在一些實施例中，SLO片段包含全長蛋白之胺基酸79-571 (例如包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32)。

在一些實施例中，GAS多肽抗原在野生型胺基酸序列中包含一或多個胺基酸突變。舉例而言，在一些實施例中，免疫原性組合物包含C5a GAS多肽抗原，其中C5a多肽包含一或多個胺基酸突變。在一些實施例中，胺基酸突變係D131A及S513A (例如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 30)。在一些實施例中，免疫原性組合物包含SLO GAS多肽抗原，其中SLO多肽包含一或多個胺基酸突變。在一些實施例中，胺基酸突變係W535A (例如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 32)。

實例性GAS抗原之胺基酸序列提供於下文之表2中。突變胺基酸係以加粗體文字來指示。在一些實施例中，加下劃線及斜體之胺基酸係自成熟GAS抗原所裂解。表 2 ：實例性 GAS 抗原

抗原	胺基酸序列	SEQ ID:
SLO [79-571片段] WT，具有His標籤及TEV序列	MHHHHHHGSGENLYFQG APKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAWEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK	5
SLO [79-571片段] W535A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQG APKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAA EWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK	7
SLO(ΔC101)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ	53
C5a [90-1035片段] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQG KTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK	1
C5a [90-1035片段] D131A/S513A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQ GKTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIA AGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTA MSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK	3

上文表2及本發明其他處中之殘基位置係指根據全長序列中之殘基位置(例如如藉由參照UniProt序列資料庫在表1及3中所鑑別)用於鑑別由nnAA修飾之片段及/或離胺酸殘基(例如某些離胺酸殘基之pAMF代替)的殘基編號。

在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有與SEQ ID NO: 1-4中之任一者至少95%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之C5a GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有與SEQ ID NO: 29-30中之任一者至少95%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之C5a GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有SEQ ID NO: 1-4中之任一者之胺基酸序列或由其組成之C5a GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有SEQ ID NO: 29-30中之任一者之胺基酸序列或由其組成之C5a GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有與SEQ ID NO: 5-8中之任一者至少95%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之SLO GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53中之任一者至少95%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之SLO GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有SEQ ID NO: 5-8中之任一者之胺基酸序列或由其組成之SLO GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列或由其組成之SLO GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有與SEQ ID NO: 10或33至少95%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之SpyAD GAS多肽抗原。在一些實施例中，免疫原性組合物包含含有SEQ ID NO: 10或33之胺基酸序列或由其組成之SpyAD GAS多肽抗原。多肽 - 多醣結合物

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物包含至少一種多肽-多醣結合物。多肽-多醣結合物包含結合多肽(亦稱為載體蛋白)及在一或多個胺基酸位置處結合至結合多肽之多醣。在一些實施例中，結合多肽係選自SpyAD、ADI、SEQ ID NO: 25、鐵蛋白及蛋白質D。實例性結合多肽之UniProt參考鑑別符提供於下文之表3中。表 3 ： 實例性結合多肽之 UniProt 及 CAS 參考

抗原	UniProt ( 或 CAS) Ref
SpyAD	Q9A1H3
ADI	P0C0B3
蛋白質D	R4R7Q5
鐵蛋白	P02792
CRM197	(CAS: 1272033-67-6)

在一些實施例中，結合多肽包含全長多肽抗原序列。在一些實施例中，結合多肽包含全長多肽序列之片段。舉例而言，在一些實施例中，免疫原性組合物包含多肽-多醣結合物，其中結合多肽係SpyAD且係全長SpyAD多肽之片段(例如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10)。在一些實施例中，SpyAD片段包含全長蛋白之胺基酸33-849 (例如包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10)。在一些實施例中，免疫原性組合物包含多肽-多醣結合物，其中結合多肽係ADI且係全長ADI多肽之片段(例如包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14)。在一些實施例中，免疫原性組合物包含多肽-多醣結合物，其中結合多肽係鐵蛋白且係全長鐵蛋白多肽之片段(例如SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22)。

在一些實施例中，結合多肽在野生型胺基酸序列中包含一或多個胺基酸突變。舉例而言，在一些實施例中，結合多肽係SpyAD，其中SpyAD多肽包含一或多個胺基酸突變。在一些實施例中，結合多肽係ADI，其中ADI多肽包含一或多個胺基酸突變。在一些實施例中，胺基酸突變係D277A (例如SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16)。

在一些實施例中，結合多肽包含一或多個非天然胺基酸(nnAA)。在一些實施例中，一或多個nnAA包含點擊化學反應性基團。在本文中，「點擊化學反應性基團」係指能夠與第二點擊化學反應性基團發生點擊化學反應之部分(例如疊氮化物或炔烴)。在一些實施例中，一種點擊化學反應性基團與第二點擊化學反應性基團反應形成經取代三唑。此類點擊反應之實例可參見(例如)國際PCT公開案第WO 2018/126229號。用於生物醫學應用中之無金屬點擊反應之一般實例可參見(例如) Kim等人，Chemical Science , 2019, 10, 7835-7851。包含點擊化學反應性基團之nnAA之實例包括2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。在一些實施例中，結合多肽包含一或多個nnAA，其中每一nnAA係pAMF。

實例性結合多肽之胺基酸序列提供於下文之表4中。適於經nnAA取代之位點係加粗體及加下劃線之字體來指示。在一些實施例中，加下劃線及斜體之胺基酸係在產生期間自成熟蛋白質所裂解。表 4 ：實例性載體蛋白

蛋白質	胺基酸序列	SEQ ID:
ADI [全長] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQG TAQTPIHVYSEIG K LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYG K YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEE K GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI	13
ADI [全長] D277A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQG TAQTPIHVYSEIG K LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYG K YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLA TVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEE K GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI	15
SpyAD [33-849片段] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQG QVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEA K ATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELK K LEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYK K THGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAK K AHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR	9
hFL [全長] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSG SSQ I RQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD	21
eCRM-pAMF6突變體	MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVIRDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS	25

在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且在SEQ ID NO: 9之位置K64、K287、K396及K657處包含4個nnAA取代。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且在SEQ ID NO: 33之位置K64、K287、K396及K657處包含4個nnAA取代。在一些實施例中，4個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，4個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且包含與SEQ ID NO: 34至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，結合多肽係ADI且在SEQ ID NO: 13之位置K15、K193及K316處包含三個nnAA取代。在一些實施例中，結合多肽係ADI且在SEQ ID NO: 35之位置K15、K193及K316處包含三個nnAA取代。在一些實施例中，三個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係ADI且包含與SEQ ID NO: 17、18、19或20中之任一者至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，三個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係SpyAD且包含與SEQ ID NO: 26、27、37或38中之任一者至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係ADI且包含SEQ ID NO: 17、18、19或20中之任一者之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係ADI且包含SEQ ID NO: 26、27、37、38中之任一者之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽。在一些實施例中，結合多肽係SLO(ΔC101)且在選自SEQ ID NO: 53之K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407及K464之位置處包含三個或四個nnAA取代。在一些實施例中，結合多肽係SLO(ΔC101)且包含在以下位置處經取代之nnAA或由其組成：位置K98、R151、K272及K357；位置K112、K189、K323及K375；位置R151、K272、K357及K407；位置R151、K272、K375及K464；位置K112、K272、K357及K464；位置K98、K189及K357；位置K112、K189及K323；位置K98、R151及K272；位置K112、K272及K375；或位置K112、K323及K407。在一些實施例中，三個或四個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽且包含與SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中之任一者至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽且包含SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中之任一者之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽。在一些實施例中，結合多肽係SLO(ΔC101)且在選自SEQ ID NO: 53之K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407及K464之位置處包含5、6、7或8個nnAA取代。在一些實施例中，結合多肽係SLO(ΔC101)且包含在以下位置處經取代之nnAA或由其組成：位置K98、R151、K272、K357及K407；位置K112、K189、K323、K375及K464；位置K112、R151、K272、K357及K407；位置K98、R151、K272、K357、K407及K464；位置K112、R151、K189、K323、K375及K464；位置K98、K112、K189、K323、K375及K464；位置K112、R151、K189、K272、K357、K407及K464；位置K98、R151、K189、K323、K375、K407及K464；位置K112、K189、K272、K357、K375、K407及K464；位置K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357及K375；位置K98、R151、K189、K272、K323、K357、K407及K464；或位置K112、K189、K272、K323、K357、K375、K407及K464。在一些實施例中，5、6、7或8個nnAA各自係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽且包含與SEQ ID NO: 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或76中之任一者至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係SLO多肽且包含SEQ ID NO: 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或76中之任一者之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，結合多肽係鐵蛋白且在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含一個nnAA取代。在一些實施例中，nnAA係pAMF。在一些實施例中，結合多肽係鐵蛋白且包含與SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 24至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，結合多肽係ADI且包含SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 24或由其組成。多醣

在一些實施例中，結合多醣係GAS多醣，例如A型碳水化合物(GAC)。GAC係由聚鼠李糖主鏈與免疫顯性GlcNAc側鏈構成並存在於所有GAS血清型菌株之表面上(不論M類型如何)，且已作為GAS候選疫苗進行檢驗。結合多醣可定義為結合物之多醣組分。經親和純化之抗GAC抗體成功地調理了三種所測試GAS血清型(Salvadori等人，1995. J. Infect. Dis. 171:593-600.)，且經GAC免疫化之小鼠可抵抗腹膜腔內及鼻內GAS攻擊(Sabharwal等人，2006. J. Infect. Dis. 193:129-135)。然而，抗GAC抗體與宿主心臟瓣膜蛋白(Goldstein等人，1967. Nature 213:44-47)及細胞骨架蛋白(例如肌動蛋白、角蛋白、肌球蛋白及波形蛋白)之間之免疫學交叉反應性會引發關於使用GAC作為GAS疫苗組分之重要潛在安全性問題。

在一些實施例中，可改造釀膿鏈球菌細菌細胞以產生多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。因此，在一些實施例中，結合多醣係缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之GAC變體(例如參見國際PCT公開案第WO 2013/020090號、美國專利第10,780,155號及Gao, N. J.等人，2020年12月29日，Infectious Microbes and Diseases, doi: 10.1097/IM9.0000000000000044)。在一些實施例中，結合多醣係包含聚鼠李糖核心之GAC。在一些實施例中，結合多醣具有約3kDa至約10kDa、約5kDa至約10kDa、約9kDa至約10kDa、約9kDa至約10kDa、約3kDa至約9kDa、約3kDa至約7kDa、約3kDa至約5kDa、約5kDa至約9kDa或約5kDa至約7kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有約3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa或約10kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣係四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體或十聚體多醣。

在一些實施例中，結合多醣具有介於約10 kDa至約45 kDa之間之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有約10 kDa至約15 kDa、約15 kDa至約20 kDa、約20 kDa至約25 kDa、約25 kDa至約30 kDa、約30 kDa至約35 kDa或約35 kDa至約40 kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有約15 kDa至約40 kDa、約15 kDa至約35 kDa、約15 kDa至約30 kDa、約15 kDa至約25 kDa或約15 kDa至約45 kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有約20 kDa至約40 kDa、約20 kDa至約35 kDa、約20 kDa至約30 kDa或約20 kDa至約45 kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有約10 kDa、15 kDa、20 kDa、25 kDa、30 kDa、35 kDa、40 kD或約45 kDa之平均分子量。在一些實施例中，結合多醣具有至少約10 kDa、15 kDa、20 kDa、25 kDa、30 kDa或約35 kDa之平均分子量。

在一些實施例中，結合多醣係自GAS細菌培養物或細菌原液所純化。該純化之方法為業內已知，例如參見WO 2010/049806、國際PCT公開案第WO 2013/020090號及van Sorge等人，Cell Host Microbe., 2014, 15(6), 729-740。亦參見 實例1。在一些實施例中，結合多醣係合成多醣。多醣之合成方法為業內已知，例如參見Zhao等人，Org. Chem. Front., 2019, 6, 3589-3596。亦參見 實例3。在一些實施例中，使用點擊化學反應性基團修飾結合多醣以促進與結合蛋白之結合。點擊化學反應性基團之實例可參見(例如)國際PCT公開案第WO 2018/126229號，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。舉例而言，在一些實施例中，結合多醣經DBCO或DBCO-PEG (例如DBCO-PEG-NH₂ )修飾。在一些實施例中，結合多醣經DBCO-(PEG)₄ -NH₂ 修飾。

在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約50 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約100 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約200 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約500 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約1000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約100 kDa至約200 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約100 kDa至約300 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約100 kDa至約400 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約100 kDa至約500 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約100 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約500 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約1000 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約2000 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約3000 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約4000 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約1000 kDa至約3000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約1000 kDa至約2000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約2000 kDa至約3000 kDa之平均分子質量。在一些實施例中，多肽-多醣結合物具有約5000 kDa或更大之平均分子質量。實例性組合疫苗

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含GAS C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SpyAD結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之變體。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含GAS C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SpyAD結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之變體。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 32至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 44至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 45至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 46至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 47至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 48至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 49至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 50至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 51至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 52至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含GAS C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SpyAD結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之變體。在一些實施例中，C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致之胺基酸序列或由其組成；SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列或由其組成；且SpyAD結合蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列或由其組成；SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列或由其組成；且SpyAD結合蛋白包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列或由其組成且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。在一些實施例中，SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 52之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 32之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 29之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列或由其組成之C5a肽酶多肽抗原；包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列或由其組成之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列或由其組成之C5a肽酶多肽抗原；包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列或由其組成之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列或由其組成之C5a肽酶多肽抗原；包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列或由其組成之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列或由其組成之C5a肽酶多肽抗原；包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列或由其組成之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含C5a肽酶多肽抗原；GAS SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含ADI結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之變體。在一些實施例中，ADI多肽包含與SEQ ID NO: 13-16中之任一者至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 17-20中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35-36中之任一者至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 37-38中之任一者之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 17-20中之任一者之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35-36中之任一者至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。在一些實施例中，ADI多肽包含SEQ ID NO: 37-38中之任一者之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含C5a肽酶多肽抗原；GAS SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈之變體。在一些實施例中，鐵蛋白多肽包含與SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22至少95%一致之胺基酸序列或由其組成且在位置I5處包含pAMF取代。在一些實施例中，鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在一些實施例中，鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或由其組成。 治療方法

在一些實施例中，本發明提供在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向個體投與本文所闡述之免疫原性組合物。在某些實施例中，提供本文所闡述之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應。在一些實施例中，本文提供本文所闡述之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應之藥劑。

在本文中，術語「個體」係指哺乳動物。在一些實施例中，個體係小鼠、大鼠、狗、天竺鼠、綿羊、非人類靈長類動物或人類。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，人類個體為18歲或更年長。在一些實施例中，人類個體小於18歲。

在一些實施例中，人類個體介於6個月齡與17歲之間。在一些實施例中，人類個體介於6個月齡與9歲之間、介於6個月齡與8歲之間、介於6個月齡與7歲之間、介於6個月齡與6歲之間、介於6個月齡與5歲之間、介於6個月齡與4歲之間、介於6個月齡與3歲之間、介於6個月齡與2歲之間或介於6個月齡與1歲之間。在一些實施例中，人類個體介於5歲與17歲之間、介於7歲與17歲之間、介於9歲與17歲之間、介於11歲與17歲之間、介於13歲與17歲之間或介於15歲與17歲之間。在一些實施例中，人類個體為6個月齡、1歲、2歲、3歲、4歲、5歲、6歲、7歲、8歲、9歲、10歲、11歲、12歲、13歲、14歲、15歲、16歲、17歲或18歲。

在本文中，術語「保護性免疫反應」涵蓋在個體中誘發抗GAS抗體反應。可藉由業內已知方式來測定在投與本文所闡述之免疫原性組合物之後所生成之效價，例如藉由衍生自免疫化個體之血清試樣之ELISA分析(參見實例6)。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至多種(亦即兩種或更多種) GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多種GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物不誘發針對人類蛋白質或組織之抗體反應。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89及M92之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89及M92之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至至少一種選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之GAS血清型。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發抗體反應，其中所生成抗體結合至兩種或更多種選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之GAS血清型。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發關於結合至一或多種志賀桿菌血清型之抗體反應。在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物在所治療個體中誘發關於結合至一或多種GAS血清型且亦結合至一或多種志賀桿菌血清型之抗體反應。在一些實施例中，志賀桿菌血清型包含含有聚鼠李糖主鏈之多醣。包含該等多醣之實例性志賀桿菌血清型包括福氏志賀桿菌，例如福氏志賀桿菌2A及3A以及福氏志賀桿菌6 。其他經編號實施例

本發明之其他實施例提供於下文之經編號實施例中：

實施例1：一種免疫原性組合物，其包含第一A型鏈球菌(GAS)多肽抗原；第二GAS多肽抗原；及至少一種多肽-多醣結合物，其中結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸，且其中結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例2：如實施例1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原。

實施例3：如實施例1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原之肽片段。

實施例4：如實施例1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35及Sfb1。

實施例5：如實施例1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。

實施例6：如實施例5之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致之胺基酸序列。

實施例7：如實施例5之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

實施例8：如實施例5之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7至少95%一致之胺基酸序列。

實施例9：如實施例5之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。

實施例10：如實施例1至9中任一項之免疫原性組合物，其中該非GAS載體多肽係鐵蛋白。

實施例11：如實施例1至10中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、eCRM及蛋白質D。

實施例12：如實施例1至11中任一項之免疫原性組合物，其中該至少一種nnAA取代該結合多肽中之離胺酸、白胺酸或異白胺酸。

實施例13：如實施例1至11中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA包含點擊化學反應性基團。

實施例14：如實施例13之免疫原性組合物，其中該nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。

實施例15：如實施例13之免疫原性組合物，其中該nnAA係pAMF。

實施例16：如實施例12至15中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列。

實施例17：如實施例16之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 9之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例18：如實施例17之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例19：如實施例12至15中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列。

實施例20：如實施例19之免疫原性組合物，其中該ADI多肽在SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例21：如實施例20之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例22：如實施例12至15中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。

實施例23：如實施例22之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。

實施例24：如實施例23之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例25：如實施例1至23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣包含聚鼠李糖核心。

實施例26：如實施例1至23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約5KDa至約7 KDa之平均分子量。

實施例27：如實施例1至26中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣係四聚體、六聚體、八聚體或十聚體多醣。

實施例28：一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例29：如實施例28之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例30：如實施例28之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例31：一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例32：如實施例31之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例33：如實施例31之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例34：一種免疫原性組合物，其包含A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原；GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例35：如實施例34之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例35A：如實施例34之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例36：如實施例1至35中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物包含約10%至約50%之該第一GAS抗原、約10%至約50%之該第二GAS抗原及約10%至約50%之該多肽-多醣結合物。

實施例37：如實施例1至36中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種選自明礬、皂素、單磷醯基脂質A (MPL)或其組合之佐劑。

實施例38：一種在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物。

實施例38A：一種如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應。

實施例38B：一種如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例39：如實施例38至38B中任一項之方法，其中該個體為18歲或更年長。

實施例40：如實施例38至38B中任一項之方法，其中該個體小於18歲。

實施例41：如實施例38至38B中任一項之方法，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例42：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之血清型。

實施例43：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之血清型。

實施例44：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之血清型。

實施例45：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之血清型。

實施例46：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之血清型。

實施例47：如實施例38至41中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之血清型。

實施例48：如實施例38至47中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對該A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在該個體中誘導針對人類組織之抗體反應。

實施例49：如實施例38至48中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應，其中志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。

實施例50：一種在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物。

實施例51：一種如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。

實施例52：一種如實施例1至37中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例53：如實施例50至52中任一項之方法或用途，其中該個體為18歲或更年長。

實施例54：如實施例53之方法或用途，其中該個體小於18歲。

實施例55：如實施例54之方法或用途，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例II-1.一種免疫原性組合物，其包含 a. 第一A型鏈球菌(GAS)多肽抗原； b. 第二GAS多肽抗原；及 c. 至少一種多肽-多醣結合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸，且其中該結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例II-2.如實施例II-1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原。

實施例II-3.如實施例II-1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原之肽片段。

實施例II-4.如實施例II-1至II-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35及Sfb1。

實施例II-5.如實施例II-1至II-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。

實施例II-6.如實施例II-5之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-7.如實施例II-5之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

實施例II-8.如實施例II-1至II-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例II-9.如實施例II-5之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-10.如實施例II-1至II-6或II-9中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-11.如實施例II-5之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。

實施例II-12.如實施例II-1至II-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例II-13.如實施例II-1至II-12中任一項之免疫原性組合物，其中該非GAS載體多肽係鐵蛋白。

實施例II-14.如實施例II-1至II-13中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、eCRM及蛋白質D。

實施例II-15.如實施例II-1至II-14中任一項之免疫原性組合物，其中該至少一種nnAA取代結合多肽中之離胺酸、白胺酸或異白胺酸。

實施例II-16.如實施例II-1至II-14中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA包含點擊化學反應性基團。

實施例II-17.如實施例II-16之免疫原性組合物，其中該nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。

實施例II-18.如實施例II-16之免疫原性組合物，其中該nnAA係pAMF。

實施例II-19.如實施例II-15至II-18中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-20.如實施例II-19之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 9之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例II-21.如實施例II-20之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例II-22.如實施例II-15至II-18中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-23.如實施例II-22之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 33位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例II-24.如實施例II-23之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例II-25.如實施例II-15至II-18中任一項之免疫原性組合物，其中結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-26.如實施例II-25之免疫原性組合物，其中ADI多肽在SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例II-27.如實施例II-26之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例II-28.如實施例II-15至II-18中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-29.如實施例II-28之免疫原性組合物，其中ADI多肽在SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例II-30.如實施例II-29之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例II-31.如實施例II-15至II-18中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。

實施例II-32.如實施例II-31之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。

實施例II-33.如實施例II-32之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例II-34.如實施例II-1至II-33中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣包含聚鼠李糖核心。

實施例II-35.如實施例II-1至II-33中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約5KDa至約7 KDa之平均分子量。

實施例II-36.如實施例II-1至II-35中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣係四聚體、六聚體、八聚體或十聚體多醣。

實施例II-37.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例II-38.如實施例II-37之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例II-39.如實施例II-37之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例II-40.如實施例II-37之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例II-41.如實施例II-37之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例II-42.如實施例II-41之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例II-43.如實施例II-1或II-37之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例II-44.如實施例II-1或II-37之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 52之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例II-45.如實施例II-1或II-37之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 32之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例II-46.如實施例II-1或II-37之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 29之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例II-47.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例II-48.如實施例II-47之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例II-49.如實施例II-47之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例II-50.如實施例II-47至II-48之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例II-51.如實施例II-47至II-48之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例II-52.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例II-53.如實施例II-52之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例II-54.如實施例II-52之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例II-55.如實施例II-1至II-54中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物包含約10%至約50%之該第一GAS抗原、約10%至約50%之該第二GAS抗原及約10%至約50%之該多肽-多醣結合物。

實施例II-56.如實施例II-1至II-55中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種選自明礬、皂素、單磷醯基脂質A (MPL)或其組合之佐劑。

實施例II-57.一種在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例II-1至II-56中任一項之免疫原性組合物。

實施例II-58.如實施例II-57之方法，其中該個體為18歲或更年長。

實施例II-59.如實施例II-57之方法，其中該個體小於18歲。

實施例II-60.如實施例II-57之方法，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例II-61.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之血清型。

實施例II-62.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之血清型。

實施例II-63.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之血清型。

實施例II-64.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之血清型。

實施例II-65.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之血清型。

實施例II-66.如實施例II-57至II-60中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之血清型。

實施例II-67.如實施例II-57至II-66中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對該A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在該個體中誘導針對人類組織之抗體反應。

實施例II-68.如實施例II-57至II-67中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應，其中該志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。

實施例II-69.一種在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例II-1至II-56中任一項之免疫原性組合物。

實施例II-70.一種如實施例II-1至II-56中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。

實施例II-71.一種如實施例II-1至II-56中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例II-72.如實施例II-69至II-71中任一項之方法或用途，其中該個體為18歲或更年長。

實施例II-73.如實施例II-72之方法或用途，其中該個體小於18歲。

實施例II-74.如實施例II-73之方法或用途，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例III-1.一種免疫原性組合物，其包含 a. 第一A型鏈球菌(GAS)多肽抗原； b. 第二GAS多肽抗原；及 c. 至少一種多肽-多醣結合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸，且其中該結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例III-2.如實施例III-1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原。

實施例III-3.如實施例III-1之免疫原性組合物，其中該等GAS多肽抗原中之至少一者係全長GAS抗原之肽片段。

實施例III-4.如實施例III-1至III-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35、Sfb1及SpyAD。

實施例III-5.如實施例III-1至III-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35及Sfb1。

實施例III-6.如實施例III-1至III-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。

實施例III-7.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-7A.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致。

實施例III-8.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

實施例III-9.如實施例III-1至III-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例III-9A.如實施例III-1至III-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列組成。

實施例III-10.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-10A.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7至少95%一致。

實施例III-11.如實施例III-1至III-7或III-10中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-11A.如實施例III-17、III-10、III-7A或III-10A中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致。

實施例III-12.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。

實施例III-12A.如實施例III-6之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之胺基酸序列組成。

實施例III-13.如實施例III-1至III-7中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例III-13A.如實施例III-1至III-7或III-7A中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列組成。

實施例III-14.如實施例III-1至III-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SpyAD。

實施例III-15.如實施例III-14之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-15A.如實施例III-14之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3至少95%一致。

實施例III-16.如實施例III-14之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例III-16A.如實施例III-14之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列組成。

實施例III-17.如實施例III-1至III-16中任一項之免疫原性組合物，其中該非GAS載體多肽係鐵蛋白。

實施例III-18.如實施例III-1至III-16中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、eCRM及蛋白質D。

實施例III-19.如實施例III-1至III-16中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、eCRM、蛋白質D及SLO。

實施例III-20.如實施例III-1至III-19中任一項之免疫原性組合物，其中該至少一種nnAA取代該結合多肽中之離胺酸、白胺酸或異白胺酸。

實施例III-21.如實施例III-1至III-19中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA包含點擊化學反應性基團。

實施例III-22.如實施例III-16之免疫原性組合物，其中該nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。

實施例III-23.如實施例III-21之免疫原性組合物，其中該nnAA係pAMF。

實施例III-24.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-24A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係與SEQ ID NO: 9至少95%一致之SpyAD多肽。

實施例III-25.如實施例III-24之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 9之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-26.如實施例III-25之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例III-26A.如實施例III-25之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列(由其組成)。

實施例III-27.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-27A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且與SEQ ID NO: 33至少95%一致。

實施例III-28.如實施例III-27之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 33之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-29.如實施例III-28之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例III-30.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-30A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致。

實施例III-31.如實施例III-30之免疫原性組合物，其中該ADI多肽在SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-32.如實施例III-31之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例III-32A.如實施例III-31之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列組成。

實施例III-33.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-33A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致。

實施例III-34.如實施例III-33之免疫原性組合物，其中該ADI多肽在SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-35.如實施例III-34之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例III-35A.如實施例III-34之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列組成。

實施例III-36.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係SLO多肽且包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-36A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係SLO多肽且與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 53至少95%一致。

實施例III-37.如實施例III-36之免疫原性組合物，其中該SLO多肽在選自K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407或K464之位置處包含3或4個pAMF取代。

實施例III-38.如實施例III-36或III-37之免疫原性組合物，其中該SLO多肽包含SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。

實施例III-38A.如實施例III-36或III-37之免疫原性組合物，其中該SLO多肽由SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列組成。

實施例III-39.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。

實施例III-39A.如實施例III-20至III-23中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且與SEQ ID NO: 21至少95%一致。

實施例III-40.如實施例III-39之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。

實施例III-41.如實施例III-40之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例III-41A.如實施例III-40之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽由SEQ ID NO: 23之胺基酸序列組成。

實施例III-42.如實施例III-1至III-41中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣包含聚鼠李糖核心。

實施例III-43.如實施例III-1至III-41中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約5KDa至約7 KDa之平均分子量。

實施例III-44.如實施例III-1至III-43中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣係四聚體、六聚體、八聚體或十聚體多醣。

實施例III-45.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例III-46.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 9至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-46A.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白與SEQ ID NO: 9至少95%一致且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-47.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

實施例III-47A.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白由SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11之胺基酸序列組成。

實施例III-48.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-48A.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白與SEQ ID NO: 33至少95%一致且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例III-49.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例III-49A.如實施例III-45之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白由SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列組成。

實施例III-50.如實施例III-49之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例III-50A.如實施例III-49或III-49A之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列組成。

實施例III-51.如實施例III-1或III-45之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例III-52.如實施例III-1或III-45之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 52之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例III-53.如實施例III-1或III-45之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 32之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例III-54.如實施例III-1或III-45之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 29之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例III-55.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例III-56.如實施例III-55之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-56A.如實施例III-55之免疫原性組合物，其中該ADI多肽與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15至少95%一致且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-57.如實施例III-55之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。

實施例III-57A.如實施例III-55之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列組成。

實施例III-58.如實施例III-55至III-56之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-58A.如實施例III-55至III-56或III-56A中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例III-59.如實施例III-55至III-56之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例III-59A.如實施例III-55至III-56或III-56A中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列組成。

實施例III-60.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例III-61.如實施例III-60之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例III-61A.如實施例III-60之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白與SEQ ID NO: 21至少95%一致且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例III-62.如實施例III-60之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例III-62A.如實施例III-60之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白由SEQ ID NO: 23之胺基酸序列組成。

實施例III-63.如實施例III-1至III-62中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物包含約10%至約50%之該第一GAS抗原、約10%至約50%之該第二GAS抗原及約10%至約50%之該多肽-多醣結合物。

實施例III-64.如實施例III-1至III-63中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種選自明礬、皂素、單磷醯基脂質A (MPL)或其組合之佐劑。

實施例III-65.一種在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例III-1至56中任一項之免疫原性組合物。

實施例III-66.如實施例III-65之方法，其中該個體為18歲或更年長。

實施例III-67.如實施例III-65之方法，其中該個體小於18歲。

實施例III-68.如實施例III-65之方法，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例III-69.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之血清型。

實施例III-70.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之血清型。

實施例III-71.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之血清型。

實施例III-72.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之血清型。

實施例III-73.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之血清型。

實施例III-74.如實施例III-65至III-68中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之血清型。

實施例III-75.如實施例III-65至III-74中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對該A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在該個體中誘導針對人類組織之抗體反應。

實施例III-76.如實施例III-65至III-75中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應，其中該志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。

實施例III-77.一種在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例III-1至56中任一項之免疫原性組合物。

實施例III-78.一種如實施例III-1至III-54中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。

實施例III-79.一種如實施例III-1至III-54中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例III-80.如實施例III-77至III-79中任一項之方法或用途，其中該個體為18歲或更年長。

實施例III-81.如實施例III-80之方法或用途，其中該個體小於18歲。

實施例III-82.如實施例III-81之方法或用途，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例IV-1.一種免疫原性組合物，其包含 a. 第一A型鏈球菌(GAS)多肽抗原； b. 第二GAS多肽抗原；及 c. 至少一種多肽-多醣結合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸，且其中該結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例IV-2.如實施例IV-1之免疫原性組合物，其中至少一種GAS多肽抗原係全長GAS抗原。

實施例IV-3.如實施例IV-1之免疫原性組合物，其中至少一種GAS多肽抗原係全長GAS抗原之肽片段。

實施例IV-4.如實施例IV-1至IV-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35、Sfb1及SpyAD。

實施例IV-5.如實施例IV-1至IV-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35及Sfb1。

實施例IV-6.如實施例IV-1至IV-3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。

實施例IV-7.如實施例IV-1至IV-6中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-8.如實施例IV-1至IV-5中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致。

實施例IV-9.如實施例IV-6之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例IV-10.如實施例IV-1至IV-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例IV-11.如實施例IV-1至IV-6中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列組成。

實施例IV-12.如實施例IV-1至IV-11中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-13.如實施例IV-1至IV-11中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32至少95%一致。

實施例IV-14.如實施例IV-1至IV-9中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-15.如實施例IV-1至IV-9中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致。

實施例IV-16.如實施例IV-1至IV-11中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。

實施例IV-17.如實施例IV-6之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32之胺基酸序列組成。

實施例IV-18.如實施例IV-1至IV-9中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例IV-19.如實施例IV-1至IV-9中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列組成。

實施例IV-20.如實施例IV-1至IV-4中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SpyAD。

實施例IV-21.如實施例IV-1至IV-6、16-17或20中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-22.如實施例IV-20或IV-21之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致。

實施例IV-23.如實施例IV-1至IV-6、16-17或20中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

實施例IV-24.如實施例IV-1至IV-6、16-17、20或23中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列組成。

實施例IV-25.如實施例IV-1至IV-24中任一項之免疫原性組合物，其中該非GAS載體多肽係鐵蛋白。

實施例IV-26.如實施例IV-1至IV-24中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原或非GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、SEQ ID NO: 25及蛋白質D。

實施例IV-27.如實施例IV-1至IV-24中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原或非GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、SEQ ID NO: 25、蛋白質D及SLO。

實施例IV-28.如實施例IV-1至IV-27中任一項之免疫原性組合物，其中該至少一種nnAA取代該結合多肽中之離胺酸、白胺酸、精胺酸或異白胺酸。

實施例IV-29.如實施例IV-1至IV-27中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA包含點擊化學反應性基團。

實施例IV-30.如實施例IV-1至IV-29中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。

實施例IV-31.如實施例IV-29或IV-30之免疫原性組合物，其中該nnAA係pAMF。

實施例IV-32.如實施例IV-26至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-33.如實施例IV-28至IV-32中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且與SEQ ID NO: 33至少95%一致。

實施例IV-34.如實施例IV-26至IV-33中任一項之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 33之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例IV-35.如實施例IV-26至IV-31或34中任一項之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例IV-36.如實施例IV-34之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽由SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列組成。

實施例IV-37.如實施例IV-26至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-38.如實施例IV-26至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致。

實施例IV-39.如實施例IV-26至IV-31或37-38中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽在SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例IV-40.如實施例IV-39之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例IV-41.如實施例IV-26至IV-31或39中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列組成。

實施例IV-42.如實施例IV-27至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係SLO多肽且包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-43.如實施例IV-27至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係SLO多肽且與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 53至少95%一致。

實施例IV-44.如實施例IV-42或IV-43之免疫原性組合物，其中該SLO多肽在選自K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407或K464之位置處包含3或4個pAMF取代。

實施例IV-45.如實施例IV-44之免疫原性組合物，其中該SLO多肽包含SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。

實施例IV-46.如實施例IV-44之免疫原性組合物，其中該SLO多肽由SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列組成。

實施例IV-47.如實施例IV-42或IV-43之免疫原性組合物，其中該SLO多肽在選自K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407或K464之位置處包含5、6、7或8個pAMF取代。

實施例IV-48.如實施例IV-47之免疫原性組合物，其中該SLO多肽包含SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76之胺基酸序列。

實施例IV-49.如實施例IV-47之免疫原性組合物，其中該SLO多肽由SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76之胺基酸序列組成。

實施例IV-50.如實施例IV-28至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。

實施例IV-51.如實施例IV-28至IV-31中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且與SEQ ID NO: 21至少95%一致。

實施例IV-52.如實施例IV-50或IV-51之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。

實施例IV-53.如實施例IV-52之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例IV-54.如實施例IV-52之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽由SEQ ID NO: 23之胺基酸序列組成。

實施例IV-55.如實施例IV-1至IV-54中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈。

實施例IV-56.如實施例IV-1至IV-56中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約5 kDa至約7 kDa之平均分子量。

實施例IV-57.如實施例IV-1至IV-56中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約10 kDa至約45 kDa之平均分子量。

實施例IV-58.如實施例IV-1至IV-55中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣係四聚體、六聚體、八聚體或十聚體多醣。

實施例IV-59.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例IV-60.如實施例IV-59之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例IV-61.如實施例IV-59之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白與SEQ ID NO: 33至少95%一致且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。

實施例IV-62.如實施例IV-59至IV-61之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。

實施例IV-63.如實施例IV-59至IV-61之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白由SEQ ID NO: 34之胺基酸序列組成。

實施例IV-64.如實施例IV-59至IV-63中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。

實施例IV-65.如實施例IV-59至IV-64中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列組成。

實施例IV-66.如實施例IV-1或IV-59之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例IV-67.如實施例IV-1或IV-59之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 52之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例IV-68.如實施例IV-1或IV-59之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 32之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例IV-69.如實施例IV-1或IV-59之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 29之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。

實施例IV-70.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例IV-71.如實施例IV-70之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例IV-72.如實施例IV-70之免疫原性組合物，其中該ADI多肽與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。

實施例IV-73.如實施例IV-72之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。

實施例IV-74.如實施例IV-72中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列組成。

實施例IV-75.一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。

實施例IV-76.如實施例IV-75之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例IV-77.如實施例IV-75之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白與SEQ ID NO: 21至少95%一致且在位置I5處包含pAMF取代。

實施例IV-78.如實施例IV-75之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

實施例IV-79.如實施例IV-75之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白由SEQ ID NO: 23之胺基酸序列組成。

實施例IV-80.如實施例IV-1至IV-79中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物包含約10%至約50%之該第一GAS抗原、約10%至約50%之該第二GAS抗原及約10%至約50%之該多肽-多醣結合物。

實施例IV-81.如實施例IV-1至IV-80中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種選自明礬、皂素、單磷醯基脂質A (MPL)或其組合之佐劑。

實施例IV-82.如實施例IV-1至IV-81中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。

實施例IV-83.一種誘導在個體中針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物。

實施例IV-84.如實施例IV-83之方法，其中該個體為18歲或更年長。

實施例IV-85.如實施例IV-65之方法，其中該個體小於18歲。

實施例IV-86.如實施例IV-65之方法，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。

實施例IV-87.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75及M89之血清型。

實施例IV-88.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72及M74之血清型。

實施例IV-89.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77及M81之血清型。

實施例IV-90.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89及M92之血清型。

實施例IV-91.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62及M89之血清型。

實施例IV-92.如實施例IV-83至IV-86中任一項之方法，其中該GAS細菌係選自M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89及M92之血清型。

實施例IV-93.如實施例IV-83至IV-92中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對該A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在該個體中誘導針對人類組織之抗體反應。

實施例IV-94.如實施例IV-83至IV-93中任一項之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應，其中該志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。

實施例IV-95.一種在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物。

實施例IV-96.一種如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。

實施例IV-97.一種如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例IV-98.一種如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應之藥劑。

實施例IV-99.一種如實施例IV-1至IV-82中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應。

實施例IV-100.如實施例IV-93至IV-99中任一項之方法或用途，其中該個體為18歲或更年長。

實施例IV-101.如實施例IV-100之方法或用途，其中該個體小於18歲。

實施例IV-102.如實施例IV-100之方法或用途，其中該個體介於5歲與17歲之間、介於6個月與9歲之間或介於5歲與9歲之間。以引用方式併入

本文所引用之所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案及專利申請案之全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中。然而，提及本文所引用之任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案及專利申請案並不且不應理解為承認或以任何形式表明，其在世界上任何國家構成有效先前技術或形成一般通常知識之一部分。。實例實例 1 ： GAS 多醣之表現及純化

實施實驗以表現來自GAS細菌培養物之GAS多醣並純化。

自適當重組GAS群落製備500 mL起始培養物，使細菌生長數小時，然後接種較大體積之1.25 L培養物以在37℃下無振盪過夜生長。將細菌粒化，使用PBS洗滌一次。使用聚苯乙烯尖端將5 mL較冷之48%氫氟酸水溶液添加至50 mL錐形管中之細胞糰粒中，使用血清學移液管小心地上下抽吸以破壞糰粒。使用較小磁攪拌棒，將混合物在4℃下攪拌48小時。在通風櫥中，將錐形管置於冰上，向細菌懸浮液中添加45 mL (10×48% HF體積)冰冷Milli-Q® (超純)水以準備透析。

對於透析而言，使用去離子水填充用於透析之4L塑膠燒杯。將攪拌棒添加至每一燒杯中，且使燒杯在冷室中冷卻並加蓋。針對每一細菌培養切割1000 MWCO再生纖維素透析管(4L燒杯使用最大約17 cm)。需要3個切管以用於6份1.25L培養物。使用去離子水洗滌該等管並使用Milli-Q® (超純)水沖洗，然後浸沒於含有冷Milli-Q® (超純)水之燒杯中。在通風櫥中，將管子置於燒杯中，然後小心填充經稀釋細菌懸浮液並使用夾具密封。如下所述來透析試樣：第1天：4℃，攪拌；第2天：換水，4℃，攪拌；第3天：換水，室溫，攪拌。

將透析管之內容物轉移至離心管中並在4℃下以14,000 rpm旋轉20 min。使用Milli-Q® (超純)水沖洗50 mL錐形管3次以去除任何可溶性塑膠殘餘物。將最多30 mL含有多醣之上清液傾析至每一管中並在乾冰中冷凍1小時。然後凍乾冷凍試樣，且將殘餘物再懸浮於8 mL冷水中，並視需要輕輕進行超音波處理。在每一多醣製劑中添加1 mL 10x蛋白酶K緩衝液(500 mM Tris HCl、10 mM CaCl₂ )及12.5 mg蛋白酶K。將試樣在雜交烘箱中於56℃下培育過夜，並偶爾混合。使用100 µL於乙醇中之100 mM PMSF (最終5 mM)終止反應且在37℃下培育1-2小時，並週期性混合。然後將混合物在攪拌下於含有0.05%疊氮化鈉之去離子水中透析24小時以去除鹽。冷凍所得粗製多醣溶液並凍乾。

藉由粒徑篩析層析使用100 cm × 1.5 cm Biogel P4管柱來純化粗製多醣，該管柱經7%乙醇預平衡且配備有設置為每一試樣20.0 min之螺旋收集器。將粗製材料再懸浮於500 µL 7%乙醇中並在4000 rpm下離心5分鐘以去除任何不溶性微粒物質。將試樣加載於管柱上，且使用500 µL 7%乙醇洗脫預加載體積及4個後續部分。使用7%乙醇洗脫管柱，並收集約20小時。使用苯酚-硫酸法分析各部分以檢測是否存在多醣，且在490 nm下讀取試樣以進行量化。彙集在苯酚-硫酸測試中測試為陽性之部分並凍乾以得到最終純化PS產物。實例 2 ：經 pAMF 修飾之結合多肽之表現及純化

實施實驗以表現及純化來自無細胞蛋白質合成提取物之經pAMF修飾之結合多肽。

使用衍生自經改造以產生用於在琥珀色終止密碼子處插入nnAA之正交tRNA之大腸桿菌(E. coli )之提取物(XtractCF⁺ )，在無細胞蛋白質合成(CFPS)反應中表現含有nnAA (例如pAMF)之結合多肽(例如SpyAD (SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 34))。用於選殖、表現及純化該等經修飾結合多肽之試樣方案可參見(例如) Kapoor等人，Biochemistry , 2018, 57(5), 516-519。

作為一實例，可使用DASbox微型生物反應器系統在25℃、恆定650 rpm攪拌、pH 7.2、30%溶解氧下實施受控性大規模抗原表現10 h。在10 h之後，收穫反應液並在4℃下以15,000 ×g 旋轉30 min，通過0.45 µm過濾器，將濾液加載於5 ml HisTrap excel管柱(Cytiva)上，該管柱經緩衝液A [50 mM Tris、150 mM M NaCl、10 mM咪唑]平衡及深度洗滌直至吸光度返回基線為止(圖17展示來自所選SLO變體之純化之試樣凝膠)。使用緩衝液B [50 mM Tris、150 mM M NaCl、500 mM咪唑]之50%分級梯度洗脫蛋白質，且彙集洗脫部分，濃縮並與過量經純化加his6標籤之TEV蛋白酶一起培育過夜，同時針對緩衝液A進行透析(圖18展示在TEV裂解SLO肽後之試樣凝膠)。將經透析裂解反應液加載回經預平衡之HisTrap excel 5 ml管柱(Cytiva)上且未加標籤蛋白質收集於流經(FT)部分中。此後，濃縮FT並加載於經緩衝液S [50 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl]預平衡之Superdex 200 26/60粒徑篩析層析(SEC)管柱上，且藉由SDS-PAGE凝膠分析來評價經洗脫部分之純度(圖19展示所選SLO變體在粒徑篩析層析後之純度)。將經純化SpyAD[4pAMF]與過量二苯并環辛炔-PEG4-四甲基玫瑰紅(DBCO-TAMRA)染料在室溫下一起培育1h以藉由SDS-PAGE凝膠證實pAMF位點，且使用Syngene G-box凝膠成像儀記錄螢光讀出。

根據類似上述方法之方法使用CFPS來製備未由nnAA修飾之多肽。圖12展示表現於CFPS中之GAS蛋白抗原及所選免疫原性核心片段之模組架構。

對SpyAD (SEQ ID NO: 9)實施單位點誘變研究以理解使用pAMF代替單一胺基酸殘基對表現之影響，如在總蛋白及可溶性蛋白二者中所量測。圖1A展示源自離胺酸掃描誘變研究之表現含量。如所展示，將pAMF殘基引入SpyAD蛋白中之單一點處對總蛋白及可溶性蛋白之表現具有可變效應。圖1B展示含有nnAA之抗原及抗原結合物之表現含量。圖13展示SLO變體、C5a肽酶及SpyAD之大於95%之純度(如藉由安全藍(Safe Blue)染色所量測)，且進一步展示將pAMF納入SpyAD變體SpyAD[4pAMF]中 (如藉由DBCO-TAMRA標記所證實)。實例 3 ： 經點擊化學反應性基團修飾之鼠李糖多醣之合成及純化

使用逐步方式合成經DBCO修飾之多醣，從而容許調整寡聚物長度。

單醣中間體 4a 及 4b 之合成 ：對單體1 實施單苄基化以提供2 ，進一步實施苄基保護以得到中間體3a 。使用乙醯丙酸在酯化條件下處理3a 以提供乙醯丙酸(Lev)酯單體4a 。或者，對3a 實施Fmoc保護以提供單體4b 。

二醣供體 7a 及 7b 之合成 ：將單醣中間體4a/b 轉化成磷酸酯5a/b ，隨後使用TMSOTf及6a 處理以提供二醣供體7a/b 。

具有點擊化學反應性基團之鼠李糖八醣之合成 ：使疊氮化物中間體8 在NIS/TfOH存在下偶合至單醣中間體4b 以得到二聚體9b ，然後使用二醣供體7b 實施三個連續去保護/偶合反應序列以得到經部分保護之八聚體中間體12b 。使用LiOH/甲醇處理12b 會水解乙醯丙酸酯以得到13 ，且使用H₂ NNH₂ /Pd(OH)₂ 進一步處理會同時還原側接疊氮化物且還原性裂解剩餘苄基醚以提供14 。使14 與DBCO-NHS偶合會得到最終八醣15 。

可藉由改變使用供體7b 之去保護/偶合序列(如上述一般反應圖中所展示)之數量來製備具有不同長度之多醣(例如十二醣及六醣)。

亦可經由固相合成使用源自單體4a 之上述中間體之經Fmoc保護之衍生物來合成本發明多醣。實例 4 ： 經純化 PS 與 DBCO-PEG 連接體之鍵聯

可使用DBCO-PEG連接體對經純化多醣(例如藉由實例1之方法所產生者)實施官能化。

通常，向多醣水溶液(在添加所有試劑之後之最終濃度為5.5 mM)中添加硼酸鹽緩衝液(1M, pH 8.5)，其中硼酸鹽在最終體積中之最終濃度為100 mM。然後添加水以填充任何額外反應體積。在劇烈攪拌下添加2.5當量(相對於多醣重複單元)之四氟硼酸1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓(CDAP；來自於乙腈中之100 mg/mL溶液)。將CDAP儲存於-20℃下且溶液必須在即將使用之前製備。在添加CDAP之後5分鐘(此時刻較為關鍵-長於5 min任何時間會導致減少DBCO-PEG-胺納入)，添加0.5莫耳當量之二苯并環辛炔-胺連接體(來自DMSO儲備溶液，最終DMSO濃度為5% v/v)。將DBCO-PEG4-胺連接體儲存於-20℃下且必須在即將使用之前製備。在進一步反應一小時之後，以1:10 (按體積)添加甘胺酸(2M, pH 8.35)以得到200 mM甘胺酸之最終濃度，從而驟冷任何未反應氰酸酯。在驟冷1 h之後，然後經由Zeba旋轉管柱純化所衍生多醣。將2-3 mL溶液添加至每一10 mL Zeba管柱中。以Bound/Free DBCO HPLC方法分析經純化多醣以測定殘餘DBCO-PEG4-胺連接體及DMAP是否藉由管柱純化完全去除。可視需要進一步純化材料。使用蒽酮分析量測多醣濃度，且使用309 nm下之吸光度量測二苯并環辛炔濃度。組合該兩個值以估計經二苯并環辛炔官能基衍生之多醣之百分比。用於CDAP反應之DBCO百分比應介於5-10%之間。

GAC 之 DBCO-PEG4 衍生：在劇烈攪拌下，向GAC於100 mM硼酸鹽緩衝液(pH 8.5)中之6 mM溶液中添加三當量(相對於多醣重複單元)四氟硼酸1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓(CDAP；來自於乙腈中之100 mg/mL溶液)以促進反應性羥基處之氰基化。在添加CDAP之後5分鐘，添加2莫耳當量之於DMSO中之二苯并環辛炔-胺連接體儲備液，其中最終DMSO濃度為5% (v/v)。在DBCO衍生之後，將200 mM甘胺酸添加至反應液中以使淬滅未反應氰酸酯。經由zeba旋轉去鹽管柱純化DBCO源多醣且藉由反相評價所回收材料之純度。在309 nm下監測吸光度時HPLC中之單峰證實，過量DBCO連接體及其他反應副產物已完全去除。最後，使用蒽酮分析(參見下文)量測多醣濃度且使用309 nm下之吸光度量測二苯并環辛炔濃度。組合該兩個值以估計經二苯并環辛炔官能基衍生之多醣之百分比。對於結合而言，GAC之DBCO衍生%保持於5-10%之間。

總多醣濃度之蒽酮分析 ：在冷硫酸中製備蒽酮試劑(Sigma-Aldrich, CAS#90-44-8)之2 mg/ml儲備液，同時在水中製備包含2x鼠李糖之多醣重複單元(PSRU)之1 mM儲備液並作為標準品。一式三份在孔中平鋪(96孔板) 100 µl PSRU儲備液(連續稀釋成參考標準品)或未知試樣(以1:3稀釋)，隨後添加200 µl /孔之蒽酮試劑儲備液。充分混合所有反應液並使用板蓋密封以供在95℃下培育10 min。將板短暫置於冰上以冷卻至環境溫度，然後使用UV/VIS讀板儀在620 nm下量測吸光度。為測定未知試樣之濃度，使用PSRU標準濃度及吸光度來生成最小平方擬合回歸。實例 5 ： 載體蛋白與 DBCO 源多醣之結合

通常，藉由使DBCO基團之環辛炔部分與納入載體蛋白中之nnAA側鏈之疊氮化物部分進行反應，使含有nnAA (例如pAMF)之載體蛋白鐵蛋白(SEQ ID NO: 23)、SpyAD (SEQ ID NO: 34)、ADI (SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 38)、SEQ ID NO: 25及蛋白質D結合至實例3及實例4之經純化DBCO源多醣。DBCO與疊氮化物基團之間之結合反應之試樣方案可參見(例如) Zimmerman等人，Bioconjugate Chemistry , 2014, 25(2), 351-361及Kapoor等人，Biochemistry , 2018, 57(5), 516-519。

pAMF 源 GAC 與 SpyAD 之結合 ：將SpyAD[4pAMF] (SEQ ID NO: 34)與DBCO源GAC以1:1比率[各0.5 mg/ml]混合以促進經由點擊化學之結合。在結合後，抵靠50 kDa截止膜透析反應混合物以去除過量之未反應游離多醣。藉由SEC (多角度光散射) MALS分析所回收結合物且使用蒽酮分析來估計濃度。圖9係概述使用DBCO-(PEG)₄ -NH₂ 衍生GAC且隨後結合至pAMF源SpyAD之反應圖。圖10展示經純化天然GAC、經純化天然SpyAD[4pAMF]及經純化結合物之SEC MALS分析。經純化天然GAC之SEC-MALS分析估計平均分子質量為7.2 kDa。經純化天然SpyAD[4pAMF]之SEC-MALS分析估計平均分子質量為87.3 kDa。經純化結合物之點擊化學後SEC-MALS分析估計平均組合分子質量為153.4 kDa。插圖展示SpyAD[4pAMF]在結合前及結合後之安全藍染色性SDS-PAGE分析，其中在結合之後並無未反應蛋白質剩餘。

使用Agilent HPLC 1100除氣器、溫度受控性自動採樣儀(4℃)、管柱室(25℃)及UV-VIS二極體陣列檢測器(Agilent, Santa Clara, CA)以及DAWN-HELEOS多角度雷射光散射檢測器及Optilab T-rEX差示折射干涉儀(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)來實施SEC MALS-UV-RI，該差示折射干涉儀耦合至三個串聯TOSOH管柱：TSKgel Guard PWXL，6.0 mm ID × 4.0 cm長，12 µm顆粒；TOSOH TSKgel 6000 PWXL，7.8 mm ID × 30 cm長，13 µm顆粒；及TSKgel 3000 PWXL，7.8 mm ID × 30 cm長，7µm顆粒。以0.5 mL/min流速使用由含有5% (v/v)乙腈之0.2 µm過濾性1x PBS組成之移動相且注射50-100 µg試樣以供分析。使用Agilent Open Lab軟體來控制HPLC，且使用Wyatt Astra 7軟體進行數據收集及分子量分析。實例 6 ：由 GAS 抗原及抗原 - 多醣結合物誘導之抗體反應

實施實驗以評價由經純化GAS抗原及其結合物所產生之抗體反應。簡言之，使用50 µg每一指示抗原或結合物或媒劑對照在第0、14及28天經肌內對兔實施免疫。在免疫化之前(預採血)及在免疫化之後第7、21及35天(終末採血)對動物採血。自每一血樣收穫血清且藉由ELISA評價針對免疫化抗原之抗體效價。

對於抗體效價之ELISA分析而言，將所指示重組蛋白抗原以3 µg/孔之濃度平鋪於無菌PBS中。使用100 µL所製備抗原塗覆高結合性平底96孔板，在室溫下培育過夜而無需攪動。使用Aquamax微量板洗滌器利用100 µL PBS + 0.05% Tween 20將板洗滌3次，然後乾燥墨點於紙巾上。使用100 µL試劑稀釋劑2將各孔阻斷2小時。亦可使用100 µL含有1% BSA之PBS。可將加蓋並密封之板在4℃下於阻斷溶液中儲存3天。然後如上所述使用100 µL PBS + 0.05% Tween 20將板洗滌3次。

藉由將試樣稀釋至1x試劑稀釋劑2中(典型稀釋度為1:400至1:10⁶ )來製備血清試樣。然後將100 µL所製備血清添加至板中，隨後培育2小時。使用所彙集免疫化前兔血清作為陰性對照，且使用無兔血清之孔作為背景對照。如上所述使用100 µL PBS = 0.05% Tween 20將板洗滌3次。然後將板與100 µL結合HRP之山羊抗兔IgG (H+L)二級抗體(以1:4000稀釋至1x試劑稀釋劑2中)一起培育2小時。然後如上所述使用100 µL PBS + 0.05% Tween 20將板洗滌3次。遵循製造商說明書來製備TMB受質，且在室溫下添加等體積之試劑A及試劑B。向每孔中添加100 µL所製備TMB受質，且將板在避光下培育不超過30分鐘。向每孔中添加50 µL 2N硫酸以停止反應。在450 nm及540 nm下讀取ELISA板，且自450 nm下之值減去540 nm下之值以進行背景校正。基於截止值:背景對照之吸光度值+ 3*背景對照之標準偏差來測定效價。

如圖2中所展示，與採血前對照相比，使用ADI (SEQ ID NO: 38)、SLO (SEQ ID NO: 32)、C5a (SEQ ID NO: 30)、SpyCEP、Sib35、SpyAD (SEQ ID NO: 33)及SpyAD-PS結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)實施免疫會誘發穩定之抗體反應。亦測試Sfb1，但其生成較弱抗體效價。不同組中之每一個別抗原識別符代表實驗中之不同兔。實例 7 ： GAS- 抗原誘發抗體與 GAS 血清型之結合

實施實驗以評價GAS-抗原誘導結合各種GAS血清型之抗體反應之能力。簡言之，使用20 µg SpyAD-PS結合物或50 µg C5a肽酶在第0、14及28天對兔實施免疫。在免疫化之前(免疫前血清)及在免疫化之後第7、21及35天(免疫血清)對動物採血。自每一血樣收穫血清。

將所有血清試樣在55℃下熱滅活30分鐘。使各種血清型之GAS生長至OD₆₀₀ =0.4，洗滌並以2×10⁸ cfu/mL冷凍。將經冷凍GAS儲備液解凍，添加10%山羊血清，且混合物在室溫下培育1小時。對於結合分析而言，將100 µL經阻斷GAS (以及山羊血清)添加至1.5 mL微離心管中。將2 µL免疫前或免疫血清添加至每一管中。充分混合試樣並在室溫下培育1小時。將試樣在3500 G下旋轉5分鐘並使用500 µL PBS洗滌1次。然後將試樣與螢光二級抗兔二級抗體一起培育。然後將試樣轉移至置於500 µL PBS中之FACS管中。藉由流式細胞術量測螢光信號強度並使用FlowJo軟體計算，且比較免疫血清及免疫前血清之信號強度。

圖3A展示使用SpyAD結合物(SEQ ID NO: 34之結合物)實施免疫後之血清與免疫前血清對M1菌株(1-21)之IgG結合。圖3B展示使用C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)實施免疫後之血清與免疫前血清對各種M1菌株(1-21)之IgG結合。SpyAD結合物及C5a肽酶之IgG與所有臨床相關GAS菌株之結合程度展示於圖3C中，其中二者展示強烈結合至＞ 95%之臨床相關GAS。

GAS 疫苗抗原之免疫原性之其他評估 ：根據上述方案，使用5 µg於240 µL總體積琥珀酸鹽緩衝液(加有佐劑Adju-phos (Invivogen))中之SLO、C5a肽酶或SpyAD-GAC結合物對動物實施免疫。為測定由接種疫苗誘發之免疫球蛋白g (IgG)效價，藉由ELISA評估終末採血(第35天)兔抗血清。對於所有三種蛋白質抗原(SpyAD、C5a肽酶及SLO)而言，與自免疫化前兔彙集之血清(「免疫前(彙集)」)或其他免疫化兔組相比，經重組蛋白免疫化之兔組展示針對靶抗原之顯著增加(3-至4-log₁₀ 倍)之抗體效價(圖3D，每一點代表衍生自一種動物之血清，每組使用2-3隻動物運行)，從而證實了對每一各別抗原之反應特異性。由SpyAD-GAC結合物生成之抗SpyAD蛋白效價並不差於僅SpyAD重組蛋白之效價，從而表明關鍵B細胞表位不受pAMF位點影響。使用流式細胞術來評估兔源IgG與不同M蛋白血清型(m1-6、M12、M28)之8種活野生型GAS菌株之表面之結合親和力。對於大多數菌株而言，各別免疫化血清之結合較免疫前血清之基線IgG結合增加1000-400% (圖3E，每一直方圖中之右上角中之數值展示增加之免疫化兔血清信號免疫化前血清信號的平均百分比)。對於8種菌株中之6種而言，針對SpyAD-GAC結合物產生之抗血清之GAS表面結合大約兩倍於使用僅針對SpyAD產生之抗血清所看到的IgG結合程度。圖3F展示兔IgG與SpyAD敲除性GAS之結合，從而證實了與天然GAC之結合。實例 8 ： 嗜中性球殺死分析

實施實驗以測定來自抗原及結合物免疫化兔之免疫血清誘發M1、M3及M3GAS菌株之嗜中性球殺死之能力。根據實例7中所闡述之方案使用指示抗原對兔實施免疫。對於單一抗原而言，使用50 µg抗原對兔實施免疫。對於結合抗原而言，使用20 µg結合物對兔實施免疫。

嗜中性球分離 ：使用21 G蝴蝶針自健康志願者將25 mL血液抽取至真空肝素管中。遵循製造商方案使用Polymorphprep自新鮮血液分離嗜中性球。所有血清(包括免疫前血清、免疫血清及FBS)在65℃下加熱30分鐘並偶爾混合，然後用於分析中。

嗜中性球殺死分析方案 ：將GAS菌株之過夜培養物以1:10之比率接種於托德休伊特培養液(Todd Hewitt Broth，THB)中。在培養物達到OD₆₀₀ =0.4時，離心培養物並再懸浮於含有10%免疫前或免疫血清之HBSS中直至達到5×10⁵ 個群落形成單位(CFU)/mL。將GAS菌株在室溫下於RPMI +血清中保持30分鐘。將所製備嗜中性球以5×10⁶ 個細胞/mL之濃度再懸浮於HBSS + 4% FBS + 4%仔兔補體(BRC)中。將100 µL嗜中性球(5×10⁵ 個細胞)接種於96孔平底板中，其中一式三份運行每一條件。將100 µL所製備細菌(5×10⁴ cfu/孔)添加至每一嗜中性球孔中。將所接種細菌以連續稀釋液形式平鋪於血液瓊脂板上以隨後對接種物cfu進行計數。將96孔板在500 G下離心5分鐘且然後在37℃ + 5% CO₂ 下培育30分鐘。在培育30分鐘後，充分混合試樣，以連續稀釋液形式平鋪於血液瓊脂板上，並在37℃下培育過夜。對GAS群落進行計數且將接種物CFU對所回收CFU之比率%計算為存活%。藉由首先計算免疫前血清組及免疫血清組中之殺死% (100-存活%)來計算與免疫前血清組相比之殺死%增加。然後，計算免疫血清組之殺死%與免疫前血清組之殺死%相比之增加。

圖4展示源自抗原ADI 1625 (SEQ ID NO: 36)、ADI結合突變體1807 (經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)、ADI結合突變體1809 (SEQ ID NO: 38之結合物)、SLO 1627 (SEQ ID NO: 32)、C5a肽酶1630 (SEQ ID NO: 30)、SpyAD 1642 (SEQ ID NO: 33)、SpyAD結合物1644、1630+1627+1644、1630+1627+1809、1630+1627及M1之免疫化之血清較免疫前血清增加GAS血清型M1、M2及M3之殺死的能力。使用SEQ ID NO: 12之肽來製備經pAMF取代之SpyAD結合物，且使用SEQ ID NO: 20之肽來製備ADI結合物。實例 9 ： GAS 抗原及結合物誘發增加 GAS 攻擊後存活之主動免疫反應

在藉由真皮下及腹膜腔內注射進行攻擊之前對小鼠實施主動免疫。表 5 ： 主動免疫化實驗時間線 - 真皮下及腹膜腔內攻擊

真皮下攻擊 - 步驟	腹膜腔內攻擊 - 步驟
第1天：第1免疫化	第1天：第1免疫化
第14天：第2免疫化	第14天：第2免疫化
第28天：第3免疫化	第28天：第3免疫化
第42天：感染攻擊	第41天：將小鼠剃毛
第49天：終止實驗	第42天：感染攻擊
	第45天：使小鼠安樂死並收集病灶

第 1 、第 2 及第 3 免疫化 - 真皮下及腹膜腔內攻擊 ：藉由組合50 µL明礬(鋁膠)與10 µg抗原或5 µg結合物並充分混合以使抗原吸附於明礬上來製備抗原/佐劑混合物。將每一抗原/佐劑混合物抽取至配備有26 ½號針之1 mL注射器中。使用吸入之異氟醚將每一小鼠麻醉並將100 µL所製備疫苗注射至後腿肌肉中。

攻擊用小鼠之準備 - 真皮下攻擊 ：使用異氟醚將小鼠麻醉。使用電動剃刀將小鼠之後背剃毛，注意不要劃傷皮膚。將脫毛膏施加至經剃毛後背上且靜置幾分鐘，然後使用紙巾將其充分擦拭乾淨。將小鼠拍乾並使其自異氟醚處理恢復。

攻擊用材料之製備 - 真皮下及腹膜腔內攻擊 ：使M1 89155菌株GAS生長至對數生長中期。使用無菌磷酸鹽緩衝鹽水調節細胞濃度，連續稀釋細菌並平鋪於瓊脂上以證實細菌劑量。對於真皮下攻擊而言，靶向CFU/10 µL/小鼠為1×10⁶ ，且將細菌抽取至配備有26 ½號針之500 µL漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)中。對腹膜腔內攻擊而言，在第35天，靶向CFU/100 µL/小鼠為1×10⁷ ，且將細菌抽取至配備有26 ½號針之1 mL注射器中。使用吸入之異氟醚將小鼠麻醉且然後將200 µL M1 89155細菌注射至腹膜腔中。使小鼠在正常空氣中自麻醉狀態恢復。在1週過程中追蹤小鼠存活，並每天檢查多次。

真皮下攻擊及病灶收集 ：對於真皮下攻擊而言，在第35天，使用吸入之異氟醚將小鼠麻醉且然後使用漢密爾頓注射器之重複分配器將10 µL M1 89155細菌注射至經剃毛後背中。在3天過程中，每天藉由使經異氟醚麻醉之小鼠與尺子並排進行拍照來追蹤病灶大小。在第3天收集病灶之前，針對每一皮膚病灶準備含有1.0 mm二氧化矽珠粒及1 mL PBS之無菌2 mL螺口管。記錄每一管之重量。在第3天，當病灶完全發展時，使用CO₂ 及頸椎脫位術對小鼠實施安樂死。使用清潔手術儀器，切下每一皮膚病灶並置於預稱重管中。記錄管重以供組織質量計算。將該等管置於MagnaLyser珠粒攪拌器中，且將該等管在6000 rpm下攪拌60 s。然後將該等管置於冰上以冷卻60 s，隨後重複攪拌循環。連續稀釋試樣，且將溶解物置於瓊脂上以量化細菌負荷。

實施兩個平行實驗，其中在整個實驗中對一組動物採血以測試接種疫苗後之抗原特異性抗體效價。在另一組中，在實驗過程期間並不對小鼠採血。最後以類似方式攻擊兩組動物以實施病灶大小及CFU/mg分析。圖5A展示採血組主動免疫化實驗之結果(如藉由病灶大小及病灶CFU/mg所量測)，從而證實本發明結合物之性能優於單獨之多醣。類似地，圖5B展示非採血組主動免疫化實驗之結果(如藉由病灶大小及病灶CFU/mg所量測)，其中SpyAD (經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)及ADI (ADImut2結合物使用經pAMF取代之SEQ ID NO: 27，且ADImut5結合物使用經pAMF取代之SEQ ID NO: 38)之GAC結合物所提供保護優於相應之單獨蛋白質。最佳保護係由C5a肽酶(SEQ ID NO: 4)賦予。圖5C展示每一免疫化後之第一、第二及第三抗體效價。圖5D展示經受主動免疫化且隨後經受腹膜腔內攻擊之小鼠之存活數據。展示一定保護之唯一組係投與總共30 µg蛋白質之6抗原組合之組。

使用抗原或抗原結合物組合之主動免疫化 ：如上所述，在藉由腹膜腔內注射進行攻擊之前使用一或多種抗原或抗原結合物對小鼠實施主動免疫。表 6 ： 主動免疫化實驗時間線 - 真皮下及腹膜腔內攻擊

腹膜腔內攻擊 - 步驟

第1天：第1免疫化

第14天：第2免疫化

第28天：第3免疫化

第42天：腹膜腔內攻擊

使用以下8種治療中之一者對小鼠(n=10/組)實施免疫：模擬免疫化(PBS +明礬)；5 µg SpyAD-GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)；5 µg ADImut5-GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)；10 µg C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)；10 µg鏈球菌溶血素O (SEQ ID NO: 32)；10 µg C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)及10 µg鏈球菌溶血素O (SEQ ID NO: 32)之組合；10 µg C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)、10 µg鏈球菌溶血素O (SEQ ID NO: 32)及5 µg SpyAD-GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)之組合；或10 µg C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)、10 µg鏈球菌溶血素O (SEQ ID NO: 32)及5 µg ADImut5-GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)之組合。使用SEQ ID NO: 12之肽來製備SpyAD結合物，且使用SEQ ID NO: 20之肽來製備ADImut5結合物。

圖5E展示在腹膜腔內攻擊之後經單一抗原/抗原結合物或兩種抗原/抗原結合物(組合)主動免疫化之小鼠之存活。僅經SLO免疫化之小鼠具有最大存活，但並無個別抗原或雙抗原組合在攻擊之後6天提供100%之保護。值得注意地，在腹膜腔內攻擊之前使用三元組合對小鼠實施主動免疫時，在6天之後觀察到100%存活。該等數據展示於圖5F中。實例 10 ： GAS 抗原及結合物誘發增加 GAS 攻擊後存活之被動免疫反應

在藉由腹膜腔內注射進行攻擊之前對小鼠實施被動免疫。

實施實驗以評價由自GAS抗原及GAS結合物免疫化小鼠分離之抗血清在轉移至隨後使用GAS攻擊之小鼠時所賦予之保護作用。簡言之，使用5 µg ADI抗原(SEQ ID NO: 36)、C5a抗原(SEQ ID NO: 30)、Sfb1抗原(SEQ ID NO: 28)、SpyAD抗原(SEQ ID NO: 33)、ADI:GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)或SpyAD:GAC結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)在第0、3及6週對兔接種疫苗。在第8週自每一動物收集血清。

被動免疫化 - 腹膜腔內攻擊 ：將在冰上轉移之經解凍兔血清(大約 200 uL/小鼠)抽取至配備有30號針之1 mL注射器中。使用無菌磷酸鹽緩衝鹽水稀釋生長至對數生長中期之M1 89155菌株GAS以調節細胞濃度。靶向CFU/100 µL/小鼠為1×10⁷ ，且將細菌抽取至配備有26 ½號針之1 mL注射器中。將兔血清在注射器中升溫至室溫，且使用吸入之異氟醚將小鼠麻醉。將200 µL兔血清經眶後轉移至每一經麻醉小鼠中。在血清轉移之後5分鐘，將200 µL M1 81955細菌注射至腹膜腔中，且使小鼠在正常空氣中自異氟醚恢復。在1週過程中追蹤小鼠存活，並每天檢查多次。

已經受被動免疫化且實施後續GAS攻擊之小鼠之存活展示於圖6A及圖6B中。所有經SLO 1627之抗原及抗原結合物(pAMF結合物)、ADI結合物Mut5 1809、SpyAD結合物1644、C5a肽酶1630、SLO+C5a肽酶、SLO+C5a+ADI結合物及SLO+C5a+SpyAD結合物治療之組皆較免疫前免疫化小組展示改良之存活。實例 11 ： GAS 抗原及結合物誘發增加 GAS 攻擊後之存活之被動免疫反應

在攻擊之前藉由真皮下注射對小鼠實施被動免疫。表 7 ： 被動免疫化實驗時間線 - 真皮下攻擊

真皮下攻擊 - 步驟

第1天：準備小鼠

第0天：製備材料、血清轉移及攻擊

第3天：病灶收集

材料製備、血清轉移及攻擊 - 真皮下攻擊 ：使M1 89155菌株GAS生長至對數生長中期。使用無菌磷酸鹽緩衝鹽水調節細胞濃度，連續稀釋細菌並平鋪於瓊脂上以證實細菌劑量。對於真皮下攻擊而言，靶向CFU/10 µL/小鼠為1×10⁶ ，且將細菌抽取至配備有26 ½號針之500 µL漢密爾頓注射器中。將兔血清解凍並轉移於冰上，然後抽取至配備有30號針之1 mL注射器中。將兔血清在注射器中升溫至室溫，且使用吸入之異氟醚將小鼠麻醉。將200 µL兔血清經眶後轉移至每一經麻醉小鼠中。在血清轉移之後5分鐘，使用重複分配器將10 µL M1 81955細菌注射至小鼠之經剃毛後背中，且使小鼠在正常空氣中自異氟醚恢復。在3天過程中，每天藉由對位於尺子旁邊之經異氟醚麻醉之小鼠拍照來追蹤病灶大小。

細菌負荷分析之病灶收集 ：在第3天於病灶收集之前，每一皮膚病灶準備含有1.0 mm二氧化矽珠粒及1 mL PBS之無菌2 mL螺口管。記錄每一管之重量。在第3天，當病灶完全發展時，使用CO₂ 及頸椎脫位術對小鼠實施安樂死。使用清潔手術儀器，切下每一皮膚病灶並置於預稱重管中。記錄管重以供組織質量計算。將該等管置於MagnaLyser珠粒攪拌器中，且將該等管在6000 rpm下攪拌60 s。然後將該等管置於冰上以冷卻60 s，隨後重複攪拌循環。連續稀釋試樣，且將溶解物置於瓊脂上以量化細菌負荷。

已經受被動免疫化且使用GAS實施真皮下攻擊之小鼠之病灶大小及細菌負荷數據展示於圖7中。小鼠(n=10，經抗原及抗原結合物ADI (SEQ ID NO: 36)、ADI結合物(SEQ ID NO: 38)、SLO (SEQ ID NO: 32)、C5a肽酶(SEQ ID NO: 30)、sfb1 (SEQ ID NO: 28)、SpyAD (SEQ ID NO: 33)、SpyAD結合物(經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)治療)在48h之後所展現之病灶大小小於免疫前小組，且大部分組中之細菌負荷在72小時之後顯著降低，其中SpyAD結合物減小細菌負荷之性能最佳。實例 12 ：人類 I 期及 IIA 期臨床試驗設計

初始I期臨床研究係在18-29歲健康成人(N=96)中進行之隨機化、安慰劑對照、遞增劑量之研究(表3)。此初始臨床研究之目標係安全性、劑量反應及免疫原性(IgG抗體)。因此年齡範圍內之許多個體具有預存在之GAS暴露及免疫性，故全面評估基線免疫性以理解預存在免疫性對疫苗反應之影響。評估對於每一疫苗組分之IgG反應及針對不同組中不同M血清型之同時GAS分離物之OPK抗體效價。表 8 ： I 期臨床試驗組

I 期臨床試驗設計
組	N	治療	劑量	時間表
1A	24	GAS疫苗	低	第0、28天
1B	8	安慰劑		第0、28天
2A	24	GAS疫苗	中等	第0、28天
2B	8	安慰劑		第0、28天
3A	24	GAS疫苗	高	第0、28天
3B	8	安慰劑		第0、28天

2A期臨床研究係隨機化、安慰劑對照、多中心之研究，其用以在10至17歲個體、隨後5至9歲兒童之連續小組(N=96)中評估疫苗(表4)。此研究之目標係評估安全性、免疫原性(血清之IgG抗體反應及調理吞噬殺死活性)及初步效能(GAS咽炎發生率)。監測每一患者12個月以測定治療組中之鏈球菌咽炎發生率。表 9 ： IIA 期臨床試驗組

IIA 期臨床試驗設計
N	年齡 ( 歲 )	治療	劑量	時間表
36	10-17	GAS疫苗	由PI決定	第0、28天
12	10-17	安慰劑		第0、28天
36	5-9	GAS疫苗	中等	第0、28天
12	5-9	安慰劑		第0、28天

實例 13 ： GAS 結合物在交叉反應性實驗中誘導生成結合至福氏志賀桿菌 2a OPS 之抗血清

實施實驗以評價由經純化GAS結合物產生之抗血清與福氏志賀桿菌2a O-抗原多醣(OPS)之結合。

OPS 純化：直接自經pSEC10-wzzB質體轉變以過度表現wzzB (從而增加OPS鏈長)之志賀桿菌細胞生質中之脂多醣(LPS)收穫OPS，且藉由使用冰乙酸將培養物pH降至3.5-3.7並在100℃下於浸沒於沸騰水浴中之玻璃瓶中培育4 h來條件化發酵生長培養基(補充有胺基酸)或搖瓶(STm D65)培養物。藉由在Sorvall RC5冷凍離心機中使用GS3轉子於4℃下以10k × g離心30分鐘來分離水解後上清液與不溶性材料。將上清液部分加入1 M NaCl中並藉由切向流微過濾經由0.2 μm空心纖維過濾器在4.5 psi跨膜壓(TMP)下過濾，使全部體積通過，隨後使用等效體積之1 M NaCl沖洗。然後將0.2 μm清除之1 M NaCl滲透液在30 kDa Hydrosart TFF膜上於14 psi TMP下濃縮10倍，且針對35透析體積之1 M NaCl、隨後10透析體積之50 mM Tris (pH 7)進行透析。

然後以10 mL/min (於20 mM Tris (pH 7)、50 mM NaCl中)使於20 mM Tris (pH 7)、50 mM NaCl中之滯留物部分通過3 × 3 mL Sartobind NanoQ陰離子交換膜(串聯連接，使用AKTA Purifier)。將流經部分加入25% (v/v)硫酸銨中並在4˚C下培育過夜。藉由在Sorvall RC5 冷凍離心機中使用GS3轉子於10k × g / 4℃下離心30 min且隨後經由0.45 μm Stericup真空過濾單元(Millipore, MA)過濾來去除沈澱材料。然後利用Slice 200 TFF裝置使用10 kDa Hydrosart膜在7.5 psi TMP下藉由TFF將濾液濃縮10倍，且針對10透析體積之去離子水進行透析。將TFF滯留物凍乾並儲存於-20℃下直至使用。

免疫化 ：簡言之，根據實例6之方案使用ADI-mut2、ADI-mut5及SpyAD結合物經肌內對兔實施免疫。

血清 IgG ELISA ：自每一終末抽血收穫血清，且藉由ELISA評價針對福氏志賀桿菌2a OPS之血清IgG抗體效價。如下所述來製備2a OPS抗原之工作溶液：將5.0 μg/ml之經純化2a OPS稀釋於碳酸鹽塗覆緩衝液(pH 9.6)中。隨後，藉由向每一板孔中添加100 μl工作溶液來塗覆Immulon 2HB 「U形」底微量滴定板(Thermo Labsystems #3655)。然後將板在37℃下培育3 h。在該培育後，使用PBS-Tween (0.05%)將板洗滌6次且在各洗滌之間浸泡兩分鐘之時段。然後在4℃下使用含有10%脫脂奶粉(NFDM)之1X PBS以250 μl/孔過夜阻斷板。在阻斷之後，如上所述再次洗滌板。

將測試試樣(兔血清)及採血前對照稀釋於PBS-Tween 10% NFDM中並添加至板中。在每一板上實施一系列稀釋且一式兩份來測試樣品及對照。如上文所闡述，將板在37℃下培育1 h且然後使用PBS-Tween洗滌。接下來，將經辣根過氧化物酶(HRP)標記之抗兔IgG (Invitrogen #65-6120)在PBS-Tween 10%脫脂奶粉(NFDM)中稀釋至1:2000。使所有孔皆接收100 μl適當抗體溶液且將板在37℃下培育1 h。再次洗滌板且將100 μl TMB Microwell過氧化物酶受質(SeraCare #5120-0047)添加至每一孔中。將板在室溫及攪動下於暗處培育15分鐘。藉由向所有孔中添加100 μl 1M磷酸來停止比色反應。立即使用Multiskan FC^TM 微量板讀數儀量測450nm下之吸光度值。

圖8展示效價分析之結果。值得注意地，衍生自所有三種GAS結合物ADI-mut2 (經pAMF取代之SEQ ID NO: 27之結合物)、ADI-mut5 (經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)及SpyAD (經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)之血清皆展現，其在1:10稀釋度下之福氏志賀桿菌2a OPS結合最多係採血前對照之大約60倍。實例 14 ： GAS 結合物在血清殺細菌分析 (SBA) 中顯示針對福氏志賀桿菌菌株之殺細菌活性

實施實驗以測定來自GAS結合物免疫化兔之免疫血清誘發福氏志賀桿菌菌株之嗜中性球殺死之能力。使用指示結合物根據實例7中所闡述之方案對兔實施免疫，然後實施殺細菌分析。簡言之，根據前述方法來實施血清殺細菌分析(SBA)及群落數位影像分析(Nahm等人，mSphere, 2018, 2018年6月13日；3(3), pii: e00146-18；及其中所涉及之SBA方案)。

表9展示源自藉由SpyAD結合物1645 (經pAMF取代之SEQ ID NO: 34之結合物)及ADI結合物突變體1807、1808、1809及1810 (經pAMF取代之SEQ ID NO: 38之結合物)之免疫化之血清針對福氏志賀桿菌2a、3a及6之殺細菌能力。所展示值係SBA (血清殺細菌活性)效價，且所有5種結合物皆相對於免疫前控制顯示殺細菌活性。針對宋內氏志賀桿菌(S. sonnei )未觀察到殺死，且此組中之效價由此報告為所測試最低稀釋度之一半。如先前所闡述，使用PnQC19 (一種人類對照血清)來正規化志賀桿菌SBA效價(Nahm等人，mSphere, 2018, 2018年6月13日；3(3), pii: e00146-18)。針對福氏志賀桿菌6所展示之效價係原始效價之平均值(2個實驗)。並未向福氏志賀桿菌6指派PnQC19值。表 10 ：兔 GAS 抗體之血清殺細菌活性

結合物	福氏志賀桿菌 2a	福氏志賀桿菌 3a	福氏志賀桿菌 6	宋內氏志賀桿菌
免疫前血清	nd	nd	233	nd
1645	1301	1333	980	30
1807	384	2496	553	30
1808	671	703	394	30
1809	487	1325	1401	30
1810	1654	652	532	30
PnQC19	28000	19000	6915	1100

實例 15 ：使用 SpyAD-GAC 進行免疫化並不誘發可檢測含量之與人類心臟表位交叉反應之抗體

藉由SDS-PAGE使用4-12% Bis-Tris凝膠分離不同量之正常成人人類心臟組織溶解物(Novus Biologicals目錄號：NB820-59217)與含有SDS之變性上樣染料，然後使用製造商方案藉由iBlot (Thermo Fisher)轉移於PVDF膜上。最後，將墨點在環境溫度下阻斷1 h，隨後使用針對每一GAS抗原生成之兔抗血清(以1:1000稀釋)進行探究。在三個30 min洗滌之後，添加結合HRP之抗兔(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.，目錄號：211-035-109)二級抗體(以1:10,000稀釋)並在一起培育墨點與pico受質(Thermo Fisher Scientific目錄號：34580)之後於Syngene G-Box F3影像掃描儀上記錄化學發光。墨點阻斷、洗滌及抗體/血清稀釋皆稀釋於TBS + 5% BSA中。

在藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳分離之正常人類心臟溶解物中對SLO、C5a肽酶及SpyAD-GAC兔免疫血清實施西方墨點分析。使用相同兔免疫化方案針對完整GAS M1蛋白產生之抗體用作對照。如圖 11 中所展示，儘管抗M1抗血清與溶解物之極高分子量組分發生反應，針對SLO (SEQ ID NO: 8)、C5a肽酶(SEQ ID NO: 4)及SpyAD-GAC (經pAMF取代之SEQ ID NO: 12之結合物)抗血清未看到與人類心臟組織之交叉反應性，且該等抗血清識別各別同族GAS蛋白(或在SpyAD-GAC之情形下識別蛋白質載體)。此分析與以下情形一致：(a) SLO、C5a肽酶或SpyAD與人類蛋白質缺乏序列同源性，及(b)在基因缺失GlcNAc側鏈(其代表常見哺乳動物糖表位)後GAC通常僅包含重複鼠李糖(不存在於人類中之一種糖)。實例 16 ： 表現經截短 SLO 肽並評價其在兔模型及鼠類模型二者中之免疫原性

舉例而言，根據上述方法來表現經截短SLO變體。圖15展示10種對應於SEQ ID NO: 44至SEQ ID NO: 53 (TEV裂解後)之該等變體序列(ΔC11、ΔC21、ΔC31、ΔC41、ΔC51、ΔC61、ΔC71、ΔC81、ΔC91及ΔC101)之圖示。圖16展示該等變體之表現(以總蛋白濃度及可溶性蛋白濃度兩種形式)以及其相應凝膠。值得注意的是，在每一變體中觀察到差異性截短模式。一些變體(如ΔC41及ΔC51)具有約50 kDa之若干緊密洗脫帶，而諸如ΔC31或ΔC81等變體則並不展示對應於分子質量之任何可辨別帶。

圖17比較在藉由HisTrap層析進行初始純化之後若干肽(包括經截短SLO變體)之表現。變體ΔC91及ΔC101表現為對應於正確蛋白質分子質量之單一獨特帶以及一些較小截短片段。圖18及圖19比較在TEV裂解以及藉由HisTrap (圖18)及粒徑篩析層析(圖19)再純化之步驟期間之SLO以及變體ΔC91及ΔC101。

免疫化兔血清之生成 ：經由類似於上述方案之方案使用明礬+ 50 µg SLO、SLO ΔC91或SLO ΔC101經肌內對兔實施免疫。對動物進行採血，且在第0、7、21及35天分析血清針對每一各別抗原之ELISA效價。圖20展示三種SLO變體中之每一者之ELISA效價。

使用多價醣結合物疫苗實施免疫會顯著抵抗全身性及真皮內 GAS 攻擊：藉由在第0、14及28天經肌內注射抗原來對CD-1小鼠實施主動免疫以檢驗增強之細菌清除對SpyAD-GAC + SLO(ΔC101) + C5a肽酶之3組分/4GAS抗原調配物之強保護效能的貢獻。在攻擊後第42天自9隻免疫化(及10隻模擬免疫)動物收集小鼠血清，並測試該等抗血清促進藉新分離人類嗜中性球對M1 GAS之離體OPK殺死之效能(圖21)。在使用免疫後SpyAD-GACPR290 + SLO(ΔC101) + C5a肽酶小鼠抗血清調理GAS時，在嗜中性球暴露後回收到約20%之原始M1 GAS接種物，與之相比，在使用模擬免疫小鼠血清調理GAS之對照研究中則回收到約60% CFU (圖21，P ＜ 0.01)。同樣，使用真皮內M1 GAS感染攻擊經SpyAD-GACPR + SLO(ΔC101) + C5a肽酶或模擬(僅PBS及佐劑)對照免疫化之小鼠。由所得急性發炎性反應生成之壞死病灶之大小並不在兩組之間顯著不同(圖22A及22B)，但在SpyAD-GACPR + SLO(ΔC101) + C5a肽酶免疫化組中，感染部位處之清除組織中之回收細菌CFU/gm減小兩倍以上(圖22C，P = 0.0012)。

用以評價是否存在針對 SLO 變體之功能抗體之紅血球溶血分析 ：測試在添加至紅血球中時針對SLO截短變體之抗血清阻斷相應SLO之溶血活性的能力。圖23展示在將0.1 µg/mL重組SLO添加至含有紅血球及抗血清之孔中時之結果。全長SLO及SLO(ΔC101)抗血清阻斷細胞溶解，而SLO(ΔC91)抗血清則不阻斷溶解。

疫苗抗血清之 GAS 調理吞噬性殺死及 SLO 活性阻斷之評估 ：使用5種不同M蛋白血清型之GAS菌株(M1-M5)評估針對GAS疫苗抗原(SLO、C5a肽酶、SpyAD及SpyAD-GAC)產生之兔抗血清促進人類嗜中性球調理吞噬性殺死(OPK)之能力。藉由使用各別熱滅活抗血清或免疫前血清對照預調理30 min來實施此分析，然後在感染複數(MOI) = 0.1個細菌/嗜中性球下於2%仔兔補體存在下暴露於新分離人類嗜中性球30 min。所有抗血清皆誘導在GAS之短期OPK發生統計學上顯著之增加(圖24A)。該分析所使用之GAS接種物係在MOI = 0.00140或MOI = 0.000141下採用人類前髓細胞性白血病HL-60細胞系之公開OPK分析之100至1,000倍，從而更準確地概括支持主要人類先天性免疫細胞功能之免疫化靶。以類似方式來評估針對SpyAD蛋白及SpyAD-GAC產生之抗血清。此外，由針對SLO、C5a肽酶及SpyAD-GAC產生之每一抗血清之三分之一構成以維持一致總血清濃度之組合抗血清的性能類似於或優於個別組分，從而指示其OPK功能並無交叉253干擾。因SLO係並不錨定至GAS表面之分泌性細胞毒素，故其對增強之嗜中性球殺死之貢獻並不源自增加吞噬性攝取，而係源自減小嗜中性球抗微生物功能之SLO介導之膜損害及損傷。不論由SLO抑或SLO(ΔC101)抗原誘發，抗SLO兔免疫血清皆顯著抑制經純化SLO針對人類紅血球之溶血活性直至稀釋度為1:2,048 (圖24B)。另外，抗SLO或抗SLO(ΔC101)免疫血清同等程度地保留針對GAS上清液(SLO)介導之抑制之嗜中性球氧化爆發功能(過氧化物生成) (圖24C)。

以類似於彼等上述方法運行之IgG結合分析來測試其他血清型。在三劑量免疫化(在第0、14及28天經肌內注射抗原)後第42天自9隻免疫化(及10隻模擬免疫化)動物收集小鼠血清，且經由流式細胞術針對活GAS菌株之IgG結合來測試該等抗血清之效能。自經3劑量模擬或組合SpyAD-GACP R + SLO(ΔC101) + C5a肽酶免疫化之雌性CD-1小鼠收集血清。圖25A及25B展示來自結合至多種血清型之GAS表面抗原之模擬抗血清(亮直方圖)或多價組合抗血清(暗直方圖)之鼠類IgG的螢光強度，如經由流式細胞術所量化。平均螢光強度匯總於柱形散佈圖中，每一點代表個別小鼠血清(圓係模擬治療小鼠，且正方形係治療組小鼠)。添加甲氧西林(Methicillin)抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) USA300作為對照以展示IgG結合之GAS特異性。實例 17 ： 表現具有 3 或 4 個 nnAA 之經截短 SLO( Δ C101) 多肽且結合

舉例而言，根據上述方法來表現含有nnAA之經截短SLO(ΔC101)變體。該等變體含有3或4個對應於SEQ ID NO: 55至SEQ ID NO: 64之pAMF殘基。SEQ ID NO: 54含有所有含nnAA殘基。圖26展示該10種變體之表現含量(以總蛋白濃度及可溶性蛋白濃度兩種形式)以及其相應凝膠。如先前所闡述進行純化。簡言之，收穫CFPS物，旋轉並過濾，然後以0.75 ml/min加載於預平衡hisTRAP excel 1 ml管柱上並在單一步驟中使用於6 ml最終體積中之250 mM咪唑進行洗脫。使用SDS-PAGE分析5 ul之每一步驟部分。圖27A展示藉由hisTRAP初始純化後之變體凝膠。然後將hisTRAP洗脫部分在50 mM Tris (pH8)中稀釋3倍以使最終鹽濃度達到50 mM NaCl，然後加載於AEX管柱上。使用SDS-PAGE分析來分析FT及洗脫部分以檢測是否存在每一變體。圖27B展示第二純化步驟後之變體凝膠。表11展示在自2-2.5 mL溶液回收之後所表現變體之最終濃度。表 11 ： 純化後之最終變體濃度

蛋白質名稱	濃度(mg/ml)
SLO(ΔC101)-var1	0.8
SLO(ΔC101)-var2	1.0
SLO(ΔC101)-var3	0.6
SLO(ΔC101)-var4	1.0
SLO(ΔC101)-var5	1.2
SLO(ΔC101)-var6	2.7
SLO(ΔC101)-var7	2.3
SLO(ΔC101)-var8	1.0
SLO(ΔC101)-var9	2.2
SLO(ΔC101)-var10	1.6

使SLO (ΔC101)變體結合至如上文所闡述之DBCO源GAC。圖28展示每一變體之具體結合條件。如圖29中所展示，藉由SDS page分析結合反應。每一凝膠之第一泳道展示結合前蛋白。藉由SEC-MALS測定最終結合物大小，其結果展示於圖30中。實例 18 ： 評價具有 3 或 4 個 nnAA 之經截短 SLO( Δ C101) 多肽在鼠類模型中之免疫原性及其溶血效價

在鼠類模型中藉由如上文在實例9中所闡述之方法來評價實例17之3-及4-pAMF SLO(ΔC101)變體及其多醣結合物。在第0、7及14天對小鼠實施免疫，隨後在第21天處死後進行終末採血。

使用5 µg之實例17之經pAMF取代之SLO(ΔC101)-var1、SLO(ΔC101)-var5、SLO(ΔC101)-var6及SLO(ΔC101)-var10 (對應於SEQ ID NO: 55、59、60及64)中的每一多醣結合物對小鼠實施免疫。在終末採血之後量測之針對SLO(ΔC101)之抗體效價展示於圖31A中。亦在溶血分析中根據實例16之方案來評估相同變體及其GAC結合物。結果展示於圖31B中。圖31C亦展示在終末採血之後量測之抗體效價，然而，此ELISA利用長多醣(藉由實例19之方法產生)而非SLO(ΔC101)作為包被抗原。總而言之，該等數據展示，經pAMF取代之變體SLO(ΔC101)-var1、SLO(ΔC101)-var5、SLO(ΔC101)-var6及SLO(ΔC101)-var10之結合物個別地針對PS及肽組分產生抗體。實例 19 ： 較高分子量 ( 長 ) 多醣之表現、純化及結合

實施實驗以自GAS細菌培養物提取GAS多醣並純化。

鹼水解 ：將所製備GAS細胞糰粒再懸浮於50 mM NaCl溶液中。使用血清學移液管，添加50mL NaCl並渦旋直至再懸浮。添加10N氫氧化鈉及1M硼氫化鈉直至達到4N NaOH及25mM NaBH₄ 之最終濃度。將經再懸浮糰粒分配至各離心瓶中，其中最終靶體積為160mL/1L發酵體積。在分配溶液時，使用恆定渦旋以確保均質性。將瓶置於65℃預加熱培育器中之振盪器上並保持2小時。在培育之後，將水解溶液在25℃下以14,000 x g離心30 min以粒化任何細胞碎屑，應確保在離心之前使水解試樣冷卻至室溫。在停止離心後立即收集上清液以不干擾糰粒，且將上清液中和至pH 6.5 ± 0.3。在中和時，將瓶置於4℃冰浴上，使用37% HCl調節pH，且視需要使用1M NaOH進一步調節。然後將試樣在4℃下培育過夜。

過濾：在培育之後，形成白色沈澱物。將溶液在10,000xg下離心30 min。形成含有宿主細胞蛋白(HCP)之大塊白色糰粒。收集澄清上清液。使用37% HCl將pH調節至3.0，且將溶液在室溫下培育1小時。使用Clarisolve過濾器µPod -40MS過濾試樣。舉例而言：在23mL/min之幫浦流速下，使水流經過濾器直至啟動，且然後打開閥門並使用120mL體積沖洗，並使用120 mL體積之15mM NaCl平衡。使提取物以23mL/min之相同幫浦流速通過過濾器，且收集來自過濾器之澄清滲透液。使用60mL 15mM NaCl洗滌過濾器，且沖洗出管及過濾器內容物。棄除濾液。將試樣pH再調節至6.5 ± 0.3。然後實施切向流過濾(TFF-10k)以去除鹽，濃縮(超濾)，然後緩衝液交換(滲濾)於10mM NaCl中。

變溶菌素 (Mutanolysin) 處理：藉由添加1M MgCl₂ 直至達到1mM MgCl₂ 之最終濃度且添加200 mM磷酸鈉(10×)直至達到20mM磷酸鈉(pH 6.8)之最終濃度來製備用於變溶菌素處理之溶液。添加變溶菌素溶液(5000 IU/mL)直至達到120 IU/mL。將試樣在37℃及振盪下培育過夜。

蛋白酶 -K 處理：然後藉由添加蛋白酶-K溶液直至最終濃度為40 IU/mL (45u/mg蛋白酶-K)來使用蛋白酶-K處理試樣。將混合物在50℃下培育過夜且同時輕輕混合。

沈澱及過濾 ：為使試樣中之酶、核酸及HCP沈澱，添加於20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)中之CTAB，在30℃下振盪1小時。將以下所有所用溶液預熱：PS試樣、5% CTAB儲備溶液及200mM磷酸鹽鈉(pH 6.8)。在加熱的同時混合(磁力攪拌棒) PS溶液，且經加熱攪拌板配備有內部溫度計以始終監測溶液中之溫度。將200mM磷酸鈉(pH 6.8)溶液添加至PS溶液中直至達到20mM磷酸鈉之最終濃度。將5% CTAB添加至PS溶液中直至達到1% CTAB濃度。將溶液混合1小時。使用40MS過濾器，對沈澱溶液實施深度過濾。舉例而言，使用200mL MilliQ H20以23mL/min之幫浦流速沖洗系統，且一旦水開始自排放口流出，則立即關閉排放口，從而迫使溶液自出口流出(底料)。然後使用75mL 20mM磷酸鈉(pH 6.8)及15mM NaCl之溶液沖洗系統。在23mL/min下過濾試樣，並使用60mL 20mM磷酸鈉(pH 6.8)及15mM NaCl溶液以20 mL/min沖洗。收集滲透液直至洗脫出氣泡為止。棄除濾液。

將PS溶液及274 mM KI升溫至30℃。將足量274mM KI添加至混合PS溶液中直至達成27.4mM KI之最終濃度。將混合物在30℃及混合下培育1小時。將溶液在培育後於30℃、10,000xg下離心30分鐘。收集上清液且棄除糰粒，注意糰粒易於破碎。然後經由0.45µm過濾器真空過濾上清液。

首先藉由TFF-10k濃縮試樣，隨後使用9DV之350mM NaCl滲濾且最後使用2 DV之MilliQ水滲濾。舉例而言，TFF系統體積為約35mL，其中幫浦流速設定於200mL/min，且使用9 DV (50mL)之緩衝液在TMP: 7-8 psi下實施滲濾。

然後藉由疏水性相互作用層析使用經3M氯化鈉及50mM磷酸鈉(pH 6.8)預平衡之HiPrep™ Butyl Fast Flow 16/10來純化多醣溶液。將氯化鈉及磷酸鹽緩衝液添加至多醣溶液中直至達到3M氯化鈉及50mM磷酸鉀(pH 6.8)。使多醣溶液通過HIC樹脂且以流經模式進行操作。使用相同平衡緩衝液洗滌樹脂且收集流經液及洗滌液以供進一步處理。

實施最終TFF (10kDa/ 3kDa)以藉由針對9DV之15mM NaCl或WFI進行滲濾來去除PS試樣中之高NaCl內容物。然後對經純化PS溶液實施0.22 um過濾。

圖36A、圖36B及圖36C展示藉由合成實例1所產生源自表現缺乏GlcNAc之PS之GAS細菌菌株之經純化多醣的NMR分析(參見PCT/US2012/049604)。NMR證實存在聚鼠李糖且不存在GlcNAc。對於試樣製備而言，將經純化多醣溶液凍乾並交換至D₂ O中，其中添加TSP作為內部標準品。在50℃下於400 MHz儀器上獲得質子NMR光譜，其中信號係40次掃描之平均值。應用0.2 Hz之譜線加寬。該純化方案亦能夠產生不含M蛋白之經純化多醣，如藉由圖37之西方墨點所證實。

長多醣之衍生及結合 ：如先前在上述方法(實例4)中所闡述使用DBCO-PEG來衍生具有較高分子量(長)之多醣。然後根據實例4之方法使DBCO源PS結合至本文所闡述之載體蛋白。舉例而言，使SpyAD[4pAMF] (SEQ ID NO: 34)結合至長多醣並在3.5小時之後及透析後進行分析。該等結合物之SEC-MALS分析展示於圖32中。在3.5小時之後，觀察到大於1 MDa之結合物。在透析後，經分離結合物之大小分佈展示大約186 kDa處之峰。實例 20 ： 表現具有 5 、 6 、 7 或 8 個 nnAA 之經截短 SLO( Δ C101) 多肽，純化， 並結合

舉例而言，根據上述方法來表現含有nnAA之經截短SLO(ΔC101)變體。該等變體含有5、6、7或8個對應於SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75及SEQ ID NO: 76之pAMF殘基。圖33A以總蛋白濃度及可溶性蛋白濃度之形式展示該12個pAMF變體(5pAMF-8pAMF)以及實例17之變體之表現含量。圖33B展示表現(SEQ ID NO: 65-76對應於var1-var12)之相應凝膠。如先前所闡述進行純化。簡言之，收穫CFPS物，旋轉並過濾，然後以0.75 ml/min加載於預平衡hisTRAP excel 1 ml管柱上並在單一步驟中使用於6 ml最終體積中之250 mM咪唑進行洗脫。使用SDS-PAGE安全藍染色分析5 µl之每一步驟部分。此後，將洗脫液稀釋3倍並加載於CaptoQ管柱上以供最終純化，且使用安全藍染色及DBCO TAMRA標記進行分析。濃縮FT部分並以200 µl等分試樣形式儲存於-80℃下。

SLO( Δ C101) 多肽與 5 、 6 、 7 或 8 個 nnAA 之結合 ：使用上述方法(包括於實例4中)使含有5、6、7或8個nnAA之多肽結合至GAS多醣。以此方式，使SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 69之含有pAM之SLO (ΔC101)變體結合至長DBCO源GAC。如圖34中所展示，藉由SDS page分析結合反應。每一變體之第一泳道展示結合前蛋白。藉由SEC-MALS測定最終結合物大小，其結果展示於圖35中。序列識別符說明

序列編號	名稱 / 說明	胺基酸序列
1	C5a [90-1035片段] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGKTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
2	C5a [90-1035片段] WT，不具有前導序列	KTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
3	C5a [90-1035片段] D131A/S513A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGKTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIAAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTAMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
4	C5a [90-1035片段] D131A/S513A，不具有前導序列	KTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIAAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTAMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
5	SLO [79-571片段] WT，具有His標籤及TEV序列	MHHHHHHGSGENLYFQGAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAWEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
6	SLO [79-571片段] WT，不具有前導序列	APKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAWEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
7	SLO [79-571片段] W535A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
8	SLO [79-571片段] W535A，不具有前導序列	APKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
9	SpyAD [33-849片段] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGQVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAKATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKKLEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKKTHGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKKAHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
10	SpyAD [33-849片段] WT，不具有前導序列	QVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAKATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKKLEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKKTHGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKKAHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
11	SpyAD [33-849片段] nnAA (例如pAMF)突變體，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置K64/K287/K386/K657 -根據全長序列編號	MHHHHHHGSGENLYFQGQVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAX ATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKX LEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKX THGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKX AHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
12	SpyAD [33-849片段] nnAA (例如pAMF)突變體，不具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF) K64/K287/K386/K657 -根據全長序列編號	QVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAX ATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKX LEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKX THGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKX AHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
13	ADI [全長] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGTAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
14	ADI [全長] WT，不具有前導序列	TAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
15	ADI [全長] D277A，具有前導序列	MHHHHHHGSGENLYFQGTAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
16	ADI [全長] D277A，不具有前導序列	TAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
17	ADI [全長] nnAA (例如pAMF)，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	MHHHHHHGSGENLYFQGTAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
18	ADI [全長] nnAA (例如pAMF)突變體，不具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	TAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
19	ADI (mut5) [全長] D277A nnAA (例如pAMF)，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	MHHHHHHGSGENLYFQGTAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
20	ADI (mut5) [全長] D277A nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	TAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
21	hFL [全長] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
22	hFL [全長] WT，不具有前導序列	SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
23	hFL [全長] nnAA (例如pAMF)，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- I5	MHHHHHHGSGSSQX RQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
24	hFL [全長] nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- I5	SSQX RQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
25	eCRM-pAMF6突變體	MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQX GIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVIRDX TKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELX TVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHX TQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSX LSLFFEIKS
26	ADI (mut2) [全長] D277A nnAA (例如pAMF)，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- K123、K247、K316	MHHHHHHGSGENLYFQGTAQTPIHVYSEIGKLKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEXTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGKYIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEXLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEXGDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
27	ADI (mut2) [全長] D277A nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列，且具有來自裂解之G懸突 X = nnAA (例如pAMF)位置- K123、K247、K316	GTAQTPIHVYSEIGKLKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEXTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGKYIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEXLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEXGDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
28	具有前導序列之Sfb1重複區	MHHHHHHGSGVETEDTKEPGVLMGGQSESVEFTKDTQTGMSGQTTPQVETEDTKEPGVLMGGQSESVEFTKDTQTGMSGQTASQVETEDTKEPGVLMGGQSESVEFTKDTQTGMSGQTTPQVETEDTKEPGVLMGGQSESVEFTKDTQTGMSGFSET
29	C5a [90-1035片段] WT，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GKTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
30	C5a [90-1035片段] D131A/S513A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GKTADTPVTSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIAAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKTAVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTADKQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGMKEDDFKDVKGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRKDGLLLKDNPKKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTAMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDTFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNK
31	SLO [79-571片段] WT，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAWEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
32	SLO [79-571片段] W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGSTLSPYGSITYK
33	SpyAD [33-849片段] WT，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GQVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAKATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKKLEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKKTHGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKKAHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
34	SpyAD [33-849片段] nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突 X = nnAA (例如pAMF)位置K64/K287/K386/K657 -編號	GQVKADDRASGETKASNTHDDSLPKPETIQEAX ATIDAVEKTLSQQKAELTELATALTKTTAEINHLKEQQDNEQKALTSAQEIYTNTLASSEETLLAQGAEHQRELTATETELHNAQADQHSKETALSEQKASISAETTRAQDLVEQVKTSEQNIAKLNAMISNPDAITKAAQTANDNTKALSSELEKAKADLENQKAKVKKQLTEELAAQKAALAEKEAELSRLKSSAPSTQDSIVGNNTMKAPQGYPLEELKX LEASGYIGSASYNNYYKEHADQIIAKASPGNQLNQYQDIPADRNRFVDPDNLTPEVQNELAQFAAHMINSVRRQLGLPPVTVTAGSQEFARLLSTSYKX THGNTRPSFVYGQPGVSGHYGVGPHDKTIIEDSAGASGLIRNDDNMYENIGAFNDVHTVNGIKRGIYDSIKYMLFTDHLHGNTYGHAINFLRVDKHNPNAPVYLGFSTSNVGSLNEHFVMFPESNIANHQRFNKTPIKAVGSTKDYAQRVGTVSDTIAAIKGKVSSLENRLSAIHQEADIMAAQAKVSQLQGKLASTLKQSDSLNLQVRQLNDTKGSLRTELLAAKAKQAQLEATRDQSLAKLASLKAALHQTEALAEQAAARVTALVAKX AHLQYLRDFKLNPNRLQVIRERIDNTKQDLAKTTSSLLNAQEALAALQAKQSSLEATIATTEHQLTLLKTLANEKEYRHLDEDIATVPDLQVAPPLTGVKPLSYSKIDTTPLVQEMVKETKQLLEASARLAAENTSLVAEALVGQTSEMVASNAIVSKITSSITQPSSKTSYGSGSSTTSNLISDVDESTQR
35	ADI [全長] WT，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GTAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
36	ADI [全長] D277A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GTAQTPIHVYSEIGK LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGK YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEK GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
37	ADI [全長] nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	GTAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLDTVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
38	ADI (mut5) [全長] D277A nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突 X = nnAA (例如pAMF)位置- K15、K193、K316	GTAQTPIHVYSEIGX LKKVLLHRPGKEIENLMPDYLERLLFDDIPFLEDAQKEHDAFAQALRDEGIEVLYLETLAAESLVTPEIREAFIDEYLSEANIRGRATKKAIRELLMAIEDNQELIEKTMAGVQKSELPEIPASEKGLTDLVESNYPFAIDPMPNLYFTRDPFATIGTGVSLNHMFSETRNRETLYGX YIFTHHPIYGGGKVPMVYDRNETTRIEGGDELVLSKDVLAVGISQRTDAASIEKLLVNIFKQNLGFKKVLAFEFANNRKFMHLATVFTMVDYDKFTIHPEIEGDLRVYSVTYDNEELHIVEEX GDLAELLAANLGVEKVDLIRCGGDNLVAAGREQWNDGSNTLTIAPGVVVVYNRNTITNAILESKGLKLIKIHGSELVRGRGGPRCMSMPFEREDI
39	hFL [全長] WT，具有前導序列	MHHHHHHGSGSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
40	hFL [全長] WT，不具有前導序列	SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
41	hFL [全長] nnAA (例如pAMF)，具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- I5	MHHHHHHGSGSSQX RQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
42	hFL [全長] nnAA (例如pAMF)，不具有前導序列 X = nnAA (例如pAMF)位置- I5	SSQX RQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD
43	eCRM-pAMF6突變體	GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQX GIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVIRDX TKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELX TVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHX TQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSX LSLFFEIKS
44	SLO(ΔC11) W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRKVIDERDVKLSKEINVNISGS
45	SLO(ΔC21)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRKVIDERDVKLS
46	SLO(ΔC31)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMARECTGLAAEWWRK
47	SLO(ΔC41)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANSRNIRIMAREC
48	SLO(ΔC51)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPFSTVIPLGANS
49	SLO(ΔC61)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWDNNWYSKTSPF
50	SLO(ΔC71)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKGKEVITKRRWD
51	SLO(ΔC81)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEILWDEINYDDKG
52	SLO(ΔC91)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQGAYVAQYEIL
53	SLO(ΔC101)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
54	SLO(ΔC101)片段W535A，不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突 X = nnAA (例如pAMF)或天然胺基酸(例如：K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407、K464；或K或R。)	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
55	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 1 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(420995) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151 、K272、K357	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
56	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 2 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(420996) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、K189、K323、K375	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
57	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 3 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(420997) X = nnAA (例如pAMF)位置- R151、K272、K357、K407	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
58	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 4 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(420998) X = nnAA (例如pAMF)位置- R151、K272、K375、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
59	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF)5 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(420999) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、K272、K357、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
60	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 6 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(421000) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、K189、K357	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
61	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 7 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(421001) X = nnAA (例如pAMF)位置-K112、K189、K323	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDXKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
62	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 8 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(421002) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151、K272	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
63	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 9 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(421003) X = nnAA (例如pAMF)位置-K112、K272、K375	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
64	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(421004) X = nnAA (例如pAMF)位置-K112、K323、K407	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
65	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426507) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151、K272、K357、K407	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
66	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426508) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、K189、K323、K375、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
67	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426509) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、R151、K272、K357、K407	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
68	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426510) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151、K272、K357、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENKPDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
69	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426511) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、R151、K189、K323、K375、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
70	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426512) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、K112、K189、K323、K375、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
71	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426513) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、R151、K189、K272、K357、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
72	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426514) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151、K189、K323、K375、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSKILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSKSNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
73	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426515) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、K189、K272、K357、K375、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFKELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
74	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426516) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTKDFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGKINLSHQ
75	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426510) X = nnAA (例如pAMF)位置- K98、R151、K189、K272、K323、K357、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDX KKSEEDHTEEINDKIYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIEX KKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVKTNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ
76	SLO(ΔC101)片段W535A - nnAA (例如pAMF) 10 -不具有前導序列且具有來自裂解之G懸突(426515) X = nnAA (例如pAMF)位置- K112、K189、K272、K323、K357、K375、K407、K464	GAPKEMPLESAEKEEKKSEDKKKSEEDHTEEINDX IYSLNYNELEVLAKNGETIENFVPKEGVKKADKFIVIERKKKNINTTPVDISIIDSVTDRTYPAALQLANKGFTENX PDAVVTKRNPQKIHIDLPGMGDKATVEVNDPTYANVSTAIDNLVNQWHDNYSGGNTLPARTQYTESMVYSKSQIEAALNVNSX ILDGTLGIDFKSISKGEKKVMIAAYKQIFYTVSANLPNNPADVFDKSVTFX ELQRKGVSNEAPPLFVSNVAYGRTVFVKLETSSX SNDVEAAFSAALKGTDVX TNGKYSDILENSSFTAVVLGGDAAEHNKVVTX DFDVIRNVIKDNATFSRKNPAYPISYTSVFLKNNKIAGVNNRTEYVETTSTEYTSGX INLSHQ

圖1A及圖1B展示用於與GAS多醣一起製備結合物之天然多肽抗原及含有非天然胺基酸之多肽抗原之表現含量。

圖2展示與採血前對照相比多肽抗原-及多肽-多醣結合物免疫化血清之效價。

圖3A、圖3B、圖3C、圖3D及圖3E展示免疫血清與免疫前血清對照相比之抗體效價及IgG結合變化。

圖3F展示兔IgG與SpyAD敲除性GAS之結合，從而證實了與天然GAC之結合。

圖4展示免疫血清與免疫前血清對照相比之增加之殺死能力。

圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E及圖5F展示主動免疫化實驗之結果，包括抗體效價、病灶大小及細菌負荷以及存活百分比。

圖6A及圖6B展示經受腹膜腔內攻擊之小鼠在被動免疫化後之存活百分比數據。

圖7展示經受真皮下攻擊之小鼠在被動免疫化後之病灶大小及細菌負荷數據。

圖8展示針對福氏志賀桿菌(S. flexneri )2a OPS之免疫血清之ELISA效價分析。

圖9展示使用DBCO-PEG₄ -NH₂ 衍生GAC且隨後結合至經pAMF修飾之SpyAD之一般反應圖。

圖10展示經純化天然GAC、經純化天然SpyAD[4pAMF]及其經純化多肽-多醣結合物之SEC MALS分析。

圖11展示評價抗原特異性抗血清與人類心臟溶解物之交叉反應性之西方墨點(Western blot)分析。

圖12係所選抗原之片段序列之圖示。

圖13展示所選抗原之對比性表現數據。

圖14展示所選單一及雙重SLO突變體與GFP相比之表現數據。

圖15係截短SLO序列與非截短SLO序列相比之圖示。

圖16展示截短SLO變體之表現含量(總體及可溶性)。

圖17展示藉由HisTrap管柱層析獲得之所捕獲肽片段之純度。

圖18展示所選表現肽在TEV裂解及HisTrap純化之後之純度。

圖19展示藉由粒徑篩析層析獲得之表現肽之純化結果。

圖20展示所選SLO片段在兔中之免疫原性之活體內評價。

圖21展示在OPK分析中使用來自模擬及肽組合免疫化小鼠之血清來調理GAS。

圖22A、圖22B及圖22C展示經模擬品或肽組合免疫化之野生型CD-1小鼠之真皮內攻擊(使用M1 89155 GAS)的結果(包括病灶大小及GAS負荷數據)。

圖23展示用以評價針對SLO變體之功能抗體之存在之紅血球溶血分析的結果。

圖24A、圖24B及圖24C展示不同人類嗜中性球血清型在來自免疫化兔之免疫血清存在下之GAS調理吞噬性殺死、抗血清之溶解阻斷及暴露於含有SLO之GAS上清液之人類嗜中性球的氧化爆發能力。

圖25A及圖25B展示免疫血清與其他GAS血清型表面抗原之差異性IgG結合。

圖26展示10種含有pAMF之SLO多肽變體之表現。

圖27A及27B展示在兩個純化步驟期間SLO變體之SDS-PAGE分析。

圖28展示SLO變體與DBCO-GAC之結合條件。

圖29展示3-及4-pAMF變體SLO變體結合物之SDS-PAGE分析。

圖30展示3-及4-pAMF變體SLO變體結合物之SEC-MALS數據。

圖31A及圖31B展示在使用利用所選SLO(ΔC101)變體作為載體蛋白製得之結合物實施免疫後小鼠之抗體效價及使用自利用彼等相同變體所製得結合物接種疫苗之小鼠生成之抗血清的溶血分析結果。圖31C展示在使用利用所選SLO(ΔC101)變體製得之結合物且使用長多醣作為ELISA中之包被抗原實施免疫後小鼠之抗體效價。

圖32展示SpyAD[4pAMF]及長多醣之結合物之SEC-MALS數據。

圖33A及圖33B展示22個具有3-8個pAMF之SLO變體之表現含量及含有5-8個pAMF之經純化變體的相應凝膠。

圖34展示具有長GAC之5-及6-pAMF變體SLO結合物之SDS-PAGE分析。

圖35展示具有長GAC之5-及6-pAMF變體SLO結合物之SEC-MALS數據。

圖36A、圖36B及圖36C展示源自表現缺乏GlcNAc之PS之GAS細菌菌株之經純化多醣的NMR分析。

圖37展示證實在如實例19中所闡述純化時自多醣去除M蛋白之西方墨點。

Claims

一種免疫原性組合物，其包含 a. 第一A型鏈球菌(Group A Streptococcus，GAS)多肽抗原； b. 第二GAS多肽抗原；及 c. 至少一種多肽-多醣結合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽抗原或非GAS載體多肽且包含至少一種非天然胺基酸，且其中該結合多醣係GAS多醣或其缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之變體。
如請求項1之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原獨立地選自C5a肽酶、鏈球菌溶血素O (SLO)、Sib35、Sfb1及SpyAD。
如請求項1之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO。
如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列組成。
如請求項1至5中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
如請求項3之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32之胺基酸序列組成。
如請求項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SLO，且該SLO多肽抗原由SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列組成。
如請求項1或4之免疫原性組合物，其中該等第一及第二GAS多肽抗原係C5a肽酶及SpyAD。
如請求項1至3、8至9或12中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項1至3、8至9或12中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
如請求項1至3、8至9、12或14中任一項之免疫原性組合物，其中該C5a肽酶多肽抗原由SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 30之胺基酸序列組成。
如請求項1至15中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原或非GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(Streptococcus pyogene Adhesion and Division, SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、SEQ ID NO: 25及蛋白質D。
如請求項1至15中任一項之免疫原性組合物，其中該第三GAS多肽抗原或非GAS多肽抗原係選自釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)多肽、精胺酸去亞胺酶(ADI)、SEQ ID NO: 25、蛋白質D及SLO。
如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物，其中nnAA包含點擊化學反應性基團。
如請求項1至18中任一項之免疫原性組合物，其中該nnAA係選自2-胺基-3-(4-疊氮基苯基)丙酸(pAF)、2-胺基-4-疊氮基丁酸、2-疊氮基-3-苯基丙酸、2-胺基-3-疊氮基丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-胺基-3-(5-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(4-(疊氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-胺基-3-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸及2-胺基-5-疊氮基戊酸。
如請求項18或19之免疫原性組合物，其中該nnAA係pAMF。
如請求項16至20中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS蛋白，該第三GAS蛋白係SpyAD多肽且包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項16至21中任一項之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽在SEQ ID NO: 33之位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。
如請求項16至22中任一項之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽包含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。
如請求項22之免疫原性組合物，其中該SpyAD多肽由SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34之胺基酸序列組成。
如請求項16至20中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係ADI多肽且包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項16至20或25中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。
如請求項16至20或25中任一項之免疫原性組合物，其中該ADI多肽由SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列組成。
如請求項17至20中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係第三GAS多肽，該第三GAS多肽係SLO多肽且包含與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 53至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項28之免疫原性組合物，其中該SLO多肽在選自K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407或K464之位置處包含3或4個pAMF取代。
如請求項29之免疫原性組合物，其中該SLO多肽包含SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。
如請求項29之免疫原性組合物，其中該SLO多肽由SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列組成。
如請求項28之免疫原性組合物，其中該SLO多肽包含SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76之胺基酸序列。
如請求項28之免疫原性組合物，其中該SLO多肽由SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76之胺基酸序列組成。
如請求項18至20中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多肽係鐵蛋白多肽且包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項34之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白多肽在SEQ ID NO: 21之位置I5處包含pAMF取代。
如請求項1至35中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣缺乏免疫顯性GlcNAc側鏈。
如請求項1至36中任一項之免疫原性組合物，其中該結合多醣具有約10 kDa至約45 kDa之平均分子量。
一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含釀膿鏈球菌黏附及分裂(SpyAD)結合多肽及GAS結合多醣或缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之其變體。
如請求項38之免疫原性組合物，其中該SpyAD蛋白包含與SEQ ID NO: 33至少95%一致之胺基酸序列且在位置K64、K287、K386及K657處包含pAMF取代。
如請求項38或39之免疫原性組合物，其中該SLO多肽抗原包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。
如請求項1或38之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。
如請求項1或38之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 52之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。
如請求項1或38之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 30之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 32之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。
如請求項1或38之免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO: 29之C5a肽酶多肽抗原；SEQ ID NO: 53之SLO多肽抗原；及多肽-多醣結合物，該結合物包含SEQ ID NO: 34之SpyAD結合多肽及GAS結合多醣。
一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含精胺酸去亞胺酶(ADI)結合多肽及GAS結合多醣或缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之其變體。
如請求項45之免疫原性組合物，其中該ADI多肽包含與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36至少95%一致之胺基酸序列且在位置K15、K193及K316處包含pAMF取代。
一種免疫原性組合物，其包含 a. A型鏈球菌(GAS) C5a肽酶多肽抗原； b. GAS鏈球菌溶血素O (SLO)多肽抗原；及 c. 多肽-多醣結合物，其包含鐵蛋白多肽及GAS結合多醣或缺乏免疫顯性N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)側鏈之其變體。
如請求項47之免疫原性組合物，其中該鐵蛋白包含與SEQ ID NO: 21至少95%一致之胺基酸序列且在位置I5處包含pAMF取代。
如請求項1至48中任一項之免疫原性組合物，其中該多肽-多醣結合物具有約10 kDa至約5000 kDa之平均分子質量。
一種在個體中誘導針對A型鏈球菌(GAS)細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如請求項1至49中任一項之免疫原性組合物。
如請求項50之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對該A型鏈球菌(GAS)細菌之抗體反應且並不在該個體中誘導針對人類組織之抗體反應。
如請求項50或51之方法，其中該免疫原性組合物在該個體中誘導針對志賀桿菌(Shigella)細菌之保護性免疫反應，其中該志賀桿菌細菌包含具有聚鼠李糖主鏈之多醣。
一種在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與如請求項1至49中任一項之免疫原性組合物。
一種如請求項1至49中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應。
一種如請求項1至49中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對志賀桿菌細菌之保護性免疫反應之藥劑。
一種如請求項1至49中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應之藥劑。
一種如請求項1至82中任一項之免疫原性組合物之用途，其用於在個體中誘導針對GAS細菌之保護性免疫反應。