TW202122799A

TW202122799A - 分離循環核小體之方法

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Publication number: TW202122799A
Application number: TW109129345A
Authority: TW
Inventors: 馬克愛德華愛寇斯頓; 雅各文森米考夫
Original assignee: 比利時商比利時意志有限公司
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-06-16
Also published as: IL290879A; CN114901832A; US20220290252A1; BR112022003546A2; MX2022002458A; CA3152642A1; EP4022312A1; WO2021038010A1; JP2022545821A; KR20220111246A; AU2020336928A1

Abstract

本發明涉及從生物液體樣品中分離包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，特別是疾病來源之核小體。這類方法允許改善與疾病來源的核小體相關的遺傳和表觀遺傳標記的分析。

Description

分離循環核小體之方法

本發明涉及富集和分離循環無細胞核小體的方法，特別是疾病來源的核小體。這樣的方法允許改善與疾病來源的核小體相關的遺傳和表觀遺傳標記的分析。

當細胞DNA以蛋白質-核酸複合物型式存在時稱為染色質。核小體是染色質結構的基本單元，且由纏繞蛋白質複合物的DNA組成。DNA纏繞成連核小體之結構通常稱為「繩珠」（beads on a string），並且形成開放或常染色質（euchromatin）之基本結構。在緊密或異染色質中，該繩在封閉且複雜的結構中為螺旋或超螺旋。

染色質中的每個核小體是由8個高保守性的核心組蛋白（包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各一對）之蛋白質複合物所組成的。大約145個鹼基對（bp）的DNA纏繞該蛋白質複合物。另一個組蛋白H1可能位於核心組蛋白外的核小體上，其與另外20bp的DNA結合，產生含有大約165bp的DNA的核小體（或染色體）。組蛋白H1據稱是作為連接組蛋白（linker histone）且另外的DNA通常被稱為「連接DNA」，即，將一個核小體與染色體中另一個核小體連接之DNA。分離染色體中兩個核小體的連接DNA有時長於20bp，且最長可達80bp。

成人的正常細胞更新包括涉及每天數量極多的細胞持續產生細胞（透過細胞分裂）以及死亡。在細胞凋亡過程中，染色質被分解成單核小體和寡核體（oligonucleosomes），其中一些可以在循環中發現。在正常情況下，在健康主體中發現的循環核小體的數量不多。在具有不同病症（包括許多癌症、自體免疫疾病、發炎情況、中風和心肌梗塞）的主體中發現數量升高（Holdenreider和Stieber，2009）。來自死細胞的核小體也可能流至其他體液，例如尿、糞便或痰中。據報導，循環中的無細胞核小體主要包含單核小體，以及在細胞死亡時透過染色質的消化而作為染色質片段產生的相關DNA。

DNA異常是所有癌症疾病的特徵。癌細胞的DNA在許多方面不同於健康細胞的DNA，包括但不限於點突變（point mutations）、易位（translocations）、基因複製數（gene copy number）、微衛星異常（micro-satellite abnormalities）、DNA鏈完整性（DNA strand integrity）和核苷酸修飾（例如胞嘧啶5號碳位置的甲基化）。通常在切片檢查或手術中取出的癌細胞或組織中例行性研究這些DNA結構或序列中與腫瘤相關的改變，以用於臨床診斷、預後和治療選擇。腫瘤遺傳和表觀遺傳特徵在不同類型腫瘤之間和具有相同腫瘤疾病的不同患者間也不同。此外，這些特徵隨著疾病的進展和對藥物或其他療法的後天抗性的發展，在同一患者的同一癌症內隨著時間而變化。因此，對於在手術或切片檢查中移除的細胞中腫瘤DNA進行一連串研究可以幫助臨床醫生評估殘留病的最小程度、預測患者的預後、為患者選擇合適的治療方法、監測疾病的進展並在早期發現任何復發或獲得的治療抗性（可能比放射性檢查早幾個月）並且可能成功改變療程。

然而，組織DNA測試具有局限性，這是因為不能重複執行侵入性的切片檢查。對於一些患者而言，可能根本不能進行切片檢查。執行切片檢查是昂貴的，會造成患者不適，以及造成患者風險，並且可能導致手術併發症。此外，患者的腫瘤可由位在相同腫瘤中的不同區域或在不同轉移位置（在轉移癌中）的多個腫瘤克隆（tumoral clones）組成，並非所有腫瘤克隆都可在切片檢查中取樣。組織切片檢查DNA研究因此提供了在特定時間，位在腫瘤的不同區域內的不同腫瘤克隆中時間和空間上的腫瘤快照。

癌症患者的血液含有循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），其被認為係源自正在死亡或死亡的癌細胞釋放到循環中的染色質片段或核小體。腫瘤衍生的ctDNA以小型DNA片段循環，與預期的單核小體大小一致。對來自癌症患者的血液和組織樣品的研究顯示，和癌症相關的突變出現在患者腫瘤中（但不在其健康細胞中），其突變也出現在取自同一個患者的血液樣品裡的ctDNA中（Newman等人，2014）。同樣地，癌細胞中差異性甲基化（胞嘧啶殘基甲基化造成的表觀遺傳的改變）的DNA序列可在血液循環中的ctDNA中作為甲基化序列被測得。此外，包含ctDNA在內的無細胞循環DNA（cell-free circulating DNA，cfDNA）的比例與腫瘤負荷相關，因此可藉由定量ctDNA出現的比例以及定性其遺傳及/或表觀遺傳組成來監控疾病進展。ctDNA的分析可產生與DNA相關的非常有用且臨床上準確的數據，係源自腫瘤內全部或許多不同的克隆，且在空間上整合腫瘤克隆。此外，隨著時間的重複取樣是一個更加實用和經濟的選擇。ctDNA的分析有可能徹底改變腫瘤的檢測和監測，以及在不進行侵入性切片檢查程序的情況下，在早期階段檢測復發和後天抗藥性，以選擇腫瘤的治療方法。此類ctDNA測試可以用於研究所有類型的與癌症相關的DNA異常（例如：點突變、核苷酸修飾狀態、易位、基因複製數、微衛星異常和DNA鏈完整性），並且將適用於例行性癌症篩檢、常規地以及更頻繁的監控以及最佳治療方案的定期確認（Zhou 等人，2012）。

血液、血漿或血清可用作為ctDNA測定的基質，並且可使用任何DNA分析方法，包括但不限於：遺傳DNA定序、表觀遺傳DNA定序分析（例如用於含有5-甲基胞嘧啶之序列）、PCR、珠乳擴磁技術（BEAMing）、次世代定序技術（靶向或全基因組）、數位PCR（digital PCR）、等溫DNA擴增、冷PCR（cold PCR）（在較低變性溫度下進行共擴增PCR）、MAP（MIDI-活化焦磷酸解）、個人化重組分析（personalized analysis of rearranged ends，PARE）和質譜分析。

由於DNA異常是所有癌症疾病的特徵，並且在研究中，所有的癌症疾病中觀察得到ctDNA，因此ctDNA檢測具有用於所有癌症疾病的潛力。所研究的癌症包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、大腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、頭頸癌和骨肉瘤（Crowley 等人，2013；Zhou 等人，2012；Jung 等人，2010）。將藉由敘述某些（不限於此）實例來說明ctDNA檢測的性質。

第一個實例涉及在ctDNA中癌症相關基因序列突變的檢測。涉及檢測ctDNA中的單基因突變的血液檢查通常具有低的臨床敏感度。這有兩個原因。首先，雖然所有癌症都具有突變，但是特定癌症疾病中任何特定突變的頻率通常較低。例如，雖然K-ras和p53突變被認為是較常發生的癌症突變中的其中兩種，並且已經在癌症中被廣泛研究，包括膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、子宮內膜癌和卵巢癌，分別在23%-64%和17%-54%的癌組織樣品中檢測到。其次，即使患者的癌症組織有突變，患者血液中存在的突變ctDNA的含量或濃度可能較低並且難以檢測。例如，K-ras和p53突變可以在0%-75%的K-ras和p53組織陽性患者的ctDNA中檢測到。這兩種效應的總和係指在少於40%的癌症患者的血液中檢測到K-ras或p53突變（Jung等人，2010）。

第二個實例涉及ctDNA中多個癌症相關基因序列突變的檢測。儘管任何特定基因（例如K-ras或p53）的突變可能僅出現在少數癌症中，但是所有癌症均包含突變，因此，足夠大的一組突變原則上應有助於檢測大多數甚至所有腫瘤。因此，增加這些檢測的臨床敏感度的一種方法是檢測許多基因中的廣泛範圍的突變。Newman等人已經採用這種方法檢測非小細胞肺癌（NSCLC），並從139個復發性突變基因中研究了521個外顯子和13個內含子序列。所研究的突變包括多種類型的癌症相關遺傳改變，包括單核苷酸變異（SNV）和融合基因。據作者所述，藉由此方法在ctDNA血液檢測中檢測超過95%的II-IV期腫瘤和50%的I期腫瘤，特異性為96% （Newman等人，2014）。

第三個實例涉及ctDNA中特定基因序列的癌症相關表觀遺傳改變的檢測。這種方法可以應用於任何DNA或核苷酸修飾。該方法的主要實例是檢測在某些癌症中，在胞嘧啶殘基處差異性甲基化的基因。為了此目的，已對多種癌症中大量的基因進行研究，其中幾個是對在膀胱癌、乳癌、大腸直腸癌、黑素瘤、卵巢癌和前列腺癌中研究SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、T1G1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2和RARβ2。通常，使用亞硫酸鹽轉化定序方法，從血漿中萃取DNA然後用亞硫酸鹽處理，將未修飾的胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶。然後可以使用定序、PCR或其他方法來確定是否存在特定的甲基化基因序列。該方法的一個說明性的實例是檢測ctDNA中的甲基化SEPTIN-9以檢測大腸直腸癌（CRC），據報導可檢測到48%的CRC病例，臨床特異性為91%（Church等人，2014）。

第四個實例是「片段組學(fragmentomics)」方法，該方法涉及循環DNA片段的序列分析，並與組織和細胞株的核酸酶可及位點分析（也稱為DNase超敏感分析）結果進行比較。在這種方法中，可以透過核酸酶消化細胞中打開的（非蛋白質結合的）DNA，建立任何細胞類型的全基因組DNA蛋白質佔據模式（occupancy pattern）。與蛋白質結合的DNA受到保護從而避免核酸酶消化，萃取後可進行定序以鑑定一細胞類型的特殊DNA蛋白質佔據模式（或未佔據的打開的DNA模式）。循環cfDNA片段同樣受到蛋白質結合的保護，蛋白質結合可能是組蛋白，如在核小體中，或者也可能受到其他蛋白質（如轉錄因子）的保護。cfDNA片段的邊緣和其與核小體、轉錄因子或其他蛋白質的結合有關，並且透過對一個體的cfDNA進行定序而獲得的片段化模式可以構建核小體和其他蛋白質佔據圖譜。可將此種cfDNA佔據圖譜與藉由核酸酶可及位點圖譜所得出的已知組織或癌細胞株的佔據圖進行比較。該方法據報指出，調控因子和基因體中的核小體空間分布（由健康個體cfDNA定序所揭露）與淋巴樣細胞和髓樣細胞株的佔據模式密切相關。晚期癌症患者的cfDNA定序顯示出另外的佔據模式，其與癌細胞株的佔據圖譜最相關，且通常符合患者癌症的解剖學來源（Snyder等人，2016）。這表示cfDNA模式的核小體和其他蛋白質佔據分析可用於檢測癌症且可能辨別癌症的器官部位。

第五實例涉及分析受試者的癌細胞和健康細胞中的整體基因組DNA甲基化模式。健康細胞的DNA在整個基因組中顯示出甲基化的全球分散模式，這反映了特定細胞和組織的表觀遺傳狀態。細胞從健康狀態向惡性癌細胞的轉移涉及DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶）的總體淨損失，以及基因組調控（例如基因啟動子）區域內5-甲基胞嘧啶殘基水平的局部升高。豐富的CpG位點聚集在DNA的短區域內。因此，癌細胞具有整體的DNA低甲基化，但是確實發生的甲基化DNA（5-甲基胞嘧啶）傾向於密集地聚集在小區域中。這意味著來自癌細胞的ctDNA片段傾向於被低甲基化或被高度甲基化，而兩者之間的間隔相對較小（即在兩個極端的甲基化水平），而來自正常細胞的ctDNA片段在兩個極端之間具有不同的甲基化模式，並且傾向於更多甲基化。癌症DNA的這些特性已被用作癌症物理化學測試的基礎（Sina等人，2018）。

與所有這些ctDNA分析方法相關的主要問題是癌症患者中cfDNA的突變等位基因比例（MAF-在特定基因組位置是突變的等位基因的比例）很低。該方法的ctDNA分析目標在大量的造血來源循環cfDNA中被稀釋。這代表由腫瘤來源的ctDNA構成的cfDNA比例很低，這限制了所有ctDNA分析方法。因此，增加患者樣品的MAF已成為ctDNA領域工作人員的目標。MAF與cfDNA片段有尺寸相關性，並且與較大的cfDNA片段相比，長度為90-150bp的cfDNA片段具有更高的MAF，因此具有更高的ctDNA比例。

Mouliere等人在2018年表明，對樣品中較小cfDNA片段的富集（enrichment）致使更高的MAF、更高的ctDNA比例、以及ctDNA檢測/分析結果的改善以及臨床檢測癌症結果的改善。ctDNA的大小選擇是透過電腦模擬方法對254位患者進行。但是，觀察到的ctDNA富集效果更好，並且改善了癌症檢測的臨床結果，這是針對35位患者進行的體外大小選擇方法，使用基於物理凝膠的方法對ctDNA進行物理富集。但是，該方法不適合常規臨床使用。

根據報導，癌症患者具有比健康受試者更高的cfDNA含量。該領域的工作者指出健康受試者的cfDNA範圍上至100ng/ml（平均為30ng/ml），而癌症受試者的cfDNA範圍上至1000ng/ml（平均為180ng/ml）（Schwarzenbach等人， 2011）。循環cfDNA由不同長度的不同大小的DNA分子所組成，其長度可達20,000bp（Zhou et al, 2012）。與ctDNA主要以單核小體循環的假設一致，在癌症患者中，循環無細胞核小體的檢測含量（如DNA含量）比在健康受試者中高（Holdenrieder等人，2001）。然而，由於核小體為細胞死亡的非特異性產物，而且在包含急性創傷的許多病症中可觀察到核小體含量增加，所以循環核小體本身含量的增加並不被用作為臨床上癌症的生物標記（Holdenrieder and Stieber, 2009）。作為細胞死亡的產物，在用細胞毒性藥物或放射療法治療時，循環核小體含量會顯著提高。然而，核小體也會從循環中被清除，因此其含量可能隨著治療而上升，然後再下降（Holdenrieder等人，2001）。

儘管循環無細胞核小體本身的含量在臨床上尚未用作於癌症中基於血液的生物標記，但是循環無細胞小體的表觀遺傳組成，就組蛋白修飾（histone modification）、組蛋白變異體（histone variant）、DNA修飾（DNA modification）以及加合物含量（adduct content）等方面作為血液中癌症生物標記而進行研究（WO 2005/019826； WO 2013/030577； WO 2013/030579； WO 2013/084002）。

有許多方法可用於從血液、血清或血漿中萃取cfDNA，並且已經比較了這些方法萃取出的DNA產量以及萃取不同長度的DNA片段的效率。苯酚-氯仿和碘化鈉萃取方法提供最高的產量，並萃取長度小於200bp的小DNA片段。據報導其他經過測試的方法（包括市售方法）具有較低的DNA萃取產量，並且可能無法萃取長度小於200bp的小DNA片段（Fong等人，2009）。

用於分析ctDNA而從血液、血清或血漿進行cfDNA的萃取通常使用市售的DNA萃取產品進行。這些萃取方法具有循環DNA的高回收率（＞ 50％），另有其他產品（例如，Qiagen生產的QIAamp循環核酸試劑組）據稱可萃取小尺寸DNA片段。使用的樣品體積通常在1-5mL範圍內的血漿。

由於許多限制，目前尚無基於ctDNA的測試可廣泛慣用於癌症的檢測或診斷。對於方法上的主要限制是需要高品質的DNA。由於樣品的特性，目前的ctDNA取樣方法產生劣質的ctDNA樣品。其中主要的困難在於在循環中存在大量的非腫瘤cfDNA，令對於ctDNA的任何分析變得更加複雜。來自不同工作人員的預估值不同，但是循環中存在的ctDNA片段可能太低而檢測不到。對於大多數癌症患者而言，ctDNA片段是cfDNA的一小部分。舉例而言，最近的研究報導指出，在治療前的肺癌患者中，ctDNA片段隨腫瘤大小而增加。在具有大腫瘤負荷的患者中發現的最高含量為3.2%，但是發現大多數患者具有低於0.1%的ctDNA片段（Newman等人，2014）。這代表對於許多患者樣品，必須在有高出許多含量的非腫瘤來源的cfDNA的情況下分析非常低量的ctDNA。除此之外，該非腫瘤來源的cfDNA是來自相同的主體，因此具有相似的序列，將干擾任何用於定量或分析ctDNA的方法。

儘管癌症患者中的cfDNA含量經常升高，但ctDNA片段少，且總ctDNA含量可能低於所觀察到的cfDNA的增加。這可表明至少某些cfDNA的增加可能與腫瘤相關，也許與腫瘤環境或間質有關，而不是直接來自於含有癌症相關DNA突變的惡性癌細胞。

對於測量循環的無細胞核小體及/或循環的核小體的表觀遺傳組成作為癌症的生物標記，也有低MAF或低腫瘤關聯或腫瘤衍生片段的類似問題存在。核小體本身是細胞死亡的指標，並作為人體正常細胞更新過程的一部分釋放以及在與細胞死亡水平升高相關的情況下釋放，例如自體免疫疾病、中風、敗血症、創傷後、燒傷、心肌梗塞、腦中風、器官移植後的移植物排斥期間以及劇烈運動後。這代表，腫瘤來源的核小體與源自各種細胞和組織的其他非腫瘤核小體一起循環，並且可能佔所有循環核小體的一小部分。非腫瘤核小體將干擾任何腫瘤相關的核小體或腫瘤來源的定量或表觀遺傳分析方法。類似的效果可能發生在其他體液中。例如，糞便可能含有源自大腸直腸癌細胞的核小體和相關DNA，以及源自健康大腸或直腸細胞的核小體。痰可能含有源自肺癌細胞的核小體和相關DNA，以及源自健康肺細胞的核小體。類似的效果也會發生在其他體液中。

因此，亟需一種用於富集體液樣品中腫瘤來源或腫瘤相關DNA及核小體的更好方法。還需要用於區分腫瘤和非腫瘤循環無細胞核小體的分析方法，以改善對癌症疾病狀態的檢測。

根據本發明之一態樣，提供了一種從一生物液體樣品中分離包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。

根據本發明之另一態樣，提供了一種從一生物液體樣品中分離不包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與該結合劑結合之核小體。

根據本發明之另一態樣，提供了一種從一生物液體樣品中分離不包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑結合至被剪切的組蛋白分子，其缺少全部或部分組蛋白尾部；（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。

根據本發明之另一態樣，提供了一種從一生物液體樣品中分離純化的循環腫瘤DNA（ctDNA）之方法，其中該方法包括步驟：（i）執行本文定義之方法；以及（ii）從分離的核小體中萃取DNA。

根據本發明之另一態樣，提供了一種診斷癌症之方法，包括：（i）執行本文所定義之方法，以從獲自患者的一生物樣品中分離循環腫瘤核小體；以及（ii）分析分離的循環腫瘤核小體和/或相關DNA。

根據本發明之另一態樣，提供了一種獲得優先結合至疾病來源的無細胞核小體的抗體或其他結合劑之方法，其中該方法包括步驟：（i）使用一含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體作為一抗原，產生針對其之一抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的該抗體或其他結合劑呈現給一含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體；以及（iii）選擇結合至步驟（i）的該核小體但不結合至步驟（ii）的該核小體之抗體或其他結合劑。

根據本發明之另一態樣，提供了一種獲得優先結合至非疾病來源的無細胞核小體的抗體或其他結合劑之方法，其中該方法包括步驟：（i）使用一含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體作為一抗原，產生針對其之一抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的該抗體或其他結合劑呈現給一含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體；以及（iii）選擇結合至步驟（i）的該核小體但不結合至步驟（ii）的該核小體之抗體或其他結合劑。

我們先前報導了用於血液和其他體液中的無細胞核小體的表觀遺傳分析方法（WO2013/030577、WO2013/030578、WO2013/030579、WO2013/084002）。如本文所述，疾病來源的無細胞核小體被釋放到循環中，但是由於正常（健康）細胞更新，他們被已存在於循環中的無細胞核小體稀釋。任何這種非疾病來源的核小體將干擾疾病核小體的遺傳或表觀遺傳的分析。從體液樣品中除去非疾病來源（即，健康）的無細胞核小體將致更高純度的疾病來源的無細胞核小體，改善樣品中疾病來源的核小體或染色質片段的分析結果。

在活細胞中染色體的每個核小體均由八個高度保留的核心組蛋白（包括各一對的組蛋白H2A、H2B、H3及H4）的蛋白質複合物組成。大約145-147個鹼基對（bp）的DNA包裹著此種複合物。另一個組蛋白H1可能位於核心組蛋白外部的核小體上，並與另外的20bp的DNA結合，產生含有大約165bp DNA的核小體（或染色體）。該另外的DNA在本領域中被稱為「連接DNA(linker DNA)」，即，將一個核小體連接到另一個核小體的DNA。分隔一條染色體中兩個核小體的DNA可能長於20bp，例如，如果相鄰的核小體都包含H1，則長度可能高達80bp。

先前我們已經報導，與源自健康細胞的核小體相比，源自腫瘤的無細胞核小體較少含有組蛋白H1（見WO 2017/068371）。可以利用這種差異進行疾病相關或衍生核小體的免疫親和富集(immunoaffinity enrichment)，其係透過使用H1的抗體結合物以分離包含或不包含組蛋白H1的核小體。

現在我們報告核小體可以透過其他方式分離。這些方式係基於利用與連接DNA的存在與否相關之核小體特徵。Underhill等人研究了人類癌症異種移植物在大鼠中產生的ctDNA片段的大小範圍，與健康大鼠cfDNA的大小範圍相比。如圖1所示，循環DNA片段的大小範圍約為230bp。在健康受試者中，循環cfDNA主要是造血來源，其片段大小範圍大約在150-230bp之間，並且有少量的較大的DNA片段對應於循環的寡核小體。健康的造血cfDNA的最常見大小約為167bp，只有很小一部分為小於150bp的片段。造血cfDNA也存在於患有癌症和懷孕等情況的受試者中，但也存在約120-150bp的其他較短的循環DNA片段。ctDNA片段大小顯示出10bp的周期性，與核小體DNA螺旋周期性相關，最常見的大小是134bp和144bp。因此，大多數健康的cfDNA長度大於160bp，而大部分ctDNA長度小於150bp。不受理論所束，發明人認為，大多數非腫瘤（和非胎兒）來源的循環無細胞核小體可被認為含有連接DNA，而腫瘤來源的循環無細胞核小體可被認為不含有連接DNA。

類似地，與非懷孕健康主體相比，在孕婦中短約150bp DNA（特別是約145bp DNA）核小體在總循環游離細胞核小體中所佔的比例更大，並且被認為是胎兒或胎盤來源的。

此外，先前已經表明，可以使用固定在固體支撐物上的抗-組蛋白H1抗體作為免疫吸附劑，從血液樣品中分離出含有組蛋白H1的核小體（WO2017/068371）。

出人意料的是，本發明人現已表明，固定在固體支撐物上作為免疫吸附劑的蛋白質組蛋白H1（本身）可用於結合以及從血漿樣品中除去含有連接DNA的核小體。另外，也可用類似方式將與含有連接DNA的核小體結合的其他結合蛋白用於從血清或血漿或其他體液樣品中結合和除去含有連接DNA的核小體。亦可用類似方式使用針對結合至與含有連接DNA的核小體結合的分子的抗體或其他結合劑，以從血清或血漿或其他體液樣品中結合和除去含有連接DNA的核小體。

包含連接DNA的核小體

本發明人發現，可以透過（i）組蛋白特徵（例如H1）結合至連接DNA的使用，（ii）（非組蛋白）染色質結合蛋白結合至連接DNA的使用，（iii）抗體或其他結合劑結合與連接DNA結合的染色質結合蛋白的使用，或（iv）結合至與核小體特徵相關的連接DNA之抗體或其他結合劑的使用。

因此，根據本發明之第一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離包含連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。

將理解的是，第一態樣的方法可以用於陰性選擇方法中，以用於去除包含連接DNA的核小體並分離不具有連接DNA的核小體。因此，根據本發明的第二態樣，提供了一種從一生物液體樣品中分離不具有連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與該結合劑結合之核小體。

在一實施例中，結合至與核小體相關的連接DNA之該結合劑係選自組蛋白H1、macroH2A、或其片段或其工程類似物之一組蛋白。

在一實施例中，結合至與核小體相關的連接DNA之該結合劑係組蛋白H1、或其片段或其工程類似物。因此，根據本發明之另一態樣提供了一種從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與組蛋白H1接觸；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與組蛋白H1結合之核小體。

將理解的是，本發明的方法可以使用組蛋白H1、或其片段或其工程類似物進行。組蛋白H1具有幾種本領域已知的同功異形體。在一實施例中，組蛋白H1為組蛋白H1.0。

由於沒有連接DNA的存在，本文所述之分離方法可用於分離疾病（或胎兒）來源的核小體。因此，在一實施例中，提供了一種從生物液體樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與組蛋白H1接觸；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與組蛋白H1結合之核小體。

一些表觀遺傳核小體特徵會和與核小體相關的連接DNA及/或組蛋白H1相互作用或影響其穩定性。舉例而言，組蛋白同功異形體macroH2A（亦稱為「mH2A」）的基本連接子將連接DNA穩定在核小體的進入/出口位置（Bowerman and Wereszczynski, 2016）。macroH2A的存在還取代了體內組蛋白H1與染色體的天然結合。由於這個原因，可將macroH2A視為連接DNA的內部核小體結合劑，其包括結合至連接DNA的成分或結構域。因此，在一實施例中，macroH2A或連接DNA結合序列、macroH2A的結構域或其工程類似物可用作為結合至與核小體相關的連接DNA的高親和力結合劑。

在一實施例中，結合至與核小體相關的連接DNA之結合劑係macroH2A、或其片段或其工程類似物。因此，根據本發明之再一態樣提供了一種從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與macroH2A、或其片段或其工程類似物接觸；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與macroH2A結合之核小體。

除組蛋白外，許多（非組蛋白）染色質結合蛋白也可用於結合至連接DNA。這類蛋白質包括但不限於：染色質域解旋酶DNA結合蛋白（CHD）、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶（DNMT）、高遷移率族或高遷移率族蛋白（HMG或HMGB）、聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）、含有甲基-CpG-結合域（MBD）的蛋白質（例如MECP2）、以及某些以非序列依賴性方式與核小體連接DNA結合的轉錄因子（例如轉錄因子p53）。

在一實施例中，結合劑與染色質結合蛋白結合，該染色質結合蛋白與含有連接DNA的核小體結合。當寫到連接DNA存在時，結合核小體的「染色質結合蛋白」是指與無細胞核小體的連接DNA部分結合的蛋白（即加合物）。因此，僅在連接DNA存在下優先或選擇性結合的染色質結合蛋白可用於標記，以確定連接DNA是否存在於無細胞核小體中。這些蛋白質包括但不限於：MBD、CHD、DNMT和PARP蛋白質家族。將理解的是，這些蛋白質家族包括多個成員。舉例而言，至少有9個CHD家族成員CHD1-CHD9。將理解的是，術語「染色質」是指當DNA包覆在細胞內時由DNA和組蛋白形成的複合物。因此，組蛋白是染色質的組成部分，術語「染色質結合蛋白」不包括組蛋白本身。因此，組蛋白（例如H1、H2A、H2B、H3和H4）不是染色質結合蛋白，即染色質結合蛋白不是組蛋白。

染色質結合蛋白包括DNA結合域，該DNA結合域在連接DNA的背景下與核小體結合，以便在體內執行其功能。舉例而言，CHD1通過C端DNA結合域與連接DNA結合，並利用ATP水解產生的能量重塑染色質。當將CHD1添加到含有201bp的DNA片段的核小體中時，觀察到的ATP水解活性很高，但是當添加到包含游離DNA或147bp的DNA的核小體中時，ATP水解活性低或不存在。沒有DNA結合結構域的截短的CHD1蛋白不結合核小體或DNA，並且幾乎沒有或沒有ATP水解活性（Ryan等，2011）。

HMG蛋白與組蛋白H1具有相似的核小體連接DNA結合特性。此外，它們會和組蛋白H1互相競爭對於連接DNA的結合以及對於核小體進入/出口二分位點的結合，並且還保護連接DNA免受核酸酶消化（Nalabothula等，2014）。

DNMT1亦與含有至少20bp的連接DNA的核小體結合，並優先甲基化連接DNA，但不與不含連接DNA的核小體結合（Schrader等人，2015）。

類似地，MBD蛋白MECP2與含有連接DNA的核小體結合，並以類似於組蛋白H1結合的方式保護連接DNA免受核酸酶消化，但僅保護約11bp的連接DNA（組蛋白H1約20bp）（Dhasarathy和Wade，2008）。

PARP-1與含有暴露的雙股斷裂的連接DNA的核小體結合。在活細胞中，PARP-1結合會誘導蛋白質構型變化，從而導致其DNA依賴性活化以及包括核心組蛋白在內的目標蛋白質的聚（ADP）-核糖基化(poly(ADP)-ribosylation)（Sultanov等，2017）。

由於這些蛋白質與含有連接DNA的單核小體結合，因此我們推測這類分子可直接用於分離、純化或富集含有連接DNA的單核小體。

因此，在一實施例中，結合至與核小體相關的連接DNA之結合劑係染色質結合蛋白、或其片段或其工程類似物。根據本發明之再一態樣提供了一種從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與染色質結合蛋白（或其片段或其工程類似物）接觸，該染色質結合蛋白結合至包含連接DNA的核小體；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與染色質結合蛋白結合之核小體。

在一實施例中，提供了一種從生物液體樣品中分離疾病或胎兒來源的循環的無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包含步驟：（i）使該樣品與染色質結合蛋白接觸，該染色質結合蛋白結合至含有連接DNA的核小體；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與染色質結合蛋白結合之核小體。

在一實施例中，結合至連接DNA之染色質結合蛋白係選自：（a）染色質域解旋酶DNA結合蛋白；（b）DNA（胞嘧啶5）-甲基轉移酶；（c）高遷移率族蛋白；（d）聚[ADP-核糖]聚合酶；（e）甲基-CpG-結合域蛋白；或（f）轉錄因子。

在一實施例中，結合至連接DNA之染色質結合蛋白係選自：（a）染色質域解旋酶DNA結合蛋白；（b）DNA（胞嘧啶5）-甲基轉移酶；（c）高遷移率族蛋白；（d）聚[ADP-核糖]聚合酶；或（e）甲基-CpG-結合域蛋白。

在一實施例中，結合至連接DNA之染色質結合蛋白係選自：（a）染色質域解旋酶DNA結合蛋白1（CHD1）；（b）DNA（胞嘧啶5）-甲基轉移酶1（DNMT1）；（c）高遷移率族蛋白1（HMGB1）；（d）聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）；（e）甲基-CpG-結合域蛋白，其係選自：MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和甲基-CpG-結合蛋白2（MECP2）；或（f）p53。

在一實施例中，結合至連接DNA之染色質結合蛋白係選自：（a）染色質域解旋酶DNA結合蛋白1（CHD1）；（b）DNA（胞嘧啶5）-甲基轉移酶1（DNMT1）；（c）高遷移率族蛋白1（HMGB1）；（d）聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）；或（e）甲基-CpG-結合域蛋白，其係選自：MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和甲基-CpG-結合蛋白2（MECP2）。

染色質部分CHD1、DNMT1、HMGB1、PARP1、MBD和p53是連接DNA的結合劑。

本文明確列出的染色質結合蛋白是本領域已知的。這些天然的蛋白質序列可在公開資料庫中找到，例如，通用Universal Protein Resource 「UniProt」（CHD1 UniProt ID：O14646；DNMT1 UniProt ID：P26358；HMGB1 UniProt ID：P09429；PARP1 UniProt ID：P09874；MBD1 UniProt ID：Q9UIS9；MBD2 UniProt ID：Q9UBB5；MBD3 UniProt ID：O95983；MBD4 UniProt ID：O95243；MECP2 UniProt ID：P51608）。

組蛋白H1蛋白或任何與含有連接DNA之核小體結合的染色質結合蛋白或蛋白結構域可被再造工程化以產生具有更高結合親和力或更高特異性（例如，最小化與不具有連接DNA的核小體的結合），或者兩者皆有。因此，在本發明一實施例中，染色質結合蛋白是具有經遺傳再造工程改變的染色質結合蛋白，其與含有連接DNA的核小體更強地結合和/或與不含連接DNA的核小體更弱地結合。再造蛋白質的方法是本領域眾所周知的，例如（Wiesler and Weinzierl，2010）的方法。在一較佳實施例中，基因工程蛋白是H1的工程類似物，即，再造工程化的H1部分。

在一實施例中，與包含連接DNA的核小體結合的染色質結合蛋白係選自CHD、DNMT、HMGB、MBD和PARP蛋白家族。本領域技術人員將清楚的是，在本發明內文中，目標蛋白質結構域主要是DNA結合結構域，並且任何其他結構域（例如，任何酵素結構域或染色質重塑結構域）可能不是必要的。因此，可以使用本文公開的結合蛋白的片段。因此，在另一實施例中，結合蛋白包含染色質結合蛋白的DNA結合結構域，該染色質結合蛋白在核小體的背景下與連接DNA結合。

在一較佳實施例中，將組蛋白H1蛋白或染色質結合蛋白塗覆在固體支撐物上，例如瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、塑膠或磁珠。在一實施例中，所述固體支撐物包括多孔材料。在另一實施例中，將組蛋白H1蛋白或染色質結合蛋白衍生為包含標籤或連接子，其可用於將組蛋白H1或染色質結合蛋白附著到適合的支撐物，其已被衍生化為與該標籤結合。許多這類的標籤和支撐物是本領域已知的（例如，Sortag、Click Chemistry、生物素/鏈黴親和素、his-標籤/鎳或鈷、GST-標籤/GSH、抗體/表位標籤以及其他）。為了易於使用，組蛋白H1蛋白或染色質結合蛋白塗覆的支撐物可包含在裝置中，例如微流體裝置。

在一實施例中，與核小體相關的連接DNA與衍生化的組蛋白H1或與染色質結合蛋白之間的結合可以在液相中發生（即，在將衍生化的組蛋白H1或染色質結合蛋白與固體支撐物結合之前）。然後可以同時或隨後使用連接反應來完成衍生化的組蛋白H1或染色質結合蛋白與固體支撐物的結合。

根據本發明之再一態樣提供了一種從生物液體樣品中透過親和純化分離具有連接DNA的循環無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法，其中該方法包含步驟：（i）使樣品與結合至染色質結合蛋白的結合劑接觸，該染色質結合蛋白結合至包含連接DNA的核小體；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合之核小體。

在本發明的此態樣中，核小體透過其連接DNA的結合是藉由透過其連接DNA與核小體（直接）結合的蛋白質的結合而間接發生的。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從血液、血清或血漿樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包含步驟：（i）使樣品與結合至染色質結合蛋白的結合劑接觸，該染色質結合蛋白結合至包含連接DNA的核小體；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與結合劑結合之核小體。

在一實施例中，與染色質結合蛋白結合的結合劑係選自抗體（或其結合片段）、親和體或適體。在另一實施例中，結合劑是抗體。

應當理解的是，上文針對染色質結合蛋白（當用作直接核小體結合劑時）所描述的實施例也適用於本發明的此態樣，其中使用了針對該染色質結合蛋白的結合劑（即作為核小體結合的間接方法）。

在一實施例中，結合劑係針對染色質域解旋酶DNA結合蛋白、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白和/或p53結合。在一實施例中，結合劑不直接與高遷移率族蛋白結合。在另一實施例中，結合劑不直接與甲基-CpG結合域蛋白結合。

本發明之另一態樣提供一結合劑，其結合至與連接DNA相關的核心核小體特徵。提到與連接DNA相關的「核心核小體特徵」是指核心核小體顆粒（例如核心組蛋白蛋白其中之一者，例如H2A、H2B、H3或H4，包括其轉譯後修飾物和同功異形體）的特徵，其只有或主要發生在含有連接DNA的核小體中。在某些情況下，核小體特徵可以結合、穩定或保護連接DNA免受核酸酶消化。

含有組蛋白同功異形體macroH2A的核小體被認為可以穩定連接DNA（Bowerman和Wereszczynski，2016）。本發明人已發現，這種類型的組蛋白同功異形體會更加優先與含有連接DNA的無細胞核小體締合，因此可以用作為將健康來源的核小體與從生物樣品中分離的標記。因此，在一實施例中，與連接DNA相關的核心核小體特徵係為組蛋白同功異形體macroH2A。

因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離含有連接DNA之無細胞核小體與未含有連接DNA之無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合至macroH2A或其片段的結合劑接觸；及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合之核小體。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從血液、血清或血漿樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包含步驟：（i）使樣品與結合至macroH2A或其片段的結合劑接觸；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與結合劑結合之核小體。

如本文所述，具有或不具有連接DNA的核小體可以由包裹在核小體周圍的DNA的長度來定義。因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合劑接觸，該結合劑經工程改造以選擇性地結合長度超過150個鹼基對的DNA的核小體，其中該結合劑結合至與具有連接DNA的核小體相關的核小體特徵；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與該結合劑結合的核小體。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從血液、血清或血漿樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包含步驟：（i）使樣品與結合劑接觸，該結合劑經工程改造以選擇性地結合長度超過150個鹼基對的DNA的核小體，其中該結合劑結合至與具有連接DNA的核小體相關的核小體特徵；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合之核小體。

透過基於各種特徵的分離所產生的核小體的子集可能不盡相同，並且對於研究目標和臨床應用有各種應用。舉例而言，與健康細胞相比，癌細胞中核小體的結構可能有所不同。使用抗體或其他結合劑來結合這些特徵中的一種或多種（這些特徵在衍自癌細胞的核小體中比在健康細胞中更常見（或反之亦然）），透過陽性或陰性選擇，在生物樣品中進行腫瘤來源的無細胞核小體的分離，該生物樣品包含無細胞核小體和細胞來源的混合物。本發明的應用包括分離腫瘤來源的核小體、分離孕婦樣品中的母體和胎兒的核小體、來自正常循環核小體的疾病來源的核小體、含有甲基化或未甲基化的DNA的核小體以及用於研究或其他目的之核小體用途的各種子集。

在一實施例中，長度包括大約150個或更多個DNA鹼基對的核小體是指具有保留的連接DNA的核小體。核小體核心顆粒（即，含有由各一對的組蛋白H2A、H2B、H3和H4組成的組蛋白八聚體）是由大約150bp的DNA所組成，例如145至150bp的DNA，特別是147bp的DNA。因此，包含大於150bp的DNA（例如，大於155bp、160bp或165bp的DNA）的核小體是含有連接DNA的。在一實施例中，結合劑結合由至少165個DNA鹼基對組成的核小體。在一實施例中，結合劑不結合包含約150bp或更少的DNA的核小體，即，結合劑選擇性地結合至含有連接DNA的核小體。

在一實施例中，結合劑結合於連接DNA內的區域。在該實施例中，結合劑（直接）結合至不與組蛋白（核心）八聚體接觸的DNA區域，即，連接DNA。

本文所述的方法可用於分離、富集和/或純化疾病來源的循環無細胞核小體，特別是來自健康來源的循環無細胞核小體。本文中提及「疾病來源」是指源自患病（例如異常或不健康）細胞的核小體和染色質片段。本文中提及「健康來源」是指源自健康（例如正常或非疾病）細胞的核小體和染色質片段。

本領域技術人員將理解的是，當結合劑針對與連接DNA相關的特徵結合時，則其可以被用於從樣品中結合（和去除）健康來源的核小體，即，在樣品的未結合部分中獲得疾病來源的核小體。因此，這可以稱為陰性選擇法。根據使用的是陽性或陰性選擇法，將確定分離出哪個核小體片段（即用於陽性選擇方法的結合片段或用於陰性選擇方法的游離/洗脫片段）。

在一實施例中，循環的無細胞核小體是腫瘤來源的。因此，本發明方法發現特別的用法，該方法是用於富集樣品中的腫瘤來源的循環無細胞核小體。然後可以將富集的樣品用於後續分析，例如用於診斷方法。

與包含連接DNA的核小體（即，包含「約165bp或更長DNA的核小體」或「長核小體」之核小體）相關的特徵可用餘分離核小體，該特徵包含組蛋白H1、macroH2A、以及與連接DNA結合的染色質結合蛋白。在一實施例中，連接DNA的結合劑（例如，組蛋白H1、CHD、DNMT、HMGB、PARP和macroH2A或此類蛋白質的DNA結合結構域）可直接用於結合和分離具有連接DNA的核小體。

在本發明之另一態樣中，可以使用抗體或針對這些特徵的其他結合劑（包括macroH2A、CHD、DNMT、HMGB和PARP之結合劑）以分離包含連接DNA的核小體。在此實施例中，分離了包含連接DNA的核小體，該核小體另外包含連接DNA的結合劑。不會分離出包含連接DNA並且未含有該特徵或結合劑之任何核小體，例如具有「游離」連接DNA之核小體。在一實施例中，樣品可以暴露於具有不同特徵的結合劑混合物（例如，固定在固相基質上）以分離含有連接DNA的核小體，該含有連接DNA的核小體併有與連接DNA相關的任何數量的不同核小體特徵。在另一實施例中，樣品可以依序暴露於與連接DNA相關的不同核小體特徵的多種結合劑。

將理解的是，本發明的實施例可以組合使用以結合包含連接DNA的核小體，所述連接DNA可另外包括及不包括諸如H1、CHD、DNMT、HMGB、PARP或macroH2A之特徵。該組合可包括將樣品依序或同時暴露於多種抗體和/或連接DNA結合蛋白。

如本文所要求的，從樣品接觸和分離核小體的方法是本領域眾所周知的，並且可以使用任何適合的分離方法。例如，分離方法可以包括親和層析或磁性抗體珠。舉例而言，如果使用親和管柱層析裝置，應當理解的是，樣品可通過包含所需結合劑的親和管柱。取決於採用本文所述的陽性或陰性選擇方法，可以收集結合至固相的核小體或流過的核小體（即，未結合的核小體）以進行進一步分析。

應當理解的是，不管目標核小體是否已經含有連接DNA之結合劑，可以使用本發明的結合劑。在這種情況下（即，連接DNA已經與另一分子結合），分離是基於透過與本發明所用之結合劑結合來取代連接DNA之結合劑，這是由於與最初與核小體結合之結合劑相比，本發明之結合劑的相對高的濃度和/或較高的相對結合親和力，例如出於平衡和動力學的理由。

顯然，具有較高結合親和力的蛋白質可以將核小體上具有較低結合親和力的蛋白質從其位置置換，尤其是如果存在較高結合親和力的蛋白質過量時。發生置換的速率將取決於（當前）結合的部分的相對親和力、濃度和脫離速率。在一個實施例中，H1用作為結合劑。H1可用作結合劑，因為其對於含有連接DNA的核小體具有高結合親和力。

在一實施例中，藉由使用結合劑的免疫親和純化方法來進行腫瘤核小體和循環腫瘤DNA（ctDNA）的分離，所述結合劑諸如針對CHD、DNMT、HMGB、PARP、MBD或macroH2A的結合劑。對於本領域技術人員將顯而易見的是，能夠與所需目標特異性結合的任何結合劑都可用於本發明的親和純化方法。這類結合劑可包括但不限於：抗體、適體、親和體或結合蛋白（例如：核小體結合蛋白）。

可以透過本領域已知的多種方法來產生抗體，包括免疫和文庫法，例如噬菌體呈現。可以針對感興趣的部分或抗原誘導免疫反應，或者可以選擇文庫與其結合。針對諸如CHD1、DNMT1、HMGB1、PARP1、MBD或macroH2A結合的抗體可以針對包括整個蛋白質胺基酸序列在內的多種這類部分產生，並可選擇性地包含其他組蛋白轉譯後修飾（PTM）。蛋白質可從活細胞中純化或合成產生。或者，可以使用代表胺基酸序列的一部分的胜肽序列，並且這也可以選擇性地含有組蛋白轉譯後修飾。本領域技術人員將清楚的是，針對所需目標之任何一部分或全部結合的結合劑可用於本發明的方法。

不具有連接DNA的核小體

類似地，較佳或選擇性地與短150bp（或更短）DNA核小體相關的特徵可用於核小體種類的分離。將理解的是，長度少於約150個鹼基對的核小體是指失去其連接DNA的核小體。核小體核心顆粒（即為包含由各一對的組蛋白H2A、H2B、H3和H4組成的組蛋白八聚體）是由大約150bp的DNA組成，例如145至150bp的DNA，特別是147bp的DNA。因此，包含小於約150bp的DNA（例如小於149bp、小於148bp、小於147bp、小於146bp或小於145bp的DNA）的核小體不包含連接DNA。在一實施例中，結合劑選擇性地結合包括小於150bp的DNA（例如小於149bp、148bp、147bp、146bp或145bp的DNA）的核小體。在一實施例中，結合劑與由少於147bp的DNA組成的核小體結合。在一實施例中，該結合劑不結合包含超過150bp的DNA的核小體，即，該結合劑選擇性地結合不具有連接DNA的核小體。

該方法使用陽性選擇，透過與不包含連接DNA的核小體結合來分離（即純化）疾病來源的核小體。這類特徵包括，例如但不限於，核心組蛋白尾部的剪切和三級折疊模式和/或包含組蛋白同功異形體H2AZ。組蛋白H2AZ和核小體相關的DNA免受核酸酶活性的保護作用的降低有關（Bonisch等，2012），而組蛋白H2AZ的含量升高與許多惡性腫瘤有關（Yang等，2018）。因此，在一實施例中，與不具有連接DNA的核小體相關的核小體特徵是組蛋白同功異形體H2AZ。類似地，染色質蛋白H2Abdb（組蛋白H2A的同功異形體）和CENP-A（組蛋白H3的同功異形體）與核小體相關的DNA免受核酸酶活性的保護作用的降低有關。已顯示H2Abdb與DNA末端的結合較不緊密（Bao等人，（2004）），而包含CENP-A的核小體比包含典型H3的核小體更容易分解（Conde e Silva等，（2007））。因此，在其他實施例中，與不具有連接DNA的核小體相關的核小體特徵是組蛋白同功異形體H2Abdb或CENP-A。

如上所述之本發明的前述態樣涉及用於包含連接DNA的核小體的結合劑。現在我們描述不包含連接DNA的核小體（即包含約150bp或更少的DNA的核小體）的結合劑。因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種結合劑，其僅結合或優先結合包含短DNA片段而不具有連接DNA的核小體的特徵。這類結合劑至少有三種，包括（i）「剪切的組蛋白(clipped histones)」的結合劑、（ii）核心組蛋白同功異形體H2AZ的結合劑、以及（iii）經過專門改造以優先結合含有短DNA片段而不具有連接DNA的核小體的結合劑。

因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離不具有連接DNA的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與一結合劑接觸，該結合劑結合至剪切的組蛋白分子（即，不存在全部或部分的組蛋白尾部）；以及（ii）從樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。

除球形結構域外，核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4還包含突出於核小體外部的組蛋白尾部。組蛋白尾部可能會經歷多種轉譯後修飾（PTM），包括甲基化、乙醯化、丙醯化、丁基化、巴豆醯化、2-羥基異丁基化、丙二醯化、琥珀醯化、甲醯化、泛素化、瓜胺酸化、磷酸化、O GlcNAcylation和ADP核糖苷化。染色質內的各種組蛋白修飾以協調的方式起作用以調控基因轉錄。組蛋白的化學PTM通常藉由組蛋白修飾酶的選擇性酶添加或組蛋白修飾的消除而發生。但是，也可以透過組蛋白尾部的受調控的蛋白水解或剪切以同時物理地和不可逆地除去多個已存在的PTM。在組蛋白H3上，剪切據報是發生在胺基酸位置21附近（Yi 和Kim，2018）。

本文所用之術語「剪切的組蛋白」是指全部或部分組蛋白尾巴被去除之組蛋白分子。去除組蛋白尾部後，核小體保留了其球狀結構，但核小體中的組蛋白剪切使相關的DNA越來越容易被核酸酶降解（Dhaenens等，2014）。因此，被剪切的核小體的結合劑可用作為結合不包含連接DNA的核小體的手段。

因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離無細胞核小體的方法（例如通過親和純化），其中該方法包括步驟：（i）使樣品與一結合劑接觸，該結合劑與包含組蛋白分子的核小體結合，該組蛋白分子已除去全部或部分組蛋白尾部；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與該結合劑結合的核小體。

本發明的此態樣可用於從不具有連接DNA的核小體（即，與結合劑結合的剪切的組蛋白）中分離具有連接DNA的核小體（即未結合的核小體）。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合劑接觸，該結合劑與包含組蛋白分子的核小體結合，該組蛋白分子已除去全部或部分組蛋白尾部；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合之核小體。

在一實施例中，含有剪切的組蛋白分子的核小體包含少於155個鹼基對的DNA。在另一實施例中，含有剪切的組蛋白分子的核小體包含少於150個鹼基對的DNA，例如少於148個DNA鹼基對或少於147個DNA鹼基對的DNA。

在一實施例中，該結合劑與剪切的組蛋白H3蛋白結合。在另一實施例中，結合劑在胺基酸殘基30之後的表位（即在胺基酸殘基30-33的表位）結合組蛋白H3。

或者，可以在陰性選擇方法中使用與組蛋白尾部結合的結合劑，以檢測/分離剪切的組蛋白。因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離無細胞核小體的方法（例如透過親和純化），其中該方法包括以下步驟：（i）使樣品與一結合劑接觸，該結合劑結合至核小體的組蛋白尾部；以及（ii）從樣品中分離在步驟（i）中未與結合劑結合的核小體。

本發明的此態樣可用於分離不具有連接DNA的核小體（即未結合的核小體）與具有連接DNA的核小體（包含組蛋白尾部之核小體，該組蛋白尾部與結合劑結合）。

在一實施例中，結合劑結合至組蛋白H3的組蛋白尾部。在另一實施例中，結合劑在胺基酸殘基30之前的表位（例如胺基酸殘基4-8的表位）上結合組蛋白H3。

組蛋白同功異形體H2AZ與核小體不穩定性和保護核小體相關的DNA免受核酸酶活性影響的作用降低有關。摻入組蛋白同功異形體H2AZ2.2的核小體特別容易受到DNA分解的影響（Bonisch等人，2012）。因此，組蛋白H2AZ的結合劑可作為結合含有少於約150bp的短DNA片段且不具有連接DNA的核小體的手段。因此，在一實施例中，結合劑結合至組蛋白H2AZ。在一較佳實施例中，H2AZ分子是H2AZ2.2。

因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體和不具有連接DNA的無細胞核小體的方法，其中該方法包含步驟：（i）使樣品與結合劑接觸，該結合劑與包含組蛋白H2AZ分子的核小體結合；以及（ii）從樣品中分離在步驟（i）中未與結合劑結合的核小體。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合劑接觸，該結合劑與包含組蛋白H2AZ分子的核小體結合；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合之核小體。

可以對結合劑進行特定的工程改造，使其與含有短DNA片段但不具有連接DNA的核小體結合，而不結合或弱結合至具有連接DNA的核小體（或染色體）。此類結合劑可用於透過已結合的不具有連接DNA的核小體的分離，以富集腫瘤相關核小體或胎兒核小體的生物樣品。類似地，可以對結合劑進行特定的工程改造，使其與具有連接DNA的核小體結合，而不結合或弱結合至含有短DNA片段但不具有連接DNA的核小體。此類結合劑還可用於透過未結合的不具有連接DNA的核小體的分離，以富集腫瘤相關核小體或胎兒核小體的生物樣品。在一較佳實施例中，抗體結合劑透過涉及陽性和陰性選擇的文庫選擇方法（例如透過噬菌體呈現文庫抗體開發）來工程化。透過將噬菌體抗體庫暴露於不具有連接DNA的核小體（例如，由核心組蛋白和145bp片段的DNA組成的合成核小體）來進行陽性選擇。在第一步驟中，選擇與不具有連接DNA的核小體牢固結合的任何抗體作為候選抗體。然後，將表現陽性抗體的噬菌體進行第二陰性選擇步驟，其中將其暴露於具有連接DNA的核小體（例如，由核心組蛋白和大約167bp或187bp片段的DNA所組成的合成核小體）。在此第二步驟中，將拒絕任何與包含連接DNA的核小體結合的抗體。選擇與不具有連接DNA的核小體結合但不與含有連接DNA的核小體結合的剩餘抗體作為適用於本發明的抗體結合劑。這類抗體可針對僅存在於不具有連接DNA的核小體中的合小體表位結合，這是因為這些核小體及/或核小體表位的特異性構象結構在存在著連接DNA的情況下不可結合（例如，出於空間因素），但在不具有連接DNA的核小體中露出。

根據本發明的另一態樣，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體和不具有連接DNA的無細胞核小體，其中該方法包括以下步驟：（i）使樣品與一結合劑接觸，該結合劑經工程改造以選擇性地結合至包含長度少於約150個鹼基對的DNA的核小體，其中該結合劑與一核小體特徵結合，該核小體特徵與不具有連接DNA的核小體相關；以及（ii）從樣品中分離在步驟（i）中未與結合劑結合的核小體。

在一實施例中，提供了一種透過親和純化從血液、血清或血漿樣品中分離疾病或胎兒來源的循環無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與一結合劑接觸，該結合劑經工程改造以選擇性地結合至包含長度少於約150個鹼基對的DNA的核小體，其中該結合劑與一核小體特徵結合，該核小體特徵與不具有連接DNA的核小體相關；以及（ii）從樣品中分離在步驟（i）中與結合劑結合的核小體。

在一實施例中，核小體包含長度約147個鹼基對的DNA，例如長度約145個鹼基對的DNA。

結合劑

對於本領域技術人員將清楚的是，能夠與所需目標特異性結合的任何結合劑都可以用於本發明的方法。這類結合劑可包括但不限於：抗體、親和體、適體或結合蛋白（例如，核小體結合蛋白）。在一實施例中，結合劑係選自抗體（或其片段）、親和體或適體，特別是抗體。

在一些實施例中，在本發明的方法中使用組蛋白H1、macroH2A或染色質結合蛋白（其優先與連接DNA結合）本身作為結合劑。發明人驚訝地發現這些蛋白質可直接用作為結合劑。不受理論的束縛，鑑於先前已經理解組蛋白H1將結合連接DNA（即與本文所述的染色質結合蛋白相同的區域）這一事實，這些替代的結合蛋白特別令人驚訝，因此並未預期可使用這些替代性結合劑。此外，本發明的方法可以透過與具有不同表觀遺傳標記的核小體結合，而用於從樣品中分離不同的核小體類型。

應當理解的是，可在本發明之方法中使用結合劑的組合，即製備結合劑的套組以富集不同類型的核小體。因此，在一實施例中，使樣品與一種以上類型的結合劑接觸，該結合劑與包含連接DNA的核小體結合。

核小體與DNA分析

透過本發明方法分離的核小體和/或相關的DNA可以藉由免疫測定、質譜、DNA定序（即分析相關的DNA的特定遺傳序列或甲基化遺傳序列）、表觀遺傳訊號結構或其他特徵來分析。

一旦已經分離出核小體的片段（特別是富含疾病（例如腫瘤）起源的核小體片段），就可以分析核小體相關的DNA，例如基因或DNA序列標記。因此，在一實施例中，該方法包括：（i）使用本文定義的方法分離（即富集）疾病來源的核小體；以及（ii）分析在步驟（i）中分離的與核小體相關的DNA。

在一較佳實施例中，從患有疑似或診斷為癌症的受試者中收集血漿樣品。透過本文所述的方法分離或富集血漿樣品中不具有連接DNA的核小體。萃取與富含腫瘤來源的核小體相關的DNA，以產生大小選擇的DNA片段文庫，其長度約小於150bp。分析DNA中與癌症相關的突變異常及/或突變等位基因比例和/或基因甲基化異常。

可以採用任何DNA分析方法，包括但不限於DNA定序（包括次世代定序（目標基因組或整個基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術（BEAMing）、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下的共擴增PCR）的PCR、等溫擴增、雜合、MIDI活化焦磷酸解（MAP）或個人化重組分析（PARE）。

DNA分析可以包括分析任何遺傳DNA標記，包括核苷酸取代、核苷酸插入、核苷酸缺失、甲基化DNA序列或其他DNA序列突變。可以在這種分析中研究的典型的癌症相關的DNA異常包括但不限於：點突變、易位、基因複製數突變、微衛星異常、DNA鏈完整性以及基因甲基化狀態。

已經發現通常在癌症患者中有大量基因突變，但是任何特定的突變很可能僅在小部分癌症患者中發生。然而，所有癌症患者的確都有某些突變，因此，在任何特定患者中檢測到至少一個突變的可能性會隨著所測試的潛在突變數的增加而增加。因此，通常需要檢測一組遺傳突變。該組遺傳突變包括但不限於一或多個下列基因突變：ABL1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、AJUBA、AKT1、AKT2、AKT3、ALB、ALK、AMER1、APC、APEX1、APLNR、APOB、AR、ARAF、ARHGAP35、ARID1A、ARID2、ARID5B、ATF7IP、ATM、ATP11B、ATR、ATRX、ATXN3、AURKA、AXIN1、AXIN2、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L11、BCL9、BCOR、BIRC2、BIRC3、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD7、BTG2、BTK、CARD11、CASP8、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD44、CD70、CD79B、CDH1、CHD3、CHD8、CDK12、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN2A、CDKN2B、CEBPA、CHD4、CHEK2、COL5A1、CREBBP、CSF1R、CSNK2A1、CTNNB1、CTNND1、CUL1、CUL3、CYP2C19、CYP2D6、DACH1、DCUN1D1、DDR2、DICER1、DNMT3A、DPYD、EEF2、EGFR、ELF3、EP300、EPHA2、EPHA3、EPHA5、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ESR1、EZH2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCI、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FOXA2、FOXQ1、GAS6-AS1、GATA1、GATA2、GATA3、GATA6、GNA11、GNAQ、GNAS、H3F3A、H3F3C、HGF、HIST1H3B、HNF1A、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、IL6、IL6ST、IL7R、INSR、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KDR、KEAP1、KIT、KNSTRN、KRAS、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、LYN、MAGOH、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAPK1、MDM2、MDM4、MECOM、MED12、MEN1、MET、MGA、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MUC6、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO18A、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NKX2-1、NKX2-8、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP133、NUP93、PALB2、PAX5、PBRM1、PD-1、PDGFRA、PDGFRB、PD-L1、PD-L2、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、POLD1、POLE、PPP2R1A、PPP6C、PRKAR1A、PRKCI、PRKDC、PSIP1、PMS2、PTCH1、PTEN、PTMA、PTPDC1、PTPN11、PTPRC、PTPRD、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAF1、RARA、RASA1、RB1、RBM10、RET、RFC1、RHEB、RHOA、RHOB、RICTOR、RNF43、ROS1、RPS6KA3、RPS6KB1、RPTOR、RQCD1、RRAS2、RUNX1、RUNX1T1、RXRA、SCAF4、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SIN3A、SLX4、SMAD2、SMAD4、SMARCA1、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOS1、SOX17、SOX2、SOX9、SPOP、SPTA1、SPTAN1、SRC、SRSF2、STAG2、STAT3、STK11、TAF1、TBL1XR1、TBX3、TCEB1、TCF12、TCF7L2、TET2、TGFBR2、TGIF1、THRAP3、TLR4、TMSB4X、TNFAIP3、TOP1、TOP2A、TP53、TPMT、TRAF3、TSC1、TSC2、TSHR、TXNIP、U2AF1、UGT1A1、UNCX、USP9X、VHL、WHSC1、WT1 XPO1以及ZFHX3基因。

類似地，已研究了許多基因作為鑑別癌症中胞嘧啶甲基化狀態的標記。其中一些是SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、TIG1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2以及RARβ2。

此外，根據本發明之另一態樣，提供了一種從生物液體樣品中分離純化的循環腫瘤DNA（ctDNA）的方法，其中該方法包括步驟：（i）執行本文定義的方法；以及（ii）分析來自分離的核小體的DNA。

本發明的此態樣在分析不具有連接DNA的核小體（即，在本發明的第二方面分離出的）中發現了特殊用途，因為推測這類核小體是疾病來源的。選擇性地，在分析之前萃取與分離的核小體相關的DNA。許多分析萃取的DNA的方法是本領域已知的。或者，直接分析DNA，即不需要萃取。

如果分離出的無細胞核小體為腫瘤來源的，則檢測到的分離的腫瘤核小體含量（以原始（未處理）樣品中存在的核小體的比例檢測）可用作在一樣品中包含循環腫瘤DNA（ctDNA）的DNA的比例的指標。此外，逆含量為健康來源的DNA在樣品中的比例。因此，本文描述的方法可用於檢測樣品中ctDNA的含量/比例或這種含量隨著時間推移的變化。這種測量類似於ctDNA中與癌症相關突變的突變等位基因比例測量，並且可以用作為腫瘤負荷和治療反應的測量。

還可以分析已經富集的疾病（例如腫瘤）來源的核小體的表觀遺傳標記（「表觀遺傳表位」）或進行進一步的富集方法。因此，在一實施例中，該方法包括：（i）通過本文定義的方法分離（即富集）疾病來源的無細胞核小體；（ii）分析步驟（ii）中分離的無細胞核小體。

在一實施例中，分析步驟包括分析分離的無細胞核小體的表觀遺傳核小體特徵，所述特徵選自：組蛋白類型（例如，H1、H2A、H2B、H3、H4組蛋白）、組蛋白轉譯後修飾、組蛋白同功異形體、特定核苷酸、修飾的核苷酸（例如甲基化、羥基-甲基化或其他核苷酸修飾）或其組合，或分析加合至核小體的其他蛋白質的存在。

檢測到的疾病來源的富集的無細胞核小體的存在或含量（包含修飾的核苷酸、組蛋白轉譯後修飾、組蛋白同功異形體或核小體-蛋白加合物）可以用作為疾病狀態、疾病預後、疾病監測、治療監測、微量殘留疾病、或對特定治療的疾病敏感性的指標，或用於其他臨床應用。

對疾病來源的分離核小體的分析可涉及本領域已知的任何合適的分析方法。這些方法包括但不限於透過使用抗體或其他結合劑對常見的核小體表位（例如DNA）或感興趣的表觀遺傳結構（包括組蛋白修飾、組蛋白變體、DNA修飾或加合至核小體的另一分子）進行免疫測定分析。這些方法包括在WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579以及WO 2013/084002中描述的所有方法，其通過引用併入本文。沒有限制，這些方法中的任何一種都可與本發明結合使用。這些方法還包括用於分析腫瘤來源的循環核小體中存在的多個表位的多重方法。

透過本發明方法分離的源自疾病的核小體的分析可涉及本領域已知蛋白質體學方法，包括但不限於：包括但不限於電泳分析（electrophoresis method）、色析法（chromatographic methods）和任何涉及質譜分析（mass spectrometry）的方法，包括涉及色譜（chromatography）和質譜（mass spectrometry）的方法，及/或穩定同位素標記的質譜法，及/或涉及蛋白質分解以產生胜肽的方法，以透過質譜法或任何其他組合質譜法進行鑑定和/或定量。

在一實施例中，表位係選自組蛋白修飾（例如，組蛋白轉譯後修飾[PTM]）、修飾的核苷酸、組蛋白變體或同功異形體、或核小體加合物或其變體。在另一實施例中，修飾的核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。

文獻中已經描述了多種表觀遺傳修飾的核苷酸，並且已知在癌症中改變了DNA和/或DNA核苷酸殘基中的表觀遺傳修飾模式。其中對其最好的描述包括在位置5的胞嘧啶甲基化，即「5-甲基胞嘧啶」。含有5-甲基胞嘧啶的DNA通常被稱為「甲基化DNA」。與健康細胞的DNA相比，癌細胞中DNA的甲基化估計減少了約50%（Guerrero-Preston等，2007；Soares等，1999）。然而，與癌症相關的循環核小體含量的增加可以是幾倍（Holdenrieder等，2001和Schwarzenbach等，2011）。

其他表觀遺傳表位的測定可以單獨進行或作為測定套組的一部分進行。

在一實施例中，對從本文所述之方法獲得的分離的核小體樣品進行進一步的富集步驟。因此，在一實施例中，本發明之方法另外包括使分離的核小體與組蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t結合劑接觸。如先前所示，組蛋白3同功異形體H3.1、H3.2和H3t可用於ctDNA富集。

獲得結合劑的方法

如本文所述的核小體相關的DNA片段大小的差異可用於設計和獲得用於本發明的結合劑。獲得優先結合短（例如小於150bp DNA）核小體的結合劑或抗體的一種方法是使用含有約147bp DNA的重組或合成核小體作為抗原，以針對其產生抗體。在該方法之另一較佳態樣，出於陰性選擇的目的，還測試了結合短DNA核小體的抗體或結合劑與更長的約167bp DNA的核小體的結合。透過這種方法，可以選擇與短DNA核小體結合但不與長DNA核小體結合的抗體，並將其用作為富集或純化短DNA核小體的試劑。

根據本發明的另一態樣，提供了一種獲得優先結合疾病來源無細胞核小體的抗體或其他結合劑的方法，其中該方法包括步驟：（i）使用含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體作為抗原，產生針對其的抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的抗體或其他結合劑呈現給含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體；和（iii）選擇結合步驟（i）的核小體但不結合（或僅弱結合）步驟（ii）的核小體之抗體或其他結合劑。

根據本發明的另一態樣，提供了一種獲得優先結合非疾病來源無細胞核小體的抗體或其他結合劑的方法，其中該方法包括步驟：（i）使用含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體作為抗原，產生針對其的抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的抗體或其他結合劑呈現給含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體；和（iii）選擇結合步驟（i）的核小體但不結合（或僅弱結合）步驟（ii）的核小體之抗體或其他結合劑。

在一實施例中，用作為抗原的核小體是重組或合成核小體。用於產生或測試短核小體的結合劑的核小體可包含約150個鹼基對或更少，例如147個鹼基對或更少、或145個鹼基對或更少。用於產生或測試含有連接DNA的核小體的結合劑的核小體（或寡核小體或其他染色質片段）可能包含大約155個鹼基對或更多，例如160個鹼基對或更多、或165個鹼基對或更多、或167個鹼基對或更多。

在該方法之一個較佳實施例中，噬菌體呈現文庫抗體選擇技術係用於鑑定抗體。舉例而言，噬菌體呈現文庫可以用於結合短DNA核小體的噬菌體株的陽性選擇以及結合長DNA核小體的噬菌體株的陰性選擇。因此，在一實施例中，該方法包括噬菌體呈現文庫抗體的選擇技術。

根據本發明的另一態樣，提供了一種生產結合劑的方法，該結合劑選擇性地結合至包含連接DNA的核小體，而不結合或弱結合至包含短DNA片段的核小體（即不具有連接DNA的核小體），其中該方法包括以下步驟：（i）使結合劑文庫與核小體接觸，（ii）在步驟（i）中分離結合至包含約165個以上鹼基對DNA的核小體的結合劑，（iii）使步驟（ii）中分離的結合劑與長度少於約150個鹼基對的DNA的核小體接觸；以及（iv）分離在步驟（iii）中不結合或弱結合至長度少於約150個鹼基對DNA的核小體的結合劑。

因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種生產結合劑的方法，該結合劑選擇性地結合含有短DNA片段的核小體（即不具有連接DNA的核小體），而不結合或弱結合至具有連接DNA的核小體，其中該方法包括步驟：（i）使結合劑文庫與核小體接觸，（ii）在步驟（i）中分離結合至包含少於150個鹼基對的DNA的核小體的結合劑，（iii）使步驟（ii）中分離的結合劑與包含長度超過165個鹼基對的DNA的核小體接觸；和（iv）分離步驟（iii）中不結合或弱結合至長度不超過165個鹼基對的DNA的核小體的結合劑。

使用抗體結合劑的方法

在另一實施例中，本文所述的方法可更包括使步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的第二結合劑接觸。因此，該方法可以與兩種結合劑一起使用以確定透過本文所述之方法分離的核小體的含量。

選擇性結合包含連接DNA的核小體或選擇性地選擇不含連接DNA的核小體的抗體可以在本發明的免疫測定方法中用作這類核小體的直接量度。根據本發明之另一態樣，提供了一種用於檢測或測量不具有連接DNA的核小體的免疫測定法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與選擇性結合不具有連接DNA的核小體的抗體結合劑接觸；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的第二結合劑接觸；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中核小體的結合；以及（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中不具有連接DNA的無細胞核小體的量度。

根據本發明之另一態樣，提供了一種用於檢測或測量含有連接DNA的核小體的免疫測定法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與選擇性結合具有連接DNA的核小體的抗體結合劑接觸；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的第二結合劑接觸；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中核小體的結合；以及（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中具有連接DNA的無細胞核小體的量度。

對結合具有連接DNA的核小體具有選擇性或對不具有連接DNA的核小體具有選擇性的抗體也可用於本發明的富集方法。

使用非抗體結合劑的免疫測定方法

發明人驚奇地發現，結合核小體的蛋白質可直接用於無細胞核小體的分離和檢測方法。這樣的方法避免了產生抗體的需求，而可以利用天然蛋白質。因此，根據另一態樣，提供了結合蛋白在從體液樣品中分離無細胞核小體的用途。

根據本發明之另一態樣，提供了一種檢測生物液體樣品中無細胞核小體的免疫測定方法，其中該方法包括以下步驟：（i）使樣品與一第一結合劑接觸，該結合劑係選自組蛋白H1、macroH2A、染色質結合蛋白或其片段、類似物或工程化衍生物；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的第二結合劑接觸；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中核小體的結合；以及（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中無細胞核小體的量度。

在另一態樣，提供了一種檢測生物液體樣品中無細胞核小體的免疫測定方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合至核小體或其成分的第一結合劑接觸；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與第二結合劑接觸，該第二結合劑係選自組蛋白H1、macroH2A、染色質結合蛋白或其片段、類似物或工程化衍生物；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中核小體的結合；以及（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中無細胞核小體的量度。

在一實施例中，染色質結合蛋白與連接DNA相關。在另一實施例中，染色質結合蛋白選自：MBD、HMGB、CHD、DNMT和PARP。

根據另一態樣，提供了一種檢測生物液體樣品中無細胞核小體的免疫測定方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與結合核小體或其成分的第一結合劑接觸；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與第二結合劑接觸，該第二結合劑與染色質結合蛋白結合，該染色質結合蛋白係選自：CHD、DNMT、PARP和MBD；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中染色質結合劑的結合；和（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中無細胞核小體的量度。

根據另一態樣，提供了一種檢測生物液體樣品中的無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與第一結合劑接觸，該第一結合劑與一染色質結合蛋白結合，該染色質結合蛋白係選自：CHD、DNMT、PARP和MBD；（ii）使在步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的第二結合劑接觸；以及（iii）檢測或測量該第二結合劑與樣品中核小體的結合；以及（iv）使用這種結合的存在或程度作為樣品中無細胞核小體的量度。

循環細胞外囊泡

血液包含許多細胞外囊泡（ECV），這些囊泡含有或結合至DNA、核小體和/或其他蛋白質-核酸複合物。外泌體是ECV的一個實例，其可包含核小體和/或DNA和/或其他染色質片段。與外泌體或其他ECV相關的核小體（包括含有連接DNA的核小體）可被保護免受或不易受染色質蛋白或其他結合劑的結合，因此當在本發明的方法中使用這些部分時可以保持未結合。任何使用本文所述之方法而未與蛋白質結合的這類ECV相關的具有連接DNA的核小體可留在上清液中。可以透過從樣品中去除外泌體和/或其他ECV來防止這種影響。

因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）從樣品中去除外泌體或其他ECV；（ii）使樣品與結合至核小體相關的連接DNA的結合劑接觸；和（iii）從樣品中分離在步驟（ii）中未與結合劑結合的核小體。

本領域技術人員將理解，以上步驟（i）和（ii）可以以任何順序或同時執行。

許多ECV的結合劑是本領域已知的，其可用於從樣品中結合和去除ECV。也可使用其他用於從樣品中分離外泌體和其他ECV的市售產品。凝集素是已知與大多數或所有外泌體結合的蛋白質。因此，在一實施例中，使用凝集素從樣品中去除外泌體或其他ECV。在本發明之較佳實施例中，凝集素蛋白附著於固相支撐物上，並用於結合樣品中存在的外泌體和其他ECV。在暴露於凝集素蛋白後，耗盡了樣品上清液中的外泌體/ECV，因此去除了任何與外泌體或ECV相關的具有連接DNA的核小體。

因此，在本發明之一實施例中，提供了一種透過親和純化從生物液體樣品中分離具有連接DNA的無細胞核小體與不具有連接DNA的無細胞核小體的方法，其中該方法包括步驟：（i）使樣品與凝集素部分接觸；（ii）使樣品與結合至核小體相關的連接DNA的結合劑接觸；以及（iii）從樣品中分離在步驟（ii）中未與結合劑結合的核小體。

本領域技術人員將理解的是，以上步驟（i）和（ii）可以以任何順序或同時執行。在一較佳實施例中，樣品為血漿樣品。

癌症的檢測和治療方法

根據本發明之另一態樣，提供了一種透過測量或檢測體液中含有很少或不含有連接DNA的核小體的存在和/或含量來檢測或診斷疾病的存在的測定方法，並且將測得的含量用作為受試者的疾病狀態的生物標記（單獨作為測試套組的一員），包括但不限於疾病的臨床診斷、疾病類型或亞型的鑑別診斷或疾病預後或疾病復發、或診斷受試者對治療方案的敏感性。本領域技術人員將理解的是，用於診斷檢測的體液包括但不限於血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液和其他液體。在一較佳實施例中，選擇作為樣品的體液是血液、血清或血漿。可以透過包括質譜法和免疫測定法在內的多種方法來測量體液中分離的含有很少或不含有連接DNA的核小體。或者，可透過物理或化學方法來測量核小體相關的DNA，所述物理或化學方法包括但不限於色譜、電泳、PCR和DNA定序方法。

在體液中，含有很少或不含有連接DNA的核小體的測定反應、含量、濃度或數量可用絕對或相對術語表示，例如但不限於表示為與存在的總核小體含量的比例或與另一核苷酸或組蛋白變體或組蛋白PTM含量的比例或與總DNA含量的比例。在一實施例中，樣品中含有或不含有連接DNA的核小體的比例被用作為癌症的標記。因此，高比例的[不具有連接DNA的核小體]/[具有連接DNA的核小體]為癌症的指標。類似地，可以確定[長度小於150bp的DNA片段]/[長度大於150bp的DNA片段]的量或濃度的比例，或者可以確定突變等位基因比例。在此，舉例150bp作為DNA片段大小的臨界值。也可使用其他的臨界值。

本文描述的方法可以與診斷方法結合使用。例如，可以使用本文所述的方法富集樣品以分離腫瘤來源的DNA或無細胞核小體，然後可以透過檢測與疾病相關的其他表觀遺傳標記，將富集的樣品用於診斷方法。

因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種診斷癌症的方法，包括：（i）執行本文定義的方法，以從獲自患者的生物樣品中分離循環腫瘤核小體；以及（ii）分析分離的循環腫瘤核小體和/或相關DNA。

在一實施例中，步驟（ii）包括分析分離的循環腫瘤核小體的表觀遺傳核小體特徵，該特徵係選自：組蛋白類型（例如，H2A、H2B、H3、H4組蛋白）、組蛋白轉譯後修飾、組蛋白同功異形體，特別是核苷酸或修飾的核苷酸（例如甲基化、羥基-甲基化或其他核苷酸修飾）、加合至核小體的蛋白質或其組合。

在一實施例中，使用DNA定序來分析相關DNA，定序方法舉例選自：次世代定序技術（靶向或全基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術(BEAMing)、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下進行共擴增PCR）的PCR、等溫擴增、雜合、MIDI活化焦磷酸解（MAP）或個人化重組分析（PARE）。

根據本發明之另一態樣，提供了一種在動物或人類受試者中診斷或檢測癌症的方法，該方法包括步驟：（i）執行本文定義的方法；（ii）使在步驟（i）中獲得的分離的腫瘤來源的核小體與一其他結合劑接觸，該結合劑結合至腫瘤衍生的核小體的表觀遺傳表位（「生物標記」）；（iii）檢測和/或定量所述其他結合劑與所述表位的結合；以及（iv）使用所測量的所述表位的含量作為受試者中存在癌症的指標。

可以直接在純化或富集的核小體樣品進行檢測和/或定量，或在其萃取物或其稀釋液間接進行。量化樣品中存在的生物標記的量可包括確定樣品中存在的生物標記的濃度。本文所述之根據本發明的檢測、監測和診斷的用途和方法可用於確認疾病的存在、透過評估發作和進展來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或消退。檢測、監測和診斷的用途和方法也可用於評估臨床篩選、預後、治療選擇、評估治療益處的方法，即用於藥物篩選和藥物開發。

本文所述的診斷方法可更包括將存在於生物樣品中的第二結合劑的含量與一或多對照組進行比較。在一實施例中，來自一或多對照組的生物樣品係取自健康（或「正常」）患者和/或患有相關良性疾病的患者。在另一實施例中，來自一或多對照組的生物樣品係取自健康患者。

根據本發明的另一態樣，提供了一種診斷癌症的方法，其包括步驟：（a）透過本發明的方法測量從受試者獲得的體液樣品中不具有連接DNA的核小體的含量；以及（b）使用步驟（a）中測得的核小體含量來確定患者是否患有癌症。

根據本發明的另一態樣，提供了一種診斷癌症的方法，其包括步驟：（a）透過本發明的方法測量從受試者獲得的體液樣品中不具有連接DNA的核小體和具有連接DNA的核小體的比例；以及（b）使用步驟（a）中測得的比例確定患者是否患有癌症。

在本發明的一態樣中，本文所述之方法可用於監測患者癌症復發的進程。在另一態樣中，本文所述之方法可用於為患者選擇合適的療法。舉例而言，分析與分離的核小體相關的DNA可以確定患者癌症的基因型，這使他們對特定療法或多或少有反應。在本發明的一態樣，本文所述之方法可用於監測微量殘留疾病（MRD），即，鑑定已治療的患者中殘留惡性細胞的存在。檢測到MRD表示治療不完全。

根據本發明的另一態樣，提供了一種治療癌症的方法，其包括步驟：（a）從病人身上取得樣品；（b）透過本發明的方法測量樣品中包含長度短於約150bp的短DNA片段的核小體的含量；（c）利用步驟（b）中測得的核小體含量來確定患者是否患有癌症；和（d）如果在步驟（c）中確定患者患有癌症，則進行治療。

根據本發明的另一態樣，提供了一種治療癌症的方法，其包括步驟：（a）從病人身上取得樣品；（b）透過本發明的方法測量樣品中包含長度約小於150bp以及長度大於150bp的短以及長DNA片段的核小體的比例；（c）使用在步驟（b）中測量的核小體的比例來確定患者是否患有癌症；以及（d）如果在步驟（c）中確定患者患有癌症，則進行治療。

在一實施例中，本發明的方法用於測量樣品中含有短或長DNA片段（即長度分別小於約150bp和大於150bp）的核小體的含量，這是本文所述的本發明的免疫測定方法。

根據本發明的另一態樣，提供了一種治療癌症的方法，其包括步驟：（a）從病人身上取得樣品；（b）透過本發明的方法分離樣品中約150bp或更短的DNA片段；（c）利用步驟（b）中分離的DNA片段的含量來確定患者是否患有癌症；和（d）如果在步驟（c）中確定患者患有癌症，則進行治療。

本發明方法的一個重要態樣是透過用於ctDNA檢測和分析的改良方法以利於改善癌症疾病的檢測和治療。在本發明的背景技術中，先前簡述的用於ctDNA分析的五種方法中的四種方法需要對DNA片段進行定序和/或對甲基化DNA片段進行定序。但是，由於所分析樣品中的ctDNA含量較低，因此這些方法難以進行。

在一個實施例中，步驟（c）包括確定DNA片段的突變等位基因比例。在另一個或替代的實施例中，步驟（c）包括對DNA片段進行定序。然後可將核苷酸序列用於確定患者是否患有癌症，例如，分析任何遺傳DNA標記、包括核苷酸取代、核苷酸插入、核苷酸缺失、甲基化DNA序列或其他DNA序列突變。

在一實施例中，所施用的治療係選自：手術、放射療法、化學療法、免疫療法、激素療法和生物療法。

試劑盒

根據本發明的另一方面，提供了一種用於檢測或分離或測量核小體的試劑盒，其包含：（i）組蛋白H1、macroH2A或染色質結合蛋白、和（ii）特異性結合至核小體或其成分的結合劑，選擇性地還有根據本文定義的方法使用試劑盒的說明。

根據本發明的另一態樣，提供了一種用於檢測或分離或測量核小體的試劑盒，其包括：（i）針對染色質結合蛋白結合的抗體或其他結合劑、和（ii）特異性結合至核小體或其成分的結合劑，選擇性地還有根據本文定義的方法使用試劑盒的說明。

本發明的試劑盒可替代地或額外地包括用於分離和/或分析核小體相關的DNA片段的試劑。根據本發明的另一態樣，提供了一種試劑盒，其包含：（i）組蛋白H1、macroH2A或染色質結合蛋白；（ii）用於分離和/或分析核小體相關DNA片段的試劑，選擇性地還有根據本文定義的方法使用試劑盒的說明。

根據另一態樣，提供了本文定義的試劑盒在診斷癌症中的用途。

本發明的一般特徵

以下實施例可以應用於本文所述發明之態樣。

在一實施例中，核小體是無細胞的單核小體或寡核小體。顯然，本文所用的術語「核小體」旨在包括單核小體和寡核小體以及可以在液體介質中分析的任何此類染色質片段。在另一實施例中，無細胞核小體是單核小體、寡核小體或其他染色體片段。

在一個實施例中，生物液體（即體液）樣品係選自血液、血清或血漿樣品。

在一實施例中，從受試者獲得生物液體樣品，並且富集樣品中的疾病相關或疾病衍生的核小體，如本文所述。液體樣品可以是從受試者獲取的任何生物液體（或體液）樣品，包括但不限於：腦脊液（CSF）、全血、血清、血漿、經血、子宮內膜液、尿液、唾液或其他身體液體（糞便、淚液、關節液、痰液）、呼吸、例如如凝結的呼吸、或其萃取物或純化物、或其稀釋物。生物樣品還包括來自活體或屍檢的標本。樣品舉例可在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式儲存。在一特定實施例中，體液係選自血液、血清和血漿。

收集生物樣品的方法是本領域眾所周知的，並且應理解的是，任何這類收集方法均適用於本文所述的方法。

在一實施例中，受試者是人或動物，例如人、馬、狗或小鼠。在本文中可互換地使用所提及的「受試者」或「患者」。

本文所述的免疫測定方法是指抗-核小體之抗體或結合物，或結合至核小體中存在的表位的抗體或其他結合物。本領域技術人員將清楚的是，此類結合物可針對存在於核小體或染色質片段中的任何表位結合。這類表位包括但不限於組蛋白（特別是核心組蛋白）、組蛋白同功異形體、修飾的組蛋白（例如組蛋白轉譯後修飾）、與核小體相關的DNA（例如核苷酸、修飾的核苷酸）、構象表位或組蛋白加合物（即蛋白質加合到核小體上）。

在一較佳實施例中，結合劑塗覆在固體支撐物上，例如瓊脂糖凝膠、葡聚醣凝膠、塑膠或磁珠。在一實施例中，所述固體支撐物包括多孔材料。在另一實施例中，將結合劑衍生以包括標籤或連接子，其可以用於將結合劑附接到已經被衍生化以結合至標籤的合適的支持物。許多這類的標籤和支撐物是本領域已知的（例如，Sortag、Click Chemistry、生物素/鏈黴親和素、his標籤/鎳或鈷、GST標籤/GSH、抗體/表位標籤等等）。為了易於使用，塗覆的支撐物可包含於裝置中，例如微流體裝置。

在一實施例中，疾病（分離的、循環的、無細胞的核小體起源於該疾病）選自癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病。在另一實施例中，該疾病是癌症。在另一實施例中，自身免疫疾病選自：全身性紅斑狼瘡（SLE）和類風濕性關節炎。在另一實施例中，炎性疾病選自：克隆氏病、結腸炎、子宮內膜異位和慢性阻塞性肺疾病（COPD）。

如果疾病是癌症，則分離的核小體可以被稱為「腫瘤衍生的」或「與腫瘤相關的」核小體。由於ctDNA和循環核小體是所研究的所有癌症疾病類型的特徵，因此本發明的方法適用於所有癌症疾病。在一實施例中，腫瘤來源或腫瘤相關的無細胞核小體源自於選自以下的癌症：乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚癌（例如黑素瘤）、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰臟癌、腸癌癌症、肝癌、子宮內膜癌、淋巴瘤、口腔癌、頭頸癌、白血病和骨肉瘤。

本公開提供了能夠特異性結合核小體的配體或結合劑，例如天然存在的或化學合成的化合物。配體或結合物可包含能夠特異性結合核小體的胜肽、抗體或其片段、或合成的配體（例如塑性抗體）、或適體、或親和體或寡核苷酸。抗體可為能夠特異性結合核小體的單株抗體或其片段。可用可檢測的標記物以標記配體或結合劑（例如本文所述的染色質結合劑，或針對核小體或其成分的結合劑），該標記物舉例為發光、螢光、酶或放射性標記物。替代地或另外地，可以用親和標籤標記配體，例如：生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素或His（例如hexa-His）標籤。或者，可以使用無標記技術（例如ForteBio Inc.）確定配體結合。

本文所述的方法使用特定標靶物分離核小體。然後可以進一步分析所述分離的核小體的特定生物標記。術語「生物標記」是指過程、事件或狀況的獨特生物學或生物來源指標。生物標記可用於診斷方法例如臨床篩查、預後評估以及監測治療結果，確定最有可能對特定治療方法、藥物篩查和開發有反應的受試者。這樣的生物標記舉例包括，無細胞核小體本身的含量（即，透過本發明的方法分離的核小體的含量）或分離的無細胞核小體的表觀遺傳學特徵的含量。

提供了用於執行本發明方法的診斷或監測試劑盒。這樣的試劑盒將適當地包含本文所述之用於檢測和/或定量靶標或生物標記的配體和/或生物感測器和/或陣列，選擇性地還有根據本文定義的方法使用試劑盒的說明。本發明之另一態樣是用於檢測疾病狀態的存在的試劑盒，其包括能夠檢測和/或定量一或多個本文定義的生物標記的生物感測器。

本文使用的術語「檢測」和「診斷」涵蓋疾病狀態的識別、確認和/或表徵。根據本發明的檢測、監測和診斷的方法可用於確認疾病的存在，透過評估發作和進展來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或消退。檢測，監測和診斷的方法也可用於評估臨床篩選、預後、治療選擇、評估治療益處的方法，即用於藥物篩選和藥物開發的方法。

有效的診斷和監測方法為改善預後提供了非常強大的「患者解決方案」，透過建立正確的診斷，可快速辨別最適合的治療（因此減少暴露於不必要的有害的藥物副作用）並降低復發率。

已經知道的是，增多的細胞更新、細胞死亡和細胞凋亡導致無細胞核小體的循環含量增加（Holdenrieder等，2001）。循環游離細胞核小體的含量是一種非特異性指標，其發生於多種疾病中，包括炎性疾病、多種良性和惡性疾病、自體免疫性疾病以及創傷或局部缺血之後（Holdenrieder等，2001）。本領域技術人員將清楚的是，本發明將應用在已在受試者中發現循環核小體的多種疾病領域中。這些包括但不限於創傷（例如，重傷或手術）、極限運動（例如進行馬拉松比賽）、中風和心臟病發作、敗血症或其他嚴重感染和子宮內膜異位。

本發明的免疫測定包括採用酶檢測方法（例如ELISA）的免疫測定、螢光標記免疫測定法、時差性螢光標記免疫測定、化學發光免疫測定、免疫比濁測定、微粒標記免疫測定和免疫放射測定以及競爭性免疫測定法，包括標記的抗原和標記的抗體競爭性免疫分析方法，其具有多種標記類型，包括放射性標記、酶標記、螢光標記、時差性螢光標記和微粒標記。所有所述免疫測定方法都是本領域眾所熟知的，參見例如Salgame等人（1997）和van Nieuwenhuijze等人（2003）。

任何DNA物理或化學分析方法均可用於本發明的方法，包括測量DNA片段長度的方法（例如色譜法或電泳法）。也可以將任何物理或化學方法用於進一步的DNA分析，如Sina等人（2018）所述的方法。類似地，可以採用任何DNA定序方法，包括次世代定序技術（靶向或全基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術(BEAMing)、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下進行共擴增PCR）的PCR、等溫擴增、雜合、MIDI活化焦磷酸解（MAP）或個人化重組分析（personalized analysis of rearranged ends，PARE）。

在一實施例中，在多種情況下重複本發明的方法。該實施例提供了在一段時間內監控檢測結果的優點。這樣的安排將提供監測或評估疾病狀態的治療功效的益處。本發明的此類監測方法可用於監測發作、進展、穩定、改善、復發和/或緩解。

因此，本發明還提供了一種監測疑似患有這種疾病的主體對於疾病狀態的治療功效的方法，包括檢測及/或定量存在於來自該主體的生物樣品中的生物標記。於監測方法中，可兩次或多次採集樣品。該方法可進一步包括將測試樣品中存在的生物標記的量與一或多對照組進行比較，及/或與較早（例如，在開始治療之前）從相同測試主體取得的一或多個先前的測試樣品進行比較，及/或與在較早治療階段從相同測試主體採集的一或多個先前的測試樣品進行比較。該方法可包括檢測在不同情況下採集的測試樣品中生物標記的性質或量的變化。

相對於較早取自相同測試主體的先前測試樣品中的含量，測試樣品中生物標記結果的改變可指示該療法對疾病或疑似疾病的有益效果（例如，穩定或改善）。此外，一旦治療完成，就可以週期性地重複本發明的方法，以監測疾病的復發。

監測治療功效的方法可用於監測現有療法及新療法在人類主體及非人類動物（例如在動物模型中）的療效。這些監測方法可以納入新藥物質及物質組合的篩選之中。

於另一實施例中，由速效療法而引起的更快速變化的監測可以以幾小時或幾天的較短間隔進行。

鑑定和/或定量可透過適合於鑑定患者的生物樣品或生物樣品的純化或萃取物或其稀釋液中特定蛋白質的存在和/或量的任何方法來進行。可用本發明的方法測試的生物樣品包括如上文所定義的那些。樣品舉例可在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式儲存。

本發明的方法可透過檢測本文所述標靶片段來進行，例如具有C端截短或N端截短的片段。片段長度較佳為大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。這樣的片段可為結合片段，即它們保留了完整蛋白質結合靶標的能力。特別注意的是，與組織蛋白末端胜肽相同或相關序列的胜肽是組織蛋白特別有用的片段。

可以直接檢測生物標記，例如透過SELDI或MALDI-TOF。或者，透過與一配體或多種配體，諸如抗體或其生物標記結合片段、或可特異性結合生物標記之其它胜肽、或配體（例如適體、親和體或寡核苷酸）的相互作用，可直接或間接檢測生物標記。配體或結合劑可以具有可檢測的標記，例如發光、螢光或放射性標記，和/或親和標記。

舉例而言，檢測和/或定量可透過一或多種方法進行，其係選自由：SELDI（-TOF）、MALDI（-TOF）、一維電泳分析（1-D gel-based analysis）、二維電泳分析（2-D gel-based analysis）、質譜（MS）、逆相（RP）LC、尺寸滲透（凝膠過濾）、離子交換、親和力、HPLC、UPLC和其他基於LC或LC MS的技術所組成的群組。適合的LC MS技術包括ICAT® （Applied Biosystems, CA, USA）或iTRAQ®（Applied Biosystems, CA, USA）。也可以使用液相層析（例如高壓液相層析（HPLC）或低壓液相層析（LPLC））、薄層層析、NMR（核磁共振）光譜。

根據本發明的診斷或監測方法可以包括分析樣品以檢測生物標記的存在或含量。這些方法也適用於臨床篩查、預後、監測治療結果、鑑定最有可能對特定治療方法有反應的患者、進行藥物篩選和開發以及鑑定藥物治療的新靶標。

可以使用免疫學方法進行鑑定和/或定量，所述免疫學方法涉及能夠特異性結合生物標記的抗體或其片段。合適的免疫學方法包括三明治免疫測定法，例如三明治型ELISA，其中使用兩種可識別一分析標記物上不同表位的抗體進行檢測；放射免疫測定（RIA）；直接、間接或競爭性酶聯免疫吸附測定（ELISA）；酶免疫測定（EIA）；螢光免疫測定（FIA）；西方墨點法；免疫沉澱法以及任何基於顆粒的免疫測定（例如使用金、銀或乳膠顆粒、磁珠或Q點）。舉例而言，可用微量滴定板或條帶形式進行免疫學方法。

涉及鑑定及/或定量的方法可以在實驗臺儀器上進行，或可以結合到可在非實驗室環境（例如，在醫師的辦公室或主體床邊）中使用的一次性、診斷或監測平台上。用於進行本發明方法的適合的生物感測器包含具有光學或聲學讀取器的「信用」卡。生物感測器可被設計為將收集到的數據以電子方式傳輸給醫師以進行解讀，並因此可以形成電子醫學的基礎。如本文所用，術語「生物感測器」是指能夠檢測靶標存在的任何事物。

本文描述了用於診斷和監測現存疾病狀態的診斷試劑盒。在一實施例中，試劑盒更包含能夠鑑定和/或定量生物標記的生物感測器。適當地，根據本發明的試劑盒可包含選自以下群組中一或多種組成物：特異性針對生物標記或生物標記的結構/形狀模擬物的配體結合劑或配體、一或多種對照組、一或多種試劑以及一或多種消耗品；選擇性地還有根據本文定義的任何方法使用試劑盒的說明。

針對疾病狀態的生物標記鑑定允許診斷程序和治療方案的整合。例如，生物標記的檢測可用於在受試者參與臨床試驗之前對其進行篩選。生物標記提供了用於指示治療反應、沒有反應、不良反應、藥物依從度和達到足夠血清藥物量的手段。生物標記可用於提供藥物不良反應的警告。生物標記可用於個人化療法的開發，因為對反應的評估可用於微調劑量、減少處方藥的數量、降低獲得有效治療的延誤且避免藥物不良反應。因此，通過監測生物標記，可以精確地調整患者照護以匹配疾病和患者的藥物基因組學特徵所確定的需求，從而可以使用生物標記以滴定最佳劑量、預測陽性治療反應並鑑定對於嚴重副作用有高風險的那些患者。

基於生物標記的檢測可對「新」患者進行第一線評估，並提供準確及快速診斷的客觀手段，而這是使用當前手段無法實現的。

此外，診斷性生物標記檢測可用於鑑別具有輕度或無症狀疾病或有可能發展症狀性疾病高度風險的家族成員或患者。這使得可以開始適當的治療或預防措施，例如管理風險因素。這些方法被認為可以改善療效，並可以預防疾病的明顯發作。

生物標記監測方法、生物感測器和試劑盒作為患者監測工具也是至關重要的，以使醫生能夠確定復發是否是由於疾病的惡化所致。如果藥理學治療被評估為不適當，則可以恢復治療方法或增加治療方法；如果適當的話，可以改變治療方法。由於生物標記對疾病狀態是敏感的，因此其可提供藥物治療效果的指標。

本發明現在將參考以下的非限制性實施例進行說明。

實例

實例1

我們購買了兩種H1蛋白產品。首先是購自Sigma-Aldrich的重組H1蛋白（產品編號：H1917-100UG）。第二種是購自Merck-Millipore的分離自小牛胸腺的生物性H1製劑（產品編號：382150）。我們將這些H1蛋白以及重組H2A、H2B、H3和H4組蛋白（分別購自BPS Bioscience，產品編號：52021、52022、52023和52024）以濃度5 µg/ml（在100 µl磷酸鹽緩衝液（PBS，產品編號：70011-038）中）塗覆在塑膠微量滴定孔上，在2-8°C培養過夜。這些孔被封閉（wellChampion，Kem-En-Tec，產品編號：4900A）以及添加10µl含有（i）從HeLa細胞純化的人類天然多核小體的溶液（Epicypher，產品編號：16-0003），該溶液由含有連接DNA的單核小體和多核小體的混合物所組成，或（ii）包含147bp 的DNA的H3.3單核小體，因此不具有連接DNA（Epicypher，產品號：16-0012）。在隔夜培養後洗滌孔，並透過添加標記的抗-核小體抗體檢測任何結合的核小體。使用有色底物反應測量結合的標記抗體，並將所得的光密度（OD）用作結合核小體的量度。

結果示於圖2中，並證明含有連接DNA的單核小體和多核小體與H1蛋白（重組H1和組織衍生的H1蛋白兩者）結合，但是不含連接DNA的單核小體不與H1蛋白結合。此外，核小體與組蛋白H1的結合是特異性的，而對於組蛋白H2A、H2B、H3或H4蛋白則未觀察到結合。這些結果表明，H1蛋白（而不是其他組蛋白）可用於製備與含有連接DNA的核小體結合的免疫吸附劑。結果還證實，H1蛋白或任何與核小體結合的蛋白質都可以在通常用於核小體或某些被該蛋白質選擇性結合的核小體的免疫測定中用作為結合劑。

實例2

我們在存在和不存在重組生物素化組蛋白H1的情況下，將鏈黴親和素塗覆的磁珠與含有167bp的DNA的重組單核小體一起培養，該DNA包括Widom 601 DNA序列。然後用磁鐵分離珠子，洗滌並用蛋白酶K處理以釋放任何結合的核小體DNA。使用Widom 601序列特異性引子，透過定量聚合酶鏈反應（qPCR）方法萃取、洗滌和測量釋放的DNA。存在H1時觀察到的Ct值（訊號越過高於背景的閾值所需的周期數的循環閾值）小於沒有H1時觀察到的Ct值的一半。這表示在存在H1的情況下，含有167bp DNA片段的重組核小體與鏈黴親和素珠的結合比在不存在H1的情況下高400倍以上，因此含有167bp DNA的核小體被H1結合在磁珠上。

本實驗的結果表明，H1蛋白塗覆的珠子可用於結合和分離含有167bp的DNA（即包含連接DNA）的核小體，並且可以用於製備用於本發明方法的免疫吸附劑以結合至含有特定結構、特性或生物學來源的核小體，以及/或富集或消耗樣品中的這類核小體。

該實驗的結果表明，固定的組蛋白H1蛋白結合了含有167bp DNA片段的重組核小體。實例1中所述的實驗結果表明，固定的組蛋白H1蛋白不結合含有147bp DNA片段的重組核小體。因此，綜上所述，實施例1和2證明組蛋白H1蛋白可用於選擇性地結合含有連接DNA的核小體，因此可用作富集和/或分離含有或不含連接DNA的核小體的工具。

實例3

在與實例2所述的類似實驗中，使用取自被診斷患有癌症的患者的血漿樣品，將鏈黴親和素塗覆的磁珠與重組生物素化的組蛋白H1和血漿樣品一起培養。然後用磁鐵分離珠子，洗滌並用蛋白酶K處理以釋放任何結合的核小體DNA。分離釋放的DNA，在洗滌後，洗脫並使用Bioanalyzer進行分析，以測量分離的DNA的片段大小分佈。觀察到的分離的DNA的大小分佈由2個條帶組成。如圖1所示，觀察到的主條帶的長度約為150-230bp，對應於非腫瘤峰的峰約為170bp。在約300-450bp處觀察到更小的條帶，其對應於二核小體和三核小體的預期大小範圍。

在血漿癌症樣品中，H1結合核小體的片段大小分佈圖完全缺失了圖1所示大約120-150bp DNA的腫瘤條帶。這表示含有長度小於150bp的DNA片段的核小體未與組蛋白H1連接的磁珠結合。

結果表明，本發明的方法可用於從血漿樣品中結合和除去含有連接DNA的單核小體和多核小體，而不含連接DNA的核小體保留在溶液中。因此，將液相分離、純化並富集了腫瘤衍生的血漿核小體。

實例4

組蛋白H1塗覆的磁珠試劑與取自癌症患者的血漿樣品一起培養。使用磁鐵以分離磁珠試劑，並使用本領域已知的方法萃取結合至磁珠的DNA和存在於液相中的未結合的DNA。

研究任何與癌症相關的基因突變的存在，並在未處理的樣品中以及在磁珠結合和未結合的DNA片段中確定突變等位基因比例。未結合片段的MAF高於未處理樣品或結合片段的MAF。

實例5

組蛋白H1塗覆的磁珠試劑與取自癌症患者的血漿樣品一起培養。使用磁鐵分離磁性試劑，並使用本領域已知的方法萃取液相中存在的DNA。對萃取的DNA進行定序。

研究任何與癌症相關的基因突變的存在，並確定突變等位基因比例。此外，使用「片段組學」方法研究了DNA序列，以鑑定血漿樣品中DNA片段的來源組織。樣品的MAF和/或突變譜和/或「片段組學」譜用於指示患者中癌症的存在。該資訊可用於為患者選擇適當的治療。

亦使用合適的方法（例如亞硫酸鹽定序）分析萃取的DNA的甲基化DNA。樣品的甲基化DNA結果用於指示患者中癌症的存在、進展或複發。

實例6

使用本領域已知的方法（例如Wiesler和Weinzierl（2010）的方法），開發了遺傳工程蛋白以與包含連接DNA的核小體牢固地結合。該蛋白質可基於任何蛋白質或任何蛋白質結構域。在本實施例中，利用全身胺基酸變化對H1蛋白進行突變分析，並檢測衍生的H1突變體與含有連接DNA的核小體的結合。選擇具有最強結合力的那些突變體作為候選物，以用於免疫吸附劑與含有連接DNA的核小體結合。然後，檢測候選突變蛋白與不具有連接DNA的核小體的結合，並選擇無結合或弱結合的候選蛋白。開發的工程蛋白可能與含有連接DNA的核小體更牢固地結合，而與不含連接DNA的核小體更不牢固地結合。可以大量生產這種工程化的蛋白質或胜肽，並且可以用作本發明方法中的結合劑。

實例7

根據製造商的說明書（Thermo Fisher Scientific），我們在Dynabeads M280磁珠上塗覆了甲基結合域2（MBD2）蛋白。將珠子暴露於5 µg/ml的含有未甲基化連接DNA的重組多核小體（Active Motif，產品編號：31466）；從HeLa細胞中純化的人類天然核小體，經微球菌核酸酶分解後，主要由單核小體組成，其中一些含有甲基化DNA（Diagenode，產品編號：C01030102）；以及，具有187bp DNA的半甲基化重組單核小體（均包含甲基化連接DNA）（EpiCypher，產品編號：SKU：16-2103）。磁珠經磁性地分離、洗滌並且用化學發光標記的抗-核小體抗體測量結合的核小體。結果如圖3所示，並且證明MBD蛋白與含有連接DNA的多核小體結合。此外，對於含有高含量甲基化DNA的單核小體，核小體結合更強。

實例8

我們開發了一種ELISA測定法，該方法利用塗覆在微量滴定盤表面的MBD蛋白作為無細胞核小體的捕獲蛋白，並使用該測定法來測量含有連接DNA的核小體的含量。簡而言之，透過在2-8°C下過夜培養，將MBD蛋白以5 µg/ml的濃度（在100 µl磷酸鹽緩衝液（PBS，產品編號：70011-038）中）塗覆在塑膠微量滴定孔上。組蛋白H4也以類似的方式塗覆在孔上，用作為對照組。這些孔被封閉（wellChampion，Kem-En-Tec，產品編號：4900A），並且添加10 µl 的含有1 µg/ ml的從HeLa細胞（Epicypher，產品編號：16-0003）中純化的人類天然多核小體的連續稀釋溶液，或10 µl 的含有1µg/ ml的含有147bp的H3.3單核小體（Epicypher，產品號：16-0012）的連續稀釋溶液。在隔夜培養後洗滌孔，並透過添加標記的抗-核小體抗體檢測任何結合的核小體。結果如圖4所示，並證明MBD與含有連接DNA的核小體（HeLa多核小體）結合，但不與不含連接DNA的核小體（H3.3單核小體）結合。

我們還使用該測定法測試了28件人類血漿樣品，結果如圖5所示，包括基於從HeLa細胞純化的人類天然核小體稀釋液得到的標準曲線（BPS Biosciences，產品編號：52039）。結果表明，MBD可用作臨床樣品的ELISA類測定的結合劑。

實例9

根據製造商的說明書，將染色質域解旋酶DNA結合蛋白（CHD）、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶蛋白（DNMT）、高遷移率族或高遷移率族蛋白（HMG或HMGB）、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白（PARP）或p53塗覆在Dynabeads M280磁珠上。珠子暴露於各種核小體，其包括：含有147bp、167bp或187bp的DNA的重組單核小體、重組多核小體（Active Motif，目錄號31466），從HeLa細胞純化的人類天然核小體以及半甲基化重組單核小體（EpiCypher，目錄號 SKU：16-2103）。磁珠經磁性分離、洗滌並使用化學發光標記的抗-核小體抗體測量結合的核小體。結果可用於證明塗有不同染色質結合蛋白的珠子可用於結合和分離核小體，並可用於製備本發明方法之免疫吸附劑以結合至包含特定結構、特性或生物學來源的核小體，以及/或富集或消耗樣品中的這類核小體。可以萃取和分析與核小體（特別是未結合磁珠的核小體）相關的DNA。

實例10

如上述實例9所述，將染色質域解旋酶DNA結合蛋白（CHD）、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶蛋白（DNMT）、高遷移率族或高遷移率族蛋白（HMG或HMGB）、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白（PARP）或p53塗覆在微量滴定孔中。封閉每個孔並添加樣品。在培養後丟棄樣品，洗滌孔並使用標記的抗-核小體抗體測量結合的核小體。結果可用於證明塗有CHD、DNMT、HMG、HMGB或PARP的孔可用於免疫測定，以測量樣品中核小體的含量，該核小體含有某些特定結構，該特定結構與孔表面固定的特定蛋白質有關。

在另一實驗中，所使用的標記抗體不是一般的抗-核小體抗體，而是結合核小體的特定表觀遺傳學特徵，例如組蛋白同功異形體、組蛋白修飾或加合到核小體上的蛋白質。

實例11

使用文庫噬菌體呈現技術開發抗體，該抗體使用陽性選擇的株與含有167bp DNA單核小體結合。將文庫中被鑑定為與含167bp DNA的單核小體結合的陽性的噬菌體結合劑株，以各種塗覆濃度固定在固體支撐物上，並暴露於含147bp、167bp或187bp DNA片段的單核小體。使用標記的抗-核小體抗體檢測核小體與結合劑株的結合。選擇的株係對含有167bp和/或187bp DNA的單核小體（即具有連接DNA的核小體）具有高親和力，但對含有147bp DNA的單核小體的結合具有低親和力，並且用於開發免疫吸附劑以進行含有連接DNA的核小體的陽性結合選擇。

實例12

使用文庫噬菌體呈現技術開發抗體，該抗體使用陽性選擇的株與含有147bp DNA的單核小體結合。將文庫中被鑑定為與含147bp DNA的單核小體結合的陽性的噬菌體結合劑株，以各種塗覆濃度固定在固體支撐物上，並暴露於含147bp、167bp或187bp DNA片段的單核小體。使用標記的抗-核小體抗體檢測核小體與結合劑株的結合。選擇的株係對含有147bp DNA的單核小體（即不具有連接DNA的核小體）具有高親和力，但對含有167bp 或187bp DNA的單核小體的結合具有低親和力，並且用於開發免疫吸附劑以進行不具有連接DNA的核小體的陽性結合選擇。

實例13

我們使用AxioMx Inc.文庫噬菌體呈現技術開發了一種抗體，該抗體使用陽性選擇的株與含有147bp DNA的單核小體結合。

將產生的三種抗體進行生物素化處理，並測量與含有147bp、167bp或187bp DNA的重組核小體的結合。簡而言之，透過用核小體溶液（1μg/ml）塗覆，將重組核小體固定在微量滴定孔上。使用商業封閉劑來封閉孔。加入生物素化抗體溶液（1 μg/ml），並在室溫下輕輕搖動培養2小時。然後倒出抗體溶液，並用洗滌緩衝液洗滌孔3次。加入含有鏈黴親和素-辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）綴合物的溶液，並在室溫下培養15分鐘。再次洗滌孔，並使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物以測量結合的HRP，並測量在450 nm處產生的光密度（OD）。結果如下表1所示。

表1. 三種抗體與不具有連接DNA、具有約20bp的連接DNA或具有約40bp的連接DNA的核小體的結合

與塗覆的核小體相關的DNA的長度（bp）	OD 抗體1	OD抗體2	OD抗體3
147bp （不具有連接 DNA）	0.34	0.93	0.63
167bp （~20bp 連接DNA）	0.27	0.81	0.55
187bp （~40bp 連接DNA）	0.20	0.52	0.40
對照組（無塗覆的核小體）	0.04	0.04	0.04

結果顯示，對於三種抗體，不含連接DNA的核小體具有更強的結合力。含有增長的連接DNA的核小體的結合較弱，並且抗體可用於陽性選擇和富集不含連接DNA的核小體。

將鑑定為對單核小體結合呈陽性的噬菌體結合劑株以各種塗覆濃度固定在固體支撐物上，並暴露於含有147bp、167bp或187bp DNA片段的單核小體。此實驗與上面描述的類似，其中核小體被固定並暴露於液相抗體，但是相反的是，抗體被固定並被暴露於液相核小體。使用標記的抗-核小體抗體檢測核小體與結合劑株的結合。一個株的結果如圖6所示，其表明該株對含有167bp或187bp DNA的單核小體具有高（幾乎相等）的親和力，但對含有147bp DNA的核小體（即不具有連接DNA的核小體）則具有低得多的親和力。本領域技術人員將清楚的是，對於含有連接DNA的核小體比不具有連接DNA的核小體具有更高親和力的結合劑，可用於結合包含連接DNA的核小體（幾乎排他地），特別是如果那些核小體存在樣品中的濃度也比沒有連接DNA的核小體高很多。

結果表明，可以開發抗體以選擇性地結合具有或不具有連接DNA的核小體上的表位。這類工程改造的抗體或抗體片段可用於開發免疫吸附劑，以用於本發明的方法，從而結合具有不同結構、特性或生物學來源的核小體和/或富集或消耗樣品中具有某種結構、特性或生物來源的核小體。例如，可將被工程改造為優先結合至不具連接DNA的核小體的抗體用於陽性選擇方法中，以富集包含不具有連接DNA的核小體的樣品（透過與那些含有連接DNA的核小體結合）。類似地，可將被工程改造為優先結合至具有連接DNA的核小體的抗體用於陰性選擇方法中，以富集包含不具有連接DNA的核小體的樣品（透過結合及去除含有連接DNA的核小體）

此類抗體的標靶表位可為多種類型。例如，標靶表位可存在於僅在含有連接DNA的核小體中的結構中，或存在於僅在不含連接DNA的核小體中的結構中。例如，這樣的結構可為另外的結構（特別是在含有連接DNA的核小體中），或者可以透過不存在或去除否則存在的結構而被掩蓋（特別是在不含連接DNA的核小體中）。標靶表位本質上也可為構象的，使得連接DNA的存在或不存在與可替代的核小體構象相關，其可以被為此目的開發的抗體以更高或更低的親和力結合。也可能是其他標靶表位。

實例14

使用鏈黴親和素覆蓋的磁珠試劑和與組蛋白同功異形體macroH2A結合的生物素化抗體進行類似於實例3的實驗。磁珠和生物素化抗體與取自癌症患者的血漿樣品一起培養。使用磁鐵分離磁珠試劑，並使用本領域已知的方法萃取結合至磁珠的DNA和存在於液相中的未結合的DNA。

研究任何與癌症相關的基因突變的存在，並在磁珠結合和未結合的DNA片段中確定突變等位基因比例。未結合片段的MAF高於結合片段的MAF。

實例15

根據製造商的說明書，將結合至染色質結合蛋白的抗體，例如甲基結合域（MBD）、染色質域解旋酶DNA結合蛋白（CHD）、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶蛋白（DNMT）、高遷移率族或高遷移率族蛋白（HMG或HMGB）、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白（PARP）或p53，塗覆在Dynabeads M280磁珠上。珠子暴露於各種核小體，包括含有147bp、167bp或187bp DNA的重組單核小體、重組多核小體、用微球菌核酸酶分解的從HeLa細胞中純化的人類天然核小體、和半甲基化的重組單核小體。磁珠被磁性分離、洗滌並使用化學發光標記的抗-核小體抗體測量結合的核小體。結果可用於證明，用針對染色質結合蛋白的不同抗體塗覆的珠子可用於結合和分離核小體，並可用於製備免疫吸附劑以用於本發明的方法從而結合至具有特定結構、特性或生物來源的核小體，和/或富集或消耗樣品中的此類核小體。

實例16

將結合至染色質結合蛋白的抗體，例如甲基結合域（MBD）、染色質域解旋酶DNA結合蛋白（CHD）、DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶蛋白（DNMT）、高遷移率族或高遷移率族蛋白（HMG或HMGB）、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白（PARP）或p53，塗覆在微量滴定孔中。封閉每個孔並添加樣品。在培養後丟棄樣品，洗滌孔，並使用化學發光標記的抗-核小體抗體測量結合的核小體。結果表明，塗有不同抗體的孔可用於免疫分析含染色質結合蛋白的核小體，例如MBD、CHD、DNMT、HMG、HMGB或PARP。

在另一實驗中，使用的第二抗體不是一般的抗-核小體抗體，而是直接結合核小體的特定表觀遺傳學特徵，例如組蛋白同工異形體、組蛋白修飾或加合在核小體上的蛋白質

實例17

根據製造商的說明書，將結合至組蛋白同功異形體H2AZ的抗體塗覆在Dynabeads M280磁珠上。洗滌磁珠並添加樣品。在培養後丟棄樣品，並且再次洗滌磁珠。現在結合至固相的核小體富含不包含連接DNA的核小體。分離的結合的核小體舉例可透過質譜或透過核小體相關DNA的定序來分析。

實例18

我們注意到，作為一般性觀察，一種設計用於測量總核小體含量的測定方法是使用一種結合在組蛋白H3的組蛋白尾部的胺基酸位置4-8表位上的第一抗體，以及一種結合在核小體中其他位置的第二抗體，該測定方法與使用相同第二抗體且針對含有組蛋白修飾H3K36Me3或H3K27Me3的核小體的測定方法相比，對患者樣品會產生較低的結果。由於修飾的核小體的子集的真實濃度不能超過總核小體的真實濃度，因此這是一個異常觀察。我們認為，這一發現可能是由於含有剪切的組蛋白的核小體的存在。據預測，這種剪切的核小體在胺基酸位置4-8處不包含表位（因為其被去除），但在位置27和36處包含離胺酸(lysines)。

我們將不含剪切的組蛋白的重組多核小體暴露於蛋白酶組織蛋白酶，該蛋白酶組織蛋白酶在胺基酸位置21處切割H3的組蛋白尾部。西方墨點法證實了這種分解的成功。然後，我們使用兩對不同的抗體分析了蛋白酶處理和未處理的重組多核小體。第一抗體對（對1）是如上所述之抗體，由一種結合在組蛋白H3的組蛋白尾部的胺基酸位置4-8表位上的抗體以及一種結合在核小體中其他位置的抗-核小體抗體所組成。第二抗體對（對2）是由一種結合在組蛋白H3的組蛋白尾部的胺基酸位置30-33表位上的抗體以及一種結合在核小體中其他位置的相同抗-核小體抗體所組成。

一如預期，兩個抗體對均對不含剪切的組蛋白的未經處理的重組多核小體產生了等效訊號。抗體對2對蛋白酶處理和未處理的多核小體產生了等效訊號。這也是可以預期的，因為剪切位點在抗體結合位點之下，因此所有核小體都含有對2中兩種抗體的結合位點。然而，與未處理的多核小體相比，抗體對1對蛋白酶處理產生更低的訊號。我們得出的結論是，因為剪切位點位於胺基酸位置4-8處的抗體結合位點上方，因此抗體的結合位點已從大部分核小體中去除。

我們還使用設計用於測量含有剪切的組蛋白的核小體的免疫測定法測量了蛋白酶處理的和未處理的多核小體。該測定法使用一種僅結合剪切的組蛋白H3的抗體，以及一種結合在核小體中其他位置的相同抗-核小體抗體。該測定對於未處理的多核小體產生了陰性結果，而對於蛋白酶處理的多核小體產生了陽性結果。

如圖7所示，這些結果表明，我們能夠選擇性地結合含有剪切的組蛋白的核小體，在固相支撐物上將其分離，並透過包括免疫測定或質譜在內的任何方法對其進行分析。本領域技術人員將清楚的是，亦可分析含有剪切的組蛋白的固定的核小體的任何適當的表觀遺傳學特徵。類似地，可以透過任何方法（包括任何DNA定序方法），來分析與分離的含有剪切的組蛋白的核小體相關的DNA。

實例19

我們透過在大腸桿菌中的表現產生組蛋白H1.0蛋白。我們使用了組蛋白H1的H1.0同功異形體，因為我們發現該同功異形體在本發明的方法中表現良好。組蛋白H1.0蛋白用於塗覆市售的磁珠，並添加到含有Hela細胞單核小體（藉由分解Hela 細胞染色質產生）的市售製劑、Hela細胞多核小體、含有組蛋白H3.1和147bp DNA的重組單核小體、以及含有組蛋白H3.1和167bp DNA的重組單核小體的溶液。珠子經磁性分離、洗滌並用化學發光標記的抗-組蛋白H3.1抗體測量結合的核小體。結果如圖8所示，其表明磁珠與含有連接DNA的多核小體和單核小體結合（Hela單核小體和含有167bp DNA的重組單核小體），但不與不含連接DNA的單核小體（含有147bp DNA的重組單核小體）結合。

實例20

將被小牛胸腺Histone H1蛋白塗覆的Tosylactivated M280磁珠暴露於含有Hela細胞單核小體（藉由分解Hela 細胞染色質產生）的市售製劑、Hela細胞多核小體、含有組蛋白H3.1和147bp DNA的重組單核小體、以及含有組蛋白H3.1和167bp DNA的重組單核小體的溶液，如上述實例19所述。珠子經磁性分離、洗滌且使用高莫耳濃度的緩衝液將結合的核小體從珠子上洗脫。透過使用酶標記的抗-組蛋白H3.1抗體開發的西方墨點法分析洗脫物。結果如圖9所示。暴露於Hela多核小體的磁珠洗脫物產生了較強的組蛋白H3.1條帶，含有連接DNA的單核小體（Hela單核小體和含有167bp DNA的重組單核小體）產生了較弱的組蛋白H3.1條帶，而暴露於含有組蛋白H3.1但不含連接DNA的單核小體（含有147bp DNA的重組單核小體）的磁珠洗脫物中卻未觀察到條帶。

實例21

通過染色質分解所製備的市售Hela細胞單核小體製劑可包括含有147bp DNA和167bp DNA片段的單核小體的混合物。我們購買了市售的Hela細胞單核小體製劑，並使用Agilent Bioanalyzer分析了相關DNA片段的大小。我們觀察到該製劑產生了一個峰，最大的DNA片段大小約為147bp，如圖10（a）所示。但是，該峰不是對稱的，而是包含對應於較長DNA片段的肩峰。

將塗有組蛋白H1.0蛋白的磁珠暴露於Hela細胞單核小體製劑中。磁珠被磁性分離並洗滌。然後，使用Qiagen DNA萃取試劑盒萃取在珠子上分離的組蛋白H1.0結合的核小體相關的DNA片段，以及溶液中剩餘的未結合的核小體相關的DNA片段，以分離游離循環DNA片段。使用Agilent Bioanalyzer分析結合和未結合的DNA片段的鹼基對長度。結果如圖10（b）所示，其表明未結合的片段包含大部分的核小體，分析給出了對應於大約147bp DNA大小的Bioanalyzer峰。然而，未觀察到對應於未處理製劑的較長DNA片段的肩峰。對於組蛋白H1.0-珠結合的片段的分析產生了較小的DNA峰，最大值對應於較長的DNA片段大小。

實例22

使用Agilent Bioanalyzer分析透過或不透過本發明的方法事先分離的，透過染色質分解所製備的市售Hela細胞單核小體，包括含有147bp DNA和167bp DNA片段的單核小體的相關DNA片段的大小。

使用磁珠與單核小體的最佳比例，將塗有組蛋白H1.0蛋白的MyOne Tosylactivated磁珠的新鮮製劑暴露於Hela細胞單核小體製劑。磁珠被磁性分離並洗滌。然後，使用用於分離循環DNA片段的QIAamp®循環核酸試劑盒，從未處理的Hela核小體製劑以及在珠子上分離的組蛋白H1.0結合的核小體片段，以及從處理後的上清液溶液中剩餘的未結合片段中萃取DNA。使用Agilent Bioanalyzer分析未處理的、與珠子結合的和未結合的上清液DNA片段的鹼基對長度。Bioanalyzer的結果如圖11所示，表明用H1塗覆的磁珠處理樣品後，殘留在上清液中的未結合的DNA片段產生了一個Bioanalyzer峰，該峰對應於大約147bp的DNA大小，該峰明顯與對應於較長的DNA片段（包含與H1結合的核小體相關的連接DNA）（約167bp）的峰分離。從未經處理的Hela核小體製劑中萃取的DNA在結合和未結合片段之間的中間大小處有一個峰。

實例23

使用Agilent Bioanalyzer在有或沒有透過本發明方法事先分離的情況下，分析從3名患有大腸癌的患者和2名健康志願者獲得的血漿樣品中相關的DNA片段的大小。隨後，對另外6例大腸直腸癌患者的血漿樣本進行了類似分析。

將塗覆有組蛋白H1.0蛋白（購自Sigma）的MyOne Tosylactivated磁珠暴露於血漿樣品中。磁珠被磁分離並洗滌。然後，使用用於分離循環DNA片段的QIAamp®循環核酸試劑盒，從未處理的的血漿樣品以及珠子上分離的與組蛋白H1.0結合的核小體血漿片段，以及從處理後的上清液溶液中剩餘的未結合染色質血漿片段中萃取DNA。使用Agilent Bioanalyzer分析未處理的、與珠子結合的和未結合的上清液DNA片段的鹼基對長度。前三個癌症樣品的Bioanalyzer結果如圖12所示，後六個癌症樣品的結果如圖13所示。健康受試者的結果如圖14所示。三個癌症患者的結果定性地相似於實例22中對Hela核小體觀察到的結果，表明用H1塗覆的磁珠處理樣品後，殘留在上清液中的未結合的DNA片段產生了對應於DNA大小約為147bp的Bioanalyzer峰，該峰明顯與對應於較長的DNA片段（包括與H1結合的核小體相關的連接DNA）（約167bp）的峰分離。Bioanalyzer的結果是對片段大小分佈的分析，並不能準確定量。但是，很明顯的是，癌症樣品的峰高從低於50FU到大約2000FU不等。儘管如此，無論存在的cfDNA含量為何，在所有情況下都發生了片段大小分佈圖中的峰分離，這表明該峰分佈是癌症核小體的特徵，而不論其數量如何。與癌症患者的結果相反，二位健康受試者的結果表明，兩個受試者的cfDNA含量均較低，並且三個峰之間的差異較小。顯然，在癌症患者和健康受試者中，H1結合峰、未結合峰和未處理峰的高度和相對位置在定性和定量上是不同的，並且可以單獨或組合用作為檢測或診斷疾病的方法。特別地，可將上清液中經含有連接DNA的核小體的結合劑處理後的大量的長度約147bp 的DNA片段（與不含連接DNA的核小體相關，因此不與H1結合）的存在用作為檢測或診斷疾病的方法。

實例24

藉由類似於實例23所述之有及沒有預先分離之方法（但使用從HMGBiotech購買的塗有HMGB1蛋白製劑的MyOne Tosylactivated磁珠），透過Agilent Bioanalyzer分析從2名患有肺癌的患者和1名患有大腸直腸癌的患者的血漿樣品中相關DNA片段的大小。癌症樣品的Bioanalyzer結果如圖15所示。三位癌症患者的結果在定性上與實施例22中Hela核小體觀察到的結果相似，並且表明用HMGB1塗覆的磁珠處理樣品後，殘留在上清液中的未結合的DNA片段產生了一個Bioanalyzer峰，該峰對應於大約147bp的DNA大小，該峰明顯與對應於較長的DNA片段（包含與HMGB1結合的核小體相關的連接DNA）（約167bp）的峰分離。

實例25

如所描述的，使用組蛋白H1塗覆的磁珠富集從患有大腸癌的患者中獲取的血漿樣品中的含有短DNA片段的核小體。從未經處理的血漿樣品中分離DNA，並從珠粒結合的DNA上清液中分離出DNA，並準備單鏈文庫以用於次世代定序。將文庫分開，一半在進行定序前先進行外顯子組捕獲（全外顯子定序-WES），其餘直接進行定序（全基因定序-WGS）。在來自Illumina的Nova-seq進行定序，獲得約300倍的WEC覆蓋率和30倍的WGS覆蓋率。使用市售的試劑盒（Swift 1S Accel和Claret Bio SRSLY）成功生成了文庫。在文庫產生之前和之後，在上清液片段中發現的DNA片段大小分佈小於與珠子結合的和未處理的片段的DNA片段大小分佈。除了具有較小的DNA片段外，上清液片段的已知癌症突變的頻率也有所增加。例如，BRAF基因的突變等位基因比例在結合珠的DNA片段中為42%，在上清液片段中為58%。未處理血漿的突變等位基因比例為50%。

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無

圖1. 與腫瘤來源和非腫瘤來源的循環核小體或染色質片段相關的循環DNA片段（bp）大小分佈圖。大部分腫瘤衍生的DNA片段的長度小於150bp，並且大多數非腫瘤衍生的DNA片段的長度大於150bp。圖2. 使用H1蛋白結合核小體的結果。 H1蛋白（重組H1以及小牛胸腺衍生的H1蛋白兩者）與含有連接DNA的多核小體結合，但不與不含連接DNA的單核小體（含有147bp DNA的重組單核小體）結合。沒有觀察到H2A、H2B、H3或H4組蛋白的核小體結合。圖3. 使用MBD2蛋白結合核小體的結果。塗覆在磁珠上的MBD2蛋白與多核小體和含有高含量甲基化DNA的核小體結合。圖4. 使用MECP2蛋白結合核小體的結果。MECP2（一種MBD蛋白）與包含連接DNA的核小體（HeLa poly）結合，但不與不包含連接DNA的核小體結合（包含147bp DNA的單核小體）。圖5. 使用MBD蛋白結合臨床樣品中核小體的ELISA分析結果。MBD在ELISA分析中作為結合劑測試了28種人類血漿樣品。結果顯示蛋白質可以用作為檢測臨床樣品中核小體的結合劑。圖6. 產生抗體以結合含有連接DNA的核小體。該抗體對含有167bp或187bp DNA的單核小體具有較高（幾乎相等）的親和力，但對含有147bp DNA的核小體具有低得多的親和力。圖7. 含有剪切的組蛋白的核小體的免疫測定結果。（A）針對組蛋白H3（抗體對1）尾部末端附近的表位的檢測方法對於含有完整組蛋白H3的核小體具有強訊號，但對於其中一些被組織蛋白酶分解而尾部已被去除（剪切）的核小體具有減弱的訊號。對於針對存在於含有完整或剪切的組蛋白H3（抗體對2）的核小體中的表位的測定法則沒有產生這樣的效果。（B）一種僅檢測含有剪切的組蛋白H3的核小體的測定對於含有完整組蛋白H3的核小體沒有產生訊號，而對於組織蛋白酶處理的核小體則產生了強訊號。圖8. 使用化學發光標記抗體分析的組蛋白H1.0蛋白的結果。由與組蛋白1.0結合的結合至不同核小體部分的化學發光標記的抗-組蛋白H3.1抗體產生相對光單位（RLU）的光訊號。結果表明，與磁珠相連的H1.0蛋白結合至Hela多核小體、和Hela單核小體以及含有167bp DNA的重組單核小體，但不結合至含有147bp DNA的重組單核小體（即不包含連接DNA）。圖9. 透過西方墨點法分析的使用組蛋白H1蛋白的結果。使用標記的抗-組蛋白H3.1抗體產生的蛋白條帶，用於結合與磁珠相連的組蛋白H1蛋白的蛋白。結果顯示了暴露於Hela多核小體、Hela單核小體和含有167bp DNA的重組單核小體的磁性組蛋白H1的條帶，但對於含有147bp DNA（即不含連接DNA）的重組單核小體沒有觀察到條帶。圖10. 使用組蛋白H1.0蛋白在市售Hela細胞單核小體製劑中分離具有或不具有連接DNA的單核小體的結果。（a）市售Hela細胞染色質單核小體製劑的DNA片段大小圖譜。（b）暴露於與磁珠連接的組蛋白H1.0後，同一單核小體製劑的磁性-H1.0結合和未結合的DNA片段的DNA片段大小分佈圖譜。圖11. 在市售Hela細胞單核小體製劑中，含有或不含連接DNA的單核小體的分離。使用組蛋白H1.0融合蛋白將塗有組蛋白H1.0蛋白的MyOne Tosylactivated磁珠暴露於Hela細胞單核小體製劑。Bioanalyzer的結果表明，用H1塗覆的磁珠處理樣品後，殘留在上清液中的未結合的DNA片段產生了對應於大約147bp DNA大小的Bioanalyzer峰，該峰明顯與對應於與H1相關的較長的DNA片段的峰分離。從未經處理的Hela核小體製劑中萃取的DNA在結合和未結合片段之間的中間大小處有一個峰。結果以螢光單位（FU）對時間（秒，s）表示。圖12. 使用H1塗覆的磁珠分離三名大腸癌患者血漿樣品中含有或不含連接DNA的單核小體。Bioanalyzer結果顯示，用H1塗覆的磁珠處理3個大腸癌血漿樣品後，未處理的DNA血漿樣品的鹼基對大小分佈圖以及結合到H1塗覆的磁性顆粒或保留在上清液中的DNA片段的分佈圖。結果表明，上清液中未結合的核小體產生了對應於大約147bp DNA大小的Bioanalyzer峰，該峰明顯與對應於與H1塗覆的磁珠結合的核小體相關的更長的DNA（約為167bp）的峰分離。圖13. 使用H1塗覆的磁珠分離三名大腸癌患者血漿樣品中含有或不含連接DNA的單核小體。Bioanalyzer結果顯示，用H1塗層磁珠處理3個大腸癌血漿樣品後，結合到H1塗覆的磁珠或保留在上清液中的DNA片段的鹼基對大小分佈圖。在所有6種情況下，結果均顯示上清液中未結合的核小體產生了一個Bioanalyzer峰，該峰對應於一個較短的約147bp的DNA大小，該峰明顯與對應於與H1塗覆的磁珠結合的核小體相關的更長的DNA（約為167bp）的峰分離。圖14. 使用H1塗覆的磁珠分離兩名健康志願者的血漿樣本中含有或不含連接DNA的單核小體。Bioanalyzer結果顯示，用H1塗覆的磁珠處理2個健康血漿樣品後，結合至H1塗覆的磁珠或殘留在上清液中的DNA片段的鹼基對大小分佈（放大以顯示目標DNA片段大小分佈）。結果表明，健康受試者中未處理的、結合的和未結合的核小體片段在其相關DNA片段大小方面的變化小於癌症患者。圖15. 使用HMGB1塗覆的磁珠分離來自三名癌症患者的血漿樣品中含有或不含連接DNA的單核小體。Bioanalyzer結果顯示，用HMGB1塗覆的磁珠處理2個肺癌血漿樣品和1個CRC血漿樣品後，結合到HMGB1塗覆的磁珠或保留在上清液中的DNA片段的鹼基對大小分佈圖。結果表明，上清液中未結合的核小體產生了一個對應於DNA大小約為147bp的Bioanalyzer峰，該峰明顯地與對應於與HMGB1塗覆的磁珠結合的核小體相關的較長DNA的峰分離（約為167bp）。

無

Claims

一種從一生物液體樣品中分離包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。
一種從一生物液體樣品中分離不包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑係結合至：（a）與核小體相關的連接DNA；（b）一染色質結合蛋白，其結合至連接DNA；或（c）一核心核小體特徵，其與連接DNA相關；以及（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中未與該結合劑結合之核小體。
如請求項1或請求項2所述之方法，其中結合至與核小體相關的連接DNA之該結合劑係選自組蛋白H1、macroH2A、或其片段或其工程類似物之一組蛋白。
如請求項1或請求項2所述之方法，其中結合至與核小體相關的連接DNA之該結合劑係一染色質結合蛋白或其片段或其工程類似物。
如請求項4所述之方法，其中結合至連接DNA之該染色質結合蛋白係選自：（a）一染色質域解旋酶DNA結合（CHD）蛋白；（b）一DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶（DNMT）蛋白；（c）一高遷移率族蛋白（HMGB）蛋白；（d）一聚[腺苷酸二磷酸-核糖]聚合酶（PARP）蛋白；或（e）一甲基-CpG-結合域（MBD）蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG結合蛋白2（MECP2）。
如請求項1或請求項2所述之方法，其中與結合至連接DNA之一染色質結合蛋白結合之該結合劑選自一抗體、一親和體或一適體。
如請求項6所述之方法，其中結合至連接DNA之該染色質結合蛋白係選自：（a）一染色質域解旋酶DNA結合（CHD）蛋白；（b）一DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶（DNMT）蛋白；（c）一高遷移率族蛋白（HMGB）蛋白；（d）一聚[腺苷酸二磷酸-核糖]聚合酶（PARP）蛋白；或（e）一甲基-CpG-結合域（MBD）蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG結合蛋白2（MECP2）。
如請求項1或請求項2所述之方法，其中與連接DNA相關之該核心核小體特徵係組蛋白變體macroH2A。
如請求項1至8中任一項所述之方法，其中更包括：（iii）透過免疫測定、質譜分析和/或DNA分析以分析步驟（ii）中分離的無細胞核小體。
如請求項9所述之方法，其中步驟（iii）包括分析該分離的無細胞核小體的表觀遺傳核小體特徵，其係選自：組蛋白類型（例如，H2A、H2B、H3、H4組蛋白）、轉譯後修飾、組蛋白同功異形體，特定核苷酸或修飾的核苷酸（例如甲基化、羥基甲基化或其他核苷酸修飾）、加合至核小體的蛋白質或其組合。
如請求項9所述之方法，其中該DNA分析包括DNA定序，其包括次世代定序技術（靶向或全基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術(BEAMing)、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下的共擴增-PCR）的PCR、等溫擴增、MIDI-活化焦磷酸解解（MAP）或個人化重組分析（PARE）。
如請求項1至11中任一項所述之方法，其更包括使在步驟（i）中結合的樣品與結合至核小體或其成分的一第二結合劑接觸。
如請求項1至12中任一項所述之方法，其中，該生物液體樣品係選自一血液、血清或血漿樣品。
如請求項1至13中任一項所述之方法，其中使該樣品與一種以上類型的結合劑接觸，該結合劑結合至包括連接DNA的核小體。
一種從一生物液體樣品中分離不包括連接DNA之循環無細胞核小體之方法，其中該方法包括步驟：（i）使該樣品與一結合劑接觸，該結合劑結合至被剪切的組蛋白分子，其缺少全部或部分組蛋白尾部；（ii）從該樣品中分離在步驟（i）中與該結合劑結合之核小體。
如請求項15所述之方法，其中更包括：（iii）透過免疫測定、質譜分析和/或DNA分析以分析步驟（ii）中分離的無細胞核小體。
如請求項16所述之方法，其中步驟（iii）包括分析該分離的無細胞核小體的表觀遺傳核小體特徵，其係選自：組蛋白類型（例如，H2A、H2B、H3、H4組蛋白）、轉譯後修飾、組蛋白同功異形體，特定核苷酸或修飾的核苷酸（例如甲基化、羥基甲基化或其他核苷酸修飾）、加合至核小體的蛋白質或其組合。
如請求項16所述之方法，其中該DNA分析包括DNA定序，其包括次世代定序技術（靶向或全基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術(BEAMing)、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下的共擴增-PCR）的PCR、等溫擴增、MIDI-活化焦磷酸解解（MAP）或個人化重組分析（PARE）。
一種從一生物液體樣品中分離純化的循環腫瘤DNA（ctDNA）之方法，其中該方法包括步驟：（i）執行請求項2至18中任一項所述之方法；以及（ii）從分離的核小體中萃取DNA。
一種診斷癌症之方法，包括：（i）執行請求項2至18中任一項所述之方法，以從獲自患者的一生物樣品中分離循環腫瘤核小體；以及（ii）分析分離的循環腫瘤核小體和/或相關DNA。
如請求項20所述之方法，其中步驟（ii）包括分析該分離的循環腫瘤核小體的表觀遺傳核小體特徵，其係選自：組蛋白類型（例如，H2A、H2B、H3、H4組蛋白）、組蛋白轉譯後修飾、組蛋白同功異形體，特定核苷酸或修飾的核苷酸（例如甲基化、羥基甲基化或其他核苷酸修飾）、加合至核小體的蛋白質或其組合。
如請求項20所述之方法，其中使用DNA定序來分析該相關的DNA，例如定序方法係選自次世代定序技術（靶向或全基因組）和甲基化DNA定序分析、珠乳擴磁技術(BEAMing)、包括數位PCR和冷PCR（在較低變性溫度下的共擴增-PCR）的PCR、等溫擴增、雜合、MIDI-活化焦磷酸解解（MAP）或個人化重組分析（PARE）。
一種獲得優先結合至疾病來源的無細胞核小體的抗體或其他結合劑之方法，其中該方法包括步驟：（i）使用一含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體作為一抗原，產生針對其之一抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的該抗體或其他結合劑呈現給一含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體；以及（iii）選擇結合至步驟（i）的該核小體但不結合至步驟（ii）的該核小體之抗體或其他結合劑。
一種獲得優先結合至非疾病來源的無細胞核小體的抗體或其他結合劑之方法，其中該方法包括步驟：（i）使用一含有約165個鹼基對或更多的DNA的核小體作為一抗原，產生針對其之一抗體或其他結合劑；（ii）將步驟（i）中獲得的該抗體或其他結合劑呈現給一含有約150個鹼基對或更少的DNA的核小體；以及（iii）選擇結合至步驟（i）的該核小體但不結合至步驟（ii）的該核小體之抗體或其他結合劑。
如請求項23或請求項24所述之方法，其中，該方法包括噬菌體呈現文庫抗體的選擇技術。