TW202045522A - 免疫分析方法 - Google Patents

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米凱拉 希金斯
喬治 西格爾
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Abstract

本發明係關於分析方法及用於此類分析之化合物及套組。

Description

免疫分析方法
本發明係關於進行免疫分析之方法。方法經設計以放大免疫分析信號及錨定其中採用之免疫分析複合物。
關於採用結合反應，例如抗原-抗體反應、核酸雜交及受體-配位體反應進行樣品中所關注分析物之靈敏量測的技術，已開發了大量的文獻。許多生物化學結合系統中高程度的特異性已在包含基礎研究、人類及獸醫診斷學、環境監測及工業測試之多種市場中產生了許多有價值的分析方法及系統。所關注分析物之存在可藉由直接量測分析物在結合反應中之參與來量測。在一些方法中，此參與可經由量測連接至結合材料中之一或多者之可觀測標記來指示。
儘管夾心免疫分析形式在許多應用中提供極佳靈敏度及特異性，但一些分析物以對於藉由習知免疫分析技術偵測而言過低之濃度存在。夾心免疫分析之效能亦可受偵測抗體之非特異性結合及包括高解離速率抗體之夾心複合物的不穩定性限制。然而，改良習知免疫分析技術以提高靈敏度及特異性之努力通常產生更複雜、勞力密集的方案，其可受可極大影響分析之靈敏度及特異性的各步驟之低效率阻礙。舉例而言，在需要多個結合事件及/或反應之複雜分析中，若任一事件或反應不太理想，則總體分析之靈敏度及特異性可受損。
本發明涵蓋以下特定實施例。本領域中熟習此項技術者可在不脫離本發明之精神及範疇的情況下對本文所述之實施例作出各種修改、添加及改變。此類修改、添加及改變意欲屬於申請專利範圍之範疇內。
實施例（1）：一 種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其 包括：將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及錨定試劑之表面上的捕捉試劑；及（ii）連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之複合物；延伸探針以形成包括結合錨定試劑之錨定區的延伸序列；將延伸序列結合至錨定試劑；及量測結合至表面之延伸序列的量。
在實施例（1）中，捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實施例中，捕捉試劑為抗體。偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實施例中，偵測試劑為抗體。在實施例（1）之一個特定實例中，捕捉及偵測試劑為針對分析物之抗體。錨定試劑可包含寡核苷酸序列、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基；且視情況，錨定區可包含適體且錨定試劑可包含適體配位體。錨定區可包括核酸序列且錨定試劑可包含DNA結合蛋白。錨定區可包含寡核苷酸序列且錨定試劑可包含互補寡核苷酸序列。錨定區可包含單股寡核苷酸序列或雙股寡核苷酸序列。
實施例（1）之結合步驟可進一步包含在錨定區與錨定試劑之間形成三螺旋。方法亦可進一步包括在結合步驟之前使錨定區變性以暴露單股序列；在結合步驟之前使錨定區暴露於解螺旋酶活性；及/或在結合步驟之前使錨定區暴露於核酸酶處理。在此實施例中，錨定區可包括一或多個經半抗原修飾之鹼基且錨定試劑可包含一或多個對半抗原具有特異性之抗體；及/或錨定區可包含一或多個經配位體修飾之鹼基且錨定試劑可包含一或多個對配位體具有特異性之受體。延伸序列可進一步包括一或多個偵測序列且量測步驟可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸；延伸序列可包含一或多個經修飾之鹼基且量測步驟可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸；及/或延伸序列可包括一或多個經標記鹼基且量測步驟可進一步包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。在此實施例中，一或多個經修飾之鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（1）之第一步可包括使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑；或實施例（1）之第一步可包括使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑；及/或第一步可包括使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。
實施例（1）之延伸步驟可包括使探針與環狀核酸結合及藉由滾環擴增來延伸環狀模板。實施例（1）之延伸步驟可包括使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針；及/或使探針與模板核酸序列結合，形成環狀核酸模板（例如藉由連接線性模板以形成環），及藉由滾環擴增延伸環狀模板。在此等實施例中，延伸探針可在探針延伸之後保持侷限於表面上。在此類實施例中，探針可為具有長度為14至24個核苷酸之探針序列的最佳化探針及/或模板可為具有長度為53至76個核苷酸之模板序列的最佳化模板。因此，複合物可在延伸步驟之後保持結合至表面，例如延伸探針在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm之位置處結合至錨定試劑。
實施例（1）之延伸步驟可包括PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）或等溫擴增方法。在一個實施例中，延伸步驟可包含等溫擴增方法，例如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增（RCA）。
實施例（1）中提及之表面可包括粒子及/或多孔盤之孔。表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同的結合域上；及/或表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。在一個實施例中，孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。表面可包含電極且量測步驟進一步可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號，且視情況，方法包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。
實施例（1）之量測步驟可進一步包括使延伸序列與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物之量相關聯，其中偵測探針包括與延伸序列之區域互補的核酸序列。可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例（1）之一特定實例中，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（2）：一種用於偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）錨定試劑的表面；及（b）連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑。
實施例（2）之錨定試劑可包括寡核苷酸序列、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且捕捉試劑可包括抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實施例中，捕捉試劑可包含抗體及/或偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在套組之一特定實施例中，偵測試劑為抗體。
實施例（2）之套組之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若套組之表面為盤之孔，則表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同的結合域上；及/或表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。在套組之特定實例中，表面為孔且孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。此外，套組之表面可包括電極。
實施例（3）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；及（ii）連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之複合物；（b）延伸探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）量測結合至表面之延伸序列的量。
在實施例（3）中，捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。同樣，偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在實施例（3）之特定實例中，偵測試劑為抗體。在實施例（3）之一個實例中，捕捉及偵測試劑為針對分析物之抗體。錨定寡核苷酸序列可包括單股寡核苷酸序列或雙股寡核苷酸序列。延伸序列可進一步包括一或多個偵測序列且量測步驟進一步可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸；或者或另外，延伸序列進一步可包含一或多個經修飾之鹼基且量測步驟進一步可包含使延伸序列與複數個能夠與一或多個經修飾之鹼基結合之可偵測部分接觸。在一特定實例中，延伸序列進一步可包含一或多個經標記鹼基且量測步驟進一步可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（3）之步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑。在另一實例中，步驟（a）可包含使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。
實施例（3）之延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針。或者，延伸步驟可包含使探針與模板環狀核酸結合及藉由滾環擴增來延伸環狀模板。或者，延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板（例如藉由連接）及藉由滾環擴增延伸環狀模板。在此類實施例中，探針可為具有長度為14至24個核苷酸之探針序列的最佳化探針及/或模板可為具有長度為53至76個核苷酸之模板序列的最佳化模板。延伸探針可在探針延伸之後保持侷限於表面上，例如複合物在延伸步驟之後保持與表面結合。在一個實例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm之位置處結合至錨定試劑。在此特定實施例中，延伸步驟可包含PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）或等溫擴增方法。舉例而言，延伸步驟可包含等溫擴增方法，例如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增（RCA）。
實施例（3）之表面可包括粒子及/或多孔盤之孔。表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則其可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為孔，則其可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。在特定實例中，表面可包含電極且量測步驟進一步可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。方法可進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。量測步驟可進一步包括使延伸序列與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物之量相關聯，其中偵測探針包括與延伸序列之區域互補的核酸序列。在此實施例中，可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。舉例而言，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（4）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；及（b）連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑。
實施例（4）之套組包含捕捉試劑，該捕捉試劑包括抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在特定實例中，捕捉試劑可包含抗體。同樣，偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且特定言之，偵測試劑可包含抗體。
實施例（4）之套組包含可包括粒子及/或多孔盤之孔的表面。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上，例如若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。舉例而言，捕捉試劑及錨定試劑在表面上之10-100 nm內。實施例（4）之表面可包含電極。
實施例（5）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；（ii）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；及（iii）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括結合試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑之複合物；（b）使用需要第一及第二探針鄰近之延伸方法來延伸第二探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）量測與表面結合之延伸序列的量。
實施例（5）之捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑為抗體。第二偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑為抗體。更特定言之，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
在實施例（5）中，錨定寡核苷酸序列可包含單股寡核苷酸序列或雙股寡核苷酸序列。在此實施例中，延伸序列進一步可包含一或多個偵測序列且量測步驟進一步可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸。延伸序列亦可包含一或多個經修飾之鹼基且量測步驟進一步可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸。延伸序列可進一步包括一或多個經標記鹼基且量測步驟進一步可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基可包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。舉例而言，一或多個經修飾之鹼基包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（5）之步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑；或步驟（a）可包含使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。
實施例（5）之延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針。延伸步驟可進一步包含使探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板及藉由滾環擴增延伸環狀模板。延伸探針可在探針延伸之後保持侷限於表面上，例如複合物在延伸步驟之後保持與表面結合。延伸探針可在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在距表面上之複合物之位置小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm的位置處結合至錨定試劑。延伸步驟可包含PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）或等溫擴增方法。在一特定實例中，延伸步驟可包含等溫擴增方法，例如為解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增（RCA）。
實施例（5）之延伸方法可包含使步驟（a）中形成之複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二探針互補之內部序列及（ii）與第一探針之不重疊區域互補的兩個末端序列。方法可進一步包含將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。或者，延伸方法可包含使實施例（5）之步驟（a）中形成之複合物與以下各者接觸：包含與第一探針之第一區域及第二探針上之第一區域互補之第一連接探針序列的第一連接寡核苷酸序列，及包括與第一探針之第二不重疊區域及第二探針之第二不重疊區域互補之第二探針序列的第二連接寡核苷酸；及視情況，連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。
實施例（5）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面亦可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。在特定實例中，表面可包含電極且量測步驟進一步可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號，且視情況，實施例（5）之方法進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。
實施例（5）之量測步驟進一步可包含使延伸序列與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物的量相關聯，其中偵測探針包括與延伸序列之區域互補的核酸序列。可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（6）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；（b）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；及（c）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑。
實施例（6）之捕捉試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑可包含抗體。同樣，第一偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑可包含抗體。類似地，第二偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑可包含抗體。
實施例（6）之表面可包括粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上；及/或若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。在特定實例中，表面可包含電極。
實施例（7）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括捕捉試劑及錨定試劑之表面上的用於分析物之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑之偵測複合物；（b）使（c）中形成之偵測複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二鄰近探針互補之內部序列及（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補之兩個末端序列；（c）     使連接序列與第一及第二鄰近探針雜交；（d）將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針以產生包括結合錨定試劑之結合域的擴增子；（f）使擴增子與錨定試劑結合；及（g）量測表面上之擴增子的量。
實施例（8）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括捕捉試劑及錨定試劑之表面上的用於分析物之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑之偵測複合物；（b）使（c）中形成之偵測複合物與第一連接寡核苷酸及第二連接寡核苷酸接觸，其中（i）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針的兩個不重疊區域互補，及（ii）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針的兩個不重疊區域互補；（c）使第一及第二連接寡核苷酸與第一及第二鄰近探針雜交；（d）連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針，以產生包括結合錨定試劑之結合域的擴增子；（f）將擴增子與錨定試劑結合；及（g）量測表面上之擴增子的量。
實施例（7）及（8）之捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。類似地，第一偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體。另外，第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在實施例（7）及（8）之特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（7）及（8）之錨定試劑可包含寡核苷酸序列、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基。在一個實例中，結合域可包含適體且錨定試劑可包含適體配位體。結合域可包含核酸序列且錨定試劑可包含DNA結合蛋白；及/或錨定試劑可包含寡核苷酸序列且擴增子可包含互補寡核苷酸序列。
實施例（7）及（8）之擴增子可進一步包括一或多個偵測序列且量測步驟可進一步包括使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸。此外，擴增子可進一步包括一或多個經修飾之鹼基且量測步驟進一步可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸。再另外，擴增子可進一步包含一或多個經標記鹼基且量測步驟進一步可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基可包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（7）及（8）之步驟（a）可包括使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之第一及第二偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑。再另外，步驟（a）可包含使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑。
實施例（7）及（8）之擴增子可在探針延伸之後保持侷限於表面上。複合物可在延伸步驟之後保持與表面結合。舉例而言，擴增子在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm之位置處結合至錨定試劑。
實施例（7）及（8）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。在特定實例中，捕捉試劑及錨定試劑在表面上之10-100 nm內。
再另外，表面可包含電極且量測步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。在此等實施例（（7）及（8））中，方法可進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。量測步驟可包含使擴增子與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物的量相關聯，其中偵測探針包括與擴增子之區域互補的核酸序列。可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。舉例而言，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（9）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）錨定試劑之表面；（b）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；（c）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及（d）包括以下之連接序列：（i）與第二鄰近探針互補之內部序列及（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（10）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）錨定試劑之表面；及（b）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；（c）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及（d）（i）第一連接寡核苷酸及（ii）第二連接寡核苷酸，其中（x）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補及（y）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（9）及（10）之捕捉試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在特定實例中，捕捉試劑可包含抗體。第一偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑可包含抗體。第二偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑可包含抗體。
實施例（9）及（10）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。在特定實例中，捕捉試劑及錨定試劑在表面上之10-100 nm內。
實施例（9）及（10）之表面可包含電極。
實施例（11）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的用於分析物之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑的偵測複合物；（b）使（c）中形成的偵測複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二鄰近探針互補之內部序列，（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列及（iii）匹配錨定序列之序列；（c）使連接序列與第一及第二鄰近探針雜交；（d）將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針，以產生包括複數個與錨定序列互補之錨定序列補體的擴增子；（f）使錨定序列與錨定序列補體中之一者雜交；及（g）量測表面上之擴增子的量。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（12）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的用於分析物之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑的偵測複合物；（b）使（a）中形成的偵測複合物與第一連接寡核苷酸及第二連接寡核苷酸接觸，其中（i）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補，（ii）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補，及（iii）第一及/或第二連接子亦包括匹配錨定序列之序列；（c）使第一及第二連接寡核苷酸與第一及第二鄰近探針雜交；（d）連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針，以產生包括複數個與錨定序列互補之錨定序列補體的擴增子；（f）使錨定序列與錨定序列補體中之一者雜交；及（g）量測表面上之擴增子的量。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（11）及（12）之捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑為抗體。同樣，第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑為抗體。在一個實例中，第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（11）及（12）之擴增子可進一步包括一或多個偵測序列且量測步驟可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸。此外，擴增子亦可包括一或多個經修飾之鹼基且量測步驟可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸。擴增子另外包含一或多個經標記鹼基且量測步驟可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包含生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（11）及（12）之步驟（a）可包括使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之第一及第二偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑。再另外，步驟（a）可包含使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑。
實施例（11）及（12）中之擴增子可在探針延伸之後保持侷限於表面上，且視情況，複合物在延伸步驟之後保持與表面結合。舉例而言，擴增子在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在距表面上之複合物之位置小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm的位置處結合至錨定試劑。
實施例（11）及（12）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。視情況，表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。
實施例（11）及（12）之表面可包括電極且量測步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。視情況，實施例（11）及（12）進一步包括收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。量測步驟亦可包含使擴增子與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物的量相關聯，其中偵測探針包括與擴增子之區域互補的核酸序列。可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在一個實例中，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（11）及（12）之樣品可包括一或多個分析物分子，且表面可包含用於一或多個分析物分子之複數種捕捉試劑，其跨越位於表面上之複數個可解析結合區分佈，且方法可包含：（x）使一或多個分析物分子與表面上之一或多種捕捉試劑結合；（y）確定各結合區中存在或不存在分析物分子；及（z）鑑別含有分析物分子之結合區之數目及/或不含分析物分子之分析物域之數目。量測步驟可包含對來自表面之光學信號成像以產生包括複數個像素之影像，且各可解析結合區映射至影像中之一或多個像素。可解析結合區可為陣列之單元及/或可解析結合區經組態以分離個別粒子。各可解析結合區可為體積＜100 nL之個別奈米孔，例如其中至少99%之結合區含有零個或一個分析物分子，其中至少約95%之結合區含有零個或一個分析物分子，其中至少約80%之結合區含有零個或一個分析物分子，及/或其中至少約50%之結合區含有零個或一個分析物分子。實施例（11）及（12）之樣品中的分析物分子濃度可使用含有至少一個或一個分析物分子之結合區之數目的校準曲線、泊松分佈（Poisson distribution）分析及/或高斯分步（Gaussian distribution）分析至少部分地確定。
在實施例（11）及（12）中，樣品可包括一或多個分析物分子，表面可包含複數個粒子，其各自包括複數種用於分析物分子之結合試劑，其中複數個粒子跨越複數個可解析結合區分佈，且方法可包含：（i）使一或多個分析物分子與表面上之一或多種結合試劑結合，及（ii）跨越可解析結合區之陣列分配複數個粒子；及（iii）確定各可解析結合區中存在或不存在分析物分子，以鑑別含有分析物分子之結合區之數目及/或不含分析物分子之結合區之數目。
實施例（13）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；（b）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；（c）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及（d）包括以下之連接序列：（i）與第二鄰近探針互補之內部序列及（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（14）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；及（b）包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；（c）包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及（d）（i）第一連接寡核苷酸及（ii）第二連接寡核苷酸，其中（x）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補，及（y）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補。在實施例中，第一及第二鄰近探針為核酸探針。
實施例（13）及（14）之捕捉試劑可包括抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑可包含抗體。同樣，第一偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑可包含抗體。類似地，第二偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑可包含抗體。
實施例（13）及（14）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內，且視情況，表面可包含電極。
實施例（15）：一種偵測樣品中之分析物之方法，其中該方法可包含：（a）使分析物與第一及第二偵測試劑結合以形成偵測複合物，各偵測複合物包括分析物、第一偵測試劑及第二偵測試劑，其中第一偵測試劑具有第一可偵測標記且第二偵測試劑具有第二可偵測標記，（b）跨越複數個反應容器分配分析物以使得大多數反應容器含有一個或更少的分析物；及（c）藉由計數含有第一及第二可偵測標記之反應容器之數目來偵測分析物分子之數目。在此實施例（15）中，第一偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體。同樣，第二偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在特定實例中，第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（15）之步驟（a）可進一步包括形成包括該等分析物及該等偵測試劑之溶液，且步驟（b）可包含跨越複數個反應容器分配溶液以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/10。或者，實施例（15）之步驟（a）可進一步包括形成包括該等分析物及該等偵測試劑之溶液，且步驟（b）可包含跨越複數個反應容器分配溶液以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/100。再另外，實施例（15）之步驟（a）可進一步包括形成包括該等分析物及該等偵測試劑之溶液，且步驟（b）可包含跨越複數個反應容器分配溶液以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/1000。此外，實施例（15）之步驟（a）可進一步包括形成包括該等分析物及該等偵測試劑之溶液，且步驟（b）可包含跨越複數個反應容器分配溶液以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/10000。
實施例（16）：一種偵測樣品中之分析物之方法，該方法包括：（a）使分析物與捕捉試劑及第一及第二偵測試劑結合以形成偵測複合物，各偵測複合物包括捕捉試劑、分析物、第一偵測試劑及第二偵測試劑，其中（i）第一偵測試劑具有第一可偵測標記且第二偵測試劑具有第二可偵測標記，（ii）捕捉試劑在表面上；（b）跨越複數個反應容器分配分析物以使得大多數反應容器含有一個或更少的分析物；及（c）藉由計數含有第一及第二可偵測標記之反應容器之數目來偵測分析物分子之數目。在此實施例中，捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體。此外，第二偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。舉例而言，捕捉試劑、第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（16）之步驟（b）可進一步包括跨越複數個反應容器分配溶液，以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/10。此外，實施例（16）之步驟（b）可進一步包括跨越複數個反應容器分配溶液，以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/100。實施例（16）之步驟（b）可進一步包括跨越複數個反應容器分配溶液，以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/1000。另外，實施例（16）之步驟（b）可進一步包括跨越複數個反應容器分配溶液，以使得在相同容器中發現未結合第一偵測試劑及未結合第二偵測試劑之可能性小於1/10000。
在捕捉試劑與分析物結合之前，實施例（16）之偵測複合物中之捕捉試劑可在表面上；或在將捕捉試劑固定於表面上之前，偵測複合物中之捕捉試劑與分析物結合。在一個實例中，捕捉試劑可包含靶向部分且表面可包含靶向部分補體。靶向部分及靶向劑結合搭配物係選自以下結合對：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、受體-配位體、抗體-抗原、核酸-核酸補體。
實施例（16）之表面為粒子，且視情況，捕捉試劑固定於複數個粒子上，且分析物之分配係藉由使分析物與捕捉試劑結合及將粒子分配至複數個反應容器中來達成。捕捉試劑可固定於複數個粒子上，且分析物之分配係藉由將粒子分配至複數個反應容器中且接著使分析物與捕捉試劑結合來達成。
實施例（16）可進一步包括將複數個粒子分配至複數個反應容器中，其中複數個粒子包括靶向部分，捕捉試劑包括靶向部分補體，且分析物之分配係藉由使靶向部分補體與靶向部分結合來達成。實施例（16）亦可包含在分配步驟之前及/或在分配步驟之後洗滌該等粒子。
實施例（16）之表面可為反應容器中之一者內之位置。在此實施例中，捕捉試劑可固定於複數個反應容器之表面上且分析物之分配係藉由使分析物與捕捉試劑結合來達成。視情況，反應容器具有其上固定有靶向部分之表面，捕捉試劑包括靶向部分補體，且分析物之分配係藉由使靶向部分補體與靶向部分結合來達成。在此特定實例中，方法可進一步包括在偵測步驟之前洗滌反應容器。
實施例（16）之複數個反應容器可包括奈米孔陣列。複數個反應容器可包括至少10,000個反應容器。在一個實施例中，反應容器之容積小於100 nL。視情況，小於50%之反應容器在偵測時含有分析物，小於10%之反應容器在偵測時含有分析物，小於1%之反應容器在偵測時含有分析物，及/或小於0.1%之反應容器在偵測時含有分析物。
在實施例（16）之一個態樣中，第一可偵測標記為偶聯酶反應系統之第一酶且第二可偵測標記為偶聯酶反應系統之第二酶，且步驟（d）可包含添加反應系統之一或多種受質、產生酶反應系統之產物及計數含有產物之反應容器。在此實施例中，僅當第一酶及第二酶極為貼近時方可產生產物，例如第一及第二酶在彼此之200 nM內，或第一及第二酶在彼此之50 nM內。舉例而言，第一酶為氧化酶，第二酶為過氧化酶，且受質包括氧化酶受質及經標記之Amplex Red或魯米諾（luminol）衍生物。在此實施例中，氧化酶可為葡萄糖氧化酶且氧化酶受質為葡萄糖。在一個實施例中，藉由偵測複合物中之第一及第二酶催化之反應使得經標記之Amplex Red或魯米諾固定於表面上，且視情況，該方法可包含量測表面上之經標記之Amplex Red或魯米諾。經標記之Amplex Red或魯米諾視情況為生物素-Amplex Red或魯米諾，且方法可包含添加經標記之抗生蛋白鏈菌素及量測抗生蛋白鏈菌素上之標記。
實施例（16）之步驟（d）可包含量測當第一及第二可偵測標記結合至相同分析物分子時產生之鄰近依賴性信號，及計數產生鄰近依賴性信號之反應容器之數目，例如鄰近依賴性信號係藉由PLA-RCA來產生。舉例而言，第一可偵測標記可為FRET供體且可偵測標記為FRET受體，且鄰近依賴性信號係藉由激發FRET供體及量測來自FRET受體之發射來量測。在一個實例中，可獨立地量測第一及第二可偵測標記。視情況，第一及第二可偵測標記為就光譜特性而言彼此不同的發光標記。在一個實例中，第一可偵測標記為與第一受質反應以產生第一信號之第一酶，且第二可偵測標記為與第二受質反應以產生不同第二信號之第二酶，且實施例（16）之步驟（d）可包含添加第一酶受質及第二酶受質及計數產生第一及第二信號之反應容器之數目。第一及第二信號可為具有不同光譜特性之吸光度的變化。視情況，第一及第二信號為具有不同光譜特性之發光信號。第一及第二酶可為水解酶，例如選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其組合，且第一及第二受質係選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷及葡萄糖苷酸修飾之穩定二氧雜環丁烷、4-甲基香豆素基、螢光素或其組合。在特定實例中，第一及第二酶係選自辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶及鹼性磷酸酶。實施例（16）之偵測步驟可包含經由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、發光、放射性、磁場或其組合來偵測。
實施例（17）：一種偵測樣品中之分析物之套組，該套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括第一可偵測標記之第一偵測試劑；（b）包括第二可偵測標記之第二偵測試劑；（c）經組態以含有一個或更少的分析物分子之複數個反應容器。
實施例（18）：一種偵測樣品中之分析物之套組，該套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括第一可偵測標記之第一偵測試劑；（b）包括第二可偵測標記之第二偵測試劑；（c）包括捕捉試劑之表面；及（d）經組態以含有一個或更少的分析物分子之複數個反應容器。
實施例（17）及（18）之第一及第二偵測試劑可包括抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基、適體或其組合。在一個實例中，第一及第二偵測試劑包括抗體。捕捉抗體可包括抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉抗體可包含抗體。在一個實例中，捕捉試劑可包含靶向部分且表面可包含靶向部分補體，例如靶向部分及靶向劑結合搭配物係選自以下結合對：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、受體-配位體、抗體-抗原、核酸-核酸補體。
實施例（17）及（18）之表面可為粒子，且舉例而言，捕捉試劑固定於複數個粒子上。或者，表面為反應容器中之一者內之位置且例如，捕捉試劑固定於複數個反應容器之表面上。視情況，反應容器具有在其上固定有靶向部分之表面且捕捉試劑包括靶向部分補體。複數個反應容器可包括奈米孔陣列或分散於油包水乳液中之水滴。複數個反應容器可包含至少10,000個反應容器，且視情況，複數個反應容器之一具有小於100 nL的容積。
在實施例（17）及（18）之套組中，第一可偵測標記可為偶聯酶反應系統之第一酶且第二可偵測標記為偶聯酶反應系統之第二酶，且套組可在一或多個額外小瓶、容器或隔室中包含反應系統之一或多種受質。舉例而言，第一酶為氧化酶，第二酶為過氧化酶，且受質包括氧化酶受質及經標記之Amplex Red或魯米諾衍生物。在一特定實施例中，氧化酶為葡萄糖氧化酶且氧化酶受質為葡萄糖。第一及第二可偵測標記可為鄰近依賴性系統之組分，例如第一可偵測標記為FRET供體且可偵測標記為FRET受體。可獨立地量測第一及第二可偵測標記。視情況，第一及第二可偵測標記為就光譜特性而言彼此不同的發光標記。
在實施例（17）及（18）之套組中，第一可偵測標記為與第一受質反應以產生第一信號之第一酶，且第二可偵測標記為與第二受質反應以產生不同的第二信號之第二酶，且套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含第一酶受質及第二酶受質。視情況，第一及第二信號為具有不同光譜特性之吸光度的變化。在一個實例中，第一及第二信號為具有不同光譜特性之發光信號。第一及第二酶可為水解酶。在一個實例中，第一及第二酶係選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其組合。第一及第二受質可選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷及葡萄糖苷酸修飾之穩定二氧雜環丁烷、4-甲基香豆素基、螢光素或其組合。視情況，第一及第二酶係選自辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶及鹼性磷酸酶。
實施例（19）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）使分析物與捕捉試劑、具有第一可偵測標記之第一偵測試劑及具有第二可偵測標記之第二偵測試劑結合及形成複合物，其中複合物中之捕捉試劑固定於表面上；（b）使第一及第二偵測試劑交聯以形成交聯產物；（c）使交聯產物自表面釋放至溶離劑中；（d）計數包括第一及第二可偵測標記兩者之洗提劑中之個別交聯產物。在此實例（19）中，捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑為抗體。此外，第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且特定言之，第二偵測試劑可為抗體。在一個特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（19）可進一步包括添加交聯劑以使第一及第二偵測試劑交聯，例如第一及第二偵測試劑包括反應性部分且交聯劑為與反應性部分連接之多官能性交聯劑。舉例而言，反應性部分包括胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合。交聯劑可包括胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合。第一及第二偵測試劑可包含結合部分且交聯劑為結合部分之多價結合搭配物。在一個實例中，第一及第二偵測試劑為動物物種之抗體且交聯劑為靶向動物物種之抗體的多價抗物種抗體。第一及第二偵測試劑可包括生物素且交聯劑為抗生蛋白鏈菌素；第一及第二偵測試劑包含抗生蛋白鏈菌素且交聯劑為生物素；第一及第二偵測試劑連接至抗生蛋白鏈菌素且交聯劑為包括複數個生物素分子之聚合物；及/或第一及第二偵測試劑分別包括第一及第二核酸探針，且交聯劑為可包含與第一核酸探針互補之序列及與第二核酸探針互補之獨立序列的寡核苷酸。
實施例（19）之表面可包括粒子、反應容器，例如管或安瓿，及/或表面可包含多孔盤之孔。實施例（19）之方法可進一步包含收集該等粒子及洗滌該等粒子以移除雜質，且視情況，第一及第二可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，第一及第二可偵測標記包括ECL標記且計數步驟可包含量測ECL信號。
實施例（20）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括固定捕捉試劑之表面；（b）具有第一可偵測標記之第一偵測試劑；（c）具有第二可偵測標記之第二偵測試劑；及（d）對第一及第二偵測試劑具有反應性之交聯劑。
實施例（20）之第一及第二偵測試劑可包括反應性部分且交聯劑為與反應性部分連接之多官能性交聯劑。反應性部分可包含胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合；且交聯劑可包含胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合。實施例（20）之第一及第二偵測試劑可包括結合部分且交聯劑為結合部分之多價結合搭配物，例如第一及第二偵測試劑為動物物種之抗體且交聯劑為靶向動物物種之抗體的多價抗物種抗體；第一及第二偵測試劑包括生物素且交聯劑為抗生蛋白鏈菌素；第一及第二偵測試劑包括抗生蛋白鏈菌素且交聯劑為生物素；第一及第二偵測試劑連接至抗生蛋白鏈菌素且交聯劑為包括複數個生物素分子之聚合物；及/或第一及第二偵測試劑分別包括第一及第二核酸探針，且交聯劑為可包含與第一核酸探針互補之序列及與第二核酸探針互補之獨立序列的寡核苷酸。
實施例（20）之表面可包含粒子、多孔盤之孔或反應容器，例如管或安瓿。另外，表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之不同結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之不同結合域上。表面亦可包含電極。
實施例（21）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）使分析物與捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑結合以形成複合物，其中第一偵測試劑可包含第一可偵測標記及第一核酸探針，第二偵測試劑可包含第二可偵測標記及第二核酸探針，且複合物中之捕捉試劑固定於表面上；（b）如下地交聯第一及第二偵測試劑：（i）使第一探針與第二探針雜交，（ii）使第一及第二探針與具有與第一及第二探針互補之區域的第三核酸雜交，或（iii）連接第一及第二探針；（c）將交聯產物自表面釋放至溶離劑中；（d）計數包括第一及第二可偵測標記兩者之溶離劑中之個別交聯產物。
實施例（21）之捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體；第二偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在一特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（21）之表面可包含粒子、反應容器（例如管或安瓿）或多孔盤之孔。實施例（21）之方法可進一步包括收集該等粒子及洗滌該等粒子以移除雜質。第一及第二可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，第一及第二可偵測標記包括ECL標記且計數步驟可包含量測ECL信號。
實施例（22）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括固定捕捉試劑之表面；（b）具有第一可偵測標記及第一核酸探針之第一偵測試劑；（c）具有第二可偵測標記及第二核酸探針之第二偵測試劑；及（d）具有與第一及第二核酸探針互補之區域的第三核酸。
實施例（22）之表面可包含粒子、多孔盤之孔或反應容器，例如管或安瓿。表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之不同結合域上，且若表面為孔，則孔可包括複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之不同結合域上。表面視情況可包含電極。
實施例（23）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）使分析物與捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑結合以形成複合物，其中第一偵測試劑可包含第一核酸探針，第二偵測試劑可包含第二核酸探針，且複合物中之捕捉試劑固定於表面上；（b）延伸第二核酸探針以形成包括可偵測標記之延伸序列，該延伸取決於第一及第二核酸探針於複合物中之共定位；（c）將延伸序列自表面釋放至溶離劑中；及（d）計數溶離劑中之個別延伸序列。在此實施例中，捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑為抗體。第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且特定言之，第二偵測試劑為抗體。在一特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（23）之表面可包含粒子、反應容器（例如管或安瓿）；或多孔盤之孔。實施例（23）之方法可進一步包括收集該等粒子及洗滌該等粒子以移除雜質。
實施例（23）之標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，標記可包含ECL標記且計數步驟可包含量測ECL信號。
實施例（23）之延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針。延伸步驟亦可包括使第一探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板及藉由滾環擴增延伸環狀模板。延伸步驟可包括使第一探針與模板核酸序列結合、使第二探針與模板序列結合及連接第一及第二探針。視情況，標記為螢光標記且計數個別延伸序列可包含單分子螢光偵測，例如可包含螢光相關光譜法及/或螢光交叉相關光譜法。單分子螢光偵測可包括使溶離劑流經毛細管、使光源聚焦於毛細管內之體積上以產生詢問區及用光偵測器觀測詢問區以偵測螢光分子通過該詢問區。單分子螢光偵測亦可包括使溶離劑流經毛細管、使光源聚焦於毛細管內之體積上以產生詢問區及用光偵測器觀測詢問區以偵測螢光分子通過該詢問區。
實施例（24）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）使分析物與捕捉試劑、具有第一可偵測標記之第一偵測試劑及具有第二可偵測標記之第二偵測試劑結合及形成複合物，其中複合物中之捕捉試劑固定於表面上；（b）藉由將固定之捕捉試劑自表面解離至溶離劑中而自表面釋放形成之複合物；及（c）計數包括第一及第二可偵測標記兩者之溶離劑中之個別產物。在此實施例中，捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體；第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體；第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體；且在特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（24）之表面可包括粒子、反應容器（例如管或安瓿）及/或多孔盤之孔。實施例（24）之方法可包含收集該等粒子及洗滌該等粒子以移除雜質。第一及第二可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測，且在特定實施例中，第一及第二可偵測標記包括ECL標記且計數步驟可包含量測ECL信號。
實施例（25）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑之表面上的捕捉試劑；（ii）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；及（iii）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括結合試劑、分析物及第一及第二偵測試劑之複合物；（b）使用需要第一及第二探針鄰近之延伸方法來延伸第二探針以形成延伸序列；及（c）量測與表面結合之延伸序列的量。在此實施例中，捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體；第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體；第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體；例如第二偵測試劑為抗體；且在特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（25）之延伸序列可包含一或多個偵測序列且量測步驟可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸；延伸序列可包含一或多個經修飾之鹼基且量測步驟可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸；及/或延伸序列可包含一或多個經標記鹼基且量測步驟可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包含抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（25）之步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑；使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑；或使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之偵測試劑。延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針；或使探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板及藉由滾環擴增延伸環狀模板。在此實施例中，延伸探針可在探針延伸之後保持侷限於表面上，例如複合物在延伸步驟之後保持與表面結合。延伸步驟可包含PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）或等溫擴增方法。在一特定實例中，延伸步驟可包含等溫擴增方法，例如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增（RCA）。
實施例（25）之延伸方法可包括使步驟（a）中形成之複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二探針互補之內部序列，及（ii）與第一探針之不重疊區域互補之兩個末端序列。方法可進一步包括將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。實施例（25）之延伸方法亦可包含使步驟（a）中形成之複合物與以下各者接觸：包含與第一探針之第一區域及第二探針上之第一區域互補之第一連接探針序列的第一連接寡核苷酸序列，及包括與第一探針之第二不重疊區域及第二探針之第二不重疊區域互補之第二探針序列的第二連接寡核苷酸。方法亦可包含連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。
實施例（25）之表面可包括粒子或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之兩個不同結合域上。若表面為孔，則孔可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之相同結合域上，且若表面為孔，則孔可包括複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之相同結合域上。表面可包含電極且量測步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。方法視情況包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。量測步驟可進一步包括使延伸序列與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及使量測值與樣品中分析物之量相關聯，其中偵測探針包括與延伸序列之區域互補的核酸序列。可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（26）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括用於分析物之捕捉試劑的表面；（b）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；及（c）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑。
實施例（26）之捕捉試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑可包含抗體；第一偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑可包含抗體；第二偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑可包含抗體；且表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之兩個相同結合域上；且若表面為孔，則孔可包括複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之兩個不同結合域上。視情況，表面可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於表面上之相同結合域上，且若表面為孔，則孔可包含複數個不同結合域且捕捉試劑位於孔內之相同結合域上。表面可包括電極。
實施例1-26之表面可包含分析容器（例如試管、比色管、流量槽、FACS細胞分選儀、濾筒或多孔盤之孔）之內表面。表面亦可包括載玻片、分析晶片或分析陣列；接腳、探針、珠粒或過濾介質；側流介質，例如過濾膜。
實施例（27）：一種偵測包括一或多個分析物分子之樣品中之所關注分析物之方法，該方法包括：（a）使樣品與包括位於表面上之複數個可解析結合區的表面接觸，各可解析結合區包括用於樣品中之一或多個分析物分子的複數種捕捉試劑；（b）將一或多個分析物分子結合至（i）表面上之一或多種捕捉試劑；（ii）包括第一可偵測標記的用於分析物之第一偵測試劑，及（iii）包括第二可偵測標記的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上之可解析結合域上形成包括捕捉試劑、分析物及第一及第二偵測試劑之偵測複合物，其中第一及第二可偵測標記為不同標記化合物；（c）確定各結合區中存在或不存在分析物分子；及（d）鑑別含有分析物分子之結合區之數目及/或不含分析物分子之結合區之數目。鑑別步驟可包含對來自表面之光學信號成像以產生包括複數個像素之影像，且各可解析結合區映射至影像中之一或多個像素。可解析結合區可為陣列之單元及/或經組態以分離個別粒子。各可解析結合區可為體積＜100 nL之個別奈米孔及/或至少99%之結合區含有零個或一個分析物分子；至少約95%之結合區含有零個或一個分析物分子；至少約80%之結合區含有零個或一個分析物分子；或至少約50%之結合區含有零個或一個分析物分子。可使用含有至少一個或一個分析物分子之結合區之數目的校準曲線、泊松分佈分析及/或高斯分步分析至少部分地確定樣品中之分析物分子濃度。
實施例（27）之表面可包含複數個粒子，其各自包括複數種用於分析物分子之捕捉試劑，其中複數個粒子跨越複數個可解析結合區分佈，且方法可包含：（i）使一或多個分析物分子與表面上之一或多種捕捉試劑及用於一或多個分析物分子中之每一者之第一及第二偵測試劑結合，其中第一及第二偵測試劑分別包含第一及第二可偵測標記；（ii）跨越可解析結合區之陣列分配複數個粒子；及（iii）確定各可解析結合區中存在或不存在分析物分子，以鑑別含有分析物分子之結合區之數目及/或不含分析物分子之結合區之數目，其中視情況，各可解析結合區為體積＜100 nL之個別奈米孔，及/或至少99%之結合區含有零個或一個分析物分子；至少約95%之結合區含有零個或一個分析物分子；至少約80%之結合區含有零個或一個分析物分子；及/或至少約50%之結合區含有零個或一個分析物分子。
實施例（27）中之捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體；第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體；第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在一特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（27）之步驟（a）可包含使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑；使分析物按以下次序與以下物質結合：（i）用於分析物之第一及第二偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑；或使分析物同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於分析物之第一及第二偵測試劑。
實施例（27）之表面可包含粒子或多孔盤之孔。在特定實例中，表面可包含電極且鑑別步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。實施例（27）之方法可進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。第一可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測；及/或第二可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。可獨立地量測第一及第二可偵測標記，且在一個實例中，第一及第二可偵測標記為就光譜特性而言彼此不同的發光標記。
實施例（27）之表面可包含分析容器（例如試管、比色管、流量槽、FACS細胞分選儀、濾筒或多孔盤之孔）之內表面。表面亦可包括載玻片、分析晶片或分析陣列；接腳、探針、珠粒或過濾介質；側流介質，例如過濾膜。
實施例（28）：一種偵測包括一或多個分析物分子之樣品中之所關注分析物之套組，該套組包括：（a）包括位於表面上之複數個可解析結合區的表面，各可解析結合區包括用於樣品中之一或多個分析物分子的複數種捕捉試劑；（b）包括第一可偵測標記的用於分析物之第一偵測試劑，及（c）包括第二可偵測標記的用於分析物之第二偵測試劑；其中第一及第二可偵測標記為不同標記化合物。
實施例（28）之可解析結合區可為陣列之單元及/或經組態以分離個別粒子。各可解析結合區視情況為體積＜100 nL之個別奈米孔。表面可包含複數個粒子，其各自包括用於分析物分子之複數種捕捉試劑，其中複數個粒子跨越複數個可解析結合區分佈，且套組可包含：用於一或多個分析物分子中之每一者之第一及第二偵測試劑，其中第一及第二偵測試劑分別包含第一及第二可偵測標記。
實施例（28）中之捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如捕捉試劑為抗體；第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體；第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在一特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對分析物之抗體。
實施例（28）之表面可包含粒子或多孔盤之孔。在特定實例中，表面可包含電極且鑑別步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。第一可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測；及/或第二可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。可獨立地量測第一及第二可偵測標記，且在一個實例中，第一及第二可偵測標記為就光譜特性而言彼此不同的發光標記。
實施例（28）之表面可包含分析容器（例如試管、比色管、流量槽、FACS細胞分選儀、濾筒或多孔盤之孔）之內表面。表面亦可包括載玻片、分析晶片或分析陣列；接腳、探針、珠粒或過濾介質；側流介質，例如過濾膜。
實施例（29）：一種偵測樣品中之HIV p24之方法，其包括：（a）將HIV p24結合至：（i）包括用於HIV p24之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；（ii）連接至第一核酸探針的用於HIV p24之第一偵測試劑；及（iii）連接至第二核酸探針的用於HIV p24之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括結合試劑、HIV p24以及第一及第二偵測試劑之複合物；（b）使用需要第一及第二探針鄰近之延伸方法來延伸第二探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）量測與表面結合之延伸序列的量。
實施例（29）之捕捉試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。同樣，第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑為抗體。第二偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑為抗體。更特定言之，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對HIV p24之抗體。
在實施例（29）中，錨定寡核苷酸序列可包含單股寡核苷酸序列或雙股寡核苷酸序列。在此實施例中，延伸序列可包含一或多個偵測序列且量測步驟可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸。延伸序列亦可包含一或多個經修飾之鹼基且量測步驟可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸。延伸序列可進一步包括一或多個經標記鹼基且量測步驟可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基可包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。舉例而言，一或多個經修飾之鹼基包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（29）之步驟（a）可包含使HIV p24按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於HIV p24之偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使HIV p24按以下次序與以下物質結合：（i）用於HIV p24之偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑；或步驟（a）可包含使HIV p24同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於HIV p24之偵測試劑。
實施例（29）之延伸步驟可包含使探針與模板核酸序列結合及藉由聚合酶鏈反應延伸探針。延伸步驟可進一步包含使探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板及藉由滾環擴增延伸環狀模板。延伸探針可在探針延伸之後保持侷限於表面上，例如複合物在延伸步驟之後保持與表面結合。延伸探針可在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm之位置處結合至錨定試劑。延伸步驟可包含PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）或等溫擴增方法。在一特定實例中，延伸步驟可包含等溫擴增方法，例如為解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增（RCA）。
實施例（29）之延伸方法可包含使步驟（a）中形成之複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二探針互補之內部序列及（ii）與第一探針之不重疊區域互補的兩個末端序列。方法可進一步包含將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。或者，延伸方法可包含使實施例（29）之步驟（a）中形成之複合物與以下各者接觸：包含與第一探針之第一區域及第二探針上之第一區域互補之第一連接探針序列的第一連接寡核苷酸序列，及包括與第一探針之第二不重疊區域及第二探針之第二不重疊區域互補之第二探針序列的第二連接寡核苷酸；及視情況，連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二探針兩者雜交之環狀目標序列。
實施例（29）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面亦可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。在特定實例中，表面可包含電極且量測步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號，且視情況，實施例（29）之方法進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。
實施例（29）之量測步驟可包含使延伸序列與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中p24之量相關聯，其中偵測探針包括與延伸序列之區域互補的核酸序列。可偵測標記可藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在特定實例中，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（30）：一種偵測樣品中之HIV p24之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於HIV p24之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；（b）連接至第一核酸探針的用於HIV p24之第一偵測試劑；及（c）連接至第二核酸探針的用於HIV p24之第二偵測試劑。
實施例（30）之捕捉試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑可包含抗體。同樣，第一偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第一偵測試劑可包含抗體。類似地，第二偵測試劑可包含抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，第二偵測試劑可包含抗體。
實施例（30）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上；及/或若表面為孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。捕捉試劑及錨定試劑可在表面上之10-100 nm內。在特定實例中，表面可包含電極。
實施例（31）：一種偵測樣品中之HIV p24之方法，其包括：（a）將HIV p24結合至：（i）包括捕捉試劑及錨定試劑之表面上的用於HIV p24之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於HIV p24之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於HIV p24之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、HIV p24以及第一及第二偵測試劑之偵測複合物；（b）使（c）中形成之偵測複合物與包括以下之連接序列接觸：（i）與第二鄰近探針互補之內部序列及（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補之兩個末端序列；（c）使連接序列與第一及第二鄰近探針雜交；（d）將連接寡核苷酸之兩個末端序列連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針以產生包括結合錨定試劑之結合域的擴增子；（f）使擴增子與錨定試劑結合；及（g）量測表面上之擴增子的量。
實施例（32）：一種偵測樣品中之HIV p24之方法，其包括：（a）將HIV p24結合至：（i）包括捕捉試劑及錨定試劑之表面上的用於HIV p24之捕捉試劑；（ii）包括第一鄰近探針的用於HIV p24之第一偵測試劑，及（iii）包括第二鄰近探針的用於HIV p24之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、HIV p24以及第一及第二偵測試劑之偵測複合物；（b）使（c）中形成之偵測複合物與第一連接寡核苷酸及第二連接寡核苷酸接觸，其中（i）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針的兩個不重疊區域互補，及（ii）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針的兩個不重疊區域互補；（c）使第一及第二連接寡核苷酸與第一及第二鄰近探針雜交；（d）連接第一及第二連接寡核苷酸以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列；（e）藉由目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針，以產生包括結合錨定試劑之結合域的擴增子；（f）將擴增子與錨定試劑結合；及（g）量測表面上之擴增子的量。
實施例（31）及（32）之捕捉試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，且在一特定實例中，捕捉試劑為抗體。類似地，第一偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第一偵測試劑為抗體。另外，第二偵測試劑為抗體、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體，例如第二偵測試劑為抗體。在實施例（31）及（32）之特定實例中，捕捉試劑及第一及第二偵測試劑為針對HIV p24之抗體。
實施例（31）及（32）之錨定試劑可包含寡核苷酸序列、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基。在一個實例中，結合域可包含適體且錨定試劑可包含適體配位體。結合域可包含核酸序列且錨定試劑可包含DNA結合蛋白；及/或錨定試劑可包含寡核苷酸序列且擴增子可包含互補寡核苷酸序列。
實施例（31）及（32）之擴增子可包含一或多個偵測序列且量測步驟可包含使延伸序列與複數個與一或多個偵測序列互補之經標記探針接觸。此外，擴增子可進一步包括一或多個經修飾之鹼基且量測步驟可包含使延伸序列與複數個能夠結合至一或多個經修飾之鹼基的可偵測部分接觸。再另外，擴增子可進一步包含一或多個經標記鹼基且量測步驟可包含偵測一或多個經標記鹼基之存在。一或多個經修飾之鹼基可包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且複數個可偵測部分各自包括一或多個經修飾之鹼基及可偵測標記之結合搭配物。一或多個經修飾之鹼基可包括抗生蛋白鏈菌素且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生蛋白鏈菌素及可偵測標記；一或多個經修飾之鹼基可包括抗生物素蛋白且複數個可偵測部分各自包括生物素及可偵測標記；及/或一或多個經修飾之鹼基可包括生物素且複數個可偵測部分各自包括抗生物素蛋白及可偵測標記。
實施例（31）及（32）之步驟（a）可包含使HIV p24按以下次序與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於HIV p24之第一及第二偵測試劑。或者，步驟（a）可包含使HIV p24按以下次序與以下物質結合：（i）用於HIV p24之第一及第二偵測試劑；及（ii）表面上之捕捉試劑。再另外，步驟（a）可包含使HIV p24同時或基本上同時與以下物質結合：（i）表面上之捕捉試劑；及（ii）用於HIV p24之第一及第二偵測試劑。
實施例（31）及（32）之擴增子在探針延伸之後保持侷限於表面上。複合物可在延伸步驟之後保持與表面結合。舉例而言，擴增子在表面上之複合物之位置的10-100 μm內之位置處結合至錨定試劑。在一個特定實施例中，延伸探針在表面上之複合物之位置的小於100 μm、小於50 μm或更特定言之小於10 μm之位置處結合至錨定試劑。
實施例（31）及（32）之表面可包含粒子及/或多孔盤之孔。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包括複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同結合域上。表面可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同結合域上。若表面為盤之孔，則孔可包含複數個不同的結合域且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同結合域上。在特定實例中，捕捉試劑及錨定試劑在表面上之10-100 nm內。
再另外，表面可包含電極且量測步驟可包含向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。在此等實施例（（31）及（32））中，方法可進一步包含收集電極上之粒子及向電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。量測步驟可包含使擴增子與具有可偵測標記之偵測探針結合、量測可偵測標記及將量測值與樣品中分析物的量相關聯，其中偵測探針包括與擴增子之區域互補的核酸序列。可偵測標記係藉由量測光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。舉例而言，可偵測標記為ECL標記且量測步驟可包含量測ECL信號。偵測探針可具有多個ECL標記。偵測探針可經由探針核苷酸組分之3'端處之鍵與多重ECL標記部分連接。
實施例（33）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：（a）在足以形成包括與第一偵測試劑結合之分析物之分析物複合物的條件下濃縮樣品，其中第一偵測試劑連接至第一核酸探針；（b）將步驟（a）中形成之分析物複合物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；及（ii）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及第一及第二偵測試劑之複合物；（c）使用需要第一及第二探針鄰近之延伸方法來延伸第二探針，以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（d）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（e）量測與表面結合之延伸序列的量。濃縮步驟（a）可進一步包括（i）使包含分析物之樣品與固相接觸，該固相連接至與第一核酸探針之至少一部分互補的靶向劑，由此形成包括經由第一核酸探針與靶向劑之間的結合反應與固相結合之分析物的濃縮複合物；（ii）收集濃縮複合物；（iii）使樣品之未結合組分與濃縮複合物分離；及（iv）釋放濃縮複合物以使固相與分析物分離以形成分析物複合物。
實施例（34）：一種偵測樣品中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於分析物之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；（b）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；（c）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑；及（d）包含與第一核酸探針之至少一部分互補之靶向劑的固相。
實施例（35）：一種偵測樣品中之外泌體之方法，其包括：（a）將外泌體結合至：（i）包括用於外泌體之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；（ii）連接至第一核酸探針的用於外泌體之第一偵測試劑；及（iii）連接至第二核酸探針的用於外泌體之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括結合試劑、外泌體以及第一及第二偵測試劑之複合物；（b）使用需要第一及第二探針鄰近之延伸方法來延伸第二探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）量測與表面結合之延伸序列的量。
實施例（36）：一種偵測樣品中之所關注外泌體之套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包括：（a）包括（i）用於外泌體之捕捉試劑及（ii）包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；（b）連接至第一核酸探針的用於外泌體之第一偵測試劑；及（c）連接至第二核酸探針的用於外泌體之第二偵測試劑。
實施例（37）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；（ii）連接至第一核酸探針的用於分析物之第一偵測試劑；及（iii）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑，由此在表面上形成包括結合試劑、分析物以及第一及第二偵測試劑之複合物；（b）延伸第一及第二核酸探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）使用式I之經標記探針量測與表面結合之延伸序列的量：
Figure 02_image001
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，且n為0與5之間的整數。
實施例（38）：一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：將分析物結合至：（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；及（ii）連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑，由此在表面上形成包括結合試劑、分析物及偵測試劑之複合物；（b）延伸核酸探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列；（c）使錨定序列與錨定序列補體雜交；及（d）使用式I之經標記探針量測結合至表面之延伸序列的量。
在以上實施例（1）至（38）中之任一者中，錨定試劑在分析物與捕捉試劑結合之前、期間或之後連接至表面。在包括套組之實施例中，錨定試劑與表面分開提供且接著固定於表面上，其中捕捉試劑固定於表面上。在包括套組之實施例中，錨定試劑及捕捉試劑提供為固定於表面上。
以上實施例（1）至（38）中之任一者可包含式I之經標記探針：
Figure 02_image003
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數且n為0與5之間的整數。
以上實施例（1）至（38）中之任一者可包含式II之經標記探針：
Figure 02_image005
式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
Figure 02_image007
。
本文實施例中所述之方法中之任一者可包含量測電化學發光之方法，其包括：（a）在其中接近電極之複合物將發射電化學發光的條件下向電極施加電位，其中複合物包括本文提供之目標寡核苷酸及經標記探針，其中經標記探針包括與目標寡核苷酸互補之寡核苷酸；及（b）量測發射之電化學發光。
實施例（1）至（38）中之任一者中所述之核酸探針（例如連接至偵測試劑）可包括寡核苷酸，其中寡核苷酸之長度為14-24個核苷酸且包括14或15個5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO: 33）之連續核苷酸。在實施例中，本發明提供使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括使偵測試劑及核酸探針與異雙官能交聯劑在其中偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應且核酸與交聯劑之第二反應性基團反應以形成結合物的條件下接觸，其中異雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑的第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團，其中方法不包括在交聯劑與核酸探針反應之前純化偵測試劑及交聯劑之反應產物。
在實施例中，本發明提供一種使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括（a）使偵測試劑與異雙官能交聯劑在其中偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應以形成第一組合物的條件下接觸，其中異雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑的第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團；（b）使第一組合物與核酸探針在其中交聯劑中之第二反應性基團與核酸探針反應以形成結合物的條件下接觸，其中方法不包括在交聯劑與核酸探針反應之前純化偵測試劑及交聯劑之反應產物。
在實施例中，本發明提供一種使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之套組，其包括：（a）包括以下之異雙官能交聯劑：（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑之第一反應性基團；及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團；（b）能夠將結合物與未反應之核酸探針分離的第一尺寸分離裝置；及（c）核酸結合螢光團，其中螢光團之螢光強度在螢光團與核酸結合時增加。在實施例中，本發明提供一種使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括：（a）使偵測試劑與核酸探針反應以形成結合物；（b）使用尺寸分離裝置將結合物與未反應之核酸探針分離以形成純化結合物；（c）形成包括純化結合物及核酸結合螢光團之樣品的測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當螢光團與核酸結合時增加的螢光強度進行選擇；及（d）量測測試組合物之螢光以確定純化結合物中核酸探針之量。
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般熟習此項技術者通常理解之含義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包含複數且複數術語應包含單數。冠詞「一（a/an）」在本文中用於指一個（種）或多於一個（種）（亦即，至少一個（種））該冠詞之語法對象。舉例而言，「一個要素」意謂一個要素或超過一個要素。
如本文所使用，術語「約」用於指示值包含用於確定該值之裝置或方法之誤差的固有變化。
如本文所用，「在……之間」為包含範圍末端之範圍。舉例而言，x與y之間的數字明確包含數字x及y，以及x及y內之任何數字。
如本文所用，「套組」係指經提供或聚集以共同地用於例如產生組合物、製造裝置或進行方法的一組組分。套組可包含一或多種組分。套組之組分可以一個封裝或多個封裝提供，其中之各者可含有組分中之一或多者。套組之所列組分可轉而亦提供為單個物理部分或經組合以供套組使用之多個部分。舉例而言，套組之儀器組件可完全組裝地提供或以在使用前組裝之多個儀器部件形式提供。類似地，套組之液體試劑組分可提供為容器中之完整液體調配物、待組合以提供完整液體調配物之一或多種乾式試劑及一或多種液體稀釋劑或待組合以提供完整液體調配物之兩種或更多種液體溶液。如此項技術中已知，用於分析之套組組分由於具有不同儲存需求，例如4℃相對於-70℃之儲存溫度而通常分開運送及儲存。
在分析中量測之分析物或分析中所用之一類試劑的情況下，術語「複數種」意謂超過一種結構上及/或功能上不同的分析物或試劑（例如捕捉抗體A及捕捉抗體B），而非僅僅分析物或試劑之超過一個複本（例如捕捉抗體A及捕捉抗體A之另一複本）。舉例而言，術語「複數種固定抗原」意謂超過一種結構上或功能上不同的抗原經固定，且不描述存在僅一個單一抗原之多個複本的情況。然而，在此上下文中使用術語「複數種」不排除存在複數種分析物或試劑中之任一者之多個複本的可能性。舉例而言，複數種固定抗原可指包括抗原A之一或多個複本及抗原B之一或多個複本的固定抗原。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽（polypeptide）」以及複數「多肽（polypeptides）」，且係指由藉由醯胺鍵（亦即，肽鍵）線性連接之單體（胺基酸）構成的分子。術語「多肽」係指胺基酸之任何一或多條鏈，且不指產物之特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指胺基酸之一或多條鏈之任何其他術語均包含於「多肽」之定義內，且可使用術語「多肽」替代此等術語中之任一者或可與其互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包含但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基衍生化、蛋白水解分裂或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物來源或藉由重組技術製得，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包含化學合成。在多肽之情形下，「線性序列」或「序列」為多肽中在胺基至羧基末端方向上的胺基酸之順序，其中序列中彼此相鄰之殘基在多肽之一級結構中鄰接。
「結合試劑」或「結合物質」係指特徵為與另一物質（其可稱為「結合搭配物」）結合之能力的試劑或物質。本發明之結合試劑、結合物質及結合搭配物包含「抗原結合物質」，其為指代抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物、抗體變異體、工程改造抗體及其他以與抗體類似之方式結合至抗原之物質的術語。抗原結合物質包含包括抗體之至少一個重鏈或輕鏈互補決定區（CDR）的物質。抗原結合物質包含包括來自一或多種抗體之至少兩個CDR的物質。抗原結合物質包含包括來自一或多種抗體之至少三個CDR的物質。抗原結合物質包含包括來自一或多種抗體之至少四個CDR的物質。抗原結合物質包含包括來自一或多種抗體之至少五個CDR的物質。抗原結合物質包含包括來自一或多種抗體之至少六個CDR的物質。
衍生自抗體之抗原結合物質或其他抗原結合物質可包含諸如在抗體序列中添加、移除或置換一或多個抗體以改良該抗體針對其所期望目標之親和力及/或特異性（例如經由使用用於抗體之「親和力成熟」的確立方法），及/或改良試劑之其他特性（例如改良穩定性或減少樣品中之潛在干擾組分，諸如補體、類風濕因子或抗物種抗體之相互作用）。在一個實施例中，抗原結合物質為減少樣品之Fc結合組分之潛在干擾的抗體之Fab部分。在量測來自特定物種之樣品中之分析物的一個實施例中，抗原結合物質為經設計以匹配該物種之抗體類別的抗體修飾形式（例如小鼠抗體可經人類化以用於對人類樣品進行之分析，以避免來自通常存在於人類樣品中之人類抗小鼠抗體（亦即，靶向小鼠抗體之人類抗體）的干擾。
如本文所用，「人類」或「全人類」抗體包含具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體，且包含自人類免疫球蛋白文庫或自針對一或多種人類免疫球蛋白轉殖基因之動物分離且不表現內源免疫球蛋白之抗體，如下文及例如美國專利第5,939,598號中所描述。「人類」或「全人類」抗體亦包含包括至少重鏈可變域或至少重鏈及輕鏈可變域之抗體，其中可變域具有人類免疫球蛋白可變域之胺基酸序列。「人類化」抗體為來自其他物種之抗體，其恆定及構架序列已經修飾以嘗試匹配一類人類抗體，同時維持結合原始抗體之目標抗原的能力。
術語「抗體」及「免疫球蛋白」在本文中可互換使用。抗體或免疫球蛋白包括至少重鏈之可變域，且通常包括至少重鏈及輕鏈之可變域。脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構為相對充分理解的。參見例如，Harlow等人(1988) 《抗體：實驗室手冊（Antibodies: A Laboratory Manual）》 (第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
術語「免疫球蛋白」包括各種廣泛類別之多肽，其可以生物化學方式區分。本領域中熟習此項技術者應瞭解，由動物物種產生之重鏈可分類為不同類別，諸如γ、μ、α、δ或ε，且此等類別可進一步分為亞類（例如γ1-γ4）。此鏈之性質將抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等經充分表徵且已知賦予功能專門化。鑒於本發明，此等類別及同型中之每一者之經修飾形式可由熟習此項技術者容易地辨別，且因此在本發明之範疇內。所有免疫球蛋白類別顯然在本發明之範疇內。以下論述通常將針對免疫球蛋白之IgG類別。哺乳動物中產生之IgG的大部分形式包括分子量約為23,000道爾頓的兩條相同輕鏈多肽，及分子量為53,000-70,000的兩條相同重鏈多肽。四條鏈通常以「Y」組態藉由二硫鍵接合，其中輕鏈在「Y」之開口處開始支托重鏈且繼續貫穿可變區。精確分子量可在物種間及亞類間不同。一些物種，諸如駱駝科物種亦可產生無輕鏈之IgG形式。
輕鏈亦可以不同可分類形式，諸如κ （Vκ）或λ （Vλ）形式產生。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。一般而言，輕鏈及重鏈彼此共價鍵結，且兩條重鏈之「尾」部分藉由共價二硫鍵或非共價鍵彼此鍵結。在重鏈中，胺基酸序列自Y組態之分叉末端處的N端延行至各鏈之底部的C端。
輕鏈及重鏈均分為具有結構及功能同源性之區域。術語「恆定」及「可變」係在功能上使用。就此而言，應瞭解，輕鏈（Vκ或Vλ-統稱為「VL」）及重鏈（VH）部分之可變域均決定抗原識別及特異性。相反，輕鏈（CL）及重鏈（CH1、CH2或CH3）之恆定域賦予重要生物特性，諸如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似特性。按照慣例，恆定區域之編號隨著其距離抗體之抗原結合位點或胺基末端愈遠而增大。N端部分為可變區且C端部分為恆定區；CH3及CL域通常分別包括重鏈及輕鏈之羧基末端。
如上文所指出，可變區允許抗體選擇性識別及特異性結合抗原上之抗原決定基。亦即，抗體之VL域及VH域或此等可變域內之互補決定區（CDR）之子集組合形成界定三維抗原結合位點之可變區。此四級抗體結構形成存在於Y之各臂末端處的抗原結合位點。更特定言之，抗原結合位點通常由VH及VL鏈中之每一者上之三個CDR定義。如本文所用，術語HCDR1、HCDR2、HCDR3分別係指VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。同樣，如本文所用，術語LCDR1、LCDR2、LCDR3分別係指VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些情況下，例如某些衍生自駱駝科物種或基於駱駝科免疫球蛋白工程改造之免疫球蛋白，完整免疫球蛋白可僅由重鏈組成，不具有輕鏈。參見例如Hamers-Casterman等人, 《自然（Nature）》 363:446-448 (1993)。
在天然存在之抗體中，通常存在於各抗原結合域中之六個「互補決定區」或「CDR」為經特異性定位以形成抗原結合域的胺基酸之短、非連續序列，因為抗體在水性環境中假定其三維組態。抗原結合域中之胺基酸的其餘部分稱為「構架」區，顯示較少分子間變化性。構架區主要採用摺疊構形且CDR形成環，該等環連接β-摺疊結構且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分。因此，構架區用於形成骨架，該骨架藉由鏈間非共價相互作用提供CDR在正確方向上之定位。藉由定位之CDR形成的抗原結合域界定與免疫反應性抗原上之抗原決定基互補的表面。此互補表面促進抗體與其同源抗原決定基非共價結合。一般熟習此項技術者可容易地鑑別分別包括CDR及構架區之胺基酸的任何給定重鏈或輕鏈可變域，因為其已被精確定義（參見下文）。
在存在兩種或更多種在此項技術中所用及/或所接受之術語的定義之情況下，除非相反地明確陳述，否則如本文所用之術語的定義意欲包含所有此類含義。特定實例為使用術語「互補決定區」(「CDR」)來描述重鏈及輕鏈多肽之可變區內所見的非連續抗原組合位點。此區域已由Kabat等人 (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, 「免疫學感興趣的蛋白質之序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, Chothia及Lesk, 《分子生物學雜誌（J. Mol. Biol.）》 196:901-917 (1987)描述，且由Kunik等人, 《核酸研究（Nucl.Acids Res.）》 40:W521-W524 (2012)最近更新，該等文獻以引用的方式併入本文中，其中當彼此對照比較時，定義包含胺基酸殘基之重疊或亞群。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文中所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋特定CDR的確切殘基數目將視CDR之序列及尺寸而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定之情況下，本領域中熟習此項技術者可以常規方式判定哪些殘基包括特定CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變域序列編號系統。一般熟習此項技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變域序列，而不依賴於除序列本身以外的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, 「免疫學感興趣的蛋白質之序列」所闡述之編號系統。
Kunik等人, 《核酸研究》40:W521-W524 (2012)揭示一種在線工具Paratome，用於基於序列或結構來系統鑑別抗體中之抗原結合區。通常，基於Paratome之分析與Kabat編號匹配，但亦可包含與習知CDR相鄰的殘基。
本發明之抗體或抗原結合片段、其變異體或衍生物包含但不限於多株、單株、多特異性、人類、人類化、靈長類化、嵌合抗體、單鏈抗體、抗原決定基結合片段（例如Fab、Fab'及F(ab')2 、Fd、Fv、單鏈Fv（scFv）、二硫鍵連接的Fv（sdFv））、包括VL或VH域之片段、由Fab表現文庫產生之片段及抗個體基因型（抗Id）抗體。scFv構築體為此項技術中已知的且描述於例如美國專利第5,892,019號中。本發明之免疫球蛋白或抗體可為免疫球蛋白分子之任何類型IgG、IgE、IgD、IgA及IgY）、類別（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2等）或亞類。產生抗體及其他抗原結合物質之許多方法為此項技術中熟知的，且包含自B細胞培養物、自融合瘤細胞培養物、自培養物或經短暫或永久轉染之宿主細胞株、自細菌、自酵母、自植物細胞及自昆蟲細胞來產生。
如本文所用，術語「重鏈部分」包含衍生自免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列。包括重鏈部分之多肽包括以下中之至少一者：CH1域、鉸鏈（例如上、中及/或下鉸鏈區）域、CH2域、CH3域、或其變異體或片段。舉例而言，用於本發明之結合多肽可包括含有CH1域之多肽鏈；包括CH1域、鉸鏈域之至少一部分及CH2域之多肽鏈；包括CH1域及CH3域之多肽鏈；包括CH1域、鉸鏈域之至少一部分及CH3域之多肽鏈或包括CH1域、鉸鏈域之至少一部分、CH2域及CH3域之多肽鏈。在另一實施例中，本發明之多肽包括含有CH3域之多肽鏈。另外，用於本發明之結合多肽可缺少CH2域之至少一部分（例如CH2域之全部或部分）。如上文所闡述，一般熟習此項技術者應瞭解，此等域（例如重鏈部分）可經修飾以使其胺基酸序列與天然存在之免疫球蛋白分子不同。
在本文揭示之某些抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物中，多聚體之一條多肽鏈之重鏈部分與多聚體之第二多肽鏈上之重鏈部分相同。或者，本發明之含重鏈部分的單體不相同。舉例而言，各單體可包括不同目標結合位點，形成例如雙特異性抗體。
如本文所用，術語「輕鏈部分」包含衍生自免疫球蛋白輕鏈，例如κ或λ輕鏈之胺基酸序列。較佳地，輕鏈部分包括VL或CL域中之至少一者。
如上文所定義之「抗原結合物質」可關於其識別或特異性結合之物質的抗原決定基或部分來描述或指定。與抗體之抗原結合域特異性相互作用之目標多肽部分為「抗原決定基」或「抗原決定子」。目標多肽可包括單個抗原決定基，但通常包括至少兩個抗原決定基，且可包含任何數目之抗原決定基，其取決於抗原中尺寸、構形及類型。此外，應注意，目標多肽上之「抗原決定基」可為或可包含非多肽元件，例如抗原決定基可包含碳水化合物側鏈。
抗原結合物質之肽或多肽抗原決定基的最小尺寸被認為是約四至五個胺基酸。肽或多肽抗原決定基較佳含有至少七個，更佳至少九個且最佳至少約15至約30個胺基酸。由於CDR可識別呈三級形式之抗原肽或多肽，包括抗原決定基之胺基酸不必為連續的，且在一些情況下，甚至可不在相同肽鏈上。由本發明之抗原結合分子識別之肽或多肽抗原決定基可含有至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、更佳至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或約15至約30個連續或非連續胺基酸的序列。
「抗原」意謂能夠特異性或優先結合抗體結合物質，諸如抗體或其抗原結合片段的物質。
在抗體（及類似地，其他抗原結合物質）的情況下，「優先結合」意謂相比於抗體將與參考抗原決定基（其可為相關、類似、同源或相似抗原決定基）結合，其更容易與抗原決定基特異性結合。因此，「優先結合」於給定抗原決定基之抗體將更容易結合於彼抗原決定基而非參考抗原決定基，儘管此類抗體可與參考抗原決定基交叉反應。
在抗體（及類似地，其他抗原結合物質）的情況下，「特異性結合」意謂抗體經由其抗原結合域結合於抗原決定基，且結合需要抗原結合域與抗原決定基之間的互補性。根據此定義，當相對於隨機的無關抗原決定基，抗體經由其抗原結合域優先結合於一抗原決定基時，將抗體稱為「特異性結合」於彼抗原決定基。
作為非限制性實例，若在實驗條件（例如用於進行分析之條件）下，相對於結合於第二抗原決定基之量的結合於第一抗原決定基之量（表示為比率）為大於1、10、100、1,000或10,000，則可將抗體視為相對於第二抗原決定基優先結合第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若相對於抗體針對第二抗原決定基之平衡解離常數（KD ），結合於第一抗原決定基之KD （表示為比率）為小於1、0.1、0.01、0.001或0.0001，則可將抗體視為相對於第二抗原決定基優先結合第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若相對於抗體針對第二抗原決定基之結合速率常數（亦稱為結合速率或kon ），結合於第一抗原決定基之kon （表示為比率）為大於1、10、100、1,000或10,000，則可將抗體視為相對於第二抗原決定基優先結合第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若相對於抗體針對第二抗原決定基之解離速率常數（亦稱為解離速率或koff ），自第一抗原決定基解離之koff （表示為比率）為小於1、0.1、0.01、0.001或0.0001，則可將抗體視為相對於第二抗原決定基優先結合第一抗原決定基。
當比較兩種抗體對第一抗原決定基相對於第二抗原決定基之偏好時，對第一抗原決定基具有更強偏好之抗體可稱為更特異性針對第一抗原決定基。偏好強度可例如藉由在所選實驗條件下與兩個抗原決定基之結合量之比率、藉由KD 值之比率、藉由kon 值之比率及/或藉由koff 值之比率（此等比率如上一段中所述地確定）來確定。
一般而言，藉由使用高親和力及緩慢解離速率抗體，分析靈敏度及穩固性得以改良。在實施例中，本文揭示之抗體或其他抗原結合物質以小於或等於10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM、30 pM或10 pM之KD 結合目標抗原。在實施例中，本文揭示之抗體或其他抗原結合物質以小於或等於10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM、30 pM或10 pM之KD 結合目標多肽。在實施例中，本文揭示之抗體或其他抗原結合物質以小於或等於5×10-2 sec-1 、10-2 sec-1 、5×10-3 sec-1 或10-3 sec-1 之koff 與目標抗原解離。在實施例中，本文揭示之本發明之抗體或其他抗原結合物質以小於或等於5×10-4 sec-1 、10-4 sec-1 、5×10-5 sec-1 或10-5 sec-1 、5×10-6 sec-1 、10-6 sec-1 、5×10-7 sec-1 或10-7 sec-1 之koff 與目標多肽解離。
本發明之抗原結合物質可具有「多特異性」、雙特異性、三特異性或更大多特異性，意謂其同時識別及結合於一或多種不同抗原（例如蛋白質）上存在之兩種或更多種不同抗原決定基。因此，抗原結合物質為「單特異性」或「多特異性」，例如「雙特異性」係指與結合多肽進行反應之不同抗原決定基之數目。多特異性抗體可對目標之不同抗原決定基具有特異性，或可對目標多肽以及異源抗原決定基，諸如異源多肽具有特異性。
如先前所指示，各種免疫球蛋白類別之恆定區之次單位結構及三維組態為熟知的。如本文所用，術語「VH域」包含免疫球蛋白重鏈之胺基末端可變域，且術語「CH1域」包含免疫球蛋白重鏈之第一（大部分胺基末端）恆定區域。CH1域與VH域相鄰，且在免疫球蛋白重鏈之鉸鏈區的胺基末端。
如本文所用，術語「鉸鏈區」包含將CH1域與CH2域接合之重鏈部分。此鉸鏈區包括大約25個殘基且為柔性的，因此允許兩個N端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可細分成三個不同域：上、中及下鉸鏈域（Roux等人, 《免疫學雜誌（J. Immunol.）》161:4083 (1998)）。
如本文所用，術語「二硫鍵」包含在兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包括可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋之硫醇基。在大部分天然存在之IgG中，CH1及CL區係藉由二硫鍵連接且兩條重鏈係藉由兩個二硫鍵在對應於使用Kabat編號系統之239及242之位置（位置226或229，EU編號系統）處連接。
如本文所用，術語「連接（linked）」、「融合（fused/fusion）」可互換使用。此等術語係指藉由包含化學結合或重組手段之任何手段使兩種或更多種元件或組分接合在一起。「框內融合」係指兩個或多於兩個聚核苷酸開放閱讀框架（ORF）以維持原始ORF之正確轉譯閱讀框架之方式接合以形成連續較長ORF。因此，重組融合蛋白為單一蛋白質，其含有兩個或更多個對應於由原始ORF編碼之多肽的區段（該等區段在自然界中通常不如此接合）。雖然閱讀框架因此在整個融合區段中連續，但該等區段可藉由例如框內連接序列在物理或空間上分離。舉例而言，編碼免疫球蛋白可變區之CDR的聚核苷酸可在框內融合，但藉由編碼至少一個免疫球蛋白構架區或額外CDR區之聚核苷酸分離，只要「融合」CDR共轉譯為連續多肽之一部分即可。
如本文所用之術語「寡核苷酸」係指諸如DNA或RNA之核酸之短聚合物。在實施例中，寡核苷酸之長度為約5至約150個核苷酸。寡核苷酸可經設計以與DNA或RNA序列特異性雜交，例如作為偵測與寡核苷酸互補之特定序列的探針。寡核苷酸可為單股或雙股。本文所述之寡核苷酸可藉由任何方式產生，包含化學合成。
術語「寡核苷酸」可包含包括非天然存在之化學結構的結構類似物。在實施例中，寡核苷酸包括在其5'末端或3'末端處之修飾、內部修飾或其組合。修飾核苷酸及/或核酸之方法為本領域中已知的。寡核苷酸修飾之實例包含但不限於可用於將寡核苷酸連接至另一物質或表面之連接修飾；螢光團及螢光淬滅劑；經修飾之鹼基；磷酸化修飾，例如當寡核苷酸用作連接酶受質時；間隔子，例如以在寡核苷酸中在核酸序列與反應性官能基之間產生距離；及硫代磷酸酯鍵，例如以增加寡核苷酸對核酸酶降解之抗性。例示性修飾提供於下表A中。表 A. 寡核苷酸修飾
修飾類型 實例
胺基修飾劑 5'胺基修飾劑C6（5AmMC6）、5'胺基修飾劑C12（5AmMC12）、胺基修飾劑C6 dT（5AmMC6T、iAmMC6T、3AmMC6T）、3'胺基修飾劑（3AmMO）、UNILINK™胺基修飾劑（5UniAmM、iUniAmM）
生物素標記 生物素（5Biosg、3Bio）、生物素-疊氮化物（5BioK、iBiodUK）、生物素dT（5BiodT、iBiodT、3BiodT）、生物素-TEG（5BioTEG、3BioTEG）、5'雙生物素（52-Bio）、5'可光裂解生物素（5PCBio）、去硫生物素-TEG（5deSBioTEG、ideSBioTEG、3deSBioTEG）
硫醇 3'硫醇修飾劑C3 S-S（3ThioMC3-D）、二硫醇（5DTPA、iDTPA、3DTPA）、5'硫醇修飾劑C6 S-S（5ThioMC6-D）
炔烴 5'己炔基（5Hexynyl）、5-辛二炔基（55OctdU、i5OctdU、35OctdU）
間隔子 C3間隔子（5SpC3、iSpC3、3SpC3）、己二醇（3C6）、1'2'-二脫氧核糖dSpacer（5dSp、idSp、3dSp）、可光裂解間隔子（5SpPC、iSpPC）、間隔子9（5Sp9、iSp9、3Sp9）、間隔子18（5Sp18、iSp18、3Sp18）
其他 5' ACRYDITE™（5Acryd）、5'腺苷醯化（5rApp）、疊氮化物NHS酯（5AzideN、iAzideN、3AzideN）、3'膽固醇-TEG（3CholTEG）、地高辛NHS酯（5DigN、3DigN）、5' I-連接子（5ILink12）、磷酸化（5Phos、3Phos）、6-FAM疊氮化物（56-FAMK、i6-FAMK）、6-FAM NHS酯（56-FAMN、i6-FAMN）、5-TAMRA疊氮化物（55-TAMK、i5-TAMK）
在實施例中，修飾包括生物素、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、胺基、硫醇基、醛基、醯肼基、疊氮基、炔基、順丁烯二醯亞胺基及/或碘乙醯胺基。
在一個實例中，核苷酸及/或核酸可包含以下化學修飾：將其與另一物質（諸如標記）連接，或提供可與另一物質（諸如標記）連接之反應性官能基，例如經由使用胺或硫醇修飾之核苷酸鹼基、磷酸鹽或糖。術語「反應性官能基」係指可經歷另一化學反應，例如以與另一官能基形成共價鍵之原子或一組相關原子。反應性官能基之實例包含但不限於胺基、硫醇基、羥基及羰基。在一個態樣中，反應性官能基包含反應性硫醇基。可經由此等化學修飾連接至核苷酸或核酸之標記包含但不限於可偵測部分，諸如生物素、半抗原、螢光團及電化學發光（ECL）標記。
在另一態樣中，寡核苷酸中之核苷酸可經修飾以防止其所併入之核酸鏈的酶促或化學延伸，例如藉由用二去氧核糖置換核糖或去氧核糖基團。在另一實例中，將核苷酸鹼基（例如糖及/或磷酸基）連接在一起之主鏈組分可經修飾或置換，例如經由使用肽核酸（PNA）或藉由併入核糖類似物，諸如在2'-O-甲基取代之RNA、鎖核酸、橋接核酸及嗎啉基核酸中發現之彼等。此等「主鏈」類似物可存在於核酸及/或寡核苷酸中之一個、一些或所有主鏈連接中，且可提供某些優勢，諸如具有改良之結合穩定性及/或與核酸酶之連接穩定性的雜交產物。在核苷酸及核酸結構類似物之另一實例中，可包含非天然核苷酸鹼基。非天然（亦稱為「非典型」鹼基）可與天然（典型）鹼基雜交或其可與另一非天然鹼基雜交。
在核酸之情況下，「探針」通常係指包含可與另一核酸序列互補之序列的寡核苷酸（通常為5至50個鹼基）。在一些應用中，與目標序列中之互補區域雜交的探針可使得探針能夠藉由聚合酶進行引子延伸，充當目標序列上之相鄰單股區域的複製起點（在此類狀況下，探針亦可稱為「引子」）。
如本文所用之「核酸探針」包含如下之寡核苷酸：（i）經一或多個反應性部分修飾，該一或多個反應性部分可用於使寡核苷酸與另一物質反應且因此將其連接，或（ii）連接至另一物質（例如經由如第（i）項中所述之反應）。在實施例中，核酸探針連接至偵測試劑。在實施例中，核酸探針連接至多肽。在實施例中，核酸探針連接至抗體或其他抗原結合物質。在實施例中，反應性部分為反應性官能基。在實施例中，反應性官能基為烯烴、張力烯烴、炔烴、鹵化物、醇、硫醇、胺、磷酸鹽、醛、酮、羧酸、羧酸鹽、醯胺、酯、硫酯、醯基磷酸鹽、酸鹵化物、腈、酸酐、肼、四嗪或疊氮化物。在實施例中，反應性部分為結合試劑-結合搭配物對之成員，例如生物素或抗生蛋白鏈菌素。在實施例中，核酸探針包括與模板寡核苷酸互補之序列以用於擴增。在實施例中，核酸探針與環狀模板寡核苷酸結合以用於環狀模板寡核苷酸之滾環擴增（RCA）。在實施例中，RCA產生延伸序列。在實施例中，核酸探針為用於RCA之引子。
「經標記探針」係指包括寡核苷酸及可偵測部分（亦稱為「標記」）之化合物。可偵測部分（或標記）係指具有可偵測物理特性或能夠使化學基團或部分展現可偵測物理特性之化學基團或部分，包含例如催化受質轉化為可偵測產物之酶。標記可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學、化學或其他方法來偵測。標記之實例包含但不限於放射性同位素、酶、受質、螢光分子、化學發光部分、電化學發光部分、磁性粒子及生物發光部分。在另一態樣中，標記為作為結合對之成員的化合物，其中結合對之第一成員（其可稱為「主要結合試劑」）附著於受質，力圖寡核苷酸，且結合對之另一成員（其可稱為「次要結合試劑」）具有可偵測物理特性。結合對之非限制性實例包含生物素及抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白；互補寡核苷酸；及抗體/抗原結合對。在實施例中，「經標記探針」包括寡核苷酸及電化學發光部分。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括本文所述之方法之延伸序列的補體。在實施例中，經標記探針結合於延伸序列，且可偵測標記用以使得能夠量測延伸序列之量。在本文所述之方法之實施例中，量測經標記探針（亦即延伸序列之量）確定樣品中分析物之量。
「互補」係指例如根據沃森-克里克（Watson-Crick）鹼基配對模型，藉由形成氫鍵而彼此結合（或「雜交」）的核酸分子或核酸分子序列。舉例而言，雜交可出現於兩個互補DNA分子之間（DNA-DNA雜交）、兩個RNA分子之間（RNA-RNA雜交）或互補DNA與RNA分子之間（DNA-RNA雜交）。雜交可出現於與較長核苷酸序列之一部分互補的短核苷酸序列之間。雜交可出現於不具有100%「序列互補性」之序列（亦即，其中基於諸如沃森-克里克鹼基配對模型之鹼基配對模型，小於100%之核苷酸比對的序列）之間，儘管相比於具有較大序列互補性之序列，具有較小序列互補性之序列較不穩定且較不可能雜交。在一個態樣中，基於沃森-克里克模型，補體之核苷酸具有100%序列互補性。在另一態樣中，基於沃森-克里克模型，補體之核苷酸具有至少約90%、95%、97%或99%序列互補性。
若兩個核酸能夠雜交或已雜交，則其分別為「可雜交的」或「雜交的」。兩個補體是否雜交可取決於雜交條件之嚴格性，其可取決於諸如溫度、溶劑、離子強度及其他參數之條件而變化（產生嚴格雜交條件之方法已為所熟知且例示於Sambrook等人, 《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual ）》第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)，尤其是其中的第11章及表11.1中）。可選擇雜交條件之嚴格性以在其他潛在交叉反應或干擾序列存在下選擇性形成或維持兩個互補核酸序列之所期望雜交產物。嚴格條件為序列依賴性的，通常較長補體在比較短補體更高的溫度下特異性雜交。一般而言，對於在界定離子強度、化學變性劑濃度、pH及雜交搭配物濃度下之特定核苷酸序列，嚴格雜交條件比熱熔點（Tm ）（亦即，50%之序列與基本上補體雜交之溫度）低約5℃至約10℃。一般而言，與具有較低百分比之G及C鹼基之核苷酸序列相比，具有較高百分比之G及C鹼基之核苷酸序列在更嚴格條件下雜交。一般而言，可藉由增加溫度、增加pH、降低離子強度及/或增加化學核酸變性劑（諸如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲亞碸、乙二醇、丙二醇及碳酸伸乙酯）濃度來增加嚴格性。嚴格雜交條件通常包含小於約1 M、500 mM、200 mM、100 mM或50 mM之鹽濃度或離子強度；高於約20℃、30℃、40℃、60℃或80℃之雜交溫度；及高於約10%、20%、30%、40%或50%之化學變性劑濃度。由於許多因素可影響雜交嚴格性，因此參數之組合可能比任何單獨參數之絕對值更重要。
例示性雜交條件包含緩衝溶液（例如磷酸鹽、tris或HEPES緩衝溶液，具有約20至200 mM緩衝組分），其在約6.5至8.5之pH下，且離子強度為約20至200 mM，在約15至40℃之溫度下。舉例而言，緩衝液可包含濃度為約10 mM至約1 M、約20 mM至約500 mM、約30 mM至約100 mM、約40 mM至約80 mM或約50 mM之鹽。例示性鹽包含NaCl、KCl、(NH4 )2 SO4 、Na2 SO4 及CH3 COONH4 。一個特定實例為在室溫（約18至25℃）下之50 M Tris-HCl，pH 7.4。另一特定實例為在22℃至37℃（或約27℃）下之66 mM乙酸鉀、50 mM氯化鉀、10 mM乙酸鎂、33 mM Tris緩衝液，pH 8.2。
在核酸序列或胺基酸序列之情況下，術語「序列一致性」或「一致性%」係指當在指定比較窗口內比對序列時，所比較序列中相同之殘基的百分比。在一些實施例中，僅比對兩個或更多個序列之特定部分以確定序列一致性。在一些實施例中，僅比對兩個或更多個序列之特定域以確定序列類似性。比較窗口可為至少10至超過1000個殘基、至少20至約1000個殘基或至少50至500個殘基之片段，其中序列可經比對及比較。用於確定序列一致性之比對方法為熟知的且可使用公開可用的資料庫（諸如BLAST）進行。當參考胺基酸序列時，「一致性百分比」或「一致性%」可藉由此項技術中已知之方法來確定。舉例而言，在一些實施例中，兩個胺基酸序列之「一致性百分比」係使用如在Karlin及Altschul, 《美國國家科學院院刊（Proceedings of the National Academy of Sciences USA ）》 90: 5873-5877 (1993)中修改的Karlin及Altschul, 《美國國家科學院院刊》 87: 2264-2268 (1990)之演算法確定。此類演算法被併入至BLAST程式中，例如BLAST+或NBLAST及XBLAST程式，其描述於Altschul等人, 《分子生物學雜誌（Journal of Molecular Biology ）》, 215: 403-410 (1990)中。BLAST蛋白質檢索可用諸如XBLAST程式之程式、評分=50、字長=3進行，以獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。當兩個序列之間存在空隙時，可如Altschul等人, 《核酸研究》 25(17): 3389-3402 (1997)中所述地利用Gapped BLAST。當利用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式（例如XBLAST及NBLAST）之預設參數。
在一些實施例中，多肽或核酸分子分別與參考多肽或核酸分子（或參考多肽或核酸分子之片段）具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。在一些實施例中，多肽或核酸分子分別與參考多肽或核酸分子（或參考多肽或核酸分子之片段）具有約70%、至少約70%、約75%、至少約75%、約80%、至少約80%、約85%、至少約85%、約90%、至少約90%、約95%、至少約95%、約97%、至少約97%、約98%、至少約98%、約99%、至少約99%或約100%序列一致性。
當兩個核酸含有補體時發生雜交，儘管取決於雜交之嚴格性，鹼基之間的錯配為可能的。在實施例中，能夠與第二序列之補體雜交之序列與第二序列基本上類似。在實施例中，能夠與第二序列之補體雜交之序列與第二序列具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。
本發明包含免疫分析方法，其包括（i）錨定在分析中所用之目標分析物與一或多種分析物結合試劑之間形成的偵測複合物；及/或（ii）放大來自經標記偵測複合物之信號。錨定可用於使涉及低結合親和力相互作用及/或高分子量標記或標記位點之複合物穩定。可藉由將延伸探針連接至含有多個標記或偵測標記位點之結合複合物，從而對於每一個別偵測複合物放大可偵測信號來達成信號放大。在一較佳實施例中，方法包含將包含多個標記或偵測標記位點之延伸探針連接至偵測複合物，及將複合物錨定至表面以確保複合物保留於表面上。此改良之分析方法可用於偵測極低數目之結合事件，甚至是個別分析物-結合試劑複合物。基本方法不限於免疫分析且可用於使用其他類別之結合試劑來進行結合分析。
在實施例中，本發明提供使用表面結合錨定試劑之結合分析，以將包含所關注分析物之偵測複合物黏附至表面且使偵測複合物穩定。此方法可用於克服形成偵測複合物之試劑之間的低結合親和力及/或防止複合物在後續處理之前自表面解離。在圖1（a）中說明了在結合分析中使用錨定試劑。表面（101）包含結合分析物A之捕捉試劑（102），及錨定試劑（103）。在一或多個步驟中，分析物結合至捕捉試劑及亦結合分析物之偵測試劑（104），其中偵測試劑連接至核酸探針（105）。分析物可同時或基本上同時結合至捕捉試劑及偵測試劑，或分析物可依序（以任一次序）結合至捕捉試劑及偵測試劑中之每一者。因此，在表面上形成包含捕捉試劑、分析物及偵測試劑之複合物（106）。探針經延伸以形成延伸序列（107），其包含結合錨定試劑之錨定區。延伸序列結合至錨定試劑且量測與表面結合之延伸序列的量。
結合分析領域之熟練技術人員將易於瞭解可用於本發明方法中之捕捉試劑及伴隨結合搭配物之範疇。此類對之非限制性清單包含（以任一次序）受體/配位體對、抗體/抗原、天然或合成受體/配位體對、半抗原/抗體對、抗原/抗體對、抗原決定基/抗體對、模擬抗原決定基/抗體對、適體/目標分子對、雜交搭配物及嵌入劑/目標分子對。在一個實施例中，結合分析採用抗體或其他受體蛋白作為用於所關注分析物之捕捉試劑及/或偵測試劑。術語「抗體」包含完整抗體分子（包含藉由抗體次單位之活體外再結合組裝的雜交抗體）、抗體片段及包括抗體之抗原結合域的重組蛋白構築體（如例如Porter, R. R.及Weir, R. C. 《細胞生理學雜誌（J. Cell Physiol. ）》, 67 (Suppl); 51-64 (1966)及Hochman, 1.Inbar, D.及Givol, D. 《生物化學（Biochemistry ）》 12: 1130 (1973)中所述），以及已經化學修飾（例如藉由引入可偵測標記）之抗體構築體。
同樣，錨定試劑及對應錨定成員或區域可包含任何適合之結合對，例如受體/配位體對、抗體/抗原、天然或合成受體/配位體對、半抗原/抗體對、抗原/抗體對、抗原決定基/抗體對、模擬抗原決定基/抗體對、適體/目標分子對、雜交搭配物、嵌入劑/目標分子對，及使用由靜電電荷結合之表面及錨定試劑。舉例而言，錨定試劑可為寡核苷酸序列、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且對應錨定區相應地包含互補寡核苷酸序列、適體配位體、適體、抗原、抗體、受體、配位體或抗體。在一個特定實施例中，錨定區為寡核苷酸序列且錨定試劑包括DNA結合蛋白。或者，若錨定區為雙股寡核苷酸序列，則錨定試劑可包含嵌入劑。在另一實施例中，錨定區可包含一或多個經修飾之寡核苷酸鹼基且對應錨定試劑包含與錨定區上之經修飾之鹼基結合的一或多個部分。舉例而言，經修飾之鹼基可包含半抗原或配位體且對應錨定試劑包含分別對半抗原或配位體具有特異性之一或多個抗體或配位體。此外，錨定區可包含複數個可用於偵測偵測複合物之經標記核苷酸鹼基。
在圖1（b）中描繪之一特定實施例中，表面結合錨定試劑包含用於將偵測複合物錨定至表面的寡核苷酸。錨定寡核苷酸序列與連接至偵測複合物之互補寡核苷酸序列結合。在此實施例中，表面（108）包含結合分析物A之捕捉試劑（109），及包括錨定寡核苷酸序列（111）之錨定試劑（110）。在一或多個步驟中，分析物結合至捕捉試劑及亦結合分析物之偵測試劑（112），其中偵測試劑連接至核酸探針（113）。如參看圖1（a）在上文所述，分析物可同時或基本上同時結合至捕捉試劑及偵測試劑，或分析物可依序（以任一次序）結合至捕捉試劑及偵測試劑中之每一者。因此，在表面上形成包含結合試劑、分析物及偵測試劑之複合物（114）。探針經延伸以形成延伸序列（115），其包含與錨定序列互補之錨定序列補體。錨定序列與錨定序列補體雜交且量測與表面結合之延伸序列的量。延伸序列亦可包含偵測序列，在此情況下，可添加與偵測序列互補之偵測探針且與延伸序列結合，且量測標記以確定表面上之延伸序列的量。
圖1（b）（其中錨定試劑用於將偵測複合物黏附至表面，且附著於偵測複合物之探針經延伸以產生與錨定試劑結合之延伸區）中描繪之方法之特定實施例進一步包括使偵測試劑上之核酸探針與以下各者結合：（i）環狀寡核苷酸，其接著進行滾環擴增以產生與錨定試劑結合之擴增子，或（ii）線性寡核苷酸，其末端結合至核酸探針且經連接以形成接著進行滾環擴增以產生與錨定試劑結合之擴增子的環狀寡核苷酸。表面包含捕捉試劑及錨定試劑。在一或多個步驟中，分析物結合至捕捉試劑、包括核酸探針之偵測試劑，由此在表面上形成偵測複合物。偵測複合物與以下各者接觸：（i）包括與核酸探針互補之序列的環狀寡核苷酸，或（ii）具有與核酸探針之不重疊區域之第一末端序列及第二末端序列的線性寡核苷酸。環狀或線性寡核苷酸與核酸探針雜交，且若使用線性寡核苷酸，則將線性寡核苷酸之末端序列連接以形成與核酸探針雜交之環狀目標序列。藉由滾環雜交使核酸探針延伸以產生包括與錨定試劑結合之結合試劑的延伸序列，且量測與表面結合之延伸序列的量。延伸序列亦可包含一或多個與經標記偵測探針互補之偵測序列，該等經標記偵測探針與擴增子雜交且用於量測與表面結合之擴增子的量。在一替代實施例中，延伸方法將經標記核苷酸鹼基併入至延伸序列中以用於直接偵測表面上之擴增子，而不添加一或多個與擴增子互補之經標記探針。可藉由併入至來自錨定物及/或偵測探針之環狀或線性寡核苷酸序列中來達成產生與錨定寡核苷酸及/或偵測探針之序列互補的延伸序列。
偵測複合物可包含一或多種偵測試劑，例如以增強分析針對分析物之特異性。若舉例而言，分析經設計以在偵測試劑中之每一者鄰近分析物時發射可偵測信號，或若可區分來自結合至分析物之單種偵測試劑的信號與自結合至分析物之多種偵測試劑發射的信號，則使用多鐘偵測試劑可增強分析之特異性。此類分析之一個實施例在圖1（c）中示出。表面（116）包含結合分析物A之捕捉試劑（117）及包含錨定寡核苷酸序列（119）之錨定試劑（118）。在一或多個步驟中，分析物結合至捕捉試劑及結合分析物之兩種（或更多種）偵測試劑（分別為120及121）中之每一者，其中第一及第二偵測試劑中之每一者連接至核酸探針（122及123，分別為第一及第二核酸探針）。分析物可同時或基本上同時，或以依序、逐步方式結合至捕捉試劑及偵測試劑。因此，在表面上形成包含捕捉試劑、分析物及第一及第二偵測試劑之複合物（124）。使用需要第一及第二探針彼此接近之延伸方法，第一探針經延伸以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列（125）。在倒數第二步中，錨定序列與錨定序列補體雜交且量測與表面結合之延伸序列的量。
圖1（c）中描繪之方法之特定實施例顯示於圖2（a）中，其中錨定試劑用於將偵測複合物黏附至表面，且連接至偵測複合物之探針經延伸以產生與錨定試劑結合之延伸區。在此實施例中，使用結合至鄰近探針之兩種偵測試劑來偵測複合物。該方法進一步包括將偵測試劑與連接序列接合，該連接序列接著經連接以形成環狀目標序列，及進行滾環擴增以產生與錨定試劑結合之擴增子。表面（201）包含捕捉試劑（202）及錨定試劑（203）。在一或多個步驟中，分析物結合至捕捉試劑、包括第一鄰近探針（205）之第一偵測試劑（204）及包括第二鄰近探針（207）之第二偵測試劑（206），從而在表面上形成偵測複合物（208）。偵測複合物與兩個連接序列（209a及209b）接觸，該兩個連接序列各自包含與第一鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列及與第二鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列。連接序列與第一及第二鄰近探針雜交，且將連接寡核苷酸之末端序列連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列（210）。藉由滾環雜交使第二鄰近探針延伸以產生包括與錨定試劑結合之結合試劑的擴增子，且量測與表面結合之擴增子的量。第一鄰近探針可經封端或以其他方式經修飾以防止第一探針延伸。（在一替代實施例中，第一鄰近探針經延伸且第二鄰近探針可經封端或以其他方式經修飾以防止延伸）。在圖2（a）中所描繪之實施例中，擴增子亦包含兩個或更多個與經標記偵測探針互補之偵測序列，該等經標記偵測探針與擴增子雜交且用於量測與表面結合之擴增子的量。在一替代實施例（未描繪於圖2（a）中）中，延伸方法將經標記核苷酸鹼基併入至擴增子中，用於在不添加一或多個與擴增子互補之經標記探針的情況下直接偵測表面上之擴增子。圖2（b）為顯示第一及第二連接寡核苷酸（分別為209a及209b）之連接序列組分的示意圖，其中第一連接子之第一端（C1(E1) ）及第二連接子之第一端（C2(E1) ）與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補，且第一連接子之第二端（C1(E2) ）及第二連接子之第二端（C2(E2) ）與第二鄰近探針之兩個不重疊區域互補。第一及第二連接子與第一及第二鄰近探針雜交，且第一及第二連接子經連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列。
圖2（c）顯示連接子之替代實施例。連接序列211包含與第二鄰近探針互補之內部序列（CIS ）及與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列（分別為CE1 及CE2 ）。在此實施例中，僅需要一個連接事件以形成用於滾環擴增之環狀目標序列（亦即，與第一鄰近探針雜交之末端CE1 及CE2 的連接），然而，由於引發/延伸來自第二鄰近探針，因而維持對於兩個鄰近探針之鄰近度的需求。較佳地，第一鄰近探針經封端或以其他方式經修飾以防止第一探針延伸。
此後，藉由環狀目標序列之滾環擴增延伸第二鄰近探針，以產生包括與錨定試劑結合之結合區的擴增子，且量測與表面結合之擴增子的量。
可藉由熟習此項技術者已知之方法設計第一及第二鄰近探針之序列。舉例而言，探針中之每一者之長度約為20-50個鹼基，較佳長度為25-40個鹼基，且最佳長度為約30-35個鹼基。第一及第二鄰近探針亦包含與在如本文所述之方法中所用之一或多個連接序列或其部分互補的序列。在一實施例中，偵測複合物與兩個連接序列（209a及209b）接觸，該兩個連接序列各自包含與第一鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列及與第二鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列。因此，在此實施例中，第一及第二鄰近探針各自包含與連接子之末端序列互補的不重疊區域。或者，僅可使用一個連接子且連接序列（211）包含與第二鄰近探針互補之內部序列（CIS ）及與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列（分別為CE1 及CE2 ）。因此，在此實施例中，第一鄰近探針包含與連接子之兩個末端序列（分別為CE1 及CE2 ）互補的不重疊區域，且第二鄰近探針包含與連接子之內部序列（CIS ）互補的序列。第一鄰近探針可經封端或以其他方式經修飾以防止第一探針延伸。（在一替代實施例中，第一鄰近探針經延伸且第二鄰近探針可經封端或以其他方式經修飾以防止延伸）。
因此，圖1至圖2中所說明之實施例展示結合分析可經修飾以併入錨定試劑及/或來自偵測複合物之信號可經放大。在一較佳實施例中，在結合分析中採用錨定試劑及信號放大方法。在包含使用錨定試劑之實施例中，表面上存在之錨定試劑的濃度為0.2-200 μg/mL，特定言之1.0 -50 μg/mL，且更特定言之3.0-10 μg/mL。或者，僅一種或另一種方法可用於達成增強之結合分析。因此，本發明包含使用如圖1-2中所述之信號放大方法的分析，其中省去錨定試劑。
在其中錨定試劑包含直接或間接結合（例如經由結合反應）至表面之錨定序列之彼等實施例中，可採用此項技術中確立的用於固定寡核苷酸之方法來產生錨定試劑，包含共價及非共價連接方法。錨定試劑可直接固定於固相上，或其可經由次要結合試劑，諸如如下所述之靶向試劑間接固定。舉例而言，錨定試劑可與靶向試劑連接或包括靶向試劑，該靶向試劑與固相上之固定靶向試劑補體結合。靶向試劑與其補體之結合可為直接的（例如靶向試劑可為抗生蛋白鏈菌素且補體可為生物素）或經由橋接劑間接的（例如靶向試劑及補體可為生物素，且橋接試劑可為多價生物素結合受體，諸如抗生蛋白鏈菌素）。在一個實施例中，靶向劑及其補體包括第一寡核苷酸及互補寡核苷酸、受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對、雜交搭配物或嵌入劑-目標分子對。選擇用於超過一種分析物之多重分析中所用之靶向劑及補體，使得與用於藉由該分析量測之分析物之捕捉試劑或偵測試劑相關的靶向劑及補體基本上不對與用於藉由該分析量測之其他分析物之捕捉試劑或偵測試劑相關之靶向劑及補體具有交叉反應性。舉例而言，結合試劑與其相關結合域之結合（經由其相關靶向劑及靶向劑補體）應大幅超過其與與其他分析物相關之結合域的結合（且呈現不同靶向劑補體）。較佳地，相對於與恰當結合域之結合，用於將用於分析物之捕捉試劑或偵測試劑與與其他分析物相關之結合域結合之交叉反應為＜1%，更佳為＜0.1%且更佳為＜0.01%。在一較佳實施例中，靶向劑/靶向劑補體包括一對包含補體之寡核苷酸，且靶向劑及其補體在足以使靶向劑與其補體雜交的條件下接觸。
當使用靶向劑時，關於分析方法中所用之錨定試劑何時固定於固相上存在一些靈活性。在一個實施例中，經由靶向劑-靶向劑補體相互作用將錨定試劑預固定於固相上提供給使用者。在另一實施例中，與靶向劑連接之錨定試劑及支撐固定之靶向劑補體之固相作為獨立組分提供。分析方法因此進一步包括藉由將靶向劑與其補體結合（直接或經由使用橋接劑）而將錨定試劑固定於固相上之步驟。此步驟可在與形成偵測複合物相關之步驟之前、與其同時或在其之後進行。
在一個實施例中，錨定試劑包括連接或以其他方式結合至錨定序列之蛋白質。在此實施例中，可使用可固定於表面上（共價或非共價）且經錨定寡核苷酸修飾之任何蛋白質。非限制性實例包含抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或牛血清白蛋白（BSA）。在一較佳實施例中，錨定試劑包括BSA。蛋白質可經錨定寡核苷酸修飾且使用已知方法（例如如圖3中所說明），使用磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯（磺基-SMCC），一種公認的異雙官能交聯劑與表面連接。SMCC之N-羥基丁二醯亞胺（NHS）基團與牛血清白蛋白（BSA）之反應用硫醇反應性順丁烯二醯亞胺基團標記BSA。順丁烯二醯亞胺基團轉而與經硫醇修飾之寡核苷酸反應，以形成經由穩定硫醚鍵連接之BSA-寡核苷酸結合物。在一個特定實例中，藉由在石墨碳表面，較佳網版印刷碳油墨電極上印刷一系列BSA-寡核苷酸結合物而形成陣列。或者，若蛋白質為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，則錨定序列可與生物素連接且經由生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用接合至固定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。
與錨定試劑連接之錨定寡核苷酸可為將與在延伸方法期間產生之延伸序列（或擴增子）雜交的任何序列。錨定寡核苷酸亦可包括非互補區域（例如poly(A)序列），其用作表面與互補（雜交）區域之間的連接序列，以使互補區延伸遠離表面。在一個實施例中，雜交序列選擇為不與結合於鄰近或偵測探針相關之擴增子區域（「惰性」區域）。在更特定實施例中，單獨或與例如長度為至多30個核苷酸之poly(A)臂組合包含與擴增子惰性區域之全長互補的雜交序列（較佳地，長度為約25個核苷酸）。較佳地，錨定寡核苷酸係選自：（i）（擴增子惰性區域之全長補體，長度為25個核苷酸）-（20個核苷酸之poly(A)臂）；或（ii）（擴增子惰性區域之一部分的補體，長度為15個核苷酸）-（30個核苷酸之poly(A)臂）。
在一個實施例中，進行鄰近連接擴增（PLA）以延伸第二鄰近探針。如參看圖2（a）-（c）在上文所述，包括兩個鄰近探針之複合物與一或多個連接寡核苷酸（209a-209b或211）接觸，且雜交連接序列之連接形成接著用於藉由環之滾環擴增（RCA）延伸第二鄰近探針的環狀寡核苷酸。用於鄰近連接擴增之適合之探針設計及擴增條件為此項技術中充分確立的。本發明之獨特態樣為在連接子中之一者中包含與錨定試劑中所用相同的序列。在第二鄰近探針之延伸期間，延伸區域因此包含錨定序列之補體，其與錨定試劑雜交，從而使夾心複合物穩定且防止第二鄰近探針解離。延伸之第二鄰近探針可含有可偵測標記（例如藉由在RCA延伸反應期間包含經標記核苷酸），其可經量測以確定表面上之分析物的量。或者，添加複數個包括可偵測標記之經標記探針且與延伸之第二鄰近探針雜交，且量測與表面結合之分析物的量。
任何適合之擴增技術可用於產生延伸序列（或擴增子），包含但不限於PCR（聚合酶鏈反應）、LCR（連接酶鏈反應）、SDA（股置換擴增）、3SR（自持合成反應）及等溫擴增方法，例如解螺旋酶依賴性擴增及滾環擴增（RCA）。在一較佳實施例中，使用RCA，因為其具有就靈敏度、多重化、動態範圍及可擴充性而言之顯著優勢。用於RCA之技術為此項技術中已知的（參見例如Baner等人, 《核酸研究（Nucleic Acids Research）》, 26:5073 5078, 1998；Lizardi等人, 《自然遺傳學（Nature Genetics）》 19:226, 1998；Schweitzer等人 《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）》 97:10113 119, 2000；Faruqi等人, 《BMC基因組學（BMC Genomics）》 2:4, 2000；Nallur等人, 《核酸研究（Nucl.Acids Res.）》 29:e118, 2001；Dean等人 《基因組研究（Genome Res.）》 11:1095 1099, 2001；Schweitzer等人, 《自然生物技術（Nature Biotech.）》 20:359 365, 2002；美國專利第6,054,274號、第6,291,187號、第6,323,009號、第6,344,329號及第6,368,801號）。已知RCA之若干不同變異體，包含線性RCA（LRCA）及指數RCA（ERCA）。RCA產生環狀模板之成千上萬個複本，其中複本之鏈與原始目標DNA連接，從而允許目標之空間解析率及信號之快速放大。RCA促進（i）偵測單一目標分子；（ii）自蛋白質以及DNA及RNA放大信號；（iii）鑑別已在固體表面上擴增之分子的位置；（iv）同時量測許多不同目標；及（v）分析溶液或固相中之一或多個目標。當以陣列或基於粒子之形式進行多重結合分析時，具有偵測複合物之RCA產物之空間定位為尤其有利的。
本發明之特定實施例描繪於圖4（a）中，其中使用錨定試劑及信號放大方法。在表面（401）上在捕捉試劑（402）、分析物（403）及兩種偵測試劑（304及305）之間形成複合物，其各自分別包含第一及第二鄰近探針（406及407）。添加第一及第二連接寡核苷酸（在圖4（a）中分別為Circ-1（408）及Circ-2（409）），其在兩個鄰近探針均存在於複合物中時各自與兩個鄰近探針雜交且將其橋接。結合之連接探針分別在連接位點1及2（410及411）處連接以形成環狀DNA模板（412）。藉由滾環擴增來擴增環狀DNA模板以延伸第二鄰近探針，且由此產生包括一或多個偵測序列（413）及錨定寡核苷酸序列補體（414）（包含部分錨定序列補體（415））之擴增子。錨定寡核苷酸序列（416）（與捕捉部分（417）連接）及其補體雜交，複數個偵測探針與複數個偵測探針序列雜交，且量測與表面結合之分析物的量（未示出但在圖1（a）中說明）。圖4（b）顯示第一環狀DNA模板Circ-1（408）（其經設計以與第一鄰近探針（PP1）雜交）、偵測寡核苷酸序列、擴增子惰性區域（其可全部或部分用於與錨定寡核苷酸序列結合）及部分PP2（其經設計以與第二鄰近探針雜交）之例示性序列。另一實施例描繪於圖4（c）中，其中藉由滾環擴增來擴增環狀DNA模板以產生包括複數個偵測序列（分別為418及419）之擴增子。在另一實施例中，與捕捉部分417連接之錨定寡核苷酸序列（416）可充當具有游離3'端之引子。在此實施例中，第二鄰近探針包含與偵測序列（413）互補之序列。
在一個實施例中，本文所述之分析形式利用在5'端處與偵測序列偶聯之偵測試劑，其中3'端經暴露以促進與連接探針連接以形成環狀DNA模板，該模板接著藉由滾環擴增來擴增以延伸第二鄰近探針（PP2）。在此實施例中，PP1潛在地獨立地可用於藉由聚合酶延伸，但可藉由添加經修飾之鹼基以防止藉由聚合酶引發來解決此問題。或者，連接模板PP1可經由其3'端直接與偵測試劑聯接，從而防止此寡核苷酸作為DNA聚合酶之引子參與，即使其經降解亦如此。
產生藉由RCA或任何適合之擴增方法擴增之目標序列的另一方法說明於圖5中。在此實施例中，鄰近探針中之每一者可摺疊為環狀髮夾結構。此等髮夾結構之形成產生含有重組信號之單股環及雙股部分。添加重組酶驅動兩個髮夾結構之重組以形成環狀DNA模板，其隨後如上所述地進行RCA。擴增子經標記且視情況錨定至錨定試劑且偵測分析物。此實施例之關鍵要素為重組酶催化含有序列特異性重組位點之DNA之位點特異性重組的能力。舉例而言，來自噬菌體P1之Cre重組酶在含有loxP位點之位點處催化重組，且其他非限制性實例包含但不限於Flippase（flp，來自酵母）、Hin（沙門氏菌（Salmonella））及Tre（Cre之工程改造（進化）型式）。此替代方法不需要添加額外組分，諸如寡核苷酸模板、ATP及dNTP。在此實施例中，loxP（重組）位點較佳經修飾以為非對稱的，使得正常平衡朝向形成所期望重組產物轉移。此在圖5中以重組位點之淡/濃陰影說明。
此外，圖6（a）說明產生藉由RCA或任何適合之擴增方法擴增之目標序列的另一方法。與偵測試劑連接之鄰近探針中之每一者包含loxP位點，其使得能夠藉由Cre重組酶在兩個寡核苷酸之間進行位點特異性重組，使得形成由一個鄰近探針之5'部分及側接lox P位點之另一鄰近探針之3'部分構成的新寡核苷酸序列。新產生之目標序列可隨後藉由任何適合之方法擴增、如上文所述地標記、視情況錨定及偵測。圖6（a）說明使用T7RNA聚合酶啟動子作為擴增之可操作元件之此實施例。亦應理解，其他RNA聚合酶位點，諸如在鄰近探針之3或5'部分處連接之T3及SP6同樣適用於此方法。在此實施例中，loxP（重組）位點較佳經修飾以為非對稱的，使得正常平衡朝向形成所期望重組產物轉移。如圖6（b）中所示，方法亦可用於產生可用於RCA中之環狀DNA模板。
本發明包含一種用於偵測分析物之方法，其包括將分析物與表面上之捕捉試劑及兩種偵測試劑結合以形成偵測複合物。方法包括量測偵測複合物，其中相對於僅包括兩種偵測試劑中之一者的複合物，量測方法優先量測包括兩種偵測試劑之複合物。在一個實施例中，方法包括形成複合物，接著使偵測試劑交聯且偵測交聯試劑。可使用任何適合之交聯化學方法來接合偵測複合物之組分。舉例而言，第一及第二偵測試劑可包含反應性部分，其與連接至反應性部分之多官能性交聯劑反應且藉由添加該多官能性交聯劑而接合。在此實施例中，反應性部分及交聯劑可包含胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合。在另一實施例中，第一及第二偵測試劑可包含結合部分且交聯劑為結合部分之多價結合搭配物。此實施例之若干非限制性實例包含：（a）第一及第二偵測試劑為動物物種之抗體且交聯劑為靶向動物物種之抗體的多價抗物種抗體；（b）第一及第二偵測試劑包括生物素且交聯劑為抗生蛋白鏈菌素（或反之亦然）；（c）第一及第二偵測試劑連接至抗生蛋白鏈菌素且交聯劑為包括複數個生物素分子之聚合物（或反之亦然）；或（d）第一及第二偵測試劑分別包括第一及第二核酸探針，且交聯劑為包括與第一核酸探針互補之序列及與第二核酸探針互補之獨立序列的寡核苷酸。
在一特定實施例中，樣品中之所關注分析物可如下偵測：藉由將分析物與固定之捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑結合以形成複合物，其中第一偵測試劑包括第一可偵測標記及第一核酸探針，且第二偵測試劑包括第二可偵測標記及第二核酸探針。在此實施例中，如下地交聯第一及第二偵測試劑：（i）使第一探針與第二探針雜交，（ii）使第一及第二探針與具有與第一及第二探針互補之區域的第三核酸雜交，或（iii）連接第一及第二探針。
一旦交聯產物結合至表面便可對其進行偵測，或視情況，交聯產物可自表面釋放至溶離劑中且進行偵測。就此而言，僅計數溶離劑中包含第一及第二可偵測標記兩者之彼等個別交聯產物。可採用任何適合之偵測方法來偵測溶離劑中標記之存在。在一較佳實施例中，標記為螢光分子且藉由單分子螢光偵測，例如螢光相關光譜法及/或螢光交叉相關光譜法來計數溶離劑中存在之經標記交聯產物。在此實施例中，單分子螢光偵測包括使溶離劑流經毛細管、使光源聚焦於毛細管內之體積上以產生詢問區及用光偵測器觀測詢問區以偵測螢光分子通過該詢問區。偵測方法可進一步包括偵測與第一標記相關之第一螢光信號及與第二標記相關之第二螢光信號，及在兩個信號均自詢問區偵測時計數偵測事件。或者，一個標記為螢光共振能量轉移（FRET）供體且另一個標記為FRET受體，且偵測方法可進一步包括在詢問區激發FRET供體及偵測來自FRET受體之螢光信號。
在一特定實施例中，可如下偵測樣品中之分析物：藉由將分析物與固定之捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑結合以形成複合物，其中第一偵測試劑包括第一核酸探針，第二偵測試劑包括第二核酸探針；延伸第二核酸探針以形成包括可偵測標記之延伸序列，延伸取決於複合物中第一及第二核酸探針之共定位；將延伸序列自表面釋放至溶離劑中；及計數溶離劑中之個別延伸序列。延伸步驟可包含將探針結合至模板核酸序列及藉由聚合酶鏈反應延伸探針。或者，延伸步驟包括使第一探針與模板核酸序列結合、形成環狀核酸模板及藉由滾環擴增延伸環狀模板。延伸步驟亦可包括使第一探針與模板核酸序列結合、使第二探針與模板序列結合及連接第一及第二探針。
在採用捕捉試劑之本發明之方法中，捕捉試劑可直接固定於固相上，或其可經由次要結合試劑，諸如如下所述之靶向試劑間接固定。舉例而言，捕捉試劑可與靶向試劑連接或包括靶向試劑，該靶向試劑與固相上之固定靶向試劑補體結合。靶向試劑與其補體之結合可為直接的（例如靶向試劑可為抗生蛋白鏈菌素且補體可為生物素）或經由橋接劑間接的（例如靶向試劑及補體可為生物素，且橋接試劑可為多價生物素結合受體，諸如抗生蛋白鏈菌素）。在一個實施例中，靶向劑及其補體包括第一寡核苷酸及互補寡核苷酸、受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對、雜交搭配物或嵌入劑-目標分子對。選擇分析中所用之靶向劑及補體，使得與用於藉由該分析量測之分析物之捕捉試劑或偵測試劑相關的靶向劑及補體基本上不對與用於藉由該分析量測之其他分析物之捕捉試劑或偵測試劑相關之靶向劑及補體具有交叉反應性。舉例而言，結合試劑與其相關結合域之結合（經由其相關靶向劑及靶向劑補體）應大幅超過其與與其他分析物相關之結合域的結合（且呈現不同靶向劑補體）。較佳地，相對於與恰當結合域之結合，用於將用於分析物之捕捉試劑或偵測試劑與與其他分析物相關之結合域結合之交叉反應為＜1%，更佳為＜0.1%且更佳為＜0.01%。在一較佳實施例中，靶向劑/靶向劑補體包括一對包含補體之寡核苷酸，且靶向劑及其補體在足以使靶向劑與其補體雜交的條件下接觸。
當使用靶向劑時，關於分析方法中所用之捕捉試劑何時固定於固相上存在一些靈活性。在一個實施例中，經由靶向劑-靶向劑補體相互作用將捕捉試劑預固定於固相上提供給使用者。在另一實施例中，與靶向劑連接之捕捉試劑及支撐固定之靶向劑補體之固相作為獨立組分提供。分析方法因此進一步包括藉由將靶向劑與其補體結合（直接或經由使用橋接劑）而將捕捉試劑固定於固相上之步驟。此步驟可在與形成偵測複合物相關之步驟之前、與其同時或在其之後進行。
在一特定實施例中，多功能靶向劑可用於本文所述之分析方法及組分中。多功能靶向劑可包含（a）經設計以經由第一區段補體結合至捕捉試劑之第一區段（亦即，捕捉試劑包含與多官能性靶向劑之第一區段互補的靶向劑補體），及（b）經設計以結合至擴增子之第二區段（亦即，多功能靶向劑之第二區段充當表面上之錨定試劑）。因此，在此實施例中，表面包含多功能靶向劑，其與經由第一區段與第一區段補體之間的連接與靶向劑結合的捕捉試劑接觸。如本文所述地進行3-AB RCA/PLA分析，且擴增子在量測步驟之前與多功能靶向劑之錨定區段結合。此方法可用於確保在分析方法中採用1:1比率的捕獲劑與錨定試劑。
多種表面適用於本發明之方法，包含來自結合分析領域之習知表面。表面可由多種不同材料製成，包含聚合物（例如聚苯乙烯及聚丙烯）、陶瓷、玻璃、複合材料（例如碳-聚合物複合物，諸如碳基油墨）。適合之表面包含宏觀物體表面，諸如分析容器（例如試管、比色管、流量槽、微流體通道、毛細管（例如來自BioTechne之ELLA玻璃奈米反應器）、FACS細胞分選儀、濾筒、多孔盤中之孔等）之內表面、載玻片、分析晶片（諸如用於基因或蛋白質晶片量測中之彼等）、接腳或探針、珠粒、過濾介質、側流介質（例如用於側流測試條之過濾膜）等。
適合之表面亦包含通常用於其他類型之基於粒子之分析中之粒子（包含但不限於膠體或珠粒），例如磁性、聚丙烯及乳膠粒子；通常用於固相合成之材料，例如聚苯乙烯及聚丙烯醯胺粒子；及通常用於層析應用之材料，例如二氧化矽、氧化鋁、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯。材料亦可為纖維，諸如碳原纖維。微米粒子可為無生命的，或者可包含有生命的生物實體，諸如細胞、病毒、細菌及其類似物。用於本發明方法之粒子可由適合於與一或多種捕捉試劑或偵測試劑連接之任何材料構成，且可經由例如離心、重力、過濾或磁性收集來收集。可與捕捉試劑或偵測試劑連接之多種不同類型的粒子為市售的，用於結合分析。此等包含非磁性粒子以及包括可磁化材料之粒子，該等可磁化材料允許藉由磁場收集粒子。在一個實施例中，粒子由導電及/或半導電材料，例如膠體金粒子構成。微米粒子可具有多種尺寸及形狀。作為實例而非限制，微米粒子可在5奈米與100微米之間。較佳地，微米粒子之尺寸在20 nm與10微米之間。粒子可為球形、長方形、棒狀等，或其可為不規則形狀。
本發明方法中所用之粒子可經編碼以允許鑑別特定粒子或粒子混合物中之粒子亞群。此類編碼粒子之使用已用於使得採用粒子作為結合分析之固相支撐物的分析能夠多重化。在一種方法中，製造粒子以包含一或多種螢光染料且基於螢光發射在一或多個波長下之強度及/或相對強度來鑑別特定粒子群。此方法已用於Luminex XMAP系統（參見例如美國專利第6,939,720號）及Becton Dickinson Cytometric Bead Array系統中。或者，粒子可經由其他物理特性，諸如尺寸、形狀、嵌入光學圖案及其類似特性中之差異來編碼。在粒子混合物或集合中提供之一或多個粒子可經編碼以藉助於粒子光學特性、尺寸、形狀、嵌入光學圖案及其類似者與混合物中之其他粒子區分開。
在一特定實施例中，本發明之方法可藉由使複數種不同分析物與用於彼等分析物之複數種捕捉試劑結合而以多重形式使用，捕捉分析物固定於編碼珠粒上，使得該編碼鑑別用於特定珠粒之捕捉試劑（及分析物目標）。方法可進一步包括計數具有結合分析物之珠粒之數目（使用本文所述之偵測方法）。
或者或另外，偵測複合物及/或捕捉試劑可直接或間接結合至一或多個固相上之不同離散結合域，例如如在結合陣列中，其中結合域為個別陣列元件，或在珠粒集合中，其中結合域為個別珠粒，使得在各結合域上產生離散分析信號且自各結合域量測離散分析信號。若用於不同分析物之捕捉試劑固定於不同結合域中，則可獨立地量測與彼等域結合之不同分析物。在此類實施例之一個實例中，藉由在一或多個表面上固定結合所關注分析物之捕捉試劑之離散域來製備結合域。視情況，表面可部分地界定保持樣品或使樣品穿過的容器（例如流量槽、孔、比色管等）之一或多個邊界。在一較佳實施例中，在電極上形成個別結合域，用於電化學或電化學發光分析。使用電化學發光對包括複數個結合域之表面上的分析物進行多重量測已用於Meso Scale Diagnostics, LLC之MULTI-ARRAY® 及SECTOR® Imager產品線中（參見例如美國專利第7,842,246號及第6,977,722號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中）。
再另外，偵測複合物及/或捕捉試劑可直接或間接結合至電極表面，其視情況包含不同離散結合域，如上文所述。電極表面可為多孔盤及/或流量槽之組成部分。電極可包括導電材料，例如金屬，諸如金、銀、鉑、鎳、鋼、銥、銅、鋁、導電允許材料或其類似物。其亦可包含氧化物塗覆之金屬，例如氧化鋁塗覆之鋁。電極可包含工作電極及相對電極，其可由相同或不同材料製成，例如金屬相對電極及碳工作電極。在一特定實施例中，電極包括碳基材料，諸如碳、碳黑、石墨碳、碳奈米管、碳原纖維、石墨、石墨烯、碳纖維及其混合物。在一個實施例中，電極包括元素碳，例如石墨、碳黑、碳奈米管等。有利地，其可包含導電碳-聚合物複合物、分散於基質（例如碳墨、碳糊、金屬油墨、石墨烯油墨）中之導電顆粒及/或導電聚合物。本發明之一個特定實施例為分析模組，較佳多孔盤，其具有包括碳，例如碳層及/或碳墨之網版印刷層的電極（例如工作電極及/或相對電極）。
本發明包含偵測及計數個別偵測複合物之方法。在一特定實施例中，表面可包括用於樣品中存在之一或多個分析物分子的複數種捕捉試劑及跨越位於表面上之複數個可解析結合區分佈的複數種捕捉試劑。在用於進行及分析量測之條件下，「可解析結合區」為與個別結合事件相關之最小表面積，該表面積可經解析及與發生另一個別結合事件之另一區域區分。因此，方法由以下各者組成：使一或多個分析物分子與表面上之一或多種捕捉試劑結合、確定表面上之複數個可解析結合區中存在或不存在分析物分子及鑑別含有分析物分子之可解析結合區之數目及/或不含分析物分子之分析物域之數目。
可解析結合區可整體或部分地進行光學詢問，亦即每一個別可解析結合區可單獨進行光學詢問，及/或包括複數個可解析結合區之整個表面可經成像且該影像內之一或多個像素或像素分組可映射至個別可解析結合區。可解析結合區亦可為複數個微米粒子內之微粒。展現光學簽名變化之可解析結合區可藉由習知光學偵測系統來鑑別。取決於偵測種類（例如螢光實體之類型等）及工作波長，設計用於特定波長之濾光器可用於可解析結合區之光學詢問。在使用光學詢問之實施例中，系統可包括超過一個光源及/或複數個濾光器以調節光源之波長及/或強度。在一些實施例中，使用CCD相機捕捉來自複數個可解析結合區之光學信號。可用於捕捉影像之相機成像系統之其他非限制性實例包含電荷注入裝置（CID）、互補金屬氧化物半導體（CMOS）裝置、科學CMOS（sCMOS）裝置及時間延遲積分（TDI）裝置，如將為一般熟習此項技術者所已知。在一些實施例中，與光電二極體或光電倍增管（PMT）耦合之掃描鏡系統可用於成像。
方法之量測步驟可包括對來自表面（或其部分）之光學信號成像以產生由複數個像素組成之影像，其中各可解析結合區映射至影像中之一或多個像素或像素組。可使用技術公認之方法來完成用以鑑別具有指示結合事件（偵測複合物）之信號之像素或像素組的影像分析，例如豐富的影像分析算法及軟體可用於鑑別及計數螢光顯微法影像中之經標記生物結構。在一個實施例中，在對影像進行濾波以移除大規模信號梯度之後，使用分割臨限值將影像轉化為二進制影像。藉由鑑別高於臨限值強度之連續區域來發現可解析結合區。若結合域滿足尺寸及強度要求，則將其分類為結合事件。
在一個實施例中，可解析結合區為陣列之元件。在一較佳實施例中，陣列為微孔或奈米孔，例如單一受質之個別凹陷或孔的陣列。較佳地，孔之體積為小於100 nL，較佳小於50 nL。在一個實施例中，孔之體積介於約10 aL-100 pL範圍內。視情況，孔可經組態以容納微粒。
在一個實施例中，位於受質上且在分析期間定址之可解析結合區中之至少50%含有零個或一個分析物分子。較佳地，可解析結合區中之至少80%、更佳至少95%且最佳至少99%含有零個或更多個分析物分子。可使用含有至少一個或一個分析物分子之結合區之數目的校準曲線、泊松分佈分析及/或高斯分步分析至少部分地確定樣品中之分析物分子濃度。在一特定實施例中，表面包括各自包含複數種用於分析物分子之捕捉試劑的複數個粒子，及跨越複數個可解析結合區（例如微孔或奈米孔陣列）分佈的複數個粒子。因此，方法包含：（i）使一或多個分析物分子與表面上之一或多種捕捉試劑結合，（ii）跨越可解析結合區之陣列分配複數個粒子；及（iii）確定各可解析結合區中存在或不存在分析物分子，以鑑別含有分析物分子之結合域之數目及/或不含分析物分子之結合域之數目。
使用本發明之方法中之一或多者偵測受限體積中之分析物亦可為有利的。在此等實施例中，樣品中之分析物分子結合至各攜有可區分標記之一對偵測試劑，且跨越複數個位置，例如基板（例如盤、培養皿、晶片、光纖、網格等）上之孔或反應容器（在本文中稱為「反應容器」）分配分析物，以使得大多數反應容器含有一種或更少的分析物。此方法使得使用者能夠藉由計數含有與分析物連接之可區分標記中之每一者的反應容器之數目來偵測分析物分子。在一些情況下，定址之複數個反應容器為可含有至少一個分析物分子（例如與至少一個分析物分子相關或不與任何分析物分子相關）之反應容器之總數量的部分或基本上全部。參考以下公佈之美國專利申請：美國專利申請案第20070259448號；美國專利申請案第20070259385號；美國專利申請案第20070259381號；及國際專利申請案第PCT/US07/019184號；及國際專利申請案第PCT/US09/005428號。此等公開案中之每一者的揭示內容以引用之方式併入本文中。可定址反應容器之至少一部分且可作出指示含有至少一個分析物分子或粒子之反應容器之數目/百分比的量度。在一些情況下，基於該數目/百分比，可測定流體樣品中之分析物分子濃度的量度。
在使得能夠偵測受限體積中之分析物分子的一個特定實施例中，樣品中之分析物可藉由使分析物與第一及第二偵測試劑結合以形成偵測複合物來偵測。各偵測複合物包含分析物、第一偵測試劑及第二偵測試劑，且第一偵測試劑及第二偵測試劑分別具有第一及第二可偵測標記。偵測複合物可同時、基本上同時或依序形成。跨越複數個反應容器分配偵測複合物，以使得大多數反應容器含有一種或更少的偵測複合物，且藉由計數含有第一及第二可偵測標記中之每一者之反應容器之數目來偵測分析物分子之數目。較佳地，跨越複數個反應容器分配偵測複合物，以使得在相同容器中偵測到未結合之第一偵測試劑及未結合之第二偵測試劑的可能性小於約1/10，較佳小於約1/100，更佳小於約1/1000，且最佳小於約1/10,000。跨越複數個反應容器分配偵測複合物，亦即劃分或分離成份或部分，例如藉由跨越複數個反應容器等分偵測複合物之一部分手動進行，及/或藉由使包括偵測複合物之溶液跨越複數個反應容器流動，以使得偵測複合物分離至支撐物上之個別反應容器中。
在另一實施例中，樣品中之分析物可如下偵測：（a）使分析物與表面結合捕捉試劑及第一及第二偵測試劑結合以形成偵測複合物，其中（i）各偵測複合物包含捕捉試劑、分析物、第一偵測試劑及第二偵測試劑，及（ii）第一偵測試劑具有第一可偵測標記且第二偵測試劑具有第二可偵測標記。偵測複合物可藉由以任何次序添加組分而形成，例如藉由同時或基本上同時將組分放在一起，或依序添加各組分而以逐步方式構建偵測複合物。跨越複數個反應容器分配偵測複合物，以使得大多數反應容器含有一種或更少的分析物，且藉由計數含有第一及第二可偵測標記之反應容器之數目來偵測分析物分子之數目。方法可在各步驟之後及偵測步驟之前進行或不進行洗滌之情況下進行。
表面可為粒子，且視情況，複數種捕捉試劑固定於粒子或複數個粒子上。在此實施例中，分配步驟可以數種方式進行：（i）將捕捉試劑固定於複數個粒子上且藉由使分析物與捕捉試劑結合且將該等粒子分配至複數個反應容器中來達成分析物之分配；或（ii）將捕捉試劑固定於複數個粒子上且藉由將該等粒子分配至複數個反應容器中，接著使分析物與捕捉試劑結合來達成分析物之分配。
複數個反應容器亦可包括分散於油包水乳液中之水滴。乳液可用直徑為至多100 μm且體積接近1 nL之液滴製成。高容量（亦即1 mL乳液中大於1010 個液滴）、製備乳液之簡易性及其在大範圍條件下之高穩定性使其成為劃分生物化學分析之理想手段。各水滴充當獨立反應容器，且可跨越複數個水滴分配視情況與粒子連接的偵測複合物。
或者，表面為反應容器中之一者內之位置，例如若反應容器為盤之孔，則表面可為盤之孔中之一者內之域或區。在此實施例中，捕捉試劑可固定於複數個反應容器之域或區上，且分割步驟係藉由使分析物分子與捕捉試劑結合來達成。在另一實施例中，複數個反應容器包含固定有靶向部分之區域，捕捉試劑包括靶向部分補體，且分配步驟係藉由使靶向部分補體與安置於複數個反應容器中之目標部分結合來達成。
在額外或替代實施例中，本文所述之結合分析亦可包含預濃縮步驟以改良分析效能，例如藉由增加樣品中分析物之濃度及/或藉由降低可存在於樣品中的可阻礙分析效能之外來物質的濃度。此可如下進行：（a）使包含所關注分析物之樣品與連接至結合分析物之第一結合試劑的固相（例如粒子）接觸，由此形成包括與該第一結合試劑結合之分析物的複合物；（b）收集複合物；（c）將樣品之未結合組分與複合物分離；（d）釋放複合物。濃縮分析物之此方法可在進行本文所述之結合分析之前進行，以移除可阻礙分析效能之雜質。就此而言，參考美國申請公開案第US 2010/0261292號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
特定言之，濃縮步驟涉及在足以形成分析物複合物之條件下對包括分析物之樣品進行處理，該分析物複合物包含與第一偵測試劑結合之分析物，其中第一偵測試劑與第一核酸探針連接。此後，在濃縮步驟結束時形成之分析物複合物結合至（i）包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑之表面上的捕捉試劑；及（ii）連接至第二核酸探針的用於分析物之第二偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及第一及第二偵測試劑之複合物。對表面結合複合物進行需要第一及第二探針鄰近之延伸方法，延伸第二探針以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列。錨定序列接著與錨定序列補體雜交；且量測與表面結合之延伸序列的量。在一特定實施例中，濃縮步驟進一步包括：（i）使包含分析物之樣品與固相接觸，該固相連接至與第一核酸探針之至少一部分互補的靶向劑，由此形成包括經由第一核酸探針與靶向劑之間的結合反應結合至固相之分析物的濃縮複合物；（ii）收集濃縮複合物；（iii）將樣品之未結合組分與濃縮複合物分離；及（iv）釋放濃縮複合物以將固相與分析物分離，以形成分析物複合物。
如本文所用，收集係指材料在混合物中之物理定位。收集包含經由結合反應或吸附來定位材料。舉例而言，混合物中之材料可藉由在固相上吸附該材料或藉由使該材料與固相上之結合試劑結合而收集於固相上。然而，收集不限於定位於固相且亦可包括此項技術中用於將材料定位於較大流體體積內之某一位置/體積的技術，例如經由使用光鑷（其使用光操縱小至單個原子之微觀物體，其中來自聚焦雷射光束之輻射壓力能夠捕獲小顆粒）、電場或磁場、聚焦流、密度梯度離心等來定位材料。
本發明之某些實施例包含收集微米粒子或與微米粒子結合之材料。適合之收集方法包含基於微粒之分析技術中已知之許多方法，該等方法實現自懸浮液定位微米粒子。此等包含在重力下或藉由離心沈降、過濾至濾膜或多孔膜上、藉由施加磁場定位（可磁化粒子）、將粒子結合或吸附至宏觀固相、使用光鑷等。
如本文所用，釋放係指先前收集材料之離域。經由化學鍵或經由特異性或非特異性結合相互作用保持於局部位置之材料可允許藉由破壞鍵或相互作用而離域，以使得材料可擴散或混合至周圍介質中。存在許多可使用的公認可裂解化學連接基團，其提供可在不需要苛刻條件的情況下裂解之共價鍵。舉例而言，可使用硫醇或其他還原劑裂解含二硫鍵之連接基團，可使用高碘酸鹽裂解含順式二醇之連接基團，可藉由改變pH或引入競爭性配位體來裂解金屬配位體相互作用（諸如鎳-組胺酸）。類似地，存在許多可採用的公認可逆結合對（包含已在親和層析技術中鑑別之彼等）。舉例而言，可經由改變pH、添加蛋白質變性劑或離液劑、添加競爭配位體等來逆轉許多抗體-配位體對之結合。其他適合之可逆結合對包含互補核酸序列，其雜交可在多種條件下逆轉，包含改變pH、降低鹽濃度、將溫度增加至高於該對之熔融溫度及/或添加核酸變性劑（諸如甲醯胺）。此類可逆結合對可用作靶向劑（如上文所述），例如第一靶向劑可連接至結合分析物之第一結合試劑，第二靶向劑可連接至固相，且第一及第二靶向劑之結合相互作用可用於將第一結合試劑可逆地固定於固相上。
釋放亦包含藉由例如混合、震盪、渦旋、對流流體流動、藉由施加磁力、電力或光學力進行混合及其類似者來使材料物理離域。當已收集微米粒子或與微米粒子結合之材料時，此類物理方法可用於將該等粒子再懸浮於周圍基質中。釋放可簡單地與先前的收集步驟相反（例如藉由上文所述之機制中之任一者），或可藉由兩種不同機制進行收集及釋放。在一個此類實例中，可藉由粒子之物理收集來達成與粒子結合之材料（諸如分析物或包括分析物之複合物）之收集。接著藉由裂解鍵或逆轉將材料固定於粒子上的結合反應來釋放材料。在第二個此類實例中，經由與連接至表面之結合試劑的結合相互作用在表面上收集材料（諸如包括分析物之複合物的分析物。接著藉由破壞鍵或將結合試劑連接至表面的第二結合相互作用來釋放材料。
收集後接著釋放可用於濃縮及/或純化樣品中之分析物。藉由在第一體積中收集及釋放至第二較小體積中，可濃縮樣品中之分析物。經由濃縮，通常有可能顯著提高後續量測步驟之靈敏度。藉由自樣品收集及移除一些或全部未收集之樣品，可減少或消除樣品中之潛在分析干擾物。視情況，移除未結合樣品可包含用定義之液體試劑（例如分析或洗滌緩衝液）洗滌收集之材料及將收集之材料釋放至該等試劑中，以提供用於後續分析步驟之均一基質。
如以引用的方式併入本文中之US 2010/0261292之圖3（a）中所說明，方法包含使包括目標分析物之樣品與連接至結合目標分析物之第一結合試劑的粒子接觸，其中第一結合試劑連接至第一靶向劑且粒子連接至第二靶向劑，且第一結合試劑及粒子經由第一與第二靶向劑之間的結合反應連接，以形成包括與該第一結合試劑結合之該目標分析物的複合物。接著收集複合物且將樣品中之未結合組分與複合物分離。釋放複合物且使釋放之複合物與結合至固相之第二結合試劑接觸，其中第二結合試劑結合至複合物。此特定實施例說明於圖16中。粒子（1601）經修飾以包含捕捉寡核苷酸序列1602，其至少部分與結合至偵測抗體1604之鄰近探針1603的序列互補。將粒子與鄰近探針混合以使捕捉序列與探針序列雜交以形成複合物1605。接著將複合物與包括分析物1606且視情況包括一或多種污染物1607-1608之樣品混合。分析物與偵測抗體結合（1609）且移除污染物（1610）。在適合之條件下自包含結合分析物之複合物移除粒子，以形成與鄰近探針結合之分析物的濃溶液（1611），其可如本文所述地用於免疫分析中，其中額外鄰近探針與分析物結合且對3-抗體複合物進行RCA-PLA以偵測樣品中分析物之存在（1612），例如如圖2（a）及隨附說明中所述。
在另一實施例中，在溶液中形成偵測抗體與分析物之間的免疫分析複合物，接著擴增，且接著經由捕捉試劑及/或錨定物將擴增產物黏附至粒子。視情況，擴增產物可經過濾且接著經由捕捉試劑及/或錨定物捕捉於粒子上。此方法說明於圖17中。分析物A（1701）結合至各自結合至鄰近探針（分別為1704及1705）的偵測抗體（分別為1702及1703），且形成包括與偵測抗體中之每一者結合之分析物的偵測複合物（1706）。偵測複合物與兩個連接序列（1707a及1707b）接觸，該兩個連接序列各自包含與第一鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列及與第二鄰近探針之不重疊區域互補的末端序列。連接序列與第一及第二鄰近探針雜交，且將連接寡核苷酸之末端序列連接以形成與第一及第二鄰近探針兩者雜交之環狀目標序列（1708）。藉由滾環雜交延伸第二鄰近探針，以產生包括與錨定試劑互補之結合試劑的擴增子。擴增子與包含捕捉試劑（1710）及錨定試劑（1711）之表面（1709）接觸，且經由使用複數個經標記探針（1712）進行標記來量測與表面結合之擴增子的量。經標記探針
在實施例中，本發明提供包括寡核苷酸及至少一個電化學發光部分之經標記探針。在實施例中，本發明提供包括寡核苷酸及至少兩個電化學發光部分之經標記探針。在實施例中，電致發光部分為電化學發光標記。在實施例中，經標記探針用於本文所述之方法及分析中以量測延伸序列的量。在實施例中，延伸序列為RCA方法之擴增產物（或擴增子）。在實施例中，經標記探針包括與延伸序列中之偵測序列互補的寡核苷酸。在實施例中，在本文所述之方法中，複數個經經標記探針用於量測與表面結合之延伸序列的量。在實施例中，量測經標記探針確定樣品中分析物之量。
已知可偵測發光標記，諸如螢光團具有自淬滅效應。自淬滅為一種標記之發光強度被另一種降低，通常隨著高標記濃度或高標記密度而增加。因此，一般避免緊密靠近的多個發光標記以減少自淬滅效應。因此，本發明人出人意料地發現本發明之經標記探針儘管含有使多個電化學發光標記保持緊密靠近之結構，但仍相對於僅具有一個標記之探針提供自標記有效產生ECL及改善信號。因此，在實施例中，本發明之經標記探針包括超過一個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括2至10個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括2至5個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括三個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個電化學發光標記。
在實施例中，本發明提供包括寡核苷酸及多個電化學發光標記之經標記探針。探針可包含（i）與寡核苷酸之經修飾之核苷酸鹼基連接的一或多個（或兩個或更多個）標記，（ii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之5'端連接，（iii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之3'端連接，或（iv）（i）、（ii）及（iii）中之兩者或更多者之組合。
在實施例中，本發明提供式I之經標記探針：
Figure 02_image009
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，且n為0與5之間的整數。
式I之核苷酸鹼基B為任何核苷酸鹼基，只要該核苷酸鹼基不干擾經標記探針之電化學發光能力。在實施例中，核苷酸鹼基為天然存在之核苷酸鹼基。在實施例中，核苷酸鹼基為合成核苷酸鹼基。在實施例中，核苷酸鹼基為嘌呤或嘧啶。在實施例中，核苷酸鹼基為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在實施例中，核苷酸鹼基為黃嘌呤、次黃嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6,8-二胺基嘌呤、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、異鳥嘌呤或異胞嘧啶。
式I之R可為任何適合之電化學發光標記。適合之電化學發光標記包含釕、鋨、銥、錸及鑭系金屬之電化學發光有機金屬複合物。適合之電化學發光標記包含含有聯吡啶或啡啉配位體（經代或未經取代）之此等金屬的電化學發光有機金屬複合物。適合之電化學發光標記之實例可見於美國專利第5,714,089號、第6,316,607號、第6,808,939號、第9,499,573號、第6,468,741號、第6,479,233號及第6,136,268號中。在實施例中，電化學發光標記為
Figure 02_image011
。
在實施例中，L1 及L2 獨立地為烷基、鹵烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜芳基取代之環烷基、雜取代之環烷基、雜烷基、氰基烷基、雜環基、雜環基烷基、烯基、炔基、苯基或其組合，具有零個或一或多個視情況經雜原子取代之碳鏈。在實施例中，L1 及L2 獨立地為具有零個或一或多個視情況經雜原子取代之碳鏈的烷基連接基團。在實施例中，一或多個雜原子獨立地為氮、硫、磷酸根或氧。在實施例中，L1 之長度為約1至約20個碳及/或雜原子。在實施例中，L1 之長度為約4至約15個碳及/或雜原子。在實施例中，L1 之長度為約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15個碳及/或雜原子。在實施例中，L2 之長度為約1至約30個碳及/或雜原子。在實施例中，L2 之長度為約7至約26個碳及/或雜原子。在實施例中，L2 之長度為約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25或約26個碳及/或雜原子。
如本文所用，「在……之間」為包含範圍末端之範圍。舉例而言，0與11之間的整數明確包含整數0及11，及在0與11內的任何整數，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。0與5之間的整數明確包含整數0及5，及在0與5內之任何整數，亦即1、2、3及4。
在實施例中，R包括釕錯合物RP1 P2 P3 ，其中P1 、P2 及P3 中之每一者獨立地為聯吡啶、經取代之聯吡啶、啡啉或經取代之啡啉。在實施例中，化學發光標記R為
Figure 02_image011
。
在實施例中，B為在尿嘧啶之5位處連接至L1 之尿嘧啶。
在實施例中，L1 包括
Figure 02_image014
、
Figure 02_image016
或其組合，其中p為1與12之間的整數。 在實施例中，L2 包括
Figure 02_image018
，
Figure 02_image020
，
Figure 02_image022
，或其組合，其中q為0與11之間的整數。
在實施例中，本發明提供式II之經標記探針：
Figure 02_image024
式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
Figure 02_image026
。在實施例中，j為0與5之間的整數，k為0，m為0與5之間的整數，且n為2與7之間的整數。在實施例中，k為0，j為0，m為1，且n為5。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少85%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少88%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少90%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少95%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少98%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少99%序列一致性之序列。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括一或多種本文所述之修飾。在實施例中，經標記探針包括胺基修飾劑。在實施例中，經標記探針包括內部胺基修飾之dT鹼基（iAmMC6T）。在實施例中，經標記探針包括內部間隔子18（iSp18）。在實施例中，經標記探針包括3'胺基修飾劑（3AmMO）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'- CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'（具有修飾之SEQ ID NO:44）。
在實施例中，本發明提供量測電化學發光之方法，其包括：（a）在其中接近電極之複合物將發射電化學發光的條件下向電極施加電位，其中複合物包括本文提供之目標寡核苷酸及經標記探針，其中經標記探針包括與目標寡核苷酸互補之寡核苷酸；及（b）量測發射之電化學發光。本文描述了量測電化學發光之例示性電極及方法。
在實施例中，經標記探針用於本文所述之分析之量測步驟中，亦即量測與表面結合之延伸序列的量。經標記探針可用於本文所述之所有方法，例如使用一種偵測試劑、兩種偵測試劑或兩種或更多種偵測試劑之方法。在實施例中，量測電化學發光之方法包括：形成包括以下之組合物：（i）包括目標序列之目標核酸，及（ii）經標記探針，其中經標記探針包括與目標序列互補之寡核苷酸；在其中經標記探針與目標核酸雜交以形成複合物之條件下培育組合物；使複合物接近電極，在其中複合物將發射電化學發光之條件下向電極施加電位，及量測發射之電化學發光。
在實施例中，經標記探針用於本文所述之分析之偵測步驟中，亦即量測與表面結合之延伸序列的量。經標記探針可用於本文所述之所有方法，例如使用一種偵測試劑、兩種偵測試劑或兩種或更多種偵測試劑之方法。
在實施例中，目標核酸為由如本文所述之RCA反應產生的延伸序列。在實施例中，目標核酸固定於電極上。在實施例中，目標核酸固定於電極上，使得複合物之形成使複合物接近電極。在實施例中，目標核酸直接固定於電極上，或其經由如本文所提供之結合試劑間接固定。在實施例中，複合物進一步包括能夠結合至目標核酸之結合試劑，其中結合試劑固定於電極上。在實施例中，複合物進一步包括能夠結合至目標核酸之結合試劑，其中結合試劑固定於電極上，及使複合物接近電極包括在其中目標核酸結合至結合試劑之條件下將組合物與電極一起培育。在實施例中，結合試劑為錨定試劑。在實施例中，結合試劑包括與目標核酸之補體。
在實施例中，目標核酸固定於固相支撐物上。在實施例中，目標核酸直接固定於固相支撐物上，或其經由如本文所提供之結合試劑間接固定。在實施例中，能夠結合至目標核酸之結合試劑固定於固相支撐物上，其中固相支撐物固定於電極上。在實施例中，目標核酸固定於固相支撐物上，且使複合物接近電極包括在其中目標核酸結合至結合試劑之條件下將組合物與電極一起培育。在實施例中，結合試劑固定於固相支撐物上，且使複合物接近電極包括在其中目標核酸結合至結合試劑之條件下將組合物與固相支撐物一起培育，其中目標核酸結合至結合試劑，及收集固相支撐物。
在實施例中，培育持續約9分鐘、10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時或約8小時。在實施例中，培育係在約15℃、約18℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃或約30℃下。在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育係在約18℃至約29℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約20℃至約28℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約21℃至約26℃下持續約30分鐘至約4小時。在實施例中，培育係在約22℃至約24℃下持續約40分鐘至約2小時。在實施例中，培育係在約23℃下持續約1小時。
本文描述了例示性固相支撐物。在實施例中，結合試劑包括與目標寡核苷酸之補體。在實施例中，固相支撐物為粒子，且粒子使用重力、離心、過濾或施加磁場而收集於電極上。
在實施例中，本發明提供量測電化學發光之套組，其包括本文提供之經標記探針，及電極；ECL讀取緩衝液；核酸聚合酶；核酸連接酶；分析稀釋劑；額外核酸試劑；分析消耗品；或其組合。額外核酸試劑之實例包含緩衝液及用於溶解、稀釋及/或穩定核酸之試劑。可包括於套組中之分析消耗品之實例為分析模組，設計為在分析之一或多個步驟期間含有樣品及/或試劑；吸管尖端及其他消耗品，用於轉移液體樣品及試劑；蓋及密封件，用於分析中所使用之分析模組及其他消耗品；托架，用於容納其他分析消耗品；標記（包括人類可讀或機器可讀格式，諸如條碼、RFID等），用於識別樣品或其他分析消耗品；及介質（包括紙質及電子介質），用於提供關於分析的資訊及/或進行分析之說明書。
在實施例中，套組包括電極，且電極為碳基電極。在實施例中，套組包括分析消耗品，且分析消耗品為多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括碳墨電極。在實施例中，套組包括具有複數個孔之多孔分析盤，且分析盤用作至少一種結合試劑之容器。在實施例中，結合試劑固定於盤中。盤內之複數個孔可具有固定於其內之結合試劑。此等孔中之各者中的結合試劑對於此等孔中之所有者、此等孔中的一些或此等孔中無一者而言可為相同的。在實施例中，複數種結合試劑作為結合試劑陣列固定於此等孔中之各者中。固定之結合試劑及/或固定之結合試劑之陣列可固定於孔內之電極（其可為碳基電極或更特定言之，碳墨電極）上。
在實施例中，套組包括ECL讀取緩衝液，且ECL讀取緩衝液包括三丙胺。在實施例中，套組包括ECL讀取緩衝液，且ECL讀取緩衝液包括丁基二乙醇胺。例示性ECL讀取緩衝液描述於例如2019年1月3日申請之U.S. 62/787,892中。經標記探針之製造方法
本發明包含製造本文所述之經標記探針之方法。在實施例中，具有兩個或更多個烷基胺部分之經修飾寡核苷酸與過量的包括電化學發光標記之胺反應性標記試劑反應。反應混合物接著經純化以分離產物，其中胺部分中之每一者與電化學發光標記偶聯。
在實施例中，具有反應性胺基之經修飾寡核苷酸具有式VIII中所示之結構，且產物具有式I中所示之結構，其中R為電化學發光標記。在實施例中，經修飾寡核苷酸具有式IX中所示之結構，且產物具有式II中所示之結構，其中R為電化學發光標記。該等式之其他成分（L1 、L2 、k、m等）如針對以上式I及II所描述。
Figure 02_image028
式VIII
Figure 02_image030
式IX
在實施例中，胺反應性標記試劑包括電化學發光標記之活性酯形式，且與胺部分反應以在經修飾寡核苷酸與標記之間形成醯胺鍵。在實施例中，活性酯為NHS酯。在實施例中，標記為
Figure 02_image032
且胺反應性標記試劑為
Figure 02_image034
。
在實施例中，經修飾寡核苷酸係藉由固相合成製備。在實施例中，最終產物係藉由離子交換層析法純化。在實施例中，最終產物係藉由陰離子交換層析法純化。在實施例中，最終產物係藉由凝膠電泳純化。核酸探針
在實施例中，與偵測試劑連接之核酸探針為與偵測試劑交聯或結合之寡核苷酸。「結合」、「生物結合」或其變體在本文中用於指在兩個分子之間形成穩定共價鍵，分子中之至少一者為生物分子，例如蛋白質、多肽、聚核苷酸等。連接分子可稱為「結合物」或「生物結合物」。在實施例中，結合物包括核酸探針及偵測試劑。
在實施例中，核酸探針包括與模板核酸之一或多個互補區。在實施例中，模板核酸為用於例如藉由PCR擴增之模板。在實施例中，模板核酸為環狀核酸模板，經連接以形成環狀核酸模板（例如用於RCA）之一或多個線性核酸模板。在實施例中，模板核酸序列為如本文中所述之電化學發光量測方法中所用之連接寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸為線性寡核苷酸，其5'及3'端能夠連接以產生環狀核酸模板。在實施例中，連接寡核苷酸包括與其3'端處之序列互補的其5'端處之序列，使得連接酶可將5'端及3'端連接在一起以形成環狀核酸模板。在實施例中，環狀核酸模板為用於滾環擴增（RCA）之模板。在實施例中，核酸探針為用於RCA反應之引子，亦即延伸環狀核酸模板以形成延伸序列。
本發明人出乎意料地發現較短核酸探針改良本發明之電化學發光量測及分析方法之效能。習知思維是適當效能將需要相對較長寡核苷酸。較短核酸探針提供簡化結合方案之額外優勢（且特定言之，使得能夠使用更簡單、勞力密集度更小且更快的方法自未結合之探針分離蛋白質-探針結合物），且亦更容易且更便宜合成及純化。因此，在實施例中，本發明之核酸探針包括長度為約10至約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約28個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約26個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約24個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約11至約22個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約21個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約20個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約18個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約19個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括約14個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括約15個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括寡核苷酸，其中寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括一或多個核酸修飾以允許與偵測試劑結合。在實施例中，使用異雙官能交聯劑完成核酸探針與偵測試劑之結合。在實施例中，核酸探針包括含有反應性官能基之非天然存在之5'修飾。官能基之非限制性實例包含例如烯烴及張力烯烴、炔烴、鹵化物、醇、硫醇、胺、磷酸鹽、醛、酮、羧酸、羧酸鹽、醯胺、酯、硫酯、醯基磷酸鹽、酸鹵化物、腈、酸酐、肼、四嗪、疊氮化物及其類似物。在實施例中，反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，反應性官能基為硫醇。在實施例中，反應性官能基為四嗪。在實施例中，反應性官能基為乙烯基或張力烯烴。在實施例中，反應性官能基為疊氮化物。在實施例中，反應性官能基為炔烴或張力炔烴。在實施例中，反應性官能基為4-甲醯基苯甲醯胺。在實施例中，反應性官能基為肼基菸鹼醯胺。
在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與本發明之異雙官能交聯劑反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與四嗪反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與乙烯基或張力烯烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與疊氮化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與炔烴或張力炔烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與肼基菸鹼醯胺反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與4-甲醯基苯甲醯胺反應。
在實施例中，非天然存在之核酸探針具有式III：
Figure 02_image036
式III， 且包括反應性官能基（R），且反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在一個實施例中，反應性官能基為硫醇（-R為-SH）。
在實施例中，非天然存在之核酸探針進一步包括含有半抗原或生物素之非天然存在之5'修飾。在實施例中，半抗原包括螢光素、二硝基苯基或地高辛。在實施例中，修飾包括生物素。在實施例中，修飾包括硫醇。在實施例中，修飾為5'硫醇修飾劑C6 S-S（5ThioMC6-D）。
在實施例中，非天然存在之核酸探針具有式IV：
Figure 02_image038
式IV。
在實施例中，本發明提供包括結合至本文所述之非天然存在之核酸探針之偵測試劑的結合化合物。在實施例中，結合化合物之寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括SEQ ID NO:33之14或15個連續核苷酸。在實施例中，結合化合物之寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括SEQ ID NO:33之14或15個連續核苷酸，且進一步包括含有反應性官能基之非天然存在之5'修飾。在實施例中，結合化合物之寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括SEQ ID NO:33之14或15個連續核苷酸，且進一步包括硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，結合化合物之寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸，具有式III且包括SEQ ID NO:33之14或15個連續核苷酸：
Figure 02_image040
式III，其中R為反應性基團。在實施例中，反應性基團R為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，反應性基團R為硫醇（-R為-SH）。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，結合化合物之偵測試劑為結合試劑。在實施例中，結合化合物之偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，偵測試劑為抗體。在實施例中，非天然存在之核酸探針之寡核苷酸之長度為10至30個核苷酸。在實施例中，非天然存在之核酸探針之寡核苷酸之長度為14至19個核苷酸。在實施例中，非天然存在之核酸探針之寡核苷酸之長度為約14、約15、約16、約17、約18或約19個核苷酸。在實施例中，非天然存在之核酸探針之寡核苷酸之長度為14個核苷酸。在實施例中，非天然存在之核酸探針之寡核苷酸之長度為15個核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括與模板核酸序列之互補區。在實施例中，模板核酸序列為環狀核酸模板，或可連接以形成環狀核酸模板之線性核酸模板。在實施例中，環狀核酸模板為用於滾環擴增（RCA）之模板。在實施例中，核酸探針為用於RCA反應之引子，亦即延伸環狀核酸模板以形成延伸序列。
在實施例中，本發明之非天然存在之寡核苷酸比習知RCA模板寡核苷酸短。如同核酸探針，較短模板寡核苷酸提供更容易且更便宜合成及純化之優勢。較短模板寡核苷酸亦可增加分析靈敏度，因為相比於較長寡核苷酸，每單位時間在RCA反應中可擴增較短寡核苷酸之更多複本。在實施例中，本發明提供長度為約40至約100個核苷酸之非天然存在之寡核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸之5'端序列及3'端序列亦可分別稱為5'末端序列及3'末端序列。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:34）及5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為約50至約78個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為約50至約70個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為約53至約61個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為約54至約61個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸之長度為61個核苷酸。在實施例中，非天然存在之寡核苷酸包括約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75或約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。
在實施例中，寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。在實施例中，寡核苷酸由5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'（SEQ ID NO:43）組成。在實施例中，寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，寡核苷酸為可連接以形成環狀寡核苷酸，例如環狀RCA模板之線性寡核苷酸。寡核苷酸序列
表B為本文提供之寡核苷酸序列之概述。表 B. 寡核苷酸序列
SEQ ID NO: 描述及序列
1 硫醇修飾之鄰近探針1（其中U=2' O-甲基-RNA） SH-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU
2 硫醇修飾之鄰近探針2 SH-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT
3 錨定寡核苷酸 5'- AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3'
4 環化寡核苷酸1 Phosphate-CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA
5 環化寡核苷酸2 Phosphate-GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A
6 偵測探針 CAG TGA ATG CGA GTC CGT CT
7 偵測探針 5'-/5Biosg/ACATCGGTAGTT-3'
8 鄰近探針1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaCACTAAGCTGTTAGTCCATTACCGmUmUmU
9 鄰近探針2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaGCTGGAGGTTCAGACGATTTTGCG
10 環化寡核苷酸1 /5Phos/AACAGCTTAGTGACATCGGTAGTTAACAGATTGATCTTGACACA TCGGTAGTTCGCAAAATCGTC
11 環化寡核苷酸2 /5Phos/TGAACCTCCAGCTTTCGGTAATGGACT
12 錨定寡核苷酸 5'ACAGATTGATCTTGAAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/
13 鄰近探針1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaAGAGTCCAGAGGCAAAGCGTGAATmUmUmU
14 鄰近探針2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaGATAAGGAAGGGGCCTTAGCGACA
15 環化寡核苷酸1 /5Phos/CCTCTGGACTCTACATCGGTAGTTTGGAACATTTTATTCTAACA TCGGTAGTTTGTCGCTAAGGC
16 環化寡核苷酸2 /5Phos/CCCTTCCTTATCTTTATTCACGCTTTG
17 錨定寡核苷酸 5'GGAACATTTTATTCTAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/
18 鄰近探針1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaAACAACTCCGATTGCTTGCTTCTTmUmUmU
19 鄰近探針2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaTAGCCCTACGTGCCCTGCATAGAC
20 環化寡核苷酸1 /5Phos/ATCGGAGTTGTTACATCGGTAGTTCGCGCAGGTCGGGAATTACA TCGGTAGTTGTCTATGCAGGG
21 環化寡核苷酸2 /5Phos/CACGTAGGGCTATTTAAGAAGCAAGCA
22 錨定寡核苷酸 5'GCGCAGGTCGGGAATAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/
23 鄰近探針1 /5ThioMC6-D/AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGACGCTTmUmUmU
24 捕捉寡核苷酸1 Aagcgtcttaactatt
25 捕捉寡核苷酸2 Aagcgtcttaact
26 捕捉寡核苷酸3 Aagcgtcttaac
27 捕捉寡核苷酸4 Aagcgtcttaa
28 捕捉寡核苷酸5 Aagcgtctta
29 捕捉寡核苷酸6 Aagcgtctt
30 捕捉寡核苷酸7 Aagcgtct
31 經標記探針 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'
32 經標記探針 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'
33 核酸探針 5'-GACAGAACTAGACAC-3'
34 模板/連接寡核苷酸 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'
35 模板/連接寡核苷酸/錨定寡核苷酸 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'
36 模板/連接寡核苷酸 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTA CAGCAAGAGTGTCTA-3'
37 錨定寡核苷酸 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'
38 poly-A連接子 AAAAAAAAAA
39 探針結合序列 TAT GAC AGA ACT AGA CAC TCT T
40 核酸探針 5'-ACAGAACTAGACAC-3'
41 核酸探針 5'-GACAGAACTAGACA-3'
42 高GC核酸探針 TGCACAGC-TCGACGC 具有修飾 5'-/5ThioMC6-D/TGCACAGCTCGACGC
43 高GC環化寡核苷酸 GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG AGAGTAGTA CAGCAAGAGCGTCGA 具有修飾 /5Phos/GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGT AGTACAGCAAGAGCGTCGA
44 具有修飾之經標記探針 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/ 3AmMO/ -3'
45 具有修飾之錨定寡核苷酸 5'-/5AmMC6/AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA/3AmMC6T/ 3'（SEQ ID NO: 45）
表B中提供之寡核苷酸中之任一者可包括一或多個修飾。本文描述了寡核苷酸之修飾。在實施例中，表B中之寡核苷酸包括一或多個修飾以連接至另一物質，諸如標記、蛋白質或表面。在實施例中，表B中之寡核苷酸包括生物素、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、胺基、硫醇基、醛基、醯肼基、疊氮基、炔基、順丁烯二醯亞胺基及/或碘乙醯胺基。在實施例中，表B中之寡核苷酸包括表A中之修飾中之一或多者。
在實施例中，表B中之寡核苷酸包括5'胺基修飾劑C6（5AmMC6）、5'胺基修飾劑C12（5AmMC12）、胺基修飾劑C6 dT（5AmMC6T、iAmMC6T、3AmMC6T）、3'胺基修飾劑（3AmMO）、UNILINK™胺基修飾劑（5UniAmM、iUniAmM）、生物素（5Biosg、3Bio）、生物素-疊氮化物（5BioK、iBiodUK）、生物素dT（5BiodT、iBiodT、3BiodT）、生物素-TEG（5BioTEG、3BioTEG）、5'雙生物素（52-Bio）、5'可光裂解生物素（5PCBio）、去硫生物素-TEG（5deSBioTEG、ideSBioTEG、3deSBioTEG）、3'硫醇修飾劑C3 S-S（3ThioMC3-D）、二硫醇（5DTPA、iDTPA、3DTPA）、5'硫醇修飾劑C6 S-S（5ThioMC6-D）、5'己炔基（5Hexynyl）、5-辛二炔基（55OctdU、i5OctdU、35OctdU）、C3間隔子（5SpC3、iSpC3、3SpC3）、己二醇（3C6）、1'2'-二去氧核糖dSpacer（5dSp、idSp、3dSp）、可光裂解間隔子（5SpPC、iSpPC）、間隔子9（5Sp9、iSp9、3Sp9）、間隔子18（5Sp18、iSp18、3Sp18）、5' ACRYDITE™（5Acryd）、5'腺苷醯化作用（5rApp）、疊氮化物NHS酯（5AzideN、iAzideN、3AzideN）、3'膽固醇-TEG（3CholTEG）、地高辛NHS酯（5DigN、3DigN）、5' I-連接子（5ILink12）、磷酸化（5Phos、3Phos）、6-FAM疊氮化物（56-FAMK、i6-FAMK）、6-FAM NHS酯（56-FAMN、i6-FAMN）、5-TAMRA疊氮化物（55-TAMK、i5-TAMK）或其組合。將多肽與寡核苷酸結合之方法
在實施例中，本發明提供將核酸探針與偵測試劑結合以形成結合物之方法，及分析結合效率之方法。本發明因此提供標記及定量核酸探針與偵測試劑（例如抗體）之偶聯效率的簡單及定量方法。涉及偵測併入至核酸探針中之螢光標記的先前方法具有顯著缺點，諸如非特異性結合及增加之背景信號。此類缺點係由於例如螢光標記通常為大型疏水性殘基。在諸如本文所述之方法之超靈敏分析中，此類問題提出特別的挑戰。本發明方法消除與使用大分子（諸如螢光標記）定量偶聯效率相關之此類問題。
在實施例中，使用在與核酸結合時發螢光之化合物來測定核酸探針與偵測試劑之間的結合效率，以使得可定量結合物之核酸探針組分。在實施例中，在自結合物反應移除未反應之核酸探針之後，結合物首先使用特異性量測偵測試劑之量的分析定量，且接著使用特異性量測核酸探針組分之量的分析定量（藉由組合結合物及螢光化合物）。比較螢光信號與對照樣品，例如校準寡核苷酸可進一步確定是否存在最小充分結合（亦即，高於低對照之螢光信號），或是否存在未反應核酸探針之不充分移除（亦即，高於高對照之螢光信號）。
在實施例中，本發明提供將核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括：（a）使偵測試劑與核酸探針反應以形成結合物；（b）使用尺寸分離裝置將結合物與未反應之核酸探針分離以形成純化結合物；（c）形成包括純化結合物及核酸結合螢光團之樣品的測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當螢光團與核酸（例如單股或雙股）結合時增加的螢光強度進行選擇；及（d）量測測試組合物之螢光以確定結合物中寡核苷酸之量。
在實施例中，螢光團之螢光強度在螢光團結合至單股核酸時增加。在實施例中，螢光團之螢光強度在螢光團結合至雙股核酸時增加。在實施例中，螢光團為QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在實施例中，螢光團為SYBR Green I染料。
在實施例中，尺寸分離裝置經組態以將包括寡核苷酸及偵測試劑之結合物與未反應之核酸探針分離。在實施例中，用於將結合物與未反應之核酸探針分離的尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。在實施例中，尺寸分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。尺寸排阻層析基質之非限制性實例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN及其類似物，其中所列類型之基質中之每一者包含經組態以分離樣品中不同尺寸之化合物的不同珠粒尺寸。在實施例中，尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。在實施例中，尺寸排阻管柱為重力管柱、旋轉管柱、泵管柱或基於真空之管柱。
在實施例中，將核酸探針與偵測試劑結合之方法進一步包括形成至少一種包括已知量之校準寡核苷酸及螢光團的校準組合物，及量測螢光。在實施例中，確定純化結合物中寡核苷酸之量包括將自測試組合物量測之螢光與用一或多種校準組合物量測之螢光進行比較。在實施例中，將核酸探針與偵測試劑結合之方法進一步包括量測純化結合物中偵測試劑之濃度。在實施例中，偵測試劑濃度係使用蛋白質分析來量測。多種適合之蛋白質分析為此項技術中已知的。實例包含基於蛋白質-金屬螯合之方法（例如縮二脲法、BCA法、Lowry法）、基於蛋白質-染料相互作用之方法（例如Bradford（Coumassie）法、Quanti-iT法及Qubit法）及基於蛋白質胺基與胺反應性染料之反應之方法（例如CBQCAt法）-參見例如ThermoFisher Scientific之《蛋白質分析技術手冊（Protein Assay Technical Handbook）》, 2017）。在實施例中，使用BCA蛋白質分析來量測偵測試劑之濃度。在實施例中，方法進一步包括計算純化結合物中每一偵測試劑之結合寡核苷酸之平均數量。在實施例中，偵測試劑為結合試劑。在實施例中，偵測試劑為抗原結合物質。
典型結合方法涉及使結合物之第一組分與交聯劑反應、純化第一組分與交聯劑之反應產物，接著使反應產物與第二反應組分反應。然而，在某些情況下可能不期望中間純化步驟，諸如當僅存在有限量之結合物組分時，及/或當以小體積進行反應時。中間純化步驟對於整體工作流程亦可為繁重的。在本文所述之方法之實施例中，使用交聯劑將核酸探針與偵測試劑有效地結合，而無需在使交聯劑與核酸探針反應之前純化偵測試劑及交聯劑之反應產物，從而呈現相比於先前方法之改良。可由於反應物之莫耳比而消除中間純化步驟。
在實施例中，本發明提供使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括使偵測試劑及核酸探針與異雙官能交聯劑在其中偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應且核酸與交聯劑之第二反應性基團反應以形成結合物的條件下接觸，其中異雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑的第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團，其中方法不包含在交聯劑與核酸探針反應之前純化偵測試劑及交聯劑之反應產物。
在實施例中，方法包括在偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應，且核酸探針與交聯劑之第二反應性基團反應之條件下培育偵測試劑、交聯劑及核酸探針，以將偵測試劑及核酸探針連接至交聯劑且形成結合物。在實施例中，培育持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育持續約30分鐘至約4小時。在實施例中，培育持續約40分鐘至約2小時。在實施例中，培育持續約1小時。在實施例中，培育持續約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時或約8小時。
在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下。在實施例中，培育係在約18℃至約29℃下。在實施例中，培育係在約20℃至約28℃下。在實施例中，培育係在約21℃至約26℃下。在實施例中，培育係在約22℃至約24℃下。在實施例中，培育係在約23℃下。在實施例中，培育係在約15℃、約18℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃或約30℃下。在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育係在約18℃至約29℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約20℃至約28℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約21℃至約26℃下持續約30分鐘至約4小時。在實施例中，培育係在約22℃至約24℃下持續約40分鐘至約2小時。在實施例中，培育係在約23℃下持續約1小時。
在實施例中，本發明提供一種使核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括：（a）使偵測試劑與異雙官能交聯劑在其中偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應以形成第一組合物的條件下接觸，其中異雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑的第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團；（b）使第一組合物與核酸探針在其中交聯劑中之第二反應性基團與核酸探針反應以形成結合物的條件下接觸，其中方法不包含在交聯劑與核酸探針反應之前純化偵測試劑及交聯劑之反應產物。
在實施例中，方法包括在使偵測試劑與交聯劑之第一反應性基團反應以將偵測試劑連接至交聯劑以形成活化偵測試劑之條件下培育第一組合物、形成包括活化偵測試劑及核酸探針之第二組合物及在使核酸探針與交聯劑之第二反應性基團反應以形成結合物之條件下培育第二組合物。
在實施例中，培育持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育持續約30分鐘至約4小時。在實施例中，培育持續約40分鐘至約2小時。在實施例中，培育持續約1小時。在實施例中，培育持續約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時或約8小時。
在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下。在實施例中，培育係在約18℃至約29℃下。在實施例中，培育係在約20℃至約28℃下。在實施例中，培育係在約21℃至約26℃下。在實施例中，培育係在約22℃至約24℃下。在實施例中，培育係在約23℃下。在實施例中，培育係在約15℃、約18℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃或約30℃下。在實施例中，培育係在約15℃至約30℃下持續約10分鐘至約8小時。在實施例中，培育係在約18℃至約29℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約20℃至約28℃下持續約20分鐘至約6小時。在實施例中，培育係在約21℃至約26℃下持續約30分鐘至約4小時。在實施例中，培育係在約22℃至約24℃下持續約40分鐘至約2小時。在實施例中，培育係在約23℃下持續約1小時。
在實施例中，方法進一步包括使用尺寸分離裝置將結合物與未結合之核酸探針分離。在實施例中，方法進一步包括：使用尺寸分離裝置將結合物與未反應之核酸探針分離以產生純化結合物；形成包括純化結合物及核酸結合螢光團之測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當螢光團與核酸結合時增加的螢光強度進行選擇；及量測測試組合物之螢光以確定純化結合物中核酸探針之量。在實施例中，螢光團之螢光強度在螢光團結合至單股核酸時增加。在實施例中，螢光團之螢光強度在螢光團結合至雙股核酸時增加。在實施例中，螢光團為QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在實施例中，螢光團為SYBR Green I染料。在實施例中，量測每一結合物之核酸探針之數目，包括量測純化結合物中結合寡核苷酸之濃度及純化結合物中偵測試劑之量。在實施例中，偵測試劑為蛋白質，例如抗原結合物質。
在實施例中，將核酸探針與偵測試劑結合之方法進一步包括形成至少一種包括已知量之校準寡核苷酸及螢光團的校準組合物，及量測螢光。在實施例中，確定純化結合物中寡核苷酸之量包括將自測試組合物量測之螢光與用一或多種校準組合物量測之螢光進行比較。在實施例中，將核酸探針與偵測試劑結合之方法進一步包括使用蛋白質分析來量測純化結合物中偵測試劑之濃度。在實施例中，使用BCA蛋白質分析來量測偵測試劑之濃度。在實施例中，方法進一步包括計算純化結合物中每一偵測試劑之結合寡核苷酸之平均數量。在實施例中，結合化合物之偵測試劑為結合試劑。在實施例中，偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，偵測試劑為非核酸偵測試劑。
在實施例中，使用寡核苷酸分析來測試不同濃度下之多種寡核苷酸校準標準物以產生螢光相對於寡核苷酸濃度之校準曲線。接著將結合物之測試樣品之螢光相比於校準曲線以確定例如樣品中寡核苷酸之濃度。在實施例中以圖形方式或以數學方式進行此比較，例如藉由將校準點擬合至數學模型及使用該模型對來自測試樣品之螢光值進行反擬合以確定樣品中之寡核苷酸濃度。或者，使用對結合水準之更定性評估。舉例而言，以等於結合物中寡核苷酸之最小可接受濃度之水準測試單一濃度之寡核苷酸校準標準品（低對照樣品）：在此情況下，結合物樣品之螢光信號與低對照之螢光的簡單比較可用於確定結合物具有可接受之標記水準（結合物之螢光≥低對照之螢光）或不具有可接受之標記水準（結合物之螢光＜低對照之螢光）。類似地，亦可測試具有高於結合物中寡核苷酸之最大預期濃度之水準的另一寡核苷酸校準標準品（高對照樣品）；在此情況下，結合物之螢光信號與螢光信號之比較可用於確定結合物是否經過度標記或純化步驟是否未充分移除未結合之寡核苷酸（結合物之螢光＞高對照之螢光）。在實施例中，可接受之寡核苷酸濃度之範圍（表示為寡核苷酸之分子/結合物之分子的最小值至最大值）為1至8、1至6、2至5、2至4、3至4、1至2、或約1、約2或約3。
在實施例中，交聯劑之第一反應性基團包括胺反應性部分。胺基反應性部分可對多肽之游離胺基具有反應性，例如在多肽之N端處，或在多肽中之離胺酸殘基處。在實施例中，第一反應性基團包括活性酯（亦即，酯-C(O)OR，其中離去基HOR經選擇以使得酯與親核物質HNuc快速反應以形成結合物-C(O)Nuc，其對與親核試劑反應具有相對較高速率常數）。在實施例中，選擇活性酯以在溫和條件（例如6至9範圍內之pH及0至40℃之溫度）下容易地（例如以小於一天之時間標度）與蛋白質上之親核試劑（例如蛋白質上之離胺酸胺）反應，以形成結合物（例如藉由形成醯胺鍵）。在實施例中，第一反應性基團為酯，其中離去基為N-羥基丁二醯亞胺、N-羥基磺基丁二醯亞胺、羥基苯并三唑（HOBt）、1-羥基-7-氮雜苯并三唑（HOAt）或五氟苯酚。在實施例中，第一反應性基團包括N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯。在實施例中，N-羥基丁二醯亞胺或N-羥基磺基丁二醯亞胺首先與羧酸反應以形成N-羥基磺基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯，隨後與偵測試劑反應。
在實施例中，交聯劑之第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、活化二硫化物、硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，核酸探針包括硫醇部分且第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分；核酸探針包括烯烴或張力烯烴部分且第二反應性基團包括四嗪部分；核酸探針包括四嗪部分且第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分；核酸探針包括炔烴或張力炔烴部分且第二反應性基團包括疊氮化物部分；核酸探針包括疊氮化物部分且第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分；核酸探針包括4-甲醯基苯甲醯胺部分且第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分；或核酸探針包括肼基菸鹼醯胺部分且第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。在實施例中，核酸探針包括硫醇，且第二反應性基團為硫醇反應性基團。
在實施例中，第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分。在實施例中，第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團包括四嗪部分。在實施例中，第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分。在實施例中，第二反應性基團包括疊氮化物部分。在實施例中，第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分。在實施例中，第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團為硫醇反應性基團。
在實施例中，核酸探針包括硫醇，第一反應性基團為胺反應性基團，第二反應性基團為硫醇反應性基團，且異雙官能交聯劑為式V化合物：
Figure 02_image042
式V， 其中r為0與24之間的整數。在實施例中，r為1與20之間的整數。在實施例中，r為2與15之間的整數。在實施例中，r為3與10之間的整數。在實施例中，r為4。
在實施例中，交聯劑為同雙官能交聯劑。在實施例中，同雙官能交聯試劑包括第一及第二反應性基團，其中第一及第二反應性基團為相同官能基。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括四嗪部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括乙烯基或張力烯烴部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括疊氮化物部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括炔烴或張力炔烴部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括肼基菸鹼醯胺部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。在實施例中，第一及第二反應性基團各為硫醇反應性基團。
在實施例中，本發明提供將核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括使偵測試劑與同雙官能交聯劑接觸，其中同雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑之第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針之第二反應性基團，其中第一及第二反應性基團為相同官能基；移除未反應之交聯劑；接著使連接至交聯劑之偵測試劑與核酸探針接觸。
在實施例中，本發明提供將核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之方法，其包括使核酸探針與同雙官能交聯劑接觸，其中同雙官能交聯劑包括（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑之第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針之第二反應性基團，其中第一及第二反應性基團為相同官能基；移除未反應之交聯劑；接著使連接至交聯劑之核酸探針與偵測試劑接觸。
在實施例中，核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括5'修飾。在實施例中，核酸探針在5'末端處經硫醇部分修飾。在實施例中，核酸探針為式IIIA化合物：
Figure 02_image044
式IIIA。
在實施例中，核酸探針之寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。在實施例中，核酸探針之寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。在實施例中，核酸探針之寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，尺寸分離裝置經組態以將包括寡核苷酸及偵測試劑之結合物與未反應之核酸探針分離。在實施例中，用於將結合物與未反應之核酸探針分離的尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。在實施例中，尺寸分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。尺寸排阻層析基質之非限制性實例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN及其類似物，其中所列類型之基質中之每一者包含經組態以分離樣品中不同尺寸之化合物的不同珠粒尺寸。在實施例中，尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。在實施例中，尺寸排阻管柱為重力管柱、旋轉管柱、泵管柱或基於真空之管柱。在實施例中，偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，偵測試劑為非核酸偵測試劑。
在實施例中，控制結合反應中一或多種組分之莫耳比以使得可再現結合能夠實現每個結合物所期望數目個連接寡核苷酸，而無需中間純化步驟。在實施例中，交聯試劑相對於偵測試劑之量呈莫耳過量，且核酸探針之量相對於交聯劑之量呈莫耳過量。在實施例中，以相對於偵測試劑之量約1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍莫耳過量添加交聯劑之量。在實施例中，以約1.5至15、2至12、3至10或4至8之莫耳過量（相對於偵測試劑）添加交聯劑之量。在實施例中，交聯劑之量為相對於偵測試劑之量至少10倍莫耳過量。在實施例中，交聯劑之量為相對於偵測試劑之量至少六倍莫耳過量。在實施例中，交聯劑之量為相對於偵測試劑之量至少五倍莫耳過量。在實施例中，交聯劑之量為相對於偵測試劑之量至少四倍莫耳過量。在實施例中，核酸探針之莫耳量為交聯劑之莫耳量的至少1.1倍。在實施例中，核酸探針之莫耳量為交聯劑之莫耳量的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2.0倍。在實施例中，方法使得至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%之偵測試劑與核酸探針結合。在實施例中，方法使得至少95%之偵測試劑與核酸探針結合。
在實施例中，使用本文所提供之方法將超過一個核酸探針與偵測試劑結合。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約2或更大。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約1至約20。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約2至約15。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約2至約7。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約3至約6。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約2至約4。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約3至約4。在實施例中，與結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數目為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20或大於20。
因此，在實施例中，結合物包括偵測試劑及約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20或大於20個核酸探針。
在實施例中，偵測試劑為蛋白質且結合物為式VI化合物：
Figure 02_image046
式VI， 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且-NH-為源自蛋白質之胺基。在實施例中，核酸探針之寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14至15個連續寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。在實施例中，r為1至20。在實施例中，r為2至15。在實施例中，r為3至10。在實施例中，r為4。在實施例中，r為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在實施例中，x為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在實施例中，x為1。在實施例中，x為2。
在實施例中，式VI之結合物係藉由包括以下之方法產生：（a）形成包括偵測試劑及核酸探針之結合物，包括（i）使偵測試劑與異雙官能交聯劑中之NHS酯部分反應以形成活化偵測試劑；（ii）使異雙官能交聯劑中之順丁烯二醯亞胺部分與核酸探針之含硫醇寡核苷酸反應以形成結合物；（iii）移除未反應之核酸探針，其中交聯劑為式VII化合物：
Figure 02_image048
式VII， 其中r為0與24之間的整數。
與本文所述之方法一起使用時，結合物之偵測試劑可為本文提供之任何偵測試劑。舉例而言，偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。適用於結合方法之偵測試劑不限於本申請案中所述之分析之偵測試劑。因此，在結合之情況下，結合物之偵測試劑不限於在本文之分析方法中使用。在結合方法及結合物自身之情況下，偵測試劑可因此用於任何其他適合及適當之應用，例如本文未明確描述之額外分析方法中。用於將多肽與寡核苷酸結合之套組
在實施例中，本發明提供用於將核酸探針與非核酸偵測試劑結合以形成結合物之套組，其包括：（a）包括以下之異雙官能交聯劑：（i）能夠與偵測試劑反應以將交聯劑連接至偵測試劑之第一反應性基團，及（ii）能夠與核酸探針反應以將交聯劑連接至核酸探針，同時基本上不對偵測試劑具有反應性的第二反應性基團；（b）能夠將結合物與未反應之核酸探針分離之第一尺寸分離裝置；及（c）核酸結合螢光團，其中螢光團之螢光強度在螢光團結合至核酸時增加。在實施例中，螢光團之螢光強度在螢光團結合至單股核酸時增加。
在實施例中，交聯劑之第一反應性基團包括胺反應性部分。胺基反應性部分可對多肽之游離胺基具體反應性，例如在多肽之N端處，或在多肽中之離胺酸殘基處。在實施例中，第一反應性基團包括活性酯（亦即，酯-C(O)OR，其中離去基HOR經選擇以使得酯與親核物質HNuc快速反應以形成結合物-C(O)Nuc，其對與親核試劑反應具有相對較高速率常數）。在實施例中，選擇活性酯以在溫和條件（例如6至9範圍內之pH及0至40℃之溫度）下容易地（例如以小於一天之時間標度）與蛋白質上之親核試劑（例如蛋白質上之離胺酸胺）反應，以形成結合物（例如藉由形成醯胺鍵）。在實施例中，第一反應性基團為酯，其中離去基為N-羥基丁二醯亞胺、N-羥基磺基丁二醯亞胺、N-羥基磺基丁二醯亞胺、羥基苯并三唑（HOBt）、1-羥基-7-氮雜苯并三唑（HOAt）或五氟苯酚。在實施例中，第一反應性基團包括N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯。在實施例中，N-羥基丁二醯亞胺或N-羥基磺基丁二醯亞胺首先與羧酸反應以形成N-羥基磺基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯，隨後與偵測試劑反應。
在實施例中，交聯劑之第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、活化二硫化物、硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，核酸探針包括硫醇部分且第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分；核酸探針包括烯烴或張力烯烴部分且第二反應性基團包括四嗪部分；核酸探針包括四嗪部分且第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分；核酸探針包括炔烴或張力炔烴部分且第二反應性基團包括疊氮化物部分；核酸探針包括疊氮化物部分且第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分；核酸探針包括4-甲醯基苯甲醯胺部分且第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分；或核酸探針包括肼基菸鹼醯胺部分且第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。在實施例中，核酸探針包括硫醇，且第二反應性基團為硫醇反應性基團。
在實施例中，第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分。在實施例中，第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團包括四嗪部分。在實施例中，第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分。在實施例中，第二反應性基團包括疊氮化物部分。在實施例中，第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分。在實施例中，第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。在實施例中，第二反應性基團為硫醇反應性基團。
在實施例中，核酸探針包括硫醇，第一反應性基團為胺反應性基團，第二反應性基團為硫醇反應性基團，且異雙官能交聯劑為式V化合物：
Figure 02_image050
式V， 其中r為0與24之間的整數。在實施例中，r為1與20之間的整數。在實施例中，r為2與15之間的整數。在實施例中，r為3與10之間的整數。在實施例中，r為4。
在實施例中，套組進一步包括核酸探針。在實施例中，核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括5'修飾。在實施例中，核酸探針在5'末端處經硫醇部分修飾。在實施例中，核酸探針為式IIIA化合物：
Figure 02_image052
式IIIA。在實施例中，核酸探針之寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，第一尺寸分離裝置經組態以將包括寡核苷酸及偵測試劑之結合物與未反應之核酸探針分離。在實施例中，用於將結合物與未反應之核酸探針分離的第一尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。在實施例中，第一尺寸分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。尺寸排阻層析基質之非限制性實例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN及其類似物，其中所列類型之基質中之每一者包含經組態以分離樣品中不同尺寸之化合物的不同珠粒尺寸。在實施例中，尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。在實施例中，尺寸排阻管柱為重力管柱、旋轉管柱、泵管柱或基於真空之管柱。
在實施例中，螢光團為QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在實施例中，螢光團為SYBR Green I染料。
在實施例中，套組進一步包括校準寡核苷酸。在實施例中，校準寡核苷酸之濃度隨套組提供。在實施例中，校準寡核苷酸結合至螢光團。在實施例中，不同濃度之校準寡核苷酸與螢光團一起使用，以產生使螢光強度與寡核苷酸濃度相關之校準曲線。
在實施例中，套組進一步包括第二尺寸分離裝置，用於在結合之前使偵測試劑脫鹽。如本文所用，「脫鹽（desalt/desalting）」或其變體係指交換其中儲存有特定高分子量化合物之溶液（或緩衝液）之低分子量組分的過程，且亦稱為「緩衝液交換」。在實施例中，第二尺寸分離裝置經組態以將偵測試劑自適合於儲存（例如在4℃、-20℃或-80℃下儲存偵測試劑）之緩衝液脫鹽至適合於與核酸探針進行結合反應之緩衝液中。在實施例中，第二尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之分子自分子量大於50,000道爾頓之偵測試劑分離的分子量截斷。在實施例中，第二尺寸分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之脫鹽管柱。尺寸排阻層析基質之非限制性實例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN及其類似物，其中所列類型之基質中之每一者包含經組態以分離樣品中不同尺寸之化合物的不同珠粒尺寸。在實施例中，脫鹽為重力管柱、旋轉管柱、泵管柱或基於真空之管柱。
在實施例中，偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，偵測試劑為非核酸偵測試劑。在實施例中，套組組分在單個包裝中。在實施例中，套組組分在一或多個小瓶、包裝或容器中。
與本文所述之套組一起使用時，結合物之偵測試劑可為本文提供之任何偵測試劑。舉例而言，偵測試劑可為抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。適合與結合套組一起使用之偵測試劑不限於本申請案中所述之分析之偵測試劑。因此，在結合之情況下，結合物之偵測試劑不限於在本文之分析方法中使用。在結合方法及結合物自身之情況下，偵測試劑可因此用於任何其他適合及適當之應用，例如本文未明確描述之額外分析方法中。使用兩種抗體之偵測方法
在實施例中，本發明提供使用兩種抗體，特定言之一種捕捉抗體及一種偵測抗體來偵測樣品中之所關注分析物的方法。儘管三抗體（3-Ab）形式可就特異性而言提供一些優勢，但二抗體（2-Ab）分析形式更易於開發、需要更少試劑（若用於目標之可用試劑有限，則其可為優勢）且可更適合於由於小尺寸、存在非免疫原性序列或存在高度可變序列而不具有可用於結合之三個正交抗原決定基的目標。
2-Ab分析之挑戰包含確定盤格式及塗佈濃度、可行性、用於分析之各種寡核苷酸之序列、捕捉抗體及錨定寡核苷酸塗佈濃度、用於結合偵測抗體及核酸探針之方法、評估結合效率之方法、純化技術、緩衝液組分等。本發明之組合物及方法克服此類挑戰。
在實施例中，本發明提供一種偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：將分析物結合至（i）包括用於分析物之捕捉試劑之表面上的捕捉試劑，其中表面塗佈有抗生蛋白鏈菌素且捕捉試劑包括生物素；及（ii）包括核酸探針的用於分析物之單一偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之複合物；延伸核酸探針以形成延伸序列；及使用經標記探針量測與表面結合之延伸序列的量。
在實施例中，本發明提供偵測樣品中之所關注分析物之方法，其包括：將分析物結合至（i）包括用於分析物之捕捉試劑及錨定試劑之表面上的捕捉試劑，其中表面塗佈有抗生蛋白鏈菌素且捕捉試劑及錨定試劑包括生物素；及（ii）包括核酸探針的用於分析物之單一偵測試劑；由此在表面上形成包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之複合物；延伸核酸探針以形成包括結合錨定試劑之錨定區的延伸序列；將延伸序列與錨定試劑結合；及使用經標記探針量測與表面結合之延伸序列的量。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中的捕捉試劑及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成包括與經標記探針之寡核苷酸互補之偵測序列補體的延伸序列；（c）將包括寡核苷酸之經標記探針與延伸序列結合；及（d）量測與結合域結合之經標記探針的量，其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中的捕捉試劑，其中結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之寡核苷酸互補之偵測序列補體的延伸序列；（c）將包括寡核苷酸之經標記探針與延伸序列結合；及（d）量測與結合域結合之經標記探針的量，其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量；其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中結合域進一步包括具有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列、能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量；其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括在溶液中形成偵測試劑與分析物之間的複合物，接著擴增，例如藉由RCA，其中擴增產物經由捕捉試劑及/或錨定試劑結合至表面。在實施例中，表面為粒子。在實施例中，表面為電極。視情況，在經由捕捉試劑及/或錨定試劑與表面結合之前過濾擴增產物。
在實施例中，量測分析物之方法包括：（a）在溶液中將分析物結合至（i）包括靶向試劑之捕捉試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，由此在溶液中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成包括與經標記探針之寡核苷酸互補之偵測序列補體的延伸序列；（c）將捕捉試劑結合至包括與靶向試劑互補之靶向試劑補體之表面上的結合域；（d）將包括寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（e）量測與結合域結合之經標記探針的量，其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，量測分析物之方法包括：（a）在溶液中將分析物結合至（i）捕捉試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，由此在溶液中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之寡核苷酸互補之偵測序列補體的延伸序列；（c）將延伸序列結合至表面上之結合域中之錨定寡核苷酸；（d）將包括寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（e）量測與結合域結合之經標記探針的量，其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，量測分析物之方法包括：（a）在溶液中將分析物結合至包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸，由此在溶液中形成包括分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之寡核苷酸互補之偵測序列補體的延伸序列；（e）將延伸序列結合至表面上之結合域中的錨定試劑；（f）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（g）量測與結合域結合之經標記探針的量；其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，及（ii）式VI之結合物：
Figure 02_image054
式VI， 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且-NH-為源自蛋白質之胺基；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成延伸序列；及（c）量測與結合域結合之延伸序列的量。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中結合域進一步包括錨定寡核苷酸，及（ii）式VI之結合物：
Figure 02_image056
式VI， 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自蛋白質之胺基的結合形式；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）延伸結合物之核酸探針以形成包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體的延伸序列；及（c）量測與結合域結合之延伸序列的量。
在實施例中，蛋白質為偵測試劑。在實施例中，r為1至20。在實施例中，r為2至15。在實施例中，r為3至10。在實施例中，r為4。在實施例中，r為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在實施例中，x為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在實施例中，x平均為約2至4，或約3。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，及（ii）式VI之結合物：
Figure 02_image058
式VI， 其中「蛋白質」為偵測試劑，r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自蛋白質之胺基的結合形式；其中結合物包括偵測試劑及核酸探針，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定寡核苷酸，及（ii）式VI之結合物：
Figure 02_image060
式VI， 其中「蛋白質」為偵測試劑，r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自蛋白質之胺基的結合形式；其中結合物包括偵測試劑及核酸探針，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列、能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量。
在實施例中，蛋白質為偵測試劑。在實施例中，r為1至20。在實施例中，r為2至15。在實施例中，r為3至10。在實施例中，r為4。在實施例中，r為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在實施例中，x為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在實施例中，x平均為約2至4，或約3。在實施例中，結合物包括含有第一及第二探針序列之寡核苷酸。在實施例中，結合物藉由本文提供之方法產生。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列及與第二探針序列互補之3'末端序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）量測與結合域結合之延伸序列的量；其中第一及第二探針序列之長度總和為14至24個核苷酸。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中結合域進一步包括具有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的內部序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）量測與結合域結合之延伸序列的量；其中第一及第二探針序列之長度總和為14至24個核苷酸。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的內部序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量；其中第一及第二探針序列之長度總和為14至24個核苷酸。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中結合域進一步包括具有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及第二探針序列之寡核苷酸；由此在結合域中形成包括捕捉試劑、分析物及結合物之複合物；（b）將複合物中之核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中連接寡核苷酸包括與第一探針序列互補之5'末端序列、與第二探針序列互補之3'末端序列、能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列；（c）將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸；（d）藉由滾環擴增延伸核酸探針以形成延伸序列；（e）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（f）量測與結合域結合之經標記探針的量；其中第一及第二探針序列之長度總和為14至24個核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括長度為約10至約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約28個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約26個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約24個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約11至約22個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約21個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約20個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約18個核苷酸之寡核苷酸。
在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約10至約30個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約12至約28個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約13至約26個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約14至約24個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約11至約22個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約12至約21個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約13至約20個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之長度總和為約14至約18個核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括長度為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約15個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸的寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括寡核苷酸，其中寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，第一及第二探針序列之組合長度為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之組合長度為約14個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列之組合長度為約15個核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列組合地包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列組合地長度為14至24個核苷酸且包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，第一及第二探針序列組合地包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。在實施例中，第一及第二探針序列組合地包括序列5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。在實施例中，第一及第二探針序列組合地包括序列5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。在實施例中，第一及第二探針序列組合地包括序列5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）。
在實施例中，核酸探針包括含有反應性官能基之非天然存在之5'修飾。官能基之非限制性實例包含例如烯烴及張力烯烴、炔烴、鹵化物、醇、硫醇、胺、磷酸鹽、醛、酮、羧酸、羧酸鹽、醯胺、酯、硫酯、醯基磷酸鹽、酸鹵化物、腈、酸酐、肼、四嗪、疊氮化物及其類似物。在實施例中，反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，反應性官能基為硫醇。在實施例中，反應性官能基為四嗪。在實施例中，反應性官能基為乙烯基或張力烯烴。在實施例中，反應性官能基為疊氮化物。在實施例中，反應性官能基為炔烴或張力炔烴。在實施例中，反應性官能基為4-甲醯基苯甲醯胺。在實施例中，反應性官能基為肼基菸鹼醯胺。
在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與本發明之異雙官能交聯劑反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與四嗪反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與乙烯基或張力烯烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與疊氮化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與炔烴或張力炔烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與肼基菸鹼醯胺反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與4-甲醯基苯甲醯胺反應。
在實施例中，核酸探針具有式IIIA：
Figure 02_image062
式IIIA， 且包括反應性官能基，且反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。
在實施例中，核酸探針進一步包括含有半抗原或生物素之非天然存在之5'修飾。在實施例中，半抗原包括螢光素、二硝基苯基或地高辛。在實施例中，修飾包括生物素。
在實施例中，核酸探針具有式IV：
Figure 02_image064
式IV。
在實施例中，核酸探針包括與模板核酸序列上之一或多個序列互補的一或多個序列。在實施例中，模板核酸序列為環狀核酸模板，或可連接（一旦與核酸探針雜交）以形成環狀核酸模板之線性核酸模板。在實施例中，環狀核酸模板為用於滾環擴增（RCA）之模板。在實施例中，核酸探針為用於RCA反應之引子，亦即延伸環狀核酸模板以形成延伸序列。
在實施例中，經標記探針包括寡核苷酸及電化學發光部分。在實施例中，經標記探針包括一或多個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括寡核苷酸及多個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括（i）與寡核苷酸之經修飾之核苷酸鹼基連接的一或多個（或兩個或更多個）標記，（ii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之5'端連接，（iii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之3'端連接，或（iv）（i）、（ii）及（iii）中之兩者或更多者之組合。在實施例中，經標記探針具有式I：
Figure 02_image066
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，且n為0與5之間的整數。
在實施例中，R包括釕錯合物RP1 P2 P3 ，其中P1 、P2 及P3 中之每一者獨立地為聯吡啶、經取代之聯吡啶、啡啉或經取代之啡啉。在實施例中，化學發光標記R為
Figure 02_image068
。
在實施例中，B為在尿嘧啶之5位處連接至L1 之尿嘧啶。
在實施例中，L1 包括
Figure 02_image070
、
Figure 02_image072
或其組合，其中p為1與12之間的整數。
在實施例中，L2 包括
Figure 02_image074
，
Figure 02_image076
，
Figure 02_image078
，或其組合，其中q為0與11之間的整數。
在實施例中，本發明提供式II之經標記探針：
Figure 02_image080
式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
Figure 02_image082
。在實施例中，j為0與5之間的整數，k為0，m為0與5之間的整數，且n為2與7之間的整數。在實施例中，k為0，j為0，m為1，且n為5。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少85%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少88%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少90%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少95%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少98%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少99%序列一致性之序列。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括一或多種本文所述之修飾。在實施例中，經標記探針包括胺基修飾劑。在實施例中，經標記探針包括內部胺基修飾之dT鹼基（iAmMC6T）。在實施例中，經標記探針包括內部間隔子18（iSp18）。在實施例中，經標記探針包括3'胺基修飾劑（3AmMO）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'- CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'（具有修飾之SEQ ID NO:44）。
在實施例中，核酸探針與連接寡核苷酸之一部分互補。在實施例中，第一及第二探針序列各自與連接寡核苷酸之不同部分互補。在實施例中，連接寡核苷酸為線性寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸為用於擴增之模板寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸經連接以形成用於RCA之環狀模板寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之5'末端序列與第一或第二探針序列中之一者互補，且連接寡核苷酸之3'末端序列與第一或第二探針序列中之另一者互補。
在實施例中，連接寡核苷酸之第一內部序列能夠與錨定試劑之錨定寡核苷酸的補體雜交。在實施例中，連接寡核苷酸之第一內部序列與錨定寡核苷酸具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。在實施例中，自連接寡核苷酸擴增之延伸序列包括與錨定寡核苷酸互補之序列。
在實施例中，連接寡核苷酸之第二內部序列能夠與經標記探針之寡核苷酸（偵測寡核苷酸）之補體雜交。在實施例中，連接寡核苷酸之第二內部序列與經標記探針之偵測寡核苷酸具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。在實施例中，自連接寡核苷酸擴增之延伸序列包括與經標記探針之偵測寡核苷酸互補的序列。
在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸之5'端序列及3'端序列亦可分別稱為5'末端序列及3'末端序列。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:34）及5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約40至約100個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約78個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約70個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約54至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75或約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在實施例中，連接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。在實施例中，寡核苷酸由5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'（SEQ ID NO:43）組成。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸為可連接以形成環狀寡核苷酸，例如環狀RCA模板之線性寡核苷酸。
在實施例中，本發明之錨定寡核苷酸比習知錨定寡核苷酸短。如同核酸探針及模板寡核苷酸，較短錨定寡核苷酸提供更容易且更便宜合成及純化之優勢。較短錨定寡核苷酸亦可藉由減少來自可存在於樣品中之結合試劑，例如可存在於血液樣品中之抗DNA抗體的非特異性結合來提高分析靈敏度。在實施例中，錨定試劑包括錨定寡核苷酸，且錨定寡核苷酸之長度為約10至約30個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約15至約28個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17至約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，錨定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO:37）組成。在實施例中，錨定試劑包括胺基修飾劑。在實施例中，胺基修飾劑為5'胺基修飾劑C6（5AmMC6）。在一些實施例中，胺基修飾劑為3'胺基修飾之dT鹼基（3AmMC6T）。在實施例中，錨定試劑包括5'-/5AmMC6/AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA/3AmMC6T/ 3'（具有修飾之SEQ ID NO:45）。
在實施例中，錨定試劑在將分析物結合至捕捉試劑之前、期間或之後連接至表面。因此，在包括套組之實施例中，錨定試劑可與表面分開提供且接著固定於表面上，其中表面包括固定於其上之捕捉試劑。在實施例中，錨定試劑在捕捉試劑已固定於表面上之後及添加包括分析物之樣品之前固定於表面上。在實施例中，錨定試劑在將包括分析物之樣品添加至包括固定捕捉試劑之表面期間固定至表面上。在實施例中，錨定試劑在形成包括分析物、捕捉試劑及偵測試劑之複合物之後固定至表面上。在實施例中，錨定試劑與偵測試劑同時添加至表面。在實施例中，錨定試劑在延伸步驟之前添加至表面。在實施例中，洗滌步驟先於將錨定試劑添加至表面。在實施例中，其中在將包括分析物之樣品添加至表面之後添加錨定試劑，且在添加錨定試劑之前進行洗滌步驟，洗滌步驟消除樣品中之潛在干擾，例如歸因於樣品-DNA相互作用，諸如分析物-DNA相互作用或抗DNA反應性（例如在抗DNA抗體之情況下）、DNA結合蛋白或DNA或RNA。在實施例中，錨定試劑及捕捉試劑包括不同靶向試劑，且表面包括能夠結合至不同靶向試劑之靶向試劑補體。在一些實施例中，靶向試劑補體為抗體，且錨定試劑包括能夠結合至抗體靶向試劑補體之抗原。舉例而言，錨定試劑可包括二硝基苯酚（DNP），且表面可包括抗DNP抗體。
在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑為蛋白質。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑為抗體。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為抗體。
捕捉及偵測試劑，例如捕捉及偵測抗體之選擇及其效能將取決於抗體特徵，包含親和力、純度、降解、聚集、解離速率及與其他分析物及抗體之非特異性結合。特徵為具有低水準之降解及聚集之高親和力結合抗體可為較佳的。
分析之靈敏度、特異性及形式可受捕捉抗體及偵測抗體之選擇影響，捕捉抗體及偵測抗體各自必須識別分析物上之不同的不重疊抗原決定基。通常，鑑別抗體對之最全面方式為測試捕捉抗體形式及偵測抗體形式之抗體之各組合。
對於許多分析，較佳地，捕捉抗體及偵測抗體均為單株抗體，其各自識別獨特抗原決定基。單株抗體通常更易於在批次之間複製且可大量產生，從而使得分析壽命延長。由於試劑可用性或所期望靈敏度，可能無法選擇兩種單株抗體。在實施例中，當使用單株抗體及多株抗體兩者時，較佳使用單株抗體作為捕捉抗體且使用多株抗體作為偵測抗體。
使用多株抗體之潛在優勢為其可含有多種識別不同抗原決定基之抗體，從而產生更高親合力。當多株抗體未經親和純化時，其含有可能導致非特異性問題或降低分析效能之非特異性抗體。親和純化之多株抗體比藉由蛋白A或G純化之多株抗體具有更大特異性，但其仍可展現批次間變化性，因為各批次可為抗體之不同混合物。當使用多株抗體作為捕捉抗體時，其可含有共用或阻斷偵測抗體抗原決定基之一群抗體，從而導致信號或靈敏度降低。
在方法之實施例中，錨定試劑及捕捉試劑各包括能夠與靶向試劑補體結合之靶向試劑，結合域包括固定於其上之靶向試劑補體，且方法進一步包括將錨定試劑及捕捉試劑結合至結合域。經由使用靶向試劑及靶向試劑補體將試劑固定至結合域中之方法、此等方法形成陣列之用途、此等陣列於分析中之用途以及例示性靶向試劑及靶向試劑補體描述於美國專利第10,189,023號中。本文描述了將捕捉試劑及錨定試劑直接或間接固定至表面之方法，例如經由使用靶向試劑。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，靶向試劑為生物素且靶向試劑補體為抗生蛋白鏈菌素。
本文提供了用於本發明之適合表面，且包含在結合分析技術中用作固相支撐物之表面。在實施例中，表面為粒子。在實施例中，表面為珠粒。本文提供粒子及珠粒之非限制性實例，且包含以珠粒-陣列分析形式使用之珠粒（諸如以LUMINEX商標出售之彼等）及磁珠（諸如用於Roche ELECSYS電化學發光分析中之彼等）。在實施例中，表面包括多孔盤之孔。在實施例中，表面包括複數個不同結合域。在實施例中，表面包括電極。在實施例中，電極為碳墨電極。在實施例中，表面包括電極且方法之偵測步驟包括向電極施加電位及量測電化學發光。在實施例中，向電極施加電位產生電化學發光信號。多重方法
在實施例中，本發明提供量測複數種分析物之方法。在實施例中，方法包括重複本文提供之量測分析物之方法的一或多個步驟，以量測一或多種額外分析物，其中各分析物結合至相同表面或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物的經標記探針為式I化合物：
Figure 02_image084
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，且n為0與5之間的整數。
在實施例中，R包括釕錯合物RP1 P2 P3 ，其中P1 、P2 及P3 中之每一者獨立地為聯吡啶、經取代之聯吡啶、啡啉或經取代之啡啉。在實施例中，化學發光標記R為
Figure 02_image086
。
在實施例中，B為在尿嘧啶之5位處連接至L1 之尿嘧啶。
在實施例中，L1 包括
Figure 02_image088
、
Figure 02_image090
或其組合，其中p為1與12之間的整數。
在實施例中，L2 包括
Figure 02_image092
，
Figure 02_image094
，
Figure 02_image096
，或其組合，其中q為0與11之間的整數。
在實施例中，本發明提供式II之經標記探針：
Figure 02_image098
式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
Figure 02_image100
。在實施例中，j為0與5之間的整數，k為0，m為0與5之間的整數，且n為2與7之間的整數。在實施例中，k為0，j為0，m為1，且n為5。
在實施例中，用於各分析物之經標記探針包括相同寡核苷酸。在實施例中，寡核苷酸由5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）組成。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少85%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少88%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少90%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少95%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少98%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少99%序列一致性之序列。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括一或多種本文所述之修飾。在實施例中，經標記探針包括胺基修飾劑。在實施例中，經標記探針包括內部胺基修飾之dT鹼基（iAmMC6T）。在實施例中，經標記探針包括內部間隔子18（iSp18）。在實施例中，經標記探針包括3'胺基修飾劑（3AmMO）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'- CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'（具有修飾之SEQ ID NO:44）。
在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物的連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，用於各分析物之連接寡核苷酸的長度為53至61個核苷酸。在實施例中，用於各分析物之連接寡核苷酸具有相同序列。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸之5'端序列及3'端序列亦可分別稱為5'末端序列及3'末端序列。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:34）及5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約40至約100個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約78個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約70個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約54至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75或約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在實施例中，連接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。在實施例中，寡核苷酸由5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'（SEQ ID NO:43）組成。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸為可連接以形成環狀寡核苷酸，例如環狀RCA模板之線性寡核苷酸。
在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物之核酸探針的長度為14至19個核苷酸。在實施例中，用於一或多個額外分析物中之各分析物之核酸探針的長度為14個核苷酸。在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物之核酸探針的長度為15個核苷酸。在實施例中，核酸探針之長度為小於24個核苷酸。在實施例中，核酸探針之長度為小於19個核苷酸。在實施例中，核酸探針之長度為小於15個核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約10至約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約28個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約26個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約24個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約11至約22個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約21個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約20個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約18個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸的寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括寡核苷酸，其中寡核苷酸之長度為14至19個核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物的結合物具有相同核酸探針序列。在實施例中，核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，提供包括錨定寡核苷酸之錨定試劑，且用於一或多種額外分析物中之各分析物之錨定寡核苷酸的長度為17至25個核苷酸。在實施例中，錨定試劑包括錨定寡核苷酸，且錨定寡核苷酸之長度為約10至約30個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約15至約28個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17至約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個核苷酸。在實施例中，相同錨定寡核苷酸用於一或多種額外分析物中之各分析物。在實施例中，錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，錨定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO:37）組成。
在實施例中，不同偵測試劑用於各分析物。在實施例中，相同偵測試劑用於各分析物。在實施例中，不同捕捉試劑用於各分析物。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑包括蛋白質。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑包括抗體。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑包括抗原結合物質。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為抗體。
在實施例中，表面包括複數個結合域，且各分析物在複數個結合域中之不同結合域中形成複合物。在實施例中，表面為粒子。在實施例中，表面為珠粒。在實施例中，表面為盤。在實施例中，表面為多孔陣列中之孔。在實施例中，表面包括電極。在實施例中，電極為碳墨電極。在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物的各結合域在獨立表面上，且表面為珠粒陣列中之珠粒。在實施例中，用於一或多種額外分析物中之各分析物的各結合域在單一表面上，且結合域在表面上形成捕捉試劑陣列之元件。在實施例中，表面包括電極且方法之偵測步驟包括向電極施加電位及量測電化學發光。在實施例中，向電極施加電位產生電化學發光信號。
在實施例中，藉由使一或多個表面與包括複數種分析物之單一液體體積接觸來並行地進行各分析物與其對應捕捉試劑之結合。在實施例中，複數種分析物包含分析物及一或多種額外分析物。在實施例中，對於各分析物並行地進行方法之各步驟。在實施例中，方法為同時多重分析。表面上分析物之多重量測描述於本文中；另外參見例如美國專利第7,842,246號及第6,977,722號。
在實施例中，各結合域包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑補體，且各錨定試劑及捕捉試劑包括能夠結合至連接試劑之補充連接試劑，且方法進一步包括如下地將捕捉試劑及錨定試劑固定於各結合域中：（1）經由補充連接試劑將捕捉及錨定試劑結合至與連接試劑連接的靶向試劑補體；及（2）將步驟（1）之產物結合至包括靶向試劑補體之結合域，其中（i）各結合域包括不同靶向試劑補體，及（ii）各靶向試劑補體選擇性地結合至靶向試劑中之一者。
因此，在實施例中，表面包括靶向試劑補體；靶向試劑連接至連接試劑；且捕捉試劑及錨定試劑中之每一者包括補充連接試劑。因此，在實施例中，表面上之靶向試劑補體結合至靶向試劑，靶向試劑連接至連接試劑，連接試劑結合至捕捉試劑及錨定試劑上之補充連接試劑。
在實施例中，連接試劑具有多於一個用於補充連接試劑之結合位點，且捕捉試劑及錨定試劑之固定進一步包括：經由補充連接試劑將捕捉及錨定試劑結合至與連接試劑連接的靶向試劑；及將產物結合至包括靶向試劑補體之結合域，其中（i）各結合域包括不同靶向試劑補體，及（ii）各靶向試劑補體選擇性地結合至靶向試劑中之一者。例如，在靶向劑為寡核苷酸、連接試劑為抗生蛋白鏈菌素且補充連接試劑為生物素之情況下，生物素標記之寡核苷酸可結合至抗生蛋白鏈菌素之四個生物素結合位點中之第一個，以形成與連接試劑連接之靶向試劑。生物素標記之捕捉試劑（亦即，與補充連接試劑連接之捕捉試劑）可隨後結合至抗生蛋白鏈菌素上其餘的生物素結合位點，以將靶向劑連接至捕捉試劑。
例示性靶向試劑及靶向試劑補體為本文所述的。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，靶向試劑為生物素且靶向試劑補體為抗生蛋白鏈菌素。在實施例中，連接試劑及補充連接試劑對為與靶向試劑及靶向試劑補體對不同的結合搭配物對。在實施例中，連接試劑為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，且補充連接試劑為生物素。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為互補寡核苷酸。
可在分析最佳化期間選擇用於本文所述之分析之各種試劑的濃度。在實施例中，用於結合至表面之捕捉試劑的濃度為約0.01 μg/mL至約0.5 μg/mL；約0.1 μg/mL至約0.4 μg/mL；約0.2 μg/mL至約0.3 μg/mL；或約0.25 μg/mL。在實施例中，用於結合至表面之捕捉試劑的濃度為小於0.25 μg/mL。在實施例中，用於結合至分析物之偵測試劑的濃度為約0.01 μg/mL至約0.5 μg/mL；約0.05 μg/mL至約0.3 μg/mL；約0.1 μg/mL至約0.2 μg/mL；或約0.125 μg/mL。在實施例中，用於結合至分析物之偵測試劑的濃度為約0.125 μg/mL。
本文所述之分析方法可具有在其期間發生結合或其他類型之反應的分析步驟。例如，方法可包括以下中之一或多者：（i）將分析物結合至捕捉試劑及包括偵測試劑及核酸探針之偵測結合物，（ii）延伸核酸探針以形成延伸序列，（iii）將延伸序列結合至錨定寡核苷酸，（iv）將延伸序列結合至經標記偵測探針，及（v）量測經標記探針。在另一實例中，方法可包括以下中之一或多者：（i）將分析物結合至捕捉試劑及包括偵測試劑及核酸探針之偵測結合物，（ii）將連接寡核苷酸結合至核酸探針，（iii）將連接序列連接以形成環狀模板，（iv）進行環狀模板之滾環擴增以延伸核酸探針及形成延伸序列，（v）將延伸序列結合至錨定寡核苷酸，（vi）將延伸序列結合至經標記偵測探針，及（vii）量測經標記探針。應瞭解，某些陳述步驟內之不同反應可依序或同時進行（例如，分析物與捕捉試劑及偵測結合物之結合可同時進行，或可首先進行分析物與捕捉試劑之結合，接著進行與偵測結合物之結合，或可首先進行分析物與偵測試劑之結合，接著進行與偵測結合物之結合）。亦應理解，某些步驟亦可同時進行（例如核酸探針之延伸及偵測探針之結合可依序或同時進行）。
亦應理解，在一些情況下，可藉由在具有此等類型之反應的一或多個步驟之後進行「洗滌」步驟以將溶液中之未反應或殘餘材料移除遠離表面且防止其干擾表面處之後續反應或表面量測，來改良包括結合或其他涉及固定於表面上之材料之所進行反應之方法的效能。例如，在涉及分析物或試劑結合至表面的步驟之後，洗滌步驟可用於自接觸表面之溶液移除未結合之分析物或試劑。在另一實例中，在涉及表面結合物質之連接、延伸或擴增的步驟之後，洗滌步驟可用於自接觸表面之溶液移除過量未結合之反應物或酶。可例如使用手動洗滌方法，或使用自動洗盤機（例如BIOTEK 405 LS Microplate Washers）進行洗滌步驟。當使用自動洗盤機進行本文所述之分析時，在實施例中，可藉由使用低分配流動速率及藉由將分配尖端定位於孔之外邊緣（例如朝向孔之一側偏移的水平分配）來獲得最佳結果。可在本文提供之分析的偵測步驟之後使用低流動速率分配洗滌，且所有其他洗滌步驟可使用預設洗滌程式。或者，可以良好再現性進行手動洗滌，其限制條件為洗滌緩衝液經完全移除。亦應理解，包括結合或其他反應之步驟可能需要一定量的時間以進展至所期望程度（培育時間），且其可在所選溫度下進行以提供最有效或最佳效能。在實施例中，使分析物與表面上之捕捉試劑結合的培育時間為約1分鐘至24小時、約5分鐘至4小時、約9分鐘至2小時、約9分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時或約2小時。在實施例中，此步驟之培育溫度為約10℃至50℃、15℃至40℃、約室溫、約25℃、約27℃、約30℃或約37℃。
在實施例中，使偵測結合物與分析物結合（其可與使分析物與捕捉試劑結合同時或依序進行）之時間為約1分鐘至24小時、約5分鐘至4小時、約9分鐘至2小時、約9分鐘、約1小時或約2小時。在實施例中，此步驟之培育溫度為約10℃至50℃、15℃至40℃、約室溫、約25℃、約27℃、約30℃或約37℃。
在實施例中，使連接寡核苷酸與偵測結合物中之核酸探針結合及將連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸（其可同時或依序進行）之時間為約1分鐘至24小時、約5分鐘至4小時、約9分鐘至2小時、約9分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時或約2小時。在實施例中，此步驟之培育溫度為約10℃至50℃、15℃至40℃、約室溫、約25℃、約27℃、約30℃或約37℃。
在實施例中，延伸核酸探針（例如藉由滾環擴增）之時間為約1分鐘至24小時、約5分鐘至4小時、約9分鐘至2小時、約9分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時或約2小時。在實施例中，此步驟之培育溫度為約10℃至50℃、15℃至40℃、約室溫、約25℃、約27℃、約30℃或約37℃。
在實施例中，（i）依序進行將分析物結合至表面及將偵測結合物結合至分析物，各自在室溫（約18至27℃）下持續1至2小時，各自接著進行洗滌步驟，（ii）在室溫下持續約30分鐘同時進行連接寡核苷酸之結合及連接，接著進行洗滌步驟，及/或（iii）在約27℃之設定溫度下經約1小時同時進行滾環擴增、偵測探針結合及（若存在錨定寡核苷酸）與錨定寡核苷酸結合，接著進行洗滌步驟。
在一個實施例中，表面為磁珠（例如抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠）且分析步驟包含：（i）將生物素標記之捕捉試劑及偵測結合物（包括核酸探針）結合至分析物以形成包括捕捉試劑、分析物及偵測結合物之複合物；（ii）在抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠上捕捉複合物，（iii）將核酸探針結合至連接寡核苷酸及將連接寡核苷酸連接以形成環狀寡核苷酸模板，（iv）藉由滾環擴增延伸核酸探針及將偵測探針結合至擴增產物，及（v）將珠粒引入至流量槽中且藉由施加磁場捕捉電極上之珠粒、向電極施加電位及進行電化學發光量測以量測珠粒上之偵測探針的量。珠粒可提供有預結合之錨定寡核苷酸、生物素標記之錨定寡核苷酸可在步驟（ii）期間添加或錨定寡核苷酸可在獨立步驟中結合至珠粒；在此等情況下，方法亦將包含將延伸探針結合至錨定寡核苷酸。在實施例中，各持續設定培育時間進行個別步驟（若在同時操作中進行兩個或更多個步驟，則此同時操作在時間為預設之培育時間）。在實施例中，持續相同培育時間進行各步驟或操作。在實施例中，此培育時間為每個步驟或操作約9分鐘。在實施例中，持續約9分鐘之數倍的培育時間進行各步驟或操作。在實施例中，在步驟（ii）、步驟（iii）及/或步驟（iv）之後洗滌磁珠（例如藉由使用磁體在管中收集磁珠且自管中移除液體）。亦可在於流量槽中收集珠粒之操作期間洗滌珠粒。
在實施例中，偵測步驟包括使延伸序列與本文提供之經標記探針接觸。在實施例中，將延伸序列及經標記探針培育約1分鐘至24小時、約5分鐘至4小時、約9分鐘至2小時、約30分鐘至90分鐘、約9分鐘、約30分鐘、約1小時、約90分鐘或約2小時。在實施例中，此步驟之培育溫度為約10℃至50℃、15℃至40℃、約室溫、約23℃、約25℃、約27℃、約30℃或約37℃。在實施例中，偵測步驟包括使延伸序列與經標記探針在約27℃下接觸約60分鐘。偵測步驟可經修改以使分析靈敏度及信號:背景比最佳化。兩個參數可能對此等因素之影響最大：（1）溫度及（2）偵測步驟之培育時間。一般而言，信號及背景均隨著溫度及培育時間的增加而增加。若期望更短的培育時間，則可能最佳的是提高溫度或改變其他分析參數中之一者以增加信號。或者，若分析背景極低及/或需要更多信號，則可增加偵測步驟培育時間及/或溫度以增加信號且潛在地增加靈敏度。在背景信號過高之情況下，較低溫度可與較短培育時間組合。此可使得特定信號與背景一起減少，但可產生增加的信號:背景比。在實施例中，一旦確定了較佳培育時間及溫度，就不應在分析執行之間改變時間及溫度，以提高分析一致性。例如，可使用恆溫振盪器或其他可控溫度振盪器來獲得培育溫度及時間的一致性。用於雙抗體分析之套組
在實施例中，本發明提供一種用於進行分析之套組，其包括：（a）根據本發明之經標記探針；（b）連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列及3'末端核苷酸序列，其中5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交，及內部核苷酸序列，該內部核苷酸序列能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交；（c）核酸連接酶；及（d）核酸聚合酶。
在實施例中，本發明提供一種用於進行分析之套組，其包括：（a）包括錨定寡核苷酸之錨定試劑；（b）根據本發明之經標記探針；（c）連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列及3'末端核苷酸序列，其中5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交；能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部核苷酸序列；及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部核苷酸序列；（d）核酸連接酶；及（e）核酸聚合酶。
在實施例中，本發明提供一種用於進行分析之套組，其包括：（a）經標記探針；（b）連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交，及內部核苷酸序列，該內部核苷酸序列能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交；（d）核酸連接酶；及（e）核酸聚合酶；其中5'及3'末端核苷酸序列不與內部序列重疊，5'及3'末端序列之長度總和為14至24個核苷酸的長度，且連接寡核苷酸之長度為53至76個核苷酸。
在實施例中，本發明提供一種用於進行分析之套組，其包括：（a）包括錨定寡核苷酸之錨定試劑；（b）經標記探針；（c）連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交；能夠與錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部核苷酸序列；及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部核苷酸序列；（d）核酸連接酶；及（e）核酸聚合酶；其中5'及3'末端核苷酸序列不與第一及第二內部序列重疊，5'及3'末端序列之長度總和為14至24個核苷酸的長度，且連接寡核苷酸之長度為53至76個核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括長度為約10至約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約28個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約26個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約24個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約11至約22個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約12至約21個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約13至約20個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14至約18個核苷酸之寡核苷酸。
在實施例中，核酸探針包括長度為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約14個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括長度為約15個核苷酸之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括寡核苷酸，其中寡核苷酸之長度為14至24個核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。
在實施例中，經標記探針包括寡核苷酸（其可稱為偵測寡核苷酸）及電化學發光部分。在實施例中，經標記探針包括一或多個電化學發光標記。在實施例中，經標記探針包括寡核苷酸及多個電化學發光標記。經標記探針可包含（i）與寡核苷酸之經修飾之核苷酸鹼基連接的一或多個（或兩個或更多個）標記，（ii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之5'端連接，（iii）具有一或多個（或兩個或更多個）標記之經標記部分，該部分與寡核苷酸之3'端連接，或（iv）（i）、（ii）及（iii）中之兩者或更多者之組合。
在實施例中，經標記探針具有式I：
Figure 02_image102
式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，且n為0與5之間的整數。
在實施例中，R包括釕錯合物RP1 P2 P3 ，其中P1 、P2 及P3 中之每一者獨立地為聯吡啶、經取代之聯吡啶、啡啉或經取代之啡啉。在實施例中，化學發光標記R為
Figure 02_image104
。
在實施例中，B為在尿嘧啶之5位處連接至L1 之尿嘧啶。
在實施例中，L1 包括
Figure 02_image106
、
Figure 02_image108
或其組合，其中p為1與12之間的整數。
在實施例中，L2 包括
Figure 02_image110
，
Figure 02_image112
，
Figure 02_image114
，或其組合，其中q為0與11之間的整數。
在實施例中，本發明提供式II之經標記探針：
Figure 02_image116
式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
Figure 02_image118
。在實施例中，j為0與5之間的整數，k為0，m為0與5之間的整數，且n為2與7之間的整數。在實施例中，k為0，j為0，m為1，且n為5。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或約100%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少85%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少88%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少90%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少95%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少98%序列一致性之序列。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括與5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少99%序列一致性之序列。
在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括一或多種本文所述之修飾。在實施例中，經標記探針包括胺基修飾劑。在實施例中，經標記探針包括內部胺基修飾之dT鹼基（iAmMC6T）。在實施例中，經標記探針包括內部間隔子18（iSp18）。在實施例中，經標記探針包括3'胺基修飾劑（3AmMO）。在實施例中，經標記探針之寡核苷酸包括5'- CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'（具有修飾之SEQ ID NO:44）。
在實施例中，核酸探針包括第一及第二核酸探針序列，其彼此相鄰且各自與連接寡核苷酸之一部分互補。在實施例中，連接寡核苷酸為線性寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸為用於擴增之模板寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸經連接以形成用於RCA之環狀模板寡核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之5'末端序列與第一或第二核酸序列中之一者互補，且連接寡核苷酸之3'末端序列與第一或第二核酸探針序列中之另一者互補。藉由選擇連接寡核苷酸之適當5'及3'末端序列以及適當互補第一及第二探針序列，連接子與核酸探針之結合將連接子之鈍端置於附近（亦即，連接子上之兩個末端核苷酸為與核酸探針上之相鄰核苷酸結合之氫），以使得能夠在連接酶存在下連接以形成環狀寡核苷酸模板。
在實施例中，連接寡核苷酸具有第一內部序列，且連接寡核苷酸之第一內部序列能夠與錨定試劑之錨定寡核苷酸之補體雜交。在實施例中，連接寡核苷酸之第一內部序列與錨定寡核苷酸具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。在實施例中，自連接寡核苷酸擴增之延伸序列包括與錨定寡核苷酸互補之序列。
在實施例中，連接寡核苷酸之內部序列（或若存在第一內部序列，則為連接寡核苷酸之第二內部序列）能夠與經標記探針之寡核苷酸之補體雜交。在實施例中，連接寡核苷酸之內部序列（或第二內部序列）與經標記探針之寡核苷酸具有70%、至少70%、75%、至少75%、80%、至少80%、85%、至少85%、90%、至少90%、95%、至少95%、97%、至少97%、98%、至少98%、99%或至少99%或100%序列一致性。在實施例中，自連接寡核苷酸擴增之延伸序列包括與經標記探針之偵測寡核苷酸互補的序列。
在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸之5'端序列及3'端序列亦可分別稱為5'末端序列及3'末端序列。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:34）及5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約40至約100個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約78個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約76個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約50至約70個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約54至約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約61個核苷酸。在實施例中，連接寡核苷酸之長度為約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75或約76個核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在實施例中，連接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在實施例中，連接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。在實施例中，寡核苷酸由5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'（SEQ ID NO:43）組成。在實施例中，連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。在實施例中，連接寡核苷酸為可連接以形成環狀寡核苷酸，例如環狀RCA模板之線性寡核苷酸。
在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為10至30個核苷酸的長度。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為12至25個核苷酸的長度。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為14至19個核苷酸的長度。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個核苷酸。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為約14個核苷酸。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為約15個核苷酸。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為小於19個核苷酸。在實施例中，5'及3'末端序列之長度總和為小於15個核苷酸。
在實施例中，包含錨定試劑且錨定試劑包括錨定寡核苷酸，且錨定寡核苷酸之長度為約10至約30個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約15至約28個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17至約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，錨定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO:37）組成。在實施例中，錨定試劑為
Figure 02_image120
。
在實施例中，套組進一步包括核酸探針，其包括與連接寡核苷酸之5'末端序列互補的第一序列及與連接寡核苷酸之3'末端序列互補的相鄰第二序列。
在實施例中，套組進一步包括用於分析物之捕捉試劑，及用於分析物之偵測試劑，其中捕捉試劑及偵測試劑能夠結合至分析物以形成複合物，且偵測試劑連接至核酸探針，該核酸探針包括與連接寡核苷酸之5'末端序列互補的第一序列及與連接寡核苷酸之3'末端序列互補的相鄰第二序列。
在實施例中，套組進一步包括用於複數種分析物之複數種捕捉試劑，及用於複數種分析物之一或多種偵測試劑，其中對於各分析物，套組包括能夠與分析物結合以形成複合物之捕捉試劑及偵測試劑，且一或多種偵測試劑各自連接至核酸探針，該核酸探針包括與連接寡核苷酸之5'末端序列互補的第一序列及與連接寡核苷酸之3'末端序列互補的相鄰第二序列。
在實施例中，核酸探針包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。在實施例中，核酸探針包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。在實施例中，核酸探針包括序列5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。在實施例中，核酸探針包括序列5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。在實施例中，核酸探針包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'（SEQ ID NO:42）之寡核苷酸。在實施例中，核酸探針包括含有反應性官能基之非天然存在之5'修飾。官能基之非限制性實例包含例如烯烴及張力烯烴、炔烴、鹵化物、醇、硫醇、胺、磷酸鹽、醛、酮、羧酸、羧酸鹽、醯胺、酯、硫酯、醯基磷酸鹽、酸鹵化物、腈、酸酐、肼、四嗪、疊氮化物及其類似物。在實施例中，反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。在實施例中，反應性官能基為硫醇。在實施例中，反應性官能基為四嗪。在實施例中，反應性官能基為乙烯基或張力烯烴。在實施例中，反應性官能基為疊氮化物。在實施例中，反應性官能基為炔烴或張力炔烴。在實施例中，反應性官能基為4-甲醯基苯甲醯胺。在實施例中，反應性官能基為肼基菸鹼醯胺。
在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與本發明之異雙官能交聯劑反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與四嗪反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與乙烯基或張力烯烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與疊氮化物反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與炔烴或張力炔烴反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與肼基菸鹼醯胺反應。在實施例中，非天然存在之5'修飾能夠與4-甲醯基苯甲醯胺反應。
在實施例中，非天然存在之核酸探針具有式IIIA：
Figure 02_image122
式IIIA， 且包括反應性官能基，且反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。
在實施例中，核酸探針進一步包括含有半抗原或生物素之非天然存在之5'修飾。在實施例中，半抗原包括螢光素、二硝基苯基或地高辛。在實施例中，修飾包括生物素。
在實施例中，核酸探針具有式IV：
Figure 02_image124
式IV。
在實施例中，核酸探針包括與模板核酸序列之互補區。在實施例中，模板核酸序列為環狀核酸模板，或可連接以形成環狀核酸模板之線性核酸模板。在實施例中，環狀核酸模板為用於滾環擴增（RCA）之模板。在實施例中，核酸探針為用於RCA反應之引子，亦即延伸環狀核酸模板以形成延伸序列。
在實施例中，核酸探針結合至偵測試劑。在實施例中，偵測試劑為蛋白質且結合物為式VI化合物：
Figure 02_image126
式VI， 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且-NH-為源自蛋白質之胺基。在實施例中，r為1至20。在實施例中，r為2至15。在實施例中，r為3至10。在實施例中，r為4。在實施例中，r為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在實施例中，x為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在實施例中，x為1。在實施例中，x為2。
在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑為蛋白質。在實施例中，捕捉試劑及/或偵測試劑為抗原結合物質。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為蛋白質。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑為抗體。
在實施例中，錨定試劑進一步包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑。在實施例中，錨定試劑及捕捉試劑各自包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑。在實施例中，套組進一步包括在其上固定有靶向試劑補體之固相支撐物。靶向試劑及靶向試劑補體為本文所述的。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，靶向試劑為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，且靶向試劑補體為生物素。在實施例中，靶向試劑補體為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，且靶向試劑為生物素。
在實施例中，固相支撐物包括表面。本文提供了用於本發明之適合之表面及固相支撐物，且包含在結合分析技術中用作固相支撐物之表面。在實施例中，固相支撐物為電極。在實施例中，固相支撐物為碳基電極。在實施例中，套組包括多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括碳墨電極。在實施例中，固相支撐物為粒子。在實施例中，固相支撐物為珠粒。
在實施例中，錨定試劑包括錨定寡核苷酸，且錨定寡核苷酸之長度為約10至約30個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約15至約28個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17至約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸之長度為約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個核苷酸。在實施例中，錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。在實施例中，錨定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO:37）組成。在實施例中，錨定試劑為
Figure 02_image128
。
在實施例中，套組進一步包括固相支撐物，且錨定試劑固定於固相支撐物上。在實施例中，套組進一步包括固相支撐物，且錨定試劑及捕捉試劑固定於固相支撐物上。本文描述了將錨定試劑及捕捉試劑固定於諸如固相支撐物之表面上之方法。
在實施例中，固相支撐物包括表面。在實施例中，固相支撐物為電極。在實施例中，固相支撐物為碳基電極。在實施例中，套組包括多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括碳墨電極。在實施例中，固相支撐物為粒子。在實施例中，固相支撐物為珠粒。
在包括複數種捕捉試劑之套組的實施例中，套組進一步包括固相支撐物，且錨定試劑及捕捉試劑固定於固相支撐物上以形成陣列，其中各陣列元件包括複數種捕捉試劑及錨定試劑中之一者。在實施例中，固相支撐物包括表面。在實施例中，固相支撐物為電極。在實施例中，固相支撐物為碳基電極。在實施例中，套組包括多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括碳墨電極。在實施例中，固相支撐物為粒子。在實施例中，固相支撐物為珠粒。
在包括複數種捕捉試劑之套組的實施例中，套組進一步包括一或多個固相支撐物，且錨定試劑及捕捉試劑固定於一或多個固相支撐物上以形成陣列，其中各陣列元件包括複數種捕捉試劑及錨定試劑中之一者。在實施例中，套組包括複數個固相支撐物，且各固相支撐物具有至少一個陣列元件。在實施例中，套組包括複數個固相支撐物，且各固相支撐物僅具有一個陣列元件。在實施例中，固相支撐物包括表面。在實施例中，固相支撐物為電極。在實施例中，固相支撐物為碳基電極。在實施例中，套組包括多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括電極中之一者。在實施例中，固相支撐物為粒子。在實施例中，固相支撐物為珠粒陣列中之珠粒。
在包括複數種捕捉試劑之套組的實施例中，套組進一步包括具有固定於一或多個固相支撐物上之複數種不同靶向試劑補體的陣列，各陣列元件包括不同靶向試劑補體，且不同靶向試劑補體中之每一者為不同靶向試劑之結合搭配物。在實施例中，捕捉試劑連接至不同靶向試劑中之一者，且捕捉試劑中之每一者連接至不同靶向試劑。此外，將錨定試劑分為複數個各自具有至少一個錨定試劑複本之部分，且各部分中之錨定試劑連接至不同靶向試劑。因此，在實施例中，固相支撐物包括靶向試劑補體，且捕捉試劑及錨定試劑中之每一者包括靶向試劑。在實施例中，各捕捉試劑及錨定試劑部分可分開提供，連接至相同靶向試劑之所有試劑/部分以混合物形式且與其他試劑分開提供，所有捕捉試劑以混合物形式提供且所有錨定試劑部分以混合物形式提供，或所有捕捉試劑及錨定試劑部分以一種混合物形式提供。
在實施例中，捕捉試劑包括補充連接試劑；錨定試劑包括補充連接試劑；靶向試劑連接至連接試劑；且連接試劑為補充連接試劑之結合搭配物。因此，在實施例中，固相支撐物包括靶向試劑補體，靶向試劑補體結合至與連接試劑連接之靶向試劑，連接試劑結合至捕捉試劑及錨定試劑上之補充連接試劑。
例示性靶向試劑及靶向試劑補體為本文所述的。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，靶向試劑為生物素且靶向試劑補體為抗生蛋白鏈菌素。在實施例中，連接試劑及補充連接試劑對為與靶向試劑及靶向試劑補體對不同的結合搭配物對。在實施例中，連接試劑為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，且補充連接試劑為生物素。在實施例中，靶向試劑及靶向試劑補體為互補寡核苷酸。
在實施例中，陣列在一個固相支撐物上，且固相支撐物為電極。在實施例中，固相支撐物為碳基電極。在實施例中，套組包括多孔盤分析消耗品，且盤之各孔包括碳墨電極。在一些實施例中，固相支撐物為粒子。在實施例中，陣列之各元件在不同固相支撐物上，且固相支撐物為珠粒。在實施例中，連接試劑及補充連接試劑為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，連接試劑為生物素且補充連接試劑為抗生蛋白鏈菌素。在實施例中，連接試劑為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，且補充連接試劑為生物素。
在實施例中，本發明之套組進一步包括以下中之一或多者：阻斷試劑、結合分析反應緩衝液、連接酶反應緩衝液、聚合酶反應緩衝液、ECL讀取緩衝液及/或獨特產品標識符。阻斷試劑可用於降低分析背景信號、防止非特異性結合及/或穩定偵測複合物以改良偵測。在實施例中，結合分析反應緩衝液、連接酶反應及/或聚合酶反應緩衝液中之每一者為Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液或HEPES緩衝液。在實施例中，結合分析反應緩衝液、連接酶反應緩衝液及聚合酶反應緩衝液為相同緩衝液。在實施例中，結合分析反應緩衝液、連接酶反應及/或聚合酶反應緩衝液之鹽濃度為約10 mM至約1 M、約20 mM至約500 mM、約30 mM至約100 mM、約40 mM至約80 mM或約50 mM。在實施例中，結合分析反應緩衝液、連接酶反應及/或聚合酶反應緩衝液包括NaCl、KCl、(NH4 )2 SO4 、Na2 SO4 或CH3 COONH4 。在實施例中，聚合酶反應緩衝液之鹽濃度為約50 mM。在實施例中，聚合酶反應緩衝液包括KCl。在實施例中，聚合酶反應緩衝液包括濃度為約50 mM之KCl。在實施例中，ECL讀取緩衝液包括三丙胺。在實施例中，ECL讀取緩衝液包括丁基二乙醇胺。在實施例中，獨特產品標識符為「條形碼」寡核苷酸序列，例如允許鑑別對應核苷酸或分子之短核苷酸（通常長度為約5至約40個核苷酸）。額外實施例
在實施例中，本文提供之偵測及量測分析物之方法可呈競爭性分析形式。一般而言，競爭性分析，例如競爭性免疫分析或競爭性抑制分析，分析物及競爭物競爭結合至結合試劑。在此類分析中，通常藉由直接量測競爭物來間接量測分析物。如本文所用，「競爭物」係指如下化合物：能夠與分析物結合至相同結合試劑，使得結合試劑，例如抗原結合物質或抗體可僅結合分析物或競爭物，但不結合二者。在實施例中，競爭性分析用於偵測及量測不能結合超過一種結合試劑之分析物，例如小分子分析物或不具有超過一個不同結合位點之分析物。舉例而言，若結合試劑為抗體，則一種抗體與小分析物之結合產生阻止第二抗體結合之位阻。本文描述了適合於競爭性分析之分析物之實例。競爭性免疫分析之其他實例包含美國專利第4,235,601號；第4,442,204號；及第5,028,535號中所述之彼等。
在競爭性分析之上下文中，「捕捉試劑」及「偵測試劑」可指結合試劑，例如抗原結合物質或抗體；或者，「捕捉試劑」及「偵測試劑」可為分析物之競爭物。在競爭性分析之實施例中，捕捉試劑或偵測試劑中之一者如本文所定義，且捕捉試劑或偵測試劑中之另一者為分析物之競爭物，例如經修飾小分子，諸如激素。在實施例中，競爭物包括本發明之核酸探針。在實施例中，競爭物具有與分析物相同的結構且包括標記或探針，例如可偵測標記或核酸探針。在實施例中，競爭物具有與分析物類似的結構且包括標記或探針，例如可偵測標記或核酸探針。在實施例中，競爭物之組成可與分析物極不同，只要其能夠與分析物競爭分析中所用之結合試劑（例如經選擇以結合至結合試劑中之分析物識別位點或袋之核酸或肽適體）。此類適體可使用此項技術中確立的用於篩選肽或核酸之方法選擇，例如藉由關於具有所期望結合活性之適體篩選肽或核酸之隨機文庫。
在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）激素。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）半抗原。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）代謝物。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）內分泌激素（諸如雌激素或睾固酮）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone）、生長激素（例如人類生長激素或重組人類生長激素）或破壞環境內分泌之化學物質，諸如Tian等人, 《農業化學及生物技術（Chemical and Biological Technologies in Agriculture）》 5:5 (2018)中揭示之彼等。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）碳水化合物或碳水化合物衍生物，諸如糖苷，諸如洋地黃毒苷或水楊苷。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）脂質，例如膽固醇。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）半抗原，例如地高辛。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）維生素，例如維生素A、維生素B、葉酸、維生素C、維生素D、維生素E、維生素K及其類似物。在實施例中，分析物為（或分析物及競爭物各為）半抗原，例如苯胺及其衍生物、漆酚、聯胺肼、氟烷、螢光素、生物素、地高辛及二硝基苯酚。在實施例中，競爭物為捕捉試劑。在實施例中，競爭物為偵測試劑且包括核酸探針。
在實施例中，競爭物結合至表面，且分析物及偵測試劑（例如包括偵測抗體及核酸探針之結合物）在溶液中，且競爭物與分析物競爭結合至偵測試劑。在此類實施例中，包括競爭物及偵測試劑之表面上的複合物經偵測及量測，且競爭物之量測量用於確定分析物之量。在實施例中，捕捉試劑結合至表面，分析物及可偵測標記之競爭物在溶液中，且可偵測標記之競爭物與分析物競爭結合至捕捉試劑。在此類實施例中，包括捕捉試劑及可偵測標記之競爭物之表面上的複合物經偵測及量測，且競爭物之量測量用於確定分析物之量。在實施例中，捕捉試劑、偵測試劑與分析物（如上文所述）之間的競爭性反應係在溶液中進行，且捕捉試劑隨後固定於表面上（例如經由使用包括靶向部分之捕捉試劑及包括靶向部分補體之表面）。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至表面上之結合域中之第一捕捉試劑，其中結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑；（b）將包括偵測試劑及核酸探針之結合物結合至結合域中之第二捕捉試劑，以形成包括第二捕捉試劑及結合物之複合物，其中偵測試劑為與分析物競爭結合至第一及第二捕捉試劑之競爭物；（c）延伸複合物中之結合物之核酸探針以形成延伸序列，其包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之偵測寡核苷酸互補之偵測序列補體；（d）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（e）量測結合至結合域之經標記探針的量；其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
在實施例中，本發明提供量測分析物之方法，其包括：（a）將分析物結合至包括第一偵測試劑及核酸探針之第一結合物；（b）將表面上之結合域中之捕捉試劑結合至包括第二偵測試劑及核酸探針之第二結合物，以形成包括捕捉試劑及第二結合物之複合物，其中（i）結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）捕捉試劑為用於結合至第一及第二偵測試劑之分析物之競爭物；（c）延伸複合物中之第二結合物之核酸探針以形成延伸序列，其包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之偵測寡核苷酸互補之偵測序列補體；（d）將包括偵測寡核苷酸之經標記探針結合至延伸序列；及（e）量測結合至結合域之經標記探針的量；其中經標記探針為根據本發明之經標記探針。
另外，本文所述之方法可用於偵測及定量寡聚分析物。若目標抗原為同源寡聚物，亦即具有兩個或更多個相同次單位之抗原，則偵測抗體需要用連接模板寡核苷酸及引子寡核苷酸獨立地標記。此可導致低效率，因為僅具有模板寡核苷酸之兩種抗體或僅具有引發寡核苷酸之兩種抗體可結合且此類非生產性複合物可降低此方法之靈敏度。此問題可在此方法應用於偵測特定寡聚結構時加劇，其中使用額外特定模板寡核苷酸以允許特異性偵測寡聚物。因此，本文所述之方法可包含預先形成一組偵測抗體，其經組態以有效結合所期望寡聚物分析物，以及用於形成滾環模板之模板。此可使用額外寡核苷酸序列，例如骨架寡核苷酸實現，該額外寡核苷酸序列可與抗體偶聯之寡核苷酸特異性雜交，以使得在偵測抗體混合物中以寡聚形式組態之抗體匹配目標抗原寡聚物。此預組織步驟允許偵測抗體與目標寡聚物之最佳結合。在偵測抗體與寡聚物抗原結合後，可經由核酸外切酶降解或另一適合之化學方法或核酸內切酶處理來移除骨架寡核苷酸。一旦移除骨架寡核苷酸，便可如本文所述地進行鄰近連接滾環擴增。
在另一實施例中，本文所述之分析形式進一步包含一或多個對照分析。可在結合域上包含陰性對照，該結合域包含不具有對應偵測抗體之捕捉抗體，從而為所有樣品提供一致背景信號。高於預設臨限值之信號的量測可指示不當分析處理或存在引起經標記偵測探針之非特異性結合的樣品依賴性基質效應。此外，在針對執行多種控制功能之人類目標抗原（諸如分泌或細胞內蛋白）的分析中，亦可包含樣本對照。正信號將指示存在人類材料，且因此測試樣品添加及品質。人類抗原亦可充當細菌抗原提取之方法對照。例如，可選擇細胞內人類分析物作為亦需要偵測溶解及萃取之樣本對照，例如Akt。低於預定義臨限值之信號的量測將指示未添加樣品、試劑或方法發生故障或存在干擾擴增或偵測之物質。除了內部對照以外，外部陽性及陰性對照亦可用於該方法及/或套組。陽性對照可包括代表藉由多重組偵測之所有特異性目標抗原的非感染性細菌提取物之混合物，在測試時對於所有分析提供正信號。陰性對照包括無任何目標蛋白之代表性基質。
可藉由本發明之方法分析之樣品之實例包含但不限於食品樣品（包含食品提取物、食品勻漿、飲料等）、環境樣品（例如土壤樣品、環境污泥、收集之環境氣溶膠、環境濕巾、水濾液等）、工業樣品（例如來自工業生產過程之起始物質、產物或中間物）、人類臨床樣品、獸醫樣品及其他生物來源之樣品。可分析之生物樣品包含但不限於糞便、黏膜拭子、生理樣品及/或含有細胞懸浮液之樣品。生物樣品之特定實例包含血液、血清、血漿、糞便、黏膜拭子、組織抽出物、組織勻漿、細胞培養物及細胞培養上清液（包含真核及原核細胞之培養物）、尿液、唾液、痰液及腦脊髓液樣品。
可使用本發明之方法量測之分析物包含但不限於蛋白質、毒素、核酸、微生物、病毒、細胞、真菌、孢子、碳水化合物、脂質、醣蛋白、脂蛋白、多醣、藥物、激素、類固醇，以上分子之營養物、代謝物及任何經修飾衍生物，或包括以上分子中之一或多者的任何複合物，或其組合。樣品中所關注分析物之水準可指示疾病或疾病病況，或其可簡單地指示患者是否暴露於所述分析物。
在一特定實施例中，所關注分析物為外泌體，亦即由大部分細胞類型釋放之小膜囊泡。外泌體之釋放及後續吸收為細胞間通訊之方法且在許多生理及病理過程之調節中起作用。已顯示外泌體含有多種信號傳導分子，包含但不限於表面結合及胞質蛋白、脂質、mRNA及miRNA，且已表明此等物質之身分及其於各外泌體中之濃度可用於推斷其細胞起源及功能。因此，患者之總外泌體群體之基因組或蛋白質組剖析可為各種病理病況，尤其包含癌症、傳染病、腎病及肝病及創傷性腦損傷提供有價值的預後資訊。
通常藉由自生物體液分離大量外泌體、破壞其膜且藉由習知方法（諸如西方墨點、PCR或定序）分析含量而在聚集體中量測外泌體。然而，本發明之方法及套組可用於經由捕捉表面上之外泌體及後續偵測由外泌體表現之目標分子來表徵外泌體。若干蛋白質已在大部分外泌體中鑑別為常見，例如CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP、Tsg101，且在一個實施例中，此等目標可個別地或組合地用於經由一或多種捕捉試劑與一或多種常見外泌體目標蛋白之間的結合相互作用來捕捉表面上之外泌體。在替代或額外實施例中，存在於外泌體上或外泌體中之疾病相關標記用於經由一或多種捕捉試劑與疾病相關外泌體標記之間的結合相互作用來捕捉表面上之外泌體。接著可使用一或多種偵測試劑對捕捉之外泌體進行探測，該一或多種偵測試劑針對常見外泌體蛋白中之一或多者，或針對存在於外泌體之一部分內或其表面上之一或多個額外分子目標。當為捕捉試劑及偵測試劑選擇不同目標時，僅將偵測包括兩個目標之彼等外泌體，從而在鑑別或定量外泌體亞群中允許額外特異性。在一特定實施例中，所用樣品為純化之外泌體製劑。
在一特定實施例中，可使用一對偵測試劑實現特定表型不同之外泌體亞群的偵測，該等偵測試劑僅在藉由與本文所述之近端目標的結合相互作用接近時才產生信號。在本發明實施例中，近端目標可為相同分子上之不同抗原決定基，其可為在單一外泌體內部保持接近或結合於相同外泌體之膜中的相同分子物質之不同複本，或其可為單一外泌體之中或之上的不同相互作用物質，諸如兩種相互作用的蛋白質（例如四跨膜蛋白-整合素複合物）、蛋白質受體及配位體（例如EFG及EGFR）或mRNA分子及RNA結合蛋白（例如Argonaute 1-4，或GW182）。另外，使用本文所述之方法准許分析至多三個不同目標分子，其可能不在功能上相關，但藉由存在於單一外泌體內而相關。本文所述之PLA/RCA方法中所用的鄰近探針可經延長以准許在外泌體之上或之中相隔更遠定位之目標分子的連接及後續擴增。在一個實施例中，使用針對擴增子之特異性螢光探針進行PLA/RCA分析。此後，用通用螢光試劑（例如針對外泌體中之RNA的吖啶橙）標記捕捉外泌體，且對捕捉外泌體成像以確定兩個螢光標記之間的相關性。使用通用螢光試劑允許基於尺寸及染色強度自所期望外泌體或其子集選擇信號。
為了探測內部目標分子（貨物蛋白、脂質或RNA分子），外泌體可在捕捉之前或之後但在添加偵測試劑之前固定及透性化。若使用本文所述之方法詢問透性化外泌體，則偵測試劑中之一或兩者可包括能夠結合至特定RNA序列之寡核苷酸探針，以使得能夠偵測mRNA、miRNA及/或蛋白質與RNA之間的相互作用。
可使用本文所述之方法在使用或不使用錨定試劑之情況下量測外泌體。如上文所述，在圖1（a）中說明了在結合分析中使用錨定試劑，且若分析物為外泌體，則表面（101）包含捕捉試劑，例如針對常見外泌體目標蛋白。在一特定實施例中，表面亦包含錨定試劑（103）。在一或多個步驟中，將外泌體結合至捕捉試劑及偵測試劑（104），該偵測試劑亦經由相同或不同外泌體目標蛋白結合外泌體，其中偵測試劑連接至核酸探針（105）。因此，在表面上形成包含捕捉試劑、外泌體及偵測試劑之複合物。探針經延伸以形成延伸序列（107），其包含結合錨定試劑之錨定區。延伸序列結合至錨定試劑且量測與表面結合之延伸序列的量。
同樣，圖1（b）中所說明之方法亦可應用於外泌體偵測。在一特定實施例中，偵測複合物可包含一或多種偵測試劑以增強分析針對外泌體之特異性，例如如圖1（c）中所說明。在一或多個步驟中，外泌體結合至捕捉試劑及兩種（或更多種）結合由外泌體表現之目標蛋白的偵測試劑（分別為120及121）中之每一者，其中第一及第二偵測試劑中之每一者連接至核酸探針（分別為122及123，第一及第二核酸探針）。外泌體可同時或基本上同時，或以依序、逐步方式結合至捕捉試劑及偵測試劑。因此，在表面上形成包含捕捉試劑、外泌體以及第一及第二偵測試劑之複合物（124）。使用需要第一及第二探針彼此接近之延伸方法，第一探針經延伸以形成包括與錨定序列互補之錨定序列補體的延伸序列（125）。在倒數第二步中，錨定序列與錨定序列補體雜交且量測與表面結合之延伸序列的量。類似地，在圖2（a）-（c）中之每一者中描繪之方法可用於偵測外泌體。
本發明之分析可用於確定樣品中之一或多種，例如兩種或更多種分析物之濃度。因此，可在相同樣品中量測兩種或更多種分析物。可在相同樣品中量測之分析物組包含例如與疾病狀態或生理狀況相關之分析物或活性的分析組。某些此類組包含以下組：細胞介素及/或其受體（例如TNF-α、TNF-β、ILl-α、ILl-β、IL2、IL4、IL6、IL-10、IL-l2、IFN-γ等中之一或多者）、生長因子及/或其受體（例如EGF、VGF、TGF、VEGF等中之一或多者）、濫用藥物、治療藥物、維生素、病原體特異性抗體、自體抗體（例如針對Sm、RNP、SS-A、SS-α、J0-1及Scl-70抗原之一或多種抗體）、過敏原特異性抗體、腫瘤標記（例如CEA、PSA、CA-125 II、CA 15-3、CA 19-9、CA 72-4、CYFRA 21-1、NSE、AFP等中之一或多者）、包含充血性心臟病及/或急性心肌梗塞之心臟疾病之標記（例如肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌血球素、CKMB、髓過氧化酶、麩胱甘肽過氧化酶、β-利鈉蛋白（BNP）、α-利鈉蛋白質（ANP）、內皮素、醛固酮、C反應蛋白（CRP）等中之一或多者）、與止血相關之標記（例如纖維蛋白單體、D-二聚體、凝血酶-抗凝血酶複合物、凝血酶原片段1及2、抗因子Xa等中之一或多者）、急性病毒性肝炎感染之標記（例如針對A型肝炎病毒之IgM抗體、針對B型肝炎核心抗原之IgM抗體、B型肝炎表面抗原、針對C型肝炎病毒之抗體等中之一或多者）、阿茲海默氏症（Alzheimer's Disease）之標記（α-澱粉狀蛋白、β-澱粉狀蛋白、Aβ42、Aβ40、Aβ38、Aβ39、Aβ37、Aβ34、tau蛋白等）、骨質疏鬆之標記（例如交聯Nor C端肽、總去氧吡啶啉、游離去氧吡啶啉、骨鈣化素、鹼性磷酸酶、I型膠原蛋白之C端前肽、骨特異性鹼性磷酸酶等中之一或多者）、生育狀態或生育相關病症之標記（例如雌二醇、孕酮、促卵泡激素（FSH）、黃體激素（LH）、促乳素、hCG、睾固酮等中之一或多者）、甲狀腺病症之標記（例如促甲狀腺激素（TSH）、總T3、游離T3、總T4、游離T4及反向T3中之一或多者）及前列腺癌之標記（例如總PSA、游離PSA、複合PSA、前列腺酸磷酸酶、肌酸激酶等中之一或多者）。本發明之某些實施例包含量測例如一或多種、兩種或更多種、四種或更多種或10種或更多種與特定疾病狀態或生理狀況相關之分析物（例如在組中分組在一起之分析物，諸如以上列出之彼等；例如適用於診斷甲狀腺病症之組可包含例如促甲狀腺激素（TSH）、總T3、游離T3、總T4、游離T4及反向T3中之一或多者）。
在一較佳實施例中，組包含傳統樣品基質中之一或多種低豐度分析物，例如濃度為小於約100 fg/mL的且更佳為小於約10 fg/mL之分析物。可包含於組中之分析物之非限制性清單包含例如IL-17、IL-21、IL-31、Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Aβ寡聚物、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12/23p40、IL-12p70、INF-g、PSA、PSAc、Tau、磷酸化Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、白蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、殘留蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、凋亡蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-β、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、β-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、α-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過氧化酶、肌血球素、PAI-1、PCSK9、纖維蛋白溶酶原、腎素/前腎素、tPA、CXCL1/GRO-α、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL1α、IL-1β、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL12(p70)、IL13、IL15、IL18、IL-22、IL-23、IL-33、c-MET、脂聯素、FGF21、TSLP、GLP-1、生長激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素、促乳素、HIV p24、HB-EGF、AKT、磷酸化AKT以及其組合。
在一特定實施例中，組包含傳統樣品基質中之一或多種低豐度分析物，例如濃度為小於約100 fg/mL且更佳為小於約10 fg/mL之分析物，且組包含以下人類目標中之一或多者：G-CDF、GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12/23p40、IL12p70、IL-17A、IL21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-33、TNFα、TSLP、VEGF、複合PSA、游離PSA、Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau、心肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、HIV p24、C-肽及/或FGF21。
另外，本文所述之方法及套組可用於免疫分析以偵測單一生物體對抗微生物耐藥性標記（PBP2a/mecA（金黃色葡萄球菌（S. aureus），革蘭氏陽性）TEM1（大腸桿菌（E. coli），革蘭氏陰性））之敏感性。此等分析可用於革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌兩者中之此類分析物。涉及針對萬古黴素、β-內醯胺、碳青黴烯類、胺基醣苷及巨環內酯抗生素之抗微生物耐藥性的以下目標蛋白中之一或多者可包含於分析中：erm家族、vanA、vanB、aac(6')-aph(2'')、KPC、NDM、OXA-48、VIM、OXA-23樣、OXA-40樣、OXA-58樣、CTX-M-1及CTX-M-9家族之ESBL基因以及其組合。此外，以下蛋白質中之一或多者可包含於分析中：50S核糖體蛋白L20、30S核糖體蛋白S7、30S核糖體蛋白S2、50S核糖體蛋白L21、50S核糖體蛋白L17、30S核糖體蛋白S4、50S核糖體蛋白L15、30S核糖體蛋白S5、50S核糖體蛋白L16、30S核糖體蛋白S3、50S核糖體蛋白L22、50S核糖體蛋白L4、核糖體蛋白L25、50S核糖體蛋白L5、30S核糖體蛋白S2、核糖體蛋白L30、L31及L32以及其組合。另外，以下目標中之一或多者可單獨或與本文鑑別之標記中之一或多者組合評估，例如延長因子EF-TU、ACP、醯基載體蛋白、RplL、核糖體蛋白GroS（MopB，65,000）、伴隨蛋白系統Gro-EL-Gro-ES及GapA之組分、糖酵解中之酶以及其組合。
另外，本文所述之方法及套組亦可用於免疫分析以偵測保健相關感染（HAI生物體），包含但不限於肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia ）、鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii ）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）、腸桿菌屬（Enterobacter ）物種及腸外致病性大腸桿菌。下標提供了用於HAI生物體中之每一者的耐藥性標記：
病原體 耐藥性標記（ GenBank 標識）
肺炎克雷伯氏桿菌 KPC（KPC-2: AAK70220.1）
鮑氏不動桿菌 VIM（VIM-1: CCG05854.1）
綠膿桿菌 IMP-1（AAL17637.1）
腸桿菌屬物種 OXA-48（AGD80396.1）
腸外致病性大腸桿菌 NDM（NDM-1: AHF22464.1）
可在本文所述之免疫分析中評估特定外膜蛋白：
病原體 外膜蛋白 GenBank 寄存編號
肺炎克雷伯氏桿菌 lpp ompA YP_002238023.1 WP_004144094.1
陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae ） lpp ompA YP_003612855.1 WP_023481315.1
產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） lpp ompA YP_004593622.1 YP_007388430.1
大腸桿菌 lpp ompA NP_416192.1 NP_286832.1
綠膿桿菌 oprF NP_250468.1
鮑氏不動桿菌 omp38 YP_008889447.1
另外，本文所述之方法及套組可用於免疫分析中以偵測以下類別之生物標記中之一或多者：細胞介素、循環腫瘤特異性蛋白、與一或多種傳染病相關之蛋白質、細胞內標記等，以及其組合。
另外，可使用本文所述之方法及套組，藉由評估以下列出之相關抗原中之一或多者的存在或不存在來鑑別以下自體免疫疾病：
器官特異性疾病 相關抗原
1型糖尿病    麩胺酸脫羧酶（GAD） 胰島素瘤-2（IA2A） 鋅轉運8蛋白（ZnT8） 胰島素原 胰島素
乳糜瀉    轉麩醯胺酸酶（tTG） 麥膠蛋白（去醯胺） 麥膠蛋白肽之去醯胺形式（DGP）
阿狄森氏病（Addison's Disease）    21-羥化酶（21-OH） 17-羥化酶（17-OH） 細胞色素p450側鏈 裂解酶（SCC）
橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's Thyroiditis） 甲狀腺過氧化酶（TPO） 甲狀腺球蛋白
格雷夫氏甲狀腺高能症（Graves'Hyperthyroidism） 促甲狀腺激素受體
副甲狀腺低能症 鈣敏感受體
原發性膽汁性肝硬化 丙酮酸脫氫酶複合物（PDC-E2） 支鏈2-側氧基-酸脫氫酶複合物（BCOADC-E2） 2-酮戊二酸脫氫酶複合物（OGDC-E2） Gp120 Sp100 Nup62
II型自體免疫性肝炎 細胞色素P450 2D6 亞胺甲基轉移酶環化去胺酶
自體免疫性胃炎 H+/K+ ATP酶
惡性貧血 H+/K+ ATP酶
禿髮 酪胺酸羥化酶
白斑病 酪胺酸酶 SOX-10 SOX-9
在一特定實施例中，組包含傳統樣品基質中之一或多種低豐度分析物，例如濃度為小於約100 fg/mL的且更佳為小於約10 fg/mL之分析物。組較佳包含以下分析物中之一或多者：IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌肌鈣蛋白T以及其組合。在特定實施例中，樣品中偵測之分析物之濃度在0.01 fM-100 fM、0.03 fM-50 fM或0.03 fM-10 fM範圍內。在一些實施例中，可基本上精確確定的樣品中之分析物分子之濃度為小於約100 fM、小於約10 fM、小於約3 fM、小於約1 fM、小於約0.3 fM、小於約0.1 fM、小於約0.03 fM或更小。若樣品中分析物分子之量測濃度在樣品中分析物分子之實際濃度的約20%以內，則可將樣品中分析物分子之濃度視為被基本上精確確定。在某些實施例中，樣品中分析物分子之量測濃度可在樣品中分析物分子之實際濃度的約10%以內、約3%以內、或約1%以內。分析之偵測極限為給出高於背景信號至少2.5標準差之信號之彼濃度，且較佳地，分析可偵測樣品中之大致10-10,000個分子，或樣品中之100-5,000個分子，或樣品中之100-1000個分子。
在另一實施例中，本文所述之方法可用於偵測由於最近的暴露及/或感染而呈低豐度之分析物。各種疾病或病況（例如癌症）、細菌感染（例如炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis ）（炭疽））、病毒感染（例如HIV、肝炎、HPV等）、毒素暴露（例如蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素A、B或E等）之早期診斷受限於一下事實：可用技術，諸如ELISA之偵測極限（LOD）高於可指示疾病發作之低豐度蛋白質的循環濃度。組可包含傳統樣品基質中之一或多種低豐度分析物，例如濃度為小於約100 fg/mL或小於約10 fg/mL之分析物。可包含於組中之分析物之非限制性清單包含例如HIVgp41；HIVgp120；HIVgp160；HIVp24；HIVp66；HIVp51；HIVp17；HIVp31；Tat；Nef；Viv；A、B、C、d或E抗原肝炎；16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73及/或82型HPV；HPV-E6及E7蛋白；IL-17；IL-21；IL-31；IL-22；IL-23；IL-33；心肌肌鈣蛋白T；以及其組合。另外，組亦可包含可由於最近的疾病發作、暴露及/或感染而呈低豐度之以下分析物中之一或多者：Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Aβ寡聚物、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、INF-g、PSA、Tau、磷酸化Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、白蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、殘留蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、凋亡蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-β、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、β-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、α-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過氧化酶、肌血球素、PAI-1、PCSK9、纖維蛋白溶酶原、腎素/前腎素、tPA、CXCL1/GRO-α、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-18、c-MET、脂聯素、FGF21、GLP-1、生長激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素、促乳素、HB-EGF、AKT、磷酸化AKT以及其組合。
本發明之方法經設計以允許偵測多種生物及生物化學試劑，如上文所述。在一個實施例中，方法可用於偵測致病性及/或潛在致病性病毒、細菌及毒素，包含多種相關臨床及環境基質（包含且不限於血液、痰液、糞便、過濾器、拭子等）中之生物戰劑（「BWA」）。可使用本發明之方法分析（單獨或呈組合形式）之病原體及毒素之非限制性清單：炭疽芽孢桿菌（炭疽）、鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis ）（瘟疫）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae ）（霍亂）、土拉熱弗朗西絲菌（Francisella tularensis ）（土拉菌病）、布魯氏菌屬（Brucella spp.）（布氏桿菌病）、貝氏考克斯菌（Coxiella burnetii ）、（Q熱）、李氏菌屬（listeria ）、沙門氏菌屬、志賀桿菌屬、霍亂弧菌（V. cholera ）、沙眼披衣菌（Chlamydia trachomatis ）、類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei ）、正痘病毒，包含天花病毒（天花）、病毒性腦炎、委內瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEE）、西部馬腦炎病毒（western equine encephalitis virus，WEE）、東部馬腦炎病毒（eastern equine encephalitis virus，EEE）、α病毒、病毒性出血熱、沙粒病毒科（Arenaviridae）、布尼亞病毒科（Bunyaviridae）、絲狀病毒科（Filoviridae）、黃病毒科（Flaviviridae）、埃博拉病毒（Ebola virus）、葡萄球菌腸毒素、蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素（A、B、E）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum ）、黴菌毒素、鐮刀菌屬（Fusarium ）、Myrotecium 、頭孢菌屬（Cephalosporium ）、木黴菌屬（Trichoderma ）、輪狀單孢菌（Verticimonosporium ）、葡萄穗黴菌（Stachybotrys ）、鼻疽、小麥真菌、球芽孢桿菌（Bacillus globigii ）、黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens ）、黃雨、單端孢黴烯族真菌毒素（trichothecene mycotoxins）、鼠傷寒沙門桿菌（Salmonella typhimurium ）、黃黴毒素（aflatoxin）、印鼠客蚤（Xenopsylla cheopis ）、山穿手瘙（Diamanus montanus ）、類天花、猴痘、沙狀病毒（Arenavirus）、漢坦病毒（Hantavirus）、拉沙熱（Lassa fever）、阿根廷出血熱（Argentine hemorrhagic fevers）、玻利維亞出血熱（Bolivian hemorrhagic fevers）、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒（Rift Valley fever virus）、克里米亞-岡果病毒（Crimean-Congo virus）、漢坦病毒、馬堡出血熱（Marburg hemorrhagic fevers）、黃熱病病毒（yellow fever virus）、登革熱病毒（dengue fever viruses）、流感（包含人類及動物株，包含H5N1禽流感、A型流感、H1特異性A型流感、H3特異性A型流感、H5特異性A型流感、2009-H1N1特異性A型流感、B型流感）、RSV、人類免疫缺陷病毒I及II（HIV I及II）、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、肝炎（非A、B或C）、腸病毒、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）、細胞巨大病毒、單純疱疹病毒、沙眼披衣菌、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrheae ）、陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis ）、人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum ）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia ）、伯氏疏螺旋體（Borellia burgdorferi ）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae ）、肺炎黴漿菌（Mycoplasma pneumoniae ）、肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae ）、嗜肺性退伍軍人桿菌（Legionella pneumophila ）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）、葡萄球菌腸毒素B（SEB ）、相思子毒素（Abrin ）、志賀毒素（Shiga Toxin ）1、志賀毒素2、黏膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis ）、釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes ）、艱難梭菌（Clostridium difficile ）、奈瑟氏腦膜炎菌（Neisseria meningitidis ）、肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae ）、結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis ）、A群鏈球菌（Group Astreptococcus ）、大腸桿菌O157、冠狀病毒、柯沙奇（Coxsackie）A病毒、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒（RSV）、間質肺炎病毒、痘瘡及腺病毒。
對本文所述之結合分析之改良可用於擴大結合分析之動態範圍，亦即可在不稀釋或濃縮樣品或改變產生類似結果之分析條件（例如所採用試劑之濃度等）的情況下藉由系統或方法定量的流體樣品中之分析物分子之濃度範圍，且其中分析物分子之量測濃度可基本上精確確定。若流體樣品中分析物分子之量測濃度在流體樣品中分析物分子之實際（例如真實）濃度的約10%內，則流體樣品中分析物分子之濃度可被視為基本上精確確定。在某些實施例中，流體樣品中分析物分子之量測濃度在實施例中基本上精確確定，其中量測濃度在流體樣品中分析物分子之實際濃度的約5%內、約4%內、約3%內、約2%內、約1%內、約0.5%內、約0.4%內、約0.3%內、約0.2%內或約0.1%內。在一些情況下，確定之濃度量測值與真實（例如實際）濃度相差不超過約20%、不超過約15%、不超過約10%、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約2%、不超過約1%或不超過約0.5%。在一些實施例中，可藉由使用所選之分析方法確定已知濃度之流體樣品中分析物分子之濃度且比較量測濃度與實際濃度來確定分析方法之精確性。
在一些實施例中，系統或方法可能能夠在以下動態範圍內量測流體樣品中分析物分子之濃度：大於約1000（3 log）、約10,000（4 log）、約100,000（5 log）、約350,000（5.5 log）、1,000,000（6 log）、約3,500,000（6.5 log）、約10,000,000（7 log）、約35,000,000（7.5 log）、約100,000,000（8 log）或更大。
在一些實施例中，可基本上精確確定的流體樣品中分析物分子之濃度（例如未知濃度）為小於約5000 fM（飛莫耳）、小於約3000 fM、小於約2000 fM、小於約1000 fM、小於約500 fM、小於約300 fM、小於約200 fM、小於約100 fM、小於約50 fM、小於約25 fM、小於約10 fM、小於約5 fM、小於約2 fM、小於約1 fM、小於約500 aM（渺莫耳（attomolar））、小於約100 aM、小於約10 aM、小於約5 aM、小於約1 aM、小於約0.1 aM、小於約500 zM（仄莫耳（zeptomolar））、小於約100 zM、小於約10 zM、小於約5 zM、小於約1 zM、小於約0.1 zM或更小。在一些情況下，偵測極限（例如可在溶液中確定的分析物分子之最低濃度）為約100 fM、約50 fM、約25 fM、約10 fM、約5 fM、約2 fM、約1 fM、約500 aM（渺莫耳）、約100 aM、約50 aM、約10 aM、約5 aM、約1 aM、約0.1 aM、約500 zM（仄莫耳）、約100 zM、約50 zM、約10 zM、約5 zM、約1 zM、約0.1 zM或更小。在一些實施例中，可基本上精確確定的流體樣品中分析物分子或粒子之濃度為約5000 fM至約0.1 fM、約3000 fM至約0.1 fM、約1000 fM至約0.1 fM、約1000 fM至約0.1 zM、約100 fM至約1 zM、約100 aM至約0.1 zM或更小。偵測上限（例如可在溶液中確定的分析物分子之上限濃度）為至少約100 fM、至少約1000 fM、至少約10 pM（皮莫耳）、至少約100 pM、至少約100 pM、至少約10 nM（奈莫耳）、至少約100 nM、至少約1000 nM、至少約10 μM、至少約100 μM、至少約1000 μM、至少約10 mM、至少約100 mM、至少約1000 mM或更大。在一些實施例中，確定的流體樣品中分析物分子或粒子之濃度為小於約50×10-15 M，或小於約40×10-15 M，或小於約30×10-15 M，或小於約20×10-15 M，或小於約10×10-15 M，或小於約，或小於約1×10-15 M。
在一些實施例中，可基本上精確確定的樣品中之分析物分子之濃度為小於約100 fM、小於約10 fM、小於約3 fM、小於約1 fM、小於約0.3 fM、小於約0.1 fM、小於約0.03 fM或更小。在一些實施例中，可基本上精確確定的樣品中分析物分子之濃度為約5000 fM至約0.1 fM、約3000 fM至約0.1 fM、約1000 fM至約0.1 fM、約1000 fM至約1 fM、約100 fM至約1 fM、約100 fM至約0.1 fM。若樣品中分析物分子之量測濃度在樣品中分析物分子之實際濃度的約20%以內，則可將樣品中分析物分子之濃度視為被基本上精確確定。在某些實施例中，樣品中分析物分子之量測濃度可在樣品中分析物分子之實際濃度的約10%以內、約3%以內、或約1%以內。在一些實施例中，可藉由使用所選分析方法確定已知濃度之樣品中分析物分子之濃度來確定分析方法之精確性。較佳地，分析可偵測樣品中之大約10-10,000個分子，較佳樣品中之100-5,000個分子，且更佳樣品中之100-1000個分子。
相對於例如使用相同捕捉抗體及兩種偵測抗體中之任一者及相同標記及偵測技術量測的習知夾心免疫分析技術，使用本文所述之分析形式可改良偵測信號及分析靈敏度多達10倍，較佳多達50倍、100倍或多達1000倍。較佳地，相對於標準夾心免疫分析，使用本文所述之分析形式改良偵測信號及分析靈敏度多達100倍。
尤其在與靈敏的光學偵測技術結合時，本發明之方法之一個有利態樣為信號放大允許將個別結合事件偵測為光亮點。可隨後藉由計數個別事件（其可藉由提供改良的結合事件與背景雜訊之區分而提供更好的針對低分析物濃度之靈敏度）或藉由在針對所有結合事件之信號內整合（其可針對量測高分析物濃度提供更好的動態範圍）來進行信號定量。
本發明之方法可用於多種分析裝置及/或形式。分析裝置可包含例如分析模組，諸如分析盤、濾筒、多孔分析盤、反應容器、試管、比色管、流量槽、分析晶片、側流裝置等，具有在分析進展時添加或預裝載於分析模組之孔、腔室或分析區域中之分析試劑（其可包含靶向劑或其他結合試劑）。此等裝置可對於特異性結合分析，例如免疫分析或免疫層析分析採用多種分析形式。說明性分析裝置及形式描述於下文中。在某些實施例中，本發明之方法可採用以乾燥狀態儲存之分析試劑，且分析裝置/套組可進一步包括或提供有用於將分析試劑維持於乾燥狀態之乾燥材料。預裝有分析試劑之分析裝置可極大地提高分析量測速度且降低其複雜度，同時維持儲存期間之極佳穩定性。乾燥的分析試劑可為任何可經乾燥且接著在用於分析之前復原之分析試劑。此等包含但不限於適用於結合分析之結合試劑、酶、酶受質、指示劑染料及其他可用於偵測所關注分析物之反應性化合物。分析試劑亦可包含不直接涉及偵測機制但在分析中起輔助作用之物質，包含但不限於封閉劑、穩定劑、洗滌劑、鹽、pH緩衝液、防腐劑等。試劑可以游離形式存在或負載於固相上，包含分析模組中之隔室（例如腔室、通道、流量槽、孔等）之表面或膠體、珠粒或其他微粒支撐物之表面。
本發明之方法可與用於量測分析物之量，且特別是量測與固相結合之分析物之量的多種方法一起使用。可使用之技術包含但不限於此項技術中已知之技術，諸如基於細胞培養之分析、結合分析（包含凝集測試、免疫分析、核酸雜交分析等）、酶分析、比色分析等。其他適合之技術將為一般熟習此項技術者顯而易見。一些量測技術允許藉由目視檢查進行量測，其他技術可能需要或受益於使用儀器進行量測。
用於量測分析物之量的方法包含無標記技術，其包含但不限於i）量測在將分析物結合至表面之後表面處之質量或折射率變化的技術（例如表面聲波技術、表面電漿子共振感測器、橢偏量測技術等），ii）質譜技術（包含如MALDI、SELDI等的技術，其可量測表面上之分析物），iii）層析或電泳技術，iv）螢光技術（其可基於分析物之固有螢光）等。
用於量測分析物之量的方法亦包含經由偵測可直接或間接（例如經由使用分析物之經標記結合搭配物）連接至分析物之標記量測分析物之技術。適合之標記包含可直接觀測之標記（例如可在視覺上看到的粒子，及產生可量測信號，諸如光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、放射性、磁場等的標記）。可使用之標記亦包含酶或其他化學反應性物質，其具有產生諸如光散射、吸光度、螢光等的可量測信號之化學活性。使用酶作為標記在酶聯免疫吸附分析（亦稱為ELISA、酶免疫分析或EIA）中沿用已久。在ELISA形式中，將未知量的抗原貼附至表面且接著在表面上洗滌特異性抗體以使其可結合至抗原。此抗體連接至酶，且在最終步驟中添加一種物質，酶將該物質轉化為提供可偵測信號變化之產物。產物形成可為可偵測的，例如由相對於受質的諸如吸光度、螢光、化學發光、光散射等可量測特性之差異所致。可與根據本發明之固相結合方法一起使用之某些（但並非所有）量測方法可受益於或需要洗滌步驟以自固相移除未結合組分（例如標記）。因此，本發明之方法可包括此類洗滌步驟。
在採用一對可偵測標記之彼等實施例中，彼等經標記物質係基於其獨立可偵測之能力及/或彼等物質共同起作用以在該對標記彼此鄰近，亦即各自直接或間接結合至偵測複合物中之所關注分析物時產生可偵測信號之能力而選擇。在一個實施例中，第一可偵測標記為偶聯酶反應系統之第一酶且第二可偵測標記為偶聯酶反應系統之第二酶，且方法進一步包含添加反應系統之一或多種受質，由此產生酶反應系統之可偵測產物的步驟。可將包含可偵測產物之彼等反應容器與不包含可偵測產物之彼等反應容器區分開。在一較佳實施例中，僅在第一酶及第二酶極為貼近，例如小於200 nm，理想地小於50 nm時產生可偵測產物。在一個實施例中，第一酶為氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，第二酶為過氧化酶，且受質包括氧化酶受質，例如葡萄糖，及經標記酪醯胺、Amplex Red（10-乙醯基-3,7-二羥基啡噁嗪），或魯米諾（luminol）衍生物（在本文中統稱為經標記反應性衍生物且在一較佳實施例中，經標記反應性衍生物包括Amplex Red或魯米諾）。在此實施例中，第一酶與受質反應產生產物，該產物與第二酶反應產生第二產物，該第二產物與經標記反應性衍生物反應產生可偵測物質。較佳地，偵測複合物中經第一及第二酶催化之反應使得經標記反應性衍生物固定於表面上，其可經量測以確定表面上存在之分析物分子之數目。在一個實施例中，經標記反應性衍生物為生物素-酪醯胺，且方法進一步包括添加經標記抗生蛋白鏈菌素及量測抗生蛋白鏈菌素上之標記。
方法中可用之鄰近依賴性另一標記系統為FRET對，例如第一可偵測標記為FRET供體且可偵測標記為FRET受體。螢光共振能量轉移（FRET）為兩個染料分子之電子激發態之間的距離依賴性相互作用，其中激發在無光子發射的情況下自供體分子轉移至受體分子。FRET之效率取決於分子間分離之倒數六次方，使其在與生物大分子之尺寸類似的距離上有用。在此標記系統中，藉由激發FRET供體及量測自FRET受體之發射來量測鄰近依賴性信號。供體及受體分子較佳緊鄰，例如約10-100埃，受體之吸收光譜較佳與供體之螢光發射光譜重疊，且供體及受體躍遷偶極取向應大致平行。FRET對之非限制性清單提供於下表1中。
表1.FRET對實例
供體 受體
螢光素 四甲基若丹明
IAEDANS 螢光素
EDANS Dabcyl
螢光素 螢光素
BODIPY FL BODIPY FL
螢光素 QSY 7及QSY 9染料
存在多種用於光學顯微鏡之FRET偵測方法，例如受體光漂白、供體光漂白、比率成像、敏化發射及螢光壽命量測。
可用於採用一對偵測標記之實施例中的另一適合之標記系統為其中可獨立量測第一及第二可偵測標記之系統。例如，第一及第二可偵測標記可為就光譜特性而言彼此不同的發光標記。或者，第一可偵測標記為與第一受質反應以產生第一信號之第一酶，且第二可偵測標記為與第二受質反應以產生不同第二信號之第二酶，且方法進一步包括添加第一酶受質及第二酶受質及計數產生第一及第二信號之反應容器之數目。第一及第二信號可為具有不同光譜特性之吸光度及/或發光信號之變化。
若第一及第二可偵測標記包含第一及第二酶，則其可各自為水解酶，例如磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其組合，且因此第一及第二受質係選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷及葡萄糖苷酸修飾之穩定化二氧雜環丁烷、4-甲基香豆素基、螢光素或其組合。或者，第一及第二酶係選自辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶及鹼性磷酸酶。
或者，用於偵測分析物分子之標記可為可用於單分子螢光偵測，例如螢光相關光譜法及/或螢光交叉相關光譜法之螢光物質。單分子螢光偵測包括使包含可偵測物質之溶離劑流經毛細管、使光源聚焦於毛細管內之體積上以產生詢問區及用光偵測器觀測詢問區以偵測螢光分子通過該詢問區。
在一個實施例中，可使用基於電化學發光之分析形式，例如基於電化學發光（ECL）之免疫分析來量測樣品中之所關注分析物。ECL之高靈敏度、寬動態範圍及選擇性為醫學診斷之重要因素。市售ECL儀器已展示優越效能且其已出於包含其極佳靈敏度、動態範圍、精確度及複雜樣品基質之耐受性之原因而得到廣泛使用。可誘導發射ECL之物質（ECL活性物質）已用作ECL標記，例如i）有機金屬化合物，其中金屬來自例如第VIII族貴金屬，包含含Ru及含Os之有機金屬化合物，諸如參聯吡啶基釕（RuBpy）部分，及ii）魯米諾及相關化合物。在ECL方法中以ECL標記參與之物質在本文中稱為ECL共反應物。常用共反應物包含三級胺（例如參見美國專利第5,846,485號）、草酸鹽及來自RuBpy之用於ECL之過硫酸鹽及來自魯米諾之用於ECL之過氧化氫（參見例如美國專利第5,240,863號）。由ECL標記產生之光可用作診斷程序中之報導信號（Bard等人，美國專利第5,238,808號，以引用之方式併入本文中）。例如，ECL標記可共價偶聯至結合劑，諸如抗體、核酸探針、受體或配位體；可藉由量測自ECL標記發射之ECL來監測結合相互作用中結合試劑之參與。或者，來自ECL活性化合物之ECL信號可指示化學環境（參見例如美國專利第5,641,623號，其描述監測ECL共反應物形成或分解的ECL分析）。關於ECL、ECL標記、ECL分析及用於進行ECL分析之儀器的更多背景，參見美國專利第5,093,268號；第5,147,806號；第5,324,457號；第5,591,581號；第5,597,910號；第5,641,623號；第5,643,713號；第5,679,519號；第5,705,402號；第5,846,485號；第5,866,434號；第5,786,141號；第5,731,147號；第6,066,448號；第6,136,268號；第5,776,672號；第5,308,754號；第5,240,863號；第6,207,369號；第6,214,552號及第5,589,136號，及公佈之PCT第W099/63347號；第WOOO/03233號；第W099/58962號；第W099/32662號；第W099/14599號；第W098/12539號；第W097/36931號及第W098/57154號，其均以引用之方式併入本文中。
本發明之方法可應用於單重或多重形式，在多重形式中，對單一樣品進行多次分析量測。可用於本發明之多重量測包含但不限於如下之多重量測：i）涉及使用多個感測器；ii）使用基於表面上之位置可區分的表面（例如陣列）上之離散分析域；iii）涉及使用基於諸如尺寸、形狀、顏色等粒子特性可區分的粒子上塗佈之試劑；iv）產生基於光學特性（例如吸光度或發射光譜）可區分的分析信號，或v）基於分析信號之時間特性（例如信號之時間、頻率或相位）。
在一些實施例中，可藉由比較量測參數與校準標準而至少部分地確定樣品中分析物分子之濃度的量度。例如，包括分析物分子之結合表面的分數可與校準曲線進行比較以確定樣品中分析物分子之濃度的量度。可藉由在用於分析測試樣品之條件下用複數個已知濃度之標準化樣品完成分析來產生校準曲線。可對於各標準化樣品獲取與分析物分子之偵測/定量有關之信號的讀數，因此允許形成校準曲線，該校準曲線將分析物分子之偵測與已知濃度之分析物分子相關聯。可接著在包括未知濃度之分析物分子的樣品上完成分析，且可在校準曲線上繪製來自此分析之分析物分子的偵測值，因此確定樣品中分析物分子之濃度的量測值。
在使用成像技術量測光學信號（諸如螢光、化學發光或電化學發光）之特定情況下，結合事件可偵測為亮點光源。當點源之表面密度較低時（例如當發現RxR區域（其中R為偵測系統之空間解析率）中之點源的概率小於10%時），可能的是任何觀測之點源係由單一結合事件所致。在此等條件下，計數事件可提供最靈敏量測。隨著表面密度增加，解析及計數個別結合事件變得愈來愈困難。在此等條件下，在結合表面上積分光學信號提供更精確量測。
熟練技術人員將顯而易見的是本文所述之方法可應用於熟習此項技術者已知之許多免疫分析平台。可調整免疫分析平台之各種特徵以適合於特定平台，但彼等調節完全在一般技術人員之技術範圍內。例如，本文所述之方法可應用於使用編碼粒子之基於珠粒之形式。在此類系統中，使用之珠粒可為磁性或非磁性的，且珠粒之表面經修飾以包含捕捉試劑之一或多個複本。此系統中採用之偵測試劑為一對偵測試劑。在一個實施例中，兩種偵測試劑包含可區分的螢光標記。或者，如本文所述，兩種偵測試劑經核酸探針修飾，在此情況下，免疫分析方法包含延伸方法，例如RCA-PLA，以產生指示可偵測之各偵測試劑之存在的擴增產物。若偵測包含兩種可區分的螢光標記，則量測步驟包含將珠粒引入至流量槽中，且若珠粒為磁性的，則在流量槽中捕捉珠粒。若偵測試劑經核酸探針修飾，則量測步驟包含在珠粒上形成夾心複合物、進行RCA-PLA及用螢光標記之偵測探針來標記擴增子。接著將經標記珠粒引入至流量槽中，且若珠粒為磁性的，則在流量槽中捕捉珠粒。在各實施例中，可基於螢光標記之經編碼珠粒之鑑別使分析以光譜方式多重化。在各實施例中，用於多色偵測之激發光源及發射光偵測器可用於偵測結合事件，定量係藉由計數具有兩種可偵測標記之珠粒或包含經可偵測標記之延伸產物之彼等珠粒來達成，且定量亦藉由積分強度，例如藉由對於所有結合事件在信號上積分進行偵測來達成。因此，可提供一種用於上文所述之方法的套組，其在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之磁性或非磁性珠粒；（b）具有可區分的螢光標記之兩種偵測試劑；及（c）視情況存在之用於分析方案之緩衝劑及/或稀釋劑。可用於上文所述之方法的另一套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之磁性或非磁性珠粒；（b）經核酸探針修飾之兩種偵測試劑（視情況，分開提供偵測試劑且另外與說明書一起提供鄰近探針（1及2），以用探針修飾偵測試劑）；及（c）螢光標記之探針；用鄰近探針修飾偵測試劑所需的視情況存在之試劑；分析稀釋劑、校準劑、環化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩衝液、ATP、BSA、Tween 20、T4 DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩衝液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
在另一實施例中，本文所述之方法可應用於流量槽分析的、基於珠粒之形式。在此類系統中，使用之珠粒可為磁性的且珠粒之表面經修飾以包含捕捉試劑之一或多個複本。如本文所述，此系統中採用之偵測試劑為經核酸探針修飾之一對偵測試劑，在此情況下，免疫分析方法包含延伸方法，例如RCA-PLA，以產生指示可偵測之各偵測試劑之存在的擴增產物。量測步驟包含在珠粒上形成夾心複合物、進行RCA-PLA及用ECL標記之偵測探針來標記擴增子。接著將經標記珠粒引入至流量槽中且在流量槽中捕捉珠粒。特定言之，施加磁場以將磁性粒子，例如珠粒吸引至電極表面，其可包括各種金屬，例如鉑。電壓源用於向電極施加電壓且發射光偵測器可用於偵測結合事件；定量係藉由計數具有經可偵測標記之延伸產物之珠粒來達成，且定量亦藉由積分強度，例如藉由對於所有結合事件在信號上積分進行偵測來達成。可用於上文所述之方法的套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之磁珠；（b）經核酸探針修飾之兩種偵測試劑（視情況，分開提供偵測試劑且另外與說明書一起提供鄰近探針（1及2），以用探針修飾偵測試劑）；及（c）ECL標記之探針；用鄰近探針修飾偵測試劑所需的視情況存在之試劑；分析稀釋劑、校準劑、環化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩衝液、ATP、BSA、Tween 20、T4 DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩衝液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
在流量槽分析的、基於珠粒之形式之一個特定實施例中，樣品與生物素標記之單株分析物特異性捕捉抗體及單株分析物特異性抗體之混合物一起培育，各抗體結合至寡核苷酸，其反應形成夾心複合物。在添加抗生蛋白鏈菌素塗佈之微米粒子之後，複合物經由生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用而結合至固相。將連接混合物添加至混合物中，且將混合物與連接混合物一起培育，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起培育。混合物經洗滌且添加生物素標記之偵測探針之混合物。為了併入適合之標記，例如發光、化學發光或電化學發光標記，例如SULFO-TAG，合成具有末端生物素標記之偵測探針且預先結合至SULFO-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素。將反應混合物抽吸至量測元件中，其中將微米粒子磁性捕捉至電極（例如金屬電極，諸如鉑電極）之表面上。接著用適合之洗滌緩衝液，例如PROCELL（含TPA之緩衝液）移除未結合物質。接著向電極施加電壓，誘導化學發光發射，其係藉由光電倍增器來量測。可在任何適合之流量槽，例如COBAS及/或ELECSYS儀器（購自Hoffmann-La Roche LTD.）中進行施加電壓及量測所得發射。
在另一實施例中，本文所述之方法可應用於基於珠粒之形式，以毛細流動數位地計數個別分子。在此類系統中，使用之珠粒可為磁性的且珠粒之表面經修飾以包含捕捉試劑之一或多個複本。此系統中採用之偵測試劑為包含可區分的螢光標記之一對偵測試劑。量測步驟包含形成包含捕捉試劑、分析物及偵測試劑之夾心複合物；交聯偵測試劑；溶離偵測試劑；及將珠粒引入至流量槽中。用於多色偵測之激發光源及發射光偵測器可用於偵測結合事件，定量係藉由關聯流量槽中兩個螢光團之偵測來達成，且定量亦藉由積分強度，例如藉由對於所有結合事件在信號上積分進行偵測來達成。可用於上文所述之方法之套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之磁珠；（b）具有可區分的螢光標記之兩種可交聯偵測試劑；及（c）視情況存在之用於分析方案之緩衝劑及/或稀釋劑。
此外，本文所述之方法可應用於基於珠粒之形式，其包含將珠粒分離至個別奈米孔中。在此類系統中，使用之珠粒可為磁性的且珠粒之表面經修飾以包含捕捉試劑之一或多個複本。此系統中採用之偵測試劑為包含可區分的酶標記之一對偵測試劑。量測步驟包含形成包含捕捉試劑、分析物及偵測試劑之夾心複合物，及添加用於兩種酶標記之受質。接著在個別奈米孔中捕捉珠粒。分析可基於具有不同光譜特性之酶產物的鑑別而以光譜方式多重化。用於多色偵測之激發光源及發射光偵測器可用於偵測結合事件，定量係藉由計數含有兩種酶產物之奈米孔來達成，且定量亦藉由積分強度，例如藉由對於所有奈米孔在信號上積分進行偵測來達成。可用於上文所述之方法的套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之磁珠；（b）各自經可區分的酶標記修飾之兩種偵測試劑，例如生物素標記之偵測試劑及半抗原結合偵測試劑；（c）抗生蛋白鏈菌素-β半乳糖苷酶、抗半抗原結合酶、試鹵靈-β-d-哌喃半乳糖苷；（d）陣列，例如QUANTERIX DVD格式陣列；（e）碳氟油；及（f）視情況存在之用於分析方案之緩衝劑及/或稀釋劑。在此特定實施例中，藉由組合使用奈米孔高靈敏度系統與基於鄰近度之偵測系統來增強可偵測信號。儘管使用特定基於鄰近度之偵測系統來說明此特定實施例，但熟練技術人員應理解如下事實：本文所述之其他基於鄰近度之偵測系統亦可用於增強分析中之可偵測信號，例如FRET供體/受體系統；就光譜特性而言彼此不同的發光標記；或使用如上文所述之第一及第二酶（其為水解酶），及適當的伴隨受質。
另外，本文所述之方法可應用於基於珠粒-陣列之平台。在此類系統中，使用之珠粒可為非磁性的且珠粒之表面經修飾以包含捕捉試劑之一或多個複本。此系統中採用之偵測試劑為包含第一及第二核酸探針之一對偵測試劑。量測步驟包含形成包含捕捉試劑、分析物及偵測試劑之夾心複合物；延伸探針中之一者以形成延伸序列，其中延伸取決於夾心複合物中第一及第二探針之共定位；用螢光探針標記延伸序列；及將延伸序列自表面釋放至溶離劑中。用於多色偵測之激發光源及發射光偵測器可用於偵測結合事件，定量係藉由計數個別經可偵測標記之延伸產物來達成，且定量亦藉由積分強度，例如藉由對於所有結合事件在信號上積分進行偵測來達成。可用於上文所述之方法的套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含以下中之一或多者：（a）具有捕捉試劑之非磁性珠粒；（b）經核酸探針修飾之兩種偵測試劑（視情況，分開提供偵測試劑且另外與說明書一起提供鄰近探針（1及2），以用探針修飾偵測試劑）；及（c）螢光標記之探針；用鄰近探針修飾偵測試劑所需的視情況存在之試劑；分析稀釋劑、校準劑、環化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩衝液、ATP、BSA、Tween 20、T4 DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩衝液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
可使用包含分析中採用之一組組分的一或多個套組來進行本文所述之結合分析。例如，用於偵測樣品中之分析物的套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包含：包含用於分析物之捕捉試劑及錨定試劑之表面；及連接至核酸探針的用於分析物之偵測試劑。此類套組可包含包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑。
可用於進行本文所述之方法之另一套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包含：包括用於分析物之捕捉試劑及包括錨定寡核苷酸序列之錨定試劑的表面；連接至第一核酸探針之第一偵測試劑；及連接至第二核酸探針之第二偵測試劑。
可用於進行本文所述之結合分析之另一套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包含：包括用於分析物之捕捉試劑及錨定試劑之表面；包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及連接序列，其包括（i）與第二鄰近探針互補之內部序列，及（ii）與第一鄰近探針之不重疊區域互補的兩個末端序列。或者，套組可替代地包含包括用於分析物之捕捉試劑及錨定試劑之表面；包括第一鄰近探針的用於分析物之第一偵測試劑；包括第二鄰近探針的用於分析物之第二偵測試劑；及   （i）第一連接寡核苷酸及（ii）第二連接寡核苷酸，其中（x）第一連接子之第一端及第二連接子之第一端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補，且（y）第一連接子之第二端及第二連接子之第二端與第一鄰近探針之兩個不重疊區域互補。另外，此等套組中之任一者或兩者中之錨定試劑可包含錨定寡核苷酸序列。
此外，可使用套組進行本文所述之方法，該套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包含包括第一可偵測標記之第一偵測試劑；包括第二可偵測標記之第二偵測試劑；經組態以含有一個或更少的分析物分子之複數個反應容器；及視情況存在之包括捕捉試劑之表面。
最後，使用本文所述之方法偵測分析物之套組可在一或多個小瓶、容器或隔室中包含包括固定捕捉試劑之表面；具有第一可偵測標記之第一偵測試劑；具有第二可偵測標記之第二偵測試劑；及對第一及第二偵測試劑具有反應性之交聯劑。交聯劑可包含多官能性交聯劑，其連接與偵測試劑連接之反應性部分或與偵測試劑連接之結合部分的多價結合搭配物。適合之多官能性交聯劑包含但不限於胺、硫醇、醯肼、醛、酯、碘乙醯胺、順丁烯二醯亞胺、點擊化學試劑以及其組合。同樣，多價結合搭配物之實例為靶向偵測試劑之多價抗物種抗體，該等偵測試劑為該動物物種之抗體。當與連接至偵測試劑之伴侶結合搭配物配對時，交聯劑亦可包含抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或生物素。交聯劑亦可為包含與直接或間接結合至套組組分之核酸探針互補之序列的寡核苷酸。在一個特定實施例中，本文所述之方法中所用之套組在一或多個小瓶、容器或隔室中包含：包括固定捕捉試劑之表面；具有第一可偵測標記及第一核酸探針之第一偵測試劑；具有第二可偵測標記及第二核酸探針之第二偵測試劑；及具有與第一及第二核酸探針互補之區域的第三核酸。
本文所述之套組之表面可包含用於一或多個分析物分子之複數種捕捉試劑，其中捕捉試劑跨越位於表面上之複數個可解析結合區或反應容器分佈，例如在陣列、多孔盤或微孔或奈米孔盤中。另外，表面亦可包含複數個粒子，其各自包括複數種用於分析物分子之捕捉試劑。
上文所描述之套組可進一步包含以下中之一或多者：一或多種額外試劑、緩衝劑、聚合酶、連接酶及/或dNTP（經標記或未標記）。另外，若一或多種偵測試劑包括可偵測標記，則套組亦可包含用於套組中採用之可偵測標記的共反應物。或者，若一或多種偵測試劑為偶聯酶反應系統之組分，則偵測試劑中之每一者包括第一及第二酶，且套組在一或多個容器、小瓶或隔室中進一步包含用於偶聯酶反應系統之一或多種受質，且視情況包含經組態以結合至偶聯酶反應系統之產物的經標記組分。例如，第一酶可為氧化酶，第二酶為過氧化酶，且套組進一步包含氧化酶受質及經標記之酪醯胺衍生物。在另一實施例中，第一及第二可偵測試劑包括鄰近依賴性偵測系統之組分，例如FRET供體及FRET受體，或就光譜特性而言彼此不同的發光標記。 其他替代實施例
另一實施例說明於圖7中。圖（a）中之夾心免疫分析複合物中之各鄰近探針的一部分經與各片段雜交之RNA之短股暫時保護。以酶方式移除RNA股，以使得鄰近探針中之每一者可彼此雜交且使用生物素標記之dNTP藉由聚合酶延伸來延伸鏈（圖（b））。併入至鏈中之各生物素標記之鹼基結合至經可偵測標記標記之抗生蛋白鏈菌素（圖（c））。
另一方法說明於圖8中。鄰近探針可連接至錨定試劑及偵測試劑（如圖（a）中所示），或鄰近探針中之每一者可連接至如上文所描述之兩種偵測試劑（未示出）。與圖7中所說明之方法非常相似，各鄰近探針之一部分經與各片段雜交之RNA之短股暫時保護。以酶方式移除RNA股，以使得鄰近探針中之每一者可彼此雜交且使用生物素標記之dNTP藉由聚合酶延伸來延伸鏈（圖（b））。併入至鏈中之各生物素標記之鹼基結合至經可偵測標記標記之抗生蛋白鏈菌素（圖（c））。
圖18中示出了另一實施例。在此實施例中，複數個短寡核苷酸用作U形釘序列（1801）以與擴增子之一部分雜交，且因此將產物摺疊為易於成像之緊湊結構。各U形釘序列包括至少兩個序列（分別為1802及1803），其各自與擴增子之序列互補，且當各U形釘序列與其補體雜交時，擴增子摺疊回自身，如圖18中所示。另外，如上文所描述，擴增子亦可經由與錨定試劑（1804）之錨定相互作用黏附至表面。可藉由在擴增步驟期間將U形釘序列添加至反應混合物而原位進行裝訂過程。因此，在完成各擴增循環時，U形釘序列自由地與新形成之擴增子雜交且使其摺疊。亦可在完成擴增過程之後添加U形釘，使得線性擴增子摺疊為線圈或平板，其取決於U形釘序列及其對應補體之設計。標記分子，例如ECL或螢光可併入至U形釘序列中（或其可如上所述地併入至擴增子中）。此實施例將在表面上產生三維結構，從而產生較高信號密度之較小特徵，其使得更容易在表面上對擴增子成像。手動及自動實施例
可手動、使用自動化技術或兩者來進行本文揭示之方法。自動化技術可為部分自動化的，例如一或多個模組化儀器，或完全整合的自動化儀器。
例示性自動化系統論述及描述於共有的國際專利申請公開案第WO 2018/017156號及第WO 2017/015636號及國際專利申請公開案第WO 2016/164477號中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
可在其上進行本文方法之自動化系統（模組及完全整合）可包括以下自動化子系統：電腦子系統，其可包括硬體（例如個人電腦、膝上型電腦、硬體處理器、光碟、鍵盤、顯示器、打印機）、軟體（例如程序，諸如驅動器、驅動器控制器及資料分析器）及資料庫；液體處理子系統，例如樣品處理及試劑處理，例如自動移液頭、注射器、攪拌設備、超音波混合設備、磁性混合設備；樣品、試劑及消耗品儲存及處理子系統，例如機器人操作臂、管或蓋或箔穿刺設備、蓋移除設備，傳送設備，諸如線性及環形傳送機及機器人操作臂、管架、盤托架、槽托架、吸管端托架、盤振盪器；離心機、分析反應子系統，例如基於流體及基於消耗品（諸如管及多孔盤）；容器及消耗品洗滌子系統，例如盤洗滌設備；磁力分離器或磁性粒子濃縮器子系統，例如流量槽、管及盤型；細胞及粒子偵測、分類及分離子系統，例如流式細胞儀及庫爾特計數器；偵測子系統，諸如比色、濁度、螢光及ECL偵測器；溫度控制子系統，例如空氣處理、空氣冷卻、空氣升溫、風扇、鼓風機、水浴；廢物子系統，例如液體及固體廢物容器；全局唯一標識符（GUI）偵測子系統，例如1D及2D條形碼掃描儀，諸如平板及棒型；樣品標識符偵測子系統，例如1D及2D條形碼掃描儀，諸如平板及棒型。分析子系統，例如層析系統，諸如高效液相層析（HPLC）、快速蛋白質液相層析（FPLC）及質譜儀亦可為模組或完全整合的。
進行樣品鑑別及製備之系統或模組可與進行分析及進行偵測或進行兩者之系統或模組組合（或與其鄰接或鄰近或機械連接或耦接）。相同種類之多個模組化系統可經組合以提高通量。模組化系統可與進行其他類型之分析，諸如化學、生物化學及核酸分析之模組組合。
自動化系統可允許分批、連續、隨機存取及即時工作流程以及單一、中等及高樣品通量。
系統可包括例如以下裝置中之一或多者：盤封口機（例如Zymark）、盤清洗機（例如BioTek、TECAN）、試劑分配器及/或自動移液站及/或液體處理站（例如TECAN、Zymark、Labsystems、Beckman、Hamilton）、培育箱（例如Zymark）、盤振盪器（例如Q.Instruments、Inheco、Thermo Fisher Scientific）、化合物庫或樣品儲存及/或化合物及/或樣品檢索模組。此等裝置中之一或多者經由機器人總成耦接至本發明之設備，以使得可自動進行整個分析過程。根據替代實施例，在設備及各種裝置（例如盤堆疊）之間手動移動容器（例如盤）。
自動化系統可經組態以執行以下功能中之一或多者：（a）將諸如盤之消耗品移至偵測子系統中、在偵測子系統內部移動及移出偵測子系統，（b）在其他子系統之間移動消耗品，（c）儲存消耗品，（d）樣品及試劑處理（例如適於混合試劑及/或將試劑引入至消耗品中），（e）消耗品振盪（例如用於混合試劑及/或提高反應速率），（f）消耗品洗滌（例如洗滌盤及/或進行分析洗滌步驟（例如孔抽吸）），（g）量測流量槽或消耗品（諸如管或盤）中之ECL。自動化系統可經組態以處理置於架子、多孔盤（諸如96或384孔盤）中之個別管。
在如本文所述之自動化系統中整合組件及模組之方法為此項技術中熟知的，參見例如Sargeant等人, 平台完善，醫療產品外包（Platform Perfection, Medical Product Outsourcing）, 2010年5月17日。
在實施例中，自動化系統為全自動的、模組化的、電腦化的、對大範圍之分析物進行活體外定量及定性測試且進行光度分析、離子選擇性電極量測及/或電化學發光（ECL）分析。在實施例中，系統包括以下硬體單元：控制單元、核心單元及至少一個分析模組。
在實施例中，控制單元使用圖形使用者介面來控制所有儀器功能，且由諸如監視器之讀出裝置、諸如鍵盤及滑鼠之輸入裝置及例如Windows操作系統之個人電腦使用構成。在實施例中，核心單元由管理向各分配之分析模組輸送樣品之若干組件構成。核心單元之實際組成取決於分析模組之組態，分析模組可由熟習此項技術者使用此項技術中已知之方法來組態。在實施例中，核心單元包括至少取樣單元及一個齒條轉子作為主要組件。輸送線及第二齒條轉子為可能的擴展。若干其他核心單元組件可包含樣品架裝載器/卸載器、端口、條形碼讀取器（用於架子及樣品）、供水系統及系統接口端口。在實施例中，分析模組進行ECL分析且包括試劑區域、量測區域、消耗品區域及預清潔區域。實例 實例 1. 鄰近連接及滾環擴增之一般方案
藉由添加鄰近探針1及2如下地修飾針對目標分析物之一對偵測抗體：向含200 μg第一偵測抗體之100 μL緩衝液中添加1.74 μL 23 mM磺基-SMCC，在150 mM磷酸鹽緩衝液中稀釋，且在室溫下培育30分鐘。藉由尺寸排阻層析移除游離磺基-SMCC。偵測抗體之最終濃度為2 mg/mL或稍低。在室溫下持續1小時用5 μL含1 mM DTT之100 mM磷酸鹽緩衝液、0.5 mM EDTA，pH 8.4還原九十五（95）μL的300 μM硫醇修飾之寡核苷酸（鄰近探針1及2）。鄰近探針1及2之序列為：
硫醇修飾之鄰近探針1：SH-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU（SEQ ID No. 1；其中三個U殘基為2' O-甲基RNA）
硫醇修飾之鄰近探針2：SH-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT（SEQ ID No. 2）。
例如藉由使用三個旋轉管柱分離物移除過量磺基-SMCC及DTT，且將抗體及DNA合併以用於共價結合。將溶液在室溫下在混合下培育1小時。例如藉由尺寸排阻層析純化抗體-鄰近探針結合物，以移除未結合的抗體及寡核苷酸。
用適當MSD® 封閉溶液將MSD MULTI-SPOT® 盤封閉1小時且洗滌。盤上之各結合域包含捕捉抗體及錨定部分（以BSA-寡核苷酸結合物形式固定，寡核苷酸選擇為對滾環擴增子具有特異性）。此實例中所用之錨定寡核苷酸的序列為5'- AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3'（SEQ ID NO: 3）。將二十五（25）µl之各分析稀釋劑及校準劑，或樣品（按需要稀釋）（產生50 μL總體積）添加至各孔中。將盤在振盪下培育1-3小時且洗滌各孔。將如上文所述製備的用鄰近探針1及2標記之偵測抗體之溶液添加至各孔中（每孔25 μL），且在振盪下培育1-2小時（或者，可依序添加各個別偵測抗體，其中各添加之後為1小時培育）。將包含以下組分之連接混合物添加至各孔中：（i）環化寡核苷酸1（4 nM）、環化寡核苷酸2（4 nM）、連接緩衝液、ATP（1 mM）、T4 DNA連接酶（0.15 U/μL），其中環化寡核苷酸中之每一者為：
環化寡核苷酸1：磷酸-CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA（SEQ ID No. 4）。
環化寡核苷酸2：磷酸-GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A（SEQ ID No. 5）。
將盤與連接混合物一起在室溫下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起在37 C下培育1.5小時，其中RCA混合物含有RCA緩衝液、dNTP（各250 μM）、Phi29 DNA聚合酶（0.125 U/ml）。盤經洗滌且添加偵測探針之混合物且在37 C下培育30分鐘，其中偵測探針混合物包含：20 mM Tris、1 mM SDTA、250 mM NaCl、0.01% Triton、BSA（200 μg/ml）、Tween 20（0.05%）、偵測探針（6.25 nM）。偵測探針為序列CAG TGA ATG CGA GTC CGT CT（SEQ ID No. 6）。為了併入電化學發光標記SULFO-TAG（Meso Scale Diagnostics），合成了具有末端生物素標記之偵測探針且與SULFO-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素預先結合。將盤洗滌且用150 µl MSD讀取緩衝液填充且立即在MSD SECTOR® 6000讀取器上讀取（盤及讀取器由Meso Scale Discovery, Rockville, MD供應）。
此通用程序用於偵測以下分析物：肌鈣蛋白I、Akt（總）、磷酸化Akt（473）、磷酸化Akt（308）、A型流感核蛋白（NP）、IL-12p40、IL-12p70、Aβ1-42、使用TNFα模型系統之橋接及同型分析Ig分析、使用B型肝炎表面抗原之橋接及同型分析Ig分析以及使用Lyme C6之橋接及同型分析Ig分析。相對於標準夾心免疫分析的ECL信號及分析靈敏度之增加在分析之間改變，但觀測到高達100倍之改良。對於某些測試之分析，例如肌鈣蛋白-I、Akt（總）、IL-12p40、IL-12p70及Aβ1-42，錨定部分之存在藉由防止偵測複合物在擴增步驟期間解離而改良信號及/或稀釋線性。圖9中示出了根據上文所述之程序進行之IL-10分析的校準曲線。另外，表2（下文）展示相對於來自Meso Scale Diagnostics（MSD）, Rockville, MD之標準雙抗體免疫分析方案（第3欄，「MSD V-Plex 2-AB免疫分析方案」）的LOD，根據上文所述之程序進行之一組代表性分析（第2欄，「3-AB RCA/PLA分析」）的LOD。 表2.
分析物 3-AB RCA/PLA分析LOD（fg/mL） MSD V-Plex 2-AB免疫分析方案（fg/mL）
IL-1b 2-5 80
IL-2 4 180
IL-4 0.7 40
IL-6 0.6 120
IL-10 2 60
實例 2. 具有或不具有錨定試劑之分析方案
各用肌鈣蛋白I捕捉抗體（220 μg/mL）如上文實例1中所述地塗佈MSD 7點MULTI-SPOT盤。捕捉抗體在具有或不具有錨定部分BSA之情況下共點樣，對擴增子具有特異性之寡核苷酸共價連接至該錨定部分（5 μg/mL錨定物，若存在）。將二十五（25）µl之各分析稀釋劑、校準劑或樣品（按需要稀釋）添加至各孔中（總共50 μl）。將盤在振盪下培育2小時且洗滌各孔。將如上文所述製備的用鄰近探針1及2標記之偵測抗體之溶液添加至各孔中（每孔25 μL），且在振盪下培育1小時。如上文實例1中所述，將連接混合物添加至各孔中。如上文實例1中所述，將盤與連接混合物一起在室溫下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起在37 C下培育1.5小時。如上文實例1中所述，盤經洗滌且添加偵測探針之混合物且在37 C下培育30分鐘。盤經洗滌且用150 µl MSD讀取緩衝液填充且立即在MSD SECTOR 6000讀取器上讀取。自盤頂部移除MSD電極以進行螢光成像，且用PBS及蓋玻片保持潤濕。用Zyla相機、20×物鏡、2×2像素組合（binning）、客戶濾光器組、在2秒曝光下在顯微鏡上查看表面。
如表3（下文）中所示，在錨定試劑存在下，ECL值高4-5倍，且偵測極限低三倍（更靈敏）。
Cal Conc （pg/ml） +錨定物 無錨定物
500 134,705 29,818
50 12,713 2,486
5 1,121 270
0.5 150 60
0.05 92 43
0.005 40 86
0.0005 56 30
0 71 37
偵測 極限 0.36 1.16
表3
圖10（a）及（b）展示具有（組（a））及不具有5 μg/mL錨定試劑（組（b））之盤表面的螢光顯微鏡影像。影像展示與個別結合事件相關之亮螢光點，且證實在錨定試劑存在下，RCA擴增更高效地產生可觀測結合事件。實例 3. 一個與兩個連接寡核苷酸之比較
使用具有一個連接位點之單一線性連接寡核苷酸替代具有兩個獨立連接位點之兩個連接寡核苷酸來重複實例2中所述之分析，以形成環狀模板。如圖11（a）中所示，製備在連接位點1或連接位點2處開放之單一線性連接寡核苷酸。將兩個單一線性連接寡核苷酸與實例1及2中所用之寡核苷酸，Circ-1及Circ-2之組合並排測試。採用實例2中所述之方案且另外，在三種濃度下測試單一線性連接寡核苷酸：125 nM、62.5 nM及31 nM，而使用Circ-1及Circ-2寡核苷酸之組合的標準分析係在125 nM下測試。如圖11（b）中所示，兩個單一線性連接子寡核苷酸以與雙組分連接寡核苷酸混合物（Circ-1及Circ-2）大致相同的效率成功地併入至RCA擴增產物中。基於信號強度、非特異性背景及總體靈敏度，在連接位點1處開放的單一線性連接寡核苷酸具有與雙組分連接子混合物類似的效能。如所預期，在連接位點2處開放的單一線性連接寡核苷酸具有更高的非特異性背景及更低的靈敏度。在此後一種情況下，連接及引發均僅取決於鄰近探針#1的存在；因此，喪失了鄰近擴增方法的一些特異性益處。實例 4. 使用替代鄰近探針、錨定寡核苷酸及連接序列進行之三抗體分析
使用實例1中概述之方案，使用以下替代試劑組進行分析： 表4
序列描述 序列
替代組（ a ）
偵測寡核苷酸 5'-/5Biosg/ACATCGGTAGTT-3'（SEQ ID NO: 7）
鄰近寡核苷酸1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaCACTAAGCTGTTAGTCCATTACCGmUmUmU（SEQ ID NO: 8）
鄰近寡核苷酸2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaGCTGGAGGTTCAGACGATTTTGCG（SEQ ID NO: 9）
Circ-1 /5Phos/AACAGCTTAGTGACATCGGTAGTTAACAGATTGATCTTGACACATCGGTAGTT CGCAAAATCGTC（SEQ ID NO: 10）
Circ-2 /5Phos/TGAACCTCCAGCTTTCGGTAATGGACT（SEQ ID NO: 11）
錨定寡核苷酸 5'ACAGATTGATCTTGAAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/（SEQ ID NO: 12）
替代組（ b ）
偵測寡核苷酸 5'-/5Biosg/ACATCGGTAGTT-3'（SEQ ID NO: 7）
鄰近寡核苷酸1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaAGAGTCCAGAGGCAAAGCGTGAATmUmUmU（SEQ ID NO: 13）
鄰近寡核苷酸2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaGATAAGGAAGGGGCCTTAGCGACA（SEQ ID NO: 14）
Circ-1 /5Phos/CCTCTGGACTCTACATCGGTAGTTTGGAACATTTTATTCTAACATCGGTAG TTTGTCGCTAAGGC（SEQ ID NO: 15）
Circ-2 /5Phos/CCCTTCCTTATCTTTATTCACGCTTTG（SEQ ID NO: 16）
錨定寡核苷酸 5'GGAACATTTTATTCTAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/（SEQ ID NO: 17）
替代組（ c ）
偵測寡核苷酸 5'-/5Biosg/ACATCGGTAGTT-3'（SEQ ID NO: 7）
鄰近寡核苷酸1 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaAACAACTCCGATTGCTTGCTTCTTmUmUmU（SEQ ID NO: 18）
鄰近寡核苷酸2 /5ThioMC6-D/aaaaaaaaaaTAGCCCTACGTGCCCTGCATAGAC（SEQ ID NO: 19）
Circ-1 /5Phos/ATCGGAGTTGTTACATCGGTAGTTCGCGCAGGTCGGGAATTACATCGGT AGTTGTCTATGCAGGG（SEQ ID NO: 20）
Circ-2 /5Phos/CACGTAGGGCTATTTAAGAAGCAAGCA（SEQ ID NO: 21）
錨定寡核苷酸 5'GCGCAGGTCGGGAATAAA AAA AAA AAA AAA AAA AA/3ThioMC3-D/（SEQ ID NO: 22）
下表5中之結果係針對肌鈣蛋白分析，其中肌鈣蛋白之濃度為500 pg/mL且MULTI-SPOT盤之各孔包含具有來自表4中所列之組中之一者之錨定寡核苷酸的一個捕捉點。該分析使用一個鄰近探針（1）及一個鄰近探針（2），濃度與實例1中所述相同。組（a）-（c）之非特異性結合更高，因為與實例1中所述相比，其具有高9倍的偵測寡核苷酸-SA-STAG之濃度。偵測寡核苷酸-SA-STAG之較高濃度由一起滴定預結合複合物，而非如同實例1單獨滴定SA-STAG而產生。 表5.
PLA 組 （ a ） （ b ） （ c ） 實例 1
肌鈣蛋白 178,560 138,540 189,166 273,261
零肌鈣蛋白 412 314 545 88
實例 5. 在其他免疫分析平台上進行之三抗體分析 （a）使用編碼粒子之基於珠粒之免疫分析形式
在96孔過濾盤中進行所有分析步驟。用真空歧管（不超過10吋Hg）自盤移除液體。切勿將盤翻轉過來。若發生堵塞，則使用15 ml錐形管之尖端輕輕按壓堵塞孔下方的區域，且接著使用1 ml巴斯德吸管橡膠球或將拇指置於堵塞孔上以藉由產生壓力來去除堵塞物。在最終抽吸步驟後，在一疊紙巾上輕輕敲打盤之底部且接著用Kimwipe輕擦過濾盤底部，以移除殘餘液體/液滴。
洗滌溶液製備：藉由用285 ml去離子水稀釋20×洗滌溶液瓶之全部內容物來製備1×工作洗滌溶液。
分析標準品製備：在100%分析稀釋劑（血清及血漿樣品）或50%分析稀釋劑/50%組織培養基（組織培養上清液）中復原凍乾標準品；復原體積：（i）1小瓶：1 ml；（ii）2小瓶：每小瓶0.5 ml。在室溫下再水化8-10分鐘。輕輕翻轉小瓶幾次且使小瓶再靜置3-5分鐘以確保完全水合。若使用超過1種標準品，則組合相等體積之各標準品且輕輕混合。進行復原標準品之3倍連續稀釋以製備七點標準曲線。
分析物捕捉： （1）渦旋（30秒）且音波處理（30秒）10×捕捉珠粒儲備液。在箔片包裝管中，將10×捕捉珠粒儲備液（每孔2.5 μL）在工作洗滌溶液（每孔25 μL，每個分析約2,000至5,000個珠粒）中稀釋。為了更高程度的多重化，調節工作洗滌溶液之體積以顧及保留之10×捕捉珠粒儲備液的額外體積。 （2）用200 μl工作洗滌溶液預潤濕標準品及樣品孔。 （3）渦旋（30秒）且音波處理（30秒）稀釋之捕捉珠粒溶液。立即向各分析孔添加25 μl，接著添加200 μL的1×洗滌溶液。抽吸且用200 μL工作洗滌溶液重複洗滌。按需要輕敲及輕擦過濾盤底部。 （4）向所有分析孔中添加50 μl培育緩衝液。 （5）向指定孔中添加100 μl標準品。對於指定用於樣品之孔，添加50 μl分析稀釋劑，接著添加50 μl樣品。將盤覆蓋且在室溫下在軌道盤振盪器（500-600 rpm）上培育2小時。在所有培育期間用不透明蓋覆蓋分析盤以避光。可能需要根據定軌振盪器之半徑來調整速度。
分析物偵測 （6）製備螢光標記之偵測抗體之1×混合物：在稀釋劑（每孔100 μL）中稀釋10×偵測抗體混合物（每孔10 μL）。混合物包含對所關注分析物具有特異性之一對偵測抗體，一個用Alexa Fluor 350（藍色螢光標記）標記且另一個用Alexa Fluor 594（紅色螢光標記）標記（此等螢光標記中之每一者購自Life Technologies, Grand Island, NY, www.lifetechnologies.com）。為了更高程度的多重化，調節稀釋劑之體積以顧及所需的10×抗體混合物儲備液之額外體積。抽吸且用200 μl工作洗滌溶液洗滌分析孔兩次。將100 μl稀釋之偵測抗體混合物添加至各分析孔。將盤覆蓋且在盤式振盪器（500-600 rpm）上培育1小時。
分析讀取 （8）抽吸且用200 μl工作洗滌溶液洗滌分析孔3次。用乾淨的紙巾擦乾過濾盤底部以完全移除所有殘餘液滴。將100 μl工作洗滌溶液添加至各分析孔且將盤置於盤式振盪器（500-600 rpm）上2-3分鐘。 （9）在包含用於各螢光標記之色彩通道的多色螢光粒子分析儀（諸如FACS系統或改良的XMAP儀器）中分析珠粒懸浮液。為了使靈敏度最大，在任何粒子可能僅具有零個或一個結合分析物之條件下執行分析，且藉由計數對包括兩個螢光標記之給定分析物具有特異性之粒子之數目（基於粒子編碼）來定量分析物之量。視情況，分析可使用編碼珠粒以多重形式執行，其中編碼指示珠粒上之捕捉抗體之分析物特異性，及額外偵測抗體對針對各分析物之特異性。當確定編碼時（如在使用併入珠粒中之額外螢光顏色的XMAP中），分析儀應具有額外偵測通道，用於量測額外顏色及鑑別珠粒編碼。 （b）   使用包含錨定部分之編碼粒子，使用經核酸探針修飾之兩種偵測試劑的基於珠粒之免疫分析形式
如實例5（a）中所概述，所有分析步驟均在96孔過濾盤中進行。如實例5（a）中所描述來製備洗滌溶液及分析標準品，且如實例1中所述，藉由添加鄰近探針1及2來修飾針對目標分析物之一對偵測抗體。如實例5（a）中所述，在捕捉珠粒上捕捉分析物。捕捉珠粒包含以BSA-寡核苷酸結合物形式固定至珠粒表面的錨定部分，其中選擇對滾環擴增子具有特異性之寡核苷酸。所用錨定寡核苷酸之序列為SEQ ID NO: 3。
將二十五（25）µl分析稀釋劑、校準劑或樣品（按需要稀釋）與捕捉珠粒之混合物混合。將混合物在振盪下培育1-3小時且洗滌。將如上文所述製備的用鄰近探針1及2標記之偵測抗體之溶液添加至混合物中，且在振盪下培育1-2小時（或者，可依序添加各個別偵測抗體，其中各添加之後為1小時培育）。添加實例1中所述之連接混合物。將混合物與連接混合物一起在37 C下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起在37 C下培育1.5小時，其中RCA混合物如上文實例1中所述。混合物經洗滌且添加螢光素標記之偵測探針之混合物且在37 C下培育30分鐘，其中偵測探針混合物如上所述。混合物經洗滌且將粒子抽吸至多通道螢光粒子分析儀中。 （c）   基於珠粒之形式及將捕捉分析物分子分離至個別奈米孔中
在100 μl之25%牛血清（2-4倍稀釋）中製備樣品且將塗佈有捕捉抗體之500K珠粒（順磁2.7 μm，視情況經螢光編碼）添加至樣品。將樣品在23℃下培育約2小時。樣品用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌三次，且添加經標記偵測抗體之混合物（包含第一生物素標記之偵測抗體及半抗原結合抗體之混合物）。將混合物在23℃下培育約1小時。將混合物用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌三次，添加酶標記抗生蛋白鏈菌素-β-半乳糖苷酶（40pM），亦添加抗半抗原結合酶，且將混合物在23℃下培育約30分鐘（或在SIMOA分析儀中培育3分鐘）。將混合物用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌七次且添加酶受質，15 μl試鹵靈-β-d-哌喃半乳糖苷（100 μM，於加樣緩衝液中）。
將混合物抽吸至奈米孔陣列（由QUANTERIX以DVD格式提供，由環烯烴聚合物製成，每個圓盤具有24個樣品）上且使其沈降約2分鐘。陣列用緩衝液沖洗，陣列用氟碳油密封，在23℃下培育2-5分鐘，且在多色螢光成像儀上讀取結果。影像分析用於計數含有兩種螢光酶產物之奈米孔之數目且因此提供與樣品中分析物之濃度相關的值。 （d）   分析之流量槽，基於珠粒之免疫分析形式
第一培育：使10 μl樣品，生物素標記之單株分析物特異性捕捉抗體（2.6 mg/l之工作溶液）及各結合至寡核苷酸之單株分析物特異性抗體之混合物（0.3 mg/l之工作溶液）反應以形成夾心複合物。如同實例1製備單株分析物特異性抗體之混合物，且混合物包含如上文實例1中所述的結合至鄰近探針1及2之一對抗體。
第二培育：在添加抗生蛋白鏈菌素塗佈之微米粒子（DYNAL M280，2.8 μm，0.72 mg/ml，生物素之結合能力為470 ng/mg）之後，複合物經由生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用變得與固相結合。將連接混合物添加至混合物，其中根據實例1中所述之方案製備連接混合物。如實例1中所述，將混合物與連接混合物一起在37 C下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起培育。混合物經洗滌且添加生物素標記之偵測探針之混合物且在37 C下培育30分鐘，其中如實例1中所描述來製備偵測探針混合物。為了併入電化學發光標記SULFO-TAG（Meso Scale Diagnostics），合成了具有末端生物素標記之偵測探針且與SULFO-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素預先結合。
將反應混合物抽吸至量測元件中，其中將微米粒子磁性捕捉至電極表面上。接著用PROCELL（含TPA之緩衝液）移除未結合物質。接著向電極施加電壓，誘導化學發光發射，其係藉由光電倍增器來量測。經由校準曲線（其為藉由2點校準專門產生之儀器）及經由試劑條形碼提供之主曲線來確定結果。實例 6. 偵測 HIV-1 P24 材料、方法及結果：
實例1中所述之程序用於偵測HIV-1 p24。自HIV-1混合效價效能組（購自Seracare Life Sciences, www.seracarecatalog.com）、HIV-1血清轉化組（亦購自Seracare Life Sciences）、HIV抗體陽性樣品（購自ProMedDx, LLC，www.promeddx.com）及正常匹配樣品（購自Bioreclamation，www.bioreclamation.com）測試大約64個血清或血漿樣品。圖12中示出了根據上文所述之程序進行之HIV-1 p24分析的校準曲線。發現分析之LOD為1.3 fg/mL，LLOQ為3.0 fg/mL，且ULOQ為37,500 fg/mL。25 μL樣品之1.3 fg/mL之偵測極限對應於大致650個p24分子且各病毒粒子（分子）產生大約2000個p24蛋白之複本。
混合效價效能組PRA204(B)由根據市售分析（bioMerieux、Perkin Elmer及Zeptometrix）對於HIV p24抗原具有介於弱至強陽性範圍內之反應性的一組十個樣本組成。組中包含兩個陰性樣本。分析結果展示於下表6中： 表6.
組成員 bioMerieux HIV Ag VIDAS p24（pg/mL） Perkin Elmer HIV Ag p24（s/co） Zeptometrix HIV Ag p24（s/co） MSD 3AB格式（pg/mL） MSD 3AB格式（ECL）
PRA204(B)-09 ＞400 ＞42 75 ＞38 1915873
PRA204(B)-10 ＜3 1 0 0.0 174
PRA204(B)-11 85 18 16 ＞38 1674519
PRA204(B)-12 60 11 14 ＞38 1601078
PRA204(B)-13 170 47 41 ＞38 1902237
PRA204(B)-15 192 45 36 ＞38 1884816
PRA204(B)-17 ＞400 42 61 ＞38 1897359
PRA204(B)-20 ＜3 1 0 0.0 150
PRA204(B)-21 68 14 18 ＞38 1422070
PRA204(B)-22 17 3 1 10 347517
PRA204(B)-23 14 2 2 7 237726
PRA204(B)-24 15 3 3 9 306728
對於大部分樣品，HIV p24水準較高且高於ULOQ。所有十個陽性樣品均為可偵測的且與市售p24套組類似，而陰性樣品（基於商業分析，分別為PRA204(B)-10及-20）相當低，分別為大約3及2 fg/mL。
血清轉化組之分析結果展示於圖13中。發現3抗體分析形式與PCR一樣靈敏，且在來自PRB948及PRB962組之兩個樣品中偵測第一陽性樣品及p24水準之時間的估計延遲與PCR套組類似且比其他商業p24分析表現更好。資料展示於表7中。 表7.
組及成員 自從第1次出血之天數 Abbott BBI（s/co） Coulter BBI（s/co） DuPont BBI（s/co） Inno.（s/co） MSD 3AB（pg/mL） MSD 3AB（ECL） Roche PCR（co/mL）   
第I-I組，PRB948-01 0 0.4 0 0.1 0.4 0.001 121 BLD   
第I-I組，PRB948-01 18 0.4 0 0.1 0.4 0.001 100 BLD   
第I-I組，PRB948-01 20 0.5 0.2 0.5 1 3 97688 3×104   
第I-I組，PRB948-01 23 5 23 15 31 ＞38 1736809 6×105   
   自從第1次出血之天數 Coulter（s/co）2 PE（s/co）2 Roche Elecsys（s/co）2 Zepto（s/co）2 MSD 3AB（pg/mL） MSD 3AB（ECL） Roche Ultra （co/mL） Roche標準
第I-II組，PRB962-01 0 0.3 0.3 0.1 0.1 0.002 149 ＜50 NT
第I-II組，PRB962-02 2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.001 120 ＜50 NT
第I-II組，PRB962-03 7 0.2 0.2 0.2 0.2 0.021 778 NT 7.6×102
第I-II組，PRB962-04 9 0.6 0.3 0.3 0.3 0.2 7603 NT 7.7×102
第I-II組，PRB962-05 14 ＞40 30 23 10 ＞38 1808344 NT 7.0×103
第I-II組，PRB962-06 17 ＞40 ＞49 155 24 ＞38 1863699 NT 1.2×107
Abbott BBI係指Abbott BBI HIV-1抗原測試。 Coulter BBI係指Coulter BBI HIV-1抗原測試。 DuPont BBI係指DuPont BBI HIV-1抗原測試。 Inno.係指Innogenetics R129 HIV-1抗原測試。 Roche PCR係指Roche PCR HIV RNA BBI測試。 Coulter係指Coulter ELISA HIV-1抗原測試。 PE係指Perkin Elmer ELISA HIV-1抗原測試。 Zepto.係指Zeptometrix ELISA HIV-1抗原測試。 Roche Ultra係指Roche Ultrasensitive HIV-1 RNA測試。 Roche標準係指Roche標準HIV-1 RNA測試。 BLD=低於偵測極限且NT=未測試。 結論：
最近感染HIV之患者對疾病傳播的貢獻不成比例。感染後最初幾週的病毒負荷較高，且新感染之患者不太可能意識到其被感染且可將疾病傳播給其他人。因此，急性HIV感染之早期偵測對公共衛生非常重要。PCR方法為就靈敏度而言之黃金標準；其可偵測少至60個HIV RNA複本/mL血清或血漿（30個病毒粒子/mL）。然而，PCR技術複雜且昂貴，且因此不適合於所有情形。免疫分析更簡單且更便宜，但當前第4代p24免疫分析之偵測極限僅為約10 pg/mL，或大約2億5千萬個衣殼蛋白/mL。在每一病毒基礎上，此等免疫分析之靈敏度比PCR測試低數千倍，儘管每一病毒存在約2,000個p24衣殼蛋白。
如本文所述，開發了基於MSD之MULTI-ARRAY® 技術的下一代電化學發光分析形式且表徵了其效能。此新穎p24免疫分析之偵測極限為大約1 fg/mL，比當前p24免疫分析靈敏10,000倍。1 fg/mL之靈敏度對應於25 μL之吾人之樣品體積中小於1個病毒粒子。定量之下限及上限分別為3 fg/mL及38,000 fg/mL。盤內CV為7%，且總CV為15%。加標回收率及稀釋線性為80%至120%。在32個明顯健康供體之血清或血漿中不可偵測到p24。p24混合效價組顯示3-AB HIVp24分析與商業p24免疫分析之間的良好相關性。測試兩個血清轉化組：SeraCare PRB948（第0及18天，PCR陰性；第22及23天，PCR陽性）及PRB962（第0及2天，PCR陰性；第7、9、14及17天，PCR陽性）。在兩種情況下，3AB HIVp24分析結果均對於所有PCR陰性樣品呈陰性且對於PCR陽性樣品呈陽性，且遠在習知p24免疫分析之前偵測到感染。
總之，本文所述之3-AB HIVp24免疫分析的靈敏度比p24 ELISA之當前極限高10,000倍且與PCR分析之靈敏度類似。該分析不需要專門設備且可在MESO QUICKPLEX SQ 120及SECTOR® 成像儀上執行。實例 7. 濃縮分析物，接著進行 3-AB RCA/PLA 分析
（a）實驗條件展示於下表8（a）中： 表8（a）.
試劑
試劑 類型 量 結合條件
磁珠 DYNABEADS® MYONE™ Streptavidin T1 0.25 mg NA
捕捉寡核苷酸 PP1補體 100 pmol 稀釋劑100（1小時）
鄰近探針（PP）-分析物偵測抗體 對HIVp24具有特異性之PP1偵測抗體 6.7 pmol （1）1 M NaCl（40分鐘）
（2）0.5 M NaCl（40分鐘）
抗原 HIVp24 7 pg/ml （1）1 M NaCl（隔夜）
（2）0.5 M NaCl（隔夜）
對照 無捕捉之珠粒，包含PP1及抗原 .25 mg 與測試樣品相同之結合條件，無釋放步驟
釋放條件
PP/抗原複合物 PP1/HIVp24 0鹽 25 C
30 C
37 C
10 mM鹽 25 C
30 C
37 C
為了捕捉相對短的寡核苷酸鄰近探針序列（例如長度為9-13個核苷酸），製備與一部分鄰近探針序列互補之捕捉寡核苷酸且在3'端進行生物素標記。表8（b）展示了鄰近探針及捕捉寡核苷酸序列之細節： 表8（b）.
PP1序列 /5ThioMC6-D/AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGA CGCTTmUmUmU（SEQ ID NO.: 23）
捕捉寡核苷酸 序列名稱 序列長度 序列（5'-3'） 5'/Poly A（20個間隔子生物素/
捕捉寡核苷酸1 Cap-1:16 16 Aagcgtcttaactatt（SEQ ID NO.: 24）
捕捉寡核苷酸2 Cap-1:13 13 Aagcgtcttaact（SEQ ID NO.: 25）
捕捉寡核苷酸3 Cap-1:12 12 Aagcgtcttaac（SEQ ID NO.: 26）
捕捉寡核苷酸4 Cap-1:11 11 Aagcgtcttaa（SEQ ID NO.: 27）
捕捉寡核苷酸5 Cap-1:10 10 Aagcgtctta（SEQ ID NO.: 28）
捕捉寡核苷酸6 Cap-1:9 9 Aagcgtctt（SEQ ID NO.: 29）
捕捉寡核苷酸7 Cap-1:8 8 Aagcgtct（SEQ ID NO.: 30）
計算之熔融溫度展示於表8（c）中：
Tm
PP1 [C]，nM 10 10 10 10
Cap [C]，nM 10 10 10 100
鹽，mM 1200 500 40 40
Cap1-16 57 51 37 43
Cap1-13 51 46 33 39
Cap1-12 46 42 28 35
Cap1-11 36 32 19 26
Cap1-10 34 29 16 24
Cap1-9 34 30 18 26
Cap1-8 26 22 9 19
如下製備經捕捉寡核苷酸修飾之珠粒：五十（50）μL DYNAL MYONE抗生蛋白鏈菌素T1珠粒漿液在渦旋之後添加至五個1.5 mL埃彭道夫管（Eppendorf tube），各管具有跨越兩個結合條件實驗進行分割所需之量的兩倍。珠粒用1 ml稀釋劑100（購自Meso Scale Discovery, Rockville, MD）洗滌三次且將1.2 mL之各捕捉寡核苷酸以包含EDTA之稀釋劑100中每ml各捕捉寡核苷酸200 pmol添加至各小瓶中。藉由旋轉將溶液在室溫下培育1小時，且向各管中之溶液摻加游離生物素直至在包含EDTA之稀釋劑100中為5 nmol/mL。藉由旋轉將溶液在室溫下培育15分鐘，且珠粒用1 mL 0.5 M NaCl/BSA溶液洗滌三次。管用1 mL 0.5 M NaCl/BSA填充，混合且各捕捉寡核苷酸-珠粒混合物等分至2小瓶中，總共10小瓶。
自所有小瓶抽吸溶液且將在0.5 M及1 M NaCl/BSA中呈1 μg/mL（6.7 pmol/mL）之1 mL PP1（結合至對HIVp24具有特異性之偵測抗體的PP1序列）添加至各捕捉管中。將溶液在室溫下在旋轉下培育40分鐘。將各管用鹽溶液洗滌三次（不洗滌不包含捕捉寡核苷酸之對照）。向四個管中以7 pg/mL添加1 mL HIVp24，同時將抗原自儲備溶液摻入無捕捉對照管中。將溶液在旋轉下在4C下培育隔夜且將具有捕捉寡核苷酸之各管用鹽溶液（各1 mL）洗滌三次。各管用洗滌緩衝液（0.1× PBS，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，2 mg/mL BSA）填充1/3，混合且將400 μL珠粒之等分試樣添加至針對2種釋放鹽條件之兩個小瓶中，總共18個管。自除了無捕捉對照管以外的所有小瓶移除洗滌緩衝液，且將400 μL 0.0 M及10 mM鹽緩衝液添加至管中。將管之內容物混合且將來自各管（包含無捕捉對照管）之100 μL等分試樣添加至用於分析三種溫度釋放條件之三個基質盤中。將盤在混合下在恆溫振盪器中分別在25 C、30 C及37 C下培育5分鐘。將珠粒磁性分離且將25 μL上清液添加至摻有5 μL 6× PBS，包含mIgG之分析盤之孔中（每種條件重複三次）。將盤在室溫下在振盪下培育1小時且在PBS緩衝液中洗滌三次。如實例1中所述，盤上之各結合域包含捕捉抗體及錨定部分，且在培育步驟後，在各結合域處形成包含結合至抗原之捕捉抗體的複合物，該抗原結合至具有PP1序列之偵測抗體（對照結合域除外）。
將標記有PP2（或用於對照之PP1+PP2）之偵測抗體溶液添加至各孔中（每孔25 μL），且在振盪下培育1小時，接著洗滌。如實例1中所述，將連接混合物添加至各孔中且將盤與連接混合物一起在室溫下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起在37 C下培育1.5小時。盤經洗滌且添加偵測探針之混合物且在37 C下培育30分鐘。盤經洗滌且用150 µl MSD讀取緩衝液填充且立即在MSD SECTOR Reader上讀取。
此實驗之結果展示於圖14中。
（b）進行額外實驗以進一步評估分析物濃度條件。一般實驗條件描述於表9（a）中：
PP1珠粒捕捉釋放
緩衝液 體積 時間，溫度 濃度因子
液相結合
稀釋劑2（購自Meso Scale Discovery, Rockville, MD） 5 mL 隔夜，4 C NA
釋放
0鹽溶液（1 mM EDTA，2 mg/mL BSA） 100 μL 6分鐘，25 C 50×
對照條件
無珠粒，無捕捉釋放，抗原+PP1
珠粒捕捉釋放，無濃縮步驟
分析盤結合（固相條件）
1× PBS 3 μL 10× PBS/mIgG+30 μL樣品 1.5小時，室溫 NA
五十（50）μL DYNAL MYONE抗生蛋白鏈菌素T1珠粒漿液在渦旋之後添加至微量離心管。珠粒用1 ml稀釋劑100洗滌三次且將1 mL捕捉寡核苷酸Cap 1:9添加至包含EDTA之稀釋劑100。藉由旋轉將溶液在室溫下培育1小時且向溶液摻加游離生物素直至在包含EDTA之稀釋劑100中為10×過量。藉由旋轉將溶液在室溫下培育30分鐘且將珠粒用1 mL洗滌緩衝液洗滌三次。添加一（1.0）mL含PP1之結合緩衝液且將溶液在室溫下在旋轉下培育40分鐘。將管用洗滌緩衝液洗滌三次且將1 mL稀釋劑2添加至珠粒中，混合，且針對1×、0.5×、0.25×及0.125×珠粒-PP1濃度在抗原水準2-4下跨越12個管分配珠粒溶液。將所需體積之珠粒-PP轉移至對照管。將HIVp24及稀釋劑2添加至珠粒溶液以獲得5 mL總體積之抗原及珠粒-PP的所需最終濃度。未摻加珠粒對照管以僅包含1×濃度之游離PP1及所有4種水準之抗原。管在旋轉下在4 C下培育隔夜，且藉由每次轉移1 mL將5 mL珠粒溶液轉移至1.5 mL埃彭道夫管。各管用洗滌緩衝液洗滌（三次）。不洗滌無珠粒之對照管。在第三次洗滌之後，將100 μL之0鹽溶液添加至試管中，且將500 μL之0鹽溶液添加至對照管中，且將管在25C下培育6分鐘。將上清液轉移至分析盤且如同實例7（a）進行分析。結果展示於表9（b）-（c）中： 表9（b）：
   珠粒上之 Cap 釋放 無珠粒 信號 增加， X
樣品編號 濃度， fg/ml 未濃縮 50× 濃縮 對照
1 120 3,764    3,687   
2 12    15,314 369 41.5
3 1.2 1,941 71 NA
4 0.12 280 32 NA
零 32   
表9（c）：
平均濃度，fg/ml 大致病毒粒子 數目/ml 大致p24數目/ml 30 μL中之大致p24數目
120 1000 3,000,000 90,000
12 100 300,000 9,000
1.2 10 30,000 900
0.12 1 3000 90
在用磁珠濃縮分析物之後，觀測到大致五十倍之信號增加。未濃縮樣品#1顯示與對照#1信號類似之結果，其表明PP-抗原複合物以最高效率釋放。使用分析物預濃縮，達成小於0.1 fg/mL之偵測，其與1個病毒粒子/mL病毒負荷類似。相比之下，商業病毒分析可合理地偵測大約50個複本/mL，其等同於25個病毒粒子/mL。此實驗在具有或不具有預濃縮之情況下的校準曲線展示於圖15中。實例 8. 使用珠粒沈降方案之 3-AB RCA/PLA 基於珠粒之分析
如實例7中所述地進行針對IL-4之3-AB RCA/PLA分析，不同之處在於使用二氧化矽珠粒替代DYNABEADS。在固定於37℃下的MSD大點多孔分析盤（購自Meso Scale Discovery, Rockville, MD）中進行RCA及偵測培育。珠粒不包含錨定試劑。在RCA培育步驟期間使珠粒藉由重力緩慢沈降至孔之表面上，其中取決於溶液體積，沈降時間大約為5-8分鐘。藉由在擺鬥離心機中旋轉盤來洗滌盤。初步測試表明，在以跨越孔表面之僅略微梯度旋轉之後，珠粒均勻分散。
用15相對於90分鐘RCA培育來測試方案。發現與磁捕捉相比，藉由使用珠粒沈降之15分鐘RCA培育，分析之靈敏度及動態範圍提高了大約10倍。藉由90分鐘RCA培育步驟，靈敏度進一步提高（至多大約50-100倍）。
或者，如本文所述地進行3-AB RCA/PLA分析，其中珠粒包含錨定試劑且在連接步驟期間添加封閉劑（大約2.5 mg/ml）以減少非特異性結合。可使用多種封閉劑，包含但不限於mBSA、剪切之poly(A)、polyBSA-I、mIgG、Tween、polyBSA-II、酵母RNA、mBSA+poly(A)及/或polyBSA+poly(A)。實例 9. 修改之橋接免疫分析格式
如上所陳述，實例1中所述之程序用於使用TNFα模型系統之橋接及亞型分析Ig分析、使用Hep B表面抗原之橋接及亞型分析Ig分析以及使用Lyme C6之橋接及亞型分析Ig分析。對此程序之修改展示於圖19中，其中使用（i）PP2修飾之抗人類Ig抗體（1902）及（ii）PP1標記之自體抗原（1903）來偵測自體抗體（1901），接著如實例1中所述地進行PLA-RCA。圖19中所示之形式亦展示使用靶向部分（1904）及其與自體抗原（1905）結合之補體作為將捕捉部分（在此情況下為自體抗原）黏附至表面（1906）的手段。
同樣，可如實例1中所述地進行針對抗體（例如自體抗體）之免疫分析，其中針對該抗體之抗原用作捕捉部分（直接連接至表面或經由靶向部分及其補體），且兩種偵測物質為連接至PP1之同型抗體及連接至PP2之抗原（或反之亦然）。形成夾心複合物，接著如實例1中所述地進行PLA-RCA。此等修改之分析形式亦可包含錨定部分以將擴增子黏附至表面。實例 10. 用於產生鄰近連接滾環模板之生物合成方法
可以生物合成方式產生鄰近連接滾環模板。此方法利用初始高度純化及充分表徵之模板在有效的基於溶液之連接及RCA反應系列中產生RCA產物。此方法亦可在珠粒上進行以增強反應之選擇性。
在擴增種子RCA模板之後，使用與短合成序列組合之獨特限制酶對單股產物進行位點特異性裂解。因此，RCA模板產生自其自身產物。對以生物合成方式產生之RCA模板進行HPLC或凝膠純化以產生含有100%適當的5'及3'末端之產物。此方法說明於圖20（a）中。此方法需要將限制位點添加至RCA模板中以導引所期望連接位點處之裂解。較佳為限制酶，諸如自限制位點切割大致14-20個鹼基之彼等。或者，亦可使用此方法與來自M13噬菌體或類似物之單股DNA組合，以毫克量產生單股模板。此方法可消除進行RCA模板之基於RCA之擴增的需要，僅需要將模板選殖至M13載體中以產生DNA。此說明於圖20（b）中。實例 11. 樣品多重化
本文所述之方法用於基於使用光譜特徵對樣品進行多重化。樣品多重化使得使用者能夠進行內部校準及控制，減少成本且提高通量。經由使用基於對分析物編碼之空間及光譜特徵的獨特特徵對該分析物多重化之能力亦可用於樣品多重化。
使用成像擴增產物之螢光染料比編碼對樣品進行多重化。對於樣品中之各分析物，採用能夠產生獨特滾環產物之一組獨特分析試劑，各試劑可用獨特偵測寡核苷酸偵測。可根據例如實例1中描述之程序進行一組獨特分析試劑之合成及使用。如圖21中所說明，含有所關注分析物之各樣品A及B與對該分析物具有特異性之兩種偵測抗體一起培育，各偵測抗體帶有獨特鄰近探針。此培育步驟將一組獨特鄰近探針與該樣品中之分析物連接，從而與分析物形成雙抗體複合物且「編碼」樣品。在此培育之後，將編碼樣品合併且作為混合物添加至單一捕捉抗體表面，培育且洗滌。
在洗滌步驟後，添加捕捉之三抗體複合物，用於各組鄰近探針之線性滾環模板，且如實例1中所述地使混合物經受雜交條件。此混合物經連接以產生滾環模板，洗滌，進行滾環擴增且洗滌。各滾環擴增子與互補且獨特的偵測寡核苷酸雜交，該寡核苷酸基於2個或更多個螢光標記之比率經獨特光譜特徵編碼。在偵測探針雜交之後，對分析表面進行成像且各滾環產物基於其光譜特徵，例如2個或更多個螢光標記之比率解碼，且計數。此允許確定多個樣品中之分析物水準。使用此方法，使用者可組合樣品及分析物多重化，允許在測試及對照樣品中同時測試多種分析物。實例 12. 偵測脂蛋白複合物
本文所述之方法用於偵測及定量脂蛋白複合物，例如HDL及LDL中存在之蛋白質複合物組。例如，使用實例1中所述之方法，在脂蛋白複合物內偵測三種不同蛋白質及/或抗原決定基，且因此可分析患者之脂蛋白內之蛋白質概況。
在人類中，血脂蛋白分為5大類：HDL、LDL、IDL、VLDL及乳糜微粒。其中，HDL及LDL部分作為心血管健康之風險標記已受到大部分臨床關注。此等關鍵脂蛋白由多種蛋白質及脂質之複合物構成。與此等脂蛋白相關之蛋白質由對其功能必不可少之蛋白質及乘客蛋白組成。此等脂蛋白亦可進行修飾個體之風險概況的修飾，諸如氧化。例如，較高水準之經氧化HDL及LDL與不良心血管事件之風險提高相關。LDL通常由兩種核心蛋白質Apo(a)及ApoB，以及脂質構成。Apo(a)升高與心臟病風險提高相關；另外，Apo(a)蛋白長度之變化亦與改變的風險概況相關。Apo(a)蛋白之尺寸由於尺寸多態性而變化，尺寸多態性由LPA基因中可變數目之所謂的三環重複（kringle repeats）引起。LDL粒子中之ApoB攜有用於各種組織中之LDL受體的配位體。高水準之ApoB亦與斑塊形成相關，從而導致心血管疾病。HDL通常由一組核心蛋白構成，包含：ApoA1、ApoE、ApoC及ApoA-II。除了此等核心蛋白以外，亦已知HDL與亦具有臨床價值之其他蛋白質相關。例如，已證實HDL相關SAA及SP-B與心臟事件及死亡率相關。經由升高ApoA-II，HDL組成之變化亦與致動脈粥樣硬化風險有關。
在實例1中所述之程序之後，如圖22中所概述地進行脂蛋白複合物之多重鄰近分析。圖22說明了HDL脂蛋白複合物之偵測，其中對核心蛋白中之每一者具有特異性之捕捉抗體固定至表面以將脂蛋白複合物結合至表面。添加對其他核心蛋白具有特異性之偵測抗體，各偵測抗體攜有鄰近探針。如實例1中所述地完成分析。實例 13. 形成抗體 - 寡核苷酸結合物之簡化方案
製備含有2 mg/mL含抗體之磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4+1 mM EDTA（PBS/EDTA）之抗體溶液。若提供之抗體在不相容溶液中，諸如含有干擾NHS酯或順丁烯二醯亞胺反應之組分，則首先使用Zeba 40凝膠過濾旋轉管柱或10 kD截止AMICON離心超濾裝置將抗體緩衝交換至PBS/EDTA中，且接著稀釋至2 mg/mL。
抗體接著與（i）具有NHS酯及順丁烯二醯亞胺部分之異雙官能交聯劑（式V化合物，其中r=4（化合物1））及（ii）經5'末端硫醇修飾之單股DNA寡核苷酸（寡核苷酸序列=5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO: 33））（式IIIA化合物（化合物2））反應，以形成抗體及寡核苷酸之結合物。 式V
Figure 02_image130
式IIIA
Figure 02_image132
， 寡核苷酸=5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）
藉由將適當體積之交聯劑（呈DMSO中之1.5 mM溶液形式）添加至抗體溶液進行反應，以使得交聯劑之激發比（CRxl ）等於6，其中CRxl 定義為添加之交聯劑分子之數目與抗體分子之數目之比。所得溶液經混合且接著在23℃下持續等於1小時之交聯劑培育時間（Txl ）進行培育。接著添加適當體積之硫醇修飾之寡核苷酸（呈PBS/EDTA中之2 mg/mL溶液形式）以使寡核苷酸之激發比（CRon ）等於9，其中CRon 定義為添加之寡核苷酸分子之數目與抗體分子之數目之比。所得溶液經混合且接著在23℃下持續等於一小時之寡核苷酸培育時間（Txl ）進行培育。根據此方案，相對於交聯劑，寡核苷酸為1.5倍莫耳過量。此等條件應產生每一抗體之寡核苷酸之平均數目約為3至4之結合物。注意：交聯劑分子之量可調高（例如CRxl =8或10）或調低（例如CRxl =3或4），以產生每一抗體之結合寡核苷酸之平均數目更高或更低之產物；在此等情況下，CRon 將調整為相對於交聯劑維持1.5倍過量。
對於具有100 µg至500 µg抗體之反應，藉由將最終反應混合物添加至管柱頂部且使其穿過管柱而將最終反應混合物裝載至Sephadex G100 Superfine凝膠過濾樹脂之2 mL（±0.1 mL）管柱（在由PBS/EDTA加上0.05%疊氮化鈉組成之收集緩衝液中預平衡）上。接著將額外堆疊體積之收集緩衝液裝載至管柱上，以使得管柱上裝載之總體積（反應溶液加上堆疊體積）為0.65 mL。接著將收集管置於管柱出口下方，裝載額外溶離體積之收集緩衝液且收集含有抗體-寡核苷酸結合物之所得溶離劑。溶離體積設定為每100 µg抗體100 µL加上200 µL，至多為最大500 µL（或者，整個反應規模可使用之最大溶離體積為500 µL，代價為在較低規模下另外稀釋結合物）。下表列出了三種不同反應規模下之反應物及收集緩衝液等分試樣之體積。可藉由使用較大管柱且適當縮放體積來達成含有大於500 µg抗體之反應規模。
   反應 體積（µL） 收集緩衝液體積（µL）
Ab Wt.（µg） Ab X-連接子 寡核苷酸 總計 堆疊 溶離
100 50 4.4 20 74 576 300
200 100 9 40 149 501 400
500 250 22 98 370 280 500
實例 14. 量測寡核苷酸併入至抗體 - 寡核苷酸結合物中之程度的簡化方案
使用標準蛋白質量測分析，尤其是二喹啉甲酸（BCA）分析（在獲自ThermoFisher Scientific之套組形式中可用）來量測抗體-寡核苷酸結合物之溶液中蛋白質之濃度。接著在收集緩衝液中稀釋結合物（參見實例13），以得到100 µg/mL之蛋白質濃度。
藉由將寡核苷酸結合至SYBR-Green I（一種DNA敏感性螢光染料）來量測稀釋結合物中寡核苷酸之濃度。 SYBR Green I
Figure 02_image134
在DMSO中製備SYBR Green I之1000×儲備溶液，濃度為在370 nm光下提供約0.8至1.0之吸光度。藉由將1000×溶液在PBS中稀釋1000倍來製備1× SYBR Green I試劑。將10 µL體積之結合物添加至200 µL之SYBR-Green I之1×溶液中。將混合物在室溫下培育5分鐘且接著使用螢光盤讀取器，使用485 nm之激發波長及528 nm之發射波長來量測混合物之螢光。藉由與校準曲線比較來確定定量濃度值，該校準曲線係藉由測試用於產生結合物之游離寡核苷酸之連續稀釋液產生（使用來自實例13之式IIIA化合物作為校準標準）。寡核苷酸之莫耳濃度除以抗體之莫耳濃度得到每一抗體之寡核苷酸之數目。
或者，可使用對結合水準之更定性評估。例如，可以等於結合物中寡核苷酸之最小可接受濃度之水準測試單一濃度之式IIIA化合物（低對照樣品）（例如對於一些應用，臨限值濃度可設定為指示每一蛋白質之寡核苷酸之平均數目大於或等於2）：在此情況下，結合物樣品之螢光信號與低對照之螢光的簡單比較可用於確定結合物具有可接受之標記水準（結合物之螢光≥低對照之螢光）或不具有可接受之標記水準（結合物之螢光＜低對照之螢光）。類似地，亦可測試由具有高於結合物中寡核苷酸之最大預期濃度之水準之式IIIA化合物製備的另一標準品（高對照樣品）（例如，對於一些應用，臨限值濃度可設定為指示每一蛋白質之寡核苷酸之平均數目小於或等於6）；在此情況下，結合物之螢光信號與螢光信號的比較可用於確定結合物是否經過度標記或純化步驟是否未充分移除未結合寡核苷酸（結合物之螢光＞高對照之螢光）。
對於如同實例14，但使用不同水準之交聯劑以改變結合寡核苷酸/抗體分子之比製備之一組抗體-寡核苷酸結合物，圖23a展示藉由螢光方法確定之標記比與基於平均分子量（如使用EXPERION儀器藉由凝膠電泳所量測）確定之標記比密切相關。圖23b比較隨製劑中寡核苷酸之濃度而變的游離寡核苷酸及由三種不同抗體形成之抗體-寡核苷酸複合物之螢光分析信號（在結合物之情況下，藉由凝膠電泳使用EXPERION儀器確定）。該圖展示螢光不受結合或抗體間差異影響。實例 15. 合成經標記偵測探針
藉由固相合成合成了具有一或多個一級烷基胺基之一系列寡核苷酸（下文編號為4至7之化合物），且在烷基胺基處用MSD SULFO-TAG NHS酯（Meso Scale Diagnostics）標記以產生經一或多個SULFO-TAG（STAG）標記標記之寡核苷酸（下文編號為9至12之化合物）。此等測試寡核苷酸包含其中經由使用經修飾胸苷在寡核苷酸序列中引入標記位點之寡核苷酸（下文編號為5及10之化合物）及其中所有修飾位點均在寡核苷酸序列外部之寡核苷酸（下文編號為4、6、7、9、11及12之化合物）（下文揭示之SEQ ID NO: 31、31及31）。
Figure 02_image136
Figure 02_image138
使用相對於烷基胺基之數目大約13倍過量之NHS酯在pH 8之磷酸鹽緩衝液中執行標記反應，以驅動所有此等基團之標記。藉由使用pH 8處之鹽梯度在陽離子樹脂上進行離子交換層析來純化經標記產物。完全標記之產物以梯度終點附近之單峰形式出現。實例 16. 雙抗體擴增夾心免疫分析之方案
在各孔底部上包含整合式碳墨電極之MSD MULTI-ARRAY多孔盤中執行分析。電極在固相結合分析中充當捕捉試劑之固相支撐物，以及自電極上之結合複合物中存在之ECL標記產生ECL的電化學能量來源。程序中所用之特定MULTI-ARRAY盤為MSD GOLD 96 Small Spot SA盤，其在各孔中之工作電極上配備有抗生蛋白鏈菌素之固定層。根據習知程序使用生物素NHS酯試劑（EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin，ThermoFisher Scientific）對捕捉抗體進行生物素標記。根據實例14中之程序製備偵測抗體及探針寡核苷酸之結合物（偵測抗體-探針結合物）。環化寡核苷酸具有5'末端磷酸基團。偵測寡核苷酸為如實例15中所述之化合物11。針對各分析最佳化所使用之分析及偵測抗體稀釋劑以提供最佳抗原-抗體結合及最小化樣品基質效應，儘管為用於擴增形式，藉由添加鮭魚精子DNA至15 μg/mL之濃度來修飾分析稀釋劑。此實例中所述之程序使用以下寡核苷酸序列： 錨定寡核苷酸（錨定物）：5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO: 37） 探針寡核苷酸（探針）：5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO: 33） 環化寡核苷酸（Circ）：5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAG TCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO: 36） 偵測寡核苷酸（偵測劑）：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO: 32）
經由將生物素標記之試劑結合至抗生蛋白鏈菌素塗佈之電極而將捕捉抗體及錨定寡核苷酸固定於MSD盤中之電極上。首先，將盤之孔用含有0.05% Tween-20之PBS（PBS-T）洗滌三次。接著向各孔中添加50 µL在含牛血清白蛋白（BSA）之緩衝液中含有生物素標記之捕捉抗體（0.25 µg/mL）及3'-生物素標記之錨定寡核苷酸（化合物13，0.2 ng/mL）的溶液（藉由組合捕捉抗體及錨定物之儲備溶液製備）。接著將盤在室溫下在振盪下培育至少1小時或不振盪培育隔夜，且接著用PBS-T洗滌3次以移除未結合的生物素標記試劑。
Figure 02_image140
接著向各孔中添加25 µL含有鮭魚精子DNA之分析稀釋劑及25 μL樣品且將盤在室溫下培育1至2小時。將盤再次用PBS-T洗滌三次以移除過量樣品。接著將含偵測抗體-寡核苷酸探針結合物（50 µL，通常濃度為約0.01 µg/mL至0.5 µg/mL）之抗體稀釋劑添加至孔中且在室溫下培育一小時以完成夾心複合物形成。接著藉由用PBS-T洗滌孔三次來移除過量偵測抗體。
將夾心複合物結合至DNA環以準備進行滾環擴增，其藉由向各孔中添加50 μL在Tris-HCl緩衝液，pH 7.4中含有DNA連接酶、Circ寡核苷酸、乙醯化及聚合BSA、MgCl2 、DTT及ATP之溶液，且將盤在室溫下在振盪下培育30分鐘以使Circ寡核苷酸結合至任何結合偵測抗體-寡核苷酸探針結合物之探針組分，且使連接酶環化Circ寡核苷酸以形成結合環。接著將盤用PBS-T洗滌三次以移除未結合之Circ寡核苷酸及連接酶。如下地進行滾環擴增及用ECL標記來標記擴增產物：藉由向各孔中添加50 µL在Tris緩衝液，pH 8.2中含有DNA聚合酶、四種標準dNTP中之每一者、偵測探針、乙酸鉀、50 mM氯化鉀、乙酸鎂、DTT及Tween-20之溶液，且將盤在27℃下振盪一小時以藉由滾環擴增延伸探針寡核苷酸，將擴增產物錨定至錨定寡核苷酸且將偵測寡核苷酸與擴增產物雜交。接著藉由用PBS-T洗滌盤三次來移除過量偵測寡核苷酸。
為了進行ECL量測，將150 μL含ECL共反應物之ECL讀取緩衝液（MSD Read Buffer Gold，Meso Diagnostics）添加至各孔中且在ECL盤讀取器（MSD Sector Imager 6000或MSD QuikPlex 120，Meso Scale Diagnostics）上分析該盤。盤讀取器向盤之各孔中之工作電極（及相關相對電極）施加電位，對所得電化學發光發射成像且對於各分析量測報導與發射光之量成比例的定量值。圖24中提供了雙抗體擴增分析形式之示意圖，其說明Circ寡核苷酸之結合及其後續連接及滾環擴增，以形成與固定之錨定序列及標記之偵測序列兩者結合之延伸產物。實例 17. 選擇尺寸排阻樹脂用於抗體 - 寡核苷酸結合物純化
如實例13中所述地以200 µg規模製備具有15聚體寡核苷酸之抗體-寡核苷酸結合物，不同之處在於結合物純化步驟。在此實例中，將使用多種不同尺寸排阻樹脂之純化相互比較且與經由使用離心超濾裝置（具有50 kD截斷之AMICON超濾裝置，根據製造商建議使用）之純化比較。為了比較尺寸排阻樹脂，將結合反應產物裝載於以下樹脂之2 mL管柱上：
樹脂 供應商 產品型號 粒度（ μm ）
Sephadex G-50 Fine Sigma G5080 20-80
Sephadex G-50 Fine Roche 03117928001 20-80
Sephadex G-100 Fine Sigma 27119-5 40-120
Sephadex G-100 Superfine GE Healthcare 17-0061-01 10-40
Superdex G-200 GE Healthcare 17-1043-01 24-44
Sephacryl S-200 GE Healthcare 17-0584-10 50
Sephacryl S-300 GE Healthcare 17-0599-10 50
另外，亦使用純結合物、未結合抗體及未結合寡核苷酸進行執行，以鑑別反應混合物中各種可能組分之峰位置。在裝載樹脂之後，產物用收集緩衝液溶離且以0.2 mL溶離份收集。
在測試之樹脂中，G-100 Superfine具有結合物及未結合寡核苷酸之最佳分離。圖25（a）中示出了使用G-100 Superfine樹脂之未純化結合物之溶離概況，同樣示出了未結合抗體、未結合寡核苷酸及純結合物之對照概況。對於蛋白質使用BCA分析且對於寡核苷酸使用SYBR Green I分析來定量溶離液分數（如實例14中所述）。如圖中所示，G-100 Superfine管柱上之純化可以高產率（通常為80至85%）提供純化結合物，且未結合寡核苷酸之污染極小（通常小於10%）。
為了測試純化結合物之活性，製備結合物以用於針對IL-6之夾心免疫分析的偵測抗體。使用G-100 Superfine管柱或使用Amicon超濾裝置純化結合物。分析中所用的來自G-100純化之溶離份展示於圖25（b）之G-100溶離概況中。偵測抗體結合物與生物素標記之IL-6捕捉抗體配對且用於在滾環擴增雙抗體分析中量測一系列IL-6校準標準物（使用與實例16中所述之方案類似的方案）。圖25（c）提供隨校準劑濃度而變的量測ECL信號，且展示使用G-100方法及Amicon方法純化之偵測抗體得到幾乎相同的分析信號。結果表明，使用G-100重力純化不會不利地影響抗體-寡核苷酸功能，儘管其進行起來比Amicon方法（其需要多次離心機執行以製備裝置及進行純化）簡單得多且更快。實例 18. 用於定量抗體 - 寡核苷酸結合物之替代螢光染料
鑑別了多種已知在結合至核酸時增加螢光之螢光染料。使用與實例14中所述類似的形式（除了改變染料），測試染料靈敏且特異性地量測抗體-寡核苷酸結合物中之15聚體寡核苷酸之能力。下表中列出了測試之染料，以及製造商報導的偵測電泳凝膠中之未結合核酸之靈敏度（以絕對濃度或相對於使用溴化乙錠染色劑）。該表亦提供不同形式之核酸的報導靈敏度，以及染料螢光之峰值激發及發射波長。
試劑 特異性 靈敏度 Ex/Em
Quant-iT OliGreen 所有核酸，尤其是胸腺嘧啶（ssDNA＞10 bp） 1 pg/μL 480/520
Quant-iT RiboGreen RNA及DNA，尤其是腺嘌呤或胞嘧啶 約1 pg/μL 480/520
QuantiFluor ssDNA系統 ssDNA 約1 pg/μL 492/528
SYBR Green I 與ssDNA具有較低結合之dsDNA 5-25× EtBr 497/520
SYBR Green II 與ssDNA具有較低結合之RNA 5-25× EtBr 497/520
SYBR Gold 所有核酸 25-100× EtBr 495/537
圖26（a）展示比較染料效能之三個圖。左圖展示相對於抗體結合物中等效濃度之寡核苷酸的未結合寡核苷酸之螢光信號（其中結合物中寡核苷酸之濃度係基於在Experion電泳儀中使用凝膠電泳分離量測之平均分子量而確定）；所有染料對於未結合及結合寡核苷酸具有大致等效的螢光信號（比率在約0.9與1.1之間），表明寡核苷酸與蛋白質之結合不干擾螢光信號之產生。中圖比較不存在寡核苷酸之未結合抗體的信號相對於等效濃度之結合物的信號；相對於結合物，所有染料對於抗體提供低信號（比率小於約2%），表明抗體之存在不干擾量測。右圖展示獲自100 ng結合物之信號的信號:背景比（基於蛋白質量測）；所有染料之比率均大於5（且一些比率大於10或15），表明分析方法具有足以分析少至100 ng結合物中之寡核苷酸水準的靈敏度。儘管所有測試之染料具有足夠效能，但選擇SYBR Green I進行進一步開發，因為其通常用於定量凝膠中之DNA及qPCR，且其在開發用於量測螢光素之濾光器組（497 nm處之激發，520 nm處之發射）下工作良好。圖26（b）展示了隨游離形式或抗體結合物形式之寡核苷酸之濃度而變的來自SYBR Green I之螢光信號，且表明兩種形式之信號在寬分析動態範圍內緊密匹配。實例 19. 替代經標記偵測探針
為了比較用於滾環擴增分析之經標記偵測探針的不同可能結構，使用針對IL-4、IL-6及IL-10之捕捉-偵測抗體對，且改變使用之偵測探針之結構來進行實例16中所述之雙抗體程序。在此實驗中，比較之偵測探針為實例15中所述之以下SULFO-TAG標記之化合物：來自實例15之化合物9（具有單一3'標記，在實例中稱為「1X 3」）、化合物10（具有2個內部標記核苷酸及3'標記，在實例中稱為「2X Internal & 3'」、化合物11（具有3標記連接至3'端之結構，在實例中稱為「3X 3'+18EG B」）及化合物12（具有3'標記經由PEG連接子連接至3'端之結構，在實例中稱為「3X 3'+18EG」）。評估之另一偵測探針方法為使用預先結合至SULFO-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素的3'生物素標記之探針（稱為「SA偵測」）。除了實例16中所述之方案（稱為「同時」方案，因為偵測探針與聚合酶一起添加，使得在形成滾環產物時發生偵測探針結合）以外，亦執行稱為「依序」方案之修改方案。在依序方案中，自聚合酶反應省去偵測探針，在聚合酶反應步驟之後添加洗滌步驟以移除聚合酶溶液，且在額外培育步驟中添加偵測探針。在使偵測探針結合之後，孔經洗滌，用ECL讀取緩衝液填充且如同同時方案量測ECL。
在第一實驗中，使用依序（圖27（a））及同時（圖27（b））方案來比較「SA偵測」、「1x3'」、「2xInternal & 3'」及「3x3'+18EG」偵測探針。在依序方案中，圖展示相對於單獨標記之「1x3'」結構，使用多標記之寡核苷酸結構（「2xInternal & 3'」及「3x3'+18EG」）提供信號之1.5至2倍增加，表明多個ECL標記即使在小寡核苷酸密集時亦可在不破壞雜交效率的情況下提供增加之ECL信號。在同時方案中，內部標記之結構（「2xInternal & 3'」）亦相對於單獨標記之結構提供增加之信號，然而，末端標記之「3x3'+18EG」給出低得多的信號，可能是由於探針與聚合酶之相互作用。出人意料地，移除「3x3+18EG」結構與寡核苷酸之間的聚乙二醇連接子（亦即，提供「3x3+18EG B」結構）消除此干擾。在第二實驗中，顯示「2xInternal & 3'」及「3x3'+18EG B」偵測探針在依序及同時方案兩者中之效能大致相等。圖28展示根據兩種方案用兩個偵測探針量測之校準曲線，且亦具有一表，該表呈現中水準校準標準之信號（「Cal3」）、空白信號（「NSB」及估計之偵測極限（LOD））。應注意，儘管依序方案之信號傾向於高於同時方案，但背景信號傾向於類似地更高，使得兩種方案之總體靈敏度大致類似。實例 20. 形成抗體 - 寡核苷酸結合物之替代條件
根據實例13之程序製備IL-4偵測抗體之抗體-寡核苷酸探針結合物，除了改變兩個參數：（i）x-連接劑之激發比（CRxl ）在3至14之間變化（測試CRxl 值包含3、5、8、9、10、11、12及14)及（ii）交聯劑之培育時間（Txl ）為0分鐘或預設之60分鐘。寡核苷酸之激發比（CRon ）及寡核苷酸之培育時間（Ton ）分別保持恆定於15及1小時。對於Txl =0條件（稱為「同時」條件，與交聯劑同時添加寡核苷酸（一種方法為在交聯劑之前添加寡核苷酸，使得交聯劑在添加時與蛋白質及寡核苷酸兩者同時反應）。在添加寡核苷酸之前使交聯劑與蛋白質反應之預設條件稱為「依序」條件。如下分析所得抗體-寡核苷酸探針結合物之效能：（i）藉由使用實例14中所述之蛋白質及寡核苷酸分析程序來確定每個抗體分子之連接寡核苷酸之數目，及（ii）當在如實例16中所述執行之IL-4分析中使用抗體-寡核苷酸探針結合物作為偵測抗體時，藉由量測由中水準IL-4校準標準產生之信號。
圖29a中之表展示依序及同時方案均有效地產生在IL-4分析中提供ECL信號之結合物。依序方案中3或同時方案中8之CRxl 值足以獲得標記:蛋白質比（「L/P」，每個抗體之連接寡核苷酸之平均數目）高於3個寡核苷酸/抗體之目標值的結合物。在此標記:蛋白質比下，泊松分佈（Poisson distribution）預測小於5%殘留的未標記抗體（藉由呈模型化凝膠影像形式之圖29b中所示之EXPERION凝膠電泳結果確認未標記抗體之低水準）。圖29a及29b亦展示CRxl 之進一步增加可用於在免疫分析中提供更高標記比及更高信號。實例 21. 用於滾環擴增免疫分析之寡核苷酸序列的最佳化
在實例16中所述之程序的開發中，測試多種寡核苷酸序列及結構且進行比較以使效能最佳化，同時使試劑之成本、尺寸及複雜度最小化。使用與實例16中之程序類似的程序執行資料，除了取代寡核苷酸序列或試劑。 錨定寡核苷酸序列
測試生物素標記之錨定寡核苷酸之變化形式且相比於具有長PolyA連接子之錨定序列的對照錨定物（與實例1中所用之錨定寡核苷酸類似）。測試之結構如下所示：
Figure 02_image142
（SEQ ID NO: 37）
錨定寡核苷酸 修飾 m，n
對照 Poly A生物素連接子 m = 18，n = 0
寡核苷酸1 無Poly A連接子 m = 0，n = 0
寡核苷酸2 無Poly A連接子 + 1個PEG間隔子 m = 0，n = 1
寡核苷酸3 無Poly A連接子 + 2個PEG間隔子 m = 0，n = 2
寡核苷酸4 無Poly A連接子 + 3個PEG間隔子 m = 0，n = 3
在擴增ECL分析中針對IL-4及IL-10測試此等錨定寡核苷酸中之每一者。圖30（a）及30（b）中所示之結果提供針對關於含有高水準校準標準（High-Cal）、中水準校準標準（Mid-Cal）及空白樣品（NSB）之樣品之各分析量測的ECL信號。該等圖表明可在不存在Poly A或PEG間隔子之情況下維持最佳效能。 抗體-寡核苷酸結合物中之寡核苷酸探針序列
進行實驗以藉由修飾實例1中所述之硫醇修飾之鄰近探針2構築體（以下結構）來確定用於抗體-寡核苷酸結合物之最佳探針組態。
Figure 02_image144
在新探針中，移除Poly A連接子且藉由在探針結合序列之兩端添加或移除鹼基來產生一系列改變長度（8至30個鹼基）之探針結合序列，同時維持與Circ寡核苷酸之末端的互補性。此等新探針構築體結合至偵測抗體以進行IL-10免疫分析（與實例13類似），且以雙抗體滾環擴增形式進行測試（與實例16類似）。圖31（a）展示針對中水準IL-2校準標準量測之特異性信號（Mid Cal）、在不存在IL-2之情況下之非特異性信號（NSB）及估計之偵測極限（LOD）。出人意料地，藉由省略連接單元及縮短探針結合序列（雜交長度）至約14至15個鹼基，信號得以增加且偵測極限得以提高。使用較短探針不僅提供更好的效能，且亦降低產生探針之成本及複雜度，且藉由使得能夠使用簡單的尺寸分離裝置來分離結合物與未結合探針而簡化用於純化抗體-探針結合物之程序。基於實驗，選擇使用15聚體探針序列：5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO: 33）。
亦研究對15聚體探針之序列的修飾。所選序列具有約47%之GC含量（15個鹼基中之7個）。測試了另一15聚體探針，其中GC含量升至大於60%或約67%（15個鹼基中之10個）；對Circ寡核苷酸之互補區進行類似改變。 高GC探針：TGCACAGC-TCGACGC（SEQ ID NO: 42） 高GC Circ：GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG AGAGTAGTACAGCAAGA-GCGTCGA（SEQ ID NO: 43）
圖31（b）提供隨連接步驟期間之溫度而變的高水準（High Cal）、中水準（Mid-Cal）及空白（NSB）校準標準物之信號，且展示增加之GC序列可在更高溫度下提供探針-Circ複合物之更好穩定性，其可為提高擴增分析形式之連接步驟之溫度及動力學提供機會。 模板（Circ）寡核苷酸序列
進行實驗以如實例3及圖11（a）中所述地藉由修飾對於鄰近探針2具有單一連接位點之整體連接寡核苷酸（Circ）來確定最佳Circ寡核苷酸構築體。此Circ寡核苷酸設計用於實例1中所述之三抗體鄰近硫醇修飾之鄰近探針2構築體（以下結構）。此Circ包含用於未經長度最佳化之雙抗體寡核苷酸探針結合物（包含未以雙抗體擴增形式使用之結合物）之結合位點。測試之Circ序列包含：
Circ寡核苷酸 長度 修飾
常規Circ2 90bp 原始全長Circ
LCS2 Min 2 78bp 移除未使用之探針結合位點
LCS2 Min 1 68bp 移除所有未使用之序列
LCS2 Min 3 61bp 將錨定序列自25 bp減小至16 bp
LCS2 Min 4 53bp 將探針結合序列自25 bp減小至16 bp
使所有Circ序列包含5'末端磷酸。使用具有15聚體探針之偵測抗體-寡核苷酸探針序列，針對IL-10在分析中測試Circ序列。圖32展示當使用不同Circ序列時，隨IL-10濃度而變之分析信號。結果表明分析信號在Circ長度減小至低於90個鹼基對（bps）或大約或低於78 bp時增加，其中在約61至約68 bps之範圍內獲得最大信號。減小之Circ長度不僅提高效能且亦降低產生寡核苷酸之成本及複雜度，可使得滾環擴增產物中環重複之複本數增加且可降低非所期望核酸相互作用之風險。選擇61 bp序列用於分析：GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGT ACAGCAAGAGTGTCTA（SEQ ID NO: 36）。
圖33中示出了相對於實例3中所用之錨定物、模板、結合物及偵測寡核苷酸，對此實例中所述之彼等之修飾的概述。實例 22. 雙抗體滾環擴增分析與習知非擴增免疫分析之比較
如實例16中所述地進行針對一系列不同分析物之分析。各分析使用如實例13及14中所述製備及表徵之生物素標記之捕捉抗體及偵測抗體-寡核苷酸探針結合物。將分析效能與習知ECL分析形式進行比較。在習知形式中，替代使用偵測抗體探針結合物，偵測抗體經MSD SULFO-TAG NHS標記以20之激發比標記（通常提供每個抗體約8個標記之最終標記比）。與擴增分析相同地執行習知分析，直至偵測抗體結合步驟（除了所用之經標記偵測抗體中存在差異）。在習知分析中，在完成與偵測抗體之培育步驟後，用PBS-T將盤洗滌3次，將150 μL MSD GOLD Read Buffer添加至各孔中，且在ECL盤讀取器上分析該等盤。
圖34a展示藉由擴增顯著改善之三個分析（IL-2、IL-4及IL-10）的校準曲線。該等圖比較以標準及擴增分析形式獲得之信號且表明藉由擴增，信號之改善介於約30倍至約100倍範圍內。圖34b比較針對人類蛋白質目標之41種分析之標準及擴增型式的偵測極限（估計為給出比分析背景高2.5個標準差之信號的濃度）：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TSLP、TNF-α、IL-21、IFN-γ、GM-CSF、IL-1β、IL-33、IL-31、IL-12p70、IL-22、IL-5、G-CSF、IL-15、IL-16、VEGF-A、IL-23、IFN- α 2a、伊紅趨素-3、IFN-β、IL-9、IL-7、IL-29/IFN-λ1、TPO、IL-27、MCP-3、MIP-3α、IL-3、I-TAC、IL-1α、IL-17B、IL-17C、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-17D、IL17A/F及TNF-β。在測試之分析中，約90%（37/41）藉由擴增使偵測極限提高了至少2倍，約68%（28/41）提高了至少5倍，約56%（23/41）提高了至少10倍，約44%（18/41）提高了至少25倍，且約21%提高了至少100倍。最大提高為約718倍。實例 23. 在其他免疫分析平台上進行之雙抗體分析 （a）使用編碼粒子之基於珠粒之免疫分析形式
在96孔過濾盤中進行所有分析步驟。用真空歧管（不超過10吋Hg）自盤移除液體。切勿將盤翻轉過來。若發生堵塞，則使用15 ml錐形管之尖端輕輕按壓堵塞孔下方的區域，且接著使用1 ml巴斯德吸管橡膠球或將拇指置於堵塞孔上以藉由產生壓力來去除堵塞物。在最終抽吸步驟後，在一疊紙巾上輕輕敲打盤之底部且接著用Kimwipe輕擦過濾盤底部，以移除殘餘液體/液滴。
洗滌溶液製備：藉由用285 ml去離子水稀釋20×洗滌溶液瓶之全部內容物來製備1×工作洗滌溶液。
分析標準品製備：在100%分析稀釋劑（血清及血漿樣品）或50%分析稀釋劑/50%組織培養基（組織培養上清液）中復原凍乾標準品；復原體積：（i）1小瓶：1 ml；（ii）2小瓶：每小瓶0.5 ml。在室溫下再水化8-10分鐘。輕輕翻轉小瓶幾次且使小瓶再靜置3-5分鐘以確保完全水合。若使用超過1種標準品，則組合相等體積之各標準品且輕輕混合。進行復原標準品之3倍連續稀釋以製備七點標準曲線。
分析物捕捉： （1）渦旋（30秒）且音波處理（30秒）10×捕捉珠粒儲備液。在箔片包裝管中，將10×捕捉珠粒儲備液（每孔2.5 μL）在工作洗滌溶液（每孔25 μL，每個分析約2,000至5,000個珠粒）中稀釋。為了更高程度的多重化，調節工作洗滌溶液之體積以顧及保留之10×捕捉珠粒儲備液的額外體積。 （2）用200 μl工作洗滌溶液預潤濕標準品及樣品孔。 （3）渦旋（30秒）且音波處理（30秒）稀釋之捕捉珠粒溶液。立即向各分析孔添加25 μl，接著添加200 μL的1×洗滌溶液。抽吸且用200 μL工作洗滌溶液重複洗滌。按需要輕敲及輕擦過濾盤底部。 （4）向所有分析孔中添加50 μl培育緩衝液。 （5）向指定孔中添加100 μl標準品。對於指定用於樣品之孔，添加50 μl分析稀釋劑，接著添加50 μl樣品。將盤覆蓋且在室溫下在軌道盤振盪器（500-600 rpm）上培育2小時。在所有培育期間用不透明蓋覆蓋分析盤以避光。可能需要根據定軌振盪器之半徑來調整速度。
分析物偵測 （6）製備1×螢光標記之偵測抗體：在稀釋劑（100 μl/孔）中稀釋10×偵測抗體（10 μl/孔）。用螢光標記，諸如Alexa Fluor 350（藍色螢光標記）或Alexa Fluor 594（紅色螢光標記）（購自Life Technologies, Grand Island, NY）標記偵測抗體。為了更高程度的多重化，調節稀釋劑之體積以顧及所需的10×抗體儲備液之額外體積。抽吸且用200 μl工作洗滌溶液洗滌分析孔兩次。將100 μl稀釋之偵測抗體添加至各分析孔。將盤覆蓋且在盤式振盪器（500-600 rpm）上培育1小時。
分析讀取 （8）抽吸且用200 μl工作洗滌溶液洗滌分析孔3次。用乾淨的紙巾擦乾過濾盤底部以完全移除所有殘餘液滴。將100 μl工作洗滌溶液添加至各分析孔且將盤置於盤式振盪器（500-600 rpm）上2-3分鐘。 （9）在包含用於各螢光標記之色彩通道的多色螢光粒子分析儀（諸如FACS系統或改良的XMAP儀器）中分析珠粒懸浮液。為了使靈敏度最大，在任何粒子可能僅具有零個或一個結合分析物之條件下執行分析，且藉由計數對包括螢光標記之給定分析物具有特異性之粒子之數目（基於粒子編碼）來定量分析物之量。視情況，分析可使用編碼珠粒以多重形式執行，其中編碼指示珠粒上之捕捉抗體之分析物特異性，及偵測抗體針對各分析物之特異性。當確定編碼時（如在使用併入珠粒中之額外螢光顏色的XMAP中），分析儀應具有額外偵測通道，用於量測額外顏色及鑑別珠粒編碼。 （b）   使用包含錨定部分之編碼粒子，使用經核酸探針修飾之偵測試劑的基於珠粒之免疫分析形式
如實例23（a）中所概述，所有分析步驟均在96孔過濾盤中進行。如實例23（a）中所描述來製備洗滌溶液及分析標準品，且如實例13中所述藉由添加SEQ ID NO: 33之核酸探針來修飾針對目標分析物之偵測抗體。如實例23（a）中所述，在捕捉珠粒上捕捉分析物。捕捉珠粒包含以BSA-寡核苷酸結合物形式固定至珠粒表面的錨定部分，其中選擇對滾環擴增子具有特異性之寡核苷酸。所用錨定寡核苷酸之序列為SEQ ID NO: 37或45。
將二十五（25）µl分析稀釋劑、校準劑或樣品（按需要稀釋）與捕捉珠粒之混合物混合。將混合物在振盪下培育1-3小時且洗滌。將如上文所述製備的用SEQ ID NO: 33之核酸探針標記之偵測抗體之溶液添加至混合物中，且在振盪下培育1-2小時（或者，可依序添加各個別偵測抗體，其中各添加之後為1小時培育）。添加實例1中所述之連接混合物。將混合物與連接混合物一起在37℃下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起在37℃下培育1.5小時，其中RCA混合物如上文實例1中所述。混合物經洗滌且添加螢光素標記之偵測探針之混合物且在37℃下培育30分鐘，其中偵測探針混合物如上所述。混合物經洗滌且將粒子抽吸至多通道螢光粒子分析儀中。 （c）   基於珠粒之形式及將捕捉分析物分子分離至個別奈米孔中
在100 μl之25%牛血清（2-4倍稀釋）中製備樣品且將塗佈有捕捉抗體之500K珠粒（順磁2.7 μm，視情況經螢光編碼）添加至樣品。將樣品在23℃下培育約2小時。將樣品用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌三次，且添加標記之偵測抗體（生物素標記之偵測抗體或半抗原結合抗體）。將混合物在23℃下培育約1小時。將混合物用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌三次，添加酶標記抗生蛋白鏈菌素-β-半乳糖苷酶（40pM），亦添加抗半抗原結合酶，且將混合物在23℃下培育約30分鐘（或在Simoa分析儀中培育3分鐘）。將混合物用PBS（5×，0.1% Tween-20）洗滌七次且添加酶受質，15 μl試鹵靈-β-d-哌喃半乳糖苷（100 μM，於加樣緩衝液中）。
將混合物抽吸至奈米孔陣列（由QUANTERIX以DVD格式提供，由環烯烴聚合物製成，每個圓盤具有24個樣品）上且使其沈降約2分鐘。陣列用緩衝液沖洗，陣列用氟碳油密封，在23℃下培育2-5分鐘，且在多色螢光成像儀上讀取結果。影像分析用於計數含有兩種螢光酶產物之奈米孔之數目且因此提供與樣品中分析物之濃度相關的值。 （d）   分析之流量槽，基於珠粒之免疫分析形式
第一培育：使10 μl樣品，生物素標記之單株分析物特異性捕捉抗體（2.6 mg/l之工作溶液）及結合至核酸探針之單株分析物特異性偵測抗體之混合物（0.3 mg/l之工作溶液）反應以形成夾心複合物。如實例13中所述，單株分析物特異性偵測抗體結合至SEQ ID NO: 33之核酸探針。
第二培育：在添加抗生蛋白鏈菌素塗佈之微米粒子（DYNAL M280，2.8 μm，0.72 mg/ml，生物素之結合能力為470 ng/mg）之後，複合物經由生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用變得與固相結合。將連接混合物添加至混合物，其中根據實例1中所述之方案製備連接混合物。如實例1中所述，將混合物與連接混合物一起在37℃下培育30分鐘，洗滌以移除過量環化寡核苷酸，且與RCA混合物一起培育。混合物經洗滌且添加生物素標記之偵測探針之混合物且在37℃下培育30分鐘，其中如實例1中所描述來製備偵測探針混合物。為了併入電化學發光標記SULFO-TAG（Meso Scale Diagnostics），合成了具有末端生物素標記之偵測探針且與SULFO-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素預先結合。
將反應混合物抽吸至量測元件中，其中將微米粒子磁性捕捉至電極表面上。接著用PROCELL（含TPA之緩衝液）移除未結合物質。接著向電極施加電壓，誘導電化學發光發射，其係藉由光電倍增器來量測。經由校準曲線（其為藉由2點校準專門產生之儀器）及經由試劑條形碼提供之主曲線來確定結果。
視情況，為了穩定擴增複合物與珠粒之連接，在開始程序之前，或在添加RCA混合物之前或期間將包括SEQ ID NO: 37或45之生物素錨定寡核苷酸結合至珠粒。實例 24. 使用磁珠之三抗體 RCA/PLA 基於珠粒之分析
使用DYNABEAD 280（具有環氧連接化學物質之2.8 µm磁珠），基本上如實例1中所述地進行針對IL-4之三抗體RCA/PLA分析。此等DYNAL珠粒以20:1之抗體:錨定物比塗佈有IL-4捕捉抗體及BSA錨定寡核苷酸。在塗佈步驟後，珠粒用含0.5% BSA之PBS封閉、洗滌且儲存於0.1% BSA中。如同實例1在PCR管條中進行RCA及偵測培育步驟，其中在旋轉混合器上培育，且將磁力分離用於洗滌步驟。在RCA及偵測步驟後，珠粒經洗滌且再懸浮於1×讀取緩衝液中且轉移至MSD大點多孔分析盤（購自Meso Scale Discovery, Rockville, MD）。在讀取ECL之前，使用96個磁體之陣列將MSD大點盤中之磁珠下拉至大點多孔分析盤之電極表面上。來自IL-4分析之結果展示於下表中。
下表展示了對珠粒使用磁性捕捉，來自DYNAL磁珠上之三抗體RCA/PLA IL-4分析之資料。ECL信號來自校準曲線之兩個複本。
IL-4校準劑 pg/mL 複本1 複本2
200 73,879 63,937
20 6,681 5,404
2 840 1,867
0 182 155
實例 25. 用於擴增夾心免疫分析之方案；在樣品培育之後添加錨定寡核苷酸
改變實例16中之分析形式以允許在將分析物捕捉至固相上之後引入錨定DNA序列。此等形式允許在不存在錨定DNA之情況下將含有分析物之樣品與捕捉抗體一起培育，消除了由樣品DNA相互作用（諸如抗DNA反應性、DNA結合蛋白相互作用及分析物DNA相互作用）所致之干擾的可能。
基本上如實例16中所述地在各孔底部上包含整合式碳墨電極之MSD MULTI-ARRAY多孔盤中執行分析，修改如下。錨定寡核苷酸含有與實例16中相同之序列，且添加5'胺基修飾劑（/5AmMC6/）及3'胺基修飾之dT鹼基（/3AmMC6T/）。使用DNP之NHS酯（DNP-X-SE D2248；THERMOFISHER）以20:1之莫耳激發比用二硝基苯酚（DNP）標記此胺基修飾之錨定物，接著使用7K ZEBA樹脂脫鹽。DNP之併入量量測為每個寡核苷酸1.9個DNP。使用生物素NHS酯試劑（EZ-LINK磺基-NHS-生物素，THERMOFISHER SCIENTIFIC）根據製造商程序標記抗DNP單株抗體純系3571-E73-2（MSD）。如同實例15，用探針寡核苷酸（探針高GC）標記實例16中之偵測抗體（IL-4抗體）。
此實例中所用之寡核苷酸如下（由商業核酸探針製造商製造）； 錨定寡核苷酸（錨定物）：5'-/5AmMC6/AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA/3AmMC6T/ 3'（具有修飾之SEQ ID NO: 45） 探針寡核苷酸（高GC探針）：5'-/5ThioMC6-D/TGCACAGCTCGACGC（具有修飾之SEQ ID NO: 42） 環化寡核苷酸（高GC Circ）：/5Phos/GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA（具有修飾之SEQ ID NO: 43） 偵測寡核苷酸（偵測劑）：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/ -3'（具有修飾之SEQ ID NO: 44）
經由將生物素標記之試劑結合至抗生蛋白鏈菌素塗佈之電極而將捕捉抗體及抗DNP抗體固定於MSD盤中之電極上。首先，將盤之孔用含有0.05% Tween-20之PBS（PBS-T）洗滌三次。接著向各孔中添加50 µL在含牛血清白蛋白（BSA）之緩衝液中含有生物素標記之捕捉抗體（0.25 µg/mL）及抗DNP抗體（20 ng/mL）之溶液（藉由組合IL-4捕捉抗體及抗DNP抗體之儲備溶液製備）。接著將盤在室溫下在振盪下培育至少1小時或不振盪培育隔夜，且接著用PBS-T洗滌3次以移除未結合的生物素標記抗體。將此等盤與含有添加之IL-4校準劑的樣品一起培育。
在一種形式中，在IL-4-探針培育步驟中將偵測抗體與2 nM DNP標記之錨定寡核苷酸一起添加。如同實例15處理偵測抗體，但使用如上之高GC Circ。在一種替代形式中，將0.5 nM DNP標記之錨定物添加至實例16之連接步驟中，接著使用如上之高GC Circ進行如實例15之方法。此兩種形式均能夠產生與實例16中概述之標準形式類似的結果（如下表中所示）。 表：來自具有不同錨定形式之分析的ECL信號。
IL-4 pg/mL 標準 實例16 DNP-錨定物 探測步驟 DNP-錨定物 連接步驟
2.14 232,336 130,379 272,295
0.00 191 136 183
如上表中所示，以三種不同錨定形式測試來自IL-4校準劑之ECL信號以用於擴增之夾心免疫分析：如實例16中之標準及兩種替代方法，其允許使用基於抗體之捕捉方法在樣品培育後引入錨定寡核苷酸。在第一種替代方法中，將錨定寡核苷酸與探針標記之抗IL-4抗體一起引入（DNP-錨定物探測步驟）。在第二種替代方法中，在連接步驟（DNP-錨定物連接步驟）中引入錨定寡核苷酸。
本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制。實際上，根據前述描述及隨附圖式，除了本文中所述之修改之外，方法之各種修改對熟習此項技術者而言亦將變得顯而易見。此類修改意欲屬於申請專利範圍之範疇內。本文中引用各種公開案，其揭示內容以全文引用的方式併入。 參考文獻
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Ribas, V.等人, 《循環研究（Circ.Res.）》 2004年10月15日: 95(8): 789-97
101:表面 102:捕捉試劑 103:錨定試劑 104:偵測試劑 105:核酸探針 106:複合物 107:延伸序列 108:表面 109:捕捉試劑 110:錨定試劑 111:錨定寡核苷酸序列 112:偵測試劑 113:核酸探針 114:複合物 115:延伸序列 116:表面 117:捕捉試劑 118:錨定試劑 119:錨定寡核苷酸序列 120:偵測試劑 121:偵測試劑 122:核酸探針 123:核酸探針 124:複合物 125:延伸序列 201:表面 202:捕捉試劑 203:錨定試劑 204:第一偵測試劑 205:第一鄰近探針 206:第二偵測試劑 207:第二鄰近探針 208:偵測複合物 209a:連接序列 209b:連接序列 210:環狀目標序列 C1(E1):第一端 C1(E2):第二端 C2(E1):第一端 C2(E2):第二端 CE1:末端序列 CE2:末端序列 CIS:內部序列 401:表面 402:捕捉試劑 403:分析物 404:偵測試劑 405:偵測試劑 406:鄰近探針 407:鄰近探針 408:Circ-1 409:Circ-2 410:連接位點 411:連接位點 412:環狀DNA模板 413:偵測序列 414:錨定寡核苷酸序列補體 415:部分錨定序列補體 416:錨定寡核苷酸序列 417:捕捉部分 418:偵測序列 419:偵測序列 1601:粒子 1602:捕捉寡核苷酸序列 1603:鄰近探針 1604:偵測抗體 1605:複合物 1606:分析物 1607:污染物 1608:污染物 1609:分析物與偵測抗體結合 1610:移除污染物 1611:形成與鄰近探針結合之分析物的濃溶液 1612:偵測樣品中分析物之存在 1701:分析物A 1702:偵測抗體 1703:偵測抗體 1704:鄰近探針 1705:鄰近探針 1706:偵測複合物 1707a:連接序列 1707b:連接序列 1708:環狀目標序列 1709:表面 1710:捕捉試劑 1711:錨定試劑 1712:經標記探針 1801:U形釘序列 1802:序列 1803:序列 1804:錨定試劑 1902:抗體 1903:自體抗原 1904:靶向部分/捕捉寡核苷酸 1905:自體抗原 1906:表面 2019:自體抗體 A:分析物
[圖1]（a）-（c）說明錨定試劑於免疫分析中之用途。圖1（a）展示錨定試劑結合至包括捕捉試劑、所關注分析物及包含核酸探針之偵測試劑的偵測複合物且使其穩定之用途。核酸探針經延伸以結合至錨定試劑。在圖1（b）中，錨定試劑包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列包含與在偵測試劑上形成之延伸序列之一部分互補的區域。圖1（c）展示特定實施例，其中兩種偵測試劑用於結合分析物，各偵測試劑包含核酸探針。對偵測試劑上之探針進行擴增方法，其使得能夠將一個延伸探針與錨定寡核苷酸序列雜交。 [圖2]（a）展示特定實施例，其中對攜有錨定試劑之表面上形成之免疫複合物進行PLA-RCA方法，以在與免疫複合物連接之延伸序列中併入複數種可偵測物質。圖2（b）及2（c）為可用於本發明方法中之連接寡核苷酸之兩種替代組態。 [圖3]展示將寡核苷酸連接至蛋白質之一種方法。 [圖4]（a）說明本發明之一較佳實施例，其中表面結合複合物形成於捕捉試劑、分析物與兩種偵測試劑之間，偵測試劑各自分別連接至第一及第二鄰近探針，該等探針連接至連接探針以形成藉由滾環擴增進行擴增之環狀DNA模板。圖4（a）亦包含擴增試劑，該擴增試劑包含與隨著分析方法進展形成之擴增子之序列互補的錨定寡核苷酸序列。圖4（b）展示第一環狀DNA模板Circ-1之例示性序列、偵測寡核苷酸序列、擴增子之惰性區及部分PP2，其經設計以與第二鄰近探針雜交。替代實施例描繪於圖4（c）中。 [圖5及6]（a）-（b）說明產生可藉由滾環擴增進行擴增之擴增子的替代方法。 [圖7]說明替代實施例，其中夾心複合物中之各鄰近探針之一部分經與各片段雜交之RNA之短股暫時保護。彼等股以酶方式移除，以允許鄰近探針彼此雜交且延伸鏈。 [圖8]展示另一實施例，其中鄰近探針連接至捕捉試劑及偵測試劑，且各鄰近探針之一部分經與其雜交之RNA之短股暫時保護，如參看圖8在上文所述。 [圖9]展示使用實例1中所述之方法進行之IL-10分析的校準曲線。 [圖10]（a）-（b）展示在使用（a）及不使用（b）錨定試劑之情況下的螢光顯微鏡影像。 [圖11]（a）展示包含連接位點1或2之單一線性連接寡核苷酸序列之組態，及此等連接子在本發明之分析中之用途。圖11（b）展示使用Circ-1及Circ-2之組合相對於包含連接位點1之單一線性連接寡核苷酸序列或包含連接位點2之單一線性連接寡核苷酸序列之分析的比較效能資料。 [圖12]展示使用實例1及6中所述之方法進行之HIV p24分析的校準曲線。 [圖13]展示使用實例1及6中所述之方法進行血清轉化組分析之結果。 [圖14]（a）-（c）展示包含分析物濃縮步驟之HIVp24分析的結果。 [圖15]展示包含分析物濃縮步驟之HIVp24分析的校準曲線。 [圖16]為包含分析物濃縮步驟的如本文所述之分析方法之示意圖。 [圖17]為如本文所述之分析方法之示意圖，其中在經由捕捉試劑及/或錨定試劑結合至表面之前，在溶液中形成擴增子。 [圖18]為分析方法之示意圖，該方法併入使用複數個U形釘序列（staple sequence）以黏附至擴增子，由此在表面上形成更緊湊結構。 [圖19]為併入3AB PLA-RCA技術之橋接免疫分析形式及靶向部分及其補體將捕捉試劑結合至表面之用途的示意圖。 [圖20]（a）-（b）為用於模板形成之生物合成方法的示意圖。 [圖21]為樣品多重化之示意圖。 [圖22]為使用本文所述之方法偵測脂蛋白複合物之示意圖。 [圖23]展示（a）藉由螢光染料方法及凝膠電泳量測之抗體-寡核苷酸結合物之平均標記/蛋白質（L/P）比的比較，及（b）對於游離寡核苷酸及抗體-寡核苷酸結合物中之寡核苷酸，隨寡核苷酸濃度而變的藉由螢光染料方法量測之信號。 [圖24]展示在抗生蛋白鏈菌素塗佈表面上進行之雙抗體擴增ECL免疫分析之示意性描述。 [圖25]展示（a）針對抗體-寡核苷酸結合反應之粗產物，來自G-100 Superfine管柱之溶離概況相對於針對未結合抗體、未結合寡核苷酸及純化結合物之概況；（b）針對IL-6偵測抗體-寡核苷酸結合物之溶離概況及收集之溶離份；及（c）使用G-100純化之IL-6偵測抗體-寡核苷酸結合物之擴增ECL免疫分析的校準曲線相對於藉由離心超濾純化結合物時之結果。 [圖26]展示（a）對於六種不同核酸敏感性螢光染料（左側），在結合至游離寡核苷酸相對於與抗體結合之寡核苷酸之後的相對螢光信號；（中間）來自與染料與蛋白質之相互作用相關之抗體-寡核苷酸結合物之信號的%及（右側）在量測100 ng結合物期間獲得的信號:背景比；及（b）隨寡核苷酸濃度而變的針對三抗體-寡核苷酸結合物使用SYBR Green I染料量測之螢光信號（及此等信號與藉由未結合寡核苷酸獲得之彼等信號的比較）。 [圖27]比較以（a）依序及（b）同時分析形式，對於三種不同分析物，在擴增ECL分析中，4種不同經標記偵測寡核苷酸構築體之效能。 [圖28]比較以依序及同時分析形式，對於三種不同分析物，在擴增ECL分析中，2種不同經標記偵測寡核苷酸構築體之效能。 [圖29]展示交聯劑激發比及結合方案對抗體-寡核苷酸結合物之產生及效能之影響，提供了（a）擴增ECL分析中之標記/蛋白質（L/P）及效能，以及（b）藉由凝膠電泳之結合物形成的表徵。 [圖30]比較不同生物素-錨定寡核苷酸構築體在擴增ECL分析中對於兩種分析物之效能。 [圖31]展示（a）偵測抗體-寡核苷酸探針結合物之探針長度對使用結合物之分析所獲得之信號、背景及偵測極限的影響，及（b）探針中之GC含量對分析中之連接步驟針對改變溫度之靈敏度的影響。 [圖32]比較擴增ECL分析中之不同Circ寡核苷酸構築體對於分析物之效能。 [圖33]為在試劑最佳化以進行擴增ECL分析期間進行的改良之示意性描述。 [圖34]展示（a）比較以習知及放大形式獲得之信號的三種分析物之分析之校準曲線；及（b）比較針對41種以不同分析物為目標之不同分析以兩種形式獲得之偵測極限。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
101:表面
102:捕捉試劑
103:錨定試劑
104:偵測試劑
105:核酸探針
106:複合物
107:延伸序列
A:分析物

Claims (263)

  1. 一種式I之經標記探針，
    Figure 03_image146
    式I， 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數且n為0與5之間的整數。
  2. 如請求項1之經標記探針，其中R包括釕錯合物RP1 P2 P3 ，其中P1 、P2 及P3 中之每一者獨立地為聯吡啶、經取代之聯吡啶、啡啉或經取代之啡啉。
  3. 如請求項2之經標記探針，其中該電化學發光標記R為：
    Figure 03_image148
    。
  4. 如請求項1至3中任一項之經標記探針，其中B為尿嘧啶，該尿嘧啶在位置5處與L1 連接。
  5. 如請求項1至4中任一項之經標記探針，其中L1 包括：
    Figure 03_image150
    Figure 03_image152
    ，或 其組合， 其中p為1與12之間的整數。
  6. 如請求項1至5中任一項之經標記探針，其中L2 包括：
    Figure 03_image154
    ，
    Figure 03_image156
    ，
    Figure 03_image158
    ，或 其組合， 其中q為0與11之間的整數。
  7. 一種式II之經標記探針：
    Figure 03_image160
    式II， 其中j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數，n為0與5之間的整數，且R為電化學發光標記：
    Figure 03_image162
    。
  8. 如請求項1之經標記探針，其中k為0，j為0，m為1且n為5。
  9. 如請求項1至8中任一項之經標記探針，其中該寡核苷酸包括與 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）具有至少90%序列一致性之序列。
  10. 如請求項1至8中任一項之經標記探針，其中該寡核苷酸包括 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。
  11. 如請求項1至8中任一項之經標記探針，其中該寡核苷酸包括 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。
  12. 一種量測電化學發光之方法，其包括： （a）   在其中接近電極之複合物將發射電化學發光的條件下向該電極施加電位，其中該複合物包括目標寡核苷酸及如請求項1至11中任一項之經標記探針，其中該經標記探針包括與該目標寡核苷酸互補之寡核苷酸； （b）   量測發射之電化學發光。
  13. 如請求項12之方法，其中該目標寡核苷酸固定於該電極上。
  14. 如請求項12之方法，其中該複合物進一步包括能夠結合至該目標寡核苷酸之結合試劑，其中該結合試劑固定於該電極上。
  15. 如請求項12之方法，其中該目標寡核苷酸固定於固相支撐物上。
  16. 如請求項12之方法，其中能夠結合至該目標寡核苷酸之結合試劑固定於固相支撐物上，且其中該固相支撐物固定於該電極上。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該固相支撐物為粒子，且該粒子係使用重力、離心、過濾或施加磁場收集於該電極上。
  18. 一種用於量測電化學發光之套組，其包括如請求項1至11中任一項之經標記探針及 （a）   電極； （b）   ECL讀取緩衝液； （c）   核酸聚合酶； （d）   核酸連接酶； （e）   分析稀釋劑； （f）   額外核酸試劑； （g）   分析消耗品；或 （h）   其組合。
  19. 如請求項18之套組，其中該套組包括該電極，且該電極為碳基電極。
  20. 如請求項18之套組，其中該套組包括該分析消耗品，且該分析消耗品為多孔盤分析消耗品，且該盤之各孔包括碳墨電極。
  21. 如請求項18至20中任一項之套組，其中該套組包括該ECL讀取緩衝液，且該ECL讀取緩衝液包括三丙胺。
  22. 如請求項18至20中任一項之套組，其中該套組包括該ECL讀取緩衝液，且該ECL讀取緩衝液包括丁基二乙醇胺。
  23. 一種包括寡核苷酸之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸之長度為14-24個核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  24. 如請求項23之非天然存在之核酸探針，其進一步包括含有反應性官能基之非天然存在之5'修飾。
  25. 如請求項24之非天然存在之核酸探針，其中該反應性官能基為硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烴、張力烯烴、疊氮化物或四嗪。
  26. 如請求項25之非天然存在之核酸探針，其具有式IIIA：
    Figure 03_image164
    式IIIA。
  27. 如請求項23之非天然存在之核酸探針，其進一步包括含有半抗原或生物素之非天然存在之5'修飾。
  28. 如請求項27之非天然存在之核酸探針，其中該半抗原包括螢光素、二硝基苯基或地高辛。
  29. 如請求項27之非天然存在之核酸探針，其中該修飾包括生物素。
  30. 如請求項29之非天然存在之核酸探針，其具有式IV：
    Figure 03_image166
    式IV。
  31. 如請求項23至30中任一項之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸之長度為14-19個核苷酸。
  32. 如請求項31之非天然存在之核酸，其中該寡核苷酸之長度為15個核苷酸。
  33. 一種結合化合物，其包括結合至如請求項23至32中任一項之非天然存在之核酸探針的偵測試劑。
  34. 如請求項33之結合化合物，其中該偵測試劑為抗原結合物質。
  35. 一種包括53-76個核苷酸之非天然存在之寡核苷酸，該寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。
  36. 如請求項35之寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列進一步包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:34）及5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  37. 如請求項36之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之長度為53-61個核苷酸。
  38. 如請求項35之寡核苷酸，其中該寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。
  39. 如請求項35至38中任一項之寡核苷酸，其進一步包括5'末端磷酸基團。
  40. 一種用於將核酸探針結合至非核酸偵測試劑以形成結合物之套組，其包括： （a）   異雙官能交聯劑，其包括 （i）    能夠與該偵測試劑反應以將該交聯劑連接至該偵測試劑之第一反應性基團；及 （ii）   能夠與該核酸探針反應以將該交聯劑連接至該核酸探針，同時基本上不對該偵測試劑具有反應性之第二反應性基團； （b）   能夠將該結合物與未反應之核酸探針分離的第一尺寸分離裝置；及 （c）   核酸結合螢光團，其中該螢光團之螢光強度在該螢光團結合至核酸時增加。
  41. 如請求項40之套組，其中該第一反應性基團包括胺反應性部分。
  42. 如請求項41之套組，其中該第一反應性基團包括N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯。
  43. 如請求項40至42中任一項之套組，其中 （i）    該核酸探針包括硫醇部分且該第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分； （ii）   該核酸探針包括烯烴或張力烯烴部分且該第二反應性基團包括四嗪部分； （iii）  該核酸探針包括四嗪部分且該第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分； （iv）  該核酸探針包括炔烴或張力炔烴部分且該第二反應性基團包括疊氮化物部分； （v）   該核酸探針包括疊氮化物部分且該第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分； （vi）  該核酸探針包括4-甲醯基苯甲醯胺部分且該第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分；或 （vii） 該核酸探針包括肼基菸鹼醯胺部分且該第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。
  44. 如請求項40至42中任一項之套組，其中該核酸探針為硫醇修飾之寡核苷酸且該第二反應性基團為硫醇反應性基團。
  45. 如請求項44之套組，其中該第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺部分。
  46. 如請求項40之套組，其中該核酸探針為硫醇修飾之寡核苷酸，該第一反應性基團為胺反應性基團，該第二反應性基團為硫醇反應性基團且該異雙官能交聯劑為式V化合物：
    Figure 03_image168
    式V， 其中r為0與24之間的整數。
  47. 如請求項46之套組，其中r為4。
  48. 如請求項40至43中任一項之套組，其中該套組進一步包括該核酸探針。
  49. 如請求項48之套組，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續寡核苷酸。
  50. 如請求項44至47中任一項之套組，其中該套組進一步包括該核酸探針。
  51. 如請求項50之套組，其中該核酸探針在5'末端處經該硫醇部分修飾。
  52. 如請求項51之套組，其中該核酸探針為式IIIA化合物：
    Figure 03_image170
    式IIIA。
  53. 如請求項50至52中任一項之套組，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  54. 如請求項40至53中任一項之套組，其中該第一尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且該分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。
  55. 如請求項54之套組，其中該分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。
  56. 如請求項55之套組，其中該尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。
  57. 如請求項38至54中任一項之套組，其中該螢光團為QUANT-IT OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。
  58. 如請求項55之套組，其中該螢光團為SYBR GREEN I染料。
  59. 如請求項40至58中任一項之套組，其中該套組進一步包括校準寡核苷酸。
  60. 如請求項40至59中任一項之套組，其中該套組進一步包括用於在結合之前使偵測試劑脫鹽之第二尺寸分離裝置。
  61. 如請求項40至60中任一項之套組，其中該偵測試劑為蛋白質。
  62. 如請求項61之套組，其中該偵測試劑為抗原結合物質。
  63. 如請求項40至62中任一項之套組，其中該等套組組分在單個包裝中。
  64. 一種將核酸探針結合至非核酸偵測試劑以形成結合物之方法，其包括 （a）   使偵測試劑與核酸探針反應以形成結合物； （b）   使用尺寸分離裝置將該結合物與未反應之核酸探針分離以形成純化結合物； （c）   形成包括該純化結合物及核酸結合螢光團之樣品的測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當該螢光團與核酸結合時增加的螢光強度進行選擇；及 （d）   量測該測試組合物之螢光以確定該純化結合物中核酸探針之量。
  65. 如請求項64之方法，其中該螢光團為QUANT-IT OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。
  66. 如請求項65之方法，其中該螢光團為SYBR GREEN I染料。
  67. 如請求項64至66中任一項之方法，其中該尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且該分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。
  68. 如請求項67之方法，其中該分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。
  69. 如請求項68之方法，其中該尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。
  70. 如請求項64至69中任一項之方法，其進一步包括形成至少一種包括已知量之校準寡核苷酸及螢光團的校準組合物及量測螢光。
  71. 如請求項70之方法，其中確定該純化結合物中寡核苷酸之量包括將自該測試組合物量測之螢光與用該一或多種校準組合物量測之螢光進行比較。
  72. 如請求項71之方法，其進一步包括量測該純化結合物中偵測試劑之濃度。
  73. 如請求項72之方法，其中該偵測試劑之濃度係使用BCA蛋白質分析來量測。
  74. 如請求項73之方法，其進一步包括計算該純化結合物中每一偵測試劑之結合核酸探針之平均數量。
  75. 如請求項64至74中任一項之方法，其中該偵測試劑為抗原結合物質。
  76. 一種將核酸探針結合至非核酸偵測試劑以形成結合物之方法，其包括 使該偵測試劑及該核酸探針與異雙官能交聯劑在其中該偵測試劑與該交聯劑之第一反應性基團反應且該核酸與該交聯劑之第二反應性基團反應以形成該結合物的條件下接觸，其中該異雙官能交聯劑包括 （i）    能夠與該偵測試劑反應以將該交聯劑連接至該偵測試劑之第一反應性基團，及 （ii）   能夠與該核酸探針反應以將該交聯劑連接至該核酸探針，同時基本上不對該偵測試劑具有反應性之第二反應性基團， 其中該方法不包括在該交聯劑與該核酸探針反應之前純化該偵測試劑及該交聯劑之反應產物。
  77. 一種將核酸探針結合至非核酸偵測試劑以形成結合物之方法，其包括 （a）   使該偵測試劑與異雙官能交聯劑在其中該偵測試劑與該交聯劑之第一反應性基團反應以形成第一組合物之條件下接觸，其中該異雙官能交聯劑包括 （i）    能夠與該偵測試劑反應以將該交聯劑連接至該偵測試劑之第一反應性基團，及 （ii）   能夠與該核酸探針反應以將該交聯劑連接至該核酸探針，同時基本上不對該偵測試劑具有反應性之第二反應性基團； （b）使該第一組合物與該核酸探針在其中該交聯劑中之該第二反應性基團與該核酸探針反應以形成該結合物之條件下接觸， 其中該方法不包括在該交聯劑與該核酸探針反應之前純化該偵測試劑及該交聯劑之反應產物。
  78. 如請求項76或77之方法，其進一步包括使用尺寸分離裝置將該結合物與未結合之核酸探針分離。
  79. 如請求項76之方法，其進一步包括 （a）   使用尺寸分離裝置將該結合物與未反應之核酸探針分離以產生純化結合物； （b）   形成包括該純化結合物及核酸結合螢光團之測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當該螢光團與核酸結合時增加的螢光強度進行選擇；及 （c）   量測該測試組合物之螢光以確定該純化結合物中核酸探針之量。
  80. 如請求項77之方法，其進一步包括 （a）   使用尺寸分離裝置將該結合物與未反應之核酸探針分離以產生純化結合物； （b）   形成包括該純化結合物及核酸結合螢光團之測試組合物，該核酸結合螢光團針對具有當該螢光團與核酸結合時增加的螢光強度進行選擇；及 （c）   量測該測試組合物之螢光以確定該純化結合物中核酸探針之量。
  81. 如請求項79或80之方法，其中該螢光團為QUANT-IT OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。
  82. 如請求項81之方法，其中該螢光團為SYBR GREEN I染料。
  83. 如請求項73至82中任一項之方法，其進一步包括形成至少一種包括已知量之校準寡核苷酸及螢光團的校準組合物及量測螢光。
  84. 如請求項83之方法，其中確定該純化結合物中核酸探針之量包括將自該測試組合物量測之螢光與用該一或多種校準組合物量測之螢光進行比較。
  85. 如請求項80之方法，其進一步包括分析該純化結合物之樣品中偵測試劑之濃度。
  86. 如請求項81之方法，其中該分析為BCA蛋白質分析。
  87. 如請求項82之方法，其進一步包括計算該純化結合物中每一偵測試劑之結合核酸探針之平均數量。
  88. 如請求項76至87中任一項之方法，其中該第一反應性基團包括胺反應性部分。
  89. 如請求項88之方法，其中該第一反應性基團包括N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯。
  90. 如請求項76至87中任一項之方法，其中 （i）    該核酸探針包括硫醇部分且該第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或活化二硫化物部分； （ii）   該核酸探針包括烯烴或張力烯烴部分且該第二反應性基團包括四嗪部分； （iii）  該核酸探針包括四嗪部分且該第二反應性基團包括乙烯基或張力烯烴部分； （iv）  該核酸探針包括炔烴或張力炔烴部分且該第二反應性基團包括疊氮化物部分； （v）   該核酸探針包括疊氮化物部分且該第二反應性基團包括炔烴或張力炔烴部分； （vi）  該核酸探針包括4-甲醯基苯甲醯胺部分且該第二反應性基團包括肼基菸鹼醯胺部分；或 （vii） 該核酸探針包括肼基菸鹼醯胺部分且該第二反應性基團包括4-甲醯基苯甲醯胺部分。
  91. 如請求項76至87中任一項之方法，其中該核酸探針包括硫醇且該第二反應性基團為硫醇反應性基團。
  92. 如請求項91之方法，其中該第二反應性基團包括順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺部分。
  93. 如請求項76至87中任一項之方法，其中該核酸探針包括硫醇，該第一反應性基團為胺反應性基團，該第二反應性基團為硫醇反應性基團且該異雙官能交聯劑為式V化合物
    Figure 03_image172
    ， 式V 其中r為0與24之間的整數。
  94. 如請求項93之方法，其中r為4。
  95. 如請求項76至90中任一項之方法，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  96. 如請求項91至94中任一項之方法，其中該核酸探針在5'末端處經該硫醇部分修飾。
  97. 如請求項96之方法，其中該核酸探針為式IIIA化合物：
    Figure 03_image174
    式IIIA。
  98. 如請求項96至97中任一項之方法，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  99. 如請求項76至98中任一項之方法，其中該尺寸分離裝置為透析裝置、超濾裝置或尺寸排阻管柱，且該分離裝置具有適合於將分子量為約5,000道爾頓或更小之寡核苷酸自分子量大於50,000道爾頓之結合物分離的分子量截斷。
  100. 如請求項99之方法，其中該分離裝置為包括尺寸排阻層析基質之管柱。
  101. 如請求項100之方法，其中該尺寸排阻層析基質包括SEPHADEX G100珠粒。
  102. 如請求項76至101中任一項之方法，其中該偵測試劑為抗原結合物質。
  103. 如請求項76至102中任一項之方法，其中該交聯劑相對於偵測試劑之量呈莫耳過量，且核酸探針之量相對於交聯劑之量呈莫耳過量。
  104. 如請求項103之方法，其中交聯劑之量相對於偵測試劑之量呈至少四倍莫耳過量。
  105. 如請求項104之方法，其中核酸探針之莫耳量為交聯劑之莫耳量的至少1.1倍。
  106. 如請求項76至105中任一項之方法，其中該方法使得至少95%之該偵測試劑結合至核酸探針。
  107. 如請求項76至105中任一項之方法，其中與該結合物中之各偵測試劑偶聯之核酸探針之平均數量為約2或更大。
  108. 一種用於進行分析之套組，其包括： （a）   包括錨定寡核苷酸之錨定試劑； （b）   如請求項1至7中任一項之經標記探針； （c）   連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中該等5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交；能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部核苷酸序列；及能夠與該經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部核苷酸序列； （d）   核酸連接酶；及 （e）   核酸聚合酶。
  109. 一種用於進行分析之套組，其包括： （a）   包括錨定寡核苷酸之錨定試劑； （b）   經標記探針； （c）   連接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中該等5'及3'末端核苷酸序列能夠與核酸探針雜交；能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部核苷酸序列；及能夠與該經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部核苷酸序列； （d）   核酸連接酶；及 （e）   核酸聚合酶； 其中 （i）    該等5'及3'末端核苷酸序列不與該等第一及第二內部序列重疊， （ii）   該等5'及3'末端序列之長度總和為14至24個核苷酸的長度，且 （iii）該連接寡核苷酸之長度為53至76個核苷酸。
  110. 如請求項109之套組，其中該經標記探針為如請求項1至7中任一項之經標記探針。
  111. 如請求項108至110中任一項之套組，其中該經標記探針包括與以下序列之14或15個連續核苷酸具有至少90%序列一致性之序列： 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。
  112. 如請求項108至110中任一項之套組，其中該經標記探針包括 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）。
  113. 如請求項108至110中任一項之套組，其中該經標記探針包括以下序列： 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'（SEQ ID NO:32）。
  114. 如請求項108至113中任一項之套組，其中該錨定寡核苷酸之長度為10-30個核酸。
  115. 如請求項104至110中任一項之套組，其中該錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  116. 如請求項111之套組，其中該錨定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'（SEQ ID NO:37）組成。
  117. 如請求項108至113中任一項之套組，其中該錨定寡核苷酸之長度為17或25個寡核苷酸。
  118. 如請求項117之套組，其中該錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  119. 如請求項108至118中任一項之套組，其中該連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。
  120. 如請求項108至119中任一項之套組，其中該連接寡核苷酸之長度為53-61個核苷酸。
  121. 如請求項108至120中任一項之套組，其中該等3'及5'末端序列之長度總和為14至19個核苷酸的長度。
  122. 如請求項121之套組，其中該等3'及5'末端序列之長度總和為14或15個核苷酸的長度。
  123. 如請求項108至122中任一項之套組，其中該5'末端序列為GTTCTGTC且該3'末端序列為GTGTCTA。
  124. 如請求項123之套組，其中該連接寡核苷酸序列由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。
  125. 如請求項108至124中任一項之套組，其中該套組進一步包括核酸探針，該核酸探針包括與該連接寡核苷酸之該5'末端序列互補之第一序列，及與該連接寡核苷酸之該3'末端序列互補之相鄰第二序列。
  126. 如請求項125之套組，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO: 33）之14或15個連續核苷酸。
  127. 如請求項125或126之套組，其中該核酸探針進一步包括呈遞反應性官能基之非天然修飾。
  128. 如請求項127之套組，其中該核酸探針為式IIIA化合物：
    Figure 03_image176
    式IIIA。
  129. 如請求項125或126之套組，其中該核酸探針結合至偵測試劑。
  130. 如請求項129之套組，其中該偵測試劑為蛋白質且該結合物為式VI化合物：
    Figure 03_image178
    式VI 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自該蛋白質之胺基的結合形式。
  131. 如請求項130之套組，其中r為4。
  132. 如請求項108至124中任一項之套組，其中該套組進一步包括 用於分析物之捕捉試劑；及 用於該分析物之偵測試劑， 其中該等捕捉試劑及偵測試劑能夠結合至該分析物以形成複合物，且該偵測試劑連接至核酸探針，該核酸探針包括與該連接寡核苷酸之該5'末端序列互補之第一序列及與該連接寡核苷酸之該3'末端序列互補的相鄰第二序列。
  133. 如請求項132之套組，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  134. 如請求項132或133之套組，其中該偵測試劑為蛋白質且該結合物為式VI化合物：
    Figure 03_image180
    式VI 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自該蛋白質之胺基的結合形式。
  135. 如請求項134之套組，其中r為4。
  136. 如請求項132至135中任一項之套組，其中該捕捉試劑及該偵測試劑為蛋白質。
  137. 如請求項136之套組，其中該捕捉試劑及該偵測試劑為抗原結合物質。
  138. 如請求項108至124中任一項之套組，其中該套組進一步包括 （a）   用於複數種分析物之複數種捕捉試劑；及 （b）   用於該複數種分析物之一或多種偵測試劑， 其中對於各分析物，該套組包括能夠與該分析物結合以形成複合物之捕捉試劑及偵測試劑，且該一或多種偵測試劑各自連接至核酸探針，該核酸探針包括與該連接寡核苷酸之該5'末端序列互補的第一序列及與該連接寡核苷酸之該3'末端序列互補的相鄰第二序列。
  139. 如請求項138之套組，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  140. 如請求項138或139之套組，其中各偵測試劑為蛋白質且連接至核酸探針以形成式VI之結合物：
    Figure 03_image182
    式VI 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自該蛋白質之胺基的結合形式。
  141. 如請求項140之套組，其中r為4。
  142. 如請求項138至141中任一項之套組，其中該等捕捉及偵測試劑為蛋白質。
  143. 如請求項141之套組，其中該等捕捉及偵測試劑為抗原結合物質。
  144. 如請求項108至143中任一項之套組，其中該錨定試劑進一步包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑。
  145. 如請求項132至137中任一項之套組，其中該錨定試劑及捕捉試劑各自包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑。
  146. 如請求項138至143中任一項之套組，其中該等錨定試劑及捕捉試劑各自包括能夠結合至靶向試劑補體之靶向試劑。
  147. 如請求項144至146中任一項之套組，其中該套組進一步包括在其上固定有該靶向試劑補體之固相支撐物。
  148. 如請求項147之套組，其中該固相支撐物為電極。
  149. 如請求項148之套組，其中該電極為碳基電極。
  150. 如請求項149之套組，其中該套組包括多孔盤分析消耗品，且該盤之各孔包括碳墨電極。
  151. 如請求項147之套組，其中該固相支撐物為珠粒。
  152. 如請求項144至151中任一項之套組，其中該等靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。
  153. 如請求項152之套組，其中該靶向試劑為生物素且該靶向試劑補體為抗生蛋白鏈菌素。
  154. 如請求項153之套組，其中該錨定試劑為
    Figure 03_image184
    。
  155. 如請求項108至143中任一項之套組，其中該套組進一步包括固相支撐物且該錨定試劑固定於該固相支撐物上。
  156. 如請求項133至138中任一項之套組，其中該套組進一步包括固相支撐物且該等錨定試劑及捕捉試劑固定於該固相支撐物上。
  157. 如請求項155至156中任一項之套組，其中該固相支撐物為電極。
  158. 如請求項157之套組，其中該電極為碳基電極。
  159. 如請求項158之套組，其中該套組包括多孔盤分析消耗品，且該盤之各孔包括碳墨電極。
  160. 如請求項155至156中任一項之套組，其中該固相支撐物為珠粒。
  161. 如請求項139至144中任一項之套組，其中該套組進一步包括固相支撐物且該等錨定試劑及捕捉試劑固定於該固相支撐物上以形成陣列，其中各陣列元件包括複數種捕捉試劑中之一者及該等錨定試劑中之至少一者。
  162. 如請求項155至156中任一項之套組，其中該固相支撐物為電極。
  163. 如請求項157之套組，其中該電極為碳基電極。
  164. 如請求項158之套組，其中該套組包括多孔盤分析消耗品，該盤之各孔包括碳墨電極，且該電極為此等碳墨電極中之一者。
  165. 如請求項139至144中任一項之套組，其中該套組進一步包括一或多個固相支撐物且該等錨定試劑及捕捉試劑固定於該一或多個固相支撐物上以形成陣列，其中各陣列元件包括複數種捕捉試劑中之一者及該等錨定試劑中之至少一者。
  166. 如請求項165之套組，其中該套組包括複數個固相支撐物，各固相支撐物具有至少一個陣列元件。
  167. 如請求項166之套組，其中各固相支撐物僅具有一個陣列元件。
  168. 如請求項165至167中任一項之套組，其中該固相支撐物為電極。
  169. 如請求項168之套組，其中該等電極為碳基電極。
  170. 如請求項169之套組，其中該套組包括多孔盤分析消耗品，且該盤之各孔包括該等電極中之一者。
  171. 如請求項167之套組，其中該等固相支撐物為珠粒陣列中之珠粒。
  172. 如請求項134至139中任一項之套組，其進一步包括 （i）    具有固定於一或多個固相支撐物上之複數種不同靶向試劑補體之陣列，各陣列元件包括不同靶向試劑補體；及 （ii）   針對該等不同靶向試劑補體中之每一者之不同靶向試劑，各靶向試劑為其對應靶向試劑補體之結合搭配物。
  173. 如請求項172中任一項之套組，其中 （i）    該等捕捉試劑連接至該等靶向試劑，且該等捕捉試劑中之每一者連接至不同靶向試劑；且 （ii）   該錨定試劑係分為各含有該等錨定試劑中之至少一者之複數個部分，且各部分中之該等錨定試劑中之至少一者連接至不同靶向試劑。
  174. 如請求項172中任一項之套組，其中 （i）    該等捕捉試劑包括補充連接試劑； （ii）   該錨定試劑包括該補充連接試劑； （iii）  該等靶向試劑連接至連接試劑；且 （iv）  該連接試劑為該補充連接試劑之結合搭配物。
  175. 如請求項172至174中任一項之套組，其中各靶向試劑及其對應靶向試劑補體為互補寡核苷酸。
  176. 如請求項172至175中任一項之套組，其中該陣列在一個固相支撐物上且該固相支撐物為電極。
  177. 如請求項176之套組，其中該電極為碳基電極。
  178. 如請求項177之套組，其中該套組包括多孔盤分析消耗品，且該盤之各孔包括碳墨電極。
  179. 如請求項178之套組，其中該陣列之各元件在不同固相支撐物上且該等固相支撐物為珠粒。
  180. 如請求項172至179中任一項之套組，其中該等連接試劑及補充連接試劑為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。
  181. 如請求項179之套組，其中該連接試劑為生物素且該補充連接試劑為抗生蛋白鏈菌素。
  182. 如請求項109至181中任一項之套組，其進一步包括以下中之一或多者：阻斷試劑、結合分析反應緩衝液、連接酶反應緩衝液、聚合酶反應緩衝液、ECL讀取緩衝液；及/或獨特產品標識符。
  183. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物；由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   延伸該結合物之該核酸探針以形成延伸序列，其包括與該錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之偵測寡核苷酸互補之偵測序列補體； （c）   將包括該偵測寡核苷酸之該經標記探針結合至該延伸序列；及 （d）   量測與該結合域結合之經標記探針的量； 其中該經標記探針為如請求項1至10中任一項之經標記探針。
  184. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   將該複合物中之該核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中該連接寡核苷酸包括與該第一探針序列互補之5'末端序列、與該第二探針序列互補之3'末端序列、能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列； （c）   將該連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸； （d）   藉由滾環擴增延伸該核酸探針以形成延伸序列； （e）   將包括該偵測寡核苷酸之經標記探針結合至該延伸序列；及 （f）量測與該結合域結合之經標記探針的量； 其中該經標記探針為如請求項1至10中任一項之經標記探針。
  185. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括錨定寡核苷酸，及（ii）式VI之結合物：
    Figure 03_image186
    式VI 其中r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自該蛋白質之胺基的結合形式； 由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   延伸該結合物之該核酸探針以形成包括與該錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體的延伸序列；及 （c）   量測與該結合域結合之延伸序列的量。
  186. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）式VI之結合物：
    Figure 03_image188
    式VI 其中該蛋白質為偵測試劑，r為0與24之間的整數，x為1與20之間的整數，且蛋白質-NH-為源自該蛋白質之胺基的結合形式； 其中該結合物包括偵測試劑及核酸探針，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸； 由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   將該複合物中之該核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中該連接寡核苷酸包括與該第一探針序列互補之5'末端序列、與該第二探針序列互補之3'末端序列、能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列； （c）   將該連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸； （d）   藉由滾環擴增延伸該核酸探針以形成延伸序列； （e）   將包括該偵測寡核苷酸之該經標記探針結合至該延伸序列；及 （f）   量測與該結合域結合之經標記探針的量。
  187. 如請求項185或186之方法，其中r為4。
  188. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括具有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   將該複合物中之該核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中該連接寡核苷酸包括與該第一探針序列互補之5'末端序列、與該第二探針序列互補之3'末端序列及能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的內部序列； （c）   將該連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸； （d）   藉由滾環擴增延伸該核酸探針以形成延伸序列； （e）   量測與該結合域結合之延伸序列的量； 其中核苷酸探針之長度為14-24個核苷酸。
  189. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至（i）表面上之結合域中之捕捉試劑，其中該結合域進一步包括具有錨定寡核苷酸之錨定試劑，及（ii）包括偵測試劑及核酸探針之結合物，該核酸探針包括具有第一探針序列及相鄰第二探針序列之寡核苷酸；由此在該結合域中形成包括該捕捉試劑、該分析物及該結合物之複合物； （b）   將該複合物中之該第一及第二核酸探針結合至連接寡核苷酸，其中該連接寡核苷酸包括與該第一核酸探針互補之5'末端序列、與該第二核酸探針互補之3'末端序列、能夠與該錨定寡核苷酸之補體雜交的第一內部序列及能夠與經標記探針之偵測寡核苷酸之補體雜交的第二內部序列； （c）   將該連接寡核苷酸連接以形成環狀模板寡核苷酸； （d）藉由滾環擴增延伸該核酸探針以形成延伸序列； （e）   將包括該偵測寡核苷酸之該經標記探針結合至該延伸序列；及 （f）量測與該結合域結合之經標記探針的量； 其中該核酸探針之長度為14-24個核苷酸。
  190. 如請求項186、187或189之方法，其中該經標記探針為式I化合物
    Figure 03_image190
    式I 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數且n為0與5之間的整數。
  191. 如請求項186、187、189或190之方法，其中該經標記探針包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）之14或15個連續寡核苷酸。
  192. 如請求項184或186至191中任一項之方法，其中該連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。
  193. 如請求項184或186至192中任一項之方法，其中該連接寡核苷酸之長度為53-76個核苷酸。
  194. 如請求項184或188至192中任一項之方法，其中該連接寡核苷酸之長度為61個核苷酸。
  195. 如請求項184或186至193中任一項之方法，其中該5'末端序列為GTTCTGTC且該3'末端序列為GTGTCTA。
  196. 如請求項184或186至194中任一項之方法，其中該連接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）組成。
  197. 如請求項183至196中任一項之方法，其中該核酸探針之長度為14至24個核苷酸。
  198. 如請求項196之方法，其中該核酸探針之長度為14或15個核苷酸。
  199. 如請求項184至197中任一項之方法，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  200. 如請求項183至198中任一項之方法，其中該錨定寡核苷酸之長度為17-25個核苷酸。
  201. 如請求項183至200中任一項之方法，其中該錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  202. 如請求項183至201中任一項之方法，其中該捕捉試劑及/或該偵測試劑為蛋白質。
  203. 如請求項183至202中任一項之方法，其中該捕捉試劑及/或該偵測試劑為抗原結合物質。
  204. 如請求項183至202中任一項之方法，其中該等捕捉試劑及偵測試劑為抗原結合物質。
  205. 如請求項183至201中任一項之方法，其中該等錨定試劑及捕捉試劑各包括能夠與靶向試劑補體結合之靶向試劑，該結合域包括固定於其上之該靶向試劑補體，且該方法進一步包括將該等錨定試劑及捕捉試劑結合至該結合域。
  206. 如請求項205之方法，其中該等靶向試劑及靶向試劑補體為選自以下之結合搭配物對之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。
  207. 如請求項206之方法，其中該靶向試劑為生物素且該靶向試劑補體為抗生蛋白鏈菌素。
  208. 如請求項183至207中任一項之方法，其中該表面為珠粒。
  209. 如請求項183至208中任一項之方法，其中該表面包括電極且該偵測步驟包括向該電極施加電位及量測電化學發光。
  210. 如請求項183之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（d），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  211. 如請求項184之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（f），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  212. 如請求項185之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（c），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  213. 如請求項186或187之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（f），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  214. 如請求項188之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（e），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  215. 如請求項189之方法，其進一步包括對於一或多種額外分析物重複步驟（a）至（f），其中各分析物結合至相同表面上或不同表面上之不同結合域中之不同捕捉試劑。
  216. 如請求項213或215之方法，其中用於各分析物之該經標記探針為式I化合物
    Figure 03_image192
    式I 其中B為核苷酸鹼基，R為電化學發光標記，L1 為鍵聯基團，L2 為鍵聯基團，j為0與11之間的整數，k為0與1之間的整數，m為0與11之間的整數且n為0與5之間的整數。
  217. 如請求項213、215或216之方法，其中用於各分析物之該經標記探針包括相同寡核苷酸。
  218. 如請求項217之方法，其中該寡核苷酸由5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'（SEQ ID NO:31）組成。
  219. 如請求項211及213至218中任一項之方法，其中用於各分析物之該連接寡核苷酸進一步包括5'末端磷酸基團。
  220. 如請求項211及213至219中任一項之方法，其中用於各分析物之該連接寡核苷酸之長度為53-76個核苷酸。
  221. 如請求項211及213至219中任一項之方法，其中用於各分析物之該連接寡核苷酸之長度為61個核苷酸。
  222. 如請求項211及213至220中任一項之方法，其中用於各分析物之該連接寡核苷酸具有相同序列。
  223. 如請求項222之方法，其中該5'末端序列為GTTCTGTC且該3'末端序列為GTGTCTA。
  224. 如請求項223中任一項之方法，其中該連接寡核苷酸序列為5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'（SEQ ID NO:36）。
  225. 如請求項210至224中任一項之方法，其中用於各分析物之該核酸探針之長度為14至24個核苷酸。
  226. 如請求項225之方法，其中用於各分析物之該核酸探針之長度為14或15個核苷酸。
  227. 如請求項210至227中任一項之方法，其中用於各分析物之該結合物具有相同核酸探針序列。
  228. 如請求項227之方法，其中該核酸探針包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）之14或15個連續核苷酸。
  229. 如請求項210至228中任一項之方法，其中用於各分析物之該錨定寡核苷酸之長度為17-25個寡核苷酸。
  230. 如請求項210至229中任一項之方法，其中相同錨定寡核苷酸用於各分析物。
  231. 如請求項230之方法，其中該錨定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  232. 如請求項210至231中任一項之方法，其中不同偵測試劑用於各分析物。
  233. 如請求項210至231中任一項之方法，其中相同偵測試劑用於各分析物。
  234. 如請求項210至233中任一項之方法，其中該捕捉試劑及/或該等偵測試劑包括蛋白質。
  235. 如請求項210至234中任一項之方法，其中該等捕捉試劑及/或該等偵測試劑包括抗原結合物質。
  236. 如請求項235之方法，其中該等捕捉試劑及偵測試劑為抗原結合物質。
  237. 如請求項210至23中任一項之方法，其中各結合域係在獨立表面上，且該表面為珠粒陣列中之珠粒。
  238. 如請求項210至236中任一項之方法，其中各結合域係在單一表面上且該等結合域在該表面上形成捕捉試劑陣列之元件。
  239. 如請求項238之方法，其中該表面包括電極且該偵測步驟包括向該電極施加電位及量測電化學發光。
  240. 如請求項210至239中任一項之方法，其中將各分析物結合至其對應捕捉試劑係藉由使該一或多個表面與包括複數種分析物之單一液體體積接觸而並行地進行。
  241. 如請求項240之方法，其中各方法步驟係對於各分析物並行地進行。
  242. 如請求項210至241中任一項之方法，其中各結合域包括能夠結合至靶向試劑之靶向試劑補體，且各錨定試劑及捕捉試劑包括能夠結合至連接試劑之補充連接試劑，且該方法進一步包括如下地將捕捉試劑及錨定試劑固定於各結合域中： （1）   經由該補充連接試劑將該捕捉及錨定試劑結合至與該連接試劑連接之靶向試劑；及 （2）   將（1）之產物結合至包括該靶向試劑補體之該結合域， 其中， （i）    各結合域包括不同靶向試劑補體，及 （ii）   各靶向試劑補體選擇性地結合至該等靶向試劑中之一者。
  243. 如請求項240之方法，其中該連接試劑具有多於一個用於補充連接試劑之結合位點且該捕捉試劑及錨定試劑之固定進一步包括： 如下地形成連接至該連接試劑之該靶向試劑：在使得該連接試劑之至少一個其他結合位點保持未結合之條件下將連接至補充連接試劑之靶向試劑補體結合至該連接試劑之結合位點。
  244. 如請求項240或241之方法，其中該連接試劑為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素且該補充連接試劑為生物素。
  245. 如請求項240、241或242之方法，其中該靶向試劑及對應靶向試劑補體為互補寡核苷酸。
  246. 如請求項23至34中任一項之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸之長度為14或15個核苷酸。
  247. 如請求項23至34中任一項之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。
  248. 如請求項23至34中任一項之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。
  249. 如請求項23至34中任一項之非天然存在之核酸探針，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。
  250. 如請求項40至63中任一項之套組，其中該螢光團之螢光強度在該螢光團結合至單股核酸時增加。
  251. 如請求項95至98中任一項之方法，其中該寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。
  252. 如請求項95至98中任一項之方法，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。
  253. 如請求項95至98中任一項之方法，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。
  254. 如請求項125至182中任一項之套組，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。
  255. 如請求項125至182中任一項之套組，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。
  256. 如請求項125至182中任一項之套組，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。
  257. 如請求項183至245中任一項之方法，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:40）。
  258. 如請求項183至245中任一項之套組，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'（SEQ ID NO:41）。
  259. 如請求項183至245中任一項之套組，其中該核酸探針包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'（SEQ ID NO:33）。
  260. 如請求項64至75、79或80中任一項之方法，其中該螢光團之螢光強度在該螢光團結合至單股核酸時增加。
  261. 一種式X之錨定試劑，
    Figure 03_image194
    式X， 其中該寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'（SEQ ID NO:35）。
  262. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至表面上之結合域中之第一捕捉試劑，其中該結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑； （b）   將包括偵測試劑及核酸探針之結合物結合至該結合域中之第二捕捉試劑，以形成包括該第二捕捉試劑及該結合物之複合物，其中該偵測試劑為與該分析物競爭結合至該等第一及第二捕捉試劑之競爭物； （c）   延伸該複合物中之該結合物之該核酸探針以形成延伸序列，其包括與該錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之偵測寡核苷酸互補之偵測序列補體； （d）   將包括該偵測寡核苷酸之該經標記探針結合至該延伸序列；及 （e）   量測與該結合域結合之經標記探針的量； 其中該經標記探針為如請求項1至10中任一項之經標記探針。
  263. 一種量測分析物之方法，其包括： （a）   將該分析物結合至包括第一偵測試劑及核酸探針之第一結合物； （b）   將表面上之結合域中之捕捉試劑結合至包括第二偵測試劑及核酸探針之第二結合物，以形成包括該捕捉試劑及該第二結合物之複合物，其中（i）該結合域進一步包括含有錨定寡核苷酸之錨定試劑，且（ii）該捕捉試劑為與該分析物競爭結合至該等第一及第二偵測試劑之競爭物； （c）   延伸該複合物中之該第二結合物之該核酸探針以形成延伸序列，該延伸序列包括與該錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體及與經標記探針之偵測寡核苷酸互補之偵測序列補體； （d）   將包括該偵測寡核苷酸之該經標記探針結合至該延伸序列；及 （e）   量測與該結合域結合之經標記探針的量； 其中該經標記探針為如請求項1至10中任一項之經標記探針。
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