TW202041538A - 用於生產抗ｔｎｆ抗體組成物之製造方法 - Google Patents

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蘇比尼 甘古利
馬爾滕 格羅內維爾德
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麥可 內德維德
凱文 史密斯
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Abstract

本發明係關於用於生產抗TNF抗體(例如，抗TNF抗體、重組抗TNF抗體)之製造方法及包含該重組抗TNF抗體之組成物，該重組抗TNF抗體具有包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之重鏈(HC)及包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之輕鏈(LC)。

Description

用於生產抗TNF抗體組成物之製造方法
電子提交序列表之參照
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式序列表經由EFS-Web電子提交，檔案名稱為「JBI6055USPSP1SEQLIST.TXT」，創建日期2019年2月5日，且檔案大小為21,508位元組。經EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。
本發明係關於用於生產抗TNF抗體(例如，抗TNF抗體、重組抗TNF抗體)之製造方法及包含該重組抗TNF抗體之組成物，該重組抗TNF抗體具有包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之重鏈(HC)及包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之輕鏈(LC)。
TNFα係17kD蛋白質次單元之可溶性同三聚體(homotrimer)。亦存在一種TNF的膜結合26kD前驅物形式。
除了單核球或巨噬細胞以外的細胞亦產生TNFα。舉例而言，人類非單核腫瘤細胞系產生TNFα及CD4+及CD8+周邊血液T淋巴球，且一些培養的T及B細胞系亦產生TNFα。
TNFα引起促發炎作用(pro-inflammatory action)，其導致組織損傷，諸如軟骨及骨的退化、誘導黏附分子、誘導血管內皮細胞上的促凝(procoagulant)活性、增加嗜中性球及淋巴球的黏附性、及刺激血小板活化因子從巨噬細胞、嗜中性球、及血管內皮細胞中釋放。
TNFα已與感染、免疫病症、腫瘤病理、自體免疫病理、及移植物抗宿主病理相關聯。TNFα與癌症及感染病理的關聯常與宿主的異 化狀態(catabolic state)有關。癌症患者受體重減輕之苦，通常與厭食相關聯。
與癌症及其他疾病相關聯之廣泛性消耗(extensive wasting)係稱為「惡病質(cachexia)」。惡病質包括回應於惡性生長之進行性體重減輕、厭食、及瘦體質量的持續侵蝕。惡病質狀態造成更高癌症發病率及死亡率。有證據顯示TNFα涉及癌症、感染病理、及其他異化狀態之惡病質。
咸信TNFα在革蘭氏陰性敗血症及內毒素性休克中扮演核心角色，其包括發燒、不適、厭食、及惡病質。內毒素強烈地活化單核球/巨噬細胞生產及TNFα及其他細胞介素的分泌。TNFα及其他單核球衍生之細胞介素介導對內毒素的代謝及神經激素反應。向人類志願者投予內毒素會導致急性疾病，伴有類流感症狀，其包括發燒、心搏過速、代謝率增加、及壓力荷爾蒙釋放。循環TNFα在患有革蘭氏陰性敗血症的患者中增加。
因此，TNFα已與發炎性疾病、自體免疫疾病、病毒、細菌、及寄生蟲感染、惡性疾病、及/或神經退化性疾病有關，且係疾病(諸如類風濕性關節炎及克隆氏症(Crohn's disease))中特定生物療法的有用靶標。據報導，在開放標籤試驗中，TNFα單株抗體的有益效果係抑制炎症、及在類風濕性關節炎及克隆氏症復發後成功再治療。亦已報導在類風濕性關節炎中抑制炎症之隨機雙盲安慰劑對照試驗中有有益結果。
在人以外的哺乳動物中，已顯示出對TNF的中和抗血清或mAb可消除不良的生理變化，並預防在實驗性內毒血症(endotoxemia)及菌血症致死性攻擊後死亡。此效果已在例如在囓齒動物致死性檢定及靈長類病理模型系統中得到證實。
已揭示hTNF之推定受體結合基因座，並已揭示由TNF之胺基酸11至13、37至42、49至57、及155至157所組成的TNFα之受體結合基因座。
非人類哺乳動物、嵌合、多株(例如，抗血清)、及/或單株抗體(Mab)及片段(例如，蛋白水解消化或其融合蛋白產物)係潛在的治療劑，在一些情況下對其進行研究以嘗試治療某些疾病。然而，此類抗 體或片段在投予至人類時可誘發免疫反應。此免疫反應可導致免疫複合物介導之抗體或片段從循環中清除，並使重複投予不適用於療法，從而降低對患者之治療效益並限制抗體或片段之再投予。舉例而言，重複投予包含非人類部分之抗體或片段可導致血清病(serum sickness)及/或重度過敏(anaphylaxis)。為了避免這些及其他問題，已採取許多方法來降低此類抗體及其部分的免疫原性，其包括嵌合化(chimerization)及人源化，如所屬技術領域中所熟知。然而，這些及其他方法仍可能導致抗體或片段具有一些免疫原性、低親和力、低親留力(avidity)，或在細胞培養、擴展(scale up)、生產、及/或低產率中存在問題。因此，此類抗體或片段可能較不適合用於製造或用作治療性蛋白質。
因此，需要提供抗TNF抗體或其片段以用作治療由TNFα介導之疾病的治療劑。
本發明之實施例分別由隨附於本文之獨立請求項及附屬請求項界定，為了簡潔起見，其以引用方式併入本文中。本發明之各種態樣的其他實施例、特徵、及優點由以下實施方式結合隨附圖式而為顯而易見的。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸 序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(Reduced Mass Analysis,RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化(disialylated)的聚醣物種。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑(follow-on biologic)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗 TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸 序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID No：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有 較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中如藉由高效液相層析法 (HPLC)或減少質量分析(RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係 藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；b.使該等抗TNF抗體在該等 CHO細胞中表現；及c.純化該等抗TNF抗體，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑(follow-on biologic)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞 (CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID No：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現，且其中如藉由高效液相層析法(HPLC)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種，且其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，且該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
〔圖1〕顯示圖形表示，其顯示在融合瘤細胞上清液中TNV mAb抑制TNFα與重組TNF受體結合的能力之檢定。將不同量之含有已知量TNV mAb的融合瘤細胞上清液與固定濃度(5ng/ml)的125I-標示之TNFα預培養。將混合物轉移至已預先塗佈有p55-sf2(一種重組TNF受體/IgG融合蛋白)之96孔Optiplate。在洗去未結合材料後，測定在mAb存在下結合至p55受體之TNFα的量，並使用γ計數器計數。雖然在這些實驗中測試八個TNV mAb樣本，但為簡單起見，在此並未顯示藉由DNA序列分析顯示與其他TNV mAb之一者同一的三個mAb。將各樣本重複測試。所示結果代表兩個獨立的實驗。
〔圖2A〕至〔圖2B〕顯示TNV mAb重鏈可變區之DNA序列。所示之生殖系基因係DP-46基因。「TNV」指示所示之序列係TNV14、TNV15、TNV148、及TNV196之序列。在TNV序列中前三個核苷酸定義轉譯起始Met密碼子。在TNV mAb基因序列中的點指示核苷酸與生殖系序列中的相同。TNV序列之前19個核苷酸(加底線)對應於用來PCR擴增可變區之寡核苷酸。僅針對生殖系基因顯示以成熟mAb開始之胺基酸轉譯(單字母縮寫)。生殖系胺基酸轉譯中的三個CDR域係以粗體標記並加底線。標示TNV148(B)的行指示所示之序列係關於TNV148及TNV148B兩者。生殖系DNA序列(CDR3)中的間隙係由於該序列當時在生殖系基因中係未知的或不存在。TNV mAb重鏈使用J6連接區(joining region)。
〔圖3〕顯示TNV mAb輕鏈可變區之DNA序列。所示之生殖系基因係人類κ生殖系可變區基因之Vg/38K家族的代表性成員。在TNV mAb基因序列中的點指示核苷酸與生殖系序列中的相同。TNV序列之前16個核苷酸(加底線)對應於用來PCR擴增可變區之寡核苷酸。僅針對生殖系基因顯示成熟mAb之胺基酸轉譯(單字母縮寫)。生殖系胺基酸轉譯中的三個CDR域係以粗體標記並加底線。標示TNV148(B)的行指示所示之序列係關於TNV148及TNV148B兩者。生殖系DNA序列(CDR3)中的間隙係由於該序列在生殖系基因中係未知的或不存在。TNV mAb輕鏈使用J3連接序列(joining sequence)。
〔圖4〕顯示TNV mAb重鏈可變區之推導的(deduced)胺基酸序列。所示之胺基酸序列(單字母縮寫)係推導自由未經選殖之PCR產物及經選殖之PCR產物兩者所測定之DNA序列。將所示胺基酸序列分為分泌信號序列(信號)、架構(FW)、及互補決定區(CDR)域。DP-46生殖系基因之胺基酸序列係顯示在各域之頂行。點指示TNV mAb中之胺基酸係與生殖系基因同一。TNV148(B)指示所示之序列係關於TNV148及TNV148B兩者。「TNV」指示所示之序列係關於所有TNV mAb，除非顯示不同序列。生殖系序列(CDR3)中的破折號指示該等序列在生殖系基因中係未知的或不存在。
〔圖5〕顯示TNV mAb輕鏈可變區之推導的胺基酸序列。所示之胺基酸序列(單字母縮寫)係推導自由未經選殖之PCR產物及經選殖之PCR產物兩者所測定之DNA序列。將所示胺基酸序列分為分泌信號序列(信號)、架構(FW)、及互補決定區(CDR)域。Vg/38K型輕鏈生殖系基因之胺基酸序列係顯示在各域之頂行。點指示TNV mAb中之胺基酸係與生殖系基因同一。TNV148(B)指示所示之序列係關於TNV148及TNV148B兩者。「全部」指示所示之序列係關於TNV14、TNV15、TNV148、TNV148B、及TNV186。
〔圖6〕顯示用來製造表現rTNV148B之C466細胞的重鏈及輕鏈表現質體的示意圖。p1783係重鏈質體且p1776係輕鏈質體。rTNV148B可變及恆定區編碼域係顯示為黑色方框。J-C內含子中的免疫球蛋白增強子係顯示為灰色框。顯示相關限制位點。該等質體顯示為定向的，使得Ab基因之轉錄以順時針方向進行。質體p1783的長度係19.53kb且質體p1776的長度係15.06kb。兩個質體的完整核苷酸序列係已知的。藉由置換BsiWI/BstBI限制片段，可輕易地用另一重鏈可變區序列置換在p1783中的可變區編碼序列。藉由置換SalI/AflII限制片段，可用另一可變區序列置換在p1776中的可變區編碼序列。
〔圖7〕顯示五個生產rTNV148B細胞系之生長曲線分析的圖形表示。藉由將細胞接種至T75燒瓶於I5Q+MHX培養基中以在30ml體積中具有1.0×105個細胞/ml之活細胞密度，在第0天開始培養。由於執行了轉染及次選殖 (subcloning)，用於這些研究的細胞培養物一直處於連續培養中。在隨後的數天，將T燒瓶中之細胞徹底再懸浮並移除0.3ml等分試樣之培養物。當細胞計數降至1.5×105個細胞/ml以下時，終止生長曲線研究。藉由台盼藍排斥法(trypan blue exclusion)測定在等分試樣中之活細胞數目，並儲存等分試樣的剩餘部分以用於稍後mAb濃度測定。同時對所有樣本等分試樣執行針對人類IgG之ELISA。
〔圖8〕顯示在存在不同濃度的MHX選擇之情況下，細胞生長速率之比較的圖形表示。將細胞次殖株C466A及C466B解凍至不含MHX的培養基(IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸)中並額外培養兩天。然後將兩種細胞培養物分成不含MHX、含有0.2X MHX、或含有1X MHX之三種培養物。一天後，將新鮮T75燒瓶以1×105個細胞/ml之起始密度接種培養物，並以24小時間隔計數細胞持續一週。使用SOP PD32.025中之式來計算前5天期間的倍增時間，並顯示於條上方。
〔圖9〕顯示兩個生產rTNV148B之細胞系隨時間之mAb生產穩定性的圖形表示。使用自從執行轉染及次選殖而一直處於連續培養中之細胞次殖株，以在24孔培養皿中開始長期連續培養。在有及沒有MHX選擇下於I5Q培養基中培養細胞。藉由每4至6天分離培養物一次而使細胞持續繼代，以維持新的活培養物，同時使先前的培養物失效(spent)。在培養物用過之後不久收集用過的細胞上清液之等分試樣並儲存，直至測定mAb濃度。同時對所有樣本等分試樣執行針對人類IgG之ELISA。
〔圖10〕顯示相較於實例4中的對照組，回應於本發明抗TNF抗體的關節炎小鼠模型小鼠Tg 197之重量變化。在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至9個處理組中之一者，並用1mg/kg或10mg/kg之單次腹膜內推注劑量的達爾伯克PBS(Dulbecco's PBS,D-PBS)或本發明之抗TNF抗體(TNV14、TNV148、或TNV196)處理。當分析從給藥前的重量變化時，在整個研究中，經10mg/kg cA2處理的動物之重量增加始終顯示比經D-PBS處理的動物更高。在第3至7週時，此重量增加係顯著的。經10mg/kg TNV148處理的動物在研究第7週亦達到顯著的重量增加。
〔圖11A〕至〔圖11C〕表示如實例4所呈現的基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數低於D-PBS控制組，此係從第3週開始並持續到研究的其餘部分(第7週)。相較於經D-PBS處理的組時，經1mg/kg TNV14處理的動物及經1mg/kg cA2處理的動物在第3週後均未顯示AI顯著降低。當各者相較於類似劑量的其他者(10mg/kg cA2相較於10mg/kg TNV14、148、及196)時，10mg/kg處理組之間沒有顯著差異。當比較1mg/kg處理組時，1mg/kg TNV148在第3、4、及7週時比1mg/kg cA2顯示顯著較低的AI。在第3及4週時，1mg/kg TNV148亦顯著低於經1mg/kg TNV14處理的組。雖然TNV196至多到研究的第6週顯示AI顯著降低(相較於經D-PBS處理的組時)，但TNV148係唯一在研究結束時仍維持顯著的1mg/kg處理。
〔圖12〕顯示相較於實例5中的對照組，回應於本發明抗TNF抗體的關節炎小鼠模型小鼠Tg 197之重量變化。在大約4週齡時，基於體重，將Tg197研究小鼠分配至8個處理組中之一者，並用3mg/kg之腹膜內推注劑量的對照組物品(D-PBS)或抗體(TNV14、TNV148)處理(第0週)。在第1、2、3、及4週時，在所有動物中重複注射。評估第1至6組的測試物品療效。在第2、3、及4週評估獲自第7及8組動物的血清樣本之TNV14或TNV148的誘導性免疫反應及藥物動力學清除。
〔圖13A〕至〔圖13C〕係表示基於關節炎指數的實例5中疾病嚴重度之進展的圖。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數顯著低於D-PBS控制組，此係從第2週開始並持續到研究的其餘部分(第5週)。相較於d-PBS控制組時，經1mg/kg或3mg/kg cA2處理的動物及經3mg/kg TNV14處理的動物在整個研究的任何時間均未達到任何AI顯著降低。相較於經d-PBS處理的組時，經3mg/kg TNV148處理的動物顯示顯著的降低，此係在第3週開始並持續到第5週。相較於在研究的第4及5週cA2之較低劑量(1mg/kg及3mg/kg)兩者時，經10mg/kg cA2處理的動物顯示AI顯著降低，且在第3至5週時亦顯著低於經TNV14處理的動物。雖然在任何3mg/kg處理組之間似乎沒有顯著差異，但用3mg/kg TNV14處理的動物之AI在一些時間點顯著高 於10mg/kg，而用TNV148處理的動物與用10mg/kg的cA2處理的動物並無顯著不同。
〔圖14〕顯示相較於實例6中的對照組，回應於本發明抗TNF抗體的關節炎小鼠模型小鼠Tg 197之重量變化。在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至6個處理組中之一者，並以3mg/kg或5mg/kg之單次腹膜內推注劑量的抗體(cA2、或TNV148)處理。此研究使用D-PBS及10mg/kg cA2控制組。
〔圖15〕表示如實例6所呈現的基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。所有處理組在較早的時間點均顯示一些保護作用，其中5mg/kg cA2及5mg/kg TNV148顯示在第1至3週時AI顯著降低，且所有處理組在第2週時均顯著降低。在研究的後期，經5mg/kg cA2處理的動物顯示一些保護作用，其中在第4、6、及7週時顯著降低。cA2及TNV148兩者的低劑量(3mg/kg)在第6週皆顯示顯著降低，且所有處理組在第7週皆顯示顯著降低。沒有處理組能夠在研究結束時(第8週)維持顯著降低。在任何時間點任何處理組(不包括鹽水對照組)之間沒有顯著差異。
〔圖16〕顯示相較於實例7中的對照組，回應於本發明抗TNF抗體的關節炎小鼠模型小鼠Tg 197之重量變化。為了比較單次腹膜內劑量的TNV148(衍生自融合瘤細胞)與rTNV148B(衍生自經轉染細胞)的療效。在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至9個處理組中之一者，並以1mg/kg之單次腹膜內推注劑量的達爾伯克PBS(D-PBS)或抗體(TNV148、rTNV148B)處理。
〔圖17〕表示如實例7所呈現的基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數低於D-PBS控制組，此係從第4週開始並持續到研究的其餘部分(第8週)。經TNV148處理的組及經1mg/kg cA2處理的組兩者在第4週皆顯示AI顯著降低。雖然先前研究(P-099-017)顯示，TNV148在單次1mg/kg腹膜內推注後，在降低關節炎指數方面稍微更有效，但此研究顯示，兩種版本之經TNV抗體處理之組的AI皆略高。雖然(除了第6週以外)相較於10mg/kg cA2組時，經1mg/kg cA2處理的組並未顯著提高，且經TNV148處理的組在第7及8週時顯著較高，但在研究中 的任何點，在1mg/kg cA2、1mg/kg TNV148、及1mg/kg TNV148B之間AI沒有顯著差異。
〔圖18〕顯示戈利木單抗(golimumab)製造程序的9個階段之概述。
〔圖19〕顯示用於預培養及擴增步驟之第1階段製造程序之流程圖，其包括程序中管制及程序監測測試。
〔圖20〕顯示第2階段製造程序步驟之流程圖，其包括程序中管制及程序監測測試。
〔圖21〕顯示使用HPLC方法與螢光偵測之在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗之代表性HPLC層析圖。標示與不同物種相關聯的峰。*指示不與戈利木單抗相關聯之系統峰。
〔圖22〕顯示在Sp2/0細胞中產生的戈利木單抗之IRMA分析的代表性重疊解析(deconvoluted)質譜。
〔圖23〕顯示具有標示為C、1、2、及3的四個主要峰及標示為B的一個次要峰之在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗之代表性cIEF電泳圖概況。亦標示pI 7.6及9.5之內部標準。亦顯示代表cIEF峰與降低的負電荷/唾液酸化程度之間的大致關係之圖。
〔圖24〕顯示在戈利木單抗IgG中一些主要N-連接寡醣物種之示意圖概述。亦顯示一些酶在醣基化成熟程序中的作用及一些二價陽離子的作用(例如，Mn2+作為輔助因子及Cu2+作為GalTI之抑制劑)(參見例如，Biotechnol Bioeng.2007 Feb 15；96(3)：538-49；Curr Drug Targets.2008 Apr；9(4)：292-309；J Biochem Mol Biol.2002 May 31；35(3)：330-6)。應注意的是，具有末端唾液酸的物種(S1及S2)係帶電物種而缺乏末端唾液酸的物種(G0F、G1F、及G2F)係中性物種，但帶電物種的產生取決於由GalT1酶添加之G1F及G2F中半乳糖的存在。
〔圖25〕顯示在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗及在CHO細胞中表現的戈利木單抗之寡醣態樣的代表性HPLC層析圖。對於基線以上的所有峰，用散列標記(hash mark)識別洗提經鄰胺苯甲酸標示之N-聚醣的峰。使用括號及/或標示來指示對應於總中性、總帶電、單唾液酸化、及二唾液酸化寡醣物種之峰群組。
本發明提供包含抗TNF抗體之組成物及用於生產此類抗TNF抗體之製程，該等抗TNF抗體具有包含SEQ ID NO：36之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：37之輕鏈(LC)。
如本文中所使用，「抗腫瘤壞死因子α抗體(anti-tumor necrosis factor alpha antibody)」、「抗TNF抗體(anti-TNF antibody)」、「抗TNF抗體部分(anti-TNF antibody portion)」、或「抗TNF抗體片段(anti-TNF antibody fragment)」、及/或「抗TNF抗體變體(anti-TNF antibody variant)」、及類似者包括任何含有包含至少一部分免疫球蛋白分子之分子的蛋白質或肽，諸如但不限於重鏈或輕鏈或其配體結合部分之至少一個互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、架構區、或其任何部分、或TNF受體或結合蛋白之至少一部分，其等可併入本發明之抗體中。此抗體可選地進一步影響特定配體，諸如但不限於此抗體在體外、原位、及/或體內調節、減少、增加、拮抗、促效(agonize)、減輕、緩解、阻斷、抑制、終止、及/或干擾至少一種TNF活性或結合、或TNF受體活性或結合。作為一非限制性實例，本發明之合適的抗TNF抗體、特定部分、或變體可結合至少一種TNF、或其特定部分、變體、或域。合適的抗TNF抗體、特定部分、或變體亦可以可選地影響TNF活性或功能中之至少一者，諸如但不限於RNA、DNA、或蛋白質合成、TNF釋放、TNF受體傳訊、膜TNF切割、TNF活性、TNF生產、及/或合成。用語「抗體(antibody)」係進一步意欲涵蓋抗體、其截切片段、特定部分、及變體，包括抗體模擬物，或包含模擬抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能之抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括結合至哺乳動物TNF之抗原結合片段。舉例而言，本發明涵蓋能夠結合至TNF或其部分之抗體片段，包括但不限於Fab(例如，藉由木瓜酶(papain)截切)、Fab'(例如，藉由胃蛋白酶(pepsin)截切及部分還原)及F(ab')2(例如，藉由胃蛋白酶截切)、facb(例如，藉由纖維蛋白溶酶(plasmin)截切)、pFc'(例如，藉由胃蛋白酶或纖維蛋白溶酶截切)、Fd(例如，藉由胃蛋白酶截切、部分還 原、及再聚集)、Fv或scFv(例如，藉由分子生物技術)片段(參見例如，上述Colligan,Immunology)。
可藉由酶切割、合成、或重組技術來產生此類片段，如所屬技術領域中已知的及/或如本文中所述。亦可使用其中在天然終止位點上游已引入一或多個終止密碼子之抗體基因以各種截短形式來產生抗體。舉例而言，編碼F(ab')2重鏈部分之組合基因可經設計以包括編碼重鏈之CH1域及/或鉸鏈區的DNA序列。可藉由習知技術以化學方式將抗體之各種部分連接在一起，或者可使用基因工程技術以連續蛋白質來製備。
如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」係指一種抗體，其中蛋白質之實質上每一部分(例如，CDR、架構、CL、CH域(例如，CH1、CH2、及CH3)、鉸鏈、(VL、VH))在人類中實質上不具免疫原性，而只有輕微的序列改變或變異。同樣地，抗體所指定的靈長類(猴、狒狒、黑猩猩等)、囓齒動物(小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、倉鼠、及類似者)、及其他哺乳動物指定此類種、亞屬、屬、亞科、科之特異性抗體。再者，嵌合抗體包括上述的任何組合。此類改變或變化可選地且較佳地相對於非經修飾抗體保留或降低在人類或其他物種中的免疫原性。因此，人類抗體係不同於嵌合抗體或人源化抗體。據指出可藉由能夠表現經功能性重排之人類免疫球蛋白(例如，重鏈及/或輕鏈)基因的非人類動物或原核或真核細胞來產生人類抗體。另外，當人類抗體為單鏈抗體時，其可包含在天然人類抗體中未發現的連結肽(linker peptide)。舉例而言，Fv可包含連結肽，諸如為二至約八個甘胺酸或其他胺基酸殘基，其連接重鏈的可變區及輕鏈的可變區。此類連結肽被認為是源自人類。
亦可使用雙特異性(例如，DuoBody®)、異特異性、異共軛(heteroconjugate)、或類似抗體，其係對於至少兩種不同抗原具有結合特異性的單株(較佳地人類或人源化)抗體。在本情況中，該等結合特異性中之一者係針對至少一種TNF蛋白，另一者係針對任何其他抗原。用於製造雙特異性抗體之方法係所屬技術領域中已知的。傳統上，雙特異性抗體之重組生產係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表現，其中兩個重鏈具有不同的特異性(Milstein and Cuello,Nature 305：537(1983))。由於免疫球 蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，這些融合瘤(四源融合瘤(quadroma))產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結構。通常藉由親和力層析步驟完成的正確分子之純化可能很繁複，且產品產率低，並已經開發了不同的策略來促進雙特異性抗體的生產。
全長雙特異性抗體可例如使用兩個單特異性雙價抗體之間的Fab臂交換(或半分子交換)來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代，以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在活體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵被還原。其中一個親本單特異性抗體所生成的游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所生成之產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，這兩個Fab臂或半分子可各自結合不同表位。
如本文中所使用，「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。如本文中所使用，「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
如本文中所使用，「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。如本文中所使用，「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「鈕扣結構」策略(見例如PCT國際專利申請案公開號WO 2006/028936)可用於產生全長雙特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域界面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸(孔)引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸(鈕)引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、 F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/028637或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美國專利公開號US2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。
除了上述方法之外，雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於以下文獻中之方法：國際專利公開號WO2011/131746。在該等方法中，第一單特異性雙價抗體及第二單特異性雙價抗體係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復至非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90min。
可用於本發明之方法及組成物的抗TNF抗體(亦稱為TNF抗體)可以可選地藉由與TNF之高親和力結合及可選地且較佳地具有低毒性來表徵。具體而言，本發明之抗體、特定片段、或變體(其中個別組分(諸如可變區、恆定區、及架構)個別地且/或共同地、可選地且較佳地具有低免疫原性)在本發明中係有用的。可用於本發明之抗體可選地係藉由其具有可測量之症狀緩解及低且/或可接受毒性之長期治療患者的能力來表徵。低或可接受的免疫原性及/或高親和力、以及其他合適的性質可有助於達成治療結果。「低免疫原性(low immunogenicity)」在本文中定義為在少於約75%、或較佳地少於約50%所治療的患者中引起顯著的HAHA、HACA、或HAMA反應，及/或在所治療的患者中引起低的效價(titre)(小於約300、較佳地小於約100，其係以雙抗原酶免疫檢定測量)(Elliott et al.,Lancet 344：1125-1127(1994)，其全文以引用方式併入本文中)。
實用性：本發明之經單離核酸可用於生產至少一種抗TNF抗體或其特定變體，其可用於測量或影響細胞、組織、器官、或動物(包括哺乳動物及人類)，以診斷、監測、調節、治療、緩解至少一種選自(但不限於)免疫病症或疾病、心血管病症或疾病、感染性、惡性、及/或神經性病症或疾病中之至少一者的TNF病況、幫助預防上述病況的發生、或減少其症狀。
此方法可包含向需要此調節、治療、緩解、預防、或減少症狀、效果、或機制之細胞、組織、器官、動物、或患者投予有效量之包含至少一種抗TNF抗體的組成物或醫藥組成物。有效量可包含每單次(例如，推注)、多次、或連續投予約0.001至500mg/kg的量、或達到每單次、多次、或連續投予之血清濃度為0.01至5000μg/ml血清濃度、或使用已知方法完成或測定之其中的任何有效範圍或值，如本文中所述或相關技術領域中已知者。引用：本文所引用之所有出版物或專利全文係以引用方式併入本文中，因為彼等顯示本發明時點之目前最佳技術且/或提供本發明之描述及實現。出版物係指任何科學或專利出版物，或任何其他可以任何媒體形式取得的資訊，其包括所有記錄、電子、或印刷形式。下列參考文獻全文係以引用方式併入本文中：Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(1987-2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Harlow and Lane,antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,(1997-2001)。
本發明之抗體：至少一種本發明之抗TNF抗體包含所有SEQ ID NO：1、2、及3之重鏈可變CDR區及/或所有SEQ ID NO：4、5、及6之輕鏈可變CDR區，且可以可選地藉由細胞系、混合細胞系、永生化細胞(immortalized cell)、或永生化細胞之無性繁殖族群(clonal population)、以及所屬技術領域中所熟知者來生產。參見例如Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(1987-2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Harlow and Lane,antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,(1997-2001)，各者全文以引用方式併入本文中。
可針對適當的免疫原性抗原(諸如經單離及/或TNF蛋白或其一部分(包括合成分子，諸如合成肽))產生對人類TNF蛋白或其片段具特異性之人類抗體。可類似地產生其他特異性或一般哺乳動物抗體。免疫性抗原(immunogenic antigen)之製備及單株抗體生產可使用任何合適的技術執行。
在一個方法中，融合瘤係藉由融合合適的永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞系，諸如但不限於Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、 NAMAIWA、NEURO 2A、或類似者)、或異源骨髓瘤(heteromyloma)、其融合產物、或任何衍生自其之細胞或融合細胞、或任何所屬技術領域中已知之其他合適的細胞系來產生。參見例如www.atcc.org、www.lifetech.com、及類似者中之抗體生產細胞，諸如但不限於經單離或經選殖之脾、周邊血液、淋巴、扁桃腺、或其他含有免疫或B細胞之細胞、或任何表現重鏈或輕鏈恆定或可變或架構或CDR序列之其他細胞，作為內源或異源核酸，作為重組或內源病毒、細菌、藻、原核、兩棲類、昆蟲、爬蟲類、魚類、哺乳動物、囓齒動物、馬、綿羊(ovine)、山羊、綿羊(sheep)、靈長類、真核、基因體DNA、cDNA、rDNA、粒線體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單股、雙股、或三股、雜交、及類似者、或其任何組合。參見例如上述Ausubel、及上述Colligan,Immunology第2章，全文以引用方式併入本文中。
抗體生產細胞亦可自周邊血液獲得，或較佳地自人類或已用所關注抗原免疫之其他合適動物之脾或淋巴結獲得。任何其他合適的宿主細胞亦可用於表現本發明之編碼抗體、其特定片段、或變體之異源或內源核酸。可使用選擇性培養條件或其他合適的已知方法將經融合細胞(融合瘤)或重組細胞單離，並藉由有限稀釋(limiting dilution)或細胞分選、或其他已知方法來選殖。可藉由合適的檢定(例如，ELISA)來選擇生產具有所欲特異性之抗體的細胞。
可使用其他適合生產或單離具有所需特異性之抗體的方法，包括但不限於從肽或蛋白質庫選擇重組抗體的方法(例如但不限於噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA、或類似者的展示庫；例如，可得自Cambridge antibody Technologies,Cambridgeshire,UK；MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE；Biovation,Aberdeen,Scotland,UK；BioInvent,Lund,Sweden；Dyax Corp.,Enzon,Affymax/Biosite；Xoma,Berkeley,CA；Ixsys。參見例如EP 368,684、PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；US 08/350260(5/12/94)；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424； WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO96/07754；(Scripps)；EP 614989(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；US 4,704,692(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400；(Xoma)；EP 229 046；PCT/US91/07149(Ixsys)；或隨機產生的肽或蛋白質-US 5723323、5763192、5814476、5817483、5824514、5976862、WO 86/05803、EP 590 689(Ixsys，現為Applied Molecular Evolution(AME)，各者全文以引用方式併入本文中)，或仰賴於基因轉殖動物之免疫法(例如，SCID小鼠，Nguyen et al.,Microbiol.Immunol.41：901-907(1997)；Sandhu et al.,Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118(1996)；Eren et al.,Immunol.93：154-161(1998)，各者全文以及相關專利及申請案以引用方式併入)，該等方法能夠產生人類抗體貯庫(repertoire)，如所屬技術領域中所已知且/或如本文中所述。此類技術包括但不限於核糖體展示(Hanes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94：4937-4942(1997年5月)；Hanes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95：14130-14135(1998年11月))；單一細胞抗體生產技術(例如，經選擇之淋巴球抗體方法(selected lymphocyte antibody method，「SLAM」)(美國專利第5,627,052號、Wen et al.,J.Immunol.17：887-892(1987)；Babcook et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848(1996))；凝膠微滴及流式細胞術(Powell et al.,Biotechnol.8：333-337(1990)；One Cell Systems,Cambridge,MA；Gray et al.,J.Imm.Meth.182：155-163(1995)；Kenny et al.,Bio/Technol.13：787-790(1995))；B細胞選擇(Steenbakkers et al.,Molec.Biol.Reports 19：125-134(1994)；Jonak et al.,Progress Biotech,Vol.5,In Vitro Immunization in Hybridoma Technology,Borrebaeck,ed.,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,Netherlands(1988))。
亦可使用用於工程改造或人源化非人類或人類抗體之方法且該方法係所屬技術領域中熟知的。通常，人源化抗體或經工程改造抗體具有來自非人類的來源(例如但不限於，小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類、或其他哺乳動物)之一或多個胺基酸殘基。這些人類胺基酸殘基通常 稱為「輸入(import)」殘基，其一般係取自已知的人類序列之「輸入」可變域、恆定域、或其他域。
已知的人類Ig序列係揭示於眾多出版物及網站中，例如：
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；
www.atcc.org/phage/hdb.html；
www.sciquest.com/；
www.abcam.com/；
www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；
www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html；
www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；
www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html；
www.antibodyresource.com/；
www.mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.
www.immunologylink.com/；
www.pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html；
www.biotech.ufl.edu/~hcl/；
www.pebio.com/pa/340913/340913.html；
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；
www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html；
www.biodesign.com/table.asp；
www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；
www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html；
www.isac-net.org/sites_geo.html；
www.aximt1.imt.uni-marburg.de/~rek/AEPStart.html；
www.baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html；
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；
www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；
www.abgen.cvm.tamu.edu/lab/
www.abgen.html；
www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html；
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/；
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html；
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；
www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；
www.jerini.de/frproducts.html；
www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)，各者全文以引用方式併入本文中。
此類導入的序列可用於降低免疫原性、或降低、增強、或修飾結合、親和力、結合速率(on-rate)、解離速率(off-rate)、親留力(avidity)、特異性、半衰期、或任何其他合適的特性，如所屬技術領域中已知的。通常，維持部分或全部非人類或人類CDR序列，而可變區及恆定區之非人類序列被人類或其他胺基酸置換。亦可以可選地將抗體人源化，同時保留對抗原的高親和力及其他有利的生物性質。為達成此目的，可以可選地藉由使用親本及人源化序列之三維模型對親本序列及各種概念性人源化產物進行分析的程序來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型係普遍可取得的且係所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉的。電腦程式可用來說明及展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構型結構。檢測這些展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可從共有且重要的序列選擇FR殘基並組合，從而獲得所欲的抗體特性，諸如對(多種)目標 抗原的親和力增加。通常而言，CDR殘基係直接且最實質涉及影響抗原結合。本發明之抗體的人源化或工程改造可使用任何已知的方法執行，諸如但不限於描述於下列中者：Winter(Jones et al.,Nature 321：522(1986)；Riechmann et al.,Nature 332：323(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239：1534(1988))、Sims et al.,J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)、Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.151：2623(1993)、美國專利第5723323號、第5976862號、第5824514號、第5817483號、第5814476號、第5763192號、第5723323號、第5,766886號、第5714352號、第6204023號、第6180370號、第5693762號、第5530101號、第5585089號、第5225539號；第4816567號，PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246，各者全文以引用方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
抗TNF抗體亦可以可選地藉由使能夠生產人類抗體貯庫的基因轉殖動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類、及類似者)免疫而產生，如本文中所述且/或如所屬技術領域中已知的。生產人類抗TNF抗體的細胞可從此類動物中單離並使用合適的方法永生化，諸如本文中所述之方法。
可藉由已知方法生產可生產結合至人類抗原之人類抗體貯庫的基因轉殖小鼠(例如但不限於核發予Lonberg等人之美國專利第5,770,428號、第5,569,825號、第5,545,806號、第5,625,126號、第5,625,825號、第5,633,425號、第5,661,016、及第5,789,650號；Jakobovits等人WO 98/50433、Jakobovits等人WO 98/24893、Lonberg等人WO 98/24884、Lonberg等人WO 97/13852、Lonberg等人WO 94/25585、Kucherlapate等人WO 96/34096、Kucherlapate等人EP 0463 151 B1、Kucherlapate等人EP 0710 719 A1、Surani等人美國專利第5,545,807號、Bruggemann等人WO 90/04036、Bruggemann等人EP 0438 474 B1、Lonberg等人EP 0814 259 A2、Lonberg等人GB 2 272 440 A、Lonberg et al.Nature 368：856-859 (1994)、Taylor et al.,Int.Immunol.6(4)579-591(1994)、Green et al,Nature Genetics 7：13-21(1994)、Mendez et al.,Nature Genetics 15：146-156(1997)、Taylor et al.,Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)、Tuaillon et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)、Lonberg et al.,Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)、及Fishwald et al.,Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，其等各者全文以引用方式併入本文中)。通常而言，這些小鼠包含至少一種包含來自至少一個人類免疫球蛋白基因座之DNA的轉殖基因，人類免疫球蛋白基因座經功能性重排或可經歷功能性重排。在此小鼠中的內源免疫球蛋白基因座可被破壞或刪除，以消除動物產生由內源基因編碼之抗體的能力。
可使用肽展示庫便利地達成篩選用於與相似蛋白質或片段特異性結合之抗體。此方法涉及針對具有所欲功能或結構之個別成員篩選大量的肽。肽展示庫之抗體篩選在所屬技術領域中係熟知的。所展示之肽序列長度可自3至5000個或更多個胺基酸，時常係5至100個胺基酸長，且常係約8至25個胺基酸長。除了用於產生肽庫之直接化學合成方法外，已描述數種重組DNA方法。一種類型涉及在噬菌體或細胞之表面上展示肽序列。各噬菌體或細胞含有編碼該特定展示的肽序列之核苷酸序列。此類方法係描述於PCT專利公開案第91/17271號、第91/18980號、第91/19818號、及第93/08278號中。用於產生肽庫之其他系統具有體外化學合成及重組方法兩者之態樣。參見PCT專利公開案第92/05258號、第92/14843號、及第96/19256號。亦參見美國專利第5,658,754號；及第5,643,768號。肽展示庫、載體、及篩選套組可商購自諸如Invitrogen(Carlsbad,CA)、及Cambridge antibody Technologies(Cambridgeshire,UK)之供應商。參見例如轉讓給Enzon之美國專利第4704692號、第4939666號、第4946778號、第5260203號、第5455030號、第5518889號、第5534621號、第5656730號、第5763733號、第5767260號、第5856456號；轉讓給Dyax之第5223409號、第5403484號、第5571698號、第5837500號，轉讓給Affymax之第5427908號、第5580717號；轉讓給Cambridge antibody Technologies之第5885793號；轉讓給Genentech之第5750373號，轉讓給Xoma之第5618920號、第 5595898號、第5576195號、第5698435號、第5693493號、第5698417號，上述Colligan；上述Ausubel；或上述Sambrook，上述專利及出版物之各者全文以引用方式併入本文中。
本發明之抗體亦可使用至少一種編碼核酸之抗TNF抗體來製備，以提供基因轉殖動物或哺乳動物，諸如山羊、牛、馬、綿羊、及類似者，其等在其等之乳汁中產生此類抗體。可使用已知方法提供此類動物。參見例如但不限於美國專利第5,827,690號；第5,849,992號；第4,873,316號；第5,849,992號；第5,994,616號；第5,565,362號；第5,304,489號、及類似者，其各者全文以引用方式併入本文中。
本發明之抗體可額外地使用至少一種編碼核酸之抗TNF抗體來製備，以提供基因轉殖植物及經培養之植物細胞(例如但不限於菸草及玉米)，該等植物及細胞在植物部分中或在自其培養的細胞中產生此類抗體、特定部分、或變體。作為一非限制性實例，已成功使用表現重組蛋白質之基因轉殖菸草葉片，以提供大量重組蛋白質，例如使用誘導性啟動子。參見例如Cramer et al.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其中所引用之參考文獻。同樣地，基因轉殖玉米已被用於以商業生產水平表現哺乳動物蛋白質，其中生物活性相當於在其他重組系統中生產者或純化自天然來源者。參見例如Hood et al.,Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其中所引用之參考文獻。亦已從基因轉殖植物種子中大量生產抗體，包括抗體片段，諸如單鏈抗體(scFv)，其包括菸草種子及馬鈴薯塊莖。參見例如Conrad et al.,Plant Mol.Biol.38：101-109(1998)及其中所引用之參考文獻。因此，本發明之抗體亦可根據已知方法使用基因轉殖植物生產。亦參見例如Fischer et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(1999年10月)、Ma et al.,Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma et al.,Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam et al.,Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)；及其中所引用之參考文獻。通常亦針對(但不限於)抗體之植物表現，參見上述參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。
本發明之抗體可以廣泛範圍的親和力(KD)結合人類TNF。在一較佳實施例中，至少一種本發明之人類mAb可以可選性地以高親和力 結合人類TNF。舉例而言，人類mAb可以等於或小於約10-7M之KD結合人類TNF，諸如但不限於0.1至9.9(或其中的任何範圍或值)X 10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、或其中的任何範圍或值。
可使用任何合適方法實驗測定抗體對抗原之親和力(affinity)或親留力(avidity)。(參見例如Berzofsky,et al.，「Antibody-Antigen Interactions」於Fundamental Immunology中，Paul,W.E.,Ed.,Raven Press：New York,NY(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company：New York,NY(1992)；及本文所述之方法)。若在不同條件(例如，鹽濃度、pH)下測量，則所測得之特定抗體-抗原交互作用的親和力可能有所變化。因此，測量親和力及其他抗原結合參數(例如，KD、Ka、Kd)較佳地係以抗體及抗原的標準化溶液、及標準化緩衝劑進行，諸如本文中所述之緩衝劑。
核酸分子：使用本文中所提供之資訊，諸如核苷酸序列(其編碼至少70至100%的SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8中之至少一者之連續胺基酸)、其特定片段、變體、或共有序列、或包含這些序列中之至少一者的寄存載體(deposited vector)，可使用本文中所述或如所屬技術領域中已知的方法來獲得本發明之核酸分子，其編碼至少一種抗TNF抗體，該抗體包含所有SEQ ID NO：1、2、及3之重鏈可變CDR區及/或所有SEQ ID NO：4、5、及6之輕鏈可變CDR區。
本發明之核酸分子可呈RNA之形式，諸如mRNA、hnRNA、tRNA、或任何其他形式，或呈DNA之形式，包括但不限於藉由選殖或合成生產而獲得的cDNA及基因體DNA，或其任何組合。DNA可係三股、雙股、或單股、或其任何組合。DNA或RNA之至少一股的任何部分可係編碼鏈，亦稱為有義鏈(sense strand)，或其可係非編碼鏈，亦稱為反義鏈(anti-sense strand)。
本發明之經單離之核酸分子可包括包含開讀框(open reading frame,ORF)的核酸分子，其可選地具有一或多個內含子，例如但不限於至少一個CDR(如至少一個重鏈(例如SEQ ID NO：1至3)或輕鏈(例如SEQ ID NO：4至6)之CDR1、CDR2、及/或CDR3)之至少一個特定部 分；包含抗TNF抗體或可變區(例如SEQ ID NO：7、8)之編碼序列的核酸分子；及包含實質上不同於上述者之核苷酸序列的核酸分子，但由於基因密碼簡併性，其仍編碼至少一種如本文中所述且/或如所屬技術領域中已知的抗TNF抗體。當然，基因密碼在所屬技術領域中係熟知的。因此，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，產生此類編碼本發明之特異性抗TNF抗體的簡併核酸變體係例行事項。參見例如上述Ausubel,et al.，且此類核酸變體係包括在本發明中。本發明之經單離核酸分子的非限制性實例包括SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15，其分別對應於編碼HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC可變區、及LC可變區之核酸的非限制性實例。
如本文中所指示，包含編碼抗TNF抗體之核酸的本發明之核酸分子可包括但不限於單獨的編碼抗體片段之胺基酸序列者；整個抗體或其一部分之編碼序列；抗體、片段、或部分之編碼序列、以及額外序列，諸如至少一個信號前導(signal leader)或融合肽之編碼序列，其具有或不具有前述額外編碼序列，諸如至少一個與額外的非編碼序列一起的內含子，包括但不限於非編碼5'及3'序列，諸如在轉錄、mRNA加工(包括剪接及多腺核苷酸化信號(例如，核醣體結合及mRNA之穩定性))中起作用的經轉錄、未經轉譯序列；編碼額外胺基酸的額外編碼序列，諸如提供額外功能者。因此，編碼抗體之序列可融合至標記序列，諸如編碼肽之序列，該肽有助於包含抗體片段或部分之經融合抗體的純化。
與如本文中所述之多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸：本發明提供經單離之核酸，其在選擇性雜交條件下與本文中所揭示之多核苷酸雜交。因此，此實施例之多核苷酸可用於單離、偵測、及/或定量包含此類多核苷酸之核酸。舉例而言，本發明之多核苷酸可用來識別、單離、或擴增寄存庫中的部分或全長殖株。在一些實施例中，多核苷酸係基因體或cDNA序列，其經單離、或以其他方式與來自人類或哺乳動物核酸庫的cDNA互補。
較佳地，cDNA庫包含至少80%全長序列，較佳地至少85%或90%全長序列，且更佳地至少95%全長序列。可將cDNA庫標準化以增加 罕見序列的表示。低或中嚴格度雜交條件一般但非排他地採用相對於互補序列具有降低的序列同一性之序列。對於較高同一性之序列，可以可選地採用中及高嚴格度條件。低嚴格度條件允許具有約70%序列同一性之序列選擇性雜交，且可用來識別異種同源(orthologous)或同種同源(paralogous)序列。
可選地，本發明之多核苷酸將編碼由本文中所述之多核苷酸編碼的抗體之至少一部分。本發明之多核苷酸涵蓋可用於與編碼本發明之抗體的多核苷酸選擇性雜交之核酸序列。參見例如上述Ausubel；上述Colligan，各者全文以引用方式併入本文中。
核酸之建構：本發明之經單離的核酸可使用(a)重組方法、(b)合成技術、(c)純化技術、或其組合而製得，如同此項技術領域已知者。
核酸可方便地包含除了本發明之多核苷酸外的序列。舉例而言，可將包含一或多個內切酶限制位點之多選殖位點插入核酸中，以協助多核苷酸單離。同樣地，可將可轉譯序列插入以協助本發明之經轉譯多核苷酸的單離。舉例而言，六組胺酸標記序列提供純化本發明之蛋白質的便利手段。本發明之核酸(不包括編碼序列)可選地係載體、轉接子(adapter)、或連接子，用於本發明之多核苷酸的選殖別或表現。
可將額外序列添加至此類選殖及/或表現序列，以最佳化彼等在選殖及/或表現中之功能，以協助多核苷酸的單離，或改善將多核苷酸引入細胞的過程。使用選殖載體、表現載體、轉接子、及連接子在所屬技術領域中係熟知的。(參見例如上述Ausubel；或上述Sambrook)。
用於建構核酸之重組方法：可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何數量的選殖方法，從生物來源獲得本發明之經單離之核酸組成物，諸如RNA、cDNA、基因體DNA、或其任何組合。在一些實施例中，使用在嚴苛條件下與本發明之多核苷酸選擇性地雜交之寡核苷酸探針來識別cDNA或基因體DNA庫中之所欲序列。RNA之單離、及cDNA及基因體庫之建構係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。(參見例如上述Ausubel；或上述Sambrook)。
核酸篩選及單離方法：可使用基於本發明之多核苷酸序列的探針來篩選cDNA或基因體庫，諸如本文中所揭示者。探針可用來與基因體DNA或cDNA序列雜交，以單離相同或不同有機體中之同源基因。所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，在檢定中可採用不同程度的雜交嚴格度(stringency of hybridization)；且雜交或洗滌介質可係嚴格的。隨著雜交條件變得更加嚴格，探針與目標之間必須有更大程度的互補，以使雙鏈體(duplex)形成。可藉由溫度、離子強度、pH、及部分變性溶劑(諸如甲醯胺)的存在中之一或多者來控制嚴格程度。舉例而言，藉由透過例如在0%至50%範圍內操控甲醯胺濃度來改變反應物溶液的極性而方便地變化雜交的嚴格度。可偵測結合所需之互補性(序列同一性)程度將根據雜交介質及/或洗滌介質之嚴格度而有所變化。互補性程度最佳將係100%、或70至100%、或其中的任何範圍或值。然而，應理解的是，可藉由降低雜交及/或洗滌介質之嚴格度來補償探針及引子中微小的序列變化。
RNA或DNA的擴增方法係所屬技術領域中熟知的，且可基於本文中所提出之教示及指南，根據本發明使用而無需過度實驗。
DNA或RNA擴增之已知方法包括但不限於聚合酶連鎖反應(PCR)及相關擴增程序(參見例如Mullis等人之美國專利第4,683,195號、第4,683,202號、第4,800,159號、第4,965,188號；Tabor等人之第4,795,699號及第4,921,794號；Innis之第5,142,033號；Wilson等人之第5,122,464號；Innis之第5,091,310號；Gyllensten等人之第5,066,584號；Gelfand等人之第4,889,818號；Silver等人之第4,994,370號；Biswas之第4,766,067號；Ringold之第4,656,134號)及RNA介導之擴增，其使用針對目標序列之反義RNA作為用於雙股DNA合成之模板(Malek等人之美國專利第5,130,238號，商品名稱為NASBA)，該等參考文獻之全部內容以引用方式併入本文中。(參見例如上述Ausubel；或上述Sambrook。)
例如，聚合酶連鎖反應(PCR)技術可用來直接從基因體DNA或cDNA庫擴增本發明之多核苷酸及相關基因之序列。PCR及其他體外擴增方法亦可用於例如選殖編碼待表現之蛋白質的核酸序列，以使核酸用作為探針，用來偵測樣本中所欲mRNA的存在、用於核酸定序、或用於 其他目的。足以引導技術人員透過體外擴增方法之技術實例可見於上述Berger、上述Sambrook、及上述Ausubel、以及Mullis等人之美國專利第4,683,202號(1987)；及Innis,et al.,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,CA(1990)。用於基因體PCR擴增之市售可得套組在所屬技術領域中係已知的。參見例如Advantage-GC基因體PCR套組(Clontech)。此外，例如可使用T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)來改善長PCR產物之產率。
用於建構核酸之合成方法：本發明之經單離核酸亦可藉由直接化學合成藉由已知方法來製備(參見例如上述Ausubel,et al.)。化學合成通常產生單股寡核苷酸，該單股寡核苷酸可藉由與互補序列雜交、或藉由使用該單股作為模板與DNA聚合酶進行聚合而轉換成雙股DNA。所屬技術領域中具有通常知識者將認知到，雖然DNA的化學合成可能限於約100或更多個鹼基之序列，但藉由較短序列之連接可獲得較長的序列。
重組表現匣：本發明進一步提供包含本發明之核酸的重組表現匣。本發明之核酸序列(例如，編碼本發明之抗體的cDNA或基因體序列)可用來建構重組表現匣，其可被引入至少一個所欲之宿主細胞中。重組表現匣一般將包含本發明之多核苷酸，其可操作地連接至轉錄起始調控序列，該等轉錄起始調控序列將引導多核苷酸在預期宿主細胞中的轉錄。可採用異源啟動子及非異源(即內源)啟動子兩者來引導本發明之核酸的表現。
在一些實施例中，可在本發明之多核苷酸的非異源形式之適當位置(上游、下游、或在內含子)中引入作為啟動子、增強子、或其他元件之經單離核酸，以上調或下調本發明之多核苷酸的表現。舉例而言，內源啟動子可藉由突變、刪除、及/或取代來在體內或體外改變。
載體及宿主細胞：本發明亦關於包括本發明之經單離核酸分子的載體、以該等重組載體基因工程改造的宿主細胞、及藉由重組技術生產至少一種抗TNF抗體，如所屬技術領域中熟知的。參見例如上述Sambrook,et al.；上述Ausubel,et al.，各者全文以引用方式併入本文中。
可選地，可將多核苷酸連接至載體，該載體含有用於在宿主中增殖之可選擇標記。通常而言，將質體載體引入沉澱物(諸如磷酸鈣沉澱物)中或具有帶電脂質的複合物中。若載體係病毒，則可使用適當的包裝細胞系將其於體外包裝，然後轉導至宿主細胞中。
DNA插入物應可操作地連接至適當的啟動子。表現建構體將進一步含有用於轉錄起始、終止之位點、及在轉錄區中用於轉譯之核醣體結合位點。由建構體表現之成熟轉錄本的編碼部分將較佳地在起始處包括轉譯起始位點且包括適當定位在待轉譯mRNA終端之終止密碼子(例如UAA、UGA、或UAG)，其中UAA及UAG較佳用於哺乳動物或真核細胞表現。
表現載體將較佳地但可選地包括至少一種可選擇標記。此類標記包括例如但不限於胺甲喋呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR，美國專利第4,399,216號；第4,634,665號；第4,656,134號；第4,956,288號；第5,149,636號；第5,179,017號)、安比西林(ampicillin)、新黴素(G418)、黴酚酸、或麩醯胺酸合成酶(GS，美國專利第5,122,464號；第5,770,359號；第5,827,739號)抗性(針對真核細胞培養)、及針對在大腸桿菌及其他細菌或原核生物中培養的四環素或安比西林抗性基因(上述專利全文係以引用方式併入本文中)。上述宿主細胞之適當培養基及條件係所屬技術領域中已知的。合適的載體對所屬技術領域中具有通常知識者將係顯而易見的。將載體建構體引入宿主細胞中會受到磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚醣介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染、或其他已知方法影響。此類方法係描述於所屬技術領域中，諸如上述Sambrook第1至4章及第16至18章；上述Ausubel第1、9、13、15、16章。
至少一種本發明之抗體可以經修飾形式表現，諸如融合蛋白，且不僅可包括分泌信號，且亦可包括額外的異源功能區。例如，可將額外胺基酸(特別是帶電胺基酸)之區添加至抗體之N端，以在純化期間、或在後續處理及儲存期間，改善在宿主細胞中之穩定性及持久性。同樣地，可將肽部份添加至本發明之抗體以促進純化。此類區域可在抗體或其至少一個片段的最終製備前移除。此類方法係描述於許多標準實驗室手 冊中，諸如上述Sambrook第17.29至17.42章及第18.1至18.74章；上述Ausubel第16、17、及18章。
所屬技術領域中具有通常知識者在可用於編碼本發明之蛋白質的核酸表現之許多表現系統中係知識豐富的。
替代地，可藉由在含有編碼本發明之抗體的內源DNA的宿主細胞中開啟(藉由操控)，在宿主細胞中表現本發明之核酸。此類方法在所屬技術領域中係熟知的，例如，如美國專利第5,580,734號、第5,641,670號、第5,733,746號、及第5,733,761號中所述，全文以引用方式併入本文中。
可用於生產該等抗體、其特定部分或變體之細胞包括哺乳動物細胞。哺乳動物細胞系統常會以單層細胞之形式培養，但亦可使該等細胞適應於在懸浮液中(例如，在搖瓶或生物反應器中)生長。在所屬技術領域中已開發出能夠表現完整的經醣基化蛋白質之數種合適的宿主細胞系，且包括COS-1(例如，ATCC® CRL-1650)、COS-7(例如，ATCC® CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC® CCL-10)、CHO(例如，ATCCCRL 1610)及BSC-1(例如，ATCC CRL-26)細胞系、中國倉鼠卵巢(CHO)、Hep G2、P3X63Ag8.653、Sp2/0-Ag14、HeLa細胞、及類似者，其可容易地自例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)取得。在某些實施例中，宿主細胞包括CHO細胞及淋巴源細胞，諸如骨髓瘤及淋巴瘤細胞，例如CHO-K1細胞、P3X63Ag8.653細胞(ATCC® CRL-1580)、及Sp2/0-Ag14細胞(ATCC® CRL-1581)。
CHO細胞系
儘管可取得數種其他哺乳動物細胞系，但現今所生產的大多數重組治療性蛋白質係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中製成的(Jayapal KP, et al. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chem Eng Prog. 2007; 103：40-47；Kunert R, Reinhart D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Appl Microbiol Biotechnol. 2016; 100(8)：3451-61)。其等之優勢包括例如作為貼附細胞或在懸浮液中之穩健生長、對無血清及化學成分確定的培養基之適應性、高生產率、及針對治療性重組蛋白生產之查驗登記(regulatory approval)的既定歷史。彼等亦非常適於基因修飾，且用於細胞轉染、重組蛋白表現、及殖株選擇之方法皆經充分表徵。CHO細胞亦可提供人類可相容之轉譯後修飾。如本文中所使用，「CHO細胞」包括但不限於例如CHO-DG44、CHO-Kl、CHO-M、CHO-S、CHO GS剔除、及其修飾及衍生物。
用於這些細胞之表現載體可包括下列中之一或多者：表現控制序列，諸如但不限於複製起源；啟動子(例如晚期或早期SV40啟動子、CMV啟動子(美國專利第5,168,062號；第5,385,839號)、HSV tk啟動子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF-1α啟動子(美國專利第5,266,491號)、至少一種人類免疫球蛋白啟動子)；增強子、及/或處理資訊位點(processing inforimation site)，諸如核醣體結合位點、RNA剪接位點、多腺核苷酸化位點(例如SV40大T Ag poly A添加位點)、及轉錄終止子序列。參見例如上述Ausubel et al.；上述Sambrook,et al.。可用於生產本發明之核酸或蛋白質之其他細胞係已知的及/或可得自例如美國典型培養物保藏中心之Catalogue of Cell Lines and Hybridomas或其他已知來源或商業來源。
當採用真核宿主細胞時，一般將多腺核苷酸化或轉錄終止子序列併入載體中。終止子序列之實例係來自牛生長激素基因之多腺核苷酸化序列。亦可包括用於轉錄本之準確剪接的序列。剪接序列之實例係來自SV40之VP1內含子(Sprague,et al.,J.Virol.45：773-781(1983))。此外，可將在宿主細胞中控制複製之基因序列併入載體中，如所屬技術領域中已知的。
抗體之純化：藉由熟知方法可從重組細胞培養物中回收並純化抗TNF抗體，熟知方法包括但不限於蛋白質A純化、硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和力層析法、氫氧磷灰石層析法、及凝集素層析法。亦可採用高效液相層析法(「HPLC」)以進行純化。參見例如Colligan，Current Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各者全部以引用方式併入本文中。
本發明之抗體包括天然純化產物、化學合成程序之產物、及藉由重組技術自真核宿主生產之產物，真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲、及哺乳動物細胞。取決於重組生產程序中所採用之宿主，本發明之抗體可經醣基化或可未經醣基化，其中經醣基化較佳。此類方法係描述於許多標準實驗室手冊中，諸如上述Sambrook第17.37節至第17.42節；上述Ausubel第10、12、13、16、18、及20章、上述Colligan,Protein Science第12章至第14章，全部全文以引用方式併入本文中。
抗TNF抗體
本發明之經單離抗體(其包含所有SEQ ID NO：1、2、及3之重鏈可變CDR區及/或所有SEQ ID NO：4、5、及6之輕鏈可變CDR區)包含本文中所揭示之抗體胺基酸序列，其係由任何合適的多核苷酸、或任何經單離或經製備抗體編碼。較佳的是，人類抗體或抗原結合片段結合人類TNF，並因此部分地或實質上中和蛋白質之至少一種生物活性。抗體或其特定部分或變體(其部分地或較佳地實質上中和至少一種TNF蛋白質或片段之至少一種生物活性)可結合蛋白質或片段，並藉此抑制透過TNF與TNF受體之結合或透過其他TNF依賴性或介導之機制介導的活性。如本文中所使用，用語「中和抗體(neutralizing antibody)」係指可抑制約20至120%之TNF依賴性活性的抗體，取決於檢定，較佳地抑制至少約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或更多。較佳地藉由至少一種合適的TNF蛋白或受體檢定來評估抗TNF抗體抑制TNF依賴性活性的能力，如本文中所述且/或如所屬技術領域已知的。本發明之人類抗體可係任何類別(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同型，且可包含κ或λ輕鏈。在一個實施例中，人類抗體包含IgG重鏈或經定義之片段，例如同型IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4中之至少一者。可藉由採用基因轉殖小鼠或其他基因轉殖非人類哺乳動物(包含至少一種人類輕鏈(例如IgG、IgA)及IgM(例如，γ1、γ2、γ3、 γ4)轉殖基因)來製備此類型之抗體，如本文中所述且/或如所屬技術領域中已知的。在另一實施例中，抗人類TNF人類抗體包含IgG1重鏈及IgG1輕鏈。
如本文中所使用，用語「抗體(antibody/antibodies)」包括在2009年之生物製劑產品價格競爭與創新法案(Biologics Price Competition and Innovation Act，BPCI法案)及全球類似法律及法規下核准之生物相似性抗體分子。根據BPCI法案，儘管在不具臨床活性的組份上有微小差異，但若數據顯示其與參考產品「高度相似」，且「預期」在安全性、純度、及效力方面產生與參考產品相同的臨床結果，則可證實抗體具有生物相似性(Endocrine Practice：2018年2月，Vol.24,No.2,pp.195-204)。為這些生物相似性抗體分子提供簡化的核准途徑，藉此申請人仰賴原廠(innovator)參考產品的臨床數據來確保監管批准。相較於基於成功的臨床試驗而被FDA核准之原始原廠參考抗體，生物相似性抗體分子(biosimilar antibody molecule)在本文中稱為「生物相似製劑(follow-on biologic)」。如本文中所呈現的，SIMPONI®(戈利木單抗)係基於成功的臨床試驗而經FDA核准之原始原廠參考抗TNF抗體。自2009年以來，戈利木單抗已在美國銷售。
本發明之至少一種抗體結合至少一種特定表位，該特定表位對至少一種TNF蛋白、次單元、片段、部分、或其任何組合具有特異性。該至少一種表位可包含至少一個抗體結合區，該至少一個抗體結合區包含該蛋白質之至少一部分，表位較佳地包含該蛋白質之至少一個胞外、可溶、親水性、外部、或胞質部分。該至少一種特定表位可包含至少1至3個胺基酸的至少一個胺基酸序列與SEQ ID NO：9之連續胺基酸的整個特定部分之任何組合。
通常而言，本發明之人類抗體或抗原結合片段將包含抗原結合區，該抗原結合區包含至少一個人類互補決定區(CDR1、CDR2、及CDR3)或至少一個重鏈可變區之變體、及至少一個人類互補決定區(CDR1、CDR2、及CDR3)或至少一個輕鏈可變區之變體。作為一非限制性實例，抗體或抗原結合部分或變體可包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸 序列的重鏈CDR3及/或具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR3中之至少一者。在一具體實施例中，抗體或抗原結合片段可具有抗原結合區，其包含具有對應CDR1、CDR2、及/或CDR3(例如，SEQ ID NO：1、2、及/或3)之胺基酸序列的至少一個重鏈CDR(即，CDR1、CDR2、及/或CDR3)之至少一部分。在另一具體實施例中，抗體或抗原結合部分或變體可具有抗原結合區，其包含具有對應CDR1、CDR2、及/或CDR3(例如，SEQ ID NO：4、5、及/或6)之胺基酸序列的至少一個輕鏈CDR(即，CDR1、CDR2、及/或CDR3)之至少一部分。在一較佳實施例中，抗體或抗原結合片段的三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR具有mAb TNV148、TNV14、TNV15、TNV196、TNV118、TNV32、TNV86中之至少一者的對應CDR之胺基酸序列，如本文中所述。此類抗體可藉由使用習知技術以將抗體的各種部分(例如CDR、框架)化學連接在一起、藉由使用習知重組DNA技術以製備並表現一(即一或多個)編碼該抗體之核酸分子、或藉由任何其他合適的方法來製備。
抗TNF抗體可包含具有經定義胺基酸序列的重鏈或輕鏈可變區中之至少一者。舉例而言，在一較佳實施例中，抗TNF抗體包含至少一個重鏈可變區(可選地具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列)及/或至少一個輕鏈可變區(可選地具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列)。可使用合適的方法製備結合至人類TNF且包含經定義之重鏈或輕鏈可變區的抗體，合適的方法諸如噬菌體展示(Katsube,Y.,et al.,Int J Mol.Med,1(5)：863-868(1998))或採用基因轉殖動物之方法，如所屬技術領域中已知的且/或如本文中所述。舉例而言，包含經功能性重排之人類免疫球蛋白重鏈轉殖基因、及包含來自人類免疫球蛋白輕鏈基因座之DNA的轉殖基因(可經歷功能性重排)之基因轉殖小鼠可用人類TNF或其片段免疫，以誘發抗體之生產。若有需要，抗體生產細胞可經單離，且融合瘤或其他永生化抗體生產細胞可如本文中所述且/或如所屬技術領域中已知的來製備。替代地，抗體、特定部分、或變體可使用編碼核酸或其部分在合適的宿主細胞中表現。
本發明亦關於抗體、抗原結合片段、免疫球蛋白鏈、及CDR，其包含與本文中所述之胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列。較佳 地，此類抗體或抗原結合片段及包含此類鏈或CDR之抗體可以高親和力(例如，KD小於或等於約10-9M)結合人類TNF。與本文中所述之序列實質上相同的胺基酸序列包括包含保守性胺基酸取代以及胺基酸缺失及/或插入之序列。保守性胺基酸取代係指用具有類似於第一胺基酸之化學及/或物理性質(例如，電荷、結構、極性、疏水性/親水性)之第二胺基酸置換第一胺基酸。保守性取代包括在下列群組內之一個胺基酸被另一個置換：離胺酸(K)、精胺酸(R)、及組胺酸(H)；天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)；天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、K、R、H、D、及E；丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、半胱胺酸(C)、及甘胺酸(G)；F、W、及Y；C、S、及T。
胺基酸代碼：構成本發明之抗TNF抗體的胺基酸通常係縮寫的。可藉由以胺基酸之單字母代碼、三字母代碼、名稱、或三個核苷酸密碼子指派該胺基酸來指示胺基酸名稱，如所屬技術領域中熟知的(參見Alberts,B.,et al.,Molecular Biology of The Cell,Third Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,1994)：
Figure 109108133-A0202-12-0043-1
Figure 109108133-A0202-12-0044-2
本發明之抗TNF抗體可包括一或多個胺基酸取代、缺失、或添加，無論是來自天然突變或人為操控，如本文中所指明。
當然，所屬技術領域中具有通常知識者會進行的胺基酸取代之數目取決於許多因素(包括以上所述者)。通常而言，針對任何給定的抗TNF抗體、片段、或變體之胺基酸取代、插入、或缺失的數目將不多於40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個，諸如1至30個或其中的任何範圍或值，如本文中所指明。
本發明之抗TNF抗體中功能必需之胺基酸可藉由所屬技術領域中已知的方法來識別，諸如定點誘變(site-directed mutagenesis)或丙胺酸掃描式誘變(alanine scanning mutagenesis)(例如，上述Ausubel第8、15章；Cunningham and Wells,Science 244：1081-1085(1989))。後者程序在分子中的每個殘基處引入單一丙胺酸突變。接著測試所得突變分子之生物活性，諸如但不限於至少一種TNF中和活性。對抗體結合至關重要之位點亦可藉由結構分析來識別，諸如結晶、核磁共振、或光親和標記(例如，Smith,et al.,J.Mol.Biol.224：899-904(1992)及de Vos,et al.,Science 255：306-312(1992))。
本發明之抗TNF抗體可包括但不限於至少一個部分、序列、或組合，其係選自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中之至少一者之1種至所有的連續胺基酸。
抗TNF抗體可進一步可選性地包含SEQ ID NO：7、8中之至少一者之70%至100%的連續胺基酸中之至少一者的多肽。
在一個實施例中，免疫球蛋白鏈或其部分(例如，可變區、CDR)之胺基酸序列與SEQ ID NO：7、8中之至少一者的對應鏈之胺基酸序列具有約70至100%同一性(例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、或其中的任何範圍或值)。舉例而言，輕鏈可變區之胺基酸序列可與SEQ ID NO：8之序列比較，或重鏈CDR3之胺基酸序列可與SEQ ID NO：7比較。較佳的是，使用合適的電腦演算法測定70至100%胺基酸同一性(即，90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、或其中的任何範圍或值)，如所屬技術領域中所已知的。
例示性重鏈及輕鏈可變區序列係提供於SEQ ID NO：7、8。本發明之抗體、或其特定變體可包含來自本發明之抗體的任何數量之連續胺基酸殘基，其中該數量係選自由抗TNF抗體中之連續殘基數量的10%至100%所組成之整數的群組。選擇性而言，此連續胺基酸的子序列的長度是至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多個胺基酸，或其中的任何範圍或數值。進言之，子序列的數量可以是從選自從1到20所組成群組的任意整數，例如至少2、3、4或5。
如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，本發明包括至少一種本發明之生物活性抗體。生物活性抗體可具有原始(非合成)、內源、或相關及已知抗體之至少20%、30%、或40%的專一活性，且較佳的是至少50%、60%、或70%，且最佳的是至少80%、90%、或95%至1000%。酶活性和受質專一性的試驗及定量方法已為熟習此項技術者所熟知。
在另一態樣中，本發明係關於人類抗體及抗原結合片段，如本文中所述，其係藉由有機部份之共價附接來修飾。此類修飾可產生具有改善之藥物動力學性質(例如，體內血清半衰期增加)的抗體或抗原結合片段。有機部份可係直鏈或支鏈親水性聚合基團、脂肪酸基團、或脂肪 酸酯基團。在具體實施例中，親水性聚合基團之分子量可係約800至約120,000道耳頓，且可係聚烷二醇(polyalkane glycol)(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、胺基酸聚合物、或聚乙烯吡咯啶酮(polyvinyl pyrolidone)，且脂肪酸及脂肪酸酯基團可包含約八個至約四十個碳原子。
本發明之經修飾抗體及抗原結合片段可包含一或多個直接或間接共價鍵結至抗體之有機部份。鍵結至本發明之抗體或抗原結合片段的各有機部份可獨立地係親水性聚合基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。如本文中所使用，用語「脂肪酸」涵蓋單羧酸及二羧酸。本文中所用之用語「親水性聚合基團(hydrophilic polymeric group)」係指比溶於辛烷更易溶於水中之有機聚合物。例如，聚離胺酸比溶於辛烷更易溶於水中。因此，本發明涵蓋經聚離胺酸共價附接修飾之抗體。適用於修飾本發明之抗體的親水性聚合物可係直鏈或支鏈的，且包括例如聚烷二醇(例如，PEG、單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-polyethylene glycol,mPEG)、PPG、及類似者)、碳水化合物(例如，葡聚醣、纖維素、寡醣、多醣、及類似者)、親水性胺基酸之聚合物(例如，聚離胺酸、聚精胺酸、聚天冬胺酸、及類似者)、聚烷烴氧化物(polyalkane oxide)(例如，聚環氧乙烷、聚環氧丙烷、及類似者)、及聚乙烯吡咯啶酮。較佳地，修飾本發明之抗體的親水性聚合物作為單獨的分子實體之分子量係約800至約150,000道耳頓。例如，可使用PEG5000及PEG20,000，其中下標係以道耳頓計的聚合物之平均分子量。親水性聚合基團可經一至約六個烷基、脂肪酸、或脂肪酸酯基團取代。經脂肪酸或脂肪酸酯基團取代之親水性聚合物可採用合適的方法製備。舉例而言，可將包含胺基團之聚合物偶合至脂肪酸或脂肪酸酯之羧酸酯，並可將脂肪酸或脂肪酸酯上之活化的羧酸酯(例如，用N,N-羰基二咪唑活化)偶合至聚合物上之羥基。
適用於修飾本發明之抗體的脂肪酸及脂肪酸酯可係飽和的或可含有一或多個不飽和單元。適用於修飾本發明之抗體的脂肪酸包括例如，正十二酸酯(C12，月桂酸酯)、正十四酸酯(C14，肉豆蔻酸酯)、正十八酸酯(C18，硬脂酸酯)、正二十酸酯(C20，花生酸酯)、正二十 二酸酯(C22，山楂酸酯(behenate))、正三十酸酯(C30)、正四十酸酯(C40)、順Δ9-十八酯(C18，油酸酯)、全順Δ5,8,11,14-二十烷四烯酸酯(C20，花生四烯酸酯(arachidonate))、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸、及類似者。合適的脂肪酸酯包括二羧酸的單酯，其包含直鏈或支鏈低級烷基。低級烷基可包含一至約十二個、較佳地一至約六個碳原子。
經修飾人類抗體及抗原結合片段可使用合適的方法製備，諸如藉由與一或多種改質劑反應。本文中所用之用語「改質劑(modifying agent)」係指包含活化基團之合適的有機基團(例如，親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。「活化基團(activating group)」係化學部份或官能基，其在適當條件下可與第二化學基團反應，從而在改質劑與第二化學基團之間形成共價鍵。例如，胺反應性活化基團包括親電子基團，諸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵基(氯基、溴基、氟基、碘基)、N-羥基琥珀醯亞胺酯(N-hydroxysuccinimidyl ester,NHS)、及類似者。可與硫醇反應的活化基團包括例如順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、丙烯醯基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)、及類似者。可將醛官能基偶合至含胺或醯肼之分子，且疊氮基團可與三價磷基反應，以形成胺基磷酸酯或磷醯亞胺鍵聯。將活化基團引入分子中之合適的方法在所屬技術領域中係已知的(參見例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press：San Diego,CA(1996))。活化基團可直接鍵結至有機基團(例如，親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或透過連接子部份，例如二價C1-C12基團，其中一或多個碳原子可經雜原子(諸如氧、氮、或硫)置換。合適的連接子部份包括例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-、及-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含連接子部份的改質劑可例如藉由使單-Boc-烷基二胺(例如，單-Boc-乙二胺、單-Boc-二胺基己烷)與脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)的存在下反應，以在游離胺與脂肪酸羧酸酯之間形成醯胺鍵來產生。Boc保護基可藉由用三氟乙酸(TFA)處理而自產物移除以暴露出一級胺，該一級胺可偶合至所述之另一羧酸鹽或可與順丁烯二酸酐反應，且所得產物經環化以產生 脂肪酸之經活化的順丁烯二醯亞胺衍生物。(參見例如Thompson等人之WO 92/16221，其完整教示係以引用方式併入本文中。)
本發明之經修飾抗體可藉由使人類抗體或抗原結合片段與改質劑反應來產生。舉例而言，有機部份可藉由採用胺反應性改質劑(例如，PEG之NHS酯)以非位點特異性方式鍵結至抗體。經修飾之人類抗體或抗原結合片段亦可藉由還原抗體或抗原結合片段之雙硫鍵(例如，鏈內雙硫鍵)來製備。接著可使經還原之抗體或抗原結合片段與硫醇反應性改質劑反應以產生本發明之經修飾抗體。包含與本發明之抗體之特定部位鍵結的有機部份之經修飾人類抗體及抗原結合片段可使用合適的方法來製備，諸如逆蛋白水解(reverse proteolysis)(Fisch et al.,Bioconjugate Chem.,3：147-153(1992)；Werlen et al.,Bioconjugate Chem.,5：411-417(1994)；Kumaran et al.,Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh et al.,Bioorg.Chem.,24(1)：59-68(1996)；Capellas et al.,Biotechnol.Bioeng.,56(4)：456-463(1997))、及於Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press：San Diego,CA(1996)中所述之方法。
抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody)對抗Tnf抗體組成物：除了單株或嵌合抗TNF抗體外，本發明亦關於對本發明之此類抗體具特異性的抗獨特型(抗Id)抗體。抗Id抗體係一種辨識獨特決定位(determinant)的抗體，獨特決定位通常與另一抗體之抗原結合區相關聯。可藉由用抗體或其含CDR區將與Id抗體來源相同的物種及遺傳類型(例如，小鼠品系)之動物免疫來製備抗Id。經免疫之動物會辨識並回應免疫抗體的獨特型決定位，並產生抗Id抗體。抗Id抗體亦可用作為「免疫原(immunogen)」，以在又另一動物中誘導免疫反應，而產生所謂的抗-抗Id抗體(anti-anti-Id antibody)。
抗Tnf抗體組成物：本發明亦提供至少一種抗TNF抗體組成物，其包含至少一、至少二、至少三、至少四、至少五、至少六、或更多種的其抗TNF抗體，如本文中所述且/或如所屬技術領域中已知的，其係以非天然存在的組成物、混合物、或形式提供。此類組成物包含非天然存在的組成物，其包含至少一或兩種抗TNF抗體胺基酸序列之全長、C-及/或N- 末端刪除的變體、域、片段、或特定變體，該抗TNF抗體胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8之70至100%的連續胺基酸、或其特定片段、域、或變體所組成之群組。較佳的抗TNF抗體組成物包括至少一或兩種全長、片段、域、或變體，其作為70至100%的SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6之抗TNF抗體序列、或其特定片段、域、或變體的至少一個含CDR或LBR部分。進一步較佳的組成物包含40至99%的70至100%之SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、或其特定片段、域、或變體中之至少一者。此類組成物百分比係以液體或乾溶液、混合物、懸浮液、乳化液、或膠體之重量、體積、濃度、體積莫耳濃度、重量莫耳濃度計，如所屬技術領域中已知的或如本文中所述。
本發明之抗TNF抗體組成物可進一步包含任何合適及有效量的包含至少一種抗TNF抗體之組成物或醫藥組成物中之至少一者至需要此調節、治療、或療法之細胞、組織、器官、動物、或患者，可選地進一步包含至少一種選自至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥劑(例如胺甲喋呤、金諾芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)、硫唑嘌呤(azathioprine)、依那西普(etanercept)、金硫蘋果酸鈉(gold sodium thiomalate)、羥氯喹硫酸酯、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine))、肌肉鬆弛劑、麻醉藥(narcotic)、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑(anesthetic)、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑(例如胺基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲劑(antiparasitic)、抗病毒劑、碳青黴烯(carbapenem)、頭孢菌素(cephalosporin)、氟喹諾酮(flurorquinolone)、巨環內酯(macrolide)、青黴素、磺醯胺、四環素、其他抗維生物劑)、抗牛皮癬劑(antipsoriatic)、皮質類固醇、同化類固醇(anabolic steroid)、糖尿病相關藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺劑、維生素、鈣相關荷爾蒙、止瀉劑、鎮咳劑、止吐劑、抗潰瘍劑、緩瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素(erythropieitin)(例如阿法依泊汀(epoetin alpha))、非格司亭(filgrastim)(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF、Leukine)、免疫作用、免疫球蛋白、免疫 抑制劑(例如巴利昔單抗(basiliximab)、環孢素(cyclosporine)、達利珠單抗(daclizumab))、生長激素、荷爾蒙替代藥物、雌激素受體調節劑、散瞳劑、睫狀肌麻痺劑(cycloplegic)、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥品、抗憂鬱劑、抗躁劑(antimanic agent)、抗精神病藥(antipsychotic)、抗焦慮劑(anxiolytic)、安眠藥、擬交感神經作用藥(sympathomimetic)、興奮劑、多奈派齊(donepezil)、塔克寧(tacrine)、氣喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、白三烯(leukotriene)抑制劑、甲基黃嘌呤(methylxanthine)、色甘酸(cromolyn)、腎上腺素或類似物、阿法鏈道酶(dornase alpha)(Pulmozyme)、細胞介素、或細胞介素拮抗劑。此類細胞介素之非限制性實例包括但不限於IL-1至IL-23中之任一者。合適的劑量係所屬技術領域中熟知的。參見例如Wells et al.,eds.,Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition,Appleton and Lange,Stamford,CT(2000)；PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)，該等參考文獻之各者全文以引用方式併入本文中。
此類抗癌或抗感染劑亦可包括與至少一種本發明之抗體相關聯、結合、共調配、或共投予的毒素分子。毒素可以可選地作用以選擇性地殺滅病理細胞或組織。病理細胞可係癌細胞或其他細胞。此類毒素可係但不限於經純化或重組毒素或毒素片段，其包含毒素的至少一種功能性細胞毒性域，毒素係例如選自下列中之至少一者：蓖麻毒素、白喉毒素、毒液毒素(venom toxin)、或細菌毒素。用語毒素亦包括由任何天然存在、突變、或重組細菌或病毒產生的內毒素及外毒素兩者，其可引起人類及其他哺乳動物的任何病理病況，包括毒素休克，其可導致死亡。此類毒素可包括但不限於：腸毒性大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)、熱穩定腸毒素(ST)、志賀氏菌(Shigella)細胞毒素、產氣單胞菌(Aeromonas)腸毒素、毒性休克症候群毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌腸毒素A(SEA)、B(SEB)、或C(SEC)、鏈球菌腸毒素、及類似者。此類細菌包括但不限於下列物種品系：腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸出血性大腸桿菌(例如，血清型0157：H7之菌株)、葡萄球菌屬物種(例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、釀膿葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes))、志賀氏菌屬物種(例如，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)、及宋內氏志賀氏菌(Shigella sonnei))、沙門氏菌屬(Salmonella)物種(例如，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholera-suis)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis))、梭菌屬(Clostridium)物種(例如，產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、艱難梭菌(Clostridium dificile)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum))、曲狀桿菌屬(Camphlobacter)物種(例如，空腸曲狀桿菌(Camphlobacter jejuni)、胎兒曲狀桿菌(Camphlobacter fetus))、螺旋桿菌屬(Heliocbacter)物種(例如，幽門螺旋桿菌(Heliocbacter pylori))、產氣單孢菌屬物種(例如，溫和型產氣單胞菌(Aeromonas sobria)、親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas caviae))、類志賀鄰單胞菌(Pleisomonas shigelloides)、小腸結腸炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)、弧菌屬(Vibrio)物種(例如，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、腸炎弧菌(Vibrio parahemolyticus))、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)物種、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、及鏈球菌(Streptococci)。參見例如Stein,ed.,INTERNAL MEDICINE,3rd ed.,pp 1-13,Little,Brown and Co.,Boston,(1990)；Evans et al.,eds.,Bacterial Infections of Humans：Epidemiology and Control,2d.Ed.,pp 239-254,Plenum Medical Book Co.,New York(1991)；Mandell et al,Principles and Practice of Infectious Diseases,3d.Ed.,Churchill Livingstone,New York(1990)；Berkow et al,eds.,The Merck Manual,16th edition,Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992；Wood et al,FEMS Microbiology Immunology,76：121-134(1991)；Marrack et al,Science,248：705-711(1990)，該等參考文獻之內容全文係以引用方式併入本文中。
本發明之抗TNF抗體化合物、組成物、或組合可進一步包含至少一種任何合適的輔助劑，諸如但不限於稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽類、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑、或類似者。醫藥上可接受之輔助劑係較佳的。此類無菌溶液之非限制性實例及製備方法係所屬技術領域中熟知的，諸如但不限於Gennaro,Ed.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,Mack Publishing Co.(Easton,PA)1990。可例行性地選擇適合所屬技術領域中熟知的或如本文所述之抗TNF抗體、片段、或變體組成物的投予模式、溶解度、及/或穩定性之醫藥上可接受之載劑。
可用於本發明組成物中之醫藥賦形劑及添加劑包括但不限於蛋白質、肽、胺基酸、脂質、及碳水化合物(例如糖類，包括單醣、雙醣、三醣、四醣、及寡醣；衍生的糖，諸如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖、及類似者；及多醣或糖聚合物)，其可單獨存在或組合存在，其單獨或組合構成1至99.99重量%或體積%。例示性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA)、重組人類白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白、及類似者。代表性胺基酸/抗體組分(其亦可發揮緩衝能力)包括丙胺酸、甘胺酸、精胺酸、甜菜鹼、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、離胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、阿斯巴甜、及類似者。一個較佳的胺基酸係甘胺酸。
適用於本發明之碳水化合物賦形劑包括例如單醣，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、及類似者；雙醣，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維雙糖、及類似者；多醣，諸如棉子糖、松三糖(melezitose)、麥芽糊精、葡聚醣、澱粉、及類似者；及醛醣醇，諸如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇(lactitol)、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇、及類似者用於本發明之較佳的碳水化合物賦形劑係甘露醇、海藻糖、及棉子糖。
抗TNF抗體組成物亦可包括緩衝劑或pH調節劑；一般而言，緩衝劑係自有機酸或鹼製備之鹽。代表性緩衝劑包括有機酸鹽，諸如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、或鄰苯二甲酸之鹽；Tris鹽酸鹽(胺丁三醇鹽酸鹽(tromethamine hydrochloride))、或磷酸鹽緩衝劑。用於本發明組成物之較佳的緩衝劑係有機酸鹽，諸如檸檬酸鹽。
此外，本發明之抗TNF抗體組成物可包括聚合賦形劑/添加劑，諸如聚乙烯吡咯啶酮、Ficoll(聚合糖)、葡萄糖結合劑(dextrate)(例如，環糊精，諸如2-羥丙基-β-環糊精)、聚乙二醇、調味劑、抗微生物 劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、界面活性劑(例如，聚山梨醇酯，諸如「TWEEN 20」及「TWEEN 80」)、脂質(例如，磷脂質、脂肪酸)、類固醇(例如，膽固醇)、及螯合劑(例如，EDTA)。
適用於根據本發明之抗TNF抗體、部分、或變體組成物中的這些及額外已知的醫藥賦形劑及/或添加劑係所屬技術領域中已知的，例如，如於「Remington：The Science & Practice ofPharmacy」，19th ed.,Williams & Williams,(1995)中、及於「Physician's Desk Reference」，52nd ed.,Medical Economics,Montvale,NJ(1998)中所列者，其等之揭露全文以引用方式併入本文中。較佳的載劑或賦形劑材料係碳水化合物(例如，醣類及醛醣醇)及緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)或聚合劑。
配方：如上所述，本發明提供穩定配方，其較佳係具有鹽水或所選的鹽之磷酸鹽緩衝劑、以及含有防腐劑之保存溶液及配方、以及適合於醫藥或獸醫用途之多用途保存配方，其於醫藥上可接受之配方中包含至少一種抗TNF抗體。保存配方含有至少一種已知的防腐劑或可選地選自由下列所組成之群組：至少一種酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苄醇、亞硝酸苯汞(phenylmercuric nitrite)、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、對羥苯甲酸烷酯(alkylparaben)(甲基、乙基、丙基、丁基、及類似者)、氯化苯二甲烴銨(benzalkonium chloride)、氯化本索寧(benzethonium chloride)、去水醋酸鈉、及硫柳汞(thimerosal)、或其等在水性稀釋劑中之混合物。可如所屬技術領域中已知的使用任何合適的濃度或混合物，諸如0.001至5%、或其中的任何範圍或值，諸如但不限於0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4.、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或其中的任何範圍或值。非限制性實例包括無防腐劑、0.1至2%間甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.1至3%苄醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001至0.5%硫柳汞(例如，0.005、0.01)、0.001至2.0%酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、 1.0%)、0.0005至1.0%對羥苯甲酸烷酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)、及類似者。
如上所述，本發明提供一種製品，其包含包裝材料及至少一個小瓶，該小瓶包含至少一種抗TNF抗體與規定的緩衝劑及/或防腐劑的溶液，其可選地在水性稀釋劑中，其中該包裝材料包含標籤，該標籤指示該溶液可保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小時、或更長的期間。本發明進一步包含一種製品，其包含包裝材料、包含經冷凍乾燥之至少一種抗TNF抗體的第一小瓶、及包含規定的緩衝劑或防腐劑之水性稀釋劑的第二小瓶，其中該包裝材料包含標籤，該標籤指示患者在水性稀釋劑中回溶(reconstitute)該至少一種抗TNF抗體，以形成可保持二十四小時或更長期間的溶液。
根據本發明使用之至少一種抗TNF抗體可藉由重組手段來生產，其包括自哺乳動物細胞或基因轉殖製劑，或可自其他生物來源純化，如本文中所述或如所屬技術領域中已知的。
本發明之產物中至少一種抗TNF抗體的範圍包括在回溶時產生的量，若是在潮濕/乾燥系統中，則濃度從約1.0μg/ml至約1000mg/ml，儘管較低及較高濃度係可操作的且係取決於預期的遞送媒劑，例如溶液配方會與經皮貼片、肺、經黏膜、或滲透或微泵方法不同。
較佳地，水性稀釋劑可選地進一步包含醫藥上可接受之防腐劑。較佳的防腐劑包括選自由下列所組成之群組者：酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苄醇、對羥苯甲酸烷酯(甲基、乙基、丙基、丁基、及類似者)、氯化苯二甲羥銨、氯化本索寧、去水醋酸鈉、及硫柳汞、或其混合物。用於配方中之防腐劑濃度係足以產生抗微生物效果的濃度。此類濃度係取決於所選擇的防腐劑，且可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易測定。
可以可選地且較佳地將其他賦形劑(例如等滲劑)、緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑增強劑添加至稀釋劑中。等滲劑(諸如甘油)常係以已知濃度使用。較佳地添加生理上耐受之緩衝劑以提供改善之pH控制。 配方可涵蓋廣泛範圍之pH，諸如約pH 4至約pH 10，且較佳的範圍係約pH5至約pH 9，且最佳的範圍係約6.0至約8.0。較佳地，本發明之配方具有在約6.8與約7.8之間的pH。較佳緩衝劑包括磷酸鹽緩衝劑，最佳的是磷酸鈉，尤其是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
其他添加劑諸如醫藥上可接受之增溶劑(如Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐單月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、及PEG(聚乙二醇))、或非離子性界面活性劑(諸如聚山梨醇酯20或80、或泊洛沙姆(poloxamer)184或188、Pluronic®多元醇)、其他嵌段共聚物、及螯合劑(諸如EDTA及EGTA)，可以可選地將其添加至配方或組成物以減少聚集。若使用泵或塑膠容器來投予配方，則這些添加劑係特別有用的。醫藥上可接受之界面活性劑的存在減輕蛋白質聚集的傾向。
本發明之配方可藉由包含將至少一種抗TNF抗體與防腐劑混合之程序來製備，該防腐劑係選自由下列所組成之群組：酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苄醇、對羥苯甲酸烷酯(甲基、乙基、丙基、丁基、及類似者)、氯化苯二甲烴銨、氯化苯索寧、去水醋酸鈉、及硫柳汞、或其等在水性稀釋劑中之混合物。至少一種抗TNF抗體與防腐劑在水性稀釋劑中之混合係使用習知溶解及混合程序進行。舉例而言，為了製備合適的配方，將測定量的緩衝溶液中之至少一種抗TNF抗體與緩衝溶液中之所欲防腐劑，以足以提供所欲濃度的蛋白質及防腐劑的數量組合。所屬技術領域中具有通常知識者會認知到此程序之變化。舉例而言，添加組分的順序(無論是否使用額外添加劑)、製備配方之溫度及pH皆係可針對所使用之濃度及投予手段進行最佳化的因素。
可將所主張之配方以澄清溶液、或以雙小瓶的方式提供給患者，該雙小瓶包含經冷凍乾燥之至少一種抗TNF抗體的小瓶，該至少一種抗TNF抗體係用第二小瓶(含有在水性稀釋劑中之水、防腐劑、及/或賦形劑，較佳地磷酸鹽緩衝劑及/或鹽水、及所選的鹽)回溶。單一溶液小瓶 或需要回溶之雙小瓶可多次重複使用，並可滿足患者治療之單一或多次循環，並因此可提供比目前可得者更方便的治療方案。
目前所主張之製品可用於立即投予至二十四小時或更長的期間內投予。因此，目前所主張之製品為患者提供明顯的好處。本發明之配方可以可選地安全儲存在約2至約40℃之溫度下且長時間保留蛋白質之生物活性，因此允許包裝標籤指示該溶液可在6、12、18、24、36、48、72、或96小時、或更長的期間內保持且/或使用。若使用保存稀釋劑，則此標籤可包括使用至多1至12個月、半年、一年半、及/或兩年。
本發明中至少一種抗TNF抗體之溶液可藉由包含將至少一種抗體在水性稀釋劑中混合的程序來製備。混合係使用習知溶解及混合程序來進行。舉例而言，為了製備合適的稀釋劑，將測定量的水或緩衝劑中之至少一種抗體，以足以提供所欲濃度的蛋白質及可選地防腐劑或緩衝劑的數量組合。所屬技術領域中具有通常知識者會認知到此程序之變化。舉例而言，添加組分的順序(無論是否使用額外添加劑)、製備配方之溫度及pH皆係可針對所使用之濃度及投予手段進行最佳化的因素。
可將所主張之產物以澄清溶液、或以雙小瓶的方式提供給患者，該雙小瓶包含經冷凍乾燥之至少一種抗TNF抗體的小瓶，該至少一種抗TNF抗體係用含有水性稀釋劑之第二小瓶回溶。單一溶液小瓶或需要回溶之雙小瓶可多次重複使用，並可滿足患者治療之單一或多次循環，並因此提供比目前可得者更方便的治療方案。
可將所主張之產物藉由提供給藥房、診所、或其他此類機構及設施來非直接地提供給患者澄清溶液、或雙小瓶，該雙小瓶包含經冷凍乾燥之至少一種抗TNF抗體的小瓶，該至少一種抗TNF抗體係用含有水性稀釋劑之第二小瓶回溶。在此情況下，澄清溶液的大小可高達一公升或甚至更大，提供一個大的貯器，可一次或多次從其中取出較小部分的至少一種抗體溶液，以轉移至較小的小瓶中，並由藥房或診所提供給他們的顧客及/或患者。
包含這些單一小瓶系統之認可裝置包括用於遞送溶液之筆式注射器裝置，諸如BD Pens、BD Autojector®、Humaject®、NovoPen®、B- D®Pen、AutoPen®、及OptiPen®、GenotropinPen®、Genotronorm Pen®、Humatro Pen®、Reco-Pen®、Roferon Pen®、Biojector®、iject®、J-tip Needle-Free Injector®、Intraject®、Medi-Ject®，例如由下列製造或開發：
Becton Dickensen(Franklin Lakes,NJ,www.bectondickenson.com)；
Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com；
Bioject,Portland,Oregon(www.bioject.com)；
Weston Medical(Peterborough,UK,www.weston-medical.com)、
Medi-Ject Corp(Minneapolis,MN,www.mediject.com)。
包含雙小瓶系統之認可裝置包括用於在匣中回溶經冷凍乾燥之藥物以遞送經回溶之溶液的筆式注射器系統，諸如HumatroPen®。
目前所主張之產物包括包裝材料。除了監管機構要求的資訊之外，包裝材料亦提供產品可使用的條件。本發明之包裝材料向患者提供在水性稀釋劑中回溶至少一種抗TNF抗體以形成溶液、及在2至24小時或更長的期間內使用用於兩個小瓶潮濕/乾燥產品之溶液的說明。針對單一小瓶溶液產品，標籤指示此類溶液可在2至24小時或更長的期間內使用。目前所主張之產物可用於人類醫藥產品用途。
本發明之配方可藉由包含將至少一種抗TNF抗體與所選之緩衝劑混合的程序來製備，所選之緩衝劑較佳地係含有鹽水或所選的鹽之磷酸鹽緩衝劑。至少一種抗體與緩衝劑在水性稀釋劑中之混合係使用習知溶解及混合程序進行。舉例而言，為了製備合適的配方，將測定量的水或緩衝劑中之至少一種抗體與水中之所欲緩衝劑，以足以提供所欲濃度的蛋白質及緩衝劑的數量組合。所屬技術領域中具有通常知識者會認知到此程序之變化。舉例而言，添加組分的順序(無論是否使用額外添加劑)、製備配方之溫度及pH皆係可針對所使用之濃度及投予手段進行最佳化的因素。
可將所主張之穩定或保存配方以澄清溶液、或以雙小瓶的方式提供給患者，該雙小瓶包含經冷凍乾燥之至少一種抗TNF抗體的小 瓶，該至少一種抗TNF抗體係用第二小瓶(含有在水性稀釋劑中之防腐劑或緩衝劑及賦形劑)回溶。單一溶液小瓶或需要回溶之雙小瓶可多次重複使用，並可滿足患者治療之單一或多次循環，並因此提供比目前可得者更方便的治療方案。
在本文中所述之穩定或保存配方或溶液中之至少一種抗TNF抗體可根據本發明經由各種遞送方法(包括SC或IM注射；經皮、肺、經黏膜、植入、滲透泵、匣、微泵、或所屬技術領域中具有通常知識者所理解之其他手段)投予至患者，如所屬技術領域中熟知的。
治療性應用：本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種TNF相關疾病的方法，其係如所屬技術領域中已知的或如本文中所述使用至少一種本發明之雙整合素抗體(dual integrin antibody)。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種TNF相關疾病之方法，該至少一種TNF相關疾病包括但不限於下列中之至少一者：肥胖、免疫相關疾病、心血管疾病、感染性疾病、惡性疾病、或神經性疾病。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種免疫相關疾病之方法，該至少一種免疫相關疾病包括但不限於下列中之至少一者：類風濕性關節炎、幼年型類風濕關節炎、全身性幼年型類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、僵直性脊椎炎、胃潰瘍、血清陰性關節病變(seronegative arthropathies)、骨關節炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗磷脂質症候群、虹膜睫狀體炎/眼色素層炎/視神經炎、特發性肺纖維化、全身性血管炎/韋格納氏肉芽腫(wegener's granulomatosis)、類肉瘤病、睪丸炎/輸精管結紮逆轉手術(vasectomy reversal procedure)、過敏性/異位性疾病、氣喘、過敏性鼻炎、濕疹、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病、全身性發炎反應症候群、敗血症候群、革蘭氏陽性敗血症(gram positive sepsis)、革蘭氏陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、嗜中性球低下發燒(neutropenic fever)、尿膿毒症 (urosepsis)、腦膜炎球菌血症(meningococcemia)、創傷/出血、燒傷、游離輻射暴露、急性胰臟炎、成人呼吸窘迫症候群、酒精性肝炎、慢性炎症病理、類肉瘤病、克隆氏病、鐮狀細胞貧血、糖尿病、腎病、異位性疾病、過敏反應、過敏性鼻炎、花粉熱、常年性鼻炎、結膜炎、子宮內膜異位、氣喘、蕁麻疹、全身性重度過敏、皮膚炎、惡性貧血、溶血性疾病、血小板減少症、任何器官或組織的移植排斥反應、腎臟移植排斥反應、心臟移植排斥反應、肝移植排斥反應、胰臟移植排斥反應、肺移植排斥反應、骨髓移植(BMT)排斥反應、皮膚同種異體移植排斥反應、軟骨移植排斥反應、骨移植排斥反應、小腸移植排斥反應、胎兒胸腺植入物排斥反應、副甲狀腺移植排斥反應、任何器官或組織的異種移植排斥反應、同種異體移植排斥反應、抗受體過敏反應、葛瑞夫茲氏病(Graves's disease)、雷諾氏病(Raynoud’s disease)、B型胰島素抗性糖尿病、氣喘、重症肌無力、抗體介導之細胞毒性、第III型過敏反應、全身性紅斑狼瘡、POEMS症候群(多發性神經病變、器官肥大、內分泌病變、單株球蛋白症(monoclonal gammopathy)、及皮膚變化症候群)、多發性神經病變、器官肥大、內分泌病變、單株球蛋白症、皮膚變化症候群、抗磷脂質症候群、天疱瘡、硬皮症、混合性結締組織疾病、特發性愛迪生氏病(idiopathic Addison's disease)、糖尿病、慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、原發性膽汁性肝硬化、白斑症(vitiligo)、血管炎、心肌梗塞後心切開術症候群(post-MI cardiotomy syndrome)、第IV型過敏、接觸性皮膚炎、過敏性肺炎、同種異體移植排斥反應、由於細胞內有機體而產生之肉芽腫、藥物敏感性、代謝性/特發性、威爾森氏症(Wilson's disease)、血鐵沉積症(hemachromatosis)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病視網膜病變、橋本氏甲狀腺炎(hashimoto's thyroiditis)、骨質疏鬆症、原發性膽汁性肝硬化、甲狀腺炎、腦脊髓炎、惡病質、囊腫纖維化、新生兒慢性肺部疾病、慢性阻塞性肺部疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、家族性噬血性淋巴組織細胞增生症(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、皮膚病況、牛皮癬、脫髮、腎病症候群、腎炎、腎絲球腎炎、急性腎衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、okt3療法、抗cd3療法、細胞介素療法、化學療法、放射 療法(例如，包括但不限於無力、貧血、惡病質、及類似者)、慢性水楊酸中毒、及類似者。參見例如The Merck Manual,12th-17th Editions,Merck & Company,Rahway,NJ(1972,1977,1982,1987,1992,1999)、Pharmacotherapy Handbook,Wells et al.,eds.,Second Edition,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(1998,2000)，各者全文以引用方式併入本文中。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種心血管疾病的方法，該至少一種心血管疾病包括但不限於下列中之至少一者：心臟頓抑症候群(cardiac stun syndrome)、心肌梗塞、充血性心臟衰竭、中風、缺血性中風、出血、動脈硬化、動脈粥樣硬化、再狹窄、糖尿病性動脈硬化性疾病、高血壓、動脈高血壓、腎血管性高血壓、暈厥、休克、心血管系統的梅毒、心臟衰竭、肺性心臟病、原發性肺高血壓、心律不整、心房異位搏動(atrial ectopic beat)、心房撲動(atrial flutter)、心房震顫(atrial fibrillation)(持續性或陣發性)、灌注後症候群、心肺繞通發炎反應(cardiopulmonary bypass inflammation response)、紊亂性或多源性心房性心搏過速、窄且規則的QRS心搏過速(regular narrow QRS tachycardia)、特異性心律不整(specific arrythmias)、心室纖維性顫動、希氏束心律不整(His bundle arrythmias)、房室傳導阻滯、束支傳導阻滯、心肌缺血性病症、冠狀動脈疾病、心絞痛、心肌梗塞、心肌病變、擴張性充血性心肌病變(dilated congestive cardiomyopathy)、限制性心肌病變(restrictive cardiomyopathy)、心臟瓣膜疾病、心內膜炎、心包膜疾病、心臟腫瘤、主動脈及周邊動脈瘤(aordic and peripheral aneurysm)、主動脈剝離、主動脈發炎、腹主動脈及其分支的閉塞、周邊血管病症、阻塞性動脈病症、周邊動脈粥樣硬化疾病(peripheral atherlosclerotic disease)、血栓閉塞性脈管炎、功能性周邊動脈病症(functional peripheral arterial disorder)、雷諾氏(Raynaud's)現象及疾病、手足發紺、肢端紅痛症、靜脈疾病、靜脈栓塞、靜脈曲張、動靜脈瘻管、淋巴水腫(lymphederma)、脂肪水腫(lipedema)、不穩定型心絞痛、再灌注損傷(reperfusion injury)、幫浦後症候群(post pump syndrome)、缺血再灌注損傷、及類似者。此方法可以可選地 包含向需要此調節、治療、或療法之細胞、組織、器官、動物、或患者投予有效量之包含至少一種抗TNF抗體的組成物或醫藥組成物。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種感染性疾病的方法，該至少一種感染性疾病包括但不限於下列中之至少一者：急性或慢性細菌感染、急性及慢性寄生蟲或感染過程(包括細菌、病毒、及真菌感染)、HIV感染/HIV神經病變、腦膜炎、肝炎(A、B、或C、或類似者)、敗血性關節炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎(epiglottitis)、大腸桿菌0157：h7、溶血性尿毒症候群/血栓溶解性血小板減少性紫癜、瘧疾、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever)、利什曼病(leishmaniasis)、麻風、毒性休克症候群、鏈球菌肌炎(streptococcal myositis)、氣性壞疽(gas gangrene)、結核分支桿菌(mycobacterium tuberculosis)、細胞內禽結核分枝桿菌(mycobacterium avium intracellulare)、肺囊蟲肺炎(pneumocystis carinii pneumonia)、骨盆腔發炎性疾病、睪丸炎/附睪炎、退伍軍人症桿菌(legionella)、萊姆病、a型流行性感冒、艾司坦-巴爾病毒(epstein-barr virus)、病毒關聯性吞噬血症候群、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、及類似者。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種惡性疾病的方法，該至少一種惡性疾病包括但不限於下列中之至少一者：白血病、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、B細胞、T細胞、或FAB ALL、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)、髮樣細胞白血病、骨髓發育不良症候群(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、惡性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、結腸直腸癌、胰腺癌、鼻咽癌、惡性組織細胞增生症(malignant histiocytosis)、伴腫瘤症候群(paraneoplastic syndrome)/惡性疾病之高血鈣症(hypercalcemia of malignancy)、實體腫瘤、腺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、血管瘤、轉移性疾病、癌症相關骨吸收、癌症相關骨骼疼痛、及類似者。
本發明亦提供一種用於在細胞、組織、器官、動物、或患者中調節或治療至少一種神經性疾病的方法，該至少一種神經性疾病包括但不限於下列中之至少一者：神經退化性疾病、多發性硬化症、偏頭痛(migraine headache)、AIDS失智症複合症(AIDS dementia complex)、髓鞘脫失病(諸如多發性硬化症及急性橫貫性脊髓炎)；錐體外及小腦病症，諸如皮質脊髓系統的病變；基底核(basal ganglia)之病症或小腦病症；過動型運動障礙(hyperkinetic movement disorder)，諸如亨汀頓氏舞蹈症(Huntington's Chorea)及老年性舞蹈症(senile chorea)；藥物誘導之運動障礙，諸如由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘導者；運動不足型運動障礙(hypokinetic movement disorder)，諸如帕金森氏症(Parkinson's disease)；進行性上眼神經核麻痺症；小腦之結構病變；脊髓小腦退化(spinocerebellar degeneration)，諸如脊髓失調症(spinal ataxia)、Friedreich氏失調症、小腦皮質退化、多發性系統退化(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager、及Machado-Joseph)；全身性病症(雷夫蘇姆氏病(Refsum's disease)、無β脂蛋白血症(abetalipoprotemia)、運動失調(ataxia)、毛細血管擴張、及粒線體多系統病症)；脫髓鞘性核心病症(demyelinating core disorders)，諸如多發性硬化症、急性橫貫性脊髓炎；及運動單位病症，諸如神經性肌萎縮症(neurogenic muscular atrophy)(前角細胞退化(anterior horn cell degeneration)，諸如肌萎縮性脊髓側索硬化症、嬰兒型脊髓性肌萎縮症、及青少年型脊髓性肌萎縮症；阿玆海默症(Alzheimer's disease)；中年唐氏症(Down's Syndrome in middle age)；瀰漫性路易氏體疾病(Diffuse Lewy body disease)；路易氏體型老年失智症；韋尼克-柯沙可夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)；慢性酒精中毒；庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)；亞急性硬化性泛腦炎(subacute sclerosing panencephalitis)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerrorden-Spatz disease)；及拳擊手型失智症(Demgrea pugilistica)、及類似者。此方法可以可選地包含向需要此調節、治療、或療法之細胞、組織、器官、動物、或患者投予有效量之包含至少一種TNF抗體、或特定部分、或變體的組成物或醫藥組成物。參見例如The Merck Manual,16th Edition,Merck & Company,Rahway,NJ(1992)
本發明之任何方法可包含向需要此調節、治療、或療法之細胞、組織、器官、動物、或患者投予有效量之包含至少一種抗TNF抗體的組成物或醫藥組成物。此方法可以可選地進一步包含共投予或組合療法以用於治療此類免疫疾病，其中至少一種抗TNF抗體、其特定部分、或變體的投予進一步包含在至少一種選自下列者之前、同時、及/或之後投予：至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥劑(例如胺甲喋呤、金諾芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)、硫唑嘌呤(azathioprine)、依那西普(etanercept)、金硫蘋果酸鈉(gold sodium thiomalate)、羥氯喹硫酸酯、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine))、肌肉鬆弛劑、麻醉藥(narcotic)、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑(anesthetic)、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑(例如胺基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲劑(antiparasitic)、抗病毒劑、碳青黴烯(carbapenem)、頭孢菌素(cephalosporin)、氟喹諾酮(flurorquinolone)、巨環內酯(macrolide)、青黴素、磺醯胺、四環素、其他抗維生物劑)、抗牛皮癬劑(antipsoriatic)、皮質類固醇、同化類固醇(anabolic steroid)、糖尿病相關藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺劑、維生素、鈣相關荷爾蒙、止瀉劑、鎮咳劑、止吐劑、抗潰瘍劑、緩瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素(erythropieitin)(例如阿法依泊汀(epoetin alpha))、非格司亭(filgrastim)(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF、Leukine)、免疫作用、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗(basiliximab)、環孢素(cyclosporine)、達利珠單抗(daclizumab))、生長激素、荷爾蒙替代藥物、雌激素受體調節劑、散瞳劑、睫狀肌麻痺劑(cycloplegic)、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥品、抗憂鬱劑、抗躁劑(antimanic agent)、抗精神病藥(antipsychotic)、抗焦慮劑(anxiolytic)、安眠藥、擬交感神經作用藥(sympathomimetic)、興奮劑、多奈派齊(donepezil)、塔克寧(tacrine)、氣喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、白三烯(leukotriene)抑制劑、甲基黃嘌呤(methylxanthine)、色甘酸(cromolyn)、腎上腺素或類似物、阿法鏈道酶 (domase alpha)(Pulmozyme)、細胞介素、或細胞介素拮抗劑。合適的劑量係所屬技術領域中熟知的。參見例如Wells et al.,eds.,Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition,Appleton and Lange,Stamford,CT(2000)；PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)，該等參考文獻之各者全文以引用方式併入本文中。
適合於本發明之組成物、組合療法、共投予、裝置、及/或方法的TNF拮抗劑(進一步包含至少一種本發明之抗體、其特定部分、及變體)包括但不限於抗TNF抗體、其抗原結合片段、及特異性結合至TNF的受體分子；預防及/或抑制TNF合成、TNF釋放、或其在目標細胞上之作用的化合物，諸如沙利度胺(thalidomide)、替尼達普(tenidap)、磷酸二酯酶抑制劑(例如，己酮可可鹼(pentoxifylline)及咯利普蘭(rolipram))、A2b腺苷受體促效劑、及A2b腺苷受體增強劑；預防及/或抑制TNF受體傳訊之化合物，諸如促分裂原活化蛋白(mitogen activated protein,MAP)激酶抑制劑；阻斷及/或抑制膜TNF切割之化合物，諸如金屬蛋白酶抑制劑；阻斷及/或抑制TNF活性之化合物，諸如血管收縮素轉化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制劑(例如，卡托普利(captopril))；及阻斷及/或抑制TNF生產及/或合成之化合物，諸如MAP激酶抑制劑。
如本文中所使用，「抗腫瘤壞死因子抗體(tumor necrosis factor antibody)」、「TNF抗體」、「TNFα抗體」、或片段及類似者在體外、原位、且/或較佳地在體內減少、阻斷、抑制、終止、或干擾TNFα活性。舉例而言，本發明之合適的TNF人類抗體可結合TNFα，並包括特異性結合至TNFα的抗TNF抗體、其抗原結合片段、及其特定突變體或域。合適的TNF抗體或片段亦可減少、阻斷、終止、干擾、預防、及/或抑制TNF之RNA、DNA、或蛋白質合成、TNF釋放、TNF受體傳訊、膜TNF切割、TNF活性、TNF生產及/或合成。
嵌合抗體cA2係由高親和性中和小鼠抗人類TNFα IgG1抗體的抗原結合可變區(指定為A2)及人類IgG1 κ免疫球蛋白的恆定區組成。人類IgG1的Fc區域提升同種異體抗體(allogeneic antibody)效應物功能，增 加循環血清半衰期，並降低抗體的免疫原性。嵌合抗體cA2的親留力及表位特異性係衍生自鼠類抗體A2的可變區。在一具體實施例中，編碼鼠類抗體A2之可變區的核酸較佳來源係A2融合瘤細胞系。
嵌合A2(cA2)以劑量依賴性方式中和天然及重組人類TNFα兩者的細胞毒性作用。從嵌合抗體cA2與重組人類TNFα的結合檢定，計算嵌合抗體cA2之親和力常數為1.04×1010M-1。用於藉由競爭性抑制測定單株抗體特異性及親和性之較佳方法可見於Harlow,et al.,antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1988；Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,New York,(1992-2000)；Kozbor et al.,Immunol.Today,4：72-79(1983)；Ausubel et al.,eds.Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York(1987-2000)；及Muller,Meth.Enzymol.,92：589-601(1983)，該等參考文獻全文以引用方式併入本文中。
在一具體實施例中，鼠類單株抗體A2係由指定為c134A之細胞系產生。嵌合抗體cA2係由指定為c168A之細胞系產生。
可用於本發明之單株抗TNF抗體之額外實例係描述於所屬技術領域中(參見例如美國專利第5,231,024號；Möller,A.et al.,Cytokine 2(3)：162-169(1990)；美國專利申請案第07/943,852號(1992年9月11日申請)；Rathjen等人之國際公開案第WO 91/02078號(1991年2月21日公開)；Rubin等人之歐洲專利公開案第0 218 868號(1987年4月22日公開)；Yone等人之歐洲專利公開案第0 288 088號(1988年10月26日)；Liang,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager,et al.,Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly et al.,Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman,et al.,Hybridoma 6：489-507(1987)；及Hirai,et al.,J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，該等參考文獻全文以引用方式併入本文中)。
TNF受體分子：可用於本發明之較佳TNF受體分子係以高親和力結合TNFα者(參見例如Feldmann等人之國際公開案第WO 92/07076 號(1992年4月30日公開)；Schall et al.,Cell 61：361-370(1990)；及Loetscher et al.,Cell 61：351-359(1990)，該等參考文獻全文以引用方式併入本文中)，且其可選地擁有低免疫原性。具體而言，55kDa(p55 TNF-R)及75kDa(p75 TNF-R)TNF細胞表面受體可用於本發明。這些受體之截短形式(包含受體之胞外域(ECD)或其功能性部分(參見例如，Corcoran et al.,Eur.J.Biochem.223：831-840(1994)))亦可用於本發明。已在尿液及血清中偵測到包含ECD之TNF受體的截短形式為30kDa及40kDa TNFα抑制性結合蛋白(Engelmann,H.et al.,J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。TNF受體多聚分子及TNF免疫受體融合分子、以及其衍生物及片段或部分係可用於本發明之方法及組成物的TNF受體分子之額外實例。可用於本發明之TNF受體分子的特徵在於彼等具有良好至優異的症狀緩解及低毒性之長期治療患者的能力。低免疫原性及/或高親和力、以及其他未定義之性質可有助於達成治療結果。
可用於本發明之TNF受體多聚分子包含經由一或多個多肽連接子或其他非肽連接子(諸如聚乙二醇(PEG))連接的二或更多種TNF受體之ECD的所有或功能性部分。多聚分子可進一步包含經分泌蛋白質之信號肽以引導多聚分子的表現。這些多聚分子及其生產方法已描述於美國專利申請案第08/437,533號(1995年5月9日申請)，該申請案之內容全文以引用方式併入本文中。
可用於本發明之方法及組成物的TNF免疫受體融合分子包含一或多種免疫球蛋白分子的至少一部分、及一或多種TNF受體的所有或功能性部分。這些免疫受體融合分子可組裝為單體、或異多聚體或同多聚體。免疫受體融合分子亦可係單價或多價的。此TNF免疫受體融合分子之實例係TNF受體/IgG融合蛋白。TNF免疫受體融合分子及其生產方法已描述於所屬技術領域中(Lesslauer et al.,Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Peppel et al.,J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219(1994)；Butler et al.,Cytokine 6(6)：616-623(1994)；Baker et al.,Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler等人之美 國專利第5,447,851號；及美國專利申請案第08/442,133號(1995年5月16日申請)，該等參考文獻之各者全文以引用方式併入本文中)。用於生產免疫受體融合分子之方法亦可見於Capon等人之美國專利第5,116,964號；Capon等人之美國專利第5,225,538號；及Capon et al.,Nature 337：525-531(1989)，該等參考文獻全文以引用方式併入本文中)。
TNF受體分子之功能等效物、衍生物、片段、或區係指TNF受體分子的部分、或編碼TNF受體分子之TNF受體分子序列的部分，其具有足夠的大小及序列以在功能上類似於可用於本發明之TNF受體分子(例如，以高親和力結合TNFα並具有低免疫原性)。TNF受體分子之功能等效物亦包括經修飾的TNF受體分子，其功能上類似於可用於本發明之TNF受體分子(例如，以高親和力結合TNFα並具有低免疫原性)。舉例而言，TNF受體分子之功能等效物可含有「沉默(SILENT)」密碼子或一或多個胺基酸取代、缺失、或添加(例如，用一個酸性胺基酸取代另一個酸性胺基酸；或用一個編碼相同或不同疏水性胺基酸之密碼子取代另一個編碼疏水性胺基酸之密碼子)。參見Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience,New York(1987-2000)。
細胞介素包括任何已知的細胞介素。參見例如CopewithCytokines.com。細胞介素拮抗劑包括但不限於任何抗體、片段、或模擬物、任何可溶性受體、片段、或模擬物、任何小分子拮抗劑、或其任何組合。
治療性處理：本發明之任何方法可包含一種用於治療TNF介導之病症，其包含向需要此調節、治療、或療法之細胞、組織、器官、動物、或患者投予有效量之包含至少一種抗TNF抗體的組成物或醫藥組成物。此方法可以可選地進一步包含共投予或組合療法以用於治療此類免疫疾病，其中至少一種抗TNF抗體、其特定部分、或變體的投予進一步包含在至少一種選自下列者之前、同時、及/或之後投予：至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥劑(例如胺甲喋呤、金諾芬(auranofin)、 金硫葡糖(aurothioglucose)、硫唑嘌呤(azathioprine)、依那西普(etanercept)、金硫蘋果酸鈉(gold sodium thiomalate)、羥氯喹硫酸酯、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine))、肌肉鬆弛劑、麻醉藥(narcotic)、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑(anesthetic)、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑(例如胺基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲劑(antiparasitic)、抗病毒劑、碳青黴烯(carbapenem)、頭孢菌素(cephalosporin)、氟喹諾酮(flurorquinolone)、巨環內酯(macrolide)、青黴素、磺醯胺、四環素、其他抗維生物劑)、抗牛皮癬劑(antipsoriatic)、皮質類固醇、同化類固醇(anabolic steroid)、糖尿病相關藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺劑、維生素、鈣相關荷爾蒙、止瀉劑、鎮咳劑、止吐劑、抗潰瘍劑、緩瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素(erythropieitin)(例如阿法依泊汀(epoetin alpha))、非格司亭(filgrastim)(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF、Leukine)、免疫作用、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗(basiliximab)、環孢素(cyclosporine)、達利珠單抗(daclizumab))、生長激素、荷爾蒙替代藥物、雌激素受體調節劑、散瞳劑、睫狀肌麻痺劑(cycloplegic)、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥品、抗憂鬱劑、抗躁劑(antimanic agent)、抗精神病藥(antipsychotic)、抗焦慮劑(anxiolytic)、安眠藥、擬交感神經作用藥(sympathomimetic)、興奮劑、多奈派齊(donepezil)、塔克寧(tacrine)、氣喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、白三烯(leukotriene)抑制劑、甲基黃嘌呤(methylxanthine)、色甘酸(cromolyn)、腎上腺素或類似物、阿法鏈道酶(dornase alpha)(Pulmozyme)、細胞介素、或細胞介素拮抗劑。
一般而言，藉由投予有效量或劑量之至少一種抗TNF抗體組成物來實現病理病況的治療，該組成物之平均總量為每劑量每公斤患者至少約0.01至500毫克之範圍的至少一種抗TNF抗體，且較佳為每單次或多次投予每公斤患者至少約0.1至100毫克抗體，取決於組成物中所含有的具體活性。替代地，有效血清濃度可包含每單次或多次投予0.1至5000μg/ml血清濃度。合適的劑量對醫療從業者而言係已知的，且當然將取決於特定疾病狀態、所投予之組成物之具體活性、及經歷治療之具體患者。在一些 情況下，為達到所欲的治療量，可能必須提供重複投予，即重複的特定監測或計量劑量之個別投予，其中重複個別投予直到達到所欲之每日劑量或效果。
較佳的劑量可以可選地包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、及/或100至500mg/kg/投予、或其任何範圍、值、或分率，或達到每單次或多次投予之血清濃度為0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、及/或5000μg/ml血清濃度、或其任何範圍、值、或分率。
替代地，所投予之劑量可取決於已知因素而變化，諸如具體藥劑之藥效動力學特性及其投予模式及途徑；接受者之年齡、健康、及重量；症狀之本質及程度、並行治療之種類、治療頻率、及所欲效果。通常活性成分之劑量可係每公斤體重約0.1至100毫克。通常每次投予每公斤0.1至50、且較佳地0.1至10毫克，或以持續釋放形式可有效獲得所欲結果。
作為非限制性實例，可以0.1至100mg/kg之至少一種本發明之抗體作為一次性或週期性劑量提供人類或動物之治療，諸如0.5、 0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、或100mg/kg，其係每天提供，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40天中之至少一天提供，或替代地或額外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、或52週中之至少一週提供，或替代地或額外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20年中之至少一年提供，或其任何組合，並使用單次、輸注、或重複劑量。
適用於內部投予的劑量形式(組成物)通常含有每單位或容器約0.1毫克至約500毫克的活性成分。在這些醫藥組成物中，以組成物之總重量計，活性成分通常以約0.5至99.999重量%的量存在。
針對腸胃外投予，抗體可經調配為溶液、懸浮液、乳化液、或經冷凍乾燥之粉劑，其與醫藥上可接受的腸胃外媒劑結合、或分開提供。此類媒劑之實例係水、鹽水、林格氏液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、及1至10%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體及諸如不揮發油之非水性媒劑。媒劑或經冷凍乾燥之粉劑可含有維持等滲性(例如，氯化鈉、甘露醇)及化學穩定性(例如，緩衝劑及防腐劑)之添加劑。配方係藉由已知或合適的技術來滅菌。
合適的醫藥載劑係描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,A.Osol(此領域中之標準參考文獻)之最新版本中。
替代性投予：可根據本發明使用許多已知及經開發的投予模式，以投予醫藥有效量的至少一種根據本發明之抗TNF抗體。雖然在下列敘述中使用肺部投予，但可根據本發明使用其他投予模式而有合適的結果。
本發明之TNF抗體可使用適合於藉由吸入或本文中所述或所屬技術領域中已知的其他模式投予之各種裝置及方法中之任一者在載劑(作為溶液、乳化液、膠體、或懸浮液、或作為乾粉)中遞送。
腸胃外配方及投予：用於腸胃外投予之配方可含有常見的賦形劑無菌水或鹽水、聚烷二醇(諸如聚乙二醇)、蔬菜來源油、氫化萘、及類似者。可根據已知方法藉由使用適當的乳化劑或增濕劑及懸浮劑來製備用於注射之水性或油性懸浮液。用於注射之藥劑可係無毒、可非口服投予之稀釋劑，諸如水溶液、或無菌注射溶液、或於溶劑中之懸浮液。作為可用的媒劑或溶劑，可使用水、林格氏液、等滲鹽水等；作為尋常溶劑或懸浮溶劑，可使用無菌非揮發性油。為了這些目的，可使用任何種類的非揮發性油及脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的單酸甘油酯、或二酸甘油酯、或三酸甘油酯。親本投予在所屬技術領域中係已知的，且包括但不限於習知注射手段、如於美國專利第5,851,198號中所述之氣體加壓無針式(gas pressured needle-less)注射裝置、及如於美國專利第5,839,446號中所述之雷射穿孔器裝置，其全文以引用方式併入本文中。
替代性遞送：本發明進一步係關於至少一種抗TNF抗體之投予，其藉由腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節內(intrarticular)、支氣管內、腹腔內、囊內(intracapsular)、軟骨內、體腔內(intracavitary)、腔內(intracelial)、小腦內(intracelebellar)、腦室內(intracerebroventricular)、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包腔內、腹腔內、胸腔內(intrapleural)、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、椎管內、滑膜腔內(intrasynovial)、胸腔內、子宮內、膀胱內、推注、陰道、直腸、經頰(buccal)、舌下、鼻內、或經皮手段。可製備至少一種抗TNF抗體組成物以用於腸胃外(皮下、肌內、或靜脈內)或任何其他投予，特別是以液體溶液或懸浮液的形式；用於陰道或直腸投予，特別是半固體形式，諸如但不限於乳霜及栓劑；用於經頰或舌下投予，諸如但不限於以錠劑或膠囊的形式；或鼻內地，諸如但不限於以粉劑、鼻滴劑、或氣霧劑、或某些藥劑的形式；或經皮，諸如但不限於凝膠、軟膏、乳液、懸浮液、 或貼片遞送系統，其具有化學增強劑(諸如二甲基亞碸)以修飾皮膚結構或增加經皮貼片中之藥物濃度(Junginger等人，於「Drug Permeation Enhancement」；Hsieh,D.S.,Eds.,pp.59-90(Marcel Dekker,Inc.New York 1994，全文以引用方式併入本文中)，或具有能夠使含有蛋白質及肽之配方施加至皮膚上之氧化劑(WO 98/53847)，或施加電場以產生暫時性傳輸途徑(諸如電穿孔)、或增加帶電藥物穿過皮膚之移動性(諸如離子電滲(iontophoresis))，或施加超音波(諸如超音波導入(sonophoresis))(美國專利第4,309,989號及第4,767,402號)(以上出版物及專利全文以引用方式併入本文中)。
肺部/鼻腔投予：針對肺部投予，較佳地以有效到達肺或鼻竇下呼吸道之粒徑遞送至少一種抗TNF抗體組成物。根據本發明，至少一種抗TNF抗體可藉由所屬技術領域中已知用於藉由吸入投予治療劑之各種吸入或鼻用裝置中之任一者來遞送。這些能夠在患者的竇腔或肺泡中沉積氣霧化配方的裝置包括計量劑量吸入器(metered dose inhaler)、霧化器(nebulizer)、乾粉產生器、噴霧器(sprayer)、及類似者。適用於引導抗體之肺部或鼻腔投予的其他裝置亦係所屬技術領域中已知的。所有此類裝置皆可使用適合於施配呈氣霧劑之抗體的投予之配方。此類氣霧劑可包含溶液(水性及非水性兩者)或固體粒子。計量劑量吸入器(像是Ventolin®計量劑量吸入器)一般使用推進劑氣體並需要在吸氣期間致動(參見例如WO 94/16970、WO 98/35888)。乾粉吸入器(像是TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler®(Glaxo)、Diskus®(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics銷售之裝置、及Spinhaler®粉末吸入器(Fisons))使用混合粉末之呼吸致動(US 4668218 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo、WO 94/08552 Dura、US 5458135 Inhale、WO 94/06498 Fisons，全文以引用方式併入本文中)。霧化器(像是AERxTM Aradigm、Ultravent®霧化器(Mallinckrodt)、及Acorn II®霧化器(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm,WO 97/22376)，以上參考文獻全文以引用方式併入本文中)自溶液產生氣霧劑，而計量劑量吸入器、乾粉吸入器等產生小粒子氣霧劑。這些市售可得之吸入裝置的具體實例旨在作為適合於實施本發明之具體裝置 的代表，而非意圖限制本發明之範疇。較佳地，包含至少一種抗TNF抗體之組成物係藉由乾粉吸入器或噴霧器遞送。用於投予至少一種本發明之抗體的吸入裝置有數個所欲特徵。舉例而言，藉由吸入裝置之遞送有利地係可靠的、可再現的、及準確的。吸入裝置可以可選地遞送小的乾燥粒子，例如小於約10μm、較佳地約1至5μm，以實現良好的吸入性。
以噴霧劑形式投予TNF抗體組成物：可藉由迫使至少一種抗TNF抗體之懸浮液或溶液在壓力下通過噴嘴來產生包括TNF抗體組成物蛋白質之噴霧劑。可選擇噴嘴尺寸及構型、所施加的壓力、及液體進料速率來達成所欲之輸出及粒徑。可例如藉由與毛細管或噴嘴進料連接的電場來產生電灑。有利地，藉由噴霧器遞送之至少一種抗TNF抗體組成物蛋白質之粒子粒徑小於約10μm，較佳地在約1μm至約5μm的範圍內，且最佳地在約2μm至約3μm的範圍內。
適合於與噴霧器一起使用之至少一種抗TNF抗體組成物蛋白質之配方一般包括於水溶液中之抗體組成物蛋白質，其濃度為每ml溶液約0.1mg至約100mg之至少一種抗TNF抗體組成物蛋白質，或單位為mg/gm，或其中之任何範圍或值，例如但不限於.1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、或100mg/ml或mg/gm。配方可包括試劑，諸如賦形劑、緩衝劑、等滲劑、防腐劑、界面活性劑、及較佳地鋅。配方亦可包括用於穩定抗體組成物蛋白質之賦形劑或試劑，諸如緩衝劑、還原劑、主體蛋白質(bulk protein)、或碳水化合物。可用於調配抗體組成物蛋白質之主體蛋白質包括白蛋白、魚精蛋白(protamine)、或類似者。可用於調配抗體組成物蛋白質之典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、或類似者。抗體組成物蛋白質配方亦可包括界面活性劑，其可降低或預防由形成氣霧劑之溶液氣霧化所引起的抗體組成物蛋白質之表面誘導聚集。可採用各種習知的界面活性劑，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯及醇、及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量的範圍通常會在配方的0.001與14重量%之間。用於本發明目的之尤佳的界面活性劑係聚氧乙烯 山梨醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、或類似者。用於蛋白質(諸如TNF抗體、或特定部分、或變體)之配方之所屬技術領域中已知的額外試劑亦可包括在配方中。
藉由霧化器投予TNF抗體組成物：抗體組成物蛋白質可藉由霧化器(諸如噴射霧化器或超音波霧化器)投予。一般而言，在噴射霧化器中，使用壓縮空氣源來產生通過孔口之高速空氣噴射。隨著氣體膨脹超過噴嘴，產生低壓區，該低壓區透過連接至液體貯器之毛細管汲取抗體組成物蛋白質之溶液。來自毛細管之液體流在離開毛細管時被剪切成不穩定細絲及液滴，而產生氣霧劑。可採用一系列構型、流速、及擋板類型以自給定的噴射霧化器得到所欲性能特性。在超音波霧化器中，使用高頻電能來產生振動的機械能，一般採用壓電轉換器。此能量係直接或透過偶合流體(coupling fluid)傳輸至抗體組成物蛋白質之配方，而產生包括抗體組成物蛋白質之氣霧劑。有利地，藉由霧化器遞送之抗體組成物蛋白質之粒子粒徑小於約10μm，較佳地在約1μm至約5μm的範圍內，且最佳地在約2μm至約3μm的範圍內。
適合於與霧化器(噴射或超音波)一起使用之至少一種抗TNF抗體之配方一般包括濃度為每ml溶液約0.1mg至約100mg之至少一種抗TNF抗體蛋白質。配方可包括試劑，諸如賦形劑、緩衝劑、等滲劑、防腐劑、界面活性劑、及較佳地鋅。配方亦可包括用於穩定至少一種抗TNF抗體組成物蛋白質之賦形劑或試劑，諸如緩衝劑、還原劑、主體蛋白質、或碳水化合物。可用於調配至少一種抗TNF抗體組成物蛋白質之主體蛋白質包括白蛋白、魚精蛋白、或類似者。可用於調配至少一種抗TNF抗體之典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、或類似者。至少一種抗TNF抗體配方亦可包括界面活性劑，其可降低或預防由形成氣霧劑之溶液氣霧化所引起的至少一種抗TNF抗體之表面誘導聚集。可採用各種習知的界面活性劑，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯及醇、及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量的範圍通常會在配方的0.001與4重量%之間。用於本發明目的之尤佳的界面活性劑係聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚 山梨醇酯20、或類似者。用於蛋白質(諸如抗體蛋白質)之配方之所屬技術領域中已知的額外試劑亦可包括在配方中。
藉由計量劑量吸入器投予TNF抗體組成物：在計量劑量吸入器(metered dose inhaler,MDI)中，推進劑、至少一種抗TNF抗體、及任何賦形劑或其他添加劑以包括液化壓縮氣體之混合物的形式含在罐中。計量閥之致動將混合物以氣霧劑釋放，其較佳地含有小於約10μm、較佳地約1μm至約5μm、且最佳地約2μm至約3μm之尺寸範圍的粒子。可藉由採用所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種方法(包括噴射研磨、噴霧乾燥、臨界點冷凝、或類似者)所生產的抗體組成物蛋白質之配方獲得所欲之氣霧劑粒徑。較佳計量劑量吸入器包括由3M或Glaxo製造者，並採用氫氟碳化物推進劑。
用於與計量劑量吸入裝置一起使用之至少一種抗TNF抗體之配方通常將包括細分粉末，其含有至少一種抗TNF抗體作為於非水性介質中之懸浮液，例如藉助於界面活性劑懸浮於推進劑中。推進劑可係用於此目的所採用之任何習知材料，諸如氯氟碳化物、氫氯氟碳化物、氫氟碳化物、或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、及1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氫氟烷-134a)、HFA-227(氫氟烷-227)、或類似者。較佳地，推進劑係氫氟碳化物。可選擇界面活性劑以穩定至少一種抗TNF抗體作為在推進劑中的懸浮液，以保護活性劑免於化學降解、及類似者。合適的界面活性劑包括山梨醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸、或類似者。在一些情況下，溶液氣霧劑較佳係使用諸如乙醇之溶劑。用於蛋白質之配方之所屬技術領域中已知的額外試劑亦可包括在配方中。
所屬技術領域中具有通常知識者將認知到，本發明之方法可經由未於本文中所述之裝置藉由肺部投予至少一種抗TNF抗體組成物來達成。
口服配方及投予：用於口服之配方依賴佐劑(例如間苯二酚及非離子性界面活性劑，諸如聚氧乙烯油基醚及正十六基聚乙烯醚)之共投予以人工增加腸壁的滲透性，以及依賴酶抑制劑(例如胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸酯(DFF)、及卡脈噴(trasylol))之共投予以抑制酶 降解。用於口服投予之固體類型劑型之活性成分化合物可與至少一種添加劑混合，添加劑包括蔗糖、乳糖、纖維素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麥芽糖醇、葡聚醣、澱粉、瓊脂、精胺酸酯、幾丁質、幾丁聚醣、果膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物、及甘油酯。這些劑型亦可含有(多種)其他類型的添加劑，例如非活性稀釋劑、潤滑劑(諸如硬脂酸鎂、對羥基苯甲酸)、防腐劑(諸如山梨酸、抗壞血酸、α-生育酚)、抗氧化劑(諸如半胱胺酸)、崩解劑、黏合劑、增稠劑、緩衝劑、甜味劑、調味劑、調香劑(perfuming agent)等。
錠劑及丸劑可進一步加工成包有腸溶衣之製劑。用於口服投予之液體製劑包括可用於醫療用途之乳化液、糖漿、酏劑、懸浮液、及溶液製劑。這些製劑可含有通常用於該領域之非活性稀釋劑，例如水。亦已將脂質體描述為用於胰島素及肝素之藥物遞送系統(美國專利第4,239,754號)。最近，混合胺基酸之人工聚合物的微球(類蛋白)已用於遞送藥品(美國專利第4,925,673號)。此外，將描述於美國專利第5,879,681號及美國專利第5,5,871,753號中之載劑化合物用於口服遞送生物活性劑係所屬技術領域中已知的。
黏膜配方及投予：針對透過黏膜表面之吸收，組成物及投予至少一種抗TNF抗體之方法包括包含複數個次微米粒子、黏膜黏著性(mucoadhesive)大分子、生物活性肽、及水連續相之乳化液，其藉由達成乳化液粒子之黏膜黏著來促進透過黏膜表面的吸收(美國專利第5,514,670號)。適用於施加本發明之乳化液的黏膜表面可包括角膜、結膜、頰、舌下、鼻、陰道、肺、胃、腸、及直腸的投予途徑。用於陰道或直腸投予之配方(例如栓劑)可含有例如聚烷二醇、凡士林、可可脂、及類似者作為賦形劑。用於鼻內投予之配方可係固體且含有例如乳糖作為賦形劑，或者可係鼻滴劑之水性或油性溶液。針對經頰投予，賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預膠化(pregelinatined)澱粉、及類似者(美國專利第5,849,695號)。
經皮配方及投予：針對經皮投予，將至少一種抗TNF抗體封裝在遞送裝置中，諸如脂質體或聚合奈米粒子、微粒子、微膠囊、或微 球體(除非另有說明，否則統稱為微粒子)。許多合適的裝置係已知的，其包括由合成聚合物製成的微粒，諸如多羥基酸(諸如聚乳酸、聚乙醇酸、及其共聚物)、聚原酸酯、聚酐、及聚磷腈，及由天然聚合物物製成的微粒，諸如膠原蛋白、聚胺基酸、白蛋白及其他蛋白質、藻酸鹽及其他多醣、及其組合(美國專利第5,814,599號)。
長期投予及配方：有時可能希望在長時間內，例如從單次投予開始的一週至一年的期間內，將本發明之化合物遞送至對象。可使用各種緩釋、長效儲存式(depot)、或植入物劑型。舉例而言，劑型可含有化合物之醫藥上可接受的無毒性鹽，其在體液中具有低溶解度，例如(a)具有多元酸之酸加成鹽，該多元酸諸如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、單寧酸、撲酸、藻酸、聚麩胺酸、萘單磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸、及類似者；(b)具有多價金屬陽離子之鹽，該多價金屬陽離子諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、及類似者，或具有有機陽離子之鹽，該有機陽離子係由例如N,N'-二苄基-乙二胺或乙二胺形成；或(c)(a)及(b)之組合，例如單寧酸鋅鹽。此外，本發明之化合物或(較佳地)相對不溶的鹽，諸如剛才所述者，可在凝膠(例如單硬脂酸鋁膠)中與例如適用於注射之芝麻油一起調配。尤其較佳的鹽係鋅鹽、單寧酸鋅鹽、撲酸鹽、及類似者。用於注射之另一類型緩釋長效儲存式配方將含有經分散以用於封裝於緩慢降解、無毒性、非抗原聚合物中之化合物或鹽，該聚合物諸如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物，例如於美國專利第3,773,919號中所述。亦可將化合物或較佳地諸如以上所述之相對不溶的鹽調配於膽固醇基質矽橡膠粒中，特別是用於動物中。額外的緩釋、長效儲存式、或植入物配方，例如氣體或液體脂質體係文獻中已知的(美國專利第5,770,222號及「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」，J.R.Robinson ed.,Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,1978)。
已大致上描述本發明，藉由參考下列實例將更容易了解本發明，該等實例係藉由說明方式提供，而非旨在限制本發明。
實例1：哺乳動物細胞中TNF抗體之選殖及表現。
典型哺乳動物表現載體含有至少一個啟動子元件，其介導mRNA、抗體編碼序列、及終止轉錄所需之信號的轉錄起始及轉錄本之多腺核苷酸化。額外的元件包括增強子、Kozak序列、及用於RNA剪接之側接供體及受體位點的介入序列。可用來自SV40之早期及晚期啟動子、來自反轉錄病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)之長末端重複(long terminal repeat,LTR)、及巨細胞病毒(CMV)之早期啟動子來達成高效率轉錄。然而，亦可使用細胞元件(例如人類肌動蛋白啟動子)。用於實施本發明之合適的表現載體包括例如諸如pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL及PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC® 37152)、pSV2dhfr(ATCC® 37146)、及pBC12MI之載體。可使用之哺乳動物宿主細胞包括人類Hela 293、H9、及Jurkat細胞、小鼠NIH3T3及C127細胞、Cos 1、Cos 7、及CV 1、鵪鶉QC1-3細胞、小鼠L細胞、及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
替代地，基因可在含有整合至染色體中之基因的穩定細胞系中表現。與可選擇標記(諸如dhfr、gpt、新黴素、或潮黴素)之共轉染允許經轉染細胞之識別及單離。
經轉染基因亦可經擴增以表現大量的經編碼抗體。DHFR(二氫葉酸還原酶)標記可用於開發攜帶數百甚至數千個所關注基因之拷貝的細胞系。另一個有用的選擇標記係酶麩醯胺酸合成酶(GS)(Murphy,et al.,Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington,et al.,Bio/Technology 10：169-175(1992))。使用這些標記，使哺乳動物細胞在選擇性培養基中生長，並選擇具有最高抗性之細胞。這些細胞系含有整合至染色體之(多個)經擴增基因。中國倉鼠卵巢(CHO)及NSO細胞常用於生產抗體。
表現載體pC1及pC4含有勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之強啟動子(LTR)(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上CMV增強子之片段(Boshart,et al.,Cell 41：521-530(1985))。多個選殖位點(例如，具有限制酶切割位點BamHI、XbaI、及Asp718)促進所關注基因 之選殖。除了3'內含子以外，載體還含有大鼠前胰島素原基因之多腺核苷酸化及終止信號。
在CHO細胞中之選殖及表現
常用於在CHO細胞中表現的一種載體係pC4。質體pC4係質體pSV2-dhfr(ATCC® 37146)之衍生物。質體含有受SV40早期啟動子控制的小鼠DHFR基因。可藉由在補充有化學治療劑胺甲喋呤的選擇性培養基(例如，alpha minus MEM,Life Technologies,Gaithersburg,MD)中生長細胞，來選擇用這些質體轉染並缺乏二氫葉酸活性之中國倉鼠卵巢細胞或其他細胞。已充分記載DHFR基因在對胺甲喋呤(MTX)有抗性的細胞中之擴增(參見例如，F.W.Alt,et al.,J. Biol. Chem.253：1357-1370(1978)；J.L.Hamlin and C.Ma,Biochem.et Biophys.Acta 1097：107-143(1990)；及M.J.Page and M.A.Sydenham,Biotechnology 9：64-68(1991))。由於DHFR基因擴增的結果，藉由過度生產目標酶DHFR，在濃度越來越高的MTX中生長的細胞對藥物產生了抗藥性。若第二基因係連接至DHFR基因，則其通常會共擴增及過度表現。在所屬技術領域中已知的是，此方法可用於開發攜帶(多個)經擴增基因之多於1,000個拷貝的細胞系。隨後，當撤出胺甲喋呤時，獲得含有整合至宿主細胞之一或多個染色體中的經擴增基因之細胞系。
質體pC4含有用於表現所關注基因的勞斯肉瘤病毒之長末端重複(LTR)的強啟動子(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上單離自人類巨細胞病毒(CMV)之立即早期基因之增強子的片段(Boshart,et al.,Cell 41：521-530(1985))。啟動子的下游係允許基因整合之BamHI、XbaI、及Asp718限制酶切割位點。在這些選殖位點的後面，質體含有大鼠前胰島素原基因之3'內含子及多腺核苷酸化位點。其他高效率啟動子亦可用於表現，例如人類β肌動蛋白啟動子、SV40早期或晚期啟動子、或來自其他反轉錄病毒(例如，HIV及HTLVI)之長末端重複。Clontech的Tet-Off及Tet-On基因表現系統及類似系統可用於在哺乳動物細胞中以受調控方式表現TNF(M.Gossen,and H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547- 5551(1992))。對於mRNA之多腺核苷酸化，亦可使用其他信號，例如來自人類生長激素或球蛋白基因。在與可選擇的標記(諸如gpt、G418、或潮黴素)共轉染時，亦可選擇攜帶整合至染色體中之所關注基因的穩定細胞系。在開始時使用多於一個可選擇標記係有利的，例如G418加上胺甲喋呤。
用限制酶截切質體pC4，然後藉由所屬技術領域中已知的程序使用小牛腸磷酸酶使其去磷酸化。然後從1%瓊脂糖凝膠中單離出載體。
然後將經單離之編碼可變區及恆定區的DNA及經去磷酸化載體與T4 DNA連接酶連接。然後將大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細胞轉化，並使用例如限制酶分析識別含有插入質體pC4中的片段之細菌。
將缺乏活性DHFR基因之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞用於轉染。使用Lipofectin將5μg表現質體pC4與0.5μg質體pSV2-neo共轉染。質體pSV2-neo含有顯性可選擇標記，來自Tn5之新基因編碼一種酶，該酶賦予對包括G418之抗生素群組的抗性。將細胞接種在補充有1μg/ml G418的alpha minus MEM中。2天後，將細胞用胰蛋白酶處理(trypsinized)並接種在融合瘤選殖盤(Greiner,Germany)於補充有10、25、或50ng/ml的胺甲喋呤加上1μg/ml G418之alpha minus MEM中。在約10至14天後，將單一殖株用胰蛋白酶處理，然後使用不同濃度的胺甲喋呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)將其接種在6孔培養皿或10ml燒瓶中。然後，將在最高濃度的胺甲喋呤下生長的植株轉移到含有更高濃度胺甲喋呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔盤中。重複相同程序直到獲得在100至200mM濃度下生長的殖株。例如藉由SDS-PAGE及西方墨點法、或藉由逆相HPLC分析來分析所欲基因產物的表現。
實例2：使用基因轉殖小鼠產生與人類TNF反應之高親和力人類IgG單株抗體。
彙總：已使用含有人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因的基因轉殖小鼠來產生高親和力、完全人類的單株抗體，該等抗體可用於治療上 以抑制TNF的作用以用於治療一或多種TNF介導之疾病。含有用於重鏈及輕鏈兩者之人類可變及恆定區抗體轉殖基因的(CBA/J×C57/BL6/J)F2雜交小鼠係用人類重組TNF免疫(Taylor et al.,Intl.Immunol.6：579-591(1993)；Lonberg,et al.,Nature 368：856-859(1994)；Neuberger,M.,Nature Biotech.14：826(1996)；Fishwild,et al.,Nature Biotechnology 14：845-851(1996))。數種融合產生一或多個小組的完全人類TNF反應性IgG單株抗體。將完全人類抗TNF抗體進一步表徵。所有皆係IgG1κ。已發現此類抗體之親和力常數在1×109與9×1012之間。這些完全人類單株抗體之出乎意料的高親和力使彼等為適合用於TNF相關疾病、病理、或病症之治療性應用的候選者。
縮寫：BSA-牛血清白蛋白；CO2-二氧化碳；DMSO-二甲基亞碸；EIA-酶免疫檢定；FBS-胎牛血清；H2O2-過氧化氫；HRP-辣根過氧化酶；ID-皮內；Ig-免疫球蛋白；TNF-組織壞死因子α；IP-腹膜內；IV-靜脈內；Mab或mAb-單株抗體；OD-光學密度；OPD-鄰苯二胺二鹽酸鹽；PEG-聚乙二醇；PSA-青黴素、鏈黴素、兩性黴素；RT-室溫；SQ-皮下；v/v-體積/體積；w/v-重量/體積。
材料及方法
動物：可表現人類抗體之基因轉殖小鼠在所屬技術領域中係已知的(且係市售可得的(例如，自GenPharm International,San Jose,CA；Abgenix,Freemont,CA、及其他者)，其表現人類免疫球蛋白但不表現小鼠IgM或Igκ。舉例而言，此類基因轉殖小鼠含有人類序列轉殖基因，該等人類序列轉殖基因經歷V(D)J連接、重鏈類型轉換、及體細胞突變，以產生人類序列免疫球蛋白貯庫(Lonberg,et al.,Nature 368：856-859(1994))。輕鏈轉殖基因可例如部分衍生自包括幾乎一半的生殖系人類Vκ區之酵母人造染色體殖株。此外，重鏈轉殖基因可編碼人類μ及人類γ1(Fishwild,et al.,Nature Biotechnology 14：845-851(1996))及/或γ3個恆定區兩者。衍生自適當基因型譜系之小鼠可用於免疫及融合程序中，以產生針對TNF之完全人類單株抗體。
免疫：可使用一或多個免疫排程來產生抗TNF人類融合瘤。可在下列例示性免疫方案之後執行前幾次融合，但也可使用其他類似的已知方案。對數隻14至20週齡的雌性及/或經手術去勢的基因轉殖雄性小鼠用1至1000μg重組人類TNF進行IP及/或ID免疫，該TNF係用等體積的TITERMAX或完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)乳化，最終體積為100至400μL(例如200)。各小鼠亦可以可選性地在2個SQ位點之各者處接受於100μL生理食鹽水中之1至10μg。然後可對小鼠在1至7、5至12、10至18、17至25、及/或21至34天後用TNF進行IP(1至400μg)及SQ(1至400μg×2)免疫，該TNF係用等體積的TITERMAX或不完全弗氏佐劑乳化。可在12至25及25至40天後在無抗凝劑之情況下藉由眼後穿刺使小鼠出血。接著使血液在RT下凝塊一小時並收集血清，且根據已知方法使用TNF EIA檢定來測量效價。當重複注射不會導致效價增加時，執行融合。此時，可給予小鼠稀釋於100μL生理食鹽水中之1至400μg TNF的最終IV追加注射(booster injection)。三天後，可藉由頸椎脫位術(cervical dislocation)將小鼠安樂死，並無菌地取出脾臟且將其浸入含有100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、及0.25μg/mL兩性黴素B(PSA)之10mL冷的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。藉由用PSA-PBS無菌灌注脾臟來採集脾細胞。將細胞於冷的PSA-PBS中洗滌一次，使用台盼藍染料排除法計數，並再懸浮於含有25mM Hepes之RPMI 1640培養基中。
細胞融合：可根據已知方法，例如所屬技術領域中已知者，以1：1至1：10之鼠類骨髓瘤細胞與活脾細胞之比進行融合。作為非限制性實例，可將脾臟細胞及骨髓瘤細胞一起沉澱。然後可將沉澱物在37℃下在30秒內緩慢地再懸浮於1mL的50%(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1,450,Sigma)中。然後可藉由在1分鐘內緩慢添加10.5mL含有25mM Hepes(37℃)的RPMI 1640培養基來停止融合。將經融合細胞以500至1500rpm離心5分鐘。然後將細胞再懸浮於HAT培養基(含有25mM Hepes、10% Fetal Clone I血清(Hyclone)、1mM丙酮酸鈉、4mM L-麩醯胺酸、10μg/mL見大黴素(gentamicin)、2.5% Origen培養補充物(Fisher)、10% 653-條件RPMI 1640/Hepes培養基、50μM 2-巰基乙醇、100μM次黃嘌呤、0.4 μM胺喋呤、及16μM胸苷之RPMI 1640培養基)中，然後以200μL/孔接種於十五個96孔平底組織培養盤中。然後將盤放置於含有5% CO2及95%空氣之加濕的37℃培養箱中達7至10天。
偵測在小鼠血清中之人類IgG抗TNF抗體：固相EIA可用來篩選小鼠血清中對人類TNF具特異性之人類IgG抗體。簡言之，將盤以於PBS中之2μg/mL的TNF塗佈整夜。於含有0.02%(v/v)Tween 20之0.15M鹽水中洗滌後，可在RT下將孔用於PBS中之1%(w/v)BSA以200μL/孔阻斷1小時。將盤立即使用或在-20℃下冷凍以供未來使用。將小鼠血清稀釋液以50μL/孔在RT下於經TNF塗佈的盤上培養1小時。將盤洗滌，然後用50μL/孔經1：30,000稀釋於1% BSA-PBS中之經HRP標示的山羊抗人類IgG(Fc特異性)在RT下探測1小時。可再次將盤洗滌，並在RT下添加100μL/孔的檸檬酸鹽-磷酸鹽受質溶液(0.1M檸檬酸及0.2M磷酸鈉、0.01% H2O2及1mg/mL OPD)達15分鐘。然後以25μL/孔添加終止溶液(4N硫酸)，並經由自動化盤分光光度計在490nm讀取OD。
偵測在融合瘤上清液中之完全人類免疫球蛋白：可使用合適的EIA來偵測分泌完全人類免疫球蛋白之生長陽性融合瘤。簡言之，可將96孔彈出盤(VWR,610744)用於碳酸鈉緩衝劑中之10μg/mL山羊抗人類IgG Fc在4℃下塗佈整夜。將盤洗滌，且在37℃下用1% BSA-PBS阻斷一小時，並立即使用或在-20℃下冷凍。將未經稀釋的融合瘤上清液在37℃下於盤上培養一小時。將盤洗滌，並用經1：10,000稀釋於1% BSA-PBS中之經HRP標示的山羊抗人類κ在37℃下探測一小時。然後將盤與如上所述之受質溶液培養。
完全人類抗TNF反應性之測定：如上所述，可使用合適的RIA或其他檢定同時檢定融合瘤對TNF的反應性。舉例而言，將上清液在如以上之山羊抗人類IgG Fc盤上培養、洗滌，接著在RT下以每孔適當計數之經放射性標記的TNF進行探測達1小時。用PBS洗滌孔兩次，並使用合適的計數器對結合的經放射性標記TNF進行定量。
可將分泌人類IgG1κ抗TNF之融合瘤在細胞培養中擴增，並藉由有限稀釋進行連續次選殖。可將所得殖株群體在冷凍培養基(95% FBS、5% DMSO)中擴增及凍存，並儲存於液態氮中。
分型：可使用EIA以類似於用來篩選小鼠免疫血清中特異性效價的格式來完成抗體之同型測定。可將TNF如上所述塗佈在96孔盤上，並將純化的抗體以2μg/mL在RT下於盤上培養一小時。將盤洗滌，並用以1：4000稀釋於1% BSA-PBS中之經HRP標示的山羊抗人類IgG1或經HRP標示的山羊抗人類IgG3在RT下探測一小時。再次將盤洗滌，並用如上所述之受質溶液培養。
人類抗人類TNF抗體與人類TNF之結合動力學：可使用例如TNF捕捉EIA及BIAcore技術來適當地評估抗體之結合特性。可在如上所述的檢定中，評估分級濃度之純化的人類TNF抗體與塗佈有2μg/mL TNF之EIA盤的結合。然後可將OD以半對數圖呈現，以顯示相對結合效率。
可例如如下所述或藉由任何其他已知的合適方法來獲得定量結合常數。將BIAcore CM-5(羧甲基)晶片放置於BIAcore 2000單元中。使HBS緩衝劑(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% v/v P20界面活性劑，pH 7.4)以5μL/分鐘流過晶片的流通池，直到獲得穩定的基線。將於200μL水中之15mg EDC(N-乙基-N'-(3-二甲基-胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)之溶液(100μL)添加到於200μL水中之2.3mg NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)之100μL溶液中。將四十(40)μL的所得溶液注射到晶片上。將六μL的人類TNF溶液(15μg/mL於10mM乙酸鈉中，pH 4.8)注射到晶片上，結果增加大約500 RU。將緩衝劑改為TBS/Ca/Mg/BSA運行緩衝劑(20mM Tris、0.15M氯化鈉、2mM氯化鈣、2mM乙酸鎂、0.5% Triton X-100、25μg/mL BSA，pH 7.4)並使其流過晶片整夜以使其平衡並水解，或封端任何未反應的琥珀醯亞胺酯。
將抗體以33.33、16.67、8.33、及4.17nM溶解於運行緩衝劑中。將流速調整至30μL/min，且將儀器溫度調整至25℃。將兩個流通池用於動力學運行，一個流通池上已固定了TNF(樣本)，而第二個是未衍生的流通池(空白)。將各抗體濃度120μL以30μL/min注射到流通池上 (締合相)，接著進行360秒不間斷的緩衝劑流(解離相)。藉由兩次依序注射各30μL的2M脈硫氰酸鹽來再生(組織壞死因子α/抗體複合物解離)晶片表面。
使用如所屬技術領域中已知之BIA評估3.0或CLAMP 2.0來進行數據分析。針對各抗體濃度，自樣本感測圖(sensogram)中減去空白感測圖。對解離(kd,sec-1)及締合(ka,mol-1 sec-1)兩者進行全域擬合(global fit)，並計算解離常數(KD,mol)(kd/ka)。當抗體親和力夠高時，所捕獲之抗體的RU係>100時，進行抗體的額外稀釋。
結果及討論
抗人類TNF單株抗體之產生：執行數次融合，且各融合係接種於15個盤(1440個孔/融合)中，產生數十種對人類TNF具特異性的抗體。在這些當中，發現一些係由人類及小鼠Ig鏈之組合組成。其餘的融合瘤分泌抗TNF抗體且僅由人類重鏈及輕鏈組成。在人類融合瘤中，預期所有皆係IgG1κ。
人類抗人類TNF抗體之結合動力學：ELISA分析證實，自大多數或所有這些融合瘤純化的抗體以濃度依賴性方式結合TNF。圖1及圖2A-2B顯示這些抗體之相對結合效率的結果。在此情況下，測量抗體對其同源(cognate)抗原(表位)的親留力。應注意的是，將TNF直接結合至EIA盤會引起蛋白質變性，且表觀結合親和力不能反映與未變性蛋白質的結合。在一濃度範圍內發現有五十百分比的結合。
定量結合常數係使用人類抗體之BIAcore分析獲得，且顯示數種人類單株抗體具有非常高的親和力，其KD在1×10-9至7×10-12的範圍內。
結論：
利用來自含有人類可變及恆定區抗體轉殖基因之雜交小鼠(用人類TNF免疫)的脾細胞執行數種融合。產生一組數種IgG1κ同型的完全人類TNF反應性IgG單株抗體。將完全人類抗TNF抗體進一步表徵。數 種所產生之抗體之親和力常數在1×109與9×1012之間。這些完全人類單株抗體之出乎意料的高親和力使彼等適合用於TNF依賴性疾病、病理、或相關病況之治療性應用。
實例3：產生與人類TNFα反應之人類IgG單株抗體。
彙總：含有用於重鏈及輕鏈兩者之人類可變及恆定區抗體轉殖基因的(CBA/J×C57BL/6J)F2雜交小鼠(1-4)係用重組人類TNFα免疫。一種名為GenTNV的融合產生了八種與經固定重組人類TNFα結合之完全人類IgG1κ單株抗體。識別後不久，將八種細胞系轉移至分子生物學組進行進一步表徵。由於這些Mab在序列上係完全人類的，因此預期彼等在人類中之免疫原性低於cA2(類克(Remicade))。
縮寫：BSA-牛血清白蛋白；CO2-二氧化碳；DMSO-二甲基亞碸；EIA-酶免疫檢定；FBS-胎牛血清；H2O2-過氧化氫；HC-重鏈；HRP-辣根過氧化酶；ID-皮內；Ig-免疫球蛋白；TNF-組織壞死因子α；IP-腹膜內；IV-靜脈內；Mab-單株抗體；OD-光學密度；OPD-鄰苯二胺二鹽酸鹽；PEG-聚乙二醇；PSA-青黴素、鏈黴素、兩性黴素；RT-室溫；SQ-皮下；TNFα-腫瘤壞死因子α；v/v-體積/體積；w/v-重量/體積。
介紹：利用含有人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠來產生對重組人類TNFα具特異性之完全人類單株抗體。希望可使用這些獨特的抗體，因為cA2(類克)係用於治療性抑制涉及TNFα介導之疾病的發炎過程，具有增加血清半衰期及減少與免疫原性相關之副作用的效益。
如本文中所定義，用語「半衰期(half-life)」指示在消除一個半衰期後藥物(例如，治療性抗TNFα抗體)之血漿濃度減半。因此，在各個後續的半衰期中，消除的藥物更少。在一個半衰期之後，身體中剩餘藥物的量係50%，兩個半衰期之後係25%，等等。藥物的半衰期取決於其清除率及分布體積。消除半衰期被認為是與身體中藥物的量無關。
材料及方法：
動物：表現人類免疫球蛋白但不表現小鼠IgM或Igκ之基因轉殖小鼠已由GenPharm International開發出來。這些小鼠含有功能性人類抗體轉殖基因，該等轉殖基因經歷V(D)J連接、重鏈類型轉換、及體細胞突變，以產生抗原特異性人類免疫球蛋白貯庫(1)。輕鏈轉殖基因係部分衍生自包括幾乎一半的生殖系人類Vκ基因座之酵母人造染色體殖株。除了數個VH基因之外，重鏈(HC)轉殖基因編碼人類μ及人類γ1(2)及/或γ3恆定區兩者。在免疫及融合程序中使用衍生自HCo12/KCo5基因型譜系之小鼠，以產生本文中所述之單株抗體。
人類TNFα的純化：藉由使用填充有偶合至Sepharose 4B(Pharmacia)之TNFα受體-Fc融合蛋白(p55-sf2)(5)的管柱之親和力層析法，將人類TNFα從來自C237A細胞的組織培養上清液中純化出來。將細胞上清液與其體積九分之一的10x達爾伯克PBS(D-PBS)混合，並在4℃下以4mL/min通過管柱。接著用PBS洗滌管柱，並用0.1M檸檬酸鈉(pH 3.5)洗提TNFα，且用2M Tris-HCl pH 8.5中和。將純化的TNFα緩衝劑交換成10mM Tris、0.12M氯化鈉pH 7.5，並過濾通過0.2um針筒過濾器。
免疫：將雌性GenPharm小鼠(大約16週齡)在第0、12、及28天用總計100μg的TNFα(批號JG102298或JG102098)進行IP(200μL)及ID(100μL，在尾巴的基部)免疫，該TNFα係用等體積的Titermax佐劑乳化。在第21及35天在無抗凝劑之情況下藉由眼後穿刺使小鼠出血。使血液在RT下凝塊一小時並收集血清，且使用TNFα固相EIA檢定來測量效價。在第28天注射後讓小鼠休息七週之後，執行名為GenTNV的融合。然後給予小鼠(針對TNFα具有1：160之特異性人類IgG效價)稀釋於100μL生理食鹽水中之50μg TNFα的最終IV追加注射。三天後，藉由頸椎脫位術將小鼠安樂死，並無菌地取出脾臟且將其浸入含有100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、及0.25μg/mL兩性黴素B(PSA)之10mL冷的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。藉由用PSA-PBS無菌灌注脾臟來採集脾細胞。將細胞於冷的PSA-PBS中洗滌一次，使用Coulter計數器來計數，並再懸浮於含有25mM Hepes之RPMI 1640培養基中。
細胞系：將非分泌型小鼠骨髓瘤融合夥伴653在1997年5月14日被Centocor產品開發小組納入細胞生物學服務(Cell Biology Services,CBS)小組中。將細胞系於補充有10%(v/v)FBS(細胞培養實驗室(Cell Culture Labs))、1mM丙酮酸鈉、0.1mM NEAA、2mM L-麩醯胺酸(全部皆來自JRH Biosciences)的RPMI培養基(JRH Biosciences)中擴增，並凍存於95% FBS及5% DMSO(Sigma)中，然後儲存在CBS於氣相液態氮冷凍器中。細胞庫係無菌的(品質管制(Quality Control),Centocor,Malvern)且不含黴漿菌(Bionique Laboratories)。將細胞維持在對數期培養中直到融合。在融合之前，將彼等於PBS中洗滌、計數、並經由台盼藍染料排除法測定存活率(>95%)。
人類TNFα係藉由重組細胞系(命名為C237A，在Centocor之分子生物學組產生)生產。將細胞系於補充有5%(v/v)FBS(細胞培養實驗室)、2mM L-麩醯胺酸(全部皆來自JRH Biosciences)、及0.5：g/mL黴酚酸的IMDM培養基(JRH Biosciences)中擴增，並凍存於95% FBS及5% DMSO(Sigma)中，然後儲存在CBS(13)於氣相液態氮冷凍器中。細胞庫係無菌的(品質管制(Quality Control),Centocor,Malvern)且不含黴漿菌(Bionique Laboratories)。
細胞融合：細胞融合係使用1：1比率的653鼠類骨髓瘤細胞及活的鼠類脾臟細胞來進行。簡言之，將脾臟細胞及骨髓瘤細胞一起沉澱。在37℃下，將沉澱物在30秒期間內緩慢再懸浮於1mL的50%(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量為1,450g/莫耳，Sigma)中。藉由在1分鐘內緩慢添加10.5mL的RPMI培養基(無添加劑)(JRH)(37℃)來停止融合。將經融合細胞以750rpm離心5分鐘。然後將細胞再懸浮於HAT培養基(含有10%胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、10μg/mL見大黴素、2.5% Origen培養補充物(Fisher)、50μM 2-巰基乙醇、1% 653-條件RPMI培養基、100μM次黃嘌呤、0.4μM胺喋呤、及16μM胸苷之RPMI/HEPES培養基)中，然後以200μL/孔接種於五個96孔平底組織培養盤中。然後將盤放置於含有5% CO2及95%空氣之加濕的37℃培養箱中達7至10天。
偵測在小鼠血清中之人類IgG抗TNFα抗體：使用固相EIA來篩選小鼠血清中對人類TNFα具特異性之人類IgG抗體。簡言之，將盤以於PBS中之1μg/mL的TNFα塗佈整夜。於含有0.02%(v/v)Tween 20之0.15M鹽水中洗滌後，在RT下將孔用於PBS中之1%(w/v)BSA以200μL/孔阻斷1小時。將盤立即使用或在-20℃下冷凍以供未來使用。將小鼠血清在經人類TNFα塗佈的盤上以50μL/孔在RT下於兩倍連續稀釋液中培養1小時。將盤洗滌，然後用50μL/孔經1：30,000稀釋於1% BSA-PBS中之經HRP標示的山羊抗人類IgG(Fc特異性(準確的))在RT下探測1小時。再次將盤洗滌，並在RT下添加100μL/孔的檸檬酸鹽-磷酸鹽受質溶液(0.1M檸檬酸及0.2M磷酸鈉、0.01% H2O2及1mg/mL OPD)達15分鐘。然後以25μL/孔添加終止溶液(4N硫酸)，並使用自動化盤分光光度計在490nm讀取OD。
偵測在融合瘤上清液中之完全人類免疫球蛋白：由於GenPharm小鼠能夠產生小鼠及人類免疫球蛋白鏈兩者，因此使用兩個分開的EIA檢定來測試生長陽性融合瘤殖株是否存在人類輕鏈及人類重鏈兩者。如上所述將盤塗佈，且將未稀釋的融合瘤上清液在37℃下在盤上培養一小時。將盤洗滌，並在37℃下用經1：10,000稀釋於1% BSA-HBSS中的HRP偶聯山羊抗人類κ(Southern Biotech)抗體或在1% BSA-HBSS中稀釋成1：30,000的HRP偶聯山羊抗人類IgG Fc特異性抗體探測一小時。然後將盤用如上所述之受質溶液培養。丟棄未給出抗人類κ及抗人類IgG Fc EIA格式兩者之正信號(positive signal)的融合瘤殖株。
分型：使用EIA以類似於用來篩選小鼠免疫血清中特異性效價的格式來完成抗體之同型測定。在4℃下，將EIA盤以10：g/mL於碳酸鈉緩衝劑中的山羊抗人類IgG(H+L)塗佈整夜，並如上所述阻斷。將來自24孔培養物之純上清液在RT下在盤上培養一小時。將盤洗滌，並用以1：4000稀釋於1% BSA-PBS中之經HRP標示的山羊抗人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4(結合位點)在RT下探測一小時。再次將盤洗滌，並用如上所述之受質溶液培養。
結果及討論：完全人類抗人類TNFα單株抗體之產生：從用重組人類TNFα蛋白免疫的GenPharm小鼠執行一種名為GenTNV的融合。 從此融合中，篩選196種生長陽性的雜交物。識別出八種融合瘤細胞系，其分泌與人類TNFα反應之完全人類IgG抗體。這八種細胞系各自分泌人類IgG1κ同型的免疫球蛋白，且全部藉由有限稀釋進行兩次次選殖以獲得穩定細胞系(>90%均質)。細胞系名稱及各別C代碼名稱係列於表1中。將細胞系之各者儲存在液態氮中並冷凍於12小瓶研究細胞庫。
從八種細胞系之各者之24孔培養皿的孔中收集的親本細胞在1999年2月18日移交給分子生物學小組，以用於轉染及進一步表徵。
表1：GenTNV細胞系名稱
Figure 109108133-A0202-12-0090-8
結論：
利用來自含有人類可變及恆定區抗體轉殖基因之雜交小鼠(用在Centocor製備之重組人類TNFα免疫)的脾細胞執行GenTNV融合。產生八種IgG1κ同型之完全人類、TNFα反應性IgG單株抗體。將親本細胞系轉移至分子生物學組以用於進一步表徵及開發。這些新的人類抗體中之一者可證明可用於消炎，相較於類克，具有減少免疫原性及過敏型併發症之潛在效益。
參考文獻：
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Scallon, et al., Cytokine 7:759-770 (1995)。
實例4：表現人類抗TNFα抗體的細胞系之選殖及製備。
彙總：發現一小組具有TNV名稱之八種人類單株抗體(mAb)以明顯高的親留力結合經固定的人類TNFα。顯示八種mAb中的七種有效地阻斷huTNFα結合至重組TNF受體。編碼該七種mAb的DNA之序列分析證實所有mAb皆具有人類V區。DNA序列亦顯示三對mAb彼此相同，因此八種mAb之原始小組僅含有四種不同的mAb，其係由TNV14、TNV15、TNV148、及TNV196表示。基於mAb之推導的胺基酸序列之分析及體外TNFα中和數據之結果，選擇mAb TNV148及TNV14以用於進一步研究。
因為在TNV148重鏈中位置75處(架構3)之脯胺酸殘基未在資料庫搜尋期間於相同亞組之其他人類抗體中之該位置處發現，故執行定點DNA誘變以在該位置處編碼絲胺酸殘基，使其符合已知的生殖系架構e序列。將經絲胺酸修飾之mAb指定為TNV148B。將編碼TNV148B及TNV14之重鏈及輕鏈可變區的經PCR擴增DNA選殖至新製備的表現載體中，該等表現載體係基於最近選殖的另一人類mAb(12B75)之重鏈及輕鏈基因，其揭示於美國專利申請案第60/236,827號(2000年10月7日申請，標題為IL-12 Antibodies,Compositions,Methods and Uses，公開為WO 02/12500)中，其全文以引用方式併入本文中。
用各別重鏈及輕鏈表現質體轉染P3X63Ag8.653(653)細胞或Sp2/0-Ag14(Sp2/0)小鼠骨髓瘤細胞，並透過兩輪次選殖篩選產生高水平的重組TNV148B及TNV14(rTNV148B及rTNV14)mAb之細胞系。mAb生產的成長曲線及穩定性隨時間的評估指示，653-轉染細胞殖株C466D及C466C在用過的培養物中穩定產生大約125：g/ml的rTNV148B mAb，而Sp2/0轉染細胞1.73-12-122(C467A)在用過的培養物中穩定產生大約25：g/ml的rTNV148B mAb。類似的分析指示，Sp2/0轉染細胞殖株C476A在用過培養物中產生了18：g/ml的rTNV14。
介紹：先前顯示，一小組衍生自經人類TNFα免疫之GenPharm/Medarex小鼠(HCo12/KCo5基因型)的八種mAb結合人類TNFα並具有完全人類IgG1 κ同型。使用簡單結合檢定，以藉由評估本發明之例示性mAb阻斷TNFα結合至重組TNF受體之能力，來測定其是否可能具有TNFα中和活性。基於該等結果、DNA序列結果、及數種mAb之體外特徵，選擇TNV148作為進行進一步表徵之mAb。
選殖編碼TNV148 mAb之DNA序列，將其修飾以擬合至編碼合適的恆定區之基因表現載體中，將其引入經充分表徵之653及Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞，並篩選所得之經轉染細胞系，直到識別出產生比原始融合瘤細胞系多40倍之mAb的次殖株。
材料及方法：
試劑及細胞：TRIZOL試劑係購自Gibco BRL。蛋白酶K係獲自Sigma Chemical Company。反轉錄酶係獲自Life Sciences,Inc.。Taq DNA聚合酶係獲自Perkin Elmer Cetus或Gibco BRL。限制酶係購自New England Biolabs。QIAquick PCR純化套組係來自Qiagen。QuikChange定點誘變套組(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)係購自Stratagene。Wizard質體小量製備(miniprep)套組及RNasin係來自Promega。Optiplate係獲自Packard。125碘係購自Amersham。客製化寡核苷酸係購自Keystone/Biosource International。此作業中所使用之寡核苷酸的名稱、識別號、及序列係示於表2中。
表2.用於選殖、工程改造、或定序TNV mAb基因之寡核苷酸。
由寡核苷酸5'14s及HuH-J6編碼之胺基酸係顯示於序列上。「M」胺基酸殘基表示轉譯起始密碼子。寡核苷酸5'14s及HuH-J6中之加底線序列分別標記BsiWI及BstBI限制位點。在HuH-J6中之斜線對應於外顯子/內含子邊界。應注意的是，序列對應於負鏈之寡核苷酸係以3'-5'之方向撰寫。
Figure 109108133-A0202-12-0093-4
Figure 109108133-A0202-12-0094-5
獲得單一冷凍小瓶的653小鼠骨髓瘤細胞。當天將小瓶解凍，並在T燒瓶中於IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸(培養基)中擴增。將這些細胞維持在連續培養，直到2至3週後用本文中所述之抗TNF DNA轉染。在解凍日後5天採集一些培養物，藉由離心沉澱，並使其再懸浮於95% FBS、5% DMSO中，將其等分至30個小瓶中、冷凍、並儲存以供未來使用。同樣地，獲得單一冷凍小瓶的Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞。將小瓶解凍，如上文所述製備新的凍結物(freeze-down)，並將冷凍小瓶儲存在CBC冷凍器盒AA及AB中。將這些細胞解凍，並用於此處所述之所有Sp2/0轉染。
TNF與受體結合之抑制檢定：使用含有TNV mAb之融合瘤細胞上清液來檢定mAb阻斷經125I標示之TNFα結合至重組TNF受體融合蛋白(p55-sf2)的能力(Scallon et al.(1995)Cytokine 7：759-770)。在37℃下的一小時培養期間，將於PBS中之50：1的p55-sf2以0.5：g/ml添加至Optiplate以塗佈孔。在96孔圓底盤中使用PBS/0.1% BSA作為稀釋劑來製備八個TNV細胞上清液的連續稀釋液。包括含有抗IL-18 mAb之細胞上清液作為陰性對照組，且包括摻有cA2(抗TNF嵌合抗體，類克，美國專利第5,770,198號，全文以引用方式併入本文中)的相同抗IL-18上清液作為陽性對照組。將經125I-標示之TNFα(58：Ci/：g,D.Shealy)添加至100：1的細胞上清液，以具有5ng/ml的最終TNFα濃度。將混合物在RT下預培養一小時。洗滌經塗佈之Optiplate以移除未結合之p55-sf2，並將50：1的125I-TNFα/細胞上清液混合物轉移至Optiplate。在RT下2hr之後，將Optiplate用PBS-Tween洗滌三次。添加100：1的Microscint-20，並使用TopCountγ計數器測定cpm結合。
V基因之擴增及DNA序列分析：在添加TRIZOL試劑以用於RNA製劑之前，將融合瘤細胞在PBS中洗滌一次。將7×106個與1.7×107 個之間的細胞再懸浮於1ml TRIZOL中。添加200μl的氯仿後，劇烈搖動管。將樣本在4℃下離心10分鐘。將水相轉移至新鮮微量離心管並添加等體積的異丙醇。劇烈搖動管並使其在室溫下培養10分鐘。然後將樣本在4℃下離心10分鐘。將沉澱物用1ml的70%乙醇洗滌一次，並在真空乾燥機中短暫乾燥。將RNA沉澱物用40μl經DEPC處理的水再懸浮。藉由在1%瓊脂糖凝膠中分餾0.5μl來測定RNA製劑之品質。將RNA儲存於-80℃冷凍器中，直到使用。
為了製備重鏈及輕鏈cDNA，製備了混合物，其包括3μl的RNA及1μg的寡核苷酸119(重鏈)或寡核苷酸117(輕鏈)(參見表1)，其體積為11.5μl。將混合物在70℃下於水浴中培養10分鐘，然後在冰上冰鎮10分鐘。製備分開的混合物，其係由2.5μl的10X反轉錄酶緩衝劑、10μl的2.5mM dNTP、1μl的反轉錄酶(20單位)、及0.4μl的核糖核酸酶抑制劑RNasin(1單位)製成。將13.5μl的該混合物添加至11.5μl的經冰鎮RNA/寡核苷酸混合物中，並將反應在42℃下培養40分鐘。然後將cDNA合成反應儲存於-20℃冷凍器中，直到使用
未經純化的重鏈及輕鏈cDNA係用來作為PCR擴增可變區編碼序列之模板。同時測試五個寡核苷酸對(366/354、367/354、368/354、369/354、及370/354，表1)引發重鏈DNA擴增的能力。同時測試兩個寡核苷酸對(362/208及363/208)引發輕鏈DNA擴增的能力。使用2單位的PLATINUM TM高保真度(HIFI)Taq DNA聚合酶進行PCR反應，總體積為50μl。各反應包括2μl的cDNA反應、10皮莫耳的各寡核苷酸、0.2mM dNTP、5μl的10×HIFI緩衝劑、及2mM硫酸鎂。熱循環程式係在95℃下5分鐘，接著進行30個循環(在94℃下30秒、在62℃下30秒、在68℃下1.5分鐘)。然後在68℃下最終培養10分鐘。
為了製備用於直接DNA定序的PCR產物，使用QIAquickTM PCR純化套組根據製造商的規程將其純化。使用50μl的無菌水將DNA自離心管柱洗提，然後使用真空乾燥機將其乾燥至體積為10μl。然後用1μl的經純化PCR產物、10μM寡核苷酸引子、4μl BigDye TerminatorTM就緒反應混合物、及14μl無菌水進行DNA定序反應，總體積為20μl。將用寡核苷酸 對367/354製成之重鏈PCR產物以寡核苷酸引子159及360定序。將用寡核苷酸對363/208製成之輕鏈PCR產物以寡核苷酸34及163定序。用於定序之熱循環程式係25個循環(在96℃下30秒、在50℃下15秒、在60℃下4分鐘)，接著在4℃下整夜。將反應產物透過聚丙烯醯胺凝膠分餾，並使用ABI 377 DNA定序儀來偵測。
定點誘變以改變胺基酸：改變TNV148重鏈可變區DNA序列中之單一核苷酸，以用絲胺酸殘基置換TNV148 mAb中之Pro75。設計並定購互補寡核苷酸(399及400(表1))以使用如製造商所述之QuikChangeTM定點誘變方法來作此改變。首先將兩個寡核苷酸透過15%聚丙烯醯胺凝膠分餾，並純化主帶。使用10ng或50ng的TNV148重鏈質體模板(p1753)、5μl的10X反應緩衝劑、1μl的dNTP混合物、125ng的引子399、125ng的引子400、及1μl的Pfu DNA聚合酶來準備誘變反應。添加無菌水以使總體積為50μl。然後將反應混合物在熱循環器中培養，程序設定為在95℃培養30秒，然後以下列依序培養循環14次：95℃下30秒、55℃下1分鐘、64℃下1分鐘、及68℃下7分鐘，接著在30℃下2分鐘(1個循環)。設計這些反應以將該等誘變寡核苷酸併入在其他方面相同、新合成的質體中。為了除去原始TNV148質體，在添加1μl的DpnI內切酶後，將樣本在37℃下培養1小時，其會只切割出原始經甲基化質體。然後，藉由標準熱休克方法，將一μl的反應用來轉化Epicurian Coli XL1-Blue超勝任大腸桿菌(supercompetent E.coli)，並在LB-安比西林瓊脂盤上接種後識別經轉化細菌。如製造商所述，使用WizardTM套組製備質體小量製備物。自WizardTM管柱洗提樣本之後，用乙醇將質體DNA沉澱以進一步純化質體DNA，然後再懸浮於20μl的無菌水中。然後執行DNA序列分析以識別出具有所欲鹼基改變之質體殖株，並確認沒有其他鹼基改變被不經意地引入TNV148編碼序列中。使用第4.3節中描述的相同參數，使一μl的質體經受循環定序反應，該循環反應由3μl的BigDye混合物、1μl的pUC19正向引子、及10μl的無菌水製備。
自12B75基因建構表現載體：執行數個重組DNA步驟以分別自先前選殖的編碼12B75之重鏈及輕鏈基因的基因體拷貝製備新的人類 IgG1表現載體及新的人類κ表現載體，其揭示於美國專利申請案第60/236,827號(2000年10月7日申請，標題為IL-12 Antibodies,Compositions,Methods and Uses，公開為WO 02/12500)中，其全文以引用方式併入本文中。設計最終載體以允許用任何經適當設計且經PCR擴增之可變區簡單且一步置換現有的可變區序列。
為了修飾質體p1560中之12B75重鏈基因，將含有啟動子及可變區之6.85kb BamHI/HindIII片段從p1560轉移至pUC19以製造p1743。與p1560相比，此質體的尺寸較小，而可使用QuikChangeTM誘變法(使用寡核苷酸BsiWI-1及BsiWI-2)就在轉譯起始位點上游按照製造商的規程引入獨特的BsiWI選殖位點。所得質體稱為p1747。為了在可變區3'端引入BstBI位點，設計了具有SalI及BstBI位點之5'寡核苷酸引子。將此引子與pUC反向引子一起使用以從p1747擴增2.75kb片段。然後將此片段選殖回在12B75可變區中的天然存在SalI位點及HindIII位點，從而引入獨特的BstB1位點。所得之中間體載體(指定為p1750)可接受具有BsiWI及BstBI端之可變區片段。為了製備其中恆定區亦衍生自12B75基因之重鏈載體版本，將p1750中之BamHI-HindIII插入物轉移至pBR322，以具有在HindIII位點下游之EcoRI位點。然後將所得質體p1768用HindIII及EcoRI截切，並連接至來自p1744(藉由將來自p1560的大BamHI-BamHI片段選殖至pBC所衍生之次殖株)之5.7kb HindIII-EcoRI片段。然後使用所得質體p1784作為具有BsiWI及BstBI端之TNV Ab cDNA片段的載體。進行額外作業來製備表現載體p1788及p1798，其包括來自12B75基因之IgG1恆定區，且彼此之間的差異在於彼等含有多少12B75重鏈J-C內含子。
為了修飾質體p1558中之12B75輕鏈基因，將含有12B75啟動子及可變區之5.7kb SalI/AflII片段從p1558轉移至質體L28之XhoI/AflII位點中。此新的質體p1745提供用於誘變步驟之較小模板。藉由QuikChangeTM誘變，使用寡核苷酸(C340salI及C340sal2)在可變區之5'端引入獨特的SalI限制位點。所得中間體載體p1746具有獨特的SalI及AflII限制位點，可變區片段可被選殖至該等限制位點中。經選殖至p1746中之任何可變區片段將較佳地與輕鏈基因的3'半部連接。為了從可用於此目的之 12B75輕鏈基因之3'半部製備限制片段，將寡核苷酸BAHN-1及BAHN-2彼此黏合以形成含有限制位點BsiW1、AflII、HindII、及NotI之雙股連接子，且其含有可被連接至KpnI及SacI位點中之末端。將此連接子選殖在pBC之KpnI與SacI位點之間以給出質體p1757。將含有12B75輕鏈恆定區之7.1kb片段(藉由用AflII截切、然後用HindIII部分截切p1558所產生)選殖在p1757之AflII與HindII位點之間以產生p1762。此新的質體含有BsiWI及AflII之獨特位點，可將含有啟動子及可變區之BsiWI/AflII片段轉移至其中以結合該基因的兩個半部。
cDNA選殖及表現質體之組裝：所有RT-PCR反應(參見上文)均用Klenow酶處理，以進一步填充DNA末端。將重鏈PCR片段用限制酶BsiWI及BstBI截切，然後將其選殖在質體L28(使用L28係因為12B75系之中間體載體p1750尚未製備)的BsiWI與BstBI位點之間。經選殖插入物的DNA序列分析顯示所得建構體是正確的，且在PCR擴增期間沒有引入錯誤。這些L28質體建構體(TNV14、TNV15、TNV148、TNV148B、及TNV196)之所指派識別號係示於表3中。
將用於TNV14、TNV148、及TNV148B重鏈之BsiWI/BstBI插入物自L28載體轉移至新製備的中間體載體p1750。這些中間體質體之所指派識別號係示於表2中。對於TNV15及TNV196，未進行此選殖步驟及後續步驟。然後將可變區轉移至兩個不同的人類IgG1表現載體中。限制酶EcoRI及HindIII係用來將可變區轉移至Centocor先前使用的IgG1載體p104中。將編碼Gm(f+)同種異型之IgG1的所得表現質體指定為p1781(TNV14)、p1782(TNV148)、及p1783(TNV148B)(參見表2)。亦將可變區選殖在衍生自12B75(GenPharm)基因之IgG1恆定區的上游。編碼G1m(z)同種異型之IgG1的表現質體亦列於表3中。
表3.各種重鏈及輕鏈質體之質體識別號。
L28載體或pBC載體代表初始Ab cDNA殖株。將該些質體中之插入物轉移至不完整的12B75系載體中，以製備中間體質體。一個額 外的轉移步驟導致最終表現質體在被線性化之後引入細胞中或用於在細胞轉染之前純化mAb基因插入物。(ND)=未進行。
Figure 109108133-A0202-12-0099-7
將輕鏈PCR產物用限制酶SalI及SacII截切，然後選殖在質體pBC之SalI與SacII位點之間。將兩個不同的輕鏈版本(其相差一個胺基酸)指定為p1748及p1749(表2)。DNA序列分析證實了這些建構體具有正確序列。然後將p1748及p1749中之SalI/AflII片段分別選殖在中間體載體p1746之SalI與AflII位點之間，以製備p1755及p1756。然後藉由將BsiWI/AflII片段自p1755及p1756轉移至新製備的建構體p1762，而將輕鏈基因的5'半部連接到基因的3'半部，分別製成最終表現質體p1775及p1776(表2)。
細胞轉染、篩選、及次選殖：用各種TNV表現質體執行總共15個小鼠骨髓瘤細胞轉染(參見在結果及討論章節中之表3)。這些轉染係藉由下列區別：(1)宿主細胞係Sp2/0或是653；(2)重鏈恆定區係由 Centocor先前的IgG1載體或12B75重鏈恆定區編碼；(3)mAb係TNV148B、TNV148、TNV14、或新的HC/LC組合；(4)DNA係線性化質體或經純化的Ab基因插入物；及(5)重鏈基因中完整的J-C內含子序列存在或不存在。此外，重複數個轉染以增加可篩選之大量殖株的可能性。
如先前所述，在標準條件下藉由電穿孔，用重鏈及輕鏈DNA的混合物(各8至12：g)各自轉染Sp2/0細胞及653細胞(Knight DM et al.(1993)Molecular Immunology 30：1443-1453)。針對轉染編號1、2、3、及16，在轉染前藉由用限制酶截切，對適當的表現質體進行線性化。舉例而言，分別使用SalI及NotI限制酶來線性化TNV148B重鏈質體p1783及輕鏈質體p1776。對於其餘的轉染，藉由截切具有BamHI的重鏈質體及具有BsiWI及NotI之輕鏈質體，自質體載體中分離出僅含有mAb基因之DNA插入物。然後藉由瓊脂糖凝膠電泳及Qiex純化樹脂將mAb基因插入物純化。將經純化基因插入物轉染之細胞用3至5：g之PstI線性化pSV2gpt質體(p13)同時轉染，作為可選擇標記之來源。電穿孔後，將細胞接種在IMDM、15% FBS、2mM麩醯胺酸中於96孔組織培養皿中，並在37℃下於5% CO2培養箱中進行培養。兩天後，添加等體積的IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸、2×MHX選擇(1×MHX=0.5：g/ml黴酚酸、2.5：g/ml次黃嘌呤、50：g/ml黃嘌呤)，且當殖株形成時，將盤額外培養2至3週。
如所述，藉由ELISA來檢定從具有殖株的孔所收集的細胞上清液中之人類IgG。簡言之，將細胞上清液的不同稀釋液在塗佈有多株山羊抗人類IgG Fc片段的96孔EIA盤中培養，然後使用鹼性磷酸酶偶聯山羊抗人類IgG(H+L)及適當的彩色受質來偵測結合的人類IgG。在各EIA盤上包括標準曲線，該曲線使用在細胞上清液中測量的相同純化mAb作為標準品，以定量上清液中的人類IgG。將似乎產生最多人類IgG的質株中之細胞繼代到24孔盤中，以便在用過的培養物中進行額外生產測定，且隨後識別出產量最高的親本殖株。
將產量最高的親本殖株進行次選殖，以識別出產量更高之次殖株，並製備更均質的細胞系。96孔組織培養盤係於IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸、1×MHX中接種有每孔一個細胞或每孔四個細胞，並在37 ℃下於5% CO2培養箱中培養12至20天直到殖株顯而易見。從每孔含有一個殖株的孔中收集細胞上清液，並如上所述藉由ELISA分析。將所選之殖株繼代至24孔盤中，並使培養物失效，然後藉由定量其等之上清液中的人類IgG水平來識別出產量最高的次殖株。當使所選的第一輪次殖株經受第二輪次選殖時，重複此程序。選擇最佳的第二輪次殖株作為用於開發之細胞系。
細胞次殖株之表徵：選擇最佳的第二輪次選殖並執行生長曲線，以評估mAb生產水平及細胞生長特性。T75燒瓶係於30ml IMDM、5%FBS、2mM麩醯胺酸、及1X MHX(或無血清培養基)中接種有1×105個細胞/ml。每隔24hr取300μl的等分試樣並測定活細胞密度。持續分析直到活細胞數量小於1×105個細胞/ml。檢定所收集的細胞上清液等分試樣中存在的抗體濃度。使用rTNV148B或rTNV14 JG92399作為標準品來執行ELISA檢定。將樣本在塗佈有多株山羊抗人類IgG Fc之ELISA盤上培養1小時，並用鹼性磷酸酶偶聯山羊抗人類IgG(H+L)以1：1000稀釋液偵測結合的mAb。
亦針對兩種細胞系進行不同的生長曲線分析，目的在比較不同量的MHX選擇存在下之生長速率。將細胞系C466A及C466B解凍至不含MHX的培養基(IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸)中並額外培養兩天。然後將兩種細胞培養物分成不含MHX、含有0.2X MHX、或含有1X MHX(1X MHX=0.5：g/ml黴酚酸、2.5：g/ml次黃嘌呤、50：g/ml黃嘌呤)之三種培養物。一天後，將新鮮T75燒瓶以1×105個細胞/ml之起始密度接種培養物，並以24小時間隔計數細胞持續一週。未收集用於mAb生產之等分試樣。使用SOP PD32.025中所提供之式來計算這些樣本的倍增時間。
執行額外研究以評估mAb生產隨時間的穩定性。使培養物在24孔盤中在IMDM、5% FBS、2mM麩醯胺酸中生長，在有或沒有MHX選擇的情況下。每當培養物變成鋪滿(confluent)時，將其分至新鮮的培養物，然後使較舊的培養物失效。此時，取上清液之等分試樣並儲存在4℃下。在55至78天期間內取得等分試樣。在此期間結束時，如以上所概述，藉由抗人類IgG Fc ELISA測試上清液中存在的抗體量。
結果及討論：
抑制TNF結合至重組受體：
進行了簡單的結合檢定以測定融合瘤細胞上清液中含有的八種TNV mAb是否能夠阻斷TNFα與受體的結合。首先藉由針對人類IgG的標準ELISA分析來測定彼等各別細胞上清液中的TNV mAb濃度。接著將重組p55TNF受體/IgG融合蛋白(p55-sf2)塗佈於EIA盤上，並使經125I標示之TNFα在不同量的TNV mAb存在下結合至p55受體。如圖1所示，八種中除了一種(TNV122)以外的所有TNV mAb有效地阻斷了TNFα與p55受體的結合。事實上，TNV mAb似乎比摻入陰性對照融合瘤上清液中之cA2陽性對照mAb更有效地抑制TNFα結合。這些結果被解讀為指示，TNV mAb很可能會在基於細胞之檢定中及在體內阻斷TNFα生物活性，並因此有必要進行額外分析。
DNA序列分析：
確認RNA編碼人類mAb：
作為表徵在受體結合檢定中顯示TNFα阻斷活性的七種TNV mAb(TNV14、TNV15、TNV32、TNV86、TNV118、TNV148、及TNV196)的第一步驟，從產生這些mAb的七種融合瘤細胞系單離出總RNA。然後使用各RNA樣本來製備人類抗體重鏈或輕鏈cDNA，其包括各mAb之完整的信號序列、完整的可變區序列、及部分恆定區序列。然後在PCR反應中擴增這些cDNA產物，且無需先選殖片段即可直接對經PCR擴增DNA進行定序。經定序的重鏈cDNA與存在於小鼠的五種人類生殖系基因中之一者(DP-46)具有>90%的同一性(圖2A-B)。同樣地，經定序的輕鏈cDNA與存在於小鼠中的人類生殖系基因中之一者具有100%或98%的同一性(圖3)。這些序列結果證實了轉錄成cDNA並經定序之RNA分子編碼人類抗體重鏈及人類抗體輕鏈。應注意的是，因為可變區係使用映射到信號序列編碼序列5'端的寡核苷酸經PCR擴增的，所以信號序列之前幾個胺基 酸可能不是原始TNV轉譯產物之實際序列，但彼等確實代表重組TNV mAb之實際序列。
獨特的中和mAb：
用於各mAb的重鏈及輕鏈兩者之整個可變區的cDNA序列之分析顯示，TNV32與TNV15相同，TNV118與TNV14相同，而TNV86與TNV148相同。受體結合檢定的結果與DNA序列分析一致，即在阻斷TNF結合方面，TNV86及TNV148兩者皆比TNV118及TNV14兩者好大約4倍。因此，後續的作業僅聚焦於四種獨特的TNV mAb，TNV14、TNV15、TNV148、及TNV196。
四種mAb之相關性
DNA序列結果顯示編碼該四種TNV mAb之重鏈的基因皆係彼此高度同源且似乎皆衍生自相同的生殖系基因(DP-46)(圖2A-B)。此外，由於重鏈CDR3序列之各者係如此相似且長度相同，且由於彼等皆使用J6外顯子，因此彼等顯然是由單一VDJ基因重排事件產生的，然後接著發生體細胞變化，使各mAb變獨特。DNA序列分析顯示，在四種mAb中只有兩種不同的輕鏈基因(圖3)。TNV14及TNV15中的輕鏈可變區編碼序列彼此相同，且與人類κ鏈之Vg/38K家族的代表性生殖系序列相同。TNV148及TNV196輕鏈編碼序列彼此相同，但在兩個核苷酸位置與生殖系序列不同(圖3)。
四種mAb之推導的胺基酸序列顯示實際mAb之相關性。四種mAb含有四種不同的重鏈(圖4)，但只含有兩種不同的輕鏈(圖5)。TNV mAb序列與生殖系序列之間的差異大部分係侷限於CDR域，但三種mAb重鏈亦與生殖系序列在架構區中有所不同(圖4)。相較於編碼DP-46生殖系之Ab架構區，TNV14係相同的，TNV15有一個胺基酸不同，TNV148有兩個胺基酸不同，而TNV196有三個胺基酸不同。
cDNA之選殖、位點特異性誘變、及最終表現質體之組裝：cDNA之選殖：基於經PCR擴增之可變區的DNA序列，為了使待選殖 至表現載體中的編碼序列適應，定購新的寡核苷酸以執行另一輪PCR擴增。在重鏈的情況下，將此第二輪PCR之產物用限制酶BsiWI及BstBI截切，並選殖至質體載體L28(質體識別號示於表2中)中。在輕鏈的情況下，用SalI及AflII截切第二輪PCR產物，並將其選殖至質體載體pBC中。接著將個別殖株定序以確認其等之序列與自PCR產物之直接定序獲得的先前序列相同，其顯示在潛在的異質性分子群體中各位置處最多的核苷酸。
位點特異性誘變以改變TNV148：一致地觀察到在中和TNFα生物活性方面，mAb TNV148及TNV196的效力比次佳的mAb(TNV14)高四倍。然而，如上所述，TNV148及TNV196重鏈架構序列與生殖系架構序列不同。TNV148重鏈序列與其他人類抗體之比較指示，許多其他人類mAb在架構1中的位置28處含有Ile殘基(僅計數成熟序列)，而在架構3中的位置75處之Pro殘基在該位置處係一個不尋常的胺基酸。
TNV196重鏈的類似比較意味著其與架構3中的生殖系序列不同的三個胺基酸在人類mAb中可能是罕見的。若投予至人類，這些差異可能會使TNV148及TNV196具有免疫原性。因為TNV148僅有一個相關的胺基酸殘基，且據信此殘基對於TNFα結合而言係不重要的，所以使用位點特異性誘變技術來改變TNV148重鏈編碼序列中(在質體p1753中)之單個核苷酸，使得生殖系Ser殘基將在位置75處代替Pro殘基被編碼出。將所得質體稱為p1760(參見表2)。將所得基因及mAb稱為TNV148B，以將其與原始TNV148基因及mAb區分(參見圖5)。
最終表現殖體之組裝：基於先前選殖為基因體片段之12B75重鏈及輕鏈基因，製備了新的抗體表現載體。雖然製備了不同的TNV表現質體(參見表2)，但在各情況下，5'側接序列、啟動子、及內含子增強子係衍生自各別的12B75基因。對於輕鏈表現質體，完整的J-C內含子、恆定區編碼序列、及3'側接序列亦衍生自12B75輕鏈基因。對於產生最終生產細胞系的重鏈表現質體(p1781及p1783，參見下文)，人類IgG1恆定區編碼序列衍生自Centocor的先前使用的表現載體(p104)。重要的是，此處所記述之最終生產細胞系表現TNV mAb與原始衍生自融合瘤的TNV mAbs(G1m(z))不同的同種異型(Gm(f+))。這係因為衍生自GenPharm小鼠 之12B75重鏈基因在CH1域的C端編碼Arg殘基，而Centocor的IgG1表現載體p104在該位置處編碼Lys殘基。製備其他重鏈表現質體(例如，p1786及p1788)，其中J-C內含子、完整的恆定區編碼序列、3'側接序列係衍生自12B75重鏈基因，但未選擇用這些基因轉染的細胞系作為生產細胞系。精心設計了載體，以允許一步選殖未來的經PCR擴增V區，其會產生最終表現質體。
將經PCR擴增之可變區cDNA自L28或pBC載體轉移至中間體階段之12B75系載體，中間體階段載體提供啟動子區及部分J-C內含子(參見表2之質體識別號)。然後將含有抗體基因之5'半部的限制片段自這些中間體階段載體轉移至最終表現載體，最終表現載體載體提供各別基因之3'半部以形成最終表現質體(參見表2之質體識別號)。
細胞轉染及次選殖：藉由限制截切使表現質體線性化，或從質體主鏈純化出各質體中之抗體基因插入物。藉由電穿孔，用重鏈及輕鏈DNA轉染Sp2/0及653小鼠骨髓瘤細胞。進行十五種不同的轉染，如藉由Ab、Ab基因之具體特性、基因係在經線性化的完整質體或經純化基因插入物中、及宿主細胞系定義，大多數轉染係獨特的(總結於表4中)。藉由ELISA，檢定了對黴酚酸有抗性的殖株之細胞上清液中人類IgG的存在，並使用經純化rTNV148B作為參考標準曲線進行定量。
產量最高之rTNV148B細胞系
將來自rTNV148B轉染2之十個產量最高的653親本系(在用過的24孔培養物中產生5至10：g/ml)進行次選殖，以篩選產量更高之細胞系並製備更均質的細胞群。親本系2.320、2.320-17、及2.320-20的兩個次殖株在用過的24孔培養物中產生大約50：g/ml，此係彼等之親本系的5倍增加。經次選殖系2.320-17及2.320-20之第二輪選殖導致
顯示編碼各mAb之重鏈及輕鏈質體之識別號。在用經純化mAb基因插入物進行轉染的情況下，將質體p13(pSV2gpt)包括在內，作為gpt可選擇標記之來源。重鏈恆定區係藉由用於編碼類克之相同的人類IgG1表現載體編碼(「舊」)，或藉由12B75(GenPharm/Medarex)重鏈基因內 含有的恆定區編碼(「新」)。H1/L2係指由TNV14重鏈及TNV148輕鏈所構成之「新穎」mAb。質體p1783及p1801的區別僅在於彼等之重鏈基因含有多少J-C內含子。轉染編號(其定義細胞殖株之通用名稱的第一個號碼)係顯示於右側。本文所述之rTNV148B生產細胞系C466(A,B,C,D)及C467A分別衍生自轉染編號2及1。rTNV14生產細胞系C476A衍生自轉染編號3。
表4.細胞轉染彙總。
Figure 109108133-A0202-12-0106-9
用過的24孔培養物上清液之ELISA檢定指示，這些第二輪次殖株的產量均在98與124：g/ml之間，比第一輪次殖株增加了至少2倍。對這些653細胞系指派C代碼名稱，如表5所示。
將來自rTNV148B轉染1之三個產量最高的Sp2/0親本系進行次選殖。親本系1.73的兩輪次選殖造成在用過的24孔培養物中識別出產生25：g/ml的殖株。將此Sp2/0細胞系指定為C467A(表5)。
產量最高之rTNV14細胞系
將來自rTNV14轉染3之三個產量最高的Sp2/0親本系進行次選殖一次。已發現次殖株3.27-1係用過的24孔培養物中產量最高者，產量為19：g/ml。將此細胞系指定為C476A(表5)。
表5.所選之生產細胞系及其C代碼的彙總。
原始殖株名稱之第一位數指示細胞系衍生自哪個轉染。此處記述的所有C編碼細胞系均衍生自用限制酶線性化之重鏈及輕鏈完整質體的轉染。
Figure 109108133-A0202-12-0107-10
經次選殖細胞系之表徵
為了更仔細地表徵細胞系生長特性並以更大規模測定mAb生產水平，使用T75培養執行生長曲線分析。結果顯示，四個C466系列細胞系之各者達到在1.0×106與1.25×106個細胞/ml之間的峰細胞密度及在110與140：g/ml之間的最大mAb累積水平(圖7)。相反地，產量最高之Sp2/0次殖株(C467A)達到2.0×106個細胞/ml之峰細胞密度及25：g/ml之最大mAb累積水平(圖7)。未在rTNV14生產細胞系C476A上進行生長曲線分析。
進行額外生長曲線分析，以比較不同濃度的MHX選擇中之生長速率。此比較係由最近的觀察提示，在MHX不存在的情況下培養的C466細胞似乎比在正常量的MHX(1X)中培養的相同細胞生長更快。由於化合物(諸如，黴酚酸)之細胞毒性濃度傾向於在數個數量級上進行測量，因此認為使用較低濃度的MHX可能導致顯著較快的細胞倍增時間，而不犧牲mAb生產的穩定性。細胞系C466A及C466B在下列情況下培養：無MHX、0.2X MHX、或1X MHX。每隔24小時取得活細胞計數達7天。結果的確顯示出MHX濃度依賴性之細胞生長速率(圖8)。細胞珠C466A在1X MHX中顯示25.0小時的倍增時間，但在無MHX中僅為20.7小時。類似地，細胞系C466B在1X MHX中顯示32.4小時的倍增時間，但在無MHX中僅為22.9小時。重要地，兩個細胞系在0.2X MHX中的倍增時間比起在1X MHX中更類似於在無MHX中所觀察到的(圖8)。此觀察結果提高可藉由使用更少MHX來實現生物反應器中細胞性能增強的可能性，對於細胞性能而言，倍增時間係一個重要的參數。然而，雖然穩定性測試結果(參見下文)表明，即使沒有MHX存在，細胞系C466D仍能穩定地生產rTNV148B至少60天，但當細胞係在MHX存在下培養時，穩定性測試亦顯示出相較於MHX不存在下更高的mAb生產水平。
為了評估大約60天期間內自各種細胞系的mAb生產，對含有或不含有MHX選擇之培養物執行穩定性測試。並非所有細胞系維持高mAb生產。僅培養兩週後，殖株C466A的產量比研究開始時低大約45%。自殖株C466B之生產似乎亦顯著下降。然而，殖株C466C及C466D維持相當穩定的生產，其中C466D顯示出最高絕對生產水平(圖9)。
結論
基於包括蛋白質序列及TNF中和效力之數個標準，從針對人類TNFα之八種人類mAb初始小組，選擇TNV148B作為較佳者、以及TNV14。製備生產大於100：g/ml rTNV148B及19：g/ml rTNV14的細胞系。
實例5：使用抗TNF抗體及對照組使用單次推注注射之關節炎小鼠研究
在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至9個處理組中之一者，並用1mg/kg或10mg/kg之單次腹膜內推注劑量的達爾伯克PBS(Dulbecco's PBS,D-PBS)或本發明之抗TNF抗體(TNV14、TNV148、或TNV196)處理。
結果：當分析從給藥前的重量變化時，在整個研究中，經10mg/kg cA2處理的動物之重量增加始終顯示比經D-PBS處理的動物更高。在第3至7週時，此重量增加係顯著的。經10mg/kg TNV148處理的動物在研究第7週亦達到顯著的重量增加。(參見圖10)。
圖11A至圖11C表示基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數低於D-PBS控制組，此係從第3週開始並持續到研究的其餘部分(第7週)。相較於經D-PBS處理的組時，經1mg/kg TNV14處理的動物及經1mg/kg cA2處理的動物在第3週後均未顯示AI顯著降低。當各者相較於類似劑量的其他者(10mg/kg cA2相較於10mg/kg TNV14、148、及196)時，10mg/kg處理組之間沒有顯著差異。當比較1mg/kg處理組時，1mg/kg TNV148在第3、4、及7週時比1mg/kg cA2顯示顯著較低的AI。在第3及4週時，1mg/kg TNV148亦顯著低於經1mg/kg TNV14處理的組。雖然TNV196至多到研究的第6週顯示AI顯著降低(相較於經D-PBS處理的組時)，但TNV148係唯一在研究結束時仍維持顯著的1mg/kg處理。
實例6：使用抗TNF抗體及對照組作為多次推注劑量之關節炎小鼠研究
在大約4週齡時，基於體重，將Tg197研究小鼠分配至8個處理組中之一者，並用3mg/kg之腹膜內推注劑量的對照組物品(D-PBS)或抗體(TNV14、TNV148)處理(第0週)。在第1、2、3、及4週時，在所有動物中重複注射。評估第1至6組的測試物品療效。在第2、3、及4週評估獲自第7及8組動物的血清樣本之TNV14或TNV148的免疫反應誘導及藥物動力學清除。
結果：當分析從給藥前的重量變化時，並未注意到顯著差異。在整個研究中，經10mg/kg cA2處理的動物之重量增加始終顯示比經D-PBS處理的動物更高。(參見圖12)。
圖13A至圖13C表示基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數顯著低於D-PBS控制組，此係從第2週開始並持續到研究的其餘部分(第5週)。相較於d-PBS控制組時，經1mg/kg或3mg/kg cA2處理的動物及經3mg/kg TNV14處理的動物在整個研究的任何時間均未達到任何AI顯著降低。相較於經d-PBS處理的組時，經3mg/kg TNV148處理的動物顯示顯著的降低，此係在第3週開始並持續到第5週。相較於在研究的第4及5週cA2之較低劑量(1mg/kg及3mg/kg)兩者 時，經10mg/kg cA2處理的動物顯示AI顯著降低，且在第3至5週時亦顯著低於經TNV14處理的動物。雖然在任何3mg/kg處理組之間似乎沒有顯著差異，但用3mg/kg TNV14處理的動物之AI在一些時間點顯著高於10mg/kg，而用TNV148處理的動物與用10mg/kg的cA2處理的動物並無顯著不同。
實例7：使用抗TNF抗體及對照組作為單次腹膜內推注劑量之關節炎小鼠研究
在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至6個處理組中之一者，並以3mg/kg或5mg/kg之單次腹膜內推注劑量的抗體(cA2、或TNV148)處理。此研究使用D-PBS及10mg/kg cA2控制組。
當分析從給藥前的重量變化時，所有處理均達到類似的重量增加。在研究初期(在第2及3週)，用3或5mg/kg TNV148或5mg/kg cA2處理的動物重量增加顯著的量。僅經TNV148處理的動物在稍後的時間點維持顯著的重量增加。用3及5mg/kg TNV148處理的動物兩者在第7週均顯示出顯著性，而3mg/kg TNV148動物在注射後8週仍顯著升高。(參見圖14)。
圖15表示基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。所有處理組在較早的時間點均顯示一些保護作用，其中5mg/kg cA2及5mg/kg TNV148顯示在第1至3週時AI顯著降低，且所有處理組在第2週時均顯著降低。在研究的後期，經5mg/kg cA2處理的動物顯示一些保護作用，其中在第4、6、及7週時顯著降低。cA2及TNV148兩者的低劑量(3mg/kg)在第6週皆顯示顯著降低，且所有處理組在第7週皆顯示顯著降低。沒有處理組能夠在研究結束時(第8週)維持顯著降低。在任何時間點任何處理組(不包括鹽水對照組)之間沒有顯著差異。
實例8：使用抗TNF抗體及對照組作為抗TNF抗體與經修飾抗TNF抗體之間的單次腹膜內推注劑量之關節炎小鼠研究
為了比較單次腹膜內劑量的TNV148(衍生自融合瘤細胞)與rTNV148B(衍生自經轉染細胞)的療效。在大約4週齡時，基於性別及體重，將Tg197研究小鼠分配至9個處理組中之一者，並以1mg/kg之單次腹膜內推注劑量的達爾伯克PBS(Dulbecco=S PBS,D-PBS)或抗體(TNV148、rTNV148B)處理。
當分析從給藥前的重量變化時，在整個研究中，經10mg/kg cA2處理的動物之重量增加始終顯示比經D-PBS處理的動物更高。在第1週及第3至8週時，此重量增加係顯著的。經1mg/kg TNV148處理的動物在研究第5、6、及8週亦達到顯著的重量增加。(參見圖16)。
圖17表示基於關節炎指數之疾病嚴重度之進展。經10mg/kg cA2處理的組之關節炎指數低於D-PBS控制組，此係從第4週開始並持續到研究的其餘部分(第8週)。經TNV148處理的組及經1mg/kg cA2處理的組兩者在第4週皆顯示AI顯著降低。雖然先前研究(P-099-017)顯示，TNV148在單次1mg/kg腹膜內推注後，在降低關節炎指數方面稍微更有效，但此研究顯示，兩種版本之經TNV抗體處理之組的AI皆略高。雖然(除了第6週以外)相較於10mg/kg cA2組時，經1mg/kg cA2處理的組並未顯著提高，且經TNV148處理的組在第7及8週時顯著較高，但在研究中的任何點，在1mg/kg cA2、1mg/kg TNV148、及1mg/kg TNV148B之間AI沒有顯著差異。
實例9：生產SIMPONI®(戈利木單抗)之製程
戈利木單抗之背景
使用抗TNFα藥劑之療法已成功用於治療發炎性關節炎，但早期的抗TNFα藥劑在安全性、給藥方案、成本、及/或免疫原性方面有限制。為了解決一些限制，開發了一種完全人類抗TNFαmAb，稱為SIMPONI®(戈利木單抗)。戈利木單抗(亦稱為CNTO 148及rTNV148B)係一種具有免疫球蛋白G 1(IgG1)重鏈同型(G1m[z]同種異型)及κ輕鏈同型之完全人類單株抗體。戈利木單抗具有包含SEQ ID NO：36之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：37之輕鏈(LC)。戈利木單抗之分子量係在149,802至151,064道耳頓之範圍內。
戈利木單抗與人類腫瘤壞死因子α(TNFα)之可溶性及跨膜生物活性形式兩者形成高親和力、穩定的複合物，其具有高親和力及特異性，可防止TNFα與其受體結合並中和TNFα生物活性。未觀察到與其他TNFα超家族配體的結合；特別是戈利木單抗不結合或中和人類淋巴毒素。TNFα主要係由活化的單核球、巨噬細胞、及T細胞合成的跨膜蛋白，彼等自締合(self-associate)以形成生物活性同三聚體，並藉由蛋白水解從細胞表面迅速釋放出來。TNFα與p55或p75 TNF受體的結合導致受體胞質域的聚集並起始傳訊。腫瘤壞死因子α已被識別為回應於各種刺激而產生的關鍵前哨細胞介素(sentinel cytokine)，且隨後透過凋亡蛋白酶依賴性細胞凋亡途徑及轉錄因子核因子(NF)-κB及活化蛋白-1(AP-1)的活化而促進發炎反應。腫瘤壞死因子α亦透過其在生發中心(germinal center)中組織免疫細胞的作用來調節免疫反應。TNFα的升高表現與慢性發炎性疾病(諸如類風濕性關節炎(RA))、以及脊椎關節病變(諸如牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis,PsA)及僵直性脊椎炎(AS))有關。TNFα係關節發炎及結構性損傷(其為這些疾病的特性)的重要介導物。
戈利木單抗之臨床試驗
在一項全球性、隨機、雙盲、安慰劑對照的第3期研究中，在患有僵直性脊椎炎(AS)(研究C0524T09)的對象中皮下(SC)投予戈利木單抗被證明在受到僵直性脊椎炎(AS)影響的對象中在改善徵象及症狀、身體機能、及健康相關生活品質(health-related quality of life,HRQOL)上係有效的。此外，安全性分析顯示SC戈利木單抗大致上耐受良好，並顯示類似於其他抗TNFα藥劑觀察到的安全性概況。
鑒於SC戈利木單抗之已知安全性及療效，預期與風濕性疾病(諸如RA、PsA、及AS)中的其他抗TNFα藥劑一致，IV戈利木單抗亦證明為有效且具有可接受之安全性概況。靜脈內戈利木單抗已在第3期研究(CNTO148ART3001)中進行了明確研究，該研究成為核准用於RA治療的 基礎。CNTO148ART3001研究係一項針對戈利木單抗之IV投予的療效及安全性的隨機、雙盲、安慰劑對照、多中心、兩臂(2-arm)研究，在患有活動性RA的對象中，儘管並行接受胺甲喋呤(MTX)療法，在第0、4週及其後每8週(q8w)時，於30±10分鐘的期間內投予2mg/kg輸注。儘管有MTX，但患有活動性RA的對象在第0、4週、及每8週至第24週，隨機接受安慰劑輸注或投予2mg/kg之IV戈利木單抗。從第24週開始，所有對象皆用IV戈利木單抗治療至第100週。證明IV戈利木單抗在改善RA徵象及症狀、身體機能、及健康相關生活品質、以及抑制結構性損傷之進展上提供實質效益。在RA治療中靜脈內投予之戈利木單抗(CNTO148ART3001)顯示出強大的療效及輸注反應發生率低之可接受的安全性概況。
最近，設計了兩個第3期研究，以評估靜脈內(IV)戈利木單抗在患有活動性僵直性脊椎炎(AS)及活動性牛皮癬性關節炎(PsA)的對象之治療中的療效及安全性。因為相較於IV戈利木單抗之30±10分鐘輸注，目前可用之IV抗TNFα藥劑在免疫原性、輸注反應方面具有限制，且輸注時間較長(60至120分鐘)，故受試者之IV投予途徑正受到評估。與SC藥劑相比，患者亦可能較偏好維持劑量排程之IV戈利木單抗，而非較頻繁的投予。
製程概述
Simponi(戈利木單抗)係在9階段程序中製造，該程序包括連續灌注細胞培養物，之後進行純化。在圖18中提供製程概述。
如本文中所使用，用語「培養物(culture)」、「培養(culturing/cultured)」、及「細胞培養物(cell culture)」係指在適於細胞群存活及/或生長之條件下懸浮於培養基中的細胞群。從上下文中對所屬技術領域中具有通常知識者而言將清楚的是，如本文中所使用的這些用語亦指包含細胞群及該細胞群懸浮於其中之培養基的組合。細胞培養物包括例如藉由批次、饋料批次(fed-batch)、或灌注細胞培養方法、及類似者生長之細胞。在某些實施例中，細胞培養物係哺乳動物細胞培養物。
用於本發明之細胞系包括哺乳動物細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、人類胚胎腎細胞(HEK細胞)、幼小倉鼠腎細胞(BHK細胞)、小鼠骨髓瘤細胞(例如，NS0細胞及Sp2/0細胞)、及人類視網膜細胞(例如，PER.C6細胞)。
如本文中所使用，用語「化學成分確定的培養基(chemically defined medium/chemically defined media)」係指已知其中所有組分之身分及濃度的合成生長培養基。化學成分確定的培養基不含有細菌、酵母、動物、或植物萃取物、動物血清或血漿，然而彼等可或可不包括個別植物或動物衍生之組分(例如蛋白質、多肽等)。化學成分確定的培養基可含有支持生長所需之無機鹽，諸如磷酸鹽、硫酸鹽、及類似者。碳來源係確定的，且通常係糖，諸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、及類似者、或其他化合物，諸如甘油、乳酸鹽、乙酸鹽、及類似者。雖然某些化學成分確定的培養基亦使用磷酸鹽作為緩衝劑，但可採用其他緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、三乙醇胺、及類似者。如本文中所使用，化學成分確定的培養基含有不多於微莫耳量之任何金屬離子。市售化學成分確定的培養基之實例包括但不限於ThermoFisher的CD Hybridoma培養基及CDHybridoma AGTTM培養基、各種達爾伯克改良伊格爾(DME)培養基(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences,Inc)、哈姆營養混合物(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences,Inc)、其組合、及類似者。製備化學成分確定的培養基之方法在所屬技術領域中係已知的，例如於美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217、及美國專利申請案公開號2008/0009040及2007/0212770中。
如本文中所使用，用語「生物反應器(bioreactor)」係指任何可用於細胞培養物之生長的容器。生物反應器可係任何尺寸，只要其可用於細胞的培養。在某些實施例中，此類細胞係哺乳動物細胞。一般而言，生物反應器會係至少1公升且可係10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000公升或更多、或之間的任何體積。生物反應器的內部條件(包括但不限於pH及溫度)在培養期期間可選地受控制。生物反應器可由任何適用於將哺乳動物細胞培養物在本發明之培養條件下保持懸浮於培養基中的任何材料構成，包括玻璃、塑膠、或金屬。如 本文中所使用，用語「生產生物反應器(production bioreactor)」係指在所關注之多肽或醣蛋白的生產中使用的最終生物反應器。生產生物反應器的體積一般係至少500公升，且可係1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000公升或更多、或之間的任何體積。所屬技術領域中具有通常知識者將認知到且能夠選擇適合用於實施本發明的生物反應器。
針對在Sp2/0細胞中表現之戈利木單抗的大規模生產，在第1階段及第2階段中執行預培養、細胞擴增、及細胞生產。在第1階段中，預培養係從表現戈利木單抗HC及LC序列之經轉染Sp2/0細胞的單一工作細胞庫小瓶起始，且該等細胞係在培養瓶、拋棄式培養袋、及配備有內部旋轉過濾器之50-L灌注種子生物反應器(perfusion seed bioreactor)或配備有交替切向流中空纖維過濾器(alternating tangential flow hollow-fiber filter,ATF)細胞保留系統之200-L灌注種子生物反應器中擴增。培養細胞直到獲得用於500-L或1000-L生產生物反應器之接種所需之細胞密度及體積。在第2階段中，使用ATF系統在500-L或1000-L生產生物反應器中連續灌注細胞培養物。自ATF系統收集細胞培養滲透物(採集物)，同時使細胞返回到生物反應器中，並用新鮮培養基補充培養物。自生物反應器移出的生物質可與自ATF系統取出的採集物合併，然後可經澄清(clarified)以產生匯集的採集物而用於進一步處理。
自細胞培養採集物中純化戈利木單抗係在第3階段至第8階段，藉由親和力及離子交換層析步驟以及去活化或移除潛在病毒汙染的步驟(溶劑/清潔劑處理及病毒移除過濾)之組合來執行。在第3階段中，使採集物及/或匯集的採集物澄清，並使用蛋白質A親和力層析法純化。將所得的直接產物捕獲(direct product capture,DPC)洗出液冷凍，直到進一步處理。解凍後，在第4階段中將DPC洗出液過濾並匯集，隨後在第5階段中用三正丁基磷酸酯(TNBP)及聚山梨醇酯80(PS 80)處理，以使任何可能存在的脂質套膜(lipid-enveloped)病毒去活化。
在第6階段中，使用陽離子交換層析法自戈利木單抗產物中移除TNBP及PS 80試劑及雜質。在第7階段中，使用陰離子交換層析法進 一步純化戈利木單抗產物，以移除DNA、可能存在的病毒、及雜質。在第8階段中，將經純化戈利木單抗產物稀釋並過濾通過病毒保留過濾器。
在第9階段中執行戈利木單抗之最終製備。超濾步驟將戈利木單抗產物濃縮，且透析過濾步驟添加配方賦形劑並移除程序中的緩衝劑鹽。添加PS 80，並將中間體過濾至聚碳酸酯容器中，以用於冷凍儲存作為經調配主體(formulated bulk,FB)，以用於原料藥(DS)及藥品(DP)。
如本文中所使用，用語「原料藥(drug substance)」(簡稱為「DS」)及「藥品(drug product)」(簡稱為「DP」)係指用於作為商業藥物之組成物，例如用於臨床試驗或作為上市藥物。DS係活性成分，其旨在疾病之診斷、治癒、減輕、治療、或預防中提供藥理活性或其他直接效應，或影響人體之結構或任何功能。DP(亦稱為藥用產品(medicinal product)、藥(medicine)、藥物(medication)、或藥劑(medicament))係用於診斷、治癒、減輕、治療、或預防疾病、或影響人體之結構或任何功能的藥物(drug)。製程中所產生之經調配主體(FB)係原料藥(DS)。DP係已經被製備成用於銷售及/或投予患者之藥用產品的DS。
在使用Sp2/0細胞之大規模製程中細胞培養之描述
第1階段
預培養及擴增
生產Simponi(戈利木單抗)的第一階段係從表現戈利木單抗HC及LC序列之經轉染Sp2/0細胞的工作細胞庫(WCB)小瓶起始預培養，並隨後在培養瓶、拋棄式培養袋、及50-或200-L種子生物反應器中擴增細胞培養物。培養細胞直到獲得用於500-或1000-L生產生物反應器之接種所需之細胞密度及體積。描繪具有程序中管制及程序監測測試之預培養及擴增步驟的第1階段流程圖係提供於圖19中。
製程
將來自WCB之冷凍小瓶解凍，並用補充有6mM L-麩醯胺酸、0.5mg/L黴酚酸、2.5mg/L次黃嘌呤、及50mg/L黃嘌呤之化學成分確 定的培養基(CD-A培養基)稀釋至接種密度為0.2至0.4×106個活細胞(VC)/mL。解凍時之培養存活率必須係
Figure 109108133-A0202-12-0117-101
50%。將初始繼代維持在溫度及CO2受控之加濕CO2培養箱中的(多個)培養瓶中。將培養物培養2至3天直到獲得0.6×106 VC/mL之最小細胞密度。
藉由在培養瓶及拋棄式培養袋中依序擴增培養物來完成規模放大。藉由用CD-A培養基稀釋，以0.2至0.4×106 VC/mL的細胞密度開始各繼代。將繼代在各擴增步驟下培養2至3天直到獲得0.6×106 VC/mL之最小細胞密度。一旦在拋棄式培養袋中以
Figure 109108133-A0202-12-0117-102
0.8×106 VC/mL及
Figure 109108133-A0202-12-0117-103
80%的培養存活率達到足夠的培養體積，就可將培養物接種至50-或200-L種子生物反應器中。
對各預培養物繼代進行取樣，以用於活細胞密度(viable cell density,VCD)、培養存活率、及顯微鏡檢查。在50-或200-L種子生物反應器的接種之前，對預培養物進行取樣以用於生物負荷量。預培養物在解凍後最多可維持30天。若偵測到微生物污染或超過最大持續時間，則終止預培養。備用預培養物可在種子生物反應器的接種後保留，或者可用新的WCB小瓶解凍開始。將備用預培養物如上所述擴增，並使其經受與初代培養物相同的程序中管制及操作參數。可將備用培養物維持並在需要時用於接種50-或200-L種子生物反應器。
當預培養物符合接種標準時，將(多個)拋棄式培養袋的內容物轉移至50-或200-L種子生物反應器中，以達到
Figure 109108133-A0202-12-0117-104
0.3×106 VC/mL之接種密度。將CD-A培養基進料至50-或200-L種子生物反應器中，並在全工作體積下以灌注模式操作。控制培養物的pH、溫度、及溶解氧濃度以支持細胞生長。擴增50-或200-L種子生物反應器培養物，直到以
Figure 109108133-A0202-12-0117-105
80%的培養存活率獲得
Figure 109108133-A0202-12-0117-106
2.0×106 VC/mL的細胞密度。在整個程序中，對50-或200-L種子生物反應器培養物進行取樣，以用於VCD、培養存活率、及顯微鏡檢查。在500-或1000-L生產生物反應器的接種之前，對50-或200-L種子生物反應器進行取樣以用於生物負荷量。若50-或200-L種子生物反應器之VCD達到
Figure 109108133-A0202-12-0117-107
2.0×106 VC/mL，且500-或1000-L生產生物反應器並未準備好用於接種，則可以灌注模式繼續培養至50-L種子生物反應器的接種後至多6天最大培 養期間及200-L種子反應器的接種後至多7天最大培養期間。若偵測到微生物污染或超過最大持續時間，則終止50-或200-L種子生物反應器操作。
第2階段
生物反應器生產
製程中的第二階段係在500-或1000-L生產生物反應器中之灌注細胞培養。自生產生物反應器收集細胞培養滲透物(採集物)，同時經由交替切向流(ATF)中空纖維細胞保留裝置保留細胞，並用新鮮培養基補充培養物。圖20中提供描繪500-或1000-L生產生物反應器程序之流程圖。
製程
藉由將50-或200-L種子生物反應器的內容物轉移到含有化學成分確定的培養基(補充有6mM L-麩醯胺酸、0.5mg/L黴酚酸、2.5mg/L次黃嘌呤、及50mg/L黃嘌呤，CD-A培養基)之500-或1000-L生產生物反應器中，來執行500-L或1000-L生產生物反應器的接種。所轉移的體積必須足以產出
Figure 109108133-A0202-12-0118-108
0.3×106個活細胞(VC)/mL之接種密度。將培養物維持在34.0至38.0℃之溫度、6.80至7.40之pH、及10至80%之溶解氧濃度。在整個500-或1000L生產程序中執行取樣，以用於活細胞密度(VCD)、培養存活率、生物負荷量、及免疫球蛋白G(IgG)濃度。
在接種後，將培養基進料至培養物之進料速率根據預定排程增加，直到達到最大進料速率。將最大進料速率控制在每天0.80至1.50反應器體積。當達到生物反應器之全工作體積時，使用ATF系統起始灌注以將細胞與滲透物分開。滲透物通過ATF過濾器連續排出，而細胞培養物則在ATF系統與生物反應器之間循環。將ATF滲透物收集在生物程序容器(bioprocess container,BPC)中。
當VCD達到
Figure 109108133-A0202-12-0118-109
8.5×106 VC/mL時，將進料至生物反應器的培養基從CD-A切換至化學成分確定的培養基(補充有6mM L-麩醯胺酸、0.5mg/L黴酚酸、2.5mg/L次黃嘌呤、50mg/L黃嘌呤、及10mM乙酸鈉， CD-B培養基)，但不晚於500-或1000-生產生物反應器的接種後第15天。藉由自培養物之可變生物質移除流手段，將生物反應器中的活細胞密度控制在目標為至少12.0×106 VC/mL。
可將自生物反應器移除的生物質丟棄或與ATF滲透物合併並藉由過濾澄清。
將ATF滲透物指定為採集物流。將乙二胺四乙酸(EDTA)添加至採集物流達5至20mM的濃度。與生物反應器分離之後，將採集物儲存於2至8℃環境的生物程序容器(BPC)中，最長期間為21天。在直接產物捕獲(第3階段)之前，對各採集物BPC進行取樣以用於IgG濃度、內毒素、及生物負荷量。
接種後，在500-或1000-L生產生物反應器中之灌注細胞培養操作持續至多60天。在500-或1000-L生產生物反應器操作的最後一天，對培養物進行取樣以用於黴漿菌及外來病毒(adventitious virus)測試。監測並記述生物反應器IgG濃度僅作為資訊用。
在CHO細胞中表現之戈利木單抗的小規模生產之描述
表現戈利木單抗的CHO細胞之產生
CHO細胞系最初係由T.T.Puck自成年中國倉鼠的卵巢產生的。CHO-K1(ATCC® CCL-61)係缺乏脯胺酸合成基因之親本CHO細胞系的次殖株。亦將CHO-K1寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(European Collection of Cell Cultures)，CHO-K1(ECACC 85051005)。在Celltech Biologics(現為Lonza Biologics)建立了CHO-K1、024M之主細胞庫(master cell bank,MCB)，並用於使CHO-K1適應懸浮液培養及無血清培養基。將經適應細胞系命名為CHOK1SV。使CHOK1SV細胞系在無蛋白質培養基中進一步適應以產生稱為269-M之細胞MCB。如下所述將衍生自269-M MCB之細胞轉染，以產生表現戈利木單抗之CHO細胞系。
在37℃及5% CO2下使用細胞培養盤及搖瓶，在加濕培養箱中生產、擴增、並維持細胞系。搖瓶中的例行接種密度係每mL 3×105個活細胞(vc/mL)。將所有搖瓶培養物以25mm軌道(orbit)維持在每分鐘130轉 (rpm)，並將96深孔(DW,Thermo Scientific,Waltham,MA,Cat.#278743)培養物以3mm軌道維持在800rpm。
使用經識別為MACH-1之培養基(一種用於CHO細胞培養之內部開發、化學成分確定的培養基)來產生表現戈利木單抗之CHO殖株。CHO宿主細胞系之例行繼代的基礎培養基係補充有6mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,Carlsbad,CA,Cat.#25030-081)之MACH-1。除非另有註明，否則將以麩醯胺酸合成酶(GS)基因轉染之CHO細胞生長於MACH-1+MSX中，其係補充有25μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX,Sigma,St.Louis,MO,Cat.#M5379-1G)之MACH-1，以抑制麩醯胺酸合成酶功能。針對推注饋料批次搖瓶及生物反應器實驗，將細胞培養於MACH-1+F8(其係補充有8g/kg F8(專有生長增強劑之補充劑)之MACH-1)中，以進一步支持細胞生長及抗體生產。在搖瓶及生物反應器實驗中使用專有補料培養基(feed media)。
將編碼感興趣基因之DNA選殖至麩醯胺酸-合成酶(GS)雙基因表現質體(Lonza Biologics)中。重鏈(HC)及輕鏈(LC)基因之表現係藉由不同人類巨細胞病毒(hCMV-MIE)啟動子驅動。GS基因選擇標記(由猿猴病毒SV40啟動子驅動)可在MSX存在下，允許在無麩醯胺酸的培養基中選擇經轉染細胞。
在各轉染之前，將1等分試樣的質體DNA(其含有戈利木單抗之HC及LC編碼區兩者)藉由限制酶截切線性化。使用BTX ECM 830Electro Cell Manipulator(Harvard Apparatus,Holliston,MA)，將線性化的15μg DNA等分試樣轉染至1×107個細胞等分試樣中。在4mm間隙透光管中，在250伏特下，使用15毫秒脈衝長度與5秒脈衝間隔，對細胞進行電穿孔3次。使用搖瓶將轉導細胞轉移至MACH-1+L-麩醯胺酸，並將該等細胞培養1天。將轉染離心，然後再懸浮於MACH-1+25uM MSX中以進行選擇，並轉移至搖瓶培養6天。
在化學選擇之後，將細胞接種在含有2.5%(w/v)甲基纖維素之客製化無麩醯胺酸Methocult培養基之單一細胞懸浮液中，該甲基纖維素係在達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)基礎培養基(Methocult,StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Cat.#03899)中。工作溶液亦含有30%(v/v)經γ輻照之透析胎牛血清(dFBS.IR,Hyclone,Logan,UT,Cat.#SH30079.03)、1x GS補充物(SAFC,St.Louis,MO,Cat.#58672-100M)、1.5mg無動物組分蛋白質G Alexa Fluor 488偶聯物(蛋白質G，Invitrogen,Carlsbad,CA,Cat.#C47010)、25μM MSX、具有F12之達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM/F12,Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,Cat.#21331-020)、及細胞懸浮液。
蛋白質G辨識人類單株抗體，並結合至由細胞分泌之IgG。蛋白質G係與螢光標示Alexa Fluor 488偶聯，因此分泌最多抗體之細胞殖株將顯示最高水平的螢光。在培養12至18天之後，使用ClonePix FL殖株挑選儀(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)將具有最高螢光水平之殖株挑選至100μL含酚紅之MACH-1+MSX的96孔盤中，並在無振盪情況下培養5至7天。在5至7天後，藉由將來自96孔盤的細胞添加至96DW盤(Thermo Scientific,Waltham,MA,Cat.#278743)中之50至100μL含酚紅之MACH-1+MSX中，並用3mm軌道以800rpm搖動來將細胞擴增。向96DW盤饋料並在96DW接種後7天經由Octet(ForteBio,Menlo Park,CA)測量效價。將對應最高批次96DW過度生長效價的前10個培養物擴增至搖瓶於MACH-1+MSX中，並建立冷凍細胞庫，其中將細胞懸浮於含有10% DMSO之MACH-1+MSX培養基中。
用於小規模生產之細胞培養
如同在Sp2/0細胞中表現之戈利木單抗的大規模生產，針對在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現之戈利木單抗的小規模生產，在第1階段及第2階段執行預培養、細胞擴增、及細胞生產。在第1階段中，預培養係從表現戈利木單抗之HC及LC序列的經轉染CHO細胞之單一細胞庫小瓶起始，且該等細胞係在培養瓶中擴增。培養細胞直到獲得用於10-L生產生物反應器之接種所需之細胞密度及體積。在第2階段中，在10-L生產生物反應器中以饋料批次模式運行細胞培養。在15天的生物反應器運行期間，根據所需用濃縮基於葡萄糖及基於胺基酸之饋料對培養物進行饋 料。在生產生物反應器運行完成時，澄清細胞培養採集物以移除生物質並過濾以用於進一步處理。
用於小規模生產的純化
用於戈利木單抗之小規模生產的純化步驟與大規模製程相同，只是小規模生產省略了第8階段病毒過濾步驟。簡言之，對於小規模生產而言，自細胞培養採集物中純化戈利木單抗係在第3階段至第7階段，藉由親和力及離子交換層析步驟以及去活化或移除潛在病毒汙染的步驟(溶劑/清潔劑處理及病毒移除)之組合來執行。在第3階段中，使採集物及/或匯集的採集物澄清，並使用蛋白質A親和力層析法純化。將所得的直接產物捕獲(direct product capture,DPC)洗出液冷凍，直到進一步處理。解凍後，在第4階段中將DPC洗出液過濾並匯集，隨後在第5階段中用三正丁基磷酸酯(TNBP)及聚山梨醇酯80(PS 80)處理，以使任何可能存在的脂質套膜(lipid-enveloped)病毒去活化。
在第6階段中，使用陽離子交換層析法自戈利木單抗產物中移除TNBP及PS 80試劑及雜質。在第7階段中，使用陰離子交換層析法進一步純化戈利木單抗產物，以移除DNA、可能存在的病毒、及雜質。如上所述，CHO衍生的戈利木單抗產物純化程序省略了第8階段過濾通過病毒保留過濾器。
戈利木單抗之最終製備係在第9階段中執行(參照大規模階段)。超濾步驟將戈利木單抗產物濃縮，且透析過濾步驟添加配方賦形劑並移除程序中的緩衝劑鹽。添加PS 80，並將主體中間體過濾至聚碳酸酯容器中，以用於冷凍儲存作為經調配主體。
方法
用於測定活細胞密度(VCD)及存活率%之方法
總細胞數/ml、活細胞數/ml(VCD)、及存活率%一般係用Beckman Coulter Vi-CELL-XR細胞存活率分析儀使用製造商提供的規程、軟體、及試劑來測定。替代地，亦已使用CEDEX自動化細胞計數系統。然 而，亦應注意的是，用於測定VCD及存活率%的其他方法係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，例如使用血球計(hemocytometer)及台盼藍排斥法。
生物活性(效力)檢定
基於戈利木單抗保護WEHI 164細胞(小鼠BALB/c纖維肉瘤細胞，獲自Walter and Eliza Hall Institute,Melbourne,Australia)免受TNFα誘導細胞毒性之能力，用體外檢定來執行戈利木單抗之生物活性(效力)測量。各檢定盤含有100-μL連續稀釋液之500ng/mL(重複6次)Simponi測試物品及Simponi參考標準。然後添加TNF-α並將盤培養。在中和及培養之後，將WEHI 164細胞添加至微量滴定盤，接著進行另一培養步驟。之後，添加代謝受質(其係活細胞的指標)，並藉由分光光度法測量經轉換受質。
使用4參數邏輯分析來擬合測試物品及參考標準中和曲線。藉由比較Simponi參考標準與Simponi測試物品之50%有效劑量(ED50)來計算效力。
在生物活性程序執行期間，應用下列系統適用性驗收標準(acceptance criteria)以產生有效結果：
參考標準：
●中和曲線之各者必須係S形曲線，其較低的高原期(plateau)在3個檢定盤之細胞+TNF-α對照組之平均OD值的40%內，較高的高原期在3個檢定盤之僅細胞對照組之平均OD值的25%內，且線性部分在該等高原期之間。
●各曲線之斜率必須係
Figure 109108133-A0202-12-0123-110
0.7且
Figure 109108133-A0202-12-0123-111
3.5。
●各曲線之r2值必須係
Figure 109108133-A0202-12-0123-112
0.97。
●所有重複ED50值必須係
Figure 109108133-A0202-12-0123-113
2ng/mL且
Figure 109108133-A0202-12-0123-114
20ng/mL。
●平均ED50值之RSD(n=6)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0123-115
20%。
TNF-α細胞毒性曲線：
●TNF-α細胞毒性曲線必須顯示出具有較低高原期、較高高原期、及該等高原期之間的線性部分之S形曲線。
●針對各擬合曲線，斜率必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-116
2.0。
●TNF-α細胞毒性曲線之r2值必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-118
0.97。
●在1.68ng/mL之TNF-α濃度下的OD值應落在0.1與0.4之間。
對照組：
●各盤之OD範圍(細胞+TNF對照組與僅細胞對照組的平均OD值之間的差)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-119
0.68。
●各盤之僅細胞對照組之平均OD值(n=6)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-120
0.75。僅細胞對照組之RSD必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-157
20%。
●各盤之細胞+TNF-α對照組之平均OD值(n=6)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-121
0.50。且TNF-α對照組之RSD必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-158
20%。
測試物品：
●中和曲線之各者必須係S形曲線，其較低的高原期在3個檢定盤之細胞+TNF-α對照組之平均OD值的40%內，較高的高原期在3個檢定盤之僅細胞對照組之平均OD值的25%內，且線性部分在該等高原期之間。
●各曲線之斜率必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-122
0.7且
Figure 109108133-A0202-12-0124-123
3.5。
●各曲線之r2值必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-124
0.97。
●平均ED50比值之RSD(n=6)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0124-159
25%。
●測試物品與參考標準曲線之間的平均斜率比率係
Figure 109108133-A0202-12-0124-125
0.8且
Figure 109108133-A0202-12-0124-126
1.2，其確保測試物品及參考標準曲線之斜率值係可比較的(相差不大於20%)。
●測試物品中和曲線之平均上漸進線值與參考標準之平均上漸進線值相差不大於10%(平均上漸進線值之差係
Figure 109108133-A0202-12-0124-127
10%)。
●測試物品中和曲線之平均下漸進線值與參考標準之平均下漸進線值相差不大於15%(平均下漸進線值之差係
Figure 109108133-A0202-12-0125-128
15%)。
用於測定寡醣組成之方法
藉由HPLC分析之寡糖組成
戈利木單抗之N-連接寡醣組成係使用Agilent 1100/1200系列HPLC系統與Chemstation/Chemstore軟體，用使用螢光偵測的正相陰離子交換HPLC方法來測定。為了定量聚醣的相對量，首先將N-連接寡醣用N-聚醣酶(PNGase F)自還原且變性的測試物品切割。將釋放之聚醣使用鄰胺苯甲酸標示，使用0.45-μm的尼龍過濾器藉由過濾純化，並藉由正相陰離子交換HPLC使用螢光偵測進行分析。HPLC層析圖作為可用以識別並定量存在於樣本中的N-連接寡醣之相對量的圖譜。藉由與寡醣標準品的共洗提，並根據大量表徵的歷史結果，藉由滯留時間來識別聚醣。戈利木單抗參考標準之代表性HPLC層析圖係示於圖21中。
各聚醣之量係藉由峰面積積分來定量，並以總聚醣峰面積之百分比(峰面積%)表示。可針對G0F、G1F、G2F、總中性聚醣、及總帶電聚醣記述結果。其他中性聚醣係在17與35分鐘之間的所有積分峰之總和，不包括對應於G0F、G1F、及G2F的峰。總中性聚醣係G0F、G1F、G2F、及其他中性聚醣之總和。總帶電聚醣係在42與55分鐘之間洗提的所有單唾液酸化聚醣峰、及在78與90分鐘之間洗提的所有二唾液酸化聚醣峰之總和。
將寡醣標準品之混合物(G0F、G2F、G2F+N-乙醯基神經胺酸(NANA)、及G2F+2NANA)作為標示反應之陽性對照、作為峰識別之標準、及作為系統適用性之量度並行分析。使用來自Prozyme之重構寡醣、G0F(目錄號GKC-004301)、G2F(目錄號GKC-024301)、SA1F(目錄號GKC-124301)、及SA2F(目錄號GKC-224301)、或等效物作為參考標準。出於系統適用性之目的，亦運行方法空白陰性對照及經預標示 之G0F標準品。在寡醣圖譜程序執行期間，應用下列系統適用性及檢定(測試物品)驗收標準以產生有效結果：
系統適用性標準：
●在寡糖標準品中之G0F與G2F峰之間的解析度(USP)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0126-129
3.0。
●在寡醣標準品中之G0F峰的理論平板計數(切線法)必須係
Figure 109108133-A0202-12-0126-130
5000。
●用於戈利木單抗參考標準之總聚醣峰面積必須
Figure 109108133-A0202-12-0126-131
1.5倍的經預標示之G0F主要聚醣峰面積。
●若任何參考標準聚醣峰超過標度，則以較少的注射體積重 新注射參考標準。
●戈利木單抗參考標準中的G0F峰滯留時間必須在寡醣標準品中的G0F滯留時間之0.4min內。
檢定驗收標準：
●該方法空白必須沒有與戈利木單抗中所指派之寡醣峰共洗提的可偵測峰。
●各測試物品之總聚醣峰面積必須
Figure 109108133-A0202-12-0126-132
1.5倍的經預標示之G0F標準的主要聚醣峰面積。
●若任何樣本聚醣峰超過標度，則以較少的注射體積之樣本，連同正常體積的經預標示之G0F、寡醣標準品、方法空白、及參考標準一起重新注射。
●各測試物品中的G0F峰滯留時間必須在寡醣標準品中的G0F峰滯留時間之0.4min內。
●若該檢定不符合任何驗收標準，則該檢定係無效的。
藉由IRMA分析之寡醣組成
IdeS-RMA(IRMA)方法可在免疫球蛋白G(IgG)用FabRICATOR®(一種可購自Genovis AB(SKU：A0-FR1-050)之釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的IgG降解酶(IdeS))酶處理之後，藉由減少質量分析(RMA)來區分主要醣型。亦參見例如，美國專利第7,666,582號。減少質量分析(RMA)涉及抗體的雙硫鍵還原，接著進行抗體之重鏈及其附接聚醣部份的完整質量分析。由於存在N端修飾(諸如焦麩胺酸形成及羧化)，一些抗體顯示出高度的異質性。因此，雙硫鍵還原及重鏈質量測量結果導致重疊解析峰的複雜圖案。因此，在一些應用中，使用還原劑(諸如二硫蘇糖醇(DTT))期望產生蛋白水解之抗體片段而非產生輕鏈及重鏈。傳統上，木瓜酶及胃蛋白酶係用於產生抗體片段，所有均係費力的程序。用胃蛋白酶切割IgG需要大量的最佳化，且係在低酸性pH下進行。木瓜酶需要活化劑，且取決於反應條件可獲得F(ab')2及Fab兩者，從而導致異質的片段匯集。這些缺點可藉由使用新穎酶FabRICATOR®來迴避。切割程序非常快速、簡單、且重要的是不需要最佳化。其係在中性pH下執行，產生精確的F(ab')2及Fc片段。未觀察到進一步降解或過度截切(常與其他如胃蛋白酶或木瓜酶之蛋白水解酶有關)。重要的是，因FabRICATOR®在重鏈中僅切割C端的雙硫鍵，因此不需要還原步驟，且可獲得完整的F(ab')2及兩個殘留的Fc片段。
定義
●H：己醣(甘露糖、葡萄糖、及半乳糖)
●Man5：甘露糖5
●N：N-乙醯基己胺醣(N-乙醯基葡萄糖胺及N-乙醯基半乳胺糖)
●F：岩藻醣
●S：唾液酸(N-乙醯基神經胺酸(NANA)及N-羥乙醯基神經胺酸(NGNA))
●G0：去唾液酸-去半乳糖-去岩藻醣基化(afucosylated)雙觸角寡醣
●G0F：去唾液酸-去半乳糖-岩藻醣基化雙觸角寡醣
●G1：去唾液酸-單半乳糖基化-去岩藻醣基化雙觸角寡醣
●G1F：去唾液酸-單半乳糖基化-岩藻醣基化雙觸角寡醣
●G2：去唾液酸-二半乳糖基化-去岩藻醣基化雙觸角寡醣
●G2F：去唾液酸-二半乳糖基化-岩藻醣基化雙觸角寡醣
●GlcNAc：N-乙醯基-D-葡萄糖胺
●Lys：離胺酸
●-Lys：截短重鏈(無C端離胺酸殘基存在)
●+Lys：含有C端離胺酸之重鏈
●ppm：百萬分點
設備
●Thermo Scientific Q Exactive(Plus)質譜儀
●Agilent 1200 HPLC系統
●Applied Biosystems POROS R2/10 2.1mmD×100mmL管柱
●Thermo Scientific Q Exactive Tune軟體
●Thermo Scientific蛋白重疊解析軟體
●能夠秤量0.01mg之分析天平
●振盪混合器，任何合適的型號
●水浴或加熱塊，任何合適的型號
●經校準溫度計-10至110℃，任何合適的型號
●經校準吸量管
●微量離心機，任何合適的型號
程序
樣本之IdeS截切
●樣本(等於50μg IgG)。
●將1μl(50單位)的IdeS酶添加至50μg的IgG，短暫振 盪，離心沉降(spin down)，並在37℃下培養30分鐘(儲 備酶@5000單位/100μl。1單位之酶在37℃下在30分鐘內完全截切1μg之IgG)
●將樣本離心沉降並轉移至LC-MS小瓶，並將樣本小瓶裝載至Agilent 1200自動取樣器中
LC-MS方法
溶液製備
●流動相A(於超純水中之0.1%甲酸(FA))-將999mL的超純水添加至1L HPLC流動相瓶，添加1mL FA並攪拌。此溶液在RT下可儲存2個月。
●流動相B(0.1% FA、99.9%乙腈)-將999mL的乙腈添加至1L HPLC流動相瓶，添加1mL FA並攪拌。此溶液在RT下可儲存2個月。
LC方法
●管柱：Applied Biosystems POROS R2/10 2.1mmD×100mmL
●管柱溫度：60℃
●自動取樣器溫度：4℃
●流速：300μL/min
●注射體積：5μL
●流動相A：於超純水中之0.1% FA
●流動相B：於乙腈中之0.1% FA
表6：LC梯度表
Figure 109108133-A0202-12-0129-11
Figure 109108133-A0202-12-0130-12
MS方法
掃描參數：
●掃描類型：全MS
●掃描範圍：700至3500 m/z
●斷裂：源內(In-source)CID 35.0eV
●解析度：17500
●極性：陽性
●鎖定質量：開啟，m/z 445.12002
●AGC目標：3e6
●最大注射時間：250
HESI源：
●鞘氣流速(sheath gas flow rate)：32
●輔助氣體流速：7
●吹掃氣體流速：0
●噴霧電壓(|kV|)：4.20
●毛細管溫度(℃)：280
●S-lens RF水平：55.0
●加熱器溫度(℃)：80
數據分析
各個經偵測之聚醣物種之相對含量係基於重疊解析質譜之分析記錄。圖22顯示在Sp2/0細胞中產生的戈利木單抗之IRMA分析的代表性重疊解析質譜。由IRMA分析所測定之主要結構包括例如Man 5(H5N2)、G0(H3N4)、G0F(H3N4F1)、G1F-GlcNAc(H4N3F1)、H5N3 G1(H4N4)、H5N3F1、G1F(H4N4F1)、G2(H5N4)、G2F(H5N4F1)、G1FS (H4N4F1S1)、H6N4F1、G2FS(H5N4F1S1)、H7N4F1、H6N4F1S1、G2FS2(H5N4F1S2)。監測這些結構之各者的百分比。所測量之峰強度表示在標準化之後各結構的百分比(總指派之%)。計算中未包括觀察到質量超出100ppm質量偏差臨限的聚醣，例如*G1F-GlcNAc-Lys、*H5N3-Lys、*G1-Lys、*H5N3F1-Lys、及*G2-Lys。如所述，這些係以星號(「*」)指示。由於Man5-Lys的強度很低，因此並不總是能在光譜中偵測到，儘管如此，當Man5-Lys存在時仍會被考慮並包括在計算中。如在具有及不具有末端離胺酸之Fc片段的兩種異構體上所偵測來計算聚醣的百分比，例如，G0F百分比係(%G0F-Lys+%G0F+Lys)。僅在重鏈異構體中之一者上偵測到的結構係以雙星號(「**」)指示，例如**G1F-GlcNAc+Lys、**H5N3+Lys、**G1+Lys、**H5N3F1+Lys、**G2+Lys、**G2FS-Lys、**H6N4F1S1-Lys、**G2FS2-Lys、**H6N4F1-Lys、**H7N4F1-Lys。大多數這些結構的豐度低，且無法從強度較高之相鄰峰中解析出來，或係低於該方法之偵測能力。
*注意：HPLC與IRMA方法之間的差異(例如參見下表7)可能係由於HPLC中之物種共洗提所造成，且可能因為一些強度非常接近IRMA方法的偵測能力而被IRMA低估了一些唾液酸化的物種。
表7：針對在Sp2/0細胞中產生的代表性戈利木單抗樣本之IRMA及HPLC的聚醣豐度比較
Figure 109108133-A0202-12-0131-13
毛細管等電聚焦
毛細管等電聚焦(cIEF)根據整體電荷或等電點(isoelectric point,pI)分離蛋白質。該方法係用以監測戈利木單抗中電荷基異構體(charge-based isoform)之分布。不同於基於凝膠之IEF程序，cIEF提供所存在的帶電物種之定量測量。此外，相較於基於凝膠之方法，cIEF顯示增加的解析度、敏感度、及再現性。cIEF程序以接近基線解析度分離4至6個Simponi(戈利木單抗)之電荷基異構體，而IEF凝膠分析僅以部分解析度分離4至5個物種。在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗之代表性cIEF電泳圖係示於圖23中，其具有標示為C、1、2、及3的四個主要峰及標示為B的次要峰。亦顯示代表cIEF峰與降低的負電荷/唾液酸化程度之間的大致關係之圖。
在市售可得之成像cIEF分析儀上執行cIEF檢定，該分析儀配備有能夠在
Figure 109108133-A0202-12-0132-133
30℃之周圍環境中將樣本溫度維持在
Figure 109108133-A0202-12-0132-134
10.5℃之自動取樣器，諸如Alcott自動取樣器(GP Instruments,Inc.)。該分析採用無外壁聚醯亞胺塗層之經內壁塗佈的矽毛細管，而可進行整體管柱偵測。此外，使用稀磷酸與甲基纖維素之陽極電解質溶液、氫氧化鈉與甲基纖維素之陰極電解質溶液、及寬範圍(pH 3至10)及窄範圍(pH 8至10.5)兩性電解質之經定義混合物。該檢定採用羧肽酶B(CPB)對測試物品及參考標準(RS)兩者進行預處理，其移除重鏈C端離胺酸並消除因存在多個C端變體而引入的不明確。
在各分析之前，將自動取樣器溫度設定點設定至4℃，並將自動取樣器預冷卻至少30分鐘，且將實驗室之周圍室溫維持在
Figure 109108133-A0202-12-0132-135
30℃。將經預處理之測試物品及RS、樣本小瓶、小瓶插入物、用於檢定中的試劑(包括純水)、含有N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)(其最佳化毛細管內的聚焦)之親本溶液、兩性電解質、用於內部標準品之pI 7.6及9.5標記、及甲基纖維素(MC)，在開始樣本製備前保持在冰上至少30分鐘。在冰上製備樣本，並記錄添加親本溶液的時間及控制暴露於TEMED的時間。 在此添加後必須在180分鐘內完成該檢定。按照以下順序表(表8)注射一次系統適用性對照組，並注射兩次測試物品及RS：
表8：樣本運行順序
Figure 109108133-A0202-12-0133-14
在藉由注射泵將樣本注射至毛細管中之後，橫跨毛細管施加電場(3kV)達8分鐘而形成pH梯度，並根據彼等之等電點(pI)分離戈利木單抗之電荷基異構體。藉由在280nm下對整個毛細管成像來偵測毛細管中之蛋白質異構體，且數據係以pI值隨A280而變動之電泳圖的形式呈現。藉由使用儀器軟體與內部pI標準品(pI 7.6及9.5)進行比較來指派pI之值，並使用標準數據收集軟體由電泳圖測定峰面積。記述所有峰
Figure 109108133-A0202-12-0133-136
LOQ的重複注射之平均pI及平均峰面積百分比、與參考標準比較之ΔpI值、及峰C、1、2、及3的面積百分比之總和。
戈利木單抗cIEF異構體之表徵
在Sp2/0細胞上產生的戈利木單抗之參考cIEF概況含有標示為C、1、2、及3的四個主要峰及次要峰B，如代表性電泳圖(圖23)所示。對於戈利木單抗，在cIEF概況中之變異性的主要來源係重鏈天冬醯胺酸43(HC Asn43)之脫醯胺化及異構化。cIEF中的鹼性峰3代表未經脫醯胺化之HC Asn43以及脫醯胺化重鏈異天冬胺酸43(HC isoAsp43)，而酸性更高的峰則代表脫醯胺化HC Asp43及唾液酸化的程度。將不同cIEF峰的預測識別列於表9中。使用cIEF檢定作為戈利木單抗電荷異質性之一般監測，且使用不同檢定作為監測脫醯胺化之主要檢定。
表9：FB a 之cIEF電泳圖中觀察到的峰之預測識別
Figure 109108133-A0202-12-0134-16
製造控制策略的介紹
在大規模商業生產期間，開發製造控制策略，以在關於原料藥(DS)及藥品(DP)之寡醣態樣、生物活性(效力)、及/或其他特性方面(例如，參見表10及表11中所識別之特性)，維持治療性蛋白質(例如，治療性抗體像是戈利木單抗)之一致DS及DP特性。例如，在製程的第9階段，監測戈利木單抗醣基化作為經調配主體(FB)之程序中管制，並制定了平均總中性寡醣%、總帶電寡醣%、及個別中性寡醣物種G0F、G1F、及G2F %的上規格及下規格。
表10：在Sn2/0細胞及CHO細胞中表現之所選戈利木單抗特性的代表性比較
Figure 109108133-A0202-12-0134-17
Figure 109108133-A0202-12-0135-18
如表10所示，在Sp2/0細胞及CHO細胞中產生的戈利木單抗之一些所選特性中存在差異。然而，先前已測定在cIEF及肽圖譜結果中所反映之脫醯胺化概況(例如，HC Asn43脫醯胺化之水平)的差異主要係由蛋白質的處理(例如，純化及/或儲存)差異所引起。同樣地，已顯示生物活性之差異係由處理(即，大規模商業生產對小規模生產)差異所引起，而不被視為係由用於表現蛋白質之宿主細胞的差異所引起。此外，在CHO細胞中表現並以小規模純化之戈利木單抗的生物活性仍在規格內。
戈利木單抗之寡醣態樣
戈利木單抗在各重鏈上的單一位點(天冬醯胺酸306上)被N-醣基化。這些N-連接寡醣結構可係一組透過天冬醯胺酸殘基之一級胺連接至蛋白質的雙觸角(biantennary)寡醣結構中之任一者，但在戈利木單抗上，彼等主要由雙觸角核心岩藻醣基化(core-fucosylated)物種組成，其具有半乳糖及唾液酸異質性。個別寡醣物種包括「G0F」(一種去唾液酸(asialo)、去半乳糖(agalacto)的核心岩藻醣基化雙觸角聚醣)、「G1F」 (一種去唾液酸、單半乳糖的核心岩藻醣基化雙觸角聚醣)、及「G2F」(一種去唾液酸、二半乳糖的核心岩藻醣基化雙觸角聚醣)。在製造的第9階段期間，監測戈利木單抗醣基化作為程序中管制，並制定了總中性寡醣、總帶電寡醣、及個別中性寡醣物種G0F、G1F、及G2F的規格。戈利木單抗IgG中一些主要N-連接寡醣物種之示意圖概述係示於圖24中。亦顯示一些酶在醣基化成熟程序中的作用，包括一些二價陽離子(例如Mn2+及Cu2+)在這些酶程序中的作用。
控制寡醣態樣
控制治療性抗體之寡醣態樣係至關重要的，因為重組單株抗體之寡醣態樣變化會顯著影響抗體生物功能。舉例而言，生物研究顯示，Fc區上不同醣型之分布可顯著影響抗體療效、穩定性、及效應子功能(J.Biosci.Bioeng.2014117(5)：639-644；Bio-Process Int.2011,9(6)：48-53；Nat.Rev.Immunol.2010,10(5)：345-352)。具體而言，無岩藻醣基化(J.Mol.Biol.368：767-779)及半乳糖基化(galactosylation)(Biotechnol.Prog.21：1644-1652)可在抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,ADCC)及補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)中發揮具大的作用，藉由這兩個重要機制，抗體透過免疫功能介導目標細胞的殺滅。此外，高甘露糖水平已顯示出會藉由增加抗體之清除率來負面影響療效(Glycobiology.2011,21(7)：949-959)，且唾液酸含量可影響抗發炎活性(Antibodies.2013 2(3)：392-414)。由於寡糖態樣變化而產生的這些生物學後果(biological consequence)，監管機構要求控制抗體醣基化模式，以確保遵守批次放行規格以提供一致、安全、且有效的產品。
寡醣態樣-在不同細胞中表現之影響
用於抗體之重組表現的兩種常用宿主細胞系係中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及小鼠骨髓瘤細胞(例如，Sp2/0細胞)。CHO細胞表現可能實際上缺乏唾液酸聚醣之重組抗體，且該等聚醣可係至多99%經岩藻醣基 化。相反地，小鼠骨髓瘤細胞表現重組抗體，該等重組抗體可含有至多50%唾液酸且通常具有較少的岩藻醣。這些差異可對體內抗體活性有顯著影響，例如，已顯示此類差異可影響分子之Fc部分的結構，從而改變抗體效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見例如美國專利第US8975040號)。舉例而言，已經注意到ADCC活性降低與唾液酸化(帶電)Fc聚醣增加(Scallon et al.Mol Immunol 2007；44：1524-34)。
對ADCC活性的影響對於抗TNF抗體而言可能特別重要，因為已表明對於一些經核准的適應症，抗TNF抗體的關鍵作用模式(mode of action,MOA)可係透過ADCC破壞TNF-α生產細胞，例如用於治療發炎性腸病(IBD)，諸如克隆氏症(CD)及/或潰瘍性結腸炎(UC)。亦已顯示出Flixabi(類克之CHO衍生的生物相似藥(英利昔單抗(infliximab)))在NK92-CD16a細胞系中具有較高的平均ADCC活性。英利昔單抗係在Sp2/0細胞中產生，且其寡醣態樣比在CHO細胞中產生的Flixabi具有更高的帶電聚醣百分比(Lee et al.MAbs.2017 Aug；9(6)：968-977)。因此，可為所欲的是降低唾液酸化，並因此降低與抗TNF抗體有關之帶電聚醣的百分比。
此外，在CHO及Sp2/0細胞中產生的抗體可在兩個聚醣表位(半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)及唾液酸化的N-聚醣Neu5Gc-α-2-6-半乳糖(Neu5Gc))之水平上有顯著差異。舉例而言，已顯示CHO細胞可表現具有無法偵測或僅為痕量水平之α-Gal及Neu5Gc的抗體，而Sp2/0細胞可表現更高水平之兩個聚醣結構(Yu et al.,Sci Rep.2016 Jan 29；7：20029)。相反地，人類在遺傳上缺乏用於生物合成α-gal的基因，而負責產生Neu5Gc的基因在所有人類中均經不可逆地突變。結果，在人體內不產生α-Gal及Neu5Gc。此外，治療性抗體上這些非人類聚醣表位的存在會在某些人類群體中引起非所欲的免疫反應，因為預先存在之針對α-Gal及Neu5Gc的抗體之水平較高。舉例而言，已報導西妥昔單抗(Cetuximab)之抗α-gal IgE介導之重度過敏反應(Chung,C.H.et al.,N Engl J Med.2008 Mar 13；358(11)：1109-17)，且已報導循環抗Neu5Gc抗體的存在會促進西妥昔單抗的清除(Ghaderi et al.,Nat Biotechnol.2010年Aug；28(8)：863-7)。
在Sp2/0細胞及CHO細胞中表現的戈利木單抗之寡醣
來自戈利木單抗之多個商業生產運行的HPLC彙集數據顯示，在Sp2/0細胞中產生的DS或DP包含抗TNF抗體，其包含總中性寡醣物種
Figure 109108133-A0202-12-0138-137
82.0%至
Figure 109108133-A0202-12-0138-138
94.4%、總帶電寡醣物種
Figure 109108133-A0202-12-0138-139
5.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0138-140
18.0%、及個別中性寡醣物種G0F
Figure 109108133-A0202-12-0138-141
25.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0138-142
42.2%、G1F
Figure 109108133-A0202-12-0138-143
31.2%至
Figure 109108133-A0202-12-0138-144
43.6%、及G2F
Figure 109108133-A0202-12-0138-145
5.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0138-146
14.2%。如表11及圖25所示，在CHO細胞中表現的戈利木單抗之寡醣態樣顯著地不同於在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗。相較於在Sp2/0細胞中產生的戈利木單抗，在CHO細胞中產生的戈利木單抗之寡醣態樣朝向非常低水平之帶電聚醣及更高水平之中性聚醣(主要為G0F)偏移。CHO細胞中所產生之戈利木單抗之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%、總帶電寡醣物種<1.0%、及個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。此外，藉由IRMA或HPLC，未偵測到CHO細胞中所產生的戈利木單抗之二唾液酸化聚醣物種，而基於HPLC分析，單唾液酸化聚醣物種之水平非常低且無法由IRMA分析偵測到。
表11：在Sp2/0細胞及CHO細胞中產生的戈利木單抗之總中性、總帶電、及其他所選寡醣物種的IRMA及HPLC分析之代表性結果
Figure 109108133-A0202-12-0138-19
表12：在Sp2/0細胞及CHO細胞中產生的戈利木單抗之個別寡醣物種的IRMA分析之代表性結果
Figure 109108133-A0202-12-0139-21
結論
因此，如上文所述，開發製造控制策略，以在關於原料藥(DS)或藥品(DP)(例如，包含治療性抗體戈利木單抗之DS及/或DP)之寡醣態樣及/或其他特性方面，維持治療性蛋白質之一致DS及DP特性。具體而言，控制治療性抗體之寡醣態樣係至關重要的，因為寡醣態樣的變化會 顯著影響抗體生物功能。控制治療性抗體之寡醣態樣的一點係選擇用於表現治療性抗體的細胞宿主。如本文所呈現，在Sp2/0細胞中表現的戈利木單抗包含抗TNF抗體，其具有包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈(LC)，其中抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種
Figure 109108133-A0202-12-0140-147
82.0%至
Figure 109108133-A0202-12-0140-148
94.4%、總帶電寡醣物種
Figure 109108133-A0202-12-0140-149
5.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0140-150
18.0%、及個別中性寡醣物種G0F
Figure 109108133-A0202-12-0140-151
25.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0140-152
42.2%、G1F
Figure 109108133-A0202-12-0140-153
31.2%至
Figure 109108133-A0202-12-0140-154
43.6%、及G2F
Figure 109108133-A0202-12-0140-155
5.6%至
Figure 109108133-A0202-12-0140-156
14.2%。
相反地，在CHO細胞中表現的戈利木單抗包含哺乳動物抗TNF抗體，其具有包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈(LC)，其中抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%、總帶電寡醣物種<1.0%、及個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。此外，藉由IRMA或HPLC，未偵測到CHO細胞中所產生的戈利木單抗之二唾液酸化聚醣物種，而基於HPLC分析，單唾液酸化聚醣物種之水平非常低且無法由IRMA分析偵測到。
在CHO細胞中產生的戈利木單抗之寡醣態樣的這些變化可在不同的治療適應症中及在不同的患者群體中提供各種益處。舉例而言，在抗TNF抗體上降低唾液酸化(帶電)的Fc聚醣可提高體內的ADCC活性，使得某些疾病(例如發炎性腸病(IBD)，諸如克隆氏症(CD)及/或潰瘍性結腸炎(UC))的治療之療效增強。此外，唾液酸化物種的大致上降低及CHO細胞中產生的抗TNF抗體之Neu5Gc特異性降低，可藉由在投予至人類時降低非所欲的免疫原性反應來提供益處。舉例而言，降低Neu5Gc的水平可降低清除率，使得相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，在CHO細胞中產生的抗TNF抗體會具有更長的半衰期，尤其是對於具有較高水平的抗Neu5Gc抗體之患者群體。
<110> 美商健生生物科技公司(Janssen Biotech,Inc.) 巴恩豪斯,克里斯托弗(Kristopher Barnthouse) 甘古利,蘇比尼(Subinay Ganguly) 格羅內維爾德,馬爾滕(Maarten Groeneveld) 洛佩茲,曼努埃爾(Manue1 Lopez) 內德維德,麥可(Michael Nedved) 史密斯,凱文(Kevin D.Smith)
<120> 用於生產抗TNF抗體組成物之製造方法
<130> JBI6055
<141> 隨此
<140> 待指派
<150> 62/818341
<151> 2019-03-14
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 重鏈互補決定區1(CDR1)。
<400> 1
Figure 109108133-A0202-12-0141-22
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> 重鏈互補決定區2(CDR2)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa係選自Ile、Phe、或Val。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2之Xaa係選自Ile或Met。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa係選自Ser或Leu。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4之Xaa係選自Tyr或Phe。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10之Xaa係選自Lys或Tyr。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置11之Xaa係選自Ser或Tyr。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> 位置17之Xaa係選自Asp或Gly。
<400> 2
Figure 109108133-A0202-12-0142-23
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> 重鏈互補決定區3(CDR3)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位置4之Xaa係選自Ile或Val。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5之Xaa係選自Ser、Ala、或Gly。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9之Xaa係選自Asn或Tyr。
<400> 3
Figure 109108133-A0202-12-0143-27
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 輕鏈互補決定區1(CDR1)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7之Xaa係選自Ser或Tyr。
<400> 4
Figure 109108133-A0202-12-0143-25
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 輕鏈互補決定區2(CDR2)。
<400> 5
Figure 109108133-A0202-12-0143-24
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 輕鏈互補決定區3(CDR3)。
<400> 6
Figure 109108133-A0202-12-0144-28
<210> 7
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(126)
<223> 重鏈可變區序列，如原始圖4中所呈現
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> 架構1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28之Xaa係選自Ile或Thr。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> 互補決定區1(CDR1)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(49)
<223> 架構2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> 位置43之Xaa係選自Lys或Asn。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> 互補決定區2(CDR2)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> 位置50之Xaa係選自Ile、Phe、或Val。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> 位置51之Xaa係選自Ile或Met。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> 位置52之Xaa係選自Ser或Leu。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> 位置53之Xaa係選自Tyr或Phe。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> 位置59之Xaa係選自Lys或Tyr。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 位置60之Xaa係選自Ser或Tyr。
<222> (60)..(60)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> 位置66之Xaa係選自Asp或Gly。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(98)
<223> 架構3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> 位置70之Xaa係選自Val或Ile。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> 位置75之Xaa係選自Ser或Pro。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(78)
<223> 位置78之Xaa係選自Thr或Ala。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> 位置80之Xaa係選自Tyr或Phe。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(94)
<223> 位置94之Xaa係選自Tyr或Phe。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(115)
<223> 互補決定區3(CDR3)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (102)..(102)
<223> 位置102之Xaa係選自Ile或Val。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (116)..(126)
<223> J6區
<400> 7
Figure 109108133-A0202-12-0146-29
Figure 109108133-A0202-12-0147-30
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(108)
<223> 輕鏈可變區序列，如原始圖5中所呈現
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(23)
<223> 架構1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(34)
<223> 互補決定區1(CDR1)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(49)
<223> 架構2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(56)
<223> 互補決定區2(CDR2)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(88)
<223> 架構3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(98)
<223> 互補決定區3(CDR3)。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> J3區
<400> 8
Figure 109108133-A0202-12-0147-31
Figure 109108133-A0202-12-0148-32
<210> 9
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(157)
<223> 人類TNF α單體序列
<400> 9
Figure 109108133-A0202-12-0148-33
Figure 109108133-A0202-12-0149-38
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Figure 109108133-A0202-12-0149-37
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Figure 109108133-A0202-12-0149-36
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Figure 109108133-A0202-12-0149-35
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Figure 109108133-A0202-12-0149-34
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Figure 109108133-A0202-12-0150-41
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Figure 109108133-A0202-12-0150-42
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400>16
Figure 109108133-A0202-12-0150-43
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Figure 109108133-A0202-12-0150-45
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Figure 109108133-A0202-12-0150-44
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Figure 109108133-A0202-12-0150-46
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Figure 109108133-A0202-12-0151-91
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Figure 109108133-A0202-12-0151-89
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Figure 109108133-A0202-12-0151-88
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Figure 109108133-A0202-12-0151-93
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Figure 109108133-A0202-12-0151-92
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Figure 109108133-A0202-12-0151-94
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Figure 109108133-A0202-12-0152-95
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Figure 109108133-A0202-12-0152-96
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Figure 109108133-A0202-12-0152-97
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Figure 109108133-A0202-12-0152-100
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Figure 109108133-A0202-12-0152-99
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Figure 109108133-A0202-12-0152-98
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> 重鏈可變區序列之信號序列， 如原始圖4中所呈現
<400> 32
Figure 109108133-A0202-12-0153-49
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 輕鏈可變區序列之信號序列， 如原始圖5中所呈現
<400> 33
Figure 109108133-A0202-12-0153-48
<210> 34
<211> 428
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重鏈可變區DNA序列，如原始圖2A至圖2B 中所呈現，其具有編碼序列1至421
<400> 34
Figure 109108133-A0202-12-0153-47
Figure 109108133-A0202-12-0154-50
<210> 35
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 輕鏈可變區DNA序列，如原始圖3中所呈現， 其具有編碼序列1至387
<400> 35
Figure 109108133-A0202-12-0154-52
<210> 36
<211> 456
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(456)
<223> 戈利木單抗重鏈(HC)
<400> 36
Figure 109108133-A0202-12-0154-53
Figure 109108133-A0202-12-0155-54
Figure 109108133-A0202-12-0156-55
<210> 37
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(215)
<223> 戈利木單抗輕鏈(LC)
<400> 37
Figure 109108133-A0202-12-0157-56
Figure 109108133-A0202-12-0158-57

Claims (18)

  1. 一種抗TNF抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現。
  2. 如請求項1所述之抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
  3. 如請求項1所述之抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
  4. 如請求項1所述之抗TNF抗體，其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(Reduced Mass Analysis,RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化(disialylated)的聚醣物種。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  6. 如請求項5所述之抗TNF抗體，其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑(follow-on biologic)。
  7. 一種用於生產抗TNF抗體之製造方法，該等抗TNF抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體係藉由製造方法生產，該製造方法包含：
    a.培養具有編碼該等抗TNF抗體之核苷酸的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；
    b.使該等抗TNF抗體在該等CHO細胞中表現；及、
    c.純化該等抗TNF抗體。
  8. 如請求項7所述之製造方法，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
  9. 如請求項7所述之製造方法，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
  10. 如請求項7所述之製造方法，其中如藉由高效液相層析法(HPLC)或減少質量分析(RMA)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種。
  11. 如請求項7至10中任一項所述之製造方法，其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  12. 如請求項11所述之製造方法，其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
  13. 一種組成物，其包含抗TNF抗體：(i)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈；及(ii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈，其中該等抗TNF抗體在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中表現。
  14. 如請求項13所述之組成物，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣包含總中性寡醣物種>99.0%及總帶電寡醣物種<1.0%。
  15. 如請求項13所述之組成物，其中該等抗TNF抗體之寡醣態樣進一步包含個別中性寡醣物種G0F>60.0%、G1F<20.0%、及G2F<5.0%。
  16. 如請求項13所述之組成物，其中如藉由高效液相層析法(HPLC)所測定，該等抗TNF抗體不具有二唾液酸化的聚醣物種。
  17. 如請求項13至16中任一項所述之組成物，其中該等抗TNF抗體相較於在Sp2/0細胞中表現的抗TNF抗體，具有較長的半衰期或增加的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  18. 如請求項17所述之組成物，其中該等抗TNF抗體係生物相似製劑。
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