TW202039817A - 用於選擇和擴增表現pd-1的t細胞之方法 - Google Patents

用於選擇和擴增表現pd-1的t細胞之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202039817A
TW202039817A TW108147064A TW108147064A TW202039817A TW 202039817 A TW202039817 A TW 202039817A TW 108147064 A TW108147064 A TW 108147064A TW 108147064 A TW108147064 A TW 108147064A TW 202039817 A TW202039817 A TW 202039817A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
antibody
expressing
cell
mixture
Prior art date
Application number
TW108147064A
Other languages
English (en)
Inventor
紳夫 花淵
強 慕姆
丹尼爾 Ｊ 弗里曼
今霖 蔣
蘇美 那朗
羅奈爾得 赫布斯特
丹妮爾 唐斯利
傑安路卡 卡雷索
泰一 金
Original Assignee
美商麥迪紐有限責任公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商麥迪紐有限責任公司 filed Critical 美商麥迪紐有限責任公司
Publication of TW202039817A publication Critical patent/TW202039817A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本揭露內容提供了用於選擇和分離表現計劃性細胞死亡1（PD-1）的T細胞以及用於選擇該分離的表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平之方法。本揭露內容還提供了大規模擴增所選擇和分離的表現PD-1的T細胞之方法，以及用於治療受試者之方法，該等方法包括向該受試者投與所選擇和分離的表現PD-1的T細胞。

Description

用於選擇和擴增表現PD-1的T細胞之方法
最近報導，癌症患者的腫瘤浸潤和外周血T細胞上的PD-1表現針對腫瘤抗原反應性而富集。計劃性死亡1（PD-1）最初被鑒定為先前活化的正在凋亡的T細胞的標記物。最近，關於PD-1的觀點已開始變換為以下觀點，即現在認為PD-1表現代表T細胞活化的標記物，並且當在TIM3或LAG3的背景下表現時，僅能標定T細胞衰竭或凋亡先兆。特別地，最近的數據表明，腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和外周血中的PD-1+細胞代表相同的新抗原（NeoAg）反應性T細胞群（Gros等人, 2014,J. Clin. Invest. [臨床研究雜誌]124(5): 2246-59）。該等數據表明，PD-1表現可能與已經暴露於腫瘤抗原並對其反應的T細胞相關。
然而，PD-1表現水平與NeoAg反應性或T細胞可能遇到抗原的時間點如何相關還不得而知。雖然可以利用螢光活化細胞分選（FACS）來分離使用針對細胞表面蛋白的抗體的特定細胞，但本揭露內容描述了藉由靶向表現PD-1的細胞由FACS從外周血中分離PD-1+T細胞產生缺乏體外擴增能力的細胞。
已在多個臨床實驗中探索了從黑色素瘤患者體內分離、體外擴增和自體再輸注TIL，已證明總反應率為50%，這表明T細胞的體外擴增係一種可行的治療干預（Dudley等人, 2010,Clin. Can.Res . [臨床癌症研究] 16(24): 6122-31）。已經開發了幾種方法來體外擴增分離的T細胞，其主要利用輻照的飼養細胞，該等飼養細胞用於提供固定化共刺激分子。該等方法包括使用高劑量白介素2（IL-2），其通常與高劑量白介素-15（IL-15）和/或白介素-17（IL-7）組合。
雖然這種快速擴增方案（Dudley等人, 2003,J. Immunother .26(4): 332-42）目前在該領域中用於嵌合抗原受體T細胞的擴增，但該過程不適用於治療多於幾千名患者。特別地，在通常不配備細胞培養或輻照設施的大多數醫院中，使用輻照的飼養細胞會妨礙使用此方案。另外，在培養條件結束時存在的細胞碎片的污染混淆了藥物產品的釋放。高濃度的IL-2引起無法控制的T細胞增殖，使起始培養物中的T細胞受體（TCR）譜系與擴增後的TCR譜系解耦。這也類似地混淆了藥物產品的釋放。
最後，人血清的供應係可變的，並且代表了另外的無法控制的製造要素。還已知的是，血清的現有批次間可變性可能使接受患者暴露於意外傳染性病原體。該等變化改變T細胞生長特性的程度尚不清楚。在本領域中還已知的是，在T細胞生長特性方面存在高度的可變性，其中在任何給定的快速擴增培養物中，CD8或CD4 T細胞會長滿培養物，或者藉由擴增維持初始培養物中的CD4/CD8相對比率。總的來說，該等製造風險指示迫切需要可擴展、可控制和可重複的簡化體外快速T細胞擴增方案，該方案較佳的是在整個擴增中維持該CD4/CD8比率。
因此，如上所述，表現PD-1的T細胞由於其腫瘤抗原特異性而具有用於治療用途的潛力。與目前正在探索的TIL（未足夠富集腫瘤抗原反應性）或CART（單抗原靶向，可能過度活化）細胞治療產品相比，可以藉由基於該等T細胞的PD-1表現水平從癌症患者中分離該等細胞，體外富集、擴增和重新活化腫瘤抗原反應性細胞，從而提供優良的活化的細胞產物。因此，需要選擇和擴增表現PD-1的T細胞的方法。
本揭露內容提供了一種從細胞群中分離表現計劃性細胞死亡1（PD-1）的T細胞之方法，該方法包括：(a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子（linker）與該抗PD-1抗體連接；(b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物；(c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；以及 (d) 從該磁場中洗脫該表現PD-1的T細胞，以分離表現PD-1的T細胞。
本揭露內容還提供了一種治療受試者之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的表現PD-1的T細胞；其中該等表現PD-1的T細胞係藉由以下方法分離的：(a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接；(b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物；(c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；以及 (d) 從該磁場中洗脫該表現PD-1的T細胞，以分離表現PD-1的T細胞；其中藉由調節以下一項或多項來選擇在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平：(i) 該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度；(ii) 該連接子的長度；(iii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率；(iv) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率；(v) 進行步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的溫度；(vi) 該細胞群中T細胞的濃度；(vii) 該珠粒混合物中磁珠的濃度；(viii) 該珠粒混合物通過該磁場的流速；(ix) 在該抗體-細胞混合物的產生與步驟 (b) 之間的時間長度；(x) 在該珠粒混合物的產生與步驟 (c) 之間的時間長度；或 (xi) 藉由該磁場施加的力；並且其中表現PD-1的T細胞群藉由以下方式進行體外擴增：(a) 致敏根據本文揭露的方法分離的表現PD-1的T細胞樣本，其中該致敏步驟包括：(i) 在第-1天用致敏因子塗覆培養板；(ii) 在第0天接種表現PD-1的T細胞群，其中接種步驟包括：(1) 在該塗覆的培養板上添加基礎培養基；和/或 (2) 向該基礎培養基中添加一定量的分離的和/或富集的T細胞，以在該塗覆的培養板上產生接種混合物；(b) 收穫表現PD-1的致敏的T細胞；(c) 將所收穫的表現PD-1的T細胞放置於接種混合物中，並將該接種混合物放置於未處理的培養板中；(d) 在該接種混合物中培養表現PD-1的T細胞；(e) 從培養的接種混合物中收穫表現PD-1的T細胞；(f) 重複步驟 (b)-(e)，直到獲得目標數量的擴增的T細胞。
在本文揭露的任何擴增和/或治療方法的一些實施方式中，在T細胞擴增中使用的致敏因子包括ICOS激動劑。在一些實施方式中，該ICOS激動劑係抗ICOS抗體。在一些實施方式中，T細胞被致敏4天。在一些實施方式中，致敏後T細胞的培養在IL-2的存在下進行。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的癌症之方法，該等方法包括：(a) 以有效於將PD-1+ 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）動員到外周血中的量向該受試者投與抗CTLA-4抗體；(b) 從該受試者的外周血中收穫PD-1+ T細胞（例如，TIL）；(c) 擴增該等收穫的PD-1+ T細胞；以及 (d) 將該等擴增的PD-1+ T細胞投與該受試者。
在一些實施方式中，根據本文揭露的任何擴增方法擴增該等收穫的PD-1+ T細胞。在一些實施方式中，該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗（tremelimumab）。
本揭露內容的特定實施方式將從以下某些實施方式和申請專利範圍的更詳細描述中變得明顯。
本揭露內容提供了用於選擇和分離表現PD-1的T細胞，以及用於選擇該分離的表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平之方法。在本揭露內容的該等方法中，可以藉由調節該等揭露的方法的一個或多個參數或變數來選擇PD-1表現T細胞的PD-1表現水平。本揭露內容還提供了大規模擴增此類選擇和分離的PD-1表現T細胞之方法。本揭露內容進一步提供了用於治療受試者之方法，該等方法包括向該受試者投與所選擇和分離的PD-1表現T細胞。本揭露內容進一步提供了基於磁珠的捕獲系統，以足夠快地從表現不同水平的PD-1的外周血中分離T細胞以允許該等T細胞的體外擴增。
本文揭露的該等方法還可用於例如從分離自腫瘤的T細胞（TIL）中選擇腫瘤反應性T細胞。在其他方面，該等腫瘤反應性T細胞可用於鑒定個體化或共有的抗原，該等個體化或共有的抗原也可用於T細胞受體治療（TCRT）或嵌合抗體受體治療（CART）。
如根據本揭露內容所使用，除非另外指出，以下術語應理解為具有以下含義。除非上下文另有要求，單數術語應包括複數形式，並且複數術語應包括單數形式。
如本文所用，術語「患者」或「受試者」包括人和動物受試者。
「障礙」係將從使用所揭露之方法富集和擴增的T細胞進行的治療中受益的任何病症。「障礙」和「病症」在本文中可互換使用，並且包括慢性和急性障礙或疾病，包括使患者易患所討論的障礙的那些病理狀況。
如本文所用，「富集（enrich或enrichment）」意指如果起始細胞的PD-1+ T細胞的百分比小於10%，則將PD-1+ T細胞的百分比增加至少2倍，或者如果起始細胞的PD-1+ T細胞的百分比等於或高於10%，則將PD-1+ T細胞的百分比增加至少50%。
如本文所用，術語「治療（treatment或treating）」係指治療性治療和預防性（prophylactic或preventative）措施。對治療有需要的那些包括患有該障礙的那些連同易於患上該障礙的那些或者打算預防該障礙的那些。
如本文所用，術語「抗」、「α-」和「a-」可互換使用，並且是指針對跟隨連字號的靶標的抗體。在一些情況下，省略了連字號。因此，僅作為實例，「α-ICOS」、「a-ICOS」、「αICOS」和「aICOS」係指抗ICOS抗體，而「α-PD-1」、「a-PD-1」、「αPD-1」和「aPD-1」係指抗PD-1抗體。
本揭露內容包括富集表現希望水平的PD-1的細胞毒性T細胞的方法。當提及細胞群上或細胞群內PD-1的表現量時，表現水平可以被稱為高、中等或低，並且也可以分別被稱為亮、中度和暗。
計劃性細胞死亡1（PD-1）係最初在經歷活化誘導的凋亡的T細胞系中鑒定的50-55 kDa的I型跨膜受體。PD-1在T細胞、B細胞和巨噬細胞上表現。PD-1的配位基係B7家族成員PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-1係在其細胞外區域中包含單個Ig V樣結構域的免疫球蛋白（Ig）超家族的成員。PD-1細胞質結構域包含兩個酪胺酸殘基，其中最接近膜的酪胺酸殘基（鼠類PD-1中的VAYEEL（SEQ ID NO: 1））位於基於免疫受體酪胺酸的抑制模體（ITIM）內。在PD-1上ITIM的存在指示出該分子藉由募集細胞質磷酸酶來用於減弱抗原受體傳訊。人和鼠類PD-1蛋白具有約60%的胺基酸序列同一性，具有四個潛在的N-糖基化位點的保守性和定義Ig-V結構域的殘基。細胞質區域中的ITIM和羧基末端酪胺酸周圍的ITIM樣模體（人和鼠類中的TEYATI（SEQ ID NO: 2））在人和鼠類直系同源物之間也是保守的。PD-1，也稱為分化簇279或CD279，作為免疫檢查點，因為它促進淋巴結中抗原特異性T細胞的凋亡，但也抑制調節性T細胞的凋亡。
在一些實施方式中，藉由使用PD-1/CD8純度值來測量或評估PD-1表現水平。PD-1/CD8純度（在本文中也稱為PD-1CD8純度或CD8PD-1純度）定義為根據本揭露內容的方法選擇或分離的PD-1表現CD8+ T細胞的百分比，該百分比落入PD-1表現T細胞的一定百分比內。例如，PD-1/CD8純度10係落入PD-1表現最高10%內的所選擇的PD-1表現CD8+ T細胞的百分比。在一些實施方式中，PD-1/CD8純度10係高PD-1表現的度量，並且PD-1/CD8純度10細胞的百分比係具有高PD-1表現的分離的PD-1表現T細胞的百分比的度量。
在另一個實例中，PD-1/CD8純度20係落入PD-1表現最高20%內的所選擇的PD-1表現CD8+ T細胞的百分比。在一些實施方式中，PD-1/CD8純度20細胞的百分比係具有中等PD-1表現的分離的PD-1表現T細胞的百分比的度量。
在另一個實例中，PD-1/CD8純度30係落入PD-1表現最高30%內的所選擇的PD-1表現CD8+ T細胞的百分比。在一些實施方式中，PD-1/CD8純度30細胞的百分比係具有低PD-1表現的分離的PD-1表現T細胞的百分比的度量。
在一些實施方式中，如本文所用，術語「高表現（high expression或high expressing）」或「高表現子」係指分離的細胞的子集，其對指示細胞標記物的表現呈陽性，並且與對指示細胞標記物的表現呈陽性的其他細胞相比，使用以下一種或多種方法（例如，FACS、流動式細胞術、免疫螢光測定法或顯微術）產生更高的對指示細胞標記物的訊號。因此，在一些實施方式中，具有「高PD-1表現」的細胞係指對PD-1呈陽性的細胞，並且如藉由例如流動式細胞術測量的，與群中的其他細胞相比，其產生更高的PD-1訊號。例如，具有指示細胞標記物的「高」表現水平的細胞對該標記物產生的訊號可高於對指示細胞標記物的表現呈陽性的其他細胞的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%，或上述任何兩個值的範圍。
在一些實施方式中，如本文所用，術語「低表現（low expression或low expressing）」或「低表現子」係指分離的細胞的子集，其對指示細胞標記物的表現呈陽性，並且與對指示細胞標記物的表現呈陽性的其他細胞相比，使用以下一種或多種方法（例如，FACS、流動式細胞術、免疫螢光測定法或顯微術）產生低的對指示細胞標記物的訊號。因此，在一些實施方式中，具有「低PD-1表現」的細胞係指對PD-1呈陽性的細胞，並且如藉由例如流動式細胞術測量的，與群中的其他細胞相比，其產生更低的PD-1訊號。例如，具有指示細胞標記物的「低」表現水平的細胞對該標記物產生的訊號可低於對於指示細胞標記物的表現呈陽性的其他細胞的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約95%、或上述任何兩個值的範圍。
在一些實施方式中，如本文所用，術語「中等表現（intermediate expression或intermediate expressing）」或「中等表現子」係指分離的細胞的子集，其對指示細胞標記物的表現呈陽性，並且使用以下一種或多種方法（例如，FACS、流動式細胞術、免疫螢光測定法或顯微術）產生在高表現細胞與低表現細胞之間的某個程度的對指示細胞標記物的訊號。因此，在一些實施方式中，具有「中等PD-1表現」的細胞係指對PD-1呈陽性的細胞，並且如藉由例如流動式細胞術測量的，與群中的一他細胞相比，其產生更低的PD-1訊號，而與群中的其他細胞相比，其產生更高的PD-1訊號。
在一方面，本揭露內容提供了從細胞群中分離表現計劃性細胞死亡1（PD-1）的T細胞之方法，該等方法包括： (a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接； (b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物； (c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；和 (d) 從該磁場中洗脫該表現PD-1的T細胞，以分離該表現PD-1的T細胞。
在另一方面，本揭露內容提供還包括藉由調節以下一種或多種來選擇在步驟 (d) 中分離的表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平之方法： (i) 該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度； (ii) 該連接子的長度； (iii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率； (iv) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率； (v) 進行步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的溫度； (vi) 該抗體-細胞混合物和/或該珠粒混合物； (vii) 該珠粒混合物中磁珠的濃度； (viii) 該珠粒混合物通過該磁場的流速； (ix) 在該抗體-細胞混合物的產生與步驟 (b) 之間的時間長度； (x) 在該珠粒混合物的產生與步驟 (c) 之間的時間長度；或 (xi) 該磁場強度。
根據本文揭露的方法，可以從任何含有T細胞的樣本或細胞群中富集T細胞，包括例如獲自健康或患病個體的白血球去除術產物。在一些實施方式中，根據本文揭露之方法，從獲自患有癌症的受試者的白血球去除術起始產物獲得T細胞。
在一些實施方式中，該等T細胞係CD8+ T細胞。在其他實施方式中，該等T細胞係CD4+ T細胞。如本文所用，術語「T細胞」係指T淋巴細胞，其係在細胞介導的免疫中起關鍵作用的白血球類型。藉由在細胞表面上存在T細胞受體，可以將T細胞與其他淋巴細胞（諸如B細胞和自然殺傷細胞）區分開。T細胞的幾個子集分別具有不同的功能。大多數人T細胞在該細胞受體上重新排列其α和β鏈，被稱為αβ T細胞（alpha beta T cell），並且是適應性免疫系統的一部分。T細胞有兩種主要類型：輔助性T細胞（CD4+）和細胞毒性T細胞（CD8+）。大多數細胞毒性T細胞表現T細胞受體（TCR），該受體識別與I類MHC分子結合的特異性抗原。
藉由本領域已知的任何合適的方法，T細胞可以選自患者外周血樣本的大外周血單核細胞（PBMC）群。這樣的獲得大PBMC群的方法可以包括但不限於抽血和/或白血球去除術。該外周血可取自健康或患病個體。從外周血樣本獲得的大PBMC群可能包含T細胞，包括腫瘤反應性T細胞（TIL）和骨髓浸潤淋巴細胞（MIL）。在其他方面，T細胞可以選自腫瘤引流淋巴結、骨髓或解聚的腫瘤組織。
表現PD-1的T細胞的非限制性實例包括以以下標記物組合為特徵的T細胞：CD8+PD-1+；PD-1+TIM-3+；PD-1+CD27+；CD8+PD-l高表現子；CD8+PD-1+TIM-3+；CD8+PD-l+CD27高表現子；CD8+PD-1+CD27+；CD8+PD-1+TIM-3-；CD8+PD-1+CD27-；CD4+PD-1+；CD4+PD-lhi；CD4+PD-1+TIM-3+；CD4+PD-l+CD27高表現子；CD4+PD-1+CD27+；CD4+PD-1+TIM-3-；和CD4+PD-1+CD27 T細胞，其中（+）表示該等細胞表現標記物，而（-）表示該等細胞不表現標記物。可以在CD4+或CD8+ T細胞上表現的其他標記物係誘導型T細胞共刺激分子（ICOS）、TIGIT、OX40、LAG-3、GITR、CTLA-4和41BB（CD137）。
在本揭露內容的一些實施方式中，該捕獲部分係生物素。 如本文所用，術語「捕獲部分」係指附接到分子的化學部分，其可用於捕獲分子，例如，藉由與另一化學部分的相互作用，以達到諸如親和純化、免疫沈澱或共免疫沈澱的目的。例如，生物素捕獲部分可與鏈黴親和素柱結合使用，以分開、分離或親和純化包含該生物素部分的分子。聚組胺酸標籤（His標籤、6xHis標籤、六組胺酸標籤或His6-標籤）（「6xHis」、「六聚組胺酸」和「His6」，揭露为SEQ ID NO: 3）係包含至少六個組胺酸胺基酸殘基的捕獲部分（SEQ ID NO: 3），可用於捕獲His標籤化的分子，因為組胺酸殘基串在特定緩衝液條件下與幾種固定化金屬離子結合（包括鎳、鈷和銅）。另外，抗His標籤抗體可商購用於涉及His標籤化的蛋白質的方法。存在對該蛋白質具有特異性的抗體的任何蛋白質可以包含捕獲部分。捕獲部分的其他實例包括血凝素（HA）標籤、鏈黴親和素（streptavidin）結合肽、鈣調蛋白結合肽、S肽或幾丁質結合結構域。
在本揭露內容的方法中，該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接。如本文所用，「連接子」係指連接兩個化學實體（諸如捕獲部分和抗PD-1抗體）的任何化學連接。在一些實施方式中，該捕獲部分和該抗PD-1抗體之間的連接子係聚乙二醇（PEG）連接子。在一些實施方式中，該PEG連接子的長度係在1與12個單體單元之間。在其他實施方式中，該連接子係具有在1與10個碳原子之間的烷基鏈。在一些實施方式中，該捕獲部分係生物素，其使用磺基-NHS-生物素、磺基-NHS-LC-生物素、磺基-NHS-LC-LC-生物素或NHS-PEG4-生物素連接到該抗PD-1抗體。
在一些實施方式中，該連接子的長度範圍為約1 Å至約50 Å。在一些實施方式中，該連接子的長度為約1 Å、或約2 Å、或約3 Å、或約4 Å、或約5 Å、或約10 Å、或約15 Å、或約20 Å、或約25 Å、或約30 Å、或約35 Å、或約40 Å、或約45 Å、或約50。在其他實施方式中，該連接子的長度為約13.5 Å、22.4 Å、29.0 Å、或30.5 Å。在一些實施方式中，關於本文揭露的富集方法，術語「短連接子」係指長度不超過約17 Å的連接子；「中間連接子」係指長度在約17 Å與約26Å之間的連接子；而「長連接子」係指長度超過約26 Å的連接子。圖2顯示可用於影響根據本文揭露的方法對具有變化的PD-1表現水平的T細胞進行的選擇的示例性連接子長度。
通常，本文揭露的方法中使用的連接子的長度與富集的T細胞的PD-1表現水平負相關，並且與富集的PD-1表現T細胞的總產率正相關。因此，使用短連接子導致具有高PD-1表現水平的T細胞的富集和表現PD-1的T細胞的低產率，而使用長連接子導致具有低PD-1表現水平的T細胞的富集和PD-1表現T細胞的高產率。因此，在一些實施方式中，增加該連接子的長度會降低表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平。在一些實施方式中，增加該連接子的長度會增加表現PD-1的分離的T細胞的產率。
如本文所用，術語「CAR」係指捕獲部分濃度與抗體濃度的化學計量比。在一些實施方式中，CAR係用作選擇根據本文揭露的方法分離的PD-1表現T細胞的PD-1表現水平和產率的變數。在生物素係捕獲部分的實施方式中，CAR也被稱為生物素與抗體比率（BAR）。在一些實施方式中，CAR影響使用本文揭露的方法獲得的PD-1表現細胞的PD-1表現水平和/或產率。通常，在本文揭露之方法中，當CAR降低時，PD-1表現水平增加並且洗脫液中PD-1表現細胞的產率降低。可替代地，當CAR增加時，PD-1表現水平降低並且洗脫液中PD-1表現細胞的總產率增加（參見例如實例2和圖5）。在一些實施方式中，當CAR增加時，表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平降低。在一些實施方式中，當CAR增加時，表現PD-1的T細胞的產率增加。在一些實施方式中，CAR在1與8之間。在一些實施方式中，CAR在1與7.5之間。在其他實施方式中，CAR為約1、或約1.5、或約2、或約2.5、或約3、或約3.5、或約4、或約4.5、或約5、或約5.5、或約6、或約6.5、或約7、或約7.5。在其他實施方式中，CAR為約1.7、5.2或6.4。
在一些實施方式中，該細胞群內T細胞的濃度在2000萬細胞/mL至5億細胞/mL之間。在其他實施方式中，該細胞群內T細胞的濃度為約2000萬細胞/mL、或約5000萬細胞/mL、或約1億細胞/mL、或約1.5億細胞/mL、或約2億細胞/mL、或約2.5億細胞/mL、或約2.75億細胞/mL、或約3億細胞/mL、或約3.5億細胞/mL、或約4億細胞/mL、或約4.5億細胞/mL、或約5億細胞/mL。
在一些實施方式中，該細胞群獲自健康受試者。在其他實施方式中，該細胞群獲自患有癌症的受試者。
在一些實施方式中，磁珠的濃度在每1 x 107 細胞約1 µL與每1 x 107 細胞約100 µL之間。在其他實施方式中，磁珠的濃度在每1 x 107 細胞約1 µL與每1 x 107 細胞30 µL之間。在其他實施方式案中，磁珠的濃度為每1 x 107 細胞約5 µL、或每1 x 107 細胞約10 µL、或每1 x 107 細胞約20 µL、或每1 x 107 細胞約100 µL。通常，在本文揭露之方法中，洗脫液中PD-1表現水平與磁珠濃度負相關，而洗脫液中PD-1表現細胞的產率與磁珠濃度正相關。因此，在一些實施方式中，增加磁珠濃度降低了表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平。在一些實施方式中，增加磁珠濃度增加了表現PD-1的分離的T細胞的產率。
任何抗PD-1抗體可用於本文揭露的方法中。可以在本文揭露之方法中使用的PD-1抗體的非限制性實例可以在例如Agata等人, 1996,Int. Immunol . [國際免疫學] 8(5): 765-72和美國專利號7,488,802和8,088,905中找到，其全部內容藉由引用以其整體併入本文。
在一些實施方式中，該抗體-細胞混合物中的抗PD-1抗體的濃度在0.1 μg/mL與10 μg/mL之間。在其他實施方式中，該抗體-細胞混合物中的抗體的濃度在0.5 µg/mL與5 µg/mL之間。
在一些實施方式中，該抗PD-1抗體係LO115。在某些方面，LO115包含具有序列SASSKHTNLYWSRHMYWY（SEQ ID NO: 4）的第一輕鏈CDR、具有序列LTSNRAT（SEQ ID NO: 5）的第二輕鏈CDR和具有序列QQWSSNP（SEQ ID NO: 6）的第三輕鏈CDR；以及具有序列GFTFSDYGMH（SEQ ID NO: 7）的第一重鏈CDR、具有序列YISSGSYTIYSADSVKG（SEQ ID NO: 8）的第二重鏈CDR和具有序列RAPNSFYEYYFDY（SEQ ID NO: 9）的第三重鏈CDR。在本文揭露的方面中，LO115包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK（SEQ ID NO: 10）；以及重鏈，該重鏈包含胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 11）。
在一些實施方式中，該抗PD-1抗體係LO115，並且該抗體的濃度在0.01 µg/mL與1 µg/mL之間。
在其他實施方式中，該抗PD-1抗體係MEDI0680。如本文所用，生物素化MEDI0680係MEDI3097。在某些方面，MEDI0680包含具有序列SASSSVSYMY（SEQ ID NO: 12）的第一輕鏈CDR、具有序列LTSNRAT（SEQ ID NO: 5）的第二輕鏈CDR和具有序列QQWSSNPFT（SEQ ID NO: 13）的第三輕鏈CDR；以及具有序列GFTFSDYGMH（SEQ ID NO: 7）的第一重鏈CDR、具有序列YISSGSYTIYSADSVKG（SEQ ID NO: 8）的第二重鏈CDR和具有序列RGYGSFYEYYFD（SEQ ID NO: 14）的第三重鏈CDR。在進一步的方面，MEDI0680包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含胺基酸序列QIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCSASSSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDYSS TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 15）；以及重鏈可變區，該重鏈可變區包含胺基酸序列EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSYTIYS ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRAED TAVYYCARRG YGSFYEYYFD YWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 16）。
在進一步的實施方式中，該抗PD-1抗體係MEDI0680，並且該抗體的濃度在0.5 μg/mL與5 μg/mL之間。
通常，在本文揭露之方法中，所選擇的T細胞上的PD-1表現水平與抗PD-1抗體濃度成反比，而PD-1表現細胞的產率與抗PD-1抗體濃度成正比。因此，在一些實施方式中，增加該抗體-細胞混合物中的抗體濃度降低了表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平。在其他實施方式中，增加該抗體-細胞混合物中的抗體濃度增加了表現PD-1的分離的T細胞的產率。
在本文揭露的方法的一些實施方式中，使包含結合了抗PD-1抗體（該等抗體又藉由捕獲部分與磁珠結合）的細胞群的細胞、抗體和磁珠的混合物通過磁場不止一次。在一些實施方式中，首先使該珠粒混合物以高流速通過磁場，並且由從高流速通道分離的磁珠洗脫的PD-1表現T細胞具有高PD-1表現水平；接著，將高表現PD-1的細胞從該珠粒混合物中洗脫後使剩餘的珠粒混合物的初級陰性級分以中等流速第二次通過磁場，從而產生包含具有中等PD-1表現水平的T細胞的捕獲細胞的次級級分；並且接著，在洗脫該等中等PD-1表現的細胞後使殘留的珠粒混合物的次級陰性級分第三次以低流速通過磁場，產生包含具有低PD-1表現水平的T細胞的捕獲細胞的三級級分。在一些實施方式中，首先使該珠粒混合物以低流速通過磁場，產生該珠粒混合物的捕獲細胞級分和廢棄的級分；接著，使該捕獲細胞級分以中等流速第二次通過磁場，產生捕獲細胞的次級級分和陰性級分，其中該陰性級分包含具有低PD-1表現水平的T細胞；並且接著，使捕獲細胞的次級部分以高流速第三次通過磁場，產生捕獲細胞的三級級分和第二陰性級分，其中該第二陰性級分包含具有中等PD-1表現水平的T細胞和包含具有高PD-1表現水平的T細胞的捕獲細胞的三級級分。
因此，在本文揭露的方法的一些實施方式中，使該珠粒混合物通過磁場並從該磁場洗脫該表現PD-1的T細胞的步驟包括： (a) 使該珠粒混合物以高流速和/或低磁場強度通過該磁場； (b) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有高PD-1表現水平的T細胞； (c) 在具有高PD-1表現水平的T細胞洗脫後使剩餘的珠粒混合物的初級陰性級分以中等流速和/或中等磁場強度通過該磁場； (d) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有中等PD-1表現水平的T細胞； (e) 在中等PD具有-1表現水平的T細胞洗脫後使剩餘的珠粒混合物的次級陰性級分以低流速和/或高磁場強度通過該磁場；和 (f) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有低PD-1表現水平的T細胞。
在本文揭露的方法的其他實施方式中，使該珠粒混合物通過磁場並從該磁場洗脫該表現PD-1的T細胞的步驟包括： (a) 使該珠粒混合物以低流速和/或高磁場強度通過該磁場，以產生第一捕獲珠粒混合物級分和廢棄的珠粒混合物級分； (b) 從該磁場中洗脫該第一捕獲珠粒混合物級分； (c) 使該第一捕獲珠粒混合物級分以中等流速和/或中等磁場強度通過該磁場，以產生次級捕獲珠粒混合物級分和第一陰性珠粒混合物級分，其中該第一陰性珠粒混合物級分包含具有低PD-1表現水平的T細胞； (d) 使該次級捕獲珠粒混合物級分以高流速和/或低磁場強度通過該磁場，以產生三級捕獲珠粒混合物級分和第二陰性珠粒混合物級分，其中該三級捕獲珠粒混合物級分包含具有高PD-1表現水平的T細胞，並且該第二陰性珠粒混合物級分包含具有中等PD-1表現水平的T細胞。
在一些實施方式中，該高流速在11.0 cm/min至20.0 cm/min的範圍內。在一些實施方式中，該中等流速在4.0 cm/min至8.0 cm/min的範圍內。在一些實施方式中，該低流速在1.0 cm/min至3.0 cm/min的範圍內。
在一些實施方式中，改變藉由該磁場施加的力以選擇根據本揭露內容的方法分離的T細胞群中具有更高或更低的PD-1表現或者更高或更低產率的PD-1表現細胞。在一些實施方式中，在該珠粒混合物連續通過該磁場期間，該磁場強度與該流速一起變化，以便在不同的通過中獲得低、中等和高表現PD-1的T細胞。例如，在一些實施方式中，該珠粒混合物首先以高流速通過該磁場，其中從高流速通道分離的磁珠洗脫的PD-1表現T細胞具有高PD-1表現水平；接著，將高表現PD-1的細胞從該珠粒混合物中洗脫後使剩餘的珠粒混合物的初級陰性級分以中等流速第二次通過磁場，從而產生包含具有中等PD-1表現水平的T細胞的捕獲細胞的次級級分；並且接著，使洗脫該等中等PD-1表現的細胞後殘留的珠粒混合物的次級陰性級分第三次以低流速但以與前兩次藉由相比更強的磁場強度通過磁場，產生包含具有低PD-1表現水平的T細胞的捕獲細胞的三級級分。
在本文揭露的方法的一些實施方式中，根據式I調節表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平：
Figure 02_image001
其中：N( 標記 ) 係表現PD-1的T細胞上預期標記分子的數量，其與分離的T細胞的PD-1表現水平負相關；N 係表現PD-1的T細胞上PD-1抗原結合位點的數量；[Ab]i 係該抗體-細胞混合物中抗PD-1抗體的初始濃度；α 係具有可接近的捕獲部分的抗PD-1抗體與總抗PD-1抗體的比率；並且Kd 係該抗PD-1抗體在孵育溫度下的解離常數，即在孵育溫度下Koff /Kon 的比率。
在一些實施方式中，藉由改變或調整以下一項或多項來調整以上式I中的參數α ： (i) 該連接子的長度； (ii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率；或 (iii) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率（可以與包含捕獲部分的該抗PD-1抗體相同，或與包含捕獲部分的該抗PD-1抗體捕獲部分不同）。
在另一方面，本揭露內容提供了用於體外T細胞擴增之方法，該等方法包括以下步驟： (a) 致敏根據本文揭露的任何方法分離的表現PD-1的T細胞樣本，其中該致敏步驟包括： (i) 在第-1天用致敏因子塗覆培養板； (ii) 在第0天接種表現PD-1的T細胞群，其中該接種步驟包括： (1) 在該塗覆的培養板上添加基礎培養基；和/或 (2) 向該基礎培養基中添加一定量的分離的和/或富集的T細胞，以在該塗覆的培養板上產生接種混合物； (b) 收穫表現PD-1的致敏的T細胞； (c) 將收穫的表現PD-1的T細胞放置於接種混合物中，並將該接種混合物放置於未處理的培養板中； (d) 在該接種混合物中培養表現PD-1的T細胞； (e) 從培養的接種混合物中收穫表現PD-1的T細胞； (f) 重複步驟 (b)-(e)，直到獲得目標數量的擴增的T細胞。
在一些實施方式中，在塗覆培養板的步驟中使用的該等致敏因子包括OKT3、可溶性α-CD28、α-ICOS、α-ICOS（#140）、α-LAG3、α-CD137、α-OX40或其任何組合。如本文所用，術語「致敏因子」係指用於擴增培養物致敏的添加劑。這樣的因子或添加劑係本領域已知的，並且作為非限制性實例包括IL-2、α-TIGIT、Iso、α-CD226、α-CD28、α-TIM3、α-LAG3、α-PD-1、Luperox、苯紮貝特或其任何組合。在一些實施方式中，向該基礎培養基中加入添加劑，並且該等添加劑可包含IL-2、α-TIGIT、Iso、α-CD226、α-CD28、α-TIM3、α-LAG3、α-PD-1、α-OX40、Luperox、苯紮貝特或其任何組合。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者之方法，該等方法包括向該受試者投與治療有效量的根據本文揭露的方法分離的表現PD-1的T細胞。在一些實施方案中，本文揭露的方法用於治療患有癌症的受試者。
在一方面，本揭露內容提供了用於體外T細胞擴增之方法，該等方法包括： (a) 使T細胞群和與抗CD3抗體、抗ICOS抗體或其組合軛合的（conjugated）珠粒接觸; (b) 孵育該珠粒和T細胞混合物以擴增該T細胞群。 在另一方面，本揭露內容提供了用於體外T細胞擴增的方法，其中該T細胞群包含活化的CD4和CD8細胞。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的表現PD-1的T細胞； 其中該等表現PD-1的T細胞係藉由以下方法分離的： (a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接； (b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物； (c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；以及 (d) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離表現PD-1的T細胞； 其中藉由調節以下一項或多項來選擇在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平： (i) 該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度； (ii) 該連接子的長度； (iii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率； (iv) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率； (v) 進行步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的溫度； (vi) 該細胞群中T細胞的濃度； (vii) 該抗體-細胞混合物和/或珠粒混合物中T細胞的濃度； (viii) 該珠粒混合物通過該磁場的流速； (ix) 在該抗體-細胞混合物的產生與步驟 (b) 之間的時間長度； (x) 在該珠粒混合物的產生與步驟 (c) 之間的時間長度；或 (xi) 該磁場強度；並且 其中表現PD-1的T細胞群藉由以下方式進行體外擴增： (a) 致敏根據本文揭露的任何方法分離的表現PD-1的T細胞樣本，其中該致敏步驟包括： (i) 在第-1天用致敏因子塗覆培養板； (ii) 在第0天接種表現PD-1的T細胞群，其中該接種步驟包括： (1) 在該塗覆的培養板上添加基礎培養基；和/或 (2) 向該基礎培養基中添加一定量的分離的和/或富集的T細胞，以在該塗覆的培養板上產生接種混合物； (b) 收穫表現PD-1的致敏的T細胞； (c) 將收穫的表現PD-1的T細胞放置於接種混合物中，並將該接種混合物放置於未處理的培養板中； (d) 在該接種混合物中培養表現PD-1的T細胞； (e) 從培養的接種混合物中收穫表現PD-1的T細胞； (f) 重複步驟 (b)-(e)，直到獲得目標數量的擴增的T細胞。
在本文揭露的任何擴增和/或治療方法的一些實施方式中，在該擴增方法的致敏步驟期間存在ICOS激動劑以引起T細胞擴增。在一些實施方式中，該致敏步驟對應於刺激的前4天。在一些實施方式中，IL-2在擴增的前4天（即在致敏期間）係可省略的，但是此後一旦除去ICOS激動就需要。
因此，在一些實施方式中，在T細胞擴增中使用的該等致敏因子包括ICOS激動劑。在一些實施方式中，該ICOS激動劑係抗ICOS抗體。在一些實施方式中，T細胞被致敏4天。在一些實施方式中，致敏後T細胞的培養在IL-2的存在下進行。
在其他實施方式中，用於T細胞擴增的該等致敏因子包括OX40激動劑。在一些實施方式中，該OX40激動劑係抗OX40抗體。在一些實施方式中，該抗OX40抗體係MEDI0562。與MEDI0562相關的揭露內容可以在美國專利號9,738,723中找到，其藉由引用以其整體併入本文。在一些實施方式中，T細胞被致敏4天。在一些實施方式中，致敏後T細胞的培養在IL-2的存在下進行。
在另一方面，本公開內容提供了治療受試者的癌症的方法，其包括首先動員PD-1+ 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）。在某些方面，該動員藉由普樂沙福（Plerixafor）、IL-10、威羅菲尼（Vemurafenib）、CXCL2或曲美木單抗的投與介導。在一個特定方面，該等方法包括：(a) 以有效於將PD-1+ 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）動員到外周血中的量向該受試者投與抗CTLA-4抗體；(b) 從該受試者的外周血中收穫PD-1+ TIL；(c) 擴增所收穫的PD-1+ TIL；以及 (d) 將該擴增的PD-1+ TIL投與該受試者。在一些實施方式中，根據本文揭露的任何擴增方法擴增所收穫的PD-1+ TIL。在一些實施方式中，該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗。與曲美木單抗相關的揭露內容可以在美國專利號6,682,736中找到，其藉由引用以其整體併入本文。
在一方面，本文揭露的方法還包括測量腫瘤突變負荷（TMB）。該等測量可以在治療之前、之中或之後進行。在某些方面，本文揭露的方法對於具有高TMB的患者可能更成功。在一方面，藉由測量循環腫瘤DNA（ctDNA）的水平來確定TMB。在正常條件下，無細胞DNA（cfDNA）僅在血液中以低量觀察到，但是響應於力竭性運動、炎症或疾病的發生，它們不能被有效地清除。例如，源自癌細胞的循環DNA代表癌症患者中cfDNA的獨特且可測量的組分。cfDNA的此ctDNA部分可用於對腫瘤和癌症疾病進行分類，諸如對癌症患者進行分層，允許投與更有效的治療方法，並允許對不太可能提供臨床改善的現有治療方法進行修改。ctDNA的使用和測量方法可以在例如美國公開號US 2018/0282417中找到。實例
以下實例說明了本揭露內容的具體實施方式及其各種用途。闡述它們僅出於解釋目的，並且不應以任何方式解釋為限制本揭露內容的範圍。實例 1. PD-1 表現 T 細胞的富集
藉由標準白血球去除術或抽血方案以人外周血的形式獲得供體血液。藉由本領域已知的離心方案從供體血液中除去紅血球。簡而言之，將外周血離心，棄去上清液，將沈澱物重懸於氯化銨鉀（ACK）緩衝液中，將該ACK沈澱物懸液在室溫下孵育，並將該等細胞在洗滌緩衝液中洗滌兩次以產生細胞沈澱物。
然後進行該等PD-1表現細胞的富集。將洗滌後的細胞沈澱重懸於洗滌緩衝液中並測定細胞計數。添加洗滌緩衝液以使細胞密度達到100 x 106 細胞/mL。將1 μg/mL MEDI3097抗體添加到細胞中，以產生包含細胞和MEDI3097抗體的抗體-細胞混合物。該抗體混合物在4°C孵育15分鐘，然後離心並用洗滌緩衝液洗滌兩次。添加洗滌緩衝液以使細胞密度達到125 x 106 細胞/mL。然後將抗生物素珠以每10億細胞2 mL珠粒的濃度添加到細胞中，以產生珠粒混合物。將該珠粒混合物在4°C孵育15分鐘，然後離心，洗滌一次，然後將細胞以200 x 106 細胞/mL總細胞的濃度重懸於洗滌緩衝液中。然後將該重懸浮的珠粒混合物載入到磁柱上。將該柱用洗滌緩衝液洗滌3次。洗脫具有不同PD-1表現水平的T細胞。另外，測試了LO115抗PD-1抗體，發現其產生MEDI3097相似的結果（參見圖13和15）。實例 2. PD-1 表現 T 細胞的可調富集
從白血球去除術產物中除去紅血球後，進行PD-1表現T細胞的富集。將洗滌後的細胞沈澱重懸於洗滌緩衝液中並測定細胞計數。添加洗滌緩衝液以使細胞密度達到100 x 106 細胞/mL。將1 μg/mL MEDI3097抗體添加到細胞中，以產生包含細胞和MEDI3097抗體的抗體-細胞混合物。已鑒定許多過程變數對高表現PD-1或低表現PD-1的T細胞的選擇具有重大影響。
在一個實驗中，評估了生物素與抗PD-1抗體比率（BAR）對富集的細胞的PD-1表現水平的作用。如圖5B所示，低BAR提供了高PD-1表現水平和低產率，而高BAR提供了低PD-1表現水平和高產率。對於4°C下的MEDI0680，BAR調節的作用穩定在3.5-4.0左右。
在另一實驗中，研究了在該捕獲部分與該抗PD-1抗體之間連接子長度的影響。測試了長度在約1 Å與約50 Å之間的連接子。BAR也影響了連接子長度對PD-1高表現子的影響。圖3顯示PD-1的表現，以及在低BAR和各種連接子長度下的PD-1高表現子純度和產率，而圖4顯示在高BAR和各種連接子長度下的選擇結果。
另外，發現抗PD-1抗體的濃度影響高表現PD-1或低表現PD-1的T細胞的選擇。低濃度的抗PD-1抗體導致高PD-1表現水平和低產率。相反，高抗PD-1抗體濃度導致低PD-1表現水平和高產率。對於4°C下的MEDI0680，抗PD-1抗體濃度對PD-1表現水平的影響穩定在5.0 μg/mL左右。如圖5所示，初始總細胞濃度不影響選擇結果。
此外，如圖6A所示，發現抗生物素微珠的濃度會影響T細胞PD-1表現水平的選擇。發現PD-1表現水平與珠粒濃度呈負相關：隨著添加的微珠量從每mL細胞懸液50 µL微珠懸液增加至100 µL微珠懸液至200 µL微珠懸液，每個CD8PD-1純度水平（10%、20%和30%）的細胞百分比都下降（圖6B，左）。發現表現高水平PD-1的T細胞的產率與微珠濃度呈正相關：隨著添加的微珠量從每mL細胞懸液50 µL微珠懸液增加至100 µL微珠懸液至200 µL微珠懸液，每個CD8PD-1純度水平（10、20和30）的細胞產率都增加。
還研究了重懸的珠粒混合物通過磁柱的流速的作用（圖7，左分支）。當該珠粒混合物首先以高流速通過柱時，選擇高表現PD-1的T細胞，並保留了陰性級分的該珠粒混合物。該珠粒混合物的陰性級分以中等流速第二次通過該柱。該中等流速選擇了PD-1中等（「PD-1中」）表現T細胞，並留下該珠粒混合物的陰性級分。該珠粒混合物的陰性級分以較低的流速第三次通過該柱。該較低流速選擇了PD-1低表現T細胞。
當該珠粒混合物首先以低流速通過該柱時（圖7，右分支），該等捕獲細胞被洗脫並以中等流速第二次通過該柱。該中等流速產生捕獲細胞和含有PD-1低表現T細胞的陰性級分。再次洗脫該等捕獲細胞，然後第三次以高流速通過該柱，這產生了捕獲細胞和含有PD-1中等（「PD-1中級」）表現T細胞的陰性級分。該捕獲級分含有PD-1高表現T細胞，將其從該柱上洗脫下來。
如圖9所示，還測試了各種流速和磁場強度的組合。首先使PD-1陽性細胞以高流速通過該柱，選擇高表現PD-1的T細胞，並保留該珠粒混合物的陰性級分。該珠粒混合物的陰性級分以中等流速第二次通過該柱。該中等流速選擇了中等表現PD-1的T細胞，並留下該珠粒混合物的第二陰性級分。該第二陰性級分以更強的磁場強度第三次通過該磁場，選擇了低表現PD-1的細胞。圖10顯示CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的選擇結果，其中第一次流動以高流速進行，隨後以低流速進行，並以更強的磁場強度結束。實例 3. PD-1 表現 T 細胞的可調富集的公式化方法
如公式1所示，以遵循與本文所述實驗一致的數學模型，測定具有不同PD-1表現水平的T細胞的富集：
Figure 02_image003
其中：N( 生物素 ) 係每個PD-1+細胞上預期可接近的生物素分子的數量，其與分離的細胞的PD-1表現水平負相關；N 係細胞上PD-1抗原結合位點的數量；[Ab]i 係該抗PD-1抗體的總濃度；α 係具有可接近的捕獲部分的抗PD-1抗體與總抗PD-1抗體的比率；以及Kd 係該抗PD-1抗體在孵育溫度下的解離常數，即在平衡狀態下Koff /Kon 的比率，其中
Figure 02_image005
。
在該數學模型中，該抗PD-1抗體的濃度對於選擇過程至關重要。如以上實例2所示，式1與實驗結果一致。如果[Ab]i 接近Kd ，則會產生明顯的作用（參見圖11，顯示具有Kd 值的抗PD-1抗體的濃度）。當[Ab]i 為＞＞ Kd 時，該抗PD-1抗體的濃度對PD-1表現細胞分離的作用（分離的細胞的總產率和PD-1表現水平）達到穩定。圖5中的實驗結果與模型的預測一致。當BAR低時，保留未修飾的抗PD-1抗體（參見圖12，黑色箭頭），然後α ＜ 1。隨著BAR的增加，生物素化MEDI0680的α比率增加到1，並且BAR對PD-1表現細胞分離的作用（分離的細胞的總產率和PD-1表現水平）先變化，然後穩定。圖5中的實驗結果與模型的預測一致。使用短連接子（諸如長度為13.5 Å的連接子）（參見圖2），該捕獲部分生物素可能無法被某些一級胺位點上的抗生物素珠粒接近，因此該等生物素化MEDI0680分子的α比率 ＜ 1。當與長連接子（諸如超過17 Å的連接子）軛合時，所有捕獲部分生物素均可被抗生物素珠粒接近，因此該等生物素化MEDI0680分子的α比率為1。結果，具有短連接子的生物素化MEDI0680可以比具有相似BAR水平的長連接子的生物素化MEDI0680富集具有更高PD-1表現水平的T細胞。實驗結果證實了這一預測（參見圖3、4和5）。該預測也適用於不同類型的連接子（例如，具有29 Å的PEG4，參見圖2），而實驗結果顯示，使用PEG4連接子分離的T細胞的生物素化MEDI0680，其PD-1表現水平與當抗體濃度相同時用22.4 Å長的LC連接子連接的使用生物素化MEDI0680分離的T細胞的PD-1表現水平相似（參見圖57）。
當應用上述公式1時，如果抗體分子的數量比表現PD-1的細胞的數量大得多（當濃度為1 μg/mL時應如此），那麼使用式2測定一個PD-1分子具有至少一個可接近生物素分子的概率：
Figure 02_image007
一個PD-1表現分子具有一個抗體的概率基於下式3的等式中提供的平衡狀態：
Figure 02_image009
， 其中抗PD-1抗體的初始濃度為[AB]i 。 可以藉由改變以下因素調整變數α：該生物素與抗PD-1抗體比率、在該捕獲部分與抗PD-1抗體之間的連接子長度、或具有捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體（其與具有捕獲部分的抗PD-1抗體相同或與具有捕獲部分的抗PD-1抗體不同）的比率、或該等因素的任何組合。對於任何抗PD-1抗體都是如此，包括具有低結合親和力的MEDI0680和具有高結合親和力的LO115。
圖13顯示，當調節生物素化PD-1抗體（LO115）的濃度時，PD-1高T細胞的表現隨著生物素化抗體濃度的降低而增加。圖14顯示，針對MEDI0680調整了具有捕獲部分（生物素化）的抗PD-1和未修飾的抗PD-1抗體的比率時，分離的細胞的PD-1表現水平隨未修飾的抗PD-1抗體的比率的增加而增加。即使總抗PD-1抗體濃度恒定，也可以觀察到這一點。圖15顯示對LO115相似的結果。實例 4. PD-1 表現 T 細胞的快速擴增
如實例1和2中所述，從白血球去除術產物富集的T細胞按如下擴增。藉由使用具有1X L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、5% CTS免疫細胞SR和500 U/mL IL-2的X-Vivo 15培養基製備基礎培養基。藉由向製備的基礎培養基中添加1 μg/mL α-CD28來製備致敏培養基。在一些實驗中，藉由將0.01 µM Luperox添加到製備的基礎培養基中來製備擴增培養基。
在將富集的T細胞接種以進行擴增的前一天，藉由用以下致敏因子將板覆蓋過夜，來對未處理的24孔培養板進行致敏：1 μg/mL OKT3，抗人T細胞的單株抗體，每個孔中500 μL磷酸鹽緩衝液中的α-ICOS濃度不同（0至5 μg/mL）。致敏示意圖如圖16所示。將該等致敏因子在4°C下孵育過夜。
第二天（第0天），將致敏的24孔板用PBS洗滌兩次，並使用本文所述的富集方案富集PD-1表現細胞。將富集的PD-1細胞以0.5 x 106 細胞/mL的濃度懸浮在致敏培養基中。然後將懸浮的細胞接種在致敏的板上，然後在37°C下孵育。
在第4天，從24孔板中收穫接種的細胞，進行計數，重懸，然後將1.5至2.5 x 106 細胞接種到6孔板上的擴增培養基中，每個孔包含10 cm2 透氣膜和40 mL培養基容量（威爾遜狼公司（Wilson Wolf），G-Rex6孔板-P/N 80240M）。
在第7天，收穫細胞，計數，重懸，然後將5 x 106 細胞接種在6孔板的每個孔中的擴增培養基中。在第10天重複此過程。
在第13天，收穫細胞，計數，並且終結擴增。圖17顯示對於不同濃度（0、0.04、0.2和1 μg/mL）的α-ICOS，PD-1表現細胞的細胞增殖情況。實例 5. PD-1 表現 T 細胞的快速擴增手動致敏和 TetAb 致敏的比較
如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。 使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS來致敏24孔板。簡而言之，將從白血球去除術產物富集的PD-1表現細胞以0.5 x 106 細胞 mL的濃度懸浮在致敏培養基中。然後將懸浮的細胞接種在致敏的板上，並添加可溶的α-CD28或TetAb（無另外的α-CD28）。然後將該等細胞在37°C下孵育。
在第13天，收穫細胞，計數，並且終結擴增。圖18顯示T細胞增殖的比較結果，其中手動致敏顯示對快速擴增更大的功效。實例 6. α-ICOS 殖株對 T 細胞擴增的增殖功效
為了比較PD-1表現T細胞擴增的增殖功效，在實例4中描述的擴增方案中使用了不同濃度的α-ICOS或不同濃度的不同α-ICOS殖株。將濃度為0.2-5 μg/mL的α-ICOS以及α-ICOS殖株#138和#140用於致敏24孔板。
在第13天，收穫細胞，計數，並且終結擴增。圖19顯示對於不同濃度的α-ICOS和α-ICOS殖株，PD-1表現細胞的細胞增殖，其中α-ICOS和α-ICOS殖株#140顯示相似的增殖功效。實例 7. T 細胞擴增中不同持續時間的化學處理
如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS來致敏24孔板。在不同的起始點和不同的時間長度內，將2 μM苯紮貝特或0.05 μM Luperox添加到培養物中。該等化學物質之間的變化係匹配的，其中在以下時間向培養基中添加苯紮貝特或Luperox：1) 第0天到第4天；2) 第0天到第7天；3) 第0天到第10天；4) 第0天到第13天；5) 第4天到第13天；6) 第7天到第13天；以及 7) 第10天到第13天。
在第13天，收穫細胞，計數，並且結束擴增。圖20顯示PD-1表現細胞在不同起始點和持續時間的化學處理下的倍數擴增。實例 8. T 細胞擴增中不同持續時間和濃度的化學處理
如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS來致敏24孔板。簡而言之，將從白血球去除術產物富集的PD-1表現細胞以0.5 x 106 細胞/mL的濃度懸浮在含或不含2 μM苯紮貝特的致敏培養基中。然後將懸浮的細胞接種在致敏的板上，並在37°C下孵育。
在第4天，在含或不含2 μM苯紮貝特或Luperox濃度在0.01 μM至1.25 μM之間的擴增培養基中，將1.5 x 106 至2.5 x 106 細胞重新接種在G-Rex 6孔板上。
在第13天，收穫細胞，計數，並且結束擴增。圖21顯示對於不同化學處理和濃度，PD-1表現細胞的倍數擴增。實例 9. PD-1 表現 T 細胞的 6 孔最佳重新接種快速擴增
如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS或α-ICOS殖株（#140）來致敏24孔板。
在第4、7和10天，將5 x 106 細胞重新接種在G-Rex6孔板上含或不含0.01或0.05μM Luperox的基礎培養基中。
在第13天，收穫細胞，計數，並且結束擴增。圖22顯示對於6孔最佳重新接種過程，PD-1表現細胞的倍數擴增。實例 10. PD-1 表現 T 細胞的 6 孔多學科綜合快速擴增
如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS殖株（#140）來致敏24孔板。
在第4、7和12天，將5 x 106 細胞重新接種在G-Rex6孔板上含或不含0.01 μM Luperox的基礎培養基中。
在第15天，收穫細胞，計數，並且結束擴增。圖23顯示對於多學科綜合快速擴增過程，PD-1表現細胞的倍數擴增。實例 11. PD-1 表現 T 細胞的全規模擴增
將如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述通過G-Rex 100M容器全規模進行擴增。使用濃度為1 μg/mL的α-ICOS或α-ICOS殖株（#140）來致敏24孔板。在第4天，將1.5 x 106 到2.5 x 106 細胞接種在G-Rex6孔板上含或不含0.01 μM Luperox的擴增培養基中。
在第7天，收穫細胞並計數。將整個細胞置於具有100 cm2 透氣膜（威爾遜狼公司，G-Rex100M – P/N 81100S）的1000 mL培養基容量的容器中含或不含0.01 μM Luperox的500 mL基礎培養基中。在擴增的第10天，計數細胞懸液，並將含或不含0.01 μM Luperox的300 mL基礎培養基添加到該容器中。
在第13天，收穫細胞，計數，並且結束擴增。圖24顯示PD-1表現細胞的倍數增殖。圖25顯示使用最佳重新接種過程和1億全規模培養過程進行的擴增的比較，而圖26顯示用於最佳重新接種培養和全規模培養的方案。
圖45A和45B顯示與標準快速擴增方案相比，PD-1+ T細胞的有利的倍數擴增（圖45A）和CD4/CD8 T細胞比率（圖45B）係由本文揭露的改善的快速擴增方案導致的（如Dudley等人, 2003,J. Immunother . [免疫治療雜誌] 26(4): 332-42所述）。該等結果表明，與標準快速擴增方案相比，本文揭露的快速擴增方案引起PD-1+ T細胞擴增並更有利地維持CD4/CD8 T細胞比率。實例 12. PD-1 表現 T 細胞擴增的抗體測試
使用本文揭露的方法進行分析以測定可用於成功擴增PD-1表現T細胞的抗體的範圍。在這種分析中，致敏步驟相比實例4有變化，使得在塗覆未處理的24孔板時，要測試的抗體替代了α-ICOS。將要測試的抗體以不同的濃度添加。測試的抗體包括：(a) α-CD137（41BB）、(b) α-PD-1、(c) α-LAG3、(d) α-TIM3（62GL）、(e) α-TIM3（F9S）、(f) OX40、(g) α-TIGIT（1170）和 (h) α-TIGIT（1182）。還使用以下致敏抗體組合進行實驗：(h) 含α-CD137（41BB）的α-ICOS、(i) 含α-CD226-A的α-TIGIT（1170）、(j) 含α-CD226-B的α-TIGIT（1170）、(k) 含α-CD226-C的α -TIGIT（1170）、(l) 含α-CD226-A的α-TIGIT（1182）、(m) 含α-CD226-B的α-TIGIT（1182）以及 (n) 含α-CD226-C的α- TIGIT（1182）。該等實驗均未顯示PD-1 T細胞的擴增活性（參見圖27至圖31），顯示活性的含α-CD137（41BB）的α-ICOS除外，但與單獨使用α-ICOS相比沒有任何改善（參見圖32）。該等結果表明，B7家族分子ICOS獨特地改變了誘導穩健擴增的PD-1+ T細胞的細胞適應性，並且與TNF受體家族分子CD137和OX40完全不同。實例 13. 使用抗體軛合的珠粒的情況下原代人 T 細胞的增殖和活化。
完成實驗以評估在不利用結合板的抗CD3和抗ICOS抗體的情況下活化人原代T細胞的可行性。為了進行概念驗證，將M280和M450甲苯磺醯基活化的聚苯乙烯Dynabeads®（英傑公司（Invitrogen））用一系列抗人CD3抗體（英商梅迪繆思有限公司（MedImmune））、抗ICOS抗體（英商梅迪繆思有限公司）或1:4比率的抗CD3:抗ICOS抗體（DualBeads）孵育。藉由評估在珠粒塗覆之前和之後的塗覆液中的總蛋白質，間接評估抗體塗覆的功效，並評估吸光度。對於T細胞活化對照，將96孔非組織培養物塗覆的板用抗CD3（英商梅迪繆思有限公司）、抗ICOS（英商梅迪繆思有限公司）或兩種抗體的組合預塗覆過夜。
在知情同意的情況下，從四個健康人供體中收集全血，並藉由陰性選擇（StemCell）純化總T細胞。用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）（英傑公司）標記細胞，將50,000個細胞接種到96孔組織培養板的培養基（RPMI 1640，含10%胎牛血清，含1x青黴素/鏈黴素）中。另外，將相當數量的CFSE標記的細胞添加到上述的結合板的對照板。製備濃度為每毫升培養基4e6、2e6、1e6、0.5e6、0.25e6、0.125e6或0.062e6珠粒的抗CD3珠粒、抗ICOS珠粒、抗CD3/抗ICOS珠粒、或抗CD3珠粒和抗ICOS珠粒的組合的系列稀釋物。將100 μL珠粒添加到適當的細胞孔中以形成最終珠粒：細胞比率為4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8和1:16。將所有含細胞的板在37°C和5% CO2 下孵育大約90小時。孵育後，將細胞染色以進行流動式細胞術分析。圖36-44顯示塗覆有抗ICOS和抗CD3分子的珠粒可以誘導增殖並活化CD4和CD8細胞。在一些情況下，T細胞的這種活化與結合板的試劑相當。實例 14. ICOS 對 T 細胞擴增的作用
為了開發針對PD-1+ T細胞的可擴展的快速擴增方案（REP），研究了誘導型T細胞共刺激分子（ICOS）對T細胞增殖的多種作用。測試了ICOS激動對線粒體質量和葡萄糖消耗的作用。如實例1和2中所述的從白血球去除術產物富集的T細胞按如實例4所述進行擴增。在第4天，從該24孔板收穫接種的細胞，計數並測試ICOS激動對線粒體質量和葡萄糖消耗的作用。為了測試線粒體質量，將擴增培養基（含500 U/ml IL-2的5% CST-SR XVivo15）中的100,000個細胞接種到96孔U底組織培養板中。將含細胞的板在添加試劑之前在37°C和5% CO2 下孵育大約30分鐘。孵育後，將Mitotracker以50 nM的終濃度添加到細胞培養物中。將細胞在37°C孵育35分鐘。孵育後，將細胞用PBS洗滌兩次，然後快速用PBS中的螢光標記的抗CD3、CD4和CD8抗體染色15分鐘，以進行流動式細胞術分析。立即將在PBS中重懸的細胞在1小時內進行流動式細胞術。 為了測試葡萄糖消耗，將無葡萄糖培養基（Agilent Seahorse XF試驗培養基改良的DMEM，0 mM葡萄糖）中的100,000個細胞接種到96孔U底組織培養板中。將含細胞的板在添加試劑之前在37°C和5% CO2 下孵育30分鐘。孵育後，將2-NBDG以50 ug/ml的終濃度添加到細胞培養物中。將細胞在37°C孵育35分鐘。孵育後，將細胞用PBS洗滌兩次，然後快速用PBS中的螢光標記的抗CD3、CD4和CD8抗體染色15分鐘，以進行流動式細胞術分析。立即將在PBS中重懸的細胞在1小時內進行流動式細胞術。如圖46所示，ICOS激動增加了CD4和CD8 T細胞中的線粒體質量。該線粒體質量增加與更增殖的表型有關。還觀察到ICOS激動減少了葡萄糖的初始消耗，表明ICOS治療引起氧化磷酸化而不是糖酵解；氧化磷酸化與增強的T細胞持久性有關。
還藉由定量逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）評估了ICOS、ICOS+Luperox或TetAb對富集的T細胞快速擴增過程中人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）表現的作用。使用RNeasy Plus Mini和QIAshredder套組（kit）（P/N 74134和79656, Qiagen）在第0天和第10天收集的細胞中提取RNA。合成第一股cDNA，然後使用Tetrad2 Peltier熱循環儀（BioRad）用Superscript III RT（P/N 18080-044，英傑公司）進行逆轉錄酶反應。使用TaqMan®人TERT基因表現測定（Hs00972656_m1，Applied Biosystems）和內源性對照GAPDH（Hs02786624_g1，Applied Biosystems）與TaqMan®快速通用PCR主混合物（P/N 4352042，Life Technologies）在BioRad CFX96即時系統（BioRad）上進行定量RT-PCR。將數據相對於第0天歸一化，然後計算ΔΔCT並歸一化至同種型對照。端粒伸長與細胞的幹細胞樣容量有關，而端粒酶活性與T細胞更新有關。如圖47所示，ICOS激動增加了TERT表現。基於其增加線粒體質量和細胞代謝的能力而將Luperox包括在內，這可能有助於細胞保持其增殖和功能容量。實際上，在單獨的ICOS激動之上，將Luperox添加到ICOS激動中增加了TERT表現。
還研究了ICOS激動對T細胞表型的作用。能夠在T細胞收縮後存活的初始CD8 T細胞表現效應記憶細胞（Tem）表型，而在清除感染後很長時間才發現的記憶CD8 T細胞群主要由中央記憶T細胞（Tcm）組成。轉移的T細胞持久性與治療結果高度相關。在小鼠和人中，與具有TEM 型的T細胞相比，輸注更年輕的T細胞（諸如TSCM 和TCM 表型）顯示優良的持久性和抗腫瘤作用。然而，使用標準REP進行T細胞的體外擴增不可避免地伴隨著向TEM 細胞的分化。因此，目前在過繼T細胞療法試驗中使用的大多數T細胞移植物都包含過度分化的T細胞。在該研究中，如實例4中所述並且還用如Dudley等人, 2003,J. Immunother. [免疫治療雜誌] 26(4): 332-42中所述的標準快速擴增方案擴增由白血球去除術富集的T細胞。 在擴增的第0、7和14天，將細胞用螢光軛合的抗CD3、CD4、CD8、PD-1、CD45RA和CCR7染色以測試T細胞表型。如圖44所示，顯示ICOS激動維持Tcm表型。
還測試了ICOS激動對於對抗原作出反應的T細胞存活的作用。在沒有適當的共刺激的情況下，擴增的T細胞介導了抗原再刺激過程中的細胞死亡。對抗原誘導的細胞死亡的抗性係體內和體外T細胞持久性和抗腫瘤作用的關鍵解釋之一。如實施方式4所述擴增如實例1和2所述從白血球去除術產物富集的PD-1+ T細胞。在擴增的第14天，將PD-1 T細胞與含或不含CMVpp65（495-503）肽的T2細胞系共培養5小時，然後藉由螢光標記的CMVpp65（495-503）肽-HLA-A*0201 dextramer檢測測試存活的CMVpp65（495-503）肽特異性T細胞的頻率。抗原刺激後，用ICOS致敏但未藉由ICOS致敏的T細胞維持了CMVpp65（495-503）肽特異性T細胞的原始頻率，表明ICOS激動促進了抗原特異性T細胞存活（圖49）。
測試了ICOS激動對細胞毒性活性的作用。如實施方式4所述擴增如實例1和2所述從白血球去除術產物富集的具有HLA-A*0201+和CMV+的PD-1+ T細胞。在第13天，藉由xCELLigence即時細胞分析（RTCA）測定測試擴增的T細胞的細胞毒性活性。如圖50所示，ICOS激動促進了PD-1 T細胞的細胞毒性活性。 在T細胞活化/增殖過程中對ICOS激動劑和其他T細胞激動劑的作用進行比較，發現ICOS激動獨特地引發IL-2表現。簡而言之，將板在PBS中用0.25 µg/mL抗CD3（殖株OKT3）或1 µg/mL抗ICOS、抗OX40（MEDI-0562）或IgG1同種型對照抗體塗覆過夜。藉由陰性選擇從外周血中分離出總的人原代T細胞。然後將100,000個純化的T細胞添加到預塗覆的板的每個孔中，並在37°C、5% CO2 下溫和地搖動四到七個小時。使用IL-2分泌測定（美天旎生物技術（Miltenyi Biotec））評估IL-2捕獲。作為IL-2產生的對照，將1 µg/mL葡萄球菌腸毒素B（SEB）添加到單獨的孔中。圖51A顯示用0.25 µg/mL單株抗體抗CD3（aCD3）、抗ICOS、抗OX40（MEDI0562）、抗ICOS+抗CD3、或MEDI0562+抗CD3、IgG1或葡萄球菌腸毒素B（SEB）治療後的CD8+ IL-2誘導。在類似的實驗中，抗CD3+抗ICOS共刺激上清液中幾乎沒有檢測到IL-2，表明IL-2被分泌並幾乎立即被誘導的IL-2受體α表現捕獲（CD25）（圖51B）。實例 15. 來自多種類型癌症患者的腫瘤浸潤淋巴細胞（ TIL ）表現 PD-1 。
藉由流動式細胞術測試了來自多種類型癌症的解離腫瘤組織中CD3+ CD8+ T細胞中的PD-1表現。如圖52A和52B所示，大多數腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）表現高水平的PD-1。據報導，腫瘤反應性T細胞在PD-1表現TIL中高度富集，表明PD-1+ T細胞的來源不僅限於外周血中的PBMC，還可以選自包括TIL的其他組織。實例 16. 抗 CTLA-4 抗體和抗 PD-L1+ 抗 CTLA-4 抗體的組合誘導外周血中表現 PD-1 的 T 細胞
藉由Taqman qRT-PCR測試了抗CTLA-4抗體（曲美木單抗）預治療對外周血PD-1表現的作用。如圖53A所示，曲美木單抗預治療在9-10天後誘導一組患者（正方形）外周血PD-1表現增加 ＞ 1.5倍，這與臨床試驗中的總生存期（OS）改善相關；NTC02527434（圖53B）。基於該等結果，曲美木單抗可用於增強PD-1+ T細胞向外周血的動員，以治療癌症。
還藉由流動式細胞術測試了度伐魯單抗和曲美木單抗預治療對外周血中PD-1表現T細胞數量的作用。如圖54A所示，在第8天時，度伐魯單抗/曲美木單抗預治療增加了患者外周血中PD-1+ T細胞的數量，而與群組增加了＜ 50%相比，群組增加 ＞= 50%則顯示OS改善（圖54B）。
圖55顯示使用度伐魯單抗/曲美木單抗動員的T細胞治療癌症的示例性臨床試驗方案。這項研究的主要目的是評估周圍腫瘤反應性T細胞的動員和捕獲方法。在動員前對患者進行活檢，並收集外周血單核細胞（PBMC）以用於以後分析。然後使用度伐魯單抗/曲美木單抗動員患者，並在動員後對活檢的腫瘤和外周血單核細胞（PBMC）進行收集，然後冷凍。
收穫TIL後，用免疫療法治療患者。對這種治療有反應的患者繼續。免疫療法後具有疾病進展的患者按以下方法用動員前和/或動員後細胞治療。比較從動員前和動員後收集的從PBMC和TIL中富集的PD-1+細胞的NeoAg反應性曲線，以確定治療方案。特別地，如果NeoAg反應性重疊，則首先用PBMC治療患者，保留TIL作為備用。如果反應性沒有重疊，則使用TIL進行治療。
儘管已經根據各種實施方式描述了本揭露內容，但是應理解，熟悉該項技術者會進行變化和修改。因此，意圖係所附申請專利範圍覆蓋落入所要求保護的本揭露內容範圍內的所有此類等效變化。另外，在此使用的章節標題只是出於組織的目的，而不應被解釋為限制所述的主題。
除非明確相反地指出，否則本文所述的每個實施方式可以與任何其他一個或多個其他實施方式組合。特別地，除非明確相反地指出，否則指示為較佳的是或有利的任何特徵或實施方式可以與指示為較佳的或有利的任何其他一個或多個特徵或實施方式組合。
本申請中引用的所有參考文獻均藉由引用明確地併入本文。
無
[圖 1 ]係本揭露內容的示例性PD-1表現T細胞選擇過程和在該選擇過程中使用的變數之示意圖。
[圖 2 ]描繪了連接捕獲部分和抗PD-1抗體之示例性連接子。
[圖 3 ]顯示在低生物素與抗體比率（BAR）水平下之PD-1選擇結果，其中PD-1表現水平在短連接子時最大，而產率在長連接子時最大（圖3A）。圖3B顯示PD-1/CD8的純度和PD-1+CD8的產率，其中純度係所選擇的T細胞群中落入PD-1表現的前10%、20%或30%的細胞的百分比，並且產率係指起始群中落入PD-1表現的前10%、20%或30%的T細胞的百分比。
[圖 4 ]顯示在高BAR水平下的PD-1選擇結果，其中PD-1表現水平在短連接子時最大，而產率在長連接子時最大（圖4A）。圖4B顯示PD-1/CD8的純度和PD-1+ CD8之產率。
[圖 5A ]顯示實驗顯示器的設計，該實驗顯示器顯示細胞濃度、抗PD-1抗體濃度和BAR對PD-1表現水平、產率、PD-1純度和細胞活力之影響。圖 5B 顯示PD-1表現選擇數據的實驗模型擬合設計的代表性結果，該PD-1表現選擇數據包括細胞濃度、PD-1抗體濃度和BAR水平。低BAR導致高PD-1表現水平和低產率，而高BAR導致低PD-1表現水平和高產率。低PD-1抗體濃度導致高PD-1表現水平和低產率，而高PD-1抗體濃度導致低PD-1表現水平和高產率。測試範圍內的細胞濃度不影響選擇結果。
[圖 6 ]顯示改變抗生物素微珠濃度時PD-1之選擇結果。圖 6A 顯示每mL細胞懸液中50 μL、100 μL和200 μL微珠的選擇前和選擇後數量。圖 6B 顯示每mL細胞懸液中50 μL、100 μL和200 μL微珠的PD-1/CD8純度（左）和PD-1+ CD8的產率（右）。
[圖 7 ]顯示流程圖，該流程圖說明了通過磁場的兩個路徑的流速以及顯示的對PD-1表現水平之作用。
[圖 8 ]顯示在實驗中在CD4+和CD8+ T細胞中PD-1的表現，其中總MEDI0680（抗PD-1抗體）濃度保持在5 µg/mL，而磁珠濃度在5、10與100 µL/mL之間變化。
[圖 9 ]係顯示實驗之示意圖，其中隨著磁場強度的增加，調節了通過磁場的珠粒混合物的流速。
[圖 10 ]顯示CD4+ T細胞和CD8+ T細胞在標準流速和緩慢流速與較強磁場強度下的PD-1選擇結果。
[圖 11 ]顯示抗PD-1抗體濃度對所選擇的T細胞的PD-1表現水平和總產率之作用。相對於不同抗PD-1抗體的Kd 值，分離的細胞的總產率和PD-1表現水平的反應曲線沒有改變。唯一的相對變化係作用進入穩定階段的x軸位置。
[圖 12 ]顯示平均BAR為1.9的生物素化MEDI0680（MEDI3097）係異質的，並且含有具有0、1、2、3、4或5個捕獲部分生物素的抗體分子。
[圖 13 ]顯示使用LO115抗PD-1抗體濃度來控制所選擇的細胞之PD-1表現水平。隨著LO115濃度從0.5 μg/mL降低至0.05 μg/mL，所選擇的細胞的PD-1表現水平增加。
[圖 14 ]顯示MEDI3097和未修飾的MEDI0680的組合如何改變所選擇的細胞之PD-1表現。隨著生物素化與未修飾的MEDI0680的比率降低，所選擇的細胞的PD-1表現水平增加。
[圖 15 ]顯示生物素化LO115和未修飾的LO115的組合如何改變所選擇的細胞之PD-1表現。隨著生物素化與未修飾的LO115的比率降低，所選擇的細胞的PD-1表現水平增加。
[圖 16 ]係示例性致敏和擴增方案之時間線。
[圖 17 ]顯示使用不同濃度的α-誘導型共刺激分子（ICOS）致敏該培養板進行PD-1擴增之結果。
[圖 18 ]顯示相比，使用1 μg/mL OKT3和抗ICOS抗體（α-ICOS）致敏板與使用TetAb的PD-1擴增之比較結果，其中手動致敏顯示快速擴增的更大功效。
[圖 19 ]顯示對於不同濃度的α-ICOS和α-ICOS殖株，PD-1表現細胞的細胞增殖，其中α-ICOS和α-ICOS殖株#140顯示相似的增殖功效。
[圖 20A ]顯示對於不同的起始點和持續時間，在苯紮貝特（Bezafibrate）或Luperox治療後第13天，PD-1表現細胞的倍數擴增中測量的結果。圖 20B 顯示測試的起始點和持續時間的七個組合之示意圖。
[圖 21A ]顯示在未治療，苯紮貝特、不同濃度的Luperox、或苯紮貝特和Luperox治療後第13天，在PD-1表現細胞的倍數擴增中測量之結果。圖 21B 顯示測試的化學、濃度和持續時間的七個組合之示意圖。
[圖 22 ]顯示對於6孔最佳重新接種過程，在第13天在PD-1表現細胞的倍數擴增中測量之結果。
[圖 23 ]顯示對於多學科綜合分析，在第13天在PD-1表現細胞的倍數擴增中測量之結果。
[圖 24 ]顯示對於G-Rex 100M全規模擴增，在第13天在PD-1表現細胞的倍數擴增中測量之結果。
[圖 25 ]顯示6孔擴增和全規模擴增的倍數擴增結果之比較。使用這兩種方法，Luperox和α-ICOS殖株#140的組合在第15天顯示最大的倍數擴增。
[圖 26 ]係描述了PD-1表現T細胞的示例性重新接種培養擴增和全規模培養擴增之時間線示意圖。
[圖 27 ]顯示對於0.04、0.2和1.0 μg/mL的α-41BB（α-CD137）塗層之擴增結果。
[圖 28 ]顯示對於0.6、3.0和15 μg/mL的α-PD-1塗層之擴增結果。
[圖 29 ]顯示對於0.2、1.0和5 μg/mL的α-LAG3塗層之擴增結果。
[圖 30A ]顯示對於20、100和500 μg/mL的α-TIM3（62GL）塗層之擴增結果。圖 30B 顯示對於0.2、1.0和5 μg/mL的α-TIM3（F9S）塗層之擴增結果。
[圖 31A ]顯示對於0.2、1.0和5 μg/mL的α-TIGIT（1170）塗層之擴增結果。圖 31B 顯示對於0.2、1.0和5 μg/mL的α-TIGIT（1182）塗層之擴增結果。圖 31C 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-A的5 μg/mL α-TIGIT（1170）塗層之擴增結果。圖 31D 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-B的5 μg/mL α-TIGIT（1170）塗層之擴增結果。圖 31E 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-C的5 μg/mL α-TIGIT（1170）塗層的擴增結果。圖 31F 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-A的5 μg/mL α-TIGIT（1182）塗層之擴增結果。圖 31G 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-B的5 μg/mL α-TIGIT（1182）塗層之擴增結果。圖 31H 顯示對於含0.4、2.0和10 μg/mL的α-CD226-C的5 μg/mL α-TIGIT（1170）塗層之擴增結果。
[圖 32 ]顯示對於含或不含0.6和3 μg/mL的可溶性PD-1或者0.04和0.2 μg/mL的塗覆α-41BB的1 μg/mL α-ICOS塗層之擴增結果。
[圖 33A ]顯示來自黑色素瘤患者PBMC的PD-1高表現T細胞富集之結果。圖 33B 顯示不使用飼養細胞或人血清的PD-1高表現T細胞之擴增。圖 33C 顯示藉由使用ICOS、Luperox和細胞介素在體內維持細胞毒性T細胞持久性之測試結果。
[圖 34 ]係個性化T細胞療法選項之示意圖。
[圖 35 ]顯示對於α-OX40塗覆之擴增結果。
[圖 36A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞之增殖。圖 36B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M450抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞之增殖。
[圖 37A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞之增殖。圖 37B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M450抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞之增殖。
[圖 38A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞上PD-1之表現。圖 38B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M450抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞上PD-1之表現。
[圖 39A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞上PD-1之表現。圖 39B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的抗ICOS或抗CD3塗覆的M450對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞上PD-1之表現。
[圖 40A ]顯示在T細胞擴增期間抗ICOS治療之示意圖。這係在PD-1-CTL REP中以早期時程方式（第0-4天）進行抗ICOS刺激之時間線。圖 40B 顯示在刺激的前4天，ICOS激動足以致敏T細胞擴增。
[圖 41A ]顯示在T細胞擴增期間抗ICOS治療之示意圖。這係在PD-1-CTL REP中以早期時程方式（第4-10天）進行抗ICOS刺激的時間線。圖 41B 顯示用抗ICOS致敏4天導致足夠增殖。
[圖 42 ]顯示對於IL2的要求，並藉由對所有7個樣本（3個LP和4個血液）取平均值，詳細說明了第13天相對倍數擴增的比較。
[圖 43A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞上CD25之表現。圖 43B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M450抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD4細胞上CD25之表現。
[圖 44A ]顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的M280抗ICOS或抗CD3塗覆的對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞上CD25之表現。圖 44B 顯示在將以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8或1:16的抗ICOS或抗CD3塗覆的M450對甲苯磺醯基活化的珠粒孵育4天後CD8細胞上CD25之表現。
[圖 45A ]顯示在如Dudley等人, 2003,J. Immunother. [免疫治療雜誌] 26(4): 332-42中所述的標準快速擴增方案（REP）或實例11中揭露的優化的REP之後，PD-1+ T細胞之倍數擴增。圖 45B 顯示與第0天的比率相比，在標準REP或優化的REP後第14天之T細胞百分比。
[圖 46 ]顯示經過或未經過ICOS治療的CD4和CD8 T細胞中之線粒體質量和葡萄糖消耗。
[圖 47 ]顯示在用CD3/CD28、CD3/CD28+抗ICOS、CD3/CD28 + 抗ICOS+白胺酸或TetAb治療後端粒酶逆轉錄酶（TERT）的表現。
[圖 48 ]顯示各種激動劑治療後之T細胞表型。NIP = 對照抗體，OKT3 = 抗CD3抗體，Lup = Luperox，Tem = 效應記憶細胞表型，Temra = 表現CD45RA的Tem細胞，Tcm = 中樞記憶細胞表型，Tn = 原始T細胞表型。
[圖 49 ]顯示激動劑治療後抗原特異性T細胞存活之百分比。NIP = 對照抗體，OKT3 = 抗CD3抗體，Lup = Luperox。
[圖 50 ]顯示ICOS激動對擴增的PD-1 T細胞的細胞毒性活性的作用。只有描述為「含IL-2的ICOS致敏的PD-1CTL」的那些細胞在高E/T比率30下顯示強大的CMV/EBV/FluA特異性細胞毒性活性。僅由OKT3/sCD28致敏的PD-1 CTL或由不含IL-2的ICOS致敏的PD-1 CTL即使具有與含ICOS/IL-2致敏的PD-1 CTL的PD-CMV/EBV/FluA特異性T細胞相似的頻率也未顯示細胞毒性活性。
[圖 51A 和 51B ]顯示用1 µg/mL單株抗體（抗CD3（aCD3）、抗OX40（MEDI0562）或MEDI0562+抗CD3）、IgG1或葡萄球菌腸毒素B（SEB）治療後之CD8+ IL-2誘導。
[圖 52A 和 52B ]顯示多種類型的癌症中的TIL表現高水平之PD-1。
[圖 53 ]顯示曲美木單抗之作用。在圖 53A 中，正方形和圓形均被曲美木單抗治療。該等圓形顯示一組PD-1表現變化小於1.5倍（＜ 1.5倍）的患者。該等正方形顯示在曲美木單抗治療後PD-1表現增加＞ 1.5倍的患者。與低反應者組（圓形）相比，高反應者組（正方形）顯示更好的總生存期。因此，這指示曲美木單抗治療可以在治療後9-10天誘導PD-1表現。圖53B顯示曲美木單抗誘導的PD-1表現與改善之總生存期（OS）相關。
[圖 54A ]顯示度伐魯單抗（durvalumab）/曲美木單抗（tremelimumab）組合治療誘導血液中之PD-1+T細胞。圖 54B 顯示度伐魯單抗/曲美木單抗組合治療誘導的PD-1表現與改善的OS相關；研究11 SCCHN：Q4W度伐魯單抗20 mg/Kg+曲美木單抗1 mg/kg；PBMC流量數據n = 35。
[圖 55 ]顯示用度伐魯單抗/曲美木單抗動員後使用PD-1+ T細胞的離體捕獲治療黑色素瘤的臨床試驗之示意圖。Treme = 度伐魯單抗，PBMC = 外周血單個核細胞，IO = 免疫治療，TIL = 腫瘤浸潤淋巴細胞。
[圖 56 ]顯示與細胞表面表型有關的T細胞效應子功能，例如諸如PD-1、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、淋巴細胞活化基因3（LAG-3）、TIM-3和CD200R等因子之表現。
[圖 57 A和 57B ]顯示使用NHS-PEG4 -生物素（A）和PEG4連接子分離的T細胞的來自生物素化MEDI0680之結果（B）。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010

Claims (45)

  1. 一種從細胞群中分離表現計劃性細胞死亡1（PD-1）的T細胞之方法，該方法包括：  (a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接； (b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物； (c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；以及 (d) 從該磁場中洗脫該表現PD-1的T細胞，以分離該表現PD-1的T細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，該方法還包括藉由調節以下一項或多項來選擇在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平： (i) 該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度； (ii) 該連接子的長度； (iii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率； (iv) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率； (v) 進行步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的溫度； (vi) 該抗體-細胞混合物和/或該珠粒混合物中； (vii) 該珠粒混合物中磁珠的濃度； (viii) 該珠粒混合物通過該磁場的流速； (ix) 在該抗體-細胞混合物的產生與步驟 (b) 之間的時間長度； (x) 在該珠粒混合物的產生與步驟 (c) 之間的時間長度；或 (xi) 該磁場強度。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該等T細胞係CD8+ T細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該等T細胞係CD4+ T細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該捕獲部分係生物素。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該連接子的長度在約1 Å與約50 Å之間。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該連接子的長度降低了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該連接子的長度增加了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的產率。
  9. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該CAR在1與8之間。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該CAR降低了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平。
  11. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加CAR增加了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的產率。
  12. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該抗體-細胞混合物或珠粒混合物中T細胞之濃度在2000萬細胞/mL與5億細胞/mL之間。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞群獲自健康受試者。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞群獲自患有癌症的受試者。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該珠粒混合物中磁珠的濃度在每1 x 107 細胞約1 µL與每1 x 107 細胞30 µL之間。
  16. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該珠粒混合物中磁珠的濃度降低了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平。
  17. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該珠粒混合物中磁珠的濃度增加了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的產率。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗PD-1抗體係LO115或MEDI0680。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度在0.1 µg/mL與10 µg/mL之間。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度在0.5 µg/mL與5 µg/mL之間。
  21. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中： (a) 該抗PD-1抗體為LO115，並且該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度在0.01 µg/mL與1 µg/mL之間；或 (b) 該抗PD-1抗體為MEDI0680，並且該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度在0.5 µg/mL與5 µg/mL之間。
  22. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度降低了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平。
  23. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中增加該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度增加了在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的產率。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中使該珠粒混合物通過磁場並從該磁場洗脫該等表現PD-1的T細胞的步驟包括： (a) 使該珠粒混合物以高流速和/或低磁場強度通過該磁場； (b) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有高PD-1表現水平的T細胞； (c) 在具有高PD-1表現水平的T細胞洗脫後使剩餘的珠粒混合物的初級陰性級分以中等流速和/或中等磁場強度通過該磁場； (d) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有中等PD-1表現水平的T細胞； (e) 在中等PD具有-1表現水平的T細胞洗脫後使剩餘的珠粒混合物的次級陰性級分以低流速和/或高磁場強度通過該磁場；以及 (f) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離具有低PD-1表現水平的T細胞。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中使該珠粒混合物通過磁場並從該磁場洗脫該等表現PD-1的T細胞的步驟包括： (a) 使該珠粒混合物以低流速和/或高磁場強度通過該磁場，以產生第一捕獲珠粒混合物級分和廢棄的珠粒混合物級分； (b) 從該磁場中洗脫該第一捕獲珠粒混合物級分； (c) 使該第一捕獲珠粒混合物級分以中等流速和/或中等磁場強度通過該磁場，以產生次級捕獲珠粒混合物級分和第一陰性珠粒混合物級分，其中該第一陰性珠粒混合物級分包含具有低PD-1表現水平的T細胞； (d) 使該次級捕獲珠粒混合物級分以高流速和/或低磁場強度通過該磁場，以產生三級捕獲珠粒混合物級分和第二陰性珠粒混合物級分，其中該三級捕獲珠粒混合物級分包含具有高PD-1表現水平的T細胞，並且該第二陰性珠粒混合物級分包含具有中等PD-1表現水平的T細胞。
  26. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中根據式I調節表現PD-1的分離的T細胞的PD-1表現水平：
    Figure 03_image011
    ， 其中：N( 標記 ) 係表現PD-1的T細胞上預期標記分子的數量；N 係表現PD-1的T細胞上PD-1抗原結合位點的數量；[Ab]i 係該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的總濃度；α 係具有可接近的捕獲部分的抗PD-1抗體與總抗PD-1抗體的比率；並且Kd 係該抗PD-1抗體在步驟 (a) 的孵育溫度下的解離常數。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中藉由改變以下一項或多項來調整α： (i) 該連接子的長度； (ii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率； (iii) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率。
  28. 一種體外T細胞擴增之方法，該方法包括： (a) 致敏根據如申請專利範圍第1-27項中任一項所述之方法分離的該表現PD-1的T細胞樣本，其中該致敏步驟包括： (i) 在第-1天用致敏因子塗覆培養板； (ii) 在第0天接種表現PD-1的T細胞群，其中該接種步驟包括： (1) 在該塗覆的培養板上添加基礎培養基；和/或 (2) 向該基礎培養基中添加一定量的分離的和/或富集的T細胞，以在該塗覆的培養板上產生接種混合物； (b) 收穫表現PD-1的致敏的T細胞； (c) 將收穫的表現PD-1的T細胞放置於接種混合物中，並將該接種混合物放置於未處理的培養板中； (d) 在該接種混合物中培養表現PD-1的T細胞； (e) 從培養的接種混合物中收穫表現PD-1的T細胞； (f) 重複步驟 (b)-(e)，直到獲得目標數量的擴增的T細胞。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該等致敏因子包括OKT3、可溶性α-CD28、α-ICOS、α-ICOS（＃140）、α-LAG3、α-CD137、α-OX40或其任何組合。
  30. 如申請專利範圍第28項所述之方法，該方法還包括向該基礎培養基中加入添加劑，其中該等添加劑包括IL-2、α-TIGIT、Iso、α-CD226、α-CD28、α-TIM3、α-LAG3、α-PD-1、α-OX40、Luperox、苯紮貝特或其任何組合。
  31. 根據如申請專利範圍第1-27項中任一項所述之方法分離的該表現PD-1的T細胞在製備用於治療受試者的藥物中之用途。
  32. 一種體外T細胞擴增之方法，該方法包括： (a) 使T細胞群和與抗CD3抗體、抗ICOS抗體或其組合軛合的珠粒接觸; (b) 孵育該珠粒和T細胞混合物以擴增該T細胞群。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之方法，其中該T細胞群包含活化的CD4和CD8細胞。
  34. 表現PD-1的T細胞在製備用於治療受試者的藥物中之用途； 其中該等表現PD-1的T細胞是藉由以下方法分離的： (a) 使該細胞群與一定量的抗PD-1抗體接觸以產生抗體-細胞混合物，其中該抗PD-1抗體包含捕獲部分，並且其中該捕獲部分藉由連接子與該抗PD-1抗體連接； (b) 使該抗體-細胞混合物與一定量的磁珠接觸，其中該等磁珠能夠特異性結合該抗PD-1抗體上的捕獲部分以產生珠粒混合物； (c) 使該珠粒混合物通過磁場以從該珠粒混合物中分離出該等磁珠和與其結合的表現PD-1的T細胞；和 (d) 從該磁場中洗脫表現PD-1的T細胞，以分離表現PD-1的T細胞； 其中藉由調節以下一項或多項來選擇在步驟 (d) 中分離的該表現PD-1的T細胞的PD-1表現水平： (i) 該抗體-細胞混合物中該抗PD-1抗體的濃度； (ii) 該連接子的長度； (iii) 捕獲部分與抗PD-1抗體（CAR）的化學計量比率； (iv) 包含捕獲部分的抗PD-1抗體與未修飾的抗PD-1抗體的比率； (v) 進行步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的溫度； (vi) 該細胞群中T細胞的濃度； (vii) 該珠粒混合物中磁珠的濃度； (viii) 該珠粒混合物通過該磁場的流速； (ix) 在該抗體-細胞混合物的產生與步驟 (b) 之間的時間長度； (x) 在該珠粒混合物的產生與步驟 (c) 之間的時間長度；或 (xi) 通過該磁場施加的力；和 其中表現PD-1的T細胞群藉由以下方式進行體外擴增： (a) 致敏根據如申請專利範圍第1-27項中任一項所述之方法分離的該表現PD-1的T細胞樣本，其中該致敏步驟包括： (i) 在第-1天用致敏因子塗覆培養板； (ii) 在第0天接種表現PD-1的T細胞群，其中該接種步驟包括： (1) 在該塗覆的培養板上添加基礎培養基；和/或 (2) 向該基礎培養基中添加一定量的分離的和/或富集的T細胞，以在該塗覆的培養板上產生接種混合物； (b) 收穫表現PD-1的致敏的T細胞； (c) 將收穫的表現PD-1的T細胞放置於接種混合物中，並將該接種混合物放置於未處理的培養板中； (d) 在該接種混合物中培養表現PD-1的T細胞； (e) 從培養的接種混合物中收穫表現PD-1的T細胞； (f) 重複步驟 (b)-(e)，直到獲得目標數量的擴增的T細胞。
  35. 如申請專利範圍第28-30項中任一項所述之方法，其中該等致敏因子包括ICOS激動劑。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之方法，其中該ICOS激動劑是抗ICOS抗體。
  37. 如申請專利範圍第35項所述之方法，其中T細胞被致敏4天。
  38. 如申請專利範圍第31項或申請專利範圍第34項所述之用途，其中該致敏因子包括ICOS激動劑。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之用途，其中該ICOS激動劑是抗ICOS抗體。
  40. 如申請專利範圍第38項所述之用途，其中T細胞被致敏4天。
  41. 如申請專利範圍第28-30項中任一項所述之方法，其中致敏後T細胞的培養在IL-2的存在下進行。
  42. 如申請專利範圍第31項或申請專利範圍第34項所述之用途，其中致敏後T細胞的培養在IL-2的存在下進行。
  43. PD-1+ 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）在製備療用於治療受試者的癌症的藥物中之用途，其中該PD-1+ TIL藉由以下方法獲得，該方法包括： (a) 以有效於將PD-1+ 腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）動員到外周血中的量向該受試者投與抗CTLA-4抗體； (b) 從該受試者的外周血中收穫PD-1+ TIL；以及 (c) 擴增所收穫的PD-1+ TIL。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之用途，其中根據如申請專利範圍第28-30、33和35-38項中任一項所述之方法擴增所收穫的PD-1+ TIL。
  45. 如申請專利範圍第43所述之用途，其中該抗CTLA-4抗體是曲美木單抗。
TW108147064A 2018-12-20 2019-12-20 用於選擇和擴增表現pd-1的t細胞之方法 TW202039817A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862782537P 2018-12-20 2018-12-20
US62/782,537 2018-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202039817A true TW202039817A (zh) 2020-11-01

Family

ID=71098346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108147064A TW202039817A (zh) 2018-12-20 2019-12-20 用於選擇和擴增表現pd-1的t細胞之方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20200199567A1 (zh)
TW (1) TW202039817A (zh)
WO (1) WO2020128908A2 (zh)

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69941689D1 (de) * 1998-02-12 2010-01-07 Univ Texas Verfahren und reagenzien zur raschen und effizienten isolierung zirkulierender krebszellen
GB0029154D0 (en) * 2000-11-30 2001-01-17 Lee Helen Signal enhancement with multiple labelled-antibodies
US20130122492A1 (en) * 2011-11-14 2013-05-16 Kellbenx Inc. Detection, isolation and analysis of rare cells in biological fluids
WO2013088114A1 (en) * 2011-12-12 2013-06-20 Cell Medica Limited Process of expanding t cells
US9944898B2 (en) * 2013-03-11 2018-04-17 Case Western Reserve University Method of generating tumor-specific T cells
WO2015162211A1 (en) * 2014-04-24 2015-10-29 Miltenyi Biotec Gmbh Method for automated generation of genetically modified t cells
US10544392B2 (en) * 2015-05-01 2020-01-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating T cells and T cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation from peripheral blood
CN107923911A (zh) * 2015-08-20 2018-04-17 豪夫迈·罗氏有限公司 使用聚乙二醇化分析物特异性结合剂的基于颗粒的免疫测定法
US10766958B2 (en) * 2016-09-19 2020-09-08 Celgene Corporation Methods of treating vitiligo using PD-1 binding antibodies
JP7110206B6 (ja) * 2017-01-09 2022-08-25 テサロ， インコーポレイテッド 抗ｐｄ－１抗体を用いてがんを処置する方法
AR112072A1 (es) * 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020128908A3 (en) 2020-07-30
WO2020128908A2 (en) 2020-06-25
US20200199567A1 (en) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7047172B2 (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US11905529B2 (en) Method of enhancing persistence of adoptively infused T cells
US20230280341A1 (en) Cd127 expression inversely correlates with foxp3 and suppressive function of cd4+ tregs
JP6665141B2 (ja) ＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ１８Ｒａｈｉであり、迅速な薬剤流出能力を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の同定
Nakazawa et al. The expression and function of costimulatory molecules B7H and B7-H1 on colonic epithelial cells
JP2019531056A (ja) 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
CA2413866C (en) Compositions and methods of monoclonal and polyclonal antibodies specific for t cell subpopulations
JP2004267220A (ja) Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激する方法
JP2021534802A (ja) 複数のｈｌａ−ｇアイソフォームに対するキメラ抗原レセプター
CN113631172A (zh) 用于靶向突变型ras的组合物和方法
US20220064255A1 (en) Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CA3160997A1 (en) Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
Holte et al. Intracellular events associated with inhibition of B cell activation by monoclonal antibodies to HLA class II antigens
TW202039817A (zh) 用於選擇和擴增表現pd-1的t細胞之方法
Williams et al. Choice of resident costimulatory molecule can influence cell fate in human naïve CD4+ T cell differentiation
US11612644B2 (en) Cell population for use in treating cancer
US20240117309A1 (en) Methods for expanding t cell populations
BANK et al. Workshop G Lymphocyte Subsets and Immune Regulation