TW202039429A - 聚合物塗層中的雜環疊氮化物單元 - Google Patents

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Abstract

本文描述含雜環疊氮化物的單體單元、包含此種含雜環疊氮化物的單體單元的共聚物、結合基板的共聚物及結合寡核苷酸的共聚物、製備此種共聚物的方法及使其與基板及/或寡核苷酸反應的方法以及使用此種共聚物將寡核苷酸固定至基板的方法，例如用於DNA定序或其他診斷應用。

Description

聚合物塗層中的雜環疊氮化物單元
本發明關於含雜環疊氮化物的單體單元、包含此種含雜環疊氮化物的單體單元的共聚物、結合基板的共聚物及結合寡核苷酸的共聚物、製備此種共聚物的方法及使其與基板及/或寡核苷酸反應的方法以及使用此種共聚物將寡核苷酸固定至基板的方法。
塗覆聚合物的基板用於許多技術應用。例如，植入式醫療裝置可經生物惰性聚合物塗覆。另一實例中，塗覆聚合物的基板用於製備及/或分析生物分子。分子分析，諸如某些核酸定序方法，依賴核酸股與塗覆聚合物的基板表面的連接。然後，連接核酸股的序列可藉由所屬技術領域中習知的許多不同方法加以確定。
某些定序方法諸如合成定序(SBS)中，基板(諸如流體槽)表面經塗覆聚合物，然後將引子(單股DNA或ssDNA)接枝至聚合物。陣列方法中，珠粒經聚合物塗覆，聚合物同樣地經官能化以捕獲目標寡核苷酸。
聚合物表面(及其製備)通常與範圍廣泛的定序及檢測方法相容，包含不同化學條件、溫度、光學檢測方法、捕獲部分密度及其他參數，且通常在各種儲存及運輸條件下為穩定的。用於此等分子生物學方案的某些聚合物材料使用側疊氮基，其在銅介導的環加成反應中與待接枝的基板及/或寡核苷酸表面上的烯基或炔基反應。然而，殘留銅可能在與生物相關的環境具有細胞毒性作用。關於DNA定序應用，在某些情況下銅會破壞DNA，從而降低定序產量及數據質量。此外，銅催化的反應通常是銅密集，因此是昂貴的，並且可能無法有效或快速地進行以確保足夠的聚合物連接及定位在基板表面上。因此，需要具有改善性質(諸如提高反應效率且減少殘留銅)的表面聚合物塗層。
本文提供的實例關於聚合物，其包含雜環疊氮化物單元及視需要接枝至該雜環疊氮化物單元的寡核苷酸、具有連接至其的該聚合物的基板、以及該聚合物及基板在諸如分子生物學方法(諸如DNA定序)及其他診斷應用的應用。本文也揭示製備該雜環疊氮化物聚合物及該基板的方法、以及使用該組成物的方法。
本文一些實例提供使用雜環疊氮基的單體及共聚物，其在具有減少銅承載的環加成反應中有效地反應，因此殘留銅較低。
一個態樣中，本文提供式(I)化合物
Figure 02_image001
(I) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，該直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；且Z為含氮雜環。
一些實例中，E可為視需要經取代的C1-4 伸烷基。
一些實例中，式(I)化合物可為式(Ia)化合物
Figure 02_image006
(Ia)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，含氮雜環可包含6員環。例示性地，A及E(例如該伸烷基疊氮基)鍵結於6員環的位置2及5。其他實例中，含氮雜環包含5員環。
另外的或可替代的，含氮雜環視需要為芳香族，或視需要飽和。
另外的或可替代的，化合物為視需要式(Ib)
Figure 02_image008
(Ib) 其中X為CH或N。
可替代的，化合物為視需要式(Ic)
Figure 02_image010
Figure 02_image012
Figure 02_image012
(Ic)。
可替代的，化合物視需要為式(Id)
Figure 02_image014
(Id)。
可替代的，化合物視需要為式(Ie)
Figure 02_image016
(Ie)。
另一個實例中，化合物為式(If)
Figure 02_image018
(If)。
另一個實例中，化合物為式(Ig)
Figure 02_image020
(Ig)。
另一個實例中，化合物為式(Ih)
Figure 02_image022
(Ih)。
另一個實例中，化合物為式(Ij)
Figure 02_image024
(Ij)。
一些實例中，化合物為式(Ik)
Figure 02_image026
(Ik) 其中X為CH或N。
例示性地，式(Ik)化合物為式(Im)化合物：
Figure 02_image028
(Im) 其中n為2至20的整數。
另一態樣中，本文提供包含式(II)重複單體單元的聚物
Figure 02_image030
(II) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，該直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；且Z為含氮雜環；以及至少一個其他的重複單體單元。
一些實例中，式(II)重複單體單元為式(IIa)重複單體單元：
Figure 02_image033
(IIa)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，式(IIa)重複單體單元為式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元：
Figure 02_image035
Figure 02_image037
(IIb)                      (IIc)
Figure 02_image039
Figure 02_image041
(IId)                      (IIe) 其中式(IIc)中的n為2至20的整數。一些實例中，至少一個其他重複單體單元為式(III)化合物：
Figure 02_image043
(III) 其中R4 為H或C1-4 烷基；R5 為H或C1-4 烷基；且R6 為H或C1-4 烷基。
例示性地，共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元。
另一個態樣中，本文提供基板-共聚物產物，由以上所述共聚物與基板反應而形成。一些實例中，基板共聚物產物為共聚物的疊氮基與基板表面上含烯基或炔基的基團反應而形成。
另一個態樣中，本文提供包含共聚物共價結合基板的結構，其中結合基板的共聚物包含共價結合基板的重複單體單元，其中重複共價鍵結的單體單元為式(IV)化合物：
Figure 02_image045
(IV) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；Z為含氮雜環；
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且三唑或三唑啉直接或經由連接子間接，經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子共價結合基板。
一些實例中，重複共價結合的單體單元為式(IVa)化合物：
Figure 02_image049
(IVa)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，重複共價結合的單體單元為式(V)化合物：
Figure 02_image051
(V) 其中G為三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。一些實例中，重複共價結合的單體單元為式(Va)化合物：
Figure 02_image053
(Va)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，重複共價鍵結的單體單元為式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)化合物：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image059
Figure 02_image061
(IVd)                        (IVe) 其中X為CH或N；且式(IVc)中的n為2至20的整數。
可替代的或另外的，重複共價結合的單體單元視需要為式(Vb)、式(Vc)、式(Vd)或式(Ve)化合物：
Figure 02_image063
(Vb)
Figure 02_image065
(Vc)
Figure 02_image067
(Vd)
Figure 02_image069
(Ve) 其中G為三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
另一個態樣中，本文提供共聚物-寡核苷酸產物，由以上所述共聚物與一或多種寡核苷酸之間的反應形成。
一些實例中，共聚物寡核苷酸產物為由共聚物的疊氮基與烯烴-或炔烴-官能化寡核苷酸的反應形成。
另一個態樣中，本文提供結合寡核苷酸的共聚物，其包含式(IV)重複單體單元：
Figure 02_image045
(IV) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；Z為含氮雜環；
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且共聚物經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合至寡核苷酸。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元為式(IVa)：
Figure 02_image049
(IVa)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元為式(VI)：
Figure 02_image073
(VI)。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元為式(VIa)：
Figure 02_image075
(VIa)，其中p為1、2、3或4。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元為式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image077
Figure 02_image078
(IVd)                        (IVe) 其中X為CH或N；且式(IVc)中的n為2至20的整數。
另外的或可替代的，結合寡核苷酸的重複單體單元為視需要式(VIb)、式(VIc)、式(VId)或式(VIe)：
Figure 02_image079
(VIb)
Figure 02_image081
(VIc)
Figure 02_image083
(VId)
Figure 02_image085
(VIe) 其中X為CH或N；且式(IVc)中的n為2至20的整數。
另一個態樣中，本文提供共聚物-基板-寡核苷酸產物，由根據任何以上所述共聚物與基板及一或多種寡核苷酸的反應形成。
另一個態樣中，本文提供將根據任何以上所述共聚物固定至基板的方法，包含使共聚物的疊氮基與複數個含烯基或炔基的官能基在基板表面反應，使共聚物與基板表面之間形成共價鍵。
另一個態樣中，本文提供將複數個寡核苷酸接枝至根據任何以上所述共聚物的方法，包含使共聚物的疊氮基與複數個寡核苷酸反應。一些實例中，複數個寡核苷酸包含烯基或炔基，且共聚物的疊氮基與寡核苷酸的烯基或炔基產生反應。
另一個態樣中，本文提供製備式(I)化合物的方法：
Figure 02_image001
(I) 包含使式(X)化合物與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image087
Figure 02_image089
(X)                    (XI) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子，以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；Z為含氮雜環；且Hal為Cl或F以形成式(I)化合物。
另一個態樣中，本文提供製備式(Ik)化合物的方法：
Figure 02_image091
(Ik) 包含使式(Xa)化合物：
Figure 02_image093
(Xa) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image089
(XI) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由組碳、氧及氮組成之群的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；p為1、2、3或4；X為CH或N；且Hal為Cl或F，以形成式(Ik)化合物。
一些實例中，方法進一步包含使式(XII)化合物：
Figure 02_image095
(XII) 與式(XIII)化合物反應：
Figure 02_image097
(XIII) 其中Pg為H或胺基保護基；且Y為-OH或-Cl；以形成式(Xa)化合物。
另一個態樣中，本文提供製備式(Ik)化合物的方法，其包含使式(XIV)化合物：
Figure 02_image099
(XIV) 其中Y為-OH或-Cl；與式(XV)化合物反應：
Figure 02_image101
(XV) 以形成式(Ik)化合物
Figure 02_image103
(Ik) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；L為包含直鏈的連接子，直鏈包含6至8個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基；p為1、2、3或4；且X為CH或N。
一些實例中，方法進一步包含使式(XII)化合物與環酐反應，以形成式(XIV)化合物。
本發明提供的一些實例關於式(Ik)化合物：
Figure 02_image026
(Ik) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；R3 為H或C1-4 烷基；X為CH或N；p為1、2、3或4；且L為具有直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及氮原子上的取代基組成。
一些態樣中，式(Ik)化合物為式(Im)化合物：
Figure 02_image028
(Im) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；R3 為H或C1-4 烷基；X為CH或N；p為1、2、3或4；且n為2至20的整數。
本發明提供一些實例為關於包含式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元的共聚物：
Figure 02_image035
Figure 02_image037
(IIb)                      (IIc)
Figure 02_image105
Figure 02_image106
(IId)                      (IIe) 其中R1 為H或C1-4 烷基；R2 為H或C1-4 烷基；R3 為H或C1-4 烷基；X為CH或N；p為1、2、3或4；且式(IIb)中的L為具有直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及氮原子上的取代基組成；且式(IIc)中的n為2至20的整數；以及至少一個其他重複單體單元。
共聚物可為直鏈、分支鏈或交聯。重複單元可以任何排列存在於共聚物中，諸如嵌段、交替或隨機。共聚物可進一步包含一或多種另外的重複單體單元。
一些態樣中，共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元及式(III)重複單體單元：
Figure 02_image043
(III) 其中R4 為H或C1-4 烷基；R5 為H或C1-4 烷基；且R6 為H或C1-4 烷基。
一些態樣中，共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元。
本發明提供的一些實例為關於基板，其具有共價結合基板的本文所述共聚物。一些實例中，共價連接為式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)單體單元的疊氮基與基板表面上含烯基或炔基的基團反應所造成。因為並非所有共聚物中的疊氮基都必定會發生反應，此種實例為包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的結合基板的共聚物。一些實例中，結合基板的共聚物進一步包含共價結合基板的重複單體單元。重複共價鍵結的單體單元由式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)代表：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image107
Figure 02_image108
(IVd)                        (IVe) 其中R1 、R2 、R3 、L、p、及n如本文定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵，且三唑或三唑啉經由一個(例如，其中結合基板的烯基或炔基為非環狀)或二個(例如，其中結合基板的烯基或炔基為環的一部分)三唑/三唑啉環碳原子(直接或經由連接子而間接)共價結合基板。
因此，一些實例中，結合基板的單體單元由式(Vb)、(Vc)、(Vd)或(Ve)代表：
Figure 02_image109
(Vb)
Figure 02_image111
(Vc)
Figure 02_image113
(Vd)
Figure 02_image115
(Ve) 其中G為三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
本文所述的共聚物也可共價結合至寡核苷酸。一些實例中，經由式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的疊氮基與烯-或炔-官能化寡核苷酸的反應，將寡核苷酸共價結合至共聚物。因為並非所有共聚物中的疊氮基都必定會發生反應，本發明提供的一些實例關於結合寡核苷酸的共聚物，其包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元。一些實例中，結合寡核苷酸的共聚物進一步包含共價結合至寡核苷酸的重複單體單元。一些實例中，結合寡核苷酸的共聚物包含式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)重複單體單元，其中R1 、R2 、R3 、L、p及n如本文定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵，且共聚物經由一個或二個三唑/三唑啉環碳原子(直接或經由連接子而間接)共價結合至寡核苷酸。此種結構的實例為結合寡核苷酸的式(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)重複單體單元：
Figure 02_image117
(VIb)
Figure 02_image119
(VIc)
Figure 02_image121
(VId)
Figure 02_image123
(VIe) 其中該等變項皆如本文定義。
本發明提供的一些實例進一步關於共聚物，其共價結合基板及寡核苷酸二者。因此，一些實例中為包含一或多種式(V)、(Va)、(Vb)、式(VIc)、(VId)及(VIe)重複單體單元的共聚物。
本發明提供的一些實例關於製備式(Ik)化合物的方法、製備包含式(IIb)重複單體單元的共聚物的方法以及製備包含式(IIb)重複單體單元及式(III)重複單體單元的共聚物的方法。
本發明提供的一些實例關於將本文所述的共聚物固定至基板的方法，其包含使包含式(IIb)重複單體單元的共聚物的疊氮基與在基板表面上複數個含烯基或炔基的官能基反應，在共聚物與表面之間形成共價鍵。
本發明提供的一些實例關於將複數個寡核苷酸接枝至本文所述共聚物的方法，包含使共聚物的疊氮基與寡核苷酸反應。一些實例中，寡核苷酸包含烯基或炔基。一些實例中，寡核苷酸包含炔基。一些實例中，在將共聚物固定至基板表面上之前，使寡核苷酸與共聚物反應。一些實例中，在將共聚物固定至基板表面上之後，使寡核苷酸與共聚物反應。
要理解，本文所述的揭示內容的每一態樣的任何各自特徵/實例可以任何適當組合一起實施，且此等態樣的任何一或多種任何特徵/實例可與本文所述其他態樣的任何特徵以任何適當組合一起實施。
除非另外定義，本文使用的所用技術及科學用語與發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解者具有相同意義。用語「包括(包括)」以及其他形式，諸如「包括(including)」、「包括(include)」及「包括(includes)」的使用不受限。用語「具有」以及其他形式，諸如「具有(have)」、「具有(has)」及「具有(had)」的使用不受限。使用於說明書時，不管是在請求項的連接詞或本文中，用語「包含(comprise(s))」及「包含(comprising)」被解讀為具有開放式意義。換言之，以上用語將被解讀為與片語「具有至少」或「包括至少」同義。例如，當用於方法內容時，用語「包含」意指該方法包含至少所述步驟，但是可以包括另外的步驟。當用於化合物、組成物或裝置內容時，用語「包含」意指化合物、組成物或裝置包含至少所述特徵或組分，但是可以包括另外的特徵或組分。
說明書全文所使用的用語「實質上（substantially）」、「大約(approximately)」及「約（about）」用以描述且考量諸如歸因於處理之變化的小波動。舉例而言，其可指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%、諸如小於或等於±1%、諸如小於或等於±0.5%、諸如小於或等於±0.2%、諸如小於或等於±0.1%、諸如小於或等於±0.05%。
如本文所用者，用語「陣列」指的是連接至一或多個基板的不同探針分子群體，使得不同探針分子可根據相對位置彼此區分。陣列可包括不同探針分子，每一個探針分子位於基板上不同的可尋址位置。可替代的或另外的，陣列可包括每一個帶有不同探針分子的分開的基板，其中可根據基板在其上連接的表面上基板位置識別不同探針分子或根據液體中基板的位置識別不同探針分子。
如本文所用者，用語「共價連接」或「共價結合」指的是形成化學鍵，換言之，特徵為共有一對原子間的電子。例如，共價連接聚合物塗層指的是與官能化基板表面形成化學鍵的聚合物塗層，相較於經由其他方式連接至表面，其他方式例如為黏著或靜電交互作用。應理解，以共價連接至表面的聚合物也可以經由共價連接以外的方式結合。
如本文所用者，「Ca 至Cb 」或「Ca-b 」，其中「a」及「b」為整數指的是特定基團中碳原子數目。換言之，基團可包含「a」至「b」(含)個碳原子。因此，例如，「C1 至C4 烷基」或「C1-4 烷基」或「C1-4 烷基」指的是具有1至4個碳的所有烷基，換言之，CH3 -、CH3 CH2 -、CH3 CH2 CH2 -、(CH3 )2 CH-、CH3 CH2 CH2 CH2 -、CH3 CH2 CH(CH3 )-及(CH3 )3 C-。
用語「鹵素」或「鹵素(halo)」，如本文所用者，意指氟、氯、溴或碘，以氟及氯為實例。
如本文所用者，「烷基」指的是完全飽和(即不含雙鍵或叁鍵)的直鏈或分支鏈。烷基可具有1至20個碳原子(每當它出現在本文，諸如「1至20」的數目範圍指的是給予範圍的每一個整數；例如 ，「1至20個碳原子」意指烷基可由1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等，多達至且包含20個碳原子組成，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「烷基」的出現)。烷基也可為具有1至9個碳原子的中等大小烷基。烷基也可為具有1至4個碳原子的低碳烷基。烷基可命名為「C1-4 烷基」或類似命名。僅作為實例，「C1-4 烷基」或「C1-4 烷基」表示烷基鏈中有1至4個碳原子，即，烷基鏈為選自由甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基組成之群組。一般烷基包含但絕不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基、己基及類似者。
如本文所用者，「烯基」指的是包含一或多個雙鍵的直鏈或分支鏈烴鏈。烯基可具有2至20個碳原子，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「烯基」的出現。烯基也可為具有2至9個碳原子的中等大小烯基。烯基也可為具有2至4個碳原子的低碳烯基。烯基可命名為「C2-4 烯基」或類似命名。僅作為實例，「C2-4 烯基」表示烯基鏈中有2至4個碳原子，即烯基鏈為選自由以下組成之群組：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基、及丁-1,2-二烯-4-基。一般烯基包含但絕不限於乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基及己烯基及類似者。
含烯基的基團包含視需要經取代的烯基、環烯基及雜環烯基。
如本文所用者，「炔基」指的是包含一或多個
Figure 108145739-A0304-12-01
鍵的直鏈或分支鏈烴鏈。炔基可具有2至20個碳原子，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「炔基」的出現。炔基也可為具有2至9個碳原子的中等大小炔基。炔基也可為具有2至4個碳原子的低碳炔基。炔基可命名為「C2-4 炔基」或類似命名。炔基可命名為「C2-4 炔基」或類似命名。僅作為實例，「C2-4 炔基」或「C2-4 炔基」表示炔基鏈中有2至4個碳原子，即炔基鏈為選自由以下組成之群組：乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基及2-丁炔基。一般炔基包含但絕不限於乙炔基、乙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基及類似者。
包含炔基的基團包含視需要經取代的炔基、環炔基及雜環炔基。
如本文所用者，「芳基」指的是環主鏈只包含碳的芳香族環或環系統(即共有二個相鄰碳原子的二或多個稠環)。當芳基為環系統，系統中每一個環為芳香族。芳基可具有6至18個碳原子，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「芳基」的出現。一些實例中，芳基具有6至10個碳原子。芳基可命名為「C6-10 芳基」、「C6 至C10 芳基」或類似命名。芳基實例包含但不限於苯基、萘基、薁基及蒽基。
如本文所用者，「雜環」指的是包含碳原子以及另一種原子(雜原子)例如氮、氧或硫的環狀化合物。雜環可為芳香族(雜芳基)或脂族。脂族雜環可為完全飽和或可包含一或多個或二或多個雙鍵，例如雜環可為雜環烷基。雜環可包含單一雜環狀環或經稠合的多雜環狀環。
如本文所用者，「雜芳基」指的是環主鏈包含一或多個雜原子的芳香族環或環系統(即共有二個相鄰原子的二或多個稠環)，換言之，碳以外的元素，包含但不限於氮、氧及硫。當雜芳基為環系統，系統中每一個環為芳香族。雜芳基可具有5-18個環員(即構成環主鏈的原子數目，包含碳原子及雜原子)，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「雜芳基」的出現。一些實例中，雜芳基具有5至10個環員或5至7個環員。雜芳基可命名為「5-7員雜芳基」、「5-10員雜芳基」或類似命名。雜芳基環實例包含但不限於呋喃基、噻吩基、呔
Figure 108145739-A0304-12-02
基、吡咯基、
Figure 108145739-A0304-12-03
唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異
Figure 108145739-A0304-12-03
唑基、異噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、嗒
Figure 108145739-A0304-12-02
基、嘧啶基、吡
Figure 108145739-A0304-12-02
基、三
Figure 108145739-A0304-12-02
基、喹啉基、異喹啉基、苯並咪唑基、苯並
Figure 108145739-A0304-12-03
唑基、苯並噻唑基、吲哚基、異吲哚基及苯並噻吩基。
如本文所用者，「環烷基」意指完全飽和碳環基環或環系統。實例包含環丙基、環丁基、環戊基及環己基。
如本文所用者，「環烯基」或「環烯」意指碳環基環或環系統具有至少一個雙鍵，其中環系統中沒有環為芳香族。實例為環己烯基或環己烯。另一個實例為降冰片烯或降冰片烯基。
如本文所用者，「雜環烯基」或「雜環烯」意指環主鏈中具有至少一個雜原子的具有至少一個雙鍵的碳環基環或環系統，其中環系統中沒有環為芳香族。一些實例中，雜環烯基或雜環烯環或環系統為3員、4員、5員、6員、7員、8員、9員、或10員。
如本文所用者，「環炔基」或「環炔」意指具有至少一個參鍵的碳環基環或環系統，其中環系統中沒有環為芳香族。實例為環辛炔。另一個實例為二環壬炔。
如本文所用者，「雜環炔基」或「雜環炔」意指環主鏈具有至少一個雜原子且具有至少一個參鍵的碳環基環或環系統，其中環系統中沒有環為芳香族。一些實例中，雜環炔基或雜環炔環或環系統為3員、4員、5員、6員、7員、8員、9員、或10員。
如本文所用者，「雜環烷基」意指在環主鏈中包含至少一個雜原子的非芳香族環狀環或環系統。雜環烷基可以稠合、橋連或螺連接方式接合在一起。雜環烷基可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中至少一個雜環狀環不為芳香族。雜環烷基可具有3至20個環員(即構成環主鏈的原子數目，包含碳原子及雜原子)，雖然本定義也涵蓋未指定數目範圍的用語「雜環烷基」的出現。雜環烷基也可為具有3至10環員的中等大小雜環烷基。雜環烷基也可為具有3至6環員雜環烷基。雜環烷基可命名為「3-6員雜環烷基」或類似命名。在一些6員單環狀雜環烷基中，雜原子為選自1至多達3個O、N或S，且在一些5員單環狀雜環烷基中，雜原子為選自一或二個選自O、N或S的雜原子。雜環烷基環的實例包含但不限於氮呯基(azepinyl)、吖啶基(acridinyl)、咔唑基、
Figure 108145739-A0304-12-04
啉基、二氧雜環戊烷(dioxolanyl)、咪唑啉基、四氫咪唑基、
Figure 108145739-A0304-12-05
啉基、環氧乙烷基(oxiranyl)、氧雜環庚烷基(oxepanyl)、硫雜環庚烷基(thiepanyl)、哌啶基、哌
Figure 108145739-A0304-12-02
基、二側氧哌
Figure 108145739-A0304-12-02
基、吡咯啶基、吡咯啶酮基(pyrrolidonyl)、吡咯啶酮基(pyrrolidionyl)、4-哌啶酮基(4-piperidonyl)、吡唑啉基、吡唑啶基、1,3-二氧雜環己烯基(1,3-dioxinyl)、1,3-二
Figure 108145739-A0304-12-03
烷基(1,3-dioxanyl)、1,4-二氧雜環己烯基(1,4-dioxinyl)、1,4-二
Figure 108145739-A0304-12-03
烷基(1,4-dioxanyl)、1,3-氧硫雜環己烷基(1,3-oxathianyl)、1,4-
Figure 108145739-A0304-12-03
噻基、1,3-氧硫雜環己烷基(1,4-oxathianyl)、2H -1,2-
Figure 108145739-A0304-12-03
Figure 108145739-A0304-12-02
基、三
Figure 108145739-A0304-12-03
烷基、六氫-1,3,5-三
Figure 108145739-A0304-12-02
基、1,3-二氧雜環戊烯基(1,3-dioxolyl)、1,3-二氧戊環基(1,3-dioxolanyl)、1,3-二硫雜環戊烯基(1,3-dithiolyl)、1,3-二硫雜戊環基(1,3-dithiolanyl)、異
Figure 108145739-A0304-12-03
唑啉基、異
Figure 108145739-A0304-12-03
唑啶基、
Figure 108145739-A0304-12-03
唑啉基、
Figure 108145739-A0304-12-03
唑啶基、
Figure 108145739-A0304-12-03
唑啶酮基(oxazolidinonyl)、噻唑啉基、噻唑啶基、1,3-氧硫雜環戊烷基(1,3-oxathiolanyl)、吲哚啉基、異吲哚啉基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫苯硫基、四氫硫哌喃基、四氫-1,4-噻
Figure 108145739-A0304-12-02
基、噻
Figure 108145739-A0304-12-05
啉基(thiamorpholinyl)、二氫苯并呋喃基、苯并咪唑啶基及四氫喹啉。
如本文使用的用語「疊氮基」指的是–N3 基。
如本文所用者，經取代的基團為衍生自未經取代的母基團，其中一或多個氫原子與另一原子或基團交換。除非另外指明，當基團被視為「經取代的」，意指該基團經一或多種獨立選自以下取代基取代：C1 -C6 烷基、C1 -C6 烯基、C1 -C6 炔基、C1 -C6 雜烷基、C3 -C7 碳環基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、C3 -C7 -碳環基-C1 -C6 -烷基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、5-10員雜環基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、5-10員雜環基-C1 -C6 -烷基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、芳基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、芳基(C1 -C6 )烷基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、5-10員雜芳基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、5-10員雜芳基(C1 -C6 )烷基(視需要經鹵素、C1 -C6 烷基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 鹵烷基及C1 -C6 鹵烷氧基取代)、鹵素、氰基、羥基、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 烷氧基(C1 -C6 )烷基(即醚)、芳氧基、氫硫基(sulfhydryl) (氫硫基(mercapto))、鹵(C1 -C6 )烷基(例如–CF3 )、鹵(C1 -C6 )烷氧基(例如–OCF3 )、C1 -C6 烷硫基、芳硫基、胺基、胺基(C1 -C6 )烷基、硝基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-胺硫甲醯基(O-thiocarbamyl)、N-胺硫甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、S-磺醯胺基、N-磺醯胺基、C-羧基、O-羧基、醯基、氰氧基(cyanato)、異氰酸基(isocyanato)、氰硫基(thiocyanato)、異硫氰基(isothiocyanato)、亞磺醯基、磺醯基及側氧基(oxo，=O)。只要是被敘述為「視需要經取代」的基團，該基團可經以上取代基取代。。
應瞭解某些基團命名規則依據內文而定可包括一價基(mono-radical)或二價基(di-radical)。例如，當取代基需要兩個連接點以連接至該分子的其餘部份，應瞭解該取代基是二價基。例如，標示為烷基且需要兩個連接點的取代基包括諸如–CH2 –、–CH2 CH2 –、–CH2 CH(CH3 )CH2 –及類似者之二價基。其他基團命名規則明確指示該基團為二價基，諸如「伸烷基」或「伸烯基」。
只要所述取代基為二價基(即具有連接至該分子的其餘部份兩個連接點)，要理解，除非另外指明，取代基可以任何方向的構型連接。因此，例如敘述為–AE–或
Figure 02_image125
的取代基包含的取代基取向，使得使得A連接在分子最左連接點以及A連接在分子最右連接點的情況。
當本文揭示的化合物具有至少一個立體中心，化合物可以單獨鏡像異構物或非鏡像異構物，或此種異構物的混合物存在，包含消旋物(racemates)。各個異構物的分離或各個異構體的選擇性合成經由應用本領域技術人員熟知的各種方法來完成。要理解，當本文揭示的化合物以互變異構形式存在時，所有互變異構形式包括於所述結構範圍。除非另外指明，所有此種異構物及其混合物包括於本文揭示的化合物範圍。此外，本文揭示的化合物可以一或多種結晶或不定型形式存在。除非另外指明，所有此種形式包括於本文揭示的化合物範圍，包含任何多晶型形式。此外，本文揭示的一些化合物可與水(即水合物)或常見有機溶劑形成溶劑化物。除非另外指明，此種溶劑化物包括於本文揭示的化合物範圍。
如本文所用者，「核苷酸」包括含氮雜環鹼基、糖及一或多種磷酸根基團。核苷酸為核酸序列之單體單元(前驅物或連接單體)。在RNA中，糖為核糖，且在DNA中，糖為脫氧核糖，亦即不具有存在於核糖中之2'位處之羥基的糖。含氮雜環鹼基可為嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。嘌呤鹼基包括腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)及其經修飾之衍生物或類似物。嘧啶鹼基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)以及其經修飾之衍生物或類似物。脫氧核糖之C-1原子結合至嘧啶之N-1或嘌呤之N-9。
如本文所用者，用語「聚核苷酸」或「寡核苷酸」通常指的是核酸，包含DNA (例如，基因組DNA或cDNA)、RNA (例如，mRNA)、合成寡核苷酸及合成核酸類似物諸如受保護的核酸、鎖核酸或架橋核酸。聚核苷酸可包括天然或非天然鹼基，或其組合及天然或非天然主鏈連結，例如硫代磷酸酯、PNA或2′-O-甲基-RNA或其組合。
如本文所用者，用語「引子」定義為具有帶有游離3' OH基團的單股的核酸。引子也可以在5'末端修飾以允許偶合反應，或將引子偶合至另一個部分。引子長度可為任何數目的鹼基(bases)長，且可包括多種非天然核苷酸。如本文所用者，「BCN引子」或「BCN經修飾引子」指的是包含在5'末端共價連接二環[6.1.0]壬-4-炔的引子。一些實例中，引子在5’末端附有末端炔基。
一些實例中，用於基板表面上的引子為P5及P7引子，用於Illumina公司出售之商購流體槽進行定序。引子序列記載於U.S. Pat. Pub. No. 2011/0059865 A1，其全部內容以引用方式併入。P5及P7引子序列可包含以下： 配對末端組： P5：配對末端5’→ 3’ AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC P7：配對末端5’→ 3’ CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT 單一讀出組： P5：單一讀出：5’→ 3’ AATGATACGGCGACCACCGA P7：單一讀出5’→ 3’ CAAGCAGAAGACGGCATACGA 其中G*為8-羥基鳥嘌呤。
一些實例中，連接寡核苷酸(諸如引子或P5或P7引子)包含在5’終端的連接子或間隔子。可以包括此種連接子(linker)或間隔子(spacer)，以便允許化學或酶促裂解，或賦予一些其他所需的性質，例如使共價連接至聚合物或固體撐體上，或作為間隔子來定位裂解位點與固體撐體的最適距離。在某些情況下，10個間隔子核苷酸可位於P5或P7引子連接至聚合物或固體撐體的連接點之間。一些實例中，使用polyT間隔子，雖然也可以使用其他核苷酸及其組合。一個實例中，間隔子為6T至10T間隔子。一些實例中，連接子包括可裂解核苷酸，其包含化學可裂解官基諸如鄰二醇或烯丙基T。
如本文所用者，用語「矽烷(silane)」指的是包含一或多個矽原子的有機或無機化合物。無機矽烷化合物的非限定實例為SiH4 ，或鹵化SiH4 ，其中氫被一或多個鹵素原子取代。有機矽烷化合物的非限定實例為X-RC -Si(ORD )3 ，其中X為非可水解有機基團，諸如胺基、乙烯基、環氧基、甲基丙烯酸酯、硫、烷基、烯基或炔基；RC 為間隔子，例如-(CH2 )n -，其中n為0至1000；每一個RD 獨立地選自氫、視需要經取代的烷基、視需要經取代的烯基、視需要經取代的炔基、視需要經取代的碳環基、視需要經取代的芳基、視需要經取代的5-10員雜芳基及視需要經取代的5-10員雜環基，如本文所定義。一些實例中，矽烷可經交聯，使得X-RC -Si(ORD )3 的-ORD 基團的氧原子連接至相鄰有機矽烷化合物X-RC -Si(ORD )3 的矽原子。此外，矽烷化合物可藉由將X-RC -Si(ORD )3 部分共價結合至表面氧原子而連接至基板表面。因此，一些實例中，所述矽烷包含以下結構：
Figure 02_image127
。
如本文所用者，用語「矽烷」可包含不同矽烷化合物的混合物。一些實例中，X為降冰片烯基。一些實例中，X為二環壬炔基。一些實例中，X為包含烯或炔的基團。一些實例中，X為烯或炔。一些實例中，RC 連接子為C2-6 伸烷基。
如本文所用者，用語「基板」指的是用作本文所述共聚物的撐體的材料。在陣列方法中，珠粒經聚合物塗覆，聚合物同樣被官能化以捕獲目標寡核苷酸。用於定序的聚合物材料已記載於U.S. Pat. Publ. Nos. 2014/0079923及2016/0122816，二者全文以引用方式併本文。本文所述實例中，基板材料可包含玻璃、二氧化矽、塑膠、石英、金屬、金屬氧化物、有機矽酸鹽(例如，多面體有機倍半矽氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化鉭、互補金屬氧化物半導體(CMOS)或其組合。POSS的實例記載於等人的Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778，其全文以引用方式併入本文。一些實例中，本應用使用的基板包括二氧化矽系基板，諸如玻璃、稠二氧化矽及其他含二氧化矽的材料。一些實例中，二氧化矽系基板可為矽、二氧化矽、氮化矽、氫化聚矽氧(silicone hydrides)。一些實例中，本應用所用基板包括塑膠材料或組分諸如聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯、聚碳酸及聚(甲基丙烯酸酯)。塑膠材料實例包括聚(甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯及環狀烯烴聚合物基板。一些實例中，基板為或包含二氧化矽系材料或塑膠材料或其組合。特殊實例中，基板具有至少一個表面包含玻璃或矽系聚合物。一些實例中，基板包含玻璃。一些實例中，基板可為，或可包含或包括金屬。一些此種實例中，金屬為金。一些實例中，基板具有至少一個表面包含金屬氧化物。一個實例中，表面包含氧化鉭或氧化錫。丙烯醯胺、烯酮或丙烯酸酯也可用作基板材料或組分。其他基板材料可包括，但不限於砷化鎵、磷化銦、鋁、陶瓷、聚醯亞胺、石英、樹脂、聚合物及共聚物。一些實例中，基板及/或基板表面可為，或包括石英。一些其他實例中，基板及/或基板表面可為，或包括半導體，諸如GaAs或ITO。上述名單欲用於說明，但不限於本應用。基板可包含單一材料或複數個不同材料。基板可為複合物或積層物。一些實例中，基板包含有機矽酸鹽材料。
基板可為平坦、圓形、球形、棒狀或任何其他合適的形狀。基板可為剛性的或可撓性。一些實例中，基板為珠粒或流體槽。
可以在基板一或多個表面上對基板進行非圖案化、紋理化或圖案化。在一些實例中，對基板進行圖案化。此種圖案可包含柱、墊、孔、脊、通道或其他三維凹面或凸面結構。在基板表面上的圖案可以是規則或不規則。圖案可以例如經由奈米壓印微影或經由使用例如在非金屬表面上形成特徵的金屬墊而形成。
一些實例中，基板表面包含塗覆共聚合物的區域及惰性區域二者。一些實例中，基板表面可含塗覆官能化矽烷的區域及惰性區域二者。例如使用圖案化基板、共聚物或矽烷可選擇性地連接至圖案特徵(例如，可連接至金屬墊或膠體可連接至孔內部)或可替代的，共聚物或矽烷可均勻地連接至圖案特徵及間隙區域二者，然後視需要從間隙區域移除。
一些實例中，本文所述的基板形成流體槽至少部分或位於流體槽中。一些此種實例中，流體槽進一步包含經由共聚物塗層將寡核苷酸連接至基板表面。在此種實例中，寡核苷酸所連接的流體槽體表面被視為基板。其他實例中，具有共塗覆聚合物表面的個別基板(例如，珠粒)被插入流體槽體中。較佳實例中，流動槽是被分成多個通道或多個區段的流動室，其中複數個通道或複數個區段中的一或多個包含塗覆本文所述共聚物塗層的表面。可用於本文提出的方法或組成物的用於製備流體槽的流體槽及基板實例包括但不限於，Illumina公司販售者(San Diego, CA)。
如本文所用者，用語「結構」指的是化合物，例如結合至基板的共聚物。例如，共聚物可例如經由疊氮基共價結合基板。
如本文所用者，用語「聚合物」指的是由許多重複次單元或重複單元構成的分子。聚合物結構的非限制實例包括直鏈、分支鏈或高分支鏈聚合物。直鏈聚合物的非限制實例包含嵌段共聚物或隨機共聚物。分支鏈聚合物的非限制實例包括星狀聚合物、包含疏水及親水片段二者的星狀或星狀嵌段聚合物，包含疏水及親水片段二者的H狀聚合物、啞鈴狀聚合物、梳狀聚合物、刷狀聚合物、樹枝狀聚合物、梯子及樹枝狀聚合物。聚合物可為交聯或些微交聯。本文所述的聚合物可為直鏈、分支鏈、高分支鏈或樹枝狀。本文所述的聚合物也可為聚合物奈米粒子形式。聚合物架構的其他實例包括，但不限於環嵌段聚合物及線-環-線聚合物(coil-cycle-coil polymers)。具有多於一種類型重複單元的聚合物可排列為嵌段共聚物、隨機共聚物或交替共聚物或其混合物。最後共聚物結構可為不同架構，包括例如隨機共聚物、嵌段共聚物、梳狀聚合物或星狀聚合物架構。不同類別聚合物主鏈包括但不限於聚丙烯酸酯醯胺、聚丙烯酸酯、聚胺甲酸酯、聚矽氧烷、聚矽氧、聚丙烯醛、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚異氰酸酯、多元醇、多醣及其組合。一些實例中，聚合物包含聚丙烯酸酯醯胺主鏈。在一些其他實例中，聚合物包含聚丙烯酸酯主鏈。又一些其他實例中，聚合物包含聚胺甲酸酯主鏈。又一些其他實例中，聚合物包含聚偶磷氮主鏈。又一些其他實例中，聚合物包含樹枝狀聚合物主鏈。
如本文所用者，字首「光」或「光-」意指與光或電磁輻射有關。該用語可以涵蓋全部或部分電磁光譜，其包括但不限於通常被稱為光譜的無線電、微波、紅外光、可見光、紫外線、X射線或伽馬射線部分的一個或多個範圍。光譜部分可以是被表面的金屬區域如本文所述的該等金屬阻擋的光譜。可替代的或另外的，光譜部分可以是穿過諸如由玻璃、塑膠、二氧化矽或本文提出的其他材料製成的區域表面的間隙區域的光譜。特別實例中， 可以使用能夠穿過金屬的輻射。可替代的或另外的，可以使用被本文提出的玻璃、塑料、二氧化矽或其他材料掩蓋的輻射。
如本文所用，術語「YES方法」係指一種由Illumina公司研發之化學氣相沉積方法，其使用由產量工程系統(「YES」)提供之化學氣相沉積工具。該工具包括三個不同氣相沉積系統。自動化YES-VertaCoat矽烷蒸氣系統經設計用於批量生產，其具有可容納200mm或300mm晶圓之可撓性晶圓處理模組。人工加載YES-1224P矽烷蒸氣系統經設計用於多功能批量生產，其具有可組態之大容量腔室。Yes-LabKote為針對可行性研究及R&D理想的低成本桌面形式。
一個態樣中，提供根據式(I)化合物。
Figure 02_image001
(I) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；且 Z為含氮雜環。
根據式(I)化合物可用作可聚合單體。例如，丙烯醯基的存在可提供可聚合部分，視需要使得複數個此種化合物(單體)彼此間聚合及視需要與一或多種其他類型化合物(單體)聚合。另外的或可替代的，存在於式(I)化合物中的疊氮基視需要可與一或多種適當的化合物(諸如一或多種適當的含烯或炔的化合物)進行環加成反應。例示性地，已發現接近疊氮基的含氮雜環基團的存在可導致銅介導的環加成反應速率增加，例如相較於不包含接近疊氮基的含氮雜環基團的化合物增加20-38倍。此意指催化環加成反應涉及較少的銅催化劑。不希望受到任何理論的束縛，據信含氮雜環中的氮可與銅催化劑配位(例如，螯合)，使得銅催化劑的銅中心可被結合在充分接近疊氮基的位置，以便更容易催化疊氮基與含烯或炔的化合物之間的環加成反應，從而增加反應速率且減少銅催化劑消耗。一些實例中，含氮雜環中的氮位於與疊氮基約5 nm或更近的距離，以便於與銅催化劑的銅中心配位，例如，約1埃至5 nm的距離，或約2埃至2 nm的距離，或約5埃至1 nm的距離。本文揭示的單體化合物視需要可形成聚合物或共聚物，其視需要可用於塗覆基板，從而使基板官能化。例如，塗覆聚合物或共聚物的基板可與烯或炔官能生物分子反應。
E例如可為視需要經取代的C1-4 伸烷基，每一個碳視需要經一或多種選自例如-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O的取代基取代。E例如可為未經取代的C1-4 伸烷基，例如CH2 、(CH2 )2 、(CH2 )3 或(CH2 )4 。
視需要，E可包含醚、酯或醯胺。例如，E可包含-CH2 CH2 OCH2 -、-COCNHCH2 -或-CH2 COOCH2 -。
R1 例如可為H或直鏈或分支鏈鏈烷基，其具有1及4個之間的碳原子，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。例如，R1 可為H或甲基。
R2 例如可為H或直鏈或分支鏈鏈烷基，其具有1及4個之間的碳原子，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。例如，R2 可為H或甲基。
R3 例如可為H或直鏈或分支鏈鏈烷基，其具有1及4個之間的碳原子，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。例如，R3 可為H或甲基。
一些實例中，L可為包含直鏈的連接子，直鏈為-C2-20 伸烷基-或3至20個原子的直鏈雜伸烷基，每一個視需要經一或多個選自由-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O組成之群組的取代基取代。L可為具有直鏈的連接子，直鏈為-C2-6 伸烷基-、視需要經一或多個-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O取代基取代。L可為未經取代的-C2-6 伸烷基-(亦表示為-(CH2 )2-6 -)，例如L可為未經取代的-C3-4 伸烷基-，例如–(CH2 )3 -或–(CH2 )4 -。
L可為包含直鏈的連接子，直鏈為3至20個原子的直鏈雜伸烷基，視需要經一或多個選自由-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O組成之群組取代基取代。例示性地，L可包含一或多個乙二醇單元。L可為-CH2 CH2 (OCH2 CH2 )x -OCH2 CH2 -，其中x為0至10。一個非限制實例中，x為1、2、3、4、5或6。L可包含一或多個醯胺基團。例如，L可為-C2-6 烷基-NHC(O)-C2-6 烷基-、或L可為-(CH2 )2 -NHC(O)-(CH2 )2 -或-(CH2 )3 -NHC(O)-(CH2 )2 -。L可包含一或多個天然或非天然胺基酸，例如L可包含一或個種天然胺基酸，例如L可包含一或多個胺基酸選自由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺或谷胺醯胺組成之群組。一些實例中，L可包含1、2或3個胺基酸單元。
N經取代的醯胺A可以二種可能構型結合至L及Z，例如A的羰基碳可結合至L且A的醯胺氮可結合至Z。可替代的，A的羰基碳可結合至Z且A的醯胺氮可結合至L。此二種構型的實例如以下式(Ic)及(Id)所示。
Z可包含含氮雜環，其具有5至10環員，例如5至10員的雜環狀環，其中環員為形成雜環狀環主鏈的原子。Z可包含單環狀結構或包含二或多個環系統的稠合結構。在單環狀結構情況下，Z可包含5或6環員，例如Z可為5或6員雜環狀環。在稠合結構情況下，Z可包含9或10環員。含氮雜環可包含一個以上的雜原子，例如一或多個另外的氮雜原子，或一或多個氧雜原子，或一或多個硫雜原子，或此種雜原子的任何適當組合。含氮雜環可為芳香族，例如吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吲哚基、喹啉基、喹唑啉基。含氮雜環可為脂族、例如環烷基。脂族含氮雜環可為飽和或可包括一或多個雙鍵而不是芳香族。一個實例中，含脂族氮雜環可為吡咯啶基。
在Z為6員雜環狀環的情況下，式(I)化合物視需要被構型使得A結合至6員環的位置2 (N構成位置1)且烷基疊氮基結合至6員環的位置5。此種構型可被視為提供相對於6員雜環狀環的1,4取代型態。
在某些選項中，式(I)化合物可為式(Ia)：
Figure 02_image006
(Ia)， 其中R1 、R2 、L、A及Z如以上式(I)所定義，且p為1、2、3或4。
在某些選項中，式(Ia)化合物可為式(Ib)
Figure 02_image008
(Ib) 其中R1 、R2 、L、A及p如以上式(I)及(Ia)所定義且X為CH或N。
式(Ia)化合物視需要可為式(Ic)化合物
Figure 02_image010
(Ic) 其中R1 、R2 、L、A及p如以上式(I)及(Ia)所定義。
如上所述，式(Ia)化合物視需要可為式(Id)或(Ie)化合物
Figure 02_image014
(Id)
Figure 02_image016
(Ie) 其中R1 、R2 、L、A及p如以上式(I)及(Ia)所定義。換言之，A可具有任何適當的構型。
一些實例中，式(Ib)及(Id)化合物可為式(Ik)化合物
Figure 02_image135
(Ik) 其中R1 、R2 、R3 、X及p如以上式(I)、式(Ia)及式(Ib)所定義。
化合物式(Ik)視需要可為式(Im)化合物
Figure 02_image137
(Im) 其中R1 、R2 、R3 、X及p如以上式(I)、式(Ia)及式(Ib)所定義且n為2至20的整數。例如，n可為1及10之間的整數，例如1及6之間的整數，例如2、3、4、5或6。例如，n可為3或4。
在特定及非限制性實例中，化合物式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ie)可為具有式(If)化合物
Figure 02_image018
(If)。
在另一特定及非限制性實例中，式(I)、(Ia)、(Ic)及(Ie)化合物可為具有式(Ig)化合物。
Figure 02_image020
(Ig)。
在其他非限制性實例中，式(I)、(Ia)、(Ib)及(Id)化合物可為具有式(Ih)或(Ij)化合物：
Figure 02_image022
(Ih)或
Figure 02_image024
(Ij)。
一些態樣中，提供共聚物，係由如式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)或(Im)定義的化合物與至少一個其他重複單體單元的反應而形成。
一些態樣中，提供包含式(II)重複單體單元的共聚物
Figure 02_image030
(II) 其中R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，直鏈包含2至20個選自由碳、氧及氮原子組成之群組以及視需要的鏈中碳及任何氮原子上的取代基； E為直鏈，其包含1至4個選自由碳、氧及氮原子組成之群組以及視需要的鏈中碳及任何氮原子上的取代基； A為具有式
Figure 02_image004
的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；及 Z為含氮雜環；及 至少一個其他重複單體單元。
應理解，R1 、R2 、L、A、Z及E可如以上所述式(I)定義。
應理解，式(II)重複單體單元可衍生自式(I)化合物。式(I)化合物的丙烯醯基中的碳碳雙鍵可聚合，從而導致包含式(I)重複單體單元的共聚物。應理解，式(II)重複單體單元可衍生自任何式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)或(Im)化合物。
視需要，至少一個其他重複單體單元可選自由聚丙烯酸酯醯胺、聚丙烯酸酯、聚胺甲酸酯、聚矽氧烷、聚矽氧、聚丙烯醛、聚偶磷氮、聚異氰酸酯、多元醇及多醣及其任何組合組成之群組。
共聚物例如可包含式(IIa)重複單體單元：
Figure 02_image033
(IIa)，其中R1 、R2 、L、A、Z及p如以上式(I)及(Ia)所定義。
共聚物例如可包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元：
Figure 02_image035
Figure 02_image037
(IIb)                      (IIc)
Figure 02_image148
Figure 02_image149
(IId)                      (IIe) 其中R1 、R2 及X如以上式(I)、(Ia)及(Ib)所定義且及式(IIc)中的n為2至20的整數。
至少一個其他重複單體單元視需要可為式(III)化合物
Figure 02_image043
(III) 其中 R4 為H或C1-4 烷基； R5 為H或C1-4 烷基；及 R6 為H或C1-4 烷基。
R4 例如可為H或具有1及4個之間的碳原子的直鏈或分支鏈烷基。例如，R4 可為H或甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、或三級丁基，例示性地，R4 可為H或甲基。
R5 例如可為H或具有1及4個之間的碳原子的直鏈或分支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、或三級丁基。例如，R5 可為H或甲基。
R6 例如可為H或具有1及4個之間的碳原子的直鏈或分支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、或三級丁基。例如，R6 可為H或甲基。
共聚物可包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元及至少一個其他重複單體單元。
另一態樣中，提供基板-共聚物產物，係由以上所述式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)共聚物與基板(例如本文所述基板)的反應形成。基板共聚合物產物可由共聚物的疊氮基與基板表面上含烯基或炔基的基團的反應形成。
使基板與以上所述共聚物反應可導致官能化基板，其中側疊氮基經構型化以與目標分子(例如生物分子或官能化生物分子)內發現的烯基或炔基反應。官能化基板可用於諸如定序或分子分析的應用。
另一態樣中，提供包含共價結合基板共聚物的結構，其中結合基板的共聚物包含共價結合基板的重複單體單元，其中重複共價結合的單體單元為式(IV)化合物：
Figure 02_image045
(IV) 其中R1 、R2 、L、A、Z、E如以上所述式(I)定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且三唑或三唑啉經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合基板。應理解，式(IV)重複共價結合至單體單元可衍生自式(I)化合物。應理解，式(IV)重複單體單元可衍生自任何式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)或(Im)化合物。
重複共價鍵結的單體單元可為式(IVa)化合物，
Figure 02_image049
(IVa) 其中R1 、R2 、L、A、Z及p如以上所述式(I)及(Ia)所定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且三唑或三唑啉經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合基板。
重複共價鍵結的單體單元可為式(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)化合物：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image152
Figure 02_image153
(IVd)                        (IVe) 其中R1 、R2 、R3 、X及p如以上所述式(I)、(Ia)及(Ib)所定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且該三唑或三唑啉經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合該基板；且式(IVc)中的n為2至20的整數。例如，n可為1及10之間的整數，例如1及6之間的整數，例如2、3、4、5或6，例如n可為3或4。
重複共價鍵結的單體單元可為式(V)化合物
Figure 02_image154
(V) 其中R1 、R2 、L、A、Z及E如以上式(I)所定義且其中G為三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
G例如可為矽烷連接子。例如，G可為-X’-RC -Si(O-)3 ，其中X’為矽烷連接子前驅物的X基團與共聚物疊氮基的反應產物。X可為烯基、炔基、降冰片烯基、或二環壬炔基。X’可為單鍵、雙鍵、
Figure 02_image156
，其中虛線5-員環為三唑啉單元、或
Figure 02_image158
，其中虛線5-員環為三唑啉單元。一些實例中，G為-環烷基-CH2 CH2 -Si(O-)3 ，其中環烷基經稠合至三唑啉單元。一些實例中，G為-環烯基-CH2 CH2 -Si(O-)3 ，其中環烯基經稠合至三唑單元且與三唑單元共有雙鍵。
重複共價鍵結的單體單元可為式(Va)化合物
Figure 02_image160
(Va) 其中R1 、R2 、L、A、Z及p如以上所述式(I)及(Ia)所定義且G如以上式(V)所定義。
重複共價鍵結的單體單元可為式(Vb)、式(Vc)、式(Vd)或式(Ve)化合物：
Figure 02_image162
(Vb)
Figure 02_image164
(Vc)
Figure 02_image166
(Vd)
Figure 02_image168
(Ve) 其中R1 、R2 、R3 、X及p如以上式(I)、式(Ia)及式(Ib)所定義；G如以上式(V)所定義且式(Vc)中的n為2至20的整數。例如，n可為1及10之間的整數，例如1及6之間的整數例如2、3、4、5或6，例如n可為3或4。
一個態樣中，提供共聚物-寡核苷酸產物，係由式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)所定義共聚物與一或多種寡核苷酸之間的反應所形成。共聚物寡核苷酸產物可由共聚物的疊氮基與烯-或炔-官能化寡核苷酸的反應所形成。
例示性地，寡核苷酸可為或包括DNA、RNA、基因組DNA、序列或引子諸如擴增引子。擴增引子可為用於合成定序系統的P5或P7序列。
另一個態樣中，提供寡核苷酸結合共聚物，其包含式(IV)重複單體單元：
Figure 02_image045
(IV) 其中R1 、R2 、R3 、L、A、Z及E如以上式(I)所定義；
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；及 共聚物經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合寡核苷酸。
應理解，式(IV)重複單體單元可衍生自式(I)化合物。應理解，式(IV)重複單體單元可衍生自任何式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)或(Im)化合物。
例如，結合寡核苷酸的重複單體單元可為式(IVa)：
Figure 02_image049
(IVa) 其中R1 、R2 、R3 、L、A、Z及p如以上式(I)及式(Ia)所定義；
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；及 共聚物經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合寡核苷酸。
例如，結合寡核苷酸的重複單體單元可為式(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image171
Figure 02_image153
(IVd)                        (IVe) 其中R1 、R2 、p及X如以上式(I)、(Ia)及(Ib)所定義；且式(IVc)中的n為2至20的整數。例如，n可為1及10之間的整數，例如1及6之間的整數，例如2、3、4、5或6，例如n可為3或4。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元可為式(VI)：
Figure 02_image172
(VI)，其中R1 、R2 、L、A、Z及E如以上式(I)所定義；
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵；且G如以上式(V)所定義。
結合寡核苷酸的重複單體單元可為式(VIa)：
Figure 02_image174
(VIa)， 其中R1 、R2 、L、A、Z及p如以上所述式(I)及(Ia)所定義且G如以上式(V)所定義。
一些實例中，結合寡核苷酸的重複單體單元可視需要為式(VIb)或式(VIc)、式(VId)、或式(VIe)：
Figure 02_image176
(VIb)
Figure 02_image178
(VIc)
Figure 02_image180
(VId)
Figure 02_image182
(VIe) 其中R1 、R2 、R3 、X及p如以上式(I)、式(Ia)及式(Ib)所定義；G如以上式(V)所定義；且式(VIc)中的n為2至20的整數。例如，n可為1及10之間的整數，例如1及6之間的整數，例如2、3、4、5或6，例如n可為3或4。
另一個態樣中，提供共聚物-基板-寡核苷酸產物，係由以上所述式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)共聚物與基板及一或多種寡核苷酸的反應而形成。一或多種寡核苷酸可包括DNA、RNA、基因組DNA、模板DNA片段或引子諸如擴增引子。擴增引子可為用於合成定序系統的P5或P7序列。
另一個態樣中，提供將以上所述式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的共聚物固定至基板的方法，包含使共聚物的疊氮基與基板表面上複數個含烯基或炔基的官能基反應，在共聚物與基板表面之間形成共價鍵。含烯或炔的官能基可為例如烯基、炔基、環炔基或環烯基。在一些特定非限制性實例中，含烯基或炔基的基團為降冰片烯基。在一些特定非限制性實例中，含烯基或炔基的基團為矽烷。在一些特定非限制性實例中，含烯基或炔基的基團為包含降冰片烯基團的矽烷。固定之前，該方法可進一步包含將共聚物施用於基板表面。例如，共聚物可被施用於基板表面，藉由將共聚物前驅物溶液施用於表面且使前驅物溶液硬化以形成共聚物。使用為發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何習知表面應用技術，共聚物前驅物溶液或共聚物可被施用於基板，例如流塗、旋塗、噴塗、浸塗或噴墨塗覆。將共聚物施用於基板後，經由抛光步驟可移除過量共聚物(例如，從圖案化基板的間隙區域移除，在圖案化區域諸如孔留下共聚物。
一些實例中，固定共聚物的方法進一步包含在共聚物固定在基板之前用含烯基或炔基基團使基板官能基化。一些實例中，用含烯或炔的矽烷預處理基板表面。例如，藉由化學氣相沉積(CVD)方法可將官能化矽烷沉積至表面上。一些實例中，藉CVD方法使用產量工程系統(YES)烘箱，可將官能化矽烷施用於第一表面。
一個態樣中，提供將複數個寡核苷酸接枝至以上定義的式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)共聚物的方法，包含使共聚物的疊氮基與複數個寡核苷酸反應。複數個寡核苷酸包含烯基或炔基基團，且反應在共聚物的疊氮基與寡核苷酸的烯基或炔基基團之間發生。含烯基或炔基的基團可為烯基、炔基、環烯基或環炔基或其經取代的變體。例如，含烯基或炔基的基團包含環炔基，例如二環[6.1.0]任-4-炔(BCN)。含烯基或炔基的基團可包含炔基。
在將共聚物固定至基枝之前，寡核苷酸可接枝至共聚物。例如，在將共聚物固定至基枝之後，寡核苷酸可接枝至共聚物。基板上含烯基或炔基的基團與寡核苷酸可為相同或不同。該方法可進一步包含洗滌步驟以移除未反應(未接枝)的寡核苷酸。該方法可進一步包含乾燥步驟。
另一個態樣中，提供製備式(I)化合物的方法：
Figure 02_image001
(I) 包含使式(X)化合物與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image087
Figure 02_image089
(X)                     (XI) 以形成式(I)化合物；其中R1 、R2 、L、A、Z及E如以上式(I)所述；且Hal為Cl或F。
提供製備式(Ik)化合物的方法：
Figure 02_image091
(Ik) 包含使式(Xa)化合物：
Figure 02_image093
(Xa) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image089
(XI) 其中R1 、R2 、R3 、L、X及p如以上式(I)、(Ia)及(Ib)所述；且Hal為Cl或F，以形成式(Ij)化合物。
該方法可進一步包含使式(XII)化合物：
Figure 02_image095
(XII) 與式(XIII)化合物反應：
Figure 02_image097
(XIII) 從而形成式(Xa)化合物；其中R3 、X及p如以上式(I)及式(Ia)所述；Pg為H或胺基保護基；且Y為-OH或-Cl。
提供製備式(Ik)化合物的方法，其包含使式(XIV)化合物：
Figure 02_image099
(XIV) 與式(XV)化合物反應：
Figure 02_image101
(XV) 以形成式(Ik)化合物
Figure 02_image103
(Ik) 其中R1 、R2 、R3 、L、X及p如以上式(I)、(Ia)及(Ik)所述；Y為-OH或–Cl。
製備式(XIV)化合物的方法可進一步包含使式(XII)化合物與環酐(諸如琥珀酸酐或戊二酸酐)反應以形成式(XIV)化合物。
也提供形成根據式(Ie)化合物的方法
Figure 02_image016
(Ie)， 其中該方法包含使式(Xb)化合物
Figure 02_image186
(Xb) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image089
(XI) 其中R1 、R2 、R3 、L、Z及p如以上所述式(I)及式(Ia)所定義；且Hal為Cl或F； 以形成式(Ie)化合物。
根據式(Xb)化合物可藉由以下方法而形成，該方法包含的步驟為使式(XVI)化合物
Figure 02_image187
(XVI) 與式(XVII)化合物反應
Figure 02_image189
(XVII) 以形成(Xb)化合物
Figure 02_image186
(Xb) 其中R1 、R2 、R3 、L、Z及p如以上式(I)及(Ia)所定義；Pg為H或胺基保護基。
本文所述寡核苷酸結合共聚物可用於各種擴增技術。可供使用的實例技術包括但不限於聚合酶鏈反應(PCR)、滾環擴增(RCA)、多重置換擴增(MDA)或隨機引發擴增(RPA)或其組合。在一些實例中，用於擴增的一或多種引子連接至基板上的共聚物塗層。利用二個種類連接引子的形式使橋式擴增，因為雙股擴增子在側接於已複製之模板序列的兩個連接引子之間形成橋狀結構。擴增也可以在使用連接至共聚物塗層的一個擴增引子及於溶液中的第二引子(例如乳液PCR)或二個引子於溶液中進行。
本文所述的塗覆共聚合物的基板可用於確定靶標核酸的核苷酸序列的方法。例如，該方法包含： 經由本文所述的共聚物使靶標核酸與共價結合基板的複數個引子中的一個(或與式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)重複單體單元的寡核苷酸)雜合； 使用複數個引子擴增經雜合靶標核酸，以形成結合基板的擴增子簇； 使用經標記的核苷酸及聚合酶處理結合基板的擴增子簇，使得當核苷酸被聚合酶併入時產生可檢測的訊號；及檢測訊號，從而確定靶標核酸的核苷酸序列。
藉檢測在模板處或模板附近產生的信號，可以確定流體槽中存在的基板表面上的聚合物塗層所連接的一或多種聚核苷酸在每個流動步驟中併入的一個或多個聚核苷酸。一些實例中，可檢測的訊號包含光學訊號。其他實例中，可檢測的訊號包含非光學訊號。此種實例中，非光學信號包含在一或多個經定序的核酸處或附近的pH或電流的變化。
適當的定序方法包括，但不限於，合成定序、焦磷酸定序、接合酶定序及其他為所屬技術領域中習知的方法。
合成定序方法中，對與聚核苷酸聚合酶相關的模板聚核苷酸提供一或多個核苷酸。聚核苷酸聚合酶將一或多個核苷酸併入與聚核苷酸模板互補的新合成的核酸股。合成從寡核苷酸引子開始，該寡核苷酸引子與模板聚核苷酸的一部分或共價結合至模板聚核苷酸至少一末端的通用或不可變核酸的一部分互補。當核苷酸併入模板聚核苷酸時，產生可檢測的訊號，從而容許確定在定序方法每一個步驟期間核苷酸已併入哪個核苷酸。以此方式，可以產生與模板聚核苷酸的至少一部分互補的核酸序列，從而允許確定模板聚核苷酸至少一部分的核苷酸序列。
可供本發明共聚物及基板使用的其他有用技術包括即時監控DNA聚合酶活性、併入核苷酸後檢測質子釋出的SBS技術(例如，Ion Torrent, Thermo Fisher)及基因表現分析。例如，可以經由帶有螢光團的聚合酶與γ-磷酸酯標記核苷酸之間的螢光共振能量轉移(FRET)交互作用或經由零模波導(ZMWs)以檢測核苷酸併入。使用RNA定序技術(諸如稱為數位RNA定序的技術)可以檢測或定量基因表現。使用諸如以上所述為所屬技術領域中習知的定序方法，可以進行RNA定序技術。也可以使用藉由與陣列直接雜交或藉由多重評鑑(multiplex assay)在陣列上檢測其產物的雜合技術檢測或定量基因表現。
在式(I)-(Ik)化合物的一些實例中，式(II)-(IIe)重複單體單元、式(IV)-(IVd)重複單體單元、式(V)-(Vd)重複單體單元以及式(VI)-(VId)重複單體單元，R1 為H。一些實例中，R1 為H或甲基。一些實例中，R1 為C1-4 烷基。一些實例中，R1 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R2 為H。一些實例中，R2 為H或甲基。一些實例中，R2 為C1-4 烷基。一些實例中，R2 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R3 為H。一些實例中，R3 為H或甲基。一些實例中，R3 為C1-4 烷基。一些實例中，R3 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，X為CH。一些實例中，X為N。
一些實例中，p為1。一些實例中，p為1或2。
一些實例中，L為具有直鏈的連接子，直鏈為-C2-20 伸烷基-或3至20個原子的直鏈雜伸烷基、每一個視需要經的一或多個選自由-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O組成之群組的取代基取代。一些實例中，L為具有直鏈的連接子，直鏈為-C2-6 伸烷基-、視需要經一或多個-C1 -4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O的取代基取代。一些實例中，L為未經取代的-C2-6 伸烷基-(亦表示為-(CH2 )2-6 -)。一些實例中，L為未經取代的-C3-4 伸烷基-。一些實例中，L為–(CH2 )3 -。一些實例中，L為-(CH2 )4 -。
一些實例中，L為具有直鏈的連接子，直鏈為3至20個原子的直鏈雜伸烷基、視需要經一或多個選自由-C1-4 烷基、-OH、-OC1-4 烷基或=O組成之群組的取代基取代。一些實例中，L包含一或個乙二醇單元。一些實例中，L為-CH2 CH2 (OCH2 CH2 )x -OCH2 CH2 -，其中x為0至10。一些實例中，x為1、2、3、4、5或6。一些實例中，L包含一或多個醯胺基團。一些實例中，L為-C2-6 烷基-NHC(O)-C2-6 烷基-。一些實例中，L為-(CH2 )2 -NHC(O)-(CH2 )2 -或-(CH2 )3 -NHC(O)-(CH2 )2 -。一些實例中，L包含一或多個天然或非天然胺基酸。一些實例中，L包含一或多個天然胺基酸。一些實例中，L包含一或多個選自由選自由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺或谷胺醯胺組成之群組的胺基酸。一些實例中，L包含1、2或3個胺基酸單元。
一些實例中，式(Ik)化合物為式(Im)化合物。一些實例中，式(IIb)重複單體單元為式(IIc)重複單體單元。一些實例中，式(IVb)重複單體單元為式(IVc)重複單體單元。一些實例中，式(Vb)重複單體單元為式(Vc)重複單體單元。一些實例中，式(VIb)重複單體單元為式(VIc)重複單體單元。每一個獨立式的一些實例中，R1 為H。一些實例中，R1 為H或甲基。一些實例中，R1 為C1-4 烷基。一些實例中，R1 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R2 為H。一些實例中，R2 為H或甲基。一些實例中、R2 為C1-4 烷基。一些實例中、R2 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R3 為H。一些實例中，R3 為H或甲基。一些實例中，R3 為C1-4 烷基。一些實例中，R3 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，X為CH。一些實例中，X為N。
一些實例中，n為1-10、1-6或2、3、4、5或6。一些實例中，n為3或4。
一些實例中，p為1。一些實例中，p為1或2。
一些實例中，式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)中的
Figure 02_image047
為單鍵。一些實例中，它為雙鍵。一些實例中，式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)的三唑經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合至表面。
式(V)、(Va)、(Vb)、(Vc)、(Vd)或(Ve)或式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)的一些實例中，G為三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。一些實例中，G為矽烷連接子。一些實例中，G為-X’-RC -Si(O-)3 ，其中X’為矽烷連接子前驅物的X基團與共聚物疊氮基的反應產物。一些實例中，X為烯基、炔基、降冰片烯基或二環壬炔基。因此，一些實例中，X’為單鍵、雙鍵、
Figure 02_image156
，其中虛線5-員環為三唑啉單元、或
Figure 02_image158
，其中虛線5-員環為三唑啉單元。一些實例中，G為-環烷基-CH2 CH2 -Si(O-)3 ，其中環烷基經稠合至三唑啉單元。一些實例中，G為-環烯基-CH2 CH2 -Si(O-)3 ，其中環烯基經稠合且共有三唑單元中的雙鍵。
一些實例中為共聚物，其包含式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元。至少一個其他重複單體單元為選自由聚丙烯酸酯醯胺、聚丙烯酸酯、聚胺甲酸酯、聚矽氧烷、聚矽氧、聚丙烯醛、聚偶磷氮、聚異氰酸酯、多元醇、多醣及其組合組成之群組。一些實例中，共聚物包含式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元以及式(III)重複單體單元。一些實例中，共聚物包含式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元及至少一個以上所述其他重複單體單元。
式(III)重複單體單元的一些實例中，R4 為H。一些實例中，R4 為C1-4 烷基。一些實例中，R4 為H或甲基。一些實例中，R4 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R5 為H。一些實例中，R5 為C1-4 烷基。一些實例中，R5 為H或甲基。一些實例中，R5 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
一些實例中，R6 為H。一些實例中，R6 為C1-4 烷基。一些實例中，R6 為H或甲基。一些實例中，R6 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
本發明提供的一些實例關於基板，其具有共價結合基板的本文所述共聚物，其中結合基板的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元。因此，一些實例中，結合基板的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及共價結合基板(直接或經由連接子間接)的重複單體單元。一些實例中，結合基板的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及式(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)重複單體單元：
Figure 02_image192
Figure 02_image194
(IVb)                        (IVc)
Figure 02_image196
Figure 02_image197
(IVd)                    (IVe) 其中R1 、R2 、R3 、X、L、p及n如本文定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵且三唑或三唑啉經由一個(例如，當結合基板的烯基或炔基為非環狀)或二個(例如，當結合基板的烯基或炔基為環的一部分)三唑/三唑啉環碳原子共價結合(直接或經由連接子間接)至基板。
一些實例中，結合基板的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及式(Vb)、(Vc)、(Vd)或(Ve)重複單體單元：
Figure 02_image198
(Vb)
Figure 02_image200
(Vc)
Figure 02_image202
(Vd)
Figure 02_image204
(Ve) 其中R1 、R2 、R3 、X、n、p及G如本文定義。
本文所述為共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元，其中共聚物共價結合至寡核苷酸。因此，一些實例中，結合寡核苷酸的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及共價結合至寡核苷酸的重複單體單元。一些實例中，結合寡核苷酸的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或IV(e)重複單體單元，其中R1 、R2 、R3 、L、p及n如本文定義，
Figure 02_image047
為單鍵或雙鍵且共聚物經由一個或二個三唑/三唑啉環碳原子共價結合(直接或經由連接子間接)至寡核苷酸。一些實例中，結合寡核苷酸的共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及式(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)重複單體單元：
Figure 02_image206
(VIb)
Figure 02_image208
(VIc)
Figure 02_image210
(VId)
Figure 02_image212
(VIe) 其中R1 、R2 、R3 、X、n、p及G每一個如本文所定義。
一些實例中，連接的寡核苷酸為DNA、RNA、基因組DNA、序列或引子諸如擴增引子。一些實例中，寡核苷酸為引子。一些實例中，引子為用於合成定序系統的P5及P7序列。
一些實例中，本文所述的共聚物經共價結合基板及寡核苷酸二者。因此，一些實例中，共聚物包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(V)、(Va)、(Vb)、(Vc)、(Vd)或(Ve)重複單體單元及式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)重複單體單元。
本發明提供的一些實例關於製備式(Ik)化合物的方法、製備包含式(IIb)重複單體單元的共聚物的方法以及製備包含式(IIb)重複單體單元及式(III)重複單體單元的共聚物的方法。
本文所述為製備式(Ik)化合物的方法：
Figure 02_image091
(Ik) 包含使式(Xa)化合物：
Figure 02_image093
(Xa) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
Figure 02_image089
(XI) 其中R1 、R2 、R3 、L、p及X如本文定義且Hal為Cl或F。
一些實例中，該方法包含使式(XII)化合物：
Figure 02_image095
(XII) 其中p、R3 及X如本文定義； 與式(XIII)化合物反應：
Figure 02_image097
(XIII) 其中 Pg為H或胺基保護基；且 Y為-OH或-Cl； 以形成式(Xa)化合物。
其他態樣為製備式(I)化合物的方法，其包含使式(XIV)化合物：
Figure 02_image099
(XIV) 其中Y為-OH或-Cl； 與式(XV)化合物反應：
Figure 02_image101
(XV) 以形成式(Ik)化合物。
此種方法可進一步包含式(XII)化合物與環酐(諸如琥珀酸酐或戊二酸酐)反應以形成式(XIV)化合物。
本發明提供的一些實例關於將本文所述的共聚物(或結合寡核苷酸的共聚物)固定至基板的方法，其包含使包含式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的共聚物的疊氮基與基板上含烯基或炔基的基團反應，以在共聚物與基板之間形成共價鍵。一些實例中，含烯基或炔基的基團為烯基、炔基或環炔基、環烯基。一些實例中，含烯基或炔基的基團為降冰片烯基。一些實例中，含烯基或炔基的基團為矽烷。一些實例中，含烯基或炔基的基團為包含降冰片烯基團的矽烷。一些實例中，固定之前，該方法進一步包含將共聚物施用於基板表面。其他實例中，共聚物被施用於基板表面，其為藉由將共聚物前驅物溶液施用於表面且使前驅物溶液硬化以形成共聚物。使用為發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何習知表面應用技術，共聚物前驅物溶液或共聚物可被施用於基板，例如流塗、旋塗、噴塗、浸塗或噴墨塗覆。一些實例中，將共聚物施用於基板後，經由抛光步驟可移除過量共聚物(例如，從圖案化基板的間隙區域移除，在圖案化區域諸如孔留下共聚物)。
一些實例中，固定共聚物的方法進一步包含在共聚物固定在基板之前用含烯基或炔基基團使基板官能基化。一些實例中，用含烯或炔的矽烷預處理基板表面。一些實例中，藉由化學氣相沉積(CVD)方法可將官能化矽烷沉積至表面上。一些此種實例中，藉CVD方法使用產量工程系統(YES)烘箱，可將官能化矽烷施用於第一表面。
將寡核苷酸接枝至本文所述共聚物的方法，其包含使共聚物的疊氮基與寡核苷酸上的含烯基或炔基的基團反應以形成結合寡核苷酸的共聚物。一些實例中，含烯基或炔基的基團為烯基、炔基、環烯基或環炔基或其經取代的變體。一些實例中，含烯基或炔基的基團包含環炔基，例如二環[6.1.0]任-4-炔(BCN)。一些其他實例中，含烯基或炔基的基團包含炔基。一些實例中，共聚物固定至基板之前，將寡核苷酸接枝至共聚物。一些實例中，共聚物固定至基板之後，將寡核苷酸接枝至共聚物。基板上的含烯基或炔基的基團及寡核苷酸可為相同或不同。一些實例中，該方法進一步包含洗滌步驟以移除未反應的(未接枝)寡核苷酸。一些實例中，該方法進一步包含乾燥步驟。 定序應用
本文所述寡核苷酸陣列可用於各種擴增技術。可供使用的實例技術包括但不限於聚合酶鏈反應(PCR)、滾環擴增(RCA)、多重置換擴增(MDA)或隨機引發擴增(RPA)或其組合。在特殊實例中，用於擴增的一或多種引子連接至基板上的共聚物塗層。利用二個種類連接引子的形式使橋式擴增，因為雙股擴增子在側接於已複製之模板序列的兩個連接引子之間形成橋狀結構。擴增也可以在使用連接至共聚物塗層的一個擴增引子及於溶液中的第二引子(例如乳液PCR)或二個引子於溶液中進行。
一些實例中，本文所述的塗覆共聚合物的基板可用於確定靶標核酸的核苷酸序列的方法。此種實例中，該方法包含： 經由本文所述的共聚物使靶標核酸與共價結合基板的複數個引子中的一個(或與式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)或(VIe)重複單體單元的寡核苷酸)雜合； 使用複數個引子擴增經雜合靶標核酸，以形成結合基板的擴增子簇； 使用經標記的核苷酸及聚合酶處理結合基板的擴增子簇，使得當核苷酸被聚合酶併入時產生可檢測的訊號；及檢測訊號，從而確定靶標核酸的核苷酸序列。
藉檢測在模板處或模板附近產生的信號，可以確定流體槽中存在的基板表面上的聚合物塗層所連接的一或多種聚核苷酸在每個流動步驟中併入的一個或多個聚核苷酸。一些實例中，可檢測的訊號包含光學訊號。其他實例中，可檢測的訊號包含非光學訊號。此種實例中，非光學信號包含在一或多個經定序的核酸處或附近的pH或電流的變化。
適當的定序方法包括，但不限於，合成定序、焦磷酸定序、接合酶定序及其他為所屬技術領域中習知的方法。
合成定序中，對與聚核苷酸聚合酶相關的模板聚核苷酸提供一或多個核苷酸。聚核苷酸聚合酶將一或多個核苷酸併入與聚核苷酸模板互補的新合成的核酸股。合成從寡核苷酸引子開始，該寡核苷酸引子與模板聚核苷酸的一部分或共價結合至至模板聚核苷酸至少一末端的通用或不可變核酸的一部分互補。當核苷酸併入模板聚核苷酸時，產生可檢測的訊號，從而容許確定在定序方法每一個步驟期間核苷酸已併入哪個核苷酸。以此方式，可以產生與模板聚核苷酸的至少一部分互補的核酸序列，從而允許確定模板聚核苷酸至少一部分的核苷酸序列。
可供本發明共聚物及基板使用的其他有用技術包括即時監控DNA聚合酶活性、併入核苷酸後檢測質子釋出的SBS技術(例如，Ion Torrent, Thermo Fisher)及基因表現分析。例如，可以經由帶有螢光團的聚合酶與γ-磷酸酯標記核苷酸之間的螢光共振能量轉移(FRET)交互作用或經由零模波導(ZMWs)以檢測核苷酸併入。使用RNA定序技術(諸如稱為數位RNA定序的技術)可以檢測或定量基因表現。使用諸如以上所述為所屬技術領域中習知的定序方法，可以進行RNA定序技術。也可以使用藉由與陣列直接雜交或藉由多重評鑑(multiplex assay)在陣列上檢測其產物的雜合技術檢測或定量基因表現。
要理解，本文所述的揭示內容的每一個態樣的任何各自特徵/實例可以任何適當組合一起實施，且此等態樣的任何一或多種任何特徵/實例可與本文所述其他態樣的任何特徵以任何適當組合一起實施。 另額的實施例
以下實施例更詳細地揭示另外的實施例，實施例不以任何方式限制申請專利範圍的範圍。
實施例1.  4-丙烯醯胺基-N-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丁醯胺
Figure 02_image215
步驟1.  (4-((6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)胺基)-4-側氧丁基)胺甲酸三級丁酯。對6-(疊氮基甲基)吡啶-3-胺及4-((三級丁氧基羰基)胺基)丁酸的溶液加入在極性溶劑(諸如二氯甲烷或DMF)中的適當醯胺偶合劑(諸如EDC/DMAP或EDC/HOBt)。在室溫下攪拌所得混合物。分離並純化產物。
步驟2.  4-胺基-N-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)丁醯胺。對來自步驟1的產物在二氯甲烷中的溶液加入TFA。所得混合物在室溫下攪拌以移除Boc基團。分離並純化產物。
步驟3.  使用丙烯醯氯及Et3 N處理步驟2的產物在二氯甲烷中的溶液，在室溫攪拌所得混合物。分離並純化產物。
實施例2.  5-丙烯醯胺基-N-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)戊醯胺。
Figure 02_image217
如實施例1所述製備標題化合物，使用5-((三級丁氧基羰基)胺基)戊酸取代4-((三級丁氧基羰基)胺基)丁酸。
實施例3.  5-丙烯醯胺基-N-(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)-C6-20 -烷基醯胺(z = 1、2、3、4、5、6、7或8)。
Figure 02_image219
如實施例1所述製備標題化合物，使用適當的酸取代取代4-((三級丁氧基羰基)胺基)丁酸。
實施例4.  N1 -(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)-N4-(2-甲基丙烯醯胺基乙基)琥珀醯亞胺。
Figure 02_image221
步驟1.  4-((6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)胺基)-4-側氧基丁酸。在室溫下攪拌6-(疊氮基甲基)吡啶-3-胺及琥珀酸酐於二氯甲烷中的溶液。分離並純化產物。
步驟2.  對步驟1產物於二氯甲烷或DMF中的溶液加入N-(2-胺基乙基)甲基丙烯醯胺及適當的醯胺偶合劑(諸如EDC/DMAP或EDC/HOBt)。所得混合物在室溫下攪拌。分離並純化產物。
實施例5.  N1 -(6-(疊氮基甲基)吡啶-3-基)-N4-(3-甲基丙烯醯胺基丙基)琥珀醯亞胺。
Figure 02_image223
如實施例4所述製備標題化合物，使用N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺取代N-(2-胺基乙基)甲基丙烯醯胺。
實施例6.
Figure 02_image020
步驟1. 用(PhO)2 PON3 (於二氯甲烷中)處理5-羥基甲基-L-脯胺酸的溶液，接著用含水氫氧化鈉(於甲醇中)處理，形成疊氮基化合物並經分離及純化。
步驟2. 用亞硫醯氯(於二氯甲烷中)處理步驟1的產物及經三級丁氧羰基(tBOC)保護的丁-1,4-二胺的溶液，在0ºC攪拌混合物1小時。然後，用三甲胺(於二氯甲烷中)處理混合物，並冷卻4小時。分離並純化產物。
步驟3.用適當的去保護劑諸如三氟乙酸(於二氯甲烷中)處理步驟2的產物。分離並純化產物。
步驟4. 在0ºC下用含水氫氧化鈉處理步驟3的產物及丙烯醯氯的溶液2小時，接著在室溫攪拌10小時。然後，用含水氫氯酸處理溶液，將pH調整至7。分離產物並純化為N-[3-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁基]-5-(疊氮基甲基)-2-吡咯啶。
實施例7
Figure 02_image018
步驟1. 用(PhO)2 PON3 (於二氯甲烷中)處理6-羥基甲基-菸酸甲酯的溶液，以形成疊氮基化合物，分離並純化。
步驟2. 用含水氫氧化鈉及乙醇處理步驟1的產物溶液，在室溫攪拌12小時。調整混合物pH至7。分離並純化產物。
步驟3.用亞硫醯氯(於二氯甲烷中)處理步驟2的產物及經三級丁氧羰基(tBOC)保護的丁-1,4-二胺的溶液，在0ºC攪拌混合物1小時。然後，用三甲胺(於二氯甲烷中)處理混合物，並冷卻4小時。分離並純化產物。
步驟4. 用適當的去保護劑諸如三氟乙酸(於二氯甲烷中)處理步驟3的產物。
步驟5.在0ºC下用含水氫氧化鈉處理步驟4的產物及丙烯醯氯的溶液2小時，將反應混合物的溫度提高至室溫，接著在室溫攪拌混合物10小時。然後，用含水氫氯酸處理溶液，將pH調整至7。分離產物並純化為N-[3-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁基]-6-(疊氮基甲基)-3-吡啶羧醯胺。
實施例8
Figure 02_image226
步驟1. 將適當的醯胺偶合劑(諸如TSTU及N,N-二異丙基乙基胺)(於DMF中)加入4-胺基苄基醇及t-Boc-N-醯胺基-PEG2-CH2 CO2 H的溶液。在室溫下攪拌所得混合物，且經BOC保護的醯胺經分離純化。
步驟2.用二苯基磷醯基疊氮化物及DBU (於DMF中)處理來自步驟1的產物，在室溫下攪拌所得混合物。
步驟3. 用適當的去保護劑諸如三氟乙酸(於二氯甲烷中)處理步驟2的產物使其去保護。
步驟4.用丙烯醯氯(於吡啶中)處理步驟3的產物的溶液，在4ºC攪拌所得混合物。產物經分離且純化為
Figure 02_image226
。
實施例9. 共聚物生成
實施例1 (2 – 50%)及丙烯醯胺的溶液在AIBN (或其他水溶性版本，例如Vazo 56)或KPS/TMED存在下，或在控制自由基聚合(CRP)條件(例如RAFT、ATRP、NMP)下聚合。
實施例10. 將共聚物固定至基板。
藉由旋塗，將本文所述的共聚物的溶液施用於降冰片烯矽烷衍生的基板表面。基板在60 °C培養1小時，使共聚物黏附至基板。
實施例11.  用寡核苷酸接枝共聚物
用炔官能化寡核苷酸、銅(I)催化劑及銅配位基(含水緩衝液中)處理如實施例9或實施例10所述共聚物。將混合物施用至基板表面(例如，流體槽通道)，培養基板，然後用緩衝液洗滌。與沒有雜環疊氮基單元(例如，烷基疊氮化物、苯基疊氮化物或苄基疊氮化物)的聚合物接枝相比，在較低銅承載量完成接枝。較低的銅承載量有利於容易製造(較低試劑毒性)、減少對接枝寡核苷酸的DNA受損、在下游擴增及定序方案期間減少銅存在以減少對模板核酸的損害、改善的接枝反應動力學及較溫和接枝條件，因為快速、無添加劑的反應在複雜的製造方法期間是有用的。
雖然以上敘述各種例示性，但是對於發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，在不偏離本發明可其中進行各種改變及修飾。所附申請專利範圍旨在涵蓋落入本發明的真實精神及範圍內的所有此類改變及修飾。
無
無
Figure 108145739-A0101-11-0002-1

Claims (70)

  1. 一種式(I)化合物，
    Figure 03_image001
    (I) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈具有2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； E為直鏈，其具有1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
    Figure 03_image004
    的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；且 Z為含氮雜環。
  2. 如請求項1之化合物，其中E為視需要經取代的C1-4 伸烷基。
  3. 如請求項1或2之化合物，其中該化合物為式(Ia)
    Figure 03_image006
    (Ia) 其中p為1、2、3或4。
  4. 如請求項1至3中任一項之化合物，其中該含氮雜環包含6員環。
  5. 如請求項4之化合物，其中A及E鍵結於該6員環的位置2及5。
  6. 如請求項1至3中任一項之化合物，其中該含氮雜環包含5員環。
  7. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該含氮雜環為芳香族。
  8. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該含氮雜環為飽和。
  9. 2、3、4、或5中任一項之化合物，其中該化合物為式(Ib) (Ib)
    Figure 03_image008
    其中X為CH或N。
  10. 2、3或6中任一項之化合物，其中該化合物為式(Ic)
    Figure 03_image010
    (Ic)。
    Figure 03_image012
    Figure 03_image012
  11. 如請求項1至10中任一項之化合物，其中該化合物為式(Id)
    Figure 03_image014
    (Id)。
  12. 如請求項1至10中任一項之化合物，其中該化合物為式(Ie)
    Figure 03_image016
    (Ie)。
  13. 如請求項1之化合物，其中該化合物為式(If)
    Figure 03_image018
    (If)。
  14. 如請求項1之化合物，其中該化合物為式(Ig)
    Figure 03_image020
    (Ig)。
  15. 如請求項1之化合物，其中該化合物為式(Ih)
    Figure 03_image022
    (Ih)。
  16. 如請求項1之化合物，其中該化合物為式(Ij)
    Figure 03_image024
    (Ij)。
  17. 2、3、4、5、7、9或11中任一項之化合物，其中該化合物為式(Ik)：
    Figure 03_image026
    (Ik) 其中X為CH或N。
  18. 如請求項17之化合物，其中該式(Ik)化合物為式(Im)化合物：
    Figure 03_image028
    (Im) 其中n為2至20的整數。
  19. 一種共聚物，其包含式(II)重複單體單元：
    Figure 03_image030
    (II) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈具有2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； E為直鏈，其具有1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
    Figure 03_image004
    的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基；且 Z為含氮雜環；以及 至少一個其他重複單體單元。
  20. 如請求項19之共聚物，其中該式(II)重複單體單元為式(IIa)重複單體單元
    Figure 03_image033
    (IIa) 其中p為1、2、3或4。
  21. 如請求項20之共聚物，其中該式(IIa)重複單體單元為式(IIb)、式(IIc)、式(IIe)或式(IIf)化合物：
    Figure 03_image035
    Figure 03_image037
    (IIb)                      (IIc)
    Figure 03_image235
    Figure 03_image236
    (IId)                     (IIe) 其中式(IIc)中的n為2至20的整數。
  22. 如請求項19至21中任一項之共聚物，其中該至少一個其他重複單體單元為式(III)化合物：
    Figure 03_image043
    (III) 其中 R4 為H或C1-4 烷基； R5 為H或C1-4 烷基；且 R6 為H或C1-4 烷基。
  23. 如請求項22之共聚物，其中該共聚物包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元。
  24. 一種基板-共聚物產物，其由如請求項19至23中任一項之共聚物與基板反應所形成。
  25. 如請求項24之基板-共聚物產物，其中該基板共聚物產物為該共聚物的疊氮基與該基板表面上的含烯基或炔基的基團反應所形成。
  26. 一種包含共價結合基板的共聚物的結構，其中該結合基板的共聚物包含共價結合基板的重複單體單元，其中該重複共價結合的單體單元為式(IV)化合物：
    Figure 03_image045
    (IV) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基組成； E為直鏈，其具有1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
    Figure 03_image004
    的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基； Z為含氮雜環；
    Figure 03_image047
    為單鍵或雙鍵；且 該三唑或三唑啉經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合該基板。
  27. 如請求項26之結構，其中該重複共價結合的單體單元為式(IVa)化合物：
    Figure 03_image049
    (IVa) 其中p為1、2、3或4。
  28. 如請求項26之結構，其中該重複共價結合的單體單元為式(V)化合物：
    Figure 03_image239
    (V) (V) 其中G為該三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
  29. 如請求項28之結構，其中該重複共價結合的單體單元為式(Va)化合物：
    Figure 03_image241
    (Va) 其中p為1、2、3或4。
  30. 如請求項27之結構，其中該重複共價結合的單體單元為式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)化合物：
    Figure 03_image055
    Figure 03_image057
    (IVb)                        (IVc)
    Figure 03_image243
    Figure 03_image244
    (IVd)                        (IVe) 其中 X為CH或N；且 式(IVc)中的n為2至20的整數。
  31. 如請求項26至30中任一項之結構，其中該重複共價結合的單體單元為式(Vb)、式(Vc)、式(Vd)或式(Ve)化合物：
    Figure 03_image245
    Figure 03_image247
    (Vb)                            (Vc)
    Figure 03_image249
    Figure 03_image251
    (Vd)                            (Ve) 其中G為該三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
  32. 一種共聚物-寡核苷酸產物，其由如請求項19至23中任一項之共聚物與一或多種寡核苷酸之間的反應形成。
  33. 如請求項32之共聚物-寡核苷酸產物，其中該共聚物寡核苷酸產物為由該共聚物的疊氮基與烯或炔官能化的寡核苷酸的反應形成。
  34. 一種寡核苷酸結合共聚物，其包含式(IV)寡核苷酸結合重複單體單元：
    Figure 03_image045
    (IV) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基組成； E為直鏈，其具有1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
    Figure 03_image004
    的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基； Z為含氮雜環；
    Figure 03_image047
    為單鍵或雙鍵；且 該共聚物經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合至該寡核苷酸。
  35. 如請求項34之寡核苷酸結合共聚物，其中該寡核苷酸結合重複單體單元為式(IVa)：
    Figure 03_image049
    (IVa) 其中p為1、2、3或4。
  36. 如請求項34之寡核苷酸結合共聚物，其中該寡核苷酸結合重複單體單元為式(VI)：
    Figure 03_image253
    (VI)。
  37. 如請求項36之寡核苷酸結合共聚物，其中該寡核苷酸結合重複單體單元為式(VIa)：
    Figure 03_image255
    (VIa) 其中p為1、2、3或4。
  38. 如請求項36之寡核苷酸結合共聚物，其中該寡核苷酸結合重複單體單元為式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)：
    Figure 03_image055
    Figure 03_image057
    (IVb)                        (IVc)
    Figure 03_image257
    Figure 03_image258
    (IVd)                        (IVe) 其中X為CH或N；p為1、2、3或4；且式(IVc)中的n為2至20的整數。
  39. 如請求項34至38中任一項之寡核苷酸結合共聚物，其中該寡核苷酸結合重複單體單元為式(VIb)、式(VIc)、式(VIa)或式(VIb)：
    Figure 03_image259
    (VIb)
    Figure 03_image261
    (VIc)
    Figure 03_image263
    (VId)
    Figure 03_image265
    (VIe) 其中X為CH或N；且式(IVc)中的n為2至20的整數。
  40. 一種共聚物-基板-寡核苷酸產物，其由如請求項19至23中任一項之共聚物與基板及一或多種寡核苷酸的反應形成。
  41. 一種將如請求項19至23中任一項之共聚物固定至基板的方法，其包含使該共聚物的疊氮基與該基板表面上複數個含烯基或炔基的官能基反應，以在該共聚物與該表面之間形成共價鍵。
  42. 一種將複數個寡核苷酸接枝至如請求項19至23中任一項之共聚物的方法，其包含使該共聚物的疊氮基與該複數個寡核苷酸反應。
  43. 如請求項42之方法，其中該複數個寡核苷酸包含烯基或炔基且該反應在該共聚物的疊氮基與該寡核苷酸的烯基或炔基之間發生。
  44. 一種製備式(I)化合物的方法，
    Figure 03_image001
    (I) 其包含使式(X)化合物與式(XI)丙烯酸酯反應：
    Figure 03_image087
    Figure 03_image089
    (X)                    (XI) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基組成； E為直鏈，其具有1至4個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子，以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基； A為具有式
    Figure 03_image004
    的N經取代的醯胺，其中R3 為H或C1-4 烷基； Z為含氮雜環；且 Hal為Cl或F， 以形成式(I)化合物。
  45. 一種製備式(Ik)化合物的方法，
    Figure 03_image091
    (Ik) 其包含使式(Xa)化合物：
    Figure 03_image093
    (Xa) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
    Figure 03_image089
    (XI) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基組成； p為1、2、3或4； X為CH或N；且 Hal為Cl或F，以形成式(Ik)化合物。
  46. 如請求項45之方法，其進一步包含使式(XII)化合物：
    Figure 03_image095
    (XII) 與式(XIII)化合物反應：
    Figure 03_image097
    (XIII) 其中 Pg為H或胺基保護基；且 Y為-OH或-Cl； 以形成式(Xa)化合物。
  47. 一種製備式(Ik)化合物的方法，其包含使式(XIV)化合物：
    Figure 03_image099
    (XIV) 其中Y為-OH或-Cl； 與式(XV)化合物反應：
    Figure 03_image101
    (XV) 以形成式(Ik)化合物
    Figure 03_image103
    (Ik) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； L為包含直鏈的連接子，該直鏈由6至8個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及任何氮原子上的取代基組成； p為1、2、3或4；且 X為CH或N。
  48. 如請求項47之方法，其進一步包含使式(XII)化合物與環酐反應以形成式(XIV)化合物。
  49. 一種式(Ik)化合物，
    Figure 03_image026
    (Ik) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； R3 為H或C1-4 烷基； X為CH或N； p為1、2、3或4；且 L為具有直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及氮原子上的取代基組成。
  50. 如請求項49之化合物，其中該式(Ik)化合物為式(Im)化合物：
    Figure 03_image028
    (Im) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； R3 為H或C1-4 烷基； X為CH或N； p為1、2、3或4；且 n為2至20的整數。
  51. 一種共聚物，其包含式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)重複單體單元：
    Figure 03_image035
    Figure 03_image037
    (IIb)                      (IIc)
    Figure 03_image270
    Figure 03_image271
    (IId)                      (IIe) 其中 R1 為H或C1-4 烷基； R2 為H或C1-4 烷基； R3 為H或C1-4 烷基； X為CH或N； p為1、2、3或4； 式(IIb)中的L為具有直鏈的連接子，該直鏈由2至20個選自由碳、氧及氮組成之群組的原子以及視需要的該鏈中碳原子及氮原子上的取代基組成；且 式(IIc)中的n為2至20的整數； 及至少一個其他重複單體單元。
  52. 如請求項51之共聚物，其包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元以及式(III)重複單體單元：
    Figure 03_image043
    (III) 其中 R4 為H或C1-4 烷基； R5 為H或C1-4 烷基；且 R6 為H或C1-4 烷基。
  53. 如請求項52之共聚物，其中該共聚物包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元、式(III)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元。
  54. 一種包含共聚物的基板，該共聚物包含式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式II(e)重複單體單元以及至少一個其他重複單體單元，其中該共聚物共價結合該基板。
  55. 如請求項54之基板，其中該共價連接為由式(IIb)、式(IIc)、式(IId)或式(IIe)單體單元的疊氮基與該基板表面上含烯基或炔基的基團的反應所形成。
  56. 如請求項54之基板，其中該結合基板的共聚物進一步包含共價結合基板的重複單體單元，其中該重複共價結合的單體單元由式(IVb)、式(IVc)、式(IVd)或式(IVe)代表：
    Figure 03_image055
    Figure 03_image057
    (IVb)                        (IVc)
    Figure 03_image272
    Figure 03_image273
    (IVd)                        (IVe) 其中R1 、R2 、R3 、L、p、及n如本文定義，
    Figure 03_image047
    為單鍵或雙鍵，且該三唑或三唑啉經由一個或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合該基板。
  57. 如請求項56之基板，其中該共聚物包含由式(Vb)、(Vc)、(Vd)或(Ve)代表的重複結合基板的單體單元：
    Figure 03_image274
    Figure 03_image276
    (Vb)                            (Vc)
    Figure 03_image278
    Figure 03_image280
    (Vd)                            (Ve) 其中G為該三唑/三唑啉環與該基板之間的連接子。
  58. 如請求項51之共聚物，其中該共聚物共價結合至寡核苷酸。
  59. 如請求項58之共聚物，其中該寡核苷酸經由式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的疊氮基與烯或炔官能化寡核苷酸的反應共價結合該共聚物。
  60. 如請求項59之共聚物，其中該結合寡核苷酸的共聚物包含式(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)重複單體單元，其中R1 、R2 、R3 、L、p及n如本文定義，
    Figure 03_image047
    為單鍵或雙鍵且該共聚物經由一或二個三唑/三唑啉環碳原子直接或經由連接子間接共價結合該寡核苷酸。
  61. 如請求項60之共聚物，其包含式(VIb)、(VIc)、(VId)或VI(e)結合寡核苷酸的重複單體單元：
    Figure 03_image282
    Figure 03_image284
    (VIb)                            (VIc)
    Figure 03_image286
    Figure 03_image288
    (VId)                            (VIe) 其中該等變項皆如本文定義。
  62. 如請求項51之共聚物，其中該共聚物共價結合基板且共價結合寡核苷酸。
  63. 如請求項62之共聚物，其中該共聚物包含式(Vb)、式(VIc)、式(VId)及式(VIe)之一或多者的重複單體單元。
  64. 一種將包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的共聚物固定至基板的方法，其包含使包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的共聚物的疊氮基與複數個該基板表面上含烯基或炔基官能基反應，以在該共聚物與該表面之間形成共價鍵。
  65. 一種將複數個寡核苷酸接枝至包含式(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)重複單體單元的共聚物的方法，其包含使該共聚物的疊氮基與該寡核苷酸反應。
  66. 如請求項65之方法，該寡核苷酸包含烯基或炔基且該反應在該共聚物的疊氮基與該寡核苷酸之間發生。
  67. 一種製備式(Ik)化合物的方法，
    Figure 03_image091
    (Ik) 包含使式(Xa)化合物：
    Figure 03_image093
    (Xa) 與式(XI)丙烯酸酯反應：
    Figure 03_image089
    (XI) 其中R1 、R2 、R3 、L、p及X如本文定義且Hal為Cl或F， 以形成式(Ik)化合物。
  68. 如請求項67之方法，其進一步包含使式(XII)化合物：
    Figure 03_image095
    (XII) 其中p、R3 及X如本文定義； 與式(XIII)化合物反應：
    Figure 03_image097
    (XIII) 其中 Pg為H或胺基保護基；且 Y為-OH或-Cl； 以形成式(Xa)化合物。
  69. 一種製備式(Ik)化合物的方法，其包含使式(XIV)化合物：
    Figure 03_image099
    (XIV) 其中Y為-OH或-Cl； 與式(XV)化合物反應：
    Figure 03_image101
    (XV) 以形成式(Ik)化合物。
  70. 如請求項69之方法，其進一步包含使式(XII)化合物與環酐反應，以形成式(XIV)化合物。
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