TW202024333A - 人源抗腸病毒７１型單株抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明為一種人源抗腸病毒71型單株抗體，透過獲得被腸病毒71型自然感染之人類病患週邊血液，篩選因感染而誘發產生的腸病毒71型特異性免疫球蛋白G分泌的B細胞，接著選殖B細胞的免疫球蛋白G可變區基因，並轉染到人類細胞株中表現，從而獲得人源抗腸病毒71型單株抗體，利用上述人源抗腸病毒71型單株抗體能專一且強效地中和多種基因亞型的腸病毒71型，特別是那些近年在台灣及中國盛行的腸病毒71型基因亞型B4、C4及B5。
Description
本發明為一種單株抗體，尤指一種人源抗腸病毒71型單株抗體。
有效的抗體保護水平是對抗腸病毒71型的重要免疫關鍵，然而，目前對於人類於自然感染腸病毒71型後所誘發產生的抗體專一性和功能特性的瞭解相當有限。
腸病毒71型(EV71)是一種無外套膜單股RNA為遺傳物質之病毒，也是導致歐洲和亞太平洋區的兒童手口足症及皰疹性咽峽炎的主要病原。爆發腸病毒71型疫情時，可能出現侵犯中樞神經之無菌性腦膜炎、似小兒麻痺神經病症、腦炎伴隨心肺衰竭、甚至是死亡的個案。2011年，越南爆發嚴重疫情，導致174,67感染個案及200個死亡病例。2012年在中國的疫情，有超過兩百萬病例及數以百計的死亡案例。2016年，西班牙的疫情有109個確診嚴重病例。儘管腸病毒71型的疫情是如此嚴重，在仍發生疫情的多數國家，都還沒有核准上市的疫苗和特定的治療方法可用來對抗腸病毒71型。
腸病毒71型大約每2-3年在流行地區會爆發疫情，有時過去出現過的基因亞型會再度出現，有時會有新的基因亞型出現，取代過去流行的基因亞型。由過去腸病毒71型疫情的病毒株可發現，高突變率和遺傳
重組率是腸病毒71型的特性之一，曾多次發現腸病毒71型具有基因重組現象，這重組可在同基因型與異基因型之間發生基因交換。
腸病毒71型新病毒株或新基因型別的出現，可能是在宿主免疫的壓力下，突變的病毒因得以躲避宿主免疫系統的攻擊而具有生存優勢，並因此感染更多人。台灣於1998年爆發腸病毒71型基因亞型C2的感染時，約有12萬以上的被感染個案，並導致了78個死亡病例。經過族群血清學分析，結果顯示，缺乏保護抗體是兒童族群高感染率和高重症風險的主要原因之一。在2012年泰國爆發腸病毒71型基因亞型B5之疫情分析，也有類似研究結果。
另外，研究顯示在一些腸病毒71型感染的小孩中，儘管其抗體反應表現出跨基因亞型的中和效價，但對某些基因亞型其中和效價甚低，或是所產生的抗體對某些基因亞型特別具有偏差性。過去許多研究也顯示，宿主的中和抗體促使了病毒的演化。最近的研究顯示，小鼠感染腸病毒71型後所產生的抗腸病毒71型單株抗體群中，也存在著對不同病毒株或不同基因分型株之的辨識歧異度。然而，我們目前對於人類抗腸病毒71型中和抗體的抗原辨識內容仍不清楚，該議題對於疫苗設計以及未來利用疫苗控制疫情的政策，有著極重要的關聯性。越來越多的證據顯示，現行開發的腸病毒71型疫苗仍不能交叉保護所有盛行的基因分型及病毒株。
腸病毒71型的蛋白質外殼是由其4個基因產物VP1-4所組成的。VP1、VP2和VP3表現在病毒外殼的外側，而VP4則深埋在內側。利用小鼠單株抗體，可標定出數個腸病毒71型的線性抗原中和決定位(linear neutralizing epitope)，例如在VP1的GH迴路(第215-220胺基酸序列)上、在VP2
的EF迴路(第141-146胺基酸序列)上、及在VP3的Knob區域。研究也顯示小鼠單株抗體可以辨識特定腸病毒71型病毒株的抗體決定位(位於VP1的第145個胺基酸)。無論如何，小鼠單株抗體的腸病毒71型抗原辨識內容無法代表人類兒童體內強效對抗腸病毒71型抗體的抗原辨識內容。至少到目前為止，尚未有任何來自急性腸病毒71型感染下人類所產生的單株抗體，與該抗體所辨識的(中和)抗原決定位被詳細的報導。
一般在腸病毒71型急性感染的兒童病患體內，在感染的第一週時，腸病毒71型特異性的免疫球蛋白G分泌B細胞(plasmablasts)會被大量誘發出來，該抗體分泌細胞反應的高峰期是在臨床病徵出現後的第4-7天。此外，研究還發現感染後的血清反應內容具有交叉對抗腸病毒71型基因型B和C的中和效價，然而有些感染後血清，有著相對較低的抗腸病毒71型基因型C的抗體效價。
現有技術係單株抗體是源自BALB/c小鼠，經由去活化腸病毒71型基因亞型C4疫苗施打後，再經雜交瘤細胞株融合技術所產生之單株抗體，而雜交瘤細胞株融合技術所產生之小鼠單株抗體只針對腸病毒71型基因亞型C4，且其抗原只有單一標的，並未包含其他在台灣及中國流行的腸病毒71型基因亞型B4及B5。
目前也有技術選殖抗腸病毒71型的抗體表現基因於酵母菌載體中，並表現及純化在酵母菌所生產的單株抗體，又或者藉由合成腸病毒71型VP1胜肽來免疫小鼠後，選殖其中VP1特異性的抗體免疫基因，並表現於人源化細胞中，生產此基因產物的單株抗體，但該單株抗體的重鏈和輕鏈可變區部分仍是鼠源，此外，鼠源抗體在人體內的效果並不佳，鼠源
單株抗體亦無清楚標示其作用在腸病毒71型的抗原決定位(epitope)區域。
本發明提供一種人源抗腸病毒71型單株抗體，人源抗腸病毒71型單株抗體係按照如下方法改造而成：(1)從已感染腸病毒71型的人類樣本血液中，分離出腸病毒71型特異性的免疫球蛋白G分泌B細胞；(2)選殖上述免疫球蛋白G分泌B細胞的免疫球蛋白可變區基因進行重組克隆，再將上述重組克隆的免疫球蛋白G基因轉染至HEK293T人類細胞株中，表達免疫球蛋白G並純化，即可獲得人源抗腸病毒71型單株抗體。
上述人源抗腸病毒71型單株抗體，係選殖自感染腸病毒71型病患之免疫球蛋白G人類B細胞免疫球蛋白可變區基因；上述抗體可變區基因重鏈及相對應輕鏈表達序列為16-2-8C(重鏈SEQ ID NO：2，輕鏈SEQ ID NO：14)、16-2-9D(重鏈SEQ ID NO：3，輕鏈SEQ ID NO：15)或16-2-12D(重鏈SEQ ID NO：6，輕鏈SEQ ID NO：18)。
本發明的優點在於：
(1)本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體是人源抗體，透過腸病毒71型感染後所誘發的人類B細胞所源生的單株抗體，相較於現有鼠源單株抗體，其中和能力強10-100倍。
(2)本發明所製造出的人源抗腸病毒71型單株抗體，能專一且強效地對抗不同基因亞型的腸病毒71型，例如在中國及台灣主要流行的基因亞型B4、B5、C4等病毒株。
(3)本發明利用篩選抗體逃脫突變株(escape mutant selection)的技術，對本發明的12個人源抗腸病毒71型單株抗體作用在腸病毒
71型外殼結構上的抗原決定位已進行分析。人源抗腸病毒71型單株抗體原本具有中和腸病毒71型的能力，而卻對該逃脫病毒株失去中和能力的現象，說明了該逃脫病毒株在被人源抗腸病毒71型單株抗體攻擊的外殼特定區域上發生了突變，透過定序以及與母株病毒比對，能夠定義出逃脫病毒外殼基因的關鍵突變點。以此方式能明確標示出12個人源抗腸病毒71型單株抗體所專一性攻擊(中和)病毒的特定區域。
(4)透過本發明能繪製人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識之病毒外殼抗原決定位圖譜，包括峽谷北部邊緣區(canyon northern rim)、峽谷底部區(canyon floor)、峽谷南部邊緣區(canyon southern rim)、3倍軸高原區(3-fold plateau)、以及2倍軸高原區(2-fold plateau)等五大區域。本發明之12株人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識之抗原決定位，在不同基因型別間相當保守，顯示本發明之12株人源抗腸病毒71型單株抗體具備辨識腸病毒71型的廣泛性與交叉互補性；在小鼠腦內攻毒感染腸病毒71型的動物模型顯示，人源抗腸病毒71型單株抗體16-2-9D(辨識峽谷底部區)和17-2-2B(辨識峽谷邊緣區)可以強效防止腸病毒71型基因亞型B5和C4腦內感染小鼠後所引起的神經病變與成長遲緩。
(5)本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體的基因可選殖至大腸桿菌的載體或其他宿主細胞中，達到便利基因序列的分析、改造及永久保存。
(6)本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體可根據腸病毒71型基因亞型B4、B5或C4進行針對性試劑盒、試劑或藥劑的製造，上述試劑盒、試劑或藥劑可以中和腸病毒腸病毒71型基因亞型B4、B5或C4。
(7)本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體可製成一種檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒是由酶聯免疫吸附測定分析法、免疫沉澱法或西方墨點法驗證是否感染腸病毒71型。
(8)可驗證所製成的人源抗腸病毒71型單株抗體在活體內專一性保護對抗腸病毒71型的能力，方法如下：(a)將複數小鼠以腦內攻毒感染腸病毒71型；(b)將上述的小鼠分為兩半，分別命名為對照組與實驗組，實驗組施打人源抗腸病毒71型單株抗體，對照組則施打同體積的緩衝液；(c)經過2~5天後，對照組相較於實驗組會明顯產生嚴重運動失能的神經學症狀，因此可證實施打人源抗腸病毒71型單株抗體可顯著地保護小鼠免於腸病毒71型感染所發生的運動失能。
圖1係為本發明製造人源抗腸病毒71型單株抗體之流程方塊圖
圖2係為本發明就人源抗腸病毒71型單株抗體對來自1998至2016年的腸病毒71型臨床株的中和反應；*人源抗腸病毒71型單株抗體(representative mAb)完全中和病毒的最低濃度符號如下所示：++++：<100ng/ml；+++：0.1-1μg/ml；++：1-10μg/ml；+：10-50μg/ml；-：無中和能力；對照組#：採用無中和能力之的人源抗腸病毒71型單株抗體，17-1-10B和16-2-1A，與腸病毒71型感染後人類血清做為對照組。
圖3係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體免疫沉澱病毒外殼蛋白質；未感染的RD細胞培養上清液做為抗原控制組(mock)，人源抗流感病毒單株抗體2-12C作為抗體對照組。
圖4係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識之病毒外殼關鍵氨基酸位點。該位點在各基因型(包括A,B1,B2,B3,B4,B5,C1,C2,C3,C4和C5)腸病毒71型之間保守存在。
圖5A係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識之病毒外殼關鍵氨基酸位點，依據RCSB Protein Data Bank 3ZFF和3VBS的腸病毒71型外殼結構所繪製的抗原決定基圖譜。該圖係使用PyMOL，繪製出病毒外殼側面卡通圖。外殼蛋白質VP1：黑色；VP2：灰色；VP3：白色。數字代表意義分別為5意思為5倍軸；3意思為三倍軸；2意思為2倍軸。
圖5B係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識之病毒外殼關鍵氨基酸位點，依據RCSB Protein Data Bank 3ZFF和3VBS的腸病毒71型外殼結構所繪製的抗原決定基圖譜。該圖係使用PyMOL，繪製出5倍頂點區做為中心之五聚體表面視圖。外殼蛋白質VP1：黑色；VP2：灰色；VP3：白色。數字代表意義分別為5意思為5倍軸；3意思為三倍軸；2意思為2倍軸。
圖6A係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體的活體內保護能力。兩週大之hSCARB2品系小鼠在感染腸病毒71型後0至14天內依指示的時間，量測小鼠的運動失能分數(motor deficit scores)，運動失能的表現則可依據嚴重度區分為7級。從第一級的失能開始，每增加一級，代表其失能的嚴重度增加一級。因此，一個更高的數字，則代表其運動失能的程度越嚴重。星號顯示在有給予和沒有給予人源抗腸病毒71型單株抗體的腸病毒71型感染上，具有顯著性差異。正立三角形、倒立三角形代表：[腸病毒71型12-96015+緩衝液PBS]v.s.[腸病毒71型12-96015+人源抗腸病毒71型單株抗體]。灰色正方形、灰色圓形代表：[腸病毒71型11-96023+緩衝液PBS]v.s.[腸病毒71型
11-96023+人源抗腸病毒71型單株抗體]。*：P 
0.05；**：P 
0.01；***：P 
0.001)。縮寫的d.p.i.；days post-infection。
圖6B係為本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體的活體內保護能力。兩週大之hSCARB2品系小鼠在感染腸病毒71型後，0至14天內依指示的時間，量測小鼠的體重。誤差線代表均值的標準誤差。星號顯示在有與沒有人源抗腸病毒71型單株抗體的腸病毒71型感染上，具有顯著性差異。正立三角形、倒立三角形代表：[腸病毒71型12-96015+緩衝液PBS]v.s.[腸病毒71型12-96015+人源抗腸病毒71型單株抗體]。灰色正方形、灰色圓形代表：[腸病毒71型11-96023+緩衝液PBS]v.s.[腸病毒71型11-96023+人源抗腸病毒71型單株抗體]。*：P 
0.05；**：P 
0.01；***：P 
0.001)。縮寫的d.p.i.；days post-infection。
參閱圖1，本發明係揭露一種人源抗腸病毒71型單株抗體的製法，按照如下方法改造而成：
(1)從經實驗室確診為腸病毒71型感染的患者中，採收患者的外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。首先標記PBMCs(細胞數：1×106)中的Plasmablast B細胞，可以使用細胞表面標記抗體來標記，包括PB anti-CD3(5μg/ml，UCHT1克隆，Becton，Dickinson and Company，美國)、FITC anti-CD19(1：10稀釋，使用於100μL實驗樣本中，HIB19克隆，Becton，Dickinson and Company，美國)、PE-Cy7 anti-CD27(1：20稀釋，使用於100μL實驗樣本中，M-T271克隆，Becton，Dickinson and Company，美國)、APC-H7 anti-CD20(5μg/ml，
L27克隆，Becton，Dickinson and Company，美國)，和PE-Cy5 anti-CD38(1：10稀釋，使用於100μL實驗樣本中，HIT2克隆，Becton，Dickinson and Company，美國)，再藉由流式細胞儀(flow cytometry)方法，確認和篩選Plasmablast B細胞並收集單一細胞至96-孔微量多孔盤。
(2)之後，分別將單一Plasmablast B細胞的免疫球蛋白G重鏈與輕鏈的可變區域基因選殖於免疫球蛋白G重鏈表達載體(IgG-AbVec表現載體[FJ475055])與kappa或lambda免疫球蛋白游離輕鏈表達載體(Igκ-AbVec表現載體[FJ475056]或Igλ-AbVec表現載體[FJ517647])，並將所選殖的重鏈和輕鏈基因載體克隆轉染(transfection)到293T細胞株(ATCC編號：ATCC CRL-3216)中，再利用無血清培養系統表達單株抗體。培養5天後，以離心的方法(400g[重力]、室溫、10分鐘)去除細胞殘骸，收集上層清液，即可獲得含有基因表達後所分泌到細胞外的重組人源抗腸病毒71型單株抗體。
來自被腸病毒71型感染的患者所提供的Plasmablast B細胞，在本次實驗中共獲得了191株的人源抗腸病毒71型單株抗體。藉由酶聯免疫吸附測定分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法，以連續稀釋已知濃度的人類免疫球蛋白所製作成的標準曲線，可估算上層清液中人源抗腸病毒71型單株抗體的相對濃度。此人源抗腸病毒71型單株抗體的抗原專一性辨識能力(或效價)，將由抗原結合測試分析與中和試驗等方法來測定。在本發明的實驗中，共有84株人源抗腸病毒71型單株抗體能專一性辨識病毒外殼，從圖2中可看出這些人源抗腸病毒71型單株抗體能夠免疫沉澱病毒外殼蛋白質，但不能辨識變性的蛋白質。這些結果表明，
本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體，主要係專一性地辨識病毒外殼的構性抗原結構，以下將會分別逐一介紹。
本發明實驗中所使用的病毒：
用於測試人源抗腸病毒71型單株抗體結合或中和病毒能力的實驗：來自1998至2016年所分離的腸病毒71型臨床病毒株(包括98-2086、98-4215、99-1691、99-3351、00-2278、01-1437、02-2792、03-70576、04-72232、05-1956、07-72043、08-96016、10-96018、11-96023、12-96015、14-51389、15-921、16-50444和16-50555)。
實驗控制組中所需的病毒：其它類型的腸病毒，包括12-50891(柯薩基病毒A2)，14-2060(柯薩奇病毒A16)，15-50909(柯薩奇病毒A16)和14-2795(腸病毒D68)。
操作：腸病毒71型或其它腸病毒的培養，使用一般常用的腸病毒生長培養基(Dulbecco's Modified Eagles Medium[DMEM]/2%的胎牛血清/青黴素100μg/ml和鏈黴素100μg/ml)與RD細胞(ATCC編號：ATCC CCL-136)，細胞將因病毒大量繁殖而產生細胞病變(cytopathic effect，CPE)，此時再經反覆結凍和解凍各三次後，以離心的方法(400g、室溫、10分鐘)去除細胞殘骸，並收集病毒存在之上清液。另一方面，針對12-96015和11-96023這兩個腸病毒71型，此處使用RD細胞生產大量的純化病毒液。為了收集上層清液中的病毒顆粒，加入NaCl(sodium chloride，250mM)和PEG 6000(10% polyethylene glycol，Sigma®，美國)後，於4℃處理12至16小時，再以高速離心法(100,000g、5小時)，沉澱病毒顆粒。以PBS(內含0.01% Triton X-100和10% protease inhibitor mixture[Roche，瑞士])回
溶含病毒顆粒的沉澱物。之後，加入RNase-free DNase(0.05mg/ml，RQ1，Promega，美國)於37℃處理30分鐘，以去除殘留的DNA；再添加EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，10mM)來停止反應。為了進一步純化病毒，則是利用10-35%酒石酸鉀梯度(potassium tartrate gradient[10-35%，w/v])溶在250mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，250mM NaCl[pH 7.5])中，以超高速離心法(159,382g、4℃、2小時)純化。最後，病毒濃度則是以BCA蛋白質分析試劑(The Thermo Scientific PierceTM BCA Protein Assay Kit，Thermo Fisher Scientific，美國)來估算。對於病毒上清液和純化病毒液，使用Reed-Muench方法，以RD細胞測定可造成50%培養組織感染的病毒效價(50% tissue culture infective dose，TCID50)。
所有用於實驗中的腸病毒71型，檢測其病毒外殼蛋白質VP1、VP2、VP3和VP4的基因序列(P1基因區域)，即使用特定的引子，以聚合酶鏈連鎖反應放大腸病毒71型的P1區域，並定序該區域。
針對基因型B的腸病毒71型病毒株：
VP1_F：GCGGCGGCCCAGAAGAA、VP1_R：GAGGTTTGCCCAGTCGTTA；
VP2_F：ACAGAGCCTCAAACAAGAC，VP2_R：GAAATTTGGGAGAATGGGTGC；
VP3_F：TTTGACCAAGGGGCAACCC，VP3_R：GTCCTGTGGGTGCCGGCAG；
VP4_F：ATCCGGTGTGCAATAGAGC，VP4_R：
CATTCACCATAACCGACTATG。
針對基因型C的腸病毒71型病毒株：
VP1_F：GCGGCAGCCCAAAAGAA，VP1_R：AAGATTTGCCCAATCATTGTG；
VP2_F：ACAGAGTCTCAAGCAGGAT，VP2_R：GAAGTTTGGTAGAATAGGTGC；
VP3_F：TACGACCAAGGAGCGACGC，VP3_R：CTGTGGGTGCTGGTAGAGC；
VP4_F：ATCCGGTGTGCAACAGAGC，VP4_R：CACTCACCATAACCGACTATG。
結果：本實驗中的84株可以專一性辨識腸病毒71型的人源抗腸病毒71型單株抗體中，有38株具有強效地中和腸病毒71型的能力。而這些病毒中和人源抗腸病毒71型單株抗體，依據其重鏈和輕鏈可變區域(VDJ和VJ)的蛋白質編碼序列分析，則可以區分為12群。因此，進一步分析這12個代表性病毒中和人源抗腸病毒71型單株抗體的特性。所述人源抗腸病毒71型單株抗體分別是16-3-10B[重鏈SEQ ID NO：1，輕鏈SEQ ID NO：13]、16-2-8C[重鏈SEQ ID NO：2，輕鏈SEQ ID NO：14]、16-2-9D[重鏈SEQ ID NO：3，輕鏈SEQ ID NO：15]、16-2-11B[重鏈SEQ ID NO：4，輕鏈SEQ ID NO：16]、17-2-2B[重鏈SEQ ID NO：5，輕鏈SEQ ID NO：17]、16-2-12D[重鏈SEQ ID NO：6，輕鏈SEQ ID NO：18]、16-3-3C[重鏈SEQ ID NO：7，輕鏈SEQ ID NO：19]、16-2-2D[重鏈SEQ ID NO：8，輕鏈SEQ ID NO：20]、17-1-12A[重鏈SEQ ID NO：9，輕鏈SEQ ID NO：21]、34-1-6D[重鏈SEQ ID
NO：10，輕鏈SEQ ID NO：22]、16-3-4D[重鏈SEQ ID NO：11，輕鏈SEQ ID NO：23]及17-2-12A[重鏈SEQ ID NO：12，輕鏈SEQ ID NO：24]，上述12個代表性人源抗腸病毒71型單株抗體，其序列都已經存入基因庫中(編碼：KY354551-KY354562，以及KY354565-KY354576)。
圖2中，為了分析代表性人源抗腸病毒71型單株抗體辨識不同基因亞型腸病毒71型的廣度，來自1998至2016年所分離的不同基因亞型腸病毒71型臨床株被納入中和試驗測試。發現其中的10株(16-3-10B,16-2-8C,16-2-11B,17-2-2B,16-2-9D,16-2-12D,16-3-3C,16-2-2D,34-1-6D，和17-1-12A)能廣泛且強效地中和多種基因亞型的腸病毒71型，包括基因型B(含B4和B5)和C(含C1,C4和C5)。但上述人源抗腸病毒71型單株抗體對抗基因亞型C2的腸病毒71型時，其效果較差，即使濃度高達50μg/ml仍無法有效中和病毒。值得注意的是，有六株人源抗腸病毒71型單株抗體(16-3-10B,16-2-8C,16-2-11B,17-2-2B,16-2-9D，和16-2-12D)在低濃度(<1μg/ml)時，對腸病毒71型基因亞型B4、B5和C4仍有很強的中和作用；尤其16-3-10B和16-2-8C在更低濃度下(<100ng/ml)仍有超強的中和作用，換言之，16-3-10B和16-2-8C相較於其他10種人源抗腸病毒71型單株抗體具有更優異的保護能力。另外還發現，人源抗腸病毒71型單株抗體16-3-4D和17-2-12A通常只能對抗基因型B的腸病毒71型，而且需要較高的濃度(>10μg/ml)，才有中和病毒的效果。
本發明實驗使用流式細胞儀(flow cytometry)為基礎之結合測試分析法：
本發明實驗以流速細胞儀測試本發明的人源抗腸病毒71型
單株抗體與腸病毒71型抗原結合的分析方法如下：
第一天，將適當量的腸病毒71型感染RD細胞。
第二天，收集、清洗和回溶這些細胞。再以新鮮配製的2%甲醛(formaldehyde)固定細胞(10分鐘、37℃)和以0.1% Triton X-100(15分鐘、37℃)通透化(permeabilizing)細胞。而後以皂苷(sapoinin)-3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)將背景區域覆蓋。這些細胞樣本再以一級抗體和二級抗體作用。其中一級抗體包括本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體(5μg/ml，稀釋在BD Perm/WashTM buffer緩衝溶液[Thermo Fisher Scientific，美國])，或腸病毒71型感染後人類血清(1：125稀釋在BD Perm/WashTM buffer緩衝溶液[Thermo Fisher Scientific，美國])，以及鼠源抗腸病毒71型3C單株抗體(1μg/ml，anti-Enterovirus 71 3C antibody，GeneTex，美國)。二級抗體則是含有螢光(fluorescence)共軛標定的山羊源抗人類免疫球蛋白G抗體(2.5μg/ml)，或是山羊源抗鼠類免疫球蛋白G抗體(1.5μg/ml，Thermo Fisher Scientific，美國)。利用BD FACSCantoTM II流式細胞分析儀分析這些被一級抗體和二級抗體作用的細胞，即分析10,000個收集的腸病毒71型感染(腸病毒71型3C陽性)細胞事件中，人源抗腸病毒71型單株抗體所辨識的細胞百分比。實施該結合測試分析法時，未被感染的RD細胞作為抗原對照組，此外，人源抗流感病毒單株抗體2-12C，和鼠源抗腸病毒71型VP2單株抗體MAB979(EMD Millipore，德國)當作每次實驗的抗體對照組。
本發明實驗使用酶聯免疫吸附測定分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay)：
本發明實驗先將純化的腸病毒71型吸附在96-孔微量多孔盤。為避免非特異性結合的反應，以3%牛血清白蛋白將背景區域加以覆蓋。加入一級抗體，包括人源抗腸病毒71型單株抗體上清液(5μg/ml)、純化人源抗腸病毒71型單株抗體(5μg/ml)、或腸病毒71型感染後人類血清(1：125稀釋)，而這些與吸附的病毒相結合的人源抗腸病毒71型單株抗體，則可以帶有山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP，Invitrogen，美國)共軛連結的抗免疫球蛋白G抗體(0.5μg/ml，Rockland，美國)當作二級抗體來檢測，連結上的二級抗體則以3',3',5',5',-四甲基聯苯胺顯色試劑(TMB substrate reagent，BD Biosciences，美國)與之反應，之後以2M硫酸終止反應，並取得每一個實驗樣本的複孔吸光(OD450減去OD570)取平均值。PBS、人源抗流感病毒單株抗體2-12C、和鼠源抗腸病毒71型VP2單株抗體MAB979(EMD Millipore，德國)當作每次實驗的一級抗體對照組。
在判定結果之前，所有樣本和陽性對照組MAB979的吸光平均值必須進行校正，校正的吸光值等於樣本和陽性對照組MAB979減去陰性對照組2-12C，其差大於或等於0.30者，判定人源抗腸病毒71型單株抗體樣本對該腸病毒71型的結合能力為陽性。
本發明實驗使用免疫沉澱(immunoprecipitation)和西方墨點(Western blotting)分析法：
免疫沉澱分析法是利用磁珠共軛連結的蛋白質G(Dynabeads®，Thermo Fisher Scientific，美國)可以將免疫球蛋白G類的抗體牢牢地抓住，以利沉澱磁珠的同時帶上本發明所要測試的人源抗腸病毒71型單株抗體，而此人源抗腸病毒71型單株抗體又可以專一性地結合所要
測試的腸病毒71型。之後依據Dynabeads®的標準方法解離(eluate)出磁珠上所結合的人源抗腸病毒71型單株抗體和人源抗腸病毒71型單株抗體所專一結合的腸病毒71型抗原複合洗出物。再透過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析洗出物所含的蛋白質，並以銀染色法(Pierce Silver Stain Kit，Thermo Fisher Scientific，美國)染出在膠體上的蛋白質帶。並以免疫印跡法檢測膠體中所含的被人源抗腸病毒71型單株抗體專一性結合之腸病毒71型抗原。圖3係利用鼠源抗腸病毒71型VP2單株抗體MAB979(1：1000稀釋，EMD Millipore，德國)和鼠源抗腸病毒71型VP1單株抗體MAB1255-M05(1：1000稀釋，Abnova，台灣)當作一級抗體，接著利用HRP共軛連結的山羊源抗鼠類免疫球蛋白G抗體(1：5000稀釋，Thermo Fisher Scientific，美國)做為二級抗體。之後，以受質化學冷光法(Pierce enhanced chemiluminescence western blotting substrate，Thermo Fisher Scientific，美國)來偵測腸病毒71型的外殼蛋白質。腸病毒71型12-96025感染RD細胞後所收集的病毒上清液作為抗原，用來與本發明之人源抗腸病毒71型單株抗體反應，以進行免疫沉澱。其中未感染的RD細胞培養上清液做為抗原控制組(mock)，人源抗流感病毒單株抗體2-12C作為抗體對照組。
本發明實驗使用的中和試驗(Neutralization assay)：
原理：使用人源抗腸病毒71型單株抗體上清液、純化過的人源抗腸病毒71型單株抗體、和對照組血清等樣本進行中和試驗，以確認本發明的人源抗腸病毒71型單株抗體是否可以中和腸病毒71型臨床株、或腸病毒71型逃脫株感染RD細胞。
血清樣本會預先在56℃處理30分鐘。然後，在96孔盤中製備人源抗腸病毒71型單株抗體(50μl)與等量的病毒(100 TCID50，50μl)的混合液(每孔洞共100μl)，並於37℃作用2小時。接著，加入100μl內含8×104個RD細胞的懸浮液，在37℃培養5天。每一次實驗的設置，均包括細胞控制組、感染後血清控制組和病毒連續稀釋組，每個樣本均設有三重複。感染反應結束時，則利用5%戊二醛(glutaraldehyde)固定細胞和0.1%結晶紫染色細胞。觀察能完全抑制細胞病變發生的人源抗腸病毒71型單株抗體最低濃度，且於三重複序列稀釋下達到一致結果者，決定最低中和濃度。
本發明實驗中的腸病毒71型病毒逃脫株的產生：
為了要分析中和人源抗腸病毒71型單株抗體所專一性辨識位於腸病毒71型外殼蛋白上的抗原決定基，實驗中利用兩株腸病毒71型12-96015的基因亞型B5(在基因庫[https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]中所登記的序號：KX267854)和11-96023的基因亞型C4(基因庫中所登記的序號：KX267855)，做為篩選逃脫病毒突變株的母株病毒，將其分別與本發明產生的人源抗腸病毒71型單株抗體作用1小時，然後接種至單層RD細胞。接種過的細胞在37℃培養4天後，與以反覆結凍和解凍各三次後，以離心的方法(400g、室溫、10分鐘)去除細胞殘骸，並收集上清液後，將再次接種至單層RD細胞。之後，細胞在37℃培養4天後若產生細胞病變，則可與以反覆結凍和解凍各三次後，以離心的方法(400g、室溫、10分鐘)去除細胞殘骸，並收集病毒上清液；但若未產生細胞病變，則將所收集上清液再次接種至單層RD細胞。
病毒逃脫株篩選實驗進行時，需同時設立不含人源抗腸病毒
71型單株抗體的對照組，一般而言，病毒逃脫株的產生需要二至三次的重複接種。而對於所收集的病毒逃脫株上清液，需以所作用的人源抗腸病毒71型單株抗體來進行病毒逃脫株的驗證，該人源抗腸病毒71型單株抗體將失去或顯著降低對該病毒逃脫株的結合與中和能力。進一步分析該逃脫病毒P1基因序列並與對照組母株12-96015或11-96023的P1基因序列進行比較，獲得病毒外殼蛋白質編碼上的點突變位置。
如圖4顯示，腸病毒71型基因亞型B5的12-96015和基因亞型C4的11-96023經過本發明的12個代表性人源抗腸病毒71型單株抗體所篩選出的逃脫病毒突變株(Escape mutant,E)，共篩選出35株可以避免被人源抗腸病毒71型單株抗體所中和的逃脫病毒突變株，經序列分析後，發現它們絕大部分發生有單一的外殼胺基酸突變點；然而，有兩株逃脫病毒突變株則被發現各有兩處的突變點(如人源抗腸病毒71型單株抗體17-2-12A所篩選出之逃脫△12-96015腸病毒71型[帶有VP3 K144E和VP3 T148A]和人源抗腸病毒71型單株抗體16-3-10B所篩選出之逃脫△11-96023腸病毒71型[帶有VP2 T141M和VP1 S283F])。分析這35株逃脫病毒的胺基酸突變位點的序列後，發現總共有25種胺基酸的置換，發生在19處的外殼蛋白胺基酸上，該19處氨基酸是人源抗腸病毒71型單株抗體中和腸病毒71型至關重要的辨識位點，這些位點分別位於外殼蛋白質VP1至VP3上，並且以字體加框標示，其中有17處保守於各種基因型腸病毒71型外殼蛋白序列上。另外，由於人源抗腸病毒71型單株抗體16-3-4D和17-2-12A無法中和腸病毒71型基因型C，所以沒有進一步針對其篩選腸病毒71型11-96023的逃脫病毒株。
接著參閱圖5A、圖5B，本發明所定義的19處抗原決定
位，是位於腸病毒71型外殼蛋白質(VP1至VP3)的19處關鍵氨基酸置換位點，我們繪製了這些人源抗腸病毒71型單株抗體中和位點所位於病毒蛋白質外殼上的五大區域位置(包括峽谷北部邊緣區(canyon northern rim)、峽谷底部區(canyon floor)、峽谷南部邊緣區(canyon southern rim)、3倍軸高原區(3-fold plateau)、和2倍軸高原區(2-fold plateau)等五大區域)。而12株代表性人源抗腸病毒71型單株抗體，依據所辨識的病毒蛋白質外殼上的五大區域位置，可以被區分為位於峽谷北部邊緣區為16-2-11B(重鏈SEQ ID NO：4，輕鏈SEQ ID NO：16)、16-3-3C(重鏈SEQ ID NO：7，輕鏈SEQ ID NO：19)和16-2-2D(重鏈SEQ ID NO：8，輕鏈SEQ ID NO：20)，位於峽谷底部區為16-2-8C(重鏈SEQ ID NO：2，輕鏈SEQ ID NO：14)、16-2-9D(重鏈SEQ ID NO：3，輕鏈SEQ ID NO：15)和16-2-12D(重鏈SEQ ID NO：6，輕鏈SEQ ID NO：18)，位於峽谷北部邊緣區為16-3-10B(重鏈SEQ ID NO：1，輕鏈SEQ ID NO：13)和17-2-2B(重鏈SEQ ID NO：5，輕鏈SEQ ID NO：17)，位於三倍軸高原區為34-1-6D(重鏈SEQ ID NO：10，輕鏈SEQ ID NO：22)和16-3-4D(重鏈SEQ ID NO：11，輕鏈SEQ ID NO：23)，位於2倍軸高原區為17-1-12A(重鏈SEQ ID NO：9，輕鏈SEQ ID NO：21)和17-2-12A(重鏈SEQ ID NO：12，輕鏈SEQ ID NO：24)。
本發明實驗使用的統計分析：
病毒感染RD細胞的TCID50值的統計分析是使用SPSS軟體中的Reed-Muench計算方法。兩組之間中和濃度的差異是以GraphPad Prism軟體的Mann-Whitney方法所分析。當p值小於0.05被認為是具有統計學意義。圖形都是以微軟Microsoft Excel和GraphPad Prism等軟體所製作。
其中所述人源抗腸病毒71型單株抗體可用於定義所辨識的腸病毒71型外殼結構區域的抗原決定位，方法如下：(1)利用人源抗腸病毒71型單株抗體與腸病毒71型母株作用，篩選出無法中和的腸病毒71型，將其命名為逃脫病毒株；(2)將上述逃脫病毒株與原先的腸病毒71型母株進行定序，即可定義出逃脫病毒株關鍵的外殼氨基酸置換位點，該氨基酸是人源抗腸病毒71型單株抗體中和腸病毒71型至關重要的辨識位點，亦即腸病毒71型外殼的抗原決定位。
本發明實驗在小鼠體內人源抗腸病毒71型單株抗體的保護效果：
參閱圖6A及圖6B，為了確定人源抗腸病毒71型單株抗體是否具有活體內保護小鼠對抗腸病毒71型的能力，我們建立小鼠腦內感染腸病毒71型的動物模型。兩週大的hSCARB2(human scavenger receptor class B member 2)轉基因小鼠(C57BL/6品系的小鼠)被用來建立小鼠腦內感染腸病毒71型的動物模型，而感染用的病毒則是使用腸病毒71型臨床病毒株(基因亞型B5的病毒株12-96015或基因亞型C4的病毒株11-96023)。接著，我們選擇一個作用在病毒外殼峽谷南部邊緣區的人源抗腸病毒71型單株抗體17-2-2B(500μg/ml)，和另一個作用在病毒外殼峽谷底部區的人源抗腸病毒71型單株抗體16-2-9D(500μg/ml)，進行保護小鼠感染的測試。在抗體實驗組，同時加入人源抗腸病毒71型單株抗體的腸病毒71型(基因亞型B5的病毒株12-96015或基因亞型C4的病毒株11-96023)被施予腦內感染；在buffer對照組，則是加入同樣體積PBS的腸病毒71型被施予腦內感染；此外，有一組並無腸病毒71型感染而是只在鼠腦內施予同樣總體積的PBS(每組n=4
至8隻老鼠)。以4×106 TCID50(50% tissue culture infective dose)劑量的腸病毒71型感染小鼠的腦部，在感染2至5天後，小鼠會開始出現嚴重運動失能的神經學症狀，並且持續至約感染後14天(圖6A和圖6B所示)，嚴重運動失能的症狀可利用為七級測量評分系統來測定，分數越高代表症狀越嚴重，結果顯示，人源抗腸病毒71型單株抗體與腸病毒71型的同時施打確實能顯著地避免小鼠因腸病毒71型感染所發生的生長遲緩，達到預防腦內感染後發生嚴重運動失能和生長延遲的功效，相對於未加人源抗腸病毒71型單株抗體處裡的對照組，具有顯著性差異(圖6A和圖6B所示)。
<110> 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院
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<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (1)..(354)
<223> 人類單株抗體16-3-1OB免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354551。
<400> 1
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人類單株抗體16-2-8C免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354552。
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<210> 3
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人類單株抗體16-2-9D免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354553。
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<223> 人類單株抗體16-2-11B免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354554。
<400> 4
<210> 5
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<212> DNA
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<223> 人類單株抗體17-2-2B免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354555。
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<223> 人類單株抗體16-2-12D免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354556。
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<223> 人類單株抗體16-2-2D免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354558。
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<211> 375
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<223> 人類單株抗體17-1-12A免疫球蛋白IgG之重鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之重鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354559。
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<223> 人類單株抗體16-3-3C免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354571。
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IgG之輕鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354574。
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<220>
<222> (1)..(330)
<223> 人類單株抗體16-3-4D免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354575。
<400> 23
<210> 24
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> (1)..(333)
<223> 人類單株抗體17-2-12A免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區。人類免疫球蛋白IgG之輕鏈變異區的選殖是依據實施方法的"人源單株抗體(monoclonal antibody)的生產"單元中所述的方法完成。此人工序列已儲存於基因庫，其編號為KY354576。
<400> 24
Claims (4)
- 一種人源抗腸病毒71型單株抗體，選殖自感染腸病毒71型病患之免疫球蛋白G人類B細胞免疫球蛋白可變區基因；上述抗體可變區基因重鏈及相對應輕鏈表達序列為16-2-2D(重鏈SEQ ID NO：8，輕鏈SEQ ID NO：20)。
- 如請求項1之人源抗腸病毒71型單株抗體，其中所述序列16-2-2D可中和腸病毒71型的基因亞型為B4、B5、C4或C5。
- 如請求項1之人源抗腸病毒71型單株抗體，其中所述序列16-2-2D可辨識腸病毒71型的病毒外殼峽谷北部邊緣區(canyon northern rim)。
- 如請求項1之人源抗腸病毒71型單株抗體，其中所述人源抗腸病毒71型單株抗體的基因可選殖至大腸桿菌的載體或宿主細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW109103842A TWI706038B (zh) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | 人源抗腸病毒７１型單株抗體 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW109103842A TWI706038B (zh) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | 人源抗腸病毒７１型單株抗體 |
Publications (2)
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Family
ID=73004968
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| TW109103842A TWI706038B (zh) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | 人源抗腸病毒７１型單株抗體 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI706038B (zh) |
-
2018
- 2018-01-30 TW TW109103842A patent/TWI706038B/zh active
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