TW202000694A - 腫瘤壞死因子類型受體-配體融合蛋白及方法 - Google Patents

Abstract

預期自我活化嵌合訊息傳遞蛋白，尤其是嵌合腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族成員配體 - 受體蛋白。在較佳的方法中，該嵌合蛋白包含CD40L的胞外部分，其透過一柔性連接子偶聯至CD40，使得該融合蛋白在一抗原呈現細胞(antigen presenting cell, APC)中表現時能夠折回其本身並傳遞一CD40調節的訊號，如同已經與位於另一細胞上的CD40L聯繫。 有利地，與抗原呈現同時表現這種嵌合蛋白的細胞將增強針對該抗原的免疫反應。

Description

腫瘤壞死因子類型受體-配體融合蛋白及方法

本發明之領域為融合蛋白、編碼這種融合蛋白的核酸，以及表現融合蛋白之重組細胞，特別是因為其涉及CD40/CD40L融合蛋白、4-1BB/4-1BBL融合蛋白，以及Ox40/Ox40L融合蛋白。

以下描述包括可用於理解本發明的資訊。這並非承認本文所提供的任何資訊為現有技術或與目前主張保護的發明相關，或者任何明確或隱含引用的出版物為現有技術。

本文中指出的所有出版物均以引用方式併入，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請被具體並單獨地指出透過引用併入。如果併入的參考文獻中術語的定義或使用與本文提供的術語之定義不一致或相反，則適用本文所提供之該術語的定義，且不適用該術語在該參考文獻中的定義。

已知腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族成員受體如CD40、4-1BB，或Ox40及其各自的配體在調節細胞及體液免疫中具有關鍵的作用。例如，4-1BB訊息傳遞涉及自然殺手(natural killer, NK)細胞活化以增加抗體依賴性細胞調節的細胞毒性作用(antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity, ADCC)與IFN-γ的分泌，而OX40訊息傳遞涉及T細胞的活化及分化。於其他實例中，CD40在各種類型的免疫細胞中表現，且主要在抗原呈現細胞(antigen presenting cell, APC)如樹突細胞、巨噬細胞，以及B細胞中表現。於其他作用中，該CD40L/CD40系統對活化並“許可”樹突細胞引發細胞毒性CD8+ T細胞反應至關重要。最典型地，在CD4+輔助性T細胞上表現的CD40配體(CD40L)與抗原呈現細胞(APC)上的CD40結合，因此誘導抗原呈現細胞(APC)的活化及成熟。因此，CD40許可的抗原呈現細胞(APC)誘導抗原特異性CD8+細胞毒性T細胞的活化及增殖。圖 1 描繪了說明CD40-CD40L調節的抗原呈現細胞(APCs)以及CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞活化的簡化示意圖。值得注意的是，沒有CD40的訊息傳遞，CD8+ T細胞與未經許可的抗原呈現細胞(APC)的相互作用誘導T細胞無反應性或觸發調節性T細胞的形成，儘管存在其他抗原性胜肽，但這可能是腫瘤在哺乳動物中持續存在的機制之一。

鑑於CD40的關鍵作用，已經進行了許多嘗試以在治療中使用CD40的活化作用。例如，可以使用激動性抗體或可溶性CD40L有效地觸發CD40訊息傳遞(例如，Int Rev Immunol 2012, 31:246–266)。然而，這種方法通常受到全身毒性的限制(例如，J Clin Oncol 2007, 25:876–883;Science 2012, 331:1612–1616)。最近，發現CD40訊息傳遞的功效取決於CD40的多聚化或三聚化。於此基礎上，製備了CD40L以及gp100腫瘤抗原的多聚體融合構築體，並顯示活化的樹突狀細胞並提高B16-F10黑色素瘤DNA疫苗模型的存活率(參見，例如，Vaccine . 2015年9月11日；33(38):4798-4806)。

在活化的抗原呈現細胞(APCs)的其他已知嘗試中，構築了一嵌合多胜肽，其由與50-100個胺基酸間隔子融合的CD40的訊號傳遞結構域所組成，其與CD40L的結合及三聚化結構域融合，如WO 00/063395中所公開的。類似地，構築一嵌合多胜肽，其由融合至第2型受體跨膜結構域的CD40的訊息傳遞結構域所組成，其與CD40L的結合及三聚化結構域融合，如WO 02/036769中所公開的。然後將該構築體在腫瘤細胞中表現，將轉染的細胞植入小鼠體內。然而，在這些參考文獻中沒有提供治療效果。在其他已知方法中，一嵌合蛋白在抗原呈現細胞中表現，其中該嵌合蛋白由融合至一FK506配體結合區的CD40細胞質區以及由荳蔻醯化膜目標區所組成，如US 7404950中所公開的。類似地，在US 8999949中描述了具有一多聚體配體結合區以及一缺乏胞外結構域的CD40部分的融合蛋白。儘管此類構築體可在體外提供至少一些增加的活性，但它們在施用於哺乳動物時容易具有抗原性。

因此，儘管調節腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體/配體訊息傳遞的各種方式在本領域為已知的，但它們中的全部或幾乎全部都存在一個或多個缺點。因此，仍然需要改進腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體/配體訊息傳遞的調節。

本發明之主題涉及包含一腫瘤壞死因子(TNF)家族成員配體以及一腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體的各種嵌合構築體，以及編碼它們的核酸，以及使用這種核酸轉染的細胞及治療癌症與病毒感染之方法。於特別較佳之方面，構築一CD40L-CD40融合蛋白並在一抗原呈現細胞(APC)中表現，其中該融合蛋白能夠折回其本身以傳遞CD40調節的訊號，如同其被一句有CD40L的單獨細胞活化一樣(例如，CD4+ T細胞)。類似地，於進一步考慮之方面，考慮了4-1BB配體/4-1BB以及Ox40L/Ox40融合蛋白，並在合適的免疫感受態細胞中表現。

於本發明主題之一方面，本案發明人考慮了一嵌合蛋白，其從N端至C端依序包括一CD40L的胞外部分，其與偶聯於CD40的一柔性連接子偶聯。於特別考慮之方面，該嵌合蛋白還包含與該CD40L胞外部分的N端偶聯的前導胜肽。

最佳但非必要地，該CD40L的胞外部分為一CD40L的人類胞外部分，且該CD40為一人類CD40，及/或該柔性連接子具有介於4-25個胺基酸之間的長度(例如，包括(GnS)x基序，其中n及x獨立地介於1-5之間)。最典型地，相較於一全長序列，該CD40缺乏一訊號序列。因此，於其他預期的選擇中，該嵌合蛋白可具有SEQ ID NO: 1-10中任一序列。

於本發明主題之另一預期方面，一重組表現片匣將包括一啟動子，該啟動子可操作地偶聯至編碼如本文所考慮的嵌合蛋白的區段。當有需要時，該重組表現片匣還可包括一第二區段，該第二區段編碼一細胞激素及/或一腫瘤相關抗原(tumor associated antigen, TAA)、一腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)，以及一腫瘤與患者特異性新抗原決定位中至少一種的至少一部分。如將容易理解的，該重組表現片匣可為一RNA，或可為一病毒表現載體的一部分(其可以包封或不包封於一病毒顆粒中)。

因此，於更進一步考慮之方面，本案發明人考慮使用本文所考慮之重組表現片匣轉染的一重組細胞。最典型的是，該細胞為一抗原呈現細胞(例如，樹突細胞)，及/或該細胞為瞬間轉染的。

由不同角度觀之，本案發明人還考慮了增強針對一抗原的免疫反應之方法，其包括以包含本文所示之一重組表現片匣的核酸構築體轉染一抗原呈現細胞之步驟，以及使該轉染細胞與該抗原接觸或在該轉染細胞中表現該抗原的進一步之步驟。在接觸或表現後，使該轉染的細胞與一CD4+ T細胞及/或一CD8+ T細胞接觸。

例如，預期的抗原為腫瘤及患者特異性新抗原決定位，或一腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)的至少一部分。通常進一步考慮該轉染步驟以離體進行，且該接觸步驟在體內進行。因此，針對該抗原的免疫反應可為在一個體內針對一腫瘤或針對一病毒(例如，HIV)的免疫反應。

因此，本案發明人還考慮了一種在一個體內治療一腫瘤之方法，該方法包括以本文所述之一重組表現片匣轉染該個體的一抗原呈現細胞之步驟，以及使該轉染細胞與一腫瘤抗原接觸或在該轉染細胞中表現該腫瘤抗原的進一步之步驟。在接觸或表現後，使該轉染的細胞與該個體的CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞接觸。

如前所述，通常考慮該轉染的步驟以離體進行，且其中該接觸步驟在體內進行。此外，考慮該腫瘤抗原為一腫瘤與患者特異性新抗原決定位，或一腫瘤相關抗原或一腫瘤特異性抗原的至少一部分。 於較佳之方面，該抗原呈現細胞為一樹突細胞，且該重組表現片為一mRNA或一腺病毒的一部分。

因此，本案發明人還考慮使用一嵌合蛋白及/或使用如本文所述之一重組細胞來治療一癌症或病毒感染。

由以下之較佳具體實施例的詳細描述及附圖中，本發明主題之各種目的、特徵、方面以及優點將變得更加明顯，附圖中相同的數字表示相同的部件。

本案發明人現已發現，透過干擾在一抗原呈現細胞處的CD40訊息傳遞事件，可以在期望的方向(亦即，增強或抑制)定制對抗原的免疫反應。例如，如以下更詳細描述的，本案發明人已經在抗原呈現細胞(APC)上構築並表現了自我活化的CD40訊息傳遞蛋白，其能夠折回其本身並因此將一CD40調節的訊號傳遞到該抗原呈現細胞(APC)中，如同已經與表現CD40L的另一細胞(例如，CD4+ T細胞)聯繫一樣。同樣地，本案發明人還考慮透過在各種免疫感受態細胞(例如，抗原呈現細胞(APCs)、自然殺手(NK)細胞、T細胞)中表現該融合蛋白以調節T細胞及自然殺手(NK)細胞的活性。

於此情況下，應該注意的是，CD40，為一種其N端位於細胞外部的第1型膜蛋白，被認為是主開關(例如，在樹突細胞上)，而CD40L (例如，位於CD4 T細胞上)是一種其C端位於該細胞外部的第2型膜蛋白。與許多其他腫瘤壞死因子(TNF)家族成員一樣，CD40需要三聚化以影響CD40的訊息傳遞，這透過與具有三聚化結構域的CD40L相互作用來實現。本案發明人透過修飾一嵌合CD40分子有利地利用了這種活化要求，該嵌合CD40分子透過一連接子與其自身的CD40L (具有三聚化結構域)偶聯，從而實現該CD40部分與該CD40L部分的適當結合，同時允許CD40L部分的三聚化。

因此，當在抗原呈現細胞中表現時，該嵌合蛋白必然會三聚化並因此影響CD40訊息傳遞，而不需要另一細胞(通常為一CD4+ T細胞)來遞送該CD40L。最佳地，該抗原呈現細胞(APC)也將表現或暴露於一所選之抗原，因此在MHC系統上呈現一部分抗原。如將容易理解的，即使在CD4+ T細胞不存在(或減少存在)的情況下，這種抗原呈現細胞(APC)也將有效增強免疫反應，這對於破壞或減少CD4+ T細胞的病原體感染具有重要意義，例如愛滋病病毒。由另一角度觀之，應當理解的是，透過在MHC呈遞系統上共同呈遞的嵌合蛋白與至少一部分抗原，可以定制的抗原特異性方式增強或下調免疫反應。對於針對特定抗原的免疫刺激，實現嵌合蛋白的三聚化(如下所示)。相反地，為了下調針對特定抗原的免疫反應，減少或抑制該嵌合蛋白的三聚化。同樣地，在腫瘤壞死因子(TNF)家族成員配體為4-1BB配體或Ox40配體的情況下，該腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體為4-1BB或Ox40。由於這些蛋白質具有共同的結構基序以及活化模式，應該認識到的是，本文提出的關於CD40L/CD40的教導同樣適用於4-1BBL/4-1BB以及Ox40L/Ox40。

因此，應該理解的是，這種構築體也與疫苗及其他免疫刺激組合物(尤其是癌症疫苗)特別相關，其中該三聚化的概念轉移到其他腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，如4-1BB、OX40等上，以透過基因表現以所需方式活化細胞。因此，預期的系統及方法也適用於抗原呈現細胞(APCs)以外的用途，並且特別考慮的用途包括自然殺手(NK)細胞及其衍生物(例如，NK-92、aNK、haNK、tank等)、T細胞及其衍生物(例如，CAR-T、TCR-T、TIL-T等)，以及B細胞等。因此，儘管以下的討論提供了CD40及CD40L的實施例及考量，但應該理解的是，本發明的主題也適用於其他腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，如4-1BB、OX40等。

例如，並且就CD40而言，預期CD40的所有變體都被認為適用於本文。然而，特別合適的CD40變體包括人類及其他哺乳動物形式的CD40。本領域已知有許多這樣的序列，並且所有這些都被認為適用於本文(參見，例如，uniprot序列資料庫)。在大多數典型的具體實施例中，但非必須的，在預期的構築體中除去CD40訊號胜肽，並以包含一連接子及該CD40L部分的上游部分替換。此外，通常較佳的是，為了活化嵌合構築體，該CD40將保留其細胞內活化結構域。另一方面，在需要下調的情況下，該CD40將具有缺少一(功能性)活化結構域的截短的胞內部分。

最典型地，將選擇特定的CD40以配對其中使用它的物種(例如，人類抗原呈現細胞(APC)的人類CD40)。此外，還應該理解的是，可以實施許多修改以實現期望之目的。例如，該細胞內活化結構域可以多個複製存在，或者部分或完全地缺失。 於其他實施例中，可添加一種或多種胺基酸作為標籤以透過免疫組織化學染色法(immunohistochemistry, IHC)進行鑑定。於更進一步的實施例中，可以交換一個或多個胺基酸(特別是在N端)以增加蛋白質半衰期。在較不佳之方面，還預期CD40的跨膜結構域可被另一跨膜結構域取代。

同樣地，預期的CD40L序列可以顯著變化，並且預期CD40L的所有變體都被認為適合用於本文。然而，如上所述，特別合適的CD40L變體包括人類及其他哺乳動物形式的CD40L。本領域已知有許多這樣的序列，且所有這些都被認為適用於本文(參見，例如，uniprot序列資料庫)。在大多數典型的具體實施例中，但非必須的，該CD40L將包括其天然訊號胜肽，然而，如果需要，也可包括其他訊號胜肽。此外，為了活化嵌合構築體，該CD40L將保留其三聚化結構域。於另一方面，在需要下調的情況下，該CD40L可具有截短的三聚化結構域或具有足以阻止三聚化的空間位阻的其他結構域。

最典型地，將選擇特定的CD40L以配對其中使用它的物種(例如，人類抗原呈現細胞(APC)的人類CD40)。此外，還應該理解的是，可以實施許多修改以實現期望之目的。例如，可優化三聚化結構域以增加親和力，或者部分或完全地刪除。於更進一步的實施例中，可以交換一個或多個胺基酸(特別是在其N端)以增加該蛋白質的半衰期。

如將容易理解的，通常選擇合適的連接子使得該CD40及CD40部分相對於彼此具有足夠的移動性以進行所有選擇性結合。因此，特別是對於活化嵌合分子，該連接子將為具有介於4-30個胺基酸的長度且具有低免疫原性或無免疫原性的多胜肽。然而，特別較佳的連接子為GS型連接子，其長度為介於4-25個胺基酸，最佳介於15-17個胺基酸。本領域已知有許多替代的連接子，並所有這些連接子都被認為適用於本文(參見，例如，Adv Drug Deliv Rev 2013年10月15日；65(10): 1357–1369)。

因此預期構築體包括在一單個多胜肽中的該CD40L部分、該連接子，以及該CD40部分，且示例性嵌合構築體顯示於SEQ ID Nos: 1-10中。

當然，應當理解的是，這些構築體在大多數情況下不作為多胜肽被遞送至一細胞，而是以一具有該編碼嵌合蛋白的表現片匣的核酸轉染至一細胞，最通常為一抗原呈現細胞(APC)。因此，考慮的核酸包括具有控制編碼該嵌合蛋白的核酸序列的表現的啟動子(組成型或誘導型)的核酸。 由於該蛋白質具有一跨膜部分，因此該構築體通常具有將該嵌合蛋白導向該細胞表面的訊號序列(任選可切割的)。

最典型地，該重組核酸可為可以整合到該抗原呈現細胞(APC)的宿主基因組中的DNA，或者可以作為一染色體外單元存留的DNA。例如，合適的DNA構築體可為線性或環狀構築體，並且可配置為一表現載體，特別是作為可以透過病毒感染遞送到該細胞中的病毒表現載體。在其他選擇中，該病毒載體可為一腺病毒載體，尤其是一具有缺失的E1及E2b基因的AdV載體。或者，該核酸也可為RNA，尤其是一mRNA或自我複製的RNA，以限制該重組有效負載的持久性。

於本發明主題之進一步較佳之方面，該宿主細胞(通常為抗原呈現細胞(APC))可以一重組核酸轉染，該重組核酸還包括將編碼一腫瘤相關抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)，以及一新抗原決定位或多抗原決定位中的至少一種的區段(其中每個可為相同或不同的核酸)。有利地，這種轉染將同時遞送該嵌合蛋白以及該特異性抗原。於另一方面，該轉染的細胞也可以暴露於腫瘤相關抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)、新抗原決定位，及/或多抗原決定位，因此攝取並加工抗原以呈遞MHC複合物。於此情況下，應該認識到該重組的腫瘤相關抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)、新抗原決定位，及/或多抗原決定位可能具有將該腫瘤相關抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)、新抗原決定位，及/或多抗原決定位導向MHC-I及/或MHC-II複合物的運輸訊號。 然而，通常較佳的運輸為至少至該MHC-II複合物。

於更進一步考慮之方面，該重組核酸還包括編碼一種或多種細胞激素的區段，尤其是用於增加免疫反應的免疫刺激細胞激素(例如，IL-2、IL-15、IL-17、IL-21)，或下調細胞激素(例如，IL-10、TGFβ)以抑制免疫反應。

用於轉染的被考慮的細胞通常包括所有類型的抗原呈現細胞，然而，特別較佳的被轉染細胞為樹突細胞或巨噬細胞。於更進一步考慮之方面，用於轉染的細胞較佳為相對於患者的一自體抗原呈現細胞(APC)，或一MHC配對的抗原呈現細胞(APC)。於較不佳之方面，還考慮了異源抗原呈現細胞(APC)。此外，應該注意的是，可以在給藥前照射該細胞以減少持久性，並且本領域普通技術人員將充分了解合適的劑量及輻射源。

最佳地，細胞將在體外轉染，適當/需要培養，然後給予該患者。或者，考慮還可以使用包含該重組病毒表現系統的一治療性病毒在體內轉染的細胞。 實施例

本案發明人已經使用CD40、CD40L、CD40/CD40L複合物的晶體結構來確定連接子長度的範圍，其可以將二個蛋白質部分連接在一起，同時保持它們的功能。為此，對5個不同長度的連接子進行建模及重組表現，並測試了幾種融合蛋白。

圖 2 描繪了帶有融合蛋白的16聚體連接子的示例性模型，其中左圖顯示了該嵌合蛋白單體的預測側視圖，其中中圖描繪了該三聚體的預測側視圖，其中右圖描繪了該三聚體的預測俯視圖。從小圖中可容易地看出，該連接子提供足夠的空間活動性以允許CD40L與CD40結合，並允許嵌合蛋白的三聚化。

為了確定這些構築體是否也表現出免疫感受態細胞的生物學效應，以具有不同連接子長度的構築體轉染KG-1細胞(骨髓細胞株)。這些細胞以約30-50%的速率轉染。因此，就產生細胞激素(此處為IL-8)而言，相較於以離子黴素對細胞的小分子活化，具有該連接子構築體的反應是容易被觀察到的。圖 3 提供了以具有不同連接子長度的CD40L-連接子-CD40構築體瞬間轉染的人類細胞的示例性數據。從數據中可以看出，一些嵌合構築體在轉染的細胞中觸發了大量活性，顯示約16個胺基酸的連接子長度在訊息傳遞中最有效。

使用BioRad Gene Pulser II透過電穿孔轉染KG-1細胞，具有3個脈衝(200歐姆，25 μF，0.26kV)，並在生長培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，補充有20%胎牛血清)中培養16小時。洗滌轉染的細胞以除去可能由電穿孔過程產生的殘留細胞激素，並於一96孔組織培養盤中以每孔20,000個細胞在新鮮培養基中培養。將細胞再培養24小時，收穫上清液。根據製造商推薦的方法，使用對人類IL-1β、MCP-1，以及IL-8特異的細胞計數珠陣列測定上清液中的細胞激素含量；然而，只有IL-8顯現出變化。

小鼠CD40L/CD40融合蛋白：為了確定自我連接的CD40/CD40L融合構築體的概念是否可以擴展到其他物種，產生編碼這些蛋白質的小鼠形式的平行構築體組，並在小鼠B16F10黑色素瘤細胞株中進行活性測試(圖 4 )。在該平行系統中獲得了類似的結果，顯示該系統可能可擴增至其他CD40序列甚至其他腫瘤壞死因子(TNF)家族成員。從數據中可以看出，一些嵌合構築體在轉染的細胞中均觸發了大量活性(KC及MCP-1)，表示14或16個胺基酸的連接子長度在訊息傳遞中是有效的，而18 個胺基酸的連接子則未引起反應。

這些轉染作用如下進行。根據製造商推薦的方案，使用Lipofectamine 2000，以小鼠CD40/CD40L融合蛋白構築體轉染小鼠黑色素瘤細胞株B16F10。將細胞靜置18小時，洗滌以除去殘留的細胞激素，並於96孔組織培養盤中以每孔50,000個細胞培養於新鮮生長培養基(Dulbecco's Minimum Essential Medium，補充有10%胎牛血清)中另外24小時。培養後，收穫上清液，根據製造商推薦的方法，使用細胞計數珠陣列測定小鼠IL-1β、MCP-1，以及KC的含量。具有14個以及16個胺基酸連接子的融合蛋白透過KC及MCP-1的產生測量顯示出反應。

使用與上述基本相同的方法，本案發明人進一步研究了以嵌合構築體轉染樹突細胞狀細胞(KG-1)以及293T衍生物(EC7)是否會導致IL-8的分泌。從圖 5 中可以看出，兩種細胞株都具有顯著的IL-8分泌，所有測試的變體都是如此。為了進一步測試該構築體是否可跨越物種邊界而產生作用，本案發明人還測試了以人類及小鼠構築體轉染小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)是否會導致趨化因子KC及MCP-1的分泌。從圖 6 中可以容易地看出，即使嵌合構築體不是來自相同的物種，該些趨化因子也被分泌。

為了確定嵌合構築體在人類(293T)以及鼠(B16F10)細胞中的表現，轉染該些細胞，24小時後以單株或多株抗體標記。這些實驗的結果分別如圖 7 及 8 所示。顯而易見的是，對於所有構築體，在兩種細胞株中都確認了表面的表現。

針對以CD40轉染的293T測試嵌合構築體的功能性，隨後以sCD40L刺激，而示例性結果顯示於圖 9 中。值得注意的是，當測量IL-8的分泌時，相較於可溶性CD40配體，該嵌合構築體具有優異的活化作用。最後，本案發明人以將小鼠及人類序列元素用於該融合蛋白的CD40結構域的方式製備了預期的構築體。因此，至少一些該融合蛋白也是關於細胞內(intracellular, IC)、跨膜(transmembrane, TM)，或胞外(extracellular, EC)結構域之起源的嵌合體。值得注意的是，如圖 10 所示，使用人類胞外(EC)結構域的人類細胞中的嵌合構築體在人類細胞中具有顯著更高的活性，即使當使用了小鼠的細胞內(IC)以及跨膜(TM)片段。 類似地，人類胞外(EC)結構域在小鼠細胞中的這種構築體中也是優越的。

於一些具體實施例中，用於描述及請求保護本發明某些具體實施例的表示成分的量、性質，如濃度、反應條件等的數字應當理解為在某些情況下由術語“約”修飾。因此，於一些具體實施例中，書面描述及所附之申請專利範圍書中列出的數值參數為近似值，其可根據特定具體實施例試圖獲得的所需性質而變化。於一些具體實施例中，數值參數應根據報告的有效數字的數量並透過應用普通的捨入技術來解釋。儘管闡述本發明的一些具體實施例的寬廣範圍的數值範圍及參數為近似值，但具體實施例中列出的數值盡可能精確地報告。於本發明的一些實施例中呈現的數值可能包含必然由其各自的測試測量中發現的標準偏差引起的某些誤差。

除非上下文指示相反，否則本文所述之所有範圍應解釋為包括其端點，並且開放式範圍應解釋為僅包括商業實用值。同樣地，除非上下文指出相反之情況，否則應將所有數值列表視為包含中間值。如本文之描述及隨後的申請專利範圍中所使用的，“一”、“一個”以及“該”的含義包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。此外，如在本文的描述中所使用的，除非上下文另有明確規定，否則“在...中”的含義包括“在…中”以及“在…上”。

對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本文的發明構思之情況下，除了已經描述的那些以外的更多修改是可能的。因此，除了所附之申請專利範圍的範圍之外，本發明的主題不受限制。此外，在解釋說明書及申請專利範圍時，所有術語應以與上下文一致的最廣泛之方式解釋。特別是，術語“包括”以及“包含”應被解釋為以非排他的方式指代元件、組件或步驟，指示所引用的元件、組件或步驟可以存在，或者被利用，或者與未明確引用的其他元件、組件或步驟組合。當說明書申請專利範圍涉及選自由A、B、C…以及N所組成之群組中的至少一種時，該文字應解釋為只需要該群組中的一個元件，而非A加N，或B加N等。示例性序列 於下文中，CD40L訊號序列以下劃線標示，CD40L胞外結構域以正常字體標示，12-20胺基酸連接子以粗體字標示，且CD40 (不帶有訊號胜肽)以斜體標示。 所有的構築體都基於以下Uniprot序列： 人類CD40: www.uniprot.org/uniprot/P25942 人類CD40L: www.uniprot.org/uniprot/P29965 小鼠CD40: www.uniprot.org/uniprot/P27512 小鼠CD40L: www.uniprot.org/uniprot/P27548 > SEQ ID NO: 1 (CD40/CD40L+12個單體連接子)MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPE HRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGSGGGGSGGG PPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ > SEQ ID NO: 2 (CD40/CD40L+14個單體連接子)MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPE HRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGG PPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ > SEQ ID NO: 3 (CD40/CD40L+16個單體連接子)MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPE HRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGSGGGGSGGGGSGG PPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ > SEQ ID NO: 4 (CD40/CD40L+18個單體連接子)MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPE HRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGSGGGGSGGGGSGGGGSG PPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ > SEQ ID NO: 5 (CD40/CD40L+20個單體連接子)MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPE HRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG PPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ > SEQ ID NO: 6 (小鼠_CD40/CD40L+12個單體連接子)MVSLPRLCALWGCLLTAVHL HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGSGGGGSGGGG QCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVICGLKSRMRALLVIPVVMGILITIFGVFLYIKKVVKKPKDNEILPPAARRQDPQEMEDYPGHNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQVTDSIALRPLV > SEQ ID NO: 7 (小鼠_CD40/CD40L+14個單體連接子)MVSLPRLCALWGCLLTAVHL HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGG QCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVICGLKSRMRALLVIPVVMGILITIFGVFLYIKKVVKKPKDNEILPPAARRQDPQEMEDYPGHNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQVTDSIALRPLV > SEQ ID NO: 8 (小鼠_CD40/CD40L+16個單體連接子)MVSLPRLCALWGCLLTAVHL HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGSGGGGSGGGGSGGG QCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVICGLKSRMRALLVIPVVMGILITIFGVFLYIKKVVKKPKDNEILPPAARRQDPQEMEDYPGHNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQVTDSIALRPLV > SEQ ID NO: 9 (小鼠_CD40/CD40L+18個單體連接子)MVSLPRLCALWGCLLTAVHL HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGSGGGGSGGGGSGGGGSGG QCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVICGLKSRMRALLVIPVVMGILITIFGVFLYIKKVVKKPKDNEILPPAARRQDPQEMEDYPGHNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQVTDSIALRPLV > SEQ ID NO: 10 (小鼠_CD40/CD40L+20個單體連接子)MVSLPRLCALWGCLLTAVHL HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG QCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVICGLKSRMRALLVIPVVMGILITIFGVFLYIKKVVKKPKDNEILPPAARRQDPQEMEDYPGHNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQVTDSIALRPLV 用於4-1BBL/4-1BB以及Ox40L/Ox40的其他構築體可基於以下Uniprot序列，基本上如上文針對CD40L/CD40所述之方式： 人類4-1BB: www.uniprot.org/uniprot/Q07011 人類4-1BBL: www.uniprot.org/uniprot/P41273 小鼠4-1BB: www.uniprot.org/uniprot/P20334 小鼠4-1BBL: www.uniprot.org/uniprot/P41274 人類Ox40: www.uniprot.org/uniprot/P43489 人類Ox40L: www.uniprot.org/uniprot/P23510 小鼠Ox40: www.uniprot.org/uniprot/P47741 小鼠Ox40L: www.uniprot.org/uniprot/P43488

圖1為說明CD40-CD40L調節的抗原呈現細胞(APCs)以及CD4+及CD8+ T細胞活化之簡化示意圖。 圖2描繪了本文考慮之一示例性融合蛋白的預測結構的數個視圖。 圖3描繪了表現本文考慮之示例性融合蛋白的細胞之結果。 圖4描繪了證明該構築體可在不同物種(鼠)中操作的示例性結果。 圖5描繪了證明該構築體導致所選的細胞株中IL-8的分泌的示例性結果。 圖6描繪了證明該構築體可跨越不同物種操作的示例性結果。 圖7描繪了本文提供的開構築體的293T細胞中表面表現的示例性結果。 圖8描繪了本文提供的該構築體的B16F10細胞中表面表現的示例性結果。 圖9描繪了以CD40轉染的293T細胞以及隨後以可溶性CD40L刺激與預期的構築體比較的示例性結果。 圖10描繪了以人類/小鼠構築體轉染的人類(293T)及小鼠(B16F10)細胞產生細胞激素的示例性結果。

Claims (15)

1. 一種嵌合蛋白，其從N端至C端，包含一腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族成員配體的胞外部分，該胞外部分透過一柔性連接子與其相應的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體偶聯。
2. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，進一步包含一與CD40L胞外部分的N端偶聯的前導胜肽。
3. 如前述申請專利範圍任一項之嵌合蛋白，其中該CD40L的胞外部分為一CD40L的人類胞外部分。
4. 如前述申請專利範圍任一項之嵌合蛋白，其中該柔性連接子具有一介於4-25個胺基酸的長度，且可選擇地包含一(G_n S)_x 序列。
5. 如前述申請專利範圍任一項之嵌合蛋白，其中該腫瘤壞死因子(TNF)家族成員配體為CD40L、4-1BB配體，或Ox40配體，且其中該腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體為CD40、4-1BB，或Ox40。
6. 如前述申請專利範圍任一項之嵌合蛋白，其中該腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體為一人類腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體，及/或其中該腫瘤壞死因子(TNF)家族成員受體缺乏一訊號序列。
7. 一種如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，具有SEQ ID NO: 1-10中任一之序列。
8. 一種重組表現片匣，包含一啟動子，該啟動子可操作地偶聯於一編碼如申請專利範圍第1-7項任一項之嵌合蛋白的區段。
9. 如申請專利範圍第8項之重組表現片匣，進一步包含一第二區段，該第二區段編碼一細胞激素及/或一腫瘤相關抗原、一腫瘤特異性抗原，以及一腫瘤與患者特異性新抗原決定位中至少一種的至少一部分。
10. 如申請專利範圍第8-9項任一項之重組表現片匣，其中該片匣為一RNA。
11. 如申請專利範圍第8-9項任一項之重組表現片匣，其中該片匣為一病毒表現載體的一部分。
12. 一種重組細胞，係為一以如申請專利範圍第8-11項任一項之重組表現片匣轉染的重組細胞。
13. 如申請專利範圍第12項之重組細胞，其中該細胞為一抗原呈現細胞。
14. 如申請專利範圍第12項之重組細胞，其中該抗原呈現細胞為一樹突細胞。
15. 如申請專利範圍第12項之重組細胞，其中該細胞為瞬間轉染的。

Images