TW201934760A - 用於２型糖尿病的生物標誌物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了基於數個CAG的豐度數據來在物件中評估2型糖尿病之存在或發生風險的方法。本發明還提供了基於這些CAG的豐度數據來在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法。

Description

用於2型糖尿病的生物標誌物及其用途
本發明係有關於用於2型糖尿病的生物標誌物及其用途，尤其提供了基於數個CAG的豐度數據來在物件中評估2型糖尿病之存在或發生風險的方法，以及基於這些CAG的豐度數據來在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法。
腸微生物群(gut microbiota)為人宿主提供很多有益功能。這些功能中一些對於我們而言是必需的，因為在我們自身的基因組中我們不對其進行編碼。從生態學角度考慮，這樣的功能可以被視為“生態系統服務”(1)。在功能上，“健康的”腸微生物群是能夠提供所需的所有生態系統服務的腸微生物群。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)產生是由腸細菌提供的此類服務的最顯著實例。關於人如何可以直接受益於SCFA，已存在大量文獻：例如，丁酸鹽(butyrate)是結腸細胞的主要能量底物，並且很多種SCFA作為調節炎症和食欲調控的信號傳導分子發揮功能(2)。因此，向人供應SCFA的細菌是生態系統服務提供者(ecosystem service provider，ESP)和用於使人宿主保持健康的腸微生物群的關鍵成員。
SCFA產生者的缺陷與生態失調相關性疾病(例如2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM))相關(3-6)。已經表明，使用高膳食纖維飲食的臨床試驗減輕T2DM的疾病表型，但是在個體之間的治療回應差 異很大(7-9)，這可能是由於腸微生物群中SCFA產生者的個體特異性譜導致的(10)。
然而，鑒定用於SCFA產生以改善T2DM的ESP並不是容易。將有機化合物發酵成SCFA的能力是衆多分類中的數百種腸細菌物種所共有的遺傳性狀(11)。由於對腸腔中酸度的耐受性不同，一些SCFA產生者可以在競爭中勝過另一些SCFA產生者(12,13)。這需要區分具有產生SCFA的遺傳能力的“產生者”與實際上在特殊腸環境中對碳水化合物進行發酵並供應SCFA的“提供者”。我們最近的研究進一步表明了丁酸和乙酸產生性物種針對高膳食纖維飲食的菌株特異性回應(14,15)。這需要菌株水平的全微生物組關聯方法以鑒定作為回應于高膳食纖維攝入的針對人宿主的實際SCFA供應者的ESP。
本申請使用鳥槍宏基因組測序來揭示T2D患者中回應于高纖維干預的腸微生物組變化。結果，發現15個表示為CAG NO.：1至15的CAG(共豐度基因集((co-abundance group)))上調並鑒定為ESP，而49個表示為CAG NO.：16至64的CAG在T2D患者中下調。這些CAG可以用作對T2D進行高效、準確且患者友好表徵的生物標誌物。
在一方面，本發明提供了在物件中評估2型糖尿病的存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG No.：1至64的每個參考CAG的豐度： A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出(read)的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及d)如果GMM指數接近或低於預定水平，則確定物件患有或有風險發生2型糖尿病，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列，並且CAG NO.：16至64分別包含SEQ ID NO.：2784至2961、2962至3130、3131至3525、3526至3747、3748至3863、3864至4068、4069至4212、4213至4393、4394至4532、4533至4891、4892至4979、4980至5116、5117至5320、5321至5464、5465至5781、5782至6279、6280至6646、6647至6954、6955至7178、7179至7613、7614至7758、7759至8046、8047至8491、8492至8546、8547至9971、9972至10099、10100至10392、10393至10502、10503至10694、10695至10986、10987至11089、11090至11262、11263至11466、11467至11704、11705至12034、12035至12113、12114至12341、12342至12454、12455至12664、12665至12825、12826至13042、13403至13500、13501至13726、13727至13949、13950至14014、14015至14290、14291至14403、14404至14686和14687至14850所示的核酸序列。
在一些實施方案中，步驟b)中的DNA分析包括以下步驟：獲得DNA序列並將所獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至14850所示的核 酸序列進行比對。
在一些實施方案中，獲得DNA序列包括以下步驟：在樣品中獲得原始序列讀出並對原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
在一些實施方案中，原始序列讀出通過基於PCR的高通量測序技術來獲得。在一些實施方案中，原始序列讀出通過Illumina測序來獲得。
在一些實施方案中，對原始序列讀出進行處理包括：去除銜接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，以及去除與人基因組匹配的序列。在一些實施方案中，短序列的長度為59bp或更小。
在一些實施方案中，DNA序列的比對使用種子延伸策略(seed-and-extend strategy)。在一些實施方案中，使用在種子序列中無錯配的序列來在步驟b)中確定每個參考CAG的豐度。在一些實施方案中，種子序列的長度為4bp或更大、5bp或更大、6bp或更大、7bp或更大、8bp或更大、9bp或更大、10bp或更大、11bp或更大、12bp或更大、13bp或更大、14bp或更大、15bp或更大、16bp或更大、17bp或更大、18bp或更大、或者19bp或更大。在一些實施方案中，種子序列的長度為31bp或更小、30bp或更小、29bp或更小、28bp或更小、27bp或更小、26bp或更小、25bp或更小、24bp或更小、23bp或更小、22bp或更小、或者21bp或更小。在一些實施方案中，種子序列的長度為20bp。
在一些實施方案中，預定水平為約-1.028883。
在第二方面，本發明提供了在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療的效力的方法，其包括以下步驟： a)在飲食干預或疾病治療之前和期間從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG No.：1至64的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及e)如果在於飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中GMM指數提高，則確定物件對飲食干預或疾病治療作出積極回應，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列，並且CAG NO.：16至64分別包含SEQ ID NO.：2784至2961、2962至3130、3131至3525、3526至3747、3748至3863、3864至4068、4069至4212、4213至4393、4394至4532、4533至4891、4892至4979、4980至5116、5117至5320、5321至5464、5465至5781、5782至6279、6280至6646、6647至6954、6955至7178、7179至7613、7614至7758、7759至8046、8047至8491、8492至8546、8547至9971、9972至10099、10100至10392、10393至10502、10503至10694、10695至10986、10987至11089、11090至11262、11263至11466、11467至11704、11705至12034、12035至12113、12114至12341、12342至12454、12455至12664、12665至12825、12826至13042、13403至13500、13501至13726、13727至13949、13950至14014、14015至14290、14291至14403、14404至14686和14687至14850 所示的核酸序列。
在一些實施方案中，步驟b)中的DNA分析包括以下步驟：獲得DNA序列並將獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至14850所示的核酸序列進行比對。
在一些實施方案中，獲得DNA序列包括以下步驟：在樣品中獲得原始序列讀出並對原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
在一些實施方案中，原始序列讀出通過基於PCR的高通量測序技術來獲得。在一些實施方案中，原始序列讀出通過Illumina測序來獲得。
在一些實施方案中，對原始序列讀出進行處理包括：去除銜接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，以及去除與人基因組匹配的序列。在一些實施方案中，短序列的長度為59bp或更小。
在一些實施方案中，DNA序列的比對使用種子延伸策略。在一些實施方案中，使用在種子序列中無錯配的序列來在步驟b)中確定每個參考CAG的豐度。在一些實施方案中，種子序列的長度為4bp或更大、5bp或更大、6bp或更大、7bp或更大、8bp或更大、9bp或更大、10bp或更大、11bp或更大、12bp或更大、13bp或更大、14bp或更大、15bp或更大、16bp或更大、17bp或更大、18bp或更大、或者19bp或更大。在一些實施方案中，種子序列的長度為31bp或更小、30bp或更小、29bp或更小、28bp或更小、27bp或更小、26bp或更小、25bp或更小、24bp或更小、23bp或更小、22bp或更小、或者21bp或更小。在一些實施方案中，種子序列的長度為20bp。
在一個實施方案中，在飲食干預或疾病治療期間，在飲食干 預或疾病治療開始後1周、2周、3周和/或4周收集糞便樣品。
在一些實施方案中，當在飲食干預或疾病治療期間GMM指數變得接近或高於預定水平時，確定物件對飲食干預或疾病治療產生積極回應。在一些實施方案中，預定水平為-1.028883。
在第三方面，本發明提供了在物件中評估2型糖尿病的存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,；以及d)如果ESP指數接近或低於預定水平，則確定物件患有或有風險發生2型糖尿病，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
在一些實施方案中，步驟b)中的DNA分析包括以下步驟：獲得DNA序列並將所獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至2783所示的核酸 序列進行比對。
在一些實施方案中，獲得DNA序列包括以下步驟：在樣品中獲得原始序列讀出並對原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
在一些實施方案中，原始序列讀出通過基於PCR的高通量測序技術來獲得。在一些實施方案中，原始序列讀出通過Illumina測序來獲得。
在一些實施方案中，對原始序列讀出進行處理包括：去除銜接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，並去除與人基因組匹配的序列。在一些實施方案中，短序列的長度為59bp或更小。
在一些實施方案中，DNA序列的比對使用種子延伸策略。在一些實施方案中，使用在種子序列中無錯配的序列來在步驟b)中確定每個參考CAG的豐度。在一些實施方案中，種子序列的長度為4bp或更大、5bp或更大、6bp或更大、7bp或更大、8bp或更大、9bp或更大、10bp或更大、11bp或更大、12bp或更大、13bp或更大、14bp或更大、15bp或更大、16bp或更大、17bp或更大、18bp或更大、或者19bp或更大。在一些實施方案中，種子序列的長度為31bp或更小、30bp或更小、29bp或更小、28bp或更小、27bp或更小、26bp或更小、25bp或更小、24bp或更小、23bp或更小、22bp或更小、或者21bp或更小。在一些實施方案中，種子序列的長度為20bp。
在一些實施方案中，預定水平為約4.4。
在第四方面，本發明提供了在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法，其包括以下步驟： a)在飲食干預或疾病治療之前和期間從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,；以及e)如果在於飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中ESP指數提高，則確定物件對飲食干預或疾病治療產生積極回應，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
在一些實施方案中，步驟b)中的DNA分析包括以下步驟：獲得DNA序列並將所獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至2783所示的核酸序列進行比對。
在一些實施方案中，獲得DNA序列包括以下步驟：在樣品中獲得原始序列讀出並對原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
在一些實施方案中，原始序列讀出通過基於PCR的高通量測序技術來獲得。在一些實施方案中，原始序列讀出通過Illumina測序來獲得。
在一些實施方案中，對原始序列讀出進行處理包括：去除銜 接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，並去除與人基因組匹配的序列。在一些實施方案中，短序列的長度為59bp或更小。
在一些實施方案中，DNA序列的比對使用種子延伸策略。在一些實施方案中，使用在種子序列中無錯配的序列來在步驟b)中確定每個參考CAG的豐度。在一些實施方案中，種子序列的長度為4bp或更大、5bp或更大、6bp或更大、7bp或更大、8bp或更大、9bp或更大、10bp或更大、11bp或更大、12bp或更大、13bp或更大、14bp或更大、15bp或更大、16bp或更大、17bp或更大、18bp或更大、或者19bp或更大。在一些實施方案中，種子序列的長度為31bp或更小、30bp或更小、29bp或更小、28bp或更小、27bp或更小、26bp或更小、25bp或更小、24bp或更小、23bp或更小、22bp或更小、或者21bp或更小。在一些實施方案中，種子序列的長度為20bp。
在一個實施方案中，在飲食干預或疾病治療期間，在飲食干預或疾病治療開始後1周、2周、3周和/或4周收集糞便樣品。
在一些實施方案中，當在飲食干預或疾病治療期間ESP指數變得接近或高於預定水平時，確定物件對飲食干預或疾病治療產生積極回應。在一些實施方案中，預定水平為4.4。
第五方面，本發明提供了一種微生物，其包含CAG NO.：1至15對應細菌中的一種或更多種，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
根據以下不應被解釋為限制性的詳細描述和實例，本公開內容的其他特徵和優點將是明顯的。在本申請通篇引用的所有參考文獻、Genbank條目、專利和公開專利申請的內容均通過引用明確地並入本文。
圖1示出了一個實施例中臨床試驗的概況。
圖2示出了高膳食纖維飲食在患有2型糖尿病的患者中改變腸微生物群並且改善葡萄糖體內平衡。(A)葡萄糖體內平衡的迴圈參數(HbAlc、空腹血糖、膳食耐量測試(meal tolerance test，MTT)中的葡萄糖和胰島素曲線下面積(area-under-curve，AUC))的變化。資料表示為從第0天起的百分比變化(±標準誤差)。使用具有Tukey事後檢驗的雙向重複測量方差分析進行組內和組間比較。相對於同一組的第0天*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001；相對於相同時間點的U組# P<0.05、## P<0.01和### P<0.001。對於所有分析，對於W組，N=27；並且對於U組，n=16，除在針對MTT的U組中n=15之外。(B)整體腸微生物結構的變化。基於Bray-Curtis距離對422個細菌共豐度基因集進行主座標分析。(C)腸微生物群多樣性(基因豐富度)的變化。將基因計數的變化調整至每個樣品3100萬個映射讀出。資料示為平均值±S.E.M。箱(box)示出了中位數和四分位數間距，須(whisker)表示在與第一和第三四分位數的1.5倍IQR內的最低值和最高值，並且異常值表示為單獨點。使用Wilcoxon匹配對符號秩檢驗(雙尾的)來在每個組內分析每個成對比較。使用Mann-Whitney檢驗來分析在相同時間點W組與U組之間的差異。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001(根據Benjamini & Hochberg,1995調整)。W=阿卡波糖加WTP飲食；U=阿卡波糖加常規護理(對照)。
圖3示出了以膳食纖維補充性的腸微生物群的移植在小鼠中改善葡萄糖耐量。接受糞便微生物群移植的無菌小鼠的(A)體重、(B)空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、(C)口服葡萄糖耐量測試(在移植後2周)和(D)空腹迴圈胰島素。移植物材料從代表性供體獲得，一個來自W組，一個來自U組，干預前(“Pre”；第0天)和干預後(“Post”；第84天)二者皆有。接受移植物的小鼠：對於W-Pre、W-Post、U-Pre，n=5；對於U-Post，n=4。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001，使用具有Tukey事後檢驗的單向ANOVA進行組內和組間比較。W=阿卡波糖加WTP飲食；U=阿卡波糖加常規護理(對照)。
圖4示出了表示(A)W組或(B)U組中干預回應性細菌的豐度(經log轉換)的熱圖(使用Wilcoxon匹配對符號秩檢驗來比較第0天和第28天的資料。P<0.05，根據Benjamini & Hochberg,1995調整)。用Spearman相關係數和ward連接對細菌進行聚類。對於W，n=27；對於U，n=16。
圖5示出了潛在的生態系統服務提供者(ESP)和共排除的不利細菌。針對W組中在干預之後豐度(A)降低或(B)提高，或者U組中在干預之後豐度(C)降低或(D)提高的基因組示出了154個高質量基因組草圖中參與短鏈脂肪酸(SCFA)、H2S和吲哚產生的基因的分佈網路。緊鄰每個灰色圓圈(鑒定為細菌菌株的高質量基因組草圖)的直方圖表示第0天和第28天的平均豐度(經log轉換)。細菌豐度的變化根據圖4中的那些來確定。將灰色圓圈與其他形狀連接的線表示參與特定活性的基因。褐色三角形表示參與H2S產生的基因；紫色平行四邊形表示參與吲哚產生的基因；綠色和藍色形狀表示參與SCFA產生的基因。乙酸合成：甲酸四氫葉酸連接酶。丁酸合成：丁醯CoA：乙酸CoA轉移酶(But)；丁醯CoA：乙醯乙酸CoA轉 移酶(Ato；由α(AtoA)和β(AtoD)亞基組成)；丁酸激酶(Buk)；丁醯CoA：4-羥基丁酸CoA轉移酶(4Hbt)。丙酸合成：丙酸CoA轉移酶/丙醯CoA：琥珀酸CoA轉移酶(PCoAt)。(E)生態系統服務提供者的豐度的變化。圓圈的大小和顏色分別表示菌株的平均豐度和豐度變異係數。W=阿卡波糖加WTP飲食；U=阿卡波糖加常規護理(對照)。
圖6顯示，高纖維飲食降低內毒素載量和炎症。(A)脂多糖結合蛋白。(B)白細胞計數。(C)TNF-α。使用具有Tukey事後檢驗的雙向重複測量方差分析進行組內和組間比較。相對於同一組的第0天*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；相對於相同時間點的U組# P<0.05、## P<0.01、### P<0.001。對於W組，N=27；對於U組，n=16。W=阿卡波糖加WTP飲食；U=阿卡波糖加常規護理(對照)。
圖7示出了細菌CAG的豐度與2型糖尿病的表型減輕之間的關係。(A-B)W組(A)和U組(B)中由細菌CAG的豐度與臨床變數的水平之間的Spearman相關係數計算的熱圖：*=P<0.05、**=P<0.01(根據Benjamini & Hochberg,1995調整)。用Spearman相關係數和ward連接基於細菌的量對其進行聚類。(C)在GUT2DM專案中，HbA1c的干預後水平與腸微生物群調節(Gut Microbiota Modulation，GMM)指數負相關(Spearman相關係數(SCC)=-0.4901,P=1.0253e-11)，所述指數為訓練資料集(W組中27位患者和U組中16位患者)中增加的15個ESP除以降低的49個的豐度。(D)在測試性QIDONG臨床試驗中，HbA1c的干預後水平與74位元患者的測試資料集中的15個ESP及其49種共排除細菌的腸微生物群調節(GMM)指數也負相關(SCC=-0.4006,P=4.53e-7)，所述患者全部在無阿卡波糖下接受高纖維飲食3個月。
圖8顯示，生態系統服務提供者(ESP)的豐度和多樣性與2型糖尿病患者中疾病表型的減輕相關。(A)單一ESP的豐度與臨床變數之間的關係的熱圖。*P<0.05和**P<0.01。(B)ESP指數(ln(Heip×1010× A i )，其中A i 是ESP i 的豐度)的變化。(C)GUT2D研究中ESP指數(第0天和第84天)與HbA1c(第0天和第84天)之間的關係。N=43。(D)GUT2D研究中ESP指數(第0天和第28天)與HbA1c(第0天和第84天)之間的關係。N=43。(E)QIDONG研究中ESP指數(第0天和第84天)與HbA1c(第0天和第84天)之間的關係。N=71。所有相關係數均使用Bland和Altman(16)所述的方法來計算。W=阿卡波糖加WTP飲食；U=阿卡波糖加常規護理(對照)。
為了可以更容易地理解本公開內容，在此對某些術語進行限定。另外的限定在具體實施方式中闡述。
術語“共豐度基因集”或“CAG”指在豐度方面與隨機挑選的種子基因相關的基因的集合。將宏基因組分離成具有類似豐度的基因集允許鑒定例如原核生物和噬菌體的生物實體，以及代表共遺傳的克隆異質性的小遺傳實體。
本文使用的術語“CAG No.：i的大小”指CAG No.：i的長度，即CAG No.：i的核苷酸的數目。
術語“生物標誌物”指某種生物狀態或狀況的可測量指標。本文使用的生物標誌物是CAG，其豐度數據可以指示T2D。
本文使用的術語“接受者操作特徵曲線(Receiver operating characteristic curve)”或“ROC曲線”指對二進位分類器系統隨著其鑒別閾 值變化的診斷能力進行展示的圖形曲線。ROC曲線通過在不同閾值設置下將真陽性率相對於假陽性率繪圖來產生。真陽性率也稱為靈敏度、召回率或檢出概率。假陽性率也稱為誤警率(fall-out)或虛警(false alarm)概率，並且可以作為(1-特異度)計算。因此，ROC曲線是作為誤警率的函數的靈敏度。
術語“Youden指數”指真陽性率與假陽性率之間的差異。使該指數最大化允許從ROC曲線發現獨立於流行率的最佳截止點。該指數圖示為在機會線之上的高度。
本文使用的術語“ROC曲線下面積”或“AUC”用於表示將受試組群分離成患有所討論疾病和未患所討論疾病的那些的檢驗的準確度。
在本發明中，通過掃描整個腸微生物組，已發現數個CAG在來自回應于高纖維飲食干預的T2D患者的樣品中普遍分佈。在這些CAG中，15個上調，而49個下調。基於這些CAG或這些CAG中一些在糞便樣品中的豐度計算的GMM指數和ESP指數可用於在物件中評估T2D的存在或發生T2D的風險。或者，這些CAG或這些CAG中一些的豐度變化可用於在患有T2D的患者中監測針對疾病治療或飲食干預的回應。兩種方法都可以以高效、準確且患者友好的方式進行。
本發明提供了在物件中評估2型糖尿病之存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至64的每個參考CAG的豐度： A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及d)如果GMM指數接近或低於預定水平，則確定物件患有或有風險發生2型糖尿病。
本發明提供了在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療的效力的方法，其包括以下步驟：a)在飲食干預或疾病治療之前和期間從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至64的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及e)如果在於飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中GMM指數提高，則確定物件對飲食干預或疾病治療產生積極回應。
對於ESP指數方面，本發明提供了在物件中評估2型糖尿病的存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個 參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,；以及d)如果ESP指數接近或低於預定水平，則確定物件患有或有風險發生2型糖尿病。
本發明還提供了在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法，其包括以下步驟：a)在飲食干預或疾病治療之前和期間從物件收集糞便樣品；b)分析從糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,；以及e)如果在於飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中ESP指數提高，則確定物件對飲食干預或疾病治療產生積極回應。
在本發明中，CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、 192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列，並且CAG NO.：16至64分別包含SEQ ID NO.：2784至2961、2962至3130、3131至3525、3526至3747、3748至3863、3864至4068、4069至4212、4213至4393、4394至4532、4533至4891、4892至4979、4980至5116、5117至5320、5321至5464、5465至5781、5782至6279、6280至6646、6647至6954、6955至7178、7179至7613、7614至7758、7759至8046、8047至8491、8492至8546、8547至9971、9972至10099、10100至10392、10393至10502、10503至10694、10695至10986、10987至11089、11090至11262、11263至11466、11467至11704、11705至12034、12035至12113、12114至12341、12342至12454、12455至12664、12665至12825、12826至13042、13403至13500、13501至13726、13727至13949、13950至14014、14015至14290、14291至14403、14404至14686和14687至14850所示的核酸序列。
為了確定本發明的每個參考CAG的豐度，可以使用本領域中公知的任何方法。在一些實施方案中，從糞便樣品獲得DNA序列並隨後將其與CAG序列進行比對。在一些實施方案中，在DNA序列的比對中使用種子延伸策略，並使用在種子序列中無錯配的序列來確定每個參考CAG的豐度。在一些實施方案中，種子序列的長度為20bp。
獲得DNA序列包括在樣品中獲得原始序列讀出並對原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。在一些實施方案中，原始序列讀出通過基於PCR的高通量測序技術來獲得。在一些實施方案中，原始序列讀出通過Illumina測序來獲得。對原始序列讀出的處理可以如本領域中已知 的進行。在一些情況下，處理包括去除銜接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，並去除與人基因組匹配的序列。在一些實施方案中，短序列的長度為59bp或更小。
在用於在物件中評估T2D之存在或發生風險的方法中，如果GMM指數或ESP指數接近或低於預定水平，則確定物件患有或有風險發生T2D。
預定水平可以根據實驗室資料或臨床資料來設置。即使水平是預定的，醫院或醫生也可以根據物件的年齡、性別、身體狀況等對其進行調整。
在本發明的一個優選實施方案中，對於GMM指數，預定水平為約-1.028883。在本發明的一個優選實施方案中，對於ESP指數，預定水平為約4.4。這些特定水平基於已使用在下文實施例中所述的資料產生的接受者操作特徵曲線來確定。如上所述，接受者操作特徵曲線是對二進位分類器系統隨著其鑒別閾值變化的診斷能力進行展示的圖形曲線。並且，Youden指數指真陽性率與假陽性率之間的差異。Youden指數通常與接受者操作特徵(ROC)分析聯合使用。該指數針對ROC曲線的所有點進行限定，並且該指數的最大值可用作用於在診斷測試提供數值結果而不是二分結果時選擇最佳截止點的標準。在本發明中，當HbA1c>=6.5%時，二進位數字設置為1。相應地，當Youden指數達到最大值時，GMM指數為-1.028883；並且當Youden指數達到最大值時，ESP指數為4.4。即，如果物件被確定具有高於-1.028883的GMM指數，則其可能具有低於6.5%的HbA1c水平，其中準確度為90.48%；如果物件被確定具有低於或等於-1.028883的GMM指數，則其可能具有高於6.5%的HbA1c水平，其中準確度為44.75%。對於ESP 指數，如果物件被確定具有高於4.4的ESP指數，則其可能具有低於6.5%的HbA1c水平，其中準確度為92.11%；如果物件被確定具有低於或等於4.4的ESP指數，則其可能具有高於6.5%的HbA1c水平，其中準確度為45.52%。
對於在患有T2D的物件中監測針對疾病治療或飲食干預的回應的方法，當在疾病治療或飲食干預期間GMM指數或ESP指數提高或者在一些實施方案中變得接近或高於預定水平時，確定物件對疾病治療或飲食干預產生積極回應。如上所述，對於GMM指數，預定水平優選為約-1.028883，或者對於ESP指數，預定水平優選為約4.4，其基於相應ROC曲線和Younden指數來確定。
本發明還提供了一種微生物，其包含CAG NO.：1至15對應細菌中的一種或更多種，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
實施例
患者和方法
GUT2D研究
用於患有2型糖尿病(T2DM)的患者的隨機化、開放標簽、平行組臨床試驗由上海交通大學醫學院上海總醫院倫理委員會批准(No.2014KY086)，並且該研究根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的原則進行。所有參與者均在試驗開始時提供了書面知情同意書。該試驗在中國臨床試驗註冊中心登記(No.ChiCTR-TRC-14004959)。臨床試驗的設計和進程示於圖1中。
招募的參與者為35至70歲的中國漢族T2DM患者(6.5%HbA1c12.0%)。主要排除標準包括：1型糖尿病；妊娠；哺乳期；打算在研究過程期間妊娠；嚴重糖尿病並發症(糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病性腎病和糖尿病足)；嚴重肝病(包括慢性持續性肝炎、肝硬化、或陽性乙型肝炎病毒表面抗原和異常肝轉氨酶(丙氨酸轉氨酶或天冬氨酸轉氨酶的血清濃度>2.5×正常值上限)的共現)；在招募前3個月內連續使用抗生素>3天；連續使用減肥藥物>1個月；胃腸外科手術(除闌尾炎或疝外科手術之外)；在過去6個月內具有嚴重的精神疾病；接受藥物治療以治療膽囊炎、消化性潰瘍、尿路感染、急性腎盂腎炎、膀胱炎或甲狀腺機能亢進；垂體功能障礙；嚴重的器質性疾病，包括癌症、冠心病、心肌梗死或腦中風；感染性疾病，包括肺結核和AIDS；以及酒精中毒。
在2周的導入期期間，終止除胰島素促分泌劑或甘精胰島素之外的所有抗糖尿病藥物以避免這些藥物對腸微生物群的潛在作用。在干預之前(第0天)，所有參與者都接受有關T2DM的健康教育和基線評價。使用基於飲食的食物頻率問卷和24小時飲食記錄，基於中國食物成分表2009(17)來計算基線營養物攝入量。將參與者隨機分配為接受阿卡波糖加針對T2DM的常規護理(U組)，或阿卡波糖加基於全穀物、中藥食品或益生元(prebiotics)的飲食配方(WTP飲食)(W組)，進行84天。
常規護理由根據中國T2DM糖尿病防治指南(Chinese diabetes guidelines for T2DM)(2013年版)的標準飲食和運動建議組成。WTP飲食包括三種即食型預製食物：配方No.1(2)、配方No.2(2)和配方No.8(由完美(中國)有限公司(中國中山)製造)。對於W組，根據營養學家的建議，將WTP飲食與適量的蔬菜、水果和堅果聯合施用。根據由中國居民膳 食營養素參考攝入量(Dietary Reference Intake，DRI)提供並由中國營養協會(Chinese Nutrition Society)(CNS,2013)建議的根據年齡的標準營養要求平衡常量營養物的輸入量。配方No.1是來自全穀物的12種組分材料和富含膳食纖維的中藥(traditional Chinese medicine，TCM)食用植物(包括薏苡(薏米(Coix lachrymal-jobi L.))、燕麥、蕎麥、白豆(white bean)、黃玉米(yellow corn)、紅豆、大豆、薯蕷、花生、蓮子和枸杞)的預烹製混合物，其以罐裝粥狀物的形式製備(每罐370g濕重)。各自包含100g成分(59g碳水化合物、15g蛋白質、5g脂肪和6g纖維)和336千卡(70%碳水化合物、17%蛋白質、13%脂肪)。配方No.2是包含苦瓜(苦瓜(Momordica cnarantia))和寡糖(包括果糖-寡糖和寡聚異麥芽糖)的輸注用粉末製劑(每袋20g)。配方No.8的詳細組成示於下表1中。對於每份膳食，作為主食食用360g的配方No.1，並分別以10g和15g食用配方No.2和No.8。使用每位元物件的飲食記錄基於中國食物成分表200939來計算營養物攝入量(表2)。阿卡波糖使用100mg的口服劑量施用，一天三次。參與者針對飲食、體重、藥物使用和不良事件記錄其治療方案。此外，記錄自監測每日空腹血糖(FBG)和餐後2小時血糖(2-hour postprandial blood glucose，2h PBG)，並根據症狀改善和每日兩點血糖譜來調整背景治療(胰島素促分泌劑和甘精胰島素)的劑量(表3)。
在基線和在干預期間每28天獲得生物樣品、人體測量資料和臨床實驗室分析。在過夜禁食10小時後收集靜脈血樣品，然後對參與者進行3小時的口服葡萄糖耐量測試。所有參與者攝入75g葡萄糖，並在30、60、120和180分鐘時獲得血液樣品。將血液樣品在室溫下靜置30分鐘後以3,000×g離心20分鐘以獲得血清。在同一天收集糞便和晨尿。收集血清、尿和糞便樣品，立即轉移至乾冰，並儲存在-80℃，在5小時內用於另外的分析。
在上海交通大學醫學院上海總醫院(中國上海)確定生物臨床參數。
QIDONG研究
在啟東人民醫院(Qidong People’s Hospital)(中國江蘇)進 行的這項臨床試驗檢測高膳食纖維飲食在健康個體以及患有前驅糖尿病和臨床上診斷為T2DM的那些的組群中在自由生活條件下的作用(QIDONG；中國臨床試驗註冊中心：ChiCTR-IPC-14005346)。T2DM亞組的基線表型特徵與GUT2D中的那些大致類似。將患有T2DM的參與者隨機分為接受WTP飲食(無阿卡波糖；n=71)或常規護理(n=33)，進行84天。在基線和在干預結束時收集血液和糞便樣品，其中分別確定HbA1c和腸微生物譜。
統計學分析
使用SPSS Statistics 17.0套裝軟體(SPSS Inc.,Chicago,USA)進行統計學分析。使用具有Tukey事後檢驗(雙尾)的雙向重複測量方差分析分別進行生物臨床參數和炎症相關標誌物的組內和組間比較。使用Pearson卡方檢驗(雙尾的)來分析兩組中HbA1c為低於7.0%或6.5%的參與者的性別和比例的變化。使用Mann-Whitney U檢驗(雙尾的)來分析兩組在基線時其他特徵的變化。
腸微生物群移植
在第0天和第84天從兩位女性參與者(來自W組的2W009和來自U組的2U004)收集糞便樣品。這兩個供體是系統性選擇的-在所有參與者中確定干預後腸微生物譜變化，排除無顯著變化的那些，然後隨機選擇來自每個組的一位參與者作為代表性供體。將每個糞便樣品(0.5g)在厭氧室(80% N2：10% CO2：10% H2)中在25mL無菌林格工作緩衝劑(9g/L氯化鈉、0.4g/L氯化鉀、0.25g/L二水氯化鈣和0.05%(w/v)L-半胱氨酸鹽酸鹽)中稀釋。使糞便材料通過徹底渦旋(5分鐘)懸浮，並通過重力沈降5分鐘。將澄清的上清液轉移到乾淨的管中，並添加等體積的20%(w/v)脫脂乳(LP0031,Oxoid,UK)。接種物在實驗當天新鮮製備，將剩餘部分儲 存在-80℃直至第二次接種。
所有的動物實驗操作均由中國科學院動物研究所動物管理和使用委員會機構(Institute of Zoology Institutional Animal Care and Use Committee of the Chinese Academy of Sciences)批准，並根據委員會的指南進行。將斷奶的無菌雌性C57BL/6J小鼠(n=30)在定期12小時光迴圈(在06：00開啟光)下維持在柔性膜塑膠隔離器中。在移植前收集糞便、食物、水和襯墊的樣品。在充分混合下，將生理鹽水添加到樣品中。然後，使用平板塗布法在以下條件培養混合物：1)對於好氧細菌，在37℃下在好氧條件下在LB瓊脂、腦心浸液瓊脂和巰基乙酸鹽瓊脂上培養；2)對於厭氧細菌，在37℃下在厭氧條件下在岐阜厭氧培養基(Gifu anaerobic medium，GAM)上培養；以及3)對於真菌，在25℃至28℃下在好氧條件下在經改良的馬丁氏瓊脂和大豆胰蛋白腖瓊脂上培養。在1、2、4、7和14天後在光學顯微鏡下檢查所有培養物。
向小鼠隨意餵食無菌常規飼料(SLAC，中國上海)。通過對糞便、食物和襯墊進行定期細菌學檢查來對細菌污染進行監測。在6周齡時，將無菌小鼠圈養在單獨的籠中，並隨機分為4組(每組保持在單獨的隔離器中)。在適應2周後，向4組小鼠經口管飼100μL的以下糞便懸浮接種物之一：第0天的2W009(W-Pre；n=10)；第84天的2W009(W-Post；n=10)；第0天的2U004(U-Pre；n=5)；和第84天的2U004(U-Post；n=5)。次日重複接種以增強微生物群移植。在第14天，在過夜禁食8小時後，對所有小鼠進行2小時的口服葡萄糖耐量測試(OGTT)。在口服管飼D-葡萄糖(2g/kg體重)後，在0、15、30、60、90和120分鐘時從尾靜脈收集血液樣品，其中使用血糖儀(Accu-Chek® Performa)確定葡萄糖水平。
腸微生物群分析
1. 宏基因組測序：如先前所述(2)從糞便樣品提取DNA，並使用GENEWIZ Co.(中國北京)的Illumina HiSeq 3000進行測序。根據服務提供商指定的工作流程進行聚類生成、模板雜交、等溫擴增、線性化、以及測序引物的封閉變性和雜交。構建插入物大小為約500bp的文庫，之後進行高通量測序以獲得在正向和反向方向具有150bp的雙端讀出。
2. 資料品質控制：使用Prinseq(3)來進行：1)從3’端修剪讀出直至到達質量閾值為20的第一個核苷酸；2)當讀出為<60bp或含有“N”鹼基時，去除讀出對；和3)對讀出去重複。去除可以與人基因組(智人(H.sapiens)，UCSC hg19)匹配的讀出(使用--reorder--no-hd--no-contain-dovetail以Bowtie2(4)進行比對(種子序列的長度設置為20bp))。
3. 從頭非冗余巨集基因組基因目錄構建和基因豐度譜計算：將來自每個樣品的高質量雙端讀出用於用IDBA_UD(5)從頭組裝成至少500bp的重疊群。使用MetaGeneMark(6)預測基因。使用參數“-c 0.95-aS 0.9”用CH-HIT構建4,893,833個微生物基因的非冗余基因目錄。使用SOAPaligner(7)將高質量讀出映射到基因目錄上。將匹配的結果進行取樣並縮減到每個樣品3100萬。使用soap.coverage.script來在每個縮減步驟中計算基因長度歸一化鹼基計數。重複取樣操作30次，並將豐度的平均值用於進一步的分析。
4. 共豐度基因集(CAG)：使用基於Canopy的聚類演算法(8)用默認參數在所有樣品中基於所有基因的豐度來對其進行分箱。在後續分析中去除原始CAG：1)與canopy譜的Spearman相關性<0.7的基因；2)總 canopy譜的90%分佈在不超過3個樣品中；3)具有少於三個基因的CAG。將具有>700個基因的大CAG當作用於進一步分析的細菌CAG。用QIIME(9)基於Bray-Curtis距離和Procrustes對細菌CAG進行主成分分析。
5. 細菌CAG的組裝和分類學分配：如先前所述(2)對180個流行細菌CAG中每一個進行從頭組裝。簡言之，如下實現CAG和樣品特異性讀出：將所有高質量讀出與CAG特異性重疊群進行比對，然後用Velvet(10)進行從頭組裝。我們採用來自人類微生物組計劃(Human Microbiome Project，HMP)(http：//www.hmpdacc.org/reference_genomes/finishing.php)的用於高質量基因組草圖組裝的六個標準和checkM(11)來評估組裝體的質量：1)基因組組裝體的90%必須包括在重疊群(>500bp)中；2)90%的組裝鹼基必須處於>5x讀出覆蓋；3)重疊群N50必須為>5kb；4)支架N50必須為>20kb；5)平均重疊群長度必須為>5kb；以及6)>90%的核心基因必須存在於組裝體中。我們使用兩種方法來鑒定CAG的系統發生分類學，其高質量基因組草圖滿足至少5個HMP標準。首先，使用CVtree3.0網路服務器(12)用具有高質量組裝體的154個細菌CAG、來自HMP DACC資料庫的352個參考胃腸基因組和伺服器內置資料庫構建系統發生樹，所述伺服器應用組分向量來進行系統發生分析。然後，我們還應用SpecI(13)來對細菌CAG進行描繪，SpecI是基於40個通用的單拷貝系統發生標誌物基因將生物分組為物種聚類的方法。在蛋白質(BLASTP)和核苷酸(BLASTN)水平二者上，將低質量的CAG與來自NCBI資料庫的7,991個參考基因組進行比對。用查詢覆蓋率(>70%)和E值(在核苷酸水平，<1e-10；在蛋白質水平，<1e-5)將該比對結果過濾。基於先前描述的分類學分配閾值(14)，將CAG分配到物種或屬級(物種級：90%的基因可以映射到在DNA水平上具有>95%同一 性的物種基因組；屬級：80%的基因可以映射到在DNA和蛋白質水平二者上具有>85%同一性的屬)。
6. GMM指數和ESP指數計算
使用Bowtie2用參數--reorder--no-hd--no-contain-dovetail將來自GUT2D和/或QIDONG資料集的每個樣品的高質量讀出與64個高質量基因組草圖進行比對(種子序列的長度設置為20bp)。過濾與YT：Z：DP(指示讀出為一對的一部分並且該對不一致地比對)的比對結果。GMM指數=log( A i / A i )，其中A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)。ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,A i (CAG No.：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)。
7. 統計學分析：根據Benjamini & Hochberg(18)，使用Wilcoxon匹配對符號秩檢驗(雙尾的)並進行調整來鑒定干預回應性細菌CAG。用“mafdr”指令在MATLAB®程式中進行P值調整。用R包“randomForest”進行隨機森林分析，並用“rfcv”進行交叉驗證。
8. 資料可用性
所有樣品的原始焦磷酸測序和Illumina讀出資料都已經以登錄號PRJEB1455(GUT2D研究)和PRJEB15179(QIDONG研究)歸入歐洲核苷酸檔案庫(European Nucleotide Archive，ENA)中。
實施例1. 高纖維干預在患有T2DM的患者中顯著改善生物臨床參數
在干預的第一個月期間，幾乎所有的生物臨床參數在W組和U組二者中都改善。糖化血紅蛋白(HbA1c)水平(當前臨床試驗中的主要結果)在兩個組中都隨時間從基線水平顯著降低(圖2A)。截止第84天，HbA1c的降低在W組中大於U組中。在干預結束時(第84天)，充分血糖控制率(組群中HbA1c<7%的比例)在W組中顯著高於U組中(88.9%相對於50.5%,P=0.005)。更加嚴格的目標實現率(組群中HbA1c<6.5%的比例)顯示類似(儘管不顯著的)趨勢(51.9%相對於25.0%，P=0.084)。與U組相比，W組中的患者還減輕顯著更大百分比的體重，並且表明脂質譜和炎症水平顯著改善。可以刺激胰島素分泌並抑制胰高血糖素分泌的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和肽YY(PYY)的水平在W組中隨時間顯著提高，而在U組中則沒有。
實施例2. 高纖維干預在患有T2DM的患者中調節腸微生物群的整體結構
對在4個時間點(第0、28、56和84天)收集的172個糞便樣品進行鳥槍宏基因組測序。從4,893,833個微生物基因的非冗余基因目錄中，鑒定422個共豐度基因集(CAG；使用基於Canopy的演算法(19)分箱)為不同的細菌基因組。基於來自422個細菌CAG的Bray-Curtis距離，腸微生物群的整體結構(如主座標分析所示的)在兩個組中顯示第0天至第28天顯著改變，之後不再進一步改變(圖2B)。在干預結束時(第84天)，W組與U組之間在腸微生物結構方面的顯著差異(P=0.0056)反映了WTP飲食對腸微生物群的獨特調節作用。在兩組中基因豐富度(每個樣品鑒定的基因的數目)明顯降低，在這之後是如整體微生物結構中的類似趨勢，即：在第28天顯著降低，並且在干預的剩餘時間保持穩定(圖2C)。基因 豐富度的這一整體下降對以下目前觀點提出挑戰：較高的多樣性意味著較佳的健康(20)。然而，與U組相比，第28天的基因豐富度在W組中顯著更高，並且在第56天和第84天觀察到類似趨勢(圖2C)，這與W組中的代謝結果更佳一致。此外，將所有生物臨床變數組合並且具有422個細菌CAG的Procrustes分析顯示，腸微生物群的結構變化與干預期間臨床結果的改善相關(P<0.0001，來自999 Monte-Carlo類比)。總之，表明，WTP飲食在T2DM患者中誘導腸微生物群的整體結構顯著變化並且這些與整體臨床結果改善相關。
實施例3. 移植表明腸微生物群對減輕T2DM的因果性貢獻
為了建立飲食改變的腸微生物群與葡萄糖代謝改善之間的因果關係，將來自W組和U組中參與者的干預前和干預後(分別為第0天和第84天)腸微生物群移植到無菌C57BL/6J小鼠中。在移植14天後，接受來自W組的干預後微生物群的小鼠具有顯著更低的體重(圖3A)。當與移植有來自W組的干預前微生物群或者來自U組的任一時間點的微生物群的那些相比時，這些小鼠還具有最低的空腹血糖和餐後血糖，顯示與空腹胰島素水平相關的效應(圖3B至3D)。我們的干預通過微生物移植的轉移效應確定，高膳食纖維引起的腸微生物群變化因果地有助於改善T2DM患者中的葡萄糖體內平衡。
實施例4. 特定菌株對纖維攝取作出回應
組裝高質量基因組草圖以鑒定驅動膳食纖維對減輕T2DM表型的腸特異性作用的細菌物種/菌株。由>20%樣品所共有的CAG組裝154個高質量基因組草圖。映射到這些高質量基因組草圖的每個樣品的總讀出百分比為57%(±11%)，這代表整個組群中的流行和主導腸細菌二者。154 個高質量基因組草圖中的141個具有至少一種用於SCFA產生的關鍵基因，並且可以視為SCFA產生者。在154個高質量基因組草圖中，選擇64種細菌用於進一步分析，因為：1)其是通過Wilcoxon匹配對符號秩檢驗鑒定的干預回應性CAG，如W或U組中在第28天通過干預顯著改變的(圖4)；以及2)其具有用於SCFA、H2S或吲哚生物合成的基因中的至少一種。W組中升高的所有15個基因組具有用於SCFA生物合成的基因和用於乙酸產生的基因中的至少一種(包括也在U組中富集的3個)，並且其中5個還具有丁酸生物合成的能力(圖5B和5D)。這與在兩組中糞便乙酸在較大程度上類似的提高以及乙酸合成途徑的富集一致，但是WTP飲食對誘導丁酸產生的作用不同。這15個基因組的富集大部分在第28天達到峰值(圖5E)，這也符合我們在整體腸微生物群中觀察到的模式，這進一步支援這些細菌菌株為生態系統中結構變化的關鍵驅動者。
這15種細菌(包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、真桿菌屬(Eubacterium spp.)和普氏糞桿菌(Faecalibacterium prausnitzii))在W組可以服務於補充乙酸和丁酸的重要目的，並且因此可以是該必需功能的生態系統服務提供者(ESP)。來自碳水化合物的高效能量產生和針對低pH的耐受性可以解釋這些細菌為什麽相對於其他SCFA產生者具有競爭優勢。在此，一個良好實例是雙歧桿菌屬，與其他乙酸產生者相比，其利用其“雙歧”途徑(21)而能夠產生更多的ATP分子和乙酸。有趣的是，儘管SCFA產生的總體遺傳能力提高，但是我們的干預顯著減少大多數SCFA產生者(圖5A和5C)，這清楚地表明，並不是所有具有功能基因的細菌都可以對底物補充產生回應並且變成宿主所需功能的提供者。我們設想，這至少部分地由腸腔pH變化驅動，因為已知一些SCFA產生者是高度pH敏感的，例如多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)和普通擬桿菌(B.vulgatus)(12)。因此，我們的資料對微生物組領域的以下共識提出挑戰，所述共識主要根據基於基因的功能預測來假定腸細菌與宿主的生理相關性。
在兩組中任一組中顯著下調的49種細菌是具有用於合成脂多糖、吲哚和H2S的基因的那些。而且，根據基因中心途徑分析，這表明產生代謝不利化合物的能力降低可能有助於高膳食纖維飲食的有益作用。已顯示內毒素產生降低減輕炎症並恢復胰島素敏感性(22,23)。脂多糖結合蛋白(內毒素載量的替代標誌物)和炎性標誌物在W組中低於U組中，表明炎症的減輕可能是由於內毒素產生降低(圖6)。吲哚和H2S產生細菌的豐度減小改善了對GLP-1產生的抑制(24-26)，這與在W組中觀察到的較大餐後GLP-1回應一致。總之，顯示減少產生不利代謝物的細菌實現宿主的臨床顯著改善。
上述15個ESP：CAG0023、CAG0033、CAG0037、CAG0045、CAG0046、CAG0064、CAG0079、CAG0106、CAG0133、CAG0153、CAG0155、CAG0207、CAG0224、CAG0236和CAG0409在本發明中分別表示為CAG NO.：1至15。顯著下調的49種細菌CAG0010、CAG0012、CAG0015、CAG0017、CAG0018、CAG0021、CAG0022、CAG0028、CAG0031、CAG0032、CAG0034、CAG0035、CAG0048、CAG0051、CAG0057、CAG0058、CAG0063、CAG0067、CAG0075、CAG0076、CAG0080、CAG0082、CAG0086、CAG0090、CAG0093、CAG0100、CAG0111、CAG0116、CAG0122、CAG0128、CAG0131、CAG0134、CAG0138、CAG0173、CAG0178、CAG0185、CAG0202、CAG0221、CAG0246、CAG0248、CAG0255、CAG0264、CAG0281、CAG0292、CAG0312、CAG0331、CAG0341、CAG0365和CAG0390在本發明中分別表示為CAG NO.：16至64。
每個樣品的腸微生物群調節(GMM)指數基於15個ESP以及在干預後降低的49個ESP的豐度數據來計算。GMM指數=log( A i / A i )，其中A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)。該GMM指數在所所有患者中與干預後HbA1c水平顯著負相關(Spearman相關係數(SCC)=-0.4901,P=1.0253e-11)，表明由MAC提高促成的微生物群中有貢獻細菌的組成改變與主要臨床結果相關(圖7C)。
ESP(生態系統服務提供者)指數僅基於在干預後提高的15個ESP的豐度數據來計算。ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,A i (CAG No.：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)。ESP指數在W組和U組二者中都遵循類似的軌迹，即從基線急劇增加至第28天並在干預的剩餘時間保持在類似水平，但是該指數在每個干預後時間點在W組中顯著更高(第28、56和84天，圖8B)。在基線時和在干預結束時HbA1c與ESP指數之間的顯著負相關(第0天和第84天；r=-0.6731；P=5.55e-07；圖8C)確定這些ESP在調節宿主葡萄糖體內平衡中的作用。雖然臨床結果(例如HbA1c)隨著干預的持續時間持續降低(圖2A)，ESP指數從第28天開始達到平穩(圖8B)。我們的資料清楚地表明膳食纖維誘導的ESP富集發生在臨床結果的顯著變化之前。當將第28天(代替第84天)的ESP指數與第84天的HbA1c一起用於繪製干預後資料點同時保持與圖8C中完全相同的基線資料點組，在HbA1c與ESP指數之間觀察到類似的負相關性(r=-7434；P=7.48e-08；圖8D)。這表明，第28天的ESP指數(指示15個ESP在該早期時間點的富集)可對更晚發生的最終治療結果具有資訊性。
實施例5. 生態系統服務提供者為不同的T2DM患者組群所共有
最後，為了發現其他T2DM患者組群是否共有在GUT2D試驗中鑒定到的生態系統服務提供者，進行了另一項獨立臨床試驗(QIDONG)，在該試驗中，使74位T2DM患者在無阿卡波糖下接受WTP飲食3個月。在干預後，HbA1c水平從基線顯著改善。對於所有患者，在基線和每個月末時收集糞便樣品。以14.1G的平均深度對148個樣品進行宏基因組測序。超過一半的測序讀出被映射到在GUT2DM專案中組裝的154個高質量基因組草圖，顯示對應的流行腸細菌是中國T2DM患者的不同組群共有的。在QIDONG試驗的患者中存在GUT2D中鑒定的15個ESP和由於這些ESP升高而共排除的49種細菌。值得注意的是，使用第二項試驗(不具有阿卡波糖)來提供測試資料集，基於15個ESP及其共排除細菌的GMM指數與主要結果(HbA1c水平)具有類似的顯著負相關性(圖7D)。
此外，使用在GUT2D中被鑒定為對膳食纖維具有積極回應性的15個SCFA提供者的相同組，在該QiDong干預組中在ESP指數與HbA1c之間存在類似的負相關性(圖8E)。
根據來自在GUT2D研究中收集的172個糞便樣品和在QIDONG研究中收集的148個樣品的GMM指數建立接受者操作特徵曲線(ROC)，其留一交叉驗證ROC下面積(AUC)達到0.7052，其中當HbA1c>=6.5%時，二進位數字設置為1，並且特異度和靈敏度分別為90.48%和44.75%。當Youden指數達到最大值時，GMM指數為-1.02888。
根據來自在GUT2D研究中收集的172個糞便樣品的ESP指數建立接受者操作特徵曲線(ROC)，其留一交叉驗證ROC下面積(AUC) 達到0.70，其中當HbA1c>=0.65%時，二進位數字設置為1，並且特異度和靈敏度分別為92.11%和45.52%。當Youden指數達到最大值時，ESP指數為4.4。
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<400> 1

Claims (22)

  1. 一種在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法，其包括以下步驟：a)在所述飲食干預或疾病治療之前和期間從所述物件收集糞便樣品；b)分析從所述糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至64的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；d)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及e)如果在所述飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中所述GMM指數提高，則確定所述物件對所述飲食干預或疾病治療產生積極回應，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列，並且CAG NO.：16至64分別包含SEQ ID NO.：2784至2961、2962至3130、3131至3525、3526至3747、3748至3863、3864至4068、4069至4212、4213至4393、4394至4532、4533至4891、4892至4979、4980至5116、5117至5320、5321至5464、5465至5781、5782至6279、6280至6646、6647至6954、6955至7178、7179至7613、7614至7758、7759至8046、8047至8491、8492至8546、8547至9971、9972至10099、10100至10392、10393至10502、10503至10694、10695至10986、10987至11089、11090至11262、11263至11466、11467至11704、11705至12034、12035至 12113、12114至12341、12342至12454、12455至12664、12665至12825、12826至13042、13403至13500、13501至13726、13727至13949、13950至14014、14015至14290、14291至14403、14404至14686和14687至14850所示的核酸序列。
  2. 一種在物件中評估2型糖尿病之存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從所述物件收集糞便樣品；b)分析從所述糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至64的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的GMM指數：GMM指數=log( A i / A i )；以及d)如果GMM接近或低於預定水平，則確定所述物件患有或有風險發生2型糖尿病，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列，並且CAG NO.：16至64分別包含SEQ ID NO.：2784至2961、2962至3130、3131至3525、3526至3747、3748至3863、3864至4068、4069至4212、4213至4393、4394至4532、4533至4891、4892至4979、4980至5116、5117至5320、5321至5464、5465至5781、5782至 6279、6280至6646、6647至6954、6955至7178、7179至7613、7614至7758、7759至8046、8047至8491、8492至8546、8547至9971、9972至10099、10100至10392、10393至10502、10503至10694、10695至10986、10987至11089、11090至11262、11263至11466、11467至11704、11705至12034、12035至12113、12114至12341、12342至12454、12455至12664、12665至12825、12826至13042、13403至13500、13501至13726、13727至13949、13950至14014、14015至14290、14291至14403、14404至14686和14687至14850所示的核酸序列。
  3. 一種在患有2型糖尿病的物件中評價飲食干預或疾病治療之效力的方法，其包括以下步驟：a)在所述飲食干預或疾病治療之前和期間從所述物件收集糞便樣品；b)分析從所述糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ；以及e)如果在所述飲食干預或疾病治療期間收集的樣品中所述ESP指數提高，則確定所述物件對所述飲食干預或疾病治療產生積極回應，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265 至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
  4. 一種在物件中評估2型糖尿病之存在或發生風險的方法，其包括以下步驟：a)從所述物件收集糞便樣品；b)分析從所述糞便樣品提取的DNA以確定選自CAG ID No.：1至15的每個參考CAG的豐度：A i (CAG No：i的豐度)=與CAG No.：i匹配的讀出的數目/(CAG No.：i的大小×總讀出的數目)；c)使用所計算的豐度數據來計算每個樣品的ESP指數：ESP指數=ln(Heip×1010× A i )，其中Heip=(e H -1)/14，H=- A i InA i ,；以及d)如果所述ESP指數接近或低於預定水平，則確定所述物件患有或有風險發生2型糖尿病，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中步驟b)中的DNA分析包括以下步驟：獲得DNA序列並將所獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至14850所示的核酸序列進行比對。
  6. 如申請專利範圍第3或4項所述之方法，其中步驟b)中的DNA分析 包括以下步驟：獲得DNA序列並將所獲得的DNA序列與SEQ ID No.：1至2783所示的核酸序列進行比對。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中獲得DNA序列包括以下步驟：在所述樣品中獲得原始序列讀出並對所述原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中獲得DNA序列包括以下步驟：在所述樣品中獲得原始序列讀出並對所述原始序列讀出進行處理以獲得合格的序列讀出。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之方法，其中所述原始序列讀出是通過基於PCR的高通量測序技術獲得的。
  10. 如申請專利範圍第7或8項所述之方法，其中所述對所述原始序列讀出進行處理包括：去除銜接子，在3’端修剪序列直至到達質量閾值高於20的第一個核苷酸，去除短序列，以及去除與人基因組匹配的序列。
  11. 如申請專利範圍第5或6項所述之方法，其中DNA序列的所述比對使用種子延伸策略。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中使用在種子序列中無錯配的序列來在步驟b)中確定所述每個參考CAG的豐度。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中所述種子序列的長度為4至31bp。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中所述種子的長度為20bp。
  15. 如申請專利範圍第1或3項所述之方法，其中在所述飲食干預或疾病治療期間，在所述飲食干預或疾病治療開始後1周、2周、3周和/或4周 收集所述糞便樣品。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當在所述飲食干預或疾病治療期間所述GMM指數變得接近或高於預定水平時，確定所述物件對所述飲食干預或疾病治療產生積極回應。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，所述預定水平為-1.028883。
  18. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中所述預定水平為約-1.028883。
  19. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中當在所述飲食干預和疾病治療期間所述ESP指數變得接近或高於預定水平時，確定所述物件對所述飲食干預或疾病治療產生積極回應。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，所述預定水平為4.4。
  21. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中所述預定水平為約4.4。
  22. 一種微生物，其包含CAG NO.：1至15對應細菌中的一或多種，其中CAG NO.：1至15分別包含SEQ ID NO.：1至191、192至326、327至593、594至835、836至885、886至960、961至1097、1098至1264、1265至1433、1434至1684、1685至1833、1834至1979、1980至2163、2164至2447和2448至2783所示的核酸序列。
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