CN106310006A - 组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症的食品、药品、保健品、营养品中的应用 - Google Patents

Abstract

一种组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症的食品、药品、保健品、营养品中的应用，所述组合包包括以下组合物，每种组合物为便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式，所述剂量单位形式是单一剂量的物理分散单位：第一组合物包括：薏仁、燕麦、荞麦、白扁豆、黄玉米、赤小豆、黄豆、山药、大枣、花生、莲子和枸杞；第一组合物也可以包括黑麦(rye)、小麦(wheat)、黎麦(quinoa)、或青稞(Hulless barley)。第二组合物包括：苦瓜、可溶性膳食纤维和低聚糖；第三组合物包括：可溶性膳食纤维和低聚糖。通过对人类小胖威利综合症患者饮食营养的合理调整，达到减轻、解除、补救、预防或改善人类小胖威利综合症症状，恢复健康的目的。

Description

组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症的食品、药品、保健品、营养品中的应用

技术领域

本发明涉及组合包的应用。更具体地，本发明涉及包括苦瓜粉的组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症(Prader-Willi syndrome,PWS)的食品、药品、保健品、营养品的应用。

背景技术

不良饮食习惯及遗传倾向性是肥胖及相关代谢疾病在全球不断增长的两大主要诱因(1-3)。小胖威利综合症(Prader-Willi syndrome，简称“PWS”)是父源15号染色体(15q11.2-q13)的缺陷导致的，是最为常见的一种人类遗传因素导致的肥胖(4,5)。PWS患儿能够在生命早期成为病理性肥胖并发展为危机生命的2型糖尿病及心血管疾病(6)。PWS患儿的体重控制被证实异常困难，这是因为PWS患儿的肌肉张力较差，这会容易导致较少的体育锻炼、难以消除和不可控的饥饿感以及饱腹感不足，从而导致PWS患儿不断渴望食物的表现。然而，使上述诱因发展为PWS患儿肥胖的大部分分子链接仍不为人所知(6)。干预哪些病理性因素从而可以有效防止PWS中的肥胖和/或减缓其发展仍然是亟待解决的问题。

越来越多的证据表明，肠道菌群是膳食诱导的肥胖的发生原因之一(7,8)。无菌小鼠能够抵抗高糖、高脂的“西式膳食”诱导的肥胖(9)。将肥胖患者或者小鼠的肠道菌群移植到无菌小鼠体内，能够引起受体小鼠脂肪的过度积累(10,11)。用广谱抗生素将小鼠肠道菌群清除后，高脂饮食诱发的肥胖将不会发生。将健康人得肠道菌群移植给肥胖患者，在移植后的6周内改善了受体的胰岛素抵抗(12)。我们以由全谷物、中国传统药食同源食材和益生元组成的膳食(WTP)对成年单纯性肥胖患者进行干预，受试者肠道中内毒素产生菌下降而有益的双歧杆菌增加，从而减少了内毒素入血并显著改善了慢性炎症、脂代谢和胰岛素抵抗(14,15)。以上证据充分说明了肠道菌群在人和小鼠膳食诱导的肥胖中的重要作用。

在一些遗传缺陷的小鼠模型中发现，肠道菌群与遗传因素造成的肥胖的也有关系。用广谱抗生素清除肠道菌群，能够阻止瘦素缺失的ob/ob小鼠和Toll样受体5 敲除小鼠由于遗传缺陷导致的肥胖和胰岛素抵抗的发生(12,16)。将这两种遗传性肥胖模型小鼠的肠道菌群移植给野生型无菌小鼠，能够在受体小鼠中复制出部分肥胖表型(16,17)。但是肠道菌群在人类遗传因素导致的肥胖中得作用还不清楚。

然而，人类的遗传性肥胖的肠道菌群的影响目前从未被表征。也没有任何现有技术显示如何改善人类的遗传性肥胖。

发明内容

本发明至少在某种程度上基于意想不到的发现，即人类小胖威利综合症(PWS)患者通过服用一种组合包可以用来扶持肠道有益菌，抑制条件致病菌，进而改善或者治疗人类小胖威利综合症。

因此，本发明提供一种组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症的食品、药品、保健品、营养品中的应用。

所述组合包包括以下组合物，每种组合物为便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式，所述剂量单位形式是单一剂量的物理分散单位：

第一组合物包括：薏仁、燕麦、荞麦、白扁豆、黄玉米、赤小豆、黄豆、山药、大枣、花生、莲子和枸杞；第一组合物也可以包括黑麦(rye)、小麦(wheat)、黎麦(quinoa)、或青稞(Hulless barley)。

第二组合物包括：苦瓜、可溶性膳食纤维和低聚糖；

第三组合物包括：可溶性膳食纤维和低聚糖。

在一些实施方案中，所述组合包用于男性人类小胖威利综合症患者。

在一些实施方案中，所述第一组合物作为主食服用，其形式选自米、面、粥或饭。用所述第一组合物制备米、面、粥或饭前，先将第一组合物的种子、果实或其他植株部位粉碎成颗粒，其中1-70％、15-70％、25-70％、30-70％、50-70％的颗粒直径为0.65mm或以上。

在一些实施方案中，所述薏仁的重量占所述第一组合物重量的10-30％，燕麦的重量占所述第一组合物重量的5-30％，所述荞麦的重量占所述第一组合物重量的5-50％，所述白扁豆的重量占所述第一组合物重量的5-20％，所述山药的重量占所述第一组合物重量的5-30％。

在一些实施方案中，蛋白质的重量占所述第一组合物重量的5-40％或10-20％，碳水化合物的重量占所述第一组合物重量的30-80％或50-70％，脂肪的重量占所述第一组合物重量的0.5-30％或2-15％，膳食纤维的重量占所述第一组合物重量的0.5-30％或2-15％，维生素的重量占所述第一组合物重量的0.1-5％或0.5-1％，矿物质的重量占所述第一组合物重量的0.1-2％或0.8-1.2％。

在一些实施方案中，每100克的所述第一组合物提供320-400千卡总热量。

在一些实施方案中，每100克的所述第一组合物含有：VA 3-857ugRE，VD0.01-5ugRE，VE 2-79.09mg，VB10.01-1.89mg，VB20.01-1.4mg，VB60.01-1.2mg，VB120.1-2.4mg，VC 1-1170mg，烟酸0.5-28.4mg，Ca 60-2458mg,P 200-1893mg，K 350-1796mg，Na 8-2200mg，Mg 100-350mg，Fe 2-20mg。

在一些实施方案中，所述第一组合物中的所述荞麦包括：普通荞麦或苦荞麦。

在一些实施方案中，所述第一组合物中的所述荞麦包括：荞麦属种子。

在一些实施方案中，所述第一组合物中的所述燕麦包括：燕麦属植物种子。

在一些实施方案中，所述第一组合物中的所述山药包括：山药干。

在一些实施方案中，所述第二组合物被制成冲调粉剂，在餐前0.25到1小时服用。

在一些实施方案中，所述第二组合物的日剂量为5-100克、40-60克、或30-80克，以水冲调。

在一些实施方案中，所述第二组合物中的所述苦瓜包括：苦瓜属的植物果实全粉。

在一些实施方案中，所述植物果实全粉是通过冷冻干燥或喷雾干燥生产。

在一些实施方案中，所述第二组合物中的所述苦瓜包括：苦瓜提取物。

在一些实施方案中，所述第二组合物中的所述可溶性膳食纤维包括：

Fibersol-2、抗性淀粉、聚葡萄糖、纤维素、半纤维素、果胶或树胶。

在一些实施方案中，所述第二组合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水苏糖或低聚乳果糖。

在一些实施方案中，所述苦瓜与所述膳食纤维和所述低聚糖的重量比为 10:1-1:1。

在一些实施方案中，所述苦瓜粉的重量占所述第二组合物重量的15-99.8％，所述可溶性膳食纤维的重量占所述第二组合物重量的0.1-51％，所述低聚糖的重量占所述第二组合物重量的0.1-34％。

在一些实施方案中，所述第三组合物被制成冲调粉剂，餐前2-5小时服用，或与早餐同时服用。

在一些实施方案中，所述第三组合物的日剂量为5-200克、30-100克或50-150克，以300-1500毫升水冲调。

在一些实施方案中，所述第三组合物中的所述可溶性膳食纤维包括：

Fibersol-2，抗性淀粉，聚葡萄糖、纤维素，半纤维素，果胶或树胶。

在一些实施方案中，所述第三组合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水苏糖、或低聚乳果糖。

现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的组合物可用于平衡人类小胖威利综合症患者中肠道菌群结构，改善代谢综合症，施用于受试者时，能够增加短链脂肪酸产生菌的数量，减少内毒素产生菌的数量；可以多个途径给予需要其的人类小胖威利综合症患者，通过对人类小胖威利综合症患者饮食营养的合理调整，达到减轻、解除、补救、预防或改善代谢综合症症状，恢复健康的目的。

附图说明

图1显示了PWS患者遗传分子检测。其中，第1-4列：亚硫酸盐处理样品；第5-9列未处理样品；第1和5列：父亲；第2和5列：母亲；第3和7列：渊源者；第4和8列：对照；第9列：空白，M,100bp DNA marker。

图2显示了(a)人体测量指标；(b)肝功能指标；(c)血糖平衡；(d)血脂代谢；(e)炎症相关指标。(f)IL-6、脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、LBP的测量。所示的数据为mean±s.e.m.。Wilcoxon配对符号秩次检验(双边检验)是用来分析PWS或SO患儿各时间点之间的差异。*P＜0.05，P＜0.01。对于大多数 的生化变量，PWS:n＝17SO:n＝21；对于OGTT血糖AUC,OGTT胰岛素AUC，PWS:n＝16，SO:n＝20；对于CRP，w.b.c.，SAA，AGP，脂联素，IL-6，PWS:n＝16，SO:n＝19。

图3显示了PWS患者干预前的肠道菌群引起悉生小鼠代谢损伤。

图4显示了肠道菌群结构变化与宿主健康改善相关。

图5显示了膳食干预过程中肠道菌群Beta多样性分析。

图6显示了膳食干预后基因多样性显著下降。

图7显示了膳食干预显著改善生理状况。

图8显示了肠道菌群改变与生理指标变化的相关性。

图9显示了肠道菌群基因组水平的互作群的划分。

图10显示了一个种里处于同一个GIG的菌株基因组的相似性高于属于不同GIG的同种的其他菌株。

图11显示了膳食干预前后没有发生显著变化的GIG。

图12显示了CAG00184组装基因组与参考基因组比较。

图13显示了CAG00184基因组中碳水化合物利用相关的基因。

图14显示了膳食干预中肠道菌群功能变化。

图15显示了膳食干预中粪便中代谢物的变化。

图16显示了不同分组的OPLS-DA模型。

图17显示了OPLS-DA系数图表明干预前后粪便样品中显著变化的代谢物。

图18显示了干预30天SO患者粪便中显著变化的代谢物。

图19显示了干预60天PWS患者粪便中显著变化的代谢物。

图20显示了干预后粪便总菌量减少。

图21显示了短链脂肪酸相对含量的变化。

图22显示了干预后粪便提取液对Caco-2细胞的毒性减少。

图23显示了PCA分析则显示299CAZy家族干预前后发生显著变化。

图24显示了降解六种不同底物的CAZy基因家族丰度变化。

图25显示了乙酸、丙酸和丁酸产生相关基因的变化。

图26显示了膳食干预中尿液代谢谱的变化。

图27显示了不同分组的OPLS-DA模型。

图28显示了OPLS-DA系数图表明干预前后粪便样品中显著变化的代谢物。

图29显示了膳食干预中显著变化的尿液代谢物。

图30显示了尿液代谢物与肠道菌群共变化分析。

图31显示了肠道菌群和宿主共代谢的变化。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

为了解决上述问题，本发明的目的是将一种组合包应用于制备改善和治疗人类遗传性肥胖/PWS的食品、药品、保健品、营养品中。

例如，作为营养品，可以是饮食补充剂的形式。作为药品，可以与药学可接受载体混合以形成药物组合物。“药学可接受载体”包括溶剂、分散剂、包衣、抗菌和抗真菌剂以及等渗和吸收延迟剂等等，适合于药物给药。

所述组合包可以配制成与其计划的给予途径相适应的剂型。参见例如美国专利No.6,756,196。给予途径的实例包括口服。所述组合包可以是用于口服的片剂、胶囊、米、粥或饭形式，为便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式，配制口服组合物将是有利的。术语“剂量单位形式”指适合作为用于治疗主体的单一剂量的物理分散单位，每一单位包含与所需的药学载体结合、计划产生所需治疗效果的预定量的活性成分。

为了研究肠道菌群失调在人类遗传性肥胖及相关代谢失调中的贡献，我们招募了一批重度肥胖的PWS患儿和膳食因素导致肥胖的儿童，在医院的对其进行WTP膳食干预(14)。通过运用系统生物学策略，合并分析肠道元基因组特征、宿主和肠道菌群共代谢谱特征及将患者肠道菌群移植给无菌小鼠，我们发现，与膳食诱导的单纯性肥胖(simple obesity，简称“SO”)类似，肠道菌群失调在遗传因素造成的肥胖中也有重要贡献。这些结果说明肠道菌群失调无论在遗传因素造成的肥胖还是单纯性肥胖中，都扮演着“分子哨卡”的作用。

实施例一：遗传性肥胖及单纯性肥胖的膳食干预

(1)膳食干预能够缓解遗传性肥胖及单纯性肥胖并改善患者的生化指标

营养干预在广东省广州市妇女儿童医疗中心进行。除了超重、持续超过3天给予抗生素或参与减肥项目外，参与营养干预的主体在先前的3个月均未患有胃肠道疾病、未进行胃肠道手术或未患有慢性疾病。所述营养干预的主体可以由主体或健康护理专业人员的判断而确定，并且可以是主观的(例如看法)或客观的(例如可通过检验或诊断方法测量的)。例如，所述干预的主体可以是具有低水平肠道有益菌和高水平条件致病菌的主体，或诊断有代谢综合症的主体。

“营养干预”定义为通过对主体饮食营养的合理调整，达到减轻、解除、补救、预防或改善代谢综合症症状，恢复健康的目的。

经上海交通大学生命与生物科技学院道德委员会批准，我们进行了开放标记研究及自控研究。临床试验在中国临床试验注册中心的注册编号为ChiCTR-ONC-12002646，并获得了患儿监护人的书面同意。我们还进行了问卷调查，从而收集了人口统计特征、健康状态、疾病历史、胃肠道状况、饮食习惯及体育活动等信息。基于《中国食物成分表(2002版)》，随餐频率的问卷调查及24小时的饮食记录被用于计算基本营养摄入。对患儿家长进行为小胖威利综合症设计的摄食过量问卷调查，从而评估干预前后的摄食过量(2)。

我们招募了PWS患儿17名(平均年龄9.26岁，范围5-16岁)和单纯性肥胖(SO)患儿21名(平均年龄10.52岁，范围2-16岁)两个人群年龄没有显著差异，患者信息见表1。PWS患者均经过遗传分子检测确诊(图1)。受试者在广东省妇幼保健院进行30天膳食干预。根据PWS患儿家长的要求，所有的PWS患儿又继续进行了60天住院干预。其中一名PWS患儿(GD02)在医院进行了285天干预。

表1：入组的PWS和SO患儿基本信息

所示的年龄数据为mean±s.d.，在学生T-检验(双边检验)中PWS和SO没有显著差别。

所述WTP饮食是指对患儿给予全谷物、中国传统药膳以及益生元。具体而言，在本实施例中，所述WTP饮食是指提供一种组合包，包括第一组合物、第二组合物及第三组合物。每种组合物为便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式，所述剂量单位形式是单一剂量的物理分散单位。所述第一组合物、所述第二组合物及所述第三组合物由食品制造商：完美(中国)有限公司制备。

所述第一组合物为事先烹调好的12种选自富含膳食纤维的全谷物及传统中医植物的食材的混合物，包括：薏仁(薏苡)、燕麦、荞麦、白扁豆、黄玉米、赤小豆、黄豆、山药、大枣、花生、莲子和枸杞，以罐头粥的形式由食品制造商制备(每罐净重为370g)。每罐第一组合物含有100g的成分(包括59g碳水化合物、15g蛋白质、5g脂肪、6g纤维)以及336kcal的热量(包括70％碳水化合物、17％蛋白质、13％脂肪)。其中，总热量可以通过氧弹测定能力修正法测定，蛋白质的含量可以通过凯氏微量法测定，碳水化合物的含量可以通过高压液相色谱测定，脂肪的含量可以通过索氏抽提法测定，膳食纤维的含量可以通过中性洗涤剂法测 定，维生素的含量可以通过高压液相色谱测定，矿物质的含量可以通过分光光度法测定。

所述第一组合物作为主食，可以制成米、面、粥或饭给予。在经过蒸、煮等烹调方式后，其中的淀粉不易糊化，不易升高血糖。患儿可被给予足够的第一组合物以满足饥饿感，并满足其年龄段的标准营养要求，该标准营养要求规定于中国营养学会(CNS，2012)建议的《中国居民膳食营养素参考摄入量》(DRI)中。每名患者的饮食记录被用于基于《中国食物成分表》(2002年)计算营养摄入。

所述第二组合物以冲调粉剂的形式制备(每袋20g)，包括：苦瓜和低聚糖。其中，低聚糖为2个或2个以上(一般指2-10个)单糖单位以糖苷键相连形成的糖分子，例如低聚果糖或低聚异麦芽糖。第二组合物制成冲调粉剂后用温水冲调食用，每天冲服5-100克第二组合物。

第三组合物包括：可溶性膳食纤维和低聚糖，其中可溶性膳食纤维包括：瓜尔胶、果胶、魔芋粉及其他可发酵膳食纤维(Fibersol-2、抗性淀粉、半纤维素)等益生元，第三组合物以冲调粉剂的形式给予。用300-1500毫升的水调匀冲服5-200克第三组合物，早晨空腹饮用。

本发明组合包的代表性给药周期为一周至几个月，例如一周、两周、一个月、两个月、四个月和八个月。在主体中肠道有益菌水平开始上升、条件致病菌水平开始下降后，组合物的剂量可以逐步降低。当肠道菌群结构恢复正常时可以结束给药。

膳食干预期间，两类儿童总热量摄入相比干预前均下降了30％。摄入蛋白质的供能比变化不大，仍占总热量的13-％14％。摄入碳水化合物的供能比在PWS患儿中从52％增加到62％，在SO患儿中从57％增加到62％。碳水化合物的种类则从干预前以精细加工的米面为主变为以全谷物为主。摄入脂类的供能比在PWS患儿中从34％减少到20％，在SO患儿中从30％减少到20％。最本质的改变是膳食纤维摄入量的变化，在PWS患儿中从每天6g增加到49g，在SO患儿中从每天9g增加到51g(表2和表3)。

表2：PWS患儿干预前后主要营养素摄入情况

所示的数据为中位数(最大-最小)或者mean±s.e.m.，在学生T-检验(双边检验)中PWS和SO没有显著差别。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001相对于基准线。对于干预前,n＝12；天数为30,60，90,n＝17。

表3：PWS患儿干预前后主要营养素摄入情况

所示的数据为中位数(最大-最小)或者mean±s.e.m.，在学生T-检验(双边检验)中PWS和SO没有显著差别。*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001相对于基准线。对于干预前,n＝5；天数为30,60，90,n＝21。

我们用干预期间受试者的人体测量指标和血液代谢物来跟踪身体状况的变化。干预30天后，所有相关的临床指标在遗传因素导致的肥胖和单纯性肥胖患者中都显著改善(图2)。经过30天的干预，SO患儿的体重减少了9.5±0.4％(mean±s.e.m.)，而PWS减少了7.6±0.6％(图2a)。血液中谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)降低表征肝功能的改善(图2b)。血糖稳态显著改善，表征胰岛素敏感性增加(图2c)。血液中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)减少(图2d)。PWS患儿在继续干预60天后，体重最终减少了18.3±1.0％，其他代谢健康指标也进一步改善。不仅如此，PWS患儿暴食症行为得到整体改善(表4)。GD02在285天住院干预中，从140.1kg减少到83.6kg，他出院后继续在家干预，在总共干预430天后减低到73kg。他所有的生理指标均恢复到正常水平。这种膳食干预能够显著改善人类遗传因素造成的肥胖相关的代谢失调，膳食导致的减重程度可与接受胃肠绕道手术的效果媲美(18)。30天干预后，多种与协同炎症相关的指标在PWS和SO中都发生显著下降，包括C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白(SAA)，alpha酸性糖蛋白和白细胞(图2e)。脂联素作为一种抗炎因子，干预后水平增加，瘦素水平减少，说明代谢性疾病的风险因素下降。脂多糖结合蛋白(LBP)是细菌产生的内毒素进入血液的量的分子标识物，干预后下降。这说明两类人干预后肠道菌群都变得健康，产生的能够引起慢性炎症的抗原减少。

表4:PWS患儿干预前后食欲问卷分析

所示的数据为mean±s.e.m.，n＝11，两个时间点间的变化的Wilcoxon配对符号秩次检验(双边检验)*P<0.05。

表5:PWS患儿膳食干预前后生化指标

所示的数据为mean±s.e.m.，两个时间点间的变化的威氏配对符号秩次检验(双边检验)*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001相对于基准线；$P<0.05,$$P<0.01and$$$P<0.001v.s.30天；+P<0.05,++P<0.01,+++P<0.001v.s.60天。

BMI:身体质量指数；DBP:舒张压；SBP:收缩压；HOMA-IR:稳态模型评估的胰岛素抵抗；OGTT:口服葡萄糖耐量试验；HDL:高密度脂蛋白；LDL:低密度脂蛋白；CRP:C反应蛋白；W.B.C.:白细胞计数；ALT:丙氨酸氨基转移酶；AST:谷草转氨酶；SAA:血清淀粉样蛋白A；AGP:α-酸性糖蛋白；LBP:脂多糖结合蛋白。

对于大多数生化变量,n＝17；对于OGTT血糖AUC,OGTT胰岛素AUC,CRP,W.B.C.,SAA,AGP,脂联素及IL-6:n＝16。

(2)干预后肠道菌群在小鼠中产生很少炎症及脂肪堆积

为了比较干预前后肠道菌群引起代谢紊乱能力的差异，我们把同一名PWS志愿者(GD58)干预前后的肠道菌群分别移植给无菌野生型C57BL/6J小鼠。接受了干预前肠道菌群的小鼠在移植后前两周体重出现显著下降，说明移植物有一定的毒害作用，在接下来的两周中这些小鼠体重迅速增加。接受了干预后肠道菌群的小鼠没有出现体重下降，在移植后的四周中其体重像正常小鼠一样有所增加(图3a)。在实验结束时，尽管移植了干预前肠道菌群的小鼠体重仍然低于移植干预后菌群的小鼠，但是其脂肪比例显著高于后者(图3b)。附睾脂肪组织切片的脂肪细胞染色反映出，由于移植了毒性较大的菌群，菌群移植两周后移植了干预前 肠道菌群的小鼠脂肪细胞显著小于移植干预后菌群的小鼠，移植四周后前者脂肪细胞则显著大于后者，但是移植移植干预后菌群的小鼠的脂肪细胞大小没有显著变化(图3c)。反转录定量PCR表明，移植了干预前肠道菌群的小鼠肝脏、回肠和结肠中TNFα、IL6和TLR4基因表达增加，说明最初一段时间的体重下降与其较高炎症水平相关(图3d-f)。以上结果表明，PWS患儿干预前的肠道菌群比干预后的菌群有更强的引起炎症和脂肪积累的能力。

(3)膳食干预改变肠道菌群结构

为了研究膳食干预过程中肠道菌群整体结构的变化，我们用Illumina Hiseq2000平台对PWS(0天、30天、60天和90天)和SO(0天和30天)粪便样品进行了元基因组测序，平均每个样本得到76.0±18.0million(mean±s.d.)高质量reads。我们对这些高质量序列进行de novo的组装和基因预测，共得到2,077,766个非冗余基因。基于Canopy算法，这两百多万个基因根据其丰度共变化相关性大于0.9的原则，归并为28,072个的基因群(co-abundance gene groups，CAGs)，属于同一个CAG的基因很有可能是来自同一个基因组(26)。其中有376个CAGs包含的基因数大于700，可以被认为是可能是细菌基因组，这些CAGs共包含识别出的基因的36.4％(775,515)。这376个CAG中，有161个在不少于20％的样本中被检测到。我们对这161个CAG基因组进行组装，得到118个组装基因组符合人类元基因组计划六条高质量组装基因组标准中的至少5条。有50个组装基因组与现有参考基因组的相似性大于95％且占有率大于80％。有10个种的细菌得到了多于1个组装基因组，比如Faecalibacterium prausnitzii有9个组装基因组，而Eubacterium eligens有5个，说明这些细菌在菌株水平的多样性。

基于376细菌CAG的Bray-Curtis距离做PCoA，反映出肠道菌群结构和组成在膳食干预30天后就发生了显著变化(MANOVA检验,P＝2.17e-6，图4a和b)。无论干预前后，PWS和SO的肠道菌群均没有显著差异(P＝0.99，P＝0.8)，说明PWS和SO干预前的肠道菌群有着类似的失调结构，而膳食干预对两者肠道菌群的影响类似(图4b)。基于其他距离的β-多样性分析及肠道菌群16S rRNA基因V1-V3区焦磷酸测序的结果反映了同样的结果(图5)。干预后两类人群肠道菌群的多样性均显著下降(图6)。更为重要的是，将基于376个CAG的PCoA结果(图3a)和临床指标的PCA结果(图7)进行普氏分析(procrustes analysis)，肠道菌群结构的改变与PWS和SO人群临床指标的变化显著相关，说明在细菌基因组水平的结构变化与宿 主健康状况的改善有密切关系(M²＝0.891,P<0.0001,999次Monte-Carlo模拟，图8)。

(4)基因组水平的共变化分析

在肠道生态系统中，细菌基因组是组成不同的功能群对于膳食干预进行反应的(27-29)，为了建立研究这种反应(30)，我们基于161个高共有率的细菌CAG在所有时间点和所用个体中分布，建立丰度共变化网络关系。基于bootstrapped Spearman相关系数的Ward聚类算法和置换MANOVA检验(9999次置换,P<0.001)将细菌CAG分为18个基因组水平的互作群(GIG，图3c和图9)。值得注意的是，同一个种的不同CAG，比如属于Faecalibacterium prausnitzii的9个CAG，属于不同的GIG，说明同一个种下的不同菌株在肠道生态中可能处于不同的代谢生态位。一个种里处于同一个GIG的菌株基因组的相似性高于属于不同GIG的同种的其他菌株，说明属于不同GIG的同种菌株可能具有功能上的差异(图10)。将基于18个GIG和临床指标的数据进行普氏分析，表明GIG水平的菌群变化和宿主临床指标的变化均是沿着第一个坐标轴，说明GIG丰度变化与宿主健康状况变化显著相关(M²＝0.898,P<0.0001,999次Monte-Carlo模拟，图3d)。GIG丰度变化与宿主健康状况的密切关系说明这种将人肠道菌群划分成基因组水平的互作群的分析策略为研究肠道菌群与宿主的互作提供了一个很好的框架。

组群水平丰度分析表明，有6个GIG在膳食干预前后没有显著变化，包括以Prevotella copri占主要地位的GIG13(图11)。GIG1、3和4在膳食干预后显著增加，而GIG7、8、11、12、14、15、16、17和18在膳食干预后显著减少(图4e)。GIG3的丰度与GIG8、15、16和18呈现负相关(r>0.45,FDR<0.01，图3c)。GIG3是膳食干预后增加最为显著的组群。值得注意的是，GIG3主要由属于Bifidobacterium的基因组组成。CAG00184是干预后增加最显著组装基因组，与参考基因组Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 20438的相似度为98.6％且占有率为81.2％(图12)。CAG00184的组装基因组中包含有编码发酵单糖、二糖、低聚糖和多聚糖产生乙酸和乳酸的代谢通路的基因(图13)(28,31-33)。

(5)膳食干预改变肠道菌群功能

为了研究肠道菌群群落结构的改变如何影响其代谢潜能，我们用HUMAnM对元基因组数据进行分析，将基因与其所在的生化反应途径相关联。总共有5,234个KEGG同源群(KO)被识别并定量。对所用KO做主成分分析发现干预前后KO发 生了显著变化(MANOVA检验,P＝2.00e-7,图14a和b)，表明膳食干预造成的菌群结构的改变也影响了其代谢潜能。无论干预前后，PWS和SO在KO水平都没有显著差异(MANOVA检验，P＝0.712且P＝0.291,图14b)。因此，干预前后，PWS和SO患儿的肠道菌群结构与功能均相似。

用线性判别分析(LDA)相应水平(LEfSe)方法，KEGG数据库共鉴定出67个生化反应通路在干预前后有显著差异(P<0.05，图14c)。41个反应通路在干预后显著降低，而26个通路显著增加。值得注意的是，在显著增加的通路中有碳水化合物分解代谢相关的通路，包括淀粉和蔗糖代谢(ko00500)和基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)。在显著减少的途径中则包含脂类和蛋白质代谢通路，如脂肪酸合成(ko00061)、苯丙氨酸代谢(ko00360)和色氨酸代谢(ko00380)。另外，脂多糖生物合成(ko00540)、肽聚糖生物合成(ko00550)和鞭毛组装(ko02040)显著减少，说明细菌来源的抗原合成在干预后显著减少。外源性化学物质生物降解(ko00627、ko00633和ko00930)和DNA损伤修复相关通路(ko03410、ko03430和ko03440)也显著减少，或许反映了干预后肠道环境中外源有毒物质及突变压力减少。

(6)碳水化合物导致的肠道中代谢变化

干预所使用的膳食富含大量人自身不能消化的碳水化合物，到达大肠后很可能会影响肠道菌群的代谢(表2和3)。用NMR对干预前后PWS和SO患儿的粪便提取液进行代谢物进行检测，对数据进行主成分分析(PCA)和隐变量正交投影判别分析(OPLS-DA)表明，干预后代谢谱发生了显著变化(图15和16)。OPLS-DA系数图表明粪便中不能消化的碳水化合物显著增加(图17)在PWS患儿中19种代谢物显著减少，而SO患儿中18种代谢物减少(图18和19)。这些减少的代谢物很多是细菌的代谢产物，这与定量PCR发现干预后肠道中细菌总量减少的结果一致(图20)。尽管细菌代谢产物减少，乙酸在短链脂肪酸中得相对比例增加，而异丁酸和异戊酸比例减少，表明肠道菌群从发酵蛋白质转变为发酵碳水化合物(图21)。三甲基胺是细菌发酵食物中脂类来源的胆碱所产生的有毒代谢物，干预后在粪便提取液中显著减少(图18和19)。体外实验表明，干预后PWS和SO患儿的粪便提取液对人源Caco-2细胞的细胞毒性显著下降说明干预后肠道菌群产生的有毒代谢物减少(图22)。

为了进一步考察膳食干预对肠道菌群碳水化合物代谢的改变，我们将所有 2,077,766非冗余基因与dbCAN数据库进行比对，鉴定出碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)。共有84,549个基因属于299个CAZy家族，这些基因在干预前后发生显著变化，说明肠道菌群碳水化合物代谢相关的基因发生变化(图23)。与降解淀粉(GH13、97和31)、菊粉(GH32和91)及纤维素(GH1,3,5,8,9,44and 48)相关的CAZys在干预后显著增加，而与降解黏膜多糖相关的CAZys则显著减少(图24)。Formate-tetrahydrofolate ligase是乙酸产生途经中的关键酶，我们发现编码这个酶的基因在干预后显著增加，这解释了干预后乙酸相对比例的增加(图25)。这些都反映了结肠中可利用的植物来源的碳水化合物增加，双歧杆菌这样的携带大量碳水化合物发酵相关基因的细菌就会大量增加，并且产生有益的代谢产物比如乙酸。

(7)肠道菌群和宿主代谢互作

在本研究中，我们用NMR这种无主观偏好的技术获得膳食干预前后尿液代谢谱，从而找出干预显著影响的代谢物。用NMR对干预前后PWS和SO患儿的尿液进行代谢物进行检测，对数据进行主成分分析(PCA)和隐变量正交投影判别分析(OPLS-DA)表明，干预后代谢谱发生了显著变化(图26a)。在所有NMR检测到的代谢物中，利用OPLS-DA模型只找到13种代谢物在PWS或SO患儿干预前后有显著变化(图26b-d和图27-29)。13种代谢物中有4种是肠道菌群和宿主的共代谢产物，这些代谢物干预后都显著降低。它们是氧化三甲基胺(TMAO)、吲哚硫酸盐(indoxyl sulfate)、苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和马尿酸(hippurate)。细菌产生的TMA进入宿主循环系统，宿主肝脏产生TMAO。其他三种代谢物的前体则是细菌在肠道中发酵氨基酸的产物，比如吲哚硫酸盐的前体吲哚是细菌发酵色氨酸的产物。TMAO在临床上能够作为预测心血管事件的独立分子标识物，而且在人和小鼠中都被证实参与动脉粥样硬化发生的机制。类似的，吲哚硫酸盐被认为与慢性肾炎病人发生高血压和心血管疾病有关。另一方面，菌群代谢胆碱产生TMAO减少，与人自身代谢胆碱产生的二甲基甘氨酸(DMG)在尿液中增加相互印证(图26c和d)。这说明干预膳食中脂类来源的胆碱主要被人吸收代谢，而不是被肠道中的细菌发酵产生TMA。

对376个细菌CAG和尿液代谢物进行协惯量分析(Co-inertia analysis)，表明两者之间有显著的共变化关系(R＝0.52,P<0.01，图30和31a)。利用Bootstrapped Spearman相关分析找出了所有与干预前后有显著变化的尿液代谢物正相关或负相 关的细菌CAGs(|r|>0.4and FDR<0.01，图31b)。在所有与潜在有毒代谢物吲哚硫酸盐正相关的细菌CAG中，9个属于GIG7和18(大部分是Bacteroides spp.和Alistipes spp.)的CAG的基因组中有编码将色氨酸转化为吲哚的色氨酸酶的基因(图31c)。在所有与有毒代谢物TMAO正相关的细菌CAG中，13个属于GIG7、8、14、15、16和18(大部分是Ruminococcus spp.、Parabacteroides spp.和Bacteroides spp.)的CAG的基因组中有编码胆碱厌氧降解相关胆碱TMA裂解酶和胆碱TMA裂解酶激酶基因簇(图31d)。这些CAG所代表的菌株很可能是肠道中产生吲哚和TMA的细菌，他们所属的GIG都是干预后减少的。他们丰度的下降对于遗传因素导致的肥胖和单纯性肥胖患者代谢失调的改善都有贡献。

PWS相关的肥胖似乎是遗传因素决定的，但是其推动因素与单纯性肥胖相似，仍然是过度饮食和低能量消耗。我们的研究表明，遗传因素造成的肥胖和单纯性肥胖患者的肠道菌群有着相似的结构和功能失调，比如1)产生的能够引起代谢损伤的有毒物质如吲哚硫酸盐和TMAO较多；2)编码产生有毒共代谢物相关酶的基因丰度较高；3)产生细菌来源的抗原如内毒素的生物合成通路较多。将PWS患儿干预前的肠道菌群移植给无菌小鼠，能够引起后者肠道炎症和脂肪积累。WTP膳食干预改变肠道菌群的代谢，使其从发酵蛋白质和脂类变为发酵碳水化合物，这种改变与遗传因素造成的肥胖和单纯性肥胖代谢失调的改善相关。

肠道菌群的一些结构特征被认为是于肥胖相关，比如厚壁菌门与拟杆菌门的比例升高或者低基因丰度。但是肠道菌群中参与肥胖和代谢失调发生发展的特定的成员及其功能互作关系，还有待进一步研究。越来越多的证据表明，肠道菌群的重要功能可能是种甚至菌株特异性的，而许多元基因组相关的研究由于技术条件所限无法将独立的基因组组装出来，只能在属甚至更高的水平上进行分析。来源于同一个基因组DNA分子上的两个基因的丰度在整个复杂的元基因组数据中相关性应该是极高的，基于上述原理，最近提出的canopy算法将丰度共变化高度相关的基因归并为一个群。如果测序深度足够，属于一个CAG的序列读段能够组装为一个高质量的基因组，因此我们可以在基因组水平分析膳食干预引起的肠道菌群变化。比如，我们发现膳食干预显著富集了具有丰富碳水化合物利用能力的B.pseudocatenulatum。这个种很可能是通过增加乙酸和其他物质的产生来抑制有害菌，从而形成健康的肠道生态环境的“关键物种”。

肠道菌群产生有毒的代谢物比如TMA和吲哚进入宿主循环系统，很可能是影 响宿主健康的方式之一。但是对于肠道菌群--特别是人肠道--中能够产生这些特定化合物的成员，我们还知之甚少。在前期以健康人群为对象做得方法研究中，我们指出可以将肠道微生物群落中特定成员与特定尿液代谢物的变化关联起来，从而揭示“群落中哪种细菌做了什么”。在这个研究中，我们将肠道中独立的细菌基因组与特定的尿液代谢物的变化关联起来，揭示了“群落中哪个细菌的基因组执行了哪种功能”。一些细菌的基因组与尿液中TMAO或者吲哚硫酸盐的水平显著相关，在这些基因组中确实有编码由胆碱或色氨酸产生这两种物质前体的酶的基因。在以后可以将这些关键细菌分离出来，进一步做深入的机制研究。

综上所述，我们证明了无论是遗传因素引起的还是膳食诱导的重度肥胖儿童，肠道菌群有着相似失调。富含不能被人体消化的复杂碳水化合物的膳食能够改善肠道菌群的失调，使得利用蛋白质或脂类产生有毒物质的细菌丰度下降，而发酵碳水化合物产生有益物质的细菌增加。这种膳食对肠道菌群的改变显著改善了PWS和SO患儿代谢失调，说明失调的肠道菌群在无论是遗传因素还是不当膳食导致的肥胖发生过程中的普遍病理作用。因此，膳食改善肠道菌群可以成为管理代谢性疾病的有价值和前途的手段。

实施例2

对一位体重175千克的志愿者进行营养干预，并对干预过程中身体各项生理生化指标和肠道菌群的变化进行系统的分子监测，进一步描述本发明。

(1)志愿者干预前的身体状况

该志愿者为26岁男性。身高172.5厘米，体重174.9千克，BMI(Body Mass Index)58.78，腰围156.1厘米，根据亚洲成年人肥胖评价标准判断，为重度肥胖患者。经系统体检，发现其患有严重的代谢综合症，其各项生理生化指标如下表6所示。

(2)干预过程中身体的生理生化指标变化与干预效果的分子评价。

相比较于该志愿者干预前0天的各项生理生化指标，营养干预9周、23周后，体重和BMI显著下降；空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白和胰岛素抵抗指数的降低，直接反映糖稳态情况及其在干预下的好转；甘油三酯和总胆固醇的下降表明机体脂代谢的改善；谷草转氨酶、丙氨酸氨基转移酶和γ谷氨酰转移酶的明显

表6：实施例1志愿者营养干预前及干预后9周、23周生理生化指标

降低，逐渐恢复到正常范围内，说明肝脏细胞的损伤的减轻；同时脂肪肝与血压均有所改善；炎性标记物中的C反应蛋白、炎性因子白介素6，提示肠道菌群引发的破坏身体的炎性反应的水平在干预下降低；抗炎因子脂联素的升高表明机体消除炎性反应的机能在干预后恢复；内毒素结合蛋白的减少提示进入血液的细菌产生的内毒素的水平在干预下降低。综合上述各项指标，该志愿者经过干预之后，代谢综合症各项表征均明显改善。

干预过程中肠道菌群结构变化情况如下：16S rRNA基因V3-DGGE指纹图谱 及注释见说明书附图。0d：为干预前时间点，4w、9w、13w、18w、23w：分别为干预后各时间点4周、9周、13周、18周和23周。红色箭头(23W泳道旁的2处箭头)所示为营养干预后增加的条带(2条条带)，蓝色箭头(M泳道旁的5处箭头)所示为营养干预后逐渐减弱的条带(5条条带)。从DGGE图谱可以看到营养干预对该个体肠道菌群结构有较大影响，营养干预后几个时间点志愿者肠道菌群结构是比较相似，这说明营养干预显著地改变了肠道菌群结构。

454焦磷酸测序结果显示该志愿者的变形菌门发生明显下降,其中以肠杆菌科变化最明显，由-30d的17.90％降为9w的0.10％和23w降为0.10％，表现在属的水平上即为机会性病原菌肠杆菌的明显下降。另外，属水平在营养干预后呈上趋势的有Faecalibacterium，该属菌种具有抗炎和产生丁酸盐的作用，对宿主的能量代谢，保护肠粘膜完整性起着重要作用。

由此可见，营养干预后，该志愿者机会性病原菌数量发生明显下降，进入宿主循环系统的肠道内内毒素减少，从而降低了宿主炎性反应水平，有效地缓解了该志愿者代谢综合症的症状。

实施例3

对89位中心型Ⅱ度肥胖症志愿者进行营养干预，并对干预过程中身体各项生理指标和肠道菌群的变化进行系统的分子监测，进一步描述本发明。

(1)干预全过程中身体的生理变化与干预效果的分子评价

相比较于志愿者干预前30天的各项生理生化指标，干预9周、23周后，体重和BMI持续显著下降；空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数的降低，直接反映糖稳态情况的好转；甘油三酯和总胆固醇的下降表明机体脂代谢的改善；丙氨酸氨基转移酶和γ谷氨酰转移酶的明显降低，说明肝脏细胞的损伤减轻；同时脂肪肝(志愿者有68.5％干预后状况好转，其中18.0％干预后转为正常)与血压均有所改善；炎性标记物中的C反应蛋白、炎性因子白介素6和肿瘤坏死因子α的减少，反映肠道菌群引发的炎性反应的水平在干预下降低；抗炎因子脂联素的升高表明机体消除炎性反应的机能在干预后的恢复；内毒素结合蛋白的减少提示进入血液的细菌产生的内毒素的水平在干预下降低。

表7：实施例2志愿者营养干预全过程生理生化指标

数据表示为均值±标准偏差，或中位数(四分位数间距)。显著性检验采用SPSS 17.0统计软件的配对t检验(正态分布数据)或非参数分布Wilcoxon检验(非正态分布数据)。

肠道通透性测试，干预前30天和干预后9周收集得到的样品数为89，干预后23周的收集样品数为76。

干预后9周、23周与干预前30天比较，^*P<0.05，^**P<0.01；干预后23周与干预后9周比较，^§P<0.05，^§§P<0.01。

干预过程中肠道菌群结构变化情况如下:

454焦磷酸测序结果显示营养干预后志愿者变形菌门数量显著下降，放线菌门数量显著上升。主要有三个科在营养干预后发生显著变化，肠杆菌科和脱硫弧菌科数量发生显著下降，而双歧杆菌科数量显著上升。

营养干预后，志愿者肠杆菌科和脱硫弧菌科两个常见的致病菌类型数量发生显著下降，而保护肠屏障的双歧杆菌科数量显著上升，肠壁通透性下降，进入宿主循环系统的肠道的内毒素量减少，从而降低了宿主炎性反应水平，缓解了代谢综合症的症状。

本说明书引用的所有出版物通过引用整体引入。

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Claims (25)

1.组合包在制备用于改善和治疗人类小胖威利综合症的食品、药品、保健品、营养品中的应用，其特征在于，所述组合包包括以下组合物，每种组合物为便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式，所述剂量单位形式是单一剂量的物理分散单位：

第一组合物包括：薏仁、燕麦、荞麦、白扁豆、黄玉米、赤小豆、黄豆、山药、大枣、花生、莲子和枸杞；

第二组合物包括：苦瓜、可溶性膳食纤维和低聚糖；

第三组合物包括：可溶性膳食纤维和低聚糖。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合包用于男性人类小胖威利综合症患者。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物作为主食服用，其形式选自米、面、粥或饭。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，用所述第一组合物制备米、面、粥或饭前，先将第一组合物的种子、果实或其他植株部位粉碎成颗粒，其中1-70％、15-70％、25-70％、30-70％、50-70％的颗粒直径为0.65mm或以上。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中，所述薏仁的重量占所述第一组合物重量的10-30％，燕麦的重量占所述第一组合物重量的5-30％，所述荞麦的重量占所述第一组合物重量的5-50％，所述白扁豆的重量占所述第一组合物重量的5-20％，所述山药的重量占所述第一组合物重量的5-30％。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中，蛋白质的重量占所述第一组合物重量的5-40％或10-20％，碳水化合物的重量占所述第一组合物重量的30-80％或50-70％，脂肪的重量占所述第一组合物重量的0.5-30％或2-15％，膳食纤维的重量占所述第一组合物重量的0.5-30％或2-15％，维生素的重量占所述第一组合物重量的0.1-5％或0.5-1％，矿物质的重量占所述第一组合物重量的0.1-2％或0.8-1.2％。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，每100克的所述第一组合物提供320-400千卡总热量。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，每100克的所述第一组合物含有：VA 3-857ugRE，VD 0.01-5ugRE，VE 2-79.09mg，VB10.01-1.89mg，VB20.01-1.4mg，VB60.01-1.2mg，VB120.1-2.4mg，VC 1-1170mg，烟酸0.5-28.4mg，Ca 60-2458mg,P 200-1893mg，K 350-1796mg，Na 8-2200mg，Mg 100-350mg，Fe2-20mg。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中的所述荞麦包括：普通荞麦或苦荞麦。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中的所述荞麦包括：荞麦属种子。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中的所述燕麦包括：燕麦属植物种子。

12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组合物中的所述山药包括：山药干。

13.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物被制成冲调粉剂，在餐前0.25到1小时服用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第二组合物的日剂量为5-100克、40-60克、或30-80克，以水冲调。

15.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中的所述苦瓜包括：苦瓜属的植物果实全粉。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述植物果实全粉是通过冷冻干燥或喷雾干燥生产。

17.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中的所述苦瓜包括：苦瓜提取物。

18.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中的所述可溶性膳食纤维包括：Fibersol-2、抗性淀粉、聚葡萄糖、纤维素、半纤维素、果胶或树胶。

19.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水苏糖或低聚乳果糖。

20.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中，所述苦瓜与所述膳食纤维和所述低聚糖的重量比为10:1-1:1。

21.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二组合物中，所述苦瓜粉的重量占所述第二组合物重量的15-99.8％，所述可溶性膳食纤维的重量占所述第二组合物重量的0.1-51％，所述低聚糖的重量占所述第二组合物重量的0.1-34％。

22.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第三组合物被制成冲调粉剂，餐前2-5小时服用，或与早餐同时服用。

23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述第三组合物的日剂量为5-200克、30-100克或50-150克，以300-1500毫升水冲调。

24.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第三组合物中的所述可溶性膳食纤维包括：Fibersol-2、抗性淀粉、聚葡萄糖、纤维素、半纤维素、果胶或树胶。

25.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第三组合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水苏糖、或低聚乳果糖。