TW201934116A

TW201934116A - 含有檸檬醛之奈米乳液組成物及其製備方法

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Publication number: TW201934116A
Application number: TW107105541A
Authority: TW
Inventors: 李柏憲; 呂玟蒨
Original assignee: 大葉大學
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-09-01

Abstract

本發明係揭露一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物及其製備方法。該方法包含：將檸檬醛、混合界面活性劑、共溶劑及水利用均質裝置進行均質，以獲得粗滴乳液；以及將粗滴乳液利用超音波震盪裝置進行超音波乳化作用，以獲得奈米乳液組成物。其中，檸檬醛的濃度固定在奈米乳液組成物總重量的10 wt%，混合界面活性劑係由Span 85及Brij 97所組成，且混合界面活性劑的HLB值係為2至12。利用上述製備方法所製備的奈米乳液組成物具有高封裝率、可長期穩定保存，同時可提升奈米乳液組成物針對細菌的抗菌活性。

Description

含有檸檬醛之奈米乳液組成物及其製備方法

本發明係關於一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物及其製備方法，具體而言，係利用以超音波乳化作用及配方的最佳條件製備檸檬醛奈米乳液組成物，以提升針對細菌的抗菌活性。

奈米乳液為具有20至100 nm液滴尺寸的乳液類型。由於液滴尺寸小，奈米乳液呈現透明或半透明且相對於習知乳液的乳狀化、聚結(coalescence)、絮凝(flocculation)及奧斯華粗化(Ostwald ripening)更加穩定。因此，奈米乳液的物化特性由於其小的液滴尺寸及長期穩定性而具有實際應用的潛力。例如，奈米乳液以農藥遞輸配方使用在農業化學、作為個人護理或護膚產品的藥物載體使用在化妝品以及作為封裝生物活性成分的基質而使用在無酒精配方需求的藥品中等。

檸檬醛(3, 7-二甲-2, 6-辛二烯醛)(3, 7-dimethyl-2, 6-octadienal)為自然產生在草藥、植物及柑橘類水果中的單萜。檸檬醛具有抗真菌活性及殺菌、殺蟲、除臭、去痰劑、食慾刺激及解痙特性；以及具有輕微利尿及抗發炎效果。然而，檸檬醛在一般儲存條件下容易被氧化降解，而在正常儲存情況下造成抗菌活性的損失，且檸檬醛在中性pH下不溶於水，因此奈米乳液科技可能為微封裝、親水化及保護此化合物的良好方式。

有鑑於上述習知之問題，本發明主要目的在於提供一種利用超音波乳化作用製備具有混合界面活性劑之水中檸檬醛型奈米乳液(citral-in-water nanoemulsions)之最佳條件，以獲得具有高封裝率、可長期穩定保存，同時提升針對細菌的抗菌活性之檸檬醛奈米乳液。

基於上述目的，本發明係提供一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物之製備方法，其包含：將檸檬醛、混合界面活性劑、共溶劑及水利用均質裝置進行均質，以獲得粗滴乳液；以及將粗滴乳液利用超音波震盪裝置進行超音波乳化作用，以獲得奈米乳液組成物。其中檸檬醛相對於奈米乳液組成物的總重量為10 wt%，混合界面活性劑係由Span 85及Brij 97所組成，且HLB值係為2至12。

較佳地，上述製備方法的超音波製程可進一步包含超音波震盪裝置在超音波功率6至30W，且超音波時間60至180秒的條件下，進行超音波乳化作用。

較佳地，檸檬醛與混合界面活性劑的比可為4~6：10，其亦可由S_o 比表示，例如，當檸檬醛與混合界面活性劑的比為4：10時，其S_o 比為0.4。

較佳地，混合界面活性劑中的Span 85及Brij 97的重量混合比可為1：9。

較佳地，共溶劑可為丙二醇。

較佳地，共溶劑可佔奈米乳液組成物的總重量的1 wt%。

較佳地，該檸檬醛在奈米乳液組成物中的封裝率可為64%~83%。

基於本發明的另一目的，本發明係提供一種由上述製備方法所製得的含有檸檬醛之奈米乳液組成物。

基於本發明的又一目的，本發明係提供一種上述奈米乳液組成物用於製備抑制一種或複數種細菌之抑菌劑之用途。

較佳地，該一種或複數種細菌可選自由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鼠傷寒沙氏桿菌及單核球增多性李氏菌所組成之群組。

本發明將藉由下列較佳實施例及其配合之圖式，作進一步之詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示之實驗數據，係為便於解釋本案技術特徵，並非用以限制其可實施之態樣。

本發明提供一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物之製備方法，其包含下列步驟：(1)均質製程：將檸檬醛、混合界面活性劑、共溶劑及水利用均質裝置進行均質，以獲得粗滴乳液；以及(2)超音波製程：將粗滴乳液利用超音波震盪裝置進行超音波乳化作用，以獲得奈米乳液組成物。其中，上述檸檬醛係佔奈米乳液組成物的總重量為10 wt%，且檸檬醛與混合界面活性劑的S_o 比係為0.4至0.6。

本發明所使用的混合界面活性劑係由Span 85及Brij 97所組成，該混合界面活性劑的HLB值係為2至12，Span 85及Brij 97的混合比為10：90。其中，Brij型界面活性劑具有由去水山梨醇(sorbitan ring)取代的三個聚氧乙烯鏈的支鏈親水區域，且Span型界面活性劑具有可以在o/w界面潛在地聚集並形成疏水區域的大的頭部基團(large head group)。

此外，共溶劑係為乙二醇(ethylene glycol)或丙二醇(Propylene Glycol)，其主要用於降低黏度，增加產物之安定性，且共溶劑為奈米乳液組成物總重量的1 wt%。

本發明之含有檸檬醛的奈米乳液組成物之製備方式如下所示。

材料與方法

用於本發明的檸檬醛(植物來源的順式及反式異構體的混合物，純度95%)購自Merck。試劑等級Span 85(山梨糖醇三油酸酯，sorbitane trioleate)及Brij 97(聚氧乙烯(10)油醚，polyoxyethylene (10) oleyl ether)分別具有1.8及12.0的平均HLB。丙二醇(C₃ H₈ O₂ , M.W. = 76 g/mol)使用作為乳化系統中的共溶劑。本發明中使用的水是利用Milli-Q系統進行去離子及過濾。

奈米乳液的製備

奈米乳液是由檸檬醛、混合界面活性劑、去離子水及共溶劑所組成。檸檬醛的濃度固定在10 wt %，且混合界面活性劑的HLB值係為2至12。混合界面活性劑的HLB值如下列公式計算：HLB_mix = HLB_S ‧S%+ HLB_P ‧P%，其中HLB_S 、HLB_P 及HLB_mix 分別為Span 85、Brij 97及混合界面活性劑的HLB值，且S%及P%分別為混合界面活性劑中的Span 85及Brij 97的質量百分比。界面活性劑的HLB值被認為是個別的界面活性劑的HLB值得代數平均。混合界面活性劑與檸檬醛的比由比S_o 表示，例如當S_o =0.6(檸檬醛:表面活性劑=6:10)時，所含表面活性劑為總重之10 wt%/6*10=約16.67 wt%。共溶劑濃度固定在1 wt %。

所有乳化由兩個階段製備。粗滴乳液(coarse emulsion)係利用Polytron (PT-MR 3000，Kinematica AG，Littau，瑞士)所獲得，且接著以超音波製程進一步乳化。每次以約30 mL的樣品量在最高速下10分鐘製備含有不同組成物的粗滴乳液。使用具有20 kHz 超音波震盪器3000 (Sonicator 3000) (Misonix Inc.，Farmingdale，New York，美國)與20 mm直徑的探針(tip horn)進行超音波乳化作用。探針針尖對稱地置於粗滴乳液中，且該實驗在各種預設的超音波標稱功率(6至51W)30至300秒進行，且由裝置軟體進行控制。在乳化作用期間，自起始粗滴乳液至最終乳液的溫度差不超過20^o C。各實驗進行三次重複。

實驗設計

回應面方法論(Response surface methodology，RSM)用於系統性探討檸檬醛奈米乳液的液滴尺寸上的自變數超音波功率(X₁ )、時間(X₂ )及S_o 比(X₃ )的影響。如表1所示，實驗包含具有20個因子的中心複合設計(CCD)和具有三個中心點的星形設計。各自的實驗以隨機順序進行。

[表1] 回應面方法論的中心複合實驗設計

液滴尺寸定義

乳液液滴尺寸藉由以Nanotrac 150系統(Microtrac, Inc.，Montgomeryville，PA)的動態光散射定義。為了避免多重散射影響，所有乳液樣品在測量之前以去離子水稀釋至10%。關於乳液液滴尺寸的資訊是以理論光散射與測量的液滴尺寸分布之間的最佳擬合所獲得。乳液液滴尺寸藉由三次測量的平均估計且以體積分布的平均直徑(MN )呈現。 [公式1] 其中，V_i 為液滴尺寸之間的體積百分比，且di 為液滴直徑。

檸檬醛的封裝率

1 mL樣品溶解於玻璃管中的20 mL去離子水並加入10 ml的已烷，隨後以混合器混合1分鐘。封裝在奈米乳液中的檸檬醛是藉由將玻璃管的樣品在45^o C下水浴加熱20分鐘並間歇混合以利用已烷進行萃取。將玻璃管冷卻至室溫並藉由離心4000 rpm、20分鐘以自液相分離出已烷。藉由分光光度法在252nm下測量吸光度來定量存在於己烷中的檸檬醛的量。封裝率以下列公式2計算： [公式2]

穿透式電子顯微鏡(TEM)分析

檸檬醛奈米乳液的型態利用TEM可視化。將樣品(50 μL)加入至200網格的塗布formvar銅TEM樣品座(formvar-coated copper TEM sample holders)(EM Sciences, Hatfield, PA，美國)，接著以50 μL的1.5% (w/v) 磷鎢酸(phosphotungstic acid)在室溫下陰性染色10分鐘。多餘的液體以Whatman濾紙吸乾。在67kV下以裝備有20 μm孔徑的JEOL JSM-1200 EX II穿透式電子顯微鏡(Peabody，MA，美國)下觀察TEM樣品。

時間穩定性

檸檬醛奈米乳液的穩定性是在室溫下儲存14天的期間測定液滴尺寸的改變來定義。

微生物不活化測試

下列細菌株用於抗菌分析：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) (ATCC 27690)、大腸桿菌(Escherichia coli ) (ATCC 23815)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )(ATCC 15442)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )(ATCC 29212)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium )(ATCC 14028)及單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes )(ATCC 19113)。所有菌株自台灣生物資源保存及研究中心(Taiwan Bioresource Collection and Research Center)(新竹，台灣)獲得。抗菌研究包含根據國家委員會臨床研究室標準協定(National Committee of Clinical Laboratory Standards protocol)的紙錠擴散法(disc diffusion method)。首先，將洋菜平板接種標準化測試微生物。接著，將含有適當濃度的抗菌試劑的濾紙錠置於洋菜平板表面上。將培養皿在適當條件下培養。在培養之後，抗菌試劑在洋菜中擴散並抑制測試微生物的發芽及生長，接著測量抑制生長區域的直徑。在此實驗中，sulfazotrin錠使用作為陽性對照組。菌株接種在營養洋菜平板的固定相中，且檸檬醛奈米乳液配置以用於緊密接觸。將洋菜平板在35^oC 下培養24小時接著檢查直接在樣品下面和周圍的細菌的生長。在樣品及樣品周圍發展的抑制區域表示抗菌活性。該實驗重複進行五次。

統計分析

結果以mean ± SD表示。統計分析包含單因子變異數分析(one-way ANOVA)及鄧肯式新多變域檢定法(Duncan’s new multiple range tests)。差異在p ＜ 0.05 時具有統計上的意義。

結果

在不同HLB值下的檸檬醛的封裝率

奈米乳液在不同HLB值下利用由Span 85及Brij 97組成的混合界面活性劑製備。混合界面活性劑的HLB值為形成乳液液滴的關鍵因子。在形成O/W乳液的期間，親脂性界面活性劑與親水性界面活性劑相比，對於乳液中分散的液滴具有更大的親和力。為保持油相和水相的平衡，需要適當的HLB值。利用最佳的HLB值，使得在乳化作用期間新形成的液滴穩定並為維持其液滴尺寸。第1圖係顯示HLB值對於由超音波乳化作用(S_o 比=0.6；超音波功率=18 W；超音波時間=120秒)所製備的奈米乳液的視覺外觀的影響。在2至10的HLB值，乳液呈現不透明(白色)且在12的HLB值為透明或半透明。

研究顯示乳液液滴尺寸對於不同核芯材料的封裝率具有顯著地影響。降低乳液液滴尺寸可在乳液系統中產生較高保留的封裝成分。然而，在習知技術中卻鮮少人進一步將奈米乳液使用在油類和香料類的封裝。根據本發明的實驗結果，在不同HLB值下，奈米乳液中的檸檬醛的封裝率如表2所示：

[表2] HLB值對奈米乳液中的液滴尺寸及檸檬醛封裝率的影響(So比=0.6；超音波功率=18W；超音波時間= 120秒) ^a-i 在相同列中具有不同字母表示具有顯著地差異(p＜0.05) 數值為平均 ± SD (n=3)

如上表所示，隨著混合界面活性劑的HLB值的增加而增加檸檬醛的封裝率。當具有2的HLB值時，液滴尺寸為410 nm且檸檬醛封裝率為64.3%，當HLB值增加至12時，液滴為最小28 nm且檸檬醛封裝率為82.8%。根據本發明之結果顯示，小的乳液液滴與大的乳液液滴相比，核芯材料的保留率較高，且所有奈米乳液配方中的檸檬醛保留率大於60%。在小的乳液液滴中保留更多的香味與體積表面的平均直徑減少有關，其可以加強球形界面組織的修飾，並增加界面面積以控制乳液中的芳香化合物的分配。

製備檸檬醛奈米乳液的條件的最佳化

為了了解自變數對依賴變數的影響，我們藉由改變在實驗範圍內的兩個自變數，同時在中心點保持另一常數來產生表面反應和等高線圖。因此，第2圖的(A)為藉由改變乳液中的超音波功率及時間，同時將S_o 比保持在0.6而產生的圖表。在本發明中，檸檬醛奈米乳液是藉由兩個階段來製備。第一階段包含以Polytron製備具有約20 μm液滴尺寸的粗滴乳液。接著，將超音波進一步用於減少液滴尺寸，以獲得最小的液滴尺寸。根據第2圖的(A)顯示，液滴在超音波功率 18W及超音波時間120秒下達到最小尺寸，然而在另一個實驗設計組(第2圖的(B))中，液滴尺寸在較低或較高的超音波功率下沒有明顯變化。由於過度處理的現象可能因在更高的超音波功率下，而在超音波乳化作用期間發生乳液的液滴聚結的增加。然而在本發明中，超音波功率在6至30W且超音波時間60至180秒的條件下皆沒有發現過度處理的現象，且檸檬醛奈米乳液皆具有小的液滴尺寸，且最佳地，在超音波功率 18 W及超音波時間120秒下具有最小尺寸。

第2圖的(B)為藉由改變S_o 比及超音波時間，同時將超音波功率保持在18 W而產生的圖表。由於超音波時間可能影響界面活性劑對液滴表面的吸附速率及新形成的液滴的液滴尺寸分布。在本發明中，當界面活性劑吸附至檸檬醛的分散表面時，其將排列成適當的分子結構。因此，最佳的超音波時間將為臨界點，以形成奈米級分散液滴。本發明可在0.4至0.6的S_o 比及超音波時間120秒下獲得約100 nm 液滴尺寸的奈米乳液。

第2圖的(C)為藉由改變S_o 比及超音波功率，同時將超音波時間保持在120秒而產生的圖表。我們在0.4至0.6的S_o 比及超音波功率18W下獲得約100 nm液滴尺寸的奈米乳液。液滴尺寸與界面活性劑濃度密切相關。在低的S_o 比下，表面活性劑不足以吸附在新形成的液滴聚結的表面上。新形成的液滴依據O/W乳液系統的S_o 比改變。最初增加的S_o 比由於新形成的液滴具有更充分的表面活性劑來穩定化，因而造成液滴尺寸的大幅降低(S_o 比從0.2至0.4)。然而，混合界面活性劑的過度增加將無法降低液滴尺寸。在乳液系統中，許多殘留的界面活性劑將干擾乳液的穩定性和外觀。在本發明中，顯示S_o 比為0.4至0.6時，具有較佳的奈米乳液液滴尺寸，且最佳地，S_o 比為0.6。

TEM 觀察

我們觀察利用HLB值12的混合界面活性劑在0.6的S_o 比及超音波功率18 W、120秒下製備所形成的檸檬醛奈米乳液的型態。以負染色樣品進行TEM分析。影像如第3圖所示，其中影像的，磷鎢酸染色的檸檬醛液滴清晰可見，且液滴尺寸分析利用Nanotrac 150光散射儀進行。此外，檸檬醛液滴的形狀為球形，且液滴的灰色部分為與乳液系統結合的檸檬醛。

液滴尺寸分布

檸檬醛奈米乳液的液滴尺寸分布如第4圖所示，其中該乳液是以HLB值12的混合界面活性劑在0.6的S_o 比及超音波功率 18 W、120秒的條件下製備所形成。我們發現由超音波乳化作用導致具有小液滴尺寸的奈米乳液，因而在10至100 nm的尺寸之間具有顯著的通過峰(passing peak)及且產生清楚的液滴尺寸分布。與使用其他機械裝置製備的乳液相比，超音波乳液的較少聚分散性且更穩定。

儲存在室溫的奈米乳液的時間穩定性

如第5圖所示，在室溫下儲存的奈米乳液的液滴尺寸隨著儲存時間進行而變化。液滴尺寸在室溫下儲存開始的7天期間非常快速地增加。在7天之後，增加速率變慢，但尺寸仍在奈米乳液的可接受範圍。在O/W乳液系統中的液滴的形成期間，新形成的液滴從施加的力量中獲得更多的能量，因而需要時間達到熱力學平衡。

抗菌活性

檸檬醛可破壞及穿透細菌的細胞壁的液體結構。其導致蛋白質的變性和細胞膜的破壞，接著細胞質滲漏和細胞裂解並死亡。在本發明中，我們在紙錠擴散測試中，將利用HLB值12的混合界面活性劑以0.6的S_o 比及超音波功率 18 W、120秒的條件下所形成的檸檬醛奈米乳液針對六種食物相關的細菌的抗菌活性進行篩選，其結果如下列表3所示：

[表3] 檸檬醛奈米乳液的抗菌活性 ^a-e 在相同列中具有不同字母表示具有顯著地差異(p＜0.05) 數值為平均 ± SD (n=3)

抑制區域的尺寸通常與樣品或產品呈現的抗菌活性程度相關，且較大區域的抑制通常表示抗菌劑更有效。為了進行比較，磺胺嘧啶(sulphadiazine)使用作為標準。檸檬醛奈米乳液針對單核球增多性李氏菌及金黃色葡萄球菌顯示出優異的抗菌活性。此外，將本發明的檸檬醛奈米乳液與未封裝於奈米乳液之檸檬醛相比，其抑制區域皆顯著地大於檸檬醛，顯示利用本發明之製備奈米乳液的最佳化配方及最佳條件所製備出的檸檬醛奈米乳液確實能達到提升針對細菌的抗菌活性之功效。

特定精油的奈米乳液針對革蘭氏陽性和陰性細菌的抗菌活性的比較顯示沒有顯著差異。遞送檸檬醛的奈米乳液系統可能藉由四個主要途徑促進其與微生物細胞膜的交互作用：(1)增加的表面積和通過外細胞膜的被動運輸提升與細胞質膜交互作用；(2)乳化劑液滴與細胞膜的磷脂雙層的融合可能促進精油在所需位置的靶向釋放；(3)自藉由油滴和水相之間的精油分配驅動的奈米乳液液滴的精油隨著時間持續釋放而延長精油的活性；以及(4)帶正電荷的奈米乳液液滴與帶負電的微生物細胞壁的靜電交互作用增加在作用部位的精油濃度。例如脂質體、微胞、微乳液及奈米乳液類的系統之奈米級遞送系統的使用可增加被動細胞吸收機制，因此降低質傳阻力並增加抗菌活性。

根據上述結果，藉由超音波乳化作用可在水中檸檬醛型系統中獲得奈米乳液液滴。用於檸檬醛奈米乳液的超音波乳化作用的最佳的微封裝條件是超音波功率18 W、超音波時間120秒及S_o 比0.4至0.6與＜ 12的HLB值，以產生液滴尺寸＜100 nm的奈米乳膠。且證實檸檬醛奈米乳液確實具有針對細菌的抗菌活性。

無。

第1圖係為在不同HLB值下的奈米乳液的視覺外觀之影像。

第2圖係為結合S_o 比、超音波功率及超音波時間對檸檬醛奈米乳液的液滴尺寸的影響之回應面輪廓圖；(A)為在恆定S_o 比(0.6)下的超音波功率及超音波時間；(B)為在恆定超音波時間(120秒)下的S_o 比及超音波功率；(C)為在恆定超音波功率(18 W)下的S_o 比及超音波時間。

第3圖係以100 nm作為比例尺之水中檸檬醛型奈米乳液系統中的液滴的穿透式電子顯微鏡之影像。

第4圖係為水中檸檬醛型奈米乳液系統的液滴尺寸分布之圖表。

第5圖係顯示奈米乳液的液滴尺寸在室溫下儲存而隨著儲存時間進行變化之圖表。

Claims

一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物之製備方法，其包含：將檸檬醛、混合界面活性劑、共溶劑及水利用一均質裝置進行均質，以獲得粗滴乳液；以及將該粗滴乳液利用一超音波震盪裝置進行超音波乳化作用，以獲得奈米乳液組成物，其中該檸檬醛係為該奈米乳液組成物總重量的10 wt%，該混合界面活性劑係由Span 85及Brij 97所組成，且該混合界面活性劑的HLB值係為2至12。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中超音波製程係進一步包含該超音波震盪裝置在超音波功率6至30W，且超音波時間60至180秒的條件下，進行超音波乳化作用。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該檸檬醛與該混合界面活性劑的比係為4~6：10。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中Span 85及Brij 97的重量混合比為1：9。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該共溶劑係為丙二醇。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該共溶劑係佔該奈米乳液組成物總重量的1 wt%。
如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該檸檬醛在該奈米乳液組成物中的封裝率係為64%~83%。
一種含有檸檬醛之奈米乳液組成物，係利用如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之製備方法所製得。
一種如申請專利範圍第8項所述之奈米乳液組成物用於製備抑制一種或複數種細菌之抑菌劑之用途。
如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該一種或複數種細菌係為選自由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鼠傷寒沙氏桿菌及單核球增多性李氏菌所組成之群組。