TW201923091A - 用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體 - Google Patents

用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW201923091A
TW201923091A TW107135633A TW107135633A TW201923091A TW 201923091 A TW201923091 A TW 201923091A TW 107135633 A TW107135633 A TW 107135633A TW 107135633 A TW107135633 A TW 107135633A TW 201923091 A TW201923091 A TW 201923091A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
target protein
immunogen
polypeptide
existing antibodies
Prior art date
Application number
TW107135633A
Other languages
English (en)
Inventor
墨漢 斯立尼凡森
強 梅尼克
馬修 葛明
Original Assignee
美商健康堤爾股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商健康堤爾股份有限公司 filed Critical 美商健康堤爾股份有限公司
Publication of TW201923091A publication Critical patent/TW201923091A/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001119—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001121—Receptors for chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001129—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

本發明提供用於產生免疫原之組合物及方法，該等免疫原代表不被可利用之抗體靶向之目標蛋白質區域，及使用該等組合物及方法產生對該等區域具有特異性的抗體。

Description

用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體
用於治療及研究用途之抗體及單株抗體一般藉由用包含目標蛋白質或目標蛋白質之一部分的免疫原使諸如小鼠之哺乳動物免疫而產生。通常，所得抗體僅與目標之少數區域結合，留下未觀察到抗體結合的其他區域。需要能提供靶向該目標之未觀察到抗體結合的部分的新穎免疫原的方法及組合物。
在一些情況下，本發明提供一種設計針對目標蛋白質之免疫原的方法，該方法包含a)獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；以及c)選擇包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原多肽，從而設計出針對該目標蛋白質的免疫原。在一些情況下，該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。在一些情況下，肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽，且該等序列可以與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質之序列約75%相同或約90%類似。該一或多種哺乳動物可為人類、小鼠、倉鼠或猴。在一些情況下，猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。在一些情況下，圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。該肽陣列可以包含一組多樣性肽或一組相關肽。該組相關肽可以75%相同或90%類似。在一些情況下，獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。在一些情況下，(i)可以包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構或(i)可以包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構，其中該演算法可以預測該目標蛋白質之摺疊結構。在一些情況下，免疫原多肽包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基及一或多個絲胺酸殘基的胺基酸序列，且連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。在一些情況下，該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。在一些情況下，免疫原包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少75%一致性的胺基酸序列。在其他情況下，免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
在一些情況下，本發明提供一種包含目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的免疫原，包含：a)獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；及c)選擇至少一種包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原。在一些情況下，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。在一些情況下，免疫原包含至少一個具有為一或多種哺乳動物所共有的胺基酸序列的區域，該一或多種哺乳動物選自人類、小鼠、倉鼠及猴。猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。該肽陣列可以包含一組多樣性肽或一組相關肽。該組相關肽可以至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%相同。獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列可以包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)選擇天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的免疫原多肽胺基酸。在一些情況下，(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。天然摺疊的目標蛋白質的結構或目標蛋白質之摺疊結構可以從演算法預測。在一些情況下，免疫原多肽包含至少2個胺基酸或至少30個胺基酸。在一些情況下，免疫原多肽包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。在一些情況下，該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。在一些情況下，免疫原包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少95%一致性的胺基酸序列。免疫原多肽可以包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。在一些情況下，該至少兩個胺基酸序列不對應於天然蛋白質中之序列位置。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，該方法包含：a)獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質上不會與該等現有抗體結合的區域；c)製備至少一種包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列的免疫原多肽；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定的區域的抗體，從而產生該抗體。在一些情況下，該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。在一些情況下，圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。該一或多種哺乳動物可以選自人類、小鼠、倉鼠及猴。猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的序列可以包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含：(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。(i)可以包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。或者(i)可以包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。用該免疫原多肽使哺乳動物免疫可以包含投與至少一個劑量的包含免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。在一些情況下，至少一個劑量包含該目標蛋白質。在其他情況下，至少一個劑量不包含該目標蛋白質。從哺乳動物產生抗體可以包括單離出表現該抗體之B細胞。一些實施例進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。在一些情況下，該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。該方法可以包括使該抗體結合至聚焦陣列。聚焦陣列可以包含具有與至少一部分該免疫原多肽至少100%相同之胺基酸序列的肽庫。在一些情況下，測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該Ab與肽庫之結合。在其他情況下，測定該抗體之抗原決定基可以包含鑑定由該Ab結合的肽，量測該抗體與肽陣列之結合。在一些情況下，捨棄與兩種或更多種不同抗原決定基結合的抗體。在一些情況下，該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。該抗體之生物作用可以包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期或縮短該目標蛋白質之半衰期。該目標蛋白質可為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。該免疫原多肽可以包含至少2個胺基酸或至少30個胺基酸。在一些情況下，該免疫原多肽包含至少一個連接子。在其他情況下，該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。該連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO:20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。一些情況進一步包含測定該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域的跨物種同源性。免疫原多肽可以包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。亦可以用前述方法產生抗體。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
在一些情況下，本發明提供一種治療有需要之個體的方法，該方法包含：a)獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；c)製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合之區域的胺基酸序列；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定的區域的抗體；及f)向該個體投與該抗體，從而治療該有需要之個體。該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。該一或多種哺乳動物可以選自人類、小鼠、倉鼠及猴。猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列可以包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含：(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。在一些情況下，(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。在其他情況下，(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。在一些情況下，演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。在其他情況下，用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。在一些情況下，至少一個劑量包含該目標蛋白質。在其他情況下，至少一個劑量不包含該目標蛋白質。從哺乳動物產生抗體可以包括單離出表現該抗體之B細胞。在一些情況下，該方法進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。在一些情況下，該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽庫之結合。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽陣列之結合。在一些情況下，捨棄與兩種或更多種不同抗原決定基結合的抗體。在其他情況下，該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。該抗體之生物作用可以包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。該目標蛋白質可為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。該免疫原多肽可以包含至少2個胺基酸或至少30個胺基酸。該免疫原多肽可以包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。該連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)及GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。該方法可以進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域的跨物種同源性。在一些情況下，免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
在一些情況下，本發明提供一種適用作藥劑的抗體，其中該抗體藉由以下產生：a)獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；c)製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定的區域的抗體。該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。該一或多種哺乳動物可以選自人類、小鼠、倉鼠及猴。猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列可以包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含：(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。在一些情況下，(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。在其他情況下，(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。在一些情況下，演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。在其他情況下，用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。在一些情況下，至少一個劑量包含該目標蛋白質。在其他情況下，至少一個劑量不包含該目標蛋白質。從哺乳動物產生抗體可以包括單離出表現該抗體之B細胞。在一些情況下，該方法進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。在一些情況下，該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽庫之結合。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽陣列之結合。在一些情況下，捨棄與兩種或更多種不同抗原決定基結合的抗體。在其他情況下，該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。該抗體之生物作用可以包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。該目標蛋白質可為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。該免疫原多肽可以包含至少2個胺基酸或至少30個胺基酸。該免疫原多肽可以包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。該連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)及GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。該方法可以進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域的跨物種同源性。在一些情況下，免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
在一些情況下，本發明提供抗體在製造藥劑方面的用途，其中該抗體係藉由以下產生：a)獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；c)製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定的區域的抗體。該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。該一或多種哺乳動物可以選自人類、小鼠、倉鼠及猴。猴可以選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域可以包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列可以包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在一些情況下，該方法進一步包含：(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。在一些情況下，(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。在其他情況下，(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。在一些情況下，演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。在其他情況下，用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。在一些情況下，至少一個劑量包含該目標蛋白質。在其他情況下，至少一個劑量不包含該目標蛋白質。從哺乳動物產生抗體可以包括單離出表現該抗體之B細胞。在一些情況下，該方法進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。在一些情況下，該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽庫之結合。測定該抗體之抗原決定基可以包含量測該抗體與肽陣列之結合。在一些情況下，捨棄與兩種或更多種不同抗原決定基結合的抗體。在其他情況下，該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。該抗體之生物作用可以包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。該目標蛋白質可為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。該免疫原多肽可以包含至少2個胺基酸或至少30個胺基酸。該免疫原多肽可以包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。該連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)及GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。該方法可以進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域的跨物種同源性。在一些情況下，免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。在一些情況下，該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。在一些情況下，第一域及第二域以非天然次序以可操作方式連接。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
該免疫原亦設計成包括殘基(例如，在一些實施例中，帶電荷胺基酸，諸如組胺酸)，該等殘基在處於諸如腫瘤微環境之酸性環境中時呈現不同的質子化狀態。例如，本文中所揭示之CD25免疫原設計成代表在酸性環境下將發生質子化的CD25之構形及組態域。使用該等免疫原構築體衍生的抗體有可能識別該免疫原在中性環境及酸性環境中不同的天然形式。藉由介導本文中所提出之經設計免疫原的pH且從而介導抗體識別免疫原的環境，T調節性細胞(T regulatory cell，Treg)可以選擇性靶向周邊(例如，正常組織)或選擇性靶向腫瘤微環境中，例如在周邊或在腫瘤細胞中之細胞表面上發現的CD25抗原。因此，此等免疫原可用於製造能夠在中性pH環境中(諸如在周邊)或在酸性pH環境(諸如腫瘤微環境)中選擇性識別抗原目標的抗體。亦可採用其他胺基酸特性來指導如本文中所揭示之抗體的選擇性靶向，其他胺基酸特性包括結構構形差異、電荷、疏水性或反應性含氧物種(reactive oxygen species)狀態。此外，調節性T細胞(Treg)之選擇性靶向將幫助減輕一些與檢查點免疫療法相關的嚴重毒性。
在一些實施例中，本發明提供一種包含目標蛋白質之至少兩個域的免疫原，該免疫原包含該目標蛋白質之第一域之多肽序列，其以非天然次序以可操作方式連接至該目標蛋白質之第二域之多肽序列。在一些情況下，該目標蛋白質之第一域藉由連接分子以可操作方式連接至該目標蛋白質之第二域。在某些實施例中，該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年10月9日申請之美國臨時申請案第62/569,945號及2017年11月16日申請之美國臨時申請案第62/587,368號之權益，該等美國臨時申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。 參考文獻併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。
本文中提供新穎免疫原、設計該等免疫原之方法及組合物、以及該等免疫原之產生新穎抗體的用途。該等免疫原可以來自與疾病過程相關或參與疾病過程的已知目標蛋白質——治療目標。本文中提供用以鑑定並靶向目標蛋白質之未被探索的區域並產生代表該目標蛋白質之未被探索的區域的定製免疫原以用於各種應用的方法及組合物。該等應用包括產生與目標蛋白質之未被探索的區域結合的抗體。本文中所揭示之其他方法及組合物係關於新穎肽陣列形式之使用，其表徵或能夠靶向目標蛋白質之所鑑定的未被探索的區域，產生針對本文中所揭示之目的的定製免疫原。設計定製免疫原之方法
本文中提供用於設計免疫原之方法及組合物，該等免疫原諸如包含目標多肽(例如，治療目標)之不會與現有抗體結合的區域的免疫原。在一些情況下，該方法包含：a)獲得目標多肽(例如，治療性目標多肽)之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；及c)選擇包含目標多肽之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列的免疫原多肽，從而設計出該免疫原。
本文中亦提供用於開發靶向特定的器官、組織、細胞環境，例如周邊組織或腫瘤微環境中所存在之細胞的抗體的方法及組合物。在一些情況下，該方法包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸(例如組胺酸)並使其突變，以便選出有可能在各種pH條件下識別抗原的抗體，從而僅在免疫原在所靶向的pH環境中表現時靶向抗體以識別目標序列。例如，本文中所揭示之CD25免疫原設計成代表能夠在酸性環境下發生質子化的CD25之構形及組態域。使用該等免疫原構築體衍生的抗體有可能有差別地識別該免疫原在中性環境或酸性環境中的天然形式。因此，此等免疫原可用於製造能夠在中性pH環境中(諸如在周邊)或在酸性pH環境(諸如腫瘤微環境)中選擇性識別抗原目標的抗體。
本文中所描述之用於產生針對目標多肽之免疫原的方法及組合物可以包括例如，其中該目標多肽為治療目標或分析相關目標或試劑相關目標或另一類型之目標。在一些實施例中，該目標多肽為治療目標。在其他實施例中，該目標多肽為分析目標。在其他實施例中，該目標多肽為試劑目標。圖譜分析現有單株抗體結合區
在本文中所揭示之方法及組合物中之一些中，現有抗體為市售抗體或已在專利或非專利出版物中揭示之抗體。本文中揭示設計針對目標蛋白質之免疫原或抗體的方法及組合物。在一些情況下，方法包含藉由偵測現有抗體與肽庫之結合來圖譜分析目標蛋白質之與現有抗體結合的區域。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。在一些情況下，肽庫包含彼此至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同或至少99%相同的序列。在其他情況下，肽庫包含彼此至少75%類似、至少80%類似、至少85%類似、至少90%類似、至少95%類似或至少99%類似的序列。
野生型哺乳動物蛋白質可為在自然條件下在個體中佔優勢的蛋白質序列，不同於非典型突變體類型。在一些情況下，圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。肽庫可以包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。在一些情況下，肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質至少60%相同、至少65%相同、至少70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同或至少99%相同的胺基酸序列的肽。在其他情況下，肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質至多60%相同、至多65%相同、至多70%相同、至多75%相同、至多80%相同、至多85%相同、至多90%相同、至多95%相同或至多99%相同的胺基酸序列的肽。在一些情況下，肽庫包含具有以下胺基酸序列的肽，該等胺基酸序列彼此50%至99%類似、彼此50%至95%類似、彼此50%至90%類似、彼此50%至85%類似、彼此50%至80%類似、彼此50%至75%類似、彼此50%至70%類似或彼此50%至65%類似。
哺乳動物包括人類、小鼠、兔、大鼠、狗、倉鼠、猴。猴包括來自狹鼻猿科(Catarrhine family) (猴總科(Cercopithecoidea superfamily))之猴，諸如食蟹猴、獼猴及恆河獼猴；來自狨科(Callitrichidae family)、捲尾猴科(Cebidae family)、青猴科(Aotidae family)、僧面猴科(Pitheciidae family)或蜘蛛猴科(Atelidae family)之猴。
對目標蛋白質之至少一個區域的表觀結合親和力可用於獲悉現有抗體與目標多肽之區域的結合或缺乏結合。結合可為具有在微莫耳(10− 6 M)範圍至奈莫耳(10− 9 M)範圍的範圍內或更低的親和力的任何相互作用。正交親和力量測亦可用於進一步表徵結合相互作用，諸如酶聯免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)、動態光散射(dynamic light scattering，DLS)、表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)、雙偏極化干涉術(dual polarisation interferometry，DPI)、生物層干涉術(bi-layer interferometry，BLI)、微尺度熱泳(microscale thermophoresis，MST)或可用於評定抗體是否有效地結合至目標蛋白質之至少一個區域的類似方法。單株抗體結合區之資料庫確定
在一些情況下，可使用電腦資料庫或電腦模式來鑑定或預測不會與該等現有抗體結合的多肽序列、已知與該等現有抗體結合的序列或預測與該等現有抗體結合的序列。電腦資料庫可含有與多個物種之抗體抗原決定基相關的資料，諸如人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物及其他動物物種的抗體抗原決定基。在一些情況下，獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列包含從已知與該等現有抗體結合之肽序列的資料庫鑑定與該等現有抗體結合之肽序列。在該等情況下，該方法可以進一步包含：(i)鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及(ii)從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇免疫原多肽。在一些情況下，(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構，且在其他情況下，(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
通常，抗原性抗原決定基被分類為連續或不連續的。連續(亦稱為線性)抗原決定基為來自蛋白質序列的連續片段，且不連續抗原決定基由沿著該蛋白質序列分散的若干片段構成，其形成抗原結合介面。目前，由於研究的方便性，大多數可用的抗原決定基預測方法集中於連續抗原決定基，其中蛋白質之胺基酸序列作為輸入。該等預測方法係基於胺基酸特性，包括親水性、溶劑可接近性、二級結構、可撓性及抗原性。存在若干資料庫，其為現有抗體提供已知線性抗原決定基的屬性(identity)，該等資料庫包括諸如Bcipep、FIMM及SVMTrip之資料庫。
此外，可使用諸如隱式馬爾可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)、人工神經網路(Artificial Neural Network，ANN)及支援向量機(Support Vector Machine，SVM)之機器學習演算法來鑑定抗原決定基。在一些情況下，本文中所描述之演算法中之一或多者可用於預測目標蛋白質之摺疊結構。定製免疫原
本文中亦提供免疫原，諸如包含目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合之區域的免疫原。本文中之免疫原在一些情況下使用本文中所提供之一或多種方法來設計，諸如包含以下之方法：a)獲得目標多肽之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；及c)製備至少一種包含目標多肽之不會與現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原多肽。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。
免疫原可以設計成含有天然目標或蛋白質抗原之一或多個區段或域，其中各區段之長度可為至少一個胺基酸。包含定製免疫原之不同區段可以藉由連接子以可以代表或可以不代表其在天然目標或蛋白質抗原中之相應序列次序的次序連接。連接蛋白質抗原之該等不同的域提供了免疫原之獨特性，其可以捕捉蛋白質抗原之『未被探索的』抗原決定基或一些獨特特徵，諸如pH敏感的域或構形。蛋白質抗原之離散域係經由連接子連接，呈現天然蛋白質抗原之獨特構形及組態。在一些情況下，定製之免疫原可以包含蛋白質之經重新定序的域序列。例如，具有四個域的天然蛋白質可以稱為具有含四個天然域之序列：「域1」、「域2」、「域3」及「域4」。源自該蛋白質之定製免疫原可以依非天然次序包含前述一或多個域、兩個或更多個域、三個或更多個域或全部域，亦即，總共4( 4 ) 種可能的組合。為了清楚起見，前述定製免疫原之非天然次序可為例如：a)「域1」、「域3」、「域4」、「域2」；b)「域4」、「域3」、「域2」、「域1」；c)「域3」、「域4」、「域2」、「域1」；d)「域4」、「域3」、「域2」、「域1」；e)「域1」、「域3」、「域2」、「域1」；或任何其他適合的非天然次序。在一些情況下，本文中提供一種定製免疫原，其包含該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列，該胺基酸序列以非天然次序至少包含第一域及第二域。在一些情況下，此等域在定製免疫原中係藉由連接子連接。在一些情況下，定製免疫原可以包含蛋白質之經重新定序的域序列，其包含天然目標蛋白質之至少兩個域。在一些情況下，該至少兩個域(諸如第一域及第二域)係依非天然次序以可操作方式連接。免疫原之以可操作方式連接的域可以包括例如以免疫原能夠在哺乳動物中引發免疫反應的方式連接的域(例如，該連接法本身不會阻止免疫反應)。
在一些情況下，本發明提供一種產生抗體的方法，該抗體係針對目標蛋白質中不會與現有之抗體結合之區域，在一些情況下，該目標蛋白質為PD-1。PD-1為屬於CD28/CTLA4家族的抑制性受體，且表現在活化的T淋巴細胞、B細胞、單核球、DC、自然殺手(Natural Killer，NK)細胞、骨髓來源的抑制性細胞(myeloid derived suppressor cell，MDSC)及Treg之表面上。與CTLA4相反，PD-1之主要作用係在對感染起炎症反應時限制周邊組織中T細胞之活性並限制自體免疫。長期抗原暴露會導致持續高度PD-1表現，其會誘導抗原特異性T細胞之耗竭或無反應(anergy)狀態，該狀態可藉由阻斷PD-1而至少部分逆轉。
PD-1之兩種配體PD-L1及PD-L2係在T細胞、APC及惡性細胞上表現，且起遏制自身反應性淋巴細胞及抑制TAA特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)之效應功能的作用。因此，靶向PD-1及其配體的療法具有恢復TAA特異性T細胞之細胞毒活性的潛力。
在配體之參與後，PD-1可經由磷酸酶SHP2抑制參與T細胞活化的激酶。PD-1可以在對感染起炎症反應時限制周邊組織中T細胞之活性並限制自體免疫。T細胞增殖的減少可導致IL-2分泌減少。PD-1亦可以在具有免疫抑制功能之調節性T細胞上高度表現，且進一步增加調節性T細胞之增殖。調節性T細胞能夠高度浸潤腫瘤；因此，阻斷PD-1可以降低腫瘤內調節性T細胞之免疫抑制功能。
由於廣泛的表現模式，PD-1亦可以增強腫瘤或組織中的NK活性。PD-1可經由PD-1+ B細胞增加抗體產生。在病毒感染及癌症中觀察到的慢性抗原暴露可導致持續的PD-1活化，且可以在同源抗原特異性T細胞中誘導無反應狀態。此無反應狀態可以經由阻斷PD-1而逆轉。
PD-1亦可以在諸多腫瘤類型的腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)上表現。CD4+ 細胞之增強的PD-1表現可以反映PD-1在腫瘤內調節性T細胞上的高表現。PD-1亦可以在CD8+ 細胞上高度表現且可以反映無反應狀態。與來自諸多腫瘤之淋巴細胞上PD-1之表現增加一致，PD-1之配體亦可以在腫瘤細胞表面上高度表現。PD-L1可以在例如黑素瘤、卵巢癌、肺癌及腎癌細胞上高度表現。PD-L2可以在例如原發性縱隔B細胞淋巴瘤、濾泡細胞B細胞淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)上高度表現。抗PD-1抗體可以誘導若干腫瘤類型的消退，包括結腸、腎、肺的腫瘤及黑素瘤。直接靶向PD-1或靶向PD-1與配體之間的相互作用的療法包括MDX-1106、BMS-936558、MK3475、CT-011及AMP-224。在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，在一些情況下，該目標蛋白質為PD-1。
在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，在一些情況下，該目標蛋白質為CD-25。CD-25為存在於活化的T細胞、活化的B細胞、一些胸腺細胞、骨髓前驅體及寡樹突細胞上的I型跨膜蛋白。免疫細胞表面上表現的CD-25之量的減少可能與原生動物克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)感染有關，且這種減少可導致慢性免疫抑制。在一些情況下，本發明提供一種用於獲得目標蛋白質上由一或多種現有抗體結合之多肽序列的方法，在一些情況下，該抗體為達利珠單抗(daclizumab)及/或巴利昔單抗(bacilixamab)。
在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，在一些情況下，該目標蛋白質為CXCR4。CXCR-4為對基質細胞衍生因子-1 (stromal-derived-factor-1，SDF-1，亦稱為CXCL12)具有特異性的α-趨化介素受體，一種對淋巴細胞具有強效趨化活性的分子。各種分子可以作為CXCR4的配體起作用，包括例如巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF或MMIF)。因此，在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之某個區域的抗體的方法，該目標蛋白質包括例如MIF。
在一些情況下，本發明提供一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，在一些情況下，該目標蛋白質為IL2。IL2為細胞介素分子，其調節負責免疫調節之白細胞(包括淋巴細胞)的活性，包括自身抗原與外來抗原的區分。IL2藉由與體內由淋巴細胞表現之IL-2受體結合來介導其作用。
在一些情況下，免疫原多肽包含至少2個胺基酸、至少3個胺基酸、至少4個胺基酸、至少5個胺基酸、至少6個胺基酸、至少7個胺基酸、至少8個胺基酸、至少9個胺基酸、至少10個胺基酸、至少11個胺基酸、至少12個胺基酸、至少13個胺基酸、至少14個胺基酸、至少15個胺基酸、至少16個胺基酸、至少17個胺基酸、至少18個胺基酸、至少19個胺基酸、至少20個胺基酸、至少21個胺基酸、至少22個胺基酸、至少23個胺基酸、至少24個胺基酸、至少25個胺基酸、至少26個胺基酸、至少27個胺基酸、至少28個胺基酸、至少29個胺基酸、至少30個胺基酸或更多。在其他情況下，免疫原多肽包含至多2個胺基酸、至多3個胺基酸、至少4個胺基酸、至多5個胺基酸、至多6個胺基酸、至多7個胺基酸、至多8個胺基酸、至多9個胺基酸、至多10個胺基酸、至多11個胺基酸、至多12個胺基酸、至多13個胺基酸、至多14個胺基酸、至多15個胺基酸、至多16個胺基酸、至多17個胺基酸、至多18個胺基酸、至多19個胺基酸、至多20個胺基酸、至多21個胺基酸、至多22個胺基酸、至多23個胺基酸、至多24個胺基酸、至多25個胺基酸、至多26個胺基酸、至多27個胺基酸、至多28個胺基酸、至多29個胺基酸、至多30個胺基酸、至多40個胺基酸、至多50個胺基酸、至多60個胺基酸、至多70個胺基酸、至多80個胺基酸、至多90個胺基酸、至多100個胺基酸、至多150個胺基酸、至多200個胺基酸、至多250個胺基酸或至多300個胺基酸。介導抗原識別
本文中亦提供用於開發靶向特定的器官、組織、細胞環境，例如周邊組織或腫瘤微環境中所存在之細胞的抗體的方法及組合物。在一些情況下，該等方法及組合物包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸(例如組胺酸)並使其突變，以便選出具有僅在免疫原在所靶向的pH環境中表現時識別目標序列的能力的抗體。在其他情況下，該等方法及組合物包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸並使其突變，以便介導免疫原之結構構形，從而僅在免疫原以僅存在於例如腫瘤細胞中之特定結構構形表現時使抗體靶向突變的免疫原以識別目標序列。在其他實施例中，方法及組合物包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸並使其突變，以便改善腫瘤可接近性，包括例如操控免疫原之電荷(例如陰離子或中性)，從而僅在免疫原表現為帶電分子時使抗體靶向突變的免疫原以識別目標序列。在其他情況下，方法及組合物包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸並使其突變，以便介導免疫原之疏水性，從而僅在免疫原表現為具有僅存在於例如腫瘤細胞中之特定疏水程度時使抗體靶向突變的免疫原以識別目標序列。在其他情況下，方法及組合物包含靶向指定免疫原序列中之選定胺基酸並使其突變，以便代表能夠介導反應性含氧物種之產生的目標蛋白質，從而使抗體靶向突變的免疫原以識別免疫原上之目標序列，從而增加在宿主腫瘤細胞中之反應性含氧物種。腫瘤細胞亦存在於缺氧環境中。
本文中揭示CD25免疫原之例示性實施例，將其設計成代表CD25之在酸性環境下將發生質子化的構形及組態域。使用該等免疫原構築體衍生的抗體有可能有差別地識別該免疫原在中性環境或酸性環境中的天然形式。因此，此等免疫原可用於製造能夠在中性pH環境中(諸如在周邊)或在酸性pH環境(諸如腫瘤微環境)中選擇性識別抗原目標的抗體。免疫原中所靶向進行修飾之胺基酸殘基包括例如帶電荷胺基酸，諸如組胺酸，可將其修飾為例如精胺酸或離胺酸，使得免疫原之質子化狀態之修飾將允許選出僅在免疫原在例如腫瘤細胞中所發現的酸性微環境的目標pH下表現時識別目標的抗體。亦可以利用免疫原序列之修飾來實現抗體之陰性選擇，例如，將帶正電荷的胺基酸(例如精胺酸、組胺酸或離胺酸)修飾為帶負電荷的胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)，從而能夠排除只能在酸性環境中識別免疫原的抗體。
抗原識別亦可藉由修飾胺基酸殘基以使得所得免疫原在其特性方面變成中性或缺乏氫鍵結來介導。例如，PD-1中之胺基酸殘基68，其在人類及食蟹猴中為酪胺酸且在小鼠中為精胺酸(參見圖 1 )，可經較小胺基酸丙胺酸或甘胺酸取代，該等較小胺基酸缺乏或具有減弱的形成側鏈氫鍵結的能力。這可以幫助允許選擇跨不同物種識別目標的抗體(亦即，泛物種抗體)。
此外，視抗體與目標之結合相互作用位點而定，免疫原序列可經修飾以利用抗體-抗原靶向之反應性含氧物種狀態。例如，已顯示增加的反應性含氧物種濃度導致非凋亡路徑中之細胞死亡。抗體與CXCR4含量之某些抗原決定基的增加的結合與高反應性含氧物種濃度相關，其中增加的CXCR4含量亦與不良預後及轉移相關。因此，修飾胺基酸殘基以使得所得免疫原在抗體與目標結合後促進反應性含氧物種的產生，這有利於選擇在增加的缺氧微環境中(例如在腫瘤微環境中)呈現時識別目標的抗體。
另外，抗原識別亦可藉由修飾胺基酸殘基以使得所得免疫原改變其電荷或疏水性/親水性狀態來介導，允許選擇在免疫原以替代性電荷、疏水性或親水性狀態表現時識別目標的抗體。這包括例如靶向含疏水性側鏈的胺基酸(例如，丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸或纈胺酸)且用含疏水性側鏈的胺基酸(例如，苯丙胺酸、色胺酸或酪胺酸)取代，或反之亦然。同樣地，所鑑定的免疫原序列中含極性中性側鏈的胺基酸(例如，天冬醯胺、半胱胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸及蘇胺酸)可經具有帶電荷胺基酸的胺基酸取代，諸如鹼性胺基酸(例如，精胺酸、組胺酸或離胺酸)或酸性胺基酸(例如，天冬胺酸或麩胺酸)。肽陣列
本文中揭示設計針對目標蛋白質之免疫原或抗體的方法及組合物。在一些情況下，圖譜分析目標蛋白質之不會與現有抗體結合的區域包含偵測現有抗體與肽陣列之結合或該結合的缺乏。陣列平台可以在陣列表面上包含複數個個別特徵。各特徵通常包含在陣列表面上原位合成的複數個個別分子，其中在一個特徵內的分子係相同的，但是在各特徵之間，分子之序列或屬性係不同的。陣列分子包括但不限於核酸(包括DNA、RNA、核苷、核苷酸、結構類似物或其組合)、肽、肽模擬物及其組合及其類似物，其中陣列分子可以在該等分子內包含天然的或非天然的單體。該等陣列分子包括大合成肽陣列之合成。在一些實施例中，使陣列上之肽在陣列表面上環化。
在一些實施例中，陣列中之分子為模擬抗原決定基(mimotope)，一種模擬抗原決定基之結構且能夠結合由抗原決定基引發的抗體的分子。在一些實施例中，陣列中之分子為互補位或互補位模擬物，其包含結合於抗原之抗原決定基的抗體(或T細胞受體)可變區中之位點。在一些實施例中，本發明陣列為包含隨機、半隨機或多樣性肽序列的肽陣列。在一些實施例中，多樣性肽序列可以源自蛋白質組庫，例如源自特定生物體(參見例如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)蛋白質組庫(Schubert等人, Cell Host Microbe (2013) 13(5):602-12))，或細胞器(參見例如粒線體(Mitochondrial，Mtd)蛋白質組庫(Calvo及Mootha, Annu. Rev. Genomics (2010) 11:25-44))，及其類似物。
在一些情況下，肽陣列可以包含一組多樣性肽、一組相關肽或這兩者。在一些情況下，該組相關肽75%相同。在其他情況下，一組相關肽可以彼此90%類似。在一些實施例中，肽陣列包含至少1000個獨特的肽。在其他實施例中，肽陣列包含至少10,000個獨特的肽。在其他實施例中，肽陣列包含至少100,000個獨特的肽。在其他實施例中，肽陣列包含至少1,000,000個獨特的肽。在其他實施例中，肽陣列包含至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少250,000、至少500,000、至少750,000、至少1,000,000、至少2,000,000、至少3,000,000或更多個獨特的肽。在其他實施例中，肽陣列係原位合成的。
在其他實施例中，多樣性肽序列可以源自一組所有已知的胺基酸組合，例如所有可能的四聚體之至少100%、所有可能的四聚體之至少90%、所有可能的四聚體之至少85%、所有可能的四聚體之至少80%、所有可能的四聚體之至少75%、所有可能的四聚體之至少70%、所有可能的四聚體之至少65%、所有可能的四聚體之至少60%、所有可能的四聚體之至少55%、所有可能的四聚體之至少50%、所有可能的四聚體之至少45%、所有可能的四聚體之至少40%、所有可能的四聚體之至少35%、所有可能的四聚體之至少30%或所有可能的四聚體之至少25%。在其他實施例中，多樣性肽序列可以源自一組所有可能的五聚體，例如所有可能的五聚體之至少100%、所有可能的五聚體之至少95%、所有可能的五聚體之至少90%、所有可能的五聚體之至少85%、所有可能的五聚體之至少80%、所有可能的五聚體之至少75%、所有可能的五聚體之至少70%、所有可能的五聚體之至少65%、所有可能的五聚體之至少60%、所有可能的五聚體之至少55%、所有可能的五聚體之至少50%、所有可能的五聚體之至少45%、所有可能的五聚體之至少40%、所有可能的五聚體之至少35%、所有可能的五聚體之至少30%或所有可能的五聚體之至少25%。在其他實施例中，陣列之多樣性肽序列可以源自一組胺基酸組合，例如所有可能的六聚體之25%至100%、所有可能的七聚體之25%至100%、所有可能的八聚體之25%至100%、所有可能的九聚體之25%至100%或所有可能的十聚體之25%至100%或其組合。多樣性肽序列之表示僅受陣列大小的限制。因此，本文中所揭示之方法、系統及分析可使用大陣列，例如至少100萬、至少200萬、至少300萬、至少400萬、至少500萬、至少600萬、至少700萬、至少800萬、至少900萬、至少1000萬或更多的肽。或者或另外，可以合成多個實質上不重疊的肽庫/陣列以覆蓋解析可由抗體識別之肽序列或基元所需的序列空間。
在其他實施例中，個別序列可以與來自相關物種之多肽的胺基酸序列共用一定百分比的同源性。多肽序列可以與相關肽之胺基酸序列共用至多10%同源性、至多20%同源性、至多30%同源性、至多40%同源性、至多50%同源性、至多60%同源性、至多70%同源性、至多80%同源性、至多90%同源性或至多99%同源性。可使用各種方法及軟體程式來測定兩個或更多個肽之間的同源性，諸如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline或另一適合的方法或演算法。
在一些實施例中，陣列上個別肽具有可變的及/或不同的長度。在一些實施例中，肽長度介於約6至20個胺基酸之間，或長度介於約7至18個胺基酸之間，或長度介於約8至15個胺基酸之間，或長度介於約9至14個胺基酸之間。在其他實施例中，肽長度為至少6個胺基酸、至少7個胺基酸、至少8個胺基酸、至少9個胺基酸、至少10個胺基酸、至少11個胺基酸、至少12個胺基酸、至少13個胺基酸、至少14個胺基酸、至少15個胺基酸。在其他實施例中，肽長度不超過15個胺基酸、不超過14個胺基酸、不超過13個胺基酸、不超過12個胺基酸、不超過11個胺基酸、不超過10個胺基酸、不超過9個胺基酸或不超過8個胺基酸。在其他實施例中，陣列上之肽具有約6個胺基酸、約7個胺基酸、約8個胺基酸、約9個胺基酸、約10個胺基酸、約11個胺基酸、約12個胺基酸、約13個胺基酸、約14個胺基酸或約15個胺基酸的平均長度。
在其他實施例中，陣列上之肽的胺基酸構建塊包含所有天然胺基酸。在其他實施例中，陣列上之肽的胺基酸構建塊包含非天然或合成胺基酸。在其他實施例中，使用僅19個胺基酸作為用於合成陣列上之肽的構建塊。在其他實施例中，使用僅18個胺基酸、僅17個胺基酸、僅16個胺基酸、僅15個胺基酸或僅14個胺基酸作為用於合成陣列上之肽的構建塊。在一些實施例中，在肽合成期間省略半胱胺酸。在其他實施例中，在肽合成期間省略甲硫胺酸。在其他實施例中，在肽合成期間省略異白胺酸。在其他實施例中，在肽合成期間省略蘇胺酸。在其他實施例中，在肽合成期間省略半胱胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸及/或蘇胺酸，包括其所有組合。
在一些實施例中，本發明陣列為包含一組聚焦的或有限的肽序列的肽陣列，所有肽序列均源自輸入胺基酸或肽序列，或輸入胺基酸或肽基元。本文中所揭示之方法、系統及分析可以使用一或多個肽陣列，包括不同的或半隨機的肽陣列及/或一組聚焦的或有限的肽序列。例如，本文中所揭示之方法、系統及分析可以利用一組多樣性肽及選擇一組聚焦的或有限的肽。肽陣列可以與如本文中所揭示之生物樣品並行或依序使用。例如，起初可以使用多樣性肽陣列，且獲得單株抗體之至少一個基元(以序列或結構為基礎)或序列，例如具有未知的結合概況。隨後可以將所鑑定的基元或序列用作輸入序列來創建至少一組聚焦的或有限的肽序列，且如本文中所描述般進行分析。使用本文中所描述之方法及陣列，可以使用多組聚焦的或有限的肽陣列來表徵抗體的抗體結合。
本文中所揭示之技術包括光微影陣列合成平台，其將半導體製造製程與組合化學合成結合起來，以在矽晶圓上產生基於陣列的庫。此外，藉由在紫外曝光下依序施加另外的光罩，可以建立各種陣列特徵。藉由利用光微影特徵圖案化的巨大進步，陣列合成平台具有高度可擴展性，且能夠在8吋晶圓上產生具有4000萬個特徵的組合化學庫。使用半導體晶圓生產設備在10,000級潔淨室中進行光微影陣列合成以達成高再現性。當將晶圓切割成標準顯微鏡載玻片尺寸時，各載玻片含有超過300萬個不同的化學實體。聚焦及靶向陣列之例示性實施例詳細描述於名為「Array-Based Peptide Libraries for Therapeutic Antibody Characterization」的PCT/US2017/025546中，針對該等揭示內容，其以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，具有藉由本文中所揭示之技術產生之化學庫的陣列係用於基於免疫的診斷分析，例如稱為免疫標記(immunosignature)分析。使用來自與陣列結合的一滴血液的患者抗體譜(antibody repertoire)，結合陣列之螢光結合概況影像提供足夠的資訊來對疾病與健康進行分類。
在一些實施例中，正在開發免疫標記分析用於臨床應用來診斷/監測自體免疫疾病並評定對自體免疫治療的反應。免疫標記分析之例示性實施例詳細描述於名為「Compound Arrays for Sample Profiling」之美國核准前公開(US Pre-Grant Publication)第2012/0190574號及名為「Immunosignaturing: A Path to Early Diagnosis and Health Monitoring」之美國核准前公開第2014/0087963號中，針對該等揭示內容，該等美國核准前公開均以引用的方式併入本文中。本文中開發的陣列使用包括橢偏儀法(ellipsometry)、質譜法及螢光在內的正交分析方法在各合成陣列內併入分析量測能力。此等量測能夠實現對陣列合成效能之縱向定性及定量評定。
在一些實施例中，肽陣列為高密度肽陣列。在一些實施例中，陣列包含在陣列上之特徵內的個別肽，其間隔小於0.5 nm、小於1 nm、小於2 nm、小於3 nm、小於4 nm、小於5 nm、小於6 nm、小於7 nm、小於8 nm、小於9 nm、相隔小於10 nm、相隔小於11 nm、相隔小於12 nm、相隔小於13 nm、相隔小於14 nm、或相隔小於15 nm。
聚焦肽陣列及多樣性肽陣列可以包含多個不同的肽。在一些情況下，肽陣列之大小視蛋白質組或目標蛋白質之所期望的覆蓋率而定。在一些情況下，本發明方法可以有效地提供：具有特異性結合的單株抗體之選擇；從結合域庫消除死端(dead-end)單株抗體；結合於目標蛋白質中之多個抗原決定基的單株抗體之選擇；結合於目標蛋白質之至少兩種同源物的單株抗體之選擇；結合於目標蛋白質之活性域、功能域或目標抗原決定基之單株抗體的選擇；或多特異性單株抗體之選擇，其係藉由篩選針對某一肽陣列之抗體，該肽陣列包含不超過2,000個肽、不超過5,000個肽、不超過10,000個肽、不超過20,000個肽、不超過30,000個肽、不超過40,000個肽、不超過50,000個肽、不超過60,000個肽、不超過70,000個肽、不超過80,000個肽、不超過90,000個肽、不超過100,000個肽、不超過200,000個肽、不超過300,000個肽、不超過400,000個肽、不超過500,000個肽、不超過600,000個肽、不超過700,000個肽、不超過800,000個肽、不超過900,000個肽、不超過1,000,000個肽、不超過2,000,000個肽、不超過3,000,000個肽、不超過4,000,000個肽或不超過5,000,000個肽。
在一些實施例中，肽陣列包含至少2,000個肽、至少3,000個肽、至少4,000個肽、至少5,000個肽、至少6,000個肽、至少7,000個肽、至少8,000個肽、至少9,000個肽、至少10,000個肽、至少11,000個肽、至少12,000個肽、至少13,000個肽、至少14,000個肽、至少15,000個肽、至少16,000個肽、至少17,000個肽、至少18,000個肽、至少19,000個肽、至少20,000個肽、至少21,000個肽、至少22,000個肽、至少23,000個肽、至少24,000個肽、至少25,000個肽、至少30,000個肽、至少40,000個肽、至少50,000個肽、至少60,000個肽、至少70,000個肽、至少80,000個肽、至少90,000個肽、至少100,000個肽、至少110,000個肽、至少120,000個肽、至少130,000個肽、至少140,000個肽、至少150,000個肽、至少160,000個肽、至少約170,000、至少180,000個肽、至少190,000個肽、至少200,000個肽、至少210,000個肽、至少220,000個肽、至少230,000個肽、至少240,000個肽、至少250,000個肽、至少260,000個肽、至少270,000個肽、至少280,000個肽、至少290,000個肽、至少300,000個肽、至少310,000個肽、至少320,000個肽、至少330,000個肽、至少340,000個肽、至少350,000個肽。
肽可以藉由連接分子物理連接至肽陣列。肽之N端或C端可附接至連接分子。連接分子可為例如存在於陣列表面上之官能複數或分子，諸如醯亞胺官能基、胺官能基、羥基官能基、羧基官能基、醛官能基及/或巰基官能基。連接分子可為例如聚合物。在一些實施例中，連接子為順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，連接子為甘胺酸-絲胺酸-半胱胺酸(GSC)或甘胺酸-甘胺酸-半胱胺酸(GGC)連接子。在一些實施例中，連接子由各種長度或各自組成之多肽組成。在一些情況下，連接子為不同長度的聚乙二醇。在其他情況下，連接子為羥甲基苯甲酸、4-羥基-2-甲氧基苯甲醛、4-胺磺醯基苯甲酸或其他適合將肽附接至固體受質的連接子。在一些情況下，連接分子經環化。環化連接子之例示性實施例包括但不限於名為「Array-Based Peptide Libraries for Therapeutic Antibody Characterization」之PCT申請案第PCT/US2017/025546號(2017年3月31日申請)中所揭示之實施例，該申請案之揭示內容全文併入本文中。
肽陣列之表面可以包含複數種不同材料。肽陣列之表面可為例如玻璃。可以包含肽陣列之表面的材料之非限制性實例包括玻璃、功能化玻璃、矽、鍺、砷化鎵、磷化鎵、二氧化矽、氧化鈉、氮化矽、硝化纖維素、耐綸(nylon)、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯(polyvinylidendifluoride)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、甲基丙烯酸酯或其組合。肽陣列之表面亦可以包含半導體晶圓，例如矽晶圓，用例如胺基矽烷分子衍生，其允許在陣列表面上點樣或原位合成。
肽陣列之表面可為平面、凹面或凸面。肽陣列之表面可為均質的且陣列表面可為異質的。在一些實施例中，肽陣列之表面為平面。在一些實施例中，肽陣列之表面為圓的，諸如珠粒之表面。肽陣列之表面可以塗有塗層。塗層可以例如改善本發明陣列之黏著能力。塗層可以例如降低生物樣品與本發明陣列之背景黏著。在一些實施例中，本發明之肽陣列包含具有胺基矽烷塗層之玻璃載片或矽晶圓。連接子
在一些情況下，免疫原多肽包含至少一個連接子。連接子可以包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。連接子可以具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。在一些情況下，免疫原可以設計成含有兩個或更多個存在於目標蛋白質之已知不會與抗體結合之表面上的殘基序列。在一些情況下，這兩個或更多個序列之次序可以相對於其在天然目標蛋白質中之位置/次序顛倒，提供具有連接至第一序列之第二序列的免疫原。例如，實例1描述針對PD-1之新穎免疫原之設計，將其設計成含有兩個存在於PD-1表面上之已知不會與納武單抗結合的殘基序列。舉例而言，實例1描述針對PD-1之新穎免疫原之設計。在該實例中，維持各序列之N端至C端方向性，但是序列次序相對於其在天然PD-1蛋白質中之位置/次序顛倒，得到具有連接至第一序列之第二序列的PD-1免疫原。分組
本發明提供基於本文中所揭示之方法及裝置來表徵及/或抗體之結合的無競爭高通量分組分析。藉由使用多樣性及聚焦陣列平台，可以鑑定不同的抗原決定基組，為目標蛋白質之抗原決定基覆蓋率提供定量度量。如本文中所使用之「分組」或「組」意謂抗體基於目標序列分析而處於不同類別的分類。例如，如 圖 11 中所見，肽陣列平台能夠基於結合至若干Her2抗體(Thermo MA5-13675、Santa Cruz SC-33684及Cell Signaling 2165)之肽序列的鑑定及比較而鑑定兩個不同的抗原決定基組(「抗原決定基組1」(左圖)及「抗原決定基組2」(右圖))。因此，所獲得之抗原決定基分組資料為各組提供假定的抗原決定基鑑定，且此外藉由所提供之序列，指出Her2蛋白質之不是被測試抗體覆蓋之區域。此允許鑑定具有可改善抗原決定基覆蓋率之特定區域的潛在新免疫原。
抗原決定基分組資料亦提供位置層面的胺基酸結合貢獻(比較 所分析之各結合肽的胺基酸分佈及覆蓋率)，這點很重要，例如就純系之泛物種選擇性而言。跨物種反應性
在一些情況下，該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。抗體設計方法
本文中亦提供抗體設計方法，諸如設計結合目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合之區域的抗體。在一些情況下，該方法包含：a)獲得目標之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；c)製備至少一種包含目標多肽之不會與現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。
本文中進一步提供用於設計與目標多肽(例如，治療性目標多肽)之獨特區域結合的單株抗體的抗體設計方法，該方法包含：a)獲得目標之與現有抗體結合的序列；b)鑑定目標多肽之不包含現有抗體中之每一者的結合區的區域；c)製備至少一種免疫原，其包含目標多肽之不包含現有抗體中之每一者的結合區的區域之胺基酸序列；d)用免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。
本文中另外提供抗體設計方法，其包含經由使用指導庫來改進單株抗體。一些此類方法包含在目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合之區域中產生單株抗體，該方法包含：a)獲得目標之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；c)製備至少一種免疫原，其包含靶向不會與該等現有抗體結合之區域的目標多肽區域之胺基酸序列；d)用免疫原多肽使哺乳動物免疫；e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體；及f)測定單株抗體與聚焦陣列之結合，聚焦陣列包含具有與目標多肽之一部分相同之胺基酸序列的肽庫，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。免疫
用該免疫原多肽使哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含免疫原多肽及視情況選用之佐劑的組合物。簡言之，可以用全長蛋白質、細胞、DNA、或選定免疫原中之一者使哺乳動物免疫。隨後，可以用全長蛋白質、細胞、DNA、或選定免疫原中之一者進行一輪追加免疫。例如，在一些實施例中，用選定免疫原中之一者使哺乳動物免疫，且隨後可以用全長目標蛋白質、靶細胞或選定免疫原或其組合(例如全長目標蛋白質與選定免疫原組合)進行一輪追加免疫。 圖 5 顯示用於產生抗體之例示性免疫方案。本文中涵蓋其他免疫方法，且熟習此項技術者將理解該等方法。測定生物作用
功能分析包含以下中之至少一者：抑制目標多肽之活性、增加目標多肽之活性、抑制目標多肽與結合配偶體之結合、穩定目標多肽與結合配偶體之結合、增加目標多肽之半衰期及減小目標多肽之半衰期。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。在一些情況下，分析可以獲悉用所揭示之方法設計之抗體是否抑制PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4、或另一生物目標。功能分析之非限制性實例可以包括：a)獲悉蛋白質與DNA之相互作用的分析，諸如去氧核糖核酸酶足跡分析(DNase footprinting assay)及凝膠移位分析(gel shift assay)；b)獲悉RNA分子之完整性的分析，諸如核連綴分析(nuclear run-on assay)；c)終點分析，其可以定量地或定性地量測分析之最終結果；d)動力學分析，其可以評估多個時間間隔之資料點讀數並比較生物過程之動力學；e)半定量分析，其提供可以在一定範圍內定量的讀出，諸如西方墨點法(western-blot)、凝血及凝集分析；f)免疫分析，其評估抗原抗體結合反應類型之反應，例如人類抗D免疫球蛋白分析量測特定免疫球蛋白之含量，及免疫分析，諸如針對百日咳疫苗、破傷風疫苗或白喉疫苗之分析，其量測經免疫之免疫系統反應的穩健性；g)酶活性分析，其測試功能及活性；h)群落形成分析，其可以測試細胞之增殖及分化能力；i)計數分析，諸如流動式細胞測量術分析；及j)成像分析，其可以例如用顯微術觀測生物過程。單株抗體
本文中亦提供藉由本文中所揭示之方法產生的單株抗體。一些此類單株抗體結合目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合的區域且藉由一種方法產生，該方法包含：a)獲得目標之與現有抗體結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；c)製備至少一種包含目標多肽之不會與現有抗體結合的區域之胺基酸序列的免疫原；d)用免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。
如本文中所提供之所獲得的單株抗體可以使用熟習此項技術者已知的一或多種方法評估。在某些實施例中，使用兩個肽陣列表徵抗體。例如，本申請案交叉參考以下專利申請案：在2017年10月9日預先申請的代理人案號43638-727.101，美國臨時申請案第62/569,926號，其以全文引用的方式併入本文中；及與本申請同時申請的名為「INTEGRATED PLATFORM FOR TARGET AND SPECIFICITY INFORMATION-DERIVED BINDING PARTNER SELECTION」的國際申請案，代理人案號RBYC-019/01WO 334002-2071，其以全文引用的方式併入本文中。來自所併入的此等申請案之方法可以在某些實施例中用於評估如本文中所描述獲得之抗體。治療方法及用途
本文中進一步提供治療方法，其包含投與藉由本文中所提供之方法產生的單株抗體。一些此類方法包含投與有效量的結合目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合之區域的單株抗體，其中該單株抗體係藉由一種方法產生，該方法包含：a)獲得目標多肽之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；c)製備至少一種免疫原，其包含目標多肽之不會與現有抗體結合的區域之胺基酸序列；d)用免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。
本文中亦提供藉由本文中所提供之方法產生的適用作藥劑的單株抗體。一些此類單株抗體結合目標多肽(例如，治療性目標多肽)之不會與現有抗體結合的區域。在一些情況下，適用作藥劑的單株抗體藉由一種方法產生，該方法包含：a)獲得目標之與現有抗體中之每一者結合的序列；b)鑑定目標多肽之不會與現有抗體中之每一者結合的區域；c)製備至少一種包含目標多肽之不會與現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原；d)用免疫原多肽使哺乳動物免疫；及e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中所鑑定之區域的單株抗體，從而產生該單株抗體。在一些實施例中，目標多肽為治療性目標多肽。例示性目標
目標蛋白質之非限制性實例包括PD-1、PD-L1、CD-25、CXCR4及MIF。為治療而投與
治療個體之方法可以包含用本發明抗體治療受試者(例如，患有疾病之患者及/或患有病狀之實驗室動物)。該方法可以包含a)獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；b)鑑定目標蛋白質之至少一個不會與現有抗體結合的區域；c)製備至少一種免疫原多肽，其包含目標蛋白質之不會與現有抗體結合的區域之胺基酸序列；d)用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；e)從該哺乳動物獲得特異性結合於在步驟b)中鑑定之區域的抗體；及f)向個體投與該抗體，從而治療有需要之個體。該治療可以治療自體免疫疾病或癌症。受試者可為人類。可在臨床疾病發作之前向受試者提供治療。可在臨床疾病發作之後向受試者提供治療。可在臨床疾病發作之後在1天、1週、6個月、12個月或2年之後向受試者提供治療。可在臨床疾病發作之後超過1天、1週、1個月、6個月、12個月、2年或更久，向受試者提供治療。可在臨床疾病發作之後不到1天、1週、1個月、6個月、12個月或2年，向受試者提供治療。治療亦可包括在臨床試驗中治療人類。治療可以包含向受試者投與醫藥組合物，諸如包含所揭示之抗體的醫藥組合物。
多個抗體可以按任何次序或同時投與。若同時，則抗體可以單一聯合形式提供，諸如靜脈內注射劑，或以多種形式提供，例如作為多個靜脈內注射劑或丸劑。抗體可以一起包裝或分開包裝，在單個包裝中或在複數個包裝中包裝。該等抗體中之一種抗體或所有抗體可以多劑量給予。若不是同時，則多個劑量之間的時間安排可以變至多達約一月。
包含本文中所描述之抗體的醫藥組合物可以呈適合單次投與精確劑量的單位劑型。在單位劑型中，將調配物分成含有適當量之一或多種化合物的單位劑量。單位劑量可以呈含有離散量調配物之包裝形式。非限制性實例為包裝好的錠劑或膠囊及於小瓶或安瓿(ampoule)中之散劑。水性懸浮液組合物可包裝於單劑量不可再封閉的容器中。可以使用多劑量可再封閉容器，例如與防腐劑組合或不與防腐劑組合。在一些實施例中，醫藥組合物不包含防腐劑。用於非經腸注射之調配物可以單位劑型存在，例如在安瓿中，或在含防腐劑的多劑量容器中。
本文中所描述之抗體可以按以下範圍存在於組合物中：約1 ng/kg至約10 ng/kg、約1 ng/kg至約100 ng/kg、約1 ng/kg至約1 mg/kg、約1 ng/kg至約10 mg/kg、約1 ng/kg至約100 mg/kg、約1 ng/kg至約250 mg/kg、約1 ng/kg至約500 mg/kg、約1 ng/kg至約750 mg/kg、約1 ng/kg至約1,000 mg/kg、約1 ng/kg至約1,250 mg/kg、約1 ng/kg至約1,500 mg/kg、約1 ng/kg至約1,750 mg/kg、約1 ng/kg至約2,000 mg/kg、約10 ng/kg至約100 ng/kg、約10 ng/kg至約1 mg/kg、約10 ng/kg至約10 mg/kg、約10 ng/kg至約100 mg/kg、約10 ng/kg至約500 mg/kg、約10 ng/kg至約750 mg/kg、約10 ng/kg至約1,000 mg/kg、約10 ng/kg至約1,250 mg/kg、約10 ng/kg至約1,500 mg/kg、約10 ng/kg至約2,000 mg/kg、約100 ng/kg至約1 mg/kg、約100 ng/kg至約10 mg/kg、約100 ng/kg至約100 mg/kg、約100 ng/kg至約250 mg/kg、約100 ng/kg至約500 mg/kg、約100 ng/kg至約750 mg/kg、約100 ng/kg至約1,000 mg/kg、約100 ng/kg至約1,250 mg/kg、約100 ng/kg至約1,500 mg/kg、約100 ng/kg至約1,750 mg/kg、約100 ng/kg至約2,000 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約100 mg/kg、約1 mg/kg至約500 mg/kg、約1 mg/kg至約750 mg/kg、約1 mg/kg至約1,000 mg/kg、約1 mg/kg至約1,250 mg/kg、約1 mg/kg至約1,500 mg/kg、約1 mg/kg至約1,750 mg/kg、約1 mg/kg至約2,000 mg/kg、約10 mg/kg至約100 mg/kg、約10 mg/kg至約500 mg/kg、約10 mg/kg至約750 mg/kg、約10 mg/kg至約1,000 mg/kg、約10 mg/kg至約1,250 mg/kg、約10 mg/kg至約1,500 mg/kg、約10 mg/kg至約1,750 mg/kg、約10 mg/kg至約2,000 mg/kg、約100 mg/kg至約500 mg/kg、約100 mg/kg至約750 mg/kg、約100 mg/kg至約1,000 mg/kg、約100 mg/kg至約1,250 mg/kg、約100 mg/kg至約1,500 mg/kg、約100 mg/kg至約1,750 mg/kg、約100 mg/kg至約2,000 mg/kg、約500 mg/kg至約750 mg/kg、約500 mg/kg至約1,000 mg/kg、約500 mg/kg至約1,250 mg/kg、約500 mg/kg至約1,500 mg/kg、約500 mg/kg至約1,750 mg/kg、約500 mg/kg至約2,000 mg/kg、約750 mg/kg至約1,000 mg/kg、約750 mg/kg至約1,250 mg/kg、約750 mg/kg至約1,500 mg/kg、約750 mg/kg至約1,750 mg/kg、約750 mg/kg至約2,000 mg/kg、約1,000 mg/kg至約1,250 mg/kg、約1,000 mg/kg至約1,500 mg/kg、約1,000 mg/kg至約1,750 mg/kg、或約1,000 mg/kg至約2,000 mg/kg。
在一些實施例中，免疫病症對如本文中所揭示之抗體的治療敏感。可以用本文中所揭示之抗體治療的免疫疾病或病狀的實例包括類風濕性關節炎、多發性硬化症、實驗性自體免疫性腦脊髓炎、牛皮癬、葡萄膜炎、第1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、濕疹、硬皮病、潰瘍性直腸炎、嚴重合併性免疫缺失病(severe combined immunodeficiency，SCID)、迪喬治氏症候群(DiGeorge syndrome)、共濟失調-毛細血管擴張症、季節性過敏、常年過敏、食物過敏、全身性過敏反應(anaphylaxis)、肥大細胞增多症、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、帕金森氏病(Parkinson's)、阿茲海默氏病(Alzheimer's)、高脾功能症、白血球黏著缺乏症(leukocyte adhesion deficiency)、X性聯淋巴增生性疾病、X性聯無γ球蛋白血症、選擇性免疫球蛋白A缺乏症、高IgM症候群、HIV、自體免疫淋巴增生症候群、偉-爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、慢性肉芽腫病、常見變異型免疫缺失症(common variable immunodeficiency，CVID)、高免疫球蛋白E症候群、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、急性發炎病狀、慢性發炎病狀及癌症。
在一些實施例中，癌症對本文中所揭示之抗體的治療敏感。癌症之非限制性實例包括：急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症、AIDS相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤，諸如小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumors)、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、原發灶不明癌(carcinoma of unknown primary origin)、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、子宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、促結締組織增生小型圓形細胞腫瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖細胞腫瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌、胃腸基質腫瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌症、肝細胞(肝)癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼內黑素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌、喉癌、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌，諸如非小細胞肺癌及小細胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨之惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、神經管胚細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、口腔癌、多發性內分泌瘤症候群、骨髓發育不良症候群、骨髓白血病、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨之惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、胰臟癌、胰臟癌胰島細胞、副鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體胚細胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺胚細胞瘤、漿細胞瘤形成、原發性中樞神經系統淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及輸尿管移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、皮膚癌梅克爾細胞(skin carcinoma merkel cell)、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、T細胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、(妊娠)滋養細胞腫瘤、原發位置未明癌症(cancer of unknown primary site)、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)。賦形劑
本發明抗體可以與其他化學組分組合，其他化學組分諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑。醫藥組合物有助於向受試者投與抗體。醫藥組合物可以藉由各種形式及途徑以治療有效量作為醫藥組合物投與，包括例如腫瘤內、靜脈內、皮下、肌肉內、經直腸、氣霧劑、非經腸、經眼、經肺、經皮、經陰道、經眼、經鼻及局部投與。抗體可以局部或全身方式投與，例如，經由將抗體直接注射至器官中，視情況在儲槽中注射。
醫藥抗體組合物可以使用一或多種生理學上可接受之載劑來調配，生理學上可接受之載劑包含賦形劑及助劑，其有助於將活性化合物加工成可以在醫藥學上使用之製劑。調配物可以視所選投與途徑而進行修飾。包含本文中所描述之抗體或免疫原的醫藥組合物可以例如藉由混合、溶解、粒化、製成糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、包覆或壓縮製程來製造。醫藥組合物可以包括至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及本文中所描述之化合物，呈游離鹼或醫藥學上可接受之鹽形式。
醫藥學上可接受之賦形劑之非限制性實例可見於例如以下各者中：Remington : The Science and Practice of Pharmacy , 第十九版 (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E.,Remington ' s Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975；Liberman, H.A.及Lachman, L.編,Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；及Pharmaceutical Dosage Fo rmsand Drug Delivery Systems, 第七版 (Lippincott Williams & Wilkins1999)，其各自以全文引用的方式併入本文中。
可以調配非經腸注射劑用於推注(bolus injection)或連續輸注。醫藥組合物可呈含於油性或水性媒劑中之無菌懸浮液、溶液或乳液的適合非經腸注射之形式，且可以含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。用於非經腸投與之醫藥調配物包括呈水溶性形式之抗體水溶液。本文中所揭示之PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4及其他抗體之懸浮液可以製成油性注射懸浮液。合適之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有合適穩定劑或增加抗體溶解性及/或減少抗體聚集之試劑，以允許製備高度濃縮之溶液。或者，可以將抗體凍乾或呈粉末形式，在使用前，使用例如無菌無熱原質之水的合適媒劑復原。在一些實施例中，經靜脈內投與本發明抗體。
本文中所揭示之抗體，例如抗PD-1、抗CD-25、抗CXCR4、抗IL2、抗MIF及其他抗體，可以局部投與且可以調配成多種可局部投與之組合物，諸如溶液、懸浮液、洗劑、凝膠、膏體、藥用條膏(medicated stick)、香膏、乳霜及油膏。此類醫藥組合物可以含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑及防腐劑。數位處理裝置
在一些實施例中，本文中所描述之方法結合電腦系統、平台、軟體及網路使用，其有助於藉由螢光、發光、量熱法、層析、放射活性、生物層干涉術及電漿子共振中之至少一者來偵測與肽陣列中之一或多種肽的結合域。前述電腦系統、平台、軟體及網路可以包括數位處理裝置或使用該數位處理裝置。在其他實施例中，數位處理裝置包括一或多個硬體中央處理單元(central processing unit，CPU)，亦即執行該裝置之功能的處理器。在另外其他實施例中，數位處理裝置進一步包含其組態在於執行可執行指令的操作系統。在一些實施例中，數位處理裝置視情況連接電腦網路。在其他實施例中，數位處理裝置視情況連接至網際網路，使得其存取全球資訊網。在另外其他實施例中，數位處理裝置視情況連接至雲端計算基礎設施。在其他實施例中，數位處理裝置視情況連接至企業內部網路。在其他實施例中，數位處理裝置視情況連接至資料儲存裝置。
根據本文中之說明，作為非限制性實例，適合數位處理裝置包括伺服器電腦、桌上型電腦、膝上型電腦、筆記型電腦、次筆記型電腦、迷你筆記型電腦、迷你平板電腦(netpad computer)、機上型電腦(set-top computer)、手持型電腦、網際網路器具、行動智慧型電話、平板電腦(tablet computer)、個人數位助理、視訊遊戲主控台及載具。熟習此項技術者將認識到，諸多智慧型電話均適用於本文中所描述之系統。熟習此項技術者亦將認識到，具有視情況選用之電腦網路連接的選擇電視、視訊播放器及數位音樂播放器適用於本文中所描述之系統。適合平板電腦包括熟習此項技術者已知的具有小冊子、平板及可轉換組態的平板電腦。
在一些實施例中，數位處理裝置包括經組態以執行可執行指令之操作系統。操作系統為例如包括程式及資料之軟體，其管理裝置之硬體且提供執行應用程式之服務。熟習此項技術者將認識到，作為非限制性實例，適合的伺服器操作系統包括FreeBSD、OpenBSD、NetBSD® 、Linux、Apple® Mac OS X Server® 、Oracle® Solaris® 、Windows Server® 及Novell® NetWare® 。熟習此項技術者將認識到，作為非限制性實例，適合的個人電腦操作系統包括Microsoft® Windows® 、Apple® Mac OS X® 、UNIX® 及類UNIX操作系統，諸如GNU/Linux® 。在一些實施例中，藉由雲端計算提供操作系統。熟習此項技術者亦將認識到，作為非限制性實例，適合的行動智能手機操作系統包括Nokia® Symbian® OS、Apple® iOS® 、Research In Motion® BlackBerry OS® 、Google® Android® 、Microsoft® Windows Phone® OS、Microsoft® Windows Mobile® OS、Linux® 及Palm® WebOS® 。
在一些實施例中，數位處理裝置包括儲存及/或記憶體裝置。儲存及/或記憶體裝置為一或多種用於在暫時或永久基礎上儲存資料或程式的物理設備。在一些實施例中，該裝置為揮發性記憶體且需要能量維持所儲存資訊。在一些實施例中，該裝置為非揮發性記憶體且當不對數位處理裝置供電時仍保留所儲存之資訊。在其他實施例中，非揮發性記憶體包含快閃記憶體。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含動態隨機存取記憶體(dynamic random-access memory，DRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含鐵電式隨機存取記憶體(ferroelectric random access memory，FRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含相變隨機存取記憶體(phase-change random access memory，PRAM)。在其他實施例中，該裝置為儲存裝置，作為非限制性實例，包括CD-ROM、DVD、快閃記憶體裝置、磁碟機、磁帶機、光碟機及基於雲端計算之儲存。在其他實施例中，儲存及/或記憶體裝置為諸如本文中所揭示之彼等裝置的組合。
在一些實施例中，數位處理裝置包括向使用者發送視覺資訊之顯示器。在一些實施例中，顯示器為陰極射線管(cathode ray tube，CRT)。在一些實施例中，顯示器為液晶顯示器(liquid crystal display，LCD)。在其他實施例中，顯示器為薄膜電晶體液晶顯示器(thin film transistor liquid crystal display，TFT-LCD)。在一些實施例中，顯示器為有機發光二極體(organic light emitting diode，OLED)顯示器。在多種其他實施例中，OLED顯示器為被動矩陣式OLED (PMOLED)或主動矩陣式OLED (AMOLED)顯示器。在一些實施例中，顯示器為電漿顯示器。在其他實施例中，顯示器為視訊投影儀。在另外其他實施例中，顯示器為諸如本文中所揭示之彼等裝置的組合。
在一些實施例中，數位處理裝置包括自使用者接收資訊之輸入裝置。在一些實施例中，輸入裝置為鍵盤。在一些實施例中，輸入裝置為指標裝置，作為非限制性實例，包括滑鼠、軌跡球、軌跡板、操縱桿、遊戲控制器或觸控筆。在一些實施例中，輸入裝置為觸控式螢幕或多點觸控式螢幕。在其他實施例中，輸入裝置為擷取語音或其他聲音輸入之麥克風。在其他實施例中，輸入裝置為擷取運動或視覺輸入之視訊攝影機。在另外其他實施例中，輸入裝置為諸如本文中所揭示之彼等裝置的組合。
在一些實施例中，數位處理裝置包括數位攝影機。在一些實施例中，數位攝影機擷取數位影像。在一些實施例中，數位攝影機為自動對焦攝影機。在一些實施例中，數位攝影機為電荷耦合裝置(charge-coupled device，CCD)攝影機。在其他實施例中，數位攝影機為CCD視訊攝影機。在其他實施例中，數位攝影機為互補金氧半導體(complementary metal-oxide-semiconductor，CMOS)攝影機。在一些實施例中，數位攝影機擷取靜止影像。在其他實施例中，數位攝影機擷取視訊影像。在各種實施例中，適合數位攝影機包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30及更高的百萬像素攝影機，包括其中的增量。在一些實施例中，數位攝影機為標準定義攝影機。在其他實施例中，數位攝影機為HD視訊攝影機。在其他實施例中，HD視訊攝影機以至少約1280×約720像素或至少約1920×約1080像素擷取影像。在一些實施例中，數位攝影機擷取彩色數位影像。在其他實施例中，數位攝影機擷取灰度數位影像。在各種實施例中，以任何適合的數位影像格式儲存數位影像。作為非限制性實例，適合的數位影像格式包括聯合圖像專家小組(Joint Photographic Experts Group，JPEG)、JPEG 2000、可交換影像檔案格式(Exchangeable image file format，Exif)、帶標影像檔案格式(Tagged Image File Format，TIFF)、RAW、可攜網路圖形(Portable Network Graphics，PNG)、圖形交換格式(Graphics Interchange Format，GIF)、Windows® 位元映射(BMP)、可攜像素映射(portable pixmap，PPM)、可攜灰度映射(portable graymap，PGM)、可攜位元映射檔案格式(portable bitmap file format，PBM)及WebP。在各種實施例中，以任何適合的數位視訊格式儲存數位影像。作為非限制性實例，適合的數位視訊格式包括AVI、MPEG、Apple® QuickTime® 、MP4、AVCHD® 、Windows Media® 、DivX™、Flash Video、Ogg Theora、WebM及RealMedia。非暫時性電腦可讀儲存媒體
在一些實施例中，本文中所描述之方法結合有助於偵測與肽陣列之一或多個肽之結合域的電腦系統、平台、軟體及網路使用。系統、平台、軟體、網路及方法包括一或多個非暫時性電腦可讀儲存媒體，其經一程式編碼，該程式包括可由視情況網路化之數位處理裝置的操作系統執行的指令。在其他實施例中，電腦可讀儲存媒體為數位處理裝置之有形組件。在另外其他實施例中，電腦可讀儲存媒體視情況可自數位處理裝置移除。在一些實施例中，作為非限制性實例，電腦可讀儲存媒體包括CD-ROM、DVD、快閃記憶體裝置、固態記憶體、磁碟機、磁帶機、光碟機、雲端計算系統及服務及其類似物。在一些情況下，程式及指令在媒體上係永久性地、實質上永久性地、半永久性地或非暫時地編碼。電腦程式
在一些實施例中，本文中所揭示之系統、平台、軟體、網路及方法包括至少一個電腦程式。電腦程式包括可在數位處理裝置之CPU中執行的一系列指令，撰寫該等指令來執行指定任務。根據本文中所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，可以各種語言之各種版本撰寫電腦程式。在一些實施例中，電腦程式包含一系列指令。在一些實施例中，電腦程式包含複數個系列之指令。在一些實施例中，自一個位置提供電腦程式。在其他實施例中，自複數個位置提供電腦程式。在各種實施例中，電腦程式包括一或多個軟體模組。在各種實施例中，電腦程式部分或全部包括一或多個網路應用程式、一或多個行動應用程式、一或多個獨立應用程式、一或多個網路瀏覽器插件、擴充、增益集或附加或其組合。可用於本發明之電腦程式的非限制性實例包括可提供現有抗體之已知線性抗原決定基的屬性的資料庫，包括諸如、FIMM及SVMTrip之資料庫。此外，諸如隱式馬爾可夫模型(HMM)、人工神經網路(ANN)及支援向量機(SVM)之機器學習演算法可用於表徵與一或多個肽特異性結合的結合域或脫靶。網路應用程式
在一些實施例中，電腦程式包括網路應用程式。根據本文中所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，網路應用程式在各種實施例中利用一或多個軟體框架及一或多個資料庫系統。在一些實施例中，在諸如Microsoft® .NET或Ruby on Rails (RoR)之軟體框架上建立網路應用程式。在一些實施例中，網路應用程式利用一或多個資料庫系統，作為非限制性實例，資料庫系統包括關聯式、非關聯式、物件導向式、聯合式及XML資料庫系統。在其他實施例中，作為非限制性實例，適合的關聯式資料庫系統包括Microsoft® SQL伺服器、mySQL™及Oracle® 。熟習此項技術者亦將認識到，網路應用程式在各種實施例中以一或多種語言之一或多個版本撰寫。網路應用程式可以一或多種標示語言、表現定義語言、客戶端腳本語言、伺服器端編碼語言、資料庫查詢語言或其組合來撰寫。在一些實施例中，網路應用程式在一定程度上以標示語言來撰寫，諸如超文字標示語言(Hypertext Markup Language，HTML)、可延伸超文字標示語言(Extensible Hypertext Markup Language，XHTML)或可延伸標示語言(eXtensible Markup Language，XML)。在一些實施例中，網路應用程式在一定程度上以表現定義語言來撰寫，諸如階層式樣式表(Cascading Style Sheet，CSS)。在一些實施例中，網路應用程式在一定程度上以客戶端腳本語言來撰寫，諸如非同步Javascript及XML (AJAX)、Flash® Actionscript、Javascript或Silverlight® 。在一些實施例中，網路應用程式在一定程度上以伺服器端編碼語言來編寫，諸如主動伺服器頁(Active Server Page，ASP)、ColdFusion® 、Perl、Java™、Java伺服器頁(JavaServer Page，JSP)、超文字前處理器(Hypertext Preprocessor，PHP)、Python™、Ruby、Tcl、Smalltalk、WebDNA® 或Groovy。在一些實施例中，網路應用程式在一定程度上以資料庫查詢語言來撰寫，諸如結構化查詢語言(Structured Query Language，SQL)。在一些實施例中，網路應用程式整合企業伺服器產品，諸如IBM® Lotus Domino® 。用於為藝術家提供生涯發展網路之網路應用程式允許藝術家上傳資訊及媒體檔案，在一些實施例中，該網路應用程式包括媒體播放器元件。在各種其他實施例中，媒體播放器元件利用諸多適合的多媒體技術中之一或多者，作為非限制性實例，適合的多媒體技術包括Adobe® Flash® 、HTML 5、Apple® QuickTime® 、Microsoft® Silverlight® 、Java™及Unity® 。行動應用程式
在一些實施例中，電腦程式包括為行動數位處理裝置提供之行動應用程式。在一些實施例中，行動應用程式在製造時被提供給行動數位處理裝置。在其他實施例中，行動應用程式經由本文中所描述之電腦網路而被提供給行動數位處理裝置。
鑒於本文中所提供之揭示內容，行動應用程式藉由熟習此項技術者已知的技術，使用此項技術中已知的硬體、語言及開發環境而建立。熟習此項技術者將認識到，可以若干種語言撰寫行動應用程式。作為非限制性實例，適合的程式設計語言包括C、C++、C#、Objective-C、Java™、Javascript、Pascal、Object Pascal、Python™、Ruby、VB.NET、WML及具有或不具有CSS之XHTML/HTML或其組合。
適合的行動應用程式開發環境可自若干來源獲得。作為非限制性實例，市售開發環境包括AirplaySDK、alcheMo、Appcelerator® 、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、Rhomobile及WorkLight Mobile Platform。作為非限制性實例，其他可免費獲得之開發環境包括Lazarus、MobiFlex、MoSync及Phonegap。此外，作為非限制性實例，行動裝置製造商分佈式軟體開發套組包括iPhone及iPad (iOS) SDK、Android™ SDK、BlackBerry® SDK、BREW SDK、Palm® OS SDK、Symbian SDK、webOS SDK及Windows® Mobile SDK。
熟習此項技術者將認識到，若干市售論壇可用於行動應用程式之分佈，作為非限制性實例，包括Apple® App Store、Android™ Market、BlackBerry® App World、掌上型裝置之App Store、webOS之App Catalog、Mobile之Windows® Marketplace、Nokia® 裝置之Ovi Store、Samsung® Apps及Nintendo® DSi Shop。獨立應用程式
在一些實施例中，電腦程式包括獨立應用程式，其為作為獨立電腦製程執行的程式，而非附加至現有製程，例如並非插件。熟習此項技術者將認識到，獨立應用程式常常經編譯。編譯器為將以程式設計語言撰寫之原始程式碼轉換成諸如組合語言或機器程式碼之二進位目標程式碼的電腦程式。作為非限制性實例，適合的經編譯程式設計語言包括C、C++、Objective-C、COBOL、Delphi、Eiffel、Java™、Lisp、Python™、Visual Basic及VB.NET或其組合。常常至少部分地進行編譯以建立可執行程式。在一些實例中，電腦程式包括一或多個可執行的經編譯應用程式。軟體模組
本文中所揭示之系統、平台、軟體、網路及方法在各種實施例中包括軟體、伺服器及資料庫模組。鑒於本文中所提供之揭示內容，軟體模組藉由熟習此項技術者已知的技術，使用此項技術中已知的機器、軟體及語言而建立。本文中所揭示之軟體模組以多種方式來實施。在各種實施例中，軟體模組包含檔案、程式碼部分、程式設計目的、程式設計結構或其組合。在其他各種實施例中，軟體模組包含複數個檔案、複數個程式碼部分、複數個程式設計目的、複數個程式設計結構或其組合。在各種實施例中，作為非限制性實例，一或多個軟體模組包含網路應用程式、行動應用程式及獨立應用程式。在一些實施例中，軟體模組在一個電腦程式或應用程式中。在其他實施例中，軟體模組在超過一個電腦程式或應用程式中。在一些實施例中，在一台機器上代管軟體模組。在其他實施例中，在超過一台機器上代管軟體模組。在其他實施例中，在雲端計算平台上代管軟體模組。在一些實施例中，在一或多台機器上在一個位置代管軟體模組。在其他實施例中，在一或多台機器上在超過一個位置代管軟體模組。
以下非限制性實例用以進一步說明本發明。所列舉之實施例
實施例I-1. 一種設計針對目標蛋白質之免疫原多肽的方法，該方法包含： a) 獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；以及 c) 選擇包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原多肽，從而設計出針對該目標蛋白質的免疫原。
實施例I-2. 如實施例I-1之方法，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-3. 如實施例I-2之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-4. 如實施例I-3之方法，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-5. 如實施例I-4之方法，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-6. 如實施例I-5之方法，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-7. 如實施例I-2至I-6中任一者之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-8. 如實施例I-7之方法，其中該肽陣列包含一組多樣性肽。
實施例I-9. 如實施例I-7之方法，其中該肽陣列包含一組相關肽。
實施例I-10. 如實施例I-9之方法，其中該組相關肽75%相同。
實施例I-11. 如實施例I-1至I-10中任一者之方法，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-12. 如實施例I-1至I-11中任一者之方法，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
實施例I-13. 如實施例I-12之方法，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-14. 如實施例I-12之方法，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
實施例I-15. 如實施例I-14之方法，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
實施例I-16. 如實施例I-1至I-15中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-17. 如實施例I-1至I-16中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-18. 如實施例I-1至I-17中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-19. 如實施例I-18之方法，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-20. 如實施例I-18或I-19之方法，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-21. 如實施例I-1至I-20中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
實施例I-22. 如實施例I-1至I-21中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少75%一致性的胺基酸序列。
實施例I-23. 如實施例I-1至I-22中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-24. 如實施例I-1至I-23中任一者之方法，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-25. 如實施例I-24之方法，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-26. 如實施例I-25之方法，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-27. 如實施例I-24之方法，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-28. 如實施例I-1至I-27中任一者之方法，其中該目標蛋白質之該區域之該胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
實施例I-29. 如實施例I-28之方法，其中該第一域及該第二域以非天然次序以可操作方式連接。
實施例I-30. 一種包含目標蛋白質之不會與現有抗體結合的區域的免疫原，其包含： a) 獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；以及 c) 選擇至少一種免疫原，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的該區域之胺基酸序列。
實施例I-31. 如實施例I-30之免疫原，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-32. 如實施例I-31之免疫原，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-33. 如實施例I-32之免疫原，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-34. 如實施例I-30至I-33中任一者之免疫原，其中該免疫原包含至少一個具有為一或多種哺乳動物所共有的胺基酸序列的區域，該一或多種哺乳動物選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-35. 如實施例I-34之免疫原，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-36. 如實施例I-31至I-36中任一者之免疫原，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-37. 如實施例I-36之免疫原，其中該肽陣列包含一組多樣性肽。
實施例I-38. 如實施例I-36之免疫原，其中該肽陣列包含一組相關肽。
實施例I-39. 如實施例I-38之免疫原，其中該組相關肽75%相同。
實施例I-40. 如實施例I-30至I-39中任一者之免疫原，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-41. 如實施例I-30至I-40中任一者之免疫原，其進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 選擇天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等免疫原多肽胺基酸。
實施例I-42. 如實施例I-41之免疫原，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-43. 如實施例I-41之免疫原，其中從演算法預測天然摺疊的該目標蛋白質之該結構。
實施例I-44. 如實施例I-43之免疫原，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
實施例I-45. 如實施例I-30至I-44中任一者之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-46. 如實施例I-30至I-45中任一者之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-47. 如實施例I-30至I-46中任一者之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-48. 如實施例I-47之免疫原，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-49. 如實施例I-47或I-48之免疫原，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-50. 如實施例I-30至I-49中任一者之免疫原，其進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
實施例I-51. 如實施例I-30至I-50中任一者之免疫原，其中該免疫原包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少75%一致性的胺基酸序列。
實施例I-52. 如實施例I-30至I-51中任一者之免疫原，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-53. 如實施例I-52之免疫原，其中該至少兩個胺基酸序列不對應於天然蛋白質中之序列位置。
實施例I-54. 如實施例I-30至I-53中任一者之免疫原，其中使該免疫原突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-55. 如實施例I-54之免疫原，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-56. 如實施例I-54之免疫原，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-57. 如實施例I-54之免疫原，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-58. 如實施例I-30至I-57中任一者之方法，其中該目標蛋白質之該區域之該胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
實施例I-59. 如實施例I-58之方法，其中該第一域及該第二域以非天然次序以可操作方式連接。
實施例I-60. 一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，該方法包含： a) 獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質上不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的該區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及 e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體，從而產生該抗體。
實施例I-61. 如實施例I-60之方法，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-62. 如實施例I-61之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-63. 如實施例I-62之方法，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-64. 如實施例I-63之方法，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-65. 如實施例I-64之方法，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-66. 如實施例I-61至I-65中任一者之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-67. 如實施例I-60至I-66中任一者之方法，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-68. 如實施例I-60至I-67之方法，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
實施例I-69. 如實施例I-68之方法，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-70. 如實施例I-68之方法，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
實施例I-71. 如實施例I-60至I-70中任一者之方法，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
實施例I-72. 如實施例I-70之方法，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
實施例I-73. 如實施例I-70之方法，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
實施例I-74. 如實施例I-60至I-73中任一者之方法，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
實施例I-75. 如實施例I-74之方法，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
實施例I-76. 如實施例I-60至I-75中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。
實施例I-77. 如實施例I-76之方法，其包括使該抗體結合至聚焦陣列。
實施例I-78. 如實施例I-77之方法，其中該聚焦陣列包含具有與至少一部分該免疫原多肽至少100%相同之胺基酸序列的肽庫。
實施例I-79. 如實施例I-76至I-78中任一者之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
實施例I-80. 如實施例I-76至I-79中任一者之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該Ab之結合量測該抗體與肽陣列之結合。
實施例I-81. 如實施例I-76至I-80中任一者之方法，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
實施例I-82. 如實施例I-60至I-81中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。
實施例I-83. 如實施例I-82之方法，其中該抗體之該生物作用包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
實施例I-84. 如實施例I-60至I-83中任一者之方法，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
實施例I-85. 如實施例I-60至I-84中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-86. 如實施例I-60至I-85中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-87. 如實施例I-60至I-86中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-88. 如實施例I-87之方法，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-89. 如實施例I-87或I-88之方法，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)及GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-90. 如實施例I-60至I-89中任一者之方法，其進一步包含測定該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。
實施例I-91. 如實施例I-60至I-90中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-92. 如實施例I-60至I-91中任一者之方法，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-93. 如實施例I-92之方法，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-94. 如實施例I-93之方法，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-95. 如實施例I-94之方法，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-96. 如實施例I-60至I-95中任一者之方法，其中該目標蛋白質之該區域之該胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
實施例I-97. 如實施例I-96之方法，其中該第一域及該第二域以非天然次序以可操作方式連接。
實施例I-98. 一種抗體，其係藉由如實施例I-60至I-97中任一者之方法產生。
實施例I-99. 一種治療有需要之個體之方法，其包含： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的該區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫； e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體；以及 f) 向該個體投與該抗體，從而治療該有需要之個體。
實施例I-100. 如實施例I-99之方法，其中該方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-101. 如實施例I-100之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-102. 如實施例I-101之方法，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-103. 如實施例I-102之方法，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-104. 如實施例I-103之方法，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-105. 如實施例I-100至I-104中任一者之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-106. 如實施例I-99至I-105中任一者之方法，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-107. 如實施例I-99至I-106中任一者之方法，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
實施例I-108. 如實施例I-107之方法，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-109. 如實施例I-107之方法，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
實施例I-110. 如實施例I-109之方法，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
實施例I-111. 如實施例I-99至I-109中任一者之方法，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
實施例I-112. 如實施例I-111之方法，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
實施例I-113. 如實施例I-111之方法，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
實施例I-114. 如實施例I-99至I-113中任一者之方法，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
實施例I-115. 如實施例I-114之方法，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
實施例I-116. 如實施例I-99至I-115中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。
實施例I-117. 如實施例I-116之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
實施例I-118. 如實施例I-116之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
實施例I-119. 如實施例I-116至I-120中任一者之方法，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
實施例I-120. 如實施例I-99至I-119中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。
實施例I-121. 如實施例I-120之方法，其中該抗體之該生物作用包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
實施例I-122. 如實施例I-99至I-121中任一者之方法，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
實施例I-123. 如實施例I-99至I-122中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-124. 如實施例I-99至I-123中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-125. 如實施例I-99至I-124中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-126. 如實施例I-125之方法，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-127. 如實施例I-125或I-126之方法，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-128. 如實施例I-99至I-127中任一者之方法，其中該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
實施例I-129. 如實施例I-99至I-128中任一者之方法，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-130. 如實施例I-99至I-129中任一者之方法，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-131. 如實施例I-130之方法，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-132. 如實施例I-130之方法，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-133. 如實施例I-130之方法，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-134. 一種適用作藥劑的抗體，其中該抗體係藉由以下產生： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；
b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；
c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的該區域之胺基酸序列；
d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及
e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體。
實施例I-135. 如實施例I-134所使用之抗體，其中方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-136. 如實施例I-135所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-137. 如實施例I-136所使用之抗體，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-138. 如實施例I-137所使用之抗體，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-139. 如實施例I-138所使用之抗體，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-140. 如實施例I-135至I-139中任一者所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-141. 如實施例I-34至I-140中任一者所使用之抗體，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-142. 如實施例I-134至I-141中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及
(ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
實施例I-143. 如實施例I-142所使用之抗體，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-144. 如實施例I-142所使用之抗體，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
實施例I-145. 如實施例I-144所使用之抗體，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
實施例I-146. 如實施例I-134至I-144中任一者所使用之抗體，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
實施例I-147. 如實施例I-146所使用之抗體，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
實施例I-148. 如實施例I-146所使用之抗體，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
實施例I-149. 如實施例I-134至I-148中任一者所使用之抗體，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
實施例I-150. 如實施例I-149所使用之抗體，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
實施例I-151. 如實施例I-134至I-150中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。
實施例I-152. 如實施例I-151所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
實施例I-153. 如實施例I-151或I-152所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
實施例I-154. 如實施例I-151至I-153中任一者所使用之抗體，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
實施例I-155. 如實施例I-134至I-154中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。
實施例I-156. 如實施例I-155所使用之抗體，其中該抗體之該生物作用包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
實施例I-157. 如實施例I-134至I-156中任一者所使用之抗體，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
實施例I-158. 如實施例I-134至I-157中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-159. 如實施例I-134至I-158中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-160. 如實施例I-134至I-159中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-161. 如實施例I-160所使用之抗體，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-162. 如實施例I-160或I-161所使用之抗體，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-163. 如實施例I-134至I-162中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
實施例I-164. 如實施例I-134至I-163中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-165. 如實施例I-134至I-164中任一者所使用之抗體，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-166. 如實施例I-165所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-167. 如實施例I-166所使用之抗體，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-168. 如實施例I-165所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-169. 一種用於製造藥劑的抗體，其中該抗體係藉由以下產生： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列；
b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；
c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的該區域之胺基酸序列；
d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及
e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體。
實施例I-170. 如實施例I-169所使用之抗體，其中方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
實施例I-171. 如實施例I-170所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
實施例I-172. 如實施例I-171所使用之抗體，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
實施例I-173. 如實施例I-172所使用之抗體，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
實施例I-174. 如實施例I-173所使用之抗體，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
實施例I-175. 如實施例I-170至I-174中任一者所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域包含偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
實施例I-176. 如實施例I-175所使用之抗體，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
實施例I-177. 如實施例I-169所使用之抗體，其中方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及
(ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
實施例I-178. 如實施例I-177所使用之抗體，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
實施例I-179. 如實施例I-177所使用之抗體，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
實施例I-180. 如實施例I-179所使用之抗體，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
實施例I-181. 如實施例I-169至I-180中任一者所使用之抗體，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
實施例I-182. 如實施例I-181所使用之抗體，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
實施例I-183. 如實施例I-181所使用之抗體，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
實施例I-184. 如實施例I-169至I-184中任一者所使用之抗體，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
實施例I-185. 如實施例I-184所使用之抗體，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
實施例I-186. 如實施例I-169至I-185中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定該抗體之抗原決定基。
實施例I-187. 如實施例I-186所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
實施例I-188. 如實施例I-186所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
實施例I-189. 如實施例I-186至I-188中任一者所使用之抗體，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
實施例I-190. 如實施例I-169至I-189中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。
實施例I-191. 如實施例I-190所使用之抗體，其中該抗體之該生物作用包含以下中之至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
實施例I-192. 如實施例I-169至I-191中任一者所使用之抗體，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
實施例I-193. 如實施例I-169至I-192中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
實施例I-194. 如實施例I-169至I-193中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
實施例I-195. 如實施例I-169至I-194中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
實施例I-196. 如實施例I-195所使用之抗體，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
實施例I-197. 如實施例I-195或I-196所使用之抗體，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
實施例I-198. 如實施例I-169至I-197中任一者所使用之抗體，其中該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
實施例I-199. 如實施例I-169至I-198中任一者所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
實施例I-200. 如實施例I-169至I-199中任一者所使用之抗體，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中與正常組織周邊相比表現出不同的物理特徵。
實施例I-201. 如實施例I-200所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
實施例I-202. 如實施例I-201所使用之抗體，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
實施例I-203. 如實施例I-200所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
實施例I-204. 一種免疫原，其包含目標蛋白質之至少兩個域，該免疫原包含該目標蛋白質之第一域之多肽序列，其以非天然次序以可操作方式連接至該目標蛋白質之第二域之多肽序列。
實施例I-205. 如實施例I-204之免疫原，其中該目標蛋白質之該第一域藉由連接分子以可操作方式連接至該目標蛋白質之該第二域。
實施例I-206. 如實施例I-204或I-205之免疫原，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-207. 如實施例I-1至I-29中任一者之方法，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-208. 如實施例I-30至I-59中任一者之免疫原，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-209. 如實施例I-60至I-97中任一者之方法，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-210. 如實施例I-99至I-133中任一者之方法，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-211. 如實施例I-134至I-168中任一者所使用之抗體，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
實施例I-212. 如實施例I-169至I-203中任一者所使用之抗體，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。實例
以下實例出於說明本發明之各種實施例之目的給出且不意欲以任何方式限制本發明。該等實例連同本文中所描述之方法當前為較佳實施例之代表，為例示性的且不意欲作為對本發明範疇之限制。熟習此項技術者將想到涵蓋在本發明之精神範圍內、如由申請專利範圍之範疇所限定的實例變化及其他用途。實例 1 ：設計針對 PD-1 之 新穎免疫原
為了設計針對PD-1之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之PD-1序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析來測定與現有抗體納武單抗結合的PD-1區域。V13肽陣列更詳細地描述於以下各者中：2017年10月9日申請之美國臨時申請案第62/569,926號；及與此並行申請之名為「INTEGRATED PLATFORM FOR TARGET AND SPECIFICITY INFORMATION-DERIVED BINDING PARTNER SELECTION」的國際申請案，代理人案號RBYC-019/01WO 334002-2071，該等申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。V13庫為一個多樣化的組合庫，具有126,009個肽，該等肽之中值長度為9個殘基，範圍為5至13個胺基酸，且將該庫設計成包括16種胺基酸(排除甲硫胺酸，M；半胱胺酸，C；異白胺酸，I；及蘇胺酸，T)之所有可能的4-mer之99.9%及所有可能的5-mer之48.3%。該等肽係使用適用於第三丁氧羰基(BOC)保護基肽化學的標準半導體光微影工具，在200 mm氧化矽晶圓上合成。測定不會與納武單抗結合之蛋白質區域且獲得PD-1之三維結構以便確定此等區域之哪些區域係存在於摺疊的蛋白質之表面上。 圖 2 中顯示圖譜分析結果及三維結構分析結果。
根據此等資料，免疫原被設計成含有兩個存在於PD-1表面上之已知不會與納武單抗結合的殘基序列。第一序列LNWARMSPSNQTDK (SEQ ID NO: 1)對應於 圖 3 中所示序列之胺基酸65至78，藉由GSG連接子以相反的次序連接至第二序列RRNDSGAYLSGAISL (SEQ ID NO: 2) (胺基酸114至128)。維持各序列N端至C端之方向性，但是序列次序相對於其在天然PD-1蛋白質中之位置/次序顛倒，得到具有連接至第一序列之第二序列的PD-1免疫原。
圖 3 中顯示所得免疫原序列RRNDSGAYLSGAISLGSG LNWARMSPSNQTDK (SEQ ID NO: 3)及其在PD-1之3-D結構上的位置。使用不同參數設計各種其他例示性PD-1免疫原且序列顯示於 圖 4 中。圖4中所示之免疫原被設計成與 圖 1 之免疫原所給出的兩個經鑑定序列之次序相反。
位置68處之胺基酸：N (小鼠)及Y (人類及食蟹猴)經A取代以減小N及Y之側鏈大小。同樣地，在位置120處之胺基酸：I (小鼠)及T (人類及食蟹猴)經A取代。取代32個胺基酸中之2個得到與天然蛋白質序列中之每一者具有93.75%一致性(2/32aa)的免疫原。實例 2 ：使用新穎免疫原製備抗體
並行使用多種免疫方案以獲得結合新穎免疫原之單株抗體。此等方案概述於 圖 5 中。簡言之，用全長蛋白質或選定免疫原中之一者對小鼠或兔進行免疫。隨後用全長蛋白質或選定免疫原中之一者對小鼠或兔追加免疫。從經免疫之小鼠或兔分離B細胞且使細胞融合以得到融合瘤。使用ELISA來測試單株抗體與全長蛋白質或選定免疫原中之一者的結合。視需要對單株抗體進行進一步融合及改進。實例 3 ： 設計針對 CD-25 之 新穎免疫原 ： 說明性第一設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗(Baciliximab)結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。
圖 6 中顯示針對CD-25之說明性設計的圖譜分析結果及三維結構分析結果。 圖 6 上所展示的免疫原包含兩個組胺酸且其展示了可能具有pH依賴性構形改變的周圍殘基。 圖 6 亦顯示免疫原與IL2配體結合域之一部分重疊，該部分在後期開發中未被現有治療劑覆蓋。此外， 圖 6 上所展示的免疫原包含雙硫鍵以增強穩定性及構形保持。最後， 圖 6 上所展示的免疫原包含經設計以使與小鼠及食蟹猴之交叉反應性的可能性最小化的點突變。
CD-25免疫原可以包含序列GHCREGSGRIYHFVGGQGSGSGAYKEGTMLNGSGYMACTGNSSASSW (SEQ ID NO: 4)之全部或一部分，如 圖 6 上之三維模型中所展示。實例 4 ： 設計針對 CD-25 之 新穎免疫原 ： 說明性第二設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。
圖 7 中顯示說明性設計之圖譜分析結果及三維結構分析結果。圖7上所展示的免疫原覆蓋整個IL2介面且包含兩個組胺酸。CD-25免疫原可以包含序列CQCTSSGSGRIKSGSLYMLGSGTMLNCECKRGFRGSGNEATERIYHFVVGGSGELCDDDPGSGSGSVCKMTHGKTRW (SEQ ID NO: 5)之全部或一部分，如 圖 7 上之三維模型中所展示。實例 5 ： 設計針對 CD-25 之 新穎免疫原 ： 說明性第三設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。
圖 8 中顯示說明性設計之圖譜分析結果及三維結構分析結果。 圖 8 上所展示的免疫原將CD25分成兩個域，保留所有組胺酸。本文中所描述之CD-25免疫原可以包含序列YKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHF (SEQ ID NO: 6)之全部或一部分，如 圖 8 上之三維模型內以紅色展示。實例 6 ： 設計針對 CD-25 之 新穎免疫原 ： 說明性第四設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。
圖 8 中顯示說明性設計之圖譜分析結果及三維結構分析結果。 圖 8 上所展示的免疫原將CD25分成兩個域，保留所有組胺酸。本文中所描述之CD-25免疫原可以包含序列ELCDDDPPEIPHATFKAMAYFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICT (SEQ ID NO: 7)之全部或一部分，如 圖 8 上之三維模型內以白色及紫色所展示。實例 7 ： 設計針對 CD - 25 之 新穎免疫原 ： 說明性第五設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。本文中所描述之免疫原將CD25分成兩個域，使所有組胺酸突變為精胺酸以模擬低腫瘤pH。本文中所描述之CD-25免疫原可以包含序列YKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSR SSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGR CREPPPWENEATERIYR F (SEQ ID NO: 8)之全部或一部分。實例 8 ： 設計針對 CD - 25 之 新穎免疫原 ： 說明性第六設計
為了設計針對CD-25之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CD-25序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體達利珠單抗或巴利昔單抗結合的CD-25區域。測定不會與達利珠單抗及巴利昔單抗結合的蛋白質區域且獲得CD-25之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。測定所得免疫原序列及其在CD-25之3-D結構上之位置。本文中所描述之免疫原將CD25分成兩個域，使所有組胺酸突變為精胺酸以模擬低腫瘤pH。本文中所描述之CD-25免疫原可以包含序列ELCDDDPPEIPR ATFKAMAYFVVGQMVYYQCVQGYRALR RGPAESVCKMTRGKTRWTQPQLICT (SEQ ID NO: 9)之全部或一部分。實例 9 ： 設計針對 CD25 之 新穎免疫原 ： 說明性第七設計
根據如實例3至8中所揭示之方法，設計額外的針對CD-25之新穎免疫原。本文中所描述之免疫原，如 圖 9 中所見，跨CD25之胺基酸144至160，且包括序列144 ESVSKMTHGKTRWTQPQ160 (SEQ ID NO: 10)。實例 10 ： 設計針對 CD25 之 IL2 結合域的新穎免疫原 ： 說明性第八設計
根據如實例3至8中所揭示之方法，設計額外的針對CD25之IL2結合域的新穎免疫原。本文中所描述之免疫原，如 圖 10 中所見，將CD25之IL2結合域分成兩個各別域，且包括序列8 PEIPH12 -GP-134 GYRALHRGPAE144 -GP-159 PQLIST164 (SEQ ID NO: 11)。實例 11 ：設計針對 CXCR4 之 新穎免疫原
CXC趨化介素受體4 (CXCR4)在諸多癌症中過度表現，該等癌症包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)及三陰性乳癌(triple negative breast cancer，TNBC)。為了設計針對CXCR4之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之CXCR4序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後可以使用V13或V14或V15或V16肽陣列上之抗原決定基圖譜分析測定與現有抗體結合的CXCR4區域。V13、V14及V15肽陣列更詳細地描述於以下各者中：2017年10月9日申請之美國臨時申請案第62/569,926號；及與此並行申請之名為「INTEGRATED PLATFORM FOR TARGET AND SPECIFICITY INFORMATION-DERIVED BINDING PARTNER SELECTION」的國際申請案，代理人案號RBYC-019/01WO 334002-2071，該等申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。V13肽陣列為一個多樣化的組合庫，具有126,009個肽，該等肽之中值長度為9個殘基，範圍為5至13個胺基酸，且將該肽陣列設計成包括16種胺基酸(排除甲硫胺酸，M；半胱胺酸，C；異白胺酸，I；及蘇胺酸，T)之所有可能的4-mer之99.9%及所有可能的5-mer之48.3%。使用一系列24個重疊光罩將V14肽陣列製備為16,920個肽的庫，其產生具有0至17個胺基酸殘基的中值長度的合成肽。V15肽陣列包含3.3M肽，且設計成包括所有可能的4-mer至6-mer之100%。V16陣列為3.2M獨特肽之3.3M特徵陣列。V16陣列包含由20種天然存在之胺基酸中除半胱胺酸(C)及甲硫胺酸(M)以外的18種合成的肽庫。肽長度在5至16個胺基酸之範圍內，且肽具有8個胺基酸之中值長度。該陣列包含低偏好肽庫，其為獨特肽之高序列多樣性庫，旨在以18個胺基酸為基礎均勻地覆蓋序列空間；及旨在圖譜分析包括抗原決定基序列之特定序列的肽庫。
可以測定不會與CXCR4抗體結合之蛋白質區域且可以獲得CXCR4之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。基於此等資料，可以將免疫原設計成含有存在於CXCR4表面上之已知不會與CXCR4抗體結合的兩個殘基序列。可以使用不同參數設計各種其他例示性CXCR4免疫原。可採用以上所提及之肽陣列之環化版本來設計免疫原。實例 12 ：設計針對 MIF 之 新穎免疫原
巨噬細胞遷移抑制因子(MIF或MMIF)，亦稱為糖基化抑制因子(GIF)、L-多巴色素異構酶(L-dopachrome isomerase)或苯基丙酮酸互變異構酶(phenylpyruvate tautomerase)，係一種作為先天性免疫之重要調節劑的蛋白質。MIF可以充當CD74及/或CXCR4受體之配體。MIF參與催化對羥基苯基丙酮酸至D-多巴色素之互變異構化，催化域可能位於蛋白質之N端附近。MIF有助於自體免疫病症(藉由例如阻斷類固醇之作用)及癌症(藉由例如具有增殖、抗細胞凋亡、遷移及/或其他腫瘤基質活性)。MIF-1與MIF-2 (亦稱為DDT)共用大約30%的同源性，MIF-2與MIF-1具有類似功能。
為了設計針對MIF之新穎免疫原，使人類、小鼠及食蟹猴之MIF序列比對並鑑定具有高相似度的區域。隨後使用V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析來測定與現有抗體結合的MIF區域。可以測定不會與MIF抗體結合之蛋白質區域且可以獲得MIF之三維結構以便確定此等區域之哪些區域存在於摺疊的蛋白質之表面上。基於此等資料，可以將免疫原設計成含有存在於MIF表面上之已知不會與MIF抗體結合的兩個殘基序列。可以使用不同參數設計各種其他例示性MIF免疫原。實例 13 ： 設計雜合的 MIF - 1 / MIF - 2 ( MIF - HT ) 免疫原
根據如實例12中所揭示之方法，設計額外的針對雜合的MIF-1/MIF-2 (DDT) (雜合MIF-HT)免疫原之新穎免疫原。抗體屬性可以包括例如抑制MIF-1及MIF-2 (DDT)兩者之活性、阻斷或抑制催化活性、阻斷或抑制CD74結合及/或阻斷或抑制CXCR4結合。在一些情況下，該設計可以包括以離胺酸32 (K32)為中心或大約在其周圍的單株抗體，其可能潛在地阻斷所有活性。
本文中所描述之免疫原，如 圖 12 中所見，為MIF-1與MIF-2 (DDT)序列之間的雜合(MIF-HT)，在該免疫原中，保留共同的殘基且使不同的殘基突變為偏好較小的殘基(例如，使帶電荷胺基酸殘基突變為丙胺酸)。另外，在MIF-1之位置111處之天冬醯胺(N111)，其對應於在 圖 12 中之比對中之位置112，已突變為半胱胺酸以迫使蛋白質表現為其生理學上相關的三聚形式。這應該允許鑑定在活體內阻斷MIF-1及MIF-2與其受體之結合的抗體。如 圖 12 中所示之雜合的免疫原MIF-HT之例示性序列包括以下序列：MPMFIVNTN VPRAA VPAG FLA ELTAA LAS ATGKPANA IAVHVVPA QLMAFGGSSEP CALCSLHSIGL IG GAQ -NRS YSA LLCG LLAAA LA IAAD RVYINYYA MASA NVGAAC STFA (SEQ ID NO: 12)，其中加粗的殘基經表面暴露，且並非三聚體介面之一部分；在 圖 12 中，紅色殘基為MIF-1與MIF-2 (DDT)之間的相同殘基，且藍色指示該等殘基在MIF-1與MIF-2 (DDT)之間不同；黃色突出顯示的殘基突變為半胱胺酸以鎖定三聚體突變殘基；此外，序列上方之深藍色區域指示CD74結合區；圍繞序列之綠色區域指示CXCR4結合區。 圖 13 描繪小鼠、人類、食蟹猴及兔之MIF-1 (A )及MIF-2 (DDT；B )的比對。 圖 14 描繪MIF-1 (A )及MIF-2 (B )之例示性模型；MIF-1及MIF-2共有的殘基之位置，其對應於 圖 12 之比對中以紅色顯示之殘基。
為了產生抗體，用雜合的MIF-1/MIF-2序列MIF-HT對小鼠進行免疫，且如上文所詳述般篩選並分離抗體。替代性免疫策略可以包括先用MIF-1免疫，隨後用針對MIF-2之免疫原追加免疫，如 圖 12 中所見。重複該程序且針對與MIF-1及MIF-2 (DDT)免疫原之交叉反應性篩選抗體。
在一些情況下，免疫原可以在大腸桿菌(E. coli)中表現，其中免疫原較佳在C端標記，儘管免疫原表現可以不使用標記。N端標記將有可能擾亂免疫原結構，且應該避免。在一些情況下，可採用噬菌體呈現模擬抗原決定基MSTPLGQYTGTK (SEQ ID NO: 13)，其包括離胺酸32 (K32)殘基。實例 14 ：使用經工程改造之免疫原製備並評估抗體
根據 圖 16 中所描繪之時程，包括追加免疫，對各別五組小鼠進行免疫。第1組用全長PD-1蛋白質免疫。第2組及第3組用肽免疫原1免疫，其在 圖 4 中為免疫原1，且具有序列RRNDSGAYLSGAISLHPDLMLNWARMSPSNQTDK (SEQ ID NO: 14)。第2組亦接受追加免疫，包含與免疫原1組合的全長PD-1蛋白質，如概述圖表上所示。第4組及第5組用肽免疫原2免疫，其在 圖 4 中為免疫原4，且具有序列RRNDSGAYLSGAISLAFA LNWARMSPSNQTDK (SEQ ID NO: 15)。第2組亦接受追加免疫，包含與免疫原2組合的全長PD-1蛋白質，如概述圖表上所示。在指定日期，從該等群組抽取血液並評估血液。從經免疫小鼠分離B細胞且使該等B細胞融合以製造融合瘤。使用ELISA分析來測試單株抗體與全長蛋白質或免疫原的結合。視需要對單株抗體進行進一步B細胞融合及改進。
圖 17 為描繪ELISA資料之圖，其偵測來自第1組、第2組及第4組之選定小鼠之血清以及非免疫小鼠血清與肽免疫原1之結合。如此圖中可見，來自不免疫的或用全長PD-1免疫的小鼠之血清不與肽免疫原1結合。 圖 18 為描繪ELISA資料之圖，其偵測來自上述小鼠之血清與全長人類PD-1之結合。如此圖中所見，來自所測試的所有經免疫小鼠之血清均與PD-1結合。
亦使用流動式細胞測量術來評估小鼠血清與表現人類PD-1之中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞的結合。 圖 19 中顯示流動式細胞測量術結果之圖，其評估來自第3組及第5組中之選定小鼠之血清及來自不免疫的小鼠之血清。所評估的所有來自經免疫小鼠的血清均展現與表現PD-1之CHO細胞的結合，而來自非免疫小鼠之血清不展現結合。 圖 20 中呈現額外的流動式細胞測量術資料，其評估各組小鼠與表現PD-1之CHO細胞(左起第二圖)及不表現PD-1之對照細胞(最右側圖)的抗體(血清)結合。具有實線輪廓的直方圖為1/2稀釋下的融合瘤庫，而沒有實線輪廓的直方圖指示僅細胞+二級。
亦評估來自第1組、第2組及第4組之血清(各群組中之所有小鼠)的跨物種反應性。 圖 21A 為如藉由ELISA評估，來自第1組、第2組及第4組之血清與人類PD-1之結合的圖。x軸為樣品之稀釋因數。第1組為最上面的線。在1000倍稀釋之後，第2組及第4組係重疊的，其中第2組為第4組上方顏色較深的線。 圖 21B 為如藉由ELISA所評估，上述群組與小鼠PD-1之結合的圖。第1組為最上面的線。第2組及第4組係重疊的，其中在10倍與100倍稀釋之間，第2組為在底部的顏色較深的線。 圖 21C 為如藉由ELISA所評估，上述群組與食蟹猴PD-1之結合的圖。第1組為最上面的線。第2組及第4組係重疊的，其中在10倍與1000倍稀釋之間，第2組為在底部的較暗的線。圖 21D 中顯示相對於與人類PD-1之結合，與小鼠對比食蟹猴PD-1結合之血清抗體之分數的概述。高百分比指示較大數目的抗體具有跨三種不同物種的反應性。
從第2組至第5組經免疫小鼠分離B細胞且使其融合以製造融合瘤，且藉由ELISA評估融合瘤上清液與人類、食蟹猴及小鼠PD-1之結合。 圖 22A 至圖 22D 中分別顯示第2組至第5組之結果。關於各圖中之各x軸條目，人類PD-1結合為左側長條，食蟹猴PD-1結合為中間的長條，且小鼠PD-1結合為右側長條。
產生單株抗體(除了C3-H1，其為多株抗體)。藉由ELISA評估此等抗體與人類、小鼠及食蟹猴PD-1在兩種不同濃度(10 nm及0.1 nm)下之結合。結果顯示於 圖 23 中。關於各x軸條目，人類10 nM結合為左側長條，人類0.1 nm為中間的長條，且食蟹猴10 nM結合為右側長條。最上面的線為食蟹猴0.1 nM結合，小鼠10 nM結合為顏色最深的線，且小鼠0.1 nM結合為最下面的線。
亦藉由報導分子分析評估單株抗體(及多株C3-H1)對PD-1/PD-L1相互作用之阻斷。Jurkat T細胞株經工程改造以穩定地表現人類PD-1及螢光素酶報導分子，其係藉由啟動子區域中之IL-2、NFAT或NF-kB反應元件觸發。Jurkat T細胞與穩定地表現PD-L1之細胞株的相互作用抑制可活化啟動子/螢光素酶構築體的細胞內機制，從而阻止螢光素酶表現。能夠充分阻斷PD-1 (在Jurkat細胞上)或PD-L1 (在CHO細胞上)以防止相互作用的抗體分子將允許Jurkat T細胞產生螢光素酶。此分析係用於評估各群組之抗體，且結果顯示於 圖 24 中之條形圖中。如此圖中所見，從用經工程改造之免疫原免疫的群組獲得的抗體能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用。 圖 25 為證明單株(M)及多株(H)融合瘤之上清液對PD-1/PD-L1結合之阻斷的圖。
使用V15肽陣列評估 圖 23 及 圖 24 中由箭頭指示之三種抗體以產生抗原之功能抗原決定基圖譜分析圖。抗體C3H1、C4M3及C2M1之此等圖譜分析圖顯示於 圖 26A 至圖 26C 中。用於開發抗原決定基圖譜分析之方法更詳細地描述於美國臨時申請案第62/569,945號中，其以全文引用的方式併入本文中。對該等結構作熱圖以指出抗原決定基信賴度，其為(正確的肽陣列結合命中比對)/(隨機比對)。信賴度量表為紅色=1，灰色=0，且藍色位於中間。
用評估來自不同抽血日(各群組在各各別日期之平均值)之群組血清的資料進行斯皮爾曼等級相關。相關性顯示於 圖 27A 至圖 27C 中。 圖 28 為概述各群組中所產生之目標結合命中之數目的表格。使用經工程改造之免疫原(第2組至第5組)比傳統的用全長PD-1免疫(第1組)產生顯著更多的目標結合命中。
使用五個不同組在第35天抽血得到之血清產生PD-1之抗原決定基圖譜分析圖。 圖 29A 至圖 29E 中顯示此等圖譜分析圖，其中深色結構為PD-1，帶狀物為PD-L1，且網狀物為經工程改造之免疫原(在右側結構中)。使用V14肽陣列產生此等圖譜分析圖。在此等圖譜分析圖中，紅色的信賴度最高，藍色最低，且白色/粉色居中。紅色、粉色及紫色區域為引發免疫反應之抗原決定基。此等圖譜分析圖證明，本文中所描述之方法導致可有效地引發免疫反應，但可避免由免疫顯性抗原決定基引起之抗原沉默(antigenic sink)的免疫原的發展。
雖然本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將明白，此等實施例僅作為實例而提供。熟習此項技術者現將想到不背離本發明的許多變化、改變及取代。應理解，可採用本文中所描述之實施例的各種替代方案。以下申請專利範圍意欲限定本發明之範疇，且由其涵蓋此申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
藉由參考以下實施方式及附圖來獲得對本發明之特徵及優點的理解，實施方式闡述利用本發明原理之說明性實施例，在附圖中：
圖 1 顯示小鼠(SEQ ID NO: 24)、人類(SEQ ID NO: 22)及食蟹猴(SEQ ID NO: 23)之PD-1序列的比對。在第二及第三小鼠/人類/食蟹猴清單的第三列中，較暗的區域為與PD-L1相互作用的蛋白質殘基。在相同清單的第五列中，較暗區域為人類、食蟹猴及小鼠中之PD-1之保守殘基。較亮的突出顯示區域(第一清單之第三列、第三清單之第三列)為Opdivo® PD-1治療性抗體的抗原決定基。
圖 2 顯示納武單抗(Nivolumab) (SEQ ID NO: 25-33)在V13肽陣列上之抗原決定基圖譜分析(epitope mapping)。
圖 3 顯示PD-1免疫原序列(SEQ ID NO: 3、25及26)及PD-1三維結構上之殘基位置。
圖 4 顯示PD-1之額外的例示性免疫原(SEQ ID NO: 3及34-36)。
圖 5 顯示使用新穎免疫原產生抗體的例示性免疫方案。
圖 6 顯示CD25 (SEQ ID NO: 37)的例示性免疫原序列，其包含兩個組胺酸、二硫鍵及經設計以使與小鼠及猴抗體之交叉反應性的可能性最小化的點突變。
圖 7 顯示例示性免疫原序列CQCTSSGSGRIKSGSLYMLGSGTMLNCECKRGFRGSGNEATERIYHFVVGGSGELCDDDPGSGSGSVCKMTHGKTRW (SEQ ID NO: 5)，覆蓋整個IL2介面。
圖 8 顯示例示性CD-25免疫原序列之3D結構模型。
圖 9 顯示CD-25免疫原序列之額外的例示性模型。在此實施例中，靶向CD-25 (SEQ ID NO: 10)之胺基酸144至160。
圖 10 顯示IL2結合域(SEQ ID NO: 11)之例示性實施例。
圖 11 說明對肽陣列應用無競爭抗原決定基分組(epitope binning)分析，以根據其共同的結合特徵(SEQ ID NO: 38-44)對抗Her2抗體進行分類。肽陣列之使用使得能夠藉由應用本文中所揭示之方法及裝置來鑑定高解析度免疫原圖譜分析及胺基酸結合貢獻。這包括：1)提供目標蛋白質之抗原決定基覆蓋率的定量度量；2)為「組(bin)」之各分類提供推定的抗原決定基鑑定；3)指示該目標之未被選定純系覆蓋的區域，其允許用特定目標區域免疫以改善抗原決定基覆蓋率；及4)提供位置層面的胺基酸結合貢獻，這對於篩選及鑑定純系之泛物種選擇性很重要。
圖 12 顯示比對的MIF-1 (SEQ ID NO: 45)及MIF-2 (DDT) (SEQ ID NO: 46)序列，及MIF-1與MIF-2之MIF-HT (雜合) (SEQ ID NO: 12)序列。加粗的殘基表面暴露，且並非三聚體介面之一部分。MIF-1與MIF-2 (DDT)之間以實線框框起來的殘基相同，且灰色殘基表示MIF-1與MIF-2 (DDT)之間的不同殘基。突出顯示且以虛線框框起來的殘基突變為半胱胺酸以鎖定三聚體突變殘基。序列上方在黑色框中之單個白色星形表示CD74結合區；灰色框中之兩個白色星形表示CXCR4結合區。朝向圖頂部的大星形區域表示開發單株抗體所感興趣的殘基。
圖 13A 及 圖 13B 顯示MIF-1 (圖 13A )與MIF2 (DDT；圖 13B )的種間比對。該比對包括MIF-1之小鼠(SEQ ID NO: 47)、人類(SEQ ID NO: 45)、食蟹猴(SEQ ID NO: 48)及兔(SEQ ID NO: 49)序列及MIF-2 (DDT)之小鼠(SEQ ID NO: 50)、人類(SEQ ID NO: 46)、食蟹猴(SEQ ID NO: 52)及兔(SEQ ID NO: 51)序列。
圖 14A 及 圖 14B 顯示MIF-1 (圖 14A )及MIF-2 (圖 14B )之例示性模型；其中共同的殘基的位置用紅色表示。
圖 15 描繪PD-1之結構，指示與已知抗體納武單抗相互作用的表面殘基(綠色)及與派姆單抗(Pembrolizumab)相互作用的表面殘基 (藍色)及用於工程改造不同免疫原的表面殘基(紅色)。一些表面殘基與納武單抗及派姆單抗兩者相互作用(橙色)。實例1之經工程改造的免疫原係以已知不會與納武單抗結合的區域為基礎而設計的。
圖 16 為概述如實例14中所述的五組不同小鼠之免疫時程的圖表。
圖 17 為描繪如實例14中所述，偵測來自第1組、第2組及第4組中之選定小鼠的血清以及非免疫小鼠血清與肽免疫原1之結合的ELISA資料的圖。
圖 18 為描繪如實例14中所述，偵測來自相同小鼠之血清與全長人類PD-1之結合的ELISA資料的圖。
圖 19 為流動式細胞測量術結果之圖，如實例14中所述，評估表現PD-1之CHO細胞與來自第3組及第5組中之選定小鼠之血清及來自不進行免疫之小鼠之血清的結合。
圖 20 為流動式細胞測量術資料，評估各組小鼠與表現PD-1之CHO細胞(左起第二圖)及不表現PD-1之對照細胞(最右側圖)的抗體(血清)結合。具有實線輪廓的直方圖為1/2稀釋下的融合瘤庫，而沒有實線輪廓的直方圖指示僅細胞+二級。
圖 21A 為如藉由ELISA評估，來自第1組、第2組及第4組之血清與人類PD-1之結合的圖。x軸為樣品之稀釋因數。第1組為最上面的線。在1000倍稀釋之後，第2組及第4組係重疊的，其中第2組為第4組上方顏色較深的線。
圖 21B 為如藉由ELISA所評估，上述群組與小鼠PD-1之結合的圖。第1組為最上面的線。第2組及第4組係重疊的，其中在10倍與100倍稀釋之間，第2組為在底部的顏色較深的線。
圖 21C 為如藉由ELISA所評估，上述群組與食蟹猴PD-1之結合的圖。第1組為最上面的線。第2組及第4組係重疊的，其中在100倍與1000倍稀釋之間，第2組為在底部的顏色較深的線。
圖 21D 為在實例14中所描述的經免疫小鼠中，相對於與人類PD-1之結合，血清抗體與小鼠對比食蟹猴PD-1之結合分數的概述。
圖 22A 為ELISA結果之條形圖，評估來自第2組融合瘤之上清液與人類、小鼠及食蟹猴PD-1之結合。關於各圖中之各x軸條目，人類PD-1結合為左側長條，食蟹猴PD-1結合為中間的長條，且小鼠PD-1結合為右側長條。
圖 22B 為ELISA結果之條形圖，評估來自第3組融合瘤之上清液與人類、小鼠及食蟹猴PD-1之結合。關於各圖中之各x軸條目，人類PD-1結合為左側長條，食蟹猴PD-1結合為中間的長條，且小鼠PD-1結合為右側長條。
圖 22C 為ELISA結果之條形圖，評估來自第4組融合瘤之上清液與人類、小鼠及食蟹猴PD-1之結合。關於各圖中之各x軸條目，人類PD-1結合為左側長條，食蟹猴PD-1結合為中間的長條，且小鼠PD-1結合為右側長條。
圖 22D 為ELISA結果之條形圖，評估來自第5組融合瘤之上清液與人類、小鼠及食蟹猴PD-1之結合。關於各圖中之各x軸條目，人類PD-1結合為左側長條，食蟹猴PD-1結合為中間的長條，且小鼠PD-1結合為右側長條。
圖 23 為如藉由ELISA所評估，在兩種不同濃度(10 nm及0.1 nm)下，源自不同小鼠群組之單株抗體(及多株C3-H1)與人類、小鼠及食蟹猴PD-1之結合的條形圖。關於各x軸條目，人類10 nM結合為左側長條，人類0.1 nm為中間的長條，且食蟹猴10 nM結合為右側長條。最上面的線為食蟹猴0.1 nM結合，小鼠10 nM結合為顏色最深的線，且小鼠0.1 nM結合為最下面的線。
圖 24 為報導分子(reporter)分析之條形圖，根據實例14，評估源自不同小鼠群組之單株抗體(及多株C3-H1)對PD-1/PD-L1相互作用的阻斷，該等小鼠用經過工程改造之免疫原免疫。
圖 25 為根據實例14，證明源自用經過工程改造之免疫原免疫的小鼠的單株(M)及多株(H)融合瘤的上清液對PD-1/PD-L1結合之阻斷的圖。
圖 26A 至圖 26C 為 圖 23 及 圖 24 中由箭頭指出之三種不同抗體的功能性抗原決定基圖譜分析圖。 圖 26A 為抗體C3H1之圖譜分析圖； 圖 26B 為C4M3之圖譜分析圖；且 圖 26C 為C2M1之圖譜分析圖。對該等結構作熱圖以指出抗原決定基信賴度，其為(正確的肽陣列結合命中比對)/(隨機比對)。信賴度量表為紅色=1，灰色=0，且藍色位於中間。
圖 27A 至圖 27C 為斯皮爾曼等級相關(Spearman's rank correlations)，如實例14中所述，其使用評估來自不同抽血日的群組血清的資料(各群組各各別日期之平均值)來進行。
圖 28 為概述根據實例14免疫之各小鼠群組中所產生的目標結合擊中之數目的表格。
圖 29A 至圖 29E 為PD-1之抗原決定基圖譜分析圖，其係使用來自根據實例14免疫之五組不同小鼠的第35天抽血血清而產生。深色結構為PD-1，帶狀物為PD-L1，且網狀物為經工程改造之免疫原(在右側結構中)。在此等圖譜分析圖中，紅色的信賴度最高，藍色最低，且白色/粉色居中。 圖 29A 為第1組。 圖 29B 為第2組。 圖 29C 為第3組。 圖 29D 為第4組。 圖 29E 為第5組。
圖 30 為人類(SEQ ID NO: 22)/食蟹猴(SEQ ID NO: 23) PD-1及人類(SEQ ID NO: 22)/小鼠(SEQ ID NO: 24) PD-1之序列比對。

Claims (212)

  1. 一種設計針對目標蛋白質之免疫原多肽的方法，該方法包含： a) 獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不與該等現有抗體結合的區域；以及 c) 選擇包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合之區域的胺基酸序列的免疫原多肽，從而設計出針對該目標蛋白質的免疫原。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  3. 如請求項2之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  4. 如請求項3之方法，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  5. 如請求項4之方法，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  6. 如請求項5之方法，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  7. 如請求項2至6中任一項之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  8. 如請求項7之方法，其中該肽陣列包含一組多樣性肽。
  9. 如請求項7之方法，其中該肽陣列包含一組相關肽。
  10. 如請求項9之方法，其中該組相關肽為75%相同。
  11. 如請求項1至6中任一項之方法，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列之取得，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  12. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇該免疫原多肽。
  13. 如請求項12之方法，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  14. 如請求項12之方法，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時之預測結構。
  15. 如請求項14之方法，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
  16. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  17. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  18. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  19. 如請求項18之方法，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  20. 如請求項18之方法，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  21. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該方法進一步包含測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
  22. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少75%一致性的胺基酸序列。
  23. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  24. 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  25. 如請求項24之方法，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中，與該正常組織周邊相比，呈不同的質子化狀態。
  26. 如請求項25之方法，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  27. 如請求項24之方法，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態、或其組合。
  28. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該目標蛋白質之該區域的該胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
  29. 如請求項28之方法，其中該第一域及該第二域係依非天然次序，以可操作方式連接。
  30. 一種包含目標蛋白質之不會與現有抗體結合的區域的免疫原，其包含： a) 獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域；以及 c) 選擇至少一種免疫原，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列。
  31. 如請求項30之免疫原，其進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  32. 如請求項31之免疫原，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  33. 如請求項32之免疫原，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  34. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原包含至少一個具有一或多種哺乳動物所共有胺基酸序列的區域，該一或多種哺乳動物選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  35. 如請求項34之免疫原，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  36. 如請求項31至33中任一項之免疫原，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  37. 如請求項36之免疫原，其中該肽陣列包含一組多樣性肽。
  38. 如請求項36之免疫原，其中該肽陣列包含一組相關肽。
  39. 如請求項38之免疫原，其中該組相關肽為75%相同。
  40. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  41. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 選擇天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的免疫原多肽胺基酸。
  42. 如請求項41之免疫原，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  43. 如請求項41之免疫原，其中從演算法預測天然摺疊的該目標蛋白質之結構。
  44. 如請求項43之免疫原，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
  45. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  46. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  47. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  48. 如請求項47之免疫原，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  49. 如請求項47之免疫原，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  50. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其進一步包括測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
  51. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原多肽包含與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質具有至少75%一致性的胺基酸序列。
  52. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  53. 如請求項52之免疫原，其中該至少兩個胺基酸序列不對應於天然蛋白質中之序列位置。
  54. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中使該免疫原突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  55. 如請求項54之免疫原，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中，與該正常組織周邊相比，呈不同的質子化狀態。
  56. 如請求項54之免疫原，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  57. 如請求項54之免疫原，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態、或其組合。
  58. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該目標蛋白質之該區域之胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
  59. 如請求項58之免疫原，其中該第一域及該第二域係依非天然次序以可操作方式連接。
  60. 一種產生針對目標蛋白質之不會與現有抗體結合之區域的抗體的方法，該方法包含： a) 獲得該目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質上不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及 e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體，從而產生該抗體。
  61. 如請求項60之方法，其進一步包括圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  62. 如請求項61之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  63. 如請求項62之方法，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  64. 如請求項63之方法，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  65. 如請求項64之方法，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  66. 如請求項61至65中任一項之方法，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  67. 如請求項60至65中任一項之方法，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  68. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸中選擇該免疫原多肽。
  69. 如請求項68之方法，其中(i)包含獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  70. 如請求項68之方法，其中(i)包含從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
  71. 如請求項60至65中任一項之方法，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫包含投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
  72. 如請求項70之方法，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
  73. 如請求項70之方法，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
  74. 如請求項60至65中任一項之方法，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
  75. 如請求項74之方法，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合，以產生表現該抗體之融合瘤。
  76. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該方法進一步包括測定該抗體之抗原決定基。
  77. 如請求項76之方法，其包括使該抗體結合至聚焦陣列。
  78. 如請求項77之方法，其中該聚焦陣列包含具有與至少一部分該免疫原多肽至少100%相同之胺基酸序列的肽庫。
  79. 如請求項76之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
  80. 如請求項76之方法，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該Ab之結合，量測該抗體與肽陣列之結合。
  81. 如請求項76之方法，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
  82. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該方法進一步包含測定該抗體之生物作用。
  83. 如請求項82之方法，其中該抗體之該生物作用包含以下其中至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
  84. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
  85. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  86. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  87. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  88. 如請求項87之方法，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  89. 如請求項87之方法，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)及GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  90. 如請求項60至65中任一項之方法，其進一步包含測定該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。
  91. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  92. 如請求項60至65中任一項之方法，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  93. 如請求項92之方法，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中，與該正常組織周邊相比，呈不同的質子化狀態。
  94. 如請求項93之方法，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  95. 如請求項94之方法，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態、或其組合。
  96. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該目標蛋白質之該區域的胺基酸序列至少包含第一域及第二域。
  97. 如請求項96之方法，其中該第一域及該第二域係依非天然次序，以可操作方式連接。
  98. 一種抗體，其係藉由如請求項60至97中任一項之方法產生。
  99. 一種抗體在製造治療有需要之個體之藥劑方面的用途，其中該抗體係藉由以下產生： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫； e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體。
  100. 如請求項99之用途，其中該方法進一步包括圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  101. 如請求項100之用途，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  102. 如請求項101之用途，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  103. 如請求項102之用途，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  104. 如請求項103之用途，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  105. 如請求項100至104中任一項之用途，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  106. 如請求項99至104中任一項之用途，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  107. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
  108. 如請求項107之用途，其中(i)包括獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  109. 如請求項107之用途，其中(i)包括從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
  110. 如請求項109之用途，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
  111. 如請求項99至104中任一項之用途，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫，包括投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之組合物。
  112. 如請求項111之用途，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
  113. 如請求項111之用途，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
  114. 如請求項99至104中任一項之用途，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
  115. 如請求項114之用途，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
  116. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該方法進一步包括測定該抗體之抗原決定基。
  117. 如請求項116之用途，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
  118. 如請求項116之用途，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
  119. 如請求項116之用途，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
  120. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該方法進一步包括測定該抗體之生物作用。
  121. 如請求項120之用途，其中該抗體之該生物作用包含以下其中至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
  122. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
  123. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  124. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  125. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  126. 如請求項125之用途，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  127. 如請求項125之用途，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  128. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該方法進一步包括測定不會與該等現有抗體結合的區域之跨物種同源性。
  129. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  130. 如請求項99至104中任一項之用途，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  131. 如請求項130之用途，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中，與該正常組織周邊相比，呈不同的質子化狀態。
  132. 如請求項131之用途，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  133. 如請求項130之用途，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
  134. 一種適用作藥劑的抗體，其中該抗體係藉由以下產生： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及 e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體。
  135. 如請求項134所使用之抗體，其中方法進一步包含圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  136. 如請求項135所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  137. 如請求項136所使用之抗體，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  138. 如請求項137所使用之抗體，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  139. 如請求項138所使用之抗體，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  140. 如請求項135至139中任一項所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  141. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  142. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之該表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
  143. 如請求項142所使用之抗體，其中(i)包括獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  144. 如請求項142所使用之抗體，其中(i)包括從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
  145. 如請求項144所使用之抗體，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
  146. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫，包括投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
  147. 如請求項146所使用之抗體，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
  148. 如請求項146所使用之抗體，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
  149. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
  150. 如請求項149所使用之抗體，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
  151. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定該抗體之抗原決定基。
  152. 如請求項151所使用之抗體，其中測定該抗體之抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
  153. 如請求項151所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
  154. 如請求項151所使用之抗體，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
  155. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定該抗體之生物作用。
  156. 如請求項155所使用之抗體，其中該抗體之該生物作用包含以下其中至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
  157. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
  158. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  159. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  160. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  161. 如請求項160所使用之抗體，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  162. 如請求項160所使用之抗體，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  163. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
  164. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  165. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  166. 如請求項165所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中與該正常組織周邊相比不同的質子化狀態。
  167. 如請求項166所使用之抗體，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  168. 如請求項165所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
  169. 一種用於製造藥劑的抗體，其中該抗體係藉由以下產生： a) 獲得目標蛋白質上與現有抗體結合的多肽序列； b) 鑑定該目標蛋白質之至少一個不會與該等現有抗體結合的區域； c) 製備至少一種免疫原多肽，其包含該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的區域之胺基酸序列； d) 用該免疫原多肽使哺乳動物免疫；以及 e) 從該哺乳動物獲得會與步驟b)中所鑑定區域特異性結合的抗體。
  170. 如請求項169所使用之抗體，其中方法進一步包括圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的區域。
  171. 如請求項170之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域，包括偵測該等現有抗體與肽庫之結合。
  172. 如請求項171所使用之抗體，其中該肽庫包含具有與來自一或多種哺乳動物之野生型蛋白質相同或類似的胺基酸序列的肽。
  173. 如請求項172所使用之抗體，其中該一或多種哺乳動物係選自人類、小鼠、倉鼠及猴。
  174. 如請求項173所使用之抗體，其中該猴係選自食蟹猴、獼猴及恆河獼猴。
  175. 如請求項170至174中任一項所使用之抗體，其中圖譜分析該目標蛋白質之與該等現有抗體結合的該區域，包括偵測該等現有抗體與肽陣列之結合。
  176. 如請求項175所使用之抗體，其中獲得該目標蛋白質上與該等現有抗體結合的多肽序列，包括從已知與該等現有抗體結合的肽序列之資料庫中鑑定與該等現有抗體結合的肽序列。
  177. 如請求項169所使用之抗體，其中方法進一步包含： (i) 鑑定天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的胺基酸；及 (ii) 從天然摺疊時存在於該目標蛋白質之表面上的該等胺基酸中選擇該免疫原多肽。
  178. 如請求項177所使用之抗體，其中(i)包括獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的結構。
  179. 如請求項177所使用之抗體，其中(i)包括從演算法獲得該目標蛋白質在天然摺疊時的預測結構。
  180. 如請求項179所使用之抗體，其中該演算法預測該目標蛋白質之摺疊結構。
  181. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中用該免疫原多肽使該哺乳動物免疫，包括投與至少一個劑量的包含該免疫原多肽及佐劑之疫苗組合物。
  182. 如請求項181所使用之抗體，其中至少一個劑量包含該目標蛋白質。
  183. 如請求項181所使用之抗體，其中至少一個劑量不包含該目標蛋白質。
  184. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中從該哺乳動物產生該抗體，包括單離出表現該抗體之B細胞。
  185. 如請求項184所使用之抗體，其進一步包括使該B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生表現該抗體之融合瘤。
  186. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定該抗體之抗原決定基。
  187. 如請求項186所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽庫之結合。
  188. 如請求項186所使用之抗體，其中測定該抗體之該抗原決定基，包括量測該抗體與肽陣列之結合。
  189. 如請求項186所使用之抗體，其中捨棄與兩種或更多種不同的抗原決定基結合的抗體。
  190. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定該抗體之生物作用。
  191. 如請求項190所使用之抗體，其中該抗體之該生物作用包含以下其中至少一者：抑制該目標蛋白質之活性、增加該目標蛋白質之活性、抑制該目標蛋白質與結合配偶體之結合、穩定該目標蛋白質與結合配偶體之結合、延長該目標蛋白質之半衰期及縮短該目標蛋白質之半衰期。
  192. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該目標蛋白質為PD-1、PD-L1、CD25、IL2、MIF或CXCR4中之至少一者。
  193. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少2個胺基酸。
  194. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少30個胺基酸。
  195. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含至少一個連接子。
  196. 如請求項195所使用之抗體，其中該連接子包含具有一或多個甘胺酸殘基、一或多個絲胺酸殘基或一或多個脯胺酸殘基的胺基酸序列。
  197. 如請求項195所使用之抗體，其中該連接子具有選自GSG、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GSG)n (SEQ ID NO: 17)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 19)、(PGSG)n (SEQ ID NO: 20)、PGSGSG (SEQ ID NO: 21)中之至少一者的胺基酸序列，其中n為1與10之間的整數。
  198. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該方法進一步包括測定不會與該等現有抗體結合的該區域之跨物種同源性。
  199. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該免疫原多肽包含來自該目標蛋白質之不會與該等現有抗體結合的兩個不同區域的至少兩個胺基酸序列。
  200. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中使該免疫原多肽突變，使得該免疫原在腫瘤微環境中，與正常組織周邊相比，表現出不同的物理特徵。
  201. 如請求項200所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括在腫瘤微環境中，與該正常組織周邊相比，呈不同的質子化狀態。
  202. 如請求項201所使用之抗體，其中該免疫原多肽中之組胺酸經精胺酸或離胺酸取代。
  203. 如請求項200所使用之抗體，其中該不同的物理特徵包括質子化狀態、電荷、結構構形、疏水性、親水性、反應性含氧物種狀態或其組合。
  204. 一種免疫原，其包含目標蛋白質之至少兩個域，該免疫原包含該目標蛋白質之第一域之多肽序列，其依非天然次序以可操作方式連接至該目標蛋白質之第二域之多肽序列。
  205. 如請求項204之免疫原，其中該目標蛋白質之該第一域藉由連接分子以可操作方式連接至該目標蛋白質之該第二域。
  206. 如請求項204或205之免疫原，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  207. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  208. 如請求項30至33中任一項之免疫原，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  209. 如請求項60至65中任一項之方法，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  210. 如請求項99至104中任一項之用途，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  211. 如請求項134至139中任一項所使用之抗體，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
  212. 如請求項169至174中任一項所使用之抗體，其中該目標蛋白質為治療性目標蛋白質。
TW107135633A 2017-10-09 2018-10-09 用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體 TW201923091A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762569945P 2017-10-09 2017-10-09
US62/569,945 2017-10-09
US201762587368P 2017-11-16 2017-11-16
US62/587,368 2017-11-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201923091A true TW201923091A (zh) 2019-06-16

Family

ID=66101038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107135633A TW201923091A (zh) 2017-10-09 2018-10-09 用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW201923091A (zh)
WO (1) WO2019074934A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11409999B2 (en) 2020-04-21 2022-08-09 Industrial Technology Research Institute Method of labelling features for image recognition and apparatus thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3892294A1 (en) * 2013-08-28 2021-10-13 AbbVie Stemcentrx LLC Site-specific antibody conjugation methods and compositions
CA2931685C (en) * 2013-12-02 2021-09-07 Anthony B. Schryvers Immunogenic compositions and vaccines derived from bacterial surface receptor proteins
AU2017240164A1 (en) * 2016-04-01 2018-11-15 HealthTell, Inc. Array-based peptide libraries for therapeutic antibody characterization

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11409999B2 (en) 2020-04-21 2022-08-09 Industrial Technology Research Institute Method of labelling features for image recognition and apparatus thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019074934A1 (en) 2019-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10475525B2 (en) Methods and systems for predicting misfolded protein epitopes
KR101535678B1 (ko) 표적 약물 개발의 방법 및 조성물
CN102143978B (zh) 抗p2x7肽和表位
US20240077492A1 (en) Array-based peptide libraries for therapeutic antibody characterization
US10894828B2 (en) Immune-stimulating monoclonal antibodies against human interleukin-2
Nevoltris et al. Conformational nanobodies reveal tethered epidermal growth factor receptor involved in EGFR/ErbB2 predimers
CN110809580A (zh) 用于靶向癌症中包含非典型hla-i和新抗原的复合体的方法和组合物
Fan et al. Neutralizing monoclonal antibodies elicited by mosaic RBD nanoparticles bind conserved sarbecovirus epitopes
Miguel et al. Similarities and differences in interactions of thyroid stimulating and blocking autoantibodies with the TSH receptor
JP2019510506A (ja) 抗ポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２モノクローナル抗体とその生成方法及び使用
TW201923091A (zh) 用於定向免疫反應的免疫原及由此產生之抗體
Abendstein et al. Complement is activated by elevated IgG3 hexameric platforms and deposits C4b onto distinct antibody domains
Fromme et al. A novel retro-inverso gonadotropin-releasing hormone (GnRH) immunogen elicits antibodies that neutralize the activity of native GnRH
Yang et al. Facile repurposing of peptide–MHC-restricted antibodies for cancer immunotherapy
Ko et al. Structure of the malaria vaccine candidate Pfs48/45 and its recognition by transmission blocking antibodies
US20210166780A1 (en) Multi-domain proteins with increased native state colloidal stability
TW201922771A (zh) 用於源自目標及特異性訊息之結合配偶體選擇的整合平台
Sastry et al. Diverse murine vaccinations reveal distinct antibody classes to target fusion peptide and variation in peptide length to improve HIV neutralization
Perosa et al. Two structurally different rituximab-specific CD20 mimotope peptides reveal that rituximab recognizes two different CD20-associated epitopes
JP2019502978A (ja) Ｄ−タンパク質リガンドの構造ベース設計
US20190062948A1 (en) In silico process for selecting protein formulation excipients
US11884741B2 (en) Method for improving thermal stability of antibody and method for producing modified antibody
TWI839556B (zh) 抗ｂｃｍａ抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
Ma Understanding Peptide-Specific Recognition Between Immune Receptors and Peptide-Major Histocompatibility Complexes
Rampuria et al. Molecular insights into recognition of GUCY2C by T-cell engaging bispecific antibody anti-GUCY2CxCD3