TW201923090A - 用於超低體積液體生物檢體之裝置、系統及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於自超低量生物樣本中之無細胞胎兒核酸獲得遺傳資訊的裝置、系統、套組及方法。由於獲得超低量樣本極為便利，故可以在需要位置處至少部分採用裝置、系統、套組及方法。

Description

用於超低體積液體生物檢體之裝置、系統及方法
基因測試係用於獲得關於個體之DNA及/或該DNA之表現之資訊的一種手段。基因測試正不斷地開發出來，以獲得關於個體之生物資訊。此生物資訊具有許多用途，包括確定個體之健康狀況、診斷患有感染或疾病之個體、確定適合個體之治療、破解犯罪及鑑定親權。當前，基因測試主要在診所及實驗室中由經過訓練之人員，利用昂貴的大型設備進行，該設備需要使用技術培訓及專門知識。其自患者獲得生物樣本之時間至向患者提供基因測試之結果，通常要花費數天至數週。
無細胞核酸來源於各種組織類型且經釋放至個體之循環中。循環中之無細胞核酸池通常表示促成組織類型之基因構成。在健康個體之情況下，該池可以為極均質之池，無較大變化。然而，當組織含有明顯地不同之基因組時，可以觀察到異質性較高之無細胞核酸池。具有基因組明顯地不同之組織之個體的常見實例包括(但不限於)：(a)癌症患者，其中腫瘤DNA含有突變位點；(b)移植患者，其中移植之器官將供體DNA釋放至無細胞DNA池中；以及(c)妊娠期婦女，其中胎盤貢獻主要代表胎兒DNA之無細胞DNA。在一些情況下，基因組可能因表觀遺傳修飾而明顯地不同。經顯示，來自不同組織、器官及細胞類型之DNA具有不同表觀遺傳模式。因此，可偵測到組織、器官及細胞，包括(但不限於)腦、肝、脂肪、胰臟、內皮及免疫細胞中之無細胞核酸。此外，當個體之組織或細胞類型受疾病或感染影響時，在該個體中該組織或細胞類型循環中可能存在較多無細胞DNA。
本文揭示用於分析生物樣本之成分(例如核酸、蛋白質)的裝置、系統、套組及方法，該生物樣本包括來自動物(人類或非人類)之樣本。一般而言，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法能夠自超低體積樣本，藉由利用無細胞DNA斷裂來提供遺傳資訊。為簡潔起見，此可以稱為「超低體積液體生物檢體」。在本發明之前，由於咸信超低體積將無法自可偵測或提供資訊之所關注特定組織(例如腦、肝、胎盤、腫瘤)提供足量無細胞核酸，故預期無法自超低體積樣本獲得可靠且有用之遺傳資訊。另外，歸於來自其他無細胞核酸之大量背景信號，特別是來自血球之背景信號，以及個體間該背景之變化，看來不太可能在測試個體與對照個體之間進行再現且可靠之比較。
與細胞DNA相比，無細胞DNA係斷裂的。為了分析超低體積樣本中之無細胞DNA，本文所揭示之方法、裝置、系統及套組利用來自重複區域(例如具有共同序列之區域)及/或多個區域之無細胞DNA片段作為統計獨立之標記物。本文所揭示之方法、裝置、系統及套組由於來自重複區域(例如基因組含有相同或類似序列之多個複本之區域)或總體許多區域之無細胞DNA片段以比未斷裂DNA序列高的有效濃度存在於樣本中而成為可能。因此，含有足以獲得有用遺傳資訊之多種分析物的樣本體積低於先前所認為之體積。有利地，來自重複區域之片段可以用單一對引子擴增或用單一探針偵測。替代地或另外地，藉由例如標誌不共有類似序列之多個偵測區域並用通用引子使其擴增或用多個引子對(例如以多路複用形式)擴增，可以偵測到小體積之該等區域。
由於該等裝置、系統、套組及方法能夠自超低體積生物樣本獲得有用遺傳資訊，故其提供以下優勢：(1)最小創傷性；(2)利用極少或無需技術訓練(例如不需要複雜設備)即可在家中應用；以及(3)在病狀(例如妊娠、感染)之早期階段提供資訊。此等優勢減少或打消對實驗室或技術員之需求，由此改善患者可及性、順應性及監測。此最終使醫療系統以較低成本引起健康狀況之改善。
有關無細胞循環核酸之分析面臨多個技術難題。舉例而言，利用全血中之一些成分(例如血紅蛋白)可以抑制血液中循環核酸之擴增。本發明方法、系統及裝置解決此技術難題之方式之一係以避免全血中成分污染之方式，自毛細血管血液獲得血漿(含有無細胞核酸)。
有關小樣本體積中無細胞循環核酸之分析特別具挑戰性。儘管過往曾嘗試實現此目標，且出於本文所描述之原因，但本領域對於可以自在需要位置處收集的小樣本體積(例如由手指刺破得到的毛細血管血液)中之無細胞DNA獲得有用且準確之遺傳資訊仍存有疑問。本文所揭示之方法、系統及裝置不僅解決此等技術難題，而且可以在需要位置處，即實際上不可能給與目前先進技術之某物處使用。
舉例而言，過去分析五毫升或超過五毫升血液中之循環無細胞腫瘤DNA的嘗試僅在樣本具有相對較高腫瘤負荷(例如15-20%)及使改變更易於偵測的15%或更高基因組改變分率(FGA)時提供資訊。然而，在大部分患者中，腫瘤負荷要低得多。在進一步嘗試中，較小量生物樣本因白血球污染而不能成功分析。因此，過去的嘗試不包括很大一部分患者群體。另外，自個體獲得五毫升或超過五毫升血液需要實驗室技術員，由此使基因分析之成本增加且對患者帶來不便(例如由基因分析之時間、不適及費用引起之不便)。本發明方法、裝置及系統經組態以藉由分析可以在需要位置處收集的遠低於五毫升之量的生物樣本，諸如毛細血管血液(例如由刺破手指得到之毛細血管血液)而提供有用且準確之遺傳資訊。
即使過去曾嘗試分析較小樣本體積，但其得到假結果。舉例而言，過去的一些分析較小量樣本之嘗試將來自細胞株之基因組DNA稀釋並剪切基因組DNA以產生並偵測無細胞(cfDNA)替代物。針對細胞株DNA/經剪切DNA之縮減取樣或稀釋以及計算機模擬方法產生假結果，因為該等結果不能反映在較低輸入分子數量下個體樣本中之大小及長度分佈及分組資訊。在另一實例中，過去分析較小量生物樣本之嘗試產生假結果，因為其依賴於偵測預定突變，該等突變亦可被稱作「已知事件」。本發明呈現以自非替代性cfDNA提供準確且非預定之遺傳資訊的方式自少量毛細血管血液(例如手指刺破)獲得血漿(含有無細胞核酸)之方法、系統及裝置。
本文所描述之過去嘗試須在初始偵測步驟中使用低通/低覆蓋率全基因組測序之組合，且之後更詳細地執行另外的分析以準確地執行基因分析。低通/低覆蓋率全基因組序列對於以高靈敏度偵測未知事件係不利的且並非最佳的，且可能會需要更詳細的跟蹤分析。另外，使用多種分析法提供基因分析較為昂貴、效率低下且在護理點處並非可替代的解決方案。相比之下，本發明方法、裝置及系統藉由使用即使在小樣本中亦可偵測的總體以高濃度存在之多個無細胞DNA片段，解決了自超低樣本體積實現準確基因分析之問題。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法概述如下。
在一些態樣中，本文揭示方法，該等方法包含自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液包含無細胞核酸；對該等無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。本文進一步揭示方法，該等方法包含自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液包含無細胞核酸；視情況使該等無細胞核酸擴增；標誌該等無細胞核酸之至少一部分以產生經標誌無細胞核酸之集合庫；視情況使該等經標誌無細胞核酸擴增；對該等經標誌無細胞核酸之至少一部分進行測序；以及偵測該等經標誌無細胞核酸之至少一部分中至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。方法可以包含製造具有至少0.5效率之集合庫。方法可以包含在擁擠劑(crowding agent)存在下，使該等無細胞核酸或經標誌無細胞核酸擴增。方法可以包含修復該等無細胞核酸之末端。在一些態樣中，方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本包含一起構成總無細胞核酸的目標無細胞核酸及非目標無細胞核酸，且其中該等目標無細胞核酸佔總無細胞核酸之低於5%；對該等目標無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。生物樣本可以包含毛細血管血液。該生物樣本可以基本上由毛細血管血液組成。獲得該生物樣本可以包含獲得毛細血管血液。獲得該生物樣本可以基本上由獲得毛細血管血液組成。獲得該生物樣本可不包含獲得靜脈血。獲得該生物樣本可不包含執行靜脈切開術。獲得該生物樣本可以包含獲得不超過1毫升血液。獲得該生物樣本可以包含獲得不超過100微升血液。獲得該生物樣本可以包含獲得不超過40微升血液。方法可以包含以至少98%準確性偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。方法可以包含全基因組擴增。方法可不包含全基因組擴增。在一些情況下，該等目標無細胞核酸係來自腫瘤之無細胞核酸。在一些情況下，該等目標無細胞核酸係來自胎兒之無細胞核酸。在一些情況下，該等目標無細胞核酸係來自移植之組織或器官的無細胞核酸。
本文揭示方法，該等方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子；對該等無細胞核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。在一些情況下，該生物樣本係體積小於約500 µl之生物流體。在一些情況下，該生物樣本係體積為約1 µL至約100 µl之生物流體。在一些情況下，該生物樣本係體積為約5 µL至約80 µl之生物流體。在一些情況下，該生物樣本具有約5 µL至約60 µl之體積。方法可以包含在測序之前，使該等無細胞核酸分子擴增。方法可以包含在測序之前且在擴增之後，標誌該等無細胞核酸分子。方法可以包含在測序之前，標誌該等無細胞核酸分子。方法可以包含在標誌無細胞核酸分子之後，使該等無細胞核酸分子擴增。方法可以包含在標誌無細胞核酸分子之前，使該等無細胞核酸分子擴增。方法可以包含擴增，該擴增包含使該等無細胞核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。擴增可以包含等溫擴增。方法可以包含偵測對應於至少一個目標染色體的測序讀段之代表性過度。方法可以包含偵測對應於至少一個目標染色體的測序讀段之代表性不足。方法可以包含將對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之數量與對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之參考數量相比較。方法可以包含量測對應於該至少一個染色體區的至少1000個測序讀段。方法可以包含量測對應於至少一個非目標染色體區的至少1000個測序讀段。一般而言，該生物樣本係生物流體。該生物樣本可以包含血液、血漿、血清、尿液、間質液、陰道細胞、陰道液、口腔細胞或唾液。該生物樣本可以基本上由血液、血漿、血清、尿液、間質液、陰道液或唾液組成。在一些情況下，該生物樣本係血清。在一些情況下，生物樣本係血漿。方法可進一步包含自血液樣本分離血漿或血清。分離可以包含過濾血液樣本以自該血液樣本移除細胞、細胞片段、微小泡囊或其組合以產生血漿樣本。該生物樣本可以為具有約5 µl至約1 ml體積之血液樣本。該生物樣本可以為具有約5 µl至約150 µl體積之血液樣本。獲得該血液樣本可以包含刺破手指。獲得該血液樣本可進一步包含自刺破之手指擠取或擠出血液。在一些情況下，該方法不包含自刺破之手指擠取或擠出血液。在一些情況下，獲得該血液樣本不包含靜脈切開術。生物樣本可以含有約104 至約109 個無細胞核酸分子。生物樣本可以含有約104 至約108 個無細胞核酸分子。生物樣本可以含有約104 至約107 個無細胞核酸分子。生物樣本可以含有低於300 pg無細胞核酸分子。生物樣本可以含有低於3 ng無細胞核酸分子。方法可以包含以大於98%準確性偵測代表性正常、代表性過度或代表性不足。方法可以包含以大於99%準確性偵測代表性正常、代表性過度或代表性不足。在一些情況下，該個體係懷孕個體且該等無細胞核酸分子包含無細胞胎兒核酸分子。方法可以包含將對應於該至少一個染色體區的測序讀段之數量與對應於該至少一個染色體的測序讀段之參考數量相比較。在一些情況下，該參考數量係基於來自懷有整倍體胎兒之至少一個整倍體懷孕個體的至少一個樣本。在一些情況下，該參考數量係基於來自具有非整倍體胎兒之至少一個整倍體懷孕個體的至少一個樣本。在一些情況下，該至少一個樣本具有與該生物樣本相同之樣本類型及相同之樣本體積。在一些情況下，該生物樣本包含約106 至約1012 個總無細胞核酸分子，其中該等總無細胞核酸分子基本上由無細胞胎兒核酸分子及母體無細胞核酸分子組成。方法可以包含當對應於該至少一個染色體區之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率時，偵測到存在具有該至少一個染色體區之胎兒非整倍體。方法可以包含當對應於該至少一個染色體區之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率與來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率相同時，偵測到不存在具有該至少一個染色體區之胎兒非整倍體。在一些情況下，該至少一個染色體區係位於染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y中之至少一個上。在一些情況下，該至少一個非目標染色體區係除染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y外之染色體中的至少一個。在一些情況下，懷孕個體懷孕少至5週。在一些情況下，懷孕個體係整倍體。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約108 個無細胞胎兒核酸。方法可以包含對至少2000個無細胞胎兒核酸進行測序。方法可以包含量測對應於該至少一個染色體區的至少1000個測序讀段。在一些情況下，該至少一個染色體區之代表性係相對於懷有對照胎兒之至少一個對照懷孕個體中之對照代表性。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒不具有非整倍體。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒不具有基因異常。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒具有對應於該染色體區之非整倍體。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒具有對應於該目標染色體區之基因異常。在一些情況下，該等無細胞核酸包含來自組織中之腫瘤的核酸。方法可以包含將對應於該至少一個染色體區的測序讀段之數量與對應於該至少一個染色體的測序讀段之參考數量相比較。在一些情況下，該參考數量係基於來自在該組織中無該腫瘤之個體的至少一個樣本。在一些情況下，該參考數量係基於來自在該組織中具有該腫瘤之個體的至少一個樣本。在一些情況下，該等無細胞核酸包含來自已移植至個體體內之器官或組織的核酸。在一些情況下，該等無細胞核酸對該器官或該組織具特異性。在一些情況下，測序包含全基因組測序。在一些情況下，測序包含隨機大規模平行測序。在一些情況下，測序包含靶向測序。在一些情況下，測序包含奈米孔測序。
本文進一步揭示方法，該等方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約1010 個無細胞核酸分子；分析在該等無細胞核酸分子之至少一部分之至少一個染色體區上的表觀遺傳修飾；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。在一些情況下，該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子。本文亦揭示方法，該等方法包含自個體獲得毛細血管血液；分析該等無細胞核酸分子之至少一部分之至少一個染色體區上的表觀遺傳修飾；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。方法可以包含獲得不超過200 µl毛細血管血液。方法可以包含獲得不超過100 µl毛細血管血液。
本文揭示系統，該等系統包含經組態用於收集個體之流體樣本的樣本收集器；經組態用於自該流體樣本分離樣本成分之樣本處理器；經組態用於偵測該流體樣本或該樣本成分中之核酸的核酸偵測器；以及核酸資訊輸出裝置。本文所揭示之系統亦可呈現為套組形式。在一些情況下，該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。在一些情況下，該穿皮穿刺裝置包含針、刺血針、微針、真空及微針陣列中之至少一種。在一些情況下，該樣本成分選自細胞、碳水化合物、磷脂、蛋白質、核酸及微小泡囊。在一些情況下，該樣本成分係血球。在一些情況下，該樣本成分不包含無細胞核酸。在一些情況下，該樣本成分包含無細胞核酸。在一些情況下，該樣本成分係血漿或血清。樣本純化器可以經組態用於自低於1毫升血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於250 µl血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於150 µl血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於100 µl血液中分離出血漿。核酸偵測器可以包含核酸測序儀。系統可以經組態用於對該流體樣本中之所關注核酸標記，且核酸偵測器包含計數系統，該計數系統對標記計數以偵測樣本中所關注核酸之代表性。系統可以包含標記，其中該標記包含與所關注核酸雜交之寡核苷酸。該寡核苷酸可以對所關注染色體區具特異性。該所關注染色體區可以位於選自染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X及染色體Y之染色體上。該所關注染色體區可以包含或能夠包含指示疾病或病狀之序列。該所關注染色體區可以包含或能夠包含至少一個指示疾病或病狀之表觀遺傳修飾。該病狀可以為基因異常。該病狀可以為癌症。該病狀可以為移植之組織或器官。系統可以包含選自引子、聚合酶及其組合之至少一種核酸擴增試劑。該至少一種核酸擴增試劑可以包含至少一種等溫擴增試劑。該至少一種等溫擴增試劑可以包含重組酶聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、鏈置換聚合酶或其組合。系統可以包含至少一種核酸擴增試劑及至少一種擁擠劑。系統包含用於由該流體樣本製造無細胞核酸集合庫之至少一個第一標記，及至少一種擴增試劑。系統可以經組態以用該至少一種擴增試劑擴增該等無細胞核酸以產生至少一個擴增子及使該至少一個擴增子與至少該第一標記接觸以產生該集合庫。系統可以經組態以使該至少一個擴增子與第二標記接觸，其中該第二標記係可偵測的。系統可以經組態以產生該集合庫及用該至少一種擴增試劑使該集合庫之至少一個成員擴增。該核酸序列輸出裝置可選自無線通信裝置、有線通信裝置、電纜連接埠及電子顯示器。在一些情況下，該系統之所有組件均存在於單一位置中。在一些情況下，該系統之所有組件均容納於單一裝置中。在一些情況下，該樣本收集器係位於第一位置處且該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在第二位置。在一些情況下，該樣本收集器與該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在相同位置。在一些情況下，樣本純化器包含過濾器。在一些情況下，樣本純化器包含用於將生物流體推動或拉動穿過該過濾器的浸潤材料或毛細管裝置。在一些情況下，過濾器之孔徑為約0.05微米至約2微米。在一些情況下，樣本純化器包含結合生物流體樣本中之核酸、蛋白質、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。在一些情況下，該結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、肽、小分子或其組合。在一些情況下，該結合部分能夠結合細胞外囊泡，其中該細胞外囊泡係自胎兒細胞或雌性個體之胎盤細胞釋放。在一些情況下，將該結合部分附接至固體載體，其中在該結合部分與生物樣本接觸之後，該固體載體可以與生物樣本之其餘部分分開或該生物樣本可以與固體載體分開。系統可以包含用於運輸或儲存該流體樣本之至少一部分的運輸或儲存隔室。在一些情況下，該運輸或儲存隔室包含吸收墊、流體容器、樣本防腐劑或其組合。在一些情況下，該運輸或儲存隔室含有使流體樣本之細胞穩定以便運輸或儲存之試劑或材料。系統可以包含容器、小袋、線及電纜中之至少一個，用於加熱或冷卻該裝置或其組件。系統可以包含至少一種緩衝液，用於對無細胞核酸進行修復、純化、擴增及測序中之至少一種。
本文揭示裝置，該等裝置包含經組態用於收集個體之流體樣本的樣本收集器；經組態用於自該流體樣本分離樣本成分之樣本處理器；經組態用於偵測該流體樣本或該樣本成分中之核酸的核酸偵測器；以及核酸資訊輸出裝置。在一些情況下，該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。在一些情況下，該穿皮穿刺裝置包含針、刺血針、微針、真空及微針陣列中之至少一種。在一些情況下，該樣本成分選自細胞、碳水化合物、磷脂、蛋白質、核酸及微小泡囊。在一些情況下，該樣本成分係血球。在一些情況下，該樣本成分不包含無細胞核酸。在一些情況下，該樣本成分包含無細胞核酸。在一些情況下，該樣本成分係血漿或血清。樣本純化器可以經組態用於自低於1毫升血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於250 µl血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於150 µl血液中分離出血漿。樣本純化器可以經組態用於自低於100 µl血液中分離出血漿。核酸偵測器可以包含核酸測序儀。裝置可以經組態用於對該流體樣本中之所關注核酸標記，且核酸偵測器包含計數系統，該計數系統對標記計數以偵測樣本中所關注核酸之代表性。裝置可以包含標記，其中該標記包含與所關注核酸雜交之寡核苷酸。該寡核苷酸可以對所關注染色體區具特異性。該所關注染色體區可以位於選自染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X及染色體Y之染色體上。該所關注染色體區可以包含或能夠包含指示疾病或病狀之序列。該所關注染色體區可以包含或能夠包含至少一個指示疾病或病狀之表觀遺傳修飾。該病狀可以為基因異常。該病狀可以為癌症。該病狀可以為移植之組織或器官。裝置可以包含選自引子、聚合酶及其組合之至少一種核酸擴增試劑。該至少一種核酸擴增試劑可以包含至少一種等溫擴增試劑。該至少一種等溫擴增試劑可以包含重組酶聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、鏈置換聚合酶或其組合。裝置可以包含至少一種核酸擴增試劑及至少一種擁擠劑。裝置可以包含用於由該流體樣本製造無細胞核酸集合庫之至少一個第一標記，及至少一種擴增試劑。裝置可以經組態以用該至少一種擴增試劑擴增該等無細胞核酸以產生至少一個擴增子及使該至少一個擴增子與至少該第一標記接觸以產生該集合庫。裝置可以經組態以使該至少一個擴增子與第二標記接觸，其中該第二標記係可偵測的。裝置可以經組態以產生該集合庫及用該至少一種擴增試劑使該集合庫之至少一個成員擴增。該核酸序列輸出裝置可選自無線通信裝置、有線通信裝置、電纜連接埠及電子顯示器。在一些情況下，該裝置之所有成分均存在於單一位置中。在一些情況下，該裝置之所有成分均容納於單一裝置中。在一些情況下，該樣本收集器係位於第一位置處且該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在第二位置。在一些情況下，該樣本收集器與該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在相同位置。在一些情況下，樣本純化器包含過濾器。在一些情況下，樣本純化器包含用於將生物流體推動或拉動穿過該過濾器的浸潤材料或毛細管裝置。在一些情況下，過濾器之孔徑為約0.05微米至約2微米。在一些情況下，樣本純化器包含結合生物流體樣本中之核酸、蛋白質、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。在一些情況下，該結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、肽、小分子或其組合。在一些情況下，該結合部分能夠結合細胞外囊泡，其中該細胞外囊泡係自胎兒細胞或雌性個體之胎盤細胞釋放。在一些情況下，將該結合部分附接至固體載體，其中在該結合部分與生物樣本接觸之後，該固體載體可以與生物樣本之其餘部分分開或該生物樣本可以與固體載體分開。裝置可以包含用於運輸或儲存該流體樣本之至少一部分的運輸或儲存隔室。在一些情況下，該運輸或儲存隔室包含吸收墊、流體容器、樣本防腐劑或其組合。在一些情況下，該運輸或儲存隔室含有使流體樣本之細胞穩定以便運輸或儲存之試劑或材料。裝置可以包含容器、小袋、線及電纜中之至少一個，用於加熱或冷卻該裝置或其組件。裝置可以包含至少一種緩衝液，用於對無細胞核酸進行修復、純化、擴增及測序中之至少一種。
本文進一步揭示系統用於偵測該個體體內腫瘤之存在的用途。本文揭示系統用於偵測該個體體內胎兒之非整倍體的用途。本文進一步揭示系統用於偵測該個體體內移植之器官之狀態的用途。本文揭示裝置用於偵測該個體體內腫瘤之存在的用途。本文進一步揭示裝置用於偵測該個體體內胎兒之非整倍體的用途。本文揭示裝置用於偵測該個體體內移植之器官之狀態的用途。
在一些態樣中，本文揭示方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；對該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。在一些情況下，該生物樣本具有低於約500 µl之體積。在一些情況下，該生物樣本具有約1 µl至約100 µl之體積。在一些情況下，該生物樣本具有約5 µl至約80 µl之體積。在一些情況下，該生物樣本具有約5 µl至約60 µl之體積。在一些情況下，方法包含在測序之前，使該等無細胞胎兒核酸分子擴增。在一些情況下，方法包含在測序之前且在擴增之後，標誌該等無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，方法包含在測序之前，標誌該等無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，方法包含在標誌該等無細胞胎兒核酸分子之後，使該等無細胞胎兒核酸分子擴增。在一些情況下，方法包含偵測對應於至少一個目標染色體的測序讀段之代表性過度。在一些情況下，方法包含偵測對應於至少一個目標染色體的測序讀段之代表性不足。在一些情況下，方法包含將對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之數量與對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之參考數量相比較。在一些情況下，該參考數量係基於來自懷有整倍體胎兒之至少一個整倍體懷孕個體的至少一個樣本。在一些情況下，該參考數量係基於來自具有非整倍體胎兒之至少一個整倍體懷孕個體的至少一個樣本。在一些情況下，該至少一個樣本具有與該生物樣本相同之樣本類型及相同之樣本體積。在一些情況下，方法包含量測對應於至少一個染色體區的至少1000個測序讀段。在一些情況下，方法包含量測對應於至少一個非目標染色體區的至少1000個測序讀段。在一些情況下，方法包含當對應於該至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率時，偵測到存在具有該至少一個目標染色體區之胎兒非整倍體。在一些情況下，方法包含當對應於該至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率與來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率相同時，偵測到不存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該生物樣本係生物流體。在一些情況下，該生物樣本包含血液、血漿、血清、尿液、間質液、陰道細胞、陰道液、口腔細胞或唾液。在一些情況下，該生物樣本係血清或血漿。在一些情況下，方法包含自血液樣本分離血漿或血清。在一些情況下，分離包含過濾該血液樣本以自該血液樣本移除細胞、細胞片段、微小泡囊或其組合，由此製造該血漿樣本。在一些情況下，方法包含自懷孕個體獲得血液樣本，該血液樣本具有約5 µl至約1 ml體積。在一些情況下，方法包含自懷孕個體獲得血液樣本，該血液樣本具有約5 µl至約150 µl體積。在一些情況下，獲得該血液樣本包含使該個體與穿皮穿刺裝置接觸。在一些情況下，獲得該血液樣本包含刺破手指。在一些情況下，方法包含自刺破之手指擠取血液。在一些情況下，獲得該血液樣本不包含靜脈切開術。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約108 個無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約107 個無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，該生物樣本包含約106 至約1012 個總無細胞核酸分子，其中該等總無細胞核酸分子基本上由無細胞胎兒核酸分子及母體無細胞核酸分子組成。在一些情況下，該生物樣本含有低於3 ng總無細胞核酸分子。在一些情況下，該生物樣本含有低於300 pg無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，懷孕個體懷孕少至5週。在一些情況下，擴增包含使該等無細胞胎兒核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。在一些情況下，擴增包含等溫擴增。在一些情況下，擴增在室溫下發生。在一些情況下，以大於98%準確性偵測狀態。在一些情況下，以大於99%準確性偵測狀態。在一些情況下，該至少一個染色體區係位於染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y中之至少一個上。在一些情況下，該至少一個非目標染色體區係除染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y外之染色體中的至少一個。在一些情況下，懷孕個體係整倍體。在一些情況下，測序包含全基因組測序。在一些情況下，測序包含隨機大規模平行測序。在一些情況下，測序包含靶向測序。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，該生物樣本含有約104 至約108 個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含對至少2000個無細胞胎兒核酸進行測序。在一些情況下，方法包含量測對應於至少一個目標染色體的至少1000個測序讀段。在一些情況下，該染色體區之代表性係相對於懷有對照胎兒之至少一個對照懷孕個體中之對照代表性。在一些情況下，該對照懷孕個體及對照胎兒中之至少一個不具有非整倍體。在一些情況下，該對照懷孕個體及對照胎兒中之至少一個不具有基因異常。在一些情況下，該對照懷孕個體及對照胎兒中之至少一個具有對應於該染色體區之非整倍體。在一些情況下，該對照懷孕個體及對照胎兒中之至少一個具有對應於該目標染色體區之基因異常。
在一些態樣中，本文揭示方法，該等方法包含自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；標誌該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分以產生經標誌無細胞胎兒核酸分子；量測經標誌無細胞胎兒核酸分子之數量；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。在一些情況下，標誌該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分包含標誌來自目標染色體區之無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，該方法不包含測序。在一些情況下，方法包含自至少一個懷孕個體獲得複數個生物樣本，其中該等生物樣本各自含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；以及用不同索引對來自各生物樣本之無細胞胎兒核酸分子編索引，由此向該等無細胞胎兒核酸分子提供樣本標識符。在一些情況下，方法包含標誌來自目標染色體區之無細胞胎兒核酸分子。
在一些態樣中，本文揭示系統，該等系統包含用於收集懷孕個體之流體樣本的樣本收集器；自該流體樣本捕捉或移除樣本成分之樣本純化器；核酸偵測器；以及核酸資訊輸出裝置。在一些情況下，該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。在一些情況下，穿皮穿刺裝置選自針、刺血針、微針及微針陣列。在一些情況下，樣本成分選自細胞、蛋白質、核酸及微小泡囊。在一些情況下，核酸偵測器包含核酸測序儀。在一些情況下，核酸偵測器包含計數系統，該系統標記流體樣本中之所關注核酸並對該等標記計數以偵測該樣本中所關注核酸之代表性。在一些情況下，計數系統包含標記，其中該等標記包含與所關注核酸雜交之寡核苷酸。在一些情況下，核酸序列輸出裝置選自無線通信裝置、有線通信裝置、電纜連接埠及電子顯示器。在一些情況下，該系統之所有組件均存在於單一位置中。在一些情況下，該系統之所有組件均容納於單一裝置中。在一些情況下，該樣本收集器係位於第一位置處且該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在第二位置。在一些情況下，樣本純化器包含過濾器。在一些情況下，樣本純化器包含用於將生物流體推動穿過該過濾器的浸潤材料或毛細管裝置。在一些情況下，過濾器之孔徑為約0.05微米至約2微米。在一些情況下，樣本純化器包含結合生物流體樣本中之核酸、蛋白質、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。在一些情況下，該結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、肽、小分子或其組合。在一些情況下，該結合部分能夠結合細胞外囊泡，其中該細胞外囊泡係自胎兒細胞或雌性個體之胎盤細胞釋放。在一些情況下，將該結合部分附接至固體載體，其中在該結合部分與生物樣本接觸之後，該固體載體可以與生物樣本之其餘部分分開或該生物樣本可以與固體載體分開。在一些情況下，該系統包含選自引子、聚合酶及其組合之至少一種核酸擴增試劑。在一些情況下，該至少一種核酸擴增試劑包含至少一種等溫擴增試劑。在一些情況下，該至少一種等溫擴增試劑包含重組酶聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、鏈置換聚合酶或其組合。在一些情況下，系統包含用於運輸該流體樣本之至少一部分的運輸或儲存隔室。在一些情況下，該運輸或儲存隔室包含吸收墊、流體容器、樣本防腐劑或其組合。在一些情況下，系統包含容器、小袋、線及電纜中之至少一種，用於加熱或冷卻該裝置或其組件。在一些情況下，系統包含至少一種緩衝液，用於對無細胞核酸進行修復、純化、擴增及測序中之至少一種。
熟習此項技術者自以下實施方式將對本發明之其他目的、特徵及優勢變得顯而易見。然而，應理解實施方式及具體實例儘管指示本發明之一些實施例，但係以說明而非限制之方式提供。在不脫離本發明精神之情況下，可在本發明之範圍內作出許多改變及修改，且本發明包括所有該等修改。另外，一個實施例之態樣可以用於其他不同的實施例中。
以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如特定及單獨地指示每一個別出版物、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。
相關申請案
本申請案主張2017年10月27日申請的美國臨時專利申請案第62/578,179號之優先權。優先權係依照35 U.S.C. § 119主張。上述專利申請案係以引用之方式併入，引用方式就如同完整陳述於本文中。
某些術語
提供以下描述以輔助理解本文所揭示之方法、系統及套組。以下對本文中使用之術語的描述並不意欲限制此等術語之定義。在本申請案通篇將進一步描述及舉例說明此等術語。
一般而言，術語「無細胞聚核苷酸」、「無細胞核酸」在本文中可互換地使用，意思指可以自未提取出細胞中之聚核苷酸或核酸之樣本分離的聚核苷酸及核酸。無細胞核酸可以包含DNA。無細胞核酸可以包含RNA。無細胞核酸係未包含在細胞膜內之核酸，亦即，其未包封在細胞隔室中。在一些實施例中，無細胞核酸係不以細胞膜為界且在血液或其他流體中循環或存在之核酸。在一些實施例中，無細胞核酸係在收集含有其之生物樣本之前及/或之時無細胞，且未因人工、有意或其他方式進行之樣本操作，包括在樣本收集之時或之後的操作，而自該細胞釋放。在一些情況下，無細胞核酸係在細胞中產生且藉由生理手段，包括例如細胞凋亡及非凋亡性細胞死亡、壞死、自體吞噬、自發釋放(例如DNA/RNA-脂蛋白複合物之自發釋放)、分泌及/或有絲分裂劇變而自該細胞釋放。在一些實施例中，無細胞核酸包含藉由生物機制(例如細胞凋亡、細胞分泌、囊泡釋放)而自細胞釋放的核酸。在另外或額外的實施例中，無細胞核酸並非藉由人工操作細胞或樣本處理(例如細胞膜破壞、溶解、渦旋、剪切等)自細胞提取之核酸。
在一些情況下，無細胞核酸係無細胞胎兒核酸。一般而言，如本文所使用，術語「無細胞胎兒核酸」係指如本文所描述之無細胞核酸，其中該無細胞核酸係來自包含胎兒DNA之細胞。對於妊娠期婦女，源自胎盤之無細胞DNA可以構成無細胞DNA總量之很大部分。胎盤DNA通常係胎兒DNA之良好替代物，因為在大多數情況下，其高度類似於胎兒DNA。絨毛膜取樣之類應用利用此事實來實行診斷應用。通常，由於胎盤組織在懷孕個體妊娠期間經常脫落，故在母體生物樣本中發現大部分無細胞胎兒核酸。通常，脫落的胎盤組織中之許多細胞係含有胎兒DNA之細胞。自胎盤脫落之細胞釋放出胎兒核酸。因此，在一些情況下，本文所揭示之無細胞胎兒核酸係自胎盤細胞釋放之核酸。
如本文所使用，術語「細胞核酸」係指包含在細胞中或由於生物樣本操作而自細胞釋放之聚核苷酸。生物樣本操作之非限制性實例包括離心、渦旋、剪切、混合、溶解及向生物樣本中添加當獲得生物樣本時不存在於該生物樣本中的試劑(例如清潔劑、緩衝液、鹽、酶)。在一些情況下，細胞核酸係由於機器、人或機器人破壞或溶解細胞而自細胞釋放的核酸。在一些情況下，細胞核酸(細胞所含核酸)係藉由本文所揭示之裝置及方法有意或無意地自細胞釋放。然而，此等不應視為如本文中使用之術語「無細胞核酸」。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法提供用於分析生物樣本中之無細胞核酸，且亦在製程中分析細胞核酸。
如本文所使用，術語「生物標記物」一般係指個體之生物學或病狀之任何標記物。生物標記物可以為疾病或病狀之指示或結果。生物標記物可以為健康狀況之指示。生物標記物可以為基因異常或遺傳性病狀之指示。生物標記物可以為循環生物標記物(例如生物流體，諸如血液中所發現之生物標記物)。生物標記物可以為組織生物標記物(例如在實體器官，諸如肝或骨髓中發現之生物標記物)。生物標記物之非限制性實例包括核酸、表觀遺傳修飾、蛋白質、肽、抗體、抗體片段、脂質、脂肪酸、固醇、多醣、碳水化合物、病毒顆粒、微生物顆粒。在一些情況下，生物標記物甚至可以包括全細胞或細胞片段。
如本文所使用，術語「標籤」一般係指可以用於鑑定、偵測或分離所關注核酸之分子。除非另外具體說明，否則術語「標籤」可與其他術語，諸如「標記」、「接頭」、「寡核苷酸」及「條形碼」互換使用。然而，應注意，術語「接頭」可以用於連接一個核酸或多個核酸之二端，而不是充當標籤。
如本文所使用，術語「遺傳資訊」一般係指一或多個核酸序列。在一些情況下，遺傳資訊可以為單核苷酸或胺基酸。舉例而言，遺傳資訊可以為存在(或不存在)單核苷酸多形現象。除非另外具體說明，否則術語「遺傳資訊」亦可指表觀遺傳修飾模式、基因表現資料及蛋白質表現資料。在一些情況下，生物標記物之存在、不存在或數量提供遺傳資訊。舉例而言，膽固醇含量可以指示高膽固醇血症之基因形式。因此，遺傳資訊不應侷限於核酸序列。
如本文所使用，術語「基因突變」一般係指基因組核苷酸序列之改變。基因突變不同於天然變異或對偶基因差異。基因突變可以見於低於10%之個體物種中。基因突變可以見於低於5%之個體物種中。基因突變可以見於低於1%之個體物種中。個體之基因突變可以引起該個體之疾病或病狀。基因突變可以引起蛋白質編碼序列之讀框轉移。基因突變可以引起至少一部分蛋白質編碼序列之缺失。基因突變可以引起蛋白質編碼序列終止密碼子之喪失。基因突變可以產生蛋白質編碼序列之過早終止密碼子。基因突變可以產生編碼錯誤摺疊之蛋白質的序列。基因突變可以產生編碼功能異常蛋白質或非功能性蛋白質(例如結合或酶活性喪失)之序列。基因突變可以產生編碼過度活化蛋白質(例如增加之結合或酶活性)之序列。基因突變可能影響單核苷酸(例如單核苷酸多形現象)。基因突變可能影響多個核苷酸(例如讀框轉移、易位)。
如本文所使用，術語「健康個體(healthy individual)」及「健康個體(healthy subject)」係指未患所關注病狀或疾病之個體。舉例而言，若使用所描述之方法或裝置偵測癌症類型，則健康個體未患該類型之癌症。健康個體可能根本未患癌症。在一些情況下，健康個體未被診斷患有任何疾病或病狀。在一些情況下，健康個體不具有已知基因突變。在一些情況下，健康個體不具有引起可偵測表型之基因突變，該可偵測表型將區分個體與不具有已知基因突變之健康個體。在一些情況下，健康個體未感染病原體。在一些情況下，健康個體感染病原體，但無已知基因突變。
如本文所使用，術語「基因組當量」一般係指為保證所有基因將存在而需要存在於純化樣本中的DNA量。
如本文所使用，術語「組織特異性」或短語「對組織具特異性」一般係指聚核苷酸主要在特定組織中表現。通常，本文所揭示之方法、系統及套組利用組織特異性無細胞聚核苷酸。本文所描述的組織特異性無細胞聚核苷酸係當表現其之組織或器官損傷或患病時以可以在生物流體中定量之水準表現的聚核苷酸。在一些情況下，生物流體中本文所揭示之組織特異性無細胞聚核苷酸之存在係由於組織或器官損傷或患病時組織特異性無細胞聚核苷酸之釋放，而不是由於組織特異性無細胞聚核苷酸表現之變化。本文所揭示之組織特異性無細胞聚核苷酸之含量升高可以指示相應組織或器官之損傷。在一些情況下，本文所揭示之無細胞聚核苷酸在若干組織中表現/產生，但在該等組織中之至少一種中以組織特異性含量表現/產生。在此等情況下組織特異性無細胞聚核苷酸之絕對或相對數量指示一個特定組織或器官，或組織或器官之集合的損傷或疾病。替代地或另外地，組織特異性聚核苷酸係具有組織特異性修飾之核酸。組織特異性聚核苷酸可以包含RNA。組織特異性聚核苷酸可以包含DNA。作為非限制性實例，本文所揭示之組織特異性聚核苷酸或標記物包括具有組織特異性甲基化模式之DNA分子(例如基因或非編碼區之一部分)。換言之，聚核苷酸及標記物可以類似地在許多組織中，或甚至在整個個體中廣泛地表現，但該等修飾具有組織特異性。一般而言，本文所揭示之組織特異性聚核苷酸或其含量對疾病不具有特異性。一般而言，本文所揭示之組織特異性聚核苷酸不編碼涉及疾病機制之蛋白質。
在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在所關注組織中之存在量大於其在個體之血液中之存在量。在一些情況下，RNA在所關注組織中之存在量大於其在血球中之存在量。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸並非由血球表現。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在組織中之存在量係在血液中之存在量的至少兩倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在組織中之存在量係在血液中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在組織中之存在量係在血液中之存在量的至少十倍。
在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在該組織中之存在量係在個體之任何其他組織中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在該組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少十倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過二個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過二個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過二個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少十倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三個組織中之存在量係在任何其他組織中之存在量的至少十倍。
在一些情況下，組織特異性聚核苷酸對目標細胞類型具特異性。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在目標細胞類型中之存在量係在非目標其他細胞類型中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在目標細胞類型中之存在量係在非目標其他細胞類型中之存在量的至少十倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過二種目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過二種目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少五倍。在一些情況下，RNA在不超過二種目標細胞類型中之表現量係在非目標細胞類型中之表現量的至少十倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三種目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少三倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三種目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少五倍。在一些情況下，組織特異性聚核苷酸在不超過三種目標細胞類型中之存在量係在非目標細胞類型中之存在量的至少十倍。
除非另外具體說明，否則如本文所使用，術語「分離」、「純化」、「移除」、「捕捉」及「分開」皆可互換使用。
如本文所使用，術語「診所」、「臨床環境」、「實驗室」或「實驗室環境」係指利用經過訓練之人員處理及/或分析生物及/或環境樣本的醫院、診所、藥房、研究機構、病理實驗室、一個或其他商業環境。此等術語與護理位置、遠端位置、家、學校及其他非企業、非機構環境形成對比。
如本文所使用，術語『約』某數字係指該數字加或減該數字之10%。術語『約』當用於範圍之情形時係指該範圍減其最低值之10%及加其最大值之10%。
除非上下文另外明確規定，否則如本文所使用，單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)參考物。舉例而言，術語「一個樣本」包括複數個樣本，包括其混合物。
按照本說明書，術語「準確性」應當以其最廣泛定義提供。然而，術語「準確性」可用於指二元分類測試如何正確地鑑定或排除病狀的統計量度。如本文所使用，術語「準確性」亦可指檢查的所有樣本中真實結果(真陽性及真陰性)之比例。如本文所使用，術語「準確性」可以涵蓋「蘭德準確性(Rand accuracy)」或如藉由「蘭德指數」所測定之準確性。
如本文所使用，術語「同源」、「同源性」或「同源性百分比」描述第一胺基酸序列或核酸序列相對於第二胺基酸序列或核酸序列之序列相似性。在一些情況下，同源性可以使用Karlin及Altschul所描述之公式測定(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990，如Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993中所修改)。此類公式併入至Altschul等人(J. Mol. Biol.215: 403-410, 1990)之鹼基局部比對檢索工具(basic local alignment search tool，BLAST)程式中。截至本申請案之申請日，序列同源性百分比可以使用BLAST之最近版本測定。在一些情況下，當比較2個或2個以上序列且在比較窗或指定區內對準達到最大對應性時，如使用以下序列比較算法之一或藉由手動比對及目視檢查所量測，若該等序列共有至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%一致性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性，則其可以為同源的。在一些情況下，若2個或2個以上序列共有至多20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%一致性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性，則其可以為同源的。較佳地，在長度為至少16個胺基酸或核苷酸之區域內或在一些情況下，在長度為50至約100個胺基酸或核苷酸之區域內存在一致性或同源性%。在一些情況下，在長度為約100至約1000個胺基酸或核苷酸之區域內存在一致性或同源性%。在一些情況下，2個或2個以上序列可以在序列中至少100個胺基酸內為同源的且共有至少20%一致性。對於序列比較，一般一個序列充當參考序列，測試序列可以與其相比較。當使用序列比較演算法時，可以將測試序列及參考輸入電腦中，必要時，隨後可以指定座標，且可以指定序列演算法程式參數。可以使用任何適合演算法，包括(但不限於) Smith-Waterman比對演算法、Viterbi、Bayesians、Hidden Markov及類似演算法。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。接著，可以使用序列比較演算法，基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。可以使用任何適合演算法，由此計算一致性百分比。舉例而言，一些程式以比對的一致殘基位置之數量除以比對位置之總數計算一致性百分比。如本文所使用，「比較窗」包括提及可以在10至600個位置範圍內的任一數量相鄰或不相鄰位置之區段。在一些情況下，該比較窗可以包含至少10、20、50、100、200、300、400、500或600個位置。在一些情況下，該比較窗可以包含至多10、20、50、100、200、300、400、500或600個位置。在一些情況下，該比較窗可以包含至少50至200個位置，或至少100至至少150個位置，其中在最佳地對準一個序列與參考序列之後，可以將該序列與相同數量相鄰或不相鄰位置之參考序列相比較。比對供比較之序列的方法係此項技術中熟知的。可以例如藉由Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性演算法；藉由Needleman及Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對演算法；藉由Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性方法檢索；藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；或藉由手動比對及目視檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編, 1995增補版))進行供比較序列之最佳比對。在一些情況下，比較窗可以包含一級序列中之相鄰位置、在三級空間中相鄰但在一級序列中不連續之位置的總對準之任何子集，或該對準中1個至所有殘基之任何其他子集。
如本文所使用，術語代表性過度及代表性不足一般係指樣本與對照中目標核酸代表性之間的差異。其代表性可能顯著小於對照代表性且因此為代表性不足。其代表性可能顯著高於對照代表性且因此為代表性過度。該顯著性可以為統計顯著的。測定統計顯著性之方法係此項技術中熟知的。作為非限制性實例，統計顯著性係使用標準雙尾t檢驗測定(*：p＜0.05；**p＜0.01)。
如本文所使用，術語「雲端」係指經共享或可共享之電子資料存儲。雲端可以用於封存電子資料、共享電子資料及分析電子資料。
在本申請案通篇，陳述短語「對應於染色體之核酸」及「對應於染色體之序列」。如本文所使用，此等短語意圖表示，「對應於染色體之核酸」係由與該染色體中所發現之序列一致或同源的核酸序列表示。術語「同源」在前述說明中有描述。
基因測試傳統上係在實驗室或臨床環境中進行。然而，在可使用基因測試之許多情況下，到達實驗室或診所係無法實現或不切實際的。高複雜性測試，諸如循環腫瘤DNA或胎兒DNA測試分析因實行此類測試之途徑受限(例如需要靜脈切開術、時間安排、需要約診、與診所/實驗室之距離)及此類測試之成本(例如進行靜脈切開術、處理數毫升樣本、樣本管及試劑、進行運送，特別是冷運送之成本)而很少見。因此，在需要位置(例如遠離實驗室及診所之位置)處可操作的基因測試係合乎需要的。用於在需要位置(例如家、學校、農場)處操作的基因測試較佳成本低廉且未經訓練之個體執行起來簡單。在需要位置處進行之基因測試較佳地僅需要少量生物樣本。傳統上，基因測試需要抽取靜脈血(靜脈切開術)以獲得數毫升含有足夠待分析DNA之血液。然而，靜脈切開術在需要位置處係不合實際的。理想的是，基因測試將僅需要經由獲取毛細血管血液，例如經由穿皮穿刺裝置獲得一定量血液。此意謂，需要位置處用於基因測試之裝置及方法需要經設計成用超低輸入量之樣本及較低豐度的待偵測目標分子。
期望具有一種基因測試，該基因測試除採用超低輸入量之樣本外，亦能夠分析循環無細胞核酸(DNA及RNA)，例如循環無細胞胎兒DNA、循環腫瘤DNA、來自移植之供體器官的循環DNA及自特定組織釋放之循環DNA作為健康相關問題、疾病進展或治療反應之一部分。然而，循環無細胞核酸之分析由於該等無細胞核酸半衰期短且因此豐度低而具挑戰性。此外，若不小心處理樣本以避免白血球溶解，則血液中之循環無細胞核酸可以經自白血球釋放之DNA稀釋。白血球DNA在循環無細胞核酸之偵測期間產生背景雜訊，由此降低分析靈敏度及特異性。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法藉由將小樣本體積(例如小於1ml)之溫和且高效處理與利用循環無細胞DNA(cfDNA)之高度斷裂性質的特有目標區域選擇及分析設計相組合來解決此等難題。舉例而言，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可以藉由刺破單個手指提供可靠的遺傳資訊。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法提供對沿目標基因之多個目標區域的分析，該等目標區域隔開足夠間隔，使得當該目標基因在循環中斷裂時，該等目標區域可能以物理方式分開。因此，儘管對於傳統上在基因測試中分析之個別長DNA片段的統計取樣存在上述限制，但取樣統計資料宜隨cfDNA片段而變化。儘管在毛細血管血液樣本中存在僅1基因組當量之聚集物，但存在許多個別cfDNA片段。因此，可以由超低輸入量實現靈敏擴增。
舉例而言，若沿基因組區域存在二十個目標區域且其隔開足夠間隔，使得在該區域斷裂時，可獨立地對該等目標區域進行分析及偵測，則使99%之所有樣本中具有至少1個目標區域所需的輸入體積在140 µl至25 µl間變化，由此顯著增加靈敏度。在一些情況下，目標區域含有一致序列或類似序列。此等目標區域可以稱為複本。
在其他情況下，目標區域可能不共有類似序列，但共有另一特徵，諸如類似的表觀遺傳狀態。舉例而言，目標區域可以具有不同序列，但其皆過度甲基化。不管各區域之間相似之基礎如何，其適當地隔開以充分利用循環無細胞DNA之斷裂模式產生許多循環cfDNA片段，該等循環cfDNA片段中之至少一個可以小體積偵測。作為非限制性實例，在單獨cfDNA片段上彼此分開足夠遠且當個體患有癌症時皆過度甲基化的選定目標區域可以利用亞硫酸氫鹽測序偵測。在小樣本體積(例如手指刺破之血液)中，存在所有此等片段(等效於未斷裂DNA)之可能性較低，但存在至少一個片段的可能性較高，且可以偵測癌症。
在又其他實例中，目標區域可能不含類似序列，且可能不含類似的表觀遺傳狀態。在此情況下，偵測可能需要製備多個引子集或集合庫，隨後用通用引子擴增以偵測若干不同目標區域。作為非限制性實例，可以由手指刺破量之血液，藉由使用多個引子集偵測無細胞胎兒DNA片段中RHD 基因之多個不同外顯子偵測RHD 陰性懷孕母親體內之胎兒RHD 基因。藉由選擇使在RHD 基因中物理上遠離且因此可能存在於不同無細胞DNA片段上之區域擴增的引子，可以增加靈敏度。偵測RHD 陰性懷孕母親體內之胎兒RHD 基因對於預防由針對子女之血液具有抗體之母親引起的新生兒之溶血性疾病極為重要。當前藉由抽取全血(八毫升血液)進行RHD 測試以獲得適當的可靠結果。咸信此體積係獲得可靠結果必需的，因為其係基於在樣本中將存在完整RHD 基因之可能性。基於此假設，在手指刺破量血液中獲得完整RHD 基因之可能性較低且容易地導致假陰性結果。
不管如何選擇目標區域，當對無細胞片段DNA進行擴增或偵測時，此等區域均存在於樣本中作為個別生物標記物。含有目標區域之片段的濃度大於相應未斷裂DNA或無法作為一組分析之片段。因此，自目標區域獲得的信號將大於自未斷裂DNA或自分析目標區域之一個複本得到的信號。偵測到在超低體積樣本中存在之目標區域的可能性比偵測到與另一區域不重複或不共有一些共同性之非目標區域的可能性要高得多。藉由分析多個DNA片段中之多個目標區域，分析靈敏度相對於傳統測試有所增加。
血液係無細胞核酸之可靠來源。大部分用於分析血液中之無細胞核酸的方法涉及分離含有無細胞核酸之血漿或血清部分。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法允許在需要位置處輕柔地處理血液樣本。由此可以避免、防止或減少白血球溶解。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法允許在需要位置處快速處理血液樣本。由此避免會導致血球溶解的樣本長期儲存及運送。在一些情況下，本文所揭示之裝置進行整合式分離，例如經由過濾直接分離出血漿，以避免、減少或防止細胞溶解。當試劑(例如探針、引子、抗體)或偵測方法無法提供較高特異性時，可能需要直接分離細胞與cfDNA。在一些情況下，為避免任何白血球溶解，用全血進行方法。當能達到相對較高特異性時，由全血進行分析可能更合乎需要。
除僅需要小樣本體積外，出於以下原因，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法亦係特別合乎需要的。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法一般需要極少技術訓練，甚至不需要技術訓練。因此，進行基因測試之成本相對於由經過訓練之人員進行測試之成本有所降低，且該測試可用於無法接近經過訓練之人員的個體。另外，可以在數分鐘(例如低於一小時)內獲得結果。當測試感染時，此可能尤為重要。對感染呈陽性之個體或動物試樣可以迅速地分離及處理，由此防止感染之擴散。另外，可以私下地獲得結果。在一些情況下，僅所測試之患者私下地獲悉所得遺傳資訊。本文所揭示之裝置、系統及套組一般重量較輕且為手持式的，使其適合且可達到遠端位置。因此，其可以在家、在學校、在工作場所、在戰場、在農場或在訪視實驗室或臨床環境不切實際或不便的任何其他場所使用。另外，由於可在護理位置處分析樣本，故不需要儲存或運送該樣本，由此降低樣本降解及錯誤鑑定(例如樣本調換)之風險。
圖 1 顯示本文所揭示之方法、裝置及系統可以遵循之各種途徑的通用流程圖。起初，在步驟110中獲得樣本。為了自樣本搜集有用資訊，必須獲得極少量樣本。該樣本可以為本文所揭示之生物樣本。該樣本可以為未處理之粗樣本(例如全血)。該樣本可以為經處理之樣本(例如血漿)。樣本之量可能基於樣本類型。通常，在步驟120中，處理該樣本或自樣本中純化出分析物(例如核酸或其他生物標記物)以產生可以擴增及/或偵測之分析物。處理可以包含過濾樣本、結合含有分析物的樣本成分、結合分析物、使分析物穩定、純化分析物或其組合。樣本成分之非限制性實例係細胞、病毒顆粒、細菌顆粒、胞外體及核小體。在一些情況下，該分析物係核酸且在步驟130中，使其擴增以產生擴增子用於分析。在其他情況下，分析物可以為或可以不為核酸，而不管是否經擴增。在偵測及分析之前，分析物或擴增子視情況經修飾(140)。在一些情況下，修飾係在擴增期間發生(未示出)。舉例而言，分析物或擴增子可以經標誌或標記。偵測可能涉及測序、目標特異性探針、等溫擴增及偵測方法、定量PCR或單分子偵測。圖 1 係作為本文所揭示之裝置及方法之廣泛概述，但本文所揭示之裝置及方法不受圖 1 限制。裝置及方法可以分別包含圖 1 中未示出的額外組件及步驟。
在一些情況下，由於遺傳資訊可以保持為使用者私密的，故本文所揭示之裝置、系統、套組及方法係合乎需要的。實際上，甚至使用該裝置亦可為私密的。或者，裝置、系統、套組及方法經組態用於與其他共享資訊或可以由使用者容易地調適以共享資訊(例如打開藍牙信號)。舉例而言，可以容易地與護士或醫生共享資訊。在一些情況下，該裝置或系統可以經由安全入口或應用程式設計介面(API)發送至在辦公室或醫院之醫療人員或工作人員/與其共享測試結果。在一些情況下，在接收到結果之後，使用者可以選擇親自與醫療人員共享資訊。在一些情況下，該資訊甚至可以即時地共享。此類通信對於例如因兵役、雇傭義務、移民政策或健康問題而分開的夫妻或家庭將係合乎需要的。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法存在多種應用。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法允許診斷及監測醫學病狀。醫學病狀之非限制性實例包括自體免疫性病狀、代謝病狀、癌症及神經病狀。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法允許個體化用藥，包括微生物群落測試、測定適當的個人醫藥劑量及/或偵測針對藥物或其劑量之反應。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法能夠偵測由病原體及/或個體對可用於治療感染之藥物之耐藥性引起的感染。在幾乎所有病例中，對於技術訓練或大型昂貴實驗室設備具有極少需求，甚至無需求。
圖 1 顯示，使用本文所揭示之裝置、系統、套組或方法者可以微量體積(例如低於一毫升)來自個體之生物樣本起始。生物樣本一般含有小於5000基因組當量之無細胞DNA。該樣本可以藉由過濾、穩定化、純化或其組合進行處理以允許分析。在一些情況下，該樣本不需要處理，諸如過濾、穩定化或純化。樣本中之若干不同分析物可以提供資訊，例如無細胞DNA、無細胞RNA、微小泡囊相關核酸及無細胞DNA上之表觀遺傳標記物。可對此等分析物中之一或多種進行分析。在一些情況下，分析物未經擴增。在一些情況下，對分析物測序，無需擴增或修飾該分析物。在一些情況下，對分析物擴增(例如聚合酶介導之核酸擴增)以產生分析物之擴增子。在一些情況下，對擴增子測序。在一些情況下，對擴增子測序，無需進一步製備或修飾。在一些情況下，利用特徵，諸如擴增子或目標區域內之多形現象、突變、表觀遺傳標記物或畸變進行進一步分析。
在一些情況下，分析物、擴增子或其組合藉由用標記、條形碼或標籤標記分析物而轉化成集合庫。除非另外說明，否則術語標記、條形碼及標籤在本文中可互換地使用。在一些情況下，對集合庫成員擴增以產生擴增之集合庫成員。在一些情況下，集合庫成員經歷全基因組擴增。在一些情況下，集合庫成員係全基因組擴增之產物。在一些情況下，未對集合庫成員擴增以產生擴增之集合庫成員。在一些情況下，集合庫成員未經歷全基因組擴增。在一些情況下，集合庫成員並非全基因組擴增之產物。在一些情況下，集合庫成員經捕捉以產生捕捉之集合庫成員。在一些情況下，集合庫成員經捕捉及擴增以產生經捕捉、擴增之集合庫成員。在一些情況下，對集合庫成員測序。在一些情況下，對擴增之集合庫成員測序。在一些情況下，對經捕捉之集合庫成員測序。在一些情況下，對經捕捉、擴增之集合庫成員測序。在一些情況下，未對集合庫成員測序。舉例而言，可以藉由一系列探針或藉由單分子計數對集合庫成員進行偵測或定量。在一些情況下，藉由一系列探針或藉由單分子計數對擴增之集合庫成員進行偵測或定量。在一些情況下，藉由一系列探針或藉由單分子計數對捕捉之集合庫成員進行偵測或定量。在一些情況下，藉由一系列探針或藉由單分子計數對經捕捉、擴增之集合庫成員進行偵測或定量。
圖 2 顯示本文所揭示之方法、系統、裝置及套組可以分配於若干位置中。舉例而言，本文所揭示之方法可以完全在家庭環境或其他需要位置進行。此對於無法進入(例如在物理上、在財政上)實驗室、核酸處理及分析設備或技術員或醫生之個體尤為重要。在一些情況下，樣本可以在實驗室(例如所需實驗室設備)中處理。然而，本文所揭示之方法、系統、裝置及套組還允許在家中收集樣本及報告。舉例而言，樣本可以在家中收集，運送至實驗室進行處理，並經由電子通信將結果傳遞給在家中之個體。因此，即使是需要在實驗室中處理時，本文所揭示之方法、系統、裝置及套組對於使用者仍很便利，只需要其具有運送/運輸其樣本之手段。在一些情況下，宜在雲端或伺服器上進行資料處理，由此可以將測試結果傳達給個體。在一些情況下，宜在實驗室中進行資料處理並在不依賴於雲端或網際網路伺服器情況下，將結果報告給在家中之個體。
無創產前測試
本文所揭示之方法、裝置及系統之一種應用係無創產前測試(NIPT)。胎兒健康係準父母在最初感知到並證實妊娠之後最關注的問題之一。除其他常規妊娠相關健康測試外，胎兒染色體或基因畸變之風險評估已成為許多國家管理懷孕之標準治療。當前，有若干測定胎兒之遺傳資訊的方式。在前三個月(第1週至第12週)期間，針對頸項半透明帶之超音波測試可以揭示是否有可能存在染色體異常，如第18對染色體三體症或第21對染色體三體症。此外，可進行母體靜脈切開術以測試懷孕相關血漿蛋白質及人絨毛膜促性腺激素之含量。此等蛋白質之含量升高亦可指示染色體異常。然而，此等測試並非決定性的且一般需要另外的、創傷性較大的測試(例如絨毛膜取樣(胎盤組織取樣)或羊水穿刺術(針穿透羊膜囊))以確定是否實際上存在異常。另外的測試可在第二個三個月期間進行，但通常需要進一步測試、另外的超音波及羊水穿刺術以進行更具決定性的測定。
前述篩查需要在臨床環境中經歷技術訓練之醫療提供者。此等測試中有許多係創傷性的(例如羊水穿刺術)，由此給胎兒以及母親帶來健康風險。通常，需要在兩個三月期時進行前述篩查以偵測染色體異常。因此，關於染色體異常之偵測通常無法在胎兒進入妊娠中期之前，使用本領域中之當前方法實現。
由於在妊娠期婦女之血液中發現循環無細胞胎兒DNA，故產前護理可見到顯著改進。母體血液中循環胎兒DNA之存在提供一種研究胎兒基因構成及鑑定可能存在之健康風險或妊娠併發症的手段，而無與諸如絨毛膜取樣及羊水穿刺術之類程序有關的風險。已開發出利用循環無細胞胎兒DNA之多種醫療相關測試，但最重要之測試係針對胎兒染色體異常之NIPT。
現有NIPT可以歸類為二個主要類別。該等類別係僅擴增及分析某些染色體或染色體區域之靶向分析或其係全基因組分析。不幸的是，現有NIPT需要靜脈穿刺(例如靜脈切開術)以獲得足以實現適當篩查效能之量的母體血液/血漿。舉例而言，現有NIPT通常需要收集多達16 ml血液。由於現有NIPT中需要大量血液，故對測試之便利性及進行存在顯著限制。此外，樣本處置物流以及測試成本及試劑成本係難以承擔的。
先前認為NIPT僅利用大量cfDNA複本數(基因組當量)，諸如用靜脈切開術獲得之cfDNA複本數(例如數毫升血液)才能實行。若干統計原因(解析極小差異需要較大樣本數量)以及傳統原因(可用於FISH之標記物有限)加強此實踐。本申請案顯示如何由超低輸入量，藉由cfDNA分析進行NIPT。參見實例1-5。本文所揭示之方法、裝置、系統及套組將現有的高效率集合庫創建方法與低水準DNA擴增(例如8-10個循環)相組合，以一種新穎方式自極小樣本體積實行NIPT。
與現有NIPT相比，本文所揭示之方法、系統及裝置使準確篩查胎兒染色體畸變所需之無細胞胎兒DNA之量減到最少，由此避免對大樣本體積之需求。在樣本係血液之情況下，可以藉由刺破手指獲得足量血液。參見例如實例3。因此，本文所揭示之方法及系統消除對靜脈穿刺之需求，由此能夠在護理位置處以顯著降低之測試成本進行NIPT。由於母體血液中之胎兒部分可能較少且母體之無細胞核酸可以變化，故本文所揭示之方法、系統及裝置成功地揭露有關胎兒之可靠且有用之遺傳資訊係出人意料的。母體生物學係始終變化的且母體個體之母體無細胞核酸存在許多變化。母體各種器官(例如肝、皮膚)中存在構成循環無細胞核酸之無細胞核酸且該等器官之生物學可以隨年齡、疾病、感染且甚至是一天中的時間而變化。不可預測的是，母體代表性係可再現的，足以將來自測試個體之無細胞胎兒核酸與來自參考/對照個體之無細胞胎兒核酸相比較。需以實驗方式證實，宿主背景DNA實際上提供足夠穩定之分佈，由此可以準確地偵測三染色體症或其他基因組變異。
本文揭示用於獲得胎兒之遺傳資訊的裝置、系統、套組及方法。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法能夠有利地在妊娠極早期獲得遺傳資訊。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可以隱秘地在家中獲得胎兒之遺傳資訊，無需實驗室設備且無樣本調換之風險。遺傳資訊可以利用本文所揭示之裝置、系統、套組及方法在數分鐘或數秒內偵測。
本文揭示用於分析懷孕個體之生物流體樣本中之無細胞胎兒核酸的裝置、系統、套組及方法。有關無細胞循環核酸之分析面臨多個技術難題。舉例而言，血液中循環核酸之擴增可以受全血中之一些成分抑制。全血中之成分的非限制性實例係血紅蛋白及所締合之鐵。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法旨在解決許多此等技術難題。此外，該等裝置、系統、套組及方法提供以下優勢：(1)最小創傷性、(2)可在家中應用，需要極少或無需技術訓練；(3)在病狀(例如妊娠)早期提供資訊。另外，裝置、系統、套組及方法一般不需要複雜或昂貴的設備。
在一些態樣中，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於分析來自胎兒之無細胞核酸，在本文中稱為「無細胞胎兒核酸」。在一些情況下，無細胞胎兒核酸係來自胎兒之至少一個細胞、胎盤之至少一個細胞或其組合。母體血液中無細胞胎兒核酸之產前應用為在無細胞母體核酸存在下分析無細胞胎兒核酸提供另外的難題，該等無細胞母體核酸在無細胞胎兒核酸中產生較大的背景信號。舉例而言，母體血液樣本可以含有每毫升全血約500至2000基因組當量之總無細胞DNA(母體及胎兒)。自妊娠期婦女取樣之血液中的胎兒部分可以為約10%，約每毫升50至200胎兒基因組當量。另外，獲得無細胞核酸之方法可能涉及自血液獲得血漿或血清。若不小心地進行，則血球可能破壞，將另外的細胞核酸釋放至樣本中，在胎兒無細胞核酸中產生另外的背景信號。典型白血球計數係每毫升血液約4*10^6至10*10^6個細胞且因此可用核DNA係總體無細胞DNA(cfDNA)之約10,000倍。因此，即使僅一小部分母體白血球破壞，將核DNA釋放至血漿或血清中，亦使胎兒部分大幅減少。舉例而言，0.01%之白血球降解可以將胎兒部分自10%減小至約5%。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法旨在減小此等背景信號。
I. 方法
一般而言，本文所揭示之方法包含獲得生物樣本並偵測其成分。在一些情況下，本文所揭示之方法係用本文所描述之裝置、系統或套組進行。可以在臨床或實驗室環境，諸如作為非限制性實例，在醫藥診所、醫院、科學研究實驗室、病理實驗室或臨床測試實驗室中獲得該生物樣本。或者，可以在遠離臨床或實驗室環境之位置，諸如作為非限制性實例，在家中、計劃生育中心、工作場所、學校、農場或戰場獲得。一般而言，本文所揭示之方法包含收集並分析相對較小體積之生物樣本，不管是在臨床環境抑或在遠端位置中收集。在一些情況下，偵測係在臨床或實驗室環境中進行。在其他情況下，偵測係在遠離臨床或實驗室環境之位置處進行。本文所揭示之方法的其他步驟，例如擴增核酸，可以在臨床/實驗室環境中或在遠端位置處進行。在一些情況下，該等方法可以由個體進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係由未接受執行該方法所需之任何技術訓練的使用者進行。
在一些態樣中，本文揭示方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有無細胞核酸分子；對該等無細胞核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個相關區域的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個相關區域之代表性正常、代表性過度或代表性不足。生物樣本可以包含低於約1010 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約105 至約1010 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約104 至約1010 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約103 至約1010 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約102 至約1010 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約105 至約109 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約105 至約108 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約105 至約107 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約106 至約1011 個無細胞核酸。生物樣本可以包含約106 至約109 個無細胞DNA。生物樣本可以包含約107 至約109 個無細胞核酸。
在一些情況下，代表性過度或代表性不足係來自測試個體之測試樣本中相關區域之代表性與至少一個對照個體中之相關區域之代表性的比較。在一些情況下，對照個體係健康個體。在一些情況下，對照個體不包含相關區域之突變。在一些情況下，對照個體具有相關區域之野生型複本數。在一些情況下，相關區域之表觀遺傳修飾形式存在代表性過度或代表性不足。在一些情況下，代表性過度或代表性不足係測試樣本中相關區域之代表性與至少一個參考樣本中相關區域之代表性的比較。參考樣本可與測試樣本同時分析。參考樣本可在分析測試樣本之前分析。該至少一個參考樣本可以包含複數個參考樣本。在一些情況下，代表性過度或代表性不足係測試樣本中相關區域之代表性與複數個參考樣本中相關區域之平均代表性的比較。
在一些情況下，方法包含分析及偵測對照樣本中之遺傳資訊。在一些情況下，方法包含分析及偵測對照樣本中之遺傳資訊，且替代地使用自對照參考資料獲得的預定對照參考值。當個體在家對其樣本進行分析且無法獲取對照樣本時，此將為特別有用的。然而，通常，該個體亦可容易地獲得對照樣本(例如自親屬、配偶、朋友獲得)。另外，本文所描述之系統及方法能夠藉由對各樣本編索引同時分析多個樣本。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本；對無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於目標序列之測序讀段；量測對應於至少一個非目標序列之測序讀段；以及以大於98%準確性偵測出目標序列中存在異常。該異常可以為不存在於健康個體中之特徵或特性。該異常可以為不存在於野生型個體中之特徵或特性。該異常可以為不存在於對照個體中之特徵或特性。該異常可以為基因突變。該異常可以為複數個基因突變。基因突變描述於本文及通篇中。該異常可以為表觀遺傳修飾。該異常可以為複數個表觀遺傳修飾。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本；對無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標序列之測序讀段；量測對應於至少一個非目標序列之測序讀段；以及相對於野生型複本數量，以大於98%準確性量測目標序列之異常複本數量。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有無細胞核酸；使該等無細胞核酸之至少一部分擴增以產生擴增之核酸；對擴增之核酸進行測序以產生測序讀段；量測測序讀段中對應於至少一個目標序列的第一部分；量測測序讀段中對應於非目標序列之至少一個序列的第二部分；以及當測序讀段之第一部分與測序讀段之第二部分的比率不同於來自對照個體之對照生物樣本中的相應比率時，以大於98%準確性測定目標序列中存在異常。在一些情況下，該等方法包含在擴增之前、期間或之後且在測序之前對無細胞核酸加條形碼或標誌。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有無細胞核酸分子；對該生物樣本中存在之無細胞核酸之至少一部分加條形碼及/或標誌以產生經標誌核酸；對該等經標誌核酸進行測序以產生測序讀段；量測測序讀段中對應於目標序列之第一部分；量測測序讀段中對應於非目標序列之第二部分；以及當測序讀段之第一部分與測序讀段之第二部分的比率不同於來自對照個體之對照生物樣本中的相應比率時，以大於98%準確性測定目標序列中存在異常。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有無細胞核酸；對該等無細胞核酸進行測序以產生測序讀段；量測測序讀段中對應於至少一個目標序列之第一部分；量測測序讀段中對應於至少一個非目標序列之第二部分；以及當測序讀段之第一部分與測序讀段之第二部分的比率不同於來自對照個體之對照生物樣本中的相應比率時，以大於98%準確性測定至少一個目標序列中存在異常。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液包含無細胞核酸；對該等無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本包含一起構成總無細胞核酸的目標無細胞核酸及非目標無細胞核酸，且其中該等目標無細胞核酸佔總無細胞核酸之低於5%；對該等目標無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。一般而言，獲得不包含進行靜脈切開術或由靜脈切開術接收樣本。在一些情況下，生物樣本不包含靜脈血。生物樣本可以包含毛細血管血液。該生物樣本可以基本上由毛細血管血液組成。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子；對該等無細胞核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。該等方法可以包含在測序之前，使該等無細胞核酸分子擴增。該等方法可以包含在測序之前且在擴增之後，標誌該等無細胞核酸分子。該等方法可以包含在測序之前，標誌該等無細胞核酸分子。該等方法可以包含在標誌無細胞核酸分子之後，使該等無細胞核酸分子擴增。該等方法可以包含在標誌無細胞核酸分子之前，使該等無細胞核酸分子擴增。
無創產前測試 ( NIPT )
在一些態樣中，本文揭示方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；對該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。
在一些情況下，代表性過度或代表性不足係相對於至少一個對照懷孕個體中之染色體或染色體區的代表性。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體係懷孕整倍體個體。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體係懷孕非整倍體個體。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體係無染色體異常之懷孕個體。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體係具有至少一個染色體異常之懷孕個體。在一些情況下，該對照懷孕個體懷有整倍體胎兒。在一些情況下，該對照懷孕個體懷有非整倍體胎兒。在一些情況下，該對照懷孕個體懷有無基因異常之胎兒。在一些情況下，該對照懷孕個體懷有含至少一個基因異常之胎兒。在一些情況下，該至少一個對照懷孕個體包含相同地存在或缺乏染色體異常之複數個懷孕個體。
在一些情況下，本文所揭示之方法、裝置、系統及套組利用另外的對照物。在一些情況下，該對照物係預期胎兒是否為整倍體的染色體之代表性。在一些情況下，該對照物係預期胎兒是否為非整倍體的染色體之代表性。在一些情況下，該對照物係預期胎兒是否為整倍體的一定量染色體。在一些情況下，該對照物係預期胎兒是否為非整倍體的一定量染色體。在一些情況下，該對照物係對應於預期胎兒是否為整倍體之染色體的一定量之測序讀段。在一些情況下，該對照物係對應於預期胎兒是否為非整倍體之染色體的一定量之測序讀段。在一些情況下，方法包含分析及偵測對照樣本中之遺傳資訊。在一些情況下，方法包含分析及偵測對照樣本中之遺傳資訊，且替代地使用自對照參考資料獲得的預定對照參考值。當懷孕個體在家對其樣本進行分析且無法獲取對照樣本時，此將為特別有用的。然而，通常，該懷孕個體亦可容易地獲得對照樣本(例如自親屬、配偶、朋友獲得)。另外，本文所描述之系統及方法能夠藉由對各樣本編索引同時分析多個樣本。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；對該等無細胞胎兒核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之測序讀段；以及以大於98%準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；對至少2000個無細胞胎兒核酸進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少1000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少1000個測序讀段；以及以大於98%準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。此等測序讀段之數量係足夠的，即使是在該生物樣本之總無細胞核酸分子中無細胞胎兒核酸分子之百分率較低時亦如此。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；使該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分擴增以產生擴增之核酸；對至少2000個擴增之胎兒核酸進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少1000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少1000個測序讀段；以及當對應於該至少一個目標染色體之測序讀段與對應於該至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體的對照生物樣本中之相應比率時，以大於98%準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該等方法包含在擴增之前、期間或之後且在對至少2000個擴增之胎兒核酸測序之前，對該等核酸加條形碼或進行標誌。在一些情況下，該等核酸係無細胞核酸。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本大致含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；對該生物樣本中存在之無細胞胎兒核酸分子之至少一部分加條形碼及/或進行標誌以產生經標誌核酸；對至少2000個經標誌核酸進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少1000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少1000個測序讀段；以及當對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體的對照生物樣本中之相應比率時，以大於98%之準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該等方法包含在對該至少8000個經標誌核酸進行測序之前，使加條形碼及/或經標誌之核酸擴增。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約1010 個無細胞核酸分子；對至少8000個無細胞核酸分子進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少4000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少4000個測序讀段；以及當對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體的對照生物樣本中之相應比率時，以大於98%準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該等無細胞核酸並非來自血球。在一些情況下，該等無細胞核酸不包含來自血球之核酸。在一些情況下，該等無細胞核酸係來自血球之核酸。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約1010 個無細胞核酸分子；使該等無細胞核酸分子擴增以產生擴增之無細胞核酸；對至少8000個擴增之無細胞核酸分子進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少4000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少4000個測序讀段；以及當對應於該至少一個目標染色體之測序讀段與對應於該至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體的對照生物樣本中之相應比率時，以大於98%準確性測定存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該等方法包含在對該至少8000個擴增之無細胞核酸分子進行測序之前，標誌擴增之無細胞核酸分子。
在一些態樣中，本文描述方法，該等方法包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約1010 個無細胞核酸分子；標誌該等無細胞核酸分子以產生經標誌之無細胞核酸分子；對存在的至少8000個經標誌之無細胞核酸分子進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個目標染色體之至少4000個測序讀段；量測對應於至少一個非目標染色體之至少4000個測序讀段；以及當對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體的對照生物樣本中之相應比率時，以大於98%準確性測定存在具有至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，該等方法包含在對該至少8000個經標誌之無細胞核酸分子測序之前，使該等經標誌之無細胞DNA片段擴增。
獲得樣本
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得本文所描述之生物樣本。可以直接獲得樣本(例如醫生自個體取得血液樣本)。可以間接(例如經由運送、藉由技術員自醫生或個體)獲得樣本。在一些情況下，該生物樣本係生物流體。在一些情況下，該生物樣本係拭子樣本(例如頰拭子、陰道拭子)。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得全血、血漿、血清、尿液、唾液、間質液或陰道液。在一些情況下，本文所揭示之方法包含經由刺破手指獲得血液樣本。在一些情況下，本文所揭示之方法包含經由刺破單一手指獲得血液樣本。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅刺破單一手指獲得血液樣本。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得毛細血管血液(例如自手指或刺破皮膚獲得血液)。在一些情況下，方法包含自刺破處擠壓或擠取血液以獲得所需體積之血液。在其他情況下，方法不包含自刺破處擠壓或擠取血液以獲得所需體積之血液。儘管刺破手指係用於獲得毛細血管血液之常用方法，但身體上之其他位置亦為適合的，例如腳趾、腳跟、臂、掌、肩部、耳垂。在一些情況下，本文所揭示之方法包含不經靜脈切開術即獲得血液樣本。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得毛細血管血液。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得靜脈血。在一些情況下，本文所揭示之方法不包含獲得靜脈血(例如自靜脈獲得血液)。在一些情況下，方法包含經由生物檢體獲得生物樣本。在一些情況下，方法包含經由液體生物檢體獲得生物流體。
在一些情況下，方法包含獲得具有斷裂之核酸的樣本。該樣本可能曾經歷對保留核酸之完整性不利的狀況。作為非限制性實例，該樣本可以為法醫樣本。法醫樣本通常受污染、暴露於空氣、熱、光等。樣本可以為冷凍及解凍的。該樣本可以暴露於降解核酸之化學試劑或酶。在一些情況下，方法包含獲得組織樣本，其中該組織樣本包含斷裂之核酸。在一些情況下，方法包含獲得組織樣本，其中該組織樣本包含核酸；及使該等核酸斷裂以產生斷裂之核酸。在一些實施例中，該組織樣本係冷凍之樣本。在一些情況下，該樣本係保藏之樣本。在一些情況下，該組織樣本係固定之樣本(例如經甲醛固定)。方法可以包含自該樣本分離出(斷裂之)核酸。方法可以包含提供呈溶液形式之斷裂核酸用於基因分析。
在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過50 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過75 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過100 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過125 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過150 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過200 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過300 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過400 µl之生物流體樣本進行。在一些情況下，本文所揭示之方法係用不超過500 µl之生物流體樣本進行。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物流體樣本，其中該超低體積在樣本體積範圍內。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約一毫升。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約900 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約800 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約700 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約600 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約500 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約400 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約300 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約200 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約150 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約100 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約90 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約85 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約80 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約75 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約70 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約65 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約60 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約55 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約5 µl至約50 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約150 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約120 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約100 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約90 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約85 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約80 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約75 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約70 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約65 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約60 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約55 µl。在一些情況下，樣本體積之範圍係約15 µl至約50 µl。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物流體樣本，其中該超低體積係約100 µl至約500 µl。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物流體樣本，其中該超低體積係約100 µl至約1000 µl。在一些情況下，該超低體積係約500 µl至約1 ml。在一些情況下，該超低體積係約500 µl至約2 ml。在一些情況下，該超低體積係約500 µl至約3 ml。在一些情況下，該超低體積係約500 µl至約5 ml。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物樣本，其中該生物樣本係全血。該超低體積可為約1 µl至約250 µl。該超低體積可為約5 µl至約250 µl。該超低體積可為約10 µl至約25 µl。該超低體積可為約10 µl至約35 µl。該超低體積可為約10 µl至約45 µl。該超低體積可為約10 µl至約50 µl。該超低體積可為約10 µl至約60 µl。該超低體積可為約10 µl至約80 µl。該超低體積可為約10 µl至約100 µl。該超低體積可為約10 µl至約120 µl。該超低體積可為約10 µl至約140 µl。該超低體積可為約10 µl至約150 µl。該超低體積可為約10 µl至約160 µl。該超低體積可為約10 µl至約180 µl。該超低體積可為約10 µl至約200 µl。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物樣本，其中該生物樣本係血漿或血清。該超低體積可為約1 µl至約200 µl。該超低體積可為約1 µl至約190 µl。該超低體積可為約1 µl至約180 µl。該超低體積可為約1 µl至約160 µl。該超低體積可為約1 µl至約150 µl。該超低體積可為約1 µl至約140 µl。該超低體積可為約5 µl至約15 µl。該超低體積可為約5 µl至約25 µl。該超低體積可為約5 µl至約35 µl。該超低體積可為約5 µl至約45 µl。該超低體積可為約5 µl至約50 µl。該超低體積可為約5 µl至約60 µl。該超低體積可為約5 µl至約70 µl。該超低體積可為約5 µl至約80 µl。該超低體積可為約5 µl至約90 µl。該超低體積可為約5 µl至約100 µl。該超低體積可為約5 µl至約125 µl。該超低體積可為約5 µl至約150 µl。該超低體積可為約5 µl至約175 µl。該超低體積可為約5 µl至約200 µl。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得超低體積之生物樣本，其中該生物樣本係尿液。一般而言，尿液中DNA之濃度係約40 ng/ml至約200 ng/ml。在一些情況下，尿液之超低體積係約0.25 µl至1 ml。在一些情況下，尿液之超低體積係約0.25 µl至約1 ml。在一些情況下，尿液之超低體積係至少約0.25 µl。在一些情況下，尿液之超低體積係至多約1 ml。在一些情況下，尿液之超低體積係約0.25 µl至約0.5 µl、約0.25 µl至約0.75 µl、約0.25 µl至約1 µl、約0.25 µl至約5 µl、約0.25 µl至約10 µl、約0.25 µl至約50 µl、約0.25 µl至約100 µl、約0.25 µl至約150 µl、約0.25 µl至約200 µl、約0.25 µl至約500 µl、約0.25 µl至約1 ml、約0.5 µl至約0.75 µl、約0.5 µl至約1 µl、約0.5 µl至約5 µl、約0.5 µl至約10 µl、約0.5 µl至約50 µl、約0.5 µl至約100 µl、約0.5 µl至約150 µl、約0.5 µl至約200 µl、約0.5 µl至約500 µl、約0.5 µl至約1 ml、約0.75 µl至約1 µl、約0.75 µl至約5 µl、約0.75 µl至約10 µl、約0.75 µl至約50 µl、約0.75 µl至約100 µl、約0.75 µl至約150 µl、約0.75 µl至約200 µl、約0.75 µl至約500 µl、約0.75 µl至約1 ml、約1 µl至約5 µl、約1 µl至約10 µl、約1 µl至約50 µl、約1 µl至約100 µl、約1 µl至約150 µl、約1 µl至約200 µl、約1 µl至約500 µl、約1 µl至約1 ml、約5 µl至約10 µl、約5 µl至約50 µl、約5 µl至約100 µl、約5 µl至約150 µl、約5 µl至約200 µl、約5 µl至約500 µl、約5 µl至約1 ml、約10 µl至約50 µl、約10 µl至約100 µl、約10 µl至約150 µl、約10 µl至約200 µl、約10 µl至約500 µl、約10 µl至約1 ml、約50 µl至約100 µl、約50 µl至約150 µl、約50 µl至約200 µl、約50 µl至約500 µl、約50 µl至約1 ml、約100 µl至約150 µl、約100 µl至約200 µl、約100 µl至約500 µl、約100 µl至約1 ml、約150 µl至約200 µl、約150 µl至約500 µl、約150 µl至約1 ml、約200 µl至約500 µl、約200 µl至約1 ml，或約500 µl至約1 ml。在一些情況下，尿液之體積係約0.25 µl、約0.5 µl、約0.75 µl、約1 µl、約5 µl、約10 µl、約50 µl、約100 µl、約150 µl、約200 µl、約500 µl或約1 ml。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約5 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約10 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約15 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約20 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約20 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約20 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約20 µL血液，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約20 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約97%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約20 µL至約120 µL血液，以至少約99.5 %置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，生物流體樣本係血漿或血清。血漿或血清構成全血之約55%。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約10 µL血漿或血清，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約10 µL血漿或血清，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約12 µL血漿或血清，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約12 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約12 µL血漿或血清，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含獲得至少約12 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約10 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約10 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約10 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約97%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約10 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，v僅為約10 µL至約60 µL之血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之方法包含僅獲得約10 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約99.5 %置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有一定量無細胞核酸分子。在一些情況下，獲得生物樣本使得生物樣本中之細胞破壞或溶解。因此，在一些情況下，生物樣本包含細胞核酸分子。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之低於約1%。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之低於約5%。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之低於約10%。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之低於約20%。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之超過約50%。在一些情況下，細胞核酸分子構成生物樣本中總細胞核酸分子之低於約90%。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得超低體積之生物流體樣本，其中該生物流體樣本含有超低量之無細胞核酸。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約100 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約150 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約200 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約300 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約400 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約500 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約4 pg至約1 ng之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約100 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約150 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約200 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約300 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約400 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約500 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約10 pg至約1 ng之間。在一些情況下，該超低量係在約20 pg至約100 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約20 pg至約200 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約20 pg至約500 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約20 pg至約1 ng之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約150 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約180 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約200 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約300 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約400 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約500 pg之間。在一些情況下，該超低量係在約30 pg至約1 ng之間。在某一情況下，個體係懷孕個體且無細胞核酸包含無細胞胎兒DNA。在一些情況下，個體具有腫瘤且無細胞核酸包含無細胞腫瘤DNA。在一些情況下，個體係器官移植接受者且無細胞核酸包含器官供體DNA。
在一些情況下，方法包含獲得低於約1 ng無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得低於約500 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得低於約100 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得至少3.5 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得至少10 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得不超過約100 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得不超過約500 pg無細胞胎兒核酸。在一些情況下，方法包含獲得不超過約1 ng無細胞胎兒核酸。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物流體樣本，其中該生物流體樣本含有至少1基因組當量之無細胞DNA。熟習此項技術者應理解，一基因組當量係保證所有基因將存在的需要存在於樣本中之DNA的量。超低體積的本文所揭示之生物流體樣本可以含有超低數量之基因組當量。在一些情況下，生物流體樣本含有低於1基因組當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少5基因組當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少10基因組當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少15基因組當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少20基因組當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有約5至約50基因組當量。在一些情況下，生物流體樣本含有約10至約50基因組當量。在一些情況下，生物流體樣本含有約10至約100基因組當量。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過50基因組當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過60基因組當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過80基因組當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過100基因組當量之無細胞核酸。
超低體積的本文所揭示之生物流體樣本可以含有超低數量之細胞當量。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物流體樣本，其中該生物流體樣本含有至少1細胞當量之無細胞DNA。在一些情況下，生物流體樣本含有至少2細胞當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少5細胞當量的無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有約5細胞當量至約40細胞當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有至少5細胞當量至約100細胞當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過30細胞當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過50細胞當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過80細胞當量之無細胞核酸。在一些情況下，生物流體樣本含有不超過100細胞當量之無細胞核酸。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至少一個所關注無細胞核酸。作為非限制性實例，所關注無細胞核酸可以為無細胞胎兒核酸、無細胞腫瘤DNA或來自移植之器官的DNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約1至約5個無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約1至約15個無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約1至約25個無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約1至約100個無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約5至約100個無細胞核酸。在一些情況下，該至少一個無細胞核酸係由本文所揭示之目標染色體特有的序列表示。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約1010 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約109 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約108 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約107 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約106 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約102 個無細胞核酸至約105 個無細胞核酸。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約1010 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約109 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約108 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約107 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約106 個無細胞核酸。在一些情況下，生物樣本含有約103 個無細胞核酸至約105 個無細胞核酸。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本具有對應於典型樣本類型體積之多個無細胞核酸。作為非限制性實例，來自懷孕個體之4 ml人血液通常含有約1010 個無細胞胎兒核酸。然而，樣本中無細胞胎兒核酸之濃度且因此提供關於胎兒遺傳學之資訊所需的樣本體積將取決於樣本類型。本文提供之實例7亦展現熟習此項技術者如何確定獲得足夠數量無細胞胎兒核酸所需之最小體積。
樣本處理
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自生物樣本分離或純化出無細胞核酸分子。在一些情況下，本文所揭示之方法包含自生物樣本分離或純化出核之無細胞胎兒核酸分子。在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除本文所述之生物樣本中之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含減少生物樣本中不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少95%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少97%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少98%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少99%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少95%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少97%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少98%的不合需要之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含移除生物樣本中至少99%的不合需要之非核酸成分。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含自生物樣本之一或多種非核酸成分分離或純化出核酸。非核酸成分亦可視為不合需要之物質。非核酸成分之非限制性實例包括細胞(例如血球)、細胞片段、細胞外囊泡、脂質、蛋白質或其組合。另外的非核酸成分在本文中及通篇有描述。應注意，儘管方法可以包含分離/純化核酸，但其亦可包含分析在核酸純化步驟中被視為不合需要之物質的樣本中之非核酸成分。分離或純化可以包含移除生物樣本中抑制、干擾或以其他方式不利於後續處理步驟，諸如核酸擴增或偵測的成分。
分離或純化可以用本文所揭示之裝置或系統進行。分離或純化可以在本文所揭示之裝置或系統內進行。分離及/或純化可以使用本文所揭示之樣本純化器進行。在一些情況下，分離或純化核酸包含移除本文所述之生物樣本中之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含丟棄生物樣本中之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含收集、處理及分析該等非核酸成分。在一些情況下，該等非核酸成分由於提供關於該個體之額外信息而可以視為生物標記物。
在一些情況下，分離或純化核酸包含溶解細胞。在一些情況下，分離或純化核酸避免溶解細胞。在一些情況下，分離或純化核酸不包含溶解細胞。在一些情況下，分離或純化核酸不包含意圖溶解細胞之有效步驟。在一些情況下，分離或純化核酸不包含有意地溶解細胞。有意地溶解細胞可以包含以機械方式破壞細胞膜(例如剪切)。有意地溶解細胞可以包含使該細胞與溶解試劑接觸。例示性溶解試劑在本文中有描述。
在一些情況下，分離或純化核酸包含用呈溶液形式之「誘餌(bait)」對目標核酸進行溶解及序列特異性捕捉，隨後使該「誘餌」結合至固體載體，諸如磁性珠粒，例如Legler等人, Specific magnetic bead-based capture of free fetal DNA from maternal plasma, Transfusion and Apheresis Science 40(2009), 153-157。在一些情況下，方法包含在重組酶或解螺旋酶存在下進行序列特異性捕捉。使用重組酶或解螺旋酶可以避免對核酸加熱變性之需求並加速偵測步驟。
在一些情況下，分離或純化包含分離本文所揭示之生物樣本之成分。作為非限制性實例，分離或純化可以包含自血液分離出血漿。在一些情況下，分離或純化包含對生物樣本離心。在一些情況下，分離或純化包含過濾生物樣本，以便分開生物樣本各成分。在一些情況下，分離或純化包含過濾生物樣本以便移除生物樣本中之非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含過濾生物樣本以便捕捉生物樣本中之核酸。
在一些情況下，生物樣本係血液且分離或純化核酸包含自血液獲得或分離血漿。獲得血漿可以包含將血漿與血液樣本中之細胞成分分開。獲得血漿可以包含對血液離心、過濾血液或其組合。獲得血漿可以包含使血液經受重力(例如沈降)。獲得血漿可以包含使血液經歷一種材料之處理，該材料將一部分血液經由毛細作用帶離血液之非核酸成分。在一些情況下，方法包含使血液經歷垂直過濾。在一些情況下，方法包含使血液經歷樣本純化器處理，該樣本純化器包含用於接收全血之過濾基質，該過濾基質的孔徑抑制細胞穿過，而血漿可以不受抑制地穿過過濾基質。已在本文所揭示之裝置中描述此類垂直過濾及過濾基質。
在一些情況下，分離或純化包含使生物樣本或其級分，或其修飾形式經歷結合部分處理。該結合部分能夠結合至生物樣本之成分並將其移除以產生耗竭不合需要或不關注之細胞、細胞片段、核酸或蛋白質的經改質樣本。在一些情況下，分離或純化包含使生物樣本經歷結合部分處理以減少生物樣本中不合需要之物質或非核酸成分。在一些情況下，分離或純化包含使生物樣本經歷結合部分處理以產生富集目標細胞、目標細胞片段、目標核酸或靶蛋白之經改質樣本。作為非限制性實例，分離或純化可以包含使生物樣本經歷結合部分處理以捕捉基於胎盤之血小板，其可能含有胎兒DNA或RNA片段。由此得到的細胞結合之結合部分可以用抗體或其他方法，例如低速離心捕捉/富集。
分離或純化可以包含用結合部分捕捉生物樣本中之細胞外囊泡或細胞外微米顆粒。在一些情況下，細胞外囊泡含有DNA及RNA中之至少一種。在一些情況下，細胞外囊泡係胎兒/胎盤起源的。方法可以包含捕捉來自母體細胞的生物樣本中之細胞外囊泡或細胞外微米顆粒。在一些情況下，本文所揭示之方法包含捕捉並丟棄母體細胞中之細胞外囊泡或細胞外微米顆粒以使樣本富集胎兒/胎盤核酸。
在一些情況下，方法包含捕捉生物樣本中之核小體並分析附接至該核小體之核酸。在一些情況下，方法包含捕捉生物樣本中之胞外體並分析附接至該胞外體之核酸。捕捉核小體及/或胞外體可以排除對溶解步驟或試劑之需求，由此簡化該方法並減少自取樣至偵測之時間。
在一些情況下，方法包含使生物樣本經歷細胞結合部分處理以捕捉基於胎盤之血小板，其可能含有胎兒DNA或RNA片段。捕捉可以包含使基於胎盤之血小板與結合部分(例如針對細胞表面標記物之抗體)接觸、使該生物樣本經歷低速離心或其組合。在一些情況下，該結合部分附接至本文所揭示之固體載體，且方法包含在該結合部分與生物樣本接觸之後，將該固體載體與該生物樣本之其餘部分分開。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除生物樣本中不合需要之非核酸成分。在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除並丟棄生物樣本中之非核酸成分。非核酸成分之非限制性實例包括細胞(例如血球)、細胞片段、細胞外囊泡、脂質、蛋白質或其組合。在一些情況下，移除非核酸成分可以包含對生物樣本離心。在一些情況下，移除非核酸成分可以包含過濾生物流體樣本。在一些情況下，移除非核酸成分可以包含使生物樣本與本文所述之結合部分接觸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含純化出樣本中之核酸。在一些情況下，純化不包含用洗滌緩衝劑洗滌核酸。在一些情況下，該等核酸係無細胞胎兒核酸。在一些實施例中，純化包含用核酸捕捉部分捕捉核酸以產生經捕捉之核酸。核酸捕捉部分之非限制性實例係二氧化矽顆粒及順磁顆粒。在一些實施例中，純化包含使含有經捕捉核酸之樣本穿過疏水相(例如液體或蠟)。疏水相保留樣本中會另外抑制核酸之進一步操作(例如擴增、測序)的雜質。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除本文所述之生物樣本中之核酸成分。在一些情況下，丟棄所移除之核酸成分。作為非限制性實例，方法可以包括僅分析DNA。因此，RNA係不合需要的且對DNA產生不合需要之背景雜訊或污染。在一些情況下，本文所揭示之方法包括移除生物樣本中之RNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包括移除生物樣本中之mRNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包括移除生物樣本中之微小RNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包括移除生物樣本中之母體RNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除生物樣本中之DNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包含移除來自懷孕個體之生物樣本中之母體DNA。在一些情況下，移除核酸成分包括使該等核酸成分與能夠與該核酸雜交之寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸偶聯、附接或結合至捕捉裝置(例如珠粒、管柱、基質、奈米顆粒、磁性顆粒等)。在一些情況下，丟棄所移除之核酸成分。
在一些情況下，移除核酸成分包括在凝膠上根據分子大小分開各核酸成分。舉例而言，循環中之無細胞胎兒DNA片段之長度一般少於200個鹼基對。在一些情況下，本文所揭示之方法包括移除生物樣本中之無細胞DNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包括捕捉生物樣本中之無細胞DNA。在一些情況下，本文所揭示之方法包括選擇生物樣本中之無細胞DNA。在一些情況下，無細胞DNA具有最小長度。在一些情況下，最小長度係約50個鹼基對。在一些情況下，最小長度係約100個鹼基對。在一些情況下，最小長度係約110個鹼基對。在一些情況下，最小長度係約120個鹼基對。在一些情況下，最小長度係約140個鹼基對。在一些情況下，無細胞DNA具有最大長度。在一些情況下，最大長度係約180個鹼基對。在一些情況下，最大長度係約200個鹼基對。在一些情況下，最大長度係約220個鹼基對。在一些情況下，最大長度係約240個鹼基對。在一些情況下，最大長度係約300個鹼基對。基於分子大小之分離適用於具有有限分子大小範圍的其他類別之核酸(例如微小RNA)，其係此項技術中熟知者。
擴增核酸
在一些情況下，本文所揭示之方法包含擴增樣本中至少一個核酸，以產生至少一種擴增產物。該至少一個核酸可以為無細胞核酸。該樣本可以為本文所揭示之生物樣本或其等比例部分或一部分。在一些情況下，方法包括產生樣本中核酸之複本，並擴增該複本，產生至少一種擴增產物。在一些情況下，方法包括產生樣本中核酸之逆轉錄本，並擴增該逆轉錄本，產生至少一種擴增產物。
在一些情況下，方法包含進行全基因組擴增。在一些情況下，方法不包含進行全基因組擴增。術語「全基因組擴增」可以指使生物樣本中之所有無細胞核酸擴增。術語「全基因組擴增」可以指使生物樣本中至少90%之無細胞核酸擴增。全基因組可以指多個基因組。全基因組擴增可以包含使來自個體之生物樣本的無細胞核酸擴增，其中該生物樣本包含來自該個體之無細胞核酸及外來組織。舉例而言，全基因組擴增可以包含使來自個體(宿主基因組)及移植至該個體體內之器官或組織(供體基因組)的無細胞核酸擴增。作為非限制性實例，全基因組擴增亦可使來自懷孕個體之生物樣本的無細胞核酸擴增，其中該生物樣本包含來自該懷孕個體之無細胞核酸及其胎兒。全基因組擴增可以包含使來自患癌症個體之生物樣本的無細胞核酸擴增，其中該生物樣本包含來自該個體之良性組織的無細胞核酸及該個體之腫瘤。全基因組擴增可以包含使來自患有感染之個體之生物樣本的無細胞核酸擴增，其中該生物樣本包含來自該個體之無細胞核酸及病原體。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含使核酸擴增，其中擴增包含進行該核酸之等溫擴增。等溫擴增之非限制性實例如下：環介導之等溫擴增(LAMP)、鏈置換擴增(SDA)、解螺旋酶依賴性擴增(HDA)、缺口酶擴增反應(NEAR)及重組酶聚合酶擴增(RPA)。
預期此項技術中已知之任何適當核酸擴增方法均可用於本文所述之裝置及方法中。在一些情況下，使用等溫擴增。在一些情況下，擴增係等溫的，不過在開始等溫擴增之前進行初始加熱步驟。多種等溫擴增方法，各自具有不同考慮因素並提供不同優勢，係此項技術中已知的且已經論述於文獻中，例如Zanoli及Spoto, 2013, 「Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in Microfluidic Devices」, Biosensors 3: 18-43；及Fakruddin等人, 2013, 「Alternative Methods of Polymerase Chain Reaction (PCR) 」, Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 5(4): 245-252，其各自以全文引用的方式併入本文中。在一些情況下，使用任何適當的等溫擴增方法。在一些情況下，所用等溫擴增方法選自：環介導之等溫擴增(LAMP)；基於核酸序列之擴增(NASBA)；多重置換擴增(MDA)；滾環擴增(RCA)；解螺旋酶依賴性擴增(HDA)；鏈置換擴增(SDA)；缺口酶擴增反應(NEAR)；網狀分枝擴增法(RAM)；以及重組酶聚合酶擴增(RPA)。
在一些情況下，所用擴增方法係LAMP(參見例如Notomi等人, 2000, 「Loop Mediated Isothermal Amplification」, NAR 28(12): e63 i-vii；及美國專利第6,410,278號, 「Process for synthesizing nucleic acid」，其各自以全文引用的方式併入本文中)。LAMP係使用自動循環鏈置換脫氧核糖核酸(DNA)合成之單步擴增系統。在一些情況下，LAMP係在60-65℃下，在熱穩定性聚合酶，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus ，Bst) DNA聚合酶I、三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)、特定引子及目標DNA模板存在下進行45-60分鐘。在一些情況下，模板係RNA且使用具有逆轉錄酶活性及鏈置換型DNA聚合酶活性之聚合酶，例如Bca DNA聚合酶，或將具有逆轉錄酶活性之聚合酶用於逆轉錄酶步驟並將不具有逆轉錄酶活性之聚合酶用於鏈置換DNA合成步驟。
在一些情況下，擴增方法係基於核酸序列之擴增(NASBA)。NASBA(又稱為3SR，及轉錄介導之擴增)係基於等溫轉錄之RNA擴增系統。使用三種酶(禽類骨髓母細胞瘤病毒逆轉錄酶、核糖核酸酶H及T7 DNA依賴性RNA聚合酶)產生單鏈RNA。在某些情況下，可以使用NASBA擴增DNA。擴增反應係在41℃下進行，維持恆定溫度，通常保持約60至約90分鐘(參見例如，Fakruddin等人, 2012, 「Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Prospects and Applications」, Int. J. of Life Science and Pharma Res. 2(1):L106-L121，以引用的方式併入本文中)。
在一些情況下，NASBA反應係在約40℃至約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在41℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在至多約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在約40℃至約41℃、約40℃至約42℃或約41℃至約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在約40℃、約41℃或約42℃下進行。
在一些情況下，擴增方法係鏈置換擴增(SDA)。SDA係使用四種不同引子之等溫擴增方法。將含有限制性位點(HincII核酸外切酶之識別序列)之引子黏接至DNA模板。作為大腸桿菌DNA聚合酶1之核酸外切酶缺陷型片段(外切克列諾片段(exo-Klenow))使引子伸長。每個SDA循環由以下組成：(1)引子結合至置換之目標片段；(2)利用外切克列諾使引子/目標複合物延伸；(3)切刻所得半硫代磷酸酯HincII位點；(4)使HincII自帶切口之位點解離；及(5)延伸該切口並利用外切克列諾置換下游鏈。
在一些情況下，方法包含使樣本中之DNA與解螺旋酶接觸。在一些情況下，擴增方法係解螺旋酶依賴性擴增(HDA)。由於使用解螺旋酶而非加熱使DNA變性，故HDA係等溫反應。
在一些情況下，擴增方法係多重置換擴增(MDA)。MDA係基於使用來自噬菌體Ø29之高加工性鏈置換DNA聚合酶以及經修飾之隨機引子以高保真度擴增完整基因組的等溫、鏈置換方法。其係開發用於自極少量起始物質擴增樣本中之所有DNA。在MDA中，將Ø29 DNA聚合酶與dNTP、隨機六聚體及變性之模板DNA一起在30℃下培育16至18小時且必須使該酶在高溫(65℃)下失活10分鐘。不需要重複再循環，但需要短暫的初始變性步驟、擴增步驟及最終使酶失活。
在一些情況下，擴增方法係滾環擴增(RCA)。RCA係一種等溫核酸擴增方法，該方法允許探針DNA序列在單一溫度，通常約30℃下擴增超過109 倍。利用Ø29 DNA聚合酶進行多輪等溫酶合成，該DNA聚合酶藉由繞圓形DNA探針連續地行進使圓形雜交之引子延伸。在一些情況下，擴增反應係使用RCA，在約28℃至約32℃下進行。
此項技術中可以發現能併入中本文所揭示之裝置及方法中的另外的擴增方法。理想的是，擴增方法係等溫的且相對於傳統PCR而言，較為快速。在一些情況下，擴增包含進行指數擴增反應(EXPAR)，該反應係等溫分子鏈反應，因為一個反應之產物催化產生該等產物之其他反應。在一些情況下，擴增係在核酸內切酶存在下發生。核酸內切酶可以為切口核酸內切酶。參見例如Wu等人, 「Aligner-Mediated Cleavage of Nucleic Acids」, Chemical Science (2018)。在一些情況下，擴增不需要使目標DNA初始加熱變性。參見例如Toley等人, 「Isothermal strand displacement amplification (iSDA): a rapid and sensitive method of nucleic acid amplification for point-of-care diagnosis」, The Analyst (2015)。脈衝控制之擴增係GNA Biosolutions GmbH開發之超速擴增方法。
在一些情況下，方法包含用一對引子進行多個循環之核酸擴增。由於擴增可能在區域之代表性中引入偏差，故擴增循環之數量極為重要。在超低輸入量下，擴增甚至更易於產生偏差且因此在擴增之前增加效率對於高準確性極為重要。並非所有區域均以相同效率擴增且因此總體代表性可能並不均勻，由此會影響分析之準確性。若根本不需要擴增，則通常較少循環係理想的。在一些情況下，方法包含進行低於30個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於25個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於20個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於15個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於12個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於11個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行低於10個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行至少3個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行至少5個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行至少8個循環之擴增。在一些情況下，方法包含進行至少10個循環之擴增。
在一些情況下，擴增反應進行約30至約90分鐘。在一些情況下，擴增反應進行至少約30分鐘。在一些情況下，擴增反應進行至多約90分鐘。在一些情況下，擴增反應進行約30分鐘至約35分鐘、約30分鐘至約40分鐘、約30分鐘至約45分鐘、約30分鐘至約50分鐘、約30分鐘至約55分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約65分鐘、約30分鐘至約70分鐘、約30分鐘至約75分鐘、約30分鐘至約80分鐘、約30分鐘至約90分鐘、約35分鐘至約40分鐘、約35分鐘至約45分鐘、約35分鐘至約50分鐘、約35分鐘至約55分鐘、約35分鐘至約60分鐘、約35分鐘至約65分鐘、約35分鐘至約70分鐘、約35分鐘至約75分鐘、約35分鐘至約80分鐘、約35分鐘至約90分鐘、約40分鐘至約45分鐘、約40分鐘至約50分鐘、約40分鐘至約55分鐘、約40分鐘至約60分鐘、約40分鐘至約65分鐘、約40分鐘至約70分鐘、約40分鐘至約75分鐘、約40分鐘至約80分鐘、約40分鐘至約90分鐘、約45分鐘至約50分鐘、約45分鐘至約55分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約45分鐘至約65分鐘、約45分鐘至約70分鐘、約45分鐘至約75分鐘、約45分鐘至約80分鐘、約45分鐘至約90分鐘、約50分鐘至約55分鐘、約50分鐘至約60分鐘、約50分鐘至約65分鐘、約50分鐘至約70分鐘、約50分鐘至約75分鐘、約50分鐘至約80分鐘、約50分鐘至約90分鐘、約55分鐘至約60分鐘、約55分鐘至約65分鐘、約55分鐘至約70分鐘、約55分鐘至約75分鐘、約55分鐘至約80分鐘、約55分鐘至約90分鐘、約60分鐘至約65分鐘、約60分鐘至約70分鐘、約60分鐘至約75分鐘、約60分鐘至約80分鐘、約60分鐘至約90分鐘、約65分鐘至約70分鐘、約65分鐘至約75分鐘、約65分鐘至約80分鐘、約65分鐘至約90分鐘、約70分鐘至約75分鐘、約70分鐘至約80分鐘、約70分鐘至約90分鐘、約75分鐘至約80分鐘、約75分鐘至約90分鐘、或約80分鐘至約90分鐘。在一些情況下，擴增反應進行約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘、約65分鐘、約70分鐘、約75分鐘、約80分鐘或約90分鐘。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含至少在一種溫度下使核酸擴增。在一些情況下，本文所揭示之方法包含在單一溫度下，使核酸擴增(例如等溫擴增)。在一些情況下，本文所揭示之方法包含使核酸擴增，其中該擴增係在不超過二種溫度下發生。擴增可以在一個步驟或多個步驟中進行。擴增步驟之非限制性實例包括雙鏈變性、引子雜交及引子延伸。
在一些情況下，至少一個擴增步驟係在室溫下進行。在一些情況下，所有擴增步驟均在室溫下進行。在一些情況下，至少一個擴增步驟係在一定溫度範圍下進行。在一些情況下，所有擴增步驟均在一定溫度範圍下進行。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約25℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約35℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約55℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約65℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約25℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約35℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約55℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約65℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約60℃。在一些情況下，該溫度範圍係約25℃至約60℃。在一些情況下，該溫度範圍係約35℃至約60℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約40℃。在一些情況下，該溫度範圍係約-20℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約-20℃至約90℃。在一些情況下，該溫度範圍係約-20℃至約50℃。在一些情況下，該溫度範圍係約-20℃至約40℃。在一些情況下，該溫度範圍係約-20℃至約10℃。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約40℃。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約30℃。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約20℃。在一些情況下，該溫度範圍係約0℃至約10℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約100℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約90℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約80℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約70℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約60℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約50℃。在一些情況下，該溫度範圍係約15℃至約30℃。在一些情況下，該溫度範圍係約10℃至約30℃。在一些情況下，本文所揭示之方法係在室溫下進行，不需要冷卻、冷凍或加熱。在一些情況下，擴增包含使樣本與隨機寡核苷酸引子接觸。在一些情況下，擴增包含使本文所揭示之無細胞核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。在一些情況下，擴增包含使本文所揭示之無細胞胎兒核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。在一些情況下，擴增包含使本文所揭示之經標誌核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。用複數個隨機引子擴增一般引起具有不同序列之多個核酸的非靶向擴增或樣本中大部分核酸之總體擴增。
在一些情況下，擴增包含靶向擴增(例如選擇器方法(描述於US6558928中)、分子倒置探針)。在一些情況下，使核酸擴增包含使核酸與具有對應於目標染色體序列之序列的至少一個引子接觸。例示性染色體序列揭示於本文中。在一些情況下，擴增包含使該核酸與具有對應於非目標染色體序列之序列的至少一個引子接觸。在一些情況下，擴增包含使該核酸與不超過一對引子接觸，其中該對引子中之每個引子包含對應於本文所揭示之目標染色體上之序列的序列。在一些情況下，擴增包含使該核酸與多組引子接觸，其中第一組中第一對之每個引子及第二組中一對引子之每個引子皆不同。
在一些情況下，擴增包含使該樣本與具有對應於本文所揭示之目標染色體上之序列的序列之至少一個引子接觸。在一些情況下，擴增包含使該樣本與具有對應於本文所揭示之非目標染色體上之序列的序列之至少一個引子接觸。在一些情況下，擴增包含使該樣本與不超過一對引子接觸，其中該對引子中之每個引子包含對應於本文所揭示之目標染色體上之序列的序列。在一些情況下，擴增包含使樣本與多組引子接觸，其中第一組中第一對之每個引子及第二組中一對引子之每個引子皆不同。
在一些情況下，擴增包含多路複用(在一個反應中進行複數個核酸之核酸擴增)。在一些情況下，多路複用包含使生物樣本中之核酸與複數個寡核苷酸引子對接觸。在一些情況下，多路複用包含使第一核酸與第二核酸接觸，其中該第一核酸對應於第一序列且該第二核酸對應於第二序列。在一些情況下，該第一序列與該第二序列相同。在一些情況下，該第一序列與該第二序列不同。在一些情況下，擴增不包含多路複用。在一些情況下，擴增不需要多路複用。在某一情況下，擴增包含巢式引子擴增。方法可以包含多個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含單核苷酸多形現象(SNP)。多路複用可以在單一管中進行。在一些情況下，方法包含超過100個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含SNP。在一些情況下，方法包含超過500個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含SNP。在一些情況下，方法包含超過1000個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含SNP。在一些情況下，方法包含超過2000個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含SNP。在一些情況下，方法包含超過300個區域之多路複用PCR，其中每個區域包含SNP。
在一些情況下，方法包含使樣本中之核酸擴增，其中擴增包含使該樣本與至少一個寡核苷酸引子接觸，其中該至少一個寡核苷酸在與該樣本接觸之前不具活性或不可延伸。在一些情況下，擴增包含使該樣本與至少一個寡核苷酸引子接觸，其中該至少一個寡核苷酸引子在暴露於選定之溫度之前不具活性或不可延伸。在一些情況下，擴增包含使該樣本與至少一個寡核苷酸引子接觸，其中該至少一個寡核苷酸引子在與活化試劑接觸之前不具活性或不可延伸。作為非限制性實例，該至少一個寡核苷酸引子可以包含封端基團。使用此類寡核苷酸引子可以使引子二聚體減到最少，允許識別未使用之引子及/或避免由未使用之引子引起的假結果。在一些情況下，擴增包含使該樣本與至少一個寡核苷酸引子接觸，該寡核苷酸引子包含對應於本文所揭示之目標染色體上之序列的序列。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含使用一或多個標籤。使用一或多個標籤可以增加本文所揭示之方法的效率、速度及準確性中之至少一種。在一些情況下，該寡核苷酸引子包含標籤，其中該標籤對目標序列不具特異性。此類標籤可以稱為通用標籤。在一些情況下，方法包含用對目標序列不具特異性之標籤標誌樣本中之目標序列或其片段。在一些情況下，該標籤對人染色體上之序列不具特異性。替代地或另外地，方法包含使該樣本與標籤及包含對應於目標序列之序列的至少一個寡核苷酸引子接觸，其中該標籤不同於該寡核苷酸引子。在一些情況下，標籤係在與目標序列雜交之後併入由寡核苷酸引子延伸產生之擴增產物中。該標籤可以為寡核苷酸、小分子或肽。在一些情況下，該標籤不包含核苷酸。在一些情況下，該標籤不包含寡核苷酸。在一些情況下，該標籤不包含胺基酸。在一些情況下，該標籤不包含肽。在一些情況下，該標籤不具有序列特異性。在一些情況下，該標籤包含不對應於任何特定目標序列之通用序列。在一些情況下，當產生擴增產物時，不管擴增之序列如何，該標籤均係可偵測的。在一些情況下，寡核苷酸引子及標籤中之至少一種包含肽核酸(PNA)。在一些情況下，寡核苷酸引子及標籤中之至少一種包含鎖核酸(LNA)。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含使用複數個標籤，由此增加該方法之準確性、該方法之速度及由該方法獲得之資訊中的至少一種。在一些情況下，本文所揭示之方法包含使用複數個標籤，由此減小獲得可靠結果所需之樣本體積。在一些情況下，該複數個標籤包含至少一個捕捉標籤。在一些情況下，該複數個標籤包含至少一個偵測標籤。在一些情況下，該複數個標籤包含至少一個捕捉標籤及至少一個偵測標籤之組合。捕捉標籤一般用於分離或分開特定序列或區域與其他區域。捕捉標籤之典型實例係生物素(其可以使用例如塗覆抗生蛋白鏈菌素之表面捕捉)。偵測標籤之實例係地高辛(digoxigenin)及螢光標籤。偵測標籤可以直接偵測(例如雷射輻射及/或量測發射之光)或經由攜帶二級偵測系統或與二級偵測系統相互作用之抗體間接偵測，諸如發光分析或酶分析。在一些情況下，該複數個標籤包含至少一個捕捉標籤(用於分離分析物之標籤)及至少一個偵測標籤(用於偵測分析物之標籤)之組合。在某一情況下，單一標籤充當偵測標籤及捕捉標籤。
在一些情況下，方法包含使該樣本中之至少一個循環無細胞核酸與第一標籤及第二標籤接觸，其中該第一標籤包含與循環無細胞核酸之有義鏈互補的第一寡核苷酸，且第二捕捉標籤包含與循環無細胞核酸之反義鏈互補的第二寡核苷酸。在一些情況下，方法包含使該樣本中之至少一個循環無細胞核酸與第一標籤及第二標籤接觸，其中該第一標籤攜帶與該第二標籤相同之標記。在一些情況下，方法包含使該樣本中之至少一個循環無細胞核酸與第一標籤及第二標籤接觸，其中該第一標籤攜帶與該第二標籤不同之標記。在一些情況下，該等標籤係相同的且存在作為偵測之所有探針/區域之聚集物的單一定性或定量信號。在一些情況下，該等標籤係不同的。一個標籤可用於純化且一個標籤可用於偵測。在一些情況下，因為僅需要聚集物信號，所以第一寡核苷酸標籤對一個區域(例如cfDNA片段)具有特異性且攜帶螢光標記，且第二寡核苷酸對相鄰區域具有特異性且攜帶相同螢光標記。在其他情況下，第一寡核苷酸標籤對一個區域(例如cfDNA片段)具有特異性且攜帶螢光標記，且第二寡核苷酸對相鄰區域具有特異性且攜帶不同螢光標記以偵測二個不同區域。
在一些情況下，方法包含偵測擴增產物，其中該擴增產物係藉由使本文所揭示之目標染色體之至少一部分或其片段擴增而產生。該目標染色體之部分或片段可以包含至少5個核苷酸。該目標染色體之部分或片段可以包含至少約10個核苷酸。該目標染色體之部分或片段可以包含至少約15個核苷酸。在一些情況下，偵測本文所揭示之擴增產物不包含標誌或標記該擴增產物。在一些情況下，方法基於量偵測擴增產物。舉例而言，該等方法可以偵測到樣本中雙鏈DNA之量增加。在一些情況下，偵測擴增產物係至少部分基於其大小。在一些情況下，該擴增產物之長度為約50個鹼基對至約500個鹼基對。
在一些情況下，偵測擴增產物包含使該擴增產物與標籤接觸。在一些情況下，該標籤包含與擴增產物之序列互補的序列。在一些情況下，該標籤不包含與擴增產物之序列互補之序列。以上及以下揭示內容描述標籤之非限制性實例。
在一些情況下，偵測擴增產物，無論是標誌抑或未標誌，包含使擴增產物經歷本文所揭示之裝置、系統或套組的信號偵測器或分析總成處理。在一些情況下，方法包含在本文所揭示之裝置、系統或套組之分析總成上進行擴增及偵測。在一些情況下，該分析總成包含擴增試劑。在一些情況下，方法包含將儀器或試劑應用於本文所揭示之分析總成(例如側流分析)以經由側流分析控制生物樣本、溶液或其組合之流動。在一些情況下，該儀器係真空、移液管、泵或其組合。
測序
在一些情況下，本文所揭示之方法包含對核酸進行測序。該核酸可以為本文所揭示之核酸，諸如經標誌核酸、擴增之核酸、無細胞核酸、無細胞胎兒核酸、具有對應於目標染色體之序列的核酸、具有對應於目標染色體之一區域之序列的核酸、具有對應於非目標染色體之序列的核酸或其組合。在一些情況下，核酸係DNA。在一些態樣中，核酸係RNA。在一些情況下，核酸包含DNA。在一些情況下，核酸包含RNA。
在一些情況下，測序包含靶向測序。在一些情況下，測序包含全基因組測序。在一些情況下，測序包含靶向測序及全基因組測序。在一些情況下，全基因組測序包含大規模平行測序，在此項技術中又稱作下一代測序或第二代測序。在一些情況下，全基因組測序包含隨機大規模平行測序。在一些情況下，測序包含針對自全基因組集合庫捕捉之目標區域的隨機大規模平行測序。
在一些情況下，方法包含對本文所揭示的擴增之核酸進行測序。在一些情況下，擴增之核酸係藉由靶向擴增(例如用對所關注目標序列具有特異性之引子)產生。在一些情況下，擴增之核酸係藉由非靶向擴增(例如用隨機寡核苷酸引子)產生。在一些情況下，方法包含對擴增之核酸進行測序，其中該測序包含大規模平行測序。
在一些情況下，方法包含使用演算法進行基因組序列比對。作為非限制性實例，該演算法可以經設計用於識別染色體複本數。該演算法可以經設計用於揭露觀察到的與各種SNP基因座處各相關等位基因有關的序列讀段之數量。該演算法可以使用親本基因型及交叉頻率資料以計算機模擬產生在所量測之基因座處單染色體、雙染色體及三染色體胎兒基因型，接著使用該等基因型預測各基因型之測序資料。使用貝氏模型(Bayesian model)，選擇具有最大可能性之測序資料作為複本數及胎兒部分且該可能性係準確性計算值。可以預期每個SNP之二個可能等位基因各自的不同機率分佈並比較觀察到的等位基因。此描述於Zimmermann等人,Prenat Diagn (2012) 32:1233-1241中。然而，Zimmermann等人咸信，含有低於4.0%胎兒部分之樣本無法提供資訊且需要至少20 ml體積之血液才能得到足夠執行此類型分析之無細胞DNA。相比之下，本申請案之方法可以使用此分析，利用含低於4%胎兒部分之樣本及不需要大致那麼多樣本之樣本。
集合庫製備
在一些情況下，本文所揭示之方法包含修飾生物樣本中之無細胞核酸以產生無細胞核酸集合庫用於偵測。在一些情況下，方法包含修飾無細胞核酸以進行核酸定序。在一些情況下，方法包含修飾無細胞核酸以進行偵測，其中偵測不包含核酸測序。在一些情況下，方法包含修飾無細胞核酸進行偵測，其中偵測包含基於標籤偵測之發生，對經標誌無細胞核酸進行計數。在一些情況下，本文所揭示之方法包含修飾生物樣本中之無細胞核酸以產生無細胞核酸集合庫，其中該方法包含使該無細胞核酸擴增。在一些情況下，修飾係在擴增之前發生。在一些情況下，修飾係在擴增之後發生。
在一些情況下，修飾無細胞核酸包含修復呈核酸片段形式之無細胞核酸的兩端。作為非限制性實例，修復兩端可以包含復原該無細胞核酸之5'磷酸酯基、3'羥基或其組合。在一些情況下，修復包含5'磷酸化、A加尾、空位填充、封閉切口位點或其組合。在一些情況下，修復可以包含移除突出端。在一些情況下，修復可以包含用互補核苷酸填充突出端。
在一些情況下，修飾無細胞核酸以製備集合庫包含使用接頭。該接頭在本文中亦可稱為測序接頭。在一些情況下，該接頭有助於測序。一般而言，該接頭包含寡核苷酸。作為非限制性實例，該接頭可以簡化該方法中之其他步驟，諸如擴增、純化及測序，因為其係在修飾之後樣本中多個(若非全部)無細胞核酸通用之序列。在一些情況下，修飾無細胞核酸包含將接頭連接至無細胞核酸。連接可以包含鈍端連接。在一些情況下，修飾無細胞核酸包含使接頭與核酸雜交。
集合庫製備步驟(例如末端修復、加尾及連接接頭)及擴增之效率可以得益於向樣本或擴增反應中添加擁擠劑。在天然環境(例如細胞中之DNA複製)中進行之酶處理通常係在擁擠環境中進行。此等酶處理中有一部分在擁擠環境中更為有效。舉例而言，擁擠環境可以增強DNA解螺旋酶之活性及DNA聚合酶之敏感性。因此，可以添加擁擠劑以模擬擁擠環境。擁擠劑可以為一種聚合物。擁擠劑可以為一種蛋白質。擁擠劑可以為一種多醣。擁擠劑之非限制性實例係聚乙二醇、葡聚糖及菲科爾(Ficoll)。模擬在活體內擁擠之濃度通常係合乎需要的。舉例而言，4% (40mg/ml) PEG 1kDa提供近似在活體內所發現之擁擠效應。在一些情況下，在擴增反應中擁擠劑之濃度係約2%至約20% w/v。在一些情況下，在擴增反應中擁擠劑之濃度係約2%至約15% w/v。在一些情況下，在擴增反應中擁擠劑之濃度係約2%至約10% w/v。在一些情況下，在擴增反應中擁擠劑之濃度係約2%至約8% w/v。在一些情況下，在擴增反應中擁擠劑之濃度係約3%至約6% w/v。
在一些情況下，修飾無細胞核酸以製備集合庫包含使用標籤。該標籤在本文中亦可稱為條形碼。在一些情況下，本文所揭示之方法包含用對應於所關注染色體區之標籤修飾無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含用對未關注之染色體區具有特異性之標籤修飾無細胞核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含用對應於至少一個所關注染色體區之第一標籤修飾無細胞核酸之第一部分及用對應於至少一個未關注染色體區之第二標籤修飾無細胞核酸之第二部分。在一些情況下，修飾無細胞核酸包含將標籤連接至無細胞核酸。連接可以包含鈍端連接。在一些情況下，修飾無細胞核酸包含使標籤與核酸雜交。在一些情況下，該等標籤包含寡核苷酸。在一些情況下，該等標籤包含可以藉由除核酸分析外之手段偵測的非寡核苷酸標記物或標記。作為非限制性實例，非寡核苷酸標記物或標記可以包含螢光分子、奈米顆粒、染料、肽或其他可偵測/可定量之小分子。
在一些情況下，修飾無細胞核酸以製備集合庫包含使用樣本索引，在本文中又簡稱為索引。作為非限制性實例，該索引可以包含寡核苷酸、小分子、奈米顆粒、肽、螢光分子、染料或其他可偵測/可定量部分。在一些情況下，來自第一生物樣本之第一組無細胞核酸用第一索引標記，且來自第一生物樣本之第一組無細胞核酸用第二索引標記，其中該第一索引與該第二索引不同。因此，當一次性分析多個樣本時，多個索引允許區分來自多個樣本之無細胞核酸。在一些情況下，方法揭示使無細胞核酸擴增，其中用於擴增無細胞核酸之寡核苷酸引子包含索引。
儘管可能在DNA分離及分析之每個步驟發生DNA損失，但最高損失通常出現在集合庫製備步驟中。傳統方法顯示80%至90%之材料損失。通常，此損失係藉由隨後擴增步驟使DNA之濃度達到下一代測序所需之必要水準來補償，但該擴增無法補償在先前步驟期間出現的資訊損失。經歷樣本中80%之初始DNA損失的集合庫可以描述為具有20%效率或0.2之效率的集合庫。在一些情況下，本文所揭示之方法包含以至少約0.2、至少約0.3、至少約0.4、至少約0.5、至少約0.6或至少約0.8之效率獲得集合庫。在一些情況下，本文所揭示之方法包含以至少約0.4之效率製造集合庫。在一些情況下，本文所揭示之方法包含以至少約0.5之效率製造集合庫。以此類效率製造集合庫之方法可以藉由如本文中所描述，使用擁擠劑及修復無細胞DNA片段末端、連接方法、純化方法、循環參數及化學計量比率達成此等效率。
偵測遺傳資訊
一般而言，本文所揭示之方法包含偵測生物標記物、分析物或其修飾形式。在一些情況下，方法包含偵測核酸。在一些情況下，方法包含偵測無細胞核酸。在一些情況下，方法包含偵測核酸之標籤。在一些情況下，方法包含偵測核酸之擴增子。替代地或另外地，方法包含偵測非核酸成分。作為非限制性實例，非核酸成分可選自蛋白質、肽、脂質、脂肪酸、固醇、磷脂、碳水化合物、病毒成分、微生物成分及其組合。在病毒成分或微生物成分之情況下，方法可以包含在偵測之前，釋放、純化及/或擴增來自病毒或細菌之核酸。
偵測可以包含對所關注核酸進行測序。偵測可以包含偵測所關注核酸上之標籤。偵測可以包含偵測所關注生物標記物上之標籤。該生物標記物可以為表觀遺傳修飾。該生物標記物可以為表觀遺傳概況(複數個表觀遺傳修飾)。該生物標記物可以為表觀遺傳修飾之核酸。偵測可以包含亞硫酸氫鹽測序。偵測可以包含進行染色體免疫沈澱(ChIP)分析。偵測可以包含對所關注生物標記物上之標籤進行測序。
如本文中所描述，偵測可以包含擴增。舉例而言，擴增可以包含qPCR，其中信號係基於目標分析物之存在或不存在而產生。在一些情況下，擴增包含PCR。在一些情況下，擴增不包含PCR。在一些情況下，擴增包含滾環擴增(RCA)。在一些情況下，使cfDNA與DNA連接酶及經設計以與cfDNA雜交之探針接觸。在一些情況下，先裂解(例如經歷限制酶處理)cfDNA以產生cfDNA片段並使cfDNA片段與連接酶及探針接觸。該連接酶產生經探針標記之環化cfDNA。視情況，使用主鏈寡核苷酸使cfDNA或cfDNA片段環化。藉由RCA使此等環化片段複製以產生多聯體。該等探針可以用可偵測寡核苷酸(例如螢光)識別並成像。
方法可以包含偵測生物樣本之核酸中的一個基因突變。方法可以包含偵測生物樣本之核酸中的複數個基因突變。方法可以包含偵測生物樣本中複數個核酸各自之基因突變。方法可以包含偵測生物樣本之複數個核酸中之複數個基因突變。
方法可以包含偵測生物樣本中之核酸之表觀遺傳修飾。在一些情況下，偵測表觀遺傳修飾包含進行亞硫酸氫鹽測序。在一些情況下，偵測表觀遺傳修飾包含進行染色體免疫沈澱(ChIP)分析。在一些情況下，表觀遺傳修飾係可遺傳之改變。在一些情況下，表觀遺傳修飾係使細胞能夠影響響應於一或多個環境刺激進行之轉錄的改變。作為非限制性實例，表觀遺傳修飾可以為胞嘧啶或腺嘌呤殘基之甲基化。在一些情況下，表觀遺傳修飾係甲基之缺乏。通常，甲基化促進基因之沉默。表觀遺傳修飾亦包括組蛋白之乙醯化、甲基化、泛素化及磷酸化。表觀遺傳修飾可以促進、抑制、防止或減少生物過程(例如免疫反應、細胞增殖)。方法可以包含偵測生物樣本中之核酸之複數個表觀遺傳修飾。方法可以包含偵測生物樣本中之複數個核酸各自之表觀遺傳修飾。方法可以包含偵測生物樣本中複數個核酸之表觀遺傳修飾。方法可以包含對表觀遺傳修飾進行全基因組分析以鑑別測試樣本與對照/參考樣本之間之差異性甲基化區。
方法可以包含偵測對組織具有特異性之一或多個表觀遺傳修飾。舉例而言，組織具有可以用於追蹤無細胞核酸起源之不同甲基化概況。此可用於確定無細胞核酸起源之處。作為非限制性實例，表觀遺傳修飾可以對腦具有特異性且帶有表觀遺傳修飾之無細胞核酸可以指示神經退化性疾病或腦瘤。若偵測到此類無細胞核酸，則方法可進一步包含對組織進行測試、活組織檢查、成像或處理。方法可以包含偵測僅對二個組織具有特異性之一或多個表觀遺傳修飾。方法可以包含偵測對低於三個組織具有特異性之一或多個表觀遺傳修飾。方法可以包含偵測對低於五個組織具有特異性之一或多個表觀遺傳修飾。
方法可以包含偵測核酸或非核酸成分之可偵測標記或可偵測信號。方法可以包含偵測結合核酸或非核酸成分之結合部分(例如小分子、肽、適體、抗體或其抗原結合片段)之可偵測標記或可偵測信號。作為非限制性實例，可偵測標記或信號可以為螢光分子、生物發光分子、發光分子、放射性信號、磁性信號、電信號或染料。舉例而言，方法可以包含偵測結合部分與所關注蛋白質之間之相互作用。作為非限制性實例，偵測可以包含進行IPCR或PLA。
偵測可以包含觀測展示測試結果的本文所揭示之裝置或系統之介面。參見例如圖 4 及圖 5A - E 。 偵測可以包含觀測側流裝置上之顏色出現或螢光信號。偵測可以包含接收在本文所揭示之裝置上進行之測試的結果。偵測可以包含接收在與本文所揭示之裝置或系統通信之行動裝置、電腦、記事本或其他電子裝置上進行之測試的結果。
一般而言，本文所揭示之方法、套組、系統及裝置能夠在較短時間量內提供遺傳資訊。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約1分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約2分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約5分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約10分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約15分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約20分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約30分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約45分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約60分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約90分鐘內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約2小時內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約3小時內進行。在一些情況下，本文所揭示之方法可在低於約4小時內進行。
在一些情況下，本文所揭示之方法需要極少技術訓練。在一些情況下，本文所揭示之方法不需要任何技術訓練。在一些情況下，本文所揭示之方法僅需要實踐本文所揭示之方法的個體遵循簡單方案轉移及混合樣本及溶液。舉例而言，本文所揭示之方法可由懷孕個體在其家中使用，無需技術員或醫藥提供商之幫助。在一些情況下，本文所揭示之方法可由沒有醫藥訓練或技術訓練之使用者進行。在一些情況下，本文所揭示之方法、套組、系統及裝置僅需要使用者將生物樣本添加至該系統或裝置中並觀測結果以獲得遺傳資訊。
方法可以包含基於該偵測，偵測疾病或病狀之存在。方法可以包含基於該偵測，偵測疾病或病狀之風險。方法可以包含基於該偵測，偵測疾病或病狀之狀態。方法可以包含基於該偵測，監測疾病或病狀之狀態。方法可以包含基於該偵測，投與療法。方法可以包含基於該偵測，改變投與個體之藥物的劑量。方法可以包含基於該偵測，監測個體對療法之反應。舉例而言，疾病可以為癌症且療法可以為化學療法。其他癌症療法包括(但不限於)抗體、抗體-藥物偶聯物、反義分子、工程改造之T細胞及輻射。方法可以包含基於該偵測，進一步測試個體。舉例而言，該疾病可以為癌症且進一步測試可以包括(但不限於)成像(例如CAT-SCAN、PET-SCAN)並進行活組織檢查。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含偵測到存在具有至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，本文所揭示之方法包含當在本文所揭示之樣本中偵測到一定量的測序讀段時，偵測到存在具有該至少一個目標染色體之胎兒非整倍體。在一些情況下，如本文中所描述，測序讀段之數量對應於來自已知在人群中呈現非整倍體之染色體或染色體區域的序列。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含當對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕個體之對照生物樣本中的相應比率時，偵測到存在具有該至少一個目標染色體區之胎兒非整倍體。在一些情況下，本文所揭示之方法包含由於對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕個體之對照生物樣本中的相應比率，故偵測到存在具有該至少一個目標染色體區之胎兒非整倍體。在一些情況下，本文所揭示之方法包含當對應於至少一個目標染色體之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率並非不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕個體之對照生物樣本中的相應比率時，偵測到不存在具有該至少一個目標染色體區之胎兒非整倍體。
在一些情況下，對應於至少一個目標染色體之測序讀段包含對應於至少一個目標染色體之染色體區域的測序讀段。在一些情況下，對應於至少一個非目標染色體之測序讀段包含對應於非目標染色體之染色體區域的測序讀段。在一些情況下，染色體區域係至少約10個鹼基對長度。在一些情況下，染色體區域係至少約20個鹼基對長度。在一些情況下，染色體區域係至少約50個鹼基對長度。
在一些情況下，該至少一個目標染色體區係染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y中之至少一個。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13、染色體18及染色體21中之至少一個。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13、染色體18、染色體21及染色體X中之至少一個。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13、染色體18、染色體21及染色體Y中之至少一個。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13、染色體18、染色體21、染色體X及染色體Y中之至少一個。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體16。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體18。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體21。在一些情況下，該目標染色體係染色體22。在一些情況下，該至少一個目標染色體係性染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體X。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體Y。
在一些情況下，該至少一個非目標染色體係除染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y外之染色體中的至少一個。在一些情況下，該至少一個非目標染色體區不為染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y。在一些情況下，該至少一個非目標染色體選自染色體1、染色體2、染色體3、染色體4、染色體5、染色體6、染色體7、染色體8、染色體9、染色體10、染色體11、染色體12、染色體14、染色體15、染色體17、染色體19及染色體20。在一些情況下，該非目標染色體係染色體1。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體2。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體3。在一些情況下，該非目標染色體係染色體4。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體5。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體6。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體7。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體8。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體9。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體10。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體11。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體12。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體14。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體15。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體17。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體19。在一些情況下，該至少一個非目標染色體係染色體20。
在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體13，且該至少一個非目標染色體係除染色體13外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體16，且該至少一個非目標染色體係除染色體16外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體18，且該至少一個非目標染色體係除染色體18外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體21，且該至少一個非目標染色體係除染色體21外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體22，且該至少一個非目標染色體係除染色體22外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體X，且該至少一個非目標染色體係除染色體X外之染色體。在一些情況下，該至少一個目標染色體係染色體Y，且該至少一個非目標染色體係除染色體Y外之染色體。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含偵測到懷孕個體之胎兒具有基因異常。在一些情況下，該基因異常係由目標染色體區中至少一個核苷酸之插入引起。在一些情況下，該基因異常係由目標染色體區中至少一個核苷酸之缺失引起。在一些情況下，該基因異常係由第一目標染色體區與第二染色體目標區域之間核苷酸之易位引起。一般而言，第一目標染色體區與第二染色體目標區域係位於不同染色體上。
在一些情況下，該目標染色體區係由極小長度界定。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約50個鹼基對長度。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約100個鹼基對長度。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約200個鹼基對長度。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約300個鹼基對長度。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約500個鹼基對長度。在一些情況下，該目標染色體區域係至少約1000個鹼基對長度。
在一些情況下，該目標染色體區係由最大長度界定。在一些情況下，該目標染色體區長達約100,000個鹼基對。在一些情況下，該目標染色體區長達約500,000個鹼基對。在一些情況下，該目標染色體區長達約1,000,000個鹼基對。在一些情況下，該目標染色體區長達約10,000,000個鹼基對。在一些情況下，該目標染色體區長達約100,000,000個鹼基對。在一些情況下，該目標染色體區長達約200,000,000個鹼基對。
在一些情況下，基因異常係複本數變化。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上基因之缺失。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上基因之二倍化複製。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上基因之三倍化複製。在一些情況下，複本數變化包含基因之超過三個複本。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上非蛋白質編碼序列之二倍化複製。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上非編碼區域之三倍化複製。在一些情況下，複本數變化包含至少一個染色體上非編碼區域之二倍化複製。
在一些情況下，基因異常使得至少約0.001%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，基因異常使得至少約0.01%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，基因異常使得至少約0.1%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，基因異常使得至少約1%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，基因異常使得至少約10%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，至少約20%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，至少約30%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，至少約50%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，至少約70%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，至少約90%之染色體臂二倍化複製。在一些情況下，完整染色體臂二倍化複製。
在一些情況下，基因異常使得至少約0.001%之染色體臂缺失。在一些情況下，基因異常使得至少約0.01%之染色體臂缺失。在一些情況下，基因異常使得至少約0.1%之染色體臂缺失。在一些情況下，基因異常使得至少約1%之染色體臂缺失。在一些情況下，基因異常使得至少約10%之染色體臂缺失。在一些情況下，至少約20%之染色體臂缺失。在一些情況下，至少約30%之染色體臂缺失。在一些情況下，至少約50%之染色體臂缺失。在一些情況下，至少約70%之染色體臂缺失。在一些情況下，至少約90%之染色體臂缺失。在一些情況下，整個染色體臂缺失。
在一些情況下，方法包含偵測到，當偵測到對應於目標染色體區之一定量的測序讀段時，胎兒具有基因異常，其中該數量指示基因異常。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含對核酸進行測序。在一些情況下，該等核酸係無細胞核酸。在一些情況下，該等核酸包含無細胞胎兒核酸。在一些情況下，該等核酸係無細胞胎兒核酸。在一些情況下，本文所揭示之方法包含製造至少最少量之測序讀段。在一些情況下，測序讀段之最少量係約100個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約1000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約2000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約3000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約4000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約5000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約6000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約7000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約8000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約9000個。在一些情況下，測序讀段之最少量係約10,000個。
在一些情況下，方法包含當(1)對應於目標染色體區之測序讀段與(2)對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率不同於來自懷有不具基因異常之胎兒之對照懷孕個體的對照生物樣本之相應比率時，偵測到該胎兒具有基因異常。在一些情況下，方法包含由於(1)對應於目標染色體區之測序讀段與(2)對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率不同於來自懷有不具基因異常之胎兒之對照懷孕個體的對照生物樣本之相應比率，偵測到該胎兒具有基因異常。在一些情況下，方法包含當(1)對應於目標染色體區之測序讀段與(2)對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率並非不同於來自懷有不具基因異常之胎兒之對照懷孕個體的對照生物樣本之相應比率時，偵測到該胎兒不具有基因異常。在一些情況下，該染色體區與該非目標染色體區係在同一染色體上。在一些情況下，該染色體區與該非目標染色體區係在不同染色體上。
在一些情況下，以一定程度準確性偵測到遺傳資訊。遺傳資訊之非限制性實例包括胎兒非整倍體、基因異常、腫瘤DNA之存在/數量及移植之器官/組織DNA之存在/數量。在一些情況下，以至少約95%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約96%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約97%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約98%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約99%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約99.5%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約99.9%準確性偵測到遺傳資訊。在一些情況下，以至少約99.99%準確性偵測到遺傳資訊。
來自每個染色體之讀段大致係根據染色體之長度表示。大部分讀段係自染色體1獲得，而來自體染色體之最少讀段將來源於染色體21。用於偵測三染色體樣本之通用方法係量測一組整倍體樣本中源自一染色體之讀段的百分含量。接下來，計算該組染色體百分含量值之平均值及標準差。截止值係藉由平均值加三個標準差來確定。若新樣本具有高於截止值之染色體百分含量值，則可以假定染色體代表性過度，此通常與該染色體之三染色體症相符。偵測染色體之代表性過度的預示性實例呈現於實例13中。
在一些情況下，當(1)對應於至少一個目標染色體之測序讀段與(2)對應於至少一個非目標染色體之測序讀段的比率與來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕個體的對照生物樣本之相應比率相差至少約0.1%時，偵測到胎兒非整倍體。在一些情況下，該等比率相差至少1%。
在一些情況下，該對照懷孕個體係整倍體懷孕個體。在一些情況下，對照係一組懷孕個體之平均值或中值。在一些情況下，對照係來自懷孕個體之一組血漿樣本的平均值或中值。在一些情況下，對照係自模擬懷有整倍體胎兒之懷孕個體的人工核酸混合物以類似方式獲得的值。在一些情況下，對照懷孕個體係懷有具整倍體染色體集合之胎兒的整倍體懷孕個體。在一些情況下，對照懷孕個體不具有基因異常，例如複本數變化。在一些情況下，對照懷孕個體所懷胎兒不具有基因異常，例如複本數變化。在一些情況下，對照懷孕個體在本文所揭示之目標染色體中不具有基因異常。在一些情況下，對照懷孕個體所懷胎兒在本文所揭示之目標染色體中不具有基因異常。在一些情況下，該對照懷孕個體及其胎兒中之至少一個具有非整倍體。在一些情況下，對照懷孕個體及其胎兒中之至少一個具有本文所揭示之基因異常。在一些情況下，對照懷孕個體及其胎兒中之至少一個在本文所揭示之目標染色體中具有基因異常。在一些情況下，本文所揭示之方法包含利用來自對照懷孕群體之對照生物樣本的相應比率。在一些情況下，該相應比率係由對照懷孕群體中之相應平均值比率得到。在一些情況下，該相應比率係由對照懷孕群體之相應中值比率得到。
在一些情況下，本文所揭示之方法使用以下裝置、系統及套組。
II. 裝置、系統及套組
在一些態樣中，本文揭示用於自生物樣本獲得遺傳資訊之裝置、系統及套組。如本文所描述，本文所揭示之裝置、系統及套組允許使用者在所選位置處收集並測試生物樣本以偵測樣本中目標分析物之存在及/或數量。在一些情況下，將本文所揭示之裝置、系統及套組用於前述方法中。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於移除個體之生物樣本中之至少一種成分(例如細胞、細胞片段、蛋白質)的樣本純化器；用於對生物樣本中之至少一種核酸進行測序的核酸測序儀；以及用於將序列資訊傳達給該裝置、系統或套組之使用者的核酸序列輸出裝置。
一般而言，本發明之裝置、系統及套組整合多種功能，例如目標分析物(例如包括其擴增產物)之純化、擴增及偵測，及其組合。在一些情況下，該多種功能係在單一分析總成單元或單一裝置內進行。在一些情況下，所有該等功能係在該單一單元或裝置外進行。在一些情況下，至少一種功能係在該單一單元或裝置外進行。在一些情況下，僅一種功能係在該單一單元或裝置外進行。在一些情況下，樣本純化器、核酸擴增試劑、寡核苷酸及偵測試劑或成分係容納於單一裝置中。一般而言，本發明之裝置、系統及套組包含顯示器、與顯示器之連接或與顯示器之通信，用於將關於該生物樣本之資訊傳達給一或多個人。
在一些情況下，裝置、系統及套組包含本文所揭示之另外的組件。另外的組件之非限制性實例包括樣本運輸隔室、樣本儲存隔室、樣本及/或試劑容器、溫度指示器、電子連接埠、通信連接、通信裝置、樣本收集裝置及外殼單元。在一些情況下，該另外的組件與該裝置形成一體。在一些情況下，該另外的組件未與該裝置形成一體。在一些情況下，該另外的組件係與樣本純化器、核酸擴增試劑、寡核苷酸及偵測試劑或成分一起容納於單一裝置中。在一些情況下，該另外的組件未容納於該單一裝置內。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含獲得樣本、提取無細胞核酸及純化無細胞核酸之組件。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含獲得樣本、提取無細胞核酸、純化無細胞核酸及製備無細胞核酸集合庫之組件。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含獲得樣本、提取無細胞核酸、純化無細胞核酸及對無細胞核酸進行測序之組件。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含獲得樣本、提取無細胞核酸、純化無細胞核酸、製備無細胞核酸集合庫及對無細胞核酸進行測序之組件。作為非限制性實例，用於獲得樣本之組件係穿皮穿刺裝置及用於自血液獲得血漿之過濾器。另外，作為非限制性實例，用於提取及純化無細胞核酸之組件包含緩衝劑、珠粒及磁體。緩衝劑、珠粒及磁體可以適合於接收自刺破手指得到之常用樣本體積(例如50-150 µl血液)的體積供應。
在一些情況下，裝置、系統及套組包含用於接收生物樣本之容器。該容器可以經組態用於保持體積在1 µl與1毫升之間之生物樣本。該容器可以經組態用於保持體積在1 µl與500 µl之間之生物樣本。該容器可以經組態用於保持體積在1 µl與200 µl之間之生物樣本。該容器可以具有限定的體積，該體積與適於裝置/系統組件之其餘部分處理及分析之樣本體積相同。由此將排除對該裝置、系統或套組之使用者量測指定體積之樣本的需求。該使用者只需要填充該容器且由此保證將適當體積之樣本傳遞至該裝置/系統。在一些情況下，裝置、系統及套組不包含用於接收生物樣本之容器。在一些情況下，樣本純化器直接地接收生物樣本。與以上關於該容器之描述類似，樣本純化器可以具有適於裝置/系統組件其餘部分處理及分析的限定之體積。一般而言，本文所揭示之裝置、系統及套組意欲完全在護理點使用。然而，在一些情況下，使用者可能想要保持所分析之樣本或將其發送至另一位置(例如實驗室、診所)以對在護理點獲得的結果進行另外的分析或確認。作為非限制性實例，該裝置/系統可以自血液分離出血漿。可在護理點分析血漿並將血液中之細胞運送至另一位置進行分析。在一些情況下，裝置、系統及套組包含運輸隔室或儲存隔室用於此等目的。運輸隔室或儲存隔室能夠容納生物樣本、其成分或其部分。運輸隔室或儲存隔室能夠在轉運至遠離直接使用者之場所期間容納生物樣本、其部分或其成分。運輸隔室或儲存隔室能夠容納自生物樣本取出之細胞，由此可以將該等細胞傳送至遠離直接使用者之場所進行測試。當直接使用者在家時，遠離直接使用者之場所的非限制性實例可以為實驗室或診所。在一些情況下，家中不具有對生物樣本執行另外的分析之機器或另外的裝置。運輸隔室或儲存隔室能夠容納由將生物樣本添加至該裝置中引起的反應或處理之產物。在一些情況下，該反應或處理之產物係核酸擴增產物或逆轉錄產物。在一些情況下，該反應或處理之產物係結合至本文所述之結合部分的生物樣本成分。該生物樣本成分可以包含核酸、細胞片段、細胞外囊泡、蛋白質、肽、固醇、脂質、維生素或葡萄糖，其中任一種可在遠離使用者之位置進行分析。在一些情況下，運輸隔室或儲存隔室包含吸收墊、紙、玻璃容器、塑膠容器、聚合物基質、液體溶液、凝膠、防腐劑或其組合。吸收墊或紙可用於使含蛋白質或其他生物標記物的乾燥之生物流體穩定並運輸以進行篩選。
在一些情況下，本文所揭示之裝置及系統可分析樣本中之無細胞核酸(例如循環RNA及/或DNA)及非核酸成分。無細胞核酸及非核酸成分之分析均可在需要之位置進行。在一些情況下，系統及裝置可在需要之位置分析無細胞核酸並保存該樣本之至少一部分或成分以在遠離需要位置之場所分析非核酸成分。在一些情況下，系統及裝置可在需要位置分析非核酸成分並保存該樣本之至少一部分或成分以在遠離需要位置之場所分析無細胞核酸。此等裝置及系統可用於攜帶者測試及偵測遺傳性疾病，諸如本文所揭示之疾病。
在一些情況下，運輸隔室或儲存隔室包含防腐劑。該防腐劑亦可在本文中稱作穩定劑或生物穩定劑。在一些情況下，該裝置、系統或套組包含在儲存及/或運輸期間降低酶活性之防腐劑。在一些情況下，該防腐劑係全血防腐劑。全血防腐劑或其成分之非限制性實例係葡萄糖、腺嘌呤、檸檬酸、檸檬酸三鈉、右旋糖、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉。在一些情況下，該防腐劑包含EDTA。EDTA可以減小酶活性，由此將以其他方式降解核酸。在一些情況下，該防腐劑包含甲醛。在一些情況下，該防腐劑係已知之甲醛衍生物。甲醛或其衍生物可以交聯蛋白質且因此使細胞穩定並防止細胞溶解。
一般而言，本文所揭示之裝置及系統係單個人可攜帶的。在一些情況下，裝置及系統係手持式的。在一些情況下，裝置及系統具有最大長度、最大寬度或最大高度。在一些情況下，裝置及系統係容納於具有最大長度、最大寬度或最大高度之單一單元中。在一些情況下，最大長度不超過12吋。在一些情況下，最大長度不超過10吋。在一些情況下，最大長度不超過8吋。在一些情況下，最大長度不超過6吋。在一些情況下，最大寬度不超過12吋。在一些情況下，最大寬度不超過10吋。在一些情況下，最大寬度不超過8吋。在一些情況下，最大寬度不超過6吋。在一些情況下，最大寬度不超過4吋。在一些情況下，最大高度不超過12吋。在一些情況下，最大高度不超過10吋。在一些情況下，最大高度不超過8吋。在一些情況下，最大高度不超過6吋。在一些情況下，最大高度不超過4吋。在一些情況下，最大高度不超過2吋。在一些情況下，最大高度不超過1吋。
樣本收集
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含樣本收集器。在一些情況下，樣本收集器係與該裝置、系統或套組之其餘部分分開地設置。在一些情況下，樣本收集器以物理方式與該裝置、系統或套組或其組件形成一體。在一些情況下，樣本收集器係與本文所述之容器形成一體。在一些情況下，樣本收集器可以為用於施加生物流體之杯、管、毛細管或孔。在一些情況下，樣本收集器可以為用於施加尿液之杯。在一些情況下，樣本收集器可以包含用於將杯中之尿液施加至該裝置、系統或套組的移液管。在一些情況下，樣本收集器可以為與本文所揭示之裝置形成一體之毛細管以施加血液。在一些情況下，樣本收集器可以為與本文所揭示之裝置形成一體的管、孔、墊或紙以施加唾液。在一些情況下，樣本收集器可以為墊或紙以施加汗液。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含穿皮穿刺裝置。穿皮穿刺裝置之非限制性實例係針及刺血針。在一些情況下，該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含微針、微針陣列或微針貼片。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含中空微針。作為非限制性實例，穿皮穿刺裝置與孔或毛細管形成一體以在個體穿刺其手指時，將血液釋放至該孔或毛細管中，在該孔或毛細管中，其將可用於該系統或裝置以分析其成分。在一些情況下，穿皮穿刺裝置係在凹表面中具有針或刺血針之按鈕裝置。在一些情況下，該針係微針。在一些情況下，穿皮穿刺裝置包含微針陣列。藉由按壓該凹表面無針側上之致動器、按鈕或位置，該針以比刺血針更易控制之方式穿刺個體之皮膚。另外，按鈕裝置可以包含真空源或柱塞以幫助自穿刺部位抽取血液。
樣本處理及純化
本文揭示包含樣本處理器之裝置、系統及套組，其中該樣本處理器改質生物樣本以移出該樣本之成分或將樣本分成多個級分(例如血球級分及血漿或血清)。樣本處理器可以包含樣本純化器，其中該樣本純化器經組態用於移除生物樣本中不合需要之物質或非目標成分，由此改質樣本。取決於生物樣本之來源，不合需要之物質可以包括(但不限於)蛋白質(例如抗體、激素、酶、血清白蛋白、脂蛋白)、游離胺基酸及其他代謝物、微小泡囊、核酸、脂質、電解質、尿素、尿膽素、醫藥劑、黏液、細菌及其他微生物，及其組合。在一些情況下，樣本純化器分離本文所揭示之生物樣本之各成分。在一些情況下，本文所揭示之樣本純化器移除樣本中抑制、干擾或以其他方式不利於諸如核酸擴增或偵測之類後續處理步驟的成分。在一些情況下，由此得到的經改質樣本富集目標分析物。此可視為目標分析物之間接富集。替代地或另外地，可以直接地捕捉目標分析物，此視為目標分析物之直接富集。
在一些情況下，樣本純化器包含用於移除生物樣本中除患者細胞外的不合需要之物質的分離材料。有用的分離材料可以包括與該物質結合或締合的特定結合部分。結合可以為共價或非共價的。此項技術中已知用於移除特定物質之任何適合的結合部分均可使用。舉例而言，抗體及其片段常用自樣本移除蛋白質。在一些情況下，本文所揭示之樣本純化器包含結合生物樣本中之核酸、蛋白質、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。在一些情況下，該結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、肽、小分子或其組合。
在一些情況下，本文所揭示之樣本純化器包含過濾器。在一些情況下，本文所揭示之樣本純化器包含膜。一般而言，該過濾器或膜能夠自本文所揭示之生物樣本分離或移除細胞、細胞顆粒、細胞片段、除無細胞核酸外之血液成分或其組合。
在一些情況下，樣本純化器有助於將血漿或血清與自血液樣本之細胞成分分離。在一些情況下，樣本純化器有助於在開始分子擴增反應或測序反應之前，將血漿或血清與血液樣本之細胞成分分離。血漿或血清可以藉由若干不同的方法，諸如離心、沈降或過濾來分離。在一些情況下，樣本純化器包含用於接收全血之過濾基質，該過濾基質之孔徑抑制細胞穿過，而血漿或血清可以不受抑制地穿過過濾基質。在一些情況下，過濾基質將在過濾器頂部處之大孔徑與在其底部處之小孔徑組合，由此在過濾程序期間極溫和地處理細胞，防止細胞降解或溶解。因為細胞降解或溶解將引起核酸自血球或母體細胞釋放而污染無細胞核酸，故此係有利的。此類過濾器之非限制性實例包括Pall VividTM GR膜、Munktell Ahlstrom濾紙(參見例如WO2017017314)、TeraPore過濾器。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組採用由毛細管力驅動之垂直過濾以自樣本分離成分或級分(例如自血液分離血漿)。作為非限制性實例，縱向過濾可以包含重力輔助之血漿分離。高效超疏水血漿分離器描述於例如Liu等人, A High Efficiency Superhydrophobic Plasma Separation, Lab Chip 2015中。
樣本純化器可以包含側向過濾器(例如樣本不沿重力方向移動或樣本垂直於重力方向移動)。樣本純化器可以包含垂直過濾器(例如樣本沿重力方向移動)。樣本純化器可以包含垂直過濾器及側向過濾器。樣本純化器可以經組態用於用垂直過濾器，隨後側向過濾器接收樣本或其部分。樣本純化器可以經組態用於用側向過濾器，隨後垂直過濾器接收樣本或其部分。在一些情況下，垂直過濾器包含過濾基質。在一些情況下，垂直過濾器構成之過濾基質包含孔徑抑制細胞穿過，而血漿可以不受抑制地通過該過濾基質的孔。在一些情況下，過濾基質包含膜，該膜尤其適合於本申請案，因為其將在過濾器頂部處之大孔徑與在其底部處之小孔徑組合，由此在過濾程序期間極溫和地處理細胞，防止細胞降解。
在一些情況下，樣本純化器包含移除生物樣本中不合需要之物質，而不移除無細胞核酸之適當分離材料，例如過濾器或膜。在一些情況下，該分離材料基於大小來分離生物樣本中之物質，例如該分離材料具有排除細胞但無細胞核酸可透過之孔徑。因此，當生物樣本係血液時，血漿或血清可以比血球更快地穿過樣本純化器中之分離材料，且含有任何無細胞核酸之血漿或血清穿透分離材料之孔。在一些情況下，生物樣本係血液，且減慢及/或截留於分離材料中之細胞係紅血球、白血球或血小板。在一些情況下，細胞係來自在體內接觸生物樣本之組織，包括(但不限於)膀胱或泌尿道上皮細胞(在尿液中)或口腔細胞(在唾液中)。在一些情況下，細胞係細菌或其他微生物。
在一些情況下，樣本純化器能夠減慢及/或截留細胞，而不會損害細胞，由此避免細胞內含物之釋放，該等細胞含量包括會干擾隨後無細胞核酸之評價的細胞核酸及其他蛋白質或細胞片段。此可以例如藉由沿側流條帶之路徑逐漸進行性減小孔徑或其他適合的分析形式實現，以允許平緩地減慢細胞移動，並由此使細胞上之力減到最小。在一些情況下，生物樣本中至少95%、至少98%、至少99%或高達100%之細胞在截留於分離材料中時仍保持完整。除大小分離外或與大小分離無關，該分離材料可以基於除大小外之細胞特性截留或分離不合需要之物質，例如該分離材料可以包含結合至細胞表面標記物之結合部分。在一些情況下，該結合部分係抗體或抗原結合抗體片段。在一些情況下，該結合部分係針對血球或微小泡囊上之受體的配體或受體結合蛋白。
在一些情況下，本文所揭示之系統及裝置包含移動、抽取、推動或拉動生物樣本穿過樣本純化器、過濾器及/或膜之分離材料。在一些情況下，該材料係浸潤材料。用於樣本純化器中以移除細胞之適當分離材料的實例包括(但不限於)聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、乙醯纖維素、硝化纖維素、聚碳酸酯、聚對苯二甲酸伸乙酯、聚乙烯、聚丙烯、玻璃纖維、硼矽酸鹽、氯乙烯、銀。適合分離材料可以防止細胞穿過為特徵。在一些情況下，該分離材料不受限制，只要其具有可以防止紅血球穿過之特性即可。在一些情況下，該分離材料係疏水性過濾器，例如玻璃纖維過濾器；複合物過濾器，例如Cytosep(例如Ahlstrom Filtration或Pall Specialty Materials,Port Washington,NY)；或親水性過濾器，例如纖維素(例如Pall Specialty Materials)。在一些情況下，全血可以根據本發明之方法，使用可商購之套組(例如Arrayit Blood Card血清分離套組,目錄號ABCS, Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA)部分分離成紅血球、白血球及血清成分以供進一步處理。
在一些情況下，樣本純化器包含以至少一個孔徑為特徵的至少一個過濾器或至少一個膜。在一些情況下，樣本純化器包含多個過濾器及/或膜，其中至少一第一過濾器或膜之孔徑不同於第二過濾器或膜。在一些情況下，至少一個過濾器/膜之至少一個孔徑係約0.05微米至約10微米。在一些情況下，該孔徑係約0.05微米至約8微米。在一些情況下，該孔徑係約0.05微米至約6微米。在一些情況下，該孔徑係約0.05微米至約4微米。在一些情況下，該孔徑係約0.05微米至約2微米。在一些情況下，該孔徑係約0.05微米至約1微米。在一些情況下，至少一個過濾器/膜之至少一個孔徑係約0.1微米至約10微米。在一些情況下，該孔徑係約0.1微米至約8微米。在一些情況下，該孔徑係約0.1微米至約6微米。在一些情況下，該孔徑係約0.1微米至約4微米。在一些情況下，該孔徑係約0.1微米至約2微米。在一些情況下，該孔徑係約0.1微米至約1微米。
在一些情況下，樣本純化器係以平緩樣本純化器為特徵。平緩樣本純化器，諸如包含過濾基質、垂直過濾器、浸潤材料或具有不允許細胞穿過之孔的膜之樣本純化器，特別適用於分析無細胞核酸。舉例而言，母體血液中無細胞胎兒核酸之產前應用為在無細胞母體核酸存在下分析無細胞胎兒核酸提供另外的難題，該等無細胞母體核酸相較於無細胞胎兒核酸產生較大的背景信號。作為非限制性實例，當獲得樣本，且樣本收集方法未引起細胞溶解或其他細胞破壞時，母體血液樣本可以含有每毫升全血約500至750基因組當量之總無細胞DNA(母體及胎兒無細胞DNA)。自妊娠期婦女取樣之血液中的胎兒部分可以為約10%，約每毫升50至75胎兒基因組當量。獲得無細胞核酸之方法通常涉及自血液獲得血漿。若不小心地進行，則母體白血球可能破壞，將另外的細胞核酸釋放至樣本中，在胎兒無細胞核酸中產生大量背景雜訊。典型白血球計數係每毫升血液約4*10^6至10*10^6個細胞且因此可用核DNA係總體無細胞DNA(cfDNA)之約4,000至10,000倍。因此，即使僅一小部分母體白血球破壞，將核DNA釋放至血漿中，亦使胎兒部分大幅減少。舉例而言，0.01%之白血球降解可以將胎兒部分自10%減小至約5%。本文所揭示之裝置、系統及套組旨在減小此等背景信號。
在一些情況下，樣本處理器經組態用於自全血分離血球。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自全血分離出血漿。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自全血分離出血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於1毫升全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於1毫升全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於500 µL全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於400 µL全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於300 µL全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於200 µL全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於150 µL全血中分離出血漿或血清。在一些情況下，樣本處理器經組態用於自低於100 µL全血中分離出血漿或血清。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於製造耗竭不合需要或未關注之細胞、細胞片段、核酸或蛋白質之經改質樣本的結合部分。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於減少生物樣本中不合需要或未關注之細胞、細胞片段、核酸或蛋白質的結合部分。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於製造富集目標細胞目標細胞片段、目標核酸或目標蛋白質之經改質樣本的結合部分。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含能夠結合核酸、蛋白質、肽、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於捕捉生物樣本中之細胞外囊泡或細胞外微米顆粒的結合部分。在一些情況下，細胞外囊泡含有DNA及RNA中之至少一種。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於分析細胞外囊泡中所含DNA或RNA之試劑或成分。在一些情況下，結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、蛋白質、肽、小分子或其組合。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含能夠與自細胞釋放之細胞外囊泡相互作用或捕捉該細胞外囊泡的結合部分。在一些情況下，細胞係胎兒細胞。在一些情況下，細胞係胎盤細胞。胎兒細胞或胎盤細胞可以為雌性懷孕個體之生物流體(例如血液)中之循環細胞。在一些情況下，細胞外囊泡係自器官、腺體或組織釋放。作為非限制性實例，該器官、腺體或組織可以患病、老化、受感染或生長。器官、腺體及組織之非限制性實例係腦、肝、心臟、腎臟、結腸、胰臟、肌肉、脂肪組織、甲狀腺、前列腺、乳房組織及骨髓。
作為非限制性實例，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠自母體樣本捕捉細胞外囊泡或細胞外微米顆粒並丟棄以使樣本富集胎兒/胎盤核酸。在一些情況下，細胞外囊泡係胎兒/胎盤起源的。在一些情況下，細胞外囊泡來源於胎兒細胞。在一些情況下，細胞外囊泡係由胎兒細胞釋放。在一些情況下，細胞外囊泡係由胎盤細胞釋放。胎盤細胞可以為滋胚層細胞。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於捕捉基於胎盤之血小板的細胞結合部分，該等血小板可能含有胎兒DNA或RNA片段。此等細胞結合部分可以用抗體或其他方法(低速離心)捕捉/富集。在此等情況下，可如本文中所描述，分析胎兒DNA或RNA片段以偵測或指示染色體資訊(例如性別)。替代地或另外地，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於捕捉來自母體細胞之生物樣本中之細胞外囊泡或細胞外微米顆粒的結合部分。
在一些情況下，將該結合部分附接至固體載體，其中在該結合部分與生物樣本接觸之後，該固體載體可以與生物樣本之其餘部分分開或該生物樣本可以與固體載體分開。固體載體之非限制性實例包括珠粒、奈米顆粒、磁性顆粒、晶片、微晶片、纖維帶、聚合物條帶、膜、基質、管柱、板或其組合。
本文所揭示之裝置、系統及套組可以包含細胞溶解試劑。細胞溶解試劑之非限制性實例包括清潔劑，諸如NP-40、十二烷基硫酸鈉及含銨、氯離子或鉀之鹽溶液。本文所揭示之裝置、系統及套組可以具有細胞溶解組件。細胞溶解組件可以為結構或機械組件且能夠溶解細胞。作為非限制性實例，細胞溶解組件可以剪切細胞以釋放細胞內成分，諸如核酸。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組不包含細胞溶解試劑。本文所揭示之一些裝置、系統及套組意圖分析無細胞核酸。
核酸擴增
一般而言，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠使核酸擴增。通常，本文所揭示之裝置、系統及包含DNA聚合酶。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含逆轉錄酶以由本文所揭示之生物樣本中之RNA產生互補DNA(cDNA)，其中該cDNA可以與如本文中所描述之基因組DNA類似之方式擴增及/或分析。本文所揭示之裝置、系統及套組通常亦含有擁擠劑，其可以增加如DNA聚合酶及解螺旋酶之類酶之效率。如本文中別處所描述，擁擠劑可以增加集合庫之效率。擁擠劑可以包含聚合物、蛋白質、多醣或其組合。可用於本文所揭示之裝置、系統及套組中的擁擠劑之非限制性實例係葡聚糖、聚(乙二醇)及葡聚糖。
傳統的聚合酶鏈反應需要熱循環。此將係可能的，但對於沒有熱循環儀之典型在家使用者不便。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠使核酸擴增，無需改變該裝置或系統或其組件之溫度。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠使核酸等溫擴增。等溫擴增之非限制性實例如下：環介導之等溫擴增(LAMP)、鏈置換擴增(SDA)、解螺旋酶依賴性擴增(HDA)、缺口酶擴增反應(NEAR)及重組酶聚合酶擴增(RPA)。因此，本文所揭示之裝置、系統及套組可以包含進行等溫擴增所需之試劑。等溫擴增試劑之非限制性實例包括重組酶聚合酶、單鏈DNA結合蛋白及鏈置換聚合酶。一般而言，使用重組酶聚合酶擴增(RPA)之等溫擴增採用三種核心酶，即重組酶、單鏈DNA結合蛋白及鏈置換聚合酶，以(1)使寡核苷酸引子與DNA中之同源序列配對；(2)使經置換之DNA鏈穩定以防止引子置換；及(3)使用鏈置換DNA聚合酶使寡核苷酸引子延伸。使用成對寡核苷酸引子，指數DNA擴增可以在室溫下(最佳在37℃下)培育時進行。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠在一定溫度下，使核酸等溫擴增。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠在不超過二種溫度下，使核酸擴增。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠在不超過三種溫度下，使核酸擴增。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要起初加熱該裝置、系統或套組之一種試劑或組件。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠在一定溫度範圍下，使核酸擴增。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約20℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約10℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約20℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約10℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約10℃至約30℃。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組，包括其所有組件及其所有試劑，在室溫下完全可操作，無需冷卻、冷凍或加熱。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組之至少一部分在約20℃至約50℃下操作。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組之至少一部分在約37℃下操作。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組之至少一部分在約42℃下操作。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組宜在室溫下操作。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組之至少一部分能夠在約20℃至約30℃下等溫擴增核酸。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組之至少一部分能夠在約23℃至約27℃下等溫擴增核酸。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法包含具有無鹼基位點之雜交探針、螢光團及猝滅劑以監測擴增。可包括核酸外切酶III以裂解無鹼基位點並釋放猝滅劑以允許螢光激發。在一些情況下，藉由將捕捉分子(例如生物素)附接至一個擴增引子並以用於捕捉之5'-抗原分子(例如螢光素衍生物FAM)標記雜交引子以允許偵測，經由側流偵測或監測擴增產物。因此，在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可偵測側流裝置上之核酸及擴增產物。側流裝置在本文中有描述。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含能夠使基因組中之第一序列及基因組中之第二序列擴增的至少一種核酸擴增試劑及至少一個寡核苷酸引子，其中該第一序列與該第二序列類似，且其中該第一序列在物理上足夠遠離該第二序列，使得該第一序列呈現於該個體之第一無細胞核酸上且該第二序列呈現於該個體之第二無細胞核酸上。在一些情況下，該至少兩個序列係緊鄰的。在一些情況下，該至少兩個序列經至少一個核苷酸分開。在一些情況下，該至少兩個序列經藉由至少兩個核苷酸分開。在一些情況下，該至少兩個序列經至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約30個、至少約40個、至少約50個或至少約100個核苷酸分開。在一些情況下，該至少兩個序列至少約50%一致。在一些情況下，該至少兩個序列至少約60%一致、至少約60%一致、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%一致。在一些情況下，第一序列與第二序列各為至少10個核苷酸長度。在一些情況下，第一序列及第二序列各自為至少約10、至少約15個、至少約20個、至少約30個、至少約50個或至少約100個核苷酸長度。在一些情況下，第一序列及第二序列係在同一染色體上。在一些情況下，第一序列係在第一染色體上且第二序列係在第二染色體上。在一些情況下，該第一序列與該第二序列呈現功能連鎖。舉例而言，基因AOX1 之啟動子區域中的CpG位點在前列腺癌中顯示相同的高甲基化，因此，此等位點因其在功能上載運相同資訊但相隔一或多個核苷酸定位而呈現功能連鎖。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含能夠黏接至無細胞核酸鏈的寡核苷酸探針或寡核苷酸引子中之至少一種，其中該無細胞核酸包含對應於所關注區域或其部分之序列。在一些情況下，該所關注區域係Y染色體之區域。在一些情況下，該所關注區域係X染色體之區域。在一些情況下，該所關注區域係體染色體之區域。在一些情況下，該所關注區域或其部分包含存在於基因組中超過一次的如本文中所描述之重複序列。在一些情況下，該所關注區域係約10個核苷酸至約1,000,000個核苷酸長度。在一些實施例中，該所關注區域係至少10個核苷酸長度。在一些實施例中，該所關注區域係至少100個核苷酸長度。在一些實施例中，該區域係至少1000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約10個核苷酸至約500,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約10個核苷酸至約300,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約100個核苷酸至約1,000,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約100個核苷酸至約500,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約100個核苷酸至約300,000個鹼基對長度。在一些情況下，該所關注區域係約1000個核苷酸至約1,000,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約1000個核苷酸至約500,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約1000個核苷酸至約300,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約10,000個核苷酸至約1,000,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約10,000個核苷酸至約500,000個核苷酸長度。在一些情況下，該所關注區域係約10,000個核苷酸至約300,000個核苷酸長度。在一些實施例中，該所關注區域係約300,000個核苷酸長度。
在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約5個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約8個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約10個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約15個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約20個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約50個核苷酸長度。在一些情況下，對應於該所關注區域之序列係至少約100個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約5個核苷酸至約1000個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約10個核苷酸至約1000個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約10個核苷酸至約500個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約10個核苷酸至約400個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約10個核苷酸至約300個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約50個核苷酸至約1000個核苷酸長度。在一些情況下，該序列係約50個核苷酸至約500個核苷酸長度。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含能夠黏接至無細胞核酸鏈的寡核苷酸探針及寡核苷酸引子中之至少一種，其中該無細胞核酸包含對應於本文所揭示之所關注子區之序列。在一些情況下，該子區係由存在於所關注區域中超過一次之序列表示。在一些情況下，該子區係約10至約1000個核苷酸長度。在一些情況下，該子區係約50至約500個核苷酸長度。在一些情況下，該子區係約50至約250個核苷酸長度。在一些情況下，該子區係約50至約150個核苷酸長度。在一些情況下，該子區係約100個核苷酸長度。
預期此項技術中已知之任何適當核酸擴增方法均可用於本文所述之裝置及方法中。在一些情況下，使用等溫擴增。在一些情況下，擴增係等溫的，不過在開始等溫擴增之前進行初始加熱步驟。多種等溫擴增方法，各自具有不同考慮因素並提供不同優勢，係此項技術中已知的且已經論述於文獻中，例如Zanoli及Spoto, 2013, 「Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in Microfluidic Devices」, Biosensors 3: 18-43；及Fakruddin等人, 2013, 「Alternative Methods of Polymerase Chain Reaction (PCR) 」, Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 5(4): 245-252，其各自以全文引用的方式併入本文中。在一些情況下，使用任何適當的等溫擴增方法。在一些情況下，所用等溫擴增方法選自：環介導之等溫擴增(LAMP)；基於核酸序列之擴增(NASBA)；多重置換擴增(MDA)；滾環擴增(RCA)；解螺旋酶依賴性擴增(HDA)；鏈置換擴增(SDA)；缺口酶擴增反應(NEAR)；網狀分枝擴增法(RAM)；以及重組酶聚合酶擴增(RPA)。
在一些情況下，所用擴增方法係LAMP(參見例如Notomi等人, 2000, 「Loop Mediated Isothermal Amplification」 NAR 28(12): e63 i-vii；及美國專利第6,410,278號, 「Process for synthesizing nucleic acid」，其各自以全文引用的方式併入本文中)。LAMP係使用自動循環鏈置換脫氧核糖核酸(DNA)合成之單步擴增系統。在一些情況下，LAMP係在60-65℃下，在熱穩定性聚合酶，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst) DNA聚合酶I、三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)、特定引子及目標DNA模板存在下進行45-60分鐘。在一些情況下，模板係RNA且使用具有逆轉錄酶活性及鏈置換型DNA聚合酶活性之聚合酶，例如Bca DNA聚合酶，或將具有逆轉錄酶活性之聚合酶用於逆轉錄酶步驟並將不具有逆轉錄酶活性之聚合酶用於鏈置換DNA合成步驟。
在一些情況下，擴增反應係使用LAMP，在約55℃至約70℃下進行。在一些情況下，LAMP反應係在55℃或更高溫度下進行。在一些情況下，LAMP反應係在70℃或更低溫度下進行。在一些情況下，LAMP反應係在約55℃至約57℃、約55℃至約59℃、約55℃至約60℃、約55℃至約61℃、約55℃至約62℃、約55℃至約63℃、約55℃至約64℃、約55℃至約65℃、約55℃至約66℃、約55℃至約68℃、約55℃至約70℃、約57℃至約59℃、約57℃至約60℃、約57℃至約61℃、約57℃至約62℃、約57℃至約63℃、約57℃至約64℃、約57℃至約65℃、約57℃至約66℃、約57℃至約68℃、約57℃至約70℃、約59℃至約60℃、約59℃至約61℃、約59℃至約62℃、約59℃至約63℃、約59℃至約64℃、約59℃至約65℃、約59℃至約66℃、約59℃至約68℃、約59℃至約70℃、約60℃至約61℃、約60℃至約62℃、約60℃至約63℃、約60℃至約64℃、約60℃至約65℃、約60℃至約66℃、約60℃至約68℃、約60℃至約70℃、約61℃至約62℃、約61℃至約63℃、約61℃至約64℃、約61℃至約65℃、約61℃至約66℃、約61℃至約68℃、約61℃至約70℃、約62℃至約63℃、約62℃至約64℃、約62℃至約65℃、約62℃至約66℃、約62℃至約68℃、約62℃至約70℃、約63℃至約64℃、約63℃至約65℃、約63℃至約66℃、約63℃至約68℃、約63℃至約70℃、約64℃至約65℃、約64℃至約66℃、約64℃至約68℃、約64℃至約70℃、約65℃至約66℃、約65℃至約68℃、約65℃至約70℃、約66℃至約68℃、約66℃至約70℃，或約68℃至約70℃下進行。在一些情況下，LAMP反應係在約55℃、約57℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約68℃或約70℃下進行。
在一些情況下，擴增反應係使用LAMP進行約30至約90分鐘。在一些情況下，LAMP反應進行至少約30分鐘。在一些情況下，LAMP反應至多約90分鐘。在一些情況下，LAMP反應進行約30分鐘至約35分鐘、約30分鐘至約40分鐘、約30分鐘至約45分鐘、約30分鐘至約50分鐘、約30分鐘至約55分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約65分鐘、約30分鐘至約70分鐘、約30分鐘至約75分鐘、約30分鐘至約80分鐘、約30分鐘至約90分鐘、約35分鐘至約40分鐘、約35分鐘至約45分鐘、約35分鐘至約50分鐘、約35分鐘至約55分鐘、約35分鐘至約60分鐘、約35分鐘至約65分鐘、約35分鐘至約70分鐘、約35分鐘至約75分鐘、約35分鐘至約80分鐘、約35分鐘至約90分鐘、約40分鐘至約45分鐘、約40分鐘至約50分鐘、約40分鐘至約55分鐘、約40分鐘至約60分鐘、約40分鐘至約65分鐘、約40分鐘至約70分鐘、約40分鐘至約75分鐘、約40分鐘至約80分鐘、約40分鐘至約90分鐘、約45分鐘至約50分鐘、約45分鐘至約55分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約45分鐘至約65分鐘、約45分鐘至約70分鐘、約45分鐘至約75分鐘、約45分鐘至約80分鐘、約45分鐘至約90分鐘、約50分鐘至約55分鐘、約50分鐘至約60分鐘、約50分鐘至約65分鐘、約50分鐘至約70分鐘、約50分鐘至約75分鐘、約50分鐘至約80分鐘、約50分鐘至約90分鐘、約55分鐘至約60分鐘、約55分鐘至約65分鐘、約55分鐘至約70分鐘、約55分鐘至約75分鐘、約55分鐘至約80分鐘、約55分鐘至約90分鐘、約60分鐘至約65分鐘、約60分鐘至約70分鐘、約60分鐘至約75分鐘、約60分鐘至約80分鐘、約60分鐘至約90分鐘、約65分鐘至約70分鐘、約65分鐘至約75分鐘、約65分鐘至約80分鐘、約65分鐘至約90分鐘、約70分鐘至約75分鐘、約70分鐘至約80分鐘、約70分鐘至約90分鐘、約75分鐘至約80分鐘、約75分鐘至約90分鐘，或約80分鐘至約90分鐘。在一些情況下，LAMP反應進行約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘、約65分鐘、約70分鐘、約75分鐘、約80分鐘或約90分鐘。
在一些情況下，擴增方法係基於核酸序列之擴增(NASBA)。NASBA(又稱為3SR，及轉錄介導之擴增)係基於等溫轉錄之RNA擴增系統。使用三種酶(禽類骨髓母細胞瘤病毒逆轉錄酶、核糖核酸酶H及T7 DNA依賴性RNA聚合酶)產生單鏈RNA。在某些情況下，可以使用NASBA擴增DNA。擴增反應係在41℃下進行，維持恆定溫度，通常保持約60至約90分鐘(參見例如，Fakruddin等人, 2012, 「Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Prospects and Applications」, Int. J. of Life Science and Pharma Res. 2(1):L106-L121，以引用的方式併入本文中)。
在一些情況下，NASBA反應係在約40℃至約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在41℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在至多約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在約40℃至約41℃、約40℃至約42℃或約41℃至約42℃下進行。在一些情況下，NASBA反應係在約40℃、約41℃或約42℃下進行。
在一些情況下，擴增反應係使用NASBA進行約45至約120分鐘。在一些情況下，NASBA反應進行約30至約120分鐘。在一些情況下，NASBA反應進行至少約30分鐘。在一些情況下，NASBA反應至多約120分鐘。在一些情況下，NASBA反應進行至多180分鐘。在一些情況下，NASBA反應進行約30分鐘至約45分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約65分鐘、約30分鐘至約70分鐘、約30分鐘至約75分鐘、約30分鐘至約80分鐘、約30分鐘至約85分鐘、約30分鐘至約90分鐘、約30分鐘至約95分鐘、約30分鐘至約100分鐘、約30分鐘至約120分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約45分鐘至約65分鐘、約45分鐘至約70分鐘、約45分鐘至約75分鐘、約45分鐘至約80分鐘、約45分鐘至約85分鐘、約45分鐘至約90分鐘、約45分鐘至約95分鐘、約45分鐘至約100分鐘、約45分鐘至約120分鐘、約60分鐘至約65分鐘、約60分鐘至約70分鐘、約60分鐘至約75分鐘、約60分鐘至約80分鐘、約60分鐘至約85分鐘、約60分鐘至約90分鐘、約60分鐘至約95分鐘、約60分鐘至約100分鐘、約60分鐘至約120分鐘、約65分鐘至約70分鐘、約65分鐘至約75分鐘、約65分鐘至約80分鐘、約65分鐘至約85分鐘、約65分鐘至約90分鐘、約65分鐘至約95分鐘、約65分鐘至約100分鐘、約65分鐘至約120分鐘、約70分鐘至約75分鐘、約70分鐘至約80分鐘、約70分鐘至約85分鐘、約70分鐘至約90分鐘、約70分鐘至約95分鐘、約70分鐘至約100分鐘、約70分鐘至約120分鐘、約75分鐘至約80分鐘、約75分鐘至約85分鐘、約75分鐘至約90分鐘、約75分鐘至約95分鐘、約75分鐘至約100分鐘、約75分鐘至約120分鐘、約80分鐘至約85分鐘、約80分鐘至約90分鐘、約80分鐘至約95分鐘、約80分鐘至約100分鐘、約80分鐘至約120分鐘、約85分鐘至約90分鐘、約85分鐘至約95分鐘、約85分鐘至約100分鐘、約85分鐘至約120分鐘、約90分鐘至約95分鐘、約90分鐘至約100分鐘、約90分鐘至約120分鐘、約95分鐘至約100分鐘、約95分鐘至約120分鐘，或約100分鐘至約120分鐘。在一些情況下，NASBA反應進行約30分鐘、約45分鐘、約60分鐘、約65分鐘、約70分鐘、約75分鐘、約80分鐘、約85分鐘、約90分鐘、約95分鐘、約100分鐘、約120分鐘、約150分鐘或約180分鐘。
在一些情況下，擴增方法係鏈置換擴增(SDA)。SDA係使用四種不同引子之等溫擴增方法。將含有限制性位點(HincII核酸外切酶之識別序列)之引子黏接至DNA模板。作為大腸桿菌DNA聚合酶1之核酸外切酶缺陷型片段(外切克列諾片段)使引子伸長。每個SDA循環由以下組成：(1)引子結合至置換之目標片段；(2)利用外切克列諾使引子/目標複合物延伸；(3)切刻所得半硫代磷酸酯HincII位點；(4)使HincII自帶切口之位點解離；及(5)延伸該切口並利用外切克列諾置換下游鏈。
在一些情況下，擴增方法係多重置換擴增(MDA)。MDA係基於使用來自噬菌體Ø29之高加工性鏈置換DNA聚合酶以及經修飾之隨機引子以高保真度擴增完整基因組的等溫、鏈置換方法。其係開發用於自極少量起始物質擴增樣本中之所有DNA。在MDA中，將Ø29 DNA聚合酶與dNTP、隨機六聚體及變性之模板DNA一起在30℃下培育16至18小時且必須使該酶在高溫(65℃)下失活10分鐘。不需要重複再循環，但需要短暫的初始變性步驟、擴增步驟及最終使酶失活。
在一些情況下，擴增方法係滾環擴增(RCA)。RCA係一種等溫核酸擴增方法，該方法允許探針DNA序列在單一溫度，通常約30℃下擴增超過109 倍。利用Ø29 DNA聚合酶進行多輪等溫酶合成，該DNA聚合酶藉由繞圓形DNA探針連續地行進使圓形雜交之引子延伸。在一些情況下，擴增反應係使用RCA，在約28℃至約32℃下進行。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含至少一個寡核苷酸引子，其中該寡核苷酸引子具有與Y染色體序列互補或對應之序列。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含一對寡核苷酸引子，其中該對寡核苷酸引子具有與Y染色體序列互補或對應之序列。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含至少一個寡核苷酸引子，其中該寡核苷酸引子包含與Y染色體序列互補或對應之序列。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含一對寡核苷酸引子，其中該對寡核苷酸引子包含與Y染色體序列互補或對應之序列。在一些情況下，本文所揭示之裝置系統及套組包含至少一個寡核苷酸引子，其中該寡核苷酸引子由與Y染色體序列互補或對應之序列組成。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含一對寡核苷酸引子，其中該對寡核苷酸引子由與Y染色體序列互補或對應之序列組成。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少75%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少80%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少85%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少80%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少90%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少95%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列至少97%同源。在一些情況下，與Y染色體序列互補或對應之序列與野生型人Y染色體序列100%同源。
核酸偵測器
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含核酸偵測器。在一些情況下，核酸偵測器包含核酸測序儀。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組經組態用於使核酸擴增並對所得到的擴增之核酸測序。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組經組態用於對核酸測序，無需使核酸擴增。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含核酸測序儀，但不包含核酸擴增試劑或核酸擴增組件。在一些情況下，核酸測序儀包含信號偵測器，其偵測反映成功擴增或不成功擴增之信號。在一些情況下，核酸測序儀係信號偵測器。在一些情況下，信號偵測器包含核酸測序儀。
在一些情況下，核酸測序儀具有與分析由核酸測序儀得到之測序讀段之電子裝置的通信連接。在一些情況下，該通信連接係硬連線的。在一些情況下，該通信連接係無線的。舉例而言，行動裝置應用程式或電腦軟體，諸如本文所揭示者，可以接收測序讀段，並基於該等測序讀段，展示或報告有關樣本之遺傳資訊(例如疾病/感染之存在、對藥物之反應、胎兒之基因異常或突變)。
在一些情況下，核酸測序儀包含奈米孔測序儀。在一些情況下，該奈米孔測序儀包含奈米孔。在一些情況下，該奈米孔測序儀包含膜及溶液，該等溶液產生跨該膜之電流且驅動帶電分子(例如核酸)移動穿過該奈米孔。在一些情況下，該奈米孔測序儀包含跨膜蛋白、其部分或其修飾形式。在一些情況下，跨膜蛋白係細菌蛋白質。在一些情況下，跨膜蛋白並非細菌蛋白質。在一些情況下，該奈米孔係合成的。在一些情況下，該奈米孔進行固態奈米孔測序。在一些情況下，該奈米孔測序儀描述為口袋大小的、攜帶型或大約蜂巢式電話大小的。在一些情況下，奈米孔測序儀經組態用於對RNA及DNA中之至少一種進行測序。奈米孔測序裝置之非限制性實例包括Oxford Nanopore Technologies MinION及SmidgION奈米孔測序USB裝置。該兩個裝置小到足以供手持。奈米孔測序裝置及組件進一步描述於Howorka(Nat Nanotechnol. 2017年7月6日; 12(7):619-630)及Garrido-Cardenas等人(Sensors(Basel). 2017年3月14日; 17(3))之評述中，兩者以引用的方式併入本文中。奈米孔測序裝置之其他非限制性實例係由Electronic Biosciences、Two Pore Guys、Stratos及Agilent(源自Genia之技術)提供。
在一些情況下，核酸偵測器包含進行亞硫酸氫鹽測序以偵測表觀遺傳修飾所需的試劑及組件。舉例而言，可以使具有許多甲基化標記物之長區域斷裂。此處，攜帶甲基化標記物之每個片段可以為獨立信號。來自所有片段之信號足以組合獲得有用的遺傳資訊。
在一些情況下，核酸偵測器不包含核酸測序儀。在一些情況下，核酸偵測器經組態用於對經標誌核酸計數，其中該核酸偵測器對來自一或多個標籤之集體信號進行定量。
捕捉及偵測
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含核酸偵測器、捕捉組件、信號偵測器偵測試劑或其組合中之至少一種，用於偵測生物樣本中之核酸。在一些情況下，捕捉組件與信號偵測器形成一體。在一些情況下，捕捉組件包含固體載體。在一些情況下固體載體包含珠粒、晶片、條帶、膜、基質、管柱、板或其組合。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含針對染色體或其片段之經表觀遺傳修飾區域的至少一個探針。在一些情況下，染色體之經表觀遺傳修飾區域的表觀遺傳修飾指示性別或為性別標記物。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含針對不存在於母體DNA中的父本遺傳之序列的至少一個探針。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含針對父本遺傳之單核苷酸多形現象的至少一個探針。在一些情況下，染色體係Y染色體。在一些情況下，染色體係X染色體。在一些情況下，染色體係Y染色體。在一些情況下，染色體係體染色體。在一些情況下，該探針包含肽、抗體、抗原結合抗體片段、核酸或小分子。
在一些情況下，裝置、系統及套組包含本文所揭示之樣本純化器及本文所揭示之捕捉組件。在一些情況下，樣本純化器包含捕捉組件。在一些情況下，樣本純化器與捕捉組件形成一體。在一些情況下，樣本純化器與捕捉組件係獨立的。
在一些情況下，捕捉組件包含本文所述之結合部分。在一些情況下，該結合部分存在於側流分析中。在一些情況下，該結合部分係在樣本添加至側流分析之前添加至樣本中。在一些情況下，該結合部分包含信號傳導分子。在一些情況下，該結合部分以物理方式與信號傳導分子締合。在一些情況下，該結合部分能夠以物理方式與信號傳導分子締合。在一些情況下，該結合部分連接至信號傳導分子。信號傳導分子之非限制性實例包括金顆粒、螢光顆粒、發光顆粒及染料分子。在一些情況下，該捕捉組件包含能夠與本文所述之擴增產物相互作用的結合部分。在一些情況下，該捕捉組件包含能夠與本文所述之擴增產物上之標籤相互作用的結合部分。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含偵測系統。在一些情況下，該偵測系統包含信號偵測器。信號偵測器之非限制性實例包括螢光讀取器、色度計、感測器、線、電路、接收器。在一些情況下，該偵測系統包含偵測試劑。偵測試劑之非限制性實例包括螢光團、化學試劑、奈米顆粒、抗體及核酸探針。在一些情況下，該偵測系統包含感測器及互補金屬氧化物半導體，其可以用於偵測pH之變化。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組或方法製造擴增產物將改變pH，由此指示遺傳資訊。
在一些情況下，該偵測系統包含信號偵測器。在一些情況下，該信號偵測器係偵測光子之光偵測器。在一些情況下，該信號偵測器偵測螢光。在一些情況下，該信號偵測器偵測化學試劑或化合物。在一些情況下，該信號偵測器偵測在製造擴增產物時釋放的化學試劑。在一些情況下，該信號偵測器偵測在擴增產物添加至偵測系統中時釋放的化學試劑。在一些情況下，該信號偵測器偵測在製造擴增產物時產生的化合物。在一些情況下，該信號偵測器偵測在擴增產物添加至偵測系統中時產生的化合物。
在一些情況下，該信號偵測器偵測電信號。在一些情況下，該信號偵測器包含電極。在一些情況下，該信號偵測器包含電路、電流或電流產生器。在一些情況下，電路或電流係由兩種或兩種以上溶液或聚合物之梯度提供。在一些情況下，電路或電流係由能量源(例如電池、蜂巢式電話、來自插座之線)提供。在一些情況下，本文所揭示之核酸、擴增產物、化學試劑或化合物藉由破壞電流來提供電信號且信號偵測器偵測該電信號。
在一些情況下，該信號偵測器偵測光。在一些情況下，信號偵測器包含光感測器。在一些情況下，信號偵測器包含攝像機。在一些情況下，信號偵測器包含蜂巢式電話、攝像機或其組件。
在一些情況下，信號偵測器包含偵測核酸中不同鹼基之電荷的奈米線。在一些情況下，奈米線之直徑為約1 nm至約99 nm。在一些情況下，奈米線之直徑為約1 nm至約999 nm。在一些情況下，奈米線包含無機分子，例如鎳、鉑、矽、金、鋅、石墨烯或鈦。在一些情況下，奈米線包含有機分子(例如核苷酸)。
在一些情況下，偵測系統包含分析總成，其中該分析總成能夠偵測目標分析物(例如核酸擴增產物)。在一些情況下，分析總成包含側流條帶，在本文中及本領域中又稱為側流分析、側流測試或側流裝置。在一些情況下，側流分析提供用於偵測本文所揭示之擴增產物的快速、廉價且技術簡單之方法。一般而言，本文所揭示之側流分析包含運輸流體之多孔材料或多孔基質，及當存在擴增產物時偵測該擴增產物的偵測器。多孔材料可以包含多孔紙、聚合物結構、燒結聚合物或其組合。在一些情況下，側流分析運輸生物流體或其部分(例如血液樣本中之血漿)。在一些情況下，側流分析運輸含有生物流體或其部分之溶液。舉例而言，方法可以包含在樣本添加至裝置或系統中之前或期間，將溶液添加至生物流體中。該溶液可以包含鹽、聚合物或有助於樣本及或擴增產物運輸穿過側流分析之任何其他成分。在一些情況下，在核酸行進穿過側流條帶之後，對核酸進行擴增。
在一些情況下，裝置、偵測系統包含側流裝置，其中該側流裝置包含多個區段或區，其中每個所需功能可以存在於獨立區段或區中。一般而言，在側流裝置中，含有目標分析物之液體樣本，例如本文所描述之體液樣本在有或無外部力幫助下移動穿過側流裝置之區段或區。在一些情況下，目標分析物在無外部力幫助下，例如藉由毛細作用移動。在一些情況下，目標分析物在外部力幫助下，例如在側流裝置移動引起之毛細作用促進下移動。移動可包含由外部輸入，例如振盪、翻轉、離心、施加電場或磁場、應用泵、施加真空或搖動側流裝置所引起的任何運動。
在一些情況下，側流裝置係側流測試條帶，其包含側向定位，在彼此後面或前面的區或區段。一般而言，側流測試條帶因每個功能區或區段之大表面積暴露而實現來自(例如上方及下方)測試條帶每一側之功能區或區段的可及性。此有助於試劑之添加，包括樣本純化或目標分析物擴增及/或偵測中使用之試劑。
預期熟習此項技術者已知的任何適合側流測試條帶偵測形式均可用於本發明之分析總成中。側流測試條帶偵測形式係熟知的且已在文獻中描述。側流測試條帶分析形式大體上描述於例如Sharma等人(2015) Biosensors 5:577-601中，其以全文引用的方式併入本文中。使用側流測試條帶夾心分析形式偵測核酸描述於例如美國專利第9,121,849號, 「Lateral Flow Assays」中，其以全文引用的方式併入本文中。使用側流測試條帶競爭性分析形式偵測核酸描述於例如以全文引用的方式併入本文中的美國專利第9,423,399號, 「Lateral Flow Assays Tagged Analytes」中。
在一些情況下，側流測試條帶使用夾心形式、競爭性形式或多路複用偵測形式偵測測試樣本中之目標分析物。在傳統夾心分析形式中，偵測信號與樣本中存在之目標分析物之量成正比，由此目標分析物之量增加導致信號強度增加。在傳統競爭性分析形式中，偵測信號與分析物之存在量呈反比關係，且分析物之量增加導致信號強度減小。
在側流夾心形式，又稱「夾心分析」中，通常將測試樣本施加至在測試條帶一端處的樣本施加墊上。施加之測試樣本自樣本施加墊至鄰近該樣本施加墊定位之偶聯墊流動穿過該測試條帶，其中該偶聯墊在樣本流動方向之下游。在一些情況下，該偶聯墊包含可逆地固定的經標記探針，例如用例如染料、酶或奈米顆粒標記之抗體或適體。若在測試樣本中存在目標分析物，則形成經標記之探針-目標分析物複合物。此複合物接著流動至包含對目標分析物具特異性的經固定之第二探針的第一測試區或區段(例如測試線)，由此截留任何經標記之探針-目標分析物複合物。在一些情況下，使用在第一測試區或區段處之信號，例如顏色之強度或幅值指示測試樣本中目標分析物之存在或不存在、數量或存在及數量。第二測試區或區段可包含結合至過量經標記探針之第三探針。若施加之測試樣本包含目標分析物，則在經標記探針將目標分析物捕捉於偶聯墊上之後，在測試條帶上將存在極少或不存在過量經標記探針。因此，第二測試區或區段將不結合任何經標記探針，且預期在第二測試區或區段處將觀察到極少或觀察低於信號(例如顏色)。因此，在第二測試區或區段處不存在信號可以確保在第一測試區或區段中觀察到的信號係由目標分析物之存在引起。
在一些情況下，本文所揭示之裝置及系統包含夾心分析。在一些情況下，夾心分析經組態用於接收本文所揭示之生物樣本並保留樣本成分(例如核酸、細胞、微米顆粒)。在一些情況下，夾心分析經組態用於接收流動溶液，該流動溶液沖洗生物樣本中之非核酸成分(例如蛋白質、細胞、微米顆粒)，留下生物樣本中之核酸。在一些情況下，夾心分析包含結合核酸以在施加流動溶液時幫助保持該等核酸的膜。結合核酸之膜的非限制性實例包括殼聚糖修飾之硝化纖維素。
類似地，在側流競爭性形式中，將測試樣本施加至在測試條帶一端處之樣本施加墊上，且目標分析物結合至經標記探針以在樣本施加墊之偶聯墊下游形成探針-目標分析物複合物。在競爭性形式中，第一測試區或區段通常包含目標分析物或目標分析物之類似物。第一測試區或區段中之目標分析物結合未結合至該偶聯墊中之測試分析物的任何游離的經標記探針。因此，在施加之測試樣本中不存在目標分析物時在第一測試區或區段中觀察到的信號之量高於存在目標分析物時的信號量。第二測試區或區段包含特異性結合至該探針-目標分析物複合物之探針。當施加之測試樣本中存在目標分析物時，在此第二測試區或區段中觀察到的信號之量較高。
在側流測試條帶多路複用偵測形式中，使用測試條帶，藉由使用包含例如對多於一種目標分析物分別具有特異性之探針的另外的測試區或區段偵測該等目標分析物。
在一些情況下，側流裝置係層狀側流裝置，其包含以向中間，例如相互上下分層定位存在之區或區段。在一些情況下，在給定層中存在一或多個區或區段。在一些情況下，各區或區段存在於個別層中。在一些情況下，一層包含多個區或區段。在一些情況下，該等層係層壓的。在層狀側流裝置中，藉由擴散控制且藉由濃度梯度驅動之程序係可能的驅動力。舉例而言，用於樣本液體中所含分析物之螢光分析或螢光定量分析的多層分析元件描述於以引用的方式併入本文中的EP0097952, 「Multilayer analytical element」中。
側流裝置可包含一或多個功能區或區段。在一些情況下，測試總成包含1至20個功能區或區段。在一些情況下，功能區或區段包含至少一個樣本純化區或區段、至少一個目標分析物擴增區或區段、至少一個目標分析物偵測區或區段及至少一個目標分析物偵測區或區段。
在一些情況下，目標分析物係核酸序列，且側流裝置係核酸側流分析。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含核酸側流分析，其中該核酸側流分析包含核酸擴增功能。在一些情況下，藉由核酸擴增功能進行之目標核酸擴增係在偵測擴增之核酸物種之前或同時發生。在一些情況下，偵測包含定性、半定量或定量偵測目標分析物之存在中之一或多種。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含分析總成，其中使目標核酸分析物在側流測試條帶中擴增以產生經標記擴增產物，或在擴增之後標記之擴增產物。在一些情況下，標記存在於一或多個擴增引子上，或在擴增之後，隨後結合至一或多個擴增引子。在一些情況下，在側流測試條帶上偵測到至少一種目標核酸擴增產物。舉例而言，側流測試條帶上之一或多個區或區段可以包含對目標核酸擴增產物具有特異性之探針。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含偵測器，其中該偵測器包含石墨烯生物感測器。石墨烯生物感測器描述於例如Afsahi等人之題為「Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection, Biosensor and Bioelectronics」, (2018) 100:85-88之文章中。
在一些情況下，本文所揭示之偵測器包含奈米孔、奈米感測器或奈米開關。舉例而言，偵測器能夠進行奈米孔測序，該方法基於跨膜電流運輸核酸穿過奈米孔，該偵測器量測對應於特定核苷酸之電流的破壞。奈米開關或奈米感測器在暴露於可偵測信號時經歷結構變化。參見例如Koussa等人, 「DNA nanoswitches: A quantitative platform for gel-based biomolecular interaction analysis」, (2015) Nature Methods, 12(2): 123-126。
在一些情況下，偵測器包含快速多路複用生物標記物分析，其中在晶片上製造針對所關注分析物之探針用於即時偵測。因此，無需標籤、標記或報告子。分析物結合至此等探針引起應於分析物濃度之折射率的變化。所有步驟皆可為自動的。培育可能並非必需的。結果可以在低於一小時(例如10-30分鐘)內得到。此類偵測器之非限制性實例係Genalyte Maverick偵測系統。
另外的測試
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於偵測或分析除核酸外之生物成分的另外的特徵、試劑、測試或分析。作為非限制性實例，生物成分可選自肽、脂質、脂肪酸、固醇、碳水化合物、病毒成分、微生物成分及其組合。該生物成分可以為抗體。該生物成分可以為響應於該個體體內之肽而產生之抗體。此等另外的分析能夠以本文及通篇所揭示之小體積或樣本規模偵測或分析生物成分。另外的測試可以包含能夠與所關注生物成分相互作用之試劑。此類試劑之非限制性實例包括抗體、肽、寡核苷酸、適體及小分子，及其組合。該試劑可以包含可偵測標記。該試劑能夠與可偵測標記相互作用。該試劑能夠提供可偵測信號。
另外的測試可能需要一或多種抗體。舉例而言，該另外的測試可以包含用於進行免疫PCR(IPCR)之試劑或組件。IPCR係這樣一種方法，其中將針對所關注蛋白質之第一抗體固定並暴露於樣本。若該樣本含有所關注蛋白質，則其將由第一抗體捕捉。接著，使捕捉的所關注蛋白質暴露於結合該所關注蛋白質之第二抗體。該第二抗體已偶合至可以藉由即時PCR偵測的聚核苷酸。替代地或另外地，該另外的測試可以包含用於進行鄰近連接分析(PLA)之試劑或組件，其中使樣本暴露於二種對所關注蛋白質具有特異性之抗體，各抗體包含一個寡核苷酸。若兩種抗體均結合至所關注蛋白質，則各抗體之寡核苷酸將足夠接近以進行擴增及/或偵測。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含妊娠測試，用以確定個體懷孕。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含有關Y染色體之存在或Y染色體之不存在的測試(性別測試)。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含有關孕齡之測試。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含有關多胎妊娠，例如雙胞胎或三胞胎之測試。在一些情況下，本文所揭示之方法對母體樣本中胎兒核酸之總量以及由各種常染色體、X及Y染色體代表性之序列之量進行定量(絕對定量或相對定量)，以偵測一個、兩個或所有胎兒係雄性抑或雌性、整倍體抑或非整倍體等。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含妊娠測試，用於指示、偵測或驗證個體懷孕。在一些情況下，妊娠測試包含用於量測妊娠相關因子之試劑或組件。作為非限制性實例，妊娠相關因子可以為人絨毛膜促性腺激素蛋白質(hCG)且針對hCG之試劑或組件包含抗hCG抗體。另外，作為非限制性實例，妊娠相關因子可以為hCG轉錄本且用於量測hCG轉錄本之試劑或組件係與hCG轉錄本雜交之寡核苷酸探針或引子。在一些情況下，妊娠相關因子係熱休克蛋白10 kDa蛋白質1，又稱為早期妊娠因子(EPF)。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠傳達胎兒之年齡。舉例而言，信號可以由該裝置或系統產生，其中信號水準對應於來自個體之樣本中hCG之量。此信號水準或強度可以轉化成表示樣本中hCG之量的數字值或用該數字值陳述。hCG之量可以指示胎兒之近似年齡。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組提供對妊娠之指示或驗證、對孕齡之指示或驗證及對性別之指示或驗證。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組以至少約90%置信度(例如90%之時間，該指示係準確的)提供對妊娠、孕齡及/或性別之指示。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組以至少約95%置信度提供對妊娠、孕齡及/或性別之指示。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組以至少約99%置信度提供對妊娠、孕齡及/或性別之指示。
效能參數
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組係在一或多種溫度下可操作的。在一些情況下，為了使該裝置、系統或套組可操作，需要改變該裝置、系統或套組之組件或試劑之溫度。一般而言，當裝置、系統及套組能夠提供由生物樣本中之生物標記物(例如RNA/DNA、肽)傳達之資訊時，認為其係「可操作」的。在一些情況下，使該裝置、系統、套組、其組件或其試劑可操作的溫度係在普通家庭中達到。作為非限制性實例，在普通家庭中達到的溫度可以由室溫、冰箱、冷凍器、微波、爐子、電熱罐、熱水/冷水浴液或烘箱提供。
在一些情況下，本文所描述之裝置、系統、套組、其組件或其試劑在單一溫度下係可操作的。在一些情況下，本文所描述之裝置、系統、套組、其組件或其試劑只需單一溫度即可操作。在一些情況下，本文所描述之裝置、系統、套組、其組件或其試劑只需二種溫度即可操作。在一些情況下，本文所描述之裝置、系統、套組、其組件或其試劑只需三種溫度即可操作。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統套組包含允許使用者獲得至少一種溫度的加熱裝置或冷卻裝置。加熱裝置及冷卻裝置之非限制性實例係由材料構成之小袋或袋子，該材料可以在冰箱或冷凍器中冷卻，或經微波處理，或在爐子頂部上煮沸，或插入電插座中，且隨後施加至本文所揭示之裝置或其組件，由此將熱傳輸至該裝置或其組件，或冷卻該裝置或其組件。加熱裝置之另一非限制性實例係延伸穿過該裝置或其部分之電線或盤管。該電線或盤管可以由外部(例如太陽能、電源插座)或內部(例如電池、蜂巢式電話)電力活化以將熱傳送至該裝置或其部分。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組包含溫度計或溫度指示器，用以幫助使用者評估在一定溫度範圍內之溫度。替代地或另外地，使用者在典型家庭環境中採用裝置(例如溫度計、蜂巢式電話等)評估該溫度。
在一些情況下，使該裝置、系統、套組、其組件或其試劑在可操作之溫度係在一定溫度範圍內或在一定溫度範圍內之至少一種溫度。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約20℃。在一些情況下，溫度範圍係約-50℃至約10℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約20℃。在一些情況下，溫度範圍係約0℃至約10℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約100℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約90℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約80℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約70℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約60℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約50℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約40℃。在一些情況下，溫度範圍係約15℃至約30℃。在一些情況下，溫度範圍係約10℃至約30℃。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組，包括其所有組件及其所有試劑，在室溫下完全可操作，無需冷卻、冷凍或加熱。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組在接收生物樣本之一定時間範圍內偵測生物樣本之成分或其產物(例如擴增產物、偶聯產物、結合產物)。在一些情況下，偵測係經由本文所述之信號傳導分子進行。在一些情況下，該時間範圍係約一秒至約一分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約十秒至約一分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約十秒至約一分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約三十秒至約一分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約2分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約3分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約5分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約10分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約15分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約10秒至約20分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約2分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約5分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約10分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約15分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約20分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30秒至約30分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約2分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約3分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約5分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約10分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約20分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約1分鐘至約30分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約5分鐘至約10分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約5分鐘至約15分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約5分鐘至約20分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約5分鐘至約30分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約5分鐘至約60分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30分鐘至約60分鐘。在一些情況下，該時間範圍係約30分鐘至約2小時。在一些情況下，該時間範圍係約1小時至約2小時。在一些情況下，該時間範圍係約1小時至約4小時。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組在少於給定時間量內偵測生物樣本之成分或其產物(例如擴增產物、偶聯產物、結合產物)。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組在少於給定時間量內提供對生物樣本之成分或其產物之分析。在一些情況下，該時間量低於1分鐘。在一些情況下，該時間量低於5分鐘。在一些情況下，該時間量低於10分鐘。在一些情況下，該時間量係15分鐘。在一些情況下，該時間量低於20分鐘。在一些情況下，該時間量低於30分鐘。在一些情況下，該時間量低於60分鐘。在一些情況下，該時間量低於2小時。在一些情況下，該時間量低於8小時。
通信及資訊儲存
一般而言，本文所揭示之裝置、系統及套組包含核酸資訊輸出裝置。該核酸資訊輸出裝置經組態用於將由樣本得到的遺傳資訊傳達給使用者。在一些情況下，核酸資訊輸出裝置包含通信連接或介面，由此可以將所獲得的遺傳資訊與不在現場的其他人(例如家族成員、醫師或遺傳諮詢師)共享。該通信連接或介面亦可允許來自其他來源之輸入。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於接收以所得遺傳資訊為主之資訊的介面。該介面或通信連接亦可自使用者接收非遺傳資訊(例如病史、醫學病狀、年齡、體重、心跳速率、血壓、身體活動等)。該介面或通信連接亦可接收由除使用者外之某人或某物所提供的資訊。作為非限制性實例，此包括基於網站之資訊、自醫療人員得到的資訊及自保險公司得到的資訊。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含用於基於所得遺傳資訊來傳達資訊的介面。在一些情況下，該介面提供對基因或染色體異常之說明。在一些情況下，該介面提供當地聯繫人之清單，諸如醫生、支持團體、商店、及提供服務者，由此支持具有基因或染色體異常之子女的家庭。在一些情況下，該介面提供產品或服務之連線清單，適用於具有基因或染色體異常之子女。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含資訊儲存單元，例如電腦晶片。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含安全地儲存遺傳資訊之構件。舉例而言，本文所揭示之裝置、系統及套組可以包含數據晶片或與硬碟機、伺服器、數據庫或雲端之連接(有線或無線連接)。用於本文所揭示之裝置及系統之介面的非限制性實例顯示於圖 4B 及圖 5A - E 中。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠以安全方式收集、加密及/或儲存來自使用者之資訊。此類資訊之非限制性實例包括健康資訊、來自可穿戴式裝置的資訊、已執行或將要執行之其他測試、人口統計資訊等。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠將有關生物樣本中生物標記物之資訊傳達至通信裝置。在一些情況下，通信裝置能夠連接至網際網路(例如經由連接埠或無線連接)。在一些情況下，通信裝置連接至網際網路。在一些情況下，通信裝置未連接至網際網路。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組能夠經由通信裝置將有關生物樣本中生物標記物之資訊傳達至網際網路。通信裝置之非限制性實例係蜂巢式電話、電子記事本及電腦。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含通信連接或通信介面。在一些實施例中，通信介面提供有線介面。在其他實施例中，有線通信介面利用通用串列匯流排(USB)(包括微型USB、微小USB、A型USB、B型USB及C型USB)、IEEE 1394(FireWire)、Thunderbolt、以太網(Ethernet)及光學互連件。
在一些實施例中，通信介面提供無線介面。參見例如圖 5A - E 。 在其他實施例中，無線通信介面利用無線通信協定諸如紅外、近場通信(NFC)(包括RFID)、藍牙、藍牙低功耗(BLE)、ZigBee、ANT、IEEE 802.11(Wi-Fi)、無線局部區域網路(WLAN)、無線個人區域網路(WPAN)、無線廣域網路(WWAN)、WiMAX、IEEE 802.16(微波存取全球互通(WiMAX))或3G/4G/LTE/5G蜂窩通信方法。
在一些實施例中，本文所述之裝置、系統、套組及方法包括數位處理裝置或其用途。在其他實施例中數位處理裝置包括一或多個執行該裝置之功能的硬體中央處理單元(CPU)或通用圖形處理單元(GPGPU)。在又其他實施例中，數位處理裝置進一步包含經組態用於執行可執行指令的操作系統。在一些實施例中，數位處理裝置包括用於與一或多個周邊裝置通信之通信介面(例如網路配接器)、一或多個不同的數位處理裝置、一或多個計算系統、一或多個電腦網路及/或一或多個通信網路。
在一些實施例中，數位處理裝置藉助於通信介面以通信方式耦接至電腦網路(「網路」)。適合網路包括個人區域網路(PAN)、局部區域網路(LAN)、廣域網路(WAN)、企業內部網路、企業間網路、網際網路(訪問全球資訊網)及其組合。在一些情況下，該網路係電信及/或數據網路。在各種情況下，該網路包括一或多個電腦伺服器，其能夠進行分佈式計算，諸如雲端計算。在一些情況下且藉助於該裝置，該網路實施點對點網路，其使耦合至該裝置的裝置能夠表現為客戶端或伺服器。
根據本文中之說明，作為非限制性實例，適合數位處理裝置包括伺服器電腦、桌上型電腦、膝上型電腦、筆記型電腦、次筆記型電腦、迷你筆記型電腦、迷你平板電腦(netpad computer)、機上型電腦(set-top computer)、媒體串流裝置、手持型電腦、網際網路器具、健身追蹤器、智慧型手錶、行動式智慧型電話、平板電腦(tablet computer)及個人數位助理。熟習此項技術者將認識到，許多智慧型電話適用於本文所述之系統中。熟習此項技術者亦將認識到，具有可選電腦網路連接的選擇電視、視訊播放器及數位音樂播放器適用於本文所述之系統中。適合平板電腦包括熟習此項技術者已知的具有目錄單、操作記錄及可變換組態的平板電腦。
在一些實施例中，數位處理裝置包括經組態用於執行可執行指令之操作系統。操作系統係例如包括程式及數據之軟體，其管理裝置之硬體且提供執行應用程式之服務。熟習此項技術者將認識到，作為非限制性實例，適合伺服器操作系統包括FreeBSD、OpenBSD、NetBSD® 、Linux、Apple® Mac OS X Server® 、Oracle® Solaris® 、Windows Server® 及Novell® NetWare® 。熟習此項技術者將認識到，作為非限制性實例，適合的個人電腦操作系統包括Microsoft® Windows® 、Apple® Mac OS X® 、UNIX® 及類UNIX操作系統，諸如GNU/Linux® 。在一些實施例中，操作系統係由雲端計算提供。熟習此項技術者亦將認識到，作為非限制性實例，適合的行動式智慧型手機操作系統包括Nokia® Symbian® OS、Apple® iOS® 、Motion® BlackBerry OS® 之研究、Google® Android® 、Microsoft® Windows Phone® OS、Microsoft® Windows Mobile® OS、Linux® 及Palm® WebOS® 。熟習此項技術者亦將認識到，作為非限制性實例，適合的媒體串流裝置操作系統包括Apple TV® 、Roku® 、Boxee® 、Google TV® 、Google Chromecast® 、Amazon Fire® 及Samsung® HomeSync® 。在一些情況下，操作系統包含物聯網(IoT)裝置。IoT裝置之非限制性實例包括Amazon之Alexa® 、Microsoft之Cortana® 、Apple Home Pod® 及Google Speaker® 。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組包含虛擬實境及/或擴增實境系統。
在一些實施例中，本文所揭示之裝置、系統及套組包含儲存及/或記憶體裝置。儲存及/或記憶體裝置係一或多個用於暫時或永久性儲存數據或程式的物理設備。在一些實施例中，該裝置係揮發性記憶體且需要電力維持所儲存之資訊。在一些實施例中，該裝置係非揮發性記憶體且當不對數位處理裝置供電時仍保留所儲存之資訊。在其他實施例中，非揮發性記憶體包含快閃記憶體。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含動態隨機存取記憶體(DRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含鐵電式隨機存取記憶體(ferroelectric random access memory，FRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包含相變隨機存取記憶體(phase-change random access memory，PRAM)。在其他實施例中，該裝置係儲存裝置，作為非限制性實例，包括CD-ROM、DVD、快閃記憶體裝置、磁碟機、磁帶機、光碟機及基於雲端計算之儲存器。在其他實施例中，該儲存及/或記憶體裝置係諸如本文所揭示之裝置的組合。
在一些實施例中，數位處理裝置包括向使用者發送可見資訊之顯示器。在一些實施例中，顯示器係液晶顯示器(LCD)。在其他實施例中，顯示器係薄膜電晶體液晶顯示器(thin film transistor liquid crystal display，TFT-LCD)。在一些實施例中，顯示器係有機發光二極體(organic light emitting diode，OLED)顯示器。在多種其他實施例中，OLED顯示器係被動矩陣式OLED (PMOLED)或主動矩陣式OLED (AMOLED)顯示器。在一些實施例中，顯示器係電漿顯示器。在其他實施例中，顯示器係視訊投影儀。在其他實施例中，顯示器係與數位處理裝置通信之頭戴式顯示器，諸如VR耳機。
在一些實施例中，數位處理裝置包括用於自使用者接收資訊之輸入裝置。在一些實施例中，輸入裝置係鍵盤。在一些實施例中，輸入裝置係指標裝置，作為非限制性實例，包括滑鼠、軌跡球、軌跡板、操縱桿、遊戲控制器或觸控筆。在一些實施例中，輸入裝置係觸控式螢幕或多點觸控式螢幕。在其他實施例中，輸入裝置係擷取語音或其他聲音輸入之麥克風。在其他實施例中，輸入裝置係視訊攝影機或擷取運動或可見輸入之其他感測器。在其他實施例中，輸入裝置係Kinect、Leap Motion或其類似物。在又其他實施例中，輸入裝置係諸如本文所揭示之裝置之類裝置的組合。
行動應用程式
在一些實施例中，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法包含數位處理裝置，或其用途，其中該數位處理裝置係與呈行動應用程式形式之可執行指令一起提供。在一些實施例中，行動應用程式係在製造時提供於行動式數位處理裝置。在其他實施例中，行動應用程式經由本文所述之電腦網路而提供於行動式數位處理裝置。
參看圖 5A ， 在一個特定實施例中，行動應用程式經組態用於與本文所揭示之裝置、系統及套組連接、通信並自該等裝置、系統及套組接收遺傳資訊及其他資訊。圖 5A 係描繪行動應用程式視情況提供給使用者之各種功能的圖式。在此實施例中，行動應用程式視情況提供：1)基於使用者之個人資訊及偏好的個人化定製使用者體驗(UX)；2)用於告知使用者如何利用該等裝置、系統及套組的交互式文字、音頻及/或視訊驅動之教學體驗；3)允許使用者訪問文章、新聞、媒體、遊戲及類似物之內容平台；以及4)用於追蹤及共享資訊、測試結果及事件之工具。
參看圖 5B ，在一個特定實施例中，行動應用程式視情況包括交互式介面，提供逐步走查以指導使用者使用本文所揭示之裝置、系統及套組。在各種實施例中，交互式走查包括文字、圖像、動畫、音頻、視訊及類似物，用以告知及指示使用者。
參看圖 5C ，在一個特定實施例中，行動應用程式視情況包括本籍螢幕，允許使用者訪問本文所揭示之行動應用程式功能。在此實施例中，本籍螢幕包括個人化問候語以及允許使用者開始測試檢視當前及歷史測試結果、共享測試結果及與較大社區之使用者交互的介面元件。
參看圖 5D ，在一個特定實施例中，行動應用程式視情況包括進程圖，用於告知使用者用於連接至本文所揭示之裝置、系統或套組之程序的狀態。在此實施例中，該圖顯示所有步驟並指示當前步驟。該等步驟係：1)經由例如藍牙與該裝置配對；2)在該裝置中偵測樣本；以及3)等待樣本處理。在一些實施例中，該圖係交互式的、動畫或用媒體或其他內容擴增。
參看圖 5E ，在一個特定實施例中，行動應用程式視情況包括社會共享螢幕，允許使用者訪問特徵以共享測試結果。許多服務、平台及網路適於共享測試結果以及其他資訊及事件。作為非限制性實例，適合社會網路連接及共享平台包括Facebook、YouTube、Twitter、LinkedIn、Pinterest、Google Plus+、Tumblr、Instagram、Reddit、VK、Snapchat、Flickr、Vine、Meetup、Ask.fm、Classmates、QQ、WeChat、Foursquare Swarm、Kik、Yik Yak、Shots、Periscope、Medium、Soundcloud、Tinder、WhatsApp、Snap Chat、Slack、Musical.ly、Peach、Blab、Renren、Sina Weibo、Renren、Line及Momo。在一些實施例中，測試結果係藉由SMS、MMS或即時訊息共享。在一些實施例中，測試結果係藉由電子郵件共享。
在一些實施例中，行動應用程式視情況包括本籍螢幕，允許使用者訪問另外的特徵，諸如與測試結果有關之重要資訊及事件的網誌及時刻表，視情況共享。在各種實施例中，適合資訊及事件包括與臨床試驗結果、新上市的治療劑、營養、鍛煉、胎兒發育、健康狀況等有關之資訊及事件。在此實施例中，本籍螢幕還包括訪問使用者偏好及設置。
在一些情況下，本文所揭示之裝置及系統與行動應用程式通信。行動應用程式可以用於獲得患者ID及電子健康記錄(EHR)，安排裝置運送(運送至使用者及/或自使用者運送)、在線訂購測試結果。行動應用程式可以用於自一點至另一點追蹤裝置或其部分(例如運送/儲存隔室)，或用該裝置獲得的資訊。各種點可選自運送、家庭、樣本處理實驗室及醫師之辦公室。
鑒於本文所提供之揭示內容，行動應用程式係藉由熟習此項技術者已知的技術，使用此項技術中已知之硬體、語言及開發環境創建。熟習此項技術者將認識到，行動應用程式係以若干種語言編寫。作為非限制性實例，適合的程式設計語言包括C、C++、C#、Objective-C、Java™、Javascript、Pascal、Object Pascal、Python™、Ruby、VB.NET、WML及具有或不具有CSS之XHTML/HTML，或其組合。
適合的行動應用程式開發環境可自若干來源獲得。作為非限制性實例，市售開發環境包括AirplaySDK、alcheMo、Appcelerator®、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、Rhomobile及WorkLight Mobile Platform。作為非限制性實例，其他可免費獲得之開發環境包括Lazarus、MobiFlex、MoSync及Phonegap。此外，作為非限制性實例，行動裝置製造商分佈式軟體開發套組包括iPhone及iPad (iOS) SDK、Android™ SDK、BlackBerry® SDK、BREW SDK、Palm® OS SDK、Symbian SDK、webOS SDK及Windows® Mobile SDK。
熟習此項技術者將認識到，若干市售論壇可用於行動應用程式之分佈，作為非限制性實例，包括Apple® App Store、Google® Play、Chrome WebStore、BlackBerry® App World、用於掌上型裝置之App Store、用於webOS之App Catalog、用於Mobile之Windows® Marketplace、用於Nokia® 裝置之Ovi Store及Samsung® Apps。
關於裝置、系統、套組及方法之態樣
以下態樣係關於本文所揭示之裝置、系統、套組及方法。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法一般經設計用於處理及分析雌性個體之生物樣本中的無細胞核酸。以下關於無細胞核酸、生物樣本及個體之描述可以幫助理解本文所揭示之裝置、系統、套組及方法之效用。
疾病及病狀
本文揭示用於偵測個體中疾病或病狀之存在、不存在或嚴重程度之裝置、系統、套組及方法。在一些情況下，疾病或病狀係由基因突變引起。該基因突變可以為遺傳性的(例如該突變存在於祖先或親屬中)。該基因突變可以為自發突變(例如DNA複製或修復之錯誤)。該基因突變可歸因於暴露於環境因素(例如紫外光、致癌物)。作為非限制性實例，基因突變可選自讀框轉移突變、插入突變、缺失突變、取代突變、單核苷酸多形現象、複本數變化及染色體易位。
在一些情況下，疾病或病狀係由環境因素(例如致癌物、飲食、應激、病原體)引起。在一些情況下，環境因素引起基因突變。在其他情況下，環境因素不會引起基因突變。在一些情況下，環境因素使個體中之一或多個表觀遺傳修飾相對於健康個體有所變化。在一些情況下，環境因素使個體中之一或多個表觀遺傳修飾相對於該個體在較早時間點之表觀遺傳修飾有所變化。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於偵測或監測影響一或多個組織、器官或細胞類型之疾病或病狀。該疾病或病狀可以引起核酸自一或多個組織、器官或細胞類型釋放。該疾病或病狀可以使自一或多個組織、器官或細胞類型之核酸釋放相對於健康個體中發生之相應釋放有所增加。組織可以歸類為上皮組織、結締組織、肌肉組織或神經組織。組織之非限制性實例係脂肪組織、肌肉組織、結締組織、乳房組織及骨髓。器官之非限制性實例係腦、胸腺、甲狀腺、肺、心臟、脾、肝、腎臟、胰臟、胃、小腸、大腸、結腸、前列腺、卵巢、子宮及膀胱。細胞類型之非限制性實例係內皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、肝細胞、胰臟β細胞、脂肪細胞、神經元、子宮內膜細胞、免疫細胞(T細胞、B細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、庫普弗細胞(Kupffer cell)、微神經膠質細胞)。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於偵測或監測一般健康狀況。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於偵測或監測健身。本文所揭示之裝置、系統套組及方法可用於偵測或監測器官移植接受者之健康狀況及/或移植之器官的健康狀況。
該疾病或病狀可以包含異常細胞生長或增殖。該疾病或病狀可以包含白血病。白血病之非限制性類型包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及毛細胞白血病(HCL)。該疾病或病狀可以包含淋巴瘤。該淋巴瘤可以為非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(例如B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia))或霍奇金氏淋巴瘤。該疾病或病狀可以包含癌症。該癌症可以為乳癌。該癌症可以為肺癌。該癌症可以為食道癌。該癌症可以為胰臟癌。該癌症可以為卵巢癌。該癌症可以為子宮癌。該癌症可以為子宮頸癌。該癌症可以為睪丸癌。該癌症可以為前列腺癌。該癌症可以為膀胱癌。該癌症可以為結腸癌。該癌症可以為肉瘤。該癌症可以為腺癌。該癌症可以為孤立的，亦即，其尚未擴散至除作為該癌症起源之器官或組織外的其他組織。該癌症可以為轉移性的。該癌症可能已擴散至鄰近組織。該癌症可能已擴散至與作為該癌症起源之器官或組織物理接觸之細胞、組織或器官。該癌症可能已擴散至不與作為該癌症起源之器官或組織物理接觸之細胞、組織或器官。該癌症可能處於早期，諸如第0期(異常細胞且可能變為癌症)或第1期(較小且被限制於一個組織)。該癌症可能處於中期，諸如第2期或第3期，在與初始腫瘤之組織物理接觸之組織及淋巴結中生長。該癌症可能處於晚期，諸如第4期或第5期，其中該癌症已轉移至遠離初始腫瘤之組織(例如不鄰近該組織或不與該組織物理接觸)的組織。在一些情況下，該癌症並非晚期癌症。在一些情況下，該癌症並非轉移性癌症。在一些實施例中，該癌症係轉移性癌症。
該疾病或病狀可以包含自體免疫性病症。自體免疫性病症及免疫病症包括(但不限於)第1型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化、狼瘡、發炎性腸病、阿狄森氏病(Addison's Disease)、格雷夫斯氏病(Graves Disease)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)及乳糜瀉。
該疾病或病狀可以包含代謝病症。代謝病狀及疾病包括(但不限於)肥胖症、甲狀腺病症、高血壓、第1型糖尿病、第2型糖尿病、非酒精性脂肪變性肝炎、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。
該疾病或病狀可以包含心血管病狀。心血管病狀之非限制性實例係動脈粥樣硬化、心肌梗塞、心包炎、心肌炎、缺血性中風、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、心臟炎、主動脈動脈瘤、外周動脈疾病、血栓栓塞疾病及靜脈血栓形成。
該疾病或病狀可以包含神經病症。該神經病症可以包含神經退化性疾病。神經退化性病症及神經病症之非限制性實例係阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、脊髓小腦失調、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、運動神經元疾病、慢性疼痛及脊髓性肌萎縮。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測個體之精神病症及/或對治療該精神病症之藥物的反應。
該疾病或病狀可以包含感染。該疾病或病狀可能由感染引起。該疾病或病狀可能因感染而加重。該感染可以為病毒感染。該感染可以為細菌感染。該感染可以為真菌感染。
該疾病或病狀可能與衰老相關。與衰老相關之疾病及病狀包括(但不限於)癌症、骨質疏鬆、癡呆、黃斑變性、代謝病狀及神經退化性病症。
該疾病或病狀可以為血液病症。血液病症之非限制性實例係貧血、血友病、血液凝固及易栓病。舉例而言，偵測易栓病可以包含偵測選自因子V萊頓(Factor V Leiden，FVL)、凝血酶原基因(PT G20210A)及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)之基因中存在的多形現象。
該疾病或病狀可能對食品、液體或藥物過敏或不耐受。作為非限制性實例，個體可能對乳糖、小麥、大豆、乳製品、咖啡鹼、酒精、堅果、貝類及雞蛋過敏或不耐受。個體亦可能對藥物、補充劑或化妝品過敏或不耐受。在一些情況下，方法包含分析預測皮膚類型或皮膚健康狀況之遺傳標記物。
在一些情況下，該病狀與過敏相關。在一些情況下，該個體未被診斷患有疾病或病狀，但正經歷指示疾病或病狀存在之症狀。在其他情況下，該個體已經診斷患有疾病或病狀，且本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於監測該疾病或病狀，或藥物對該疾病或病狀之影響。
染色體異常
本文揭示用於偵測染色體異常之裝置、系統、套組及方法。熟習此項技術者亦可將染色體異常稱為染色體畸變。在一些情況下，染色體異常係染色體二倍化複製。在一些情況下，染色體異常係染色體缺失。在一些情況下，染色體異常係染色體之一臂缺失。在一些情況下，染色體異常係染色體之一臂的部分缺失。在一些情況下，染色體異常包含基因之至少一個複本。在一些情況下，染色體異常係由染色體斷裂引起。在一些情況下，染色體異常係由第一染色體之一部分易位成第二染色體之一部分引起。
許多已知的染色體異常會引起染色體病症。因此，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可以用於偵測染色體病症。作為非限制性實例染色體病症包括唐氏綜合症(Down's syndrome)(第21對染色體三體症)、愛德華氏症候群(Edward's syndrome)(第18對染色體三體症)、巴陶氏症候群(Patau syndrome)(第13對染色體三體症)、貓叫症候群(Cri du chat syndrome)(染色體5之短臂部分缺失)、沃夫-賀許宏氏症候群(Wolf Hirschhorn syndrome)(染色體4之短臂缺失)、雅各布森症候群(Jacobsen syndrome)(染色體11之長臂缺失)、迪喬治氏症候群(diGeorge's syndrome)(染色體22少量缺失)、克氏症候群(Klinefelter's syndrome)(雄性存在另外的X染色體)及特納氏症候群(Turner syndrome)(雌性僅存在單一X染色體)。
生物樣本
本文揭示用於分析生物樣本中之無細胞核酸的裝置、系統、套組及方法。生物樣本之非限制性實例包括全血、血漿、血清、唾液、尿液、汗液、淚液及陰道液之樣本。在一些情況下，生物樣本包含全血。在一些情況下，生物樣本係含有生物物質之環境樣本。舉例而言，生物樣本可以為含有病毒、細菌或其片段/顆粒之食品樣本或水樣本。
本文所述之方法、系統及套組一般偵測及定量無細胞核酸。出於此原因，本文所述之生物樣本一般為實質上非細胞的生物流體或可以經改質成為非細胞的生物流體。作為非限制性實例，來自個體之樣本可以為移除了細胞之血液、血漿血清、尿液、唾液或陰道液。舉例而言，無細胞核酸可以為個體之血流中的循環無細胞核酸，且因此可以使用偵測試劑偵測或定量來自個體之血液或血清樣本中的標記物。除非另外指出，否則術語「血漿」及「血清」在本文中可互換地使用。然而，在一些情況下，其係包括在樣本物種之單一清單中以指示兩者涵蓋於本說明書或申請專利範圍中。在一些情況下，生物流體不包含羊膜液。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法能夠移除生物樣本中之細胞。所得到的樣本可以稱為細胞耗竭樣本。該細胞耗竭樣本可以具有比生物樣本少至少95%之總完整細胞。該細胞耗竭樣本可以具有比生物樣本少至少90%之總完整細胞。該細胞耗竭樣本可以具有比生物樣本少至少80%之總完整細胞。該細胞耗竭樣本可以具有比生物樣本少至少約75%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約40%或至少約25%之總完整細胞。該細胞耗竭樣本可以完全不含任何總完整細胞。
自毛細管(例如四肢，如手指、腳趾之血管)獲得的血液在本文中可稱為「毛細血管血液」。自靜脈(例如臂、手中間)獲得的血液在本文中可稱為「靜脈血」。用於靜脈穿刺以獲得靜脈血之總靜脈係肘正中靜脈、頭靜脈、貴要靜脈及掌背側靜脈。在一些情況下，生物樣本包含毛細血管血液。在一些情況下，生物樣本基本上由毛細血管血液組成。在一些情況下，生物樣本由毛細血管血液組成。在一些實施例中，生物樣本不包含靜脈血。在一些情況下，生物樣本包含血漿。在一些情況下，生物樣本基本上由血漿組成。在一些情況下，生物樣本由血漿組成。在一些情況下，生物樣本包含血清。在一些情況下，生物樣本基本上由血清組成。在一些情況下，生物樣本由血清組成。在一些情況下，生物樣本包含尿液。在一些情況下，生物樣本基本上由尿液組成。在一些情況下，生物樣本由尿液組成。在一些情況下，生物樣本包含唾液。在一些情況下，生物樣本基本上由唾液組成。在一些情況下，生物樣本由唾液組成。在一些情況下，生物流體包含陰道液。在一些情況下，生物樣本基本上由陰道液組成。在一些情況下，生物流體由陰道液組成。在一些情況下，陰道液係藉由對懷孕個體進行陰道擦拭獲得。在一些情況下，生物流體包含間質液。在一些情況下，生物樣本基本上由間質液組成。在一些情況下，生物流體包含滑液。在一些情況下，生物樣本基本上由滑液組成。在一些情況下，生物流體包含來自液體生物檢體之流體。在一些情況下，生物流體基本上由來自液體生物檢體之流體組成。液體生物檢體之實例係自癌症患者獲得血液並針對自腫瘤或癌症細胞釋放至血流中的核酸進行測試。核酸可能因壞死、細胞凋亡、自體吞噬及引起癌細胞死亡/損傷之癌症療法而自腫瘤或癌症細胞釋放。
在一些情況下，生物樣本係全血。一般而言，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法能夠分析來自極少全血樣本之無細胞核酸。在一些情況下，少量全血樣本可藉由刺破手指，諸如用刺血針或插針/針刺破手指獲得。在一些情況下，少量全血樣本可在不經歷靜脈切開術下獲得。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約1 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約10 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約20 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約30 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約40 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約50 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約60 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約70 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約1 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約10 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約20 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約30 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約40 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約60 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約80 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約100 µL血液，以至少約90%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，該方法包含僅獲得約1 µL至約500 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，該方法包含僅獲得約10 µL至約200 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，該方法包含僅獲得約15 µL至約150 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，該方法包含僅獲得約20 µL至約100 µL血液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約20 µL至約100 µL血液，以至少約98%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約20 µL至約100 µL血液，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約20 µL至約100 µL血液，以至少約99.5 %置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約20 µL至約100 µL血液，以至少約99.9%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，生物樣本係血漿或血清。血漿或血清佔全血之大約55%。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約1 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約10 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約20 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約30 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約40 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約50 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約10 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約20 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約30 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約40 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組需要至少約50 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約10 µL至約50 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約20 µL至約60 µL血漿或血清，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統及套組僅需要約10 µL至約50 µL血漿或血清，以至少約99%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，生物樣本係唾液。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約100 µL唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約200 µL唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約500 µL唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約1 ml唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約2 ml唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約3 ml唾液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，生物樣本係陰道液。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約50 µL陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約100 µL陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約200 µL陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約500 µL陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約1 ml陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約2 ml陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。在一些情況下，本文所揭示之裝置、系統、套組及方法需要至少約3 ml陰道液，以至少約95%置信度或準確性提供測試結果。
在一些情況下，本文所揭示之生物樣本包含無細胞核酸，其中一部分無細胞核酸係來自外來組織或異常組織。該部分中之無細胞核酸可以稱為「外來無細胞核酸」或「異常無細胞核酸」。作為非限制性實例，外來或異常組織可以包含已移植至個體體內之組織或器官。外來或異常組織可以稱為供體組織且個體可以稱為宿主組織。另外，作為非限制性實例，異常組織可以包含腫瘤。在一些情況下，該部分係生物樣本中所有(總)無細胞核酸之一部分，其中該部分包含外來或異常無細胞核酸。在一些情況下，該部分基本上由外來或異常無細胞核酸組成。在一些情況下，外來或異常無細胞核酸包含DNA。在一些情況下，外來或異常無細胞核酸包含RNA。在一些情況下，外來或異常無細胞核酸基本上由DNA組成。在一些情況下，外來或異常無細胞核酸基本上由RNA組成。
無細胞核酸中來自外來或異常組織之部分可以佔樣本中總無細胞核酸之百分含量表徵。在一些情況下，無細胞核酸中來自外來或異常組織之部分低於25%。在一些情況下，無細胞核酸中來自外來或異常組織之部分低於20%。在一些情況下，該部分低於15%。在一些情況下，該部分低於10%。在一些情況下，該部分低於8%。在一些情況下，該部分低於6%。在一些情況下，該部分低於5%。在一些情況下，該部分低於4%。在一些情況下，該部分低於2%。在一些情況下，該部分係至少1%。在一些情況下，該部分係約1.5%至約15%。在一些情況下，該部分係約2%至約12%。在一些情況下，該部分係約4%至約10%。在一些情況下，該部分係約4%至約9%。在一些情況下，胎兒部分係約4%至約8%。在一些情況下，胎兒部分係約1%至約5%。在一些情況下，胎兒部分係約1%至約4%。
在一些情況下，本文所揭示之生物樣本包含無細胞核酸，其中一部分無細胞核酸係來自胎兒。此部分可以稱為胎兒部分。在一些情況下，該胎兒部分係生物樣本中所有(總)核酸之一部分，其中該部分由胎兒核酸組成。在一些情況下，該等核酸及/或胎兒核酸包含DNA。在一些情況下，該等核酸及/或胎兒核酸包含RNA。在一些情況下，該等核酸及/或胎兒核酸基本上由DNA組成。在一些情況下，該等核酸及/或胎兒核酸包含DNA及RNA。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約1.5%至約15%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約2%至約12%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約4%至約10%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約4%至約9%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約4%至約8%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約1%至約5%。在一些情況下，該胎兒部分佔生物樣本中總無細胞核酸之約1%至約4%。在一些情況下，至少一部分胎兒核酸係來自胎兒。在一些情況下，至少一部分胎兒核酸係來自胎盤。在一些情況下，至少一部分胎兒核酸係來自胎兒且至少一部分胎兒核酸係來自胎盤。在一些情況下，胎兒核酸僅來自胎兒。在一些情況下，胎兒核酸僅來自胎盤。在一些情況下，胎兒核酸係來自胎兒及胎盤之所有核酸。在一些情況下，胎兒核酸並非來自母體組織或母體流體。在一些情況下，母體組織係除胎盤外之母體組織。在一些情況下，母體流體係除羊膜液外之母體流體。
在一些情況下，本文所揭示之方法包含使生物流體改質以使生物樣本與擴增或測序相容。在一些情況下，本文所揭示之方法可以包含將緩衝液、鹽、蛋白質或核酸添加至生物樣本中。作為非限制性實例，可以將EDTA添加至血液樣本中以防止凝血。為簡單起見，此類經改質生物樣本仍稱為『生物樣本』。
無細胞核酸
在一些情況下，本發明之組合物及方法可用於評價生物樣本中之無細胞核酸。該無細胞核酸可以來自動物。該無細胞核酸可以來自哺乳動物。該無細胞核酸可以來自人類個體。該無細胞核酸可以來自植物。該無細胞核酸可以來自病原體。該無細胞核酸可以來自生物樣本中存在之病原體，其中該生物樣本係來自動物。該無細胞核酸可以來自生物樣本中存在之病原體，其中該生物樣本係來自人類個體。病原體可以包含細菌或其成分。病原體可以為病毒或其成分。病原體可以為真菌或其成分。
在一些情況下，無細胞核酸係DNA(cf-DNA)。在一些情況下，無細胞核酸係基因組DNA。在一些情況下，無細胞核酸係RNA(cf-RNA)。在一些情況下，無細胞核酸係來自胎兒之細胞的核酸，在本文中稱為無細胞胎兒核酸。在一些情況下，無細胞胎兒核酸係無細胞胎兒DNA(cff-DNA)或無細胞胎兒RNA(cff-RNA)。在一些情況下，cf-DNA或cff-DNA係基因組DNA。在一些情況下，無細胞核酸係呈由cf-RNA或cff-RNA逆轉錄產生的互補DNA(cDNA)形式。在一些情況下，cf-DNA包含粒線體DNA。在一些情況下，cf-RNA或cff-RNA係信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、粒線體RNA或天然反義RNA(NAS-RNA)。在一些情況下，無細胞核酸係母體及胎兒核酸之混合物。在母體血流中循環之無細胞胎兒核酸可稱為「循環無細胞核酸」或「循環細胞外DNA」。在一些情況下，無細胞核酸包含表觀遺傳修飾。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於性別或其他所關注遺傳資訊之表觀遺傳修飾模式。在一些情況下，無細胞核酸包含甲基化胞嘧啶。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於性別或其他所關注遺傳資訊之胞嘧啶甲基化模式。
在一些情況下，本文所揭示之方法、裝置、系統及套組經組態用於偵測或定量細胞核酸，諸如來自破壞之細胞或溶解之細胞的核酸。在一些情況下，細胞核酸係來自有意地破壞或溶解之細胞。在一些情況下，細胞核酸係來自無意地破壞或溶解之細胞。本文所揭示之方法、裝置、系統及套組可以經組態用於分析有意地破壞或溶解之細胞，但不分析無意地破壞或溶解之細胞。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約0.1%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約1%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約5%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約10%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約20%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約30%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約40%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約50%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約60%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約70%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約80%係細胞核酸。在一些情況下，生物樣本中總核酸之低於約90%係細胞核酸。在一些情況下，裝置、系統、套組及方法包含實驗對照或其用途。在一些情況下，實驗對照包含核酸、蛋白質、肽、抗體、抗原結合抗體片段、結合部分。在一些情況下，實驗對照包含用於偵測實驗對照之信號。信號之非限制性實例係螢光分子、染料分子、奈米顆粒及比色指示劑。在一些情況下，實驗對照包含無細胞核酸。在一些情況下，無細胞核酸包含無細胞胎兒核酸。在一些情況下，無細胞核酸包含母體無細胞核酸。在一些情況下，無細胞核酸包含母體無細胞核酸(例如用於評估在樣本處理期間發生的細胞破壞/溶解之量)。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於體染色體之序列。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於性染色體之序列。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於可能呈非整倍體之染色體(例如染色體13、16、18、21、22、X、Y)的序列。在一些情況下，無細胞核酸包含對應於極不可能呈非整倍體之染色體(例如染色體1-12、14、15、17、19或20)的序列。
在一些情況下，生物樣本包含母體之體液樣本。在一些情況下，母體之體液樣本包含血液，例如全血、末梢血液樣本或血液級分(血漿、血清)。在一些情況下，母體之體液樣本包含汗液、淚液、痰液、尿液、耳液(ear flow)、淋巴、唾液、腦脊髓液、骨髓懸浮液、陰道液、經子宮頸灌洗液、腦流體、腹水或乳汁。在一些情況下，母體之體液樣本包含呼吸系統、腸及泌尿生殖道之分泌物、羊膜液或白血球分離術樣本。在一些情況下，生物流體樣本係可以藉由無創程序容易地獲得的母體之體液樣本，例如血液、血漿、血清、汗液、淚液、痰液、尿液、耳液或唾液。在一些情況下，該樣本係至少二份體液樣本之組合。在一些情況下，無細胞胎兒核酸來源於母體胎盤，例如來自凋亡之胎盤細胞。在一些情況下，生物樣本係胎盤血。
在一些情況下，藉由本文所揭示之裝置、系統、套組及方法評價或分析之核酸具有較佳長度。在一些情況下，無細胞核酸係無細胞胎兒核酸。在一些情況下，核酸係無細胞胎兒DNA片段。在一些情況下，無細胞胎兒DNA片段係來自Y染色體。在一些情況下，核酸係約15 bp至約500 bp長度。在一些情況下，核酸係約50 bp長度至約200 bp長度。在一些情況下，核酸係至少約15 bp長度。在一些情況下，核酸係至多約500 bp長度。在一些情況下，核酸係約。15 bp長度至約50 bp長度、約15 bp長度至約75 bp長度、約15 bp長度至約100 bp長度、約15 bp長度至約150 bp長度、約15 bp長度至約200 bp長度、約15 bp長度至約250 bp長度、約15 bp長度至約300 bp長度、約15 bp長度至約350 bp長度、約15 bp長度至約400 bp長度、約15 bp長度至約450 bp長度、約15 bp長度至約500 bp長度、約50 bp長度至約75 bp長度、約50 bp長度至約100 bp長度、約50 bp長度至約150 bp長度、約50 bp長度至約200 bp長度、約50 bp長度至約250 bp長度、約50 bp長度至約300 bp長度、約50 bp長度至約350 bp長度、約50 bp長度至約400 bp長度、約50 bp長度至約450 bp長度、約50 bp長度至約500 bp長度、約75 bp長度至約100 bp長度、約75 bp長度至約150 bp長度、約75 bp長度至約200 bp長度、約75 bp長度至約250 bp長度、約75 bp長度至約300 bp長度、約75 bp長度至約350 bp長度、約75 bp長度至約400 bp長度、約75 bp長度至約450 bp長度、約75 bp長度至約500 bp長度、約100 bp長度至約150 bp長度、約100 bp長度至約200 bp長度、約100 bp長度至約250 bp長度、約100 bp長度至約300 bp長度、約100 bp長度至約350 bp長度、約100 bp長度至約400 bp長度、約100 bp長度至約450 bp長度、約100 bp長度至約500 bp長度、約150 bp長度至約200 bp長度、約150 bp長度至約250 bp長度、約150 bp長度至約300 bp長度、約150 bp長度至約350 bp長度、約150 bp長度至約400 bp長度、約150 bp長度至約450 bp長度、約150 bp長度至約500 bp長度、約200 bp長度至約250 bp長度、約200 bp長度至約300 bp長度、約200 bp長度至約350 bp長度、約200 bp長度至約400 bp長度、約200 bp長度至約450 bp長度、約200 bp長度至約500 bp長度、約250 bp長度至約300 bp長度、約250 bp長度至約350 bp長度、約250 bp長度至約400 bp長度、約250 bp長度至約450 bp長度、約250 bp長度至約500 bp長度、約300 bp長度至約350 bp長度、約300 bp長度至約400 bp長度、約300 bp長度至約450 bp長度、約300 bp長度至約500 bp長度、約350 bp長度至約400 bp長度、約350 bp長度至約450 bp長度、約350 bp長度至約500 bp長度、約400 bp長度至約450 bp長度、約400 bp長度至約500 bp長度，或約450 bp長度至約500 bp長度。在一些情況下，核酸係約15 bp長度、約50 bp長度、約75 bp長度、約100 bp長度、約150 bp長度、約200 bp長度、約250 bp長度、約300 bp長度、約350 bp長度、約400 bp長度、約450 bp長度或約500 bp長度。
使用本發明之裝置、系統、套組及方法評價之無細胞核酸的大小可以取決於例如所用具體體液樣本而變化。舉例而言，據觀察，cff-DNA序列比母體cf-DNA序列短，且尿液中之cff-DNA及母體cf-DNA比血漿樣本中的短。
在一些情況下，尿液中評價之cff-DNA序列在約20 bp至約300 bp長度範圍內。在一些情況下，尿液樣本中評價之cff-DNA序列係約15 bp長度至約300 bp長度。在一些情況下，尿液樣本中評價之cff-DNA序列係至少約15 bp長度。在一些情況下，尿液樣本中評價之cff-DNA序列係至多約300 bp長度。在一些情況下，尿液樣本中評價之cff-DNA序列係約15 bp長度至約20 bp長度、約15 bp長度至約30 bp長度、約15 bp長度至約60 bp長度、約15 bp長度至約90 bp長度、約15 bp長度至約120 bp長度、約15 bp長度至約150 bp長度、約15 bp長度至約180 bp長度、約15 bp長度至約210 bp長度、約15 bp長度至約240 bp長度、約15 bp長度至約270 bp長度、約15 bp長度至約300 bp長度、約20 bp長度至約30 bp長度、約20 bp長度至約60 bp長度、約20 bp長度至約90 bp長度、約20 bp長度至約120 bp長度、約20 bp長度至約150 bp長度、約20 bp長度至約180 bp長度、約20 bp長度至約210 bp長度、約20 bp長度至約240 bp長度、約20 bp長度至約270 bp長度、約20 bp長度至約300 bp長度、約30 bp長度至約60 bp長度、約30 bp長度至約90 bp長度、約30 bp長度至約120 bp長度、約30 bp長度至約150 bp長度、約30 bp長度至約180 bp長度、約30 bp長度至約210 bp長度、約30 bp長度至約240 bp長度、約30 bp長度至約270 bp長度、約30 bp長度至約300 bp長度、約60 bp長度至約90 bp長度、約60 bp長度至約120 bp長度、約60 bp長度至約150 bp長度、約60 bp長度至約180 bp長度、約60 bp長度至約210 bp長度、約60 bp長度至約240 bp長度、約60 bp長度至約270 bp長度、約60 bp長度至約300 bp長度、約90 bp長度至約120 bp長度、約90 bp長度至約150 bp長度、約90 bp長度至約180 bp長度、約90 bp長度至約210 bp長度、約90 bp長度至約240 bp長度、約90 bp長度至約270 bp長度、約90 bp長度至約300 bp長度、約120 bp長度至約150 bp長度、約120 bp長度至約180 bp長度、約120 bp長度至約210 bp長度、約120 bp長度至約240 bp長度、約120 bp長度至約270 bp長度、約120 bp長度至約300 bp長度、約150 bp長度至約180 bp長度、約150 bp長度至約210 bp長度、約150 bp長度至約240 bp長度、約150 bp長度至約270 bp長度、約150 bp長度至約300 bp長度、約180 bp長度至約210 bp長度、約180 bp長度至約240 bp長度、約180 bp長度至約270 bp長度、約180 bp長度至約300 bp長度、約210 bp長度至約240 bp長度、約210 bp長度至約270 bp長度、約210 bp長度至約300 bp長度、約240 bp長度至約270 bp長度、約240 bp長度至約300 bp長度，或約270 bp長度至約300 bp長度。在一些情況下，尿液樣本中評價之cff-DNA序列係約15 bp長度、約20 bp長度、約30 bp長度、約60 bp長度、約90 bp長度、約120 bp長度、約150 bp長度、約180 bp長度、約210 bp長度、約240 bp長度、約270 bp長度或約300 bp長度。
在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係至少約20 bp長度。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係至少約40 bp長度。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係至少約80 bp長度。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係至多約500 bp長度。在一些情況下，血漿或血清中評價之cff-DNA序列在約100 bp至約500 bp長度範圍內。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係約50 bp長度至約500 bp長度。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係約80 bp長度至約100 bp長度、約80 bp長度至約125 bp長度、約80 bp長度至約150 bp長度、約80 bp長度至約175 bp長度、約80 bp長度至約200 bp長度、約80 bp長度至約250 bp長度、約80 bp長度至約300 bp長度、約80 bp長度至約350 bp長度、約80 bp長度至約400 bp長度、約80 bp長度至約450 bp長度、約80 bp長度至約500 bp長度、約100 bp長度至約125 bp長度、約100 bp長度至約150 bp長度、約100 bp長度至約175 bp長度、約100 bp長度至約200 bp長度、約100 bp長度至約250 bp長度、約100 bp長度至約300 bp長度、約100 bp長度至約350 bp長度、約100 bp長度至約400 bp長度、約100 bp長度至約450 bp長度、約100 bp長度至約500 bp長度、約125 bp長度至約150 bp長度、約125 bp長度至約175 bp長度、約125 bp長度至約200 bp長度、約125 bp長度至約250 bp長度、約125 bp長度至約300 bp長度、約125 bp長度至約350 bp長度、約125 bp長度至約400 bp長度、約125 bp長度至約450 bp長度、約125 bp長度至約500 bp長度、約150 bp長度至約175 bp長度、約150 bp長度至約200 bp長度、約150 bp長度至約250 bp長度、約150 bp長度至約300 bp長度、約150 bp長度至約350 bp長度、約150 bp長度至約400 bp長度、約150 bp長度至約450 bp長度、約150 bp長度至約500 bp長度、約175 bp長度至約200 bp長度、約175 bp長度至約250 bp長度、約175 bp長度至約300 bp長度、約175 bp長度至約350 bp長度、約175 bp長度至約400 bp長度、約175 bp長度至約450 bp長度、約175 bp長度至約500 bp長度、約200 bp長度至約250 bp長度、約200 bp長度至約300 bp長度、約200 bp長度至約350 bp長度、約200 bp長度至約400 bp長度、約200 bp長度至約450 bp長度、約200 bp長度至約500 bp長度、約250 bp長度至約300 bp長度、約250 bp長度至約350 bp長度、約250 bp長度至約400 bp長度、約250 bp長度至約450 bp長度、約250 bp長度至約500 bp長度、約300 bp長度至約350 bp長度、約300 bp長度至約400 bp長度、約300 bp長度至約450 bp長度、約300 bp長度至約500 bp長度、約350 bp長度至約400 bp長度、約350 bp長度至約450 bp長度、約350 bp長度至約500 bp長度、約400 bp長度至約450 bp長度、約400 bp長度至約500 bp長度，或約450 bp長度至約500 bp長度。在一些情況下，血漿或血清樣本中評價之cff-DNA序列係約80 bp長度、約100 bp長度、約125 bp長度、約150 bp長度、約175 bp長度、約200 bp長度、約250 bp長度、約300 bp長度、約350 bp長度、約400 bp長度、約450 bp長度或約500 bp長度。
個體
本文揭示用於分析來自個體之樣本中之生物成分的裝置、系統、套組及方法。該個體可以為人類。該個體可以為非人類。該個體可以為非哺乳動物(例如鳥類、爬行動物、昆蟲)。在一些情況下，該個體係哺乳動物。在一些情況下，該哺乳動物係雌性的。在一些情況下，該個體係人類個體。在一些情況下，哺乳動物係靈長類動物(例如人類、巨猿、小猿、猴)。在一些情況下，哺乳動物係犬科動物(例如犬、狐狸、狼)。在一些情況下，哺乳動物係貓科動物(例如家貓、大貓)。在一些情況下，哺乳動物係馬科動物(例如馬)。在一些情況下，哺乳動物係牛科動物(例如牛、水牛、野牛)。在一些情況下，哺乳動物係綿羊。在一些情況下，哺乳動物係山羊。在一些情況下，哺乳動物係豬。在一些情況下，哺乳動物係嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。
在一些情況下，本文所述之個體感染疾病或病狀。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試該疾病或病狀、偵測該疾病或病狀及/或監測該疾病或病狀。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試遺傳性狀之存在、監測健身及偵測家族關係。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測個體之癌症。癌症之非限制性實例包括乳癌、前列腺癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌/結腸癌、膀胱癌、胰臟癌、淋巴瘤及白血病。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測個體之免疫病症或自體免疫性病症。自體免疫性病症及免疫病症包括(但不限於)第1型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化、狼瘡、發炎性腸病、阿狄森氏病、格雷夫斯氏病、克羅恩氏病及乳糜瀉。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測與個體衰老相關之疾病或病狀。與衰老相關之疾病及病狀包括(但不限於)癌症、骨質疏鬆、癡呆、黃斑變性、代謝病狀及神經退化性病症。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測血液病症。血液病症之非限制性實例係貧血、血友病、血液凝固及易栓病。舉例而言，偵測易栓病可以包含偵測選自因子V萊頓(FVL)、凝血酶原基因(PT G20210A)及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)之基因中存在的多形現象。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測個體之神經病症或神經退化性病症。神經退化性病症及神經病症之非限制性實例係阿茲海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、脊髓小腦失調、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、運動神經元疾病、慢性疼痛及脊髓性肌萎縮。本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測個體之精神病症及/或對治療該精神病症之藥物的反應。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測代謝病狀或疾病。代謝病狀及疾病包括(但不限於)肥胖症、甲狀腺病症、高血壓、第1型糖尿病、第2型糖尿病、非酒精性脂肪變性肝炎、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。
本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於測試、偵測及/或監測對食品、液體或藥物之過敏或不耐受。作為非限制性實例，個體可能對乳糖、小麥、大豆、乳製品、咖啡鹼、酒精、堅果、貝類及雞蛋過敏或不耐受。個體亦可能對藥物、補充劑或化妝品過敏或不耐受。在一些情況下，方法包含分析預測皮膚類型或皮膚健康狀況之遺傳標記物。
在一些情況下，該病狀與過敏相關。在一些情況下，該個體未被診斷患有疾病或病狀，但正經歷指示疾病或病狀存在之症狀。在其他情況下，該個體已經診斷患有疾病或病狀，且本文所揭示之裝置、系統、套組及方法可用於監測該疾病或病狀，或藥物對該疾病或病狀之影響。
本文揭示用於分析來自懷孕個體之母體生物樣本中之胎兒的無細胞核酸之裝置、系統、套組及方法。一般而言，懷孕個體係人懷孕個體。然而，熟習此項技術者應瞭解，可能出於在農場或動物園中育種之目的，本發明可以應用於其他哺乳動物。在一些情況下，懷孕個體係整倍體。在一些情況下，懷孕個體包含非整倍體。在一些情況下，懷孕個體具有基因或其部分之複本變化。在一些情況下，懷孕個體具有基因插入突變。在一些情況下，懷孕個體具有基因缺失突變。在一些情況下，懷孕個體具有基因錯義突變。在一些情況下，懷孕個體具有單核苷酸多形現象。在一些情況下，懷孕個體具有單核苷酸多形現象。在一些情況下，懷孕個體具有產生融合基因之易位突變。作為非限制性實例，BCR-ABL基因係可以在許多白血病患者之染色體22上發現的融合基因。改變之染色體22稱為費城染色體(Philadelphia chromosome)。
在一些情況下，懷孕個體係約2週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約3週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約4週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約5週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約6週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約7週孕齡至約42週孕齡。在一些情況下，懷孕個體係約8週孕齡至約42週孕齡。
在一些情況下，懷孕個體係低於約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約12週、約16週、約20週、約21週、約22週、約24週、約26週或約28週妊娠。在一些情況下，懷孕個體懷孕少至5週。在一些情況下，人類個體係已達到至少約5週、至少約6週、至少約7週或至少約8週妊娠之懷孕女性。在一些情況下，人類個體係已達到至少約5至約8週妊娠之懷孕女性。在一些情況下，人類個體係已達到至少約5至約8週、至少約5至約12週、至少約5至約16週、至少約5至約20週、至少約6至約21週、至少約6至約22週、至少約6至約24週、至少約6至約26週、至少約6至約28週、至少約6至約9週、至少約6至約12週、至少約6至約16週、至少約6至約20週、至少約6至約21週、至少約6至約22週、至少約6至約24週、至少約6至約26週，或至少約6至約28週妊娠之懷孕女性。在一些情況下，人類個體係已達到至少約7至約8週、至少約7至約12週、至少約7至約16週、至少約7至約20週、至少約7至約21週、至少約7至約22週、至少約7至約24週、至少約7至約26週、至少約7至約28週、至少約8至約9週、至少約8至約12週、至少約6至約16週、至少約8至約20週、至少約8至約21週、至少約6至約22週、至少約8至約24週、至少約8至約26週，或至少約8至約28週妊娠之懷孕女性。在一些情況下，妊娠時間係藉由量測自最後一次月經期之第一天起之妊娠時間來偵測。
在一些情況下，生物樣本係自懷孕個體、疑似懷孕之個體或近期(例如在前一天內)生產之個體獲得的母體之體液樣本。在一些情況下，該個體係哺乳動物。在一些情況下，該哺乳動物係雌性的。在一些情況下，哺乳動物係靈長類動物(例如人類、巨猿、小猿、猴)、犬科動物(例如犬、狐狸、狼)、貓科動物(例如家貓、大貓)、馬科動物(例如馬)、牛科動物(例如牛、水牛、野牛)、綿羊科動物(例如綿羊)、山羊科動物(例如山羊)、豬科動物(例如豬)、犀科動物或嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在一些情況下，個體係處於妊娠第一個、第二個或第三個月之懷孕女性。在一些情況下，人類個體係低於約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39或約40週妊娠之懷孕女性。
編號之實施例
經由本文中所列舉之編號實施例的評述，將進一步理解本發明。1. 一種方法，其包含：自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液包含無細胞核酸；對該等無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。2. 一種方法，其包含：自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液 包含無細胞核酸；視情況使該等無細胞核酸擴增；標誌該等無細胞核酸之至少一部分以產生經標誌無細胞核酸之集合庫；視情況使該等經標誌無細胞核酸擴增；對該等經標誌無細胞核酸之至少一部分進行測序；以及偵測該等經標誌無細胞核酸之至少一部分中至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。3. 如實施例1或2之方法，其包含以至少0.5之效率製造集合庫。4. 如任何先前實施例之方法，其包含在擁擠劑存在下，使該等無細胞核酸或經標誌無細胞核酸擴增。5. 如任何先前實施例之方法，其包含修復該等無細胞核酸之末端。6. 一種方法，其包含自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本包含目標無細胞核酸及非目標無細胞核酸，其一起構成總無細胞核酸，且其中該等目標無細胞核酸佔該等總無細胞核酸低於 5 % ；對該等目標無細胞核酸之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個所關注目標序列的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。7. 如實施例6之方法，其中該生物樣本包含毛細血管血液。8. 如實施例6之方法，其中該生物樣本基本上由毛細血管血液組成。9. 如實施例6之方法，其中獲得該生物樣本包含獲得毛細血管血液。10. 如實施例6之方法，其中獲得該生物樣本包含獲得毛細血管血液。11. 如實施例6之方法，其中獲得該生物樣本基本上由獲得毛細血管血液組成。12. 如實施例6之方法，其中獲得該生物樣本不包含獲得靜脈血。13. 如實施例6之方法，其中獲得該生物樣本不包含執行靜脈切開術。14. 如任何先前實施例之方法，其中獲得該生物樣本包含獲得不超過1毫升血液。15. 如任何先前實施例之方法，其中獲得該生物樣本包含獲得不超過100微升血液。16. 如任何先前實施例之方法，其中獲得該生物樣本包含獲得不超過40微升血液。17. 如任何先前實施例之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自腫瘤之無細胞核酸。18. 如任何先前實施例之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自胎兒之無細胞核酸。19. 如任何先前實施例之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自移植之組織或器官的無細胞核酸。20. 如任何先前實施例之方法，其中該方法包含以至少98%準確性偵測該至少一個目標序列之代表性正常、代表性過度或代表性不足。21. 如任何先前實施例之方法，其中該方法不包含全基因組擴增。22. 一種方法，其包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子；對該等無細胞核酸分子之至少一部分進行測序以產生測序讀段；量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。23. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係體積小於約500 µl之生物流體。24. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係體積為約1 µL至約100 µl之生物流體。25. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係體積為約5 µL至約80 µl之生物流體。26. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本具有約5 µL至約60 µl之體積。27. 如任何先前實施例之方法，其包含在測序之前，使該等無細胞核酸分子擴增。28. 如任何先前實施例之方法，其包含在測序之前且在擴增之後，標誌該等無細胞核酸分子。29. 如任何先前實施例之方法，其包含在測序之前，標誌該等無細胞核酸分子。30. 如任何先前實施例之方法，其包含在標誌該等無細胞核酸分子之後，使該等無細胞核酸分子擴增。31. 如任何先前實施例之方法，其包含在標誌該等無細胞核酸分子之前，使該等無細胞核酸分子擴增。32. 如任何先前實施例之方法，其中擴增包含使該等無細胞核酸分子與隨機寡核苷酸引子接觸。33. 如任何先前實施例之方法，其中該擴增包含等溫擴增。34. 如任何先前實施例之方法，其包含偵測對應於至少一個目標染色體之測序讀段的代表性過度。35. 如任何先前實施例之方法，其包含偵測對應於至少一個目標染色體之測序讀段的代表性不足。36. 如任何先前實施例之方法，其包含將對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之數量與對應於該至少一個目標染色體的測序讀段之參考數量相比較。37. 如任何先前實施例之方法，其包含量測對應於該至少一個染色體區之至少1000個測序讀段。38. 如任何先前實施例之方法，其包含量測對應於至少一個非目標染色體區之至少1000個測序讀段。39. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係生物流體。40. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本包含血液、血漿、血清、尿液、間質液、陰道細胞、陰道液、口腔細胞或唾液。41. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係血清或血漿。42. 如實施例41之方法，其進一步包含自血液樣本分離該血漿或血清。43. 如實施例41之方法，其中分離包含過濾該血液樣本以自該血液樣本移除細胞、細胞片段、微小泡囊或其組合，由此產生該血漿樣本。44. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係體積為約5 µl至約1 ml之血液樣本。45. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本係體積為約5 µl至約150 µl之血液樣本。46. 如實施例44或45之方法，其中獲得該血液樣本包含刺破手指。47. 如實施例46之方法，其進一步包含自該刺破之手指擠取或擠壓血液。48. 如實施例46之方法，其中該方法不包含自該刺破之手指擠取或擠壓血液。49. 如任何先前實施例之方法，其中獲得該血液樣本不包含靜脈切開術。50. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞核酸分子。51. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本含有約104 至約108 個無細胞核酸分子。52. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本含有約104 至約107 個無細胞核酸分子。53. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本含有低於300 pg之無細胞核酸分子。54. 如任何先前實施例之方法，其中該生物樣本含有低於3 ng之無細胞核酸分子。55. 如任何先前實施例之方法，其包含以超過98%準確性偵測該代表性正常、代表性過度或代表性不足。56. 如任何先前實施例之方法，其包含以超過99%準確性偵測該代表性正常、代表性過度或代表性不足。57. 如任何先前實施例之方法，其中該個體係懷孕個體且該等無細胞核酸分子包含無細胞胎兒核酸分子。58. 如任何先前實施例之方法，其包含將對應於該至少一個染色體區的測序讀段之數量與對應於該至少一個染色體區的測序讀段之參考數量相比較。59. 如實施例58之方法，其中該參考數量係基於來自懷有整倍體胎兒之至少一個整倍體懷孕個體的至少一個樣本。60. 如實施例58之方法，其中該參考數量係基於來自懷有非整倍體胎兒之至少一整倍體懷孕個體的至少一個樣本。61. 如實施例60之方法，其中該至少一個樣本係與該生物樣本相同之樣本類型及相同之樣本體積。62. 如實施例57之方法，其中該生物樣本包含約106 至約1012 個總無細胞核酸分子，其中該等總無細胞核酸分子基本上由該等無細胞胎兒核酸分子及母體無細胞核酸分子組成。63. 如任何先前實施例之方法，其包含當對應於該至少一個染色體區之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率不同於來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率時，偵測到存在具有該至少一個染色體區之胎兒非整倍體。64. 如任何先前實施例之方法，其包含當對應於該至少一個染色體區之測序讀段與對應於至少一個非目標染色體區之測序讀段的比率與來自懷有整倍體胎兒之對照懷孕整倍體個體之對照生物樣本中的相應比率相同時，偵測到不存在具有該至少一個染色體區之胎兒非整倍體。65. 如實施例63或64之方法，其中該至少一個染色體區係位於染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y中之至少一個上。66. 如實施例64或65之方法，其中該至少一個非目標染色體區係除染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X或染色體Y之染色體中的至少一個。67. 如實施例57至66中任一個之方法，其中該懷孕個體係低於5週孕齡。68. 如實施例57之方法，其中該懷孕個體係整倍體。69. 如實施例57之方法，該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞胎兒核酸。70. 如實施例57之方法，其中該生物樣本含有約104 至約108 個無細胞胎兒核酸。71. 如實施例57之方法，其包含對至少2000個無細胞胎兒核酸進行測序。72. 如實施例58之方法，其包含量測對應於該至少染色體區之至少1000個該等測序讀段。73. 如實施例58之方法，其中該至少一個染色體區之代表性係相對於懷有對照胎兒之至少一個對照懷孕個體中之對照代表性。74. 如實施例73之方法，其中該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒不具有非整倍體。74. 如實施例73之方法，其中該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒不具有基因異常。75. 如實施例73之方法，其中該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒具有對應於該染色體區之非整倍體。76. 如實施例73之方法，其中該至少一個對照懷孕個體及對照胎兒具有對應於該目標染色體區之基因異常。77. 如任何前述實施例之方法，其中該等無細胞核酸包含來自組織中之腫瘤的核酸。78. 如實施例77之方法，其包含將對應於該至少一個染色體區的測序讀段之數量與對應於該至少一個染色體區的測序讀段之參考數量相比較。79. 如實施例78之方法，其中該參考數量係基於來自在該組織中無該腫瘤之個體的至少一個樣本。80. 如實施例78之方法，其中該參考數量係基於來自在該組織中具有該腫瘤之個體的至少一個樣本。81. 如任何前述實施例之方法，其中該等無細胞核酸包含來自移植至該個體體內之器官或組織的核酸。82. 如任何前述實施例之方法，其中該等無細胞核酸對該器官或該組織具有特異性。83. 如任何前述實施例之方法，其中測序包含全基因組測序。84. 如任何前述實施例之方法，其中測序包含隨機大規模平行測序。85. 如任何前述實施例之方法，其中測序包含靶向測序。86. 如任何前述實施例之方法，其中測序包含奈米孔測序。87. 一種方法，其包含：自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子；分析該等無細胞核酸分子之至少一部分的至少一個染色體區上之表觀遺傳修飾；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。88. 一種方法，其包含：自個體獲得毛細血管血液；分析該等無細胞核酸分子之至少一部分的至少一個染色體區上之表觀遺傳修飾；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。89. 如實施例88之方法，其包含獲得不超過200 µl毛細血管血液。90. 如實施例88之方法，其包含獲得不超過100 µl毛細血管血液。91. 一種方法，其包含：自懷孕個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；標誌該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分以產生經標誌無細胞胎兒核酸分子；量測經標誌無細胞胎兒核酸分子之數量；以及偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。92. 如實施例91之方法，其包含標誌該生物樣本中之每個無細胞胎兒核酸分子。93. 如實施例91之方法，其中標誌該等無細胞胎兒核酸分子之至少一部分包含標誌來自目標染色體區之無細胞胎兒核酸分子。94. 如實施例91之方法，其中該方法不包含測序。95. 如實施例91之方法，其包含自至少一個懷孕個體獲得複數個生物樣本，其中該等生物樣本各含有至多約109 個無細胞胎兒核酸分子；以及用不同索引對來自各生物樣本之無細胞胎兒核酸分子編索引，由此向該等無細胞胎兒核酸分子提供樣本標識符。96. 如實施例91之方法，其包含標誌來自目標染色體區之無細胞胎兒核酸分子。97. 一種系統，其包含：經組態用於收集個體之流體樣本的樣本收集器；經組態用於自該流體樣本分離樣本成分之樣本處理器；經組態用於偵測該流體樣本或該樣本成分中之核酸的核酸偵測器；以及核酸資訊輸出裝置。98. 如實施例97之系統，其中該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。99. 如實施例97之系統，其中該穿皮穿刺裝置包含針、刺血針、微針、真空及微針陣列中之至少一種。100. 如實施例97之系統，其中該樣本成分選自細胞、碳水化合物、磷脂、蛋白質、核酸及微小泡囊。101. 如實施例100或101之系統，其中該樣本成分係血球。102. 如實施例97之系統，其中該樣本成分不包含無細胞核酸。103. 如實施例97之系統，其中該樣本成分包含無細胞核酸。104. 如實施例97之系統，其中該樣本成分係血漿或血清。105. 如實施例104之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於1毫升血液中分離出血漿。106. 如實施例105之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於250 µl血液中分離出血漿。107. 如實施例105之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於150 µl血液中分離出血漿。108. 如實施例105之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於100 µl血液中分離出血漿。109. 如實施例97之系統，其中該核酸偵測器包含核酸測序儀。110. 如實施例97之系統，其中該系統經組態用於標記該流體樣本中之所關注核酸，且該核酸偵測器包含計數系統，該計數系統對該等標記計數以偵測該樣本中所關注核酸之代表性。111. 如實施例110之系統，其包含該等標記，其中該等標記包含與該等所關注核酸雜交之寡核苷酸。112. 如實施例111之系統，其中該寡核苷酸對所關注染色體區具有特異性。113. 如實施例112之系統，其中該所關注染色體區位於選自染色體13、染色體16、染色體18、染色體21、染色體22、染色體X及染色體Y之染色體上。114. 如實施例112之系統，其中該所關注染色體區包含或能夠包含指示疾病或病狀之序列。115. 如實施例112之系統，其中該所關注染色體區包含或能夠包含指示疾病或病狀之至少一個表觀遺傳修飾。116. 如實施例114或115之系統，其中該病狀係基因異常。117. 如實施例114或115之系統，其中該疾病係癌症。118. 如實施例114或115之系統，其中該病狀係移植之組織或器官。119. 如實施例97之系統，其包含選自引子、聚合酶及其組合之至少一種核酸擴增試劑。120. 如實施例119之系統，其中該至少一種核酸擴增試劑包含至少一種等溫擴增試劑。121. 如實施例119之系統，其中該至少一種等溫擴增試劑包含重組酶聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、鏈置換聚合酶或其組合。122. 如任何先前實施例之系統，其包含至少一種核酸擴增試劑及至少一種擁擠劑。123. 如實施例97之系統，其包含至少一個用於由該流體樣本製造無細胞核酸集合庫之第一標記，及至少一種擴增試劑。124. 如實施例123之系統，其中該系統經組態用於用該至少一種擴增試劑使該等無細胞核酸擴增以產生至少一個擴增子及使該至少一個擴增子與至少該第一標記接觸以產生該集合庫。125. 如實施例124之系統，其中該系統經組態用於使該至少一個擴增子與第二標記接觸，其中該第二標記係可偵測的。126. 如實施例97之系統，其中該系統經組態用於產生該集合庫並用該至少一種擴增試劑使該集合庫之至少一個成員擴增。127. 如實施例97之系統，其中該核酸序列輸出裝置選自無線通信裝置有線通信裝置、電纜連接埠及電子顯示器。128. 如實施例97之系統，其中該系統之所有組件均存在於單一位置中。129. 如實施例97之系統，其中該系統之所有組件均容納於單一裝置中。130. 如實施例97之系統，其中該樣本收集器係位於第一位置處且該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在第二位置。131. 如實施例97之系統，其中該樣本收集器與該樣本純化器及核酸偵測器中之至少一個係在相同位置處。132. 如實施例97之系統，其中該樣本純化器包含過濾器。133. 如實施例97之系統，其中該樣本純化器包含用於推動或拉動該生物流體穿過該過濾器的浸潤材料或毛細管裝置。134. 如實施例147之系統，其中該過濾器具有約0.05微米至約2微米之孔徑。135. 如實施例97之系統，其中該樣本純化器包含結合該生物流體樣本中之核酸、蛋白質、細胞表面標記物或微小泡囊表面標記物之結合部分。136. 如實施例135之系統，其中該結合部分包含抗體、抗原結合抗體片段、配體、受體、肽、小分子或其組合。137. 如實施例135之系統，其中該結合部分能夠結合細胞外囊泡，其中該細胞外囊泡係自雌性個體之胎兒細胞或胎盤細胞釋放。138. 如實施例135之系統，其中該結合部分附接至固體載體，其中在該結合部分與該生物樣本接觸之後，該固體載體可以與該生物樣本之其餘部分分開或該生物樣本可以與該固體載體分開。139. 如實施例97之系統，其包含用於運輸或儲存該流體樣本之至少一部分的運輸或儲存隔室。140. 如實施例139之系統，其中該運輸或儲存隔室包含吸收墊、流體容器、樣本防腐劑或其組合。141. 如實施例139之系統，其中該運輸儲存隔室含有使該流體樣本之細胞穩定以進行運輸或儲存的試劑或材料。142. 如實施例97之系統，其包含容器、小袋、線及電纜中之至少一種，用於加熱或冷卻該裝置或其組件。143. 如實施例97之系統，其包含用於對無細胞核酸進行修復、純化、擴增及測序中之至少一種的至少一種緩衝液。145. 一種根據實施例97之系統的用途，其係用於偵測個體體內腫瘤之存在。146. 一種根據實施例97之系統的用途，其係用於偵測個體體內胎兒之非整倍體。147. 一種根據實施例97之系統的用途，其係用於偵測個體體內移植之器官的狀態。
實例
提供以下實例係出於說明本文所揭示之裝置、系統及套組之各種實施例的目的且不打算以任何方式限制本發明之裝置、系統及套組。本發明實例以及本文所描述之方法係目前較佳實施例之代表，為例示性的且不打算作為對本發明範圍之限制。熟習此項技術者將想到由申請專利範圍之範圍所界定的本文所揭示之裝置、系統及套組之精神內所涵蓋的其中之變化及其他用途。
實例 1 ： 超低 ( 約 20 µ l ) 量母體血液中三染色體症之偵測。
三染色體症偵測依賴於源自一個染色體之遺傳物質與源自其他染色體之遺傳物質之準確代表性的比較。將此比率與在整倍體群體中比率之分佈相比較。當((chr21/chr.all)-MEDIAN(chr21))/MAD(chr21)之比率在統計上與該分佈足夠不同時，稱為三染色體症。
儘管10%胎兒部分係9週及以上孕齡之典型群體的中值，但並非所有樣本均具有高達10%之胎兒部分含量且一些可能具有甚至更高的含量。胎兒部分之典型截止值係4%。考慮典型群體中胎兒部分之分佈且需要更普遍之特異性(99.9%)及靈敏度(99%)截止值的模型可以幫助說明關於此方法之輸入要求。在約5百萬標記物計數(序列讀段)下，可以實現此靈敏度。然而，若每個染色體分析一個標記物，則此將需要30,000細胞當量，但此並不可行。
本文所揭示之方法及系統係基於以下事實：在細胞凋亡過程中，每一基因組當量基本上分成2千萬個cfDNA片段(每個基因組30億鹼基對除以cfDNA之150個鹼基對平均大小)。由此表明，若可以將每一個cfDNA單分子自血液轉移至測序儀，則四分之一整倍體基因組之當量足以進行分析。
然而，實際上，該程序中之每個步驟因各種量之DNA損失而削弱。因此，要取樣高得多的量且經歷集合庫產生及測序程序。儘管DNA損失係在該程序之每個步驟產生，但最高損失通常出現在集合庫製備步驟。傳統方法顯示80%至90%之材料損失。通常，此損失藉由後續擴增步驟(通用PCR)使DNA之濃度達到下一代測序所需之必要含量來補償。儘管擴增係增加可用於測序之總體核酸材料的較佳方法，但在特定條件下，擴增無法補償在先前步驟期間所發生的資訊損失。簡單的假想實驗即可幫助理解資訊之損失。假定以1000基因組當量開始，此表示20*109 個cfDNA片段。若出現巨大損失且只有二個片段可用於擴增。一個片段來自參考區域且一個來自目標區域。僅二個片段不足以裝載測序設備，但經由擴增(PCR)，每個片段可以容易地複製數十億倍。現在擴增之後，有足夠材料可用於開始測序程序，但樣本中之資訊減少至該二個複本中所保持之資訊。且在此情況下，該資訊不足以進行整倍體與三染色體樣本之分類，因為兩種樣本類型將顯示不可區分之50%部分。
典型下一代測序儀之規格需要將5µl之4 nM溶液稀釋於995 µl NaOH中以製備20 pM溶液，將其中600 µl裝載於測序儀上。因此，需要總計1.2*1010 個DNA片段，以產生2千萬個測序計數。如以上所展示，4個樣本達2千萬計數足以且因此，每個樣本必須提供約3*109 個DNA片段。(因為每一基因組當量貢獻2千萬個DNA片段，故當未發生損失及擴增時，需要總計150基因組當量。)此概述於圖 6 中。
典型NIPT方案以大量cfDNA(6000基因組當量)開始，由此允許在集合庫製備期間之大量損失。接著，使該材料擴增且高度稀釋以使其適於測序。
典型樣本在每毫升血漿中含有1500基因組當量之cfDNA。常規抽取8至10 ml血液得到約4 ml血漿，產生6000基因組當量之可用cfDNA。採用DNA提取效率(90%)及集合庫製備效率(10%)之典型數量，約540基因組當量進行擴增(通常8至10個循環，此處例如有1000倍擴增)。擴增之後，總計540000基因組當量或1.08*1013 個DNA片段可用於測序。進行超過1000倍稀釋以將擴增集合庫調至所需的4 nM。參見表1。
表 1 . 標準 8 - 10 ml 抽血量
此資料可能錯誤地暗示，由於該程序中產生大量過量之DNA片段，故可以簡單地按比例縮小該反應以提供低於100 µl之血量。然而，歸因於前述資訊損失，此係不可能的。參見表2。在考慮DNA提取(效率90%)及集合庫製備(效率10%)期間之丟失以及PCR擴增(約10個循環)的胎兒部分下限(4%)下進行模擬顯示，靈敏度降低至少於25個(反曲點為10個)輸入DNA材料複本靈敏度在10個複本時降低至89%且在5個複本時降低至81%，對於含4%胎兒部分之樣本，兩個值在需要約95%理論靈敏度之市場中將係不可接受的。參見圖 7 。
表 2 .標準方案按比例縮小至 20 µ l 抽血量
相比之下，若增加集合庫效率(例如利用擁擠劑、末端修復)且減少擴增，則更多資訊得以保存且可以達成超過95%之靈敏度，甚至是在複本數(基因組當量)小於5情況下亦如此。參見表3及圖7。
表 3 . 增加集合庫效率及減少擴增之方案 實例 2. 使用超低輸入量 ccfDNA ( 1 - 20 基因組當量 ) 進行之 低覆蓋率全基因組邊合成邊測序的可行性。
經由靜脈穿刺將雄性全血(10 ml)收集至Streck無細胞DNA BCT中並藉由如下進行雙自旋離心處理，得到血漿：
自旋1 - 1330 rpm，20分鐘，無制動 自旋2 - 3300 rpm，10分鐘
血漿在4℃或-80℃下儲存待用。根據製造商之方案，在Qiagen循環核酸提取套組中使用4 ml方案，自血漿提取循環無細胞DNA，並在55 µl EB中溶離。在Quantstudio 6即時儀器上，使用SRY/RNA酶P Taqman雙重qPCR分析(Life Technologies)測定每個樣本之基因組當量。使用NEBNext Ultra II DNA集合庫製備套組，利用Illumina之NEBNext多路複用寡核苷酸(索引集引子1)(New England Biolabs)製備DNA集合庫。用於集合庫製備之模板ccfDNA以1:5自每個集合庫96 GE調定降至1 GE。考慮到較低模板量之化學計算量，使用較低體積產生集合庫。所用體積取決於模板之輸入量。集合庫製備由以下組成：
1. 藉由在20℃下培育30分鐘，隨後在65℃下培育30分鐘進行末端修復、5'-磷酸化及加腺苷酸尾。 2. 藉由在20℃下培育15分鐘進行接頭連接，隨後藉由在37℃下培育15分鐘裂解連接之接頭環。接頭以1:25稀釋至0.6 µM操作濃度。接著，使用SPRISelect珠粒對經裂解、接頭連接之集合庫進行基於珠粒之純化。在接頭連接之後，將珠粒體積增加至116 µl，以進一步增進高度斷裂之低濃度ccfDNA的結合。 3. 藉由在98℃下初始變性1分鐘，隨後進行13個循環的98℃變性10秒及在65℃下黏接/延伸75秒，且在65℃下進行最後一次延伸，持續5分鐘，進行集合庫擴增/編索引。接著，使用SPRISelect珠粒(45 µl)純化擴增之集合庫。
所有集合庫均使用配備高靈敏度DNA晶片之Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies)測定大小並表徵。在測序之前，使用Qubit v3.0(Life Technologies)測定濃度以進行集合庫稀釋。在測序之前，將每一集合庫正規化至2 nM濃度並彙集起來以進行變性及稀釋。使用Illumina NextSeq 550，在1.5 pM裝載濃度下進行邊合成邊測序。對每個索引/樣本進行七十五個循環的雙端測序(2×75)。一般而言，每個樣本在每一方向上產生約4百萬個通過過濾器之讀段。使用Bowtie，利用比對參數「-k 1-n 0」，將所有測序資料(fasta.gz文件)與人類參考基因組構造hg38相比對。為進一步分析，將人類基因組分成連續的50,000個鹼基對區域，又稱為50kb分組，並以精確至3位小數之精確度計算各分組中鹼基「G」及「C」之部分。對於每個分組，對以一分組開始的經比對之序列讀段進行計數。為進一步分析，藉由濾除不在染色體1至22(例如不包括染色體X及Y)上之分組來簡化資料。在此過濾之後，在每個分組之GC含量與讀段計數之間進行Loess回歸並計算中值分組計數。Loess回歸針對每一GC含量值提供期望的分組計數，又稱為期望值。此期望值除以中值分組計數，得到校正因子。接著，用量測的分組計數除以該校正因子，得到GC校正之分組計數並計算出GC校正之分組計數的中值。用所有50 kb分組除以中值GC校正之分組計數，得到GC正規化之分組計數並計算每個分組的中值及中值絕對偏差(MAD)。選出具有低MAD且中值為約期望值1之分組(將MAD ＞=0.25或中值＜0.7或中值＞1.3之分組濾除)。
由遞減量之ccfDNA輸入生成集合庫之電泳圖且其顯示總集合庫產物隨輸入而減少，但接頭二聚體量未顯著增加。參見圖8A-8C。y軸顯示相對螢光單位(強度)且x軸顯示時間，以秒計。在70秒處之主要峰係所希望的300 bp集合庫產物。自圖 8A 至圖 8B 至圖 8C ，自20 GE以1:5調定輸入基因組當量。相較於具有高得多的模板輸入之其他整倍體樣本，輸入降至1 GE產生足夠集合庫，以可接受之測序度量進行可行的邊合成邊測序。
實例 3 . 使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序 ， 用超低輸入量的自毛細血管血液分離之 ccfDNA ( 10 基因組當量 ) 進行的 低百分率 Y - 染色體 ( 2 . 5 % 或更高百分比 ) 偵測。
藉由使用接觸致動之刺血針(BD Microtainer)穿刺指尖毛細管床收集雌性或雄性全血並將血液收集至SAFE-T_FILL毛細管收集裝置(KABE Labortechnik, GMBH)中。藉由如下進行雙自旋離心處理毛細血管血液，得到血漿：
自旋1 - 1330 rpm，20分鐘 自旋2 - 3300 rpm，10分鐘
血漿在4℃下儲存待用。將雄性血漿以在2.5%-20%體積範圍內之不同百分含量摻加至雌性血漿中。接著，使用修改的用於10 μl血漿之方案，利用MagMax無細胞DNA分離套組(Life Technologies)自血漿提取出循環無細胞DNA。分離由以下步驟組成：
1. 將血漿與蛋白酶K(體積取決於起始輸入量)一起在60℃下培育20分鐘。 2. 溶解血漿/藉由在室溫下結合10分鐘，使其結合至DynaBeads MyOne矽烷順磁珠粒(2.5-5μl)。 3. 洗滌珠粒/ccfDNA複合物(體積取決於起始輸入量)。 4. 用80%乙醇(體積取決於起始輸入量)沖洗珠粒/ccfDNA複合物。 5. 藉由在室溫下培育2分鐘，自珠粒溶離出ccfDNA(體積取決於起始輸入量)。
基於先前之提取，在10 µl-4000 µl及公開資料之體積範圍內，估計各樣本之基因組當量為1 GE/µl血漿。使用所有溶離之ccfDNA作為集合庫產生之輸入。使用NEBNext Ultra II DNA集合庫製備套組，利用Illumina之NEBNext多路複用寡核苷酸(索引集引子1)(New England Biolabs)製備DNA集合庫。考慮到較低模板量之化學計算量，使用較低體積產生集合庫。所用體積取決於模板之輸入量。集合庫製備由以下組成：
1. 藉由在20℃下培育30分鐘，隨後在65℃下培育30分鐘進行末端修復、5-磷酸化及加腺苷酸尾。 2. 藉由在20℃下培育15分鐘進行接頭連接，隨後藉由在37℃下培育15分鐘裂解連接之接頭環。接頭以1:25稀釋至0.6 µM操作濃度。接著，使用SPRISelect珠粒對經裂解、接頭連接之集合庫進行基於珠粒之純化。在接頭連接之後，將珠粒體積增加至116 µl，以進一步增進高度斷裂之低濃度ccfDNA的結合。 3. 藉由在98℃下初始變性1分鐘，隨後進行13個循環的98℃變性10秒及在65℃下黏接/延伸75秒，且在65℃下進行最後一次延伸，持續5分鐘，進行集合庫擴增/編索引。接著，使用SPRISelect珠粒(45 µl)純化擴增之集合庫。
所有集合庫均使用配備高靈敏度DNA晶片之Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies)測定大小並表徵。在測序之前，使用Qubit v3.0(Life Technologies)測定濃度以進行集合庫稀釋。在測序之前，將每一集合庫正規化至2 nM濃度並彙集起來以進行變性及稀釋。使用Illumina NextSeq 550，在1.5 pM裝載濃度下進行邊合成邊測序。對每個索引/樣本進行七十五個循環的雙端測序(2×75)。一般而言，每個樣本產生約4百萬個通過過濾器之讀段。使用Bowtie，利用比對參數「-k 1-n 0」，將所有測序資料(fasta.gz文件)與人類參考基因組構造hg38相比對。為進一步分析，將人類基因組分成連續的50,000個鹼基對區域，又稱為50kb分組，並以精確至3位小數之精確度計算各分組中鹼基「G」及「C」之部分。對於每個分組，對以一分組開始的經比對之序列讀段進行計數。為進一步分析，藉由濾除不在染色體1至22(例如不包括染色體X及Y)上之分組來簡化資料。在此過濾之後，在每個分組之GC含量與讀段計數之間進行Loess回歸並計算中值分組計數。Loess回歸針對每一GC含量值提供期望的分組計數，又稱為期望值。此期望值除以中值分組計數，得到校正因子。接著，用量測的分組計數除以該校正因子，得到GC校正之分組計數並計算出GC校正之分組計數的中值。用所有50 kb分組除以中值GC校正之分組計數，得到GC正規化之分組計數並計算每個分組的中值及中值絕對偏差(MAD)。選出具有低MAD且中值為約期望值1之分組(將MAD ＞=0.25或中值＜0.7或中值＞1.3之分組濾除)。特別是對於Y染色體代表性之計算，對源自染色體Y之分組進行LOESS回歸。參見圖 10 及圖 11 。圖 10 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用自雌性及雄性之毛細血管血液/血漿混合物DNA分離之超低輸入量cfDNA進行的低百分率Y-染色體(2.5%或更高百分比)偵測。利用來源於藉由刺破手指收集之毛細血管血液的雌性/雄性血漿之混合物中超低量之cfDNA，發現染色體Y代表性在遞增量之雄性毛細血管血液源性血漿下仍相應增加。圖 11 顯示基於雙端測序資料得到的來自毛細血管血液與靜脈血之cfDNA之間的cfDNA片段大小分佈比較。自來源於靜脈血與毛細血管血液之超低量血漿得到的cfDNA之大小分佈看起來類似。源自染色體Y之序列讀段的代表性百分含量係藉由對源自染色體Y之分組的所有GC正規化值求和並除以排除源自染色體21及19之該等值的所有GC正規化值之總和計算。
實例 4 . 使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序 ， 利用超低輸入量之 ccfDNA ( 10 基因組當量 ) 進行的 低百分率 Y - 染色體 ( 2 . 5 % 或更高百分比 ) 偵測 .
經由靜脈穿刺將雌性或雄性全血(10 ml)收集至Streck無細胞DNA BCT中並藉由如下進行雙自旋離心處理，得到血漿：
自旋 1 - 1330 rpm，20分鐘，無制動
自旋2 - 3300 rpm，10分鐘
血漿在4℃下儲存待用。將雄性血漿以在2.5%-20%體積範圍內之不同百分含量摻加至雌性血漿中。接著，使用修改的用於10 μl或20 µl血漿之方案，利用MagMax無細胞DNA分離套組(Life Technologies)自血漿提取出循環無細胞DNA。分離由以下步驟組成：
6. 將血漿與蛋白酶K(體積取決於起始輸入量)一起在60℃下培育20分鐘。 7. 溶解血漿/藉由在室溫下結合10分鐘，使其結合至DynaBeads MyOne矽烷順磁珠粒(2.5-5μl)。 8. 洗滌珠粒/ccfDNA複合物(體積取決於起始輸入量)。 9. 用80%乙醇(體積取決於起始輸入量)沖洗珠粒/ccfDNA複合物。 10. 藉由在室溫下培育2分鐘，自珠粒溶離出ccfDNA(體積取決於起始輸入量)。
基於先前之提取，在10 µl-4000 µl及公開資料之體積範圍內，估計各樣本之基因組當量為1 GE/µl血漿。使用所有溶離之ccfDNA作為集合庫產生之輸入。使用NEBNext Ultra II DNA集合庫製備套組，利用Illumina之NEBNext多路複用寡核苷酸(索引集引子1)(New England Biolabs)製備DNA集合庫。考慮到較低模板量之化學計算量，使用較低體積產生集合庫。所用體積取決於模板之輸入量。集合庫製備由以下組成：
4. 藉由在20℃下培育30分鐘，隨後在65℃下培育30分鐘進行末端修復、5-磷酸化及加腺苷酸尾。 5. 藉由在20℃下培育15分鐘進行接頭連接，隨後藉由在37℃下培育15分鐘裂解連接之接頭環。接頭以1:25稀釋至0.6 µM操作濃度。接著，使用SPRISelect珠粒對經裂解、接頭連接之集合庫進行基於珠粒之純化。在接頭連接之後，將珠粒體積增加至116 µl，進一步增進高度斷裂之低濃度ccfDNA的結合。 6. 藉由在98℃下初始變性1分鐘，隨後進行13個循環的98℃變性10秒及在65℃下黏接/延伸75秒，且在65℃下進行最後一次延伸，持續5分鐘，進行集合庫擴增/編索引。接著，使用SPRISelect珠粒(45 µl)純化擴增之集合庫。
所有集合庫均使用配備高靈敏度DNA晶片之Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies)測定大小並表徵。在測序之前，使用Qubit v3.0(Life Technologies)測定濃度以進行集合庫稀釋。在測序之前，將每一集合庫正規化至2 nM濃度並彙集起來以進行變性及稀釋。使用Illumina NextSeq 550，在1.5 pM裝載濃度下進行邊合成邊測序。對每個索引/樣本進行七十五個循環的雙端測序(2×75)。一般而言，每個樣本產生約4百萬個通過過濾器之讀段。使用Bowtie，利用比對參數「-k 1-n 0」，將所有測序資料(fasta.gz文件)與人類參考基因組構造hg38相比對。為進一步分析，將人類基因組分成連續的50,000個鹼基對區域，又稱為50kb分組，並以精確至3位小數之精確度計算各分組中鹼基「G」及「C」之部分。對於每個分組，對以一分組開始的經比對之序列讀段進行計數。為進一步分析，藉由濾除不在染色體1至22(例如不包括染色體X及Y)上之分組來簡化資料。在此過濾之後，在每個分組之GC含量與讀段計數之間進行Loess回歸並計算中值分組計數。Loess回歸針對每一GC含量值提供期望的分組計數，又稱為期望值。此期望值除以中值分組計數，得到校正因子。接著，用量測的分組計數除以該校正因子，得到GC校正之分組計數並計算出GC校正之分組計數的中值。用所有50 kb分組除以中值GC校正之分組計數，得到GC正規化之分組計數並計算每個分組的中值及中值絕對偏差(MAD)。選出具有低MAD且中值為約期望值1之分組(將MAD ＞=0.25或中值＜0.7或中值＞1.3之分組濾除)。
特別是對於Y染色體代表性之計算，對源自染色體Y之分組亦進行LOESS回歸。源自染色體Y之序列讀段的代表性百分含量係藉由對源自染色體Y之分組的所有GC正規化值求和並除以排除源自染色體21及19之該等值的所有GC正規化值之總和計算。參見圖 9 。圖 9 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用自靜脈血分離之超低量cfDNA(10基因組當量)進行的低百分率Y-染色體(2.5%或更高百分比)偵測。將雄性血漿以固定量混入雌性血漿中以產生雌性/雄性血漿混合物。自該等血漿混合物提取出cfDNA並測序。測定染色體Y之代表性以顯示，藉由增加混入雌性血漿中之雄性血漿的量，仍可自超低輸入量之cfDNA精確地偵測到染色體Y代表性之相應增加。
實例 5 . 使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序 ， 利用超低輸入量之 ccfDNA ( 10 基因組當量 ) 進行的 胎兒染色體非整倍體之偵測
經由靜脈穿刺將全血(10 ml)收集至Streck 無細胞DNA BCT中並藉由雙自旋離心處理，得到血漿。新鮮處理血漿，在4℃或-80℃下儲存待用。接著，使用修改的用於1.2 ml血漿之方案，利用順磁珠粒自血漿中提取出循環無細胞DNA。分離由以下步驟組成：
1. 將血漿與蛋白酶K、糖原及溶解緩衝液及珠粒一起在室溫下培育20分鐘以進行溶解/結合。 2. 洗滌珠粒/ccfDNA複合物。 3. 自珠粒溶離出ccfDNA(42 µl)並在55℃溫度下培育10分鐘。
對提取之DNA定量以用於上游應用。將所有樣本正規化至每個集合庫33 pg(10GE)之總輸入量。使用NEBNext Ultra II DNA集合庫製備套組，利用Illumina之NEBNext多路複用寡核苷酸(索引集引子1)(New England Biolabs)製備DNA集合庫。考慮到較低模板量之化學計算量，使用較低體積產生集合庫。所用體積取決於模板之輸入量。集合庫製備由以下組成：
1. 藉由在20℃下培育30分鐘，隨後在65℃下培育30分鐘進行末端修復、5-磷酸化及加腺苷酸尾。 2. 藉由在20℃下培育15分鐘進行接頭連接，隨後藉由在37℃下培育15分鐘裂解連接之接頭環。接頭以1:25稀釋至0.6 µM操作濃度。接著，使用SPRISelect珠粒對經裂解、接頭連接之集合庫進行基於珠粒之純化。在接頭連接之後，將珠粒體積增加至116 µl，進一步增進高度斷裂之低濃度ccfDNA的結合。 3. 藉由在98℃下初始變性1分鐘，隨後進行13個循環的98℃變性10秒及在65℃下黏接/延伸75秒，且在65℃下進行最後一次延伸，持續5分鐘，進行集合庫擴增/編索引。接著，使用SPRISelect珠粒(45 µl)純化擴增之集合庫。
所有集合庫均使用配備高靈敏度DNA晶片之Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies)測定大小並表徵。在測序之前，使用Qubit v3.0(Life Technologies)測定濃度以進行集合庫稀釋。在測序之前，將每一集合庫正規化至2 nM濃度並彙集起來以進行變性及稀釋。使用Illumina NextSeq 550，在1.5 pM裝載濃度下進行邊合成邊測序。對每個索引/樣本進行七十五個循環的雙端測序(2×75)。一般而言，每個樣本產生約4百萬個通過過濾器之讀段。使用Bowtie，利用比對參數「-k 1-n 0」，將所有測序資料(fasta.gz文件)與人類參考基因組構造hg38相比對。為進一步分析，將人類基因組分成連續的50,000個鹼基對區域，又稱為50kb分組，並以精確至3位小數之精確度計算各分組中鹼基「G」及「C」之部分。對於每個分組，對以一分組開始的經比對之序列讀段進行計數。為進一步分析，藉由濾除不在染色體1至22(例如不包括染色體X及Y)上之分組來簡化資料。在此過濾之後，在每個分組之GC含量與讀段計數之間進行Loess回歸並計算中值分組計數。Loess回歸針對每一GC含量值提供期望的分組計數，又稱為期望值。此期望值除以中值分組計數，得到校正因子。接著，用量測的分組計數除以該校正因子，得到GC校正之分組計數並計算出GC校正之分組計數的中值。用所有50 kb分組除以中值GC校正之分組計數，得到GC正規化之分組計數並計算每個分組的中值及中值絕對偏差(MAD)。選出具有低MAD且中值為約期望值1之分組(將MAD ＞=0.25或中值＜0.7或中值＞1.3之分組濾除)。
根據簡化且正規化之資料，鑑別出源自染色體21之所有序列分組。源自染色體21之序列讀段的代表性百分含量係藉由對源自染色體21之分組的所有GC正規化值求和並用該總和除以排除源自染色體21及19(以及先前步驟中已排除之其他染色體，例如X及Y，除1-22之染色體)之分組之GC正規化值的所有GC正規化值之總和來計算。接著，計算一組已知之整倍體樣本(參考樣本)中染色體21代表性之中值及MAD。對於各樣本，用樣本特異性染色體21代表性減去中值染色體21代表性，得到樣本特異性差異值。用此樣本特異性差異值除以染色體21代表性MAD，得到一值，稱為Z分數。接著，基於Z分數對測試樣本進行分類，其中Z分數為3分及更高分數之樣本歸類為三染色體的且Z分數低於3分之樣本歸類為整倍體。參見圖 12 。所用參考樣本集由總計36個測序結果組成。20個係自一位雄性個體獲得。利用各種量的超低輸入量之循環無細胞DNA(cfDNA)產生集合庫：2個測序集合庫係由1基因組當量(GE)之cfDNA輸入量(約3.5pg cfDNA)產生；2個測序集合庫係由4 GE之cfDNA(約14 pg cfDNA)產生；4個測序集合庫係由10 GE之cfDNA(約35 pg cfDNA)產生；2個測序集合庫係由19 GE之cfDNA產生；3測序集合庫係由25 GE之cfDNA產生；3個測序集合庫係由50 GE之cfDNA產生；1個測序集合庫係由96 GE之cfDNA產生；2個測序集合庫係由100 GE之cfDNA產生；1個測序集合庫係由2000 GE之cfDNA產生。
亦對資料進行分析以建立一種獨立於參考樣本之方法，用於由來自懷孕女性之血液的超低輸入量循環無細胞DNA測定胎兒三染色體症之存在。使用Bowtie，利用比對參數「-k 1-n 0」，將所有測序資料(fasta.gz文件)與人類參考基因組構造hg38相比對。為進一步分析，將人類基因組分成連續的50,000個鹼基對區域，又稱為50kb分組，並以精確至3位小數之精確度計算各分組中鹼基「G」及「C」之部分。對於每個分組，對以一分組開始的經比對之序列讀段進行計數。
為進一步分析，藉由濾除不在染色體1至22(例如不包括染色體X及Y)上之分組來簡化資料。在此過濾之後，在每個分組之GC含量與讀段計數之間進行Loess回歸並計算中值分組計數。Loess回歸針對每一GC含量值提供期望的分組計數，又稱為期望值。此期望值除以中值分組計數，得到校正因子。接著，用量測的分組計數除以該校正因子，得到GC校正之分組計數並計算出GC校正之分組計數的中值。
用所有50 kb分組除以中值GC校正之分組計數，得到GC正規化之分組計數並計算每個分組的中值及中值絕對偏差(MAD)。選出具有低MAD且中值為約期望值1之分組(將MAD ＞=0.25或中值＜0.7或中值＞1.3之分組濾除)。
為偵測可能存在的染色體畸變(例如三染色體症)，對於各測試樣本，選擇來源於一個染色體之所有分組並減去校正因子。用於此分析中之具體校正值係：
Chr1 0.018246891、Chr2 0.020434185、Chr3 0.011982353、Chr4 0.001049686、Chr5 0.020581150、Chr6 0.009152075、Chr7 0.005677261、Chr8 0.022754399、Chr9 0.015059119、Chr10 0.021188753、Chr11 0.017143964、Chr12 0.007069202
Chr13 0.002157471、Chr14 0.010356892、Chr15 0.019037573、Chr16 0.009929239、Chr17 0.004990359、Chr18 0.023177486、Chr19 -0.063998368、Chr20 0.042335516、Chr21 0.00498782、Chr22 0.025008553。
接著，對此經過濾集合中源自染色體21之分組的數量(在此資料集中為657個)進行計數，且接著自所有可用分組中隨機地選出相同量之分組(657)，使其含有源自各種不同染色體之分組。接著，計算該組隨機選擇之分組中的代表性百分含量。對該組隨機選擇之分組的所有GC正規化值求和並除以所有GC正規化值之總和。重複最後的步驟一萬次並儲存每個值。接著，藉由對源自染色體21之所有GC正規化值求和並用此數字除以所有GC正規化值之總和，計算出源自染色體21之序列讀段的代表性百分含量。由此計算出源自染色體21之分組的代表性百分含量比重複一萬次的源自隨機選擇之分組之染色體代表性高出多少倍。參見圖 13 。用該總和除以10,000，得到在0與1之間的值，在本文中稱為「百分位」。基於百分位值對樣本進行分類：值為千分之十(1%)將樣本分類為三染色體症，值小於千分之十(小於1%)將樣本分類為整倍體。
實例 6 . 在家 無創產前測試
有流產史之懷孕女性懷疑其再次懷孕且其可能有約6週孕齡。其將意圖儘可能快地確定其確實懷孕且胎兒是否存在可能使其處於風險下之任何基因異常。其購買本文所揭示之無創產前測試裝置並將該裝置帶回家。在其最親密之家庭成員及朋友之情感支持存在下，其藉由將其手指按壓抵靠該裝置之孔中的微針陣列起始測試。裝置中之奈米孔測序儀對其血液樣本中足夠量之核酸(低於109 個胎兒核酸)進行測序以在低於約一小時內揭露所希望之遺傳資訊。USB連接埠或無線技術將序列資訊轉送至其電話上之應用程式或其電腦上之網站。該應用程式或網站採用軟體，以自測序讀段獲得遺傳資訊，揭露該女性之一組結果進行評述。或者，該裝置本身具有軟體讀取序列並在該裝置之窗口中產生屏面。該屏面確定該女性懷孕且包括關於該胎兒是否有已知之染色體畸變(例如染色體13、16、18、21、22、及/或X/Y之三染色體症)或其他基因異常的資訊。該屏面亦確定其懷孕且預期其懷有男孩。
實例 7 ：用微量體積之母體樣本進行無測試 .
考慮標準方法在DNA提取(效率90%)及集合庫製備(效率10%)期間之丟失以及PCR擴增(約10個循環)的胎兒部分下限(4%)下進行模擬顯示，準確性降低至少於25個(反曲點為10個)輸入DNA材料複本。準確性在10個複本時降低至89%且在5個複本時降低至81%，兩個值在關於含4%胎兒部分之樣本需要約95%理論準確性的市場中將係不可接受的。參見圖 7 淺灰色線。
當增加集合庫效率(增加至50%，相對於10%)並減少擴增時，保存更多資訊且可以實現大於95%之靈敏度，即使是在複本數(基因組當量)小於5時亦如此。參見圖 7 ，深灰色線。
表 4 . 有關自 20 µ l 血漿獲得胎兒遺傳資訊之工作流程 實例 8 ： 藉由對來自妊娠期婦女之無細胞 DNA 進行全基因組測序來分析胎兒染色體異常 .
自懷孕女性之生物流體獲得180 pg 無細胞DNA，該量相當於約100 µl血液中無細胞DNA之量。用DNA修復套組純化無細胞DNA並將其放入緩衝溶液中以保持其完整性。
為了製備無細胞DNA進行測序，用DNA片段末端修復套組修復無細胞DNA片段之末端。接下來，將修復之末端連接至街頭以產生接頭連接之DNA。
藉由將接頭連接之DNA與可以結合DNA之珠粒一起培育來純化接頭連接之DNA。使用磁體截留該等珠粒，用乙醇溶液洗滌帶有DNA之珠粒若干次，隨後自該等珠粒溶離接頭連接之DNA。
藉由在98℃下保持30秒進行初始變性步驟，隨後進行10個循環的98℃下10秒及65℃下75秒，隨後在65℃下最後一次延伸5分鐘來進行接頭連接之DNA的循環擴增。視情況，可以使用索引引子擴增接頭連接之DNA，此可用於在同一測序儀操作上執行多個樣本的情形。此等引子不同於在集合庫擴增之前引入的特有條形碼/標籤。與接頭連接之DNA類似，用珠粒及磁體系統純化擴增之DNA。對由此得到的經純化之擴增DNA進行測序。
用高通量測序機器進行測序，產生數百萬個測序讀段且讀段長度為30至500個鹼基對。該等索引允許同時自多個樣本獲得測序讀段。每次測序操作，獲得每個樣本約4百萬個讀段。
對於各樣本，進行以下步驟：
進行序列比對以偵測所有序列讀段之基因組起源。
將基因組子組放入50 kb長度之不重疊分組中。基於參考基因組，計算各分組的GC含量。對位於各分組區域中之序列讀段的數量進行計數。根據y=ax+b(y：預期計數，a：斜率，x：GC含量，b：截距)，計算有關該等分組之GC含量與計數之間之關係的線性模型。基於線性模型調整每個分組之計數以減小GC偏差。用於各分組，計算所有分組之中值計數之間的差異並自線性擬合減去預期之計數值。對於各相應分組，將此差異與觀察之計數值相加。計算源自所關注染色體之序列讀段的百分含量。在本實例中，所關注染色體係染色體21。
使用一組參考樣本計算源自染色體21之序列讀段的百分含量(稱為ref.p21)。計算該組ref.p21樣本之中值(稱為ref.med)以及中值絕對偏差(MAD)(稱為ref.mad)。
量測至少一個測試樣本之類似值(與上文所描述之方案相同)。計算源自染色體21之序列讀段的百分含量(稱為test.p21)。對於各樣本，藉由計算測試樣本中源自染色體21之序列讀段的百分含量與參考樣本之中值(test.p21-ref.med)之間的差值並用此差值除以參考集之中值絕對偏差來計算Z分數([test.p21-ref.med]/mad.ref)。結果參見圖 3 。
若發現Z分數值高於預定截止值(通常，該截止值等於3)，則該樣本可以解釋為具有源自染色體21之基因組材料的代表性過度。此代表性過度指示胎兒有第21對染色體三體症。相反，若Z分數小於預定截止值，則該樣本可以解釋為具有基因組材料之正常或代表性不足。此分析可以適用於其他染色體或染色體區域。
實例 9.藉由對母體血漿中之無細胞胎兒核酸進行測序來偵測基因異常 .
自懷孕個體收集血液樣本。該懷孕個體可以為少至5週孕齡。在一些情況下，其為少至7週孕齡。在一些情況下，該懷孕個體在家親自藉由在裝置上刺破其手指來收集血液。該懷孕個體將其樣本放在裝置中或容器中送至有樣本處理及測序設備之實驗室。或者，該裝置進行樣本處理(例如純化、目標富集)及/或測序，且因此，該懷孕個體不需要將其樣本送至實驗室。刺破手指獲得約100 µl血液，其中獲得約50 µl血漿或血清。因為在取樣時血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量平均為10%，所以該50 µl血漿含有約1.5×10^8個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，胎兒部分僅為4%，且100 µl血液樣本含有約6×10^7個無細胞胎兒核酸。由於血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量可以低至1%，所以應自個體獲得以確保在妊娠任何階段得到可靠資訊的最小血液體積係約2 µl。
實例 10 . 藉由對母體尿液中之無細胞胎兒核酸進行測序來偵測基因異常 .
自懷孕個體收集尿液樣本。該懷孕個體可以為少至5週孕齡。在一些情況下，其為少至7週孕齡。在一些情況下，懷孕個體在家親自收集尿液。該懷孕個體將其樣本放在裝置中或容器中送至有樣本處理及測序設備之實驗室。或者，懷孕個體將尿液樣本放入家用裝置中，進行樣本處理(例如純化、目標富集)及/或測序，且因此，懷孕個體不需要將其樣本送至實驗室。在一些情況下，尿液樣本之體積為約100 µl。由於在取樣時尿液樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量係4%，且尿液中無細胞核酸之典型濃度係8×10^11個片段/毫升，所以100 µl尿液含有約8×10^10個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，胎兒部分係4%，且尿液樣本含有約3.2×10^9個無細胞胎兒核酸。由於尿液樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量可以低至1%，所以應自個體獲得以確保在妊娠任何階段得到可靠資訊的最小尿液體積係約2 µl。
實例 11 . 藉由在實驗室中對自家中收集之樣本的母體血漿中之無細胞胎兒核酸進行計數來偵測基因異常
自懷孕個體收集血液樣本。該懷孕個體可以為少至5週孕齡。在一些情況下，其為少至7週孕齡。在一些情況下，該懷孕個體在家例如藉由親自刺破其手指來收集毛細血管血液。在一些情況下，該裝置分離出血液中的血漿。懷孕個體將其血液(或血漿樣本)裝在該裝置或容器中送至具有用於樣本處理、核酸庫製備及測序之試劑及設備的實驗室。在一些情況下，集合庫製備涉及用標記或信號標誌無細胞胎兒核酸，對其計數或定量。在一些情況下，該標記或信號連接至與特定無細胞胎兒核酸雜交之寡核苷酸。
該等特定無細胞胎兒核酸之量經由該信號或標記轉化成數量，並藉由懷孕個體、裝置或技術員進行分析來偵測。刺破手指獲得約100 µl血液，其中獲得約50 µl血漿或血清。因為在取樣時血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量為約10%，所以該50 µl血漿含有約1.5×10^8個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，胎兒部分僅為約4%，且100 µl血液樣本含有約6×10^7個無細胞胎兒核酸。由於血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量可以低至1%，所以應自個體獲得以確保在妊娠任何階段得到可靠資訊的最小血液體積係約2 µl。
在實驗室中分析之結果係以電子方式發送至懷孕個體。
實例 12 . 藉由在實驗室中對自家中處理之樣本的母體血漿中之無細胞胎兒核酸進行計數來偵測基因異常 .
自懷孕個體收集血液樣本。該懷孕個體可以為少至5週孕齡。在一些情況下，其為少至7週孕齡。在一些情況下，該懷孕個體在家親自藉由在裝置上刺破其手指來收集血液。該裝置進行進行處理(例如純化、目標富集)及集合庫製備。因此，懷孕個體僅需將其經過處理及製備之樣本送至測序機構或能夠對核酸測序之機構。
該等特定無細胞胎兒核酸之量經由該信號或標記轉化成數量，並藉由懷孕個體、裝置或技術員進行分析來偵測。刺破手指獲得約100 µl血液，其中獲得約50 µl血漿或血清。因為在取樣時血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量為約10%，所以該50 µl血漿含有約1.5×10^8個無細胞胎兒核酸。在一些情況下，胎兒部分僅為約4%，且100 µl血液樣本含有約6×10^7個無細胞胎兒核酸。由於血漿樣本之總無細胞核酸中無細胞胎兒核酸之百分含量可以低至1%，所以應自個體獲得以確保在妊娠任何階段得到可靠資訊的最小血液體積係約2 µl。
在實驗室中分析之結果係以電子方式發送至懷孕個體。
實例 13 . 偵測胎兒三染色體症
來自每個染色體之讀段大致係根據染色體之長度表示。大部分讀段係自染色體1獲得，而來自體染色體之最少讀段將來源於染色體21。用於偵測三染色體樣本之通用方法係量測一組整倍體樣本中源自一染色體之讀段的百分含量。接下來，計算該組染色體百分含量值之平均值及標準差。截止值係藉由平均值加三個標準差來確定。若新樣本具有高於截止值之染色體百分含量值，則可以假定染色體代表性過度，此通常與該染色體之三染色體症相符。
對於懷有整倍體胎兒之懷孕個體，自染色體21獲得的讀段之百分含量的平均值係1.27%且標準差為0.01%。因此，指示三染色體症之截止值係1.30%。此理論實例顯示三染色體症樣本中胎兒部分為10%且染色體21之百分含量為1.34。該樣本高於截止值且將正確地歸類為三染色體症樣本。懷有整倍體胎兒之整倍體個體中所有染色體的染色體百分含量之例示性平均值，以及懷有非整倍體胎兒之整倍體個體的樣本中所有染色體之百分含量顯示於表5中。
表 5 . 各 染色體之染色體百分比的平均值 * 類似截止值不可用於性染色體，因為此例示性方法僅適用於體染色體。實例 14 ：用於分析母體血液中之胎兒無細胞核酸的裝置
用於自全血中分離出血漿用於分析無細胞核酸目的之裝置包含6層。由下至上，此等層係：
(1)下部黏合片
(2)下部分離盤：由黏合片材料(對DNA或血漿無活性之聚合材料)製成的16 mm直徑盤且膠黏劑在面向下部黏合片一側上
(3)各種大小，通常在6與16 mm之間的聚醚碸(PES)膜，較佳設計之特徵在於10 mm PES膜。該膜用作浸潤材料，經由細管力自過濾器吸引血漿。
(4)濾片(例如Pall VividTM 膜)，16 mm直徑，粗糙側面朝向，有光澤側面向PES膜。
(5)上部分離盤：與下部分離盤之材料相同，12或14 mm直徑大小，在中心中含有4 mm孔。當使用黏合片材料時，現膠黏劑側面朝上以與上部黏合片相接。上部分離盤之直徑小於濾片直徑。由此允許來自上部黏合片之膠黏劑與濾片之邊緣相互作用且藉此在邊緣處密封該濾片。
(6)上部黏合片，在將定位該裝置之中心的位置處鑽有一個6 mm孔。
所有層沿其中心排列且接著使用標準辦公室層壓機器層壓。
該裝置經組態用於執行實例6中所述之測試。
施加血液並過濾至該裝置如下：
將100 μl全血施加至該裝置之中心，穿過上部黏合片中之孔及上部分離盤中之孔。血液在毛細管力作用下向中心分佈於整個濾片。血漿亦在毛細管力力作用下浸潤穿過濾片，到達PES膜。約二分鐘之後，最大量之血漿已轉移至PES膜中。將該裝置或具有PES膜之部分運送至實驗室進行DNA測試。
含有無細胞核酸之PES膜回收如下：
自該裝置移出PES膜。舉例而言，在PES膜之邊緣周圍切斷裝置。該膜易於與過濾器及下部盤分離。
自該膜溶離DNA如下：
將含有血漿之PES膜轉移至艾本德管(Eppendorf tube)(0.5 ml)中並添加100µl溶離緩衝液(溶離緩衝液可以為H2 O、EB緩衝液(QGEN)、PBS、TE或適於後續分子分析之其他物質)。自該膜溶離出DNA之後，對含有溶離之cfDNA的緩衝液進行基因分析，該基因分析涉及核酸擴增、標誌、測序或其組合。
儘管本文已顯示並描述本文所揭示之裝置、系統及套組的較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見此類實施例係僅作為實例提供。在不背離本文所揭示之裝置、系統及套組的情況下，熟習此項技術者現將想到多種變化、改變及取代。應理解，本文所揭示之裝置、系統及套組之實施例的各種替代例可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍界定該等裝置、系統及套組之範圍，且藉此涵蓋在此等申請專利範圍及其等效物之範圍內的方法及結構。
本文所揭示之方法、裝置、系統及套組的新穎特徵在所附申請專利範圍中細緻地陳述。參考以下實施方式及附圖將更好地理解本文所揭示之本發明裝置、系統及套組的特徵及優勢，以下實施方式闡述利用本文所揭示之裝置、系統及套組之原理的例示性實施例，且在附圖中：
圖 1 顯示本文所揭示之方法的可選工作流程。
圖 2 顯示如何將本文所揭示之方法及系統之成分分配於各種位置(物理及/或電子)間或主要聚焦於一個物理位置中的圖式。
圖 3 顯示由超低樣本量，藉由低覆蓋率全基因組邊合成邊測序(whole genome sequencing-by-synthesis)產生的三染色體症偵測之結果。描繪出參考及測試樣本中染色體21代表性的Z分數。點線代表Z分數為3分。測試樣本顯示Z分數等於或高於3分意味著，該樣本含有較高染色體21代表性且被視為染色體21三體。若該樣本來自妊娠期婦女，則所偵測到的染色體21之額外量係由胎兒貢獻且因此得出結論，該胎兒係染色體21三體。
圖 4A 顯示連接至遠程系統及個體之裝置的製程概述。圖 4B 顯示連接至遠程系統及個體之裝置的例示性介面。
圖 5 顯示行動裝置及行動應用程式如何組態成與本文所揭示之裝置、系統及套組連接、通信並自其接收遺傳資訊及其他資訊。圖 5A 顯示行動應用程式提供之各種功能。圖 5B 顯示指導使用者使用本文所揭示之裝置、系統及套組的逐步走查。圖 5C 顯示允許使用者起始測試、查看並共享測試結果，且與其他使用者交互的介面元件。圖 5D 顯示用於監測測試狀態之介面。圖 5E 顯示如何共享結果。
圖 6 顯示在使用8-10 ml靜脈血液作為起始量進行低覆蓋率全基因組測序之不同程序步驟中預期的cfDNA片段之典型量。
圖 7 顯示增加測序集合庫效率以顯著改善使用超低cfDNA輸入量之應用之靈敏度的重要性。
圖 8A -C顯示由遞減輸入量之無細胞(cfDNA)產生的測序集合庫之電泳圖。無細胞DNA之輸入量在圖8A中之20基因組當量(20 GE)降至圖8C中之1基因組當量(1 GE)間變化。儘管集合庫之總產率降低，但接頭二聚體之量未顯著增加且仍存在足夠量及品質之集合庫可用於成功序列分析。
圖 9 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用自靜脈血分離之超低量cfDNA(10基因組當量)進行的低百分率Y-染色體(2.5%或更高百分比)偵測。
圖 10 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用自雌性及雄性之毛細血管血液/血漿混合物DNA分離之超低輸入量cfDNA進行的低百分率Y-染色體(2.5%或更高百分比)偵測。
圖 11 顯示基於雙端測序資料得到的來自毛細血管血液與靜脈血之cfDNA之間的cfDNA片段大小分佈比較。
圖 12 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用來源於妊娠期婦女血液/血漿之超低輸入量cfDNA進行的胎兒染色體非整倍體偵測。使用來自非三染色體參考樣本之超低輸入量cfDNA測定染色體21代表性之中值及中值絕對偏差。測試樣本係來自懷有正常胎兒(無三染色體症)或患染色體21三染色體症之胎兒之妊娠期婦女的超低量cfDNA(10 GE)。
圖 13 顯示使用低覆蓋率全基因組邊合成邊測序，利用來源於妊娠期婦女血液/血漿之超低輸入量cfDNA進行的胎兒染色體非整倍體偵測。分析係在無參考樣本集存在下，使用測定第21對染色體三體症狀態之樣本內部方法進行。測試樣本係來自懷有正常胎兒(無三染色體症)或患染色體21三染色體症之胎兒之妊娠期婦女的超低量cfDNA(10 GE)。

Claims (48)

  1. 一種方法，其包含： a) 自個體獲得毛細血管血液，其中該毛細血管血液包含無細胞核酸； b) 視情況使該等無細胞核酸擴增； c) 標誌至少一部分無細胞核酸，以產生經標誌無細胞核酸之集合庫； d) 視情況擴增該等經標誌無細胞核酸； e) 對該等經標誌無細胞核酸之至少一部分進行測序；以及 f) 偵測該至少一部分經標誌無細胞核酸中至少一個目標序列的代表性正常、代表性過度或代表性不足。
  2. 如請求項1之方法，其包含產生具有至少0.5效率之集合庫。
  3. 如請求項1之方法，其包含在擁擠劑(Crowding agent)存在下，擴增該等無細胞核酸或經標誌無細胞核酸。
  4. 如請求項1之方法，其包含修復該等無細胞核酸之末端。
  5. 如請求項1之方法，其中獲得毛細血管血液包括獲得不超過1毫升血液。
  6. 如請求項1之方法，其中獲得毛細血管血液包括獲得不超過100微升血液。
  7. 如請求項1之方法，其中獲得毛細血管血液包括獲得不超過40微升血液。
  8. 如請求項1之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自腫瘤之無細胞核酸。
  9. 如請求項1之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自胎兒之無細胞核酸。
  10. 如請求項1之方法，其中該等目標無細胞核酸係來自移植之組織或器官的無細胞核酸。
  11. 一種方法，其包含： a) 自個體獲得生物樣本，其中該生物樣本含有至多約109 個無細胞核酸分子； b) 對至少一部分該等無細胞核酸分子進行測序以產生測序讀段； c) 量測對應於至少一個染色體區的測序讀段之至少一部分；以及 d) 偵測該至少一個染色體區之代表性正常、代表性過度或代表性不足。
  12. 如請求項11之方法，其中該生物樣本係體積小於約500 µl之生物流體。
  13. 如請求項11之方法，其中該生物樣本係體積為約1 µL至約100 µl之生物流體。
  14. 如請求項11之方法，其中該生物樣本係體積為約5 µL至約80 µl之生物流體。
  15. 如請求項11之方法，其中該生物樣本包含血液、血漿、血清、尿液、間質液、陰道細胞、陰道液、口腔細胞或唾液。
  16. 如請求項11之方法，其中該生物樣本係血清或血漿。
  17. 如請求項11之方法，其進一步包含自血液樣本分離出該血漿或血清。
  18. 如請求項17之方法，其中該分離包括過濾該血液樣本，以自該血液樣本移除細胞、細胞片段、微小泡囊或其組合，由此產生該血漿樣本。
  19. 如請求項17之方法，其中該血液樣本之獲得包括刺破手指。
  20. 如請求項11之方法，其中該生物樣本含有約104 至約109 個無細胞核酸分子。
  21. 如請求項11之方法，其中該生物樣本含有約104 至約107 個無細胞核酸分子。
  22. 如請求項11之方法，其中該生物樣本含有低於300 pg無細胞核酸分子。
  23. 如請求項11之方法，其中該生物樣本含有低於3 ng無細胞核酸分子。
  24. 如請求項11之方法，其中該個體係懷孕個體且該等無細胞核酸分子包含無細胞胎兒核酸分子。
  25. 如請求項11之方法，其中該等無細胞核酸包含來自組織中之腫瘤的核酸。
  26. 一種系統，其包含： a) 經組態用於收集個體之流體樣本的樣本收集器； b) 經組態用於自該流體樣本分離出樣本成分之樣本處理器； c) 經組態用於偵測該流體樣本或該樣本成分中之核酸的核酸偵測器；以及 d) 核酸資訊輸出裝置。
  27. 如請求項26之系統，其中該樣本收集器包含穿皮穿刺裝置。
  28. 如請求項27之系統，其中該穿皮穿刺裝置包含針、刺血針、微針、真空及微針陣列中之至少一種。
  29. 如請求項26之系統，其中該樣本成分選自細胞、碳水化合物、磷脂、蛋白質、核酸及微小泡囊。
  30. 如請求項26之系統，其中該樣本成分係血球。
  31. 如請求項26之系統，其中該樣本成分不包含無細胞核酸。
  32. 如請求項26之系統，其中該樣本成分包含無細胞核酸。
  33. 如請求項26之方法，其中該樣本成分係血漿或血清。
  34. 如請求項33之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於1毫升血液分離出血漿。
  35. 如請求項33之系統，其中該樣本純化器經組態用於自低於250 µl血液分離出血漿。
  36. 如請求項26之系統，其中該核酸偵測器包含核酸測序儀。
  37. 如請求項26之系統，其中該系統經組態用於標記該流體樣本中之所關注核酸，且該核酸偵測器包含計數系統，該計數系統會計算該等標記，以偵測該樣本中所關注核酸之代表性。
  38. 如請求項26之系統，其包含至少一種核酸擴增試劑及至少一種擁擠劑。
  39. 如請求項26之系統，其包含用於由該流體樣本製造無細胞核酸集合庫之至少一個第一標記，及至少一種擴增試劑。
  40. 如請求項26之系統，其中該核酸序列輸出裝置選自無線通信裝置、有線通信裝置、電纜連接埠及電子顯示器。
  41. 如請求項26之系統，其中該系統之所有組件均存在於單一位置中。
  42. 如請求項26之系統，其中該系統之所有組件均容納於單一裝置中。
  43. 如請求項26之系統，其中該樣本收集器係位於第一位置處且該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在第二位置。
  44. 如請求項26之系統，其中該樣本收集器與該樣本純化器及該核酸偵測器中之至少一個係在相同位置。
  45. 如請求項26之系統，其中該樣本純化器包含過濾器。
  46. 如請求項45之系統，其中該過濾器具有約0.05微米至約2微米之孔徑。
  47. 如請求項26之系統，其包含用於運輸或儲存至少一部分該流體樣本之運輸或儲存隔室。
  48. 如請求項47之系統，其中該運輸或儲存隔室包含吸收墊、流體容器、樣本防腐劑或其組合。
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