TW201922797A - 凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地，本公開涉及包含該凝血酶抗體CDR區的鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，以及包含凝血酶抗體和/或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。特別地，本公開涉及一種人源化的凝血酶抗體在製備用於治療凝血酶相關的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
本公開涉及凝血酶抗體、其抗原結合片段，進一步地，本公開還涉及包含該凝血酶抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，本公開還涉及包含該凝血酶抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為凝血酶相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
這裡的陳述僅是提供與本發明有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
血液凝固是防止受損血管出血(止血)的重要過程。然而，阻塞血液流經血管(血栓形成)或脫落後沉積在體內其它部位的血管(血栓栓塞)的血凝塊對健康是嚴重的威脅。血栓症(如急性心肌梗塞(AMI)、靜脈血栓塞等)是一類嚴重危及人類健康及生命的心血管疾病。世界衛生組織2008年統計，到目前，心血管發病及死亡率已經躍居第一位。世界每年心血管病死亡人數約1733萬人，占死亡總數30%，中國心血管患者2.9億人，每年死亡約350萬人， 占總死亡原因41%。2010年全球疾病負擔研究(GBD)統計，中風是我國居民第一大死因。所以近年來，研究有效的治療心血管疾病的藥物及方法引起了人們越來越多的關注。目前，一些抗凝血療法可以治療病理學血液凝固，例如使用傳統藥物肝素、小分子肝素或華法林，或者直接使用凝血酶(Thrombin)抑制劑達比加群酯(Dabigatran)等。這些療法的普遍缺陷是增加出血風險。許多抗凝藥物發揮藥效劑量(阻止血栓形成)和安全劑量(最高無出血風險)之間的窗口不夠大，考慮到個體病人的反應差異，該窗口將進一步縮小。以凝血酶為靶點，用凝血酶拮抗劑來抑制血栓的生成即是臨床治療血栓的方法之一。
凝血反應是一個複雜的信號級聯過程，凝血酶在其中佔有核心地位。凝血酶將循環系統的纖維蛋白原分解為纖維蛋白單體(可聚合形成纖維蛋白，血液凝塊的纖維基質)，對細胞也有很多直接調控。作為一種絲胺酸蛋白酶，它觸發血小板發生形變，釋放血小板活化劑ADP、血清素和血栓烷A2，以及趨化因子和生長因子。除此以外，還促進黏附分子P-選擇素和CD40配體遷移到血小板表面，進而激活整合素aIIb/b3。後者結合纖維蛋白原和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，進而介導血小板的聚集。凝血酶還刺激血小板表面的促凝血活性，反過來促進凝血酶的表達。在內皮細胞的培養中，凝血酶促進vWF的釋放，細胞質膜的P-選擇素的出現和趨化因子的產生。這些反應被認為觸發體內血小板和白細胞與內皮細胞表面 的結合。內皮細胞隨即改變形狀，內皮細胞層通透性增加。這些反應被預計將促進血漿蛋白的局部滲出，促進水腫。在非內皮組織中，凝血酶藉由作用於平滑肌細胞引起血管收縮。在成纖維細胞或血管平滑肌細胞的體外培養中，凝血酶調節細胞因子的產生並促進有絲分裂，在T淋巴細胞中它觸發鈣信號和其他的反應。這些細胞反應表明凝血酶將組織損傷與止血過程、炎症反應、甚至加強免疫應答的機體調控關聯在了一起。這些細胞反應也提出了一種可能性：除了組織受損外，內皮細胞和其他類型細胞的凝血酶可能在白細胞外滲，血管重塑和/或血管生成中也扮演了一定的角色。因此，凝血酶成為了一個極具潛力的，新的抗凝血抗栓靶標。
分離的抗凝血酶抗體分子應在體內抑制凝血酶，而不促進或大幅促進出血(bleeding)或溢血(haemorrhage)，即該抗體分子不抑制或大幅抑制對血管損傷的正常生理反應(即止血)。例如，止血不會被抗體分子抑制或會被其最低程度地抑制(即微小程度地抑制，不會影響病人的健康或需要進一步干預)。出血不會被抗體分子增加或會被其最低程度地增加。
儘管目前已有少量抗凝血酶抗體的專利公開，如WO2013123591、WO2014153195、WO2014202992、WO2014202993、CN107043423A和WO2017133673。到目前為止，還沒有抗凝血酶抗體藥物上市，有必要進一步開發和篩選活性更好的抗凝血酶抗體進行相關的臨床研究和 應用。
本公開提供與凝血酶的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或其抗原結合片段(也可稱凝血酶結合蛋白)。
一方面，本公開提供一種單株抗體或其抗原結合片段，該單株抗體或其抗原結合片段結合人凝血酶，該單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、4和9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13為分別具有如下通式所示的胺基酸序列：HCDR3 DHYX1GNSYVFDX2 SEQ ID NO：9
LCDR1 KAX3X4X5X6YNRLA SEQ ID NO：11
LCDR2 GX7TX8LEX9 SEQ ID NO：12
LCDR3 QQYWX10X11PWT SEQ ID NO：13
其中：X1選自His、Leu；X2選自Tyr、Leu；X3選自Ser、Thr；X4選自Glu、His；X5選自Asp、Arg；X6選自Ile、Met；X7選自Ala、Thr；X8選自Ser、Gln、Lys；X9選自Thr、Gly；X10選自Ser、Gly；X11選自Thr、Asn、Tyr；且當X1為His時，X2不為Tyr，並且X3至X11不同時選自如下胺基酸：X3為Ser、X4為Glu、X5為Asp、X6為Ile、X7為Ala、X8為Ser、X9為Thr、X10為Ser和X11 為Thr。在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段和凝血酶的親和力與凝血酶原(pro-thrombin)的親和力的比值大於25。
在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、4和15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；在一些實施方式中，該輕鏈可變區中的LCDR1的序列選自如SEQ ID NO：6、17和18所示的任一序列，輕鏈可變區中的LCDR2的序列選自如SEQ ID NO：7、19和20所示的任一序列，輕鏈可變區中的LCDR3的序列選自如SEQ ID NO：8、21和22所示的任一序列，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3不同時選自如下序列：LCDR1選自SEQ ID NO：6、LCDR2選自SEQ ID NO：7和LCDR3選自SEQ ID NO：8。
在一些實施方式中，在該單株抗體或其抗原結合片段中，該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、4和15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區為選自如下a至i中任一項所述的輕鏈可變區：a、包含分別如SEQ ID NO：17、19和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，b、包含分別如SEQ ID NO：6、19和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，c、包含分別如SEQ ID NO：17、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，d、包含分別如SEQ ID NO：6、20和8所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，e、包含分別如SEQ ID NO：17、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，f、包含分別如SEQ ID NO：6、7和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，g、包含分別如SEQ ID NO：6、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，h、包含分別如SEQ ID NO：18、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區，和i、包含分別如SEQ ID NO：18、7和22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，前述單株抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，前述單株抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
其中該重鏈可變區序列通式(SEQ ID NO：10)如下： 該輕鏈可變區序列通式(SEQ ID NO：14)如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAX3X4X5X6YNRLAWYQ 其中：X1選自His、Leu；X2選自Tyr、Leu；X3選自Ser、Thr；X4選自Glu、His；X5選自Asp、Arg；X6選自Ile、Met；X7選自Ala、Thr；X8選自Ser、Gln、Lys；X9選自Thr、Gly；X10選自Ser、Gly；X11選自Thr、Asn、Tyr；且當X1為His時，X2不為Tyr，並且X3至X11不同時選自如下胺基酸：X3為Ser、X4為Glu、X5為Asp、X6為Ile、X7為Ala、X8為Ser、X9為Thr、X10為Ser和X11為Thr。
在一些實施方式中，前述單株抗體或其抗原結合片段包含選自如下j至r重鏈可變區和輕鏈可變區：j、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區；k、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區；l、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；m、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區；n、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：27所示的輕鏈可變區；o、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區； p、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區；q、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變區；和r、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，前述單株抗體或其抗原結合片段進一步包括抗體恆定區。在一些實施方式中，其中抗體包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和/或包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；較佳地，該重鏈恆定區為與人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列具有至少85%序列同一性的重鏈恆定區變體，例如藉由胺基酸突變增強抗體功能(例如延長抗體在血清中的半衰期、增強抗體穩定性等)的IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區變體，較佳為YTE突變、L234A和/或L235A突變、或S228P突變的IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區變體；該輕鏈恆定區為與人源κ、λ鏈序列具有至少85%序列同一性的輕鏈恆定區變體。在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：32序列所示或與SEQ ID NO：32具有至少85%序列同一性的重鏈恆定區，和/或如SEQ ID NO：33序列所示或與SEQ ID NO：33具有至少85%序列同一性的輕鏈恆定區。其中上述具有至少85%序列同一性的重/輕鏈恆定區，較佳為具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、或99%序列同一性，更佳為具有90%、95%或99%以上序列同一性的胺基酸序列，所述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列可以是藉由一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得。
在一些實施方式中，前述單株抗體或其抗原結合片段中，該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
另一方面，本公開還提供一種核酸分子，其編碼前述的單株抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本公開還提供一種重組載體，其包含前述的核酸分子。
另一方面，本公開還提供一種用根據前述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳為哺乳動物細胞。
另一方面，本公開還提供用於生產前述的單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括將前述的宿主細胞在適合該宿主細胞生長的培養基中進行培養以形成並積累前述的單株抗體或其抗原結合片段，以及從培養物中回收所積累的該單株抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本公開還提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的根據前述的單株抗體或其抗原結合片段、或前述的核酸分子、或前述的重組載體、或前述的宿主細胞，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。 在一些實施方式中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的抗體或其抗原結合片段；在一些實施方式中，醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量為0.1至2000mg；在另外一些實施方式中，醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量為1至1000mg。
另一方面，本公開還提供用於體外免疫檢測或測定人凝血酶的方法，該方法包括使用包含前述的單株抗體或其抗原結合片段的試劑進行檢測或測定的步驟。
另一方面，本公開還提供前述的單株抗體或其抗原結合片段在製備與凝血酶相關的疾病的診斷劑中的用途。
在一些方面，本公開還提供一種與凝血酶相關的疾病的治療或預防方法，該方法包括向受試者施用治療或預防有效量的前述單株抗體或其抗原結合片段、或前述的核酸分子、或前述的重組載體、或前述的宿主細胞、或前述的醫藥組成物，以治療或預防凝血酶相關的疾病，其中該疾病包括但不限於血栓性疾病；較佳為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；更佳為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
在另一方面，本公開還提供一種前述的單株抗體或其抗原結合片段、或前述的核酸分子、或前述的重組載體、或前述的宿主細胞、或前述的醫藥組成物在製備與凝血酶相關的疾病的治療劑中的用途，其中該疾病較佳為血栓性 疾病；更佳為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；最佳為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
在另一方面，本公開還提供一種作為藥物的前述的單株抗體或其抗原結合片段，和/或前述的核酸分子、和/或前述的重組載體、和/或前述的宿主細胞、和/或如所述的醫藥組成物；較佳地，該藥物藥物用於治療或預防凝血酶相關的疾病；較佳地，該藥物用於治療血栓性疾病，該血栓性疾病包括但不限於：靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；更佳地，該疾病為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
在另一方面，本公開還提供一種可用於治療疾病的單株抗體或其抗原結合片段或其組合物，其中該單株抗體或其抗原結合片段為前述任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，該疾病包括但不限於血栓性疾病；較佳為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；更佳為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
在一些實施方式中，本公開凝血酶單株抗體或其抗原結合片段與凝血酶的結合並不抑制或大幅抑制對血管損傷的正常生理反應(即止血)。
在一些實施方式中，本公開凝血酶單株抗體或其抗原結合片段具有很高的特異性與凝血酶的高親和力，大大提高APTT時間。
在一些實施方式中，本公開凝血酶單株抗體或其抗原結合片段具有特異性識別凝血酶的良好選擇活性。
在一些實施方式中，本公開即提供一種親和力高，對血栓生成具有顯著抑制活性，並具有更高選擇活性的新型凝血酶抗體。
第1圖為凝血酶抗體對凝血酶酶活的檢測。
第2圖為正常人血漿活化部分凝血活酶時間(APTT)的檢測。
發明詳述
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
“單株抗體”或“單抗”是指從基本上均質抗體的群體獲得的抗體，即除可能的變體抗體(例如含有天然存在的突變或在製造單株抗體製劑的期間產生的突變，這些變體通常以少量存在)之外，構成該群體的個別抗體相同和/或結合 相同表位。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製備物不同，單株抗體製備物(製劑)的每個單株抗體是針對抗原上的單一決定簇的。因此，修飾語“單株”指示如從基本上均質抗體群體獲得的抗體的特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來製造抗體。例如，本公開的單株抗體可藉由各種技術製備，該技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，此類方法以及用於製備單株抗體的其他示例性方法在本文中進行描述。
本公開所述的“抗體(antibody，Ab)”指免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈，據此可以將抗體分為兩型(type)。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。根據λ鏈恆定區個別胺基酸的差異，又可分為λ1、λ2、λ3和λ4四個亞型(subtype)。
在本公開中，本公開所述抗體輕鏈可進一步包含輕鏈 恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(framework region，FR，也稱框架區、構架區)連接組成。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR或VL)和重鏈可變區(HCVR或VH)由3個CDR區和4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方式中，本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))。
本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳為人源化抗體。
術語“鼠源抗體”是根據本領域知識和技能製備的來源於小鼠的單株抗體。製備時用抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤，當所注 射的試驗對象為小鼠時，所產生的抗體為鼠源抗體。在本公開的其中一個實施例中，“鼠源抗體”是根據本領域知識和技能製備的結合人凝血酶的單株抗體。製備時用凝血酶抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個實施方案中，該鼠源凝血酶抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個具體的實施方案中，該凝血酶嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該凝血酶嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變，L234A和/或L235A突變，或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，包括CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植 到人的抗體可變區框架(即不同類型的人種系抗體框架序列)中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(因特網http：//www.vbase2.org)中獲得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本公開一個實施方案中人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈序列，和人種系輕鏈序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變(回復突變，即將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基)，以保持活性。
CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基的變化而導致產生的抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可能是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺 基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。
在本公開一個實施方案中，該人源化抗體或其抗原結合片段，可進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。在本公開一個實施方案中，包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變，L234A和/或L235A突變，或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區變體。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，凝血酶)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成，還包括最大抗體(maxibody)、微型抗體(minibody)、胞內抗體 (intrabody)、三抗體、四抗體、v-NAR(v-new antigen receptor)及雙scFv(參見例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23.9：1126-1136)；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的一般技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選的片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)，IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。本公開的一些實施例中，該抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000Da的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
本公開的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。
F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000Da並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
本公開的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000Da並具有抗原結合活性的抗體片段。本公開的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本公開的特異性識別凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可 變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1至4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本公開的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。
雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。
本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物 表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本公開的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
包含CDR的肽是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。
本公開的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。
本文中使用的術語“抗體框架”，是指可變結構域VL 或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“胺基酸突變”或“胺基酸差異”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個、2個、3個或數個胺基酸的插入、缺失或替換。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，凝血酶分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10-8M，例如大約小於10-9M、10-10M、10-11M或更小的親和力(KD)結合。
術語"KD"是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本公開的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合凝血酶，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
“親和力”是指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離平衡常數 (KD)來表述。親和力可藉由本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的那些。
“親和力成熟的抗體”指這樣的抗體，在抗體的一個或多個高變區(CDR)中具有一處或多處改變，導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有提高。
當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體或特異性結合的抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如凝血酶抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990， Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面上)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。或者藉由固定抗原結合蛋白A，檢測與抗原結合蛋白預先結合的標記過的抗原信號變化來測定競爭性抑制。通常，這種競爭性抑制測試會調換抗原結合蛋白A和抗原結合蛋白B的位置進行確認。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白；以及，與充分接近參考抗原結合蛋白結合的表位所鄰近的表位發生結合的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，部分競爭性抗原結合蛋白抑制(例如降低)至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%)參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在完全競爭情況下，參考抗原結合蛋白與抗原的結合被抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或更多。抑制小於30%被認為是不競爭。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼 序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠遞送一個或多個目標基因或序列並且較佳地在宿主細胞中表達其的構建體。載體的實例包括，但不限於，病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑締合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體和某些真核生物細胞諸如生產細胞。在本公開的一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人凝血酶或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從網站 http：//www.imgt.org/得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括微生物(例如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NSO細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人凝血酶特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混 合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段的組合物或編碼抗體或其抗原結合片段的核酸分子，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方 法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指蛋白質或多肽中的胺基酸被具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸取代，使得在不改變蛋白的生物學活性或其他所需特性(例如抗原親和力和/或特異性)的情況下，可以經常進行改變。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代如下表所示：
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症 的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本公開的一個實施方式中，“有效量”為獲得消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作(包括但不限於，病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀)的任一種或多種有益結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量；在另一個一個實施方式中，“有效量”為獲得有益的或所需的臨床結果(包括但不限於，諸如減少各種凝血酶相關病症的發病率或改善所述病症的一個或多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的凝血酶相關病症的進展)所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”、“同一性”在本文中可以互換，是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的 位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的一般BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量 的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1至3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
此外，本公開包括用於治療與凝血酶相關的疾病的藥 劑，該藥劑包含本公開的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。
對與凝血酶相關的疾病沒有限制，只要它是與凝血酶相關的疾病即可，例如利用本公開的分子誘導的治療反應可藉由結合人類凝血酶然後抑制凝血酶活性，從而抑制凝血。因此，當處於適於治療應用的製備物和製劑中時，本公開的分子對這樣一些人是非常有用的，他們患有血栓性疾病；更佳為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；最佳為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
此外，本公開涉及用於免疫檢測或測定凝血酶的方法、用於免疫檢測或測定凝血酶的試劑、用於免疫檢測或測定表達凝血酶的細胞的方法和用於診斷與凝血酶相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別人凝血酶並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。
在本公開中，用於檢測或測定凝血酶的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與凝血酶相關的疾病可以藉由用本公開的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達凝血酶的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本公開中，對用於檢測或測定凝血酶的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達凝血酶的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別所述單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制著本公開的範圍。本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例1. h1601-008對凝血酶選擇活性提高
對h1601-008(參見WO2017133673A1所述的h1601-008)進行進一步的親和力成熟，針對凝血酶和凝血酶原進行淘選，在保證抗體對凝血酶的結合活性不降低的前提下，進一步，以提高抗體對兩種分子結合的選擇活性。
>h1601-008 VH：(SEQ ID NO：1)
>h1601-008 VL：(SEQ ID NO：2)
提高選擇活性採用M13噬菌體展示技術。採用基於密碼子的(codon-based)引子(在引子合成過程中，單個密碼子 都由野生型密碼子和NNK組成)在每個CDR引入突變，每個CDR都構建一個單獨的噬菌體展示文庫。根據CDR的長短，調整每個CDR需要摻入的NNK比例和需要文庫的庫容大小，具體方案見表2。
將構建好的6個文庫藉由重疊延伸PCR的方法連接組合在一起，形成一個庫容大於1E9的組合文庫。將組合文庫包裝成噬菌體，進行淘篩：在液相與高濃度的凝血酶原室溫預孵育後，再加入生物素化的凝血酶結合，鏈黴親和素磁珠捕獲，淘洗，沖提，重新侵染大腸桿菌，進行下一個循環的淘篩。每一輪淘篩將生物素化凝血酶濃度降低2至5倍。3輪淘篩之後，每個文庫挑取單株進行測序驗證。發現HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3都有明顯的胺基酸富集，根據CDR區胺基酸殘基富集程度，挑選獲得部分純株如H4L9、H4L10、H4L11、H4L12、H4L13、H4L14、H4L15、H4L17、H4L18、H4L19，構建全長免疫球蛋白進 行哺乳動物細胞表達。
所挑選的純株與h1601-008在HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3上都有差異。相關的HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3通式及其相應輕重鏈可變區如下所描述。
篩選獲得的HCDR3序列通式(SEQ ID NO：9)如下：DHYX1GNSYVFDX2；進而獲得相關的重鏈可變區序列通式(SEQ ID NO：10)如下： 在SEQ ID NO：9和10中X1選自H，L；X2選自Y，L；其中X1為H時X2不為Y。
篩選獲得的LCDR序列通式如下：LCDR1 KAX3X4X5X6YNRLA SEQ ID NO：11；LCDR2 GX7TX8LEX9 SEQ ID NO：12；LCDR3 QQYWX10X11PWT SEQ ID NO：13；進而獲得相關的輕鏈可變區序列通式(SEQ ID NO：14)如下： 在SEQ ID NO：11至14中X3選自S，T；X4選自E， H；X5選自D，R；X6選自I，M；X7選自A，T；X8選自S，Q，K；X9選自T，G；X10選自S，G；X11選自T，N，Y，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3不同時分別為KASEDIYNRLA、GATSLET和QQYWSTPWT。
獲得的具體相關序列包括但不限於表3和表4所述：
抗體重鏈可變區H4：(SEQ ID NO：16)
抗體輕鏈可變區L9：(SEQ ID NO：23)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKATEDMYNRLAWYQ 抗體輕鏈可變區L10：(SEQ ID NO：24) 抗體輕鏈可變區L11：(SEQ ID NO：25) 抗體輕鏈可變區L12：(SEQ ID NO：26) 抗體輕鏈可變區L13：(SEQ ID NO：27)
抗體輕鏈可變區L14：(SEQ ID NO：28) 抗體輕鏈可變區L15：(SEQ ID NO：29)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQ 抗體輕鏈可變區L17：(SEQ ID NO：30) 抗體輕鏈可變區L18：(SEQ ID NO：31) 上述抗體的輕重鏈可變區，選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恆定區分別與各重鏈可變區和輕鏈可變區組合，形成完整的抗體重鏈和輕鏈，其中重鏈在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其它已知的突變來增加其性能。
抗體重鏈恆定區：(SEQ ID NO：32) KSLSLSLGK
輕鏈恆定區：(SEQ ID NO：33)
示例性地，經親和力成熟和篩選之後所形成的完整抗體包括：
株蛋白經純化後，利用biacore測定抗體與凝血酶和凝血酶原的親合力。
以下用生化測試方法驗證本公開抗體性能及有益效果。
測試例1. 凝血酶抗體結合人凝血酶蛋白的ELISA實驗
抗凝血酶抗體的結合力藉由抗體與帶His標簽的人凝 血酶的ELISA實驗來檢測。用生物素標記試劑盒(東仁化學，Cat No.LK03)標記的帶His標簽的凝血酶藉由與包被在酶標板中的鏈黴親和素結合，從而固定到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和凝血酶的結合活性，具體實驗方法如下。
用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將鏈黴親和素(Sigma，Cat No.S4762-5MG)稀釋至5μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05% tween-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(pH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/ml的生物素標記的帶His標簽的人凝血酶，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度的本公開凝血酶待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育10至15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血 酶抗體對人凝血酶的結合EC50值。結果如表6所示。
結果顯示本公開篩選得到的人源化抗體與人凝血酶蛋白有較高的結合活性，較h1601-008有大幅提高。
測試例2. 凝血酶抗體結合人凝血酶原蛋白的ELISA實驗
凝血酶原是酶解活化得到凝血酶的前體。抗凝血酶原抗體的結合力藉由抗體與人凝血酶原的ELISA實驗來檢測，具體實驗方法如下。
用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將帶His標簽的人凝血酶原(SEQ ID NO：2)稀釋至10μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板中，4 ℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進行封閉。封閉結束後棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05% tween-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(pH7.4 PBS含1%BSA)梯度稀釋的本公開凝血酶待測抗體和對照抗體Ichorcumab(來自WO2013088164)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育10至15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對人凝血酶原的結合EC50值。
測試例3. BIAcore檢測凝血酶抗體親和力實驗
按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中所述的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於芯片表面流經凝血酶抗原帶His標簽的人凝血酶，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物芯片洗淨再生。對經噬菌體展示技術篩選獲得的抗體進行親和 力測試，結果見表8：
由上可知，藉由噬菌體展示技術篩選得到的新抗體，對凝血酶的親和力提高明顯，同時相對凝血酶原的親和力也有所提高，但上述抗體選擇活性則大大增高。抗體的選擇活性均大於25，其中H4L13相較於h1601-008最高提高了2.99倍(33.42/11.18)。
測試例4. 凝血酶抗體對凝血酶酶活的影響
本實驗藉由測試凝血酶對其受質S2228的酶解活性，檢測本公開抗體對凝血酶酶活的影響。
用pH7.4的PBS梯度稀釋帶His標簽的人凝血酶至濃度為100nM，25μl/孔，加入黑壁透明底96孔板中。用PBS把本公開凝血酶待測抗體梯度稀釋至濃度為2000nM至62.5nM(1：2梯度稀釋)，25μl/孔，也加入此板中。室溫孵育30至60分鐘後，用PBS稀釋S2228(用於檢測凝血酶活性的受質，吉爾生化(上海)有限公司合成)至濃度為4mM，50μl/孔，加入到上一步驟的板中。陰性對照為僅加入凝血酶，或僅加入S2228的對照孔。室溫孵育30分鐘後，用NOVOStar酶標儀在波長405nm處讀取吸收值。結果見第1圖，其中僅含凝血酶和僅含S2228表示陰性對照孔測出的OD值，0.625：1、1.25：1、2.5：1、5：1、10：1、20：1表示待測抗體與凝血酶的不同莫耳比時測出的OD值。
第1圖結果表明，h1601-008及噬菌體展示所獲得的抗體與凝血酶結合後，並不影響其對受質S2228的酶解活性。
凝血酶抗體藥效學實驗
測試例5. 正常人血漿APTT實驗
本實驗藉由將正常人血漿與IgG和不同濃度的凝血酶抗體共孵育，測試本公開抗體對APTT值(activated partial thromboplastin time，活化部分凝血活酶時間)的影響。
IgG為陰性對照，即利用傳統的親和層析方法如ProteinA純化獲得的人免疫球蛋白；Ichorcumab(來自 WO2013088164)為陽性對照，檢測h1601-008以及本公開不同濃度待測抗體。
實驗結果如第2圖所示，隨著抗體h1601-008和噬菌體展示獲得的抗體的濃度的增加，正常人血漿的APTT值也有所延長。h1601-008在最高濃度3200nM時，APTT值的增加達到34秒的峰值，而噬菌體展示所獲得的抗體APTT值相對h1601-008在高濃度時都有明顯的升高(表9)。
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本公開的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉 由引用完整地清楚結合。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 凝血酶抗體、其抗原结合片段及醫藥用途
<130> 780088CPCT
<150> CN201711160510.5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 1601系列抗體重鏈恆定區
<400> 32
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 1601系列抗體輕鏈恆定區
<400> 33

Claims (33)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合片段，該單株抗體或其抗原結合片段結合人凝血酶，該單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、4和9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13為分別具有如下通式所示的胺基酸序列：HCDR3 DHYX1GNSYVFDX2 SEQ ID NO：9；LCDR1 KAX3X4X5X6YNRLA SEQ ID NO：11；LCDR2 GX7TX8LEX9 SEQ ID NO：12；LCDR3 QQYWX10X11PWT SEQ ID NO：13；其中：X1選自His、Leu；X2選自Tyr、Leu；X3選自Ser、Thr；X4選自Glu、His；X5選自Asp、Arg；X6選自Ile、Met；X7選自Ala、Thr；X8選自Ser、Gln、Lys；X9選自Thr、Gly；X10選自Ser、Gly；X11選自Thr、Asn、Tyr；且當X1為His時，X2不為Tyr，並且X3至X11不同時選自如下胺基酸：X3為Ser、X4為Glu、X5為Asp、X6為Ile、X7為Ala、X8為Ser、X9為Thr、X10為Ser和X11為Thr。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、 4和15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該輕鏈可變區LCDR1序列選自如SEQ ID NO：6、17和18所示的任一序列，LCDR2序列選自如SEQ ID NO：7、19和20所示的任一序列，LCDR3序列選自如SEQ ID NO：8、21和22所示的任一序列；其中LCDR1、LCDR2和LCDR3不同時選自如下序列：LCDR1選自SEQ ID NO：6、LCDR2選自SEQ ID NO：7和LCDR3選自SEQ ID NO：8。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、4和15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區為選自如下a至i任一項所述的輕鏈可變區：a、包含分別如SEQ ID NO：17、19和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；b、包含分別如SEQ ID NO：6、19和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；c、包含分別如SEQ ID NO：17、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；d、包含分別如SEQ ID NO：6、20和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；e、包含分別如SEQ ID NO：17、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；f、包含分別如SEQ ID NO：6、7和21所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；g、包含分別如SEQ ID NO：6、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；h、包含分別如SEQ ID NO：18、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區；和i、包含分別如SEQ ID NO：18、7和22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體或抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該單株抗體或其抗原結合片段包含選自如下j至r中任一項所述重鏈可變區和輕鏈可變區：j、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區；k、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區；l、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；m、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區；n、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：27所示的輕鏈可變區；o、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；p、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區；q、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變區；和r、如SEQ ID NO：16所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其包括抗體恆定區，其中，該抗體重鏈包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和/或抗體輕鏈包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈恆定區為與人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列具有至少85%序列同一性的重鏈恆定區變體。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈恆定區為YTE突變、L234A和/ 或L235A突變、或S228P突變的IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區變體。
  11. 如申請專利範圍第8項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該輕鏈恆定區為與人源κ、λ鏈序列具有至少85%序列同一性的輕鏈恆定區變體。
  12. 如申請專利範圍第8項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含如SEQ ID NO：32所示或與SEQ ID NO：32具有至少85%序列同一性的重鏈恆定區，和如SEQ ID NO：33所示或與SEQ ID NO：33具有至少85%序列同一性的輕鏈恆定區。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二聚化的V區、二硫鍵穩定化的V區和包含CDR的肽的抗原結合片段。
  14. 一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
  15. 一種重組載體，其包含如申請專利範圍第14項所述的核酸分子。
  16. 一種宿主細胞，其係用如申請專利範圍第15項所述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的宿主細胞，其中，該細胞為真核細胞。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的宿主細胞，其中，該細 胞為哺乳動物細胞。
  19. 一種用於生產申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括將如申請專利範圍第16至18項中任一項所述的宿主細胞在適合該宿主細胞生長的培養基中進行培養以形成並積累如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，以及從培養物中回收所積累的該單株抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體和/或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第14項所述的核酸分子、或如申請專利範圍第15項所述的重組載體、或如申請專利範圍第16至18項中任一項所述的宿主細胞，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  21. 一種用於免疫檢測或測定人凝血酶的方法，該方法包括使用包含如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的試劑進行檢測或測定的步驟。
  22. 一種申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的用途，其用在製備與凝血酶相關的疾病的診斷劑。
  23. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第14項所 述的核酸分子、或如申請專利範圍第15項所述的重組載體、或如申請專利範圍第16至18項中任一項所述的宿主細胞、或如申請專利範圍第20項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備與凝血酶相關的疾病的藥物。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該疾病為血栓性疾病。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的用途，其中，該疾病為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該疾病為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
  27. 一種作為藥物的如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，和/或如申請專利範圍第14項所述的核酸分子、和/或如申請專利範圍第15項所述的重組載體、和/或如申請專利範圍第16至18項中任一項所述的宿主細胞、和/或如申請專利範圍第20項所述的醫藥組成物。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的藥物，其中，該藥物用於治療或預防凝血酶相關的疾病。
  29. 如申請專利範圍第27或28項所述的藥物，其中，該藥物用於治療血栓性疾病，該血栓性疾病包括但不限 於：靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的藥物，其中，該疾病為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
  31. 一種可用於治療疾病的單株抗體或其抗原結合片段或其組合物，其中，該單株抗體或其抗原結合片段為如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段，該疾病包括但不限於血栓性疾病。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的可用於治療疾病的單株抗體或其抗原結合片段或其組合物，其中，該疾病為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的可用於治療疾病的單株抗體或其抗原結合片段或其組合物，其中，該疾病為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
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