TW201918263A - 抗體－藥物結合物之改良製造方法 - Google Patents

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Abstract

一種式(1)所表示的化合物之結晶、及其製造方法、以及使用了該結晶的抗體-藥物結合物之製造方法。

Description

抗體-藥物結合物之改良製造方法
本發明係關於抗體-藥物結合物之藥物連結子中間體的改良製造方法、及使用了其之抗體-藥物結合物之改良製造方法。
抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)，係使具有細胞毒性的藥物與抗體結合，其中抗體係會與在癌細胞表面表現且可於細胞內在化的抗原結合，抗體-藥物結合物藉由可選擇性的將藥物送達至癌細胞，而可期待使藥物蓄積於癌細胞內、使癌細胞死亡(非專利文獻1~5)。
作為抗體-藥物結合物之一者，已知以抗體與為拓樸異構酶I抑制劑的依喜替康作為構成要素的抗體-藥物結合物(專利文獻1~5、非專利文獻6、7)。此等之抗體-藥物結合物因具有優異的抗腫瘤效果及安全性，目前臨床試驗正在進行中。
作為用以製造上述之抗體-藥物結合物的藥物連結子中間體之製造方法，而已知有記載於專利文獻1~4的方法。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 國際公開第2014/057687號
專利文獻2 國際公開第2015/098099號
專利文獻3 國際公開第2015/115091號
專利文獻4 國際公開第2015/155998號
非專利文獻
非專利文獻1 Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010)21, 5-13.
非專利文獻2 Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010)14, 529-537.
非專利文獻3 Damle N. K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004)4, 1445-1452.
非專利文獻4 Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012)30, 631-637.
非專利文獻5 Howard A. et al., J Clin Oncol 29：398-405.
非專利文獻6 Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research(2016)22(20), 5097-5108.
非專利文獻7 Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016)107, 1039-1046.
發明概要
用以製造本發明之抗體-藥物結合物的藥物連結子中間體，係式(1)所表示的化合物。
作為式(1)所表示的化合物之製造方法，已知有記載於專利文獻1~4的方法。然而，未知有所謂式(1)所表示的化合物可作為結晶而取得之事，由於有進行需要藉由層析之純化等煩雜操作的必要，而冀望在工業上更為優異的製造方法之開發。
本發明之一課題係發現一種不需要藉由層析之純化，而工業上優異的藥物連結子中間體之改良製造方法。本發明之其他之一課題係構築一種使用了該藥物連結子中間體之改良製造方法的抗體-藥物結合物之改良製造方法。
本發明者等人，深入檢討藥物連結子中間體之製造方法的結果，令人驚訝地發現了式(1)所表示的化合物可作為結晶取得。又，改良了式(1)所表示的化合物之製造方法的結果，發現了不需要藉由層析之純化之工 業上優異的製造方法。進一步構築使用了式(1)所表示的化合物之結晶的抗體-藥物結合物之改良製造方法，而完成了本發明。
即，本發明係關於：
[1]一種式(1)所表示的化合物之結晶，
[2]如[1]記載之結晶，其於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於5.6±0.2°、15.5±0.2°、及22.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
[3]一種式(1)所表示的化合物之結晶之製造方法，其包含下列步驟：調製溶解了式(1)所表示的化合物之溶液的步驟，
其次，使式(1)所表示的化合物之結晶自前述之溶液析出的步驟。
[4]如[3]記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於5.6±0.2°、15.5±0.2°、及22.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
[5]如[3]或[4]記載之製造方法，其中溶解式(1)所表示的化合物的溶液，係包含低級酮及低級醇作為溶媒。
[6]如[5]記載之製造方法，其中低級酮為丙酮。
[7]如[5]記載之製造方法，其中低級酮為甲基乙基酮。
[8]如[5]至[7]中任一項記載之製造方法，其中低級醇為1-丙醇。
[9]如[5]至[7]中任一項記載之製造方法，其中低級醇為2-丁醇。
[10]如[3]至[9]中任一項記載之製造方法，其包含添加式(1)所表示的化合物之結晶的種晶的步驟。
[11]如[3]至[10]中任一項記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(I)而被製造；(其中，製造方法(I)係包含下列步驟的製造方法：將式(B)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基脫保護
(其中，R1係表示經保護基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(8)所表示的化合物及式(C)所表示的化合物縮合
(其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，
而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[12]如[3]至[10]中任一項記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(II)而被製造；(其中，製造方法(II)係包含下列步驟之製造方法：藉由將式(B)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護
(其中，R1係表示經保護基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(D)所表示的化合物的步驟
(其中，R2係表示與前述相同意義)； 其次，藉由將式(D)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合
(其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(E)所表示的化合物的步驟
(其中，R2係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(E)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，
而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[13]如[11]或[12]中任一項記載之製造方法，其包含下列步驟：於包含1,2-二甲氧基乙烷的溶媒中，使式(10)所表示的化合物溶解的步驟；其次使式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶析出的步驟。
[14]如[13]記載之製造方法，其中式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
[15]如[11]至[14]中任一項記載之製造方法，其中藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟，係於硫酸鈉水溶液及四氫呋喃之2相系統中進行。
[16]如[3]至[10]中任一項記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(III)而被製造；(其中，製造方法(III)係包含下列步驟之製造方法： 藉由將式(B)所表示的化合物之羧基之保護基脫保護
(其中，R1係表示經保護基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(F)所表示的化合物的步驟
(其中，R1係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(F)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，
而變換為式(G)所表示的化合物的步驟
(其中，R1係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(G)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(16)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合
(其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[17]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽。
[18]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧m水合物(其中，m為0~3個之範圍內)。
[19]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧無水物。
[20]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧1水合物。
[21]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧2水合物。
[22]如[11]至[16]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧3水合物。
[23]如[11]至[22]中任一項記載之製造方法，其中式(B)所表示的化合物係藉由製造方法(IV)而被製造；(其中，製造方法(IV)係包含下列步驟之製造方法：藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應
(其中，R3係表示經保護基保護的胺基)，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟
(其中，R3係表示與前述相同意義)；其次，藉由使式(J)所表示的化合物、與式(K)所表示的化合物
(其中，R2係表示與請求項11至22中任一項記載之R2同意義)，於酸或於鹼之存在下反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟
(其中，R2及R3係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(L)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟
(其中，R2係表示與前述相同意義)； 其次，藉由將式(M)所表示的化合物與式(N)所表示的化合物縮合
(其中，R1係表示與[11]至[22]中任一項記載之R1同意義)，而變換為式(B)所表示的化合物的步驟)
(其中，R1及R2係表示與前述相同意義))。
[24]如[23]記載之製造方法，其中藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟，係於乙酸之存在下進行。
[25]如[23]或[24]記載之製造方法，其中使式(J)所表示的化合物與式(K)所表示的化合物反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟，係於氫氧化鈉水溶液之存在下進行。
[26]如[23]或[24]記載之製造方法，其中使式(J)所表示的化合物與式(K)所表示的化合物反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟，係於參(五氟苯基)硼烷之存在下進行。
[27]如[23]或[26]記載之製造方法，其包含藉由將式(L)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟之後，藉由添加酸，而使式(M)所表示的化合物與酸之鹽析出的步驟。
[28]如[27]記載之製造方法，其中酸為1-羥基苯并三唑。
[29]如[11]至[28]中任一項記載之製造方法，其中R1為經苄氧基羰基保護的胺基。
[30]如[11]至[28]中任一項記載之製造方法，其中R1為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
[31]如[11]至[30]中任一項記載之製造方法，其中R2為經苄基保護的羧基。
[32]如[23]至[31]中任一項記載之製造方法，其中R3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
[33]如[11]至[32]中任一項記載之製造方法，其中X為(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。
[34]如[3]至[10]中任一項記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(V)而被製造；(其中，製造方法(V)係包含下列步驟之製造方法：藉由將將式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，
而變換為式(3)所表示的化合物的步驟；
藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(5)所表示的化合物與式(6)所表示的化合物縮合，
而變換為式(7)所表示的化合物的步驟；
其次，將式(7)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基脫保護，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(8)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合，
而變換為式(10)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，
而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[35]如[34]記載之製造方法，其包含使式(10)所表示的化合物溶解於包含1,2-二甲氧基乙烷的溶媒中的步驟；其次，使式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶析出的步驟。
[36]如[35]記載之製造方法，其中式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
[37]如[34]至[36]中任一項記載之製造方法，其中藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟，係於硫酸鈉水溶液及四氫呋喃之2相系統中進行。
[38]如[3]至[10]中任一項記載之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(VI)而被製造；(其中，製造方法(VI)係包含下列步驟之製造方法：藉由使式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，
而變換為式(3)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(5)所表示的化合物與式(12)所表示的化合物縮合，
而變換為式(13)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(13)所表示的化合物之羧基之保護基脫保護，而變換為式(14)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(14)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，
而變換為式(15)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(15)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由將式(16)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合，
而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[39]如[34]至[38]中任一項記載之製造方法，其中藉由使式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(3)所表示的化合物的步驟，係於乙酸之存在下進行。
[40]如[34]至[39]中任一項記載之製造方法，其中將式(3)所表示的化合物變換為式(4)所表示的化合物的步驟，係於氫氧化鈉水溶液之存在下進行。
[41]如[34]至[39]中任一項記載之製造方法，其中其中將式(3)所表示的化合物變換為式(4)所表示的化合物的步驟，係於參(五氟苯基)硼烷之存在下進行。
[42]如[34]至[41]中任一項記載之製造方法，其包含藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟之後，藉由添加酸，使式(5)所表示的化合物及酸之鹽析出的步驟。
[43]如[42]記載之製造方法，其中酸為1-羥基苯并三唑。
[44]如[34]至[43]中任一項記載之製造方法，中式(6)所表示的化合物係藉由包含下列步驟之方法而製造： 藉由式(23)所表示的化合物與N-羥基琥珀醯亞胺縮合，
而變換為式(24)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由式(24)所表示的化合物與L-苯基丙胺酸縮合，而變換為式(6)所表示的化合物的步驟。
[45]如[34]至[44]中任一項記載之製造方法，其中式(9)所表示的化合物係藉由包含下列步驟之方法製造：藉由使式(17)所表示的化合物與順丁烯二酸酐反應，
而變換為式(18)所表示的化合物的步驟；
其次，藉由於包含式(18)所表示的化合物、與N-羥基琥珀醯亞胺、及2,6-二甲吡啶的混合溶液中，添加亞硫醯氯，而變換為式(9)所表示的化合物的步驟。
[46]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽。
[47]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧m水合物(其中，m為0~3個之範圍內)。
[48]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧無水物。
[49]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧1水合物。
[50]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧2水合物。
[51]如[34]至[45]中任一項記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧3水合物。
[52]一種式(J)所表示的化合物之製造方法，其包含下列步驟：藉由將式(H)所表示的化合物，於乙酸之存在下，使與四乙酸鉛反應
(其中，R3係表示經保護基保護的胺基)，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟
(其中，R3係表示與前述相同意義)。
[53]如[52]記載之製造方法，其中R3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
[54]一種式(L)所表示的化合物之製造方法，其包含下列步驟：藉由使式(J)所表示的化合物
(其中，R3係表示經保護基保護的胺基)與式(K)所表示的化合物
(其中，R2係表示經保護基保護的羧基)，於氫氧化鈉水溶液或參(五氟苯基)硼烷之存在下反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟
(其中，R2及R3係表示與前述相同意義)。
[55]如[54]記載之製造方法，其係於氫氧化鈉水溶液之存在下反應。
[56]如[54]記載之製造方法，其係於參(五氟苯基)硼烷之存在下反應。
[57]如[54]至[56]中任一項記載之製造方法，其中R2為經苄基保護的羧基。
[58]如[54]至[57]中任一項記載之製造方法，其中R3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
[59]一種式(M)所表示的化合物及酸之鹽之製造方法，其包含下列步驟：藉由使式(L)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護
(其中，R2係表示經保護基保護的羧基，R3係表示經保護基保護的胺基)，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟
(其中，R2係表示與前述相同意義)；其次，藉由添加酸，使式(M)所表示的化合物及酸之鹽析出的步驟。
[60]如[59]記載之製造方法，其中酸為1-羥基苯并三唑。
[61]如[59]或[60]記載之製造方法，其中R2為經苄基保護的羧基。
[62]如[59]至[61]中任一項記載之製造方法，其中R3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
[63]一種式(9)所表示的化合物之製造方法，其包含下列步驟： 藉由添加亞硫醯氯於包含式(18)所表示的化合物、與N-羥基琥珀醯亞胺、及2,6-二甲吡啶的混合溶液中，
而變換為式(9)所表示的化合物的步驟
[64]如[63]記載之製造方法，其中式(18)所表示的化合物，係藉由包含使式(17)所表示的化合物與順丁烯二酸酐反應的步驟的方法而被製造者
[65]一種式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶之製造方法，其包含下列步驟：使式(10)所表示的化合物溶解於包含1,2-二甲氧基乙烷的溶媒的步驟；
其次，使式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶析出的步驟。
[66]如[65]記載之製造方法，其中式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示波峰。
[67]一種式(1)所表示的化合物之製造方法，其包含下列步驟：藉由將式(10)所表示的化合物 及式(11)所表示的化合物 於硫酸鈉水溶液及四氫呋喃之2相系統中縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
[68]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽。
[69]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧m水合物(其中，m為0~3個之範圍內)。
[70]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧無水物。
[71]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧1水合物。
[72]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧2水合物。
[73]如[67]記載之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧3水合物。
[74]如[3]至[73]中任一項記載之製造方法，其未使用層析。
[75]一種式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，
[76]如[75]記載之結晶，其於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
[77]一種式(5)所表示的化合物與酸之鹽，
[78]如[77]記載之鹽，其中酸為1-羥基苯并三唑。
[79]一種式(19)所表示的藥物連結子與抗體藉由硫醚鍵而結合之抗體-藥物結合物之製造方法
(式中，A係表示與抗體的鍵結位置)，其特徵為使用藉由[3]至[51]中任一項記載的方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶作為起始原料，
其包含：i)將抗體還原的步驟，其次， ii)添加溶解有藉由上述方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶的溶液，使與經還原的抗體反應的步驟。
[80]如[79]記載之製造方法，其中抗體為抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、或抗GPR20抗體。
[81]如[80]記載之製造方法，其中抗體為抗HER2抗體。
[82]如[81]記載之製造方法，其中抗HER2抗體，係包含由序列識別號1中胺基酸編號1至449記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號2中胺基酸編號1至214記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或包含由序列識別號1記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號2記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體。
[83]如[81]或[82]記載之製造方法，其中抗體-藥物結合物中的每1抗體之藥物連結子的平均結合數為7至8個之範圍。
[84]如[80]記載之製造方法，其中抗體為抗HER3抗體。
[85]如[84]記載之製造方法，其中抗HER3抗體為包含由序列識別號3記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號4記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
[86]如[84]或[85]記載之製造方法，其中抗體-藥物結合物中的每1抗體之藥物連結子的平均結合數為7至8個之範圍。
[87]如[80]記載之製造方法，其中抗體為抗TROP2抗體。
[88]如[87]記載之製造方法，其中抗TROP2抗體為包含由序列識別號5中胺基酸編號20至470記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號6中胺基酸編號21至234記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
[89]如[87]或[88]記載之製造方法，其中抗體-藥物結合物中的每1抗體之藥物連結子的平均結合數為3至5個之範圍。
[90]如[80]記載之製造方法，其中抗體為抗B7-H3抗體。
[91]如[90]記載之製造方法，其中抗B7-H3抗體為包含由序列識別號7中胺基酸編號20至471記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號8中胺基酸編號21至233記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
[92]如[90]或[91]記載之製造方法，其中抗體-藥物結合物中的每1抗體之藥物連結子的平均結合數為3至5個之範圍。
[93]如[80]記載之製造方法，其中抗體為抗GPR20抗體。
[94]如[93]記載之製造方法，其中抗GPR20抗體為包含由序列識別號9中胺基酸編號20至472記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號10中胺基酸編號21至234記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
[95]如[93]或[94]記載之製造方法，其中抗體-藥物結合物中的每1抗體之藥物連結子的平均結合數為7至8個之範圍。
依據本發明，式(1)所表示的化合物之結晶之取得成為可能，且可提供一定品質之式(1)所表示的化合物。又，可提供一種不需要藉由層析之純化，且工業上優異的式(1)所表示的化合物之製造方法。又可提供使用了其之抗體-藥物結合物之改良製造方法。
圖1係呈示抗HER2抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號1)。
圖2係呈示抗HER2抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號2)。
圖3係呈示式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶的粉末X射線繞射。
圖4係呈示式(1)所表示的化合物之結晶的粉末X射線繞射。
圖5係呈示抗HER3抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號3)。
圖6係呈示抗HER3抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號4)。
圖7係呈示抗TROP2抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號5)。
圖8係呈示抗TROP2抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號6)。
圖9係呈示抗B7-H3抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號7)。
圖10係呈示抗B7-H3抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號8)。
圖11係呈示抗GPR20抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號9)。
圖12係呈示抗GPR20抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號10)。
用以實施發明之形態
以下，針對用以實施本發明之適合形態一邊參照圖式一邊說明。又，以下說明的實施形態係呈示本發明之代表的實施形態之一例，本發明之範圍並不藉此而被狹義解釋。
[抗體-藥物結合物]
依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，係藉由硫醚鍵而使式(19)所表示的藥物連結子、及抗體結合的抗體-藥物結合物
(式中，A表示與抗體的鍵結位置)。
於本發明中，將抗體-藥物結合物中之由連結子及藥物所構成的部分構造稱為「藥物連結子」。此藥物連結子係與於抗體之鏈間雙硫鍵部位(2處之重鏈-重鏈間、及2處之重鏈-輕鏈間)產生的硫醇基(換言之，半胱胺酸殘基之硫原子)結合。
本發明之藥物連結子係將為拓樸異構酶I抑制劑的依喜替康作為構成要素。依喜替康為式(11)所表示之具有抗腫瘤效果的喜樹鹼衍生物(camptothecin)。
於本發明所使用的抗體-藥物結合物，亦可以式(20)表示。
其中，藥物連結子係藉由硫醚鍵與抗體結合。又，n為與所謂的平均藥物結合數(DAR；Drug-to-Antibody Ratio)同意義，表示每1抗體之藥物連結子之平均結合數。
本發明所使用的抗體-藥物結合物，係藉由在移行至癌細胞內後，將式(22)所表示的化合物游離，而發揮抗腫瘤效果。
式(22)所表示的化合物，係被認為是依據本發明所製造的抗體-藥物結合物之抗腫瘤活性的本體，被確認具有拓樸異構酶I阻害作用(Ogitani Y.et al.,Clinical Cancer Research,2016,Oct 15；22(20)：5097-5108,Epub 2016 Mar 29)。
式(22)所表示的化合物，係被認為是藉由依據本發明所製造的抗體-藥物結合物之連結子部分被切斷而產生。
被認為是藉由式(21)表示的化合物之胺縮醛(aminal)構造分解而產生。
亦已知依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，係具有旁觀者效應(bystander effect)(Ogitani Y.et al.,Cancer Science(2016)107,1039-1046)。
此旁觀者效應，係依據本發明所製造的抗體-藥物結合物於標的表現的癌細胞中內在化之後，被游離之式(22)所表示的化合物對未表現標的之附近的癌細胞亦發生抗腫瘤效果，而被發揮。
[抗體-藥物結合物之製造所使用的藥物連結子中間體]
本發明之抗體-藥物結合物之製造所使用的藥物連結子中間體，係式(1)所表示的化合物。
依據本發明，而式(1)所表示的化合物可作為結晶取得，該結晶可較佳使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造用。
式(1)所表示的化合物之結晶的品質，係可例如以雜質含有率、殘留溶媒量、及外觀等作為指標而進行評價。又，可例如以在如25℃/60%RH下、或40℃/75%RH下的環境下之於3個月、6個月、12個月、24個月、及36個月的保存安定性作為指標，而進行評價。
亦可藉由此等之品質評價，而確認相對於非晶性之式(1)所表示的化合物的優位性。
本發明之製造方法，係特徵為藉由使式(1)所表示的化合物之結晶自溶解了式(1)所表示的化合物之溶液析出，而製造式(1)所表示的化合物之結晶。據此，而可製造純度高、且具有一定品質之式(1)所表示的化合物之結晶。
式(1)所表示的化合物之結晶，係特徵為較佳於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於 5.6°、15.5°、及22.0°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。一般而言，粉末X射線繞射中的繞射角度(2θ)由於會在±0.2°之範圍內產生誤差，因而有必要理解上述之繞射角度之值亦包含±0.2°之範圍內之數值(關於利用粉末X射線繞射的測定‧評價之技術常識，可參照例如，第十六改正日本藥典p64-68(2.58粉末X射線繞射測定法)、或第十七改正日本藥典p71-74(2.58粉末X射線繞射測定法)等)。因此，不僅與上述之繞射角度完全一致的結晶，而且於5.6±0.2°、15.5±0.2°、及22.0±0.2°之繞射角度(2θ)具有主要波峰的結晶亦為相同，包含於本發明。於本發明中，所謂「±0.2°」，係表示對於特定之數值為-0.2°~+0.2°之範圍的數值。例如所謂「5.6±0.2°」，係表示5.4°~5.8°之範圍的數值。
用以使式(1)所表示的化合物之結晶析出的溶液，係較佳為包含丙酮及低級醇作為溶媒的溶液。同樣地，包含低級酮及低級醇作為溶媒的溶液，亦可適合地使用作為用以使式(1)所表示的化合物之結晶析出的溶液。
於本發明中，所謂「低級酮」，係表示碳數為3~6個之酮類，可列舉例如，丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基異丙基酮、甲基丁基酮、甲基異丁基酮、甲基三級丁基酮、乙基乙基酮、乙基丙基酮、及乙基異丙基酮，較佳可列舉丙酮、及甲基乙基酮，更佳可列舉丙酮。
於本發明中，所謂「低級醇」，係表示碳數為1~4個之醇類，可列舉例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-丁醇、及三級丁醇，較佳可列舉1-丙醇、及2-丁醇，更佳可列舉1-丙醇。
因此，用以使式(1)所表示的化合物之結晶析出的溶液，較佳為包含丙酮及1-丙醇的溶液、或包含丙酮及2-丁醇的溶液，更佳為包含丙酮及1-丙醇的溶液。
式(1)所表示的化合物之結晶之析出，亦可藉由將式(1)所表示的化合物之結晶之種晶添加於包含式(1)所表示的化合物的溶液來進行。
式(1)所表示的化合物之結晶之種晶，即便直接進行上述之方法亦可取得，但較佳可藉由將式(1)所表示的化合物之少量藉由層析而純化之後，溶解於包含丙酮及1-丙醇的溶媒、或包含丙酮及2-丁醇的溶媒，且使自該溶液晶析而取得。
式(1)所表示的化合物，亦可參考國際公開第2014/057687號、國際公開第2015/098099號、國際公開第2015/115091號、國際公開第2015/155998號等之記載而製造，但較佳可使用利用以下之製造方法(I)、(II)、(III)、(V)、(VI)、及(IX)所製造者。據此，而可於全部步驟中，不使用層析而高產率地製造式(1)所表示的化合物之結晶。
[製造方法(I)]
製造方法(I)，係自式(B)所表示的化合物，經由步驟1~3而變換為式(1)所表示的化合物的方法。以下，詳細說明關於步驟1~3。
[式中，R1係表示經保護基保護的胺基，較佳為表示經苄氧基羰基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基，較佳為表示經苄基保護的羧基，X係表示活性酯基、或羧基，較佳為表示(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。]
步驟1：
本步驟，係藉由將式(B)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基脫保護，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟。
式(B)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基之脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
R1為經苄氧基羰基保護的胺基，R2為經苄基保護的羧基的情形，本步驟係較佳可藉由以下之方法進行。
式(B)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基的脫保護，係只要反應會進行，則方法不被限制，但較佳可在氫氣環境下，使用鈀觸媒、鉑觸媒、鎳觸媒、釕觸媒、或銠觸媒，更佳可使用鈀觸媒進行，進一步更佳可使用鈀碳進行，進一步更佳可使用5%鈀碳。用於本步驟的5%鈀碳之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(B)所表示的化合物為5~40重量%。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃及水之混合溶媒。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1~5小時。
步驟2：
本步驟，係藉由將式(8)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟。式(C)所表示的化合物，係可使用市售者、或利用周知方法而製造者、或利用按照下述之製造方法(VII)的方法所製造者。X為(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基的情形，本步驟係較佳可藉由以下之方法進行。
用於本步驟的式(C)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(8)所表示的化合物為1~4當量。
本步驟係較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼，係只要反應會進行，則無特別限制，但可列舉例如，三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺、N-甲基啉、N-甲基吡咯啶、及N-甲基哌啶等，較佳可列舉N,N-二異丙基乙基胺。用於本步驟的N,N-二異丙基乙基胺之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(8)所表示的化合物為0.5~2當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈及水之混合溶媒。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為7~30小時。
式(10)所表示的化合物，係較佳可作為1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶而取得。
式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶之品質，係可例如，以雜質含有率、殘留溶媒量、及外觀等作為指標而進行評價。又可例如，以在如25℃/60%RH下、或40℃/75%RH下的環境下之於3個月、6個月、12個月、24個月、及36個月的保存安定性作為指標，而進行評價。亦可藉由此等之品質評價，而確認相對於非晶性之式(10)所表示的化合物的優位性。
式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係特徵為較佳於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0°、及25.0°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。一般而言，粉末X射線繞射中的繞射角度(2θ)由於會在±0.2°之範圍內產生誤差，因而有必要理解上述之繞射角度之值亦包含±0.2°之範圍內之數值(關於粉末X射線繞射所致的測定‧評價之技術常識，可參照例如，第十六改正日本藥典p64-68(2.58粉末X射線繞射測定法)、或第十七改正日本藥典p71-74(2.58粉末X射線繞射測定法)等)。因此，本發明包含不僅與上述之繞射角度完全一致的結晶，亦包含於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)具有主要波峰的結晶。
步驟3：
本步驟，係藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。式(11)所表示的化合物較佳可作為甲磺酸鹽使用，更佳為可作為甲磺酸鹽‧m水合物(其中m為0~3個)使用，進一步更佳可作為甲磺酸鹽‧無水物、甲磺酸鹽‧1水合物、甲磺酸鹽‧2水合物、或甲磺酸鹽‧3水合物使用，進一步更佳可作為甲磺酸鹽‧2水合物使用，但任一者皆可用於本發明之製造方法。又，上述之水合物數可藉由調整結晶取得‧乾燥時之濕度而控制。
用於本步驟的式(11)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(10)所表示的化合物為0.5~2當量。
式(10)所表示的化合物，較佳可藉由誘導為活性酯，而使與式(11)所表示的化合物縮合。本步驟中的誘導為活性酯，係只要反應會進行，則方法不被限制，例如可藉由使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽(WSCD‧HCl)、或N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)等之縮合劑，而使與1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、N-羥基琥珀醯亞胺、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯、或p-硝基酚等之添加劑反應而進行，較佳可使用3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽及氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯來進行。用於本步驟的3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(10)所表示的化合物 為0.5~2當量。用於本步驟的氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(10)所表示的化合物為0.02~0.2當量。
本步驟係較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼，係只要反應會進行，則無特別限制，但可列舉例如，三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺、N-甲基啉、N-甲基吡咯啶、及N-甲基哌啶等，較佳可列舉N-甲基啉。用於本步驟的N-甲基啉之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(10)所表示的化合物為0.5~2當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃與水之混合溶媒。
又，式(11)所表示的化合物之甲磺酸鹽，係藉由鹼被中和，於成為游離體之後，反應會進行。此處，由於式(11)所表示的化合物之甲磺酸鹽為親水性，但另一方面，式(11)所表示的化合物之游離體為親油性，所以為了使一連串反應有效率地進行，本步驟較佳可於水層及有機層之2相系統中進行。有機層為四氫呋喃的情形，作為與其難以混和的水層，而可較佳使用離子強度高的水溶液，例如硫酸鈉水溶液。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為0.5~2小時。
[製造方法(II)]
製造方法(II)，係自式(B)所表示的化合物，經由步驟4~7而變換為式(1)所表示的化合物的方法。以下，針對步驟4~7詳細地說明。
[式中，R1係表示經保護基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基，X係表示活性酯基、或羧基，較佳為表示(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。]
步驟4：
本步驟，係藉由將式(B)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(D)所表示的化合物的步驟。
式(B)所表示的化合物之胺基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
步驟5：
本步驟，係藉由將式(D)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合，而變換為式(E)所表示的化合物的步驟。
本步驟，係可藉由與製造方法(I)之步驟2相同的方法進行。
步驟6：
本步驟，係藉由將式(E)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟。
式(B)所表示的化合物之羧基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
式(10)所表示的化合物，係較佳可藉由與製造方法(I)之步驟2相同的方法，作為1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶而取得。
步驟7：
本步驟，係藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。
本步驟，係可藉由與製造方法(I)之步驟3相同的方法進行。
[製造方法(III)]
製造方法(III)，係自式(B)所表示的化合物，經由步驟8~11而變換為式(1)所表示的化合物的方法。以下，針對步驟8~11詳細地說明。
[式中，R1係表示經保護基保護的胺基，較佳為表示經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基，較佳為表示經苄基保護的羧基，X表示活性酯基、或羧基，較佳為表示(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。]
步驟8：
本步驟，係藉由將式(B)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(F)所表示的化合物的步驟。
式(B)所表示的化合物之羧基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
R2為經苄基保護的羧基的情形，本步驟較佳可係下列之方法進行。
式(B)所表示的化合物之羧基之保護基的脫保護，係只要反應會進行，則方法不被限制，但較佳為可在氫氣環境下，使用鈀觸媒、鉑觸媒、鎳觸媒、釕觸媒、銠觸媒進行，更佳可使用鈀觸媒進行，進一步更佳可使用鈀碳進行，進一步更佳可使用鈀碳-伸乙基二胺錯合物。用於本步驟的鈀碳-伸乙基二胺錯合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(B)所表示的化合物為34~136重量%。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃與水之混合溶媒。
本步驟之反應溫度較佳為10~40℃，但只要反應會進行，則不被限制於此。本步驟之反應時間係較佳為1~54小時，但只要反應會進行，則不被限制於此等。
步驟9：
本步驟，係藉由將式(F)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(G)所表示的化合物的步驟。
式(F)所表示的化合物，較佳為可藉由誘導為活性酯，而與式(11)所表示的化合物縮合。用於本步驟的式(11)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(F)所表示的化合物為0.7~1.3當量。本步驟中的誘導為活性酯，係只要反應會進行，則方法不被限制，但例如可藉由使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽(WSCD‧HCl)、或N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)等之縮合劑，而使與1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、N-羥基琥珀醯亞胺、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯、或p-硝基酚等之添加劑反應而進行，較佳可藉由使用3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽與1-羥基苯并三唑而進行。用於本步驟的3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(F)所表示的化合物為0.7~1.3當量。用於本步驟的1-羥基苯并三唑之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(F)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
本步驟較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼，係只要反應會進行，則無特別限制，但可列舉例如，三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺、N-甲基啉、N-甲基吡咯啶、及N-甲基哌啶等，較佳可列舉三乙基胺。用於本步驟的三乙基胺之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(F)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1~4小時。
步驟10：
本步驟，係藉由將式(G)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟。
式(G)所表示的化合物之胺基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
R1為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基的情形，本步驟較佳可藉由下列之方法進行。
式(G)所表示的化合物之胺基之保護基的脫保護，係只要反應會進行，則無特別限制，但可使用例如，1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯、三甲基胍、1,5,7-三氮雜雙環[4,4,0]十-5-烯、或7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環[4,4,0]十-5-烯1,5-二氮雜雙環[4,3,0]-5壬烯，較佳可使用1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯。用於本步驟的1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(15)所表示的化合物為0.5~2當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1~5小時。
步驟11：
本步驟，係藉由將式(16)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。式(C)所表示的化合物，係可使用市售者、藉由周知 方法而製造者、或利用按照下述之製造方法(VII)的方法所製造者。X為(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基的情形，本步驟較佳可藉由以下之方法進行。
用於本步驟的式(C)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(16)所表示的化合物為0.5~2當量。
本步驟係較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼，係只要反應會進行，則無特別限制，但可列舉例如，三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺、N-甲基啉、N-甲基吡咯啶、及N-甲基哌啶等，較佳可列舉三乙基胺。用於本步驟的三乙基胺之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(16)所表示的化合物為0.75~6當量。
本步驟，係較佳可進一步使用對甲苯磺酸吡啶鎓。用於本步驟的對甲苯磺酸吡啶鎓之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(16)所表示的化合物為1~4當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、吡啶、及水、以及此等之混合溶媒，但較佳可列舉吡啶、乙腈、及四氫呋喃之混合溶媒。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1.5~7小時。
製造方法(I)~(III)中的式(B)所表示的化合物，較佳可使用利用以下之製造方法(IV)所製造者。
[製造方法(IV)]
製造方法(IV)，係自式(H)所表示的化合物，經由步驟12~15而變換為式(B)所表示的化合物的方法。以下，針對步驟12~15詳細地說明。
[式中，R1係表示經保護基保護的胺基，較佳為表示經苄氧基羰基、或(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基， R2係表示經保護基保護的羧基，較佳為表示經苄基保護的羧基，R3係表示經保護基保護的胺基，較佳為表示經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基，X係表示活性酯基、或羧基，較佳為表示(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。]
步驟12：
本步驟，係藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟。式(H)所表示的化合物，係可使用市售者或參照周知之方法而製造者。用於本步驟的四乙酸鉛之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(H)所表示的化合物為1~3當量。
本步驟，係較佳可於乙酸、或吡啶之存在下進行，更佳可於乙酸之存在下進行。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、及二甲亞碸、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉四氫呋喃。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為45~85℃，更佳為成為四氫呋喃之加熱回流下的溫度。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為0.5~3小時。
步驟13：
本步驟，係藉由將式(J)所表示的化合物與式(K)所表示的化合物，於酸或於鹼之存在下反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟。用於本步驟的式(K)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(J)所表示的化合物為1~4當量。
本步驟係可於鹼、或酸之存在下進行。用於本步驟的鹼，較佳為氫氧化鈉水溶液。用於本步驟的氫氧化鈉水溶液之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(J)所表示的化合物為0.5~2當量。用於本步驟的酸，係較佳為參(五氟苯基)硼烷。用於本步驟的參(五氟苯基)硼烷之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(J)所表示的化合物為0.01~0.1當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、及1,4-二烷，較佳可列舉1,2-二甲氧基乙烷。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為-10~15℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為0.5~6小時。
步驟14：
本步驟，係藉由將式(L)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟。
式(L)所表示的化合物之胺基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例 如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
R3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基的情形，本步驟較佳可藉由下列之方法進行。
式(L)所表示的化合物之胺基之保護基的脫保護，係只要反應會進行，則無特別限制，但例如，可使用1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯、三甲基胍、1,5,7-三氮雜雙環[4,4,0]十-5-烯、或7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環[4,4,0]十-5-烯1,5-二氮雜雙環[4,3,0]-5壬烯來進行，較佳可使用1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯來進行。用於本步驟的1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(L)所表示的化合物為0.25~1當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈、及N,N-二甲基乙醯胺。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為2~8小時。
式(M)所表示的化合物係藉由與酸作成鹽，使自反應溶液析出，可適合地單離純化。據此，可去除可成為以後之步驟的反應阻礙要因的副生成物。
上述之酸係較佳為1-羥基苯并三唑。於本步驟所使用的1-羥基苯并三唑，係於接著的步驟15，亦可作為縮合劑之一者而發揮機能。同樣地，1-羥基苯并三唑以外之酸，若為可作為縮合劑之一而發揮機能者，則亦可適合地使用於本步驟。
步驟15：
本步驟，係藉由將式(M)所表示的化合物與式(N)所表示的化合物縮合，而變換為式(B)所表示的化合物的步驟。式(N)所表示的化合物，係可使用市售者、利用周知之方法所製造者、或利用按照下述之製造方法(VIII)的方法所製造者。用於本步驟的式(N)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(M)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
式(M)所表示的化合物，較佳為可藉由誘導成活性酯，而使與式(N)所表示的化合物縮合。誘導為活性酯，可藉由使用例如，1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽(WSCD‧HCl)、或N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)等之縮合劑，而使與1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、N-羥基琥珀醯亞胺、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯、或p-硝基酚等之添加劑反應來進行，較佳可使用3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽與1-羥基苯并三唑來進行。用於本步驟的3-(3-二甲 基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(5)所表示的化合物為0.7~1.3當量。用於本步驟的1-羥基苯并三唑之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(M)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
又，於式(M)所表示的化合物為1-羥基苯并三唑鹽的情形，本步驟較佳可不添加新的1-羥基苯并三唑而進行。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈及水之混合溶媒。
又，於步驟14中，不單離式(M)所表示的化合物而接續進行本步驟的情形，本步驟之溶媒可直接使用步驟14所使用的溶媒。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為-10~15℃。本步驟之反應時間，只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1.5~7小時。
作為更具體的態樣，式(1)所表示的化合物，係較佳可使用由以下之製造方法(V)或(VI)所製造者。
[製造方法(V)]
製造方法(V)，係自式(2)所表示的化合物，經由步驟16~22而變換為式(1)所表示的化合物的方法。以下，針對步驟16詳細地說明。
步驟16：
本步驟，係藉由將式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(3)所表示的化合物的步驟。式(2)所表示的化合物，係可使用市售者或參考周知之方法而製造者。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟12相同的方法進行。
步驟17：
本步驟，係藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或於鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟13相同的方法進行。
步驟18：
本步驟，係藉由將式(4)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟14相同的方法進行。
步驟19：
本步驟，係藉由將式(5)所表示的化合物與式(6)所表示的化合物縮合，而變換為式(7)所表示的化合物的步驟。式(6)所表示的化合物，係可使用市售者、利用周知之方法而製造者、或利用下述之製造方法(VIII)而製造者。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟15相同的方法進行。
步驟20：
本步驟，係藉由將式(7)所表示的化合物之胺基及羧基的保護基脫保護，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(I)之步驟1相同的方法進行。
步驟21：
本步驟，係藉由將式(8)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(I)之步驟2相同的方法進行。
步驟22：
本步驟，係藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(I)之步驟3相同之方法進行。
[製造方法(VI)]
製造方法(VI)，係自式(2)所表示的化合物，經由步驟23~30而變換為式(1)所表示的化合物的方法。以下，針對步驟23~30詳細地說明。
步驟23：
本步驟，係藉由使式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(3)所表示的化合物的步驟。式(2)所表示的化合物，係可使用市售者或參考周知之方法而製造 者。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟12相同的方法進行。
步驟24：
本步驟，係藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或於鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟13相同的方法進行。
步驟25：
本步驟，係藉由將式(4)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟14相同的方法進行。
步驟26：
本步驟，係藉由將式(5)所表示的化合物與式(12)所表示的化合物縮合，而變換為式(13)所表示的化合物的步驟。式(13)所表示的化合物，係可使用市售者、或藉由周知之方法而製造者。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟15相同的方法進行。
步驟27：
本步驟，係藉由將式(13)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(14)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟8同樣之方法進行。
步驟28：
本步驟，係藉由將式(14)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(15)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟9相同之方法進行。
步驟29：
本步驟，係藉由將式(15)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟10相同的方法進行。
步驟30：
本步驟，係藉由將式(16)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟11相同的方法進行。
[製造方法(VII)]
式(9)所表示的化合物係較佳可使用利用以下之製造方法(VII)而製造者。據此，可以抑制有影響之後的步驟中所製造的化合物之品質的可能性的雜質，可有助於高品質之式(1)所表示的化合物之取得。
步驟31：
本步驟，係藉由將式(17)所表示的化合物與順丁烯二酸酐縮合，而變換為式(18)所表示的化合物的步驟。 用於本步驟的順丁烯二酸酐之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(17)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
本步驟係較佳為於乙酸中進行。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為80~120℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為8~32小時。
步驟32：
本步驟，係藉由將式(18)所表示的化合物與N-羥基琥珀醯亞胺縮合，而變換為式(9)所表示的化合物的步驟。用於本步驟的N-羥基琥珀醯亞胺之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(17)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
式(18)所表示的化合物，可藉由誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，而與N-羥基琥珀醯亞胺縮合，較佳可藉由誘導為酸鹵化物，而與N-羥基琥珀醯亞胺縮合。
誘導為酸鹵化物，係較佳可使用亞硫醯氯進行。用於本步驟的亞硫醯氯之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(18)所表示的化合物為0.5~1.5當量。於本步驟較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼較佳為2,6-二甲吡啶。用於本步驟的2,6-二甲吡啶之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(18)所表示的化合物為1~3當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、及氯苯、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為-25℃~0℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為0.5~2小時。
[製造方法(VIII)]
式(6)所表示的化合物，係可使用藉由以下之製造方法(VIII)所製造者。
步驟33：
本步驟，係藉由將式(23)所表示的化合物與N-羥基琥珀醯亞胺縮合，而變換為式(24)所表示的化合物的步驟。用於本步驟的式(23)所表示的化合物之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(23)所表示的化合物為0.7~1.5當量。
式(23)所表示的化合物，係可藉由誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，而與N-羥基琥珀醯亞胺縮合，較佳可藉由誘導為活性酯化物，而與N-羥基琥珀醯亞胺縮合。
活性酯化係可較佳使用3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽來進行。用於本步驟的3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(23)所表示的化合物為0.7~1.5當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為10~40℃。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為2~8小時。
步驟34：
本步驟，係藉由將式(24)所表示的化合物與L-苯基丙胺酸縮合，而變換為式(6)所表示的化合物的步驟。用於本步驟的L-苯基丙胺酸之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(24)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
本步驟係較佳為使用鹼。用於本步驟的鹼，係只要反應會進行，則無特別限制，但可列舉例如，三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺、N-甲基啉、N-甲基吡咯啶、及N-甲基哌啶等，較佳可列舉三乙基胺。用於本步驟的三乙基胺之量，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳相對於式(24)所表示的化合物為0.7~1.3當量。
就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但可列舉例如，乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、環己烷、乙基環己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸、及水、以及此等之混合溶媒，較佳可列舉乙腈與水之混合溶媒。
本步驟之反應溫度，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為式(23)所表示的化合物。本步驟之反應時間，係只要反應會進行，則不被限制，但較佳為1~4小時。
[製造方法(IX)]
式(1)所表示的化合物，亦可使用藉由以下之製造方法(IX)而製造者。
[式中，R1係表示經保護基保護的胺基，R2係表示經保護基保護的羧基，R3係表示經保護基保護的胺基，X係表示活性酯基、或羧基，較佳為表示(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。]
步驟35：
本步驟，係藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟。式(H)所表示的化合物，係可使用市售者或參考周知之方法而製造者。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟12相同的方法進行。
步驟36：
本步驟，係藉由使式(J)所表示的化合物，於酸或於鹼之存在下，與式(K)所表示的化合物反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(IV)之步驟13相同的方法進行。
步驟37：
本步驟，係藉由將式(L)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(O)所表示的化合物的步驟。
式(L)所表示的化合物之羧基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
步驟38：
本步驟，係藉由將式(O)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(P)所表示的化合物的步驟。
式(O)所表示的化合物，較佳可藉由誘導為活性酯，而與式(11)所表示的化合物縮合。
步驟39：
本步驟，係藉由將式(P)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(25)所表示的化合物的步驟。
式(P)所表示的化合物之羧基之保護基的脫保護，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行(例如，參照Peter G.M.Wuts,Theodora W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 4th Edition(2007),Wiley-Interscience等)。
步驟40：
本步驟，係藉由將式(25)所表示的化合物與式(N)所表示的化合物縮合，而變換為式(G)所表示的化合物的步驟。
式(N)所表示的化合物，較佳可藉由誘導為活性酯，而與式(25)所表示的化合物縮合。
步驟41：
本步驟，係藉由將式(G)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟10相同的方法進行。
步驟42：
本步驟，係藉由將式(16)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟。本步驟，係可藉由與製造方法(III)之步驟11相同的方法進行。
[使用於抗體-藥物結合物之製造的抗體]
使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體，係可源自任一物種，但較佳為源自人類、大鼠、小鼠、及兔的抗體。抗抗體為源自人類以外的物種的情形，係較佳使用周知之技術而進行嵌合化或人類化。本發明之抗體，可為多株抗體，亦可為單株抗體，但較佳為單株抗體。
使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體，較佳為具有可以癌細胞為標的之性質者，以具備可辨識癌細胞的特性、可與癌細胞結合的特性、被攝入癌細胞內而內在的特性、及/或對癌細胞的殺細胞活性等者較佳。
抗體之對癌細胞的結合性，係可使用流動式細胞測量術加以確認。抗體被攝入癌細胞內，係使用以下方法而可確認：(1)使用會與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)，而將被攝入細胞內的抗體以螢光顯微鏡可視化的試驗(Cell Death and Differentiation(2008)15,751-761)；(2)使用會與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)，而測定被攝入細胞內之螢光量的試驗(Molecular Biology of the Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)；或(3)所謂的Mab-ZAP試驗(Bio Techniques 28：162-165,January 2000)，其係使用會與治療抗體結合的免疫毒素，而若被攝入細胞內則毒素被釋放而細胞增殖會被抑制。就免疫毒素而言，亦可使用白喉毒素之觸媒區域與蛋白質G之重組複合蛋白質。
抗體之抗腫瘤活性，係在活體外，藉由測定細胞之增殖之抑制活性而可確認。例如，可培養過度表現抗體之標的蛋白質的癌細胞株，於培養系統中以各種濃度添加抗體，且測定對焦點形成、群落形成及球體增殖的抑制活性。在活體內，則藉由例如，對移植高表現標的蛋白質的癌細胞株的裸鼠投予抗體，且測定癌細胞之變化，而可確認抗腫瘤活性。
抗體本身具有抗腫瘤效果為較佳，但因抗體-藥物結合物有結合會發揮抗腫瘤效果的化合物，故抗體本身之抗腫瘤效果並非必須。由使抗腫瘤性化合物之細胞毒性於癌細胞中特異性‧選擇性地發揮之目的來看，具有抗體內在化而移行至癌細胞內的性質係重要，且較佳。
使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體，係可藉由周知之手段取得。例如，可藉由使用此領域中所通常實施的方法，將成為抗原的多肽對動物作免疫，且採取、純化活體內所產生的抗體而獲得。抗原之來源並不限定於人類，亦可將源自小鼠、大鼠等之人類以外之動物的抗原對動物免疫。於此情形，藉由試驗會與所取得的異種抗原結合的抗體及人類抗原之交叉性，而可選擇可適用於人類疾病的抗體。
又，亦可按照周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497；Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，藉由使產生對抗抗原的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，而建立融合瘤，且獲得單株抗體。
又，抗原係可藉由將編碼抗原蛋白質的基因進行基因操作，使於宿主細胞產生而獲得。具體而言，係製作可表現抗原基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，並將表現了的抗原純化即可。藉由使用將經上述基因操作所致的抗原表現細胞、或表現抗原的細胞株，對動物進行免疫的方法，亦可取得抗體。
使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體，較佳為以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體，又較佳為僅具有源自人類的抗體之基因序列的抗體，即人類抗體。此等之抗體可使用已知方法製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區域及恒定區域彼此為異種的抗體，例如將源自小鼠或大鼠的抗體之可變區域與源自人類之恒定區域接合的嵌合抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
就人類化抗體而言，可列舉僅將異種抗體之互補性決定區域(CDR；complementarity determining region)組合至源自人類之抗體的抗體(Nature(1986)321,p.522-525)；藉由CDR移植法，而除了異種抗體之CDR之序列，亦將異種抗體之一部分的框架之胺基酸殘基移植至人類抗體的抗體(國際公開第90/07861號)；使用基因轉換突變誘發(gene conversion mutagenesis)策略而人類化的抗體(美國專利第5821337號)。
就人類抗體而言，可列舉使用具有包含人類抗體之重鏈及輕鏈的基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠而作成的抗體(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)。或者，亦可列舉藉由選自人類抗體庫的利用噬菌體展示而取得的抗體(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體中，亦包含抗體之修飾體。該修飾體，係意指對本發明之抗體施加化學或生物學的修飾而成者。化學的修飾體中，係包含具有對胺基酸骨架之化學部分之鍵結、對N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學部分的鍵結的化學修飾體等。生物學的修飾體中，係包含被轉譯後修飾(例如，N-結合或O-結合型糖鏈之附加、N末端或C末端之加工、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化等)者；藉由使用原核生物宿主細胞使表現，而於N 末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了可進行本發明之抗體或抗原之檢測或單離而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾體之意義。此種本發明之抗體之修飾體，係有用於抗體之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的降低、抗體或抗原之檢測或單離等。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(糖苷化(glycosylation)、脫岩藻糖(fucose)化等)，而可增強抗體依存性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知有國際公開第99/54342號、國際公開第00/61739號、國際公開第02/31140號等，但未限定於此等。本發明之抗體亦包含該糖鏈修飾經調節的抗體。
又，於哺乳類培養細胞所生產的抗體，已知該重鏈之羧基末端的離胺酸殘基有缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))；又已知，相同地，重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸殘基的2個胺基酸殘基有缺失，且於羧基末端位置的脯胺酸殘基被新醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等之重鏈序列之缺失及修飾，對抗體之抗原結合能力及效應子(effector)機能(補體之活性化或抗體依存性細胞傷害作用等)並無影響。因此，於本發明之抗體亦包含受到該修飾的抗體及該抗體之機能性片段，亦包含於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺欠的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應子機 能，則本發明之抗體之重鏈的羧基末端之缺失體並不被限定於上述之種類。構成本發明之抗體的2股重鏈，可為選自包含完全長度及上述之缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為組合任二種者。各缺失體之量比雖可受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但本發明之抗體較佳可列舉於2股之重鏈雙方中羧基末端之一個胺基酸殘基有缺欠者。
就本發明之抗體之同型(isotype)而言，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，但較佳可列舉IgG1或IgG2。
可使用於本發明之抗體-藥物結合物之製造的抗體並無特別限制，但可列舉例如，抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、抗CD3抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD98抗體、抗DR5抗體、抗EGFR抗體、抗EPHA2抗體、抗FGFR2抗體、抗FGFR4抗體、抗FOLR1抗體、抗VEGF抗體、及抗GPR20抗體，較佳為抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、及抗GPR20抗體。
於本發明中，所謂「抗HER2抗體」，係表示會與HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2；ErbB-2)特異性結合，且較佳為藉由與HER2結合而具有會於HER2表現細胞中內在的活性的抗體。
就抗HER2抗體而言，可列舉例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)(美國專利第5821337號)、及帕妥珠單 抗(pertuzumab)(國際公開第01/00245號)，較佳可列舉曲妥珠單抗。
於本發明中，「曲妥珠單抗」為一種人類化抗HER2單株抗體，其係包含由序列識別號1(圖1)中胺基酸編號1至449記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號2(圖2)中胺基酸編號1至214記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成。
於本發明中，所謂「抗HER3抗體」，係表示會與HER3(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 3；ErbB-3)特異性結合，且較佳為與HER3表現細胞表面上之HER3結合而具有會於該HER3表現細胞內在化的活性的抗體。
就抗HER3抗體而言，可列舉例如，帕曲土單抗(patritumab；U3-1287)、U1-59(國際公開第2007/077028號)、MM-121(seribantumab)、國際公開2008/100624號記載之抗ERBB3抗體、RG-7116(lumretuzumab)、及LJM-716(elgemtumab)，較佳可列舉帕曲土單抗、及U1-59。
於本發明中，所謂「抗TROP2抗體」，係表示會與TROP2(TACSTD2：腫瘤相關鈣訊息轉導蛋白2(Tumor-associated calcium signal transducer 2)；EGP-1)特異性結合，且較佳為藉由與TROP2結合而具有會於TROP2表現細胞中內在化的活性的抗體。
就抗TROP2抗體而言，可列舉例如，hTINA1-H1L1(國際公開第2015/098099號)。
於本發明中，所謂「抗B7-H3抗體」，係表示會與B7-H3(B細胞抗原#7同源物3(B cell antigen #7 homolog 3)；PD-L3；CD276)特異性結合，且較佳為藉由與B7-H3結合而具有會於B7-H3表現細胞中內在化的活性的抗體。
就抗B7-H3抗體而言，可列舉例如，M30-H1-L4(國際公開第2014/057687號)。
於本發明中，所謂「抗GPR20抗體」，係表示會與GPR20(G蛋白質偶合受體20(G Protein-coupled receptor 20))特異性結合，且較佳為藉由與GPR20結合而具有會於GPR20表現細胞中內在化的活性的抗體。
就抗GPR20抗體而言，可列舉例如，h046-H4e/L7(國際公開第2018/135501號)。
[抗體與藥物連結子中間體之結合物]
本發明之抗體-藥物結合物，可藉由使式(1)所表示的化合物、及具有硫醇基(或亦稱為巰基)的抗體反應而製造。
本發明之式(1)所表示的化合物之結晶，係較佳為可溶解於溶媒，作成含有式(1)所表示的化合物的溶液後，用於反應。就用於本步驟的溶媒而言，只要不是會抑制反應者，則不被特別限定，但較佳可使用包含二甲亞碸、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮的溶媒，更佳可使用包含二甲亞碸的溶媒。
具有巰基的抗體，可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法獲得(Hermanson,G.T,Bioconjugate Techniques,pp.56-136,pp.456-493,Academic Press(1996))。例如，可相對於每1個抗體內鏈間雙硫鍵，而使用參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)等之還原劑0.3至3莫耳當量，且於包含伸乙基二胺四乙酸(EDTA)等之鳌合劑的緩衝液中，使與抗體反應，以獲得具有抗體內鏈間雙硫鍵被部分或完全還原的巰基的抗體。
再者，每1個具有巰基的抗體，可使用2至20莫耳當量之式(1)所表示的化合物，而製造每1個抗體結合有2個至8個藥物的抗體-藥物結合物。
製造的抗體-藥物結合物之抗體每一分子的平均藥物結合數之算出，可藉由下列方法進行，例如，藉由測定280nm及370nm之二波長中的抗體-藥物結合物及其結合物前驅體之UV吸光度而算出的方法(UV法)；或將以還原劑處理抗體-藥物結合物所獲得的各片段，藉由HPLC測定而定量並算出的方法(HPLC法)。
抗體及藥物連結子中間體(式(1)所表示的化合物)之結合物、及抗體-藥物結合物之抗體每一分子的平均藥物結合數之算出，可參考國際公開第2014/057687號、國際公開第2015/098099號、國際公開第2015/115091號、國際公開第2015/155998號、及國際公開第2018/135501號等之記載而實施。
於本發明中，所謂「抗HER2抗體-藥物結合物」，係表示抗體-藥物結合物中的抗體為抗HER2抗體的抗體-藥物結合物。
抗HER2抗體，係較佳為包含由序列識別號1中胺基酸編號1至449記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號2中胺基酸編號1至214記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或包含由序列識別號1記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號2記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體。
依據本發明所製造的抗HER2抗體-藥物結合物之每1抗體之藥物連結子的平均結合數，係較佳為2至8，更佳為3至8，進一步更佳為7至8，進一步更佳為7.5至8，進一步更佳為約為8。
該抗HER2抗體-藥物結合物，係可使用利用本發明之製造方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶，參考國際公開第2015/115091號等之記載而製造。
於本發明中，所謂「抗HER3抗體-藥物結合物」，係表示抗體-藥物結合物中的抗體為抗HER3抗體的抗體-藥物結合物。
抗HER3抗體，係較佳為包含由序列識別號3記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號4記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
依據本發明所製造的抗HER3抗體-藥物結合物之每1抗體的藥物連結子之平均結合數，係較佳為 2至8，更佳為3至8，進一步更佳為7至8，進一步更佳為7.5至8，進一步更佳為約為8。
該抗HER3抗體-藥物結合物，係可使用利用本發明之製造方法所製造的(1)所表示的化合物之結晶，參考國際公開第2015/155998號等之記載而製造。
於本發明中，所謂「抗TROP2抗體-藥物結合物」，係表示抗體-藥物結合物中的抗體為抗TROP2抗體的抗體-藥物結合物。
抗TROP2抗體，係較佳為包含由序列識別號5中胺基酸編號20至470記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號6中胺基酸編號21至234記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
依據本發明所製造的抗TROP2抗體-藥物結合物之每1抗體的藥物連結子之平均結合數，係較佳為2至8，更佳為3至5，進一步更佳為3.5至4.5，進一步更佳為約為4。
該抗TROP2抗體-藥物結合物，係可使用利用本發明之製造方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶，參考國際公開第2015/098099號等之記載而製造。
於本發明中，所謂「抗B7-H3抗體-藥物結合物」，係表示抗體-藥物結合物中的抗體為抗B7-H3抗體的抗體-藥物結合物。
抗B7-H3抗體，係較佳為包含由序列識別號7中胺基酸編號20至471記載之胺基酸序列所構成的重 鏈及由序列識別號8中胺基酸編號21至233記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
依據本發明所製造的抗B7-H3抗體-藥物結合物之每1抗體之藥物連結子的平均結合數，係較佳為2至8，更佳為3至5，進一步更佳為3.5至4.5，進一步更佳為約為4。
該抗B7-H3抗體-藥物結合物，係可使用利用本發明之製造方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶，參考國際公開第2014/057687號等之記載而製造。
於本發明中，所謂「抗GPR20抗體-藥物結合物」，係表示抗體-藥物結合物中的抗體為抗GPR20抗體的抗體-藥物結合物。
抗GPR20抗體，係較佳為包含由序列識別號9中胺基酸編號20至472記載之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號10中胺基酸編號21至234記載之胺基酸序列所構成的輕鏈而成的抗體、或該抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基有缺失的抗體。
依據本發明所製造的抗GPR20抗體-藥物結合物之每1抗體的藥物連結子之平均結合數，係較佳為2至8，更佳為3至8，進一步更佳為7至8，進一步更佳為7.5至8，進一步更佳為約為8。
該抗GPR20抗體-藥物結合物，係可使用利用本發明之製造方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶，參考國際公開第2018/135501號等之記載而製造。
[醫藥組成物]
依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，係可含有1種以上之藥學上適合性之成分而被投予。藥學上適合性之成分，係可因應依據本發明所製造的抗體-藥物結合物之投予量或投予濃度等，而適宜選自此領域中所通常使用的製劑添加物及其他而適用。例如，依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，係可作為包含組胺酸緩衝劑等之緩衝劑、蔗糖或海藻糖等之賦形劑、以及聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20等之界面活性劑的醫藥組成物，而被投予。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，係對於患者可適用作為全身療法之外，可局部適用於癌組織而期待治療效果。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，雖可適合對哺乳動物使用，但更佳為對人類使用。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，係較佳可作為注射劑使用，更佳可作為水性注射劑或冷凍乾燥注射劑使用，進一步更佳可作為冷凍乾燥注射劑使用。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物為水性注射劑的情形，較佳可以適當稀釋液稀釋之後，點滴投予至靜脈內。就稀釋液而言，可列舉葡萄糖溶液(較佳為5%葡萄糖溶液)、生理食鹽液等。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物為冷凍乾燥注射劑的情形，較佳為可藉由注射用水而溶解之後，以適當稀釋液稀釋必要量之後，點滴投予至靜脈內。就稀釋液而言，可列舉葡萄糖溶液(較佳為5%葡萄糖溶液)、生理食鹽液等。
就為了投予包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物而可使用的導入路徑而言，可列舉例如，靜脈內、皮內、皮下、肌肉內、及腹腔內之路徑，較佳為靜脈內之路徑。
依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，可對於人類，以1~180日間1次的間隔來投予，較佳可以1週、2週、3週、或4週1次的間隔來投予，進一步更佳可以3週1次的間隔投予。又，依據本發明所製造的抗體-藥物結合物，可以每1次約0.001~100mg/kg之投予量來投予，較佳可以每1次0.8~12.4mg/kg之投予量來投予。依據本發明所製造的抗體-藥物結合物為抗HER2抗體-藥物結合物的情形，較佳可以每1次5.4、6.4、或7.4mg/kg之投予量來投予，進一步更佳可以每1次5.4mg/kg或6.4mg/kg之投予量來投予。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，可使用於癌症之治療用，較佳可使用於選自包含乳癌、胃癌(亦稱為胃腺癌)、大腸癌(亦稱為結腸直腸癌，包含結腸癌及直腸癌)、肺癌(包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、食道癌、唾液腺癌、胃食道接合部腺癌、膽管癌、佩吉特氏病、胰臟癌、卵巢癌、子宮癌 肉瘤、尿道上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、胃腸間質腫瘤、消化道間質腫瘤、子宮頸癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臟癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、腎臟癌、外陰部癌、甲狀腺癌、陰莖癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤(plasmacytoma)、骨髓瘤、神經上皮組織性腫瘤、神經鞘性腫瘤、頭頸部癌、皮膚癌、咽頭癌、膽囊癌、膽管癌、間皮瘤(mesothelioma)、及肉瘤之群組的至少一者之治療用，例如，依據本發明所製造的抗體-藥物結合物為抗HER2抗體-藥物結合物的情形，更佳為可使用於選自包含乳癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、食道癌、唾液腺癌、胃食道接合部腺癌、膽管癌、佩吉特氏病、胰臟癌、卵巢癌、及子宮癌肉瘤之群組的至少一者之治療用，更佳為可使用於選自包含乳癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、食道癌、唾液腺癌、胃食道接合部腺癌、膽管癌、及佩吉特氏病之群組的至少一者之治療用，進一步更佳為可使用於乳癌、胃癌、大腸癌、或非小細胞肺癌之治療用。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，係可選擇使用作為癌治療之主要治療法的藥物療法用之藥劑，而作為其結果，可使癌細胞的成長延遲，抑制增殖，進而破壞癌細胞。藉由此等之作用，於癌患者，可達成癌所致症狀的解放、或QOL之改善，且保持癌患者之生命而達成治療效果。即使是未達成癌細胞之破壞的情形，亦可藉由癌細胞之增殖的抑制或控制，而一邊於癌患者達成較高QOL，且達成更長期之生存。
於此種藥物療法中之藥物單獨的使用之外，包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，亦可於輔助療法中與其他之療法組合而使用，可與外科手術、放射線療法、荷爾蒙療法等組合。再者亦可使用作為新輔助療法中的藥物療法。
如以上的治療的使用之外，包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，亦可期待抑制微細轉移癌細胞之增殖，進而破壞等預防效果。例如，可期待於轉移過程中抑制體液中的癌細胞並破壞的效果、對剛著床於任一組織之後的微細癌細胞的抑制、破壞等之效果。因此，特別可期待於外科上的癌去除後之癌轉移的抑制、預防效果。
包含依據本發明所製造的抗體-藥物結合物的醫藥組成物，亦可與其他癌治療劑併用而投予，可據此使抗腫瘤效果增強。作為以此種目的而被使用的其他癌治療劑，可列舉5-氟尿嘧啶(5-FU)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、卡鉑(Carboplatin)、順鉑(Cisplatin)、吉西他濱(Gemcitabine)、卡培他濱(Capecitabine)、依立替康(Irinotecan)(CPT-11)、多西紫杉醇(Docetaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、索拉非尼(Sorafenib)、長春花鹼(Vinblastin)、長春瑞濱(Vinorelbine)、依維莫司(Everolims)、坦螺旋黴素(Tanespimycin)、貝伐單抗(Bevacizumab)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、拉帕替尼(Lapatinib)、曲妥珠單抗美坦新(Trastuzumab emtansine)(T-DM1)及國際公開第2003/038043號記載之藥劑，又LH-RH類似物(亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)等)、雌莫司汀磷酸鹽(Estramustine Phosphate)、動情素拮抗藥(泰莫西芬(Tamoxifen)、雷洛昔芬(Raloxifene)等)、芳香酶阻害劑(阿那曲唑(Anastrozole)、來曲唑(Letrozole)、及依西美坦(Exemestane)等)等，但只要為具有抗腫瘤活性的藥劑，則未被限定。
[實施例]
以下列舉實施例而進一步詳細說明本發明，但本發明並未限定於此等例。
實施例中之「1H-NMR」及「13C-NMR」係意指「核磁共振光譜」，括弧內之CDCl3意指為測定溶媒的氘代氯仿，DMSO-d6意指為測定溶媒的氘代二甲亞碸，D2O意指為測定溶媒的重水，MeOH-d4係意指為測定溶媒的氘代甲醇。使用TMS(四甲基矽烷)作為內部標準物質。1H-NMR中的多重度意指s=單峰、d=雙峰、t=三峰、q=四重峰、、m=多重峰、及brs=寬單峰。
(實施例1)
2,5-二側氧基吡咯啶-1-基N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺酸酯
於N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺酸(200.00g，0.751mol)之乙腈(2.0L)混合物中，添加N-羥基琥珀醯亞胺(95.10g，0.826mol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(172.80g，0.901mol)，於室溫攪拌約4小時。將反應液冷卻至1℃，攪拌約3小時。過濾析出物，將濾出的粉末以乙腈(400mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了2,5-二側氧基吡咯啶-1-基N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺酸酯(221.6g，0.610mol，產率81.2%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.81(4H,s),δ3.69(2H,d,6.7Hz),δ4.28(2H,d,6.1Hz),δ5.04(2H,s),δ7.29-7.39(5H,m),δ7.56(1H,t,6.4Hz),δ8.55(1H,t,5.8Hz).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ25.4,38.2,43.3,65.6,127.7,127.8,128.3,137.0,156.5,166.3,170.0,170.0.
MS(ESI)(m/z)：364([M+H]+).
(實施例2)
N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸
於L-苯基丙胺酸(80.0g，0.487mol)之乙腈(400mL)、水(400mL)之混合物中，添加三乙基胺(74.7mL，0.536mol)、2,5-二側氧基吡咯啶-1-基N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺酸酯(212.4g，0.585mol)，於室溫攪拌約2小時。於反應液中添加水(800mL)、濃鹽酸(40.6mL)後，添加N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸(80mg)，於室溫攪拌約攪拌6小時。過濾析出物，將濾出的粉末以水(160mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸(157.2g，0.380mol，產率78.0%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.86-2.91(1H,m),δ3.03-3.08(1H,m),δ3.64-3.78(4H,m),δ4.41-4.47(1H,m),δ5.04(2H,s),δ7.18-7.40(10H,m),δ7.50(1H,t,6.1Hz),δ8.05(1H,t,5.8Hz),δ8.17(1H,d,7.9Hz),δ12.77(1H,s).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ36.8,41.6,43.5,53.5,65.5,126.5,127.7,127.8,128.2,128.3,129.1,137.0,137.4,156.5,168.6,169.3,172.7.
MS(ESI)(m/z)：412([M-H]-).
(實施例3)
({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯
於N-[(9H-茀-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺酸(650.0g，1.834mol)中添加四氫呋喃(9.75L)、乙酸(1.95L)，加熱至40℃而使溶解。添加四乙酸鉛(1301.3g，2.935mol)，回流約1.5小時。冷卻至室溫，濾除不溶物，將濾出的不溶物以乙酸乙酯(3.25L)洗淨，合併濾液。於獲得的溶液中，添加20(w/v)%檸檬酸三鈉二水合物水溶液(3.25L)而攪拌，分液而去除水層。將獲得的有機層以20(w/v)%檸檬酸三鈉二水合物水溶液(3.25L)洗淨2次，之後將有機層減壓濃縮至6.5L。添加水(1.95L)後，添加({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯(0.65g)，於室溫攪拌約1小時。滴加水(6.5L)，冷卻至0~5℃而攪拌約3小時。過濾析出物，將濾出的粉末以冷30(v/v)%四氫呋喃水溶液(2.6L)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯(617.1g，1.675mol，產率91.3%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ2.06(3H,s),δ3.90(2H,d,4.9Hz),δ4.23(1 H,t,6.7Hz),δ4.45(2H,d,6.7Hz),δ5.25(2H,d,7.3Hz),δ5.39(1H,brs),δ7.05(1H,brs),δ7.30-7.34(2H,m),δ7.41(2H,t,7.3Hz),δ7.59(2H,d,7.3Hz),δ7.77(2H,d,7.3Hz)
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ20.8,44.4,47.0,63.9,67.2,120.0,125.0,127.1,127.7,141.3,143.6,156.6,169.8,171.7.
MS(ESI)(m/z)：369([M+H]+).
(實施例4)
[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯
於({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯(610.0g，1.656mol)之1,2-二甲氧基乙烷(9.15L)混合物中，添加乙醇酸苯甲酯(470mL，3.312mol)，冷卻至0~5℃。添加10mol/L氫氧化鈉溶液(162.6mL，1.626mol)，攪拌約1小時。添加乙酸(47.4mL)，並於1℃攪拌約1小時後，滴加水(2.0L)，添加[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(0.61g)，於0~5℃攪拌約1小時。滴加水(4.7L)，於0~5℃攪拌約2.5小時。過濾析出物，將濾出的粉末以冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.44L)洗淨。於獲得 的濕品粉末中添加1,2-二甲氧基乙烷(9.15L)，於室溫攪拌約30分鐘而使溶解。添加水(3.66L)後，添加[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(0.61g)，於室溫攪拌約1小時。滴加水(3.05L)，於室溫攪拌約1小時。冷卻至0~5℃，攪拌約1小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.44L)洗淨。於獲得的濕品粉末中添加1,2-二甲氧基乙烷(9.0L)，於室溫攪拌約30分鐘而使溶解。添加水(3.6L)後，添加[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(0.01g)，於室溫攪拌約1小時。滴加水(3.0L)，於室溫攪拌約1小時。冷卻至0~5℃，攪拌約1小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以冷(v/v)50%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.4L)洗淨。於獲得的濕品粉末中添加1,2-二甲氧基乙烷(9.0L)，於室溫攪拌約20分鐘而使溶解。添加水(3.6L)後，添加[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(0.15g)，於室溫攪拌約2小時。滴加水(3.0L)，於室溫攪拌約1小時。冷卻至0~5℃，攪拌約2小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.4L)洗淨。獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得粗[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯。於獲得的粗[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯中添加甲苯(12L)，加熱至70℃，使溶解。冷卻至0~5℃，攪拌約2小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以冷甲苯(2.4L)洗淨。將獲得 的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(575.5g，1.213mol，產率73.2%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.82(2H,d,4.9Hz),δ4.19-4.22(3H,m),δ4.45(2H,d,6.7Hz),δ4.83(2H,d,6.7Hz),δ5.15(2H,s),δ5.34(1H,brs),δ6.95(1H,brs),δ7.29-7.37(7H,m),δ7.40(2H,t,7.3Hz),δ7.58(2H,d,7.3Hz),δ7.76(2H,d,7.9Hz).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ44.5,47.1,66.6,66.8,67.1,70.6,120.0,124.9,127.1,127.8,128.4,128.5,128.6,135.2,141.3,143.6,170.2,170.2,170.4.
MS(ESI)(m/z)：475([M+H]+).
(實施例5)
甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺
於[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(340.0g，0.717mol)之乙腈(10.2L)混合物中，添加1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯(53.6mL，0.358mol)，並於室溫攪拌約2小時。冷卻至0~5℃，添 加1-羥基苯并三唑一水合物(132.0g，0.862mol)、N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸(311.0g，0.752mol)後，分割添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(158.0g，0.824mol)，於0~5℃攪拌約1小時。添加10(w/v)%磷酸緩衝液(pH3，3.4L)，加熱至室溫。分液而去除水層後，減壓濃縮至3.7L。添加乙酸乙酯(3.4L)、水(1.7L)，分液而去除水層。添加10(w/v)%碳酸氫鉀水溶液(3.4L)而攪拌，分液而去除水層。添加10(w/v)%碳酸氫鉀水溶液(3.4L)而攪拌，分液而去除水層。添加水(3.4L)而攪拌，分液而去除水層後，減壓濃縮至1.5L。添加2-甲氧基乙醇(3.74L)，減壓濃縮至3.06L。移至20L高壓釜，添加四氫呋喃(1.36L)、水(3.4L)、5%鈀碳(72.6g，水分53.2%)，將環境氣體置換成氫。於室溫攪拌約19小時後，將環境氣體置換成氮，添加水(360mL)，於室溫攪拌約30分鐘。濾出鈀碳，將鈀碳以水(1.36L)洗淨，合併濾液。添加乙酸乙酯(0.85L)、n-庚烷(2.55L)而攪拌後，分液，去除有機層，減壓濃縮至1.6L。添加水(221mL)、2-甲氧基乙醇(126mL)後，添加甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(0.34g)，加熱至40℃而攪拌約19小時。滴加乙醇(3.4L)，於室溫攪拌約18小時。過濾析出物，將濾出的粉末以乙醇(1.02L)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(243.7g，0.576mol，產率80.3%)。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ3.03-3.20(2H,m),δ3.79-3.96(6H,m),δ3.97(2H,s),δ4.64(1H,t,7.9Hz),δ4.67-4.75(2H,m),δ7.29-7.42(5H,m).
13C-NMR(100MHz,D2O)δ37.3,41.0,42.7,43.2,56.0,67.3,70.0,127.8,129.4,129.8,136.9,168.4,171.7,172.9,174.4,178.1.
MS(ESI)(m/z)：422([M-H]-).
(實施例6)
苄基[(甘胺醯基胺基)甲氧基]乙酸酯1H-苯并三唑-1-醇
於[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(50.00g，105.4mmol)之乙腈(1.5L)混合物中，添加1,8-二氮雜雙環[5,4,0]-7-十一烯(8.02g，52.7mmol)，於室溫攪拌約4小時。於室溫分割添加1-羥基苯并三唑一水合物(35.51g，231.9mmol)，攪拌約30分鐘。冷卻至1℃，攪拌約11小時。過濾析出物，將濾出的粉末以乙腈(250mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了苄基[(甘胺醯基胺基)甲氧基]乙酸酯1H-苯并三唑-1-醇(38.98g，100.6mol，產率95.4%)。
1H-NMR(500MHz,MeOH-d4)δ3.63-3.68(2H,brs),δ4.19-4.23(2H,brs),δ4.79(2H,s),δ5.16-5.20(2H,brs),δ7.25-7.38(7H,m),δ7.64-7.72(2H,dd,17.3Hz,7.8Hz).
13C-NMR(125MHz,MeOH-d4)δ41.9,66.3,67.6,71.0,112.3,118.7,125.24,125.27,128.8,129.25,129.30,129.5,136.9,144.4,169.5,171.8
(實施例7)
N-[(苄氧基)羧基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-{[2-(苄氧基)-2-側氧基乙氧基]甲基}甘胺醯胺
於N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸(10.99g，26.58mmol)之乙腈(120mL)、水(20mL)之混合物中，添加苄基[(甘胺醯基胺基)甲氧基]乙酸酯1H-苯并三唑-1-醇(10.00g，25.81mmol)，冷卻至2℃，添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.70g，29.73mmol)，於0~5℃攪拌約3.5小時。於反應液中添加乙醇(100mL)、水(150mL)，於室溫攪拌14小時。分割添加水(130mlL)，攪拌2小時後，冷卻至1℃並攪拌約1小時。過濾析出物，將濾出的粉末以乙腈：水=1：2(60mL) 洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了N-[(苄氧基)羧基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-{[2-(苄氧基)-2-側氧基乙氧基]甲基}甘胺醯胺(15.34g，23.68mmol，產率91.7%)。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ2.79(1H,dd,14Hz,9.2Hz),δ3.06(1H,dd,14Hz,4.5Hz),δ3.55-3.80(6H,m),δ4.15(2H,s),δ4.51(1H,ddd,Hz,9.2Hz,8.6Hz,4.5Hz),δ4.63(2H,d,6.5Hz),δ5.03(2H,S),δ5.15(2H,s),δ7.15-7.40(15H,m),δ7.15-7.40(15H,m),δ7.50(1H,t,6Hz),δ8.02(1H,t,5.8Hz),δ8.15(1H,d,8.6Hz),δ8.33(1H,t,5.8Hz),δ8.60(1H,t,7Hz)
13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ37.4,41.9,42.2,43.6,54.2,64.5,65.6,65.7,69.1,126.3,127.77,127.85,128.10,128.14,128.2,128.4,128.5,129.2,135.8,137.0,137.9,156.6,168.9,169.5,169.9,170.2,171.5.
(實施例8)
甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺
於N-[(苄氧基)羧基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-{[2-(苄氧基)-2-側氧基乙氧基]甲基}甘胺醯胺(15.0g、23.16mmol)之四氫呋喃(315mL)、水(210mL)之混合物中，添加5%鈀碳(3.31g，水分54.7%)，將環境氣體置換成氫。於室溫攪拌約2.5小時後，將環境氣體置換成氮，濾出鈀碳，將鈀碳以水(60mL)洗淨，合併濾液。將濾液減壓濃縮至240mL。添加乙醇(150mL)，減壓濃縮至180mL。添加乙醇(150mL)，減壓濃縮至135mL。添加乙醇(150mL)，減壓濃縮至90mL。添加乙醇(300mL)，並攪拌17小時。過濾析出物，將濾出的粉末以乙醇(75mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(8.95g，21.14mmol，產率91.3%)。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ3.03-3.20(2H,m),δ3.79-3.96(6H,m),δ3.97(2H,s),δ4.64(1H,t,7.9Hz),δ4.67-4.75(2H,m),δ7.29-7.42(5H,m).
13C-NMR(100MHz,D2O)δ37.3,41.0,42.7,43.2,56.0,67.3,70.0,127.8,129.4,129.8,136.9,168.4,171.7,172.9,174.4,178.1.
MS(ESI)(m/z)：422([M-H]-).
(實施例9)
6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸
於6-胺基己酸(2.5kg，19.1mol)之乙酸(10L)溶液中，於25~30℃下耗時1小時滴加順丁烯二酸酐(1.87kg，19.1mol)之乙酸(10L)溶液，於相同溫度下攪拌2小時。於獲得的漿液中滴加硫酸(0.93kg，9.55mol)，升溫至100℃後，攪拌16小時。將反應液冷卻至30℃後，減壓濃縮至7.0L。於0~5℃之冷水(20L)中，於攪拌條件下，耗時1小時滴加獲得的濃縮液(約7.0L)，於相同溫度下攪拌1小時。過濾析出物，將濾出的粉末以冷水(5.0L)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(1.46kg，6.95mol，產率36.4%)。
將獲得的6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(1.40kg，6.66mol)溶解於25~30℃乙酸(2.1L)、純水(1.4L)之混合液中，添加純(0.7L)後，冷卻至20~25℃後，攪拌2小時。於獲得的懸浮液耗時1小時滴加純水(7.0L)，冷卻至0~5℃後，攪拌1小時。過濾析出物，將濾出的粉末以冷水(2.1L)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(1.27kg，6.02mol，產率90.4%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.18-1.24(2H,m),δ1.45-1.52(4H,m),δ2.18(2H,t,7.5Hz),δ3.38(2H,t,7.5Hz),δ7.01(2H,s),δ11.98(1H,s).
(實施例10)
1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮
於6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(5.0g，23.6mmol)、N-羥基琥珀醯亞胺(3.0g，26.0mmol)之乙腈(50mL)混合物中，添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.45g，28.4mmol)，於室溫攪拌約3.5小時。添加水(100mL)、甲苯(100mL)而攪拌後，分液而去除水層。有機層以水(50mL)洗淨2次，將有機層減壓濃縮至25mL。注入矽膠筒(KP-sil 10g)，以甲苯：丙酮=9：1(100mL)通液而回收溶出液，減壓濃縮至25mL。添加1-丁醇(50mL)後，添加1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(10mg)，於室溫攪拌1小時。滴加1-丁醇(50mL)，冷卻至-10℃而攪拌。過濾析出物，將濾出的粉末以冷1-丁醇(20mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(6.52g，21.1mmol，產率89.4%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.27-1.35(2H,m),δ1.48-1.56(2H,m),δ1.59-1.67(2H,m),δ2.65(2H,t,7.3Hz),δ2.81(4H,s),δ3.39(2H,t,7.0Hz),δ7.00(2H,s).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ23.7,25.1,25.4,27.4,30.0,36.8,134.4,168.9,170.2,171.1.
MS(ESI)(m/z)：309([M+H]+).
(實施例11)
1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮
將6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸(1.1kg，5.21mol)、N-羥基琥珀醯亞胺(0.72kg，6.25mol)之乙腈(11L)混合液冷卻至-15℃，添加2,6-二甲吡啶(1.34kg，12.50mol)後，於-15℃~-10℃耗時1小時滴加亞硫醯氯(0.74kg，6.25mol)。添加水(11L)、甲苯(11L)而攪拌後，分液，去除水層。有機層以0-5℃之冷水(11L)洗淨2次，以0-5℃之20%食鹽水(11L)洗淨，將有機層減壓濃縮至5.5L後，添加甲苯(5.5L)，再次減壓濃縮至5.5L。填充以甲苯濕潤的中性矽膠(Silicage160N，3.3kg)至漏斗，將濃縮液通液，以甲苯：丙酮=9：1(29L)洗淨而獲得濾液。將獲得的濾液減壓濃縮至5.5L後，添加1-丁醇(8.8L)後，於20-25℃攪拌16小時。滴加1-丁醇(13.2L)，冷卻至-15℃而攪拌1小時。過濾析出物，將濾出的粉末以冷1-丁醇(4.4L)洗淨。將獲得的粉末於減壓 下40℃乾燥，獲得了1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1.45kg，4.72mol，產率90.5%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.27-1.35(2H,m),δ1.48-1.56(2H,m),δ1.59-1.67(2H,m),δ2.65(2H,t,7.3Hz),δ2.81(4H,s),δ3.39(2H,t,7.0Hz),δ7.00(2H,s).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ23.7,25.1,25.4,27.4,30.0,36.8,134.4,168.9,170.2,171.1.
MS(ESI)(m/z)：309([M+H]+).
(實施例12)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺
於1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(291.3g，0.945mol)之乙腈(1.8L)溶液中，添加甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(200.0g，0.472mol)、水(4.2L)、N,N-二異丙基乙基胺(48.8g，0.378mol)，於室溫攪拌約 9小時。添加乙酸異丙酯(2.0L)、無水磷酸二氫鈉(400.0g)、無水磷酸氫二鈉(26.0g)而攪拌後，分液而去除有機層。添加四氫呋喃(1.0L)、乙酸乙酯(1.0L)、無水磷酸二氫鈉(160.0g)而攪拌後，分液而去除水層。添加10(w/v)%磷酸緩衝液(pH3.4，0.6L)而攪拌，分液而去除水層後，減壓濃縮至1.0L。添加1,2-二甲氧基乙烷(4.0L)，減壓濃縮至1.0L。添加1,2-二甲氧基乙烷(4.0L)、乙腈(0.4L)，濃縮至1.0L減壓。添加乙腈(20mL)，溶液之水分測定的結果為6.1%(相當水18.8mL)。添加水(19mL)後，添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(0.2g)，滴加1,2-二甲氧基乙烷(0.8L)，於室溫攪拌約16小時。滴加1,2-二甲氧基乙烷(3.2L)，減壓濃縮至4.0L。添加1,2-二甲氧基乙烷(1.0L)，冷卻至0~5℃，攪拌約19.5小時。過濾析出物，將濾出的粉末以1,2-二甲氧基乙烷(0.8L)洗淨。將獲得的粉末於減壓下40℃乾燥，獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(268.3g，0.435mol，產率92.1%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.15-1.23(2H,m),δ1.43-1.52(4H,m),δ2.11(2H,t,7.3Hz),δ2.78-2.84(1H,m),δ3.04-3.09(1H,m),δ3.37(2H,t,7.0Hz)δ3.61-3.79(6H,m),δ3.94(2H,s),δ4.47-4.52(1H,m),δ4.61(2H,d,6.7Hz),δ6.99(2H,s),δ7.15-7.27(5H,m ),δ8.11-8.15(2H,m),δ8.22(1H,d,8.5Hz),δ8.31(1H,t,5.8Hz),δ8.63(1H,t,6.4Hz).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ24.6,25.8,27.8,34.9,37.0,37.2,41.9,42.1,42.1,54.2,65.1,69.2,126.2,128.1,129.1,134.4,137.9,168.9,169.5,169.8,171.1,171.4,171.9,172.6.
MS(ESI)(m/z)：615([M-H]-).
(實施例13)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺之1,2-二甲氧基乙烷加成物
於1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(72.8g，0.236mol)之乙腈(450.0mL)溶液中，添加甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(50.0g，0.118mol)、水(1050.0mL)、N,N-二異丙基乙基胺(16.5mL，0.095mol)，於室溫攪拌約15小時。添加乙酸異丙酯(500.0mL)、無水磷酸二氫鈉(100.0g)、無水磷酸氫二鈉(6.5g)而攪拌後，分液而移除有機層。添加乙酸異酯(500.0mL)而攪拌後，分液而移除有機層。添加1,2-二 甲氧基乙烷(250.0mL)、乙酸乙酯(250.0mL)、乙腈(25.0mL)、無水磷酸二氫鈉(400.0g)而攪拌後，分液而移除水層。添加乙腈(750.0mL)、水(113.0mL)、氯化鈉(30.0g)、無水磷酸二氫鈉(7.5g)、磷酸(85%、1.5g、0.012mol)而攪拌，分液而移除水層。添加水(113.0mL)、氯化鈉(30.0g)、無水磷酸二氫鈉(7.5g)而攪拌，分液而移除水層。添加水(113mL)、氯化鈉(30.0g)、無水磷酸二氫鈉(7.5g)而攪拌，分液而移除水層後，減壓濃縮至500.0mL。添加1,2-二甲氧基乙烷(750.0mL)後，減壓濃縮至500.0mL。溶液之水分測定的結果為6.9%(相當水31.3g)。添加水(9.5mL)、1,2-二甲氧基乙烷(1.0L)後，於室溫攪拌約13小時。滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0mL)，於室溫攪拌約5小時後，減壓濃縮至1.0L。滴加1,2-二甲氧基乙烷(1.0L)，於室溫攪拌約1小時後，減壓濃縮至1.0L。滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0mL)，於室溫攪拌約16小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以1,2-二甲氧基乙烷(250.0L)洗淨。於獲得的濕品粉末中添加1,2-二甲氧基乙烷(2.0L)、水(65.0mL)，升溫至45℃。攪拌30分鐘後，濾出氯化鈉，氯化鈉以1,2-二甲氧基乙烷/水(97/3、150mL)洗淨，合併濾液，減壓濃縮至1.0L。添加1,2-二甲氧基乙烷(1.0L)，於室溫攪拌約3小時後，減壓濃縮至1.0L。滴加1,2-二甲氧基乙烷(1.0L)，減壓濃縮至1.0L。滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0mL)，於室溫攪拌約16小時後，過濾析出物，將濾出的粉末以1,2-二甲氧基乙烷(250mL)洗淨。將獲得的粉末於減壓下(4kPa)25℃乾燥， 作為結晶而獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺之1,2-二甲氧基乙烷加成物(65.7g，0.107mol，產率90.3%)。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.16-1.23(2H,m),δ1.44-1.52(4H,m),δ2.11(2H,t,7.5Hz),δ2.79-2.84(1H,m),δ3.05-3.09(1H,m),δ3.24(6H,s),δ3.37(2H,t,7.3Hz),δ3.43(4H,s),δ3.56-3.78(6H,m),δ3.99(2H,s),δ4.48-4.52(1H,m),δ4.61(2H,d,6.5Hz),δ7.00(2H,s),δ7.16-7.27(5H,m),δ8.02-8.10(2H,m),δ8.15(1H,d,8.0Hz),δ8.32(1H,t,6.0Hz),δ8.58(1H,t,6.8Hz).δ12.61(1H,brs)
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ25.5,26.8,28.7,35.9,37.9,38.2,42.8,43.0,43.1,55.1,59.0,65.2,69.8,72.0,127.2,129.0,130.1,135.4,138.8,169.8,170.4,170.9,172.0,172.3,172.4,173.6.
MS(ESI)(m/z)：615([M-H]-).
粉末X射線繞射：
對於標題化合物之結晶，於銅之Kα線的照射進行獲得的粉末X射線繞射。將結果示於表1及圖3。於19.0°、及25.0°之繞射角度(2θ)觀察到主要的波峰。
(實施例14)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
於甲磺酸(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-胺鎓2水合物(總 量154.6g，水分值2.95%補正後內容量150.0g，0.282mol)之四氫呋喃(1.8L)懸浮液中，添加5(w/v)%硫酸鈉水溶液(1.5L)、N-甲基啉(28.5g，0.282mol)，於32℃攪拌約1小時。添加氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯(8.0g，56.3mmol)、N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(總量232.0g，1,2-二甲氧基乙烷2.50%換算後內容量226.2g，0.367mol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(108.2g，0.564mol)，於29~32℃攪拌約1小時後，分液而移除水層。添加乙酸乙酯(1.8L)、5(v/v)%乙酸水溶液(0.45L)而攪拌，分液而移除水層。添加活性碳(15.0g，強力白鷺(Osaka Gas Chemical Co.,Ltd.製))而於室溫攪拌約30分鐘後，濾出活性碳，將活性碳以四氫呋喃(0.45L)洗淨而合併濾液，減壓濃縮至0.75L。添加1-丙醇(1.5L)，減壓濃縮至0.75L，添加丙酮：1-丙醇=1：1(3.0L)。添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(0.15g)，於室溫攪拌約45小時。過濾析出物，將濾出的粉末以丙酮：1-丙醇=1：1(0.6L)洗淨。於獲得的濕品粉末中添加四氫呋喃(1.5L)、水(0.3L)而溶解，減壓濃縮至0.75L。添加1-丙醇(1.5L)，減壓濃縮至0.75L，添加丙酮：1-丙醇=1： 1(3.0L)。添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(0.15g)，於室溫攪拌約24小時。過濾析出物，將濾出的結晶以丙酮：1-丙醇=1：1(0.6L)洗淨。將獲得的結晶於減壓下於40℃乾燥，作為結晶而獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(254.6g，產率87.3%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.87(3H,t,7.3Hz),δ1.14-1.21(2H,m),δ1.41-1.50(4H,m),δ1.78-1.93(2H,m),δ2.09(2H,t,7.3Hz),δ2.13-2.23(2H,m),δ2.36(3H,s),δ2.74-2.80(1H,m),δ3.00-3.04(1H,m),δ3.08-3.25(2H,m),δ3.32-3.37(2H,m),δ3.56-3.77(6H,m),δ4.02(2H,s),δ4.44-4.50(1H,m),δ4.64(2H,d,6.7Hz),δ5.17(2H,d,5.5Hz),δ5.41(2H,s),δ5.57-5.62(1H,m),δ6.51(1H,s),δ6.99(2H,s),δ7.14-7.26(5H,m),δ7.30(1H,s),δ7.75(1H,d,11.0Hz),δ8.00(1H,t,5.8Hz),δ8.06(1H,t,5.3Hz),δ8.12(1H,d,7.9Hz),δ8.29(1H,t,5.8Hz),δ8.49(1H,d,8.5Hz),δ8.62(1H,t,6.7Hz).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ7.6,10.8,10.9,23.5,24.6,25.7,27.7,30.2,30.6,34.8,36.9,37.1,41.7,42.0,44.4,49.5,54.1,65.1,66.9,69.7,72.2,96.6,109.6,109.8,119.0,121.5,123.4,123.6,125.3,126.2,128.0,129.0,134.3,136.2,136.3,137.7,140.4,145.0,147.7,147.8,149.9,152.2,156.6,160.2,162.7,168.8,169.1,169.3,170.0,171.0,171.3,172.3,172.5.
MS(ESI)(m/z)：1034([M+H]+).
粉末X射線繞射：
對於標題化合物之結晶，於銅之Kα射線的照射下進行獲得的粉末X射線繞射。將結果示於表2及圖4。於5.6°、15.5°、及22.0°之繞射角度(2θ)觀察到主要的波峰。
(實施例15)
({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯
氮氣環境下，於N-9-茀基甲氧基羰基甘胺醯基甘胺酸(2.85kg，8.04mol)之無水四氫呋喃(38.0kg)懸浮液中，添加乙酸(2.41kg，40.1mol)、四乙酸鉛(IV)(5.35kg，12.0mol)，回流1.5小時。冷卻至室溫後，濾出析出的固體，將濾出的固體以四氫呋喃(10.1kg)洗淨。獲得的濾洗液於減壓下，液量濃縮至成為16L左右，於獲得的濃縮液中添加乙酸乙酯(26kg)、10%檸檬酸水溶液(17.1L)、20%食鹽水(5.7L)，攪拌後分液。將獲得的有機層依序以10%檸檬酸水溶液(17.1L)、9%碳酸氫鈉水溶液(28.5L)、20%食鹽水(14.3L)分液洗淨。於獲得的有機層中添加矽膠60(5.7kg)、乙酸乙酯(10.3kg)並攪拌1小時後，濾出固體，將濾出的固體以乙酸乙酯(7.7kg)洗淨。獲得的濾洗液於減壓下，濃縮至液量成為5L左右，添加環戊基甲基醚(24.5kg)。再度減壓下，濃縮液量成為5L左右，於獲得的濃縮液中添加環戊基甲基醚(14.7kg)，於5℃左右攪拌1小時。濾出析出的固體，將獲得的結晶以冷卻至5℃左右的環戊基甲基醚(4.9kg)洗淨。將獲得的結晶於減壓下於40℃乾燥，獲得了為無色固體之標題化合物(2.01kg，產率68%)。
(實施例16)
[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯
氮氣環境下，於({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯(2.01kg、5.46mol)之無水1,2-二甲氧基乙烷(21kg)懸浮液中添加乙醇酸苄酯(1.81kg，10.9mol)，冷卻至0℃左右。添加參(五氟苯基)硼烷(142g、0.27mol)，於相同溫度攪拌3小時後，添加乙酸乙酯(27.1kg)、10%碳酸氫鉀水溶液，升溫至室溫，分液。於獲得的有機層中添加10%食鹽水(20.1L)並分液洗淨。獲得的有機層於減壓下，濃縮至液量成為4L左右，添加甲醇(15.7kg)。減壓下，濃縮液量成為4L左右，於獲得的濃縮液中添加甲醇(7.8kg)。減壓下，濃縮液量成為4L左右。於獲得的濃縮液中添加甲醇(12.5kg)，冷卻至5℃左右，攪拌1小時。濾出析出的結晶，將獲得的結晶以冷卻至5℃左右的甲醇(4.7kg)洗淨。將獲得的固體於減壓下於40℃乾燥，獲得了標題化合物(2.28kg，產率88%)。
(實施例17)
[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯
氮氣環境下，於[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(2.28kg、4.81mol)之N,N-二甲基乙醯胺(15.0kg)溶液中添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(0.37kg、2.4mol)，於室溫下攪拌30分鐘。添加對甲苯磺酸吡啶鎓(0.60kg，2.4mol)，1-羥基苯并三唑1水合物(0.74kg、4.8mol)、N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸(2.19kg、4.37mol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(0.84kg、4.37mol)，於室溫下攪拌3小時。添加乙酸乙酯(21.0kg)、10%食鹽水(34L)，攪拌後分液。將獲得的有機層以10%檸檬酸水溶液(11.4L)分液洗淨。於獲得的有機層中添加四氫呋喃(20kg)、15%碳酸氫鉀水溶液(22.8L)，並攪拌分液。將獲得的有機層以10%食鹽水(22.8L)分液洗淨。獲得的有機層於減壓下，濃縮液量成為6.8L左右，添加2-丙醇(12.4kg)。減壓下，再次濃縮液量至成為6.8L左右，於獲得的濃縮液中，於約50℃之加熱下，添加2-丙醇(30.2kg)。於相同溫度攪拌1小時後，冷卻至5℃左右，再攪拌2小時。過濾析出的固體，將濾出的固體以冷卻至5℃左右2-丙醇(14.2kg)洗淨。使獲得的結晶2懸浮於2-丙醇(36kg)，於5℃左右攪拌1小時後，過濾析出的固 體，將濾出的固體以冷卻至5℃左右的2-丙醇(28.5kg)洗淨。將獲得的結晶於減壓下50℃乾燥，獲得了標題化合物(3.34kg，產率94%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.79(1H,dd,J=14.0,9.8Hz),3.05(1H,dd,J=14.0,4.3Hz),3.58-3.79(6H,m),4.15(2H,s),4.20-4.24(1H,m),4.28-4.30(2H,m),4.48-4.53(1H,m),4.63(2H,d,J=6.7Hz),5.14(2H,s),7.15-7.43(13H,m),7.58(1H,t,J=6.1Hz),7.71(2H,d,J=7.3Hz),7.89(2H,d,J=7.9Hz),8.01(1H,t,J=5.5Hz),8.15(1H,d,J=7.9Hz),8.33(1H,t,J=5.8Hz),8.59(1H,t,J=6.4Hz).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ37.3,41.8,42.1,43.5,46.6,54.1,64.4,65.6,65.7,69.0,120.1,125.2,126.3,127.1,127.6,128.0,128.1,128.1,128.4,129.1,135.8,137.8,140.7,143.8,156.5,168.8,169.4,169.9,170.1,171.4.
MS(ESI)(m/z)：736([M+H]+).
(實施例18)
N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺
於[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯(367g、0.499mol)之四氫呋喃(5.88kg)、水(1.61L)懸浮液中，添加鈀碳-伸乙基二胺錯合物(28g)，於常壓之氫氣環境中、室溫下攪拌1小時至3小時。濾出觸媒，將濾出的觸媒以四氫呋喃(1.63kg)洗淨，獲得濾洗液。重複上述反應與觸媒之濾出操作9次，合併獲得的9次份的濾洗液。減壓下，濃縮液量至成為17L左右。於獲得的濃縮液中添加2-丙醇(39kg)，減壓下，重複3次濃縮液量至成為17L左右的操作。於獲得的濃縮液中添加乙酸乙酯(45kg)，於室溫下攪拌6小時。將此懸浮液於5℃左右再攪拌1小時。過濾析出的固體，將濾出的固體以冷卻至5℃左右的2-丙醇及乙酸乙酯之1：3混合液(23.1L)洗淨。將獲得的結晶減壓下於40℃乾燥，獲得了標題化合物之粗體(2.18kg，產率75%)。於獲得的粗體(400g，0.62mol)中，添加懸浮於四氫呋喃(2.4L)、乙酸乙酯(5.6L)之1%硫酸氫鉀水溶液(4L)並加熱至32℃左右攪拌，並使溶解。分液，將獲得的有機層以水(2L)分液洗淨。獲得的有機層於減壓下濃縮液量至2L左右。於獲得的濃縮液中添加乙腈(6L)，減壓下濃縮液量至2.8L左右後，有固體析出。 添加乙酸乙酯(6L)，於室溫攪拌18小時後，冷卻至5℃左右，攪拌3小時。過濾析出的固體，將濾出的結晶以乙腈及乙酸乙酯之1：2混合液(7L)洗淨。將獲得的固體減壓下於40℃乾燥，獲得了標題化合物(356g，產率89%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.79(1H,dd,J=14.0,9.8Hz),3.06(1H,dd,J=13.7,4.6Hz),3.58-3.79(6H,m),3.98(2H,s),4.21-4.25(1H,m),4.28-4.30(2H,m),4.48-4.54(1H,m),4.61(2H,d,J=6.7Hz),7.16-7.20(1H,m),7.22-7.27(4H,m),7.33(2H,t,J=7.3Hz),7.42(2H,t,J=7.3Hz),7.59(1H,t,J=6.1Hz),7.71(2H,d,J=7.3Hz),7.89(2H,d,J=7.3Hz),8.03(1H,t,J=5.5Hz),8.16(1H,d,J=7.9Hz),8.33(1H,t,J=5.8Hz),8.57(1H,t,J=6.7Hz).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ37.4,41.8,42.1,43.5,46.6,54.1,64.2,65.7,68.8,120.1,125.2,126.3,127.1,127.6,128.1,129.1,137.8,140.7,143.8,156.5,168.8,169.4,170.0,171.4,171.4.
MS(ESI)(m/z)：646([M+H]+).
(實施例19)
N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
氮氣環境下，於甲磺酸(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-胺鎓2水合物(260g，0.458mol)之二甲亞碸(1.8L)、四氫呋喃(1.3L)懸浮液中，添加三乙基胺(55.6g，0.549mol)、1-羥基苯并三唑1水合物(84.2g，0.549mol)、N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(325g，0.503mol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(114g、0.595mol)，於室溫下攪拌2小時。添加四氫呋喃(3.9L)、乙酸乙酯(2.6L)、11%碳酸氫鉀水溶液(5.2L)，並攪拌分液。將獲得的有機層依序以19%檸檬酸水溶液(3.9L)、22%碳酸氫鉀水溶液(2.6L)、18%食鹽水(0.78L)洗淨。於獲得的有機層中添加活性碳(52g)，攪拌30分鐘後，添加四氫呋喃(0.78L)、無水硫酸鎂(0.78g)，並攪拌30分鐘。濾出固體，將濾出的固體以四氫呋喃(0.78L)洗淨。將獲得的濾洗液於減壓下濃縮液量至200mL左右。於獲得的濃縮液中添加乙酸乙酯(1.3L)，減壓下濃縮液量至200mL左 右。於獲得的濃縮液中添加四氫呋喃(1.8L)。將獲得的溶液，於另外的容器中，耗時12分鐘滴加於準備的乙酸乙酯(1.3L)、環戊基甲基醚(1.3L)混合液中。於此懸浮液中添加環戊基甲基醚(2.6L)，攪拌18小時後，冷卻至5℃左右，再攪拌1小時。過濾析出的固體，將濾出的固體以四氫呋喃及環戊基甲基醚之1：3混合液(1.3L)洗淨。將獲得的固體於減壓下40℃乾燥，獲得了標題化合物(408g，產率84%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.86(3H,t,J=7.3),1.79-1.90(2H,m),2.11-2.22(2H,m),2.37(3H,s),2.77(1H,dd,J=14.0,9.8Hz),3.02(1H,dd,J=13.7,4.6Hz),3.07-3.25(2H,m),3.58-3.79(6H,m),4.02(2H,s),4.18-4.23(1H,m),4.26-4.30(2H,m),4.45-4.54(1H,m),4.64(2H,d,J=6.7Hz),5.17(2H,dd,J=23.5,J=19.2Hz),5.40(2H,s),5.56-5.61(1H,m),6.52(1H,s),7.14-7.43(10H,m),7.58(1H,t,J=6.1Hz),7.68(2H,d,J=7.3Hz),7.76(1H,d,J=11.0Hz),7.86(2H,d,J=7.3Hz),8.02(1H,t,J=5.5Hz),8.15(1H,d,J=7.9Hz),8.32(1H,t,J=5.8Hz),8.50(1H,d,J=8.5Hz),8.63(1H,t,J=6.4Hz).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ7.7,10.9,11.0,23.1,23.7,27.8,30.3,31.4,37.3,41.8,42.1,43.5,44.6,46.6,49.6,54.2,55.6,65.2,65.8,67.0,69.8,72.3,82.0,96.7,109.7,109.9,119.1,120.0,121.6,123.5,123.7,125.2,125.3,126.3,127.0,127.6,128.1,129.1,136.3,136.4,137.8,140.5,140.7,143.8,143.8,145.1,147.8,147.9,150.0,152.3,156.5,156.7,160.3,162.8,168.9,169.2,169.4,170.2,171.4,172.4.
MS(ESI)1063：(M+H)+
(實施例20)
甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
氮氣流下，於N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(400g，0.376mol)之脫水四氫呋喃(8L)懸浮液中，分8次每5分鐘添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(51.6g，0.339mol)，攪拌2.5小時。氮氣流下，過濾析出的固體，將濾出的固體以四氫呋喃(2.4L)洗淨。將獲得的固體於減壓下40℃乾燥，獲得了含標題化合物的混合物(363g，產率115%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.87(3H,t,J=7.3),1.57-1.67(6H,m),1.80-1.92(2H,m),2.06-2.25(2H,m),2.35-2.38(3H,m),2.61-2.63(2H,m),2.73-2.89(1H,m),3.00-3.79(29H,m),3.80(1H,dd,J=16.2,7.0Hz),3.99-4.10(2H,m),4.30-4.51(1H,m),4.58(1H,dd,J=9.8,6.1Hz),4.63-4.69(1H,m),5.01(0.5H,br),5.15(1H,t,J=18.3Hz),5.24(1H,t,J=18.3Hz),5.41(2H,s),5.54-5.62(1H,m),6.52(0.6H,br),7.11-7.31(6H,m),7.75-7.79(1H,m),8.12-8.15(0.6H,m),8.22(0.2H,d,J=8.5Hz),8.36(0.2H,t,J=5.8Hz),8.52(0.2H,t,J=5.5Hz),8.66(0.2H,t,J=6.4Hz),8.93(0.6H,t,J=5.5Hz),9.10(1H,dd,J=20.1,9.2Hz),9.82(0.6H,br).
MS(ESI)841：(M+H)+
(實施例21)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之種晶之調製
於甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(200mg，0.24mmol)之吡啶(0.2mL)、四氫呋喃(2.0mL)、乙腈(0.6mL)懸浮液中，添加對甲苯磺酸吡啶鎓(120mg，0.48mmol)、三乙基胺(100μL，0.72mmol)、6-馬來醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺酯(73mg，0.24mmol)，室溫下攪拌3小時。將反應液以矽膠驟管柱層析(Biotage AB)[四氫呋喃：丙酮=3：7~7：3(v/v)]純化，獲得了為油狀物之標題化合物。於獲得的油狀物19.5mg中添加丙酮(0.4mL)、2-丁醇(0.2mL)，加熱至約60℃，於室溫過濾析出的固體，將濾出的固體以2-丁醇(約0.2mL)洗淨，獲得了為無色粉末之標記化合物(14.3mg)。獲得的粉末作為種晶而使用於下一反應。
(實施例22)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
氮氣環境下，使對甲苯磺酸吡啶鎓(209g，0.832mol)、6-馬來醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺酯(128g，0.415mol)、甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3‘,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(350g，0.416mol)溶解於吡啶(0.35L)、乙腈(1.1L)、四氫呋喃(3.5L)中後，添加三乙基胺(63.2g，0.625mol)，於室溫下攪拌3.5小時。添加四氫呋喃(3.5L)、19%檸檬酸水溶液(3.5L)、乙酸乙酯(2.5L)、18%食鹽水(2.5L)，攪拌後分液。於獲得的有機層中添加19%檸檬酸水溶液(2.5L)、18%食鹽水(2.5L)，攪拌後分液。 將獲得的有機層以22%碳酸氫鉀水溶液(2.1L)，其次以18%食鹽水(1.8L)分液洗淨。將獲得的有機層滴加於另外容器中準備的活性碳(35g)之乙腈(35L)懸浮液，攪拌30分鐘後，濾出活性碳，將濾出的活性碳以乙腈(1.8L)洗淨。獲得的濾洗液於減壓下外溫40℃左右濃縮直到溶媒未溜出。於獲得的濃縮殘渣中依序加入丙酮(1.8L)、1-丙醇(3.5L)，加熱至55℃而使溶解後，冷卻至室溫。將實施例21所獲得的粉末(0.2g)作為種晶而添加，攪拌86小時後，過濾析出的固體，將濾出的固體以丙酮(1.1L)洗淨。將獲得的固體減壓下於40℃乾燥，獲得了作為結晶之標題化合物(191g，產率44%)。
(實施例23)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
對包含無水硫酸鈉(1.8g)、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯(0.16g，1.13mmol)、N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(總量5.76g，1,2-二甲氧基乙烷12.40%換算後內容量5.05g，8.18mmol)的純水及四氫呋喃(24mL及18mL)之混合液，於20~30℃，添加包含甲磺酸(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-胺鎓(3.0g，5.64mmol)的純水及四氫呋喃(9mL及15mL)之混合懸浮液。於混合液中，添加包含四氫呋喃(9mL)及N-甲基啉(0.63g，6.23mmol)的四氫呋喃7.5mL之溶液，於相同溫度攪拌15分鐘後，添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.16g，11.27mmol)及純水與四氫呋喃(1.5mL及1.5mL)之混合液。將混合液於20~30℃攪拌30分鐘以上，確認反應結束後，分液而移除水層。將有機層溫度調整至15~25℃，添加包含乙酸乙酯(36mL)及無水硫酸鈉(1.26g)、N-甲基啉(0.14g，1.38mmol)的純水(24mL)而攪拌，分液而移除水層。於有機層中添加純水(9mL)而攪拌、分液，進一步添加包含乙酸(0.45mL)的純水(9mL)而攪拌、分液，獲得有機層。添加活性碳(0.30g，強力白鷺(Osaka Gas Chemical Co.,Ltd.製))而於室溫攪拌約15分鐘後，濾出活性碳，將活性碳以四氫呋喃(9mL)洗淨而合併濾液，減壓濃縮至30mL。於濃縮液中添加四氫呋喃(75mL)，減壓濃縮至30mL，再添加四氫呋喃 (45mL)，減壓濃縮至30mL。確認濃縮液中之水分量為8.0%(v/v)以下後，添加丙酮及1-丙醇(30mL及71mL)之混合液。添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(30mg)，於20~30℃攪拌12小時以上。將懸浮液冷卻至0~5℃後，再攪拌24小時以上，過濾析出物，將濾出的粉末於0~5℃以丙酮及1-丙醇之1：1混合液(30mL)洗淨。將獲得的結晶減壓下於35℃乾燥，獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之粗結晶(5.23g，產率89.6%)。
於N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之粗結晶(4.50g，4.35mmol)，添加包含乙酸(15μL)的丙酮及純水(10.6mL及2.9mL)之混合液，於34~38℃攪拌1小時以上，確認溶解後，冷卻至 20~25℃。添加丙酮及1-丙醇(31.5mL及64.8mL)之混合液，添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺(27mg)，於20~25℃攪拌24小時以上。將懸浮液冷卻至0~5℃後，再攪拌12小時，過濾析出物，將濾出的粉末以0~5℃丙酮及1-丙醇之1：1混合液(27mL)洗淨。將獲得的結晶減壓下於35℃乾燥，獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之精結晶(4.37g，產率93.0%)。
機器資料係與實施例14記載之化合物同樣。
(實施例24)
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺
對包含無水硫酸鈉(1.8g)、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯(0.16g，1.13mmol)、N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(羧基甲氧基)甲基]甘胺醯胺(總量5.76g，1,2-二甲氧基乙烷12.40%換算後內容量5.05g，8.18mmol)的純水及四氫呋喃(24mL及18mL)之混合液，於20~30℃添加包含甲磺酸(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-胺鎓(3.0g，5.64mmol)的純水及四氫呋喃(9mL及15mL)之混合懸浮液。於混合液中添加包含四氫呋喃(9mL)及N-甲基啉(0.63g，6.23mmol)的四氫呋喃7.5mL之溶液，於相同溫度攪拌15分鐘後，添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.16g，11.27mmol)及純水與四氫呋喃(1.5mL及1.5mL)之混合液。將混合液於20~30℃攪拌30分鐘以上，確認反應結束後，分液而移除水層。將有機層溫度調整至15~25℃，添加包含乙酸乙酯(36mL)及無水硫酸鈉(1.26g)、N-甲基啉(0.14g，1.38mmol)的純水(24mL) 而攪拌，分液而移除水層。於有機層中添加純水(9mL)而攪拌，分液，再添加包含乙酸(0.45mL)的純水(9mL)而攪拌、分液，獲得有機層。添加活性碳(0.30g，強力白鷺(Osaka Gas Chemical Co.,Ltd.製))，於室溫攪拌約15分鐘以上後，濾出活性碳，將活性碳以四氫呋喃(9mL)洗淨而合併濾液，減壓濃縮至30mL。於濃縮液中添加四氫呋喃(75mL)，減壓濃縮至30mL，再添加四氫呋喃(45mL)，減壓濃縮至30mL。確認濃縮液中之水分量為8.0%(v/v)以下後，添加丙酮及1-丙醇(30mL及71mL)之混合液，於20~30℃攪拌22小時。將懸浮液冷卻至0~5℃後，再攪拌24小時以上，過濾析出物，將濾出的粉末以0~5℃丙酮及1-丙醇之1：1混合液(30mL)洗淨。將獲得的結晶於減壓下35℃乾燥，獲得了N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之結晶(5.08g，產率87.0%)。
機器資料係與實施例14記載之化合物同樣。
[序列表之非關鍵詞文字]
序列識別號1：抗HER2抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號2：抗HER2抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號3：抗HER3抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號4：抗HER3抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號5：抗TROP2抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號6：抗TROP2抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號7：抗B7-H3抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號8：抗B7-H3抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號9：抗GPR20抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號10：抗GPR20抗體輕鏈之胺基酸序列
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 抗體-藥物結合物之改良製造方法
<130> DSPCT-FP1824
<150> JP2017-167691
<151> 2017-08-31
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER2抗體之重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER2抗體之輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER3抗體之重鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER3抗體之輕鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TROP2抗體之重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TROP2抗體之輕鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗B7-H3抗體之重鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗B7-H3抗體之輕鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPR20抗體之重鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPR20抗體之輕鏈
<400> 10

Claims (52)

  1. 一種式(1)所表示的化合物之結晶，
  2. 如請求項1之結晶，其於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於5.6±0.2°、15.5±0.2°、及22.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
  3. 一種式(1)所表示的化合物之結晶之製造方法，其包含下列步驟：調製溶解了式(1)所表示的化合物之溶液的步驟， 其次，使式(1)所表示的化合物之結晶自前述之溶液析出的步驟。
  4. 如請求項3之製造方法，其中式(1)所表示的化合物之結晶係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於5.6±0.2°、15.5±0.2°、及22.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
  5. 如請求項3或4之製造方法，其中溶解式(1)所表示的化合物的溶液係包含低級酮及低級醇作為溶媒。
  6. 如請求項5之製造方法，其中低級酮為丙酮。
  7. 如請求項5之製造方法，其中低級酮為甲基乙基酮。
  8. 如請求項5至7中任一項之製造方法，其中低級醇為1-丙醇。
  9. 如請求項5至7中任一項之製造方法，其中低級醇為2-丁醇。
  10. 如請求項3至9中任一項之製造方法，其包含添加式(1)所表示的化合物之結晶的種晶的步驟。
  11. 如請求項3至10中任一項之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(I)而被製造；(其中，製造方法(I)係包含下列步驟的製造方法：將式(B)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基脫保護， (其中，R 1係表示經保護基保護的胺基，R 2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(8)所表示的化合物及式(C)所表示的化合物縮合， (其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合， 而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
  12. 如請求項3至10中任一項之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(II)而被製造；(其中，製造方法(II)係包含下列步驟之製造方法：藉由將式(B)所表示的化合物之胺基的保護基脫保護， (其中，R 1係表示經保護基保護的胺基，R 2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(D)所表示的化合物的步驟 (其中，R 2係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(D)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合， (其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(E)所表示的化合物的步驟 (其中，R 2係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(E)所表示的化合物之羧基的保護基脫保護，而變換為式(10)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合， 而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
  13. 如請求項11或12之製造方法，其包含下列步驟：於包含1,2-二甲氧基乙烷的溶媒中，使式(10)所表示的化合物溶解的步驟；其次，使式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶析出的步驟。
  14. 如請求項13之製造方法，其中式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
  15. 如請求項11至14中任一項之製造方法，其中藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟，係於硫酸鈉水溶液及四氫呋喃之2相系統中進行。
  16. 如請求項3至10中任一項之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(III)而被製造；(其中，製造方法(III)係包含下列步驟之製造方法：藉由將式(B)所表示的化合物之羧基之保護基脫保護 (其中，R 1係表示經保護基保護的胺基，R 2係表示經保護基保護的羧基)，而變換為式(F)所表示的化合物的步驟 (其中，R 1係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(F)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合， 而變換為式(G)所表示的化合物的步驟 (其中，R 1係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(G)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(16)所表示的化合物與式(C)所表示的化合物縮合 (其中，X係表示活性酯基、或羧基)，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
  17. 如請求項11至16中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽。
  18. 如請求項11至16中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧m水合物(其中，m為0~3個之範圍內)。
  19. 如請求項11至16中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧2水合物。
  20. 如請求項11至19中任一項之製造方法，其中式(B)所表示的化合物係藉由製造方法(IV)而被製造；(其中，製造方法(IV)係包含下列步驟之製造方法：藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應 (其中，R 3係表示經保護基保護的胺基)，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟 (其中，R 3係表示與前述相同意義)；其次，藉由使式(J)所表示的化合物、與式(K)所表示的化合物 (其中，R 2係表示與請求項11至19中任一項記載之R 2同意義)，於酸或於鹼之存在下反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟 (其中，R 2及R 3係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(L)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟 (其中，R 2係表示與前述相同意義)；其次，藉由將式(M)所表示的化合物與式(N)所表示的化合物縮合 (其中，R 1係表示與如請求項11至19中任一項之R 1同意義)，而變換為式(B)所表示的化合物的步驟 (其中，R 1及R 2係表示與前述相同意義))。
  21. 如請求項20之製造方法，其中藉由使式(H)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(J)所表示的化合物的步驟，係於乙酸之存在下進行。
  22. 如請求項20或21之製造方法，其中使式(J)所表示的化合物及式(K)所表示的化合物反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟，係於氫氧化鈉水溶液之存在下進行。
  23. 如請求項20或21之製造方法，其中使式(J)所表示的化合物及式(K)所表示的化合物反應，而變換為式(L)所表示的化合物的步驟，係於參(五氟苯基)硼烷之存在下進行。
  24. 如請求項20至23中任一項之製造方法，其包含藉由將式(L)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(M)所表示的化合物的步驟之後，藉由添加酸，而使式(M)所表示的化合物與酸之鹽析出的步驟。
  25. 如請求項24之製造方法，其中酸為1-羥基苯并三唑。
  26. 如請求項11至25中任一項之製造方法，其中R 1為經苄氧基羰基保護的胺基。
  27. 如請求項11至25中任一項之製造方法，其中R 1為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
  28. 如請求項11至27中任一項之製造方法，其中R 2為經苄基保護的羧基。
  29. 如請求項20至28中任一項之製造方法，其中R 3為經(9H-茀-9-基甲氧基)羰基保護的胺基。
  30. 如請求項11至29中任一項之製造方法，其中X為(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基羰基。
  31. 如請求項3至10中任一項之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(V)而被製造；(其中，製造方法(V)係包含下列步驟之製造方法：藉由將式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應， 而變換為式(3)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(5)所表示的化合物與式(6)所表示的化合物縮合， 而變換為式(7)所表示的化合物的步驟； 其次，將式(7)所表示的化合物之胺基及羧基之保護基脫保護，而變換為式(8)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(8)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合， 而變換為式(10)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合， 而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
  32. 如請求項31之製造方法，其包含使式(10)所表示的化合物溶解於包含1,2-二甲氧基乙烷的溶媒中的步驟；其次，使式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶析出的步驟。
  33. 如請求項32之製造方法，其中式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
  34. 如請求項31至33中任一項之製造方法，其中藉由將式(10)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合，而變換為式(1)所表示的化合物的步驟，係於硫酸鈉水溶液及四氫呋喃之2相系統中進行。
  35. 如請求項3至10中任一項之製造方法，其中式(1)所表示的化合物係藉由製造方法(VI)而被製造；(其中，製造方法(VI)係包含下列步驟之製造方法：藉由使式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應， 而變換為式(3)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由使式(3)所表示的化合物，於酸或鹼之存在下，與乙醇酸苄酯反應，而變換為式(4)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(5)所表示的化合物與式(12)所表示的化合物縮合， 而變換為式(13)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(13)所表示的化合物之羧基之保護基脫保護，而變換為式(14)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(14)所表示的化合物與式(11)所表示的化合物縮合， 而變換為式(15)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(15)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(16)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由將式(16)所表示的化合物與式(9)所表示的化合物縮合， 而變換為式(1)所表示的化合物的步驟
  36. 如請求項31至35中任一項之製造方法，其中藉由使式(2)所表示的化合物與四乙酸鉛反應，而變換為式(3)所表示的化合物的步驟，係於乙酸之存在下進行。
  37. 如請求項31至36中任一項之製造方法，其中將式(3)所表示的化合物變換為式(4)所表示的化合物的步驟，係於氫氧化鈉水溶液之存在下進行。
  38. 如請求項31至36中任一項之製造方法，其中將式(3)所表示的化合物變換為式(4)所表示的化合物的步驟，係於參(五氟苯基)硼烷之存在下進行。
  39. 如請求項31至38中任一項之製造方法，其包含藉由將式(4)所表示的化合物之胺基之保護基脫保護，而變換為式(5)所表示的化合物的步驟之後，藉由添加酸，使式(5)所表示的化合物及酸之鹽析出的步驟。
  40. 如請求項39之製造方法，其中酸為1-羥基苯并三唑。
  41. 如請求項31至40中任一項之製造方法，其中式(6)所表示的化合物係藉由包含下列步驟之方法而製造：藉由式(23)所表示的化合物與N-羥基琥珀醯亞胺縮合， 而變換為式(24)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由式(24)所表示的化合物與L-苯基丙胺酸縮合，而變換為式(6)所表示的化合物的步驟。
  42. 如請求項31至41中任一項之製造方法，其中式(9)所表示的化合物係藉由包含下列步驟之方法製造：藉由使式(17)所表示的化合物與順丁烯二酸酐反應， 而變換為式(18)所表示的化合物的步驟； 其次，藉由於包含式(18)所表示的化合物、與N-羥基琥珀醯亞胺、及2,6-二甲吡啶的混合溶液中，添加亞硫醯氯，而變換為式(9)所表示的化合物的步驟。
  43. 如請求項31至42中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽。
  44. 如請求項31至42中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧m水合物(其中，m為0~3個之範圍內)。
  45. 如請求項31至42中任一項之製造方法，其中式(11)所表示的化合物為甲磺酸鹽‧2水合物。
  46. 如請求項3至45中任一項之製造方法，其未使用層析。
  47. 一種結晶，其係式(10)所表示的化合物之1,2-二甲氧基乙烷加成物之結晶，
  48. 如請求項47之結晶，其係於銅之Kα射線之照射所獲得的粉末X射線繞射，於19.0±0.2°、及25.0±0.2°之繞射角度(2θ)顯示主要波峰。
  49. 一種鹽，其係式(5)所表示的化合物及酸之鹽，
  50. 如請求項49之鹽，其中酸為1-羥基苯并三唑。
  51. 一種抗體-藥物結合物之製造方法，係式(19)所表示的藥物連結子 (式中，A表示與抗體的鍵結位置)、及抗體藉由硫醚鍵而結合之抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為使用藉由如請求項3至46中任一項之方法而製造的式(1)所表示的化合物之結晶作為起始原料， 其包含i)將抗體還原的步驟，其次，ii)添加溶解有以上述方法所製造的式(1)所表示的化合物之結晶的溶液，使與經還原的抗體反應的步驟。
  52. 如請求項51之製造方法，其中抗體為抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、或抗GPR20抗體。
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