TW201825526A - Ｂ型肝炎治療型疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種作為B型肝炎治療型疫苗的融合蛋白。該融合蛋白包含：(a)一抗原呈現細胞(APC)結合域或一CD91受體結合域；(b)一蛋白轉導域；以及(c)一抗原，包含一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變體，其缺乏X蛋白的至少第21-50號位胺基酸。該蛋白轉導域係一融合多肽，包含一T細胞致敏信號轉導肽、一連接子及一轉位肽。該APC結合域或CD91受體結合域位於該融合蛋白之N端，該抗原位於該蛋白傳導域之C端。

Description

B型肝炎治療型疫苗
本發明係關於一種B型肝炎。詳言之，係關於一種B型肝炎疫苗。
根據2017年世界衛生組織全球肝炎報告，全世界B型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)帶原者達2.57億人。目前已知HBV足以引起各種肝臟疾病，包括肝臟發炎、肝硬化及肝(細胞)癌(Hepatocelllular carcinoma,HCC)，其中B型肝炎病毒X蛋白(HBV X protein,HBx)扮演重要角色。
菌體表現之HBx難溶於水。Dong Liu等人曾以麥芽糖結合蛋白標籤(maltose binding protein tag,MBP-tag)取得可溶於水之HBx，省下變性與復性處理之需求(Biotechnol.Appl.Biochem.2009,54：141-147)。此方法缺陷在於本身的複雜性：其需使用直鏈澱粉樹脂(amylose resin)和Q-瓊脂糖層析(Q-Sepharose chromatography)進行純化，並以第Xa因子酵素消化48小時，將MBP-tag去除。這些步驟使得純化流程變得複雜，使花費的成本和時間增加，限制在大規模生產的運用性。其他作者曾以包涵體之變性及復性搭配金屬親和層析[其使用鎳離子瓊脂糖管柱(Ni2+ sepharose column)]製備HBx蛋白，但此方法存在鎳毒性之問題(Forgacs Z et al.(2012),J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng,47(9)：1249-60)，因此於藥品製程之運用有限。
美國9,481,714 B2號專利揭示有一種融合蛋白RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3亦存在凝集物形成之問題：其製程中需以高濃度尿素破壞蛋白內氫鍵，使包涵體內重組蛋白變性、具水溶性。然而，最後去除尿素、使蛋白復性之步驟易使凝集物和沉澱物生成，導致產率不良。
因此，需開發一種新穎的治療HBV疫苗及新的製備方法。
據發現，在不影響蛋白結構和功能下，以DNA工程技術予第21~50號位胺基酸殘基缺失可解決蛋白復性時易發生凝集及沉澱之問題，進而提升最終蛋白產率。
本發明之一態樣係關於一種融合蛋白，其包含：(a)一抗原呈現細胞(APC)結合域或一CD91受體結合域，其位於該融合蛋白之N端；(b)一蛋白轉導域，係位於該APC結合域或CD91受體結合域之C端，該蛋白轉導域為一融合多肽，其包含：(1)一T細胞致敏信號轉導肽，在長度上由28-53個胺基酸殘基所組成，且包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，其中Xaa8為異白胺酸(I)或白胺酸(L)，Xaa10為纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)或丙胺酸(A)，Xaa11為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L)，Xaa17為白胺酸(L)或異白胺酸(I)，位於該融合多肽之N端；(2)一轉位肽，在長度上由34-112個胺基酸殘基所組成，且包含一與SEQ ID NO：3、4、20或30至少90%相同之胺基酸序列；以及(3)一連接子，其連接該T細胞致敏信號轉導肽及該轉位肽；以及(c)一抗原，其包含一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變體(hepatitis B virus X protein deletion mutant)(△HBx)，其缺乏X蛋白的至少第21-50號位的胺基酸殘基，該抗原位於該蛋白轉導域之C端。
本發明之另一態樣係關於一種疫苗，包含：(a)本發明之一具有治療有效劑量的融合蛋白；以及(b)一佐劑。該佐劑可包含CpG去氧寡核苷酸(Oligodeoxynucleotide)。
本發明之另一態樣係關於以本發明之融合蛋白供用於製備一醫藥品的用途，該醫藥品供用於誘發一B型肝炎病毒(HBx)專一性T細胞反應、治療B型肝炎病毒感染、將B型肝炎病毒感染症狀降至最低程度、抑制B型肝炎病毒於肝臟細胞內增生，及/或抑制一需治療個體之B型肝炎病毒感染。
本發明之另一態樣係關於本發明之融合蛋白，該融合蛋白供用於誘發B型肝炎病毒(HBx)專一性T細胞反應、治療B型肝炎病毒感染、將B型肝炎病毒感染症狀降至最低程度、抑制B型肝炎病毒於肝臟細胞內增生，及/ 或抑制一需治療個體之B型肝炎病毒感染。
此外，本發明亦關於一種方法，係供用於誘發B型肝炎病毒(HBx)專一性T細胞反應、治療B型肝炎病毒感染、將B型肝炎病毒感染症狀降至最低程度、抑制B型肝炎病毒於肝臟細胞內增生，及/或抑制一需治療個體之B型肝炎病毒感染。該方法係包含對需治療的個體投予本發明之一治療有效劑量的融合蛋白。
本發明另一態樣係關於一種用於製備一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變融合蛋白之方法，其包含：(a)產生一質體，係用於表現本發明的融合蛋白；(b)使該質體於一宿主細胞中表現該融合蛋白；以及(c)自該宿主細胞收集該融合蛋白。
本發明的一實施方式中，該APC結合域或CD91受體結合域包含一胺基酸序列，其與選自SEQ ID NO：5、9、6、7及8所構成之群組的序列具有至少90%相同。
本發明的另一實施方式中，該融合蛋白可進一步包含一內質網滯留序列，係位於該融合蛋白之C端。本發明的另一實施方式中，如果該抗原含有10個或10個以上的抗原決定位(epitope)，則融合蛋白在C端不包含一內質網滯留序列。本發明的另一實施方式中，該蛋白轉導域包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該蛋白轉導域可包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。本發明的另一實施方式中，該APC結合域或CD91受體結合域包含一選自SEQ ID NO：5、9、6、7及8所構成之群組的胺基酸序列。本發明的另一實施方式中，該T細胞致敏信號轉導肽包含一選自SEQ ID NO：1及2所構成之群組的胺基酸序列。本發明的另一實施方式中，該轉位肽包含SEQ ID NO 3之胺基酸序列。本發明的另一實施方式中，該抗原包含SEQ ID NO 23之胺基酸序列。本發明的另一實施方式中，該缺失突變體△HBx具有第1-50號位、第5-50號位、第10-50號位、第15-50號位，或第18-50號位的胺基酸缺失(deletion)。本發明的另一實施方式中，該缺失突變體△HBx具有自第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21號位至第50號位的胺基酸缺失。本發明的另一實施方式中，該抗原包含一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變體(△HBx)，其具有自第21號位至第50號位的胺基酸缺失。
以下最佳實施方式及圖式均彰顯此等及其他態樣，然而其變異及變更經改變後，亦不影響所揭示新穎概念之精神與範疇。
圖式為本發明一個或多個實施方式，搭配書面說明此發明之原則。圖式中同一符號係指一實施方式之相同或類似元素。
圖1係顯示載體圖譜，為質體RAP1-CD28conv-PEt-△HBx-K3-pTac。
圖2係顯示凝膠電泳之結果。
圖3係顯示接種及試樣收集之時間安排。
圖4係顯示C57BL/6小鼠接種RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3+CpG ODN1826疫苗後，其誘導一抗原專一性體液免疫反應之酵素連結免疫吸附分析(ELISA)結果。其中，係以純化重組HBx蛋白捕捉血清HBx專一性抗體，並以顏色標示波長450nm下的吸收度比較。
圖5係顯示C57BL/6小鼠接種RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3+CpG ODN1826疫苗後，其誘發之專一性Th1細胞免疫反應，其中以ELISPOT分析。比較經不同HBx專一性肽資料庫(小型混合肽-1、小型混合肽-2)刺激後，分泌IL-2(上)、IFNγ(中)及TNFα(下)之脾臟免疫細胞數量。
圖6係顯示B型肝炎病毒(HBV)帶原小鼠模型、採樣流程及給藥時間安排之確立。
圖7係顯示HBV帶原小鼠接種後之體重變化。
圖8係顯示HBV帶原小鼠接種後之總膽紅素變化。
圖9係顯示HBV帶原小鼠接種後之血清丙胺酸轉胺酶(ALT)變化。
圖10係顯示HBV帶原小鼠第一次接種後，經82天之肝臟(上)及脾臟(下)重量比例。
圖11係顯示HBV帶原小鼠接種後，血清病毒DNA量(DNA load)(x1000copies/ml)(上)及陽性率(positive rate)(>1000copies/ml)(下)比例之變化。佐劑及疫苗組間達統計顯著差異者(P<0.05)以「*」表示。各組別小鼠數量如下：對照組：n=7；佐劑組：n=10；疫苗組：n=10。
圖12係顯示HBV帶原小鼠接種後，血清表面抗原量(x100IU/ml)(上)及陽性 率(>0.05IU/ml)比例(下)之變化。佐劑及疫苗組間達統計顯著差異者(P<0.05)以「*」表示。
圖13係顯示HBV帶原小鼠第一次接種後，經82天以西方墨點法分析之肝臟核心抗原表現。
在本發明背景及使用各詞彙之具體背景中，本說明書所使用詞彙為技術領域的一般意義。下文或本說明書其他部分中，以特定詞彙描述本發明係為從業人員提供關於本發明說明之額外指引。為便利起見，特定詞彙予以特別標示，如使用斜體及/或引號，使用特別標示不影響詞彙之範疇與意義，於同一背景下均維持一致，無論是否予以特別標示，同一事物可以多於一種方式陳述為佳，故本案所述任一或更多詞彙得使用替代言語及同義詞，詞彙是否於本案說明或討論並無任何特別意義。特定詞彙係提供同義詞。複述一個或更多同義詞並不排除其他同義詞之使用。本說明書其餘部分之實施例使用均僅供示例目的，包括本發明所述任何詞彙之範例，且不限定於本發明或任何已豁免詞彙之範疇與意義。同樣地，本發明不限定於本說明書所舉各實施方式。
若無另行定義，本案所有技術及科學詞彙之意義均與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解者相同。出現衝突時，以本文件包括定義部分為準。
如本發明所使用，「約莫」、「大約」或「近似」應一般表示處於一定值或範圍之20%內，以10%內為佳，且以5%內較佳。本發明所列數值為近似值，亦即未明確使用「約莫」、「大約」或「近似」等詞彙時，仍具其意涵。
美國9,481,714 B2、9,339,536 B2及20160250324 A1號專利揭示有一種諸如融合蛋白之免疫原性蛋白作為免疫原性增強劑，其供誘發抗原專一性T細胞反應。上述所列專利號均作為本案參考文獻。
「抗原呈現細胞(Antigen-presenting cell,APC)結合域」一詞係指可與一抗原呈現細胞結合的一結構域(係一多肽)。一實施方式中，該APC結合域係選自受體相關蛋白-1(Receptor-associated protein-1,RAP1)第三結構域、alpha-2-巨球蛋白受體相關蛋白(alpha-2-macroglobulin receptor-associated protein, A2M)、HIV-Tat、熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)及綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin,PE)A第一結合域所構成之群組。另一實施方式中，該APC結合域可為一多肽，其包含一與選自SEQ ID NO：5、6、7、8及9所構成之群組的序列具有至少90%相同的胺基酸序列。
分化簇91(Cluster of differentiation,CD91)係一蛋白質，形成細胞膜上之受體，且涉及受體媒介胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)。
另一實施方式中，該APC結合域或CD91受體結合域具識別、結合一抗原呈現細胞受體之特性，該抗原呈現細胞係選自樹突細胞、單核球、B細胞與淋巴球所構成之群組。
受體相關蛋白(Receptor-associated protein,RAP1)具有分子量39kDa，其係一內質網駐留蛋白(ER resident protein)及LDL受體相關蛋白之分子伴護蛋白(molecular chaperone)。RAP1對於CD91(Kd~3nM)具高度結合親和力，且由三個功能類似之結構域所組成。
「一蛋白轉導域(Protein transduction domain)」係一多肽，其功能為T細胞敏感化，增強抗原專一性T細胞反應，及/或為一抗原引導或導向至(目標)抗原表現之第一類主要組織相容性複合體(Class I major histocompatibility complex,MHC-I)途徑(胞殺T細胞途徑)。
「致敏T細胞(to sensitize T cells)」一般指CD8+及CD4+ T細胞致敏化，增強抗原測試中CD8+(CTL)及CD4+ T細胞之反應。一抗原專一性的胞殺細胞(Antigen-specific cytotoxic cell,CTL)反應是藉由針對抗原反應所產生的抗原專一性誘發γ-干擾素(γ-interferon)的量化而被測定。例如，無致敏化訊號下，抗原本身誘發之CTL訊號微弱或無CTL反應時，即抗原專一性γ-干擾素之生產不存在或微弱。故致敏化訊號之功能為將在宿主內的CD8+ T細胞致敏化，因此當宿主遭遇抗原挑戰時，該抗原可因為先前的CD8+ T細胞致敏化而誘發一經增強之抗原專一性CTL反應。
此外，CD4+ T細胞反應也會受到先前之T細胞致敏化而被增強。一抗原專一性的CD4+ T細胞反應可藉由來自於B細胞之抗體(IgG)滴度生成量而被間接地測量。
一蛋白轉導域得為一肽及/或融合多肽，係選自以下組成之群 體：(i)一T細胞致敏信號轉導肽，其在長度上具28-53個胺基酸殘基，且包含與SEQ ID NO：1至少90%相同之胺基酸序列；(ii)一轉位肽，其在長度上具34-112個胺基酸殘基，且包含與SEQ ID NO：1至少90%相同之胺基酸序列；以及(iii)一融合多肽，其包含該T細胞致敏信號轉導肽及該轉位肽，其中該T細胞致敏信號轉導肽位於該融合多肽之N端。
本發明另一實施方式中，該蛋白轉導域可為「一融合多肽(Fusion polypeptide)」，其中該融合多肽包含一T細胞致敏信號轉導肽、一連接子及一轉位肽。例如，該融合多肽得為「CD28convPEt」多肽，其包含位於「CD28conv」及「PEt」間的一連接子(Linker)。
「CD28conv」一詞係指一CD28保守區域(CD28 conserved region)，為一「T細胞致敏信號轉導肽」。CD28conv是用以誘發CD28促效抗體(CD28 agonist antibody)的一抗原決定位(epitope)。
「PEt」或「PEtCore」一詞係指一PE轉位域核心(PE translocation domain core)，其在長度上具有34個胺基酸殘基。
融合蛋白「CD28convPEt」之定向或排列相當重要，其中「CD28conv」(或T細胞致敏信號轉導肽)必須處於PEt(或轉位肽)之上游端，即PEt必須位於「CD28conv」之C端，才可取得增強之T細胞反應。「CD28convPEt」可使CD28conv之專一性IgG(稱為CD28專一性促效抗體(CD28-specific agonist antibody))滴度提高，且其幅度明顯高於反向定位之融合蛋白PEtCD28conv。CD28專一性促效抗體可使CD4+及CD8+ T細胞致敏化。正確定向融合多肽CD28convPEt含CD28conv及PEt間的一連接子(R1X2R3X4K5R6)。連接子含一抗原呈現細胞專一性蛋白酶(細胞自溶酵素[cathepsin]L)切割位離胺酸(Lys)-精胺酸(Arg)(KR)。因此，融合蛋白RAP1-CD28convPEt-抗原-K3可消化為二片段：RAP1-CD28conv及PEt-抗原-K3。RAP1-CD28conv片段可於溶酶體進一步消化，CD28conv抗原決定位經由第二類主要組織相容性複合體(MHC II)途徑，而被呈現於抗原呈現細胞的表面，其進而誘導一體液免疫反應並產生CD28促效抗體。故CD28促效抗體由B細胞產生。CD28促效抗體可與T細胞表面之 CD28結合，並進而預先活化T細胞(CD4+及CD8+ T細胞)。
一「T細胞致敏信號轉導肽」，其在長度上具有28~53個胺基酸殘基，且包含一與SEQ ID NO：28至少90%相同的胺基酸序列，其中X8為異白胺酸(I)或白胺酸(L)，X10為纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)或丙胺酸(A)，X11為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L)，X17為白胺酸(L)或異白胺酸(I)。
該T細胞致敏信號轉導肽包含關鍵區域K1X2E3X4X5Y6P7P8P9Y10(SEQ ID NO：29)，其中X2為異白胺酸(I)或白胺酸(L)，X4為纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)或丙胺酸(A)，X5為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L)。
美國9,481,714 B2號專利揭示有小鼠專一性的一T細胞致敏信號轉導肽(TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH；SEQ ID NO：28，其中X8為I，X10為F，X11為M，X17為L)。
一PE轉位肽可包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：3、4、20或30至少為90%相同。例如，PE轉位肽可為PE全長(SEQ ID NO：10)之a.a.280-a.a.313(SEQ ID NO：3)、a.a.268-a.a.313(SEQ ID NO：20)、a.a.253-a.a.313(SEQ ID NO：30)，或a.a.253-a.a.364(SEQ ID NO：4)。即一PE轉位肽之胺基酸序列可含PE第二結構域之任何區域(a.a.253-a.a.364；SEQ ID NO：4)，只要其包含必要片段a.a.280-a.a.313(SEQ ID NO：3)。
一內質網滯留序列(Endoplasmic reticulum,ER)之功能係協助一抗原自胞吞腔轉位至內質網，並將其留置於內腔中。內質網滯留序列包含Lys Asp Glu Leu(KDEL)或RDEL序列。例如，一內質網滯留序列可包含KKDLRDELKDEL(SEQ ID NO：16)、KKDELRDELKDEL(SEQ ID NO：17)、KKDELRVELKDEL(SEQ ID NO：18)或KDELKDELKDEL(SEQ ID NO：19)序列。
製備具HBx缺失突變體(deletion HBx mutants)的二融合蛋白，其中一者具第1-50號位的胺基酸缺失，另一者具第21-50號位的胺基酸缺失。本發明之融合蛋白RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3與融合蛋白RAP1-CD28convPEt-HBx-K3(具全長HBx)之效果相當，但前者穩定性明顯優於後者。經儲存一段時間(例如一年)後，液體內融合蛋白RAP1-CD28convPEt-HBx-K3之凝集率(aggregation)為100%，而融合蛋白 RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3之凝集率較低。
包含有CpG基序(CpG motif)的去氧寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides)(CpG ODN)被廣泛地使用於免疫細胞的活化。
「個體(Subject)」一詞係指人類或非人類動物。
「治療」(「Treating」或「Treatment」)一詞係指對具需求個體施用一有效量之融合蛋白，且個體具癌症或感染，或具症狀或導致疾病之前驅問題。治療之目的為治癒、緩和、減緩、補救、緩解或預防疾病、其症狀或前驅問題。個體可由專業醫療人員依據任何適當診斷方法結果辨識。
「有效量」一詞係指使治療個體獲治療效果所需的一活性化合物份量。有效劑量由發明所屬技術領域中具有通常知識者認定，取決於施用途徑、賦形劑使用，以及與其他治療同時使用之可能性。
縮寫釋義：CD28係分化簇28。
實施例
以下本發明實施例並未意圖限定其發明範疇、示例性儀器、裝置、方法及其相關結果。為便讀者閱讀，實施例得使用標題或子標題，但應不限定於本發明之範疇。此外，本案所推導及揭示之理論，無論其正確與否，均應不限定於本發明之範疇，惟無論任何理論或行動計畫，本發明之實施均需按本發明案為之。
方法
製備融合蛋白RAP1-CD28 conv PEt-△HBx-K3
1. 建立質體RAP1-CD28-PEt-△HBx-K3-pTac係使用下列引子：HBV1-F’-EcoRI：GAATTCATGGCTGCTCGTATGTGCTGC(SEQ ID NO：31)；HBV20.51-S：CTGCGTCCGTCTCACCTGTCTCTGCGTGG(SEQ ID NO：32)；HBV20.51-A：GTTCTGTGCCTGCGTCCGTCTCACCTGTCGACAGGTGAGACGGACGCAGGCACAGAAC(SEQ ID NO：33)；HBV154-R’-XhoI：CTCGAGGGCAGAGGTGAAGAAGTTGCAC(SEQ ID NO：34)。
以美國專利申請9,481,714 B2號所揭示融合蛋白 RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3-pTac為一DNA模板(見該專利之圖10及圖11之8號)，並分別以SEQ ID NOs.31-34為引子，經聚合酶鏈反應合成HBx1-20及HBx51-154片段。引子HBV20.51-S及HBV20.51-A經設計使兩者具相互重疊且互補之部分序列，故HBx1-20及HBx51-154片段相互重疊且互補，形成一聚合酶鏈反應之模板，並以引子HBV1-F'-EcoRI及HBV154-R'-XhoI來擴增該鏈反應，最終產生含EcoRI、XhoI限制內切酶切割位之△HBx(1-20,51-154)片段。△HBx(1-20,51-154)片段之EcoRI及XhoI切割位允許△HBx(1-20,51-154)片段插入RAP1-K3-pTac質體(見美國專利9,481,714 B2號之圖10)，繼而獲得構建物RAP1-△HBx-K3-pTac。含MfeI及EcoRI切割位之mCD28conv及hCD28conv片段均以基因合成製備。
運用MfeI及EcoRI切割位，將mCD28conv及hCD28conv片段分別插入RAP1-△HBx-K3-pTac質體之EcoRI點位，即分別生成構建RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3-pTac及RAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3-pTac。
2. RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3包含RAP1、CD28conv、PEt、△HBx等組成。表1係製備本發明融合蛋白所使用之不同組成序列。
3. 生產融合蛋白：簡言之，含目標質體之大腸桿菌BL21細胞自主要細胞庫取出後解凍，以培養基稀釋100倍，在30℃、250rpm震動下培養15小時。之後BL21細胞放入含培養基之醱酵槽中，稀釋至OD600=0.5後，繼續在37℃、pH 7.0、40%溶 氧下培養4小時，並予70%葡萄糖溶液。OD600達20時，加入0.2M異丙基-â-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使誘發蛋白質表現，持續4小時，該經誘發之大腸桿菌於4℃、7000rpm下離心15分鐘，收集沉澱細胞後儲存於-80℃。
為取得融合蛋白，將沉澱細胞再度懸浮後，以超音波打破細胞，於4℃、9500rpm下離心15分鐘，使內涵體(inclusion bodies)分離、沉澱。內涵體經沖洗數次後，加入含8M尿素及10mM DTT之緩衝液，於4℃下隔夜放置，使內涵體中的重組蛋白溶解(solubilize)。將含溶解蛋白之緩衝液於4℃、9500rpm下離心2分鐘，上清液以0.2μm濾網過濾後，收集濾液。濾液以離子交換層析法純化，其中以DEAE瓊脂糖(DEAE sepharose)作為固相，且沖提緩衝液含8M尿素、1mM DTT、30-200mM氯化鈉(pH 8.8)。
離子交換層析純化後之沖出物予以收集，繼而藉由透析(使用不含尿素之8倍體積緩衝液，pH 5.0)來去除尿素，使重組蛋白復性(重新摺疊)。液體於4℃、9500rpm下離心15分鐘，形成一上清液及一沉澱(沉澱物)，收集上清液即取得一可溶之目標融合蛋白。
△HBx融合蛋白比較療效資料及確認：
內涵體重組蛋白製程之習知技術使用尿素破壞蛋白質氫鍵，再將變性之重組蛋白復性。復性期間存在不當序列時，可能促使融合蛋白RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3發生不正確之摺疊，進而導致不可逆之凝集與沉澱。以重組DNA技術刪除HBx第21~50號位的胺基酸區域後，發現融合蛋白RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3可解決蛋白質重新摺疊時易發生凝集和沉澱的問題，進而改善最終蛋白回收率。
蛋白復性條件以經透析及純化的融合蛋白RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3測試。該測試發現經蛋白質復性後，上清液內可溶性RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3(具HBx第21~50號位的胺基酸缺失)的含量(圖2第5行及第6行)高於RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3(無HBx第21~50號位的胺基酸缺失)(圖2第1行及第2行)。
以影像軟體定量40kDa之蛋白質色帶(圖2第1行至第8行)。經重新摺疊後，上清液內RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3之比例[計算方法為：第 1行/(第1行+第3行)]計算值大約為2.31%。經重新摺疊後，上清液內RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3之比例[計算方法為：第5行/(第5行+第7行)]計算值大約為12.93%。代表去除HBx第21~50號位胺基酸可於重新摺疊過程中減少凝集與沉澱，並使重新摺疊後的回收率提升超過10%。
圖2係顯示RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3之蛋白質摺疊比較。蛋白質重新摺疊係於同一蛋白濃度及透析條件下進行。經蛋白質重新摺疊後，上清液及沉澱分別經有或無一還原劑(DTT)之處理，並以十二烷基硫酸酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。M：蛋白階梯標記；第1行：RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3重新摺疊後，以還原劑處理之上清液；第2行：RAP1-mCD28conv-PEt-HBx1-154-K3重新摺疊後，未以還原劑處理之上清液；第3行：RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3重新摺疊後，以還原劑處理之沉澱物；第4行：RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3重新摺疊後，未以還原劑處理之沉澱物。第5行：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3重新摺疊後，以還原劑處理之上清液。第6行：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3重新摺疊後，未以還原劑處理之上清液。第7行：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3重新摺疊後，以還原劑處理之沉澱物。第8行：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3重新摺疊後，未以還原劑處理之沉澱物。
表2係顯示RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3蛋白質重新摺疊後，電泳影像蛋白質色帶之定量分析結果。
此外，也對RAP1-hCD28convPEt-HBx1-154-K3及RAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3進行蛋白質重新摺疊之比較。與RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3類似，RAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3的重新摺疊後回收率比RAP1-hCD28convPEt-HBx1-154-K3高出10%(數據未顯示)。上述結果確認去除HBx第21~50號位胺基酸可減少目標蛋白質之凝集，並改善回收率。
△HBx融合蛋白作為一疫苗之效果：
(1)疫苗免疫原性試驗：
使用時間安排、方法及動物類別：
C57BL/6雌性小鼠(4~5週齡)每週經皮下注射接種一次、共三次(第0天、第7天、第14天)。血液試樣於第0天、第7天、第14天、第21天採集，並以ELISA分析血清抗HBx抗體。小鼠予犧牲後收集脾臟。脾臟內免疫細胞以二HBx專一性肽資料庫(HBx小型混合肽-1、HBx小型混合肽-2)予刺激，後以ELISpot分析Th1專一性免疫細胞數量及細胞激素分泌。
圖3係顯示C57BL/6小鼠接種三劑疫苗，以及收集血液及脾臟試樣之時間。動物分為兩組，每組5隻小鼠。對照組施予PBS緩衝液，疫苗組施予RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3+CpG ODN1826。表3係各組施予劑量及動物隻數。
結果：
C57BL/6小鼠係接種RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3+CpG ODN1826。第0天、第7天、第14天、第21天收集之血清試樣均以ELISA分析HBx專一性抗體(圖4)。疫苗組之第7天及第14天血清HBx專一性抗體濃度無顯著變化，第21天出現微幅提升，與對照組相比未達統計顯著水準。結果顯示接種三次 RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3+CpG ODN1826後，未誘發顯著之抗原專一性體液免疫反應。
小鼠於21天後犧牲，以兩種不同之混合HBx專一性短肽(HBx小型混合肽-1、HBx小型混合肽-2)刺激小鼠之脾臟免疫細胞，後以ELISPOT(ELISpot)分析專一性細胞媒介免疫原性反應。疫苗組中，分泌IL-2(上)、IFNγ(中)及TNFα(下)之小鼠脾臟免疫細胞數量顯著增加(圖5)。相對的，小鼠對照組經兩種不同之HBx專一性肽刺激後，分泌IL-2、IFNγ及TNFα之專一性脾臟免疫細胞數量未增加。
總結以上，圖4與圖5指出同時接種RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3+CpG ODN1826，每週接種一次且經過三次後，儘管無法在經接種之C57BL/6小鼠上誘發HBx專一性體液免疫反應，但其可有效地誘導HBx專一性Th1細胞媒介免疫反應。
(2)疫苗治療效果測試
動物實驗模型：
係以CBA系雄性小鼠(5~6週齡)建立一長期B型肝炎病毒帶原動物之模式(即HBV帶原小鼠)，pAAV/HBV1.2質體及食鹽水(大約等於小鼠體重8%)的一混合物以一快速模式(5~10秒內)在一高壓下注射入(液動注射[hydrodynamic injection,HDI])小鼠尾靜脈，迫使質體穿透細胞膜，進入肝細胞。帶有質體之肝細胞可表現B型肝炎病毒蛋白。病毒可於肝細胞內組合，並自肝細胞釋出。一表面抗原(HBsAg)亦被釋出至血液中。此動物模型模擬一存在慢性B型肝炎症狀之人類病患。
使用時間安排、方法及動物類別：
高壓注射28天後，CBA小鼠接受每週一次、共三次(分別於第0天、第7天、第14天)之皮下注射治療型疫苗進行治療(圖6)。於高壓注射當天、第0天、第7天、第14天、第21天、第32天及第42天測量體重，另收集血液分析丙胺酸轉胺酶(ALT)、膽紅素、病毒DNA及表面抗原(HBsAg)。小鼠於第一次接種82天後犧牲，肝臟核心抗原(HBcAg)量以西方墨點法分析。
小鼠分為三個實驗組：對照組施予PBS緩衝液，佐劑組施予CpG ODN1826，疫苗組則施予RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3+CpG ODN1826。表4列出動物組別、劑量及每一組別之動物隻數。
結果：
疫苗組之體重(圖7)及總膽紅素(圖8)未出現異常變化，對照組與佐劑組無顯著差異，代表HBV帶原小鼠對疫苗耐受性高。疫苗組血清丙胺酸轉胺酶(ALT)略升高，且隨時間出現顯著波動(圖9)。疫苗組中每十隻小鼠有八隻之血清ALT濃度高於正常範圍(40U/L或更低)，但其血清ALT濃度於後續血液抽樣點均回到正常數值。
佐劑組亦出現ALT濃度略升高，波動幅度較小。然而，平均數值不超過正常範圍。對照組血清ALT濃度為正常，且無顯著波動。結果顯示疫苗和佐劑用於HBV帶原小鼠時，其可能誘發專一性免疫反應、清除受感染的肝臟細胞、引起輕度肝臟發炎，並使血清ALT濃度提升、出現波動。
第一次給藥後的第82天犧牲小鼠，測定肝臟、脾臟與體重之比例(分別為圖10上、下)。三組間的肝臟重量比例無差異，顯示佐劑及疫苗對於肝臟無明顯效應。然而，佐劑組之脾臟重量比略高於對照組，疫苗組之脾臟重量比例亦略高於佐劑組。雖然差異未達統計顯著程度，可能代表佐劑及疫苗誘發一免疫反應，而導致脾臟重量比略為提升。
血清試樣內病毒標記(即HBV DNA及HBsAg)變化顯示實驗組間存在顯著差異。截至42天為止，對照組之血清病毒DNA量維持於40,000-120,000copies/ml，陽性率為100%(圖11上及下)，代表已成功建立一HBV帶原CBA小鼠(HBV帶原小鼠)模型。各組陽性率計算方式如下：血清病毒DNA量高於1000copies/ml(偵測限值[Limit of detection,LOD])之動物數量除以動物總數。
佐劑組之血清病毒DNA量於第0天為80,000copies/ml，第7天(第一次給藥7天後)則降至大約15,000copies/ml，陽性率則降至60%(圖11下)。第二次及第三次給藥後，病毒DNA量並無進一步之顯著改善，至第42天均維持穩定。
相對的，疫苗組病毒DNA量平均值於第0天開始時，大約為80,000copies/ml，第7天(第一次給藥7天後)時大幅降低，但陽性率仍達90%(圖十一下)。疫苗組所有小鼠於第14天(第二次給藥7天後)皆未測得病毒DNA，與佐劑組相比達統計顯著差異(圖11上)。截至42天為止，病毒DNA均維持無法測得之程度(圖11下)。
表面抗原及陽性率變化係與血清病毒DNA量呈正相關，至第42天為止，對照組之血清表面抗原(HBsAg)濃度維持穩定，為600-800IU/ml、陽性率亦均為100%(圖12上、下)。各組陽性率計算方式如下：血清表面抗原濃度高於0.05IU/ml之動物隻數除以總動物隻數。
佐劑組之血清表面抗原(HBsAg)平均值於第0天為大約1200IU/ml，第7天(第一次給藥7天後)減至大約500IU/ml，第14天(第二次給藥7天後)減至大約400IU/ml，而第三次給藥後無進一步顯著減少(圖12上)。之後，血清抗原濃度維持同一數值至第42天。佐劑組之表面抗原陽性率於第7天降至90%、第14天降至80%、第32天降至70%，出現緩慢降低之趨勢(圖12下)。
疫苗組之血清表面抗原(HBsAg)平均值於第0天為大約800IU/ml，第14天(第二次給藥7天後)大幅降至大約2IU/ml，第21天、第32天和第42天更進一步降至低於1IU/mL。疫苗組與佐劑組間血清表面抗原濃度存在統計顯著差異，該差異相當穩定，且持續至第42天(圖12上)。疫苗組之表面抗原陽性率於第14天(第二次給藥7天後)大幅降低至30%，第21天和第32天分別更降至20%和10%(圖十二下)。
該等結果顯示施用疫苗RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3+CpG ODN1826可誘發一HBx專一性免疫反應、清除受感染肝臟細胞、抑制小鼠體內病毒複製，且幾停止表面抗原之生產與釋出。疫苗對於HBV帶原小鼠之作用中， 可能部份來自佐劑之抗病毒效果，或是來自疫苗與佐劑的協同作用，其導致增強抗病毒的效果。
以西方墨點法比較各動物組於第一次接種後第82天之肝臟組織核心抗原(HBcAg)表現量。自對照組取得之所有肝臟組織均測得核心抗原表現，其中5隻小鼠之HBcAg表現較高，2隻小鼠(R4、ML4)之表現較低(圖13上)。佐劑組內三隻小鼠(L2、L3、ML3)之核心抗原表現較高、三隻小鼠(R1、R2、L4)為中等，以及四隻小鼠(R3、R5、L1、ML2)為弱(圖13中)。相對的，疫苗組所有肝臟組織之核心抗原表現微弱或無法測得(圖13下)。
西方墨點法結果與免疫組織化學染色結果(數據未顯示)具有一致性，且與血清病毒DNA量以及病毒表面抗原陽性率呈正相關(圖11下及圖12下)。代表在接種後，表現病毒抗原的肝細胞可能已受免疫系統破壞，或病毒抗原表現可能受到抑制。
一抗HBcAg的專一性核心抗體被使用來偵測肝臟組織內的核心抗原(HBcAg)，接著對照組、佐劑組及疫苗組之小鼠肝臟核心抗原(HBcAg)的表現被進行定量與比較(分別為圖13上、中、下)。β-肌動蛋白：內部對照；Nc：陰性對照(空白、CBA小鼠肝臟細胞)；Pc：陽性對照組(HepG2.2.15系細胞)。
其他△HBx融合蛋白
以前文所揭示的類似設計製備以下△HBx融合蛋白：(1)RAP1-CD28convPEt-△HBx；(2)PE1-252-CD28convPEt-△HBx；(3)A2M最小-CD28convPEt-△HBx；(4)HIV-Tat最小-CD28convPEt-△HBx；(5)HSPs最小-CD28convPEt-△HBx；(6)PE1-252-CD28convPEt-△HBx-K3；(7)A2M最小-CD28convPEt-△HBx-K3；(8)HIV-Tat最小-CD28convPEt-△HBx-K3；(9)HSPs最小-CD28convPEt-△HBx-K3。
該等△HBx融合蛋白之免疫原性測試中，其實驗設計、給藥及取樣時間安排與前文、圖3及圖6類似。可預期這些融合蛋白可經由其本身APC結合域或CD91受體結合域進入抗原呈現細胞(APCs)。抗原△HBx之抗原決定位將被呈現於APCs之細胞膜表面，進而誘導B型肝炎病毒X蛋白(HBx)專一性T細胞反應。因此，這些融合蛋白也可有效抑制B型肝炎病毒於肝臟細胞中 增生及/或抑制HBV病患之B型肝炎病毒感染。本發明融合蛋白之作用機制與美國專利9,481,714號所揭示融合蛋白相同。
本發明示例性實施方法之說明僅供示意及說明用途，不盡述或限定於所揭示之精確型態。鑑於以上說明，可能存在多個變更及變異。
本發明技術領域中具通常知識者將可明確得知其替代實施方式，且不影響其精神及範疇。據此，本發明之範疇如下述之請求項，而非前文之說明及其中所述示例性實施方式。部分參考文獻得包括專利、專利申請案及各種著作，均於本發明之說明引用、討論之。本發明說明書引用及討論之所有參考文獻均係完整引用作為參考，如同每一參考文獻個別作為參考。
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<400> 3
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 104
<212> PRT
<213> 人類
<400> 5
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人類
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 人類免疫不全病毒
<400> 7
<210> 8
<211> 641
<212> PRT
<213> 人類
<400> 8
<210> 9
<211> 252
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<400> 9
<210> 10
<211> 613
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<400> 10
<210> 11
<211> 323
<212> PRT
<213> 人類
<400> 11
<210> 12
<211> 357
<212> PRT
<213> 人類
<400> 12
<210> 13
<211> 101
<212> PRT
<213> 人類免疫不全病毒
<400> 13
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內質網滯留序列
<400> 14
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<400> 15
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內質網滯留序列
<400> 16
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內質網滯留序列
<400> 17
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內質網滯留序列
<400> 18
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內質網滯留序列
<400> 19
<210> 20
<211> 46
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<400> 20
<210> 21
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mCD28convPEt
<400> 21
<210> 22
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD28convPEt
<400> 22
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B型肝炎病毒X蛋白缺失突變
<400> 23
<210> 24
<211> 154
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 24
<210> 25
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAP1-mCD28convPEt-缺失突變HBx-K3
<400> 25
<210> 26
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAP1-hCD28convPEt-缺失突變HBx-K3
<400> 26
<210> 27
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28convPEt
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<400> 27
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28一致序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<400> 28
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28關鍵區域
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可能是任何自然產生的胺基酸
<400> 29
<210> 30
<211> 61
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<400> 30
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV1-F'-EcoRI
<400> 31
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV20.51-S
<400> 32
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV20.51-A
<400> 33
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV154-R'-XhoI
<400> 34

Claims (15)

  1. 一種融合蛋白，其包含：(a)一抗原呈現細胞(APC)結合域或一CD91受體結合域，係位於該融合蛋白之N端；(b)一蛋白轉導域，係位於該APC結合域或CD91受體結合域之C端，其中該蛋白轉導域為一融合多肽，其包含：(1)一T細胞致敏信號轉導肽，在長度上由28-53個胺基酸殘基所組成，且包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，其中Xaa8為I或L，Xaa10為V、F或A，Xaa11為M或L，Xaa17為L或I，位於該融合多肽之N端；(2)一轉位肽，在長度上由34-112個胺基酸殘基所組成，且包含一與SEQ ID NO：3、4、20或30至少90%相同之胺基酸序列；以及(3)一連接子，其連接該T細胞致敏信號轉導肽及該轉位肽；以及(c)一抗原，其包含一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變體(△HBx)，其缺乏X蛋白的至少第21-50號位的胺基酸殘基，該抗原位於該蛋白轉導域之C端。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該APC結合域或CD91受體結合域包含一胺基酸序列，其與選自SEQ ID NO：5、9、6、7及8所構成之群組的序列具有至少90%相同。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其進一步包含一位於該融合蛋白之C端的內質網滯留序列。
  4. 如請求項1之融合蛋白，其中若該抗原含有10個或10個以上抗原決定位，則該融合蛋白在C端不包含一內質網滯留序列。
  5. 如請求項1之融合蛋白，其中該蛋白轉導域包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之融合蛋白，其中該APC結合域或CD91受體結合域包含一選自由SEQ ID NO：5、9、6、7及8所構成之群組的胺基酸序列。
  7. 如請求項1之融合蛋白，其中該T細胞致敏信號轉導肽包含一選自SEQ ID NO：1及2所構成之群組的胺基酸序列。
  8. 如請求項1之融合蛋白，其中該轉位肽包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之融合蛋白，其中該抗原包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
  10. 如請求項1之融合蛋白，其中該缺失突變體△HBx具有第1-50號位、第5-50號位、第10-50號位、第15-50號位，或第18-50號位的胺基酸缺失。
  11. 一種疫苗組成物，包含：(a)一具有治療有效劑量的如請求項1的融合蛋白，以及(b)一佐劑。
  12. 如請求項11之疫苗組成物，其中該佐劑包含CpG去氧寡核苷酸。
  13. 一種如請求項1的融合蛋白供用於製備一醫藥品的用途，該醫藥品供用於誘發一B型肝炎病毒X蛋白(HBx)專一性T細胞反應、治療B型肝炎病毒感染、將B型肝炎病毒感染症狀降至最低程度、抑制B型肝炎病毒於肝臟細胞內增生，及/或抑制一需治療個體之B型肝炎病毒感染。
  14. 一種用於製備一B型肝炎病毒X蛋白缺失突變融合蛋白之方法，其包含：(a)產生一質體，其用於表現如請求項1的融合蛋白；(b)使該質體於一宿主細胞內表現該融合蛋白；以及(c)自該宿主細胞收集該融合蛋白。
  15. 如請求項1至10中任一項之融合蛋白，其中該蛋白轉導域包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
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