本案揭示內容提供抗體藥劑及與其相關的各種組成物及方法，包括例如多肽、核酸、細胞及各種方法學等。本發明之抗原結合蛋白以高親和力結合於TIM-3且有效中和TIM-3活性。明確提供免疫球蛋白重鏈多肽(SEQ ID NO:1及5)及免疫球蛋白輕鏈多肽(SEQ ID NO:2及6)序列。在一些具體例中，分離免疫球蛋白重鏈多肽及/或免疫球蛋白輕鏈多肽。如本文所用，術語「免疫球蛋白」或「抗體」係指脊椎動物之血液或其他體液中發現的蛋白質，其供免疫系統用於鑑定及中和外來物體，諸如細菌及病毒。完整的免疫球蛋白通常由四個多肽組成：重(H)鏈多肽之兩個一致複本及輕(L)鏈多肽之兩個一致複本。各重鏈含有一個N端可變(V
H
)區及三個C端恆定（C
H
1、C
H
2及C
H
3）區，且各輕鏈含有一個N端可變(V
L
)區及一個C端恆定(C
L
)區。免疫球蛋白輕鏈可基於其恆定結構域之胺基酸序列分為兩種不同類型之一，κ(k)或λ(l)。在典型的免疫球蛋白中，各輕鏈藉由二硫鍵與重鏈連接，且兩個重鏈藉由二硫鍵彼此連接。輕鏈可變區與重鏈可變區對齊，且輕鏈恆定區與重鏈之第一恆定區對齊。重鏈之其餘恆定區彼此對齊。 每對輕鏈及重鏈之可變區形成抗體之抗原結合位點。V
H
及V
L
區具有相同的通用結構，各區包含由三個互補決定區(CDR)連接之四個構架(FW或FR)區。如本文所用，術語「構架區」係指位於高變區或互補決定區(CDR)之間的可變區內相對保守的胺基酸序列。在典型的免疫球蛋白中，各可變結構域中存在四個構架區，其命名為FR1、FR2、FR3及FR4。構架區形成提供可變區之結構性構架的β摺疊(參見例如C.A. Janeway等人(編),
Immunobiology,
第5版., Garland Publishing, New York, NY (2001))。 在典型的免疫球蛋白中，各可變結構域中存在三個互補決定區(CDR)，其命名為CDR1、CDR2及CDR3。CDR形成抗體之「高變區」，其負責抗原結合。CDR形成環連接，且在一些情況下，包含由構架區形成之β-摺疊結構的一部分。雖然輕鏈及重鏈之恆定區不直接參與抗體與抗原之結合，但恆定區可影響可變區之方向。恆定區亦展現各種效應功能，諸如經由與效應分子及細胞之相互作用參與抗體依賴性補體介導之溶解或抗體依賴性細胞毒性。 本案揭示內容至少部分提供結合於T細胞免疫球蛋白及黏蛋白3(TIM-3)之特定抗體藥劑。在一些具體例中，TIM-3結合抗體藥劑包含免疫球蛋白重鏈多肽及/或免疫球蛋白輕鏈多肽。TIM-3為由三個結構域構成之60 kDa 1型跨膜蛋白：N端Ig可變(IgV)樣結構域、中心富含Ser/Thr之黏蛋白結構域及具有短細胞內尾之跨膜結構域(參見例如Kane, L.P.,
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(6): 2743-2749 (2010))。TIM-3最初在終末分化之Th1細胞上被鑑定，且藉由誘導T細胞凋亡負調節T細胞反應(參見例如Hastings等人，
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(9): 2492-2501 (2009))。TIM-3亦在活化的Th17及Tc1細胞上表現，且CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上Tim-3表現之調節異常與數種自體免疫疾病、病毒感染及癌症相關聯(參見例如Liberal等人,
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: 449 (2013))。 結合於TIM-3之某些其他抗體及其組分為此項技術中已知的(參見例如美國專利8,101,176；美國專利8,552,156；及美國專利8,841,418)。某些抗TIM-3抗體亦可自諸如Abcam (Cambridge, MA)及R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)之來源購得。 在一些具體例中，所提供之重鏈、輕鏈及/或抗體藥劑經糖基化且一或多個位點。如本文所用，「聚糖」為糖蛋白之糖聚合物(部分)組分。術語「聚糖」涵蓋游離聚糖，包括已自糖蛋白裂解或以其他方式釋放之聚糖。在一些具體例中，聚糖經N-連接至Fc區。在一些具體例中，抗體藥劑在Asn297處(Kabat編號)經糖基化。 在一些具體例中，本發明提供一種組成物，其包含如本文所述之重鏈、輕鏈及/或抗體藥劑的一或多個糖型。術語「糖型」在本文中用以指糖蛋白之特定形式。亦即，當糖蛋白包括具有與不同聚糖或聚糖組連接之潛力的特定多肽時，則糖蛋白之各不同形式(亦即當多肽與特定聚糖或聚糖組連接時)稱為「糖型」。在一些具體例中，所提供之組成物包含如本文所述之重鏈、輕鏈及/或抗體藥劑中之一或多者的複數個糖型。在一些具體例中，所提供之組成物包含複數個以特定絕對及/或相對量存在之此類糖型。在一些具體例中，本揭示案提供可實質上不含如本文所述之重鏈、輕鏈及/或抗體藥劑之一或多個特定糖型的組成物。 在一些具體例中，糖型之量以「百分比」形式表示。對於任何給定參數，「百分比」係指相對於製劑之聚糖總莫耳數的特定聚糖(聚糖X)莫耳數。在一些具體例中，「百分比」係指相對於偵測到之PNGase F釋放之Fc聚糖總莫耳數的PNGase F釋放之Fc聚糖X的莫耳數。 在一些具體例中，所提供之重鏈、輕鏈及/或抗體藥劑具有包括一或多個二硫鍵之結構。在一些具體例中，一或多個二硫鍵為或包括在IgG4免疫球蛋白之預期位置處的二硫鍵。在一些具體例中，二硫鍵存在於對應於選自SEQ ID NO:1之殘基22、96、127、140、196、219、222、254、314、360及418之位置的一或多個殘基處 。在一些具體例中，二硫鍵存在於對應於選自SEQ ID NO:2之殘基23、88、134、194及214之位置的一或多個殘基處。 在一些具體例中，經分離之免疫球蛋白重鏈多肽包含與SEQ ID NO:1或5至少90%一致(例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)的胺基酸序列。 在一些具體例中，經分離之免疫球蛋白輕鏈多肽包含與SEQ ID NO:2或6至少90%一致(例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)的胺基酸序列。 如本文所述，核酸或胺基酸序列「一致性」可藉由將所關注之核酸或胺基酸序列與參考核酸或胺基酸序列進行比較來確定。百分比一致性為所關注之序列與參考序列之間相同(亦即一致)的核苷酸或胺基酸殘基之數目除以最長序列之長度(亦即所關注之序列或參考序列之長度，以較長者為準)。用於獲得兩個或更多個序列之間的最佳比對及計算一致性的許多數學算法為已知的且併入至許多可用的軟體程式中。此類程式之實例包括CLUSTAL-W、T-Coffee及ALIGN (用於核酸及胺基酸序列之比對)、BLAST程式(例如BLAST 2.1、BL2SEQ及其更新版本)及FASTA程式(例如FASTA3x、FASTM及SSEARCH) (用於序列比對及序列相似性搜尋)。序列比對算法亦揭示於例如Altschul等人，
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2
。 「半保守突變」包括上文所列之相同群內、但不在相同子群內之胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，天冬胺酸取代天冬醯胺或天冬醯胺取代離胺酸涉及相同群、但不同子群內之胺基酸。「非保守突變」涉及不同群之間的胺基酸取代，例如離胺酸取代色胺酸或苯丙胺酸取代絲胺酸等。 本揭示案至少部分提供經分離之抗TIM-3抗體藥劑，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：本文所述之本發明經分離之胺基酸序列。如本文所用，術語「經分離」(或「經純化」)係指核酸序列(例如聚核苷酸)或胺基酸序列(例如多肽)自其天然環境中存在之其他組分移除或分離。舉例而言，經分離之多肽為與產生該多肽之細胞的其他組分(例如內質網或細胞質蛋白質及RNA)分離之多肽。經分離之聚核苷酸為與其他細胞核組分(例如組蛋白)及/或與上游或下游核酸序列分離之聚核苷酸。經分離之核酸序列或胺基酸序列可至少60%不含、或至少75%不含、或至少90%不含、或至少95%不含指定核酸序列或胺基酸序列之天然環境中存在之其他組分。 「抗TIM-3抗體藥劑」意指特異性結合於TIM-3蛋白質之分子、較佳蛋白質分子。在一些具體例中，經分離之抗TIM-3抗體藥劑包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：免疫球蛋白重鏈多肽(例如SEQ ID NO:1)及/或免疫球蛋白輕鏈多肽(例如SEQ ID NO:2)。在一些具體例中，經分離之抗TIM-3抗體藥劑包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：序列包含SEQ ID NO:1之免疫球蛋白重鏈多肽及序列包含SEQ ID NO:2之免疫球蛋白輕鏈多肽。 在一些具體例中，所提供之重鏈多肽基本上由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5之胺基酸序列組成，且可另外包含不實質上影響多肽、例如藉由影響本發明重鏈多肽對TIM-3之親和力之額外組分。此類組分之實例包括例如有助於純化或分離之蛋白質部分(諸如生物素)、乘客突變、不含包括游離半胱胺酸之問題位點、額外糖基化位點及高可能性脫醯胺或異構化位點的序列。 在一些具體例中，所提供之免疫球蛋白重鏈多肽由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5之胺基酸序列組成，且不包含任何額外組分(亦即對於本發明免疫球蛋白重鏈多肽並非內源性之組分)。 在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑包括免疫球蛋白重鏈多肽及/或免疫球蛋白輕鏈多肽中之一或多個胺基酸經不同胺基酸殘基以任何組合置換或可缺失或插入之變體，只要抗TIM-3抗體藥劑之生物活性並未由於胺基酸置換、插入及/或缺失而實質上降低(例如增強或改良)即可。TIM-3結合劑之「生物活性」係指例如對特定TIM-3抗原決定基之結合親和力、中和或抑制TIM-3結合於其受體、中和或抑制
活體內
TIM-3活性(例如IC
50
)、藥代動力學及交叉反應(例如與TIM-3蛋白質之非人類同源物或直系同源物，或與其他蛋白質或組織)。此項技術中公認之抗原結合劑的其他生物特性或特徵包括例如親合力、選擇性、溶解性、摺疊、免疫毒性、表現及調配。前述特性或特徵可使用標準技術觀察、量測及/或評定，包括但不限於ELISA、競爭性ELISA、表面電漿子共振分析(BIACORE™)或動力學排阻分析(ΚIΝΕΧΑ™)、活體外或活體內中和分析、受體-配體結合分析、細胞因子或生長因子產生及/或分泌分析以及信號轉導及免疫組織化學分析。 如本文所用，關於抗TIM-3抗體藥劑活性之術語「抑制」或「中和」係指實質上拮抗、阻止、預防、限制、減緩、破壞、改變、消除、停止或逆轉例如TIM-3之生物活性或與TIM-3相關聯之疾病或病況的進展或嚴重程度的能力。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑抑制或中和TIM-3之活性至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約100%或由任何兩個前述值界定之範圍(例如20%至100%、40%至100%或60%至95%等)。 在一些具體例中，TIM-3結合劑為完整抗體。在一些具體例中，抗體或抗體片段包含基於野生型IgG1、IgG2或IgG4抗體或其變體之重鏈恆定區。應瞭解，各抗體類別或同型一旦識別出抗原，就參與一組獨特的效應機制用於處置或中和抗原。因此，在一些具體例中，當抗TIM-3抗體藥劑為抗體時，其可展現一或多種效應功能，諸如經由與效應分子及細胞之相互作用(例如補體系統之活化)參與抗體依賴性補體介導之溶解或抗體依賴性細胞毒性。 在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑包含IgG4重鏈恆定區。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑包含IgG重鏈區內之一或多個突變。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑包含在重鏈恆定區中具有一或多個突變之IgG4重鏈恆定區。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑包含在鉸鏈區中具有一或多個突變之IgG4重鏈恆定區。據設想，在一些具體例中，IgG4鉸鏈區中之突變可防止與其他IgG4分子之半分子交換。在一些具體例中，IgG4之鉸鏈區中之一或多個突變可包括防止與其他IgG4分子之半分子交換的S228P突變或絲胺酸至脯胺酸穩定突變。參見例如J. Biol. Chem. 2015; 290(9):5462-5469。 抗TIM-3抗體藥劑亦可為抗體結合物。在此方面，抗TIM-3抗體藥劑可為(1)抗TIM-3抗體與(2)蛋白質或非蛋白質部分之結合物。舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑可為與肽、螢光分子或化學治療劑結合之抗體。 抗TIM-3抗體藥劑可為或可獲自人類抗體、非人類抗體或嵌合抗體。「嵌合」意指包含人類區及非人類區之抗體或其片段。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑為人源化抗體。「人源化」抗體為包含人類抗體骨架及獲自或源於非人類抗體之至少一個CDR的單株抗體。非人類抗體包括自任何非人類動物、諸如嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)分離之抗體。人源化抗體可包含獲自或源於非人類抗體之一個、兩個或三個CDR。在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑之CDRH3獲自或源於小鼠單株抗體，而抗TIM-3抗體藥劑之其餘可變區及恆定區獲自或源於人類單株抗體。 人類抗體、非人類抗體、嵌合抗體或人源化抗體可藉由任何方式獲得，包括經由活體外來源(例如重組產生抗體之融合瘤或細胞株)及活體內來源(例如嚙齒動物)。用於生成抗體之方法為此項技術中已知的且描述於例如Köhler及Milstein,
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第5版，Garland Publishing, New York, NY (2001))中。在某些具體例中，人類抗體或嵌合抗體可使用一或多個內源免疫球蛋白基因經一或多個人類免疫球蛋白基因置換之轉殖基因動物(例如小鼠)產生。內源抗體基因經人類抗體基因有效置換之轉殖基因小鼠之實例包括但不限於Medarex HUMAB-MOUSE™、Kirin TC MOUSE™及Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (參見例如Lonberg,
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: 69-97 (2008))。人源化抗體可使用此項技術中已知的任何適合之方法產生(參見例如An, Z. (編),
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(1): 115-120 (2008))。在一些具體例中，人源化抗體可使用例如美國專利申請公開案2011/0287485 A1中所述之方法產生。 在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑結合TIM-3之抗原決定基，阻斷TIM-3與其推定配體(例如磷脂醯絲胺酸、半乳糖凝集素-9、高遷移率族蛋白1 (HMGB1)及癌胚抗原細胞黏附分子1 (CEACAM1))中之任一者的結合且抑制TIM-3介導之信號傳導。本案揭示內容亦提供一種經分離或純化之TIM-3的抗原決定基，其阻斷TIM-3以間接或異位方式與其推定配體中之任一者結合。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑結合TIM-3之抗原決定基，阻斷TIM-3與其推定配體中之一者、兩者或更多者的結合。 本案揭示內容亦提供一或多種經分離或純化之核酸序列，其編碼本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽及/或抗TIM-3抗體藥劑。 術語「核酸序列」意欲涵蓋DNA或RNA之聚合物，亦即聚核苷酸，其可為單股或雙股的且可含有非天然或改變的核苷酸。如本文所用，術語「核酸」及「聚核苷酸」係指任何長度之核苷酸核糖核苷酸(RNA)或去氧核糖核苷酸(DNA)的聚合形式。此等術語係指分子之一級結構，且因此包括雙股及單股DNA以及雙股及單股RNA。該等術語包括由核苷酸類似物及經修飾之聚核苷酸(諸如但不限於甲基化及/或封端聚核苷酸)製成的RNA或DNA類似物作為等效物。儘管此項技術中已知許多其他鍵(例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯及其類似物)，但核酸通常經由磷酸酯鍵連接以形成核酸序列或聚核苷酸。 本案揭示內容另外提供一種載體，其包含編碼本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽及/或本發明TIM-3結合劑之一或多種核酸序列。載體可為例如質體、游離基因體、黏接質體、病毒載體(例如反轉錄病毒或腺病毒)或噬菌體。適合之載體及載體製備方法為此項技術中所熟知(參見例如Sambrook等人，
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, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994))。 除編碼本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽及/或本發明TIM-3結合劑之核酸序列之外，載體可包含為了在宿主細胞中表現編碼序列所提供之表現控制序列，諸如啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號、轉錄終止子、信號肽(例如骨結合素信號肽)、內部核糖體進入位點(IRES)及其類似物。例示性表現控制序列為此項技術中已知的且描述於例如Goeddel,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
，第 185卷，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中。 包括來自各種不同來源之組成型、誘導型及可抑制型啟動子的大量啟動子為此項技術中所熟知。啟動子之代表性來源包括例如病毒、哺乳動物、昆蟲、植物、酵母及細菌，且來自此等來源之適合啟動子容易獲得，或可基於例如來自諸如ATCC之保藏處以及其他商業或個人來源之公共可獲得之序列以合成方式製得。啟動子可為單向(亦即在一個方向上啟動轉錄)或雙向(亦即以3'或5'方向啟動轉錄)。啟動子之非限制性實例包括例如T7細菌表現系統、pBAD (araA)細菌表現系統、細胞巨大病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子。誘導型啟動子包括例如Tet系統(美國專利5,464,758及5,814,618)、蛻皮激素誘導型系統(No等人，
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,
11
: 1735-1742 (2004))。代表性市售游離型表現載體包括但不限於利用埃-巴二氏核抗原1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1，EBNA1)及埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus，EBV)複製起點(oriP)之游離型質體。來自Invitrogen (Carlsbad, CA)之載體pREP4、pCEP4、pREP7及pcDNA3.1以及來自Stratagene (La Jolla, CA)之pBK-CMV代表使用T抗原及SV40複製起點代替EBNA1及oriP之游離型載體的非限制性實例。 其他適合之載體包括整合表現載體，其可隨機整合至宿主細胞之DNA中，或可包括重組位點以使表現載體與宿主細胞之染色體之間發生特異性重組。此類整合表現載體可利用宿主細胞染色體之內源表現控制序列來實現所需蛋白質之表現。以位點特異性方式整合之載體的實例包括例如來自Invitrogen (Carlsbad, CA)之flp-in系統的組分(例如pcDNA™5/FRT)或cre-lox系統，諸如可在來自Stratagene (La Jolla, CA)之pExchange-6核心載體中發現。隨機整合至宿主細胞染色體中之載體的實例包括例如來自Life Technologies (Carlsbad, CA)之pcDNA3.1 (當在T抗原不存在下引入時)、來自Millipore (Billerica, MA)之UCOE及來自Promega (Madison, WI)之pCI或pFN10A (ACT) FLEXI™。 亦可使用病毒載體。代表性市售病毒表現載體包括但不限於可購自Crucell, Inc. (Leiden，荷蘭)之基於腺病毒之Per.C6系統、來自Invitrogen (Carlsbad, CA)之基於慢病毒之pLP1及來自Stratagene (La Jolla, CA)之反轉錄病毒載體pFB-ERV加pCFB-EGSH。 編碼本發明胺基酸序列之核酸序列可在相同載體(亦即
順式
)上提供給細胞。單向啟動子可用於控制各核酸序列之表現。在一些具體例中，雙向及單向啟動子之組合可用於控制多個核酸序列之表現。編碼本發明胺基酸序列之核酸序列或者可在單獨載體(亦即
反式
)上提供給細胞群。各單獨載體中之各核酸序列可包含相同或不同的表現控制序列。單獨載體可同時或依序提供給細胞。 包含編碼本發明胺基酸序列之核酸的載體可引入至能夠表現由其編碼之多肽的宿主細胞中，包括任何適合之原核或真核細胞。因此，本揭示案提供一種包含本發明載體之經分離之細胞。宿主細胞包括可容易且可靠地生長、具有合理的快速生長速率、具有良好表徵之表現系統且可容易且有效地轉型或轉染之細胞。 適合之原核細胞的實例包括但不限於來自芽孢桿菌屬(
Bacillus
) (諸如枯草芽孢桿菌(
Bacillus subtilis
)及短芽孢桿菌(
Bacillus brevis
))、埃希氏菌屬(
Escherichia
) (諸如大腸桿菌)、假單胞菌屬(
Pseudomonas
)、鏈黴菌屬(
Streptomyces
)、沙門氏菌屬(
Salmonella
)及伊文氏桿菌屬(
Erwinia
)之細胞。有用的原核細胞包括例如各種大腸桿菌菌株(例如K12、HB101 (ATCC第33694號)、DH5α、DH10、MC1061 (ATCC第53338號)及CC102)。 在一些具體例中，本發明載體引入至真核細胞中。適合之真核細胞為此項技術中已知的且包括例如酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。適合之酵母細胞的實例包括來自克魯維酵母屬(
Kluyveromyces
)、畢赤酵母屬(
Pichia
)、鼻孢子蟲屬(
Rhino
-
sporidium
)、酵母屬(
Saccharomyces
)及裂殖酵母屬(
Schizosaccharomyces
)之彼等酵母細胞。酵母細胞包括例如釀酒酵母(
Saccharomyces cerivisae
)及畢赤酵母(
Pichia pastoris
)。 適合之昆蟲細胞描述於例如Kitts等人，
Biotechniques
,
14
: 810-817 (1993)；Lucklow,
Curr. Opin. Biotechnol., 4
: 564-572 (1993)；及Lucklow等人，
J. Virol.
,
67
: 4566-4579 (1993)中。昆蟲細胞包括例如Sf-9及HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。 在一些具體例中，利用哺乳動物細胞。許多適合之哺乳動物宿主細胞為此項技術中已知的，且許多可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC, Manassas, VA)獲得。適合之哺乳動物細胞的實例包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞(CHO) (ATCC第CCL61號)、CHO DHFR細胞(Urlaub等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,
97
: 4216-4220 (1980))、人胚腎(HEK) 293或293T細胞(ATCC第CRL1573號)及3T3細胞(ATCC第CCL92號)。其他適合之哺乳動物細胞株為猴COS-1 (ATCC第CRL1650號)及COS-7細胞株(ATCC第CRL1651號)以及CV-1細胞株(ATCC第CCL70號)。其他例示性哺乳動物宿主細胞包括靈長類細胞株及嚙齒動物細胞株，包括經轉型之細胞株。正常的二倍體細胞、源於原代組織之活體外培養物的細胞品系以及原代外植體亦為適合的。其他適合之哺乳動物細胞株包括但不限於小鼠神經母細胞瘤N2A細胞、HeLa、小鼠L-929細胞及BHK或HaK倉鼠細胞株，其均可自ATCC獲得。用於選擇適合之哺乳動物宿主細胞的方法及用於細胞之轉型、培養、擴增、篩選及純化的方法為此項技術中已知的。 在一些具體例中，哺乳動物細胞為人類細胞。舉例而言，哺乳動物細胞可為人類淋巴細胞株或源於淋巴之細胞株，諸如前B淋巴細胞來源之細胞株。人類淋巴細胞株之實例包括但不限於RAMOS (CRL-1596)、Daudi (CCL-213)、EB-3 (CCL-85)、DT40 (CRL-2111)、18-81 (Jack等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,
85
: 1581-1585 (1988))、Raji細胞(CCL-86)、PER.C6細胞(Crucell Holland B.V., Leiden，荷蘭)及其衍生物。 編碼本發明胺基酸序列之核酸序列可藉由「轉染」、「轉型」或「轉導」引入至細胞中。如本文所用，「轉染」、「轉型」或「轉導」係指藉由使用物理或化學方法將一或多種外源聚核苷酸引入至宿主細胞中。許多轉染技術為此項技術中已知的且包括例如磷酸鈣DNA共沈澱(參見例如Murray E.J. (編),
Methods in Molecular Biology
，第7卷，
Gene Transfer and Expression Protocols
, Humana Press (1991))；DEAE-葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質體介導之轉染；鎢粒子促進之微粒轟擊(Johnston,
Nature
,
346
: 776-777 (1990))；及磷酸鍶DNA共沈澱(Brash等人，
Mol. Cell Biol.
,
7
: 2031-2034 (1987))。在感染性顆粒在適合之包裝細胞中生長之後，可將噬菌體或病毒載體引入至宿主細胞中，其中許多為市售的。 本案揭示內容提供一種組成物，其包含有效量之本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽、本發明TIM-3結合劑、編碼前述任一者之本發明核酸序列或包含本發明核酸序列之本發明載體。在一些具體例中，組成物為醫藥學上可接受之(例如生理學上可接受之)組成物，其包含載劑、較佳醫藥學上可接受之(例如生理學上可接受之)載劑及本發明胺基酸序列、抗原結合劑或載體。在本發明之情形內可使用任何適合之載劑，且此類載劑為此項技術中所熟知。載劑之選擇將部分藉由可投與組成物之特定部位及用於投與組成物之特定方法來確定。組成物視情況可為無菌的。組成物可冷凍或凍乾以便儲存且在使用之前在適合之無菌載劑中復原。組成物可根據例如Remington:
The Science and Practice of Pharmacy
，第21版，Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)中所述之習知技術來產生。 TIM-3為免疫反應之負調節劑且因此為療法之靶標(圖1)。因此，本案揭示內容另外提供一種治療哺乳動物之對TIM-3抑制或中和起反應之病症的方法。該方法包含向患有對TIM-3抑制或中和起反應之病症的哺乳動物投與前述組成物，由此治療該哺乳動物之病症。「對TIM-3抑制起反應」或「對TIM-3中和起反應」之病症係指TIM-3水準或活性降低在諸如人類之哺乳動物中具有治療益處或TIM-3之不當表現(例如過度表現)或活性增加引起或造成疾病或病症之病理效應的任何疾病或病症。對TIM-3抑制起反應之病症包括例如癌症、感染性疾病及自體免疫疾病。本發明方法可用於治療此項技術中已知的任何類型的癌症，諸如黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰臟癌、白血病、淋巴瘤或梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma) (參見例如Bhatia等人，
Curr. Oncol. Rep
.,
13
(6): 488-497 (2011))。在一些具體例中，癌症為子宮內膜癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、輸卵管癌、睪丸癌、原發性腹膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、肛門生殖器區鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌、胃癌、膀胱癌、膽囊癌、肝癌、甲狀腺癌、喉癌、唾液腺癌、食道癌、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰臟癌、間皮瘤、梅克爾細胞癌、肉瘤、神經膠母細胞瘤或血液學癌症(例如多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)/原發性縱隔B細胞淋巴瘤或慢性骨髓性白血病)。本發明方法可用於治療任何類型之感染性疾病(亦即由細菌、病毒、真菌或寄生蟲引起之疾病或病症)。可藉由本發明方法治療之感染性疾病的實例包括但不限於由人類免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道融合性病毒(RSV)、流感病毒、登革熱病毒、B型肝炎病毒(HBV或C型肝炎病毒(HCV))引起之疾病。本發明方法可用於治療任何類型之自體免疫疾病(亦即，如由免疫系統過度活動引起之身體攻擊且損害其自身組織的疾病或病症)，諸如MacKay I.R.及Rose N.R.編，
The Autoimmune Diseases
，第五版，Academic Press, Waltham, MA (2014)中所述之彼等自體免疫疾病。可藉由本發明方法治療之自體免疫疾病的實例包括但不限於多發性硬化症、1型糖尿病、類風濕性關節炎、硬皮病、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、牛皮癬、全身性紅斑狼瘡(SLE)及潰瘍性結腸炎。 投與包含本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽、本發明TIM-3結合劑、編碼前述任一者之本發明核酸序列或包含本發明核酸序列之本發明載體的組成物誘導針對哺乳動物之癌症或感染性疾病的免疫反應。哺乳動物包括例如小鼠、大鼠、兔子、犬、貓、牛、馬、非人類靈長類動物及人類。「免疫反應」可能需要例如抗體產生及/或免疫效應細胞(例如T細胞)之活化。 如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所期望的藥理學及/或生理學效應。在一些具體例中，該效應為治療性的，亦即該效應部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良症狀。為此目的，本發明方法包含投與「治療有效量」之抗TIM-3抗體藥劑。「治療有效量」係指在必需劑量及時間段有效達成所期望之治療結果的量。治療有效量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重之因素及抗TIM-3抗體藥劑在個體中引發所期望之反應的能力而變化。舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑之治療有效量為降低人類之TIM-3生物活性的量。 或者，藥理學及/或生理學效應可為預防性的，亦即該效應完全或部分預防疾病或其症狀。在此方面，本發明方法包含投與「預防有效量」之抗TIM-3抗體藥劑。「預防有效量」係指在必需劑量及時間段有效達成所期望之預防結果(例如預防疾病發作)的量。 典型劑量可為例如在1 pg/kg至20 mg/kg動物或人類體重範圍內；然而，低於或高於此例示性範圍之劑量在本發明之範疇內。每日非經腸劑量可為約0.00001 mg/kg至約20 mg/kg總體重(例如約0.001 mg/kg、約0.1 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約100 mg/kg、約500 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg或由前述值中之任兩者界定的範圍)。在一些具體例中，約0.1 mg/kg至約10 mg/kg總體重(例如約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約50 mg/kg、約150 mg/kg、約300 mg/kg、約750 mg/kg、約1.5 mg/kg、約5 mg/kg或由前述值中之任兩者界定的範圍)。在一些具體例中，約1 mg/kg至5 mg/kg總體重(例如約3 mg/kg、約15 mg/kg、約75 mg/kg、約300 mg/kg、約900 mg/kg、約2 mg/kg、約4 mg/kg或由前述值中之任兩者界定的範圍)。在一些具體例中，每天約0.5至15 mg/kg體重(例如約1 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約6 mg/kg、約9 mg/kg、約11 mg/kg、約13 mg/kg或由前述值中之任兩者界定的範圍)。可藉由定期評定所治療患者來監測治療或預防功效。對於經數天或更長時間之重複投與，視病況而定，可重複治療直至出現所期望之疾病症狀抑制，或者，治療可持續患者之一生。然而，其他給藥方案可為有用的且在本發明之範疇內。所需劑量可藉由單次快速投與組成物、藉由多次快速投與組成物或藉由連續輸注投與組成物來遞送。 包含有效量之本發明免疫球蛋白重鏈多肽、本發明免疫球蛋白輕鏈多肽、本發明TIM-3結合劑、編碼前述任一者之本發明核酸序列或包含本發明核酸序列之本發明載體的組成物可使用標準投與技術投與哺乳動物，包括經口、經眼、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、支氣管、經頰、皮內、皮間、經皮、局部、肌內、鼻內、經頰、舌下、腸內、動脈內、胃內、特定器官內(例如肝內)、經直腸、皮下、舌下、氣管、經陰道、玻璃體、髓內、鞘內、心室內、經黏膜或栓劑投與。在一些具體例中，組成物適於非經腸投與。如本文所用，術語「非經腸」包括靜脈內、肌內、皮下、經直腸、經陰道及腹膜內投與。在一些具體例中，組成物藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射使用外周全身遞送投與哺乳動物。哺乳動物包括例如小鼠、大鼠、兔子、犬、貓、牛、馬、非人類靈長類動物及人類。 一旦投與哺乳動物(例如人類)，抗TIM-3抗體藥劑之生物活性可藉由此項技術中已知的任何適合之方法量測。舉例而言，生物活性可藉由測定特定TIM-3結合劑之穩定性來評定。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑(例如抗體)之
活體內
半衰期在約30分鐘與45天之間(例如約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約10小時、約12小時、約1天、約5天、約10天、約15天、約25天、約35天、約40天、約45天或由前述值中之任兩者界定的範圍)。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑之
活體內
半衰期在約2小時與20天之間(例如約5小時、約10小時、約15小時、約20小時、約2天、約3天、約7天、約12天、約14天、約17天、約19天或由前述值中之任兩者界定的範圍)。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑之
活體內
半衰期在約10天與約40天之間(例如約10天、約13天、約16天、約18天、約20天、約23天、約26天、約29天、約30天、約33天、約37天、約38天、約39天、約40天或由前述值中之任兩者界定的範圍)。 抗TIM-3抗體藥劑之穩定性可使用此項技術中已知的任何其他適合之分析來量測，諸如量測血清半衰期、差示掃描量熱法(DSC)、熱漂移分析及脈衝-追蹤分析。在本發明之情形下可使用之其他量測
活體內
及
活體外
蛋白質穩定性的方法描述於例如
Protein Stability and Folding
, B.A. Shirley (編)，Human Press, Totowa, New Jersey (1995)；
Protein Structure, Stability, and Interactions (Methods in Molecular Biology)
, Shiver J.W. (編)，Humana Press, New York, NY (2010)；及Ignatova,
Microb. Cell Fact., 4
: 23 (2005)中。 抗TIM-3抗體藥劑之穩定性可依據轉變中點值(T
m
)量測，該轉變中點值為50%之胺基酸序列處於其天然構形且另50%變性的溫度。一般而言，T
m
愈高，蛋白質愈穩定。在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑包含約60-100℃之活體外轉變中點值(T
m
)。舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑可包含約65-80℃(例如66℃、68℃、70℃、71℃、75℃或79℃)、約80-90℃(例如約81℃、85℃或89℃)或約90-100℃(例如約91℃、約95℃或約99℃)之活體外T
m
。 特定TIM-3結合抗體藥劑之生物活性亦可藉由測定其對TIM-3或其抗原決定基之結合親和力來評定。術語「親和力」係指兩種藥劑之可逆結合的平衡常數且表示為解離常數(K
D
)。結合劑對配體之親和力，諸如抗體對抗原決定基之親和力可為例如約1皮莫耳(pM)至約100微莫耳(mM) (例如約1皮莫耳(pM)至約1奈莫耳(nM)、約1 nM至約1微莫耳(mM)或約1 mM至約100 mM)。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑可以小於或等於1奈莫耳(例如0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、0.1 nM、0.05 nM、0.025 nM、0.01 nM、0.001 nM或由前述值中之任兩者界定的範圍)之K
D
結合於TIM-3蛋白質。在一些具體例中，抗TIM-3抗體藥劑可以小於或等於200 pM (例如190 pM、175 pM、150 pM、125 pM、110 pM、100 pM、90 pM、80 pM、75 pM、60 pM、50 pM、40 pM、30 pM、25 pM、20 pM、15 pM、10 pM、5 pM、1 pM或由前述值中之任兩者界定的範圍)之K
D
結合於TIM-3。對所關注之抗原或抗原決定基的免疫球蛋白親和力可使用任何此項技術中公認的分析來量測。此類方法包括例如螢光活化細胞分選(FACS)、可分離珠粒(例如磁性珠粒)、表面電漿子共振(SPR)、溶液相競爭(KINEXA™)、抗原淘選、競爭性結合分析及/或ELISA (參見例如Janeway等人(編)，
Immunobiology
，第5版， Garland Publishing, New York, NY, 2001)。 TIM-3結合劑可單獨或與其他藥物組合投與。舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑可與其他藥劑組合投與用於治療或預防本文揭示之疾病，諸如對癌細胞具有細胞毒性、調節癌細胞免疫原性或促進對癌細胞之免疫反應的藥劑。在此方面，舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑可與至少一種其他抗癌劑組合使用，包括例如此項技術中已知的任何化學治療劑、電離輻射、小分子抗癌劑、癌症疫苗、生物療法(例如其他單株抗體、殺癌病毒、基因療法及授受性T細胞轉移)及/或手術。 當本發明方法治療感染性疾病時，抗TIM-3抗體藥劑可與至少一種抗細菌劑或至少一種抗病毒劑組合投與。在此方面，抗細菌劑可為此項技術中已知的任何適合之抗生素。抗病毒劑可為任何特異性靶向特定病毒之任何適合類型的疫苗(例如減毒活疫苗、次單位疫苗、重組載體疫苗及小分子抗病毒療法(例如病毒複製抑制劑及核苷類似物)。當本發明方法治療自體免疫疾病時，抗TIM-3抗體藥劑可與抗炎劑組合使用，包括例如皮質類固醇(例如潑尼松(prednisone)及氟替卡松(fluticasone))及非類固醇抗炎藥(NSAID) (例如阿司匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)及萘普生(naproxen))。 在一些具體例中，當抗TIM-3抗體藥劑用於治療癌症或感染性疾病時，TIM-3結合劑可與抑制免疫檢查點途徑之其他藥劑組合投與。舉例而言，抗TIM-3抗體藥劑可與抑制或拮抗計劃性死亡1蛋白質(PD-1)、淋巴細胞活化基因-3蛋白質(LAG-3)及/或細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (CTLA-4)途徑之藥劑組合投與。同時靶向此等免疫檢查點途徑中之兩者或更多者的組合治療已證明改良且潛在協同的抗腫瘤活性(參見例如Sakuishi等人，
J. Exp. Med
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207
: 2187-2194 (2010)；Ngiow等人，
Cancer Res
.,
71
: 3540-3551 (2011)；及Woo等人，
Cancer Res.
,
72
: 917-927 (2012))。在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑與抑制LAG-3信號傳導之藥劑及/或抑制PD-1信號傳導之藥劑組合投與。在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑投與已投與或將投與抑制LAG-3信號傳導之藥劑的個體，使得個體接受兩者之治療。在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑投與已投與或將投與抑制PD-1信號傳導之藥劑的個體，使得個體接受兩者之治療。在一些具體例中，接受本發明TIM-3藥劑治療之哺乳動物已經或將要接受用抑制PD-1之藥劑及抑制LAG-3之藥劑治療，使得哺乳動物接受全部三者。 在一些具體例中，本發明TIM-3結合劑與結合於LAG-3之抗體及/或結合於PD-1之抗體組合投與。在一些具體例中，抗PD-1抗體為選自由以下組成之群之抗體：BGB-A317、BI 754091、IBI308、INCSHR-1210、JNJ-63723283、JS-001、MEDI-0680、MGA-012、尼沃單抗(nivolumab)、PDR001、派姆單抗(pembrolizumab)、PF-06801591、REGN-2810、TSR-042及其衍生物。在一些具體例中，抑制PD-1之藥劑為抗PD-L1/L2藥劑。在一些具體例中，抗PD-L1/L2藥劑為抗PD-L1抗體。在一些具體例中，抗PD-L1抗體藥劑為阿特珠單抗(atezolizumab)、艾維路單抗(avelumab)、CX-072、德瓦魯單抗(durvalumab)、FAZ053、LY3300054、PD-L1米拉分子(millamolecule)或其衍生物。 在一些具體例中，個體正接受或將接受與TIM-3結合劑組合之一或多種額外療法。在一些具體例中，額外療法為PARP抑制劑。在一些具體例中，PARP抑制劑為ABT-767、AZD 2461、BGB-290、BGP 15、CEP 8983、CEP 9722、DR 2313、E7016、E7449、弗左帕尼(fluzoparib) (SHR 3162)、IMP 4297、INO1001、JPI 289、JPI 547、單株抗體B3-LysPE40結合物、MP 124、尼拉帕尼(niraparib) (ZEJULA) (MK-4827)、NU 1025、NU 1064、NU 1076、NU1085、奧拉帕尼(olaparib) (AZD2281)、ONO2231、PD 128763、R 503、R554、如卡帕瑞(rucaparib) (RUBRACA) (AG-014699、PF-01367338)、SBP 101、SC 101914、斯密帕尼(Simmiparib)、塔拉佐帕瑞(talazoparib) (BMN-673)、維利帕尼(veliparib) (ABT-888)、WW 46、2-(4-(三氟甲基)苯基)-7,8-二氫-5H-硫哌喃并[4,3-d]嘧啶-4-醇及其鹽或衍生物。在一些具體例中，PARP抑制劑為尼拉帕尼、奧拉帕尼、如卡帕瑞、塔拉佐帕瑞及維利帕尼。在一些具體例中，額外療法包括用遞送抑制PD-1之藥劑的組成物治療及用PARP抑制劑治療，使得個體接受全部三者之治療。在一些具體例中，額外療法包括用遞送抑制PD-1之藥劑的組成物治療、用遞送抑制LAG-3之藥劑的組成物治療及用PARP抑制劑治療，使得個體接受全部四者之治療。 在此方面，治療哺乳動物之對TIM-3抑制起反應之病症(例如癌症或感染性疾病)的方法可另外包含向該哺乳動物投與包含(i)結合於TIM-3蛋白質之抗體及(ii)醫藥學上可接受之載劑的組成物或包含(i)結合於PD-1蛋白質之抗體及(ii)醫藥學上可接受之載劑的組成物。哺乳動物包括例如小鼠、大鼠、兔子、犬、貓、牛、馬、非人類靈長類動物及人類。 除治療用途之外，本文所述之抗TIM-3抗體藥劑可用於診斷或研究應用。在此方面，抗TIM-3抗體藥劑可用於診斷病症或疾病之方法中，其中TIM-3之不當表現(例如過度表現)或活性增加引起或造成該疾病或病症之病理效應。以類似方式，抗TIM-3抗體藥劑可用於分析中以監測關於對TIM-3抑制起反應之疾病或病症所測試之個體的TIM-3蛋白質水準。研究應用包括例如利用抗TIM-3抗體藥劑及標記偵測樣品(例如人類體液或細胞或組織提取物)中之TIM-3蛋白質的方法。抗TIM-3抗體藥劑可在存在或不存在修飾(諸如用可偵測部分共價或非共價標記)之情況下使用。舉例而言，可偵測部分可為放射性同位素(例如
3
H、
14
C、
32
P、
35
S或
125
I)、螢光或化學發光化合物(例如螢光異硫氰酸鹽、若丹明(rhodamine)或螢光素)、酶(例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化酶)或輔基。此項技術中已知用於使抗原結合劑(例如抗體)分別結合於可偵測部分之任何方法可用於本發明之情形中(參見例如Hunter等人，
Nature
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: 495-496 (1962)；David等人，
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: 1014-1021 (1974)；Pain等人，
J. Immunol. Meth., 40
: 219-230 (1981)；及Nygren,
J. Histochem. and Cytochem.
,
30
: 407-412 (1982))。 TIM-3蛋白質水準可使用本發明TIM-3結合劑藉由此項技術中已知的任何適合之方法量測。此類方法包括例如放射免疫分析(RIA)及FACS。 TIM-3之正常或標準表現值可使用任何適合之技術建立，例如藉由使包含或疑似包含TIM-3之樣品與TIM-3特異性抗體在適於形成抗原-抗體複合物之條件下組合。用可偵測物質直接或間接標記抗體以便於偵測結合或未結合之抗體。適合之可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料(參見例如Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques
, CRC Press, Inc. (1987))。樣品中表現之TIM-3多肽之量隨後與標準值相比。 抗TIM-3抗體藥劑可提供於套組中，例如預定量之試劑與用於進行診斷分析之說明書的封裝組合。若抗TIM-3抗體藥劑用酶標記，則套組宜包括酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測之發色團或螢光團的受質前體)。另外，其他添加劑可包括於套組中，諸如穩定劑、緩衝劑(例如阻斷緩衝劑或溶解緩衝劑)及其類似物。可改變各種試劑之相對量以提供實質上使分析靈敏度最佳化之試劑溶液中的濃度。試劑可以乾燥粉末(通常凍乾)形式提供，包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。 本發明之其他特徵將在以下對例示性具體例之描述過程中變得顯而易見，該等例示性具體例為了說明本發明而給出且不欲對其進行限制。
例證
實施例1 - 某些例示性抗TIM-3抗體之描述 此實施例描述特定抗TIM-3抗體重鏈多肽及輕鏈多肽序列以及編碼其之核酸。 抗TIM-3抗體重鏈多肽(SEQ ID NO:1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVSTISGGGTYTYYQDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 抗TIM-3抗體輕鏈多肽(SEQ ID NO:2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRRYLNWYHQKPGKAPKLLIYGASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQSHSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 具有
信號序列
之抗TIM-3抗體重鏈多肽(SEQ ID NO:5)
MEFGLSWLFLVAILKGVQC
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVSTISGGGTYTYYQDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 具有
信號序列
之抗TIM-3抗體輕鏈多肽(SEQ ID NO:6)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRRYLNWYHQKPGKAPKLLIYGASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQSHSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 編碼抗TIM-3抗體重鏈多肽之核苷酸序列(SEQ ID NO:3) GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT GAC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAC TGG GTC TCA ACC ATT AGT GGT GGT GGT ACT TAC ACC TAC TAT CAA GAC AGT GTG AAG GGG CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG TCC ATG GAC TAC TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCA TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCG CTA GCA CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCA GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC GTA GAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG GGG GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG TCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CTG GGT AAA 編碼抗TIM-3抗體輕鏈多肽之核苷酸序列(SEQ ID NO:4) GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGG AGG TAT TTA AAT TGG TAT CAC CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA TCC ACC TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGT AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAA CAG AGT CAC AGT GCC CCC CTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAA TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTC AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 以上序列描述利用人類IGHG4*01重鏈基因及人類IGKC*01 κ輕鏈基因作為骨架之例示性人源化單株抗TIM-3抗體。在IgG4重鏈之鉸鏈區中存在單個Ser至Pro點突變。此突變處於典型S228位置，對應於包括信號序列之SEQ ID NO: 5的殘基240。不希望受理論所束縛，設想此點突變用以使抗體重鏈之鉸鏈穩定。 此例示性人源化單株抗TIM-3抗體之生物物理學及生物化學特徵與IgG4分子之預期二硫鍵模式一致。預期的鏈間及鏈內二硫鍵中所涉及之殘基列表如下(表1及2)。 表1 - 具有如SEQ ID NO:1中所示胺基酸序列的例示性抗TIM-3抗體藥劑重鏈的二硫鍵中所涉及之預期殘基。
表2 - 具有如SEQ ID NO:2中所示胺基酸序列的例示性抗TIM-3抗體藥劑輕鏈的二硫鍵中所涉及之預期殘基。
此例示性抗TIM-3抗體在成熟蛋白質序列(SEQ ID NO:1)中各重鏈之CH2結構域的天冬醯胺殘基290處展現佔據的N-糖基化位點。在此位點處表現之N-糖基化為通常在哺乳動物細胞培養物中表現之IgG上觀察到的寡醣物種之混合物，例如，下文所示為來自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中所培養之此例示性抗TIM-3抗體製備物的聚糖物種的相對豐度(表3)。 表3 - 抗TIM-3抗體結合劑之聚糖分析
實施例2 - 例示性抗TIM-3抗體與重組TIM-3之結合 此實施例描述例示性抗TIM-3抗體(具有分別如SEQ ID NO:1及2中所示之重鏈及輕鏈)與重組TIM-3多肽之結合。具體而言，此實施例分別證實使用表面電漿子共振(SPR)及流式細胞測量術所測定之例示性抗體與可溶性TIM-3融合物及細胞表現之重組TIM-3的高親和力結合。 使用Biacore T200進行SPR分析且使用Biacore T200評估軟體確定動力學常數。實驗參數經選擇以使得在最高抗原濃度下達到飽和且使R
max
值保持在50個反應單位(RU)下。使用EDC活化的胺偶合化學將GE抗小鼠IgG (Fc特異性)固定在Biacore CM5晶片上。二聚可溶性人類TIM-3 mIgG2a Fc隨後捕捉於此表面上至約70 RU或更小的目標捕捉含量。接著，例示性抗TIM-3抗體(具有分別如SEQ ID NO:1及2中所示之重鏈及輕鏈)流經具有所捕捉之抗原(TIM-3融合物)的表面。在HBS-EP+緩衝液中進行捕捉及分析物結合。在各循環之間移除所捕捉之抗原及抗體以確保各濃度抗原之新鮮結合表面。所得感測器圖譜使用1:1結合模型全面擬合以計算結合及解離速率(分別為k
結合
及k
解離
)及解離常數作為總體親和力(K
D
)之量度。SPR量測證實例示性抗TIM-3抗體以K
D
估計值分別為7及17 pM之高親和力結合於人類及食蟹獼猴TIM-3 (表4)。其他結合分析確定，例示性抗TIM-3抗體實質上不結合於人類TIM-1多肽或人類PD-1多肽(資料未展示)。 使用穩定轉染天然人類或食蟹獼猴TIM-3之CHO-K1細胞株純系進行流式細胞測量術研究。例示性抗TIM-3抗體(具有分別如SEQ ID NO:1及2中所示之重鏈及輕鏈)以3倍稀釋度稀釋。將例示性抗體之稀釋液添加至表現人類或食蟹獼猴TIM-3之CHO-K1細胞(1E5細胞)且在冰上培育。將細胞洗滌兩次且在冰上用PE結合之山羊抗人類IgG4培育以偵測抗體結合。將細胞洗滌且在碘化丙錠存在下再懸浮以排除死細胞，固定，隨後在BD FACSArray (BD Biosciences)上分析螢光。使用非線性(S形)回歸分析對資料進行中值螢光強度之分析，繪圖且在GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)中擬合用於EC
50
值計算的曲線。發現此例示性抗TIM-3抗體分別以0.17及0.27 nM之EC
50
結合於細胞表面人類及食蟹獼猴TIM-3 (表4)。 表4. 藉由表面電漿共振(SPR)及表現TIM-3之CHO-K1細胞的例示性抗TIM-3抗體與TIM-3之結合
K
assoc
= 結合速率常數；K
dissoc
= 解離速率常數；K
D
= 解離常數。 此實施例證實在本發明之範疇內的抗TIM-3抗體可以高親和力特異性結合於TIM-3多肽。 實施例3 - TIM-3阻斷增強耗竭免疫細胞中之T細胞活化 此實施例描述特徵在於PD-1及TIM-3表現增加的活體外T細胞耗竭模型中例示性抗TIM-3抗體藥劑的表徵(圖2A)。具體而言，自MBP-Tracker小鼠取出脾臟且處理以產生脾細胞之單細胞懸浮液。使細胞以3×10
6
/mL再懸浮且用WT-MBP或APL-MBP刺激72小時。刺激後，T細胞藉由ficoll密度梯度純化且隨後在20U/mL IL-2中以2×10
6
/mL再塗覆四天。4天後，收集細胞，再懸浮(4×10
5
/mL，最終每孔2×10
4
個)且使用經輻照之APC(來自B10PLxC57BL/6小鼠，4×10
6
/mL，最終每孔2×10
5
個)單次劑量之APL-MBP肽連同測試或參考物質或適當對照物再刺激72小時。收集培養上清液且冷凍儲存用於後續評定。 藉由ELISA評定細胞因子產生表明TIM-3阻斷顯著增強此系統中之IFN-γ產生(圖2B)。因此，此實施例證實在本發明之範疇內的抗TIM-3抗體可活化耗竭免疫細胞。 已如此描述本發明之至少數個態樣及具體例，應瞭解各種改變、修改及改進將對熟悉本技藝者顯而易見。此類改變、修改及改進意欲為本揭示案之一部分，且意欲在本發明之精神及範疇內。因此，前述描述僅作為實施例且本發明藉由以下申請專利範圍詳細描述。 本文中所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均以引用之方式併入本文中，其引用程度就如同個別及特定地指示各參考文獻以引用之方式併入且全文闡述於本文中一般。除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用術語「一(a/an)」及「該」及「至少一個」及類似指示物應解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則使用後接一或多個項目之清單(例如「A及B中之至少一者」)之術語「至少一者」應理解為意謂選自所列項目之一個項目(A或B)或所列項目中之兩者或更多者之任何組合(A及B)。除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放式術語(亦即意指「包括但不限於」)。除非本文另外指示，否則本文中數值範圍之敍述僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各獨立值之速記方法，且各獨立值併入本說明書中，如同在本文中個別敍述一般。除非本文另外指明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實施例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲較好地闡明本發明而不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解成表示對於實踐本發明係必不可少之任何未主張的要素。