TW201808346A - 長效調酸素調配物及其產生與投與方法 - Google Patents
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Abstract
描述包括可逆聚乙二醇化調酸素結合物之醫藥調配物及醫藥組合物,以及其產生及使用方法。結合物包含將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或2-磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於調酸素肽之結合物,其中PEG聚合物經由可撓性連接子附接於胺基端或調酸素內之胺基殘基,其中可撓性連接子包括Fmoc或FMS。
Description
描述包括可逆聚乙二醇化調酸素結合物之醫藥調配物及醫藥組合物,以及其產生及使用方法。結合物包含將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或2-磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於調酸素肽之結合物,其中PEG聚合物經由可撓性連接子附接於胺基端或調酸素內之胺基殘基,其中可撓性連接子包括Fmoc或FMS。
胃腸道負責合成及釋放許多調節進食行為之肽激素,包含胰蛋白(PP)、類升糖素肽1(GLP-1)、肽YY(PYY)及調酸素(OXM)。OXM由腸及CNS中組織特異性之升糖素原之轉譯後加工產生。其含有37個胺基酸,包含完整升糖素序列與C端基礎八肽延伸,此延伸展示影響OXM在活體外與活體內之特性,但僅僅其並不足夠實現肽之作用。對攝入食物起反應,腸L細胞分泌OXM至血流中,與膳食熱量成比例。
在經口與腹膜內投與後,OXM經由刺激胰島素分泌來增強葡萄糖清除。其亦調節對食物攝入之控制。OXM經腦室內(ICV)及核內注射至丘腦下部之室旁及弓狀核(ARC)中可抑制空腹大鼠再次進食。此抑制亦已在自由進食大鼠中黑暗期開始時證實。此外,OXM之周圍投與劑量依賴性地抑制空腹誘發與黑暗期之食物攝入。
蛋白質及尤其短肽容易在血液、肝臟或腎中變性或酶促降解。因此,肽通常具有幾小時之短循環半衰期。由於穩定性低,所以肽類藥物通常以持續頻率傳遞以便維持活性肽之有效血漿濃度。此外,由於肽類藥物通常藉由輸注來投與,故頻繁注射肽類藥物對個體造成相當大不適。
不利之藥物動力學(如短血清半衰期)可能會防礙多種在其他方面有前景之候選藥物的藥學研發。血清半衰期為分子之經驗特徵,且對於每種潛在新穎藥物而言須以實驗方式測定。舉例而言,在較低分子量之多肽藥物的情況下,諸如腎過濾之生理清除機制可能由於所需給藥方案之成本或頻率而無法維持藥物之治療水準。相反,在藥物或其代謝物具有毒性副作用時不期望長血清半衰期。
因此,需要將延長治療性多肽之半衰期,同時維持其高藥理學功效的技術。用於此類所需肽藥物之調配物及組合物亦應滿足以下要求:血清穩定性增強、高活性及當注射至個體中時誘發不當免疫反應之概率低。本文揭示OXM衍生物之調配物及組合物,其中肽之半衰期利用可逆聚乙二醇化技術來延長;此等OXM衍生物具有長半衰期,同時維持高藥理學功效,且同時血清穩定性增強、具有高活性及在個體中誘發不當免疫反應之概率低。
在一個態樣中,本文揭示一種醫藥調配物,其包括緩衝液、張力劑及可逆聚乙二醇化調酸素,所述可逆聚乙二醇化調酸素由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。
在一相關態樣中,緩衝液為100 mM乙酸鹽。在另一相關態樣中,張力劑為100 mM蔗糖。在另一相關態樣中,調配物係在約4.7之pH值下。
在一相關態樣中,可逆聚乙二醇化調酸素係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度下。在另一相關態樣中,調配物為液體調配物。
在一相關態樣中,緩衝液包括檸檬酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸或磷酸鉀緩衝液。在另一相關態樣中,調配物包括凍乾調配物。
在一相關態樣中,PEG聚合物為具有硫氫基部分之PEG聚合物。在另一相關態樣中,PEG聚合物為PEG30。在另一相關態樣中,調酸素由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列組成。
在一相關態樣中,醫藥調配物經調配用於一週一次投與個體,以提高所述個體之葡萄糖耐受性。在另一相關態樣中,本文揭示之醫藥調配物用於一週一次投與個體,以改善所述個體之血糖控制。在另一相關態樣中,本文揭示之醫藥調配物係投與個體,以減少所述個體之食物攝入。在另一相關態樣中,本文揭示之醫藥調配物係投與個體,用於一週一次投與個體,以減輕所述個體之體重。在又一態樣中,一週一次投與個體,以降低所述個體之膽固醇含量。在另一相關態樣中,一週一次投與個體,以增加所述個體之胰島素敏感性。在另一態樣中,一週一次投與個體,以降低所述個體之胰島素抗性。在另一態樣中,一週一次投與個體,以增加所述個體之能量消耗。在另一相關態樣中,本文揭示之醫藥調配物係一週一次投與個體,以治療所述個體之糖尿病。在另一相關態樣中,個體為人類。
在一相關態樣中,在投與醫藥調配物後,藉由使FMS或Fmoc連接子自所述調酸素化學水解,將調酸素釋放至生物流體中。在另一相關態樣中,生物流體為血液、血清或腦脊髓液。
在一相關態樣中,調配物係用於皮下投與。
在一個態樣中,本文揭示一種製備本文揭示之醫藥調配物的方法,其一週一次投與個體,所述方法包括以下步驟:(i)藉由將聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於所述調酸素,將調酸素可逆聚乙二醇化,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30);(ii)在約4.7之pH值下將步驟(i)之可逆聚乙二醇化調酸素與所述緩衝液及所述張力劑混合;以及(iii)用所述調配物預先填充注射器。在一相關態樣中,注射器為雙腔室注射器。
在一個態樣中,本文揭示一種用本文揭示之醫藥調配物填充注射器的方法,其包括以下步驟:(i)調配具有預定量之所述可逆聚乙二醇化調酸素的所述可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其中所述預定量係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度且約2.0至200 mg之劑量下;以及(ii)用所述調配物填充注射器。在一相關態樣中,注射器為雙腔室注射器。
在另一態樣中,本文揭示之方法係針對需要提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、減少食物攝入、減輕體重、改善膽固醇、增加胰島素敏感性、降低胰島素抗性或增加能量消耗或其任何組合之個體。
在一個態樣中,本文揭示可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其包括如本文所揭示之醫藥調配物。在一個態樣中,本文揭示一種醫藥組合物,其一週一次投與個體,其包括由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成之可逆聚乙二醇化調酸素,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30);以及醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。在一相關態樣中,可逆聚乙二醇化調酸素係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度下。在另一相關態樣中,PEG聚合物為具有硫氫基部分之PEG聚合物。在另一相關態樣中,PEG聚合物為PEG30。在另一相關態樣中,調酸素由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列組成。在另一相關態樣中,所述組合物包括凍乾調配物。
在一相關態樣中,投與本文揭示之醫藥組合物提高所述個體之葡萄糖耐受性。在另一相關態樣中,所述投與改善所述個體之血糖控制。在另一相關態樣中,投與減少所述個體之食物攝入。在另一相關態樣中,投與減輕所述個體之體重。在另一相關態樣中,投與降低所述個體之膽固醇含量。在另一相關態樣中,投與增加所述個體之胰島素敏感性。在另一相關態樣中,投與降低所述個體之胰島素抗性。在另一相關態樣中,投與增加所述個體之能量消耗。在另一相關態樣中,投與治療所述個體之糖尿病。在另一相關態樣中,個體為人類。
在一相關態樣中,在投與醫藥組合物後,藉由使FMS或Fmoc連接子自所述調酸素化學水解,將調酸素釋放至生物流體中。在另一相關態樣中,生物流體為血液、血清或腦脊髓液。在另一相關態樣中,組合物係用於皮下投與。
在一個態樣中,本發明揭示可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其包括如本文所揭示之醫藥組合物。
在一個態樣中,本發明揭示一種凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其包括可逆聚乙二醇化調酸素。在一相關態樣中,可逆聚乙二醇化調酸素由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。在另一相關態樣中,調配物進一步包括檸檬酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸或磷酸鉀緩衝液。在另一相關態樣中,調配物進一步包括蔗糖或海藻糖。在另一相關態樣中,調配物進一步包括甘露糖醇、甘胺酸、羥基乙基澱粉或非離子型界面活性劑或其任何組合。在另一相關態樣中,調配物進行復原。
在以下詳細描述中,闡述眾多特定細節以便充分瞭解本文呈現之調配物及組合物。然而,本領域中熟習此項技術者應瞭解,此等調配物及組合物可在無此等特定細節之情況下實踐。在其他情況下,未詳細描述熟知方法、程序及組分,以免混淆本文揭示之調配物及組合物。
在一個實施例中,本文揭示一種醫藥調配物,其包括緩衝液、張力劑及可逆聚乙二醇化調酸素,所述可逆聚乙二醇化調酸素由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。
在一個實施例中,本文揭示之調配物係一週一次投與個體。在另一實施例中,個體為人類個體。在另一實施例中,人類個體為成人。在另一實施例中,人類個體為兒童。在另一實施例中,個體需要提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、減少食物攝入、減輕體重、改善膽固醇、增加胰島素敏感性、降低胰島素抗性或增加能量消耗或其任何組合。
在一個實施例中,本文揭示之方法係用於製備用於一週一次投與個體之醫藥調配物,所述方法包括以下步驟:(i)藉由將聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於所述調酸素,將調酸素可逆聚乙二醇化,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30);(ii)在約4.7之pH值下將步驟(i)之可逆聚乙二醇化調酸素與所述緩衝液及所述張力劑混合;以及(iii)用所述調配物預先填充注射器。在另一實施例中,本文揭示一種用如本文所描述之醫藥調配物填充注射器的方法,其包括以下步驟:(i)調配具有預定量之所述可逆聚乙二醇化調酸素的所述可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型;以及(ii)用所述調配物填充注射器。
在一個實施例中,本文揭示一種新穎的延長肽之血清半衰期之方法。此方法係基於使用一種包括聚乙二醇(PEG)鏈經由化學連接子(稱為FMS或Fmoc)可逆附接於肽之結合物,使得天然肽緩慢釋放至血流中。接著所釋放之肽亦可跨越血腦屏障,進入中樞神經系統(CNS)或任何其他目標器官。在一個實施例中,FMS連接子之獨特化學結構產生特定肽釋放速率。
在一個實施例中,本文揭示可逆聚乙二醇化調酸素肽及其產生及使用方法。 可逆聚乙二醇化調酸素肽
在實施例中,本文揭示之結合物包括雙重GLP-1/升糖素受體促效劑、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及可撓性連接子或由其組成。在另一實施例中,本文揭示一種結合物,所述結合物包括雙重GLP-1/升糖素受體促效劑、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子或由其組成。在另一實施例中,本文揭示之結合物包括調酸素(OXM)、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子或由其組成。在另一實施例中,PEG聚合物經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys12)。在一個實施例中,長效OXM為一種結合物,所述結合物包括OXM及經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於OXM之胺基酸序列之位置十二號(Lys12)上的離胺酸殘基的聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)或由其組成。
在另一實施例中,本文揭示一種延長OXM肽之生物半衰期的方法。在另一實施例中,本文揭示一種延長OXM在生物流體中之循環時間的方法,其中所述循環時間藉由完整OXM肽之緩慢釋放來延長。在另一實施例中,延長所述OXM肽之所述生物半衰期或所述循環時間允許所述OXM跨越血腦屏障且靶向CNS。熟練的業內人士非常瞭解生物流體可為血液、血清、腦脊髓液(CSF)及其類似物。
在一個實施例中,在將本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素結合物投與個體後,調酸素由於所述FMS或所述Fmoc連接子自所述結合物化學水解而釋放至個體之生物流體中。在另一實施例中,所釋放之OXM完整且重新獲得完整GLP-1及升糖素受體結合活性。在另一實施例中,所述FMS或所述Fmoc化學水解延長所述OXM肽在所述生物流體中之循環時間。在另一實施例中,延長所述OXM之循環時間允許所述OXM跨越血腦屏障且靶向CNS。在另一實施例中,延長所述OXM之循環時間允許所述OXM跨越血腦屏障且靶向丘腦下部。在另一實施例中,延長所述OXM之循環時間允許所述OXM跨越血腦屏障且靶向弓狀核。
熟練的業內人士將瞭解,術語「可逆聚乙二醇化調酸素」與「聚乙二醇化調酸素」可互換使用,兩者具有相同含義及品質。
在一個實施例中,可逆聚乙二醇化OXM為PEG30-FMS-OXM之胺基變異體,其中PEG30-FMS-OXM為包括經由雙官能連接子(FMS或Fmoc)連接之OXM及mPEG(30)-SH的定點結合物。在另一實施例中,OXM肽經由N端側之其末端胺連接,所述末端胺自一側與連接子上之N-丁二醯亞胺酯(NHS)基團反應,而mPEG(30)-SH藉由其硫醇基連接於FMS連接子之順丁烯二醯亞胺部分(參見本文中之實例)。Lys12及Lys30變異體經由其Lys殘基之胺基結合於FMS連接子。在一個實施例中,本文中可逆聚乙二醇化法用於產生本文揭示之持久調酸素(OXM)肽(例如PEG30-FMS-OXM)。
熟練的業內人士將瞭解,術語雙重「GLP-1/升糖素受體促效劑」與「促效劑」可互換使用,兩者具有相同含義及品質。在一個實施例中,術語涵蓋此項技術中已知之任何GLP-1/升糖素受體促效劑。在另一實施例中,GLP-1/升糖素受體促效劑包括天然存在之雙重促效劑。在另一實施例中,GLP-1/升糖素受體促效劑包括非天然存在之雙重促效劑。在另一實施例中,非天然存在之GLP-1/升糖素受體促效劑以不同於調酸素之對GLP-1及升糖素受體之親和力結合於此等受體。在另一實施例中,較佳促效劑為調酸素或OXM或其功能變異體。
熟練的業內人士將瞭解,術語「功能」涵蓋本文揭示之促效劑或OXM具有生物活性之能力,其包含(但不限於)減輕體重、增加胰島素敏感性、降低胰島素抗性、增加能量消耗、提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、改善膽固醇含量等,如本文進一步揭示。
在一個實施例中,本文揭示之結合物包括OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子,其中PEG聚合物經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM胺基酸序列之位置三十號(Lys30
)上的離胺酸殘基。在一個實施例中,長效OXM為一種結合物,其包括OXM及經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於OXM胺基酸序列之位置十二號(Lys30
)上的離胺酸殘基的聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)或由其組成。
在一個實施例中,本文揭示之結合物由OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子組成,其中PEG聚合物經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基酸序列之位置三十號(Lys30
)上的離胺酸殘基。在一個實施例中,長效OXM為一種結合物,所述結合物包括OXM及經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於OXM之胺基酸序列之位置十二號(Lys30
)上的離胺酸殘基的聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)或由其組成。
在一個實施例中,本文揭示之結合物包括OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子,其中PEG聚合物經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基端。在一個實施例中,長效OXM為一種組合物,所述組合物包括OXM及經由Fmoc或FMS連接子附接於OXM之胺基酸序列之胺基端的聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)或由其組成。
在一個實施例中,本文揭示之結合物由OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子組成,其中PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基端。在一個實施例中,長效OXM為一種結合物,所述結合物包括OXM及經由Fmoc或FMS連接子附接於OXM之胺基酸序列之胺基端的聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)或由其組成。
在另一實施例中,本文揭示之結合物包括OXM肽及經由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子結合於位置十二(Lys12)或位置30(Lys30)上或OXM肽之胺基端上OXM肽之離胺酸胺基酸的聚乙二醇(PEG)聚合物。在另一實施例中,本文揭示之經修飾之OXM肽由OXM肽及經由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子結合於位置十二(Lys12)或位置30(Lys30)上或OXM肽之胺基端上OXM肽之離胺酸胺基酸的聚乙二醇(PEG)聚合物組成。在另一實施例中,其中PEG在Lys12、Lys30或胺基端附接於OXM之結合物分別稱為OXM之「Lys12變異體」、「Lys30變異體」或「胺基變異體」。熟練的業內人士將瞭解,術語「胺基變異體」或「胺基端變異體」與「N端變異體」、「N'變異體」或「N末端變異體」同義,均具有相同含義及品質。應瞭解熟練的業內人士可在本發明引導下容易以位點特異性或隨機方式將離胺酸殘基插入整個OXM序列中以在此等離胺酸殘基附接本文揭示之連接子(Fmoc或FMS)/PEG結合物。在一個實施例中,本發明中亦涵蓋如下變異體,其中一或多個離胺酸殘基位於整個OXM序列中不同位置且用於將OXM結合於PEG及可裂解連接子(例如FMS或Fmoc)。
在一個實施例中,本文揭示之結合物包括OXM肽及經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子結合於位置十二(Lys12)或位置30(Lys30)上OXM肽之離胺酸胺基酸的聚乙二醇(PEG)聚合物。在另一實施例中,本文揭示之結合物包括OXM肽及經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子結合於位置十二(Lys12)上或胺基端上OXM肽之離胺酸胺基酸的聚乙二醇(PEG)聚合物。在另一實施例中,本文揭示之結合物包括OXM肽及經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)連接子結合於位置三十(Lys30)上或胺基端上OXM肽之離胺酸胺基酸的聚乙二醇(PEG)聚合物。
在另一實施例中,長效OXM為聚乙二醇化OXM。在另一實施例中,長效OXM為可逆聚乙二醇化OXM。熟練的業內人士將瞭解,短語「長效OXM」、「可逆聚乙二醇化OXM(reversed PEGylated OXM)」、「可逆聚乙二醇化OXM(reversible PEGylated OXM)」或「包括OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)或由其組成之結合物」可互換使用,均具有相同含義及品質。在另一實施例中,長效OXM為經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接子連接於PEG之OXM。在另一實施例中,長效OXM經由其Lys12殘基或其Lys30殘基或其胺基(N')端連接於視情況經取代之Fmoc或FMS。
在一個實施例中,本文揭示之長效OXM包括PEG聚合物。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM包括經由視情況經取代之Fmoc或FMS結合於OXM肽之胺基端的PEG聚合物。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM包括經由視情況經取代之Fmoc或FMS結合於OXM肽之離胺酸殘基12或30的PEG聚合物。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM包括經由視情況經取代之Fmoc或FMS結合於OXM肽之胺基端與OXM之離胺酸殘基12及30的PEG聚合物。
在另一實施例中,長效OXM為包括1:0.2-10:0.2-10之莫耳比的OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)或由其組成的結合物。在另一實施例中,長效OXM為包括1:0.5-2:0.5-2之莫耳比的OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)或由其組成的結合物。在另一實施例中,長效OXM為包括1:1:1之莫耳比的OXM、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)或由其組成的結合物。在另一實施例中,長效OXM包含經由視情況經取代之Fmoc或FMS結合於OXM之胺基端的PEG聚合物。在另一實施例中,OXM-PEG與連接子之莫耳比為1:1:1-1:1:3.5。在另一實施例中,莫耳比為1:1:1-1:1:10.0。在另一實施例中,連接子之較高比率允許結合物之產率最佳化。
在另一實施例中,長效OXM經由諸如(但不限於)視情況經取代之Fmoc及FMS之可逆連接子連接於PEG。在另一實施例中,Fmoc及FMS對鹼敏感且在生理條件下可移除。在另一實施例中,可逆連接子為對鹼敏感且在生理條件下可移除之連接子。在另一實施例中,可逆連接子為對鹼敏感且在血液、血漿或淋巴中在生理條件下可移除之連接子。在另一實施例中,可逆連接子為對鹼敏感且在體液中在生理條件下可移除之連接子。在另一實施例中,可逆連接子為在具有鹼性pH值之體液中可移除之連接子。在另一實施例中,對鹼敏感之連接子在暴露於鹼性環境時裂解,因此自連接子及PEG釋放OXM。在另一實施例中,對溫度敏感之連接子在暴露於允許裂解發生之特定溫度時裂解。在另一實施例中,能夠使連接子斷裂之溫度在生理範圍內。在另一實施例中,可逆連接子為此項技術中已知之任何可逆連接子。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM為其中OXM經由可逆連接子連接於PEG之結合物。在另一實施例中,在暴露於鹼性環境時可逆聚乙二醇化OXM釋放游離OXM。在另一實施例中,在暴露於血液或血漿時可逆聚乙二醇化OXM釋放游離OXM。在另一實施例中,長效OXM包括彼此不直接連接(如標準聚乙二醇化程序中)之PEG及OXM,而是兩個殘基連接於對鹼高度敏感且在常見生理條件下可移除之Fmoc或FMS之不同位置。在另一實施例中,常見生理條件包含生理環境,諸如血液或血漿。
在另一實施例中,Fmoc及FMS之結構及其製備方法描述於美國專利第7585837號。美國專利第7585837號之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,本文揭示之結合物藉由式I之結構呈現: (X)n—Y, 其中Y為帶有游離胺基、羧基或羥基之雙重GLP-1/升糖素受體促效劑; X為式(i)之基團:其中R1
為含有蛋白質或聚合物載體部分之基團;聚乙二醇(PEG)部分; R2
係選自由氫、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、鹵素、硝基、--SO3
H、--SO2
NHR、胺基、銨、羧基、PO3
H2及OPO3
H2
組成之群; R係選自由氫、烷基及芳基組成之群; R3
及R4
相同或不同,各選自由氫、烷基及芳基組成之群; 當基團連接於OXM-Y之胺基或羥基時,A為共價鍵;以及 n為至少一之整數,及其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中,R1
為含有蛋白質或聚合物載體部分之基團;聚乙二醇(PEG)部分。在另一實施例中,PEG部分為-NH-C(O)-(CH2
)p-順丁烯二醯亞胺-S-PEG,其中p為1-6之間的整數。在另一實施例中,p為2。
在另一實施例中,式I之n為至少1之整數。在另一實施例中,n為1。在另一實施例中,n為2。在另一實施例中,n在1至5之間。在另一實施例中,n在2至5之間。
在另一實施例中,GLP-1/升糖素受體促效劑為調酸素(OXM)。
本領域中一般熟習此項技術者將認識到,術語「烷基」、「烷氧基」、「烷氧基烷基」、「芳基」、「烷芳基」及「芳烷基」涵蓋具有1-8個,較佳1-4個碳原子之烷基,例如甲基、乙基、丙基、異丙基及丁基,以及具有6-10個碳原子之芳基,例如苯基及萘基。此外,熟練的業內人士將瞭解,術語「鹵素」涵蓋溴基、氟基、氯基及碘基。
在另一實施例中,R2
、R3
及R4
各自為氫。
在另一實施例中,R2
為-氫,A為--OCO- [-OC(=O)-],R3
及R4
各自為氫,亦即9-茀基甲氧基羰基(下文中為「Fmoc」)。
在另一實施例中,R2
為在茀環之位置2處之--SO3
H,R3
及R4
各自為氫,且A為--OCO-- [-OC(=O)-]。在另一實施例中,R2
為在茀環之位置1處之--SO3
H,R3
及R4
各自為氫,且A為--OCO-- [-OC(=O)]。在另一實施例中,R2
為在茀環之位置3處之--SO3
H,R3
及R4
各自為氫,且A為--OCO-- [-OC(=O)]。在另一實施例中,R2
為在茀環之位置4處之--SO3
H,R3
及R4
各自為氫,且A為--OCO-- [-OC(=O)]。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在一個實施例中,本文揭示之結合物藉由式II結構呈現,其中OXM經由所述OXM之胺基端連接於連接子:其中R2
為氫或SO3
H。在一個實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置2處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置1處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置3處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其組合。在一個實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置2處且PEG為PEG30。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置1處且PEG為PEG30。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置3處且PEG為PEG30。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置4處且PEG為PEG30。
在一個實施例中,MOD-6031藉由式IIa之結構呈現,其中PEG為PEG30
且R2
為在茀之位置2處之SO3
H:
在一個實施例中,本文揭示之結合物藉由式III之結構呈現,其中OXM經由所述OXM之Lys30
之胺基殘基連接於連接子:其中R2
為氫或SO3
H。在一個實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置2處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置1處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置3處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在一個實施例中,本文揭示之結合物藉由式IV之結構呈現,其中OXM經由所述OXM之Lys12之胺基殘基連接於連接子:其中R2
為氫或SO3
H。在一個實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置2處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置1處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置3處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在一個實施例中,本文揭示之結合物藉由下式呈現:PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、PEG-S-MAL-FMS-OXM、(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM;其中n為至少1之整數。在另一實施例中,OXM經由OXM之胺基端或OXM胺基酸之一之胺基殘基連接於FMS或Fmoc。在另一實施例中,PEG經由-NH-C(O)-(CH2
)p-順丁烯二醯亞胺-S-連接於Fmoc或FMS,其中p為1-6之間的整數,且其中PEG連接於硫醚基。
在一個實施例中,本文揭示之Fmoc藉由以下結構呈現:。
在一個實施例中,本文揭示之FMS藉由以下結構呈現:。
在一個實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置2處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置1處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置3處。在另一實施例中,R2
為SO3
H且在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在另一實施例中,OXM包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在另一實施例中,OXM由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成。在另一實施例中,SEQ ID NO: 1包括以下胺基酸(AA)序列或由其組成:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO: 1)。在另一實施例中,OXM包括CAS No. 62340-29-8中描繪之胺基酸序列或由其組成。
在另一實施例中,OXM為人類OXM或任何哺乳動物OXM。在另一實施例中,OXM亦稱為升糖素-37或生物活性腸升糖素。在另一實施例中,OXM為雙重GLP-1/升糖素受體促效劑。在另一實施例中,OXM為OXM之生物活性片段。在另一實施例中,生物活性OXM自SEQ ID NO: 1之胺基酸30延伸至胺基酸37。在另一實施例中,生物活性OXM自SEQ ID NO: 1之胺基酸19延伸至胺基酸37。在另一實施例中,本文揭示之OXM對應於其中缺失兩個C端胺基酸之八肽。在另一實施例中,本文揭示之OXM對應於保留如本文所揭示之OXM活性的SEQ ID NO: 1之任何片段。
在一個實施例中,OXM包括SEQ ID NO: 1之肽之肽同源物。在一個實施例中,如使用美國國家生技資訊中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少50%同源。在一個實施例中,如使用NCBI之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少60%同源。在一個實施例中,如使用NCBI之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少70%同源。在一個實施例中,如使用NCBI之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少80%同源。在一個實施例中,如使用NCBI之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少90%同源。在一個實施例中,如使用NCBI之BlastP軟體使用預設參數測定,本文揭示之OXM胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中闡述之OXM序列至少95%同源。
在一個實施例中,本文揭示之OXM結合物用於需要OXM呈可溶形式之治療劑中。在另一實施例中,本文揭示之OXM結合物包含一或多種非天然或天然極性胺基酸,包含(但不限於)由於具有含羥基側鏈而能夠增加蛋白質溶解性之絲胺酸及蘇胺酸。
在一個實施例中,如本文所揭示之OXM係諸如藉由使用標準固相技術以生物化學方法合成。在另一實施例中,此等生物化學方法包含排他性固相合成、部分固相合成、片段縮合或經典溶液合成。
在一個實施例中,固相OXM合成程序為本領域中熟習此項技術者所熟知且由John Morrow Stewart及Janis Dillaha Young, 《固相蛋白質合成(Solid Phase Protein Syntheses)》(第2版, Pierce Chemical Company, 1984)進一步描述。在另一實施例中,合成蛋白質藉由製備型高效液相層析法[Creighton T. (1983) 《蛋白質、結構及分子原理(Proteins, structures and molecular principles)》. WH Freeman and Co. N.Y.]來純化且其組成可藉由本領域中熟習此項技術者已知之方法進行胺基酸定序來確定。
在另一實施例中,重組蛋白技術用於產生本文揭示之OXM。在一些實施例中,重組蛋白技術用於產生大量本文揭示之OXM。在另一實施例中,重組技術由以下各者描述:Bitter等人, (1987) 《酶學方法(Methods in Enzymol.)》 153:516-544;Studier等人 (1990) 《酶學方法(Methods Enzymol.)》 185:60-89;Brisson等人 (1984) 《自然(Nature)》 310:511-514;Takamatsu等人 (1987) 《EMBO雜誌(EMBO J.)》 6:307-311;Coruzzi等人 (1984) 《EMBO雜誌(EMBO J.)》 3:1671-1680;及Brogli等人, (1984) 《科學(Science)》 224:838-843;Gurley等人 (1986) 《分子細胞生物學(Mol. Cell. Biol.)》 6:559-565;及Weissbach與Weissbach, 1988, 《植物分子生物學方法(Methods for Plant Molecular Biology)》 Academic Press, NY, 第VIII部分, 第421-463頁。
在另一實施例中,使用編碼本文揭示之OXM的聚核苷酸,合成本文揭示之OXM。在一些實施例中,編碼本文揭示之OXM的聚核苷酸接合至表現載體,所述表現載體包括順式調控序列(例如啟動子序列)之轉錄控制。在一些實施例中,順式調控序列適用於引導本文揭示之OXM之組成性表現。
熟練的業內人士將瞭解,短語「聚核苷酸」涵蓋可呈RNA序列、互補聚核苷酸序列(cDNA)、基因組聚核苷酸序列及/或複合聚核苷酸序列(例如以上各者之組合)分離及提供的單股或雙股核酸序列。
熟練的業內人士將瞭解,短語「互補聚核苷酸序列」可涵蓋由信使RNA使用逆轉錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶逆轉錄所產生之序列。在一個實施例中,所述序列隨後可以使用DNA聚合酶活體內或活體外擴增。
熟練的業內人士將瞭解,短語「基因組聚核苷酸序列」可涵蓋由染色體衍生(分離)之序列且由此其表示染色體之連續部分。
熟練的業內人士將瞭解,術語「複合聚核苷酸序列」可涵蓋至少部分互補且至少部分屬於基因組之序列。在一個實施例中,複合序列包括編碼本文揭示之肽所需的一些外顯子序列以及插入其間的一些內含子序列。在一個實施例中,內含子序列可以為任何來源,包含其它基因,且典型地將包含保守剪接信號序列。在一個實施例中,內含子序列包含順式作用表現調控元件。
在一個實施例中,本文揭示之聚核苷酸使用PCR技術或本領域中熟習此項技術者已知之任何其他方法或程序製備。在一些實施例中,所述程序涉及接合兩個不同DNA序列(參看例如《最新分子生物學實驗方法彙編(Current Protocols in Molecular Biology)》, Ausubel等人編, John Wiley & Sons, 1992)。在一個實施例中,多種原核或真核細胞可用作宿主表現系統以表現本文揭示之OXM。在另一實施例中,此等宿主表現系統包含(但不限於)微生物,諸如經含有蛋白質編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌;經含有蛋白質編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母;經重組病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒,CaMV;菸草花葉病毒,TMV)感染或經含有蛋白質編碼序列之重組質體表現載體(諸如Ti質體)轉型的植物細胞系統。
在一個實施例中,使用非細菌表現系統(例如哺乳動物表現系統,諸如CHO細胞)表現本文揭示之OXM。在一個實施例中,用於在哺乳動物細胞中表現本文揭示之聚核苷酸的表現載體為包括CMV啟動子及新黴素抗性基因之pCI-DHFR載體。
在另一實施例中,在本文揭示之細菌系統中,宜根據所表現之蛋白質所意欲之用途選擇多種表現載體。在一個實施例中,需要大量OXM。在一個實施例中,需要載體引導蛋白質產物高水準之表現,可能表現成與疏水性信號序列之融合物,所述疏水性信號序列引導所表現之產物至其中蛋白質產物容易純化之細菌胞外質或培養基中。在一個實施例中,某些融合蛋白經工程改造以具有特定裂解位點,從而幫助回收蛋白質。在一個實施例中,可用於此類操控之載體包含(但不限於)大腸桿菌表現載體之pET系列[Studier等人, 《酵學方法(Methods in Enzymol.)》 185:60-89 (1990)]。
在一個實施例中,使用酵母表現系統。在一個實施例中,如美國專利申請案第5,932,447號中所揭示,含有組成型或誘導型啟動子之多種載體可用於酵母中。在另一實施例中,使用促進外來DNA序列整合至酵母染色體中的載體。
在一個實施例中,本文揭示之表現載體可進一步包含允許例如自單一mRNA(諸如內部核糖體進入位點(IRES))轉譯數種蛋白之其他聚核苷酸序列及用於基因組整合啟動子-嵌合蛋白之序列。
在一個實施例中,哺乳動物表現載體包含(但不限於)pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81,其可購自Invitrogen;pCI,其可購自Promega;pMbac、pPbac、pBK-RSV及pBK-CMV,其可購自Strategene;pTRES,其可購自Clontech;及其衍生物。
在另一實施例中,含有來自諸如逆轉錄病毒之真核病毒之調控元件的表現載體用於本文揭示之方法中以製備如本文所揭示之結合物或其部分。SV40載體包含pSVT7及pMT2。在另一實施例中,來源於牛乳頭瘤病毒之載體包含pBV-1MTHA,且來源於艾伯斯坦巴爾病毒(Epstein Bar virus)之載體包含pHEBO及p2O5。其他示例性載體包含pMSG、pAV009/A+
、pMTO10/A+
、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE以及允許蛋白質在SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳房腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、多角體蛋白啟動子或顯示對真核細胞中之表現有效之其他啟動子的指導下表現的任何其他載體。
在一個實施例中,使用植物表現系統。在一個實施例中,藉由多種啟動子驅動OXM編碼序列之表現。在另一實施例中,使用病毒啟動子,諸如CaMV之35S RNA及19S RNA啟動子[Brisson等人, 《自然(Nature)》 310:511-514 (1984)]或TMV之外殼蛋白啟動子[Takamatsu等人, 《EMBO雜誌(EMBO J.)》 6:307-311 (1987)]。在另一實施例中,使用植物啟動子,諸如RUBISCO之小次單元[Coruzzi等人, 《EMBO雜誌(EMBO J.) 3:1671-1680 (1984);以及Brogli等人, 《科學(Science)》 224:838-843 (1984)]或熱休克啟動子,例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B [Gurley等人, 《分子細胞生物學(Mol. Cell. Biol.)》 6:559-565 (1986)]。在一個實施例中,使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉型、顯微注射、電穿孔及熟練的業內人士熟知之其他技術將構築體引入植物細胞中。參見例如Weissbach與Weissbach [《植物分子生物學方法(Methods for Plant Molecular Biology)》, Academic Press, NY, 第VIII部分, 第421-463頁 (1988)]。本領域中所熟知之諸如昆蟲及哺乳動物宿主細胞系統之其他表現系統亦可用於如本文所揭示之方法及用途中。
應瞭解,除含有對所插入編碼序列(編碼蛋白質)之轉錄及轉譯而言必需之元件外,本文揭示之表現構築體亦可包含經工程改造以最佳化所表現蛋白質之穩定性、產量、純化、產率或活性的序列。
在一些實施例中,各種方法可用於將本文揭示之表現載體引入宿主細胞系統中。在一些實施例中,此類方法概述於Sambrook等人, 《分子選殖:實驗指南(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)》, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992);Ausubel等人, 《最新分子生物學實驗方法彙編(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley and Sons, 馬里蘭州巴爾的摩(Baltimore, Md.) (1989);Chang等人, 《體細胞基因療法(Somatic Gene Therapy)》, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995);Vega等人, 《基因靶向(Gene Targeting)》, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995);《載體:分子選殖載體之調查及其用途(Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses)》, Butterworths, Boston Mass. (1988)及Gilboa等人 [《生物技術(Biotechniques) 4 (6): 504-512, 1986]中,且包含例如穩定或短暫轉染、脂質體轉染、電穿孔及經重組病毒載體感染。另外,關於正向-負向選擇方法,參見美國專利第5,464,764號及第5,487,992號。
在一個實施例中,經轉型細胞在允許表現較高量重組OXM之有效條件下培養。在另一實施例中,有效培養條件包含(但不限於)允許蛋白質產生之有效培養基、生物反應器、溫度、pH及氧條件。熟練的業內人士將瞭解,有效培養基涵蓋其中細胞經培養以產生本文揭示之重組OXM的任何培養基。在另一實施例中,培養基通常包含具有可同化之碳、氮及磷酸根來源以及適當鹽、礦物質、金屬及其他營養素(諸如維生素)之水溶液。在一個實施例中,本文揭示之細胞可在習知醱酵生物反應器、搖瓶、試管、微量滴定培養皿及皮氏培養盤(petri plate)中進行培養。在另一實施例中,培養在適於重組細胞之溫度、pH及氧含量下進行。在另一實施例中,培養條件在本領域之一般技術者之專門知識中。
在一個實施例中,視用於產生之載體及宿主系統而定,本文揭示之所得OXM保持在重組細胞內,分泌至醱酵培養基中,分泌至兩個細胞膜之間的空間中,諸如大腸桿菌中之周質空間;或保持在細胞或病毒膜之外表面上。
在一個實施例中,在培養預定時間之後,回收重組OXM。
熟練的業內人士將瞭解,短語「回收重組OXM」可涵蓋收集含有OXM之整個醱酵培養基,且無需隱含其他分離或純化步驟。
在另一實施例中,本文揭示之OXM可經化學修飾。詳言之,OXM之胺基酸側鏈、胺基端及/或羧酸端可經修飾。舉例而言,OXM可進行以下中之一或多者:烷基化、二硫化物形成、金屬錯合、醯化、酯化、醯胺化、硝化、用酸處理、用鹼處理、氧化或還原。用於進行此等過程之方法為本領域中所熟知。詳言之,OXM包括其低碳烷基酯、低碳烷基醯胺、低碳二烷基醯胺、酸加成鹽、羧酸鹽或鹼金屬加成鹽。詳言之,OXM之胺基或羧酸端可藉由例如酯化、醯胺化、醯化、氧化或還原衍生。詳言之,OXM之羧酸端可衍生形成醯胺部分。
在另一實施例中,修飾包含(但不限於)N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾,包含(但不限於)CH2
-NH、CH2
-S、CH2
-S=O、O=C-NH、CH2
-O、CH2
-CH2
、S=C-NH、CH=CH或CF=CH、主鏈修飾及殘基修飾。製備肽模擬化合物之方法為本領域中熟知且例如說明於《定量藥物設計(Quantitative Drug Design)》, C.A. Ramsden Gd., 第17.2章, F. Choplin Pergamon Press (1992)中,所述文獻以引用的方式併入,就如同本文中充分闡述一般。下文揭示在此方面之其他細節。
在另一實施例中,肽內之肽鍵(-CO-NH-)經取代。在一些實施例中,肽鍵經N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)取代。在另一實施例中,肽鍵經酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在另一實施例中,肽鍵經酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)取代。在另一實施例中,肽鍵經α-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-,其中R為任何烷基,例如甲基)、卡巴鍵(carba bond)(-CH2-NH-)取代。在另一實施例中,肽鍵經羥基伸乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)取代。在另一實施例中,肽鍵經硫代醯胺鍵(-CS-NH-)取代。在一些實施例中,肽鍵經烯烴雙鍵(-CH=CH-)取代。在另一實施例中,肽鍵經逆醯胺鍵(-NH-CO-)取代。在另一實施例中,肽鍵經肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代,其中R為碳原子上天然呈現之「正常」側鏈。在一些實施例中,此等修飾出現於沿著肽鏈之任一鍵處且甚至同時出現於若干(2-3個鍵)處。
在一個實施例中,用合成非天然酸取代蛋白質之天然芳族胺基酸(諸如Trp、Tyr及Phe),所述合成非天然酸為諸如苯基甘胺酸、TIC、萘基丙胺酸(Nol)、Phe之環甲基化衍生物、Phe之鹵化衍生物或鄰甲基-Tyr。在另一實施例中,本文揭示之肽包含一或多個經修飾之胺基酸或一或多個非胺基酸單體(例如脂肪酸、複雜碳水化合物等)。
與野生型OXM相比,本文揭示之OXM衍生物或變異體含有若干胺基酸取代,及/或可聚乙二醇化或者以其他方式修飾(例如以重組方式或化學方式)。
本文揭示之OXM亦涵蓋以上OXM序列之任何類似物。序列中之任一或多個胺基酸殘基可獨立地經如本領域中熟知之保守替換物替換,亦即用類似化學類型之一替換胺基酸,諸如用另一疏水性胺基酸替換一疏水性胺基酸。或者,可進行非保守胺基酸突變,使得OXM之作用或生物活性增強。在一個實施例中,OXM經修飾以抵抗二肽基肽酶IV(DPP-IV)對其進行裂解及不活化。OXM之衍生物及變異體及其產生方法揭示於美國專利第8,367,607號、美國專利申請公開案第2011/0034374號及美國專利第7,928,058號中,所述文獻均以引用的方式併入本文中。
熟練的業內人士將瞭解,術語「胺基酸(amino acid)」或「胺基酸(amino acids)」可涵蓋20種天然存在之胺基酸;通常在活體內經轉譯後修飾之彼等胺基酸,包含例如羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸及磷酸蘇胺酸;及其他非尋常胺基酸,包含(但不限於)2-胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈素、正纈胺酸、正白胺酸及鳥胺酸。在一個實施例中,「胺基酸」包含D-胺基酸與L-胺基酸。應瞭解,亦可使用其他合成胺基酸或經修飾之胺基酸。
在一個實施例中,本文揭示之調酸素(OXM)使用多種標準蛋白質純化技術純化,諸如(但不限於)親和層析、離子交換層析、過濾、電泳、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析、逆相層析法、伴刀豆球蛋白A層析、層析聚焦及差異溶解。
在一個實施例中,為促進回收,所表現之編碼序列可經工程改造以編碼本文揭示之蛋白質且融合可裂解部分。在一個實施例中,融合蛋白可經設計,使得蛋白質可容易藉由親和層析分離;例如藉由固定在對可裂解部分具有特異性之管柱上。在一個實施例中,裂解位點在蛋白質與可裂解部分之間經工程改造,且蛋白質可藉由在此位點處用特異性裂解融合蛋白之適當酶或試劑處理而自層析管柱釋放[例如參見Booth等人, 《免疫學快報(Immunol. Lett.)》 19:65-70 (1988);及Gardella等人, 《生物化學雜誌(J. Biol. Chem.) 265:15854-15859 (1990)]。在另一實施例中,本文揭示之OXM以「基本上純」形式取回。熟練的業內人士將瞭解,短語「基本上純」可涵蓋允許在本文所述之應用中有效使用OXM之純度。
在一個實施例中,本文揭示之OXM亦可使用活體外表現系統合成。在一個實施例中,活體外合成方法為本領域中熟知且系統之組分可購得。
在另一實施例中,藉由量測如本文所描述之天然、重組及/或可逆聚乙二醇化OXM以及包括其之醫藥組合物治療或改善諸如(但不限於)糖尿病、肥胖症、飲食障礙、代謝病症等疾病或病狀的能力來確定活體外結合活性。在另一實施例中,藉由所治療之疾病之已知量度來推斷活體內活性。
在另一實施例中,OXM-PEG-與連接子之莫耳比為1:1:1-1:1:3.5。在另一實施例中,莫耳比為1:1:1-1:1:10.0。在另一實施例中,連接子之較高比率允許結合物之產率最佳化。
在另一實施例中,PEG聚合物經由視情況經取代之Fmoc或FMS附接於調酸素之胺基端或離胺酸殘基。熟練的業內人士將瞭解,術語「附接」及「連接」可互換使用,均具有相同含義及品質。在另一實施例中,PEG聚合物連接於OXM之α-胺基側鏈。在另一實施例中,PEG聚合物連接於OXM之ε-胺基側鏈。在另一實施例中,PEG聚合物連接於OXM之一或多個ε-胺基側鏈。在另一實施例中,PEG聚合物包括硫氫基部分。
在另一實施例中,PEG係線性。在另一實施例中,PEG係分支。在另一實施例中,PEG具有在200至200,000 Da範圍內之分子量。在另一實施例中,PEG具有在5,000至80,000 Da範圍內之分子量。在另一實施例中,PEG具有在5,000至40,000 Da範圍內之分子量。在另一實施例中,PEG具有在20,000 Da至40,000 Da範圍內之分子量。在一個實施例中,PEG30
包括平均分子量為30,000 Da之PEG。PEG40
包括平均分子量為40,000 Da之PEG。 生物活性
在另一實施例中,本文揭示之可逆聚乙二醇化OXM使得OXM成為長效OXM。在另一實施例中,長效調酸素為具有延長生物半衰期之調酸素。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化使OXM避免降解。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化使得OXM避免經DPPIV降解。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化影響OXM之Cmax
且降低與本文揭示之結合物投與相關之副作用。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化延長OXM之Tmax
。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化延長OXM之循環半衰期。在另一實施例中,與未經修飾之OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM之生物可用性得到提高。在另一實施例中,與未經修飾之OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM之生物活性得到提高。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化增強OXM之效能。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM之胰島素敏感性得到提高。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM劑量依賴性地減少終末葡萄糖。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM劑量依賴性地減少胰島素。
在其他實施例中,就生物化學量度而言,本文揭示之可逆聚乙二醇化OXM至少與未經修飾之OXM同等。在其他實施例中,就藥理學量度而言,可逆聚乙二醇化OXM至少與未經修飾之OXM同等。在其他實施例中,就結合能力(Kd)而言,可逆聚乙二醇化OXM至少與未經修飾之OXM同等。在其他實施例中,就消化系統之吸收而言,可逆聚乙二醇化OXM至少與未經修飾之OXM同等。在其他實施例中,可逆聚乙二醇化OXM在經消化系統吸收期間比未經修飾之OXM更穩定。
在另一實施例中,與游離OXM相比,本文揭示之可逆聚乙二醇化OXM展現提高之血液曲線下面積(AUC)水準。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM展現提高之生物活性及血液曲線下面積(AUC)水準。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM展現提高之血液滯留時間(t1/2
)。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM展現提高之生物活性及血液滯留時間(t1/2
)。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM展現提高之血液Cmax
水準,其中在另一實施例中,此引起更緩慢之釋放過程,從而降低與本文揭示之可逆聚乙二醇化組合物投與相關之副作用。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM展現提高之生物活性及血液Cmax
水準。在另一實施例中,本文揭示一種提高OXM之AUC、Cmax
、t1/2
、生物活性或其任何組合的方法,所述方法包括以下步驟或由以下步驟組成:經由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS),將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)結合於游離OXM之胺基端。
在另一實施例中,藉由聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於游離OXM之胺基端提高OXM之AUC、Cmax
、t1/2
、生物活性或其任何組合能夠降低OXM之給藥頻率。在另一實施例中,本文揭示一種降低OXM之給藥頻率的方法,所述方法包括以下步驟或由以下步驟組成:經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS),將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)結合於OXM之胺基端或離胺酸殘基。在另一實施例中,本文揭示之OXM之可逆聚乙二醇化有利地允許使用較低劑量。在一個實施例中,本文揭示之長效OXM維持未經修飾之OXM之生物活性。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM包括OXM生物活性。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減少消化分泌物。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減少及延遲胃排空。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制小腸中之饋送蠕動模式。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制由五肽胃泌素刺激之酸分泌。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括增加胃生長抑素釋放。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括增強肽YY之作用。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制胃饑餓素釋放。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括刺激胺基比林(aminopyrine)聚積及cAMP產生。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括結合GLP-1受體。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括結合升糖素受體。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括藉由活化腺苷酸環化酶來刺激H+產生。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制組胺刺激之胃酸分泌。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制食物攝入。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括刺激胰島素釋放。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括抑制外分泌胰臟分泌。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括增加胰島素敏感性。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括降低葡萄糖含量。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減少終末葡萄糖。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減少胰島素。
在一個實施例中,本文揭示之延長調酸素之生物半衰期的方法由以下步驟組成:將調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)以1:1:1之莫耳比結合,其中在另一實施例中,PEG聚合物經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基或位置30號上的離胺酸殘基或胺基端。
在另一實施例中,本文揭示之延長調酸素之生物半衰期的方法由以下步驟組成:將調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)以1:1:1之莫耳比結合,其中所述PEG聚合物經由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基。
在另一實施例中,本文揭示之延長調酸素之生物半衰期的方法由以下步驟組成:將調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)以1:1:1之莫耳比結合,其中所述PEG聚合物經由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於所述調酸素之胺基酸序列之位置30號上的離胺酸殘基。
在另一實施例中,本文揭示之延長調酸素之生物半衰期的方法由以下步驟組成:將調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)以1:1:1之莫耳比結合,其中所述PEG聚合物經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於所述調酸素之胺基酸序列之胺基端。
在一個實施例中,本文揭示之提高調酸素之曲線下面積(AUC)的方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基或位置30號上的離胺酸殘基或胺基端。
在另一實施例中,本文揭示之提高調酸素之曲線下面積(AUC)的方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基。
在一個實施例中,本文揭示之提高調酸素之曲線下面積(AUC)的方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置30號上的離胺酸殘基。
在一個實施例中,本文揭示之提高調酸素之曲線下面積(AUC)的方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之胺基端。
在一個實施例中,本文揭示一種降低調酸素之給藥頻率之方法,所述方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基或位置30號上的離胺酸殘基或胺基端。
在另一實施例中,本文揭示一種降低調酸素之給藥頻率之方法,所述方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置12號上的離胺酸殘基。
在另一實施例中,本文揭示一種降低調酸素之給藥頻率之方法,所述方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之位置30號上的離胺酸殘基。
在另一實施例中,本文揭示一種降低調酸素之給藥頻率之方法,所述方法由以下步驟組成:將聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)經由視情況經取代之9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)結合於調酸素之胺基酸序列之胺基端。
在另一實施例中,本文揭示之用於減少個體之食物攝入的方法包括投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之用於減輕個體體重之方法包括向個體投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之用於改善個體之血糖控制的方法包括投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之用於改善個體之血糖及脂質型態的方法包括投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之用於改善個體之血糖型態的方法包括向個體投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之用於改善個體之脂質型態的方法包括向個體投與本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
本文揭示之胺基變異體,例如其中FMS經由末端胺基連接於OXM之變異體,意外地實現食物攝入減少、體重控制及血糖控制,如本文中所例示(參見實例5)。在一個實施例中,本文揭示之OXM肽之PEG修飾意外地不干擾OXM功能。
在另一實施例中,本文揭示之用於改善個體之膽固醇含量的方法包括向個體投與有效量之本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。在另一實施例中,改善膽固醇含量包括降低個體之LDL膽固醇,同時增加HDL膽固醇。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於200 mg/dL,但超過0 mg/dL。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至約100-129 mg/dL。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於100 mg/dL,但超過0 mg/dL。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於70 mg/dL,但超過0 mg/dL。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於5.2 mmol/L,但超過0 mmol/L。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至約2.6-3.3 mmol/L。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於2.6 mmol/L,但超過0 mmol/L。在另一實施例中,LDL膽固醇含量減至低於1.8 mmol/L,但超過0 mmol/L。
在另一實施例中,本文揭示之用於降低個體之胰島素抗性的方法包括向個體投與有效量之本文揭示之結合物的步驟。在另一實施例中,結合物由式I-IV
之結構表示。
在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括經由迷走神經間接機制抑制胰臟分泌。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減少經由小腸之水礦物運送。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括刺激葡萄糖攝入。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括控制/刺激生長抑素分泌。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括食物攝入與體重增加兩者的降低。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括肥胖減少。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括食慾抑制。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括改善血糖及脂質型態。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括誘導食慾喪失。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括減輕超重及肥胖個體之體重。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性包括誘導脂肪激素瘦素及脂聯素之含量變化。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM之生物活性除減少超重及肥胖個體之能量攝取外亦包括增加能量消耗。在另一實施例中,本文揭示之長效OXM為式I-IV
之結合物。 製備方法
在一個實施例中,使用聚乙二醇化劑製備本文揭示之長效OXM,所述聚乙二醇化劑意謂能夠與諸如(但不限於)NH2
、OH、SH、COOH、CHO、--N=C=O、--N=C=S、--SO2
Cl、--SO2
CH=CH2
、--PO2
Cl、--(CH2
)xHal之存在於Fmoc或FMS部分之茀環上的官能基反應之任何PEG衍生物。在另一實施例中,聚乙二醇化劑通常呈其單甲氧基化形式使用,在甲氧基化形式中僅僅PEG分子一端之一個羥基可用於結合。在另一實施例中,舉例而言,若需要獲得其中兩個肽或蛋白質殘基共價附接於單個PEG部分之結合物,則可使用其中兩個末端均可用於結合之PEG之雙官能形式。
在另一實施例中,分支PEG表示為R(PEG-OH)m
,其中R表示中央核心部分,諸如季戊四醇或丙三醇,且m表示分支臂之數目。分支臂之數目可在三至一百或更多之範圍內。在另一實施例中,羥基進行化學修飾。在另一實施例中,分支PEG分子描述於美國專利第6,113,906號、第5,919,455號、第5,643,575號及第5,681,567號中,該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在另一實施例中,本文揭示一種OXM,其具有未直接附接於OXM之PEG部分(如標準聚乙二醇化程序中),而是PEG部分經由諸如視情況經取代之Fmoc或FMS之連接子附接。在另一實施例中,連接子對鹼高度敏感且在溫和鹼性條件下可移除。在另一實施例中,經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接於PEG的OXM活性與游離OXM同等。在另一實施例中,經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接於PEG的OXM活性比游離OXM大。在另一實施例中,經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接於PEG的OXM活性不同於游離OXM。在另一實施例中,經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接於PEG的OXM不同於游離OXM,其無中樞神經系統活性。在另一實施例中,經由視情況經取代之Fmoc或FMS連接於PEG的OXM不同於游離OXM,無法穿過血腦屏障進入大腦。在另一實施例中,與游離OXM相比,經由Fmoc或FMS連接於PEG的OXM包括延長之循環半衰期。在另一實施例中,經由Fmoc或FMS連接於PEG的OXM失去其PEG部分連同Fmoc或FMS部分,因此回收游離OXM。
在另一實施例中,OXM之聚乙二醇化及(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM或(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM結合物之製備包含將MAL-FMS-NHS或MAL-Fmoc-NHS附接於OXM之胺組分,因此獲得MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM結合物,且接著使PEG-SH與MAL-FMS-OXM上之順丁烯二醯亞胺部分反應,分別產生PEG-S-MAL-FMS-OXM或PEG-S_MAL-Fmoc-OXM、(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM結合物。
在另一實施例中,MAL-Fmoc-NHS由以下結構表示:。
在另一實施例中,MAL-FMS-NHS由以下結構表示。
在一個實施例中,SO3
H在茀之位置2處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置3處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在另一實施例中,MAL-Fmoc-OXM由以下結構表示:。
在另一實施例中,MAL-FMS-OXM由以下結構表示:。
在一個實施例中,SO3
H在茀之位置2處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置3處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在另一實施例中,(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM由以下結構表示:。
在另一實施例中,(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM由以下結構表示:。
在一個實施例中,SO3
H在茀之位置2處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置3處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
在另一實施例中,OXM之聚乙二醇化包含使MAL-FMS-NHS或MAL-Fmoc-NHS與PEG-SH反應,因此形成PEG-S-MAL-FMS-NHS或PEG-S-MAL-Fmoc-NHS結合物,且接著使其與OXM之胺組分反應,分別產生所需(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM結合物。在另一實施例中,諸如OXM之肽/蛋白質之聚乙二醇化描述於美國專利第7,585,837號中,所述專利以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中,用Fmoc或FMS對諸如OXM之肽/蛋白質進行可逆聚乙二醇化描述於美國專利第7,585,837號中。
在另一實施例中,PEG-S-MAL-Fmoc-NHS由以下結構表示:。
在另一實施例中,PEG-S-MAL-FMS-NHS由以下結構表示:。
在一個實施例中,SO3
H在茀之位置2處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置3處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置4處。在另一實施例中,SO3
H在茀之位置1、2、3或4處或其任何組合。
熟練的業內人士將瞭解,短語「長效OXM」及「可逆聚乙二醇化OXM」可互換使用且涵蓋本文揭示之結合物。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM由在本文中由下式標識之PEG-FMS-OXM及PEG-Fmoc-OXM構成:(PEG-FMS)n-OXM或(PEG-Fmoc)n-OXM,其中n為至少一之整數,且OXM經由至少一個胺基連接於FMS或Fmoc基團。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM由在本文中由下式標識之PEG-S-MAL-FMS-OXM及PEG-S-MAL-Fmoc-OXM構成:(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM,其中n為至少一之整數,且OXM經由至少一個胺基連接於FMS或Fmoc基團。
在一個實施例中,本文揭示的用於製備PEG-S-MALFmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM(其中所述OXM之胺基端連接於Fmoc或FMS且其中所述OXM由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr- Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp- Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]組成)的方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM:MAL-Fmoc-NHS 或MAL-FMS-NHS 與其中所述調酸素之胺基殘基經保護之調酸素樹脂反應;獲得MAL-Fmoc-經保護之OXM或MAL-FMS-經保護之OXM,其中所述調酸素之胺基殘基分別經保護,接著與硫氫基PEG聚合物(PEG-SH)反應,其中在所述與PEG-SH之反應之後或之前移除所述保護基及樹脂;獲得PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM,其中所述OXM之胺基端連接於Fmoc或FMS。
在一個實施例中,本文揭示的用於製備PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM結合物(其中所述OXM之Lys12之所述胺基殘基連接於所述Fmoc或FMS且所述調酸素(OXM)由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr- Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]組成)的方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM:MAL-Fmoc-NHS 或MAL-FMS-NHS 與其中所述調酸素之胺基殘基(不包含Lys12)及His1
之胺基端經保護的調酸素樹脂反應;獲得MAL-Fmoc-經保護之OXM或MAL-FMS-經保護之OXM,其中所述調酸素之胺基殘基(不包含Lys12)及His1
之胺基端分別經保護;接著與硫氫基PEG聚合物(PEG-SH)反應,其中在與所述PEG-SH之反應之後或之前移除所述保護基及所述樹脂;得到PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MAL-FMS-OXM,其中所述OXM之Lys12之所述胺基殘基連接於所述Fmoc或FMS。
在一個實施例中,本文揭示的用於製備PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM結合物(其中所述OXM之Lys30之所述胺基殘基連接於所述Fmoc或FMS且所述調酸素(OXM)由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr- Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]組成)的方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM:MAL-Fmoc-NHS 或MAL-FMS-NHS 與其中所述調酸素之胺基殘基(不包含Lys30)及His1
之胺基端經保護的調酸素樹脂反應;獲得MAL-Fmoc-經保護之OXM或MAL-FMS-經保護之OXM,其中所述調酸素之胺基殘基(不包含Lys30)及His1
之胺基端分別經保護;接著與硫氫基PEG聚合物(PEG-SH)反應,其中在與所述PEG-SH之反應之後或之前移除所述保護基及所述樹脂;得到PEG-S-MALFmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM,其中所述OXM之Lys12之所述胺基殘基連接於所述Fmoc或FMS。
在另一實施例中,PEG-S-MALFmoc或PEG-S-MALFMS結合於OXM之Lys12或Lys30或胺基端不會使OXM失活。
在一個實施例中,Lys12變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制體重。在另一實施例中,本文揭示之Lys30變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制體重。在另一實施例中,本文揭示之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制體重。
在一個實施例中,Lys12變異體比本文揭示之其他變異體更有效地實現長期血糖控制。在另一實施例中,本文揭示之Lys30變異體比本文揭示之其他變異體更有效地實現長期血糖控制。在另一實施例中,本文揭示之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制血糖。
在其他實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制體重。在其他實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地控制血糖。在另一實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地減輕體重。在另一實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地減少累積食物攝入。在另一實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地減少血漿葡萄糖攝入。在另一實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地提高葡萄糖耐受性。在另一實施例中,PEG30-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地減少終末血漿膽固醇含量。
在一個實施例中,PEG-S-MAL-Fmoc-OXM有效地減少終末血漿果糖胺含量。在另一實施例中,PEG-EMCS-OXM有效地減少終末血漿果糖胺含量。在另一實施例中,PEG30-S-MAL-FMS-OXM之胺基變異體有效地減少終末血漿果糖胺含量。在另一實施例中,PEG30-S-MAL-FMS-OXM之胺基變異體比本文揭示之其他變異體更有效地減少終末血漿果糖胺含量。 醫藥調配物、醫藥組合物及使用方法
在一個實施例中,本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素結合物可本身投與個體。在一個實施例中,本文揭示之結合物可作為醫藥組合物或醫藥調配物之一部分投與個體,其中其與醫藥學上可接受之載劑混合。
熟練的業內人士將瞭解,術語「醫藥調配物」可涵蓋本文所述之一或多種活性成分與其他化學組分(諸如生理學上適合之載劑及賦形劑)之製劑。「醫藥調配物」之目的為促進化合物投與生物體。另外,熟練的業內人士將瞭解,術語「醫藥組合物」可涵蓋本文所述之一或多種活性成分與其他化學組分(諸如生理學上適合之載劑及賦形劑)之製劑。醫藥組合物之目的為促進化合物投與生物體。在某些實施例中,「醫藥組合物」或「醫藥調配物」涵蓋藥物之藥學劑型。在某些實施例中,「醫藥組合物」或「醫藥調配物」可包括緩慢釋放技術、經皮貼片或本領域中之任何已知劑型。
在一個實施例中,本文揭示一種醫藥調配物,其包括緩衝液、張力劑及本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素(OXM)結合物。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM由OXM、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。在另一實施例中,OXM結合物由式I-IV
表示。
在一個實施例中,本文揭示一種醫藥組合物,其包括緩衝液、張力劑及本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素(OXM)結合物。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM由OXM、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述OXM之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。在另一實施例中,OXM結合物由式I-IV
表示。
在另一實施例中,包括本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素(OXM)結合物之醫藥組合物或醫藥調配物包括具有硫氫基部分之PEG聚合物。在另一實施例中,包括本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素(OXM)結合物之醫藥組合物或醫藥調配物包括其中所述PEG聚合物為PEG30之PEG聚合物。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括其中所述PEG聚合物為PEG40之PEG聚合物。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括其中所述PEG聚合物為PEG50之PEG聚合物。在另一實施例中,包括本文揭示之可逆聚乙二醇化調酸素(OXM)結合物之醫藥組合物或醫藥調配物包括含有SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列的OXM。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物包括由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列組成的OXM。
在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於預防高血糖症、提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、改善血糖控制、治療選自由以下組成之群的糖尿病或其任何組合:非胰島素依賴性糖尿病(在一個實施例中,2型糖尿病)、胰島素依賴性糖尿病(在一個實施例中,1型糖尿病)及妊娠期糖尿病。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物用於治療2型糖尿病。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加對胰島素之敏感性。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低胰島素抗性。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加能量消耗。
在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於抑制食慾。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於誘發飽腹感。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於減輕體重。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於減少體脂肪。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低身體質量指數。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於減少食物消耗。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於治療肥胖症。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於治療與肥胖症相關之糖尿病。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加心率。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加基礎代謝率(BMR)。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加能量消耗。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於提高葡萄糖耐受性。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於改善血糖及脂質型態。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於改善血糖控制。熟練的業內人士將瞭解,術語「血糖控制」涵蓋非高及/或非波動血糖含量及/或非高及/或非波動糖基化血紅蛋白含量。
在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於抑制體重增加,其中在另一實施例中,體重增加由脂肪增加引起。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低血糖含量。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於減少熱量攝入。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低食慾。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於控制體重。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於誘發或促進體重減輕。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於維持所需體重、所需身體質量指數、所需外型及良好健康中之任一或多者。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於控制脂質型態。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低三酸甘油酯含量。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低丙三醇含量。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加脂聯素含量。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低游離脂肪酸含量。
熟練的業內人士將瞭解,短語「降低含量」可涵蓋相對於原始、野生型、正常或對照含量,降低約1-10%。在另一實施例中,降低約11-20%。在另一實施例中,降低約21-30%。在另一實施例中,降低約31-40%。在另一實施例中,降低約41-50%。在另一實施例中,降低約51-60%。在另一實施例中,降低約61-70%。在另一實施例中,降低約71-80%。在另一實施例中,降低約81-90%。在另一實施例中,降低約91-95%。在另一實施例中,降低約96-100%。
熟練的業內人士將瞭解,短語「增加含量」或「延長」可涵蓋相對於原始、野生型、正常或對照含量,增加約1-10%。在另一實施例中,增加約11-20%。在另一實施例中,增加約21-30%。在另一實施例中,增加約31-40%。在另一實施例中,增加約41-50%。在另一實施例中,增加約51-60%。在另一實施例中,增加約61-70%。在另一實施例中,增加約71-80%。在另一實施例中,增加約81-90%。在另一實施例中,增加約91-95%。在另一實施例中,增加約96-100%。
在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於降低膽固醇含量。在一個實施例中,膽固醇含量之降低超過投與天然OXM後觀測到之降低。在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物使膽固醇含量下降60-70%。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物使膽固醇含量下降50-100%。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物使膽固醇含量下降25-90%。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物使膽固醇含量下降50-80%。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物使膽固醇含量下降40-90%。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物用於增加HDL膽固醇含量。
在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物可用於達成本文描述之目的,而在投與過程期間不會顯著降低效力。在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達1天。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達2-6天。在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達1週。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達2週。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達3週。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達4週。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達6週。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達2個月。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達4個月。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達6個月。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物保持有效達1年或更長時間。
在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物可用於達成本文描述之目的且可在投與第一劑量後即刻有效。
在一個實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物在投與兩劑或更多劑後有效。在另一實施例中,本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物藉由使FMS或Fmoc連接子自OXM化學水解,將OXM釋放至生物流體中。在另一實施例中,生物流體為血液、血清或腦脊髓液或其任何組合。在另一實施例中,使FMS或Fmoc連接子水解發生在生理條件下,例如在37℃下pH 7。
在另一實施例中,如上文所描述的利用本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物的方法應用於罹患可藉由OXM緩解、抑制及/或治療之疾病或病狀的人類個體。在另一實施例中,如上文所描述的利用本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物的方法為獸醫學方法。在另一實施例中,如上文所描述的利用本文揭示之結合物及包括其之醫藥組合物或醫藥調配物的方法應用於動物,諸如農畜、寵物及實驗室動物。因此,在一個實施例中,本文揭示之個體為貓科動物、犬科動物、牛類動物、豬類動物、鼠類、馬類動物等。
在另一實施例中,本文揭示一種治療或減輕個體的可利用OXM或包括其之醫藥調配物或醫藥組合物治療或減輕之疾病的方法,其包括以下步驟:向個體投與治療有效量之本文揭示之結合物,從而治療或減輕個體之可利用OXM治療或減輕之疾病。
熟練的業內人士將瞭解,如本文所用之OXM、「肽」或「蛋白質」涵蓋天然肽(降解產物、以合成方式合成之蛋白質或重組蛋白)及肽模擬物(通常為以合成方式合成之蛋白質)以及類肽及半類肽(其為蛋白質類似物),在一些實施例中其具有修飾,使得蛋白質在體內時更穩定或更能夠滲透至細胞中。
熟練的業內人士將瞭解,術語「PEG-Fmoc-OXM及/或PEG-FMS-OXM變異體」涵蓋本文揭示之結合物。在另一實施例中,「PEG-Fmoc-OXM及/或PEG-FMS-OXM變異體」分別涵蓋PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MAL-FMS-OXM且為本文揭示之結合物。在另一實施例中,本文揭示之結合物由式I-IV
表示。在另一實施例中,本文揭示之結合物為經由FMS或Fmoc之連接PEG的OXM,其中OXM經由OXM之Lys12或經由OXM之Lys30或經由OXM之胺基端連接於FMS或Fmoc。在另一實施例中,醫藥組合物包括呈可注射溶液中0.005至0.1 mg/kg之間的本文揭示之OXM肽。在另一實施例中,醫藥組合物包括0.005至0.5 mg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥組合物包括0.05至0.1 μg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括呈可注射溶液中0.005至0.1 mg/kg之間的本文揭示之OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括0.005至0.5 mg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括0.05至0.1 μg/kg OXM肽。
在另一實施例中,醫藥組合物包括呈可注射溶液中0.005至5.0 mg/kg之間的本文揭示之OXM肽。在另一實施例中,醫藥組合物包括0.5至5.0 mg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥組合物包括0.5至1.0 mg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括呈可注射溶液中0.5至2.0 mg/kg之間的本文揭示之OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括0.5至3.0 mg/kg OXM肽。在另一實施例中,醫藥調配物包括0.5至4.0 mg/kg OXM肽。
在另一實施例中,可注射溶液包括供靜脈內(IV)使用之溶液。在另一實施例中,可注射溶液包括供皮下(SC)使用之溶液。在另一實施例中,可注射溶液包括供肌肉內(IM)使用之溶液。
在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物一日投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每36小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每48小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每60小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每72小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每84小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每96小時投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每5天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每6天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每7天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每週投與。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每8-10天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每10-12天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每12-15天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每15-25天投與一次。在另一實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物每兩週投與一次。
在一個實施例中,包括本文揭示之結合物的醫藥組合物或醫藥調配物藉由肌肉內(IM)注射、皮下(SC)注射或靜脈內(IV)注射來投與。在另一實施例中,投與係藉由肌肉內(IM)注射。在另一實施例中,投與係藉由皮下(SC)注射。在另一實施例中,投與係藉由靜脈內(IM)注射。在另一實施例中,藉由IM、SC或IV一週投與一次。在另一實施例中,藉由IM、SC或IV每兩週投與一次。
在另一實施例中,本文揭示之結合物可本身投與個體。在一個實施例中,本文揭示之可逆聚乙二醇化OXM可作為醫藥組合物或醫藥調配物之一部分投與個體,其中其與醫藥學上可接受之載劑混合。
熟練的業內人士將瞭解,「醫藥組合物」或「醫藥調配物」可涵蓋如本文所描述之長效OXN與其他化學組分(諸如生理學上適合之載劑及賦形劑)之製劑。醫藥組合物或醫藥調配物之目的係促進化合物投與生物體。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM發揮生物作用。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物包括本文揭示之結合物、醫藥學上可接受之載劑及賦形劑。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物包括本文揭示之結合物、緩衝液及張力劑。
在另一實施例中,任一本文揭示之組合物或調配物將至少包括可逆聚乙二醇化OXM。在一個實施例中,本文揭示組合製劑。熟練的業內人士將瞭解,「組合製劑」可尤其涵蓋「多部分套組」,意為如上文所揭示之組合搭配物可獨立地或藉由使用與區別量之組合搭配物的不同固定組合來給與,亦即同時、並行、分開或依序給與。在一些實施例中,多部分套組之各部分可接著例如同時投與或按時間順序錯開,亦即對於多部分套組之任一部分而言,在不同時間點且時間間隔相等或不同。在一些實施例中,組合搭配物之總量的比率可在組合製劑中投與。在一個實施例中,組合製劑可改變,例如以便應對待治療之患者亞群的需求或單個患者之需求,所述不同需求可歸因於具體疾病、疾病之嚴重程度、年齡、性別或體重,如可由本領域中熟習此項技術者易於作出。
熟練的業內人士將瞭解,短語「生理學上可接受之載劑」與「醫藥學上可接受之載劑」可互換使用且可涵蓋不會對生物體造成顯著刺激且不會消除所投化合物之生物活性及特性的載劑或稀釋劑。佐劑包含在此等短語下。在一個實施例中,包含於醫藥學上可接受之載劑中之成分之一可為例如聚乙二醇(PEG),聚乙二醇為一種在有機及水性介質中均具有廣泛範圍之溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等人 (1979))。
熟練的業內人士將瞭解,術語「賦形劑」可涵蓋添加至醫藥組合物中以進一步促進長效OXN投與之惰性物質。在一個實施例中,賦形劑包含碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖及各類澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油及聚乙二醇。
用於調配及投與藥物之技術見於《雷明頓藥學科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版中,所述出版物以引用的方式併入本文中。
在另一實施例中,適合投與本文揭示之肽的途徑例如包含口腔、直腸、經黏膜、經鼻、腸或非經腸傳遞,包含肌肉內、皮下及髓內注射,以及鞘內、直接室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。
本文揭示一種可逆聚乙二醇化OXM,其用於製造藉由大腦周圍途徑投與以用於任一上述治療方法之藥物。周圍途徑之實例包含口腔、直腸、非經腸(例如靜脈內、肌肉內或腹膜內)、經黏膜(例如經頰、舌下、經鼻、皮下或經皮投與)投與,包含藉由吸入投與。以下給出OXM用於藥物之較佳劑量。
本文揭示一種包括可逆聚乙二醇化OXM及醫藥學上適合載劑之醫藥組合物或醫藥調配物,其呈適合於經口、經直腸、非經腸(例如靜脈內、肌肉內或腹膜內)、經黏膜(例如經頰、舌下、經鼻、皮下或經皮投與)投與之形式,包含藉由吸入投與。若呈單位劑型,則每單元之劑量可例如如下所述或如以下給出,基於每公斤劑量計算。
在另一實施例中,製劑以局部而非全身方式,例如經由將製劑直接注射至患者身體之特定區域來投與。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM調配成鼻內劑型。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM調配成可注射劑型。
涵蓋劑量範圍之各種實施例,例如:可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每3天投與(僅僅提供可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM重量,因為PEG之尺寸可在很大程度上不同)。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每7天投與。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每10天投與。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每14天投與。在另一實施例中,意外地,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物中OXM之有效量為游離OXM之有效量之1/4-1/10。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少50%。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少70%。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少75%。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少80%。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少85%。在另一實施例中,意外地,OXM之可逆聚乙二醇化能夠限制規定投與患者之OXM之量為與游離OXM相比至少90%。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每3天投與一次(僅僅提供可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM重量,因為PEG之尺寸可在很大程度上不同)。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每7天投與一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每10天投與一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍每14天投與一次。
在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM使有效給藥頻率降低至少2倍,且使有效每週劑量降低至少2倍,因此限制不良事件之風險且增加對OXM療法之使用的順應性。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM使有效給藥頻率降低至少3倍,且使有效每週劑量降低至少3倍,因此限制不良事件之風險且增加對OXM療法之使用的順應性。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM使有效給藥頻率降低至少4倍,且使有效每週劑量降低至少4倍,因此限制不良事件之風險且增加對OXM療法之使用的順應性。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM使有效給藥頻率降低至少5倍,且使有效每週劑量降低至少5倍,因此限制不良事件之風險且增加對OXM療法之使用的順應性。在另一實施例中,與游離OXM相比,可逆聚乙二醇化OXM使有效給藥頻率降低至少6倍,且使有效每週劑量降低至少6倍,因此限制不良事件之風險且增加對OXM療法之使用的順應性。在另一實施例中,有效給藥頻率及有效每週劑量係基於:(1)可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內所投OXM組分之重量;以及(2)游離OXM(未經修飾之OXM)組合物或調配物內所投OXM組分之重量。
在另一實施例中,本文所揭示之方法包含增加罹患需要OXM療法之慢性疾病之患者的順應性。在另一實施例中,本文所揭示之方法能夠藉由如上文所描述將OXM可逆聚乙二醇化來降低OXM之給藥頻率。在另一實施例中,本文所揭示之方法包含藉由降低OXM之投與頻率來增加需要OXM療法之患者的順應性。在另一實施例中,OXM之投與頻率降低歸功於使OXM更穩定且更有效之可逆聚乙二醇化而實現。在另一實施例中,OXM之投與頻率降低由於OXM之T1/2增加而實現。在另一實施例中,OXM之投與頻率降低由於OXM之血液清除降低而實現。在另一實施例中,OXM之投與頻率降低由於OXM之T1/2增加而實現。在另一實施例中,OXM之投與頻率降低由於OXM之AUC量度增加而實現。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM一日投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每兩天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每三天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每四天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每五天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每六天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每週投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每7-14天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每10-20天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每5-15天投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每兩週投與個體一次。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM每15-30天投與個體一次。
在一個實施例中,經口投與包括單位劑型,所述單位劑型包括錠劑、膠囊、口含錠、咀嚼錠劑、懸浮液、乳液及其類似物。此類單位劑型包括安全且有效之量的本文揭示之OXM,所述各量在一個實施例中為約0.7或3.5 mg至約280 mg/70 kg,或在另一實施例中,約0.5或10 mg至約210 mg/70 kg。適用於製備用於經口投與之單位劑型的醫藥學上可接受之載劑為本領域中熟知。在一些實施例中,錠劑通常包括習知醫藥學上相容之佐劑作為惰性稀釋劑,諸如碳酸鈣、碳酸鈉、甘露糖醇、乳糖及纖維素;黏合劑,諸如澱粉、明膠及蔗糖;崩解劑,諸如澱粉、海藻酸及交聯羧甲纖維素;潤滑劑,諸如硬脂酸鎂、硬脂酸及滑石。在一個實施例中,諸如二氧化矽之助流劑可用以改善粉末混合物之流動特徵。在一個實施例中,諸如FD&C染料之著色劑可出於外觀而添加。甜味劑及調味劑,諸如阿斯巴甜糖、糖精、薄荷醇、胡椒薄荷及水果調味劑為適用於咀嚼錠劑之佐劑。膠囊通常包括一或多種上文揭示之固體稀釋劑。在一些實施例中,載劑組分之選擇視如口味、成本及存放穩定性之次要考慮因素而定,其對於本文揭示之目的而言並非關鍵且可易於由本領域中熟習此項技術者作出。
在一個實施例中,經口劑型包括預定釋放型態。在一個實施例中,本文揭示之經口劑型包括延長釋放錠劑、膠囊、口含錠或咀嚼錠劑。在一個實施例中,本文揭示之經口劑型包括緩慢釋放錠劑、膠囊、口含錠或咀嚼錠劑。在一個實施例中,本文揭示之經口劑型包括立即釋放錠劑、膠囊、口含錠或咀嚼錠劑。在一個實施例中,經口劑型根據如本領域中熟習此項技術者已知之長效OXN之所需釋放型態調配。
在另一實施例中,用於本文所揭示之方法的組合物包括溶液或乳液,其在另一實施例中為水溶液或水性乳液,包括安全且有效之量的本文揭示之化合物及視情況選用之意欲用於局部鼻內投與的其他化合物。在一些實施例中,組合物包括約0.001% w/v至約10.0% w/v,更佳地約00.1% w/v至約2.0% w/v的主題化合物,其用於藉由鼻內途徑全身傳遞化合物。
在另一實施例中,醫藥組合物藉由靜脈內、動脈內、皮下或肌肉內注射液體製劑來投與。在另一實施例中,液體調配物包含溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在一個實施例中,醫藥組合物靜脈內投與,且因此以適用於靜脈內投與之形式調配。在另一實施例中,醫藥組合物動脈內投與,且因此以適用於動脈內投與之形式調配。在另一實施例中,醫藥組合物肌肉內投與,且因此以適用於肌肉內投與之形式調配。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物為液體調配物。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物為凍乾調配物。在另一實施例中,凍乾調配物可在使用之前再懸浮(復原),以便形成液體調配物。
另外,在另一實施例中,醫藥組合物局部投與身體表面,且因此以適用於局部投與之形式調配。適合局部調配物包含凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、滴劑及其類似物。對於局部投與,本文揭示之化合物與其他適當治療劑或藥劑組合,呈具有或不具有醫藥載劑之生理學上可接受之稀釋劑中的溶液、懸浮液或乳液形式製備且施用。
在一個實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物藉由本領域中熟知之方法,例如藉助於習知混合、溶解、造粒、製備糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、包覆或凍乾方法來製造。
在一個實施例中,根據本文中之揭示內容使用的醫藥組合物以習知方式使用一或多種生理學上可接受之載劑調配,所述載劑包括賦形劑及助劑,其促進OXM加工成可在醫藥學上使用之製劑。在一個實施例中,調配物視所選投與途徑而定。
在一個實施例中,本文揭示之可注射劑以水溶液形式調配。在一個實施例中,本文揭示之可注射劑在生理學上相容之緩衝液中進行調配,所述緩衝液為諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽緩衝液。在一些實施例中,對於經黏膜投與,調配物中使用對欲滲透之屏障而言適當的滲透劑。此類滲透劑通常為本領域中已知。
在一個實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物包括緩衝液、張力劑及OXM結合物。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽。在另一實施例中,緩衝液為50 mM乙酸鹽。在另一實施例中,張力劑為100 mM蔗糖。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,可逆聚乙二醇化OXM由OXM、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物選自式I-IV
。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物為式I
。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物為式II
。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物為式IIa
。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物為式III
。在另一實施例中,緩衝液為100 mM乙酸鹽,張力劑為100 mM蔗糖,且OXM結合物為式IV
。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物在約4-7之pH範圍下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物在約4-6之pH範圍下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物在約4-5之pH範圍下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物在約4.7之pH值下。
蛋白質治療劑通常需要以高濃度給出,但對於注射而言,需要更小體積,此可引起溶液黏度增加。當大劑量之本文描述之治療性可逆聚乙二醇化OXM結合物以小體積液體投與(諸如用於注射)時,非常希望調配物或組合物具有高濃度之未展現通常在此類高蛋白質濃度下所見到之黏度增加的活性OXM結合物。
在一個實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物經調配以包括濃度為約70 mg/ml至約100 mg/ml之如本文所描述之OXM結合物。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約40 mg/ml至約110 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約50 mg/ml至約60 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約60 mg/ml至約70 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約70 mg/ml至約80 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約80 mg/ml至約90 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約90 mg/ml至約100 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約40 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約50 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約60 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約70 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約80 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約90 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約100 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約110 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約120 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約130 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約140 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約150 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約160 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約170 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約180 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約190 mg/ml之濃度下。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物係在約200 mg/ml之濃度下。
在一個實施例中,本文描述之醫藥組合物及醫藥調配物經調配用於非經腸投與,例如藉由快速注射或連續輸注來投與。在另一實施例中,用於注射之調配物呈單位劑型呈現,例如於安瓿或多劑量容器中,其中視情況添加防腐劑。在另一實施例中,組合物為於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。
在另一實施例中,組合物或調配物亦包括防腐劑,諸如氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)及硫柳汞及其類似物;螯合劑,諸如乙二胺四乙酸鈉及其他;緩衝液,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及乙酸鹽;張力劑,諸如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露糖醇及其他;抗氧化劑,諸如抗壞血酸、乙醯胱胺酸、偏亞硫酸氫鈉及其他;芳族試劑;黏度調節劑,諸如聚合物,包含纖維素及其衍生物;以及聚乙烯醇,以及根據需要調節此等水性組合物之pH值的酸及鹼。在一些實施例中,黏度調節劑包括增加黏度之黏度調節劑。在其他實施例中,黏度調節劑包括降低黏度之黏度調節劑。
技術人員將瞭解,術語「黏度」涵蓋流體流動阻力,且可以厘泊(cP)或毫帕-秒(mPa-s)之單位量測,其中在既定剪切速率下1 cP=l mPa-s。黏度可藉由使用黏度計,例如Brookfield Engineering數位式讀數黏度計型號LVT量測。可使用任何其他方法及本領域中已知之任何其他單元中量測黏度(例如絕對、動態或動態黏度)。
在一個實施例中,可藉由使用包括降低黏度之黏度調節劑的賦形劑得到黏度降低百分比。熟練的業內人士將瞭解,含有有效「降低黏度」之量之賦形劑(或「降低黏度」之量或濃度之此類賦形劑)的醫藥調配物或組合物可涵蓋呈最終投與形式之調配物或組合物之黏度量度(若為溶液,或若為粉末,在用所欲量之稀釋劑復原後),其中所量測之黏度比適當對照調配物之黏度小至少5%。可使用無賦形劑之對照調配物,但因為此類調配物可能例如由於低張性而無法作為治療性調配物來實施,所以其可能無法始終作為最適當之對照調配物。含有兩性離子賦形劑之調配物或組合物為適用的,因為其可用於產生等張調配物,而不會造成黏度增加。在另一實施例中,包括降低黏度之黏度調節劑的賦形劑包括兩性離子賦形劑。在另一實施例中,「黏度降低」之醫藥調配物或醫藥組合物包括與對照調配物相比展現黏度降低之調配物。
高黏度調配物在製造期間,包含在散裝及填充階段難以處置。高黏度調配物亦難以進入注射器且注射,常常需要使用可能不適於患者之較低規格針。在一個實施例中,添加包括可例如選自包括以下各者之群的降低黏度之黏度調節劑之賦形劑至包括可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物意外地降低此等組合物或調配物之黏度:牛磺酸、茶胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、甜菜鹼、精胺酸、離胺酸、二甲基乙醯胺、NDSB-195(NDBS-非清潔劑磺基甜菜鹼)、NDSB-201、NDSB-256、蔗糖、Triton-X 100、聚山梨醇酯80、苄星青黴素(benzathine)、二乙醇胺、二乙胺、碘化葡甲胺、樟腦-1-磺酸鹽、二甲基亞碸、甘胺酸及普魯卡因-HCl或其混合物。
在一個實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約10 μM至約300 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約10 μM至約650 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約1 μM至約750 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約1 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約5 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約10 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約50 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約100 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約200 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約250 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約300 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約350 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約400 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約500 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約600 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約640 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約650 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約700 mM。在另一實施例中,本文揭示之賦形劑之濃度為至少約750 mM。
在一個實施例中,本文揭示包括生物活性可逆聚乙二醇化OXM及降低黏度之濃度之賦形劑或其任何混合物的醫藥組合物及醫藥調配物。在另一實施例中,黏度降低包括對比對照調配物降低至少約10-70%。在另一實施例中,黏度降低包括對比對照調配物降低至少約10-30%。在另一實施例中,黏度降低包括對比對照調配物降低至少約10%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約15%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約20%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約25%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約30%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約35%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約40%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約45%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約50%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約55%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約60%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約65%。在另一實施例中,黏度降低為降低至少約70%。
在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物具有約6-40 cP之間的黏度量度。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於40 cP之黏度量度。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於30 cP之黏度量度。在另一實施例中,黏度量度小於25 cP。在另一實施例中,黏度量度小於20 cP。在另一實施例中,黏度量度小於15 cP。在另一實施例中,黏度量度小於10 cP。在另一實施例中,黏度量度小於5 cP。
熟練的業內人士將瞭解,本文描述之調配物及組合物可視情況包含醫藥學上可接受之鹽、緩衝液、界面活性劑、其他賦形劑、載劑、稀釋劑及/或其他調配劑。
熟練的業內人士將瞭解,術語「界面活性劑」可涵蓋包括改變水界面張力之試劑的界面活性劑。通常,界面活性劑在分子中具有一個親脂性基團及一個親水性基團。所述基團廣泛地包含肥皂、清潔劑、乳化劑、分散劑及潤濕劑及若干組之防腐劑。在一個實施例中,可視情況包含於本文揭示之醫藥組合物及醫藥調配物中之界面活性劑包括硬脂醯三乙醇胺、月桂基硫酸鈉、牛磺膽酸鈉、月桂基胺基丙酸、卵磷脂、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨及單硬脂酸甘油酯;以及親水性聚合物,諸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素及羥丙基纖維素。
雖然界面活性劑之影響對醫藥製劑之物理特性或效能有益,但其時常刺激皮膚及其他組織且尤其刺激黏膜,諸如在鼻、口、眼睛、陰道、直腸、頰或舌下區域等中發現之黏膜。另外,許多且實際上大部分界面活性劑使蛋白質變性,因此破壞其生物功能。因此,其應用有限。因為界面活性劑在超過臨界膠束濃度(CMC)下發揮其作用,所以需要具有低CMC之界面活性劑,從而使得其可以低濃度或少量有效地用於醫藥調配物及組合物。在一個實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物中所用之界面活性劑具有在純水中或在水溶液中小於1 mM之CMC。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物中所用之界面活性劑具有在純水中或在水溶液中小於0.5 mM之CMC。
熟練的業內人士將瞭解,術語「臨界膠束濃度」或「CMC」可涵蓋兩性組分(例如界面活性劑)在溶液中之濃度,在此濃度下溶液中開始形成膠束(球形膠束、圓形棒、薄層狀結構等)。
在一個實施例中,用於非經腸投與之醫藥組合物或醫藥調配物包含呈水溶性形式之活性製劑之水溶液。另外,在一些實施例中,長效OXM之懸浮液以適當油性或水基注射懸浮液形式製備。在一些實施例中,適合親脂性溶劑或媒劑包含脂肪油,諸如芝麻油;或合成脂肪酸酯,諸如油酸乙酯、甘油三酯或脂質體。在一些實施例中,水性注射懸浮液含有使懸浮液之黏度增加的物質,諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。在另一實施例中,懸浮液亦含有適合穩定劑或增加長效OXM溶解度以允許製備高度濃縮之溶液之試劑。
在另一實施例中,活性化合物可於囊泡、尤其脂質體中傳遞(參看Langer, 《科學(Science)》 249:1527-1533 (1990);Treat等人, 《傳染性疾病及癌症之療法中的脂質體(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)》, Lopez-Berestein及Fidler(編), Liss, 紐約, 第353-365頁 (1989);Lopez-Berestein, 同書, 第317-327頁;一般參看同書)。
在另一實施例中,呈控制釋放系統傳遞之醫藥組合物或醫藥調配物經調配用於靜脈內輸注、可植入滲透泵、經皮貼片、脂質體或其他投與模式。在一個實施例中,使用泵(參見Langer, 上述;Sefton, 《化學橡膠公司生物醫藥工程評論綜述(CRC Crit. Ref.Biomed. Eng.
) 14:201 (1987);Buchwald等人, 《手術(Surgery)》 88:507 (1980);Saudek等人, 《新英格蘭醫學雜誌(N. Engl. J. Med.)》 321:574 (1989))。在另一實施例中,可使用聚合物材料。在又一實施例中,可將控制釋放系統接近治療目標(亦即,大腦)置放,因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如,Goodson, 《控制釋放之醫學應用(Medical Applications of Controlled Release)》, 同上, 第2卷, 第115-138頁, 1984)。其他控制釋放系統由Langer(《科學(Science)》249:1527-1533 (1990))在綜述中論述。
在一個實施例中,長效OXM呈在使用之前用適合媒劑(例如無菌、無熱原質水基溶液)復原之粉末形式。在一些實施例中,組合物或調配物經調配用於霧化及吸入投與。在另一實施例中,組合物或調配物含於附接有霧化構件之容器中。
在一個實施例中,本文揭示之製劑調配成例如使用習知栓劑基質(諸如可可豆油或其他甘油酯)之經直腸組合物或調配物(諸如栓劑或保留灌腸劑)。
在一個實施例中,適合用於本文揭示之內容的醫藥組合物或醫藥調配物包含其中長效OXM之含量有效實現所預期目的之組合物。在另一實施例中,治療有效量意謂長效OXM有效預防、減輕或改善疾病症狀或延長所治療個體之存活期之量。
在一個實施例中,治療有效量之確定完全在本領域中熟習此項技術者能力範圍內。
組合物或調配物亦包括防腐劑,諸如氯化苯甲烴銨及硫柳汞及其類似物;螯合劑,諸如乙二胺四乙酸鈉及其他;緩衝液,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及乙酸鹽;張力劑,諸如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露糖醇、蔗糖及其他;抗氧化劑,諸如抗壞血酸、乙醯胱胺酸、偏亞硫酸氫鈉及其他;芳族試劑;黏度調節劑,諸如聚合物,包含纖維素及其衍生物;以及聚乙烯醇,以及根據需要調節此等水性組合物之pH值的酸及鹼。組合物或調配物亦可包括局部麻醉劑或其他活性劑。組合物或調配物可用作噴霧劑、噴霧、滴劑及其類似物。
可充當醫藥學上可接受之載劑或其組分之物質的一些實例為:糖,諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖;澱粉,諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉;纖維素及其衍生物,諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及甲基纖維素;粉末狀黃蓍膠;麥芽;明膠;滑石;固體潤滑劑,諸如硬脂酸及硬脂酸鎂;硫酸鈣;植物油,諸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及可可油;多元醇,諸如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇;海藻酸;乳化劑,諸如Tween™牌乳化劑;濕潤劑,諸如月桂基硫酸鈉;著色劑;調味劑;製錠劑、穩定劑;抗氧化劑;防腐劑;無熱原質水;等張鹽水;以及磷酸鹽緩衝溶液。待與化合物結合使用之醫藥學上可接受之載劑的選擇基本上藉由化合物待投與之方式來確定。若本發明化合物將進行注射,則在一個實施例中,醫藥學上可接受之載劑為具有血液相容性懸浮劑之無菌生理鹽水,其pH值已調至約7.4。
另外,組合物或調配物進一步包括黏合劑(例如阿拉伯膠、玉米澱粉、明膠、卡波姆(carbomer)、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮)、崩解劑(例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸、二氧化矽、交聯羧甲纖維素鈉、交聯聚維酮、瓜爾膠、羥乙酸澱粉鈉)、具有各種pH及離子強度之緩衝液(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、用以防止吸收至表面之添加劑(諸如白蛋白或明膠)、清潔劑(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽酸鹽)、蛋白酶抑制劑、界面活性劑(例如月桂基硫酸鈉)、滲透增強劑、增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁基化羥基苯甲醚)、穩定劑(例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、黏度增加劑(例如卡波姆、膠態二氧化矽、乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如阿斯巴甜糖(aspartame)、檸檬酸)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)、潤滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉)、流動助劑(例如膠態二氧化矽)、塑化劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如卡波姆、羥丙基纖維素、月桂基硫酸鈉)、聚合物塗層(例如泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))、塗層及膜形成劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)及/或佐劑。
用於糖漿、酏劑、乳液及懸浮液之載劑之典型組分包含乙醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、液體蔗糖、山梨糖醇及水。對於懸浮液,典型懸浮劑包含甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、纖維素(例如Avicel™、RC-591)、黃蓍膠及海藻酸鈉;典型濕潤劑包含卵磷脂及聚氧化乙烯脫水山梨糖醇(例如聚山梨醇酯80)。典型防腐劑包含對羥基苯甲酸甲酯及苯甲酸鈉。在另一實施例中,經口液體組合物亦含有一或多種上文揭示之組分,諸如甜味劑、調味劑及著色劑。
組合物或調配物亦包含將活性物質併入聚合化合物(諸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等)之微粒狀製劑之中或之上或併入脂質體、微乳液、膠束、單層或多層囊泡、紅血球血影或原生質球狀體上。此類組合物將影響物理狀態、溶解度、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。
本文中之揭示內容亦包含塗有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)之微粒狀組合物或調配物且化合物偶合至針對組織特異性受體、配位體或抗原之抗體或偶合至組織特異性受體之配位體。
在一個實施例中,本文揭示之化合物包含藉由諸如聚乙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮或聚脯胺酸之水溶性聚合物的共價連接而修飾的化合物。在另一實施例中,經修飾之化合物在靜脈內注射之後展現出的血液中半衰期基本上長於相應未經修飾之化合物。在一個實施例中,修飾亦提高化合物於水溶液中之溶解度,消除聚集,增強化合物之物理及化學穩定性,且極大地降低化合物之免疫原性及反應性。在另一實施例中,修飾不消除化合物之聚集。在另一實施例中,經修飾之化合物之進一步處置,例如凍乾化合物,可導致經修飾之化合物聚集。在另一實施例中,所期望之活體內生物活性藉由與未經修飾之化合物相比以更低頻率或以更低劑量投與此類聚合物-化合物加合物而獲得。
熟練的業內人士將瞭解,術語「聚集體」及「聚集」可涵蓋集合或收集成塊或整體,例如可逆聚乙二醇化OXM或其變異體之聚集中。聚集體可自我聚集或由於其他因素而聚集,例如聚集試劑或沈澱試劑,或凍乾,或使可逆聚乙二醇化OXM或其變異體集合在一起之其他方式及方法。
在另一實施例中,有效量或劑量之製劑最初可根據活體外分析來估計。在一個實施例中,劑量可在動物模型中進行設計且所述資訊可用以更準確地確定人類中之適用劑量。
在一個實施例中,如本文所描述之長效OXM之毒性及治療功效可藉由活體外、細胞培養物或實驗動物中之標準醫藥程序來確定。在一個實施例中,獲自此等活體外及細胞培養物分析及動物研究之資料可用以設計適用於人類之劑量範圍。在一個實施例中,劑量視所採用之劑型及所用投與途徑而變化。在一個實施例中,確切調配物、投與途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之病狀來選擇。[參見例如,Fingl等人, (1975) 《治療劑之藥理學基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)》, 第1章, 第1頁)]。
在一個實施例中,視待治療之病狀的嚴重程度及反應而定,給藥可為單次或多次投與,療程持續數天至數週或直至實現治癒或達成疾病狀態減弱為止。
在一個實施例中,待投與之組合物或調配物的量當然將視所治療之個體、病痛之嚴重程度、投與方式、處方醫生之判斷等而定。
在一個實施例中,亦製備包含本文揭示之製劑在相容性醫藥載劑中調配之組合物或調配物,置於適當容器中,且標記用於治療所指示症狀。
在另一實施例中,如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM經由全身投與來投與。在另一實施例中,如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM藉由靜脈內、肌肉內或皮下注射來投與。
在另一實施例中,如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM與諸如非離子表面活性劑(亦即界面活性劑)、各種糖、有機多元醇及/或人類血清白蛋白之複雜有機賦形劑及穩定劑組合,進行凍乾(亦即冷凍乾燥)。在另一實施例中,賦形劑及/或穩定劑以在用稀釋劑復原時有效降低黏度之重量-重量濃度存在。在另一實施例中,稀釋劑包括無菌水及緩衝液。在另一實施例中,賦形劑以每毫克可逆聚乙二醇化OXM約100 μg至每毫克可逆聚乙二醇化OXM約1 mg之間的濃度存在。在另一實施例中,賦形劑以每毫克可逆聚乙二醇化OXM約200 μg至每毫克可逆聚乙二醇化OXM約500 μg之間的濃度存在。
在另一實施例中,存在之賦形劑及/或穩定劑減少可逆聚乙二醇化OXM之任何可能聚集。在另一實施例中,減少聚集之賦形劑及/或穩定劑包括硫酸化多醣、多磷酸鹽、胺基酸及各種界面活性劑,包含烷基醣苷或其任何組合。熟練的業內人士將瞭解,術語「烷基醣苷」可與術語「烷基醣」互換且可涵蓋藉由鍵與任何疏水性烷基接合之任何糖,如本領域中已知。疏水性烷基鏈與親水性醣之間的鍵可包含醣苷、酯、硫代醣苷、硫酯、醚、醯胺或醯脲鍵或鍵以及其他可能。可選擇具有任何需要尺寸之疏水性烷基,視所需疏水性及醣部分之親水性而定。在一個實施例中,烷基鏈之範圍為9至24個碳原子。在另一實施例中,烷基鏈之範圍為10至14個碳原子。
在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM,其在注射用無菌水中復原。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM,其在注射用無菌PBS中復原。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM,其在注射用無菌0.9% NaCl中復原。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM,其在本文描述之任何緩衝系統中復原。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM,其在本文描述之任何緩衝系統中復原,所述醫藥組合物或醫藥調配物進一步包括載劑及/或賦形劑。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之緩衝系統及張力劑。
在某些實施例中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM製劑在投與前復原。涵蓋復原濃度範圍之各種實施例,例如:可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤個體體重0.01-0.5 mg範圍復原(僅僅提供可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM重量,因為PEG之尺寸可在很大程度上不同)。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.01-0.5 mg之範圍復原。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤個體體重0.1-5.0 mg之範圍復原(僅僅提供可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM重量,因為PEG之尺寸可在很大程度上不同)。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物內之OXM肽組分以每公斤體重0.1-5.0 mg之範圍復原。
在一個實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物經復原以包括濃度為約70 mg/ml至約100 mg/ml之如本文所描述之OXM結合物。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約40 mg/ml至約110 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約50 mg/ml至約60 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約60 mg/ml至約70 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約70 mg/ml至約80 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約80 mg/ml至約90 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約90 mg/ml至約100 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約40 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約50 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約60 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約70 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約80 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約90 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約100 mg/ml。在另一實施例中,醫藥調配物或醫藥組合物中所包括之OXM結合物經復原,濃度為約110 mg/ml。
在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM組合物或調配物之口服劑型以約0.7或3.5 mg至約280 mg/70 kg,或在另一實施例中,約0.5或10 mg至約210 mg/70 kg之範圍復原。
在另一實施例中,復原之醫藥調配物或醫藥組合物的黏度與凍乾前之醫藥調配物或組合物相同。在另一實施例中,復原之醫藥調配物或醫藥組合物的黏度大於包括可逆聚乙二醇化OXM之溶液在凍乾前的黏度。在另一實施例中,復原之醫藥調配物或醫藥組合物的黏度小於包括可逆聚乙二醇化OXM之溶液在凍乾前的黏度。
在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有約3-50 cP之間的黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於50 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於40 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於30 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於25 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於20 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於20 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於15 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於10 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於5 cP之黏度量度。在另一實施例中,復原之醫藥組合物或醫藥調配物具有小於3 cP之黏度量度。
在一個實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物在室溫下穩定。在另一實施例中,醫藥組合物在4℃下穩定。在另一實施例中,醫藥組合物在5℃下穩定。在另一實施例中,醫藥組合物在-20℃下穩定。在另一實施例中,醫藥組合物穩定至少三個月。在另一實施例中,醫藥組合物穩定至少六個月。在另一實施例中,醫藥組合物穩定至少一年。在另一實施例中,醫藥組合物穩定至少兩年。
在一個實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物調配成凍乾調配物以支持長期穩定性。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物調配成藥品(DP)。在另一實施例中,本文揭示之醫藥組合物或醫藥調配物調配成用於原料藥(DS)之粉末。在另一實施例中,調配成DP之組合物或調配物在4℃下穩定。在另一實施例中,調配成DP之組合物或調配物在室溫下穩定。在另一實施例中,調配成DP之組合物或調配物提供長期穩定性。
在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM及複雜載劑,諸如人類血清白蛋白、多元醇、糖及陰離子型表面活性穩定劑。參見例如WO 89/10756(Hara等人-含多元醇及對羥基苯甲酸酯)。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM及乳糖酸及乙酸鹽/甘胺酸緩衝液。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM及胺基酸,諸如精胺酸或麩胺酸,所述胺基酸增加干擾素組合物於水中之溶解性。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM及甘胺酸或人類血清白蛋白(HSA)、緩衝液(例如乙酸鹽)及等張劑(例如NaCl)。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括如本文所描述之凍乾之可逆聚乙二醇化OXM及磷酸鹽緩衝液、甘胺酸及HSA。
熟練的業內人士將瞭解,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物可涵蓋「乾燥組合物」。在一個實施例中,「乾燥組合物」包括乾燥形式之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物。適合乾燥方法為噴霧乾燥及凍乾(冷凍乾燥)。在另一實施例中,可逆聚乙二醇化OXM之凍乾組合物或調配物包括最大10%之殘餘水含量。在另一實施例中,殘餘水含量小於5%。在另一實施例中,殘餘水含量小於4%。在另一實施例中,殘餘水含量小於3%。在另一實施例中,殘餘水含量小於2%。在另一實施例中,殘餘水含量小於1%。在另一實施例中,殘餘水含量小於0.5%。在另一實施例中,殘餘水含量小於0.1%。在另一實施例中,使用卡爾費歇爾滴定法(Karl Fischer titration methodology)測定水含量。在另一實施例中,使用本領域中已知之任何方法測定水含量。
在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮(復原)以便形成與凍乾之前的液體調配物相比,包括100%生物活性之液體調配物。在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮以便形成包括至少90%生物活性之液體調配物。在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮以便形成包括至少80%生物活性之液體調配物。在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮以便形成包括至少70%生物活性之液體調配物。在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮以便形成包括至少60%生物活性之液體調配物。在另一方法中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物在使用之前再懸浮以便形成包括至少50%生物活性之液體調配物。
熟練的業內人士將瞭解,「凍乾之醫藥組合物或醫藥調配物」可涵蓋先冷凍,且隨後藉助於減壓進行減水之醫藥組合物或醫藥調配物。此術語不排除在組合物填充至最終容器前在製造製程中進行且為本領域中所熟知之其他乾燥步驟。熟練的業內人士將瞭解,術語「凍乾」(冷凍乾燥)涵蓋脫水法,其特徵在於將組合物冷凍且接著降低周圍壓力,且視情況加熱以允許組合物中之冷凍水直接自固相昇華成氣體。通常,昇華之水藉由反昇華來收集。用於凍乾之方法為本領域中所熟知,例如參見Carpenter, J.F., Chang, B.S., Garzon-Rodriguez, W., 及Randolph, T.W. 2002. 《穩定凍乾蛋白質調配物之設計基本原理(Rationale design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice)》. 《穩定蛋白質調配物之設計基本原理-理論與實踐(Rationale Design of stable protein formulations-theory and practice)》(J.F. Carpenter及M.C. Manning編輯) Kluwer Academic/Plenum publishers, 紐約(New York), 第109-133頁,其以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中,在凍乾之前,「凍乾保護劑」與可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物組合。熟練的業內人士將瞭解,術語「凍乾保護劑」可涵蓋當與相關多肽組合時,一般在乾燥時及尤其在凍乾及隨後儲存期間顯著預防或降低多肽之化學及/或物理不穩定性的分子。在另一實施例中,凍乾保護劑包括糖、胺基酸、易溶鹽、甲胺、多元醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、普洛尼克(pluroincs)或羥烷基澱粉或其任何組合。在另一實施例中,凍乾保護劑糖包括蔗糖或海藻糖。在另一實施例中,凍乾保護劑胺基酸包括精胺酸、甘胺酸、麩胺酸或組胺酸。在另一實施例中,凍乾保護劑甲胺包括甜菜鹼。在另一實施例中,凍乾保護劑易溶鹽包括硫酸鎂。在另一實施例中,凍乾保護劑多元醇包括三元醇或更高級糖醇,包括丙三醇、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。在另一實施例中,凍乾保護劑包括有包括羥基乙基澱粉(HES)之羥基烷基澱粉。
在另一實施例中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物不包括聚集體。在另一實施例中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物包括小於1%聚集體。在另一實施例中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物包括小於5%聚集體。在另一實施例中,凍乾之可逆聚乙二醇化OXM醫藥組合物或醫藥調配物包括小於10%聚集體。
在另一實施例中,凍乾之醫藥組合物或醫藥調配物經無菌水復原,得到與凍乾前相同濃度之藥物。在另一實施例中,凍乾之醫藥組合物或醫藥調配物經無菌水復原,得到與投與需要相同濃度之藥物。在另一實施例中,凍乾之醫藥組合物或醫藥調配物經無菌水溶液復原,得到與凍乾前相同濃度之藥物。在另一實施例中,凍乾之醫藥組合物或醫藥調配物經無菌水溶液復原,得到與與投與需要相同濃度之藥物。
在另一實施例中,包括如本文所描述之聚乙二醇化或可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物在置於具有約4與7.2之間的pH值之緩衝溶液中時穩定。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物在具有約4.7之pH值的緩衝溶液中穩定。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物利用胺基酸作為穩定劑及在一些情況下利用鹽(若胺基酸不含帶電側鏈)來穩定。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物為包括約0.3重量%與5重量%之間的穩定劑的液體組合物,所述穩定劑為胺基酸。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物提供給藥準確性及產品安全性。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物提供具有生物活性之穩定液體調配物,其用於可注射應用。在另一實施例中,醫藥組合物或醫藥調配物包括未凍乾之如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物提供允許呈液態長時間儲存,有助於投與前儲存及運送之液體調配物。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物提供允許呈乾燥狀態長時間儲存,有助於投與前儲存及運送之凍乾調配物。在另一實施例中,凍乾調配物可儲存於小瓶、套筒、雙腔室注射器或預填充混合系統中。在雙腔室注射器中,針筒中間之塞子充當兩個腔室之間的障壁。凍乾藥物可包裝在一個腔室中且另一腔室可填充有稀釋劑,具有另一塞子。使用者一旦對柱塞施加壓力,稀釋劑即移至包括凍乾藥物之腔室,使凍乾藥物復原。
在另一實施例中,凍乾調配物儲存於約-40℃下。在另一實施例中,凍乾調配物儲存於約-20℃下。在另一實施例中,凍乾調配物儲存於約25℃下。在另一實施例中,凍乾調配物儲存於約室溫下。在另一實施例中,凍乾調配物冷藏儲存於約2-8℃下。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括固體脂質作為基質材料。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之可注射醫藥組合物或醫藥調配物包括固體脂質作為基質材料。在另一實施例中,脂質微米粒子藉由噴霧凝結之產生由Speiser(Speiser等人, 《藥學研究(Pharm. Res.)》 8 (1991) 47-54)描述,接著為用於經口投與之脂質奈米丸粒(Speiser EP 0167825 (1990))。在另一實施例中,身體對所用脂質之耐受性良好(例如由存在於乳液中用於非經腸營養之脂肪酸構成的甘油酯)。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物呈脂質體形式(J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275)。
在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括聚合物微米粒子。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之可注射醫藥組合物或醫藥調配物包括聚合物微米粒子。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括奈米粒子。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括脂質體。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括脂質乳液。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括微米球。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括脂質奈米粒子。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括有包括兩性脂質之脂質奈米粒子。在另一實施例中,包括如本文所描述之可逆聚乙二醇化OXM之醫藥組合物或醫藥調配物包括有包括藥物、脂質基質及界面活性劑之脂質奈米粒子。在另一實施例中,脂質基質之單甘油酯含量為至少50 w/w%。
在一個實施例中,本文揭示之組合物或調配物呈現在包裝或分配器裝置中,諸如FDA批准之套組,其含有一或多個含有長效OXM之單位劑型。在一個實施例中,包裝例如包括金屬或塑膠箔,諸如泡殼包裝。在一個實施例中,包裝或分配器裝置附有投藥說明書。在一個實施例中,包裝或分配器附有與容器關聯之通知,其呈管制醫藥品之製造、使用或銷售之政府機構指定的形式,所述通知反映所述機構批准所述組合物形式或投與人類或獸醫學。在一個實施例中,此類通知為經美國食品與藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用於處方藥物的標籤或經批准之產品插頁。
在一個實施例中,應瞭解本文揭示之可逆聚乙二醇化OXM可與其他活性劑一起提供至個體,以實現與用各藥劑單獨治療相比提高的治療作用。在另一實施例中,對與組合療法相關之不良副作用採取措施(例如給予及選擇補充藥劑)。
在一個實施例中,本文揭示一種用於製備本文描述之醫藥調配物及醫藥組合物的方法。在另一實施例中,本文揭示一種製備投與個體之醫藥調配物及醫藥組合物的方法,所述方法包括以下步驟:(i)藉由將聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於所述調酸素,將調酸素可逆聚乙二醇化,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30);(ii)在約4.7之pH值下將步驟(i)之可逆聚乙二醇化之調酸素與所述緩衝液及所述張力劑混合;以及(iii)用所述調配物預先填充注射器。
在另一實施例中,本文揭示一種用如本文所描述之調配物或組合物填充注射器的方法,所述方法包括以下步驟:(i)調配具有預定量之所述可逆聚乙二醇化調酸素的所述可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型;以及(ii)用所述調配物填充注射器。在另一實施例中,用於填充注射器之方法係針對需要提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、減少食物攝入、減輕體重、改善膽固醇、增加胰島素敏感性、降低胰島素抗性或增加能量消耗或其任何組合之個體。
在一個實施例中,本文揭示包括如本文所描述之醫藥調配物或醫藥組合物的可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型。
本領域一般技術人員在參閱以下實例後將變得顯而易知本文揭示之其他目標、優點及新穎特徵,所述實例並不意欲為限制性的。另外,如上文所描繪且如所附申請專利範圍部分中所主張的本文揭示之各種實施例及態樣中之每一者在以下實例中找到實驗支持。實例
一般而言,本文所用之命名法及本文中之揭示內容中所用之實驗室程序包含分子、生物化學、微生物學及重組DNA技術。此類技術在文獻中已充分解釋。參見例如《分子選殖:實驗指南》 Sambrook等人, (1989);《最新分子生物學實驗方法彙編》 第I-III卷 Ausubel, R. M.編(1994);Ausubel等人, 《最新分子生物學實驗方法彙編》, John Wiley and Sons, 馬里蘭州巴爾的摩 (1989);Perbal, 《分子選殖實用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》, John Wiley & Sons, 紐約(1988);Watson等人, 《重組DNA(Recombinant DNA)》, 《科學美國人書籍(Scientific American Books)》, 紐約;Birren等人(編) 《基因組分析:實驗指南系列(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)》, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 紐約 (1998);如美國專利第4,666,828號、第4,683,202號、第4,801,531號、第5,192,659號及第5,272,057號中所闡述之方法;《細胞生物學:實驗指南(Cell Biology: A Laboratory Handbook)》, 第I-III卷 Cellis, J. E.編(1994);《動物細胞培養-基礎技術指南(Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique)》, Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第三版;《最新免疫學實驗方法彙編(Current Protocols in Immunology)》 第I-III卷 Coligan J. E.編(1994);Stites等人(編), 《基礎及臨床免疫學(Basic and Clinical Immunology)》 (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell及Shiigi (編), 《細胞免疫學中選擇的方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》, W. H. Freeman and Co., 紐約 (1980);可用免疫分析法在專利及科學文獻中充分描述,參見例如美國專利第3,791,932號;第3,839,153號;第3,850,752號;第3,850,578號;第3,853,987號;第3,867,517號;第3,879,262號;第3,901,654號;第3,935,074號;第3,984,533號;第3,996,345號;第4,034,074號;第4,098,876號;第4,879,219號;第5,011,771號及第5,281,521號;《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》 Gait, M. J.編(1984);《核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)》 Hames, B. D.及Higgins S. J.編(1985);《轉錄及轉譯(Transcription and Translation)》 Hames, B. D.及Higgins S. J.編(1984);《動物細胞培養(Animal Cell Culture)》 Freshney, R. I.編(1986);《固定細胞及酶(Immobilized Cells and Enzymes)》 IRL Press, (1986);《分子選殖的實用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》 Perbal, B., (1984)及《酶學方法(Methods in Enzymology)》 第1-317卷, Academic Press;《PCR方案:方法及應用指南(PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)》, Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshak等人, 《蛋白質純化及表徵策略-實驗過程指南(Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual)》 CSHL Press (1996);皆以引用的方式併入。在整個本文中提供其他通用參考文獻。實例 1 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 之製備 OXM 之合成
調酸素之胺基酸序列以下列肽序列闡述:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO: 1)
藉由固相法,在整個肽鏈組裝中採用Fmoc策略(Almac Sciences, 蘇格蘭)來合成肽。
使用以下步驟組裝肽序列:1. 封端
使用0.5M乙酸酐(Fluka)於DMF(Rathburn)中之溶液將樹脂封端。2. 脫除保護基
使用20% v/v哌啶(Rathburn)於DMF(Rathburn)中之溶液自生長之肽鏈移除Fmoc保護基。3. 胺基酸偶合
使用1M HOBt(Carbosynth)於DMF(Rathburn)中之溶液及1M DIC(Carbosynth)於DMF(Rathburn)中之溶液,活化0.5M胺基酸(Novabiochem)於DMF(Rathburn)中之溶液。每次偶合使用4當量各胺基酸。
藉由在三異丙基矽烷(Fluka)、水、二甲基硫(Aldrich)、碘化銨(Aldrich)及TFA(Applied Biosystems)之混合物中攪拌4小時,粗肽自樹脂裂解且移除保護基。藉由自冷二乙醚沈澱來收集粗肽。肽純化
將粗肽溶解於乙腈(Rathburn)/水(MilliQ)(5:95)中且負載至製備型HPLC管柱上。層析參數如下: 管柱:Phenomenex Luna C18 250 mm×30,15 µm,300A 移動相A:水+0.1% v/v TFA(Applied Biosystems) 移動相B:乙腈(Rathburn)+ 0.1% v/v TFA(Applied Biosystems) UV偵測:214或220 nm 梯度:經4管柱體積,25% B至31% B 流速43 mL/minMAL-FMS-NHS 之合成 流程1 - MAL-FMS-NHS連接子之合成
化合物2-5之合成係基於Albericio等人在《合成通訊(Synthetic Communication)》, 2001, 31(2), 225-232中描述之程序。2-(Boc- 胺基 ) 茀 ( 2 ):
在磁性攪拌下在冰浴中將2-胺基茀(18 g,99 mmol)懸浮於二噁烷:水(2:1)之混合物(200 ml)及2 N NaOH(60 ml)中。接著添加Boc2
O(109 mmol,1.1當量),且在室溫下繼續攪拌。藉由TLC(Rf= 0.5,己烷/乙酸乙酯2:1)監測反應,且藉由添加2 N NaOH維持pH值在9-10之間。反應完成時,懸浮液用1M KHSO4酸化至pH=3。過濾固體且用冷水(50 ml)、二噁烷-水(2:1)洗滌,且接著與甲苯共沸兩次,隨後用於下一步驟。9- 甲醯基 -2-(Boc- 胺基 ) 茀 ( 3 ):
在3頸RBF中,將NaH(60%於油中;330 mmol,3.3當量)懸浮於無水THF(50 ml)中,經20分鐘逐滴添加步驟2中描述之-(Boc-胺基)氟(28 g;100 mmol)於無水THF(230 ml)中之溶液。觀測到濃稠黃色漿液,且在室溫下在氮氣下攪拌混合物10分鐘。逐滴添加甲酸乙酯(20.1 ml,250 mmol,2.5當量)(注意:氣體放出)。漿液變成淺棕色溶液。將溶液攪拌20分鐘。藉由TLC(Rf=0.5,己烷/乙酸乙酯1:1)監測反應,且當僅僅觀測到痕量起始物質時,用冰水(300 ml)淬滅反應。在減壓下蒸發混合物,直至移除大部分THF。所得混合物用乙酸處理至pH=5。將所獲得之白色沈澱溶解於乙酸乙酯中且分離有機層。水層用乙酸乙酯萃取且將所有有機層合併且用飽和碳酸氫鈉、鹽水洗滌且經MgSO4
乾燥。過濾及移除溶劑後,獲得黃色固體。此物質用於下一步驟中。9- 羥基甲基 -2-(Boc- 胺基 ) 茀 ( 4 ):
將來自以上之化合物3
懸浮於MeOH(200 ml)中且經15分鐘逐步添加硼氫化鈉。將混合物攪拌30分鐘(注意:放熱反應及氣體放出)。藉由TLC(Rf=0.5,己烷/EtOAc 1:1)監測反應且反應完成。添加水(500 ml)且用乙酸調節pH值至pH 5。處理涉及用乙酸乙酯萃取兩次,用碳酸氫鈉及鹽水洗滌經合併之有機層,經MgSO4
乾燥,過濾且濃縮至乾。所獲得之粗產物藉由急驟層析法,使用庚烷/EtOAc(3:1)來純化,得到黃色泡沫(36 g,97.5%純度,在1H-NMR中觀測到痕量乙酸乙酯及二乙醚)。MAL-Fmoc-NHS ( 7 ):
向具有頂部攪動之500 ml乾淨乾燥RBF饋入含三光氣(1.58 g,0.35當量)之無水THF(55 ml)以在周圍形成溶液。此用冰/水浴冷卻至0℃,且在氮氣下在0℃下經10分鐘逐滴添加NHS(0.67 g,0.38當量)於無水THF(19 ml)中之溶液。將所得溶液攪拌30分鐘。在0℃下經10分鐘逐滴添加另一部分含NHS(1.34 g,0.77當量)之無水THF(36 ml)且攪拌15分鐘。
將化合物6(5.5 g,1當量)、無水THF(55 ml)及吡啶(3.07 ml,2.5當量)一起攪拌以形成懸浮液。在0-5℃下將此分部分添加至NHS溶液,且接著藉由移除冰浴,使其達至室溫。
20小時後,終止反應(起始物質仍然存在,若推動反應完成,則觀測到二聚體雜質)。
過濾反應混合物且向濾液添加4%鹽水(200 ml)及EtOAc(200 ml)。分離後,將有機層用5%檸檬酸(220 ml)及水(220 ml)洗滌。接著濃縮有機層,得到7.67 g MAL-Fmoc-NHS(純度為93-97%)。藉由管柱層析法,使用環己烷/EtOAc 70:30至40:60之梯度來純化此物質。在真空下濃縮含有產物之溶離份,得到3.47 g(45%)MAL-Fmoc-NHS。MAL-FMS-NHS - ( A )
向MAL-Fmoc-NHS(100 mg,0.2 mmol)於三氟乙酸(10 ml)中之溶液中添加氯磺酸(0.5 ml)。15分鐘後,添加冰冷二乙醚(90 ml)且產物沈澱。藉由離心來收集物質,用二乙醚洗滌,且在真空下乾燥。獲得41.3 mg(35%)米色固體。MAL-FMS-NHS -- ( B )
在惰性氛圍下將起始物質Mal-Fmoc-NHS溶解於純TFA(通常520 mL)中,通常歷時5分鐘。將6當量氯磺酸溶解於純TFA(通常106 mL)中且逐滴添加至反應混合物(通常45分鐘)。磺化(通常50分鐘)結束後,將反應混合物傾倒在冷二乙醚(通常25.4 L)上進行沈澱。過濾沈澱且在真空中乾燥(通常90分鐘),得到Mal-FMS-NHS(純度為93-97%),其直接進行偶合階段。獲得具有93%-97%之間的足夠純度之Mal-FMS-NHS。實例 1A OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS- ( A ) 之結合 - 「一鍋反應」 , 得到 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 之非均質結合物 ( MOD 6030 )
OXM肽中3個胺位點(Lys12、Lys30及胺基端)之非均質結合作為「一鍋反應」進行,其中將OXM、mPEG-SH及FMS連接子各1當量之組分在pH 7.2下混合在一起,歷時30分鐘。藉由添加乙酸使pH值減少至4來終止反應。
非均質結合物(MOD-6030,圖 1
,PEG30
-FMS-OXM)之合成如下進行:MAL-FMS-NHS-(A)[如上所述]與OXM及PEG(30)-SH混合(作為一鍋反應)。MAL-FMS-NHS-(A)間隔子藉由其一側上之NHS活化酯偶合於OXM,且同時藉由PEG-SH,連接至另一側上之順丁烯二醯亞胺基團。以此方式,PEG-S-MAL-FMS-OXM結合物之非均質混合物由藉由OXM肽之3種胺之一(N端、Lys12
及Lys30
)連接的三種變異體構成。
在非均質結合中,完成調酸素合成,且在裂解期間移除所有保護基,且因此具有一級胺者可進一步與NHS基團反應。粗調酸素經純化且進行一鍋反應。實例 1B OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS- ( A ) 之結合 - 兩步法 , 得到 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 之均質結合物
結合程序進一步發展成兩步法,其中與FMS間隔子(MAL-FMS-NHS)之附接以控制及定點方式進行。在第一步中,FMS間隔子偶合於經保護之OXM*(樹脂上部分保護之OXM,其中在Lys12及Lys30經保護之N端OXM為較佳經保護之OXM),接著裂解,隨後脫除保護基及純化MAL-FMS-OXM(藉由RP-HPLC)。
*在使用Fmoc-SPPS法對OXM進行肽合成期間,胺基酸由針對胺基酸之各R基團之各種保護基保護,在藉由TFA自樹脂裂解期間脫除保護基。為合成FMS之Lys12或Lys 30定點偶合,使用ivDde保護離胺酸之胺基,例如對於OXM-Lys12-FMS,Lys12之R基團中之NH2藉由ivDde額外保護,ivDde藉由弱酸條件選擇性地移除,而使用其他保護基之所有其他胺基酸仍然經保護。對於特定N端偶合,使用常規SPPS。亦即,完成OXM合成,接著添加MAL-FMS-NHS,MAL-FMS-NHS僅僅偶合於未經保護之N端基團。
第二步為PEG30-SH附接於經純化之均質MAL-FMS-OXM。最終結合產物(PEG30-S-MAL-FMS-OXM)藉由RP-HPLC進一步純化。可應用其他純化步驟,諸如離子交換或SEC-HPLC或任何其他純化步驟。
使用Fmoc固相策略合成樹脂上之三種肽。為合成藉由OXM之位置12或30之胺基酸離胺酸連接的均質結合物,針對OXM之Lys12或Lys30,應用選擇性保護基ivDde(1-[(4,4-二甲基-2,6-二側氧基環己基-1-亞基)乙基]),其可在鹼性條件下移除,而具有其他保護基之肽之其餘部分仍然在樹脂上。
因此,合成三種經樹脂結合之OXM:N端-利用Fmoc策略,使用適合於固相合成之保護基(通常Boc保護基用於ε胺);以及Lys12
或Lys30
,利用ivDde保護基。此等OXM肽意欲用於與FMS連接子進一步選擇性偶合。
均質結合物作為『樹脂上合成』進行。結合物分兩個步驟合成: 1. OXM與MAL-FMS-NHS之間的偶合、裂解及純化。 2. 用PEG30
-SH將MAL-FMS-OXM聚乙二醇化。在此程序中,MAL-FMS-NHS化合物之偶合係用任一經保護之OXM(游離N端-OXM、游離Lys12-OXM或游離Lys30-OXM)進行,同時其結合於樹脂。經保護之OXM在其他游離胺位點處經保護,允許OXM上特定未經保護之所需胺基位點與MAL-FMS-NHS上之NHS部分反應。使經純化之MAL-FMS-OXM與PEG30-SH反應,產生粗結合物,使用HPLC(RP或陽離子交換或兩者)純化。 MAL-FMS-NHS ( A )與 Lys12/Lys30 經保護之 N 端 OXM 偶合 ( MOD-6031 ):
將MAL-FMS-NHS連接子溶液(0.746 ml,DMF中10 mg/ml,2當量)添加至Lys12/Lys30經保護之N端OXM樹脂*(1當量,200 mg樹脂,31.998 µmol/g游離胺)。添加DMF,直至樹脂剛好自由移動,且接著音波處理19小時。將樹脂用DMF及甲醇洗滌,接著在真空乾燥器中乾燥隔夜。裂解混合物含有TFA/TIS/H2O。在室溫下裂解超過3.5小時。過濾樹脂後,MAL-FMS-OXM在冷二乙醚中沈澱。在裂解階段結束時,獲得42.1 mg粗MAL-FMS-OXM(36%純)。 MAL-FMS-NHS ( A )與 Lys12 定點之 OXM 偶合 :
在添加DIEA(5當量)下,將MAL-FMS-NHS連接子溶液(DMF中10 mg/ml,2.5當量)添加至(Lys12)OXM樹脂(1當量)。添加DMF,直至樹脂剛好自由移動,且接著音波處理隔夜。將樹脂用DMF及甲醇洗滌,接著在真空乾燥器中乾燥隔夜。如針對N端定點所述,進行裂解及沈澱。 MAL-FMS-NHS ( A ) 與 Lys30 定點之 OXM 偶合 :
在添加DIEA(5當量)下,MAL-FMS-NHS連接子(2.5當量)溶解於DCM中。將此連接子/DIEA溶液添加至(Lys30)OXM樹脂,接著音波處理隔夜。將樹脂用DCM及甲醇洗滌,接著在真空乾燥器中乾燥隔夜。如針對N端定點所述,進行裂解及沈澱。 純化
在以下條件下,一次性純化來自以上產生之任一所得均質中間物的所得粗MAL-FMS-OXM。 樣品稀釋劑:含10%乙腈之水 管柱:Luna C18 (2),100Å,250×21.2 mm 注射流速:9 ml/min 跑動流速:9 ml/min 緩衝液A:水(0.1% TFA) 緩衝液B:乙腈(0.1% TFA) 梯度:經32分鐘,10-45% B 監測:230 nm
在以下步驟中,以上產生之任一均質中間物用於形成均質結合物: PEG30SH 與 MAL-FMS-OXM 之結合
製備MAL-FMS-OXM溶液(1當量,1.5 ml DMF中15.1 mg)。將PEG30SH(1當量,9.2 ml,pH 6.5磷酸鹽緩衝液中10 mg/ml)添加至MAL-FMS-OXM溶液。接著在室溫下攪拌反應混合物30分鐘,接著添加冰醋酸(200 μl)以藉由降低pH值來淬滅反應。
接著使用RP-HPLC純化所得產物,以提供所需均質結合物PEG-S-MAL-FMS-OXM(PEG-FMS-OXM)。 管柱:Luna C18 (2),100Å,250×21.2 mm 注射流速:5 ml/min 跑動流速:20 ml/min 緩衝液A:含0.1% TFA之水 緩衝液B:乙腈/水(75:25)及0.1% TFA 梯度:經41分鐘10-65% B 監測:220、240、280 nm實例 1C OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS- ( B ) 之結合 - 兩步法 , 得到 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 之均質結合物
藉由在惰性氛圍下使OXM樹脂(通常236 g,在2 L DMF中(使用Lys12/Lys30經保護之N端OXM或Lys12/N端OXM經保護或Lys30/N端經保護之OXM*))懸浮在MAL-FMS-NHS(B)於純DMF/DCM (1:1,v/v,通常濃度為12 g/L)中之溶液中,隨後用純DIPEA(通常7.5 mL)調整反應混合物至6.0-6.5之表觀pH值,來進行偶合。在室溫下在攪拌下進行偶合。Mal-FMS-NHS連接子分兩部分添加(第一部分:1.5當量;第二部分0.5當量Mal-FMS-NHS;當量係根據肽樹脂之負載來計算;在抽出第一部分後添加第二部分)。各偶合步驟進行22至24小時。隨後過濾、用DMF(通常8.5 mL/g樹脂,3次)、MeOH(通常8.5 mL/g樹脂,3次)及異丙醚(通常8.5 mL/g樹脂,3次)連續洗滌樹脂及隨後在真空中乾燥(69至118 h),得到完全經保護之MAL-FMS-OXM樹脂。通常獲得116 g之量,至多243 g MAL-FMS-OXM樹脂。
*在使用Fmoc-SPPS法對OXM進行肽合成期間,胺基酸由針對胺基酸之各R基團之各種保護基保護,在藉由TFA自樹脂裂解期間脫除保護基。為合成FMS之Lys12或Lys 30定點偶合,使用ivDde保護離胺酸之胺基,例如對於OXM-Lys12-FMS,Lys12之R基團中之NH2藉由ivDde額外保護,ivDde藉由弱酸條件選擇性地移除,而使用其他保護基之所有其他胺基酸仍然經保護。對於特定N端偶合,使用常規SPPS。亦即,完成OXM合成,接著添加MAL-FMS-NHS,MAL-FMS-NHS僅僅偶合於未經保護之N端基團。 裂解 :
藉由在室溫下用TFA/H2
O/TIPS(84:8.5:7.5,v/v/v)處理肽樹脂3.5小時,獲得粗MAL-FMS-OXM。3.5小時後,添加1當量固體狀碘化銨,用於還原Met(O)-。4.0小時後,添加固體狀抗壞血酸(1.5當量)。再攪拌裂解混合物5分鐘,且在異丙醚(IPE)(通常每毫升裂解混合物5 mL)中沈澱。藉由過濾來分離且在真空中乾燥(通常41至90小時)。 純化
應用二維純化方案(代替一維) 改變固定相及梯度。 樣品稀釋劑:50%乙酸 管柱:Luna C8(10 μm,100 Å),30 cm×25 cm 注射流速:1500 ml/min 跑動流速:1500 ml/min 緩衝系統及梯度:第一維度,0.1% H3PO4(pH 2)(A:3%,B:60% ACN)(梯度型態:0% B-70 min-100% B);及第二維度,0.1% TFA溶離劑(pH 2)(A:3%,B:100% ACN)(梯度型態:0% B-97 min-100% B)。 偵測波長:220 nm PEGSH 結合於 MAL-FMS-OXM
使肽MAL-FMS-OXM(B)(12.3 g,1當量)及PEG30-SH(1.1當量,67.8 g(活性SH-基團))分別溶解在含有10% ACN之20 mM NaOAc緩衝液(pH 4.7)中(肽為12 g/L且PEG30-SH為10 g/L)。調整pH值至6.1(藉由使用NaOAc水溶液,pH 9.3)後,在室溫下在惰性氛圍下攪拌溶液通常1小時。接著,將pH值用AcOH(25% v/v)調整至4.5-5.0,且所得反應混合物用於製備型HPLC純化。
樣品稀釋劑:來自聚乙二醇化反應之粗物質 管柱:Luna C18(2)(10 μm,100 Å),20 cm×28 cm 注射流速:907 ml/min 跑動流速:907 ml/min 緩衝系統:0.1% TFA溶離劑(pH 2.0)(A:5% ACN,B:90% ACN) 梯度型態:5% B - 30 min - 5% B - 66 min - 78% B -1 min - 90% B -15 min - 90% B 偵測波長:220 nm
彙集經純化之溶離份且凍乾。實例 2 GLP-1 受體活化之活體外表徵 GLP-1 受體活化之活體外表徵
使用兩種不同細胞株評估GLP-1受體之活化;HTS163C2(Millipore)及cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R(Discoverx),兩者均表現GLP-1受體。HTS163C2(Millipore)在96孔半區域白色盤(Greiner)中以100,000個細胞/毫升之密度接種且在37℃下培育24小時。將細胞與遞增濃度之非均質PEG30-FMS-OXM及3種均質PEG30-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)一起培育。藉由HTRF分析法(Cisbio 62AM4PEB)定量細胞cAMP濃度,且藉由PRISM軟體分析EC50參數。cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R在配位體結合於受體時分泌cAMP。將細胞以500000個細胞/毫升之密度接種在96孔盤中,且在37℃與5% CO2
下培育24小時。配位體在含有IBMX之稀釋劑中稀釋且在37℃與5% CO2
下一式兩份地添加至培養孔,歷時30分鐘。PEG30-FMS-OXM之濃度範圍為1.5×10-10
至1.2×10-6
M。將溶解緩衝液及偵測試劑添加至孔且使用化學發光信號偵測cAMP濃度。建立劑量依賴性曲線且使用PRISM軟體,藉由應用最佳擬合劑量反應模型(四參數)來計算各種配位體之結合親和力(EC50)。
使用表現GLP-1受體之兩種不同細胞株,評估PEG-S-MAL-FMS-OXM(MOD-6030;非均質)及PEG-S-MAL-FMS-OXM之3種不同均質變異體(胺基(MOD-6031)、Lys12及Lys30)的GLP-1受體結合活化:Millipore HTS163C2細胞株及cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R。藉由計算各變異體之EC50,接著計算各變異體相對於非均質(MOD-6030)型式之效能(將各均質變異體之EC50除以非均質型式之EC50且乘以100)來確定效能。EC50值及所計算之相對效能呈現在表4中。為進行比較,量測OXM及GLP-1對cAMP Hunter CHO-K1 GLP1R細胞株之GLP-1受體的結合親和力。
表4:GLP-1及升糖素受體結合活化
將均質變異體之相對效能與非均質型式相比且概述在表4中。使用Millipore HTS163C2及cAMPHunter™ CHO-K1 GLP1R量測,胺基變異體與非均質變異體之可比生物活性分別展現72.2%及99.1%之相對效能。
使用Millipore HTS163C2細胞株,Lys12及Lys30變異體展示GLP-1受體結合活化減少2及4倍,而使用cAMP Hunter™CHO-K1 GLP1R細胞株,僅僅分別展示少量減少及減少2倍。胺基變異體證明與其他變異體相比結合活性優良的事實令人意外,因為據報導OXM之N端與OXM結合於GLP-1受體有關(Druce等人,2008)。總體而言,胺基變異體及非均質變異體展示可比生物活性。量測OXM及GLP-1肽之GLP-1受體結合活化。發現OXM及GLP-1展示比非均質PEG30-FMS-OXM高5.9及508.7倍之受體結合活化。實例 3 升糖素受體活化之活體外表徵 升糖素受體活化之活體外表徵
使用過度表現升糖素受體之cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR細胞株,評估升糖素受體之活化。此細胞株在配位體結合於升糖素受體時分泌cAMP。將細胞以500000個細胞/毫升之密度接種在96孔盤中,且在37℃與5% CO2
下培育24小時。配位體在含有IBMX之稀釋劑中稀釋且在37℃與5% CO2
下一式兩份地添加至培養孔,歷時30分鐘。MOD-6031之濃度範圍為5.8×10-11
至2.7×10-7
M。將溶解緩衝液及偵測試劑添加至孔且使用化學發光信號偵測cAMP濃度。建立劑量依賴性曲線且使用PRISM軟體,藉由應用最佳擬合劑量反應模型(四參數)來計算各種配位體之結合親和力(EC50)。
使用過度表現升糖素受體之cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR細胞株,測定PEG-S-MAL-FMS-OXM變異體與升糖素受體之結合親和力。此細胞株用於表徵非均質PEG-S-MAL-FMS-OXM(MOD-6030)及PEG-S-MAL-FMS-OXM之3種不同均質變異體:胺基(MOD-6031)、Lys12及Lys30。藉由計算各變異體之EC50,接著計算各變異體相對於非均質型式之效能(將各均質變異體之EC50除以非均質型式之EC50且值乘以100)來確定效能。EC50值及所計算之相對效能呈現在表4中。胺基變異體展示與非均質型式可比之結合活性。Lys30變異體展示最高生物活性且Lys12展示減少1.8倍。量測OXM及升糖素肽之升糖素受體結合活化。發現OXM及升糖素展示比非均質PEG30-S-MAL-FMS-OXM高11.1及283倍之受體結合活化。實例 4 PEG30-FMS-OXM 變異體對葡萄糖耐受性之誘導
C57BL/6雄性小鼠空腹隔夜,接著稱重,且使用手持型血糖儀,藉由尾靜脈取樣來量測血糖含量。小鼠IP注射PEG-SH(媒劑)、PEG30-FMS-OXM(非均質)及PEG30-FMS-OXM之三種均質變異體(胺基、Lys12及Lys30)。測試物品投與後15分鐘,IP投與葡萄糖(1.5 gr/kg)。在葡萄糖投與前及葡萄糖投與後10、20、30、60、90、120及180分鐘,使用手持型血糖儀,藉由尾靜脈取樣,量測血糖含量。
為評估非均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30
-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12
及Lys30
)之活體內活性,應用IPGTT模型。向空腹隔夜之C57BL/6小鼠IP注射不同化合物及媒劑(PEG-SH),接著IP注射葡萄糖及使用血糖儀,自尾靜脈量測血糖含量。在IP注射葡萄糖(1.5 gr/kg)前15分鐘,IP投與PEG-SH(238.10nmol/kg)、非均質及均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM(100 nmol/kg肽含量)。與媒劑組相比,所有化合物均誘導葡萄糖耐受性。意外地,與活體外活性結果相反,均質胺基變異體略微不如兩種其他變異體及非均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM(表5,圖 3
)有效,如葡萄糖AUC比其他變異體略高所反映。但與媒劑PEG-SH對照相比,所有變異體均顯著提高葡萄糖耐受性。
表
5
:
C57BL/6
小鼠中之葡萄糖耐受性
可逆PEG30
-S-MAL-FMS-OXM之非均質及均質變異體展示在活體外與活體內IPGTT模型中具有活性。意外地,活體外結果與文獻中提出之以下結果不一致:天然OXM之N端與肽結合於GLP-1受體有關;因此,預期胺基端變異體將在活體外與活體內展示最低效能。然而,使用兩種不同細胞株,PEG30
-S-MAL-FMS-OXM之均質胺基變異體證明與兩種其他均質變異體相比,GLP-1受體活化提高(表4),同時證實在IPGTT活體內模型中功效可比。IPGTT活體內模型似乎呈現可比活性(考慮動物之間的變化性)。雖然在不同PEG30-FMS-OXM變異體之間觀測到對GLP-1R及GCGR之不同活體外結合活化,但展示誘導葡萄糖耐受性之能力可比(表4及5)。意外地,在活體內IP葡萄糖耐受性測試中未反映出如cAMP誘導分析法中所示,均質胺基PEG30
-S-MAL-FMS-OXM之優良活體外活性。與兩種其他變異體及非均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM相比,均質胺基變異體PEG30
-S-MAL-FMS-OXM展示最低葡萄糖耐受性型態。然而,仍然展示與媒劑相比顯著葡萄糖耐受性作用(圖 3
)。實例 5 在 OB/OB 小鼠模型中 PEG30 - S-MAL-FMS-OXM 變異體對體重、血糖及脂質型態之改善 物質與方法
研究 1
:使二十五隻雄性ob/ob小鼠(雄性,B6. V-Lep^ob/OlaHsd,5-6週齡,Harlan)適應設施(10天),接著進行處置方案,其中如同給藥一般,處置動物,但實際上未稱重或給藥(10天)。隨後,動物經歷7天之基線時間段,其中其藉由皮下途徑一週給與適當媒劑兩次,體積為20 ml/kg。每日記錄體重、食物及水攝入,且取得樣品,用於非空腹及空腹葡萄糖量測及非空腹及空腹胰島素量測。隨後基於體重及血糖型態,動物分成五個處理組(N=5)。如表1中所述,每四天(天:1、5、9、13及16)向動物給藥。在處理期期間,在給藥前,每日量測且記錄食物攝入、水攝入及體重。已進行若干程序及取樣:第2天、第6天、第14天及第17天非空腹及空腹葡萄糖(第17天,僅僅量測非空腹葡萄糖)、空腹及非空腹胰島素(第2天、第6天及第14天)。針對膽固醇,分析第19天終末樣品。
表
1
:研究設計
研究
2
:
使一百隻雄性ob/ob小鼠(5-6週齡,Charles River)適應設施(3天),接著進行處置方案,其中如同給藥一般,處置動物,但實際上未稱重或給藥(7天)。隨後,動物經歷7天之基線時間段,其中其藉由皮下途徑一週給與PEG30-SH媒劑(146 mg/ml)兩次,體積為20 ml/kg。每日記錄體重、食物及水攝入。隨後,動物分成8個處理、對照及成對進食組(A-H組,N=8)(表2)。成對進食組與MOD-6031之高劑量(6000 nmol/kg)組成對進食,且假定每日食物配給等於前一天組D中其成對對應者所食用之食物配給。向3個其他組(組I-K,N=12)投與1000、3000及6000 nmol/kg之MOD-6031,且用於取樣進行PK分析。PEG-SH媒劑(292 mg/ml)、1000、3000及6000 nmol/kg之MOD-6031及成對進食組一週兩次投與,歷時32天,而OXM、Liraglutide®及PBS每日投與兩次。每日量測體重、食物及水攝入。一週量測非空腹及空腹葡萄糖一次,在第2天及第30天進行OGTT。分析終末血液樣品(第33天)之葡萄糖、胰島素、膽固醇以及MOD-6031、PEG-S-MAL-FMS-NHS及OXM濃度。PK組中之小鼠接收單次劑量之MOD-6031,且在4、8、24、36、48、72、96及120小時(每一時間點n=3)取得血液樣品,以進行PK分析,允許藉由LC-MS/MS方法定量MOD-6031及其化合物濃度。
表
2
:研究設計
研究
3
:
使四十二隻雄性ob/ob小鼠(7週齡,Charles River,意大利)適應設施(10天),接著進行處置方案,其中如同給藥一般,處置動物,但實際上未稱重或給藥。隨後,動物經歷1週之基線時間段,其中各動物藉由皮下途徑給與PEG30-SH兩次,體積為20 ml/kg。每日記錄體重、食物及水攝入,且取得樣品,用於非空腹及空腹葡萄糖量測及非空腹及空腹胰島素量測。隨後基於血漿葡萄糖、體重及每日食物及水攝入,動物分成三個處理、對照及成對進食組(組A,N=10,組B-E,N=8)。成對進食組與組B(PEG-S-MAL-FMOC-OXM)成對進食,但用PEG-SH(204.5 mg/kg)處理。假定每日食物配給等於前一天組B中其成對對應者所食用之食物配給。因而,在所有研究程序及量測中,組E中之動物將與組B相差一天。在研究期間,如表3中所述,每四天向動物給藥(第1天、第5天、第9天、第13天、第17天、第21天、第25天及第29天)。在處理期期間,在給藥之前,每日量測且記錄食物攝入、水攝入及體重。已進行若干程序及取樣:第1天、第6天、第14天、第22天及第29天非空腹葡萄糖、第10天、第18天及第26天空腹葡萄糖。第2天及第30天空腹葡萄糖樣品已視為OGTT程序之一部分,其中與葡萄糖同時量測胰島素。分析第33天終末樣品之膽固醇、三酸甘油酯及果糖胺。
表
3
:研究設計
結果
ob/ob
小鼠模型展現ob
基因之一種突變,此突變使得小鼠無法產生瘦素且顯現特徵為高胰島素血症、肥胖症、暴食、胰島素抗性及隨後高血糖症之表型。此等小鼠用作兩次不同研究中糖尿病之遺傳模型以評估PEG30-FMS-OXM(非均質)及PEG30-S-MAL-FMS-OXM之三種均質變異體(胺基、Lys12及Lys30)之功效。
研究 1
:此研究比較當以2000 nmol/kg投與時均質變異體(胺基、Lys12及Lys30)及非均質MOD-6030之功效。與媒劑(PEG-SH)組相比,所有測試物品均減輕體重,其中Lys12、MOD-6030、胺基及Lys30變異體之最終減輕(第18天)分別為3.1%、4.7%、4.9%及6.5%(圖 4
)。在注射藥物後第1天、第5天、第13天及第16天觀測到體重減輕(圖 4
)。對於所有處理組,在藥物投與後,均觀測到食物攝入減少(除第9天外)(圖 5
)。沿著研究量測血糖參數展示胺基及Lys12處理組改善非空腹葡萄糖(圖 6A
)且所有處理組改善空腹葡萄糖(圖 6B
)。所有處理組均展示與對照相比顯著更低之胰島素含量。值得注意地,此研究中之投與劑量為2000 nmol/kg,其為MOD-6030之較低有效劑量,且因此體重、食物攝入及血糖型態之改善相對中等。意外地,胺基變異體為展示能夠減輕體重、抑制食物攝入及改善血糖控制之優良功效的唯一變異體。自製造角度而言,考慮到固相合成中之肽自胺基端延伸,胺基變異體之樹脂上合成為最簡單程序。與位置12及30處之離胺酸之內部胺基相比,末端胺較佳可用於偶合。此可用性反映在與Lys12及Lys30變異體相比,胺基變異體之製造產率更高。另一益處為對於非均質變異體而言,形成胺基變異體之合成相對於OXM合成保持不變,而Lys12及Lys30變異體之合成藉由改變用於肽合成之Lys及藉由添加選擇性裂解步驟(選擇性地移除Lys之保護基)而有所改變。如前針對非均質發展之OXM合成已最佳化,實現更佳產率及穩固性。總體而言,自製造角度而言,樹脂上合成胺基變異體為簡單的,且具有優於替代變異體之優點。均質變異體亦具有優於非均質變異體之優點,因為其更適合於藥物研發及藥物治療。
研究 2
:此研究調查在ob/ob
小鼠模型中以1000、3000及6000 nmol/kg一週兩次投與MOD-6031(胺基變異體)對藥理學及藥物動力學參數之長期作用,而OXM及利拉魯肽(長效GLP-1受體促效劑)作為參考化合物進行評估。所量測之藥理學參數為體重、食物及水攝入、葡萄糖控制及脂質型態。一週兩次投與高劑量MOD-6031(6000 nmol/kg)顯著減少食物攝入及體重(圖 7
;圖 8
),而較低劑量(3000及1000 nmol/kg)展示較低作用。在研究結束時(第33天),1000、3000及6000 nmol/kg之動物展示體重分別減輕5.2%、12.3%及28.3%。與高劑量組成對且食用相同量之食物(除空腹日外)之成對進食組雖然進行類似食物攝入,但體重減輕12.7%。此現象可歸因於PEG30-FMS-OXM之胺基變異體能夠增加能量消耗,且因此用6000 nmol/kg胺基變異體處理之動物的體重減輕比其成對進食組之體重減輕多。在研究期間,OXM與利拉魯肽均顯著減輕體重,分別減輕10.3%及8.3%。監測第1天、第5天、第12天、第19天、第26天及第29天之非空腹葡萄糖及第2天、第9天、第16天、第23天及第30之空腹葡萄糖的血糖型態之量測展示此等參數顯著改善,尤其6000 nmol/kg(圖 9A
;圖 9B
)。在第2天及第30天進行口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)研究(分別圖 10
及圖 11
)。結果展示在1000、3000及6000 nmol/kg組中,MOD-6031(胺基變異體)顯著且劑量依賴性地提高葡萄糖耐受性,其中血漿葡萄糖顯著減少。與最高MOD-6031劑量成對進食之動物展現葡萄糖給與後葡萄糖偏移,在任一測試時間點,此與對照未顯著不同。在OGTT研究第2天,改善之葡萄糖型態引起胰島素反應延遲,其略微延遲且對AUC 0-120 min之刺激更高(圖 10
)。此可歸因於MOD-6031之藥理學活性誘發之胃排空抑制,引起葡萄糖延遲釋放至血液中及第二胰島素分泌階段。OGTT研究第30天引起與對照相比,胰島素反應減少,表明化合物提高胰島素敏感性(圖 11
)。另外,MOD-6031劑量依賴性地減少終末膽固醇;在6000 nmol/kg劑量MOD-6031下觀測到之減少顯著超過成對進食對應物(圖 12
)。體重、食物攝入、血糖及脂質型態之所有此等藥理學改善不僅超過經OXM或利拉魯肽每日兩次處理之動物,而且亦顯著超過在成對進食之對應者中觀測到之作用。
使用LC-MS/MS合格方法量測MOD-6031(PEG--S-MAL-FMS-OXM)及其水解化合物(PEG--S-MAL-FMS及OXM)之終末血液含量。結果展示MOD-6031處理組之劑量依賴性濃度(表6)。此數據與第2天之化合物含量(單次投與後)的比較展示OXM肽在研究期期間當一週兩次投與時不累積。PEG--S-MAL-FMS及PEG-S-MAL-FMS-OXM展示在研究期間中度累積(表6)。在最後一次注射後24小時(第33天),MOD-6031最高劑量之MOD-6031及OXM肽之實際濃度分別為490 µg/ml及0.37 µg/ml。來自對照動物之所有樣品均低於分析下限。
表 6
:單次劑量(第2天)與最後一次注射重複MOD-6031給藥方案(第33天)後24小時血漿濃度之比較
*包含雜質之劑量為1515、4545及9090 nmol/kg實例 6 在 ob/ob 小鼠模型中 MOD-6031 變異體對藥物動力學參數之改善 結果
三組(n=12)ob/ob小鼠單獨投與1000、3000及6000 nmol/kg MOD-6031,且在投與後4、8、24、36、48、72、96及120小時抽血(每一時間點n=3),以進行PK分析,且藉由LC-MS/MS法測定MOD-6031之量及其化合物濃度。計算MOD-6031(PEG-S-MAL-FMS-OXM)及其水解產物PEG-S-MAL-FMS-NHS及OXM之藥物動力學參數,諸如Cmax、Tmax、AUC、T1/2Cl及Vz,此等參數分別呈現在表7a、7b及7c中。對於所有組分,在所有劑量下,AUC 0-∞在AUC 0-t之15%內,表明取樣時程足以表徵各組分之藥物動力學型態。對於全部三種組分,暴露似乎與劑量成比例。一般而言,Cmax及AUC0-t隨劑量而增加,且比例與劑量增加大致相同。
各組分之參數以莫耳濃度表示在表8中。PEG-S-MAL-FMS-OXM與PEG-S-MAL-FMS-NHS之Cmax值大致相等,且OXM較低。所觀測到之PEG-S-MAL-FMS-OXM及OXM之T1/2
分別為約9及12小時。PEG-S-MAL-FMS-NHS之終末T1/2
長得多,約30小時。來自對照動物之所有樣品及在給藥前收集之所有樣品均低於分析下限。
藥物動力學及藥理學數據證實MOD-6031之長效特性。一週兩次給與3000 nmol/kg MOD-6031顯著減輕體重及減少食物消耗,此與OXM肽處理組一天兩次投與6000 nmol/kg劑量相當,亦顯著減少載藥量。
表 7a
:在SC注射1000、3000或6000 nmol/kg後PEG-S-MAL-FMS-OXM藥物動力學參數
表 7b
:在SC注射1000、3000或6000 nmol/kg MOD-6031後PEG-S-MAL-FMS-NHS藥物動力學參數
注意:歸因於給藥溶液中之PEG-S-MAL-FMS-NHS雜質,PEG-S-MAL-FMS-NHS(MOD-6031加PEG-S-MAL-FMS- NHS雜質)之投與劑量為1515、4545及9090 nmol/kg,分別代替1000、3000及6000 nmol/kg。
表 7c
:SC注射1000、3000或6000 nmol/kg MOD-6031後OXM藥物動力學參數
NC= 由於濃度對比時間型態曲線之形狀,無法計算參數
表 8
:以莫耳計比較三種組分之藥物動力學參數
a
PEG-S-MAL-FMS-NHS之劑量說明雜質(MOD-6031加PEG-S-MAL-FMS-NHS雜質)。
在動物中MOD-6031劑量依賴性地減少終末葡萄糖且顯著減少胰島素(p<0.01,圖 27
),指示MOD-6031處理提高胰島素敏感性。對於兩個變數,在6000 nmol/kg劑量MOD-6031下觀測到之減少顯著超過成對進食對應者(p<0.001)。在研究結束時,利拉魯肽對血漿胰島素或葡萄糖無統計學上顯著之作用。相比之下,調酸素顯著減少兩個參數(葡萄糖為p<0.05,胰島素為p<0.001)。實例 7 在 ob/ob 小鼠模型中與 PEG30-FMOC-OXM 及 PEG30-EMCS-OXM 相比 PEG30-FMS-OXM 對 體重、血糖及脂質型態之改善
ob/ob小鼠模型用作此研究中糖尿病之遺傳模型以評估MOD-6031(PEG30-S-MAL-FMS-OXM)對比其水解速率緩慢之變異體(PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM)及其中N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)丁二醯亞胺(EMCS)替換Fmoc作為連接子之其不可逆形式(PEG30-EMCS-OXM)的藥理學功效。在所有三種聚乙二醇化結合物中,連接子在OXM肽之N胺基端側。
此研究比較當每四天以6000 nmol/kg投與時MOD-6031、PEG30-Fmoc-OXM及PEG30-EMCS-OXM之藥理學功效,而PEG-SH用作研究對照。所量測之藥理學參數為體重、食物及水攝入、葡萄糖及胰島素控制以及脂質型態。在研究開始兩週或三週期間,與媒劑(PEG-SH)組相比,所有三種結合物之投與均顯著減少體重及食物攝入(圖 13
;圖 14
),而僅僅MOD-6031直至研究終止均展現此傾向,且程度更大。MOD-6031、PEG30-Fmoc-OXM及PEG30-EMCS-OXM與對照(PEG-SH)相比,體重之最終減少改變(第33天)分別為25.4%、5.1%、2.4%。與對照相比,僅僅MOD-6031顯示顯著較低之體重值。與其成對進食組相比,PEG30-Fmoc-OXM之體重之減少改變不顯著(2.6%)。在MOD-6031及PEG30-Fmoc-OXM每次藥物注射後均觀測到體重減少,而對於PEG30-EMCS-OXM,重量減少僅僅發生在空腹隔夜後給藥之日。對於食物攝入減少,已觀測到相同型態。沿著研究量測血糖參數展示MOD-6031組顯著改善非空腹葡萄糖(圖 15A
)且MOD-6031及PEG30-Fmoc-OXM組顯著改善空腹葡萄糖(圖 15B
)。在第2天及第30天進行OGTT程序(分別圖16及17)。關於第2天OGTT,MOD-6031及PEG30-Fmoc-OXM顯著提高葡萄糖耐受性,其中血漿葡萄糖顯著減少且同時胰島素分泌顯著增加(圖 16
)。成對進食組動物展現葡萄糖給與後葡萄糖偏移,在任一測試時間點,此與對照未顯著不同。關於第30天OGTT,觀測到MOD-6031與PEG30-Fmoc-OXM之葡萄糖型態顯著改善,然而,後者程度較小。另外,在兩組中觀測到與對照相比胰島素反應減少,表明化合物提高胰島素敏感性(圖 17
)。分析終末血漿樣品之脂質型態,且果糖胺展示MOD-6031與PEG30-Fmoc-OXM之兩個檢查均顯著減少(圖 18
;圖 19
)。在兩種情況中,如所有其他研究結果中,MOD-6031展現超過PEG30-Fmoc-OXM。實例 8 MOD-6031 之離體水解速率之活體外表徵
進行此研究以表徵及比較MOD-6031在不同條件下之離體水解速率:不同pH值、溫度及不同物種之血漿。材料與方法
藉由液相層析大氣壓電離串聯質譜分析(LC-MS/MS),在K2EDTA大鼠及猴血漿中,證實用於測定PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS及OXM之生物分析法。穩定標記之PEG-S-MAL-FMS-OXM、穩定標記之PEG-S-MAL-FMS-NHS及13
C24,15
N4-OXM分別用作PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS及OXM之內標。藉由使用乙腈在低pH值下進行蛋白質沈澱萃取,自測試血漿樣品萃取PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS及OXM及其內標。蒸發至乾及復原後,藉由LC-MS/MS分析萃取物。針對所有資料集,新製PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS及OXM之校準曲線,且用於定量所分析組分。
藉由使用pH 6.8、7.4及7.8之磷酸鹽緩衝液,來達成不同pH值。在大鼠血漿中檢驗在35℃、37℃及41℃之溫度下培育。在37℃下評估在大鼠、食蟹獼猴或人類血漿中培育之MOD-6031之水解速率的比較。對於人類血漿,使用來源於雄性及雌性個體之血漿量測彙集與個別樣品。MOD-6031(400 µg/ml總物質)添加至含有相關血漿或緩衝液之管(N=3),且樣品在以上不同條件下培育0(緊接在添加物質之後)、4、8、24、48及72小時。在指示時間點,藉由樣品冷凍在-70℃下,來終止水解。在添加MOD-6031前,DPPIV抑制劑(1%)及抑肽酶(500KIU/ml)添加至血漿樣品,以避免蛋白水解酶進行之不相關及非特異性裂解。對於各條件,製備三種獨立樣品。樣品在35℃、37℃或41℃之給出溫度下培育。在分析前所有樣品均儲存於-70℃下。利用LC-MS/MS方法,定量MOD-6031(PEG-S-MAL-FMS-OXM)、OXM及PEG-S-MAL-FMS-NHS濃度。建立MOD-6031水解型態且計算在不同血漿基質中之水解速率。
研究條件為: a. pH值,其中水解在pH 6.8、7.4及7.8下測試; b. 溫度,其中水解在35℃、37℃及41℃之溫度下測試;以及 c. 血漿來源,其中水解在自大鼠、食蟹猴及人類獲得之血漿樣品中測試。對於人類血漿,使用彙集與個別樣品,且分開量測來自雄性及雌性之血漿的水解速率。
MOD-6031(400 µg/ml總物質)在不同條件下培育至多72小時。在指示時間點,取得樣品用於LC-MS/MS分析。對MOD-6031及其降解產物OXM及PEG-S-MAL-FMS-NHS定量,且因此進行藥物動力學分析。
結果表明pH水準對MOD-6031水解速率有影響;較高pH值(pH 7.8)下水解速率高於較低pH值(pH 6.8)下水解速率(表9,圖 20A-20C
)。關於溫度,與在35℃或37℃下培育之水解速率相比,在41℃下培育產生更高水解速率(表10,圖 21A-21C
)。在大部分血漿樣品中MOD-6031具有可比水解速率,如所量測基質中OXM及PEG-S-MAL-FMS-NHS濃度之類似清除率及類似增加所反映(表11,圖 22A-22C
)。在相同物種之不同批次中及物種之間,OXM清除率存在變化。PEG-S-MAL-FMS-NHS清除率在不同血漿物種中非常類似。
結論:
在來自大鼠、猴及人類基質之血漿中培育的MOD-6031之水解速率及水解模式非常相似且未展現超過自各物種之不同個體所觀測的顯著差異。
表 9
:不同pH值下PEG-S-MAL-FMS-OXM、OXM及PEG-S-MAL-FMS-NHS之PK分析
表 10
:在不同溫度下PEG-S-MAL-FMS-OXM、OXM及PEG-S-MAL-FMS-NHS之PK分析
表 11
:OXM、PEG-S-MAL-FMS及PEG-S-MAL- FMS-OXM之PK值 實例 9 由來自二肽基肽酶 IV ( DPPIV ) 消化之 MOD-6031 的 PEG 部分提供之保護之活體外評估
MOD-6031、OXM肽及PEG-EMCS-OXM與DPPIV一起培育且藉由RP-HPLC測試各者之消化。鑑別及量測消化及非消化形式。
首先,評估在10 mM Tris緩衝液中在兩個不同pH水準(pH=6及pH=7)下OXM肽降解之初始檢查。在37℃下培育各反應物1小時。培育後,將50 μl反應物用100 μl含0.1% TFA之DDW稀釋。接著10 μl此溶液負載在RP-HPLC Intrada WP-RP 2×50 mm,3 μm,300 Å管柱(總共3.3 μg)上。
使用RP-HPLC管柱鑑別OXM及MOD-6031之非消化及消化形式。裂解OXM(OXM之活性形式)OXM3-37之溶離時間與OXM肽相差0.2 min。藉由量測相對面積百分比,來評估消化百分比。對於各反應,製備及量測無DPPIV之對照樣品。
MOD-6031及PEG-EMCS-OXM與DPPIV一起培育且量測消化百分比。反應條件與以上針對OXM肽所述相同。
酶二肽基肽酶IV(DPPIV)為一種在大部分細胞類型中表現之內源性膜醣蛋白,且自多肽之N端裂解二肽。已在活體外及活體內證明OXM藉由DPPIV之消化,且認為此消化為血流中肽半衰期短之主要原因。OXM在位置2與3處之胺基酸之間裂解,產生非活性形式OXM3-37。在此研究中,檢查DPPIV對呈可逆及不可逆結合(分別MOD-6031及PEG-EMCS-OXM)連接於PEG之OXM肽的消化。
初始評估在pH=6相對於pH=7下DPPIV酶對OXM肽降解之速率,表明在pH=6下DPPIV酶更有效,其中在37℃下培育1小時後,與pH=7下26.52相比,在pH=6下OXM3-37之相對面積%為46.12(圖 23-2
4,表12-15)。因此,在pH=6下進行MOD-6031之消化研究,其亦為防止MOD-6031水解之較佳條件。
量測MOD-6031及PEG-EMCS-OXM之消化百分比。評估MOD-6031結合物在與DPPIV一起培育後之降解(圖 25
,表17),且藉由RP-HPLC管柱,使用與用於OXM肽相同之條件進行分析。作為陰性對照,在變化pH值及/或溫度下但不添加DPPIV下進行反應以證實OXM未水解。作為陽性對照,對評估非結合物一部分之OXM之水解的反應進行量測。(圖 25
,表16)。
在不存在酶DPPIV下培育MOD-6031後未觀測到MOD-6031降解,且因此,OXM未水解,相對面積百分比為98.28。進行與DPPIV 1X [DPPIV濃度](表17)及10X [DPPIV濃度(表18)之兩個反應。在兩個反應中,未觀測到OXM降解且MOD-6031之相對面積百分比分別為98.49及98.24。
亦以相同方式,針對DPPIV對OXM之降解,測試不可逆聚乙二醇化PEG-EMCS-OXM(圖 26
,表20)。作為對照,進行無DPPIV之反應(圖 26
,表19)。在兩個反應中,未觀測到結合物降解。PEG-EMCS-OXM之相對面積百分比分別為98.48及99.09。
基於此處呈現之結果,可推斷經由可水解或不可水解連接子結合於PEG部分之OXM避免由DPPIV降解。表 12
:pH=6下OXM之降解分析
表 13
:pH=6下OXM+ DPPIV之降解分析
表 14
:pH=7下OXM之降解分析
表 15
:pH=7下OXM+DPPIV之降解分析
表 16
:pH=6下MOD-6031之降解分析 表 17
:pH=6下MOD-6031+ DPPIV(1X DPPIV濃度)之降解分析
表 18
:pH=6下MOD-6031+ DPPIV(10X DPPIV濃度)之降解分析
表 19
:pH=6下PEG-EMCS-OXM之降解分析
表 20
:pH=6下PEG-EMCS-OXM+ DPPIV之降解分析 實例 10 MOD-6031 之調配物研發
可逆聚乙二醇化肽
:MOD-6031由式 IIa
之結構表示,其中PEG為PEG30
且R2
為在茀之位置2處之SO3
H:
式 IIa
包含具有如SEQ ID NO: 1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO: 1)中所闡述之序列的37胺基酸調酸素(OXM)肽,及經由硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵連接於可裂解間隔子-FMS連接子之30 kD PEG-SH。OXM肽亦經由可裂解胺基甲酸酯鍵附接於間隔子。MOD-6031對鹼性pH值敏感且分解成PEG-FMA-OH及OXM部分。
膠凝分析
.
藉由視覺外觀觀察及估計溶液流動性來測定膠凝,其中零(0)代表完全固體凝膠(膠凝)且十(10)代表完全流體溶液(自由流動)。
結果
在黏度篩選及緩衝液選擇期間,在至多3小時之短時段後,大量樣品形成凝膠,如以下表21及表22中所示:表 21 :在變化 pH 值下不同緩衝液之膠凝分析 表 22 :在變化 pH 值下不同緩衝液之膠凝分析
表21及表22中呈現之結果展示膠凝受緩衝液類型、緩衝液pH值及MOD-6031濃度影響。在靠近100 mg/ml濃度下,乙酸鹽緩衝液提供與其他緩衝液基質相比改善之特徵,不過鑒於TPP,黏度量測值保持高值。
黏度分析
.
用Brookfield流變計(DV-III Ultra)量測黏度。對於各調配物,在25℃之控制溫度下自五個剪切速率(Sec-1
)讀取結果(15.0、30.0、45.0、60.0及75.0)之平均值獲得黏度。使用Rheocalc®軟體(Brookfield)處理數據。
為解決高黏度之問題,在若干條件下大規模篩選賦形劑。條件包含濃度、緩衝液類型、pH值及NaCl。藉由緩衝液之基質部分與三氟乙酸(TFA)之相互作用形成緩衝液,三氟乙酸與用於乾種子處理(DS)之粉末共同溶離。所有賦形劑篩選在pH 6下用20 mM檸檬酸鈉緩衝液進行。
所用篩選條件及賦形劑包含: 1. 檸檬酸鈉(pH 3、4、6) 2. 磷酸鈉(pH 3、7) 3. 乙酸鈉(pH 5) 4. 丁二酸鈉(pH 4、5、6) 5. 組胺酸(pH 6、7) 6. NaCl 7. 碘化鈉 8. 碘化鈣 9. 精胺酸 10. 離胺酸 11. 牛磺酸 12. 肌胺酸 13. 二甲基乙醯胺 14. NDSB*-195 15. NDSB*-201 16. NDSB*-256 17. 蔗糖 18. Triton-X 100 19. 聚山梨醇酯80 20. 苄星青黴素 21. 二乙醇胺 22. 二乙胺 23. 碘化葡甲胺 24. 普魯卡因鹽酸鹽 25. 樟腦-10-磺酸鹽 26. 二甲基亞碸 27. 甘胺酸 28. 二甲基亞碸 * NDBS = 非清潔劑磺基甜菜鹼結果
黏度篩選結果展示無一種賦形劑對黏度具有顯著影響(圖 29
)。以藍色展示之對照樣品為20 mM檸檬酸鈉,pH 6。表23-26呈現在開始點(T=0)及24小時後(T=24小時)乙酸鹽調配物緩衝液中50至100 mg/ml之一系列MOD-6031濃度之黏度篩選數據。結果展示對於50 mg/ml、60 mg/ml及70 mg/ml之濃度,pH 4.7下50 mM乙酸鹽緩衝液與pH 4.7下100 mM乙酸鹽緩衝液之間的黏度差異雖小,但明顯。表 23 : T=0 之 黏度量測 , 調配物緩衝液 : 50 mM 乙酸鹽 pH 4.7 表 24 : T=24 小時之 黏度量測 , 調配物緩衝液 : 50 mM 乙酸鹽 pH 4.7 表 25 : T=0 之 黏度量測 , 調配物緩衝液 : 100 mM 乙酸鹽 pH 4.7 表 26 : T=24 小時之 黏度量測 , 調配物緩衝液 : 100 mM 乙酸鹽 pH 4.7
隨後,在不同MOD-6031濃度(60-80 mg/mL)下,使用100 mM乙酸鹽、100 mM蔗糖、pH 4.7之調配物緩衝液,量測黏度。對於60-77 mg/ml之間的MOD-6031濃度,觀測到線性傾向(R2
=0.9974)(圖 30
)。此等結果以表格形式呈現在以下表27中:表 27 : 在不同 MOD-6031 濃度下黏度量測 , 調配物緩衝液 : 100 mM 乙酸鹽、 100 mM 蔗糖、 pH 4.7
對於表27中呈現之結果,在A280下,量測MOD-6031濃度(*),50%乙酸中1:20稀釋。Cimzia(**,聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol))為一種經批准之非經腸PEG-蛋白質藥物,其以200 mg/ml之濃度皮下投與,且此處用於與MOD-6031結果進行比較。
調配物緩衝液分析
測試之兩種調配物緩衝液之參數呈現在以下表28中:表 28 : 調配物緩衝液之參數
*藉由1:70重力稀釋法量測濃度。
可注射性分析
使用Instron儀器型號5942測試可注射性。在1 ml聚丙烯Luer鎖注射器(Becton-Dickinson C/N 309628)中使用26G及27G針(分別Becton-Dickinson C/N305111及C/N 305109)測試調配物。另外,使用28G針,利用原始1 ml注射器(Becton-Dickinson C/N329410)進行測試。對於各針尺寸,量測兩種速度速率:4.8 in/min及9 in/min,分別對應於每30秒及16秒之1 ml注射速度。結果
在一種情況下,可注射性之驗收準則設定在(滑移力)下。基於乙酸鹽之緩衝液之兩種不同調配物及使用三種不同規格針之可注射性的結果呈現在以下表29中。表30展示作為比較之經批准之非經腸PEG-蛋白質藥物Cimzia的可注射性。表 29 :兩種乙酸鹽調配物之可注射性 表 30 : Cimzia 之可注射性 結論:
基於以上研究,建立用於毒理學研究及I期臨床試驗之起始調配物以具有以下參數: 如在A280下量測,50-70 mg/ml之MOD-6031濃度 液體調配物 儲存溫度:-20℃ 緩衝液:100 mM乙酸鹽緩衝液,100 mM蔗糖,pH 4.7 穩定性:產物穩定至少12個月;繼續-20℃下穩定性研究實例 11 製備凍乾調配物
凍乾MOD-6031之水性緩衝溶液,例如,例如使用本文中之實例1或實例10之製備方法提供的MOD-6031之彙集之純化溶離份。
使用不同水性緩衝液溶液獲得MOD-6031之凍乾製劑。分析緩衝液類型及緩衝液pH值之作用。舉例而言,緩衝溶液係選自丁二酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液及乙酸鹽緩衝液。pH值係選自約pH 4.5、約pH 4.7、約pH 5.8或約pH 7.0。測試之緩衝液包含10.0 mM丁二酸鈉,pH 4.5;44.6 mM丁二酸鈉,pH 5.8;8.7 mM檸檬酸鈉,pH 4.5;25 mM檸檬酸鈉,pH 5.8;20.5 mM乙酸鈉,pH 4.5;50 mM乙酸鈉,pH 7.0;171.0 mM乙酸鈉,pH 5.8;100 mM乙酸鹽緩衝液,4.7。在某些情況下,水溶液將包含5%(w/v)海藻糖及/或蔗糖。在一些情況下,水溶液將包含100 mM蔗糖。在某些情況下,水溶液將包含甘露糖醇、甘胺酸或羥基乙基澱粉。在某些情況下,水溶液將包含非離子或離子型界面活性劑。
在10-100 mM之濃度下,在檸檬酸鹽或麩胺酸鹽或組胺酸或磷酸鉀緩衝液中製備MOD-6031之凍乾製劑。
藉由首先冷凍含有MOD-6031之水性緩衝溶液之小瓶且接著置於商業凍乾器,例如Labconco Freezon中36小時,進行凍乾。使用多個冷凍步驟及乾燥步驟進行替代凍乾方法,例如參見美國公開案第2001/0051604號,其全文併入本文中。使用如下凍乾循環進行另一凍乾方法:1. 冷凍溫度:-40℃-(-60℃),冷凍時間3-6小時;2. 主要乾燥:-30℃-(-10℃),持續時間10-72小時,壓力300-100毫托;3. 次要乾燥10℃-40℃,持續時間6-20小時,壓力100-200毫托。(替代循環為本領域中已知,例如美國專利第8/298,530號,其全文併入本文中)。
凍乾製劑經最佳化以最大程度地延長儲存而不損失生物活性。分析再懸浮之凍乾調配物,以例如比較活體外特徵及生物活性(實例3、8及9作為準則)及/或活體內特徵(參見實例4-7作為準則)。
儘管已在本文中說明及描述本文揭示之某些特徵,但本領域之普通技術人員現將想到多種修改、替代、變化及等效物。因此,應瞭解所附申請專利範圍意欲涵蓋全部此類修飾及改變,如處於本文揭示之調配物及組合物之真實精神內。
無
以下圖式形成本說明書之一部分,且包含以下圖式以進一步證實本發明之某些實施例,可參考此等圖式中之一或多者以及本文呈現之特定實施例的詳細描述更好地瞭解本文描述之組合物及調配物。圖 1
展示所產生之PEG-S-MAL-FMS-OXM結合物之不同變異體。圖 2
為展示非均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30
-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)在與過度表現GLP-1受體之CHO-K1細胞一起培育時之活體外活性(cAMP定量)的圖。圖 3
為展示在IPGTT模型中非均質PEG30
-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30
-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)之活體內活性的圖。與媒劑組相比,所有化合物均誘導葡萄糖耐受性。圖 4
展示在雄性ob/ob
小鼠中非均質PEG30-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)對體重之影響。圖 5
展示在雄性ob/ob小鼠中非均質PEG30-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)對食物攝入之影響。圖 6A-6B
展示在雄性ob/ob
小鼠中非均質PEG30-S-MAL-FMS-OXM及三種PEG30-S-MAL-FMS-OXM變異體(胺基、Lys12及Lys30)對非空腹(圖 6A
)及空腹葡萄糖(圖 6B
)之影響。圖 7
展示在雄性ob/ob
小鼠中MOD-6031、OXM及利拉魯肽(liraglutide)對累積食物攝入之影響。圖 8
展示在雄性ob/ob
小鼠中MOD-6031、OXM及利拉魯肽對體重之影響。圖 9A-9B
展示在雄性ob/ob
小鼠中MOD-6031、OXM及利拉魯肽對自由進食(圖 9A
)及空腹血漿葡萄糖(圖 9B
)之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性(p<0.05)。圖 10A-10B
展示在雄性ob/ob
小鼠中在研究第2天MOD-6031及成對進食組對葡萄糖耐受性(2 g/kg po)的影響。圖 10A
展示對血漿葡萄糖之影響,而圖 10B
展示對血漿胰島素之影響。圖 11A-11B
展示在雄性ob/ob
小鼠中在研究第30天MOD-6031及成對進食組對葡萄糖耐受性(2 g/kg po)的影響。圖 11A
展示對血漿葡萄糖之影響,而圖 11B
展示對血漿胰島素之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 12
展示在雄性ob/ob小鼠中MOD-6031、OXM及利拉魯肽對終末血漿膽固醇之影響。圖 13
展示在雄性ob/ob
小鼠中PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對體重之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 14
展示在雄性ob/ob
小鼠中PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對累積食物攝入之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 15A-15B
展示在雄性ob/ob
小鼠中重複投與PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對血漿葡萄糖之影響。圖 15A
展示對自由進食動物之影響且圖 15B
展示對空腹動物之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 16A-16B
展示在雄性ob/ob
小鼠中PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對葡萄糖耐受性(2g/kg po)之影響。圖 16A
展示對血漿葡萄糖之影響,而圖 16B
展示對血漿胰島素之影響。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 17A-17B
展示在雄性ob/ob
小鼠中重複投與PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對葡萄糖耐受性(2g/kg po)之影響。圖 17A
展示對血漿葡萄糖之影響,而圖 17B
展示對血漿胰島素之影響。圖 18
展示在雄性ob/ob
小鼠中重複投與PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對非空腹終末血漿脂質之影響。圖 19
展示在雄性ob/ob
小鼠中重複投與PEG30-S-MAL-Fmoc--OXM、MOD-6031及PEG-EMCS-OXM對非空腹終末血漿果糖胺之影響。圖 20A-20C
展示在磷酸鹽緩衝液中在不同pH水準下平均MOD-6031(圖 20A
)、OXM(圖 20C
)及PEG30-S-MAL- FMS-NHS(圖 20B
)濃度對比時間之圖。圖中所示之附接樹脂之PEG-FMS-OXM為MOD-6031且具有圖 28A
中所示之結構。圖中之PEG-FMS係指如圖 28B
中呈現之PEG30-S-MAL-FMS-NHS。圖 21A-21C
展示在大鼠血漿中在不同溫度下平均MOD-6031(圖 21A
)、OXM(圖 21C
)及PEG30-S-MAL-FMS-NHS(圖 21B
)濃度對比時間之圖。圖中所示之附接樹脂之PEG-FMS-OXM為MOD-6031且具有圖 28A
中所示之結構。圖中之PEG-FMS係指如圖 28B
中呈現之PEG30-S-MAL-FMS-NHS。圖 22A-22C
展示在不同血漿類型中平均MOD-6031(圖 22A
)、OXM(圖 22C
)及PEG30-S-MAL-FMS-NHS(圖 22B
)濃度對比時間之圖。圖中所示之附接樹脂之PEG-FMS-OXM為MOD-6031且具有圖 28A
中所示之結構。圖中之PEG-FMS係指如圖 28B
中呈現之PEG30-S-MAL-FMS-NHS。圖 23
展示在pH=6下OXM及OXM+DPPIV之降解分析。圖 24
展示在pH=7下OXM及OXM+DPPIV之降解分析。圖 25
展示在pH=6下MOD-6031、MOD-6031+ DPPIV(1X [DPPIV濃度]及10X [DPPIV濃度])之降解分析。圖 26
展示在pH=6下PEG-EMCS-OXM及PEG-EMCS-OXM + DPPIV之降解分析。圖 27A-27B
展示MOD-6031劑量依賴性地減少終末葡萄糖(圖 27A
)且顯著減少胰島素(圖 27B
)。顯著性藉由與對照組A相比,*p<0.05及***p<0.001來表示,而#p<0.05表示MOD-6031 6000 nmol/kg(D組)與其成對進食組(E)之間的顯著性。圖 28A-28B
展示其中PEG為PEG30
且R2
為位置C2
上之SO3
H(圖 28A
)的MOD-6031結構之結構,以及PEG30-S-MAL-FMS-NHS之結構(圖 28B
)。圖 29
展示每種調配物濃度為100 mg/ml之MOD-6031的黏度篩選結果。所用物質包含約25%未結合PEG。對照樣品呈藍色展示,其中對照為20 mM檸檬酸鈉,pH 6。圖 30
展示不同MOD-6031濃度下之黏度量測。
Claims (56)
- 一種醫藥調配物,其包括緩衝液、張力劑及可逆聚乙二醇化調酸素,該可逆聚乙二醇化調酸素由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥調配物,其中所述緩衝液為100 mM乙酸鹽。
- 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項之醫藥調配物,其中所述張力劑為100 mM蔗糖。
- 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之醫藥調配物,其中所述調配物係在約4.7之pH值下。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之醫藥調配物,其中所述可逆聚乙二醇化調酸素係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度下。
- 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之醫藥調配物,其中所述調配物為液體調配物。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥調配物,其中所述緩衝液包括檸檬酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸或磷酸鉀緩衝液。
- 如申請專利範圍第7項之醫藥調配物,其中所述調配物包括凍乾調配物。
- 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之醫藥調配物,其中所述PEG聚合物為具有硫氫基部分之PEG聚合物。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之醫藥調配物,其中所述PEG聚合物為PEG30。
- 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之醫藥調配物,其中所述調酸素由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列組成。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以提高所述個體之葡萄糖耐受性。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以改善所述個體之血糖控制。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以減少所述個體之食物攝入。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以減輕所述個體之體重。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以降低所述個體之膽固醇含量。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以增加所述個體之胰島素敏感性。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以降低所述個體之胰島素抗性。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以增加所述個體之能量消耗。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥調配物,其用於一週一次投與個體以治療所述個體之糖尿病。
- 如申請專利範圍第12項至第20項中任一項之醫藥調配物,其中所述個體為人類。
- 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之醫藥調配物,其中在投與後,藉由使FMS或Fmoc連接子自所述調酸素化學水解,將所述調酸素釋放至生物流體中。
- 如申請專利範圍第22項之醫藥調配物,其中所述生物流體為血液、血清或腦脊髓液。
- 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之醫藥調配物,其中所述調配物係用於皮下投與。
- 一種製備如申請專利範圍第1項至第24項之醫藥調配物的方法,所述醫藥調配物一週一次投與個體,所述方法包括以下步驟: (i)藉由將聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)附接於所述調酸素,將調酸素可逆聚乙二醇化,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30); (ii)將步驟(i)之所述可逆聚乙二醇化調酸素與所述緩衝液及所述張力劑在約4.7之pH值下混合;以及 (iii)用所述調配物預先填充注射器。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中所述注射器為雙腔室注射器。
- 一種用如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之調配物填充注射器的方法,其包括以下步驟: (i)調配具有預定量之所述可逆聚乙二醇化調酸素的所述可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其中所述預定量係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度及約2.0至200 mg之劑量下;以及 (ii)用所述調配物填充所述注射器。
- 如申請專利範圍第27項之方法,其中所述注射器為雙腔室注射器。
- 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項之方法,其中所述個體需要提高葡萄糖耐受性、改善血糖控制、減少食物攝入、減輕體重、改善膽固醇、增加胰島素敏感性、降低胰島素抗性或增加能量消耗或其任何組合。
- 一種可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其包括如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之醫藥調配物。
- 一種醫藥組合物,其用於一週一次投與個體,其包括由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成之可逆聚乙二醇化調酸素,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30);以及醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
- 如申請專利範圍第31項之醫藥組合物,其中所述可逆聚乙二醇化調酸素係在約70 mg/ml-100 mg/ml之濃度下。
- 如申請專利範圍第31項至第32項中任一項之醫藥組合物,其中所述PEG聚合物為具有硫氫基部分之PEG聚合物。
- 如申請專利範圍第31項至第33項中任一項之醫藥組合物,其中所述PEG聚合物為PEG30。
- 如申請專利範圍第31項至第34項中任一項之醫藥組合物,其中所述調酸素由SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列組成。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述組合物包括凍乾調配物。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與提高所述個體之葡萄糖耐受性。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與改善所述個體之葡萄糖控制。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與減少所述個體之食物攝入。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與減輕所述個體之體重。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與降低所述個體之膽固醇含量。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與增加所述個體之胰島素敏感性。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與降低所述個體之胰島素抗性。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與增加所述個體之能量消耗。
- 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項之醫藥組合物,其中所述投與治療所述個體之糖尿病。
- 如申請專利範圍第31項至第35項及第37項至第45項中任一項之醫藥組合物,其中所述個體為人類。
- 如申請專利範圍第31項至第35項及第37項至第45項中任一項之醫藥組合物,其中在投與後,藉由使FMS或Fmoc連接子自所述調酸素化學水解,將所述調酸素釋放至生物流體中。
- 如申請專利範圍第47項之醫藥組合物,其中所述生物流體為血液、血清或腦脊髓液。
- 如申請專利範圍第31項至第35項及第37項至第45項中任一項之醫藥組合物,其中所述組合物係用於皮下投與。
- 一種可逆聚乙二醇化調酸素之一週一次劑型,其包括如申請專利範圍第31項至第49項中任一項之醫藥組合物。
- 一種凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其包括可逆聚乙二醇化調酸素。
- 如申請專利範圍第51項之凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其中所述可逆聚乙二醇化調酸素由調酸素、聚乙二醇聚合物(PEG)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或磺酸基-9-茀基甲氧基羰基(FMS)組成,其中所述PEG聚合物經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基端,或經由Fmoc或FMS連接子附接於所述調酸素之胺基酸序列之位置十二號上的離胺酸殘基(Lys 12)或位置三十號上的離胺酸殘基(Lys30)。
- 如申請專利範圍第51項至第52項中任一項之凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其進一步包括檸檬酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸或磷酸鉀緩衝液。
- 如申請專利範圍第51項至第53項中任一項之凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其進一步包括蔗糖或海藻糖。
- 如申請專利範圍第51項至第54項中任一項之凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素調配物,其進一步包括甘露糖醇、甘胺酸、羥基乙基澱粉或非離子型界面活性劑或其任何組合。
- 如申請專利範圍第51項至第55項中任一項之凍乾之可逆聚乙二醇化調酸素,其中所述調配物經復原以形成如申請專利範圍第1項至第6項及第9項至第24項中任一項之醫藥調配物或如申請專利範圍第31項至第35項及第37項至第45項中任一項之醫藥組合物。
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