TW201730342A - 多基因組反轉錄病毒載體製劑及產生及使用其之方法及系統 - Google Patents

多基因組反轉錄病毒載體製劑及產生及使用其之方法及系統 Download PDF

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Abstract

本發明提供新穎多基因組反轉錄病毒載體、用於製備此類反轉錄病毒載體之方法及包裝系統以及使用方法。

Description

多基因組反轉錄病毒載體製劑及產生及使用其之方法及系統
本發明提供新穎多基因組反轉錄病毒載體及用於製備此類反轉錄病毒載體之方法及包裝系統。
反轉錄病毒載體為一種常用之基因傳遞工具，因為反轉錄病毒載體能夠傳遞相關核酸至廣泛細胞中，使得其非常適合將基因轉移至細胞。反轉錄病毒載體已用於基因療法中，以及用於感染疾病及癌症之治療疫苗。然而，多種轉殖基因自單個反轉錄病毒載體基因組之表現(多順反子表現)常常因例如不同啟動子競爭轉錄因子或內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)之功能變化而引起重組蛋白之表現量不等。在核酸傳遞至樹突狀細胞之情況下，已觀測到尤其某些腫瘤抗原下對表現量、抗原加工或呈現之干擾現象。
本發明提供促進多種轉殖基因表現的改良之反轉錄病毒載體及其製備方法。
本發明之一個態樣提供一種重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其包含：a)第一反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第一相關 序列之第一反轉錄病毒載體基因組；b)第二反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組；c)第三反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組及一個複本之包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組；其中該第一相關序列與該第二相關序列不同；其中第一及第二反轉錄病毒載體基因組為缺陷反轉錄病毒基因組(例如不編碼基本病毒蛋白，諸如功能性gag或pol蛋白質，且在進入標靶細胞後無法產生感染顆粒)且其中反轉錄病毒載體製劑用異源包膜醣蛋白假模式化。在本文中重組多基因組反轉錄病毒載體製劑之某些實施例中，第三反轉錄病毒顆粒佔製劑中全部反轉錄病毒顆粒之至少60%、70%、80%、90%或95%。在本文所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑之另一個實施例中，異源包膜醣蛋白選自由VSVg、麻疹包膜醣蛋白及辛德比包膜醣蛋白(Sindbis envelope glycoprotein)組成之群。在一特定實施例中，異源包膜醣蛋白包含變異辛德比病毒E2醣蛋白，且在一實施例中，變異辛德比病毒E2醣蛋白結合於DC-SIGN。在一個實施例中，本文所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑為慢病毒載體製劑。
在本文所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑之另一個實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原或一或多種新抗原且第二相關序列編碼免疫調節分子。在另一實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且第二相關序列編碼不同腫瘤相關抗原。在另一個實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且第二相關序列編碼一或多種新抗原。在另一實施例中，一或多種新抗原來源於第一相關序列之腫瘤相關抗原。
在另一實施例中，本文所述之重組多基因組反轉錄病毒載體 製劑進一步包含；e)第四反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第三相關序列之第三反轉錄病毒載體基因組；f)第五反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組及一個複本之包含第三相關序列之第三反轉錄病毒載體基因組；以及g)第六反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組及一個複本之包含第三相關序列之第三反轉錄病毒載體基因組。在一個實施例中，用於產生本文中多基因組反轉錄病毒載體製劑之反轉錄病毒載體基因組為缺陷反轉錄病毒基因組(例如不編碼基本病毒蛋白質，諸如功能性gag或pol蛋白質，且在進入標靶細胞後無法產生感染顆粒)。
本發明之另一態樣提供一種用於產生假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑之反轉錄病毒載體包裝系統，其包含：a)編碼病毒包膜蛋白之第一核酸分子；b)編碼gag及pol蛋白質之第二核酸分子；c)編碼rev之第三核酸分子；d)包含有包含第一相關序列之第一慢病毒載體基因組之第四核酸分子；e)包含有包含第二相關序列之第二慢病毒載體基因組之第五核酸分子；f)視情況，編碼vpx之第六核酸分子；以及g)包裝細胞或細胞株。在本文所述之反轉錄病毒載體包裝系統之某些實施例中，反轉錄病毒載體製劑為慢病毒載體製劑。在一個實施例中，用於產生本文中多基因組反轉錄病毒載體製劑之載體基因組為缺陷反轉錄病毒基因組(例如不編碼基本病毒蛋白質，諸如功能性gag或pol蛋白質，且在進入標靶細胞後無法產生感染顆粒)。在本文中反轉錄病毒載體包裝系統之另一個實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原或一或多種新抗原且第二相關序列編碼免疫調節分子。在另一實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且 第二相關序列編碼不同腫瘤相關抗原。在一個實施例中，第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且第二相關序列編碼一或多種新抗原。在申請專利範圍第13項之反轉錄病毒載體包裝系統的另一個實施例中，其中病毒包膜蛋白選自由VSVg、麻疹包膜醣蛋白及辛德比包膜醣蛋白組成之群。在某些實施例中，病毒包膜蛋白包含能夠感染樹突狀細胞之辛德比病毒E2醣蛋白或其變異體。在反轉錄病毒載體包裝系統之另一個實施例中，使用等量之第四核酸分子與第五核酸分子。在另一個實施例中，包裝系統中使用之第四核酸分子與第五核酸分子的相對輸入比率為60：40。
在本文所述之反轉錄病毒載體包裝系統之另一個實施例中，第一慢病毒載體基因組及第二慢病毒載體包含回文二聚體起始位點(DIS)序列。在某一實施例中，第一慢病毒載體基因組及第二慢病毒載體中之回文二聚體起始位點(DIS)序列相同。在另一實施例中，第一慢病毒載體基因組包含第一回文DIS序列且第二慢病毒載體包含第二回文二聚體起始位點(DIS)序列。因此，在某些實施例中，反轉錄病毒載體包裝系統較佳產生同種接合反轉錄病毒載體顆粒。在本文所述之反轉錄病毒載體包裝系統之另一個實施例中，第一慢病毒載體基因組包含第一DIS序列且第二慢病毒載體包含第二二聚體起始位點(DIS)序列，其中在包裝期間第一DIS序列與第二DIS序列配對，使得反轉錄病毒載體包裝系統較佳產生異種接合反轉錄病毒載體顆粒。
在本文所述之反轉錄病毒載體包裝系統之某些實施例中，pol蛋白質具有非功能性整合酶。在一個實施例中，用於產生本文中多基因組反轉錄病毒載體製劑之載體基因組為缺陷反轉錄病毒基因組(例如不編 碼基本病毒蛋白質，諸如功能性gag或pol蛋白質，且在進入標靶細胞後無法產生感染顆粒)。因此，在某些實施例中，用於產生本文所述之任一多基因組載體製劑的載體基因組不含編碼功能性gag或pol蛋白質之序列。
本發明之另一態樣提供一種多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其包含：a)至少兩種核酸分子，各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組；b)一或多種編碼產生假模式化反轉錄病毒載體顆粒所需之組分的核酸分子；c)視情況，編碼vpx之核酸分子；以及d)包裝細胞株。在一個實施例中，至少兩種反轉錄病毒載體基因組為缺陷反轉錄病毒基因組(例如不編碼基本病毒蛋白質，諸如功能性gag或ppl蛋白質且在進入標靶細胞後無法產生感染顆粒)。在一個實施例中，多基因組反轉錄病毒載體包裝系統由2至8種各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組之核酸分子組成。在某些實施例中，獨特相關序列選自由編碼MAGEA1、MAGEA4、NYESO1、MAGEA3、MAGEA10、ScFvanti-PD1、IL12、IL23、CD40、ScFvanti-PDL1及ScFvanti-CTLA4或前述任一者之免疫原性變異體組成之群。在一個實施例中，產生反轉錄病毒載體顆粒所需之組分包括gag、pol、rev及包膜蛋白。在另一個實施例中，包裝細胞株穩定表現一或多種產生反轉錄病毒載體顆粒所需之組分。在多基因組反轉錄病毒載體包裝系統之一個特定實施例中，反轉錄病毒載體基因組為慢病毒載體基因組。
本發明之另一態樣提供一種用於產生假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑之方法，其包含培養本文所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統之包裝細胞株，其中該包裝細胞株經以下轉染：a)至少兩種核 酸分子，各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組；b)一或多種編碼產生假模式化反轉錄病毒載體顆粒所需之組分的核酸分子；以及c)視情況，編碼vpx之核酸分子；以及收穫假模式化多基因組反轉錄病毒載體顆粒。本發明之一個態樣提供一種藉由此方法產生之假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑。
本發明之另一態樣提供一種誘發個體中免疫反應之方法，其包含投與本文所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑，在某些實施例中，彼等製劑表現一或多種腫瘤抗原及/或一或多種免疫調節分子。
本發明之另一態樣提供一種治療個體之癌症的方法，其包含投與表現一或多種腫瘤抗原及/或一或多種免疫調節分子之多基因組反轉錄病毒載體製劑。
本發明之另一態樣提供一種用於在活體內向個體傳遞及表現多種相關序列之方法，其包含投與本文所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑。
本發明之另一態樣提供本文所述之任一實施例之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於療法中。
本發明之另一態樣提供本文所述之任一實施例之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於治療患者之方法中。
本發明之另一態樣提供本文所述之任一實施例之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於治療患者之癌症之方法中。
本發明之另一態樣提供本文所述之任一實施例之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於刺激患者中免疫反應之方法中。
在參考以下詳細描述及附圖時，本發明之此等及其他態樣將變得顯而易見。
圖1為展示多基因組反轉錄病毒載體製劑如何產生之圖。如所述，在該多基因組系統中產生之異種接合病毒顆粒可稱作重配。
圖2為概述BALB/c小鼠中由單個、混合、共同免疫接種及多基因組病毒載體製劑誘發之針對NY-ESO-1之CD8+ T細胞免疫反應的條形圖。
圖3為概述BALB/c小鼠中由單個、混合、共同免疫接種及多基因組病毒載體製劑誘發之針對MAGE-A3之CD8+ T細胞免疫反應的條形圖。
圖4為概述BALB/c小鼠中由單個、混合、共同免疫接種及多基因組病毒載體製劑誘發之針對NY-ESO-1之CD4+ T細胞免疫反應的條形圖。
圖5含有來自在尾基中注射多基因組慢病毒載體製劑以傳遞表現NYESO1/MAGEA3/MAGEA10之載體之BALB/c雌性小鼠的抗原特異性CD8 T細胞反應的圖。
圖6為展示用多基因組慢病毒載體處理之小鼠之肺中腫瘤結節形成減少且抗原特異性CD8+ T細胞增加的圖。BALB/c雌性用CIN.23細胞靜脈內接種。接種後第3天，如所示，小鼠經慢病毒載體免疫接種(亦參見實例4)。接種後第17天，收穫肺進行結節計數(6A)；脾細胞用MHC多聚體染色進行流動式細胞量測分析(6B)。誤差條表示平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.005。
圖7為展示與接受各表現單一抗原之混合載體之小鼠或接受表現單一 抗原之載體之注射液的小鼠相比，來自在尾基中注射多基因組慢病毒載體製劑以傳遞表現MAGEA1/A3/A4及A10[M1、M3、M4、M10]之載體之BALB/c小鼠的抗原特異性CD8 T細胞反應的圖。7A：在活體外用MAGEA1池刺激之CD8+ T細胞的多ICS染色；7B：在活體外用MAGEA3池刺激之CD8+ T細胞的多ICS染色；7C：在活體外用MAGEA4池刺激之CD8+ T細胞的多ICS染色；7D：在活體外用MAGEA10池刺激之CD8+ T細胞的多ICS染色。
圖8為展示在尾基中注射多基因組慢病毒載體製劑以傳遞表現三個抗原(NYESO1/MAGEA3/A10[NY、M3、M10])及mIL12或GFP之載體之BALB/c小鼠中抗原特異性CD8 T細胞反應的圖。8A：活體外用NYESO1肽池刺激之CD8+ T細胞之% IFNg+；8B：活體外用MAGEA3肽池刺激之CD8+ T細胞之% IFNg+；8C：活體外用MAGEA10池刺激之CD8+ T細胞之% IFNg+；採用疫苗%在相關條柱上方表示。*使用曼-惠特尼測試(Mann-Whitney test)，統計學上顯著。
圖9展示用野生型及經修飾之DIS序列製成的慢病毒載體製劑之基因特異性基因組力價。9A：GCN/GCN=用編碼具有野生型DIS(GCGCGC，SEQ ID NO：1)之NYESO1之單個載體基因組質體製備的慢病毒載體製劑；GGN/GGN=用編碼具有突變DIS(GGGGGG，SEQ ID NO：4)之NYESO1之單個載體基因組質體製備的慢病毒載體製劑。9B：GCN/GCN=用編碼具有野生型DIS(GCGCGC，SEQ ID NO：1)之NYESO1之單個載體基因組質體製備的慢病毒載體製劑；GCN/GCM=用各含有SEQ ID NO：1之野生型HIV DIS序列之兩個不同載體基因組質體製備的多基因組慢病毒載體製劑：GCN：編碼NYESO之基因組；GCM：編碼MAGEA3之基因組；GGN/CCM =用兩個不同載體基因組製備的多基因組慢病毒載體製劑：GGN：編碼具有突變DIS序列GGGGGG(SEQ ID NO：4)之NYESO1的載體基因組；GGM：編碼具有突變DIS序列CCCCCC(SEQ ID NO：5)之MAGEA3的載體基因組。
序列表之簡要說明
SEQ ID NO1-SEQ ID NO：14為可用於本文所述之反轉錄病毒載體基因組及包裝系統中之二聚體起始位點(DIS)序列。GCGCGC(SEQ ID NO：1)；GCCCGG(SEQ ID NO：2)；CCGGGC(SEQ ID NO：3)；GGGGGG(SEQ ID NO：4)；CCCCCC(SEQ ID NO：5)；GUGCAC(SEQ ID NO：6)；GCGCGG(SEQ ID NO：7)；CGCGCC(SEQ ID NO：8)；GGGCGG(SEQ ID NO：9)；CCCGCC(SEQ ID NO：10)；CGCGCG(SEQ ID NO；11)；CGGGCC(SEQ ID NO：12)；GGCCCG(SEQ ID NO：13)；CACGUG(SEQ ID NO：14)。
慢病毒載體經證實為用於在活體內傳遞核酸之工具。美國專利8,187,872描述一種缺乏整合之靶向DC之第三代改良慢病毒載體平台，當前處於2期研究中評估其引發針對腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)之免疫反應。對於慢病毒載體技術而言，有效負載之尺寸常常限於8-10kb，其雖然有效，但可阻礙多種腫瘤抗原(TA)之靶向且阻礙包括其他相關序列，諸如編碼免疫調節分子之序列。另外，在單一載體構築體內表現諸如抗原之多種蛋白質之常用方法(例如內切蛋白酶裂解、內部核糖體進入位點(IRES)等)常常引起相關蛋白質之表現下降，及/或在疫苗背景下，針對一或多種編碼抗原之抗原特異性T細胞反應的誘發顯著減少。
因此，本發明之多基因組反轉錄病毒載體製劑經設計以解決單一基因組載體平台在所需基因之任何組合之有效共同表現方面的侷限性。不同於其他載體，本發明之多基因組載體製劑不需要多個修飾載體主鏈之選殖步驟，該等選殖步驟常常產生編碼基因產物之不可預測之表現模式。本發明克服先前載體系統之侷限性且成功地允許活體內多基因傳遞。本發明提供一種下一代反轉錄病毒載體系統，其尤其實現多種腫瘤抗原之有效靶向。在載體產生之轉染階段以可控比率混合表現抗原之質體的能力可靈活地製造多基因組載體之組合(以其他方式無法實現)，且其製造通用性及靈活性使得其可成為共同表現腫瘤抗原與免疫調節劑用於增強癌症免疫療法之最佳類別載體系統。因為能夠跨越多種相關抗原及/或抗原決定基(包括新抗原抗原決定基)產生穩固的抗原特異性T細胞反應，所以本發明之多基因組反轉錄病毒載體系統可成為一種對多種腫瘤類型具有優良抗腫瘤控制之藥劑的強大平台。本發明提供如本文所述之其他優點。
本發明描述在單一產生步驟中產生表現一種(同源載體)或兩種(異源載體)轉殖基因之反轉錄病毒載體顆粒。此為一種產生可傳遞及表現兩種或更多種相關蛋白質之反轉錄病毒載體製劑之新穎方法，且克服當前構築雙順反子載體或多順反子載體之侷限性，包括限制插入物尺寸、基因表現受損、削弱功能性基因產物之生物合成、缺乏對相對表現量之有效控制等。
在一個態樣中，本發明描述異種接合反轉錄病毒載體顆粒及產生此類載體顆粒之方法，該等載體顆粒含有兩種RNA基因組，各編碼經由在製造過程期間受控及定向遺傳再配而產生之不同轉殖基因(參見圖 1)。該過程產生慢病毒載體顆粒之混合物，其中一些為異種接合且其中一些為同種接合。如本文中更詳細描述，該過程可經控制，使得視需要可改變病毒載體製劑中異種接合與同種接合顆粒之比率。包含異種接合顆粒之此等多基因組病毒載體製劑可用於在活體內或活體外在標靶細胞(例如樹突狀細胞、T細胞或其他標靶細胞)中單獨或組合傳遞及表現兩種或更多種不同相關核酸，例如編碼包括新抗原、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或任何其他相關蛋白質之癌症抗原之核酸。與構築載體癌症疫苗之目前先進技術方法相比，本發明能夠快速構築具有優良免疫原性及廣泛保護之現成、半個人化及個人化癌症疫苗。
自重配反轉錄病毒載體表現多種轉殖基因可解決此等問題。雖然多順反子載體之選殖需要轉移載體基因組中相關轉殖基因之定位優化，但重配載體可藉由用包含各表現不同轉殖基因之多種反轉錄病毒轉移載體(反轉錄病毒基因組)之質體混合物轉染生產/包裝細胞而產生快得多。
有時，藉由在轉導細胞前組合單順反子載體製劑來實現多種轉殖基因之表現。此需要組合之載體混合物以高感染倍率(multiplicities of infection，MOI)用於活體外轉導，此引起載體製劑之使用效率低。此外，此方法在疫苗或治療背景下極其低效，因為在活體內投與後無法預測共同轉導之實現。本發明允許活體內及活體外極低MOI下共同表現兩種轉殖基因。
本發明允許基於使用現成轉移載體經由多質體轉染所產生之載體混合物產生個人化癌症疫苗。此亦允許產生由作用機製得益於在活 體內相同細胞內共同表現之不同轉殖基因構成的疫苗。一個實例為編碼輔助T細胞抗原決定基與CTL或B細胞抗原決定基之轉殖基因共同表現，以誘發有效適應性免疫反應及免疫記憶。第二個實例為抗原與諸如IRF-3或CpG基元之細胞內免疫調節因子共同表現。第三個實例為諸如介白素-12之雜二聚功能性分子之個別次單元以避免「非自身」新抗原抗原決定基可能由經工程改造之連接子結構域產生的方式共同表現。第四個實例為非常大，因此低效包裝至LV中之自我複製、複製子、轉錄物的表現。藉由將大型複製子RNA分裂成兩個分開但互補之載體構築體，可用足夠小而可包裝之插入物個別實現複製子功能性。
此外，本發明允許藉由如本文中表1及表2中概述，在產生步驟期間變化輸入質體之相對量，有效控制個別載體基因組之摻合比率。此用多順反子載體無法可靠地實現。
此外，本發明提供另一優點：藉由改變各反轉錄病毒載體基因組之二聚體起始信號，能夠控制任何既定製劑中異種接合或同種接合載體之比例，以促進同種接合相互作用或異種接合相互作用。就此而言，已知兩個反轉錄病毒RNA複本在病毒出芽前，甚至在其與gag蛋白相互作用前，在宿主細胞中遇到(參見例如Moore等人，《艾滋病評論(AIDS Rev.)》2009年4月-6月；11(2)：91-102)。在HIV-1中，舉例而言，RNA中存在莖環，稱為SL1，其暴露回文序列GCGCGC(SEQ ID NO：1)。此序列以瓦生-克里克(Watson-Crick)方式與其他RNA搭配物上之相同序列相互作用。修飾此序列可打開或關閉二聚。此特徵可用於針對特定所需二聚特性調整既定基因組。本文中預期使用來源於任何反轉錄病毒之回文二聚序列。作為另一 實例，HIV-1亞型C具有回文GUGCAC(SEQ ID NO：6)。
作為一個實例，為降低基因組A與基因組B二聚之概率，不同回文序列可用於基因組B(不與基因組A之回文序列配對的序列)中，使得其僅僅自身二聚。序列可經設計，使得其允許均二聚，但不與基因組A雜二聚。此可用於其中特定相關序列得益於在同種接合載體中的情形，例如出於產生免疫反應的目的。
作為另一實例，回文二聚序列可經修飾，使得均二聚無法發生(例如序列經修飾以呈非回文)。實際上，序列經工程改造以與同源搭配物形成強鹼基配對。舉例而言，對於基因組A，為諸如GCCCGG(SEQ ID NO：2)之序列，且對於基因組B，為CCGGGC(SEQ ID NO：3)。此序列組態有利於異源二聚配對及異種接合載體顆粒形成。以此方式，可控制且使得製劑中異種接合載體顆粒(重配)之所得比例含有超過50%重配。此例如適用於免疫調節分子連同特定抗原一起傳遞且最佳傳遞至相同宿主細胞的情況下(例如其中使用需要共同傳遞之IRF3、CD40、siRNA或其他相關序列)。較佳促進異種接合配對之另一實例為在儘可能少的均二聚體下表現TCR-α及β鏈以產生CART。本文中涵蓋之其他二聚基元包括分別針對A及B之GGGGGG(SEQ ID NO：4)及CCCCCC(SEQ ID NO：5)。一或多個A-U鹼基配對之添加可用於改變相互作用之結合強度。亦參見Baig等人，2008《反轉錄病毒(Retrovirl)》5：65；Lu等人2011《分子生物學雜誌(J Mol Biol)》410：609；Moore等人，2007《病毒學雜誌(J Virol)》81：4002；Moore等人，2009《艾滋病評論(AIDS Rev.)》11：91；Tran等人，2015《反轉錄病毒(Retrovirol)》12：83。
A. 病毒載體包膜
本文所述之病毒載體一般用來自異源病毒之包膜蛋白假模式化。「假模式化」慢病毒為具有一或多種由不同於慢病毒基因組之病毒編碼之包膜醣蛋白的慢病毒顆粒。包膜醣蛋白可如本文所描述進行修飾、突變或工程改造。具有適合靶向及如技術人員已知之其他特徵的任何包膜醣蛋白可用於將本文中之病毒載體假模式化。在某些實施例中，病毒載體用VSVg包膜醣蛋白假模式化。在其他實施例中，病毒載體可用來源於異源HIV(例如HIV-2)或其他異源反轉錄病毒(諸如貓免疫缺乏病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)或maedi/visna病毒)的包膜醣蛋白假模式化。在又其他實施例中，本文所述之病毒載體用麻疹病毒包膜醣蛋白假模式化。
在特定實施例中，本文所述之病毒載體用來源於蟲媒病毒之包膜醣蛋白假模式化。節肢動物媒介病毒(蟲媒病毒)為藉由諸如蚊子之感染節肢動物載體傳遞至諸如人類、馬或鳥類之宿主的病毒。蟲媒病毒進一步劃分成包括α病毒及黃病毒之病毒子家族，其具有正極性之單股RNA基因組及含醣蛋白之包膜。舉例而言，登革熱病毒(dengue fever virus)、黃熱病病毒及西尼羅河病毒(West Nile virus)屬於黃病毒家族，且辛德比病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis virus)為α病毒家族成員(Wang等人《病毒學雜誌》66,4992(1992))。辛德比病毒之包膜包括兩種跨膜醣蛋白(Mukhopadhyay等人《自然評論：微生物學(Nature Rev.Microbio.)》3,13(2005))：E1，咸信其負責融合；及E2，咸信其負責細胞結合。已知辛德比 病毒包膜醣蛋白將包括致癌反轉錄病毒及慢病毒之其他反轉錄病毒假模式化。
辛德比病毒及其他α病毒之包膜併入病毒顆粒膜之脂質雙層中，且通常包括兩種醣蛋白E1及E2之多個複本。各醣蛋白具有跨膜區；E2具有約33殘基之細胞質域，而E1之胞質尾區極短(約2個殘基)。E1與E2均具有附接在跨膜區中或靠近跨膜區之棕櫚酸。E2最初合成為前驅蛋白，由弗林蛋白酶(furin)或其他Ca2+依賴性絲胺酸蛋白酶裂解成E2及稱為E3之小醣蛋白。在編碼E2及E1之序列之間，為編碼稱為6K之蛋白質的序列。E3及6K為分別用來將E2及E1醣蛋白易位至膜中之信號序列。在辛德比病毒基因組中，辛德比包膜蛋白之編碼區包括編碼E3、E2、6K及E1之序列。如本文所用，蟲媒病毒之「包膜」至少包括E2，且亦可包括E1、6K及E3。辛德比病毒之包膜醣蛋白之一示例性序列株系HR呈現為WO 2011/011584之SEQ ID No.17。其他蟲媒病毒之包膜醣蛋白之序列可見於例如GenBank。舉例而言，編碼登革熱病毒醣蛋白之序列可見於寄存號GQ252677(尤其GenBank中)以及NCBI之病毒變異資料庫(GenBank寄存號及病毒變異資料庫中包膜醣蛋白序列以引用的方式併入)，且編碼委內瑞拉馬腦炎病毒包膜醣蛋白之序列可見於寄存號NP 040824(包膜醣蛋白之序列以引用的方式併入)。
雖然迄今未曾明確鑑別出樹突狀細胞上針對α病毒及尤其辛德比病毒之細胞受體，但一種受體似乎為DC-SIGN(Klimstra等人，《病毒學雜誌》77：12022,2003)。術語「附接」、「結合」、「靶向」及其類似術語之使用可互換地使用且不意欲指示辛德比病毒包膜醣蛋白與細胞組分之間 的相互作用機制。DC-SIGN(樹突狀細胞特定ICAM-3(細胞內黏附分子3)-抓握非整合素；亦稱為CD209)為能夠快速結合及內吞物質之C型凝集素樣受體(Geijtenbeek,T.B.等人，《免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol.)》22：33-54,2004)。E2似乎經由DC-SIGN將病毒靶向樹突狀細胞。如本文所示，與不表現DC-SIGN之同基因細胞相比，表現DC-SIGN之細胞藉由用辛德比病毒E2假模式化之病毒載體顆粒更好地(至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍更好)轉導。E2醣蛋白如何促進病毒感染之機制似乎可能經由直接結合於DC-SIGN或引起構形改變或一些其他機制而涉及DC-SIGN。無論實際機制如何，對於表現DC-SIGN之細胞，亦即樹突狀細胞而言，藉由E2靶向較佳。
辛德比病毒亦似乎經由硫酸乙醯肝素結合於細胞(Klimstra等人，《病毒學雜誌》72：7357,1998；Burmes及Griffin，《病毒學雜誌》72：7349,1998)。因為在大部分細胞類型之表面上發現硫酸乙醯肝素及其他細胞表面葡糖胺聚糖，所以需要減少硫酸乙醯肝素與辛德比包膜醣蛋白之間的相互作用。此可藉由減少辛德比病毒包膜與硫酸乙醯肝素之結合或增加辛德比病毒包膜與樹突狀細胞之結合，例如增加親合力，或兩者來實現。因此，減少與可由其他細胞類型表現且即使包膜對DC-SIGN具有特異性亦可出現之其他分子之非特異性結合，且改善之特異性可用來避免不希望的副作用，諸如可減少所需免疫反應之副作用，或與其他細胞類型之脫靶轉導相關之副作用。或者或除表現DC-SIGN之細胞之相對特異性轉導的優點之外，用辛德比病毒包膜E2醣蛋白假模式化之病毒顆粒可提供優於用諸如VSVG之醣蛋白假模式化之病毒顆粒的其他優點。此類優點之實例包括減少 之補體介導之溶解及/或減少之神經元細胞靶向，咸信兩者均與投與VSV-G假模式化之病毒顆粒相關。
在各種範例中，慢病毒載體顆粒特異性結合於表現DC-SIGN之細胞且具有減少或消除之與硫酸乙醯肝素之結合。亦即，辛德比病毒包膜E2醣蛋白可經修飾以相對於其他細胞類型，優先將病毒導向表現DC-SIGN之樹突狀細胞。基於自其他研究中結構研究及分子模擬獲得之資訊，包膜蛋白、尤其E2及E1醣蛋白之變異序列經設計及產生，使得醣蛋白維持其作為包膜蛋白之功能，但具有所需結合特異性、親合力或結合水準。可針對各醣蛋白產生候選變異序列且使用本文所描述之方法或此項技術中已知之其他方法分析，以鑑別具有最合乎需要之特徵的包膜醣蛋白。
B. 慢病毒載體基因組
病毒載體顆粒包含有包含相關序列之基因組。可包括其他序列，諸如允許基因組包裝至病毒顆粒中之序列及促進相關序列在標靶細胞轉導後表現之序列。基因組可來源於大量適合之可用反轉錄病毒中之任一者，例如慢病毒之基於基因組之載體，包括經鑑別用於人類基因療法應用之反轉錄病毒，諸如Pfeifer及Verma所述之反轉錄病毒(《基因組和人類遺傳學年鑒(Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.)》2：177-211,2001)。
1. 主鏈
適合反轉錄病毒載體基因組可來源於任何反轉錄病毒，包括α反轉錄病毒(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、β反轉錄病毒(小鼠乳房腫瘤病毒)、γ反轉錄病毒(鼠類白血病病毒；貓白血病病毒)、δ反轉錄病毒(牛白血病病毒；人類T嗜淋巴細胞病毒(HTLV))、ε反轉錄病 毒、泡沫病毒(猿猴泡沫狀病毒)及慢病毒。特定而言，例示性反轉錄病毒載體基因組包括慢病毒載體基因組。慢病毒載體基因組包括基於人類免疫缺乏病毒(HIV-1)、HIV-2、貓免疫缺乏病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)及maedi/visna病毒之基因組。慢病毒之合乎需要之特徵在於其能夠感染分裂與未分裂細胞，無需標靶細胞分裂(或刺激標靶細胞分裂)。一般而言，基因組及包膜醣蛋白將基於不同病毒，使得所得病毒載體顆粒假模式化。理想地，併有載體基因組之安全特徵。安全特徵包括自身不活化LTR及非整合基因組。
在一些示例性實施例中，病毒載體基因組包含來自慢病毒基因組、諸如HIV-1基因組或SIV基因組之序列。病毒基因組構築體可包含來自慢病毒之5'及3' LTR之序列，且尤其可包含來自慢病毒之5' LTR之R及U5序列及來自慢病毒之不活化或自身不活化3' LTR。LTR序列可為來自任何物種之任何慢病毒的LTR序列。舉例而言，其可為來自HIV、SIV、FIV或BIV之LTR序列。通常，LTR序列為HIV LTR序列。
載體基因組可包含不活化或自身不活化3'LTR(Zufferey等人《病毒學雜誌》72：9873,1998；Miyoshi等人，《病毒學雜誌》72：8150,1998)。自身不活化載體一般在3'長末端重複序列(long terminal repeat，LTR)中缺失強化子及啟動子序列，3'長末端重複序列在載體整合期間複製至5'LTR。在一種情況下，3'LTR之U3元件缺失其強化子序列、TATA盒、Sp1及NF-κB位點。由於自身不活化3'LTR，所以在進入及反轉錄後產生的原病毒將包含不活化之5'LTR。基本原理為藉由降低載體基因組之動員風險及LTR對鄰近細胞啟動子之影響來提高安全性。可藉由此項技術中已知之任何方法構 築自身不活化3'LTR。
視情況，來自慢病毒5'LTR之U3序列可經病毒構築體中之啟動子序列，諸如異源啟動子序列置換。此可增加自包裝細胞株回收之病毒的力價。亦可包括強化子序列。可使用增加包裝細胞株中病毒RNA基因組之表現的任何強化子/啟動子組合。在一個實例中，使用CMV強化子/啟動子序列(US 5385839及US 5168062)。
反轉錄病毒載體基因組一般缺乏gag及/或pol(參見Coffin,J.，《RNA腫瘤病毒(RNA Tumor Viruses)》，Weiss,R.等人(編)Cold Spring Harbor Laboratory，第2卷，第36-73頁，1985)。因此，適用於本文中之反轉錄病毒載體基因組一般為缺陷反轉錄病毒載體基因組，其一旦包裝，即能夠感染標靶細胞，將其RNA基因組反轉錄，且在某些實施例中，將反轉錄DNA整合至標靶細胞基因組(或保持為游離型)，但不能在標靶細胞內複製，產生感染反轉錄病毒顆粒。此等所謂第三代及第四代反轉錄病毒載體具有本質上取出大部分或所有HIV蛋白質之基因組。接著顆粒產生所需之病毒蛋白質呈反式提供在包裝系統中，提供顯著安全之優點。因此，在某些實施例中，載體基因組包含不含功能性gag/pol開放閱讀框之聚核苷酸。因此，在某些實施例中，適合載體基因組不編碼功能性gag或pol蛋白質。在某些實施例中，適合載體基因組不編碼功能性gag、pol或env蛋白質。如一般技術者所瞭解，在某些實施例中，需要保持一些gag序列靠近包裝信號，以促進選殖及/或有效包裝，然而不存在gag/pol之全部編碼區。
在某些實施例中，插入突變誘發之風險藉由將慢病毒載體基因組構築成整合缺陷型而減至最少。可進行多種方法以產生非整合之載體 基因組。此等方法需要將突變工程改造至pol基因之整合酶組分中，使得其編碼具有不活化整合酶之蛋白質。載體基因組本身可藉由例如突變或缺失一個或兩個附接位點，或經由缺失或修飾使3' LTR-近端多嘌呤區(proximal polypurine tract，PPT)無功能進行修飾以預防整合。另外，可使用非遺傳方法；此等包括抑制整合酶之一或多種功能之藥劑。該等方法不相互排斥，亦即一次可使用超過一種方法。舉例而言，整合酶與附接位點可為非功能性的，或整合酶與PPT位點可為非功能性的，或附接位點與PPT位點可為非功能性的，或均可為非功能性的。
如上所述，一種方法為製備及使用非功能性整合酶。整合酶與染色體標靶位點之兩股中病毒雙股鈍端DNA之裂解及末端接合於5'-磷酸有關。整合酶具有三個功能結構域：N端結構域，其含有鋅結合基元(HHCC)；中央結構域核心，其含有催化核心及保守DD35E基元(HIV-1中D64、D116、E152)；及C端結構域，其具有DNA結合特性。引入整合酶中之點突變足夠破壞正常功能。已構築及表徵許多整合酶突變(參見Philpott及Thrasher，《人類基因療法(Human Gene Therapy)》18：483,2007；Apolonia，提交給倫敦大學學院(University College London)之論文，2009年4月，第82-97頁；Engelman等人《病毒學雜誌》69：2729,1995；Nightingale等人《分子治療(Mol Therapy)》，13：1121,2006)。編碼整合酶蛋白質之序列可缺失或突變，致使蛋白質不活化，較佳不顯著削弱反轉錄酶活性或核靶向，從而僅僅防止原病毒整合至標靶細胞基因組中。可接受之突變可減少整合酶催化、股轉移、結合於att位點、結合於宿主染色體DNA及其他功能。舉例而言，HIV或SIV整合酶之殘基35上單個天冬胺酸至天冬醯胺 之取代完全消除病毒DNA整合。整合酶之缺失一般將限於C端結構域。殘基235-288之編碼序列的缺失產生適用的非功能性整合酶(Engelman等人《病毒學雜誌》69：2729,1995)。作為其他實例，可產生突變，例如Asp64(殘基數目針對HIV-1給出，來自其他慢病毒或反轉錄病毒之整合酶的對應殘基數目可容易由一般技術者確定)(例如D64E、D64V)、Asp116(例如D116N)、Asn120(例如N120K)、Glu152、Gln148(例如Q148A)、Lys156、Lys159、Trp235(例如W235E)、Lys264(例如K264R)、Lys266(例如K266R)、Lys273(例如K273R)。可構築其他突變且測試整合、轉殖基因表現及任何其他合乎需要之參數。熟知用於此等功能之分析法。突變可由多種技術中之任一者產生，包括定點突變誘發及核酸序列之化學合成。可進行一種突變，或此等突變中之超過一者可存在於整合酶中。舉例而言，整合酶可在兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸等上具有突變。
或者或與使用整合酶突變體組合，U3及U5中之附接位點(att)亦可突變。整合酶結合於此等位點且3'-末端二核苷酸在載體基因組之兩端裂解。CA二核苷酸位於凹陷3'端；CA為加工、核苷酸突變、區塊整合至宿主染色體所需。CA二核苷酸之A為整合最關鍵之核苷酸，且在基因組兩端之突變將產生最佳結果(Brown等人《病毒學雜誌》73：9011(1999))。在一個範例中，各端之CA變成TG。在其他範例中，各端之CA在一端變成TG且在另一端變成GT。在其他範例中，各端之CA缺失；在其他範例中，CA之A在各端缺失。
整合亦可藉由位置接近3' LTR之3'多嘌呤區(PPT)的突變或缺失來抑制(WO 2009/076524)。PPT為約15個核苷酸之序列，其可充當 正鏈DNA合成之引子結合位點。在此情況下，PPT之突變或缺失靶向反轉錄過程。不希望受限於機制，藉由使PPT突變或缺失，根本上減少線性DNA之產生且基本上僅僅產生1-LTR DNA環。整合需要線性雙股DNA載體基因組，且無該基因組時，基本上消除整合。如上文所陳述，可藉由突變或藉由缺失使PPT無功能。通常，整個約15nt PPT缺失，不過在一些實施例中，可進行14nt、13、nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt及2nt之更短缺失。當進行突變時，通常進行多個突變，尤其在PPT之5'半部中(McWilliams等人，《病毒學雜誌》77：11150,2003)，不過在起始四個鹼基中之單個及雙重突變仍減少轉錄。在PPT之3'端進行的突變一般具有更顯著之作用(Powell及Levin《病毒學雜誌》70：5288,1996)。
此等使載體基因組不整合之不同方法可個別或組合使用。可使用超過一種方法，經由冗餘機制建立故障-安全載體。因此，PPT突變或缺失可與att位點突變或缺失組合或與整合酶突變組合，或PPT突變或缺失可與att位點突變或缺失及整合酶突變兩者組合。類似地，att位點突變或缺失及整合酶突變可彼此組合或與PPT突變或缺失組合。
2. 調控元件
如本文所論述，病毒載體基因組包含一或多個需要在標靶細胞中表現之相關核酸。為簡單起見，術語「相關序列」(SOI)用於意謂一或多個相關序列(諸如抗原，有或無一或多種其他免疫刺激分子、細胞介素或一或多種其他抗原)。通常，相關序列位於5' LTR及3' LTR序列中。此外，相關序列較佳與例如轉錄調控序列(包括啟動子或強化子)之其他遺傳元件呈功能性關係，以調控相關序列以特定方式表現。在某些情況下， 適用轉錄調控序列為在時間上及空間上對活性進行高度調控之序列。此項技術中已知可用於調控組分表現之表現控制元件，且包括(但不限於)誘導型啟動子、組成型啟動子、分泌信號、強化子及其他調控元件。
相關序列及任何其他可表現序列通常與內部啟動子/強化子調控序列呈功能性關係。「內部」啟動子/強化子為位於病毒載體構築體中之5' LTR與3' LTR序列之間且可操作地連接於相關序列的啟動子/強化子。內部啟動子/強化子可為已知可提高與其呈功能性關係之基因表現的任何啟動子、強化子或啟動子/強化子組合。「功能性關係」及「可操作地連接」意謂(不限於)該序列相對於啟動子及/或強化子呈正確位置及取向，使得當啟動子及/或強化子與適當分子接觸時將表現相關序列。
內部啟動子/強化子之選擇係基於相關序列之所需表現模式及已知啟動子/強化子之特定特性。因此，內部啟動子可為組成性活性的。可使用之組成型啟動子之非限制性實例包括泛素(US 5510474；WO 98/32869)、CMV(Thomsen等人，《美國國家科學院院刊》81：659,1984；US 5168062)、β-肌動蛋白(Gunning等人1989《美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》84：4831-4835)及pgk(參見例如Adra等人1987《基因(Gene)》60：65-74；Singer-Sam等人1984《基因》32：409-417；以及Dobson等人1982《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》10：2635-2637)之啟動子。
或者，啟動子可為組織特異性啟動子。在一些較佳實施例中，啟動子為標靶細胞特異性啟動子。舉例而言，啟動子可來自樹突狀細胞表現之任何產物，包括CD11c、CD103、TLR、DC-SIGN、BDCA-3、DEC-205、DCIR2、甘露糖受體、凝集素-1、Clec9A、MHC II類。另外，啟動子可經選 擇以允許相關序列誘導型表現。用於誘導型表現之許多系統為此項技術中已知，包括四環素反應系統、lac操作子-抑制子系統以及對多種環境或生理變化(包括熱休克、金屬離子(諸如金屬硫蛋白啟動子)、干擾素、低氧、類固醇(諸如孕酮或糖皮質激素受體啟動子)、放射線)起反應之啟動子，諸如VEGF啟動子。啟動子之組合亦可用於獲得相關基因之所需表現。一般技術人員能夠基於基因在相關生物體或標靶細胞中之所需表現模式選擇啟動子。
病毒基因組可包含至少一種RNA聚合酶II或III反應性啟動子。此啟動子可操作地連接於相關序列且亦可連接於終止序列。另外，可併入超過一種RNA聚合酶II或III啟動子。熟習此項技術者熟知RNA聚合酶II及III啟動子。一系列適合RNA聚合酶III啟動子可見於例如Paule及White，《核酸研究(Nucleic Acids Research.)》第28卷，第1283-1298(2000)頁。RNA聚合酶II或III啟動子亦包括可引導RNA聚合酶II或III轉錄下游RNA編碼序列的任何合成或經工程改造之DNA片段。此外，用作病毒載體基因組一部分之RNA聚合酶II或III(Pol II或III)啟動子可為誘導型的。任何適合之誘導型Pol II或III啟動子可用於本發明之方法。特定而言，適合Pol II或III啟動子包括Ohkawa及Taira，《人類基因療法(Human Gene Therapy)》，第11卷，第577-585頁(2000)及Meissner等人《核酸研究》，第29卷，第1672-1682頁(2001)中提供之四環素反應性啟動子。
內部強化子亦可存在於病毒構築體以提高相關基因之表現。舉例而言，可使用CMV強化子(Boshart等人《細胞(Cell)》,41：521,1985)。病毒基因組(諸如HIV、CMV)及哺乳動物基因組中之許多強化子 已經鑑別及表徵(參見GenBank)。強化子可與異源啟動子組合使用。一般技術者將能夠基於所需表現模式選擇適當強化子。
病毒載體基因組通常將含有由標靶細胞識別且可操作地連接於相關序列、病毒組分及本文中論述之其他序列的啟動子。啟動子為由允許RNA聚合酶結合及進行轉錄之核酸序列形成的表現控制元件。啟動子可為誘導型、組成型、時間上活性或組織特異性。誘導型啟動子之活性藉由生物或非生物因子之存在或不存在誘發。誘導型啟動子可為可用於遺傳工程改造之工具，因為其可操作地連接之基因的表現可在生物體發育、其製造之某些階段或特定組織中打開或關閉。誘導型啟動子可分組為化學調控之啟動子及物理調控之啟動子。典型化學調控之啟動子包括(不限於)醇調控之啟動子(例如醇脫氫酶I(alcA)基因啟動子)、四環素調控之啟動子(例如四環素反應性啟動子)、類固醇調控之啟動子(例如基於大鼠糖皮質激素受體(GR)之啟動子、基於人類雌激素受體(ER)之啟動子、基於娥蛻皮激素受體之啟動子及基於類固醇/類視黃素/甲狀腺受體超家族之啟動子)、金屬調控之啟動子(例如基於金屬硫蛋白基因之啟動子)及與發病機制相關啟動子(例如基於芥菜屬及玉米病原體相關(PR)蛋白質之啟動子)。典型物理調控之啟動子包括(但不限於)溫度調控之啟動子(例如熱休克啟動子)及光調控之啟動子(例如大豆SSU啟動子)。其他示例性啟動子描述於其他地方，例如2009年5月18日訪問之Patent Lens網站上《用於調控基因表現之啟動子(Promoters used to regulate gene expression)》。
熟習此項技術者將能夠基於特定情形選擇適當啟動子。此項技術中熟知許多不同啟動子，以及將啟動子可操作地連接於待表現之基因 的方法。天然啟動子序列與許多異源啟動子均可用於引導包裝細胞及標靶細胞中之表現。然而，異源啟動子為較佳，因為其與天然啟動子相比，一般使所需蛋白質之轉錄程度更大及產率更高。
啟動子可例如自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛類乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、肝炎B病毒及猿猴病毒40(SV40)之病毒的基因組獲得。啟動子亦可為例如異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子或通常與天然序列相關之啟動子，限制條件為此類啟動子與標靶細胞相容。在一個實施例中，啟動子為病毒表現系統中天然存在之病毒啟動子。在一些實施例中，啟動子為樹突狀細胞特異性啟動子。樹突狀細胞特異性啟動子可為例如CD11c啟動子。
轉錄可藉由將強化子序列插入載體中來增加。強化子通常為DNA之順式作用元件，通常長度為約10至300bp，其作用於啟動子上以提高其轉錄。現已知來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)及來自真核細胞病毒之許多強化子序列。實例包括複製起點後側(bp 100-270)上之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側上之多瘤病毒強化子以及腺病毒強化子。強化子可在抗原特異性聚核苷酸序列之5'或3'位置剪接至載體中，但較佳相對於啟動子位於5'位點。
表現載體亦可含有終止轉錄及使mRNA穩定化所需之序列。此等序列常常在真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'非轉譯區發現，且為此項技術中所熟知。
病毒載體基因組亦可含有其他遺傳元件。可包括於構築體中之元件類型不以任何方式受限制且可經選擇以達成特定結果。舉例而言，可包括促進病毒基因組在標靶細胞中進入細胞核之信號。此類信號之一個實例為HIV-1 cPPT/CTS信號(DNA瓣)。此外，可包括促進原病毒整合位點在標靶細胞中表徵之元件。舉例而言，tRNA琥珀抑制因子序列可包括於構築體中。來自例如雞β-血球蛋白之隔離子序列亦可包括於病毒基因組構築體中。此元件降低整合之原病毒在標靶細胞中因甲基化及異染色質化而沉默的機率。另外，隔離子可保護內部強化子、啟動子及外源性基因避免在染色體上之整合位點處受到來自周圍DNA之正面或負面位置效應。另外，載體基因組可含有經設計以增強相關基因表現之一或多個遺傳元件。 舉例而言，土拔鼠肝炎病毒反應元件(WRE)可置放於構築體中(Zufferey等人1999.《病毒學雜誌》74：3668-3681；Deglon等人2000.《人類基因療法(Hum.Gene Ther.)》11：179-190)。
病毒載體基因組通常呈可轉染至包裝或生產細胞株中之質體形式構築。質體一般包含可用於在細菌中複製質體之序列。此類質體為此項技術中所熟知。另外，包括原核生物複製起點之載體亦可包括表現賦予諸如抗藥性之可偵測或可選標記的基因。典型細菌抗藥性產物為賦予安比西林或四環素抗性之產物。
含有本文所述之一或多種組分之質體容易使用此項技術中熟知之標準技術構築。對於為證實所構築之質體中序列正確的分析，質體可在大腸桿菌中複製，純化，且藉由限制性核酸內切酶消化分析或其DNA序列藉由習知方法測定。
亦可使用經構築以在哺乳動物細胞中短暫表現之載體。短暫表現涉及使用能夠在宿主細胞中有效複製之表現載體，使得宿主細胞積聚表現載體之許多複本且又在表現載體中合成高水準之由抗原特異性聚核苷酸編碼之多肽。參見Sambrook等人，上述，第16.17-16.22頁。適合於表現多肽之其他載體及方法為此項技術中所熟知且容易針對特定情形調適。
使用本文提供之教示內容，熟習此項技術者將認識到特定表現系統之功效可藉由用包含編碼報導蛋白之基因之載體轉染包裝細胞且使用適合技術量測表現，例如量測來自綠色螢光蛋白結合物之螢光來測試。適合報導基因為此項技術中所熟知。
3. 二聚體起始位點(DIS)序列
反轉錄病毒選擇性地包裝未剪接RNA基因組之兩個複本。已知兩個反轉錄病毒RNA複本在病毒出芽前，甚至在其與gag蛋白相互作用前在宿主細胞中相遇(參見例如Moore等人，《艾滋病評論(AIDS Rev.)》2009年4月-6月；11(2)：91-102；Lu等人《分子生物學雜誌(J Mol Biol)》2011410：609-633)。在HIV-1中，舉例而言，在RNA中靠近基因組之5'端處且主要在5'非轉譯區(5'UTR)內存在莖環，稱為SL1，其暴露回文序列GCGCGC(SEQ ID NO：1)。此序列以瓦生-克里克方式與其他RNA搭配物上之相同序列相互作用。修飾此序列可打開或關閉二聚。此特徵可用於針對特定所需二聚特性調整既定基因組。本文中預期使用來源於任何反轉錄病毒之回文或非回文二聚體起始位點(DIS)序列。本文中亦預期使用合成回文或非回文DIS序列。作為另一實例，HIV-1亞型C具有回文GUGCAC(SEO ID NO：6)。
作為一個實例，為降低基因組A與基因組B二聚之概率，不同回文序列可用於基因組B(不與基因組A之回文序列配對的序列)中，使得其僅僅自身二聚。序列可經設計，使得其允許均二聚，但不與基因組A雜二聚。此可用於其中特定相關序列得益於在同種接合載體中的情形，例如出於產生免疫反應的目的。
作為另一實例，回文DIS序列可經修飾，使得均二聚減少(例如序列經修飾以呈非回文)。實際上，序列經工程改造以與同源搭配物形成強鹼基配對。舉例而言，對於基因組A，為諸如GCCCGG(SEQ ID NO：2)之序列，且對於基因組B，為CCGGGC(SEQ ID NO：3)。此序列組態有利於異源二聚配對及異種接合載體顆粒形成。以此方式，異種接合載體顆粒(重配)在製劑中之所得比例可改變且使得其含有超過50%重配異種接合顆粒。此例如適用於免疫調節分子連同特定抗原一起傳遞且最佳傳遞至相同宿主細胞的情況下(例如其中使用需要共同傳遞之IRF3、CD40、siRNA或其他相關序列)。較佳促進異種接合配對之另一實例為在儘可能少的均二聚體下表現TCR-α及β鏈以產生CART。本文中涵蓋之其他二聚基元包括分別針對A及B之GGGGGG(SEQ ID NO：4)及CCCCCC(SEQ ID NO：5)。一或多個A-U鹼基配對之添加可用於改變相互作用之結合強度。可用於本文中之載體中的其他二聚序列對包括GCGCGG(SEQ ID NO：7)與CGCGCC(SEQ ID NO：8)配對；GGGCGG(SEQ ID NO：9)與CCCGCC(SEQ ID NO：10)配對。亦參見Lu等人2011《分子生物學雜誌》410：609；Baig等人，2008《反轉錄病毒》5：65；Moore等人，2007《病毒性雜誌》81：4002；Moore等人，2009《艾滋病評論》11：91；Tran等人，2015《反轉錄病毒》12：83。涵蓋用以 促進一個基因組與另一基因組如所需配對或充當二聚序列的任何RNA序列或序列對用於本文中之病毒載體及包裝系統。
4. 相關序列(SOI)
相關序列不以任何方式受限制且包括一般技術者希望在標靶細胞中轉錄且表現之任何核酸。通常，相關序列與反轉錄病毒載體基因組異源，然而在某些實施例中，相關序列可編碼反轉錄病毒蛋白質。產物可為蛋白質或核酸。相關序列可編碼蛋白質或核酸分子，包括siRNA、微RNA、自身互補之雙股RNA(其中互補區域長度超過約20個核糖核苷酸)或與信使RNA互補之RNA(其中該互補(反義)RNA與信使RNA之結合阻斷其轉譯成蛋白質之能力)。
在一些情況下，相關序列可編碼希望免疫反應針對之抗原。詳言之，希望來自諸如HIV、RSV、HBV、HSV、HCV、HPV、百日咳、金黃色葡萄球菌、瘧疾或肺結核之病原體的腫瘤抗原、尤其新抗原及感染性疾病抗原。與許多疾病及病症相關之抗原為此項技術中所熟知。抗原可事先已知與疾病或病症相關，或可藉由此項技術中已知之任何方法鑑別。舉例而言，可已知患者所患之癌症類型之抗原，諸如腫瘤相關抗原或新抗原，或可藉由此項技術中已知之多種方法中的任一者自腫瘤本身鑑別。
已知多種癌症，包括例如肉瘤、腎細胞癌、前列腺癌、黑色素瘤及乳癌之腫瘤相關抗原。在一些乳癌中，舉例而言，Her-2受體在癌細胞之表面上過度表現。示例性腫瘤抗原包括組織分化抗原、突變蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌-睪丸抗原及血管或基質特異性抗原。預期用於本文中之腫瘤抗原包括(但不限於)任何癌症睪丸抗原，以下中之任一或多者：MAGE 腫瘤抗原(例如MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10)、BAGE、RAGE及NY-ESO-1，其為在睪丸之免疫特許區中及多種腫瘤細胞中表現之未突變抗原；譜系特異性腫瘤抗原，諸如黑色素細胞-黑色素瘤譜系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白質、腎細胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I及IX(亦稱為G250)、低氧誘導因子(例如HIF-1α及HIF-2aα)、VEGF或前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酯及前列腺之六跨膜上皮抗原(STEAP)、NKX3.1(其為在來源於相同組織之正常及贅生性細胞中表現之抗原)；來源於腫瘤細胞中突變之基因或腫瘤中以不同於正常細胞之水準轉錄之基因的抗原決定基蛋白質/肽，諸如端粒酶、存活素、間皮素、SSX2(HOM-MEL-40腫瘤抗原)、突變ras、bcr/abl重排、Her2/neu、EGF受體(包括EGFRviii突變)、突變或野生型p53、細胞色素P450 1B1及異常表現之內含子序列，諸如N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶-V；免疫球蛋白基因之純系重排，在骨髓瘤及B細胞淋巴瘤中產生獨特個體基因型；來源於致癌病毒過程之抗原決定基蛋白質/肽，諸如人類乳頭狀瘤病毒蛋白質E6及E7；具有腫瘤選擇性表現之未突變癌胚蛋白，諸如癌胚抗原及α-胎蛋白。亦涵蓋之腫瘤相關抗原為胚胎轉錄因子鼠短尾突變體表型(Brachyury)(參見例如Roselli等人《臨床癌症研究(Clin Cancer Res.)》2012年7月15日；18(14)：3868-79；Hamilton等人，《腫瘤學研討(Semin Oncol.)》2012年6月；39(3)：358-66；Palena等人，《美國國立癌症研究所雜誌(J Natl Cancer Inst.)》2014年5月9日；106(5))。已評論許多腫瘤相關抗原(參見例如《T淋巴細胞識別之腫瘤抗原(Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes)》,Boon T,Cerottini J C, Vandeneynde B,Vanderbruggen P,Vanpel A，《免疫學年鑒(Annual Review Of Immunology)》12：337-365,1994；《T細胞識別之人類腫瘤抗原清單(A listing of human tumor antigens recognized by T cells)》,Renkvist N,Castelli C,Robbins P F,Parmiani G.《癌症免疫學與免疫療法(Cancer Immunology Immunotherapy)》50：(1)2001年3月3-15日)。
在一個特定實施例中，多基因組慢病毒載體製劑將NYESO1及MAGEA3表現為相關序列。在另一個實施例中，有或無免疫調節分子下多基因組慢病毒載體製劑表現多種MAGE蛋白質。在一個實施例中，多基因組慢病毒載體製劑表現MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10及IL-12。在另一實施例中，有或無免疫調節分子下，除一或多種新抗原之外，多基因組慢病毒載體製劑表現多種MAGE蛋白質。在此點上，該一或多種新抗原可來自MAGE抗原或來自不同蛋白質。
在某些實施例中，相關序列編碼一或多種新抗原。新抗原為藉由癌細胞產生之異常突變蛋白且藉由免疫系統識別(參見例如Martin等人2015《腫瘤學年鑒(Annals Oncol.)》26：2367-2374；Linnemann等人，2015《自然醫學(Nature Medicine)》21：81-85；Kreiter等人，《自然(Nature)》520,692-696；《血液(Blood)》.2014年7月17日；124(3)：453-462等)。新抗原可藉由來自個體之腫瘤及正常組織之DNA及RNA進行定序以鑑別腫瘤特異性突變來鑑別；自所鑑別之新抗原對個體進行HLA分型且預測HLA結合抗原決定基。接著新抗原在開放閱讀框中合成且用於製備個人化疫苗。使用電腦模擬預測及/或對來自腫瘤生檢之HLA溶離肽進行基於MS之定序的高通量定序及抗原決定基鑑別以及免疫分析證明允許鑑別來自患者 之新抗原及所鑑別之新抗原立即用於個人化疫苗中。因此，用於產生多基因組載體製劑之本發明系統尤其適合於產生編碼新抗原或新抗原多抗原決定基卡匣及視情況具有其他全長腫瘤抗原及/或免疫調節分子的患者特異性多基因組病毒載體製劑。
抗原亦可為與諸如HIV/AIDS之感染性疾病相關之抗原。抗原可為例如gp120(Klimstra,W.B.等人，2003.《病毒學雜誌》77：12022-12032；Bernard,K.A.等人，2000.《病毒學(Virology)》276：93-103；Byrnes,A.P.等人，1998.《病毒學雜誌》72：7349-7356)。其他示例性抗原包括(但不限於)：gag、pol、env、tat、nef及rev(Lieberman,J.等人1997.《艾滋病研究及人類反轉錄病毒(AIDS Res Hum Retroviruses)13(5)：383-392；Menendez-Arias,L.等人1998.《病毒免疫學(Viral Immunol)》11(4)：167-181)。
病毒抗原之實例包括(但不限於)腺病毒多肽、α病毒多肽、杯狀病毒多肽(例如杯狀病毒衣殼抗原)、冠形病毒多肽、犬瘟熱病毒多肽、埃博拉病毒多肽、腸病毒多肽、黃病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(例如B型肝炎核心或表面抗原)或C型肝炎病毒E1或E2醣蛋白、核心或非結構蛋白、疱疹病毒多肽(例如單純疱疹病毒或水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白)、免疫缺乏病毒多肽(例如人類免疫缺乏病毒包膜或蛋白酶)、感染腹膜炎病毒多肽、流感病毒多肽(例如A型流感紅血球凝集素)、神經胺糖酸酶或核蛋白、白血病病毒多肽、馬堡病毒多肽(Marburg virus polypeptide)、正黏病毒多肽、乳頭瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如紅血球凝集素/神經胺糖酸苷酶)、副黏病毒多肽、細小病毒多肽、瘟疫病毒多肽、小RNA病毒多肽(例如脊髓灰白質炎病毒衣殼多肽)、痘病毒多肽(例如牛痘病毒 多肽)、狂犬病病毒多肽(例如狂犬病病毒醣蛋白G)、呼腸孤病毒多肽、反轉錄病毒多肽及輪狀病毒多肽。
細菌抗原之實例包括(但不限於)放線菌(Actinomyces)多肽、芽孢桿菌(Bacillus)多肽、擬桿菌(Bacteroides)多肽、鮑特氏菌屬(Bordetella)多肽、巴爾通體菌(Bartonella)多肽、疏螺旋體屬(Borrelia)多肽(例如伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)OspA)、布氏桿菌屬(Brucella)多肽、曲狀桿菌屬(Campylobacter)多肽、二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)多肽、衣原體多肽、梭菌屬(Clostridium)多肽、棒狀桿菌(Corynebacterium)多肽、考克斯氏體屬(Coxiella)多肽、潛蚤屬(Dermatophilus)多肽、腸球菌屬(Enterococcus)多肽、艾利希體屬(Ehrlichia)多肽、埃希氏桿菌屬(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)多肽、梭桿菌屬(Fusobacterium)多肽、血巴爾通氏體屬(Haemobartonella)多肽、嗜血桿菌屬(Haemophilus)多肽(例如b型流感嗜血桿菌外膜蛋白質)、螺旋桿菌屬(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌(Klebsiella)多肽、L-形式細菌多肽、鉤端螺旋體屬(Leptospira)多肽、李斯特菌屬(Listeria)多肽、分枝桿菌(Mycobacteria)多肽、黴漿菌(Mycoplasma)多肽、奈瑟氏菌屬(Neisseria)多肽、新立克次體(Neorickettsia)多肽、諾卡菌屬(Nocardia)多肽、巴氏桿菌(Pasteurella)多肽、消化球菌屬(Peptococcus)多肽、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌(Pneumococcus)多肽、變形桿菌(Proteus)多肽、假單胞菌(Pseudomonas)多肽、立克次體菌(Rickettsia)多肽、羅克利馬體屬(Rochalimaea)多肽、沙門氏菌(Salmonella)多肽、志賀桿菌屬(Shigella)多肽、葡萄球菌(Staphylococcus)多肽、鏈球菌屬 (Streptococcus)多肽(例如化膿性鏈球菌(S.pyogenes)M蛋白)、密螺旋體屬(Treponema)多肽及耶爾森菌屬(Yersiriia)多肽(例如鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)F1及V抗原)。
真菌抗原之實例包括(但不限於)犁頭黴屬(Absidia)多肽、枝頂孢屬(Acremonium)多肽、交鏈孢屬(Alternaria)多肽、麴菌屬(Aspergillus)多肽、蛙糞黴菌屬(Basidiobolus)多肽、平臍蠕孢屬(Bipolaris)多肽、芽生菌屬(Blastomyces)多肽、念珠菌屬(Candida)多肽、粗球菌(Coccidioides)多肽、耳黴屬(Conidiobolus)多肽、隱球菌屬(Cryptococcus)多肽、彎孢黴屬(Curvalaria)多肽、表皮癬菌(Epidermophyton)多肽、外瓶黴屬(Exophiala)多肽、地絲菌(Geotrichum)多肽、組織漿菌(Histoplasma)多肽、馬杜拉分支菌屬(Madurella)多肽、馬拉色氏黴菌屬(Malassezia)多肽、小芽孢菌(Microsporum)多肽、小叢梗孢屬(Moniliella)多肽、被孢黴屬(Mortierella)多肽、白黴菌屬(Mucor)多肽、擬青黴菌屬(Paecilomyces)多肽、青黴菌(Penicillium)多肽、單胞瓶黴屬(Phialemonium)多肽、瓶黴屬(Phialophora)多肽、原壁菌屬(Prototheca)多肽、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria)多肽、假小托菌屬(Pseudomicrodochium)多肽、腐黴菌(Pythium)多肽、鼻孢子蟲屬(Rhinosporidium)多肽、根黴菌屬(Rhizopus)多肽、線狀擔子菌屬(Scolecobasidium)多肽、孢子絲菌屬(Sporothrix)多肽、匍柄黴屬(Stemphylium)多肽、發癬菌(Trichophyton)多肽、毛芽胞酵母(Trichosporon)多肽及木絲黴屬(Xylohypha)多肽。
原生動物寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)巴倍蟲屬(Babesia)多肽、腸袋蟲屬(Balantidium)多肽、貝諾孢子蟲屬(Besnoitia) 多肽、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)多肽、艾美爾球蟲(Eimeria)多肽、腦胞內原蟲屬(Encephalitozoon)多肽、內阿米巴屬(Entamoeba)多肽、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)多肽、哈蒙德蟲屬(Hammondia)多肽、肝簇蟲屬(Hepatozoon)多肽、等孢子球蟲屬(Isospora)多肽、利什曼原蟲(Leishmania)多肽、微孢子蟲(Microsporidia)多肽、孢子蟲(Neospora)多肽、小孢子蟲(Nosema)多肽、五鞭毛蟲屬(Pentatrichomonas)多肽、瘧原蟲(Plasmodium)多肽(例如惡性瘧原蟲(P.falciparum)環子孢子(PfCSP))、子孢子表面蛋白2(PfSSP2)、肝臟狀態抗原1之羧基端(PfLSA1 c端)及輸出蛋白1(PfExp-1)、肺囊蟲(Pneumocystis)多肽、肉孢子蟲(Sarcocystis)多肽、住血吸蟲屬(Schistosoma)多肽、泰累爾犁漿蟲屬(Theileria)多肽、弓蟲(Toxoplasma)多肽及錐蟲屬(Trypanosoma)多肽。
寄生蠕蟲抗原之實例包括(但不限於)棘唇屬(Acanthocheilonema)多肽、貓圓線蟲屬(Aelurostrongylus)多肽、鉤蟲屬(Ancylostoma)多肽、血管圓線蟲屬(Angiostrongylus)多肽、蛔蟲屬(Ascaris)多肽、布魯線蟲屬(Brugia)多肽、仰口線蟲屬(Bunostomum)多肽、毛細線蟲屬(Capillaria)多肽、夏氏線蟲屬(Chabertia)多肽、古柏線蟲屬(Cooperia)多肽、環體線蟲屬(Crenosoma)多肽、網尾線蟲屬(Dictyocaulus)多肽、膨結線蟲屬(Dioctophyme)多肽、雙板線蟲屬(Dipetalonema)多肽、裂頭絛蟲屬(Diphyllobothrium)多肽、複孔絛蟲屬(Diplydium)多肽、絲蟲屬(Dirofilaria)多肽、龍線屬(Dracunculus)多肽、住腸線蟲屬(Enterobius)多肽、類絲蟲屬(Filaroides)多肽、血矛線蟲屬(Haemonchus)多肽、兔唇蛔屬(Lagochilascaris)多肽、羅阿線蟲屬(Loa)多肽、曼森線蟲屬(Mansonella) 多肽、繆勒線蟲屬(Muellerius)多肽、侏形吸蟲屬(Nanophyetus)多肽、鉤蟲屬(Necator)多肽、細頸線蟲屬(Nematodirus)多肽、結節線蟲屬(Oesophagostomum)多肽、盤尾絲蟲屬(Onchocerca)多肽、後睾吸蟲屬(Opisthorchis)多肽、奧斯特線蟲屬(Ostertagia)多肽、副絲蟲屬(Parafilaria)多肽、並殖吸蟲屬(Paragonimus)多肽、副蛔蟲屬(Parascaris)多肽、泡翼線蟲屬(Physaloptera)多肽、原圓屬(Protostrongylus)多肽、狗尾草屬(Setaria)多肽、旋尾線蟲屬(Spirocerca)多肽、迭宮絛蟲屬(Spirometra)多肽、冠絲蟲屬(Stephanofilaria)多肽、類圓線蟲屬(Strongyloides)多肽、圓線蟲(Strongylus)多肽、吸吮線蟲屬(Thelazia)多肽、蛔線蟲屬(Toxascaris)多肽、弓蛔蟲屬(Toxocara)多肽、旋毛蟲屬(Trichinella)多肽、毛樣圓蟲屬(Trichostrongylus)多肽、鞭蟲屬(Trichuris)多肽、鉤蟲屬(Uncinaria)多肽及吳策線蟲屬(Wuchereria)多肽。
外部寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)來自以下各者之多肽(包括保護性抗原以及過敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱及軟蜱；蒼蠅，諸如蠓、蚊子、白蛉、黑蠅、馬蠅、角蠅、鹿蠅、舌蠅、廄螫蠅、引起蠅蛆病之蒼蠅及庫蠓；螞蟻；蜘蛛、虱；蟎；以及蝽，諸如床虱及接吻蟲。
一旦已鑑別及選擇抗原，則鑑別編碼所需抗原之序列。在某些實施例中，序列包含cDNA。
在某些情況下，相關序列可為編碼下調分子表現之相關小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)之基因。舉例而言，編碼siRNA或微RNA之基因可用於下調細胞中負調節劑(包括抑制樹突狀細胞活化或成熟之調節劑)之表現。siRNA及微RNA為此項技術中所熟知(Fire等人，《自 然》391：806,1998；亦參見應用生物系統之「RNA干擾資源」(“The RNA Interference Resource”of Applied Biosystems),Trang等人，《致癌基因(Oncogene)》增刊2：S52,2008；Taganov,K.等人，2007.《免疫性(Immunity)》26：133-137；Dahlberg,J.E.及E.Lund.2007.《科學(Sci.)》STKE 387：pe25；Tiemann及Rossi，《歐洲分子生物學學會分子醫學(EMBO Mol Med)》1：142,2009)。或者，相關序列可編碼其中互補區長度超過約20個核糖核苷酸的自我互補雙股RNA，或長度超過約20個核糖核苷酸之反義RNA。一般技術者將瞭解，siRNA、miRNA、dsRNA及反義RNA分子可自RNA聚合酶III啟動子表現，或者，可為自RNA聚合酶II啟動子轉錄之非編碼RNA之組分。
另外，相關序列可編碼超過一種產物。在一些組態中，待傳遞之序列可包含編碼至少一種蛋白質、至少一種siRNA、至少一種微RNA、至少一種dsRNA或至少一種反義RNA分子或其任何組合之多種基因。舉例而言，待傳遞之序列可包括編碼希望免疫反應所針對之一或多種抗原的一或多種核酸。該一或多種抗原可與單個疾病或病症相關聯，或其可與多種疾病及/或病症相關聯。在某些實施例中，SOI包含編碼免疫調節蛋白之序列。在一些情況下，編碼免疫調節蛋白之序列可連同編碼希望免疫反應所針對之抗原的序列一起包括，且該組合可引發及調控免疫反應至所需方向及程度。在其他情況下，編碼siRNA、微RNA、dsRNA或反義RNA分子之序列可用編碼希望免疫反應所針對之抗原的基因構築，且該組合可調控免疫反應之範疇。產物可呈初始融合產物產生，其中編碼序列與一個啟動子呈功能性關係。或者，產物可分開編碼且各編碼序列與一個啟動子呈功能 性關係。啟動子可相同或不同。
在某些組態中，載體含有編碼免疫調節分子之聚核苷酸序列。示例性免疫調節分子包括多種細胞介素中之任一者。如本文所用，「細胞介素」意謂由一種細胞群體釋放而作用於另一細胞之蛋白質(如細胞間介體)的通用術語。此類細胞介素之實例為淋巴因子、單核因子及傳統多肽激素。細胞介素包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；苗勒氏管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-i及胰島素樣生長因子-ii；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；顆粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；以及顆粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1至IL-36，包括IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。預期用於本文中之其他免疫調節分子包括IRF3、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配位體(CD40L)、藥物誘導性CD40(iCD40)及其類似物。在某些實施例中，此等聚核苷酸通常在引導編碼序列在樹突狀細胞中之表現的一或多個 調控元件的控制下。
在某些實施例中，由本文所述之反轉錄病毒載體編碼之免疫調節分子為檢查點抑制分子。免疫檢查點係指對於維持自體耐受性及調節免疫反應之持續時間及幅度而言至關重要的免疫系統之多種抑制路徑。腫瘤使用某些免疫檢查點路徑作為免疫抵抗之主要機制，尤其抵抗對腫瘤抗原具有特異性之T細胞。(參見例如Pardoll,2012《自然》12：252；Chen及Mellman 2013《免疫性》39：1)。本發明提供編碼免疫檢查點抑制劑之載體。免疫檢查點抑制劑包括以統計學上顯著之方式阻斷或抑制免疫系統之抑制路徑的任何藥劑。此類抑制劑可包括結合於及阻斷或抑制免疫檢查點受體之抗體或其抗原結合片段，或結合於及阻斷或抑制免疫檢查點受體配位體之抗體。阻斷或抑制可靶向之例示性免疫檢查點分子包括(但不限於)CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(屬於分子之CD2家族，且在所有NK、γδ及記憶CD8+(αβ)T細胞上表現)、CD160(亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括結合於以下中之一或多者及阻斷或抑制以下中之一或多者的活性的抗體或其抗原結合片段或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。例示性免疫檢查點抑制劑包括曲美單抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻斷劑)、納武單抗(Nivolumab)(抗PD1抗體)、CT-011(抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224(抗PDL1 抗體)、BMS-936559(抗PDL1抗體)、MPLDL3280A(抗PDL1抗體)、MSB0010718C(抗PDL1抗體)及易沃伊(Yervoy)/伊派利單抗(ipilimumab)(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。
在某些實施例中，由慢病毒載體基因組表現之相關序列為嵌合抗原受體(CAR)(亦稱為嵌合T細胞受體)或重組T細胞受體，包括單鏈或可溶性T細胞受體。在某些實施例中，藉由包含細胞質信號傳導結構域(例如ζ鏈信號傳導結構域，有或無共刺激信號傳導區)及標靶特異性抗原結合域之單個嵌合T細胞受體提供標靶T細胞之活化及共同共刺激。本文中之嵌合抗原受體亦包含跨膜(TM)結構域以將其錨定至T細胞表面。TM可來源於CD3 ζ鏈或可來源於另一跨膜分子，諸如CD28或CD4。如熟習此項技術者所認識，可使用適合用於將嵌合受體錨定至膜之任何TM結構域。嵌合T細胞受體適合在已經本文所述之表現嵌合T細胞受體之慢病毒載體顆粒轉導的T淋巴細胞中產生。例示性嵌合抗原受體描述於例如美國專利7,741,465；5,843,728；7,446,190；6,392,013；7,994,298；8,252,914；6,410,319；7,446,179；7,265,209；以及公開申請案US20130288368、WO2012/079000及WO2012/129514。
在另一實施例中，相關序列編碼「結合域」或「結合區」或「結合元件」。根據本發明，結合域可為例如能夠特異性識別及結合於生物分子(例如細胞表面受體或腫瘤相關蛋白或其組分)之任何蛋白質、多肽、寡肽或肽。結合域包括相關生物分子之任何天然存在、合成、半合成或以重組方式產生之結合搭配物。舉例而言，結合域可為抗體輕鏈及重鏈可變區，或輕鏈及重鏈可變區可一起接合在單鏈中及呈任一取向(例如VL-VH 或VH-VL)。已知用於鑑別特異性結合特定標靶之本發明結合域的多種分析法，包括西方墨點法、ELISA、流動式細胞量測術或表面電漿子共振分析(例如使用BIACORE.TM.分析)。
在某些實施例中，待由結合域結合之標靶分子可為細胞表面表現之蛋白質，諸如受體(例如免疫檢查點分子)或腫瘤抗原。在另一實施例中，由本文中適用之結合域結合的標靶分子為可溶性抗原，諸如細胞介素、白蛋白或其他血清蛋白。例示性結合域包括免疫球蛋白抗原結合域，諸如scFv、scTCR、受體之細胞外域、細胞表面分子/受體之配位體或其受體結合域及腫瘤結合蛋白。在某些實施例中，抗原結合域可為scFv、VH、VL、域抗體變異體(dAb)、駱駝科抗體(VHH)、纖維結合蛋白3結構域變異體、錨蛋白重複序列變異體及來源於其他蛋白質支架之其他抗原特異性結合域。
可包括編碼可偵測產物、通常蛋白質之序列，以允許鑑別表現所需產物之細胞。舉例而言，螢光標記蛋白，諸如綠色螢光蛋白(GFP)連同相關序列(例如編碼抗原)一起併入構築體中。在其他情況下，蛋白質可藉由抗體偵測，或蛋白質可為作用於受質，得到可偵測產物或允許選擇經轉染或轉導之標靶細胞，例如賦予抗藥性(諸如抗潮黴素性)之產物之酶。典型選擇基因編碼賦予對抗生素或適合用於真核細胞之其他毒素(例如此項技術中之已知者中，尤其新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、殺稻瘟菌素(blasticidine))之抗性，補充營養缺陷型不足或供應介質所阻止之關鍵營養素的蛋白質。可選標記可視情況存在於分開質體上且藉由共轉染引入。
如其他地方所描述，本文中用於產生重配反轉錄病毒載體之方法意欲克服載體中多順反子表現單元之某些侷限性。然而，在某些實施例中，可能需要使用一或多個多順反子表現單元，其包括在包裝細胞中產生所需病毒需要的兩個或更多個元件(例如相關序列、包膜)。在某些實施例中，多順反子表現單元可包括於病毒載體基因組中。多順反子載體之使用降低所需要之核酸分子總數且因此避免與協調自多種載體基因組之表現相關之可能困難。在多順反子載體中，待表現之各種元件可操作地連接於一或多個啟動子(及視需要之其他表現控制元件)。在一些組態中，多順反子載體包含相關序列、編碼報導子產物之序列及病毒元件。相關序列通常編碼抗原、免疫調節分子或一或多種抗原與一或多種免疫調節分子之組合。有時，多順反子載體包含編碼抗原之基因、編碼免疫調節分子之基因。
待在多順反子表現載體中表現之各組分可例如藉由內部核糖體進入位點(IRES)元件或病毒2A元件分開，以允許各種蛋白質自相同啟動子分開表現。IRES元件及2A元件為此項技術中已知(美國專利第4,937,190號；de Felipe等人2004.Traffic 5：616-626)。在一個實施例中，編碼弗林裂解位點序列(RAKR)(Fang等人2005.《自然生物技術(Nat.Biotech)》23：584-590)與來自口蹄疫病毒(FMDV)、馬類動物鼻炎A病毒(ERAV)及明脈扁刺蛾β四體病毒(TaV)之2A樣序列連接(Szymczak等人2004.《自然生物技術》22：589-594)的寡核苷酸用於分開多順反子載體中之遺傳元件。特定多順反子載體之功效容易藉由使用標準方案偵測各基因之表現來測試。
在一特定範例中，病毒載體基因組包含：細胞巨大病毒 (CMV)強化子/啟動子序列；來自HIV 5' LTR之R及U5序列；包裝序列(ψ)；RRE、HIV-1 cPPT/CTS(DNA瓣)信號；內部強化子；內部啟動子；相關基因；土拔鼠肝炎病毒反應元件；tRNA琥珀抑制序列；缺失強化子序列之U3元件；雞β-血球蛋白隔離子；以及3' HIV LTR之R及U5序列。在一些範例中，載體基因組包含完整慢病毒5' LTR及自身不活化3' LTR(Iwakuma等人《病毒學(Virology)》15：120,1999)。
可使用此項技術中已知之任何適合之遺傳工程改造技術，實現載體基因組之構築，包括(但不限於)限制性核酸內切酶消化、接合、轉型、質體純化及DNA定序之標準技術，例如如以下中所述：Sambrook等人(1989.《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)》Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.)；Coffin等人(《反轉錄病毒(Retroviruses)》.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1997))及《RNA病毒：一種實用方法(RNA Viruses：A Practical Approach)》(Alan J.Cann編，Oxford University Press,(2000))。
本文所述之任一相關序列可包含相關序列(核苷酸序列或胺基酸序列中之任一者或兩者)之野生型型式的變異體。
關於聚核苷酸序列(例如用於包裝系統中之DNA/cDNA質體、RNA基因組序列等)，聚核苷酸變異體可含有一或多種取代、添加、缺失及/或插入，使得由變異聚核苷酸編碼之多肽之生物功能相對於由聚核苷酸序列編碼參考多肽基本上未減弱。舉例而言，某些多基因組慢病毒載體製劑可包括編碼免疫調節分子之序列。編碼免疫調節分子之聚核苷酸序列之變異體可包含一或多種取代、添加、缺失及/或插入，較佳使得由此編碼 之分子的免疫調節活性相對於由聚核苷酸序列編碼之參考免疫調節分子基本上未減弱。就此而言，此類聚核苷酸編碼生物活性(例如免疫調節活性)水準為參考多肽序列的至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的多肽。作為一非限制性實例，免疫調節蛋白質可為IL-12。IL-12活性可使用一般技術者已知之分析法量測。可量測變異IL-12多肽之活性且與野生型IL-12蛋白質相比。
在某些實施例中，變異體可為編碼與參考蛋白質一致之蛋白質的密碼子優化之變異聚核苷酸序列。
在另一實施例中，變異體可為參考序列之不規則變化類似物(參見例如美國專利8741576)。不規則變化之抗原決定基為誘發之T細胞反應比天然抗原決定基誘發之反應更強的經修飾之T細胞抗原決定基。不規則變化之類似物定義為如藉由對既定劑量之反應增加或藉由實現相同反應所需之量更小所量測，對特定T細胞之刺激能力或效能增加的肽(或全長蛋白質內之抗原決定基)。
與臨床應用中使用不規則變化類似物相關之優點如下。首先，不規則變化之類似物能夠藉由逆轉T細胞失能狀態，活化T細胞之不耐受交叉反應純系，或藉由調節「免疫偏差(亦即所產生之CTL類型，諸如Th1或Th2)」來破壞/克服耐受性。近期研究指示不規則變化之類似物為免疫原性的(Zaremba等人，《癌症研究(Cancer Research)》,57：4570(1997)；Rivoltoni等人，《癌症研究》，59：301(1999)；Selby等人，162(2)：669(1999))，因為其能夠誘發識別內源性加工之抗原決定基的CTL。此藉由在不同免疫系統中之研究證實(Zugel等人，《免疫學雜誌》，161：1705(1998)；Wang等 人，《實驗醫學學報(J.Exp.Med.)》,190：983(1999)；Men等人，《免疫學雜誌》，162：3566,(1999))。舉例而言，Zugel等人(Zugel等人，上述)之研究展示成年小鼠中T細胞對免疫顯性T細胞抗原決定基之耐受性可藉由用肽之不規則變化之交叉反應肽類似物免疫接種來解決。
在某些實施例中，變異體為免疫原性變異體，其中聚核苷酸變異體將含有一或多種取代、添加、缺失及/或插入，較佳使得由變異聚核苷酸編碼之多肽之免疫原性相對於由參考序列編碼之多肽基本上不減弱。
在某些實施例中，本文中之聚核苷酸(例如聚核苷酸變異體)編碼與參考多肽序列(例如公共序列資料庫中可得之腫瘤抗原序列)在免疫學上交叉反應之多肽。在其他實施例中，此類聚核苷酸編碼免疫原性活性水準為參考多肽序列之活性水準的至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的多肽。
因此，在本發明之某些實施例中，諸如位點特異性突變誘發之突變誘發方法用於製備本文所述之相關序列之變異體及/或衍生物。藉由此方法，可經由使編碼多肽序列之基礎聚核苷酸突變誘發，對多肽序列進行特定修飾。此技術提供一種製備及測試序列變異體之簡單方法，例如藉由引入一或多種核苷酸序列改變至聚核苷酸中，併入以上考慮因素中之一或多者。
位點特異性突變誘發允許經由使用編碼所需變異體之DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數目之相鄰核苷酸產生變異體，以提供具有足夠尺寸及序列複雜性之引子序列，從而在所穿過之序列之兩側上形成穩定雙螺旋。突變可用於所選聚核苷酸序列，以改善、更改、減少、改 變或者變化聚核苷酸本身之特性，及/或改變編碼多肽之特性、活性、組成、穩定性或一級序列。
在本發明之某些實施例中，本發明人涵蓋相關序列之突變誘發，以更改編碼多肽之一或多個特性，諸如多肽疫苗之免疫原性。位點特異性突變誘發之技術為此項技術中熟知，且廣泛用於產生多肽與聚核苷酸之變異體。舉例而言，位點特異性突變誘發常常用於更改DNA分子之特定部分。
C. 多基因組病毒載體製劑之產生
一般而言，用於產生本文所述之反轉錄病毒載體顆粒的方法為此項技術中已知之標準方法，其例外之處在於為產生包含異種接合(重配)反轉錄病毒顆粒之多基因組病毒載體製劑，包裝系統將包括至少兩種不同病毒載體基因組質體(參見例如圖1)。因為反轉錄病毒傾向於形成基因組重配，所以假設所得載體製劑含有所有可能同種接合及異種接合載體顆粒之混合物。
如本文中其他地方所述，在某些實施例中，預期用於本文中之至少兩種不同病毒載體基因組質體含有缺陷反轉錄病毒基因組。換言之，反轉錄病毒(例如慢病毒)載體基因組不含功能性gag/pol開放閱讀框。因此，在某些實施例中，適合載體基因組不編碼功能性gag蛋白質或功能gag或pol蛋白質。在某些實施例中，適合載體基因組不編碼功能性gag、pol或env蛋白質。
本發明藉由變化產生步驟期間輸入質體之相對量，允許有效控制多基因組病毒載體顆粒製劑中同種接合載體基因組相對於異種接合載 體基因組之最終比率。總輸出基因組分佈同樣可藉由變化產生步驟期間輸入質體之相對量來控制。此等概念概述於以下表1、表2及表3中。如其他地方所述，對兩個(或更多個)不同相關序列之表現的最終控制無法用多順反子載體、尤其以現成方式可靠地實現。
因此，使用本文所述之病毒載體包裝系統，可使用兩個或更多個不同病毒載體基因組。在此點上，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同病毒載體基因組質體可以各種不同比率添加至包裝系統中，以獲得所需多基因組反轉錄病毒載體製劑。在某些實施例中，2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-9、4-8、4-7、4-6或4-5種不同病毒載體基因組質體可以各種不同比率添加至包裝系統中，以獲得所需多基因組反轉錄病毒載體製劑。
在某些實施例中，不同病毒載體基因組除相關序列外均相同。在此點上，病毒載體基因組針對各相關序列將具有相同啟動子。在其他實施例中，不同病毒載體基因組中之一或多者可具有不同啟動子。因此， 在某些實施例中，不同啟動子可用於不同相關序列。啟動子及表現控制序列為熟習此項技術者所知且更詳細地描述於本文中其他地方。
此外，如本文中其他地方中更詳細地描述(參見部分B.慢病毒載體基因組之分部3.二聚體起始位點(DIS)序列)，本發明藉由改變各反轉錄病毒載體基因組之二聚體起始信號以促進同種接合相互作用或異種接合相互作用，而提供能夠控制任何既定多基因組製劑中異種接合或同種接合載體顆粒之比例的另一個優點。此外，本發明提供能夠控制輸入載體基因組之特定配對的優點。因此，在某些實施例中，超過兩種不同病毒載體基因組質體可用於本文所述之包裝系統中。舉例而言，2、3、4、5、6、7、8、9、10種或甚至更多種不同載體基因組質體可用於本文所述之包裝系統中，該等載體基因組質體中兩種或更多種含有DIS序列以促進特定配對事件(且因此促進特定同種接合或異種接合病毒載體顆粒)。
因此，與構築載體癌症疫苗之目前先進技術方法相比，本發明能夠快速構築具有優良免疫原性及廣泛保護之現成、半個人化及個人化癌症疫苗。
多種轉殖基因自多基因組反轉錄病毒載體製劑之表現解決需要將轉移載體基因組中相關轉殖基因之定位優化的多順反子載體選殖之問題。多基因組病毒載體可藉由用包含各表現不同轉殖基因之多種反轉錄病毒轉移載體(反轉錄病毒基因組)的質體混合物轉染生產/包裝細胞而產生快得多。
本發明允許基於使用現成轉移載體經由多質體轉染所產生之載體混合物產生個人化癌症疫苗。此亦允許產生由作用機製得益於在活 體內相同細胞內共同表現之不同轉殖基因構成之疫苗。
如本文所用，使用本文中之方法產生的病毒載體之混合群體可稱為「多基因組」病毒載體或多基因組病毒載體製劑。此有助於將本文中之載體與僅採用兩種病毒載體製劑且其一旦產生即將其混合相區分。熟習此項技術者清楚，此類混合之病毒載體製劑不含有任何異種接合病毒顆粒。如上所述，本文中之多基因組病毒載體可包含顆粒混合物，一些顆粒包含同種接合基因組且一些顆粒包含異種接合基因組。可使用本發明產生病毒載體之多種多基因組群體(參見例如作為一非限制性實例，表1及2)。多基因組病毒載體製劑可包含各種比率之同種接合及異種接合病毒載體顆粒，視所用輸入載體基因組(例如使用各種二聚體起始信號序列促進同種接合或異種接合相互作用，或藉由使用均包含相同DIS序列之不同病毒載體基因組，且藉由改變包裝系統中使用之輸入載體基因組質體之量，控制輸出群體)而定。在一個實施例中，在包裝系統中使用兩種載體基因組(載體基因組A及B)之情況下，輸出多基因組製劑可包含有各呈特定比率之包含AA同種接合基因組、BB同種接合基因組之顆粒，且此外包含特定比率之AB異種接合顆粒。在另一實施例中，輸出多基因組製劑可包含至少約50%包含同種接合基因組(AA及BB同種接合子基因組)之顆粒且包含約50% AB異種接合顆粒。在某些實施例中，輸出多基因組製劑可包含至少約60%包含同種接合基因組(AA及BB同種接合基因組)之顆粒且包含約40% AB異種接合顆粒。在某些實施例中，輸出多基因組製劑可包含至少約70%包含同種接合基因組(AA及BB同種接合基因組)之顆粒且包含約30% AB異種接合顆粒。在某些實施例中，輸出多基因組製劑可包含至少約80%包 含同種接合基因組(AA及BB同種接合基因組)之顆粒且包含約20% AB異種接合顆粒。
在某些實施例中，可能需要多基因組病毒載體製劑中異種接合顆粒之百分比儘可能高。就此而言，本發明提供包含至少60%異種接合病毒載體顆粒之多基因組病毒載體製劑及用於產生多基因組病毒載體製劑之方法。在某些實施例中，本發明提供一種多基因組病毒載體製劑，其包含約50%至約99%異種接合病毒載體顆粒。在另一實施例中，本發明提供一種多基因組病毒載體製劑，其包含至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%異種接合病毒載體顆粒。在某些實施例中，本發明提供一種多基因組病毒載體製劑，其包含約40%至約80%、約45%至約75%、約50%至約70%或約55%至約65%異種接合病毒載體顆粒。如本文所描述，本發明提供用於製備包含本文所述之百分比之異種接合病毒載體顆粒的混合病毒載體製劑的特定病毒載體基因組、方法及包裝系統。
在某些實施例中，多基因組病毒載體製劑藉由量測與特定製劑之總基因組力價相比，特定基因組之百分比來表徵(參見例如實例1)。就此而言，在某些實施例中，本發明提供製劑中包含約2%至約95%特定基因組之多基因組病毒載體製劑。在某些實施例中，多基因組病毒載體製劑可在製劑中包含約5%至約70%、約10%至約60%、約15%至約50%特定基因組。視輸入載體基因組質體之數目及各使用之比率而定，最終多基因組慢病毒載體製劑中具體特定基因組之百分比將變化(參見例如表2及3)。
多基因組病毒載體製劑可包含具有本文所述之相關序列之任何組合的載體基因組。作為一非限制性實例，多基因組病毒載體製劑可使用各編碼不同腫瘤抗原之三種不同病毒載體基因組製備且亦包括編碼免疫調節分子之一或多個病毒載體基因組。產生多基因組病毒載體製劑之病毒載體基因組組合之例示性實例包括(但不限於)：1)LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-CTLA4；2)LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-IL12；3)2)LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-IL23；4)LV-NY-ESO-1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-CD40；5)LV-MAGEA1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA4、LV-MAGEA10；6)LV-NTESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PD1；7)LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PDL1；8)LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PDL1、LV-ScFvanti-CTLA4。
在某些實施例中，多基因組病毒載體製劑可使用各編碼不同腫瘤抗原之四種或四種不同病毒載體基因組，在有或無編碼免疫調節分子之一或多種病毒載體基因組下製備。產生多基因組病毒載體製劑之病毒載體基因組之組合的一例示性實例包括(但不限於)：多種MAGE蛋白質，有或無免疫調節分子(例如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10，有或無IL-12)。
在某些實施例中，多基因組病毒載體製劑可使用各編碼不同腫瘤抗原之多個不同病毒載體基因組、各編碼一或多種新抗原之一或多種病毒載體基因組，在有或無編碼免疫調節分子之一或多種病毒載體基因組 下製備。作為一非限制性實例，產生多基因組病毒載體製劑之病毒載體基因組之組合包括(但不限於)：1)除一或多種新抗原之外的多種MAGE蛋白質，有或無免疫調節分子(例如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10中之一或多者之任何組合，包含多種新抗原之新抗原卡匣，有或無IL-12)。
如熟習此項技術者所瞭解，多基因組病毒載體製劑將含有不同異種接合與同種接合病毒顆粒之混合物(參見例如表2，其描述使用三種病毒載體基因組之製劑之的不同可能顆粒)。
在某些實施例中，混合病毒載體顆粒製劑包含一或多種異種接合病毒載體顆粒，其中異種接合病毒載體顆粒包含編碼抗原之病毒載體基因組及編碼免疫調節分子之病毒載體基因組。作為其他非限制性實例，在一個實施例中，異種接合病毒載體顆粒包含編碼第一抗原之第一載體基因組及編碼第二抗原之第二載體基因組，其中第二抗原不同於第一抗原。在某些實施例中，異種接合病毒載體顆粒包含編碼全長腫瘤抗原之第一載體基因組及編碼一或多種新抗原或新抗原抗原決定基之卡匣之第二載體基因組。在另一個實施例中，異種接合病毒載體顆粒包含編碼抗原之第一載體基因組及編碼檢查點抑制分子之第二載體基因組。在另一實施例中，異種接合病毒載體顆粒包含編碼抗原之第一載體基因組及編碼TLR促效劑之第二載體基因組。
此項技術中已知之多種方法中之任一者可用於產生基因組包含如本文所述之病毒載體基因組之RNA複本的慢病毒顆粒。在一種方法中，將如其他地方所描述之兩種或超過兩種病毒載體基因組引入含有包裝病毒基因組RNA所需之所有組分的包裝細胞株中，自病毒載體基因組轉錄 成病毒顆粒。或者，除一或多種相關序列之外，病毒載體基因組可包含編碼病毒組分之一或多種基因。然而，為防基因組在標靶細胞中複製，通常將移除複製所需之內源性病毒基因且呈反式分開提供於包裝細胞株中。
一般而言，反轉錄病毒載體顆粒藉由經含有產生顆粒所需之組分之一或多種質體載體轉染的細胞株產生。在轉染生產細胞前，將各編碼相關蛋白質(例如全長抗原或免疫調節劑或新抗原抗原決定基卡匣)之兩種或更多種不同載體基因組質體(以預定比率)連同編碼形成載體顆粒之蛋白質之其他恆定質體一起混合。
此等載體顆粒通常不能複製，亦即其僅僅能夠進行單輪感染。最通常，多種質體載體用以將產生反轉錄病毒載體顆粒之各種遺傳組分分開，主要為了降低可能另外產生複製勝任型病毒之重組事件的機率。然而，必要時，可使用具有所有反轉錄病毒組分之單一質體載體。作為採用多種質體載體之系統的一個實例，細胞株經以下轉染：含有病毒載體基因組之至少兩種質體(亦即載體基因組質體)，包括LTR、順式作用包裝序列及相關序列，其常常可操作地連接於異源啟動子；編碼病毒酶及結構組分之至少一種質體(亦即編碼諸如Gag及Pol之組分的包裝質體)；及編碼包膜醣蛋白之至少一種包膜質體。如本文所描述及此項技術中已知，其他質體可用於增強反轉錄病毒顆粒之產生，例如Rev表現質體及/或Vpx表現質體。病毒顆粒發芽穿過細胞膜且包含包括含有相關序列之基因組的核心及靶向樹突狀細胞之包膜醣蛋白。當包膜醣蛋白為辛德比病毒E2醣蛋白時，醣蛋白經工程改造以與參考菌株硫酸乙醯肝素相比，與硫酸乙醯肝素之結合減少。
用本發明之質體載體轉染包裝細胞可藉由熟知方法實現，且所使用之方法不以任何方式受限制。許多非病毒傳遞系統為此項技術中已知，包括例如電穿孔、包括脂質體之基於脂質之傳遞系統、傳遞「裸」DNA及使用聚環糊精化合物傳遞，諸如Schatzlein AG.(2001.《癌症基因療法中的非病毒載體：原理及進展(Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy：Principles and Progresses)》.《抗癌藥物(Anticancer Drugs)》。通常採用陽離子脂質或鹽處理方法，參見例如Graham等人(1973.《病毒學(Virol.)》52：456；Wigler等人(1979.美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》76：1373-76)。最常使用磷酸鈣沈澱法。然而，亦可使用其他用於將載體引入細胞中之方法，包括核顯微注射及細菌原生質體融合。
如本文中在表1、2、3及實例中進一步描述，多基因組反轉錄病毒載體製劑中所需之各基因組之輸入反轉錄病毒基因組質體的比率可視所需輸出而變化。
包裝細胞株提供將病毒基因組RNA包裝成反轉錄病毒載體顆粒所需之呈反式之組分，包括病毒調控及結構蛋白。包裝細胞株可為能夠表現反轉錄病毒蛋白質且產生功能性反轉錄病毒載體顆粒之任何細胞株。一些適合包裝細胞株包括293(ATCC CCL X)、293T、海拉(HeLa)(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)及Cf2Th(ATCC CRL 1430)細胞。包裝細胞株可穩定表現必需病毒蛋白質。此類包裝細胞株描述於例如美國專利第6,218,181號中。或者，包裝細胞株可經編碼一或多種必需病毒蛋白質之核酸分子以及病毒載體基因組短暫轉染。收集所得病毒顆粒且用於感染標靶細胞。編碼包膜醣蛋白之基因通常 選殖至諸如pcDNA3(Invitrogen,CA USA)之表現載體中。真核細胞表現載體為此項技術中所熟知且獲自許多商業來源。接著諸如293T細胞之包裝細胞經編碼相關序列之病毒載體基因組、編碼病毒包裝組分之至少一種質體及用於表現靶向分子之載體共轉染。包膜在包裝細胞之膜上表現且併入病毒載體中。
在一種情況下，一或多種載體用於將聚核苷酸序列引入包裝細胞株中以製備如本文所描述，用VSVg包膜或辛德比病毒包膜醣蛋白(諸如E2)假模式化的反轉錄病毒載體顆粒。載體可含有編碼病毒之各種組分的聚核苷酸序列，包括VSVg或辛德比病毒包膜、各含有相關序列(例如抗原或其他相關序列)之載體基因組質體及包裝細胞未提供之產生病毒所需之任何組分。
在其他情況下，包裝細胞與編碼相關蛋白質之至少兩種病毒載體基因組及一或多種其他載體共轉染。舉例而言，除包含相關序列(及視情況存在之一或多種其他相關序列)之病毒載體基因組之外，第二載體攜有編碼包膜蛋白(諸如VSVg包膜或經修飾(亦稱為變異)辛德比病毒包膜)之基因。在一些情形下，含有病毒載體基因組之質體包括編碼其他選定免疫調節分子(包括趨化因子、細胞介素、DC成熟因子或調控免疫檢查點機制之因子的非限制性實例)之聚核苷酸序列。
在某些實施例中，包裝系統為所謂第四代包裝系統，其中gag-pol基因進一步分離至兩個分開的質體上。此類系統為此項技術中已知且描述於例如美國專利6365150、6955919、7311907及8034620中。此類包裝系統亦可購自例如Clontech/Takara(San Diego,CA)。在某些實施例中，pol 基因可與vpr融合以確保反轉錄酶/整合酶蛋白質輸送至重組病毒顆粒中。
在某些實施例中，包裝系統如WO2013/149167或WO2011/011584中所述。
在一些或任何實施例中，本文所述之反轉錄病毒載體顆粒包含SAMHD1抑制劑。在某些實施例中，SAMHD1抑制劑為Vpx蛋白質或Vpr蛋白質。在某些實施例中，本文所述之反轉錄病毒載體顆粒包含Vpx蛋白質或其變異體(參見例如WO2013/149167)。在一些或任何實施例中，變異體保留抑制SAMHD1之能力。
在一些實施例中，反轉錄病毒載體用諸如辛德比包膜蛋白之蟲媒病毒包膜醣蛋白假模式化。辛德比病毒包膜蛋白含有四個N連接之聚糖-兩個在E2蛋白上且兩個在E1蛋白上。在缺乏甘露糖苷酶I抑制劑下在哺乳動物細胞中產生之病毒的兩個N-聚糖具有高甘露糖結構(一個E2N連接之聚糖及一個E1 N連接之聚糖)，而剩餘兩個具有複雜結構。兩個複雜結構N-聚糖暴露在包膜蛋白之表面上，而兩個高甘露糖結構N-聚糖埋在包膜蛋白之三聚體之中心內。具有複雜N連接之聚糖的辛德比病毒顆粒結合DC-SIGN不如具有不太複雜之高甘露糖化醣蛋白之顆粒有效。
在某些實施例中，病毒顆粒在哺乳動物細胞中在存在甘露糖苷酶I抑制劑(諸如基夫鹼)下產生(參見例如WO2013/149167)。因此，在一些或任何實施例中，病毒包裝細胞在存在甘露糖苷酶I抑制劑下培養。在一些或任何實施例中，甘露糖苷酶I抑制劑為基夫鹼。在一些實施例中，基夫鹼以約0.01μg/ml至約1mg/ml、約0.1μg/ml至約10μg/ml、約0.1μg/ml至約9μg/ml、約0.1μg/ml至約8μg/ml、約0.1μg/ml至約7μg/ml、約0.1μg/ml 至約6μg/ml、約0.1μg/ml至約5μg/ml、約0.1μg/ml至約4μg/ml、約0.1μg/ml至約3μg/ml、約0.1μg/ml至約2μg/ml、約0.1μg/ml至約1μg/ml、約0.25μg/ml至約10μg/ml、約0.25μg/ml至約9μg/ml、約0.25μg/ml至約8μg/ml、約0.25μg/ml至約7μg/ml、約0.25μg/ml至約6μg/ml、約0.25μg/ml至約5μg/ml、約0.25μg/ml至約4μg/ml、約0.25μg/ml至約3μg/ml、約0.25μg/ml至約2μg/ml或約0.25μg/ml至約1μg/ml之濃度存在於培養基中。
在一些或任何實施例中，在假模式化反轉錄病毒載體顆粒包含辛德比病毒E2醣蛋白及Vpx蛋白質下，反轉錄病毒顆粒在存在甘露糖苷酶I抑制劑下產生。在一些實施例中，甘露糖苷酶抑制劑為去氧甘露糖野尻黴素(deoxymannojirimycin，DMNJ)。在較佳實施例中，甘露糖苷酶抑制劑為基夫鹼。在一些實施例中，DMNJ以約1.0μg/ml至約1.0mg/ml、約1.0μg/ml至約900μg/ml、約1.0μg/ml至約800μg/ml、約1.0μg/ml至約700μg/ml、約1.0μg/ml至約600μg/ml、約1.0μg/ml至約500μg/ml、約1.0μg/ml至約400μg/ml、約1.0μg/ml至約300μg/ml、約1.0μg/ml至約200μg/ml、約1.0μg/ml至約100μg/ml、約50μg/ml至約500μg/ml、約50μg/ml至約400μg/ml、約50μg/ml至約300μg/ml、約50μg/ml至約200μg/ml、約50μg/ml至約100μg/ml、約100μg/ml至約500μg/ml、約100μg/ml至約400μg/ml、約100μg/ml至約300μg/ml、約100μg/ml至約200μg/ml、約200μg/ml至約500μg/ml或約200μg/ml至約400μg/ml之濃度存在於培養基中。
在一些或任何實施例中，在存在甘露糖苷酶I抑制劑(例如基夫鹼)下產生之假模式化反轉錄病毒載體顆粒包含包膜醣蛋白(例如辛德比病毒E2)，其中至少60%N連接之聚糖包含甘露糖5(Man5)、Man6、 Man7、Man8及/或Man9結構。在一些實施例中，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% N連接之聚糖包含Man5、Man6、Man7、Man8及/或Man9+結構。
在一種情況下，一或多種載體用於將聚核苷酸序列引入包裝細胞株中以製備如本文所描述，用辛德比病毒包膜醣蛋白(諸如E2)假模式化的反轉錄病毒載體顆粒。在一些實施例中，反轉錄病毒載體顆粒高度甘露糖化。在一些實施例中，反轉錄病毒載體顆粒亦包含Vpx蛋白質或其變異體。在其他實施例中，反轉錄病毒載體顆粒高度甘露糖化且包含Vpx蛋白質或其變異體。載體可含有編碼病毒之各種組分之聚核苷酸序列，包括辛德比病毒包膜、相關序列(通常編碼抗原)及包裝細胞未提供之產生病毒所需之任何組分。
病毒包膜蛋白之糖基化型態可藉由此項技術中已知之任何方法測定。舉例而言，可比較用糖苷酶(例如EndoH或PNGaseF)處理之病毒醣蛋白或未經處理之病毒醣蛋白上的凝膠遷移分析法。其他方法包括自病毒醣蛋白裂解聚糖且經由HPLC及質譜分析法分離及鑑別組分。
如本文所描述量測病毒之產生且表示為每體積之IU。IU為感染單元，或者為轉導單元(TU)；IU及TU可互換使用，作為病毒載體顆粒製劑之力價之定量量度。如本文所描述，產生其中基因組可表現容易量測之產物的病毒。螢光蛋白、綠色螢光蛋白為較佳。反轉錄病毒載體通常為非整合的。接著將病毒投與標靶細胞且諸如藉由流動式細胞量測術測定表現GFP之標靶細胞之數目。接著計算力價。力價較佳儘可能高，但至少 為至少1×105IU/mL、至少3×105IU/mL、至少1×106IU/mL、至少3×106IU/mL或至少1×107IU/mL細胞上清液(在任何濃縮前)。或者，力價為在相同細胞中用VSV-G包膜假模式化之相同反轉錄病毒載體之力價的至少80%、至少90%、至少95%、至少100%。
在某些實施例中，病毒之產生量測為基因組/毫升。基因組可使用此項技術中已知之各種方法，諸如RT-PCR、PCR、qPCR、qdd(數位小滴)PCR及RNASCOPE或DNASCOPE量測。
多種方法可用於測定本文所述之包含重配之特定反轉錄病毒載體顆粒製劑的組成。舉例而言，可使用基於對存在於病毒載體製劑中之各相關序列具有特異性之引子組的基因特定之qRT-PCR。在某些實施例中，基因特定之qRT-PCR與流動式細胞量測術可組合使用。亦可使用其他單細胞方法，諸如數位小滴PCR(參見例如Bio-Rad QX-100 RT-ddPCR系統，Bio-Rad,Hercules,CA)；亦參見Hindson BJ等人(2011).《用於DNA複本數絕對定量之高通量小滴數位PCR系統(High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number)》.《分析化學(Anal Chem)》83(22)：8604-8610；Pinheiro LB等人(2012).《用於定量DNA複本數之小滴數位聚合酶鏈式反應格式的評估(Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification)》.《分析化學》84,1003-1011)。其他方法包括RNASCOPE及DNASCOPE(Advanced Cell Diagnostics,Inc.,Newark,CA)(參見例如Deleage等人，《病原體及免疫性(Pathogens and Immunity)》2016年春；1(1)：68-106；Wang等人，《分子診斷雜誌(J Mol Diagn.)》2012；14(1)：22-9；Player等人，《組織化學與細胞化學 雜誌(J Histochem Cytochem.)》2001；49(5)：603-12)。此等方法及用於測定特定病毒載體製劑或病毒顆粒或轉導細胞之同種接合相對於異種接合之組成的其他方法將為熟習此項技術者所知。
D. 病毒之傳遞
包含多基因組病毒載體製劑之組合物可以允許病毒與其中希望相關聚核苷酸傳遞之標靶細胞接觸的任何方式傳遞至標靶細胞。視應用而定，可靶向不同細胞。在某些實施例中，靶向腫瘤細胞。在其他實施例中，靶向樹突狀細胞(DC)。在其他實施例中，靶向T細胞或B細胞。本發明之反轉錄病毒載體可活體外使用(例如用於離體修飾細胞)或直接活體內使用。
有時，將適合量之包含多基因組病毒載體製劑之組合物例如經由注射至體內而直接引入人類或其他動物(活體內)。適合動物包括(但不限於)任何哺乳動物，諸如馬、狗、貓、牛、豬、綿羊、兔、雞或其他鳥類。病毒顆粒可藉由許多途徑，諸如靜脈內、肌肉內、真皮內、皮下、結節內、瘤內、腹膜腔內或經黏膜注射。病毒可使用皮下注射裝置傳遞，諸如美國專利第7,241,275號、第7,115,108號、第7,108,679號、第7,083,599號、第7,083,592號、第7,047,070號、第6,971,999號、第6,808,506號、第6,780,171號、第6,776,776號、第6,689,118號、第6,670,349號、第6,569,143號、第6,494,865號、第5,997,501號、第5,848,991號、第5,328,483號、第5,279,552號、第4,886,499號中所揭示之裝置。其他注射位置亦為適合的，諸如直接注射至包含標靶細胞之器官中。舉例而言，淋巴結內注射、脾臟內注射或骨髓內注射可分別用於將病毒傳遞至淋巴結、脾臟及骨髓。視標 靶細胞之特定情形及性質而定，引入可經由其他方式進行，包括例如吸入或直接接觸上皮組織，例如眼腈、口或皮膚中之上皮組織。
或者，提供標靶細胞且使之與病毒顆粒在活體外，諸如在培養盤中接觸。標靶細胞通常為包含獲自健康個體或需要治療之個體或希望刺激對抗原之免疫反應之個體的T細胞或樹突狀細胞之細胞群體。自個體獲得細胞之方法為此項技術中所熟知且包括靜脈切開術、外科切除術及生檢。人類DC亦可藉由獲得CD34α+人類造血祖細胞且使用如其他地方所描述之活體外培養方法產生(例如Banchereau等人《細胞(Cell)》106,271-274(2001)，以全文引用的方式併入本文中)。適當T細胞群體可使用類似方法在活體外產生。
多基因組製劑可懸浮於培養基中且添加至培養盤、管或其他容器之孔中。可在塗鋪細胞前或在塗鋪細胞後添加含有病毒之培養基。細胞通常在適量培養基中培育以提供存活力且允許培養基中病毒具有適合濃度，使得宿主細胞轉導。細胞較佳與病毒一起培育足夠允許病毒感染細胞之時間量。較佳地，細胞與病毒一起培育至少1小時、至少5小時或至少10小時。
在活體內與活體外傳遞時，可使用等分試樣的含有足夠感染所需標靶細胞之數目之病毒顆粒。當培養標靶細胞時，病毒顆粒之濃度一般為至少1IU/mL、更佳至少10IU/ml、甚至更佳至少300IU/mL、甚至更佳至少1×104IU/mL、甚至更佳至少1×105IU/mL、甚至更佳至少1×106IU/mL或甚至更佳至少1×107IU/mL。
在活體外用病毒顆粒感染後，標靶細胞可引入(或再引入) 人類或其他動物中。細胞可引入真皮中、真皮下或末梢血流中。引入動物之細胞較佳為來源於該動物之細胞以避免不良免疫反應。亦可使用來源於具有類似免疫背景之供體的細胞。亦可使用之其他細胞包括經設計以避免不良免疫反應之細胞。
可針對例如相關序列或基因之整合、轉錄及/或表現、所整合之基因之複本數目及整合位置，分析標靶細胞。此類分析可在任何時間進行且可藉由此項技術中已知之任何方法進行。
可針對經感染細胞之位置、病毒傳遞之聚核苷酸或相關基因之表現、免疫反應之刺激分析投與病毒或病毒感染細胞之個體，且藉由此項技術中已知之任何方法監測與疾病或病症相關之症狀。
以上揭示之感染細胞之方法不視細胞之個體特定之特徵而定。因此，其容易擴展至多種動物物種。在一些情況下，病毒顆粒傳遞至人類或人類細胞，諸如T細胞、B細胞或樹突狀細胞，且在其他情況下，其傳遞至動物，諸如小鼠、馬、犬、貓或小鼠或鳥類。如本文所論述，將病毒載體假模式化以賦予其廣泛宿主範圍以及標靶細胞特異性。熟習此項技術者亦知曉適當內部啟動子及其他元件以實現相關序列在特定動物物種中之所需表現。因此，熟習此項技術者將能夠修改感染來自任何物種之細胞之方法。
標靶細胞可用如本文所述之混合反轉錄病毒載體顆粒製劑感染，以預防或治療疾病或病症。在某些實施例中，標靶細胞可用如本文所述之混合反轉錄病毒載體顆粒製劑感染，以預防或治療活化患者中免疫反應將有益之疾病或病症。熟知許多此類疾病。舉例而言，可藉由本發明 之方法治療或預防的疾病或病症包括(但不限於)癌症、自體免疫疾病及感染，包括病毒、細菌、真菌及寄生蟲感染。在一種方法中，疾病藉由本文所述之病毒顆粒治療，以將相關序列傳遞至樹突狀細胞，其中相關序列之表現產生疾病特異性抗原且刺激抗原特異性細胞免疫反應及體液免疫反應。一般而言，相關序列編碼希望免疫反應所針對，但通常在樹突狀細胞中不表現之一或多種抗原。抗原藉由樹突狀細胞表現及呈現。在其他實施例中，病毒載體基因組可編碼如本文所述之免疫調節分子。在某些實施例中，病毒載體顆粒為異種接合且包含編碼抗原之病毒載體基因組及編碼免疫調節分子之病毒載體基因組，兩者均在標靶細胞中表現。
在典型使用中，病毒顆粒將編碼希望免疫反應所針對之抗原的序列及編碼免疫調節分子之序列傳遞至樹突狀細胞。傳遞可藉由使細胞與病毒在活體外接觸來實現，從而提供經感染細胞給患者。其他時候，傳遞可藉由將病毒傳遞至個體來實現以在活體內感染細胞。在某些實施例中，將包含多基因組製劑之組合物傳遞至個體以在活體內感染樹突狀細胞。接著樹突狀細胞刺激患者中抗原特異性T細胞或B細胞以誘發對所表現抗原之細胞及體液免疫反應。因此，本發明提供誘發個體中免疫反應之方法，其包含向該個體投與包含本文所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑之醫藥組合物。在其他實施例中，本發明提供治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含本文所述之多基因組病毒載體製劑之醫藥組合物，其中SOI編碼一或多種腫瘤相關抗原及視情況存在之一或多種檢查點抑制劑或一或多種細胞介素或其組合。在另一實施例中，本發明提供一種治療個體之感染性疾病之方法，其包含向該個體投與包含本文所述之多基因組 病毒載體製劑之醫藥組合物，其中SOI編碼與感染性疾病相關之抗原。
在其他實施例中，標靶細胞在活體內或活體外用本文所述之表現免疫調節分子之病毒感染。接著經感染細胞在患者中表現免疫調節分子以調節免疫反應。以此類方式，罹患疾病或病症之患者藉由用免疫調節分子產生具有所需特異性或調節免疫反應之免疫細胞來治療
與疾病或病症相關之任何抗原可使用如本文所述之多基因組病毒載體傳遞至樹突狀細胞。鑑別與疾病或病症相關之抗原以製備靶向樹突狀細胞之病毒顆粒。
若離體接觸，則接著標靶樹突狀細胞例如藉由注射而轉移回患者，其中其與能夠針對所需抗原產生免疫反應之免疫細胞相互作用。在其他實施例中，重組病毒注射至患者中，其中其當場轉導所靶向之樹突狀細胞。接著樹突狀細胞表現與待治療之疾病或病症相關之特定抗原，且患者能夠針對該疾病或病症發動有效免疫反應。
在某些實施例中，病毒載體顆粒為異種接合且含有各包含編碼不同抗原之聚核苷酸序列之載體基因組，且在轉導標靶樹突狀細胞時，產生針對傳遞至細胞之眾多抗原的免疫反應。在一些實施例中，抗原與單一疾病或病症相關。在其他實施例中，抗原與多種疾病或病症相關。
在一些本文所述之多基因組載體中，顆粒包含至少一種編碼活化及/或刺激免疫反應且在某些實施例中活化及/或刺激DC成熟之免疫調節分子的載體基因組。在替代方案中，在病毒傳遞之前、同時或之後，DC藉由DC成熟因子之傳遞而活化。DC成熟因子可與病毒投與分開提供。
本文所描述之方法可用於患者中過繼性免疫療法。如上所 述，鑑別希望免疫反應所針對之抗原。獲得編碼所需抗原之聚核苷酸且包裝成如本文所述之重組多基因組病毒載體製劑。標靶樹突狀細胞獲自患者且用含有編碼所需抗原之聚核苷酸之重組病毒轉導。接著樹突狀細胞轉移回患者。
多基因組病毒載體可在活體內注射，其中其感染標靶細胞，諸如DC，且傳遞通常編碼抗原及/或免疫調節分子之相關序列。病毒顆粒之量為至少3×106IU，且可為至少1×107IU、至少3×107IU、至少1×108IU、至少3×108IU、至少1×109IU或至少3×109IU。以所選時間間隔，來自接受者之淋巴器官的DC可例如藉由觀測標記物表現，諸如相關抗原或GFP或螢光素酶，用於量測表現。核酸監測技術及反轉錄酶(RT)活性之量測亦可用於分析病毒顆粒生物分佈。可自對抗原刺激之反應的程度及持久性，量測來自經慢病毒載體顆粒治療之接受者之周邊血單核細胞、淋巴結、脾臟或惡性或標靶病原體感染組織的T細胞。可分析除DC外之諸如上皮細胞及淋巴細胞之組織細胞的活體內基因傳遞特異性。
疫苗常常包括佐劑。本文所述之多基因組反轉錄病毒載體亦可連同佐劑一起投與。佐劑可在重組病毒顆粒前或在重組病毒顆粒後與重組病毒顆粒一起投與。若與病毒顆粒一起投與，則合乎需要之佐劑不顯著破壞病毒顆粒之完整性，諸如破壞含有包膜醣蛋白之病毒膜。
雖然本文中多基因組病毒載體之典型使用為在活體內靶向DC以誘發針對一種抗原或多種抗原之免疫反應，但本文中涵蓋其他標靶細胞及使用，諸如用於過繼性免疫療法、產生經修飾之T細胞(表現經修飾之TCR或嵌合抗原受體)、基因療法等。
多種佐劑可與病毒組合使用以引發對病毒載體基因組中編碼之抗原的免疫反應。較佳佐劑增加對抗原之內源性反應，不會引起影響反應之定性形式的抗原構形改變。較佳佐劑包括礬、3去O-醯化單磷醯基脂質A(MPL)(參見GB 2220211)。QS21為自南美洲發現之皂皮樹莫利納樹(Molina tree)之樹皮分離的三萜糖苷或皂素(參見Kensil等人，《疫苗設計：次單元及輔助方法(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)》(Powell及Newman編，Plenum Press,NY,1995)；美國專利第5,057，540號)。其他佐劑為水包油乳液(諸如角鯊烯或花生油)，視情況與諸如單磷醯基脂質A之免疫刺激劑組合(參見Stoute等人，《新英格蘭醫學雜誌(N.Engl.J.Med.)》336,86-91(1997))。另一佐劑為CpG(《今日生物世界(Bioworld Today),1998年11月15日)。或者，Aβ可偶合於佐劑。舉例而言，Aβ之脂肽型式可藉由如關於B型肝炎抗原疫苗接種所述，棕櫚酸或其他脂質直接偶合於Aβ之N端來製備(Livingston，《免疫學雜誌(J.Immunol.)》159,1383-1392(1997))。然而，此類偶合基本上不應改變Aβ之構形以致影響其免疫反應之性質。佐劑可作為與活性劑之治療組合物之組分投與或可在投與治療劑之前、並行或之後分開投與。
一類佐劑為鋁鹽(礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸酯鋁、硫酸鋁。此類佐劑可在有或無諸如MPL或3-DMP、QS21、諸如聚麩胺酸或聚離胺酸之聚合或單體胺基酸之其他特定免疫刺激劑下使用。另一類別佐劑為水包油乳液調配物。此類佐劑可在有或無如下其他特定免疫刺激劑下使用：胞壁醯基肽(例如N-乙醯基胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(去甲-MDP)、N-乙醯基 胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'二棕櫚醯基-sn--甘油基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙醯基葡萄糖胺基-N-乙醯基胞壁醯基-L-Al-D-isoglu-L-Ala-二棕櫚醯氧基丙醯胺(DTP-DPP)theramide.TM.)或其他細菌細胞壁組分。水包油乳液包括(a)MF59(WO 90/14837)，其含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80及0.5% Span 85(視情況含有各種量之MTP-PE，使用微流化床，諸如型號110Y微流化床(Microfluidics,Newton Mass.)調配成次微米級顆粒；(b)SAF，其含有10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5%普洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，微流化成次微米級乳液或渦動以產生更大粒徑乳液；及(c)Ribi佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種來自由以下各者組成之群之細菌細胞壁組分：單磷醯基脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳MPL+CWS(DetoxTM)。另一類別較佳佐劑為皂素佐劑，諸如Stimulon.TM.(QS21,Aquila,Worcester,Mass.)或自其產生之顆粒，諸如ISCOM(免疫刺激複合物)及ISCOMATRIX。其他佐劑包括完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)。其他佐劑包括細胞介素，諸如介白素(IL-1、IL-2及IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)。
可用於本文中之組合物的另一佐劑藉由化學式(I)鑑別：
其中部分A1及A2獨立地選自氫、磷酸酯及磷酸鹽之群。鈉及鉀為磷酸鹽之示例性抗衡離子。部分R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自由C3-C23表示之具有3至23個碳之烴基之群。為更加清晰，將解釋當部分「獨立地選自」具有多個成員之指定基團時，應瞭解針對第一部分選擇之成員不以任何方式影響或限制針對第二部分選擇之成員的選擇。R1、R3、R5及R6接合之碳原子為不對稱的，且因此可呈R或S立體化學存在。在一個實施例中，彼等碳原子全部呈R立體化學，而在另一個實施例中，彼等碳原子全部呈S立體化學。
「烴基」係指完全由氫及碳形成之化學部分，其中碳原子之排列可為直鏈或分支、非環狀或環狀，且相鄰碳原子之間的鍵結可完全為單鍵，亦即得到飽和烴基，或任兩個相鄰碳原子之間可存在雙鍵或參鍵，亦即得到不飽和烴基，且烴基中之碳原子數在3至24個碳原子之間。烴基可為烷基，其中代表性直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及其類似物，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、 十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而分支烷基包括異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基及其類似基團。代表性飽和環烴基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基及其類似基團；而不飽和環烴基包括環戊烯基及環己烯基及其類似基團。不飽和烴基含有至少一個在相鄰碳原子之間的雙鍵或參鍵(若烴基為非環狀，則分別稱為「烯基」或「炔基」，且若烴基為至少部分環狀，則分別稱為環烯基及環炔基)。代表性直鏈及分支烯基包括伸乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基及其類似基團；而代表性直鏈及分支炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及其類似基團。
式(I)之佐劑可藉由此項技術中已知之合成方法，例如PCT國際公開案第WO 2009/035528號(以引用的方式併入本文中)以及WO 2009/035528中鑑別之公開案(其中彼等公開案中之每一者亦以引用的方式併入本文中)中所揭示之合成方法獲得。某些佐劑亦可購得。一較佳佐劑為GLA且具有以下示為E1與E10組合之式。
在某些實施例中，佐劑具有以下展示之式：
在本發明之各種實施例中，佐劑具有式(I)之化學結構，但部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5及R6係選自先前針對此等部分所提供之選擇子集，其中此等子集在下文藉由E1、E2等鑑別。
E1：A1為磷酸酯或磷酸鹽且A2為氫。
E2：R1、R3、R5及R6為C3-C21烷基；且R2及R4為C5-C23烴基。
E3：R1、R3、R5及R6為C5-C17烷基；且R2及R4為C7-C19烴基。
E4：R1、R3、R5及R6為C7-C15烷基；且R2及R4為C9-C17烴基。
E5：R1、R3、R5及R6為C9-C13烷基；且R2及R4為C11-C15烴基。
E6：R1、R3、R5及R6為C9-C15烷基；且R2及R4為C11-C17烴基。
E7：R1、R3、R5及R6為C7-C13烷基；且R2及R4為C9-C15烴基。
E8：R1、R3、R5及R6為C11-C20烷基；且R2及R4為C12-C20烴基。
E9：R1、R3、R5及R6為C11烷基；且R2及R4為C13烴基。
E10：R1、R3、R5及R6為十一烷基且R2及R4為十三烷基。
在某些選擇中，E2至E10中之每一者與實施例E1組合，及 /或E2至E9之烴基為烷基，較佳為直鏈烷基。
式(I)之佐劑可視情況與共同佐劑一起調配成醫藥組合物，各如下文所論述。在此點上，參考美國專利公開案第2008/0131466號，其提供調配物，例如關於GLA佐劑之水性調配物(AF)及穩定乳液調配物(SE)，其中此等調配物可用於任一式(I)之佐劑。
佐劑可與本發明之多基因組病毒載體一起呈單一組合物投與，或可在投與本發明之重組病毒之前、並行或之後投與。免疫原及佐劑可包裝且供應在相同小瓶中或可包裝在分開小瓶中且在使用之前混合。免疫原及佐劑通常與指示所欲治療應用之標記一起包裝。若免疫原及佐劑分開包裝，則包裝通常包括關於在使用之前混合之說明書。佐劑及/或載劑之選擇視含有佐劑之疫苗的穩定性、投藥途徑、給藥時程、佐劑對經疫苗接種之物種的功效而定，且在人類中，醫藥學上可接受之佐劑為已由相關監管機構批准或可批准用於投與人類之佐劑。舉例而言，完全弗氏佐劑不適合於投與人類。礬、MPL及QS21為較佳。視情況，兩種或超過兩種不同佐劑可同時使用，諸如礬與MPL、礬與QS21、MPL與QS21以及礬、QS21及MPL一同。此外，可使用不完全弗氏佐劑(Chang等人，《先進藥物傳遞綜述(Advanced Drug Delivery Reviews)32,173-186(1998))，視情況與礬、QS21及MPL中之任一者及其所有組合進行組合。
包含如本文所述之多基因組病毒載體的組合物亦可與一或多種其他治療劑同時、在其之前或之後投與。
此類組合療法可包括投與含有異種接合病毒載體及一或多種其他活性劑之單一醫藥給藥調配物，以及投與自身呈分開醫藥給藥調配 物形式的包含本發明之異種接合病毒載體及各活性劑之組合物。舉例而言，包含異種接合病毒載體及其他活性劑之組合物可在單一經腸(例如口服)給藥組合物(諸如錠劑或膠囊)中一同投與患者，或各藥劑在分開經腸(例如口服)給藥調配物中投與。類似地，包含異種接合病毒載體及其他活性劑之組合物可在單一非經腸(例如已知及本文所述之任一非經腸途徑，諸如皮下、皮內、結節內、瘤內或肌肉內)給藥組合物(諸如在鹽水溶液或其他生理學上可接受之溶液中)中一同投與患者，或各藥劑在分開經腸給藥調配物中投與。如本文所述之組合療法可藉由相同途徑投與或可使用不同途徑投與。在使用分開給藥調配物下，包含異種接合病毒載體及一或多種其他活性劑之組合物可在基本上相同之時間，亦即並行投與，或在分別錯開之時間，亦即依序及以任何次序投與；應瞭解組合療法包括所有此等方案。
因此，在某些實施例中，亦涵蓋投與包含本發明之多基因組病毒載體製劑與一或多種其他治療劑(例如其他抗癌劑或其他姑息性或輔助性療法)組合的組合物。在某些實施例中，此類治療劑可在本領域中公認為如本文所述之特定癌症的標準治療。所涵蓋之例示性治療劑包括細胞介素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、免疫檢查點抑制劑、化學治療劑、放射線治療劑或其他活性及輔助劑。
在一個實施例中，包含多基因組病毒載體製劑之組合物與一或多種癌症治療劑(包括一或多種化學治療劑)組合投與。癌症治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)及三甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、甲氮芥氧化物鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素 (nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、喋羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸鹽(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；蘑菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腺(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)； 莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多烯紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE®.,Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；曲妥珠單抗(trastuzumab)、多烯紫杉醇、鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸衍生物，此類TargretinTM(貝瑟羅汀(bexarotene)、PanretinTM(阿利維甲酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox))；埃斯波黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；以及以上中之任一者之醫藥學上 可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括用來調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(Fareston))；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。其他癌症治療劑包括索拉非尼(sorafenib)及其他蛋白激酶抑制劑，諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、克卓替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕尼單抗(panitumumab)、帕佐泮尼(pazopanib)、派加替尼(pegaptanib)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、盧佐替尼(ruxolitinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)及舒尼替尼(sunitinib)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、依維莫司(everolimus)及其他mTOR抑制劑。
在另一實施例中，包含本文中多基因組病毒載體製劑之組合物與另一免疫刺激劑組合投與。此類免疫刺激因子包括(但不限於)N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺酸-D-異麩醯胺酸(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、干擾素-γ及抗CD40抗體或結合於及活化共刺激路徑(例如CD28、ICOS、OX40、CD27及其類似物)之其他抗體。
在一個實施例中，本文中之多基因組病毒載體組合物與一或多種免疫檢查點抑制劑組合投與。免疫檢查點係指對於維持自體耐受性及調節免疫反應之持續時間及幅度而言至關重要的免疫系統之多種抑制路徑。腫瘤使用某些免疫檢查點路徑作為免疫抵抗之主要機制，尤其抵抗對腫瘤抗原具有特異性之T細胞。(參見例如Pardoll,2012《自然》12：252；Chen及Mellman 2013《免疫性》39：1)。本發明提供可與不具有抗原之GLA組合物組合投與之免疫檢查點抑制劑。此類組合療法共同起作用，增強抗癌免疫反應。某些病毒亦已發展共同選擇免疫檢查點路徑之機制。因此，在某些實施例中，此類組合療法可用於增強抗病毒免疫反應。
免疫檢查點抑制劑包括以統計學上顯著之方式阻斷或抑制免疫系統之抑制路徑的任何藥劑。此類抑制劑可包括小分子抑制劑或可包括結合於及阻斷或抑制免疫檢查點受體之抗體或其抗原結合片段或結合於及阻斷或抑制免疫檢查點受體配位體之抗體。阻斷或抑制可靶向之例示性免疫檢查點分子包括(但不限於)CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(屬於分子之CD2家族，且在所有NK、γδ及記憶CD8+(αβ)T細胞上表現)、CD160(亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括結合於以下中之一或多者及阻斷或抑制以下中之一或多者的活性的抗體或其抗原結合片段或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。例示性免疫檢查點抑制劑包括曲美單抗(CTLA-4阻斷抗體)、 抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻斷劑)、納武單抗(抗PD1抗體)、CT-011(抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224(抗PDL1抗體)、BMS-936559(抗PDL1抗體)、MPLDL3280A(抗PDL1抗體)、MSB0010718C(抗PDL1抗體)及易沃伊/伊派利單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。
在另一個實施例中，本文中之多基因組病毒載體組合物與其他TLR4促效劑或TLR8促效劑或TLR9促效劑組合投與。此類促效劑可選自肽聚糖、polyI：C、CpG、3M003、鞭毛蛋白及真核核糖體伸長及起始因子4a之利什曼原蟲同源物(LeIF)。
在另一實施例中，本文中之多基因組病毒載體組合物與細胞介素組合投與。「細胞介素」意謂由一種細胞群體釋放而作用於另一細胞之蛋白質(如細胞間介體)的通用術語。此類細胞介素之實例為淋巴因子、單核因子及傳統多肽激素。細胞介素包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；苗勒氏管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-i及胰島素樣生長因子-ii；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)， 諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；顆粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；以及顆粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1至IL-36，包括(但不限於)IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。如本文所用，術語細胞介素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞介素之生物活性同等物。
在某些實施例中，包含如本文所述之多基因組病毒載體製劑的組合物可與氯奎寧(chloroquine)(一種預防核內體酸化且抑制由腫瘤細胞誘發之自體吞噬以經受住細胞生長加速及營養剝奪的向溶酶體劑)組合投與。更一般而言，包含如本文所述之異種接合病毒載體之組合物可與充當自體吞噬抑制劑、放射敏化劑或化學敏化劑(諸如氯奎寧、米索硝唑(misonidazole)、甲硝噠唑(metronidazole)及諸如替拉紮明(tirapazamine)之低氧細胞毒素)之治療劑組合投與。在此點上，異種接合病毒載體與氯奎寧或其他放射性或化療敏化劑或自體吞噬抑制劑之此類組合可進一步與其他癌症治療劑或放射線療法組合使用。
在另一實施例中，包含如本文所述之多基因組病毒載體製劑之組合物可與已知殺死腫瘤細胞(稱為「免疫原性細胞死亡」)，同時活化免疫反應之小分子藥物(諸如環磷醯胺、小紅莓(doxorubicin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及米托蒽醌(mitoxantrone))組合投與。此外，與已知增強腫瘤細胞之免疫原性之藥物組合，該等藥物諸如帕土匹龍(patupilone)(埃坡黴素B(epothilone B))、靶向表皮生長因子受體(EGFR)之單株抗體7A7.27、組蛋白去乙醯基酶抑制劑(例如伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛 (romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、貝林諾他(belinostat)及恩替諾特(entinostat))、n3-多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸，此外蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib))、紫草醌(shikonin)(紫草(Lithospermum erythrorhizon)根部主要成分)及溶瘤病毒，諸如TVec(塔利拉帕(talimogene laherparepvec))。在其他實施例中，包含如本文所述之異種接合病毒載體之組合物可與可局部或全身投與之表觀遺傳療法，諸如DNA甲基轉移酶抑制劑(例如地西他濱(Decitabine)、5-氮雜-2'-去氧胞苷)組合投與。
在另一實施例中，包含如本文所述之多基因組病毒載體製劑之組合物可與一或多種增加DC對腫瘤之ADCC攝取之抗體組合投與。因此，本發明涵蓋將包含多基因組病毒載體製劑之組合物與誘發或增強抗原呈現細胞對腫瘤細胞或其片段之攝取及隨後腫瘤抗原呈現至免疫系統之任何分子組合。此等分子包括誘發受體結合(諸如Fc或甘露糖受體)及輸送至抗原呈現細胞之試劑，諸如抗體、抗體樣分子、多特異性多價分子及聚合物。此類分子可在瘤內與包含異種接合病毒載體之組合物一起投與或藉由不同途徑投與。舉例而言，包含如本文所述之異種接合病毒載體之組合物可在瘤內與在瘤內注射以下各者一起投與：利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、坎帕斯(Campath)、帕尼單抗(panitumumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、阿多-曲妥珠單抗恩他新(Ado-trastuzumab emtansine)、歐比托珠單抗(Obinutuzumab)、抗HER1、-HER2或-HER3抗體(例如MEHD7945A；MM-111；MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗體(例如尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、ABT-806)或其他類似抗 體。能夠接合Fc受體及可誘發內化之其他受體的任何多價骨架可用於本文所述之組合療法中，例如能夠結合連接於Fc片段之標靶的肽及/或蛋白質或能夠接合受體之聚合物。
在某些實施例中，多基因組病毒載體製劑與此類抗體之組合可進一步與促進共刺激信號(例如藉由阻斷抑制路徑)之抗體(諸如抗CTLA-4)或活化共刺激路徑之抗體(諸如抗CD40、抗CD28、抗ICOS、抗OX40、抗CD27抗體及其類似物)組合。
包含多基因組病毒載體製劑之組合物可單獨或與其他已知之癌症治療(諸如放射線療法、免疫檢查點抑制劑、化學療法或其他癌症治療劑、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等)組合投與。組合物亦可與抗生素組合投與。
E. 醫藥組合物及套組
本文亦涵蓋含有本文提供之多基因組病毒載體製劑及一或多種組分之醫藥組合物及套組。醫藥組合物可包括如本文所提供之多基因組病毒載體及醫藥載劑。套組可包括本文提供之醫藥組合物及/或組合及一或多種組件，諸如使用說明書、用於向個體投與化合物之裝置及用於向個體投與化合物之裝置。
本文提供含有如本文所提供之病毒顆粒及適合醫藥載劑之醫藥組合物。本文提供之醫藥組合物可呈各種形式，例如呈固體、液體、粉末、水溶液或凍乾形式。適合醫藥載劑之實例為此項技術中已知。此類載劑及/或添加劑可藉由習知方法調配且可以適合劑量投與個體。諸如脂質、核酸酶抑制劑、聚合物及螯合劑之穩定劑可防止組合物在體內降解。
本文提供之多基因組病毒載體可包裝成套組。套組可視情況包括一或多種組件，諸如使用說明書、裝置及其他試劑，以及諸如用於實施該等方法之管、容器及注射器的組件。示例性套組可包括本文提供之病毒，且可視情況包括使用說明書、用於偵測個體中之病毒之裝置、用於向個體投與病毒之裝置及用於向個體投與化合物之裝置。
本文中亦涵蓋包含編碼一或多種相關序列之聚核苷酸的套組。套組可包括至少一種編碼病毒包裝組分之質體及編碼病毒包膜(諸如VSVg或辛德比病毒E2醣蛋白變異體)之載體。一些套組將含有至少一種編碼病毒包裝組分之質體、編碼辛德比病毒E2醣蛋白變異體之載體及兩種病毒載體基因組質體，一種載體基因組編碼抗原且一種載體基因組編碼免疫調節分子。
本文中亦涵蓋包含編碼一或多種相關序列之病毒載體及視情況選用之編碼免疫調節分子之聚核苷酸序列的套組。在一些套組中，套組包括至少一種編碼病毒包裝組分之質體及編碼病毒包膜醣蛋白之載體。
套組亦可含有說明書。說明書通常包括描述以下各者之有形表述：病毒及視情況套組中包括之其他組分，以及投與方法，包括確定個體適當狀態、適當劑量及投與病毒之適當投與方法的方法。說明書亦可包括關於在治療時間之持續時間期間監測個體之指導。
本文提供之套組亦可包括用於向個體投與病毒之裝置。此項技術中已知之用於投與藥物或疫苗之多種裝置中的任一者可包括於本文提供之套組中。示例性裝置包括(但不限於)皮下注射針、靜脈內針、導管、無針注射裝置、吸入劑及液體分配器，諸如點眼藥器。通常，用於投與套 組之病毒的裝置將與套組之病毒相容；舉例而言，諸如高壓注射裝置之無針注射裝置可包括於高壓注射不破壞病毒之套組中，但通常不包括於高壓注射破壞病毒之套組中。
本文提供之套組亦可包括用於向個體投與化合物，諸如免疫調節分子或其他治療劑之裝置。此項技術中已知之用於向個體投與藥物之多種裝置中的任一者可包括於本文提供之套組中。示例性裝置包括皮下注射針、靜脈內針、導管、無針注射，但不限於皮下注射針、靜脈內針、導管、無針注射裝置、吸入劑及液體分配器，諸如點眼藥器。通常用於投與套組之化合物的裝置將與投與化合物之所需方法相容。
除非上下文另外明確指示，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「所述」包括多個指示物。因此，舉例而言，提及「抗原」包括多種此類抗原，且提及「細胞」或「所述細胞」包括提及熟習此項技術者已知之一或多個細胞及其同等物(例如多個細胞)等等。類似地，除非上下文另外明確指示，提及「化合物」或「組合物」包括多種此類化合物或組合物，且分別係指一或多種化合物或組合物。當描述或要求方法之步驟且步驟描述為以特定次序進行時，若重寫說明第二步驟「跟隨」第一步驟進行(或執行)，則「先於」第二步驟(亦即在其之前)進行(或執行)的第一步驟之描述具有相同含義。術語「約」在涉及數字或數字範圍時意謂所提及之數字或數字範圍為實驗變化性內(或統計實驗誤差內)之近似值，因此數字或數字範圍可例如與所述數字或數字範圍有1%至15%的差異。術語「包含」(及相關術語，諸如「包含」或「具有」或「包括」)不意欲排除在其他某些實施例中，例如本文所述之 任何主題組合物、組合物、方法或過程或其類似物之實施例可「由所述特徵組成」或「基本上由所述特徵組成」。
以下實例係以說明而非限制之方式提供。
實例 實例1
多基因組慢病毒載體誘發對兩種抗原之穩固CD8 T細胞反應
除了NY-ESO-1及MAGE-A3載體基因組質體用於轉染包裝細胞外，使用標準轉染方案製備NY-ESO-1/MAGE-A3重配(多基因組)慢病毒載體顆粒。可使用此項技術中已知之多種轉染方案。所用典型方案涉及293T細胞(293LTV細胞株；CELL BIOLABS INC,LTV-100)之磷酸鈣(CaPO4)介導之短暫轉染。293T細胞經六種與CaPO4一起沈澱之質體轉染。以下六種質體用於產生多基因組慢病毒載體製劑且對應於以下：i)表現NY-ESO-1之慢病毒載體基因組；ii)表現MAGE-A3之慢病毒載體基因組；iii)編碼HIV Rev之質體；iv)編碼HIV Gag/Pol之質體；以及v)編碼vpx之質體；vi)編碼包膜之質體(在此實驗中，包膜為如先前在例如WO2011/011584中所描述之經修飾之辛德比包膜醣蛋白)。對於典型轉染方案，使用1mg慢病毒載體基因組質體。在此情況下，保持載體基因組質體之總量(1mg)相同，但分在兩種所用慢病毒載體基因組質體之間。因此，0.5mg各載體基因組(MAGE-A3及NY-ESO-1)用於轉染。慢病毒載體基因組均含有相同回文二聚體起始位點(DIS)序列。詳言之，DIS序列為GCGCGC(SEQ ID NO：1)。因此，在此多基因組製劑中，預測的同種接合相對於異 種接合顆粒之比率如表1中所述，例如25/25/50比率。
載體純化後，使用基因特定之qRT-PCR，基於對NY-ESO-1及MAGE-A3具有特異性之引子組，測定病毒力價。無論相關序列如何，使用擴增所有基因組之PCR引子，量測整個多基因組病毒製劑之總基因組力價。接著存在於所得製劑中之特定基因組之百分比計算為特定力價/總基因組力價(例如NYESO1基因組=5.1E10/1.2E11=42.5%)。力價展示在以下表4中。如所示，多基因組慢病毒載體製劑含有NY-ESO-1以及MAGE-A3載體RNA且呈50/50比率之輸入質體下所預期之比率。一般而言，所用基因組分析法具有約2倍變化率。基於此，力價在預期比率內：多基因組慢病毒製劑中42.5% NYESO1及42% MAGEA3。
BALC/c小鼠經編碼NY-ESO-1(NY)或MAGE-A3(M3)之同種接合LV(各製劑1E10基因組)免疫接種，或經含有NY-ESO-1與MAGE-A3基因組之LV物質之多基因組病毒載體製劑(2E10總基因組以實現1E10NY-ESO-1或MAGE-A3基因組各者；根據表1，各載體基因組基於50/50起始載體基因組質體DNA，25%顆粒將為NYESO1或MAGEA3同種接合且50%顆粒為異種接合)免疫接種，或經混合在一起之同種接合 NY-ESO-1及MAGE-A3 LV物質(各1E10基因組)免疫接種，或經分開注射之同種接合NY-ESO-1及MAGE-A3 LV物質(各1E10基因組)共同免疫接種。在免疫接種後第14天，使用肽再刺激評估T細胞免疫反應，接著為細胞內細胞介素染色及流動式細胞量測術。圖示出抗NYESO1 CD8 T細胞反應(圖2)、抗MAGE-A3 CD8 T細胞反應(圖3)及抗NYESO-1 CD4 T細胞反應(圖4)。
實例2
小鼠中多基因組慢病毒載體進行免疫接種之活體內免疫原性作用
本實例證實經表現三種腫瘤相關抗原之多基因組慢病毒載體免疫接種在小鼠中產生針對所靶向之全部三種腫瘤抗原之抗原特異性T細胞反應。
除了在此實驗中使用三種載體基因組質體，使用標準轉染方案，製備多基因組慢病毒載體顆粒製劑。詳言之，在此實驗中，NY-ESO-1、MAGE-A3及MAGE-A10慢病毒載體基因組質體用於轉染生產細胞。如實例1中所述，慢病毒載體質體DNA之總量保持為1mg，但在三種質體之間等分。因此，在此情況下，0.33mg各載體基因組質體用於產生多基因組LV：NY/M3/M10病毒載體製劑。
載體純化後，使用基因特定之qRT-PCR，基於對NY-ESO-1及MAGE-A3具有特異性之引子組，測定力價。結果展示多基因組LV製劑含有在預期比率範圍內的來自此兩種載體基因組之載體RNA。雖然不特別量測，但假設MAGE-A10載體基因組之量如基於所量測之兩種載體基因組 之量所預期。
在此研究中，在第0天，BALB/c雌性小鼠(每組n=5)經所製造之慢病毒載體之5E9基因組免疫接種以活體內傳遞NY-ESO-1、MAGE-A3及MAGE-A10基因(多基因組LV：NY/M3/M10至抗原呈現細胞。在第14天，自經免疫接種之小鼠收穫脾臟以測定針對腫瘤抗原NY-ESO1、MAGE-A3及MAGE-A10之抗原特異性CD8 T細胞反應之發展。
如圖5A-5C中所示，經多基因組LV：NY/M3/M10免疫接種之小鼠發展針對全部三種靶向腫瘤抗原之抗原特異性CD8 T細胞。
多種載體製劑之qRT-PCR滴定證明表現多達四種不同TAA(諸如NYESO1、MAGE-A3)及兩種免疫調節劑(諸如IL-12、檢查點抑制劑等)之多基因組病毒載體製劑的產率針對編碼個別抗原之載體物質與所產生之總載體基因組可高度再現。與經呈融合蛋白或藉由2A內切蛋白酶裂解位點分離或在不同IRES基元之控制下表現來自單一載體基因組之多種基因之載體免疫接種的小鼠相比，經多基因組病毒載體製劑免疫接種之小鼠始終發展針對所有靶向TAA之抗原特異性T細胞。
本實例描述實現多種腫瘤抗原之有效靶向之下一代慢病毒載體系統。在載體產生之轉染階段以可控比率混合多種慢病毒載體基因組質體之能力可靈活地製造高度適用於活體內以誘發腫瘤特異性T細胞反應及抗腫瘤療法之多基因組載體製劑組合(以其他方式無法實現)。詳言之，此慢病毒載體生產系統可用於產生表現多種腫瘤抗原(包括新抗原)之患者特異性慢病毒載體。
實例3
小鼠中使用多基因組慢病毒載體進行免疫接種之活體內免疫原性作用
研究在投與表現多種腫瘤抗原及免疫調節因子之多基因組慢病毒載體後產生之免疫反應。
在此研究中，在第0天，BALB/c雌性小鼠(每組n=5)經所製造之多基因組慢病毒載體免疫接種以在活體內傳遞NY-ESO-1、MAGE-A3及MAGE-A10基因及以下免疫調節因子之一至抗原呈現細胞：mIL-12、mIRF3(5D)、抗mPDL1或抗mCTLA4。在第14天，自經免疫接種之小鼠收穫脾臟以測定針對腫瘤抗原NY-ESO1、MAGE-A3及MAGE-A10之抗原特異性CD8T細胞反應的發展。
實例4
小鼠中使用多基因組慢病毒載體進行免疫接種之活體內治療功效
先前資料表明，當以相同基因組給藥時，與僅僅編碼NYESO1蛋白質之慢病毒載體相比，含有編碼藉由T2A裂解位點分離(NY-T2A-M3)之多順反子基因組上NYESO1及MAGEA3之序列的慢病毒載體顆粒在小鼠中誘發顯著較少之NYESO1特異性CD8 T細胞。經NY-T2A-M3載體免疫接種之小鼠能夠誘發針對MAGEA3之免疫反應。另外，NY-T2A-M3多順反子慢病毒載體展示在表現NYESO1之小鼠腫瘤模型系統中治療無效。本實例中之實驗經設計以評估與多順反子NY-T2A-M3慢病毒載體顆粒相比，含有NY-ESO-1及MAGEA3編碼序列之多基因組病毒載體製劑之治療功效。
BALB/c雌性小鼠靜脈內接種CIN.23細胞(表現NYESO1之CT26腫瘤細胞株)。接種後第3天，小鼠經對照載體、LV/NYESO1、混合LV/NYESO1及LV/MAGEA3、LV/NY-T2A-M3(單一基因組上2種抗原)或多基因組LV：NY/M3載體(亦參見實例1)免疫接種。接種後第17天，收穫肺進行結節計數；脾細胞用NYESO1肽MHC多聚體染色進行流動式細胞量測分析。
經多基因組載體免疫接種之小鼠不斷發展針對所有靶向TAA之T細胞(參見例如圖2及3)。然而，證實先前實驗，NY-T2A-M3多順反子載體未誘發NYESO1特異性T細胞(參見例如圖6B)(應注意MAGEA3 T細胞誘發在此實驗中未量測，但已在其他實驗中展示(未顯示)。在此實驗中，經多基因組載體免疫接種之小鼠展現與經靶向相關腫瘤抗原，在此情況下NYESO1之單一載體免疫接種之小鼠相當之腫瘤生長控制(圖6A)及存活。重要地，與表現來自相同基因組(多順反子基因組)之兩種腫瘤抗原之慢病毒載體相比，多基因組慢病毒載體誘發顯著更強之NYESO1特異性CD8 T細胞免疫反應且顯著減少腫瘤生長(參見與標記為LV-Multi/[NY、M3]之條柱相比，圖6中標記為LV/NY-T2A-M3之條柱)。
實例5
小鼠中使用多基因組(MultiMage)慢病毒載體進行免疫接種之活體內免疫原性
本實例中，研究在投與表現多種MAGE腫瘤抗原之多基因組慢病毒載體後產生之免疫反應。
含有表現四種不同MAGE腫瘤抗原之載體顆粒之混合群體 的多基因組載體製劑基本上如實例1中所述製備。在此實驗中，如實例1中，1mg慢病毒載體基因組質體用於轉染包裝細胞。因此，載體基因組質體之總量(1mg)保持相同，且分在四種所用慢病毒載體基因組質體之間，因此0.25mg各慢病毒載體基因組質體(MAGEA1/MAGEA3/MAGEA4/MAGEA10(所有密碼子優化)用於此實驗以產生多基因組慢病毒載體製劑。如實例1中所述，特定基因組引子用於確定多基因組慢病毒製劑中各特定基因組%。結果展示在以下表5中且基於分析法之2倍變化率，百分比一般如所預期。
BALB/c小鼠(n=5)如圖7A-7D中所示，以2.5E9載體基因組(vg)(vg/特定Ag)之劑量經所列載體製劑免疫接種。使用如圖7中指示之肽池，經由活體外再刺激及ICS，評估免疫反應。
結果展示由於小鼠H2K背景，所以LV/MageA1(M1)在此小鼠品系中為非免疫原性，且對於此小鼠品系MHC單倍型，無適當M1抗 原決定基。Black6小鼠品系中之其他實驗展示MultiMAGE多基因組載體為免疫原性且在該品系中產生抗M1免疫反應。
多基因組LV誘發MageA3(M3)Ag特定之CD8 T細胞，與M1、M4或M10無交叉反應性。
多基因組LV誘發MAGEA4(M4)Ag特定之CD8 T細胞，與M1及M10具有交叉反應性。
MAGEA10(M10)在此小鼠品系中最低限度免疫原性。
因此，本實例證實此下一代慢病毒載體系統經由多基因組慢病毒載體製劑實現有效表現及誘發針對多種腫瘤抗原之免疫反應。
實例6
小鼠中使用表現多種抗原及免疫調節分子之多基因組慢病毒載體進行免疫接種之活體內免疫原性
本實例證實與包括對照蛋白質GFP相比，多基因組慢病毒載體製劑中包括IL-12顯著增強針對由多基因組慢病毒載體(例如NYESO1及MAGE-A3)表現之抗原之CTL反應以及增加疫苗攝取。
多基因組慢病毒載體製劑基本上如實例1中所述製備。使用包裝系統中1：1：1：3比率之質體輸入，製備包含編碼NYESO1(NY)、MAGEA3(M3)、MAGEA10(M10)及mIL12之慢病毒基因組或作為對照之GFP的質體。因此，0.5mg質體在NY、M3及M10質體之間等分，且剩餘0.5mg質體為mIL12質體。基本上如實例1中所述，使用特定PCR，測定特定及總病毒基因組。此分析法中抗原特定之引子僅僅可用於NYESO1及MAGEA3。結果展示在以下表6中，且證實特定基因組之百分比接近分析法 中約2倍變化下所預期。
BALB/c小鼠(n=7)經含有NY、M3及M10±GFP或IL-12之多基因組製劑免疫接種。選擇兩種標靶劑量(1E9或2E9 Ag之載體基因組)：「極低」及「低」。選擇兩倍差異，以評估每一劑載體基因組(編碼抗原之基因組)之IL-12作用且反映基因組分析法中之近似變化率。
如圖8中所示，與添加GFP相比，多基因組慢病毒製劑中包括IL-12顯著增強針對NYESO1及MAGE-A3之CTL反應，以及增加疫苗攝取(參見標註為疫苗攝取%之條柱)。免疫增強作用大於2倍劑量增加之作用。
實例7
具有經修飾之二聚體起始信號(DIS)序列之多基因組慢病毒載體製劑的產生
本實例提供操縱多基因組慢病毒載體之包裝過程中使用之輸入基因組的二聚體起始信號(DIS)序列可影響所得病毒製劑中異種接合及同種接合顆粒之比例的證據。
在第一實驗中，用具有野生型DIS序列(GCGCGC，SEQ ID NO：1；表示為GCN/GCN之病毒製劑)之單一輸入基因組(編碼NYESO1)或用其中DIS序列經非回文(及非互補)DIS(GGGGGG，SEQ ID NO：4；表示為GGN/GGN之病毒製劑)替換的基因組製備慢病毒載體製劑。回文 DIS序列經非互補DIS序列替換使得慢病毒載體基因組力價顯著降低(p=0.0022，曼-惠特尼檢驗，圖9A)。此等結果說明回文DIS序列介導有效二聚及高力價慢病毒載體產生。結果進一步展示儘管效力低得多，仍包裝缺乏配對回文DIS序列之基因組，從而病毒載體力價較低。
在下一實驗中，使用兩種輸入基因組(相同輸入量)，在各基因組上使用相同回文DIS序列或各基因組上突變但互補DIS序列，製備多基因組慢病毒載體製劑。在第一多基因組製劑中，各基因組含有野生型HIV-1回文DIS序列(SEQ ID NO：1)。第一基因組編碼NYESO(圖9B中表示為GCN)且第二基因組編碼MAGEA3(圖9中表示為GCM)。所得多基因組製劑表示為GCN/GCM。在第二多基因組病毒載體製劑中，編碼NYESO1蛋白質之第一載體基因組質體的DIS序列突變成GGGGGG(SEQ ID NO：4；表示為GGN)且編碼MAGEA3之第二基因組含有突變成CCCCCC(SEQ ID NO：5；表示為CCM)之DIS序列。所得多基因組病毒製劑表示為GGN/CCM。
如實例1中所述，慢病毒載體藉由轉染產生。接著使用實例1中描述之方法，量測存在於所得多基因組慢病毒載體製劑中之特定基因組(參見例如表4)。
圖9B展示與GCN/GCM多基因組慢病毒載體製劑相比，使用野生型回文DIS(GCN/GCN)之標準單一基因組病毒製劑的基因特定之載體基因組力價。證實先前實驗，在用一半NYESO1及一半MAGEA3輸入基因組質體製備之GCN/GCM多基因組製劑中，所得多基因組病毒製劑中之偵測之NYESO1基因組為NYESO1單一基因組病毒製劑中偵測到之NYESO1基因組的一半。如自包裝過程中使用之NYESO1/MAGEA3基因組 質體的1：1輸入比率預期，在GCN/GCM製劑作為NYESO1基因組中偵測到相同比例之MAGEA3基因組。基於病毒遺傳，根據表1，所得製劑應針對各基因組為25%同種接合，且NYESO1/MAGEA3為50%異種接合。
先前實驗(圖9A)展示用非回文、非互補突變之DIS序列製備之病毒製劑中基因組(GGN/GGN)不有效配對及包裝。如圖9B(GGN/CCM)中所示，在用突變之DIS序列製備之多基因組病毒製劑中，與用回文DIS序列製備之多基因組病毒製劑相比，觀測到NYESO1及MAGEA3特定基因組力價降低。此基因特定之基因組力價的降低可能因為同種接合基因組(GGN/GGN及CCM/CCM)之配對及包裝減少。因此，可推斷GGN/CCM多基因組病毒製劑中所得異種接合顆粒之百分比增加。
本實例展示操縱DIS序列可用於調節多基因組病毒載體製劑中異種接合及同種接合顆粒之百分比。
可組合上述各種實施例以提供其他實施例。在本說明書中提及及/或申請案資料表中列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案以全文引用的方式併入本文中。必要時，可修改該等實施例之態樣以採用各種專利、申請案及公開案之概念來提供其他實施例。
可鑒於以上詳細描述來對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例連同該等申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本發明限制。
<110> 免疫設計公司
<120> 多基因組反轉錄病毒載體製劑及產生及使用其之方法及系統
<130> 31943/50496/PC
<150> US-62/298,948
<151> 2016-02-23
<150> US-62/371,513
<151> 2016-08-05
<150> US-62/410,633
<151> 2016-10-16
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (48)

  1. 一種重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其包含：a.第一反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組；b.第二反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組；c.第三反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之該包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組及一個複本之該包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組；其中該第一相關序列與該第二相關序列不同；且其中該反轉錄病毒載體製劑用異源包膜醣蛋白假模式化。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第三反轉錄病毒顆粒佔該製劑中全部反轉錄病毒顆粒之至少50%。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第三反轉錄病毒顆粒佔該製劑中全部反轉錄病毒顆粒之至少60%。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第三反轉錄病毒顆粒佔該製劑中全部反轉錄病毒顆粒之至少75%。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該異源包膜醣蛋白選自由VSVg、麻疹包膜醣蛋白及辛德比包膜醣蛋白(Sindbis envelope glycoprotein)組成之群。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該異源包膜醣蛋白包含變異辛德比病毒F2醣蛋白。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該變異辛德比病毒E2醣蛋白將該載體靶向樹突狀細胞。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該反轉錄病毒載體製劑為慢病毒載體製劑。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原或一或多種新抗原且該第二相關序列編碼免疫調節分子。
  10. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且該第二相關序列編碼不同腫瘤相關抗原。
  11. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且該第二相關序列編碼一或多種新抗原。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該一或多種新抗原為該第一相關序列之該腫瘤相關抗原之新抗原。
  13. 一種反轉錄病毒載體包裝系統，其用於產生假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑，其包含：a.編碼病毒包膜蛋白之第一核酸分子；b.編碼gag及pol蛋白質之第二核酸分子；c.編碼rev之第三核酸分子；d.第四核酸分子，其包含有包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組； e.第五核酸分子，其包含有包含第二相關序列之第二反轉錄病毒載體基因組；f.視情況，編碼vpx之第六核酸分子；以及g.包裝細胞或細胞株。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該反轉錄病毒載體製劑為慢病毒載體製劑。
  15. 如申請專利範圍第13項或申請專利範圍第14項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原或一或多種新抗原且該第二相關序列編碼免疫調節分子。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且該第二相關序列編碼不同腫瘤相關抗原。
  17. 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一相關序列編碼腫瘤相關抗原且該第二相關序列編碼一或多種新抗原。
  18. 如申請專利範圍第13項至第17項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該病毒包膜蛋白選自由VSVg、麻疹包膜醣蛋白及α病毒包膜醣蛋白組成之群。
  19. 如申請專利範圍第13項至第17項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該病毒包膜蛋白包含能夠靶向樹突狀細胞之辛德比病毒E2醣蛋白或其變異體。
  20. 如申請專利範圍第13項至第19項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝 系統，其中使用等量之該第四核酸分子與該第五核酸分子。
  21. 如申請專利範圍第13項至第19項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該包裝系統中所用之該第四核酸分子與該第五核酸分子之相對輸入比率為3：2。
  22. 如申請專利範圍第13項至第21項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一慢病毒載體基因組及該第二慢病毒載體包含回文二聚體起始位點(DIS)序列。
  23. 如申請專利範圍第13項至第21項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一慢病毒載體基因組及該第二慢病毒載體中之該回文DIS序列相同。
  24. 如申請專利範圍第13項至第21項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一慢病毒載體基因組包含第一回文DIS序列且該第二慢病毒載體包含第二回文DIS序列。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該反轉錄病毒載體包裝系統較佳產生同種接合反轉錄病毒載體顆粒。
  26. 如申請專利範圍第13項至第21項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該第一慢病毒載體基因組包含第一DIS序列且該第二慢病毒載體包含第二DIS序列，其中該第一DIS序列及該第二DIS序列非回文。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中在包裝期間該第一DIS序列與該第二DIS序列配對，使得該反轉錄病毒載體包裝系統較佳產生異種接合反轉錄病毒載體顆粒。
  28. 如申請專利範圍第13項至第26項中任一項所述之反轉錄病毒載體包裝系統，其中該pol蛋白質具有非功能性整合酶。
  29. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其進一步包含：e.第四反轉錄病毒顆粒，其包含兩個複本之包含第三相關序列之第三反轉錄病毒載體基因組；f.第五反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之該包含第一相關序列之第一反轉錄病毒載體基因組及一個複本之包含該第三相關序列之該第三反轉錄病毒載體基因組；以及g.第六反轉錄病毒顆粒，其包含一個複本之包含第二相關序列之該第二反轉錄病毒載體基因組及一個複本之包含該第三相關序列之該第三反轉錄病毒載體基因組。
  30. 如申請專利範圍第1項至第12項或申請專利範圍第29項中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其中該第一反轉錄病毒載體基因組佔該多基因組載體製劑中該等載體基因組之約50%。
  31. 一種多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其包含：a.至少兩種核酸分子，各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組；b.一或多種編碼產生假模式化反轉錄病毒載體顆粒所需之組分的核酸分子；c.視情況，編碼vpx之核酸分子；以及d.包裝細胞株。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其由2至8種各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組之核酸分子組成。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其由5種各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組之核酸分子組成。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中該5種各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組之核酸分子的相對輸入比率選自表3中所示之輸入比率之一。
  35. 如申請專利範圍第33項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中該5種各包含有包含獨特相關序列之反轉錄病毒載體基因組之核酸分子的相對輸入比率為4：1：1：1：1。
  36. 如申請專利範圍第31項至第35項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中該等獨特相關序列選自由以下組成之群：編碼MAGEA1、MAGEA4、NYESO1、MAGEA3、MAGEA10、ScFvanti-PD1、IL12、IL23、CD40、ScFvanti-PDL1及ScFvanti-CTLA4之序列或與野生型序列具有至少80%-90%一致性之前述任一者之免疫原性變異體。
  37. 如申請專利範圍第31項至第36項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中產生反轉錄病毒載體顆粒所需之該等組分包括gag、pol、包膜及視情況選用之rev及/或vpx蛋白質。
  38. 如申請專利範圍第31項至第37項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中該包裝細胞株穩定表現一或多種產生反轉錄病毒 載體顆粒所需之組分。
  39. 如申請專利範圍第31項至第38項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體包裝系統，其中該反轉錄病毒載體基因組為慢病毒載體基因組。
  40. 一種用於產生假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑之方法，其包含培養經(a)及(b)及視情況選用之(c)之該等核酸轉染的申請專利範圍第31項至第37項中任一項之包裝細胞株。
  41. 一種假模式化多基因組反轉錄病毒載體製劑，其藉由如申請專利範圍第40項所述之方法產生。
  42. 一種誘發個體中免疫反應之方法，其包含投與如申請專利範圍第1項至第12項、第29項、第30項及第41項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑。
  43. 一種治療個體之癌症的方法，其包含投與如申請專利範圍第1項至第12項、第29項、第30項及第41項中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑。
  44. 一種用於在活體內向個體傳遞及表現多種相關序列之方法，其包含投與如前述申請專利範圍中任一項所述之多基因組反轉錄病毒載體製劑。
  45. 如前述申請專利範圍中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於療法中。
  46. 如前述申請專利範圍中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於治療患者之方法中。
  47. 如前述申請專利範圍中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製 劑，其用於治療患者之癌症之方法中。
  48. 如前述申請專利範圍中任一項所述之重組多基因組反轉錄病毒載體製劑，其用於刺激患者中免疫反應之方法中。
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