TW201726162A - 用於治療掉髮之方法及組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於治療掉髮之方法，包含將一Notch訊息傳遞路徑之活化劑投藥予有其需要的個體。

Description

用於治療掉髮之方法及組成物
本發明係關於一種治療方法及其應用之組成物，特別係關於利用Notch訊息傳遞路徑之活化劑治療掉髮之方法及組成物。
本發明係主張美國臨時案第62/233,354號(申請日為2015年9月26日)之優先權，其完整內文以引用方式納入本說明書為參考文獻。
成體幹細胞在動物體的一生當中扮演著維持組織動態平衡及再生的角色，特別的是小鼠的毛囊組織提供了一種研究組織再生機制的模型系統，該毛囊組織係包含三個區段：下區段(毛囊球)、中間區段(毛囊隆突及毛囊峽部)及上區段(毛囊漏斗)。在初期的毛囊型態發生(morphogenesis)之後，毛囊的下區段會進行重複的生長循環，包含衰退期(catagen)、靜止期(telogen)及生長期(anagen)，支持此再生循環過程為駐留在隆突部(bulge)的特化區位內之毛囊幹細胞(HFSC)的多元分化潛能和自我更新(self-renew)能力。
在靜止期的過程中，毛囊幹細胞(Bu-SCs)與位於隆突部下方，稱作次級毛胚(Hair germ,Hg)的一簇細胞都會處於靜止的狀態，而毛胚係與名為真皮乳突細胞(dermal papillae,DP)的間葉細胞群(mesenchymal cells)相比鄰。當生長期開始時，毛胚會受真皮乳突細胞及周圍微環境的訊號誘導而早於毛囊幹細胞被活化，增生的毛胚隨後生成毛囊之基 質細胞(matrix cells)，該基質細胞係為一種毛囊的短暫增殖細胞(transit-amplifying cells,TACs)，且具有不同於毛囊幹細胞及毛胚之獨特分子標記，基質細胞在生長期的過程中接著增生並分化為髮幹(hair shaft)及內根鞘(inner root sheath,IRS)。毛囊幹細胞在生長期的活化會慢上毛胚1-2天，而活化後的毛囊幹細胞不僅會形成向外展延之外根鞘(outer root sheath,IRS)，亦會進行自我更新以補充消耗的毛囊幹細胞。當毛囊生長進入到衰退期時，包含間質細胞及外根鞘之毛髮子代(hair progeny)開始產生細胞凋亡的現象，同時殘餘的上皮索(epithelial strand)與真皮乳突細胞共同向上收縮。在衰退期與靜止期之間的過渡期間，一些位置較靠近上部且在衰退期後仍然存活的外根鞘細胞，將成為新的毛囊隆突部及毛胚，以供下一次毛髮週期中使用。
在哺乳類動物當中，目前已經有四種Notch受體(Notch 1-4)及五種典型的Notch配體(Jagged 1-2,Delta 1,3及4)被鑑定出來，細胞間Notch配體及受體之間的交互作用將導致Notch受體一連串的蛋白酶水解反應，進而生成Notch細胞內片段(Notch intracellular domain,NICD)，而形成之Notch細胞內片段接著轉位至細胞核內與Rbpj蛋白質及MamL蛋白質進行結合，以活化其下游包含轉錄抑制子Hes基因及Hey基因家族或其他之效應子(effectors)。Notch蛋白的訊號傳遞係經由Notch受體之細胞外片段的糖化(glycosylation)所調控，其中如蛋白質O-岩藻糖基轉移酶-1(protein O-fucosyltransferase 1,Pofut1)，其可藉由轉移O-岩藻糖至Notch受體之細胞外片段中EGF-like repeats的特別共有序列之上以進行修飾。研究指出此修飾作用能使Notch配體-受體之結合作用效率提高，且使訊息傳導更具效率。反之，小鼠胚胎缺乏蛋白質O-岩藻糖基轉移酶-1時，則其表現型如同缺乏早老素基因(Presenilins)和重組結合蛋白抑制子 基因(Rbpj)等Notch訊息傳遞核心的表現型一樣有重大發育缺陷。
於胚胎與成人皮膚中Notch配位子、受體及下游效應子的表現係呈現複雜且動態的型式(Watt FM等人，Curr Opin Cell Biol 20：171-179,2008)。功能喪失和獲得的動物研究顯示，常規Notch-Rbpj訊息傳遞軸作用在基底/棘突層，控制基底層分化(Blanpain C等人，Genes Dev 20：3022-3035,2006)。喪失Notch訊息傳遞並不影響毛囊分布及毛髮基底形成；但是，Notch訊息傳遞為毛囊完全分化作用所必需(Blanpain C等人，Genes Dev 20：3022-3035,2006)。有趣的是，上皮缺失Notch1或Notch配位子Delta1會引起第一次毛髮週期中生長期階段的缺陷，表示Notch訊息傳遞可能在毛髮週期調節上發揮作用。
鹼性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)基因Hes1在很多類型的動物組織中，都是與Notch訊息傳遞息息相關的效應子，Hes1會藉由負向調節動物組織內特有之bHLH活化子，而維持神經系統或消化系統內具分化功能的幹細胞或祖細胞。除此之外，Hes1基因在脊突角化細胞中表現，並在表皮發生的過程中藉由調節bHLH蛋白的轉錄活化子-Ascl2以維持脊突細胞的祖細胞命運。有趣的是，Hes1基因剔除小鼠的皮膚在轉植入裸鼠時可正常發育，此結果表示Hes1在皮膚發育的功用僅限制於胚胎發育時期。於毛髮生長靜止期時Hes1在隆突部的表現量低，而其表現係隨著毛囊逐漸生長而增加。然而，Hes1在毛髮週期中的確切功能，及其在維持毛囊幹/祖細胞中的作用較少被了解。
於一方面，本發明係描述一種治療掉髮病況之方法，包含將一Notch訊息傳遞路徑之活化劑投藥予有其需要 的個體。所述之掉髮病況可為男性型掉髮、女性型掉髮、圓形禿掉髮、生長期掉髮或靜止期掉髮。
於一項具體實施例，所述之活化劑為一種Notch配位體。例如所述之配位體可為Jagged1、Jagged2、Delta1或Delta4。
於一項具體實施例，所述之活化劑為一種Notch下游效應物，例如Hes1。
於本發明治療方法之一項具體實施例，所述之活化劑為一種Notch修飾蛋白。一種例舉之活化劑為蛋白質O-岩藻糖基轉移酶-1(protein O-fucosyltransferase 1,Pofut1)。
所述之Notch訊息傳遞路徑活化劑可局部施用於該個體之受掉髮影響的區域。
另一方面，本發明係描述一種用於治療掉髮病況之組成物。所述之組成物含有一有效量的Notch訊息傳遞路徑活化劑，及生理上可接受之載體。所述之組成物可應用於本發明所描述的治療方法。
於一項具體實施例，所述之組成物為一種局部調配物。例如，所述之調配物可為乳霜、乳液、洗劑、軟膏、泡沫、溶液、糊劑、懸浮液、噴液、噴霧劑、粉末或貼布。
於以下記載之圖式及實施方式，將詳細描述本發明的一或多項具體實施態樣。該等具體實施態樣之其他特色、目的及優點，將由下列敘述說明及圖式，以及申請專利範圍彰顯出來。
圖1係顯示於毛囊中Pofut1基因剔除會導致毛髮重返生長期(anagen re-entry)的缺陷。(A)取自於出生後30天(P30)之對照組及Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠背部皮膚切片進 行Ki67免疫染色。毛囊球大小量化取自於P30之對照組及Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠的毛囊免疫染色。長條圖顯示取自二獨立對照組與突變型組對之毛囊球長度(平均值+/-s.d.,n=30)，**：P<0.01。(B)及(C)取自於P22(毛髮生長靜止期)及P24(毛髮生長期早期)之背部皮膚樣本進行Lef1與α6-integrin(α6)雙重染色、P-鈣黏素(Pcad)與CD34雙重染色及Pcad與Ki67雙重染色。定量存在於P24之對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠毛胚中的Lef1-陽性(Lef1+)及Ki67-陽性(Ki67+)細胞。長條圖顯示取自二獨立對照組與突變型組對之毛胚的Lef1+細胞數(B)與Ki67+細胞數(C),**：P<0.01。所使用之抗體根據螢光標記的第二抗體進行顏色編碼。
圖2係顯示Pofut1基因剔除於毛囊中會導致毛髮循環過渡期間之細胞增生和細胞凋亡調節異常。(A)於P20(衰退期)、P22(靜止期)、P24(毛髮生長期早期)及P30(毛髮生長期晚期)以BrdU-標定對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠。所指定階段之背部皮膚樣本進行BrdU與中間絲蛋白雙重染色(vimentin)。中間絲蛋白免疫染色係用於標定切片中的DP，並排除分析中錯誤的毛囊。定量BrdU-陽性(BrdU+)細胞：長條圖顯示取自指定階段二至三獨立對照組與突變型組對之每一毛囊的BrdU+陽性細胞數(平均值+/-s.d.,n>40)。(B)前述樣本之連續系列切片進行已裂解凋亡蛋白酶(cleaved Caspase-3)之免疫染色。定量已裂解凋亡蛋白酶3染色陽性的細胞：長條圖顯示取自指定階段二至三獨立對照組與突變型組對之每一毛囊的裂解凋亡蛋白酶3-陽性(凋亡)細胞數(平均值+/-s.d.,n>40),*：P<0.05,**：P<0.01。
圖3係顯示取自對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠之毛囊中γ-H2AX免疫染色的定量結果圖。對照組與 Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠於P22之背部皮膚切片進行γ-H2AX免疫染色。於突變型毛囊細胞核中偵測雙股DNA損傷訊號(γ-H2AX-陽性)。長條圖顯示得自三組獨立對照組與突變型組對之於20倍放大倍率下超過50個視野中γ-H2AX-陽性毛囊的百分比(平均值+/-s.d.)。**：P<0.01。
圖4係顯示於分離自對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠之隆突部毛囊幹細胞中部分(A)p53標靶基因、(B)週期素基因及(C)DNA修復基因組的qRT-PCR(及時定量分析)結果。長條圖顯示相對於其所對應對照組之mRNA量。(平均值+/-s.d.,n>3)。
圖5係顯示於所分選CD34+α6+隆突部毛囊幹細胞於有或無DAPT存在下進行之細胞連續繼代集落形成分析的定量結果圖。等數量得自8週齡野生型小鼠之所分選CD34+α6+隆突部毛囊幹細胞與swiss 3T3餵養細胞進行共同培養，並以DMSO(作為載劑對照組)或10 ¼M DAPT處理7天。該圖顯示每平方公分之集落數(平均值+/-s.d.,n=3)。*：P<0.05,**：P<0.01。
圖6係顯示證明使用K14-Cre引起之Hes1表皮剔除小鼠(Hes1eK小鼠)，會造成毛髮生長期啟動的延遲。利用Rosa26-LacZ代理報導小鼠確認K14-Cre小鼠的重組型式。[K14-Cre+/wt；Rosa-LacZ+/wt]小鼠之背部皮膚切片以X-gal進行染色。(A)該圖顯示Hes1eKO相對於對照組小鼠背部皮膚上皮細胞中Hes1、Hes5及Hey1之表現量的qRT-PCR(及時定量分析)。(B)該示意圖係顯示小鼠出生後的兩次同步毛髮週期。所示係將於該二次毛髮週期中的不同毛髮週期階段與年齡對應。
圖7係顯示Hes1eKO小鼠毛囊於生長期啟始上的延遲可能是由於活化及抑制毛髮生長信號不平衡所致。(A)將對照組與Hes1eKO小鼠之背部皮膚切片進行β-連環素 (β-catenin)免疫染色。核內β-連環素染色之定量顯示於長條圖。n>30HF(毛囊)，取自二獨立的對照組與突變型組對。(B)對照組與Hes1eKO小鼠之背部皮膚切片進行磷酸化-Smad1/5/8免疫染色，且具有陽性染色之% HF(毛囊)的定量結果由長條圖表示。n>30HF(毛囊)，取自二獨立的對照組與突變型組對。
圖8為含有基質(Lef1+且Ki67+，位於Auber線下方)與髮幹前驅細胞(Lef1+且Ki67+，位於Auber線上方及AE13標記內部)之毛囊球示意圖。
圖9係顯示於Hes1表皮剔除小鼠觀察到之較小毛囊球可能是因形態發生期的發育延遲所造成。(A)對照組與Hes1eKO小鼠之背部皮膚切片進行AE13與Ki67之雙重免疫染色。基質與髮幹前驅細胞之細胞增生定量結果顯示於長條圖(平均值+/-s.d.,n>30HF，取自二獨立的配對)。***：P<0.001。(B)對照組與Hes1eKO小鼠之背部皮膚切片進行AE13與Lef1之雙重免疫染色。基質與髮幹中之Lef1+細胞定量結果顯示於長條圖(平均值+/-s.d.,n>30HF，取自二獨立的配對)。***：P<0.001。
圖10為毛囊不同細胞層中毛髮角質標記物的示意圖。外根鞘(ORS)；伴隨層(CP)；Henle層(He)；Huxley層(Hu)；IRS之角皮(Ci)；毛幹之角皮(Ch)；毛幹之皮層(Co)；毛幹之髓質(Me)。
圖11係顯示於Delta-Fc有或無存在下對毛囊幹細胞進行細胞連續繼代集落形成分析之定量結果。(平均值+/-s.d.,n=3)。**：P<0.01。P2，繼代2；P3，繼代3。
圖12係顯示使用K14-Cre引起之Hes1表皮剔除小鼠(Hes1eKO小鼠)於重複拔毛後的毛髮重生延遲及毛被變薄。在出生後第50天(P50)對同窩出生對照組(Ctrl)與Hes1條件剔除小鼠(Hes1eKO)之背部皮膚進行剃毛及脫毛(拔 毛)，每隔三週一次連續四次。拔毛促進毛囊引發新的毛髮週期。於拔毛後，再生毛囊進行一回合生長期-衰退期-靜止期的毛髮週期，正常需耗時3週。圖示為於拔毛後0週、1週、2週及3週，對照組及Hes1eKO小鼠之背部毛被照片。
圖13係顯示於拔毛(1及5次)後第2天，毛胚與隆突部中的細胞增生。對照組與Hes1eKO小鼠(分別脫毛1或5次)之背部皮膚切片經過染色處理以進行細胞增生分析。
圖14係顯示具有γ-H2AX染色訊號之毛囊的定量結果。對照組與Hes1eKO小鼠(分別脫毛1或5次)之背部皮膚切片經過免疫染色處理以進行γ-H2AX訊號分析。
意外地發現，Notch訊息傳遞對於HFSC的自我更新和長期再生是至關重要的。因此，本文描述一種使用可活化Notch訊息傳遞途徑的藥劑治療掉髮的方法。
Notch訊息傳遞途徑活化劑可為(例如)一種Notch配位體。Notch配位體係一種能與Notch受體結合並使其活化的媒介蛋白質。所述之配位體可為Jagged1(例如，NCBI登錄號AF003837(人類)、BC058675(小鼠)或NM_019147(挪威大鼠))、Jagged2(例如，NCBI登錄號AF029778(人類)、AF038572(小鼠)或U70050(挪威大鼠))、Delta1(例如，NCBI登錄號AF222310(人類)、BC065063(小鼠)或U78889(挪威大鼠))或Delta4(例如，NCBI登錄號NM_019074(人類)、BC042497(小鼠)或NM_001107760(挪威大鼠))。所述之配位體亦可為一野生型配位體的功能性變異型(例如，突變型)或功能性片段。所述之配位體亦可為一含有野生型Notch配位體、其功能性變異型或其功能性片段之修飾 型(例如經PEG修飾)、融合、或嵌合型分子。於此項陳述已知有各種Notch配位體，為Jagged1、Jagged2、Delta1或Delta4之片段。
或者，所述之Notch訊息傳遞途徑活化劑可為一種Notch下游效應物如Hes1，例如NCBI登錄號BC0391(人類)、BC051428(小鼠)或BC061730(挪威大鼠)。所述之效應物可為一野生型蛋白質的功能性變異型(例如，突變型)或功能性片段。所述之活化劑亦可為一含有野生型Notch效應物、其功能性變異型或其功能性片段之修飾型(例如經PEG修飾)、融合或嵌合型分子。
所述之Notch訊息傳遞途徑活化劑亦可為一種Notch受體的修飾蛋白，如蛋白質O-岩藻糖基轉移酶-1(Pofut1)，例如NCBI登錄號BC000582(人類)、BC046295(小鼠)或NM_001002278(挪威大鼠)。所述之活化劑可為一野生型Pofut1的功能性變異型(例如，突變型)或功能性片段。所述之活化劑亦可為一含有野生型Notch修飾蛋白、其功能性變異型或其功能性片段之修飾型、融合或嵌合型分子。
前述之Notch訊息傳遞途徑活化劑可由先前已知的方法，例如重組技術製造，或從已公開可取得之來源獲得。
本發明係將一Notch訊息傳遞途徑活化劑投藥予個體，用以治療該個體之掉髮。術語“掉髮”、“脫髮”或“禿髮”用於本文係指，頭部或身體某部分的毛髮脫落或缺少。掉髮病況包括男性型掉髮、女性型掉髮、圓形禿掉髮、生長期掉髮及已知稱為靜止期掉髮的毛髮稀疏。圓形禿會造成約一個大硬幣尺寸的禿頭斑塊。生長期掉髮是普遍的掉髮，可能影響範圍包括頭皮、臉部和身體。此類型掉髮最常發生原因為癌症化療。術語“毛髮”用於本文非指內耳毛。
所述之Notch訊息傳遞途徑活化劑可經由各種 路徑投藥予個體，例如口服、非經腸道、靜脈內、肌肉內、皮下、局部或經皮投藥路徑。
本文亦描述一種用以治療掉髮病況之組成物。所述之組成物包括一有效劑量之Notch訊息傳遞途徑活化劑，及一生理上可接受的載體。所述之載體必須是“可接受的”，即其與該組成物的活性成分相容，且對於待治療個體是無害的。所述之載體係基於投藥方式與途徑及標準製藥作法而選擇。
於一項具體實施例，所述之組成物係調製成一種可局部施用至受掉髮影響之區域的組成物。局部調配物可包括一或多種載劑，以使所述之組成物經調配成特殊形式(例如乳霜)，或增進所述組成物之觸感、顏色、香味、吸收性或鋪展性。用於治療掉髮之局部組成物可包括可存在於化妝品調配物中的成分，例如顏料、香料、防腐劑、保護劑、吸附劑、緩和劑、潤膚劑、緩衝劑，皮膚滲透劑和介面活性劑。局部組成物亦可含有一或多種皮膚護理成分，例如維生素或油類。
適用於經皮投藥之調配物可製成散式貼布，運用儲庫或微儲庫系統、粘合劑擴散-控制系統或基質分散型系統中來達成投藥目的。
本發明以下所敘述之特別實施例僅作為輔助說明，並非用於以任何方式限制本發明所揭露的其他部分。無需進一步詳細描述，相信熟習於本領域技術人員可基於本文的描述，最大程度地利用本發明所揭露之內容。所有於本文引用的公開文獻皆以其完整內容通過引用方式併入本文。
實施例
實施例1：於毛囊細胞後裔中阻斷Notch訊息傳遞會導致重返毛髮生長期(anagen re-entry)延遲
先前使用經由Krt14-Cre剔除Rbpj基因進行有關 Notch訊息傳遞在毛囊循環之作用的研究，結果由於嚴重的表皮屏障功能缺陷而導致新生小鼠死亡。為避免由於在基底表皮中Notch信號的去除所引起的新生胎鼠致死性，本實例遂使用Tgfb3-Cre剔除表皮上皮和毛囊細胞後裔中的Pofut1(Lin HY等人，PLoS One 6：e15842,2011)。
先前文獻已描述Tgfb3-Cre(Tgfb3-Cre+/wt)、floxed Pofut1(Pofut1 fx/fx)及floxed Hes1(Hes1 fx/fx)小鼠之產生(Shi S,Stanley P.,Proc Natl Acad Sci U S A 100：5234-5239,2003；Yang LT,Li WY,Kaartinen V.2008.Genesis 46：112-118.Imayoshi I et al,Development 135：2531-2541,2008)。將Pofut1 fx/fx 小鼠與Tgfb3-Cre小鼠交配，而產生異型雜合子的Tgfb3-Cre+/wt；Pofut1 fx/wt小鼠，然後將其與Pofut1 fx/fx 小鼠交配，而產生Pofut1j fx/fx ；Tgfb3-Cre條件剔除小鼠(以下稱為Pofut1/Tgfb3-Cre)。
使用年齡匹配的Pofut1 fx/fx或Pofut1 fx/wt小鼠作為同窩出生對照組。Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠的平均壽命為4-5個月，且於產後3週在頭-至-尾方向上呈現漸行性禿髮。
所有動物工作皆依據台灣COA國家準則進行。對小鼠進行的所有研究和程序，均在國家衛生研究院(NHRI)的研究實驗室進行，並經由NHRI動物護理和使用委員會批准。
將下背部皮膚樣本以4%多聚甲醛在冰上固定30分鐘然後進行冷凍切片加工處理，或於室溫下固定4小時之後進行石蠟切片加工處理。所有樣本皆切片成7μm。用於組織學分析，切片係使用標準程序以蘇木精和曙紅染色。
組織學分析結果顯示，Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠在P30展現比對照小鼠更小的毛囊。因此，將取自對照組及突變型小鼠之背部皮膚切片進行Ki67(為一種細胞增生核抗原)免疫染色，來檢測毛囊球。結果發現在P30的突變型毛囊中， Ki67-陽性基質細胞及毛囊球體積都減少(圖1A)。於突變型小鼠觀察到毛囊球體積減少，意味著毛囊球基質細胞的祖細胞活化受損或細胞凋亡增加。進一步研究此二種可能性。
毛胚(為一種特別的上皮結構，分開隆突部與真皮乳頭)直接有助於形成下一回毛髮週期的毛囊後裔。為檢測對照組與Poftt1/Tgfb3-Cre小鼠間之毛胚狀態，遂於P22(毛髮生長靜止期)及P24(毛髮生長期早期)採取背部皮膚樣本，進行毛胚標記物(Lef1及P-cadherin鈣黏素)與細胞增生狀態分析。雖然在毛髮靜止期對照組與突變型小鼠間之毛胚(Lef1+與Pcad+細胞)大小相當，在生長期早期突變型毛囊呈現較對照組毛囊小的毛胚，且具有較少的Lef1+陽性細胞(圖1B)。此外，P-鈣黏素與Ki67之雙重染色結果顯示，在P24突變型毛胚細胞中的Ki67+細胞數量較對照組毛胚少(圖1C)。此等數據共同暗示，Notch訊息傳遞喪失會導致重返毛髮生長期上的缺陷。
實施例2：Notch訊息傳遞調節毛囊循環期間之毛囊幹細胞/祖細胞的適當增生和細胞死亡
接著，本實例經由分析毛髮週期中的細胞增生及凋亡狀態，研究造成在Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠中所觀察到之較小隆突部/毛胚的潛在機制。
將對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠於不同毛髮週期階段(從衰退期到毛髮生長期晚期)以BrdU-標定，並進行BrdU之免疫染色。BrdU染色及定量分析結果顯示，於突變型小鼠毛囊，在P24(毛髮生長期早期)之毛胚中，及在P30(毛髮生長期晚期)之毛囊球中的細胞增生，相較於對照組樣本大量減少(圖2A)。值得注意的是，於突變型毛囊退化的ORS(在P20衰退期)，及於突變型毛囊的隆突部/峽部區域(在P22毛髮生長靜止期)中觀察到BrdU染色。
亦使用在前述細胞增生分析之連續系列切片進 行細胞凋亡標記物已裂解凋亡蛋白酶(cleaved Caspase-3)的免疫染色。對於免疫染色執行，係將切片置於遮蔽溶液(5%正常山羊血清、2.5%牛血清白蛋白與0.3% Triton-X 100溶於PBS)中，並於4℃下與存在遮蔽溶液中之第一抗體靜置過夜。清洗後，與Dylight 488-或Dylight 594結合之第二抗體(Jackson ImmunoResearch)靜置，之後於含有DAPI的上樣介質(Vector Labs)中進行複染。擷取影像則使用接附Olympus DP71 CCD裝置及配備DP控制器與DP處理器軟體之Olympus BX51顯微鏡，或使用配備Leica Power 3D軟體之Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡。對照組與突變型樣本之間的比較，係使用於影像捕獲的相同的曝光和背景平衡條件，以至少三組獨立的對照組與突變型組對獲得相似結果。
對照組毛囊僅在P20(衰退期)於退化的ORS中呈現細胞凋亡陽性染色，而突變型毛囊則在在P20(衰退期)於退化的ORS中，及在P22(毛髮生長靜止期)和P24(毛髮生長期早期)，於隆突部/峽部與毛胚區域中展現陽性染色，如圖2B之定量分析結果所示。在P30於Pofut1/Tgfb3-Cre毛囊球中未出現細胞凋亡，表示突變型毛囊球的體積減少並非因於細胞凋亡增加。總之，在毛髮週期過渡期間Pofut1-剔除毛囊展現出細胞增生和細胞凋亡的調節異常，其可能用來解釋於Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠所觀察到之生長期較小發育的隆突部/毛胚。
實施例3：於毛囊細胞後裔中阻斷Notch訊息傳遞會導致DNA損傷反應及DNA修復機制缺乏
於Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠所觀察到，在毛髮週期過渡期間的重返毛髮生長期延遲，及細胞增生/細胞凋亡調節異常，促使於本實例檢測Notch訊息傳遞喪失是否會在突變型毛囊中造成某些壓力反應，例如DNA損傷反應或細胞衰老。
對於衰老-關聯之β-半乳糖苷酶分析，係將冷凍切片於0.2%多聚甲醛中在冰上固定20分鐘，並遵照標準程序使用X-gal染色觀察β-半乳糖苷酶活性。於X-gal染色後，將切片以曙紅進行複染。衰老-關聯之β-半乳糖苷酶分析並未顯示毛囊細胞後裔中有發生老化。然而，觀察到在Pofut1/Tgfb3-Cre毛囊細胞中有較多γ-H2AX染色訊號(相較於對照組毛囊細胞)，暗示DNA雙股斷裂(DSB)信號增加(圖3)。
接著，於本實例探討DNA損傷信號是否觸發突變型毛囊幹細胞中的細胞週期檢查點。將取自P22之對照組與Pofut1/Tgfb3-Cre小鼠的隆突部(CD34+CD49f+)角質細胞以FACS分離，並藉由qRT-PCR分析一組促凋亡基因、細胞週期調節子及DNA修復基因的基因表現。背部皮膚使用分散酶(dispase)收取表皮，並將角質細胞之單細胞懸浮液抗體標染處理，以供進行FACS。將經由FACS分離之隆突部毛囊幹細胞直接分選入TRIzol試劑中。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)根據廠商操作流程分離出總體RNA。以Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)測量RNA品質與濃度。
為獲得足夠量用於qRT-PCR分析之樣本，遂將從隆突部毛囊幹細胞分離得之總體RNA(~200ng得自105細胞)以RiboMultiplier sense-RNA擴增套組(Epicentre Biotech.)進行擴增。使用等量RNA(~2μg)以Transcriptor反轉錄酶(Roche)與oligo-dT引子，遵照廠商操作說明合成cDNA。及時定量PCR(RT-qpcR)的操作為使用配備ABI 7500系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，以及FastStart Universal Probe Master(Rox,Roche)和經設計基因-特異性跨越外顯子-外顯子邊界之探針/引子組。樣本以SDS軟體v1.4分析，並對管家基因核醣體蛋白L7(Rp17)或次黃嘌呤-鳥嘌呤 磷酸核糖基轉移酶(Hprt-1)之表現量正常化。使用欲達到每一樣本之交叉點(Ct)所需的循環次數，以2-CP方法進行相對定量分析。可要求取得依據基因-特異性通用探針編號及引子序列。
如圖4所示，在突變型中觀察到p21適度增加，及Noxa和Gadd45b表現量呈現較大增加，而突變型中CyclinD1、CyclinE2與CyclinB1之表現量減少。有趣的是，吾等發現在突變型中同源重組及非-同源終端連結途徑之DNA修復基因，包括Brca2、Rad51、Ku80與Exo1受到減量調節。此等數據暗示，毛囊細胞後裔中之Notch訊息傳遞喪失會導致促凋亡基因之表現增加，DNA修復機制缺乏及誘發細胞週期檢查點。
於本實例研究在Pofut1/Tgfb3-Cre毛囊觀察到之DSB信號，是否由異常細胞增生所造成(已經在致癌基因誘導的DNA損傷檢查點反應之個案報導過)。為測試此項假說，遂使用FACS從8週齡野生型小鼠分離得隆突部幹細胞，並將其於有或無γ-分泌酶抑制劑(Notch訊息傳遞抑制劑)存在下進行細胞連續繼代集落形成分析。觀察到，相較於DMSO-處理之隆突部毛囊幹細胞，DAPT-處理之隆突部毛囊幹細胞中的群落數目及大小都顯著增加(圖5)。本發明之數據表示，隆突部幹細胞之Notch訊息傳遞喪失會導致細胞增生異常，且此類DNA複製壓力可誘導DNA損傷反應(DDR)，隨後是細胞死亡。
實施例4：於小鼠表皮中去除Notch訊息傳遞效應子Hes1會造成毛髮生長期延遲及較小的毛囊球的缺陷。
前述實例已證明，於毛囊細胞後裔中去除Notch訊息傳遞會導致重返毛髮生長期的延遲，以及毛囊幹細胞中的DNA損傷反應增加。本實例進一步探討Hes1(Notch訊息傳遞之主要標靶基因)在毛囊週期中的特異性作用。將Hes1 fx/fx小鼠與K14-Cre小鼠交配，所生成之[Hes1 fxfx；K14-Cre]小鼠(以下稱作Hes1eKO小鼠)，於出生時沒有任何明顯的表現型。使用Rosa26-LacZ代理報導小鼠測試K14-Cre於小鼠表皮中之基因重組型式，確認K14-Cre可以誘導整層表皮中的基因重組。於Hes1eKO表皮中，Notch下游效應子Hes1、Hes5及Hey1之RT-qPCR顯示，Hes1與Hey1基因表現相較於對照組表皮有顯著減少，而Hes5基因表現維持與對照組相當(圖6A)。
由於Notch訊息傳遞在毛囊(HFs)之完整形態發生上具有重要作用，本實例遂檢測在出生後毛髮週期之不同階段的背部皮膚整體表現型(圖6B)。當HF處於靜止期時，小鼠背部皮膚失去色素著色(粉紅色)，而當HF處於生長期，小鼠背部皮膚的顏色變深(黑色)。在P20將同窩出生對照組及小鼠之毛被(hair coat)剃除，發現在Hes1eKO小鼠中，背部皮膚顏色變黑所花費的時間似乎比同窩出生對照組小鼠的長。Hes1eKO小鼠的毛被仍會長回來，而在P35對照組與Hes1eKO小鼠之間沒有明顯的差異。然後在P42(衰退期)將小鼠剃毛，以監測背部皮膚的靜止期階段，對照組與Hes1eKO小鼠之剃毛區在P56(第二靜止期)仍維持粉紅色，表示對照組與Hes1eKO小鼠之HF皆進入靜止期。
然後使用組織學分析(H&E染色)檢測在不同毛髮週期階段收集到的對照組與Hes1eKO小鼠之背部皮膚樣本。於第一毛髮週期的生長期(P14)及衰退期(P19)，Hes1eKO HFs與對照組HF之間無可辨別的差異。有趣的是，於第二毛髮週期的生長期(P20-P24)，Hes1eKO HF顯現出較對照組HF小的毛胚。於第二毛髮週期的生長期晚期(P28)，Hes1eKO毛髮毛囊球明顯較對照組HF的小。Hes1eKO與對照組HF在第二毛髮週期的衰退期(P42)都進行毛囊衰退，且在第二靜止期(P56)呈現靜止期形態-隆突區緊鄰真皮乳突觸。先前研究已知，靜 止期HF的毛髮拔除會刺激毛髮再進入生長期(Muller-Rover S等人，J Invest Dermatol 117：3-15,2001)。
於是在P56於對照組與Hes1eKO小鼠之背部進行蜜蠟-脫毛，並在拔毛後8天從Hes1eKO小鼠之脫毛區採收背部皮膚樣本。組織學分析顯示，Hes1eKO毛囊具有較對照組毛囊小的毛囊球。此等數據暗示，Hes1eKO小鼠之毛囊在生長期起始作用上具有缺陷，並發育出較小的毛囊球。
實施例5：Hes1eKO小鼠毛囊於生長期起始上的缺陷可能是由於不平衡的毛髮活化及抑制生長信號所致接著，於Hes1eKO HF觀察到的生長期起始缺陷進行分析。將處於生長期早期之對照組與Hes1eKO HF進行P-鈣黏素(P-cadherin毛胚標記物)與Ki67(細胞增生標記物)之雙重染色，觀察到Hes1eKO HF於生長期早期之毛胚的細胞增生減少。
前人研究證據已顯示，生長期起始作用係受到活化與抑制信號間的平衡控制，其中Wnt訊息傳遞之強度(活化訊號)因BMP訊息傳遞(抑制訊號)受(至少一部分)TGF-β訊息傳遞介導的減量調節而增加(Lin HY,Yang LT..Dev Biol 373：394-406,2013)。於是本實例透過進行β-連環素、磷酸化-Smad1/5/8與磷酸化-Smad2/3之免疫染色，來檢測對照組與Hes1eKO小鼠背部皮膚切片中Wnt、BMP及TGF-β的訊息傳遞途徑。
定量分析結果顯示，Hes1eKO HF之毛胚呈現較對照組HF少的核內β-連環素訊號(Wnt訊息傳遞)(圖7A)；對照組HF呈現較Hes1eKO HF少的磷酸化-Smad1/5/8訊號(BMP訊息傳遞)，以及較多的磷酸化-Smad2/3訊號(TGF-β訊息傳遞)(圖7B)。此等數據暗示，相較於對照組HF，HesleKO HF受到較低活化，且Hes1可能控制隆突部幹細胞對生長期促進訊號之活化的閥值。
於本實例亦確認，Hes1eKO HF之生長期起始的延遲並非由於HFSCs明顯缺少或隆突部區域內細胞死亡增加，證據在於對照組與Hes1eKO HF中毛囊幹細胞標記物CD34(第一抗體1：100，eBioscience)、Sox9(第一抗體1：100，Santa Cruz)及NFATc1(第一抗體1：150，Santa Cruz)的免疫染色結果訊號差異不大，且皆無呈現TUNEL陽性染色。使用DeadEnd Fluorometric TUNEL系統(Promega)遵照廠商操作說明進行TUNEL分析。以手動計數特定組織區域中的陽性染色細胞。使用Student’s t-test對於得自二到三組獨立的對照組與突變型組對之系列切片進行統計分析，且P-值小於0.05被認為具有顯著差異。
實施例6：Hes1eKO毛囊之生長期毛囊球缺陷可能是因形態發生的延遲發育所造成。
本實例為研究HesleKO HF之毛囊球缺陷，首先分析毛囊球及毛幹前軀體中的增生狀態。亦參見圖8。藉由使用BrdU併入之免疫染色細胞增生套組(Amersham)或Click-iT EdU Alex Fluor 594成像套組(Thermo Fisher Scientific)，遵照廠商操作程序進行，完成細胞增殖分析。
如Ki67染色(細胞增生標記物)所證明，對照組HF中的基質細胞呈現較Hes1eKO HF多的細胞增生。此外，Hes1eKO HF中之毛幹前軀體較對照組HF中呈現較少增生性(圖9A)。亦檢測存在對照組與Hes1eKO HF中的毛髮基質與毛幹前軀體(由Lef1+細胞標示)。由Lef1染色之定量分析結果發現，相較於對照組HF，Hes1eKO HF具有較少基質細胞與毛幹前軀體(圖9B)。於對照組與Hes1eKO小鼠第二同步生長期、衰退期及靜止期之TUNEL染色結果所示的證據，排除細胞死亡增加是造成毛囊球缺陷的原因。
為檢驗毛囊細胞後裔中Hes1缺失是否會引起毛髮構造缺陷(圖10)，本實例於P29(生長期中期)及P35(生長 期晚期)分析毛髮角質標記物K6(伴隨層)、AE15(IRS He、Hu與毛幹Me)、AE13(毛幹Co)、K82(毛幹Ch)及K73(IRS Ci)。K6染色顯示，對照組與Hes1eKO HF皆具有伴隨層。有趣的是，AE15(1：100,Santa Cruz)染色顯示Hes1eKO HF於P29缺乏毛幹的髓質層；AE13(1：100,Abcam)染色顯示Hes1eKO HF在P29發育出較對照組HF短的毛幹。K82(1：100,Abnova)及K73(1：150,biorbyt)染色亦顯示在P29，Hes1eKO HF中之毛幹與IRS的角質層形成相較於對照組HF都呈現較少成形。而在P35，Hes1eKO HF之毛幹髓質(AE15+)開始出現，且Hes leKO HF之AE13+、K82+與K73+細胞層也延伸其長度。本發明之數據指出，Hes1-剔除毛囊能在毛髮生長期產生毛囊細胞後裔，但是由生長期間IRS與毛幹細胞層發育較慢之結果顯示，彼等呈現明顯的形態發生延遲。
實施例7：於活體外細胞集落形成分析中Hes1-剔除毛囊幹細胞不能維持其自我更新能力。
毛囊幹細胞(HFSCs)保留自我更新能力，且能在活體外經數次繼代後持續增生，此為一種幹細胞特性。因為在Hes1eKO小鼠觀察到較少被活化的靜止期HF，本實例研究Hes1eKO HFSCs在連續繼代實驗中的細胞集落形成能力(CFA)。
從8週齡對照組與Hes1eKO小鼠以FACS-分選出毛囊幹細胞(HFSCs)。將等數之單離HFSCs(~5000)接種於經絲裂黴素C-處理之swiss 3T3纖維母細胞上，並進行三次連續繼代培養。觀察到，起初Hes1eKO HFSCs呈現較對照組HFSCs高的CFA；但是相較於對照組HFSCs，Hes1eKO HFSCs之CFA在第二及第三次繼代明顯減少。此等數據暗示，Hes1-剔除的HFSC較類似於祖細胞且逐漸喪失其幹細胞特性。
實施例8：游離Notch配體Delta-Fc之製備及應用
Notch游離配體Delta1-Fc之固定化或IgG-團簇形式已顯示可活化Notch訊息傳遞(Hicks C等人，J Neurosci Res 68：655-667,2002)。為證明Notch訊息傳遞在HFSC自我更新能力的維持上具有作用，本實例構築一種游離配體Delta1-Fc，並將其用於HFSC細胞集落形成分析中活化Notch訊息傳遞。
於本實例製造含有小鼠Delta1細胞外功能域(a.a.1-530)與人類IgG2之Fc區的Delta1-Fc融合蛋白質。293T細胞以Delta1-Fc表現構體進行模擬轉染或轉感染，並使用HRP-結合之山羊-抗-人類Fc抗體進行免疫轉漬分析Delta1-Fc之表現，確認其存在於培養物上清液中為分子量90kDa的蛋白質。該Notch游離配體的表現質體的構築係將對應於小鼠Delta1之a.a.1-530的cDNA序列以PCR擴增，並將其選殖入pFUSE-hIgG2-Fc載體的EcoR I與Bgl II切位中(以下稱作Delta1-Fc質體)。藉由將293T細胞以Delta1-Fc質體轉感染，來製造Delta-Fc融合蛋白。在轉感染後16小時，將293T細胞之培養基換成低鈣DMEM/F12(0.07mM Ca2+,1% FBS)。於轉感染後4天收集上清液，並將其離心去除細胞碎片。使用透過抗體團簇作用固定化該Delta1-Fc蛋白，遂將山羊-抗-人類IgG Fc IgG以1：2(Delta-Fc：IgG)之莫爾分子比例與Delta1-Fc混合於E-培養基(Nowak JA等人，Methods Mol Biol 482：215-232,2009)，於旋轉器上於室溫下進行混合30分鐘。然後，將透過抗體團簇的Delta1-Fc蛋白以0.4g(3.12nM)/孔(12孔平盤)的濃度施用於毛囊幹細胞體外培養。
接著，測試聚集Delta1-Fc蛋白對於隆突部幹細胞自我更新之影響。分離出HFSCs，並藉由在有或無聚集Delta1-Fc蛋白存在下進行連續繼代培養測定其CFA。由CFA定量結果發現，在聚集Delta1-Fc蛋白處理的HFSCs經過三次繼代後能維持HFSC之CFA，而無Delta-Fc存在下HFSC 呈現逐漸喪失其自我更新能力(圖11)。
實施例9：活體內分析顯示Hes1-剔除毛囊幹細胞無法保持重覆拔毛後之毛髮長期再生
由以上所知Hes1-剔除之HFSCs於活體外細胞集落形成分析中呈現較對照組HFSC差的自我更新能力，於本實例進行一項用於測試毛囊幹細胞自我更新及長期再生所設計之活體內分析(Chen T等人，Nature 485：104-108,2012)。為了測試HFSC之長期再生能力，遂重複地拔除同窩出生對照組及Hes1eKO小鼠之背部毛被，並監測其毛被再生達4回合。
拔毛去除杵狀毛(舊毛)會移除維持HFSC靜止之附著於隆突部內面的細胞。於拔毛後，剩餘的存活HFSCs會變為活化態，並啟始新的毛髮週期。對照組在每一回合拔毛引起的毛髮再生大致皆能補充毛被。相反地，於重覆拔毛後Hes1eKO小鼠其毛髮再生力減低，而呈現逐漸變薄的毛被，暗示Hes1eKO HFSC無法維持其長期再生，而在活體內壓力測試中呈現過早老化(premature aging)(圖12)。本實例之數據顯示，Hes1可能參與在毛髮長期再生期間的HFSC維持。
於生長期內，毛胚在第一時間消耗而形成毛囊細胞後裔，隨後HFSC才增生以補充祖細胞(毛胚)並且進行自我更新(隆突部)(Greeo V等人，Cell Stem Cell 4：155-169,2009)。
為確定Hes1eKO小鼠於重複拔毛後發生過早掉髮之機制，本實例首先檢驗毛胚與膨出部的增生狀態，可分別反映出HFSC對於祖細胞補充及幹細胞自我更新之能力(圖13)。
於對照組與HesleKO毛囊進行之CD34之免疫染色及EdU併入分析顯示，在重複拔毛後，Hes1eKO毛囊逐漸喪失毛胚增生(比較第一次脫毛與第五次脫毛後的第2天)。 雖然對照組及Hes1eKO小鼠之HFSC在第一次脫毛時呈現相當程度的自我更新，Hes1eKO小鼠之HFSC無法在5次脫毛回合後維持其自我更新能力。由於DNA損傷的累積已發現為老化HF的標誌，本實例亦檢測Hes1eKO HF中之DNA損傷反應(DDR)。結果發現，在重複拔毛後Hes1eKO HF之γ-H2AX染色訊號(DNA雙股斷裂標記)顯著增加(圖14)，表示持續的DDR可用來解釋(至少一部分)基因組壓力為導致Hes1eKO小鼠在重複拔毛後所觀察到之毛囊過早老化的現象。
其他具體實施態樣
本說明書中所揭露之所有特徵可以任何方式進行組合。本說明書中所揭露之任一特徵可由用於相同、等同或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另有明確說明，所揭露的每一特徵僅僅是一般等價或類似特徵系列的實施範例。
從上述說明，熟習於該項技術者能容易地掌握所描述實施例的根本特徵，並且可在不偏離本說明書所述範圍之下對該等實施例進行各種改變及修飾，以適應各種用途和條件。因此，其他實施例亦包含在申請專利範圍內。

Claims (20)

  1. 一種治療掉髮病況之方法，包含將一Notch訊息傳遞路徑之活化劑投藥予有其需要的個體。
  2. 如請求項1所述之治療掉髮病況之方法，其中該活化劑為一Notch配體。
  3. 如請求項2所述之治療掉髮病況之方法，其中該配體係選自於由Jagged1、Jagged2、Delta1和Delta4所組成之群組中之一者。
  4. 如請求項1所述之治療掉髮病況之方法，其中該活化劑為一Notch下游效應物。
  5. 如請求項4所述之治療掉髮病況之方法，其中該Notch下游效應物為Hes1。
  6. 如請求項1所述之治療掉髮病況之方法，其中該活化劑為一Notch修飾蛋白。
  7. 如請求項6所述之治療掉髮病況之方法，其中該Notch修飾蛋白係為蛋白質O-岩藻糖基轉移酶-1(O-fucosyltransferase 1,Pofut1)。
  8. 如請求項1-7所述之治療掉髮病況之方法，其中該掉髮病況為男性型掉髮、女性型掉髮、圓形禿掉髮、生長期掉髮或靜止期掉髮。
  9. 如請求項1-7所述之治療掉髮病況之方法，其中該活化劑係施用於患有掉髮病況之區域。
  10. 如請求項9所述之治療掉髮病況之方法，其中該活化劑 係局部地進行投藥。
  11. 一種治療掉髮病況之組成物，其包含一有效量之Notch訊息傳遞路徑活化劑；及一生理上可接受之載體。
  12. 如請求項11所述之治療掉髮病況之組成物，其中該活化劑為一Notch配體。
  13. 如請求項12所述之治療掉髮病況之組成物，其中該配體係選自於由Jagged1、Jagged2、Delta1和Delta4所組成之群組中之一者。
  14. 如請求項11所述之治療掉髮病況之組成物，其中該活化劑為一Notch下游效應物。
  15. 如請求項14所述之治療掉髮病況之組成物，其中該Notch下游效應物為Hes1。
  16. 如請求項11所述之治療掉髮病況之組成物，其中該活化劑為一Notch修飾蛋白。
  17. 如請求項16所述之治療掉髮病況之組成物，其中該Notch修飾蛋白為O-岩藻糖基轉移酶-1(O-fucosyltransferase 1,Pofut1)。
  18. 如請求項11-17所述之治療掉髮病況之組成物，其中該掉髮病況為男性型掉髮、女性型掉髮、圓形禿掉髮、生長期掉髮或靜止期掉髮。。
  19. 如請求項11-17所述之治療掉髮病況之組成物，其中該組成物為一局部施用之調配物。
  20. 如請求項19所述之治療掉髮病況之組成物，其中該調配 物為乳霜、乳液、洗劑、軟膏、泡沫、溶液、糊劑、懸浮液、噴液、噴霧劑、粉末或貼布。
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